Untersuchung der Interaktion humaner IgG Antikörper mit humanen FcγR in vitro und in vivo Der naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Anja Lux aus Altenburg Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 22. Dezember 2010 Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen. Albert Einstein Inhalt Inhalt A. Zusammenfassung ............................................................................1 I. II. Zusammenfassung .......................................................................................................1 Summary ......................................................................................................................2 B. Einleitung ...........................................................................................3 I. Fcγ Rezeptoren.............................................................................................................3 Murine und humane Fcγ Rezeptoren........................................................................3 Induktion von Antikörpereffektorfunktionen ..............................................................5 Einfluss der IgG Glykosylierung auf die FcγR Interaktion.........................................6 Polymorphismen von humanen FcγR .......................................................................7 II. Untersuchungen in humanisierten Mausmodellen .....................................................10 1. Generierung humanisierter Mausmodelle...............................................................10 2. Humanisierte Mausmodelle in der biomedizinischen Forschung............................11 1. 2. 3. 4. C. Fragestellung ...................................................................................13 D. Ergebnisse .......................................................................................15 I. Bindung von Immunkomplexen an FcγR in vitro.........................................................15 Herstellung von anti-TNP IgG Subtypen (Klon 7B4)...............................................15 Stabile Expression von humanen FcγR in CHO Zellen ..........................................16 Bindung von Immunkomplexen an FcγR ................................................................17 Einfluss der N297 Glykosylierung auf die FcγR-Bindung .......................................20 II. Untersuchung von Antikörpereffektorfunktionen im humanisierten Mausmodell........24 1. Herstellung von anti-CD20 IgG Subtypen (Klon 1F5).............................................24 2. Eigenschaften von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen ..............................................................25 3. Aufreinigung und Analyse von humanen hämatopoetischen Stammzellen............27 4. Genotypisierung der FcγR Polymorphismen ..........................................................28 5. Rekonstitution von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen mit humanen HSC ................................30 6. Charakterisierung der humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse.....................................32 6.1) Leukozytenpopulationen im humanen Immunsystem .........................................33 6.2) Leukozytenpopulationen in der humanisierten Maus ..........................................34 6.3) Expression humaner FcγR in humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen ...................36 6.4) CD20 Expression in humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen .................................38 7. IgG-vermittelte B-Zell-Depletion in humanisierten Mäusen ....................................40 7.1) Fc-Abhängigkeit der 1F5 IgG induzierten B-Zell-Depletion..................................40 7.2) B-Zell-Depletion in Blut, Milz und Knochenmark .................................................41 7.3) Depletion reifer B-Zell-Populationen Milz und Knochenmark ..............................43 7.4) 1F5 IgG vermittelte B-Zell-Depletion im Blut .......................................................45 7.5) Einfluss der FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Polymorphismen............................47 8. anti-CD20 IgG vermittelte Regulation von FcγR .....................................................48 1. 2. 3. 4. E. Diskussion........................................................................................51 I. II. III. IV. In vitro Bindung von Immunkomlexen an humane FcγR ............................................51 Etablierung eines humanisierten Mausmodells ..........................................................53 Anti-CD20 IgG vermittelte B-Zell-Depletion im humanisierten Mausmodell ...............56 Einfluss der FcγR Polymorphismen in vivo.................................................................59 Inhalt F. Material und Methoden ....................................................................63 I. Material.......................................................................................................................63 1. Chemikalien, Plastik- und Verbrauchsmaterialen ...................................................63 2. Puffer und Lösungen ..............................................................................................63 3. Kommerzielle Kits ...................................................................................................63 4. Antikörper und Konjugate .......................................................................................64 5. Oligonukleotide.......................................................................................................65 6. Software .................................................................................................................65 II. Methoden....................................................................................................................66 1. Klonierung der 7B4 und 1F5 IgG Antikörper...........................................................66 1.1) Klonierung der variablen Regionen .....................................................................66 1.2) Klonierung der schweren und leichten Ketten.....................................................66 1.3) Herstellung von chemisch kompetenten E.coli TOP10 Bakterien .......................67 1.4) Transformation von E.coli TOP10 Bakterien .......................................................68 1.5) Isolation von Plasmid DNA aus Bakterien...........................................................68 1.6) Sequenzierung ....................................................................................................68 2. Produktion der 7B4 und 1F5 IgG Antikörper...........................................................69 2.1) Transiente Transfektion von HEK293T Zellen ....................................................69 2.2) Aufreinigung der Antikörper.................................................................................69 2.3) Entfernung von LPS-Kontaminationen ................................................................70 3. Proteinmodifikationen .............................................................................................70 3.1) Biotinylierung.......................................................................................................70 3.2) Konjugation von FITC-Fluorochromen ................................................................70 3.3) Konjugation von Alexa647-Fluorochromen .........................................................70 3.4) Herstellung von F(ab)2 Fragmenten ....................................................................70 4. In vitro Analyse der 7B4 IgG Bindung an FcγR ......................................................71 4.1) Affinität der 7B4 IgG für TNP...............................................................................71 4.2) FcγR Expression in stabil transfizierten CHO Zellen ...........................................71 4.3) Anreicherung FcγR exprimierender CHO Zellen .................................................72 4.4) Immunkomplexbindung an FcγR exprimierende CHO Zellen..............................72 4.5) Einfluss der Glykosyslierung auf die Immunkomplexbindung .............................72 5. In vitro Analyse der Bindung von 1F5 IgG an LCL1.11 Zellen................................73 6. In vitro Analyse der C1q Bindung durch 1F5 IgG ...................................................73 7. Humane hämatopoetische Stammzellen ................................................................74 7.1) Aufreinigung humaner hämatopoetischer Stammzellen......................................74 7.2) Durchflusszytometrische Analyse von Nabelschnurblut und HSC ......................74 8. Genotypisierung der FcγR Allele ............................................................................75 8.1) Isolation von genomischer DNA aus humanem Nabelschnurblut .......................75 8.2) Genotypisierung mittels allelspezifischer PCR....................................................75 9. Rekonstitution von humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen.......................................76 10. Probengewinnung und durchflusszytometrische Analysen ....................................76 10.1) Präparation von Maus-Leukozyten aus dem Blut..............................................76 10.2) Präparation von humanen Leukozyten aus dem Blut........................................77 10.3) Präparation von Leukozyten aus Milz und Knochenmark .................................77 10.4) Durchflusszytometrische Färbung und Analyse ................................................77 11. Immunfluoreszenz-Analyse der humanisierten Mäuse...........................................78 12. 1F5 IgG vermittelte B-Zell-Depletion ......................................................................78 Inhalt 13. Zellkultur .................................................................................................................79 14. Versuchstierhaltung................................................................................................79 15. Statistik ...................................................................................................................79 G. Literaturverzeichnis ........................................................................81 H. Anhang .............................................................................................89 I. Sequenzen und Vektorkarten .....................................................................................89 1. Sequenzen der klonierten Antikörper: Schwere Ketten ..........................................89 2. Sequenzen der klonierten Antikörper: Leichte Ketten ............................................91 3. Vektorkarten ...........................................................................................................92 II. Abkürzungsverzeichnis...............................................................................................93 III. Eigene Publikationen..................................................................................................96 1. Zeitschriftenartikel ..................................................................................................96 2. Posterpräsentation und Vorträge............................................................................96 IV. Lebenslauf ..................................................................................................................97 I. Danksagung.......................................................................................98 Zusammenfassung A. Zusammenfassung I. Zusammenfassung Immunglobulin G (IgG) Antikörper sind ein essentieller Bestandteil des adaptiven Immunsystems. vollständigen Genetische Defekte, die zu einer verminderten Bildung bzw. dem Fehlen dieses Antikörper-Isotyps führen, gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit einher. Eine Vielzahl von Studien in der Maus deuten darauf hin, dass insbesondere Fcγ Rezeptoren (FcγR), die auf fast allen Zellen des angeborenen Immunsystems exprimiert werden, eine wichtige Rolle für die Aktivität von IgG Antikörpern spielen. In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, ob die Aktivität von humanen IgG Antikörpern von ähnlichen Faktoren in vitro und in vivo beeinflusst wird. Durch in vitro Bindungsstudien von humanen Immunkomplexen an humane FcγR konnte im ersten Teil dieser Arbeit ein Zusammenhang zwischen der Größe von Immunkomplexen und der Bindung an FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA, nicht aber an FcγRIA, gezeigt werden. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Immunkomplexe ohne die Glykosylierung am Asparagin 297 eine verminderte Bindung an die niedrigaffinen FcγR aufweisen. Große Immunkomplexe konnten die durch Deglykosylierung bedingte reduzierte Affinität teilweise kompensieren. Einen weiteren möglichen Einflussfaktor auf die IgG-FcγR Interaktion stellen Polymorphismen in den humanen FcγR dar. In dieser Arbeit wurden genetische Varianten der aktivierenden FcγR, FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V, untersucht. In in vitro Analysen wies FcγRIIA131H für alle humanen IgG Isotypen eine erhöhte Affinität auf. Für die in vivo Analyse IgG-vermittelter Effektorfunktionen wurde ein humanisiertes Mausmodell etabliert, in dem die genetische Komplexität des humanen Immunsystems abgebildet wird. Hierfür wurden immundefiziente Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse verwendet, die nach Transplantation mit humanen hämatopoetischen Stammzellen ein humanes Immunsystem mit B- und T-Lymphozyten sowie NK-Zellen, Monozyten und dendritischen Zellen entwickelten. Weiterhin zeigten die humanen Effektorzellen, wie etwa Monozyten und NKZellen, ein dem Menschen vergleichbares Expressionsmuster der humanen FcγR. In diesem neuen humanisierten Mausmodell wurde der Zusammenhang zwischen den FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Polymorphismen und der biologischen Wirksamkeit von IgG beispielhaft durch die Induktion der Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die durch Injektion von anti-CD20 IgG verursachte Depletion von humanen B-Zellen vom konstanten Teil des IgG Antikörpers abhängt. Zudem zeigten die verschiedenen IgG Subklassen eine unterschiedliche Aktivität und es konnten erste Hinweise gewonnen werden, die vermuten lassen, dass die IgG2vermittelte Depletion in Gegenwart der hochaffinen Varianten der aktivierenden Fc Rezeptoren FcγRIIA131H bzw. FcγRIIIA158V verstärkt war. 1 Zusammenfassung II. Summary Immunoglobulin G (IgG) antibodies are an essential part of the adaptive immune system. Genetic defects leading to a reduced production or a complete lack of this antibody isotype are associated with an increased susceptibility to infectious diseases. Studies of the murine immune system suggest that the biological activity of IgG is mainly mediated by their binding to Fcγ receptors (FcγR) expressed on almost all cells of the innate immune system. The aim of the thesis was to analyse which factors influence the biological activity of IgG in vitro and in vivo. We performed in vitro interaction studies of human immune complexes and human FcγR which suggested a correlation of immune complex size and binding to FcγRIIA, FcγRIIB and FcγRIIIA, but not FcγRIA. In addition, we could show that a lack of glycosylation on asparagine 297 impairs binding to low affinity FcγR. However, this reduced binding could be overcome by increasing the size of the immune complexes. Polymorphisms of the human FcγR pose another factor influencing the interaction with IgG antibodies. To study this, we analysed genetic variants of the activating FcγR, FcγRIIA131H/R and FcγRIIIA158F/V. In vitro binding studies showed an enhanced affinity of FcγRIIA131H for all human IgG subclasses. To study IgG induced effector functions in vivo we developed a humanized mouse model which mirrors the genetic complexity of the human immune system. Immunodeficient Rag2/γc/Fcγ-/- mice transplanted with human hematopoetic stem cells developed a human immune system as shown by the appearance of B and T lymphocytes, NK cells, myeloid cells and dendritic cells. Effector cells such as monocytes and NK cells displayed expression levels of human FcγRs comparable to their human counterparts. This new humanized mouse model was used to study the influence of FcγRIIA131H/R and FcγRIIIA158F/V polymorphisms on the biological activity of IgG antibodies such as the induction of antibody induced cell mediated cytotoxicity (ADCC). B cell depletion induced by the injection of anti-CD20 IgG antibodies greatly depended on the constant region of the antibody. Furthermore, IgG subclasses showed a distinct in vivo activity. Preliminary data also suggest an enhanced IgG2 mediated B cell depletion in the presence of FcγRIIA131H and FcγRIIIA158 2 Einleitung B. Einleitung I. Fcγ Rezeptoren Antikörper, oder Immunglobuline (Ig), sind ein essentieller Bestandteil des adaptiven Immunsystems zur Abwehr von Viren und Bakterien. Zunehmend werden sie auch zu therapeutischen Zwecken bei der Behandlung von Entzündungserkrankungen und bei der Tumortherapie eingesetzt. Die biologische Wirksamkeit von Antikörpern beruht, neben durch die Antigenbindung ausgelösten Effekten, vor allem auf dem Fc Fragment. Aufgrund dieser konstanten Domänen können die Immunglobuline in fünf verschiedene Klassen unterteilt werden: IgM, IgG, IgD, IgE und IgA. Für IgA und IgG existieren jeweils noch weitere Subtypen. In Abb. 1 sind die vier Varianten von IgG (IgG1-4) dargestellt, die sich durch eine starke Konservierung ihrer Sequenzen und eine vergleichbare Proteinstruktur auszeichnen. Dennoch unterscheiden sie sich in Bezug auf die Induktion von Fc-abhängigen Antikörpereffektorfunktionen. So können IgG1, IgG3 und in vermindertem Maße auch IgG2 beispielsweise an das Protein C1q binden und damit den klassischen Weg der Komplementkaskade aktivieren. Der Großteil der Fc-abhängigen Effekte wird jedoch über die Interaktion mit Fc Rezeptoren induziert. Besonders IgG1, IgG2 und IgG3, weniger aber IgG4, sind in der Lage mit den Fc Rezeptoren für IgG zu interagieren – den FcγR [2]. Abb. 1: Im Menschen existieren 4 Subtypen von Immunglobulin G (IgG) Antikörpern. Diese unterscheiden sich in der Induktion von Effektorfunktionen. IgG1, IgG2 und IgG3 binden an C1q und aktivieren so den klassischen Weg der Komplementkaskade. Vor allem IgG1, IgG2 und IgG3 binden auch an FcγR. 1. Murine und humane Fcγ Rezeptoren Als Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie sind FcγR durch extrazelluläre IgG-bindende Domänen charakterisiert [3]. Die murinen FcγR werden auf vielen Zellen des adaptiven und angeborenen Immunsystems wie z.B. Monozyten/Makrophagen [4-6], NK-Zellen [7], BLymphozyten [8] und Granulozyten exprimiert [9]. Wie in Abb. 2A dargestellt, werden in der Maus 4 Klassen von FcγR unterschieden, deren Gene auf Chromosom 1 kodiert sind [10]: die aktivierenden FcγRI (CD64) [4], FcγRIII (CD16) [3] und FcγRIV [11] und der inhibitorische FcγRIIB (CD32) [3]. Der auf Makrophagen exprimierte FcγRI bindet aufgrund von drei 3 Einleitung extrazellulären Domänen mit hoher Affinität an monomere IgG. Dagegen besitzen die niedrigaffinen FcγRIIB, FcγRIII und FcγRIV zwei extrazelluläre Domänen und interagieren mit IgG nur in aggregierter Form oder in Form von Immunkomplexen bestehend aus Antigen und Antikörpern [12, 13]. Ein weiteres wichtiges Merkmal der murinen FcγR ist ihre unterschiedliche Affinität für die verschiedenen IgG Subklassen in vitro [11] und in vivo [1416]. Abb. 2: Murine und humane FcγR. A) Darstellung der 4 Klassen muriner FcγR. Die aktivierenden FcγR sind mit der akzessorischen Fcγ Kette assoziiert, die intrazellulär über eine ITAM Domäne verfügt. Der inhibitorische FcγRIIB ist durch eine intrazelluläre ITIM Sequenz charakterisiert. B) Darstellung der humanen FcγR. Analog zu den murinen FcγR, sind die aktivierenden FcγRIA und FcγRIIIA mit der ITAM-tragenden Fcγ Kette assoziiert. Beim aktivierenden FcγRIIA wird die ITAM- und beim inhibitorischen FcγRIIB die ITIM-Sequenz direkt durch die α Kette kodiert. Die in dieser Arbeit näher untersuchten Polymorphismen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA sind markiert. Während die Interaktion von FcγR und IgG durch die extrazellulären IgG-bindenden Domänen der α Kette vermittelt wird, erfolgt die Signaltransduktion der Rezeptoren durch intrazelluläre Signalmotive. Das immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (ITIM) des FcγRIIB befindet sich in der intrazellulären Domäne der α Kette [17]. Anstelle eigener Signalmotive sind die aktivierenden FcγR der Maus durch ihre Transmembranregionen mit 4 Einleitung der Fcγ Kette assoziiert [11, 18, 19]. Das intrazelluläre immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) der Fcγ Kette ist für die Signaltransduktion der aktivierenden FcγR nach IgG-Bindung verantwortlich [20]. Die Assoziation mit der Fcγ Kette erhöht nicht nur die Affinität der Rezeptoren für IgG [21] sondern ist notwendig für die Expression der Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Fehlt die Fcγ Kette in Immunzellen, so kommt es zum proteolytischen Abbau der α Ketten [22]. In Fcγ-/- Mäusen kommt es daher zu einer Reduktion FcγR-induzierter Effektorfunktionen wie der Phagozytose von Immunkomplexen durch Makrophagen und der Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC). Die Expression von FcγRIIB auf B-Zellen ist dagegen nicht beeinträchtigt [18]. Rezeptoren für IgG finden sich auch auf den Zelloberflächen von humanen Monozyten/Makrophagen [23], B-Zellen [24], Granulozyten [25], NK-Zellen [26] und Thrombozyten [27]. Im Vergleich zur Maus, bei der 4 FcγR bekannt sind, existieren im humanen Immunsystem 3 Klassen von FcγR, die sich weiter in verschiedene Subtypen aufteilen lassen. Diese Vielfalt kommt durch Duplikation und Rekombination der Gene [28] auf Chromosom 1 zustande [29-31]. Die FcγRI-Familie (CD64) besteht aus 3 Genen [32]. Es wird jedoch nur der hochaffine FcγRIA als funktionelles Produkt exprimiert [33]. Mehrere Isoformen existieren auch für den niedrigaffinen FcγRII (CD32) [34, 35]: Bei FcγRIIA handelt es sich um einen aktivierenden FcγR, der in der intrazellulären Domäne über ein ITAM für die Signaltransduktion verfügt. Analog zur Maus ist der inhibitorische FcγRIIB durch ein intrazelluläres ITIM charakterisiert [36]. Die beiden Isoformen des niedrigaffinen FcγRIII (CD16) unterscheiden sich vor allem in ihrer Verankerung in der Zellmembran. Beim aktivierenden FcγRIIIA handelt es sich um ein Transmembranprotein [37], wogegen FcγRIIIB über Glykosylphosphatidylinositol (GPI) an die Zellmembran assoziiert ist [37]. Analog zu den murinen FcγR, sind die humanen aktivierenden FcγRIA und FcγRIIIA mit der Fcγ Signalkette assoziiert. Diese Interaktion ist sowohl für die Oberflächenexpression als auch für die Funktionalität der Rezeptoren essentiell [38-40] (Abb. 2B). 2. Induktion von Antikörpereffektorfunktionen Antikörpereffektorfunktionen werden durch die Bindung von IgG-Immunkomplexen an FcγR induziert. Diese Interaktion führt zu einer Kreuzvernetzung der FcγR, gefolgt von der Rekrutierung in lipid rafts. Bei der Bindung an aktivierende FcγR folgt die Phosphorylierung des intrazellulären ITAM [41]. Die dadurch ausgelöste Signaltransduktionskaskade führt letztlich zur Freisetzung von Kalzium [42-44]. Je nach betroffener Effektorzelle kommt es zur Phagozytose des Immunkomplexes, der Präsentation des aufgenommenen Antigens durch MHCII-Komplexe, zur Freisetzung von Zytokinen, zur Proliferation oder Reifung der betroffenen Zelle oder zur Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) [6, 5 Einleitung 45, 46]. Bei Kreuzvernetzung des inhibitorischen FcγRIIB kommt es dagegen zur Phosphorylierung des ITIM. Dies induziert eine Signalkaskade, die die Signale der aktivierenden FcγR hemmt [47] (Abb. 3). Die meisten Immunzellen, wie z.B. Makrophagen, exprimieren sowohl aktivierende wie auch inhibitorische FcγR, wohingegen B-Zellen nur den inhibitorischen FcγRIIB und NK-Zellen nur den aktivierenden FcγRIII besitzen. Die Koexpression aktivierender und inhibitorischer Rezeptoren beeinflusst maßgeblich Antikörper-induzierte Effekte wie z.B. die Zerstörung von Tumorzellen durch ADCC in vivo [48] oder die Hemmung der Antikörperproduktion durch negative Rückkoppelung [49]. Ein Fehlen von inhibitorischen Signalen führt weiterhin zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen [50]. Daher ist eine Balance zwischen aktivierenden und hemmenden FcγR-Signalen essentiell für die Regulation der Immunantwort und die Erhaltung immunologischer Toleranz. Abb. 3: Die Kreuzvernetzung von FcγR durch IgG-Immunkomplexe induziert Antikörpereffektorfunktionen in Abhängigkeit von der Effektorzelle. Die Koexpression und Kreuzvernetzung des inhibitorischen FcγRIIB dämpft die aktivierende ITAMSignaltransduktion und bestimmt damit die Schwelle für die Immunzellaktivierung. 3. Einfluss der IgG Glykosylierung auf die FcγR Interaktion Einen wesentlichen Einfluss auf die Interaktion von IgG mit FcγR hat die N-Glykosylierung am Asparagin 297 (N297) in der CH2 Domäne der schweren Ketten. Änderungen an ihrer Zusammensetzung wirken sich auf die Konformation des Fc Fragments und damit auf seine Funktionalität aus [51]. Dies bestätigen Analysen bei denen durch Behandlung von IgG Molekülen mit verschiedenen Glykosidasen die Zuckerketten entfernt werden. Beispielsweise hydrolysiert die Peptid:N Glykosidase F (PNGaseF) aus Flavobacterium meningosepticum die Verknüpfung der Zuckerkette mit Asparagin-Resten wie dem N297 [52]. Alternativ schneidet die Endoglykosidase S (EndoS) aus Streptococcus pyogenes nach N-Acetyl-Glucosamin-Resten innerhalb der Zuckerketten [53] (Abb. 4). In mehreren Studien wurde gezeigt, dass die N297-Glykosylierung die Affinität für die FcγR in vitro und die Wirkung von IgG Molekülen in vivo bestimmt. So führt die Deglykosyslierung 6 Einleitung von IgG Antikörpern mit EndoS zu einer reduzierten Bindung an murine und humane FcγR in vitro [54, 55]. Die EndoS-Behandlung verursacht außerdem eine Dissoziation der IgG-FcγR Interaktion [1, 55]. In verschiedenen experimentellen Modellen IgG-vermittelter Autoimmunität wurde durch die Deglykosylierung der IgG mit EndoS eine Besserung der klinischen Parameter in vivo erreicht [1, 54]. Eine verminderte Interaktion des humanen IgG1 mit humanen FcγR wurde auch erzielt, indem das N297 durch ein Alanin ersetzt wurde [56]. Abb. 4: Variante der IgG Glykosylierung an Aminosäure Asparagin 297 der schweren Ketten. (adaptiert nach [1]). Eine Behandlung der IgG mit den Enzymen EndoS bzw. PNGaseF trunkiert die Glykosylierung an den markierten Positionen. (NANA, N-Acetyl-Neuraminsäure; Gal, Galaktose; GlcNAc , N-Acetyl-Glucosamin; Man, Mannose; Fuc, Fucose) 4. Polymorphismen von humanen FcγR Die in vivo Wirkung von Antikörpern wird nicht nur durch unterschiedliche Affinitäten der FcγR für die IgG Subtypen oder durch das Expressionsniveau der aktivierenden und inhibitorischen FcγR bestimmt. Polymorphismen in den kodierenden Genen beeinflussen ebenfalls die Funktionalität der FcγR. So sind für das FcγRIIB-Gen zwei Polymorphismen bekannt. Ein Polymorphismus im Promotor verursacht die verminderte Transkription des Rezeptors [57]. Die Rekrutierung des kreuzvernetzten FcγRIIB in lipid rafts wird dagegen durch eine Mutation in der Transmembranregion verhindert [58]. Beide Polymorphismen führen zu einer verminderten FcγRIIB-Signaltransduktion. In den Genen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA sind ebenfalls Polymorphismen publiziert. Für den humanen aktivierenden FcγRIIA ist eine Punktmutation von Guanin zu Alanin in der zweiten IgG-bindenden extrazellulären Domäne beschrieben. Diese Mutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Arginin zu Histidin an Position 131 [59]. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Affinität für IgG1 Antikörper der Maus werden die beiden Varianten als low responder (LR, FcγRIIA131H), die nur schwach mit den Maus-IgG interagieren, bzw. high responder (HR, FcγRIIA131R), die dagegen eine hohe Affinität für die Maus-IgG aufweisen, bezeichnet [60]. Die so beschriebenen polymorphen FcγRIIA unterscheiden sich aber zusätzlich in einem weiteren Aminosäureaustausch von Glutamin zu Tryptophan an Position 27 [61]. Um die Bindung der humanen IgG in Abhängigkeit des FcγRIIA131H/R 7 Einleitung Polymorphismus zu untersuchen wurden surface plasmon resonance (SPR) Affinitätsstudien durchgeführt. Der FcγRIIA131H/R Polymorphismus scheint keinen Einfluss auf die Affinität für humanes IgG3 und IgG4 zu haben. Allerdings binden humane IgG1 und IgG2 Antikörper stärker an die FcγRIIA131H-Variante. Zudem interagiert dieser hochaffine FcγRIIA131H verstärkt mit therapeutischen anti-CD20 Antikörpern [62]. In der Sequenz des humanen aktivierenden FcγRIIIA verursacht die Punktmutation von Thymin zu Guanin in der zweiten extrazellulären Domäne einen Aminosäureaustausch von Phenylalanin zu Valin an Position 158. In vitro Experimente zeigen eine verbesserte Interaktion von FcγRIIIA158V mit IgG1 und IgG3. Dies führt zur Freisetzung von intrazellulärem Kalzium, einer verstärkten Aktivierung von NK-Zellen und einer Induktion der ADCC. Im Gegensatz zu FcγRIIIA158F, ist FcγRIIIA158V in der Lage mit IgG4 zu interagieren [63-65]. Die Bestimmung der Bindungskonstanten zeigt eine erhöhte Affinität von FcγRIIIA158V für alle humanen IgG Isotypen [62]. Im Gegensatz dazu ist die Beseitigung IgG3-gebundener Erythrozyten durch FcγRIIIA158V exprimierende Monozyten in vivo vermindert [66]. Die beschriebenen funktionellen Polymorphismen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA wirken sich auf die in vitro Bindung von IgG aus. Um ihren Einfluss auf Antikörper-vermittelte Effekte wie z.B. die IgG-induzierte Immunabwehr von Infektionen, der therapeutischen Anwendung von IgG oder der Entstehung IgG-induzierter Autoimmunerkrankungen in vivo zu ermitteln, wurden epidemiologische Studien durchgeführt. In einer Studie ist die niedrigaffine Variante des FcγRIIA131R mit einer größeren Empfindlichkeit gegen bakterielle Atemwegsinfektionen assoziiert, da IgG2-opsonisierte Bakterien schlechter phagozytiert werden können [67]. Die Wirkung monoklonaler Antikörper z.B. des anti-CD20 IgG1 Rituximab zur Therapie des follikulären Non-Hodgkin Lymphoms wird positiv durch FcγRIIIA158V beeinflusst [68]. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern in vitro Analysen, bei denen Rituximab mit höherer Affinität an FcγRIIIA158V bindet. Die Zahl FcγRIIIA exprimierender Effektorzellen in vivo wird nicht durch den Polymorphismus beeinflusst [69]. Weiterhin scheint ein erhöhtes FcγRIII-Expressionsniveau bei FcγRIIIA158V in vivo die verbesserte Bindung von Rituximab und als Folge dessen eine verstärkte ADCC zu verursachen [70]. Auch die biologische Wirksamkeit anderer therapeutischer Antikörper wie z.B. des anti-epidermal growth factor receptor IgG1 Cetuximab wird von Polymorphismen der aktivierenden FcγR beeinflusst. Während sich die hochaffine Variante von FcγRIIA131H positiv auf den Therapieerfolg auswirkt, hat der hochaffine FcγRIIIA158V einen negativen Einfluss [71]. Auch die Anwendung des anti-TNFα IgG1 Infliximab führt bei Expression von FcγRIIIA158F zu einem besseren therapeutischen Verlauf [72]. Bei anderen Erkrankungen oder therapeutischen Antikörpern scheinen die FcγR Polymorphismen dagegen keinen Einfluss zu haben [73, 74]. 8 Einleitung Neben ihren Effekten auf die Immunabwehr und auf monoklonale Antikörpertherapien sind die beiden Polymorphismen in unterschiedlichen epidemiologischen Studien außerdem mit der Entstehung und dem Schweregrad von Autoimmun- und anderen Entzündungserkrankungen assoziiert. Ein Beispiel hierfür ist die Rheumatoide Arthritis (RA), eine systemische Autoimmunerkrankung, die durch die entzündliche Schwellung von Gelenken gekennzeichnet ist. In starker Abhängigkeit von der untersuchten Bevölkerungsgruppe ist entweder das niedrigaffine [75] oder das hochaffine Allel [76, 77] des FcγIIIA mit dem Erkrankungsrisiko für RA assoziiert. Der FcγRIIA131H/R Polymorphismus scheint dagegen nicht für das Auftreten [78] sondern eher für den Krankheitsverlauf der RA bestimmend zu sein [79] auch wenn das gemeinsame Auftreten von FcγRIIA131H und FcγRIIIA158V das Risiko an RA zu erkranken erhöht [80]. Sowohl FcγRIIA131R [79] als auch FcγRIIIA158V [81] exprimierende Patienten zeigen einen deutlich schwereren Verlauf der Erkrankung. Eine weitere IgG-vermittelte Autoimmunerkrankung ist der Systemische Lupus Erythematodes (SLE). Eine mögliche Ursache von SLE scheinen Defekte bei der Makrophagen-vermittelten Phagozytose zu sein. Dadurch kommt es zur Ablagerung von Immunkomplexen im Gewebe, die die Einwanderung von Immunzellen und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren verursachen [82]. In der europäischen Bevölkerung besteht ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von SLE und der FcγRIIIA158F-Variante [83]. FcγRIIA131R scheint dagegen ein Risikofaktor für die Entstehung einer Lupus-Nephritis oder der Produktion von Autoantikörpern zu sein [84, 85]. Auch der niedrigaffine FcγRIIIA158F wird mit einem schlechteren klinischen Phenotyp der SLE in Verbindung gebracht [86]. Bei der Untersuchung anderer IgG-vermittelter Erkrankungen zeigt die niedrigaffine FcγRIIA Variante einen negativen Einfluss bei der Heparin-induzierten Thrombozytopenie [87], bei der Entwicklung von Myasthenia gravis [88] und Riesenzell-Arterititis [78]. Außerdem verstärken FcγRIIA131R und FcγRIIIA158V den Schweregrad der IgA Nephropathie [89]. Auch wenn die Daten auf eine verstärkte Bindung von monomeren IgG und Immunkomplexen an die hochaffinen Rezeptorvarianten hindeuten, lassen die zum Teil widersprüchlichen Ergebnisse epidemiologischer Studien keinen Schluss auf die tatsächliche Bedeutung der FcγR Polymorphismen für Antikörper-vermittelte Effekte in vivo zu. 9 Einleitung II. Untersuchungen in humanisierten Mausmodellen Humanisierte Mausmodelle dienen der Untersuchung von komplexen Fragestellungen, die in vitro oder in klassischen Mausmodellen nur unzureichend beantwortet werden können. Beispiele hierfür sind die Untersuchungen zur Entwicklung und Funktionsweise des menschlichen Immunsystems oder die Pathogenese von Infektions- und anderen humanen Erkrankungen. Eine Humanisierung wird durch die Ausstattung der Mäuse mit humanen Zellen oder Genen erreicht, wobei in dieser Arbeit der Fokus auf zellulär humanisierten Mausmodellen liegen soll. In den letzten Jahren konnten verschiedene für entsprechende Fragestellungen optimierte Modelle entwickelt werden. 1. Generierung humanisierter Mausmodelle Die Grundlage für die Etablierung humanisierter Mausmodelle war die Entdeckung der severe combined immunodeficiency (scid) Mutation in Mäusen [90]. Diese Mutation der DNA-abhängigen Proteinkinase p350 führt zu einer Blockade der Lymphozyten- Differenzierung und somit zu einer ausgeprägten Immundefizienz. Die Ursache hierfür liegt in der essentiellen Rolle von p350 bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen wie sie z.B. bei der Rekombination der B- und T-Zell-Rezeptoren vorkommen [90-92]. Nach Übertragung von isolierten hämatopoetischen Zellen in scid Mäuse kommt es zunächst zur Proliferation und Differenzierung humaner Immunzellen in vivo [93, 94]. Eine länger anhaltende Repopulierung des murinen Knochenmarks wird dagegen durch den Transfer von Zellen aus Nabelschnurblut erreicht [95]. Die Weiterentwicklung des scid Mausmodells erfolgte durch die Übertragung der Mutation auf diabetis-susceptible nonobese diabetic (NOD) Mäuse. Der resultierende Stamm zeichnet sich durch eine reduzierte Aktivität von NK-Zellen, Makrophagen und des Komplementsystems aus [96]. Rekonstituierte NOD/scid Mäuse zeigen einen 5-10fachen Anstieg des Anteils humaner Zellen in der Milz [97]. Allerdings weisen diese Mäuse auch eine erhöhte Inzidenz von Lymphomen auf [98]. Zusätzlich ist ihre Verwendung in der biomedizinischen Forschung vor allem durch die sporadische und verzögerte Entwicklung von funktionellen Lymphozyten und der vorhandenen Restaktivität des angeborenen Immunsystems limitiert [96]. Der negative Einfluss von NK-Zellen auf den adoptiven Transfer humaner Zellen führte zur zusätzlichen Deletion des β2 Mikroglobulin Gens [99] bzw. der gemeinsamen Signalkette der Rezeptoren für Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-7, IL-9 und IL-15. Diese sog. γc Kette ist für die NK-ZellEntwicklung essentiell [70, 100]. Die so erzeugten Mausstämme zeigen nicht nur eine verbesserte Lebenserwartung. Die transferierten humanen Zellen differenzieren auch in alle hämatopoetischen Linien [101]. Als Alternative zu NOD/scid/γc-/- Mäusen wurde ein weiterer immundefizienter Mausstamm generiert, der sich durch das vollständige Fehlen aller 10 Einleitung Lymphozyten - B-, T- und NK-Zellen - auszeichnet. Verursacht wird dieser Phänotyp durch das Fehlen des recombinase activating gene 2 (RAG2) und die zusätzliche Deletion der IL2R γc Kette. Durch Verwendung von Rag2/γc-/- Mäusen konnte die Humanisierungseffizienz im Vergleich zu NOD/scid Mäusen ebenfalls gesteigert werden [102]. Neben dem verwendeten Mausstamm gibt es weitere Faktoren, die das Anwachsen der humanen Immunzellen beeinflussen. Die Effizienz wird z.B. durch die Art der transplantierten Zellen bestimmt. Humanisierte Mäuse lassen sich mit hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmark [103], aus der fötalen Leber, Thymus bzw. Lymphknoten [93] oder aus dem peripheren Blut [94] rekonstituieren. Die besten Ergebnisse werden jedoch durch Injektion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSC) aus Nabelschnurblut erzielt [104]. Die CD34+ Zellen nisten sich dauerhaft im murinen Knochenmark ein [95], das daraufhin zum primären Ort der humanen Hämatopoese wird. Reife Zellen wandern schließlich in die Peripherie aus [105]. Der Transfer von CD34+ Zellen führt zu einer dem menschlichen Immunsystem entsprechenden Entwicklung funktioneller Lymphozyten, dendritischer Zellen, Monozyten, Erythrozyten und Thrombozyten [101, 104, 106]. Weiterhin kann die Humanisierungseffizienz durch Transplantation neugeborener, anstelle adulter Mäuse [104, 107] und die Bestrahlung der Mäuse [95, 105] vor der Zellinjektion gesteigert werden. Auch die Art der Injektion beeinflusst die Humanisierung. Die Zellen können intravenös [96, 102], intrafemural [108] oder intraperitoneal [109] in adulte Mäuse transferiert werden. Zur Differenzierung humaner Immunzellen kommt es auch nach der in uteri Applikation der humanen Zellen [110]. Die Rekonstitution neugeborener Mäuse kann durch intrahepatische [107] oder intravenöse Injektion in die Gesichtsvene [104] erreicht werden. Letzteres führt zu einem besonders effizienten Anwachsen des humanen Immunsystems. 2. Humanisierte Forschung Mausmodelle in der biomedizinischen Humanisierte Mausmodelle in ihren verschiedenen Formen werden in vielen Gebieten der biomedizinischen Forschung angewendet. Mit ihrer Hilfe können die Entwicklung des Immunsystems, die Pathogenese von Infektions- und anderen Erkrankungen oder auch die Wirkung von potentiellen Therapeutika in vivo untersucht werden. Besonders bei der Untersuchung der Pathogenese humanspezifischer Krankheitserreger wie beispielsweise dem Dengue-Virus [111] oder Humanen Immundefizienz Virus (HIV) [112] haben Mausmodelle, die mit einem humanen Immunsystem ausgestattet sind, eine große Bedeutung. Auch die Entwicklung von Therapeutika z.B. gegen Mycobacterium tuberculosis [113] und HIV [114] wird durch humanisierte Mausmodelle vereinfacht. Humanisierte Mäuse eignen sich auch für die Analyse der Wirkmechanismen und potentieller Nebenwirkungen neuer Medikamente wie z.B. therapeutischer Antikörper vor der Anwendung im Menschen 11 Einleitung [115, 116]. Ein weiteres Forschungsfeld ist die Entwicklung von zellbasierten Therapien für Typ-1-Diabetis [117] oder Lebererkrankungen [118] und die Weiterentwicklung der Gentherapie z.B. bei der Fanconi-Anämie [119]. Natürlich können humanisierte Mausmodelle auch genutzt werden um die Pathogenese von humanen Erkrankungen wie der Spinalen Muskelatrophie [120], der Rheumatoiden Arthritis [121] oder Typ-1-Diabetis [122] zu untersuchen. Weiterhin können Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen, die sog. graft versus host disease (GVHD), in ihnen gut abgebildet werden [123]. Auch für die Tumorforschung haben humanisierte Mausmodelle eine große Bedeutung erlangt. So werden in xenotransplantierten Mäusen der Einfluss von Onkogenen [124] oder anderen kanzerogenen Faktoren wie ultraviolettem Licht [125] untersucht oder Medikamente auf ihre Wirksamkeit überprüft [126]. Zusammenfassend werden humanisierte Mausmodelle heute vielseitig angewendet, nicht nur um die humane Hämatopoese, sondern v.a. auch um human-spezifische Krankheitsprozesse in vivo zu untersuchen. Hierbei sind sie in vitro Studien und herkömmlichen Mausmodellen überlegen. Das variable Anwachsen der humanen Zellen schränkt ihre Anwendung allerdings weiterhin ein. Auch das Fehlen der humanen Umgebung in Form von Zytokinprofilen und Stromazellen für die Differenzierung in ein vollständiges, funktionelles Immunsystem und die verbleibende Aktivität der Maus-Immunzellen ist problematisch. Die Zielstellung dieser Arbeit besteht in der Analyse von Einflussfaktoren auf die Interaktion von humanen IgG und FcγR in vivo. Diese Untersuchungen werden zusätzlich durch die Anwesenheit der murinen FcγR-exprimierenden Immunzellen, die ebenfalls mit humanem IgG interagieren, kompromittiert. Daher ist es essentiell neue humanisierbare Mausstämme herzustellen, die eine Untersuchung der Mechanismen der Aktivität humaner IgG Antikörper in vivo erlauben. 12 Fragestellung C. Fragestellung In Form von Immunkomplexen binden Antikörper vom Immunglobulin G Isotyp an FcγRezeptoren (FcγR) auf den Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems. Diese Interaktion löst Antikörpereffektorfunktionen wie z.B. die Antikörper-induzierte Zell-vermittelte Zytotoxizität (ADCC), die Phagozytose von Immunkomplexen oder die Freisetzung von Sauerstoffradikalen und Zytokinen aus. Aufgrund von Versuchsdaten in Mausmodellsystemen wird angenommen, dass die Intensität dieser Effektorantworten von der Stärke der Bindung der IgG Subklassen an verschiedene FcγR abhängig sein könnte. Im Rahmen dieser Dissertation sollte untersucht werden, ob ähnliche Einflussfaktoren die Interaktion von humanen IgG Subklassen mit humanen FcγR in vitro und in vivo beeinflussen. Einen indirekten Hinweis für einen solchen Zusammenhang geben epidemiologische Studien, die vermuten lassen, dass Polymorphismen der humanen FcγR, die zu einer veränderten Affinität zu bestimmten IgG Subklassen führen, mit der Aktivität bestimmter therapeutischer Antikörper korrelieren. Um diese Fragestellung zu beantworten, sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob die Größe und die Glykosylierung von humanen Immunkomplexen einen Einfluss auf die Interaktion mit humanen FcγR in vitro haben. Darauf aufbauend sollte im zweiten Teil der Arbeit ein neues Maus-Modellsystem etabliert werden, in dem der Einfluss der Polymorphismen in den aktivierenden FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V auf Antikörpervermittelte Effektorfunktionen in vivo untersucht werden kann. 13 Ergebnisse D. Ergebnisse I. Bindung von Immunkomplexen an FcγR in vitro Im ersten Teil der Arbeit wurde die Bindung von humanem Immunglobin G (IgG) an die humanen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) untersucht. Insbesondere wurde analysiert, inwiefern die Größe und die Glykosylierung von Immunkomplexen die FcγR Bindung beeinflussen. 1. Herstellung von anti-TNP IgG Subtypen (Klon 7B4) Um die Bindung von humanen IgG an FcγR zu untersuchen, erfolgte zunächst die Klonierung des gegen das Hapten 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP) gerichteten Antikörpers 7B4. Hierzu wurde aus der Hybridomzelllinie 7B4 die Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und einer 5´-RACE unterzogen. Mit dieser Methode konnten die variablen Regionen der schweren und leichten Kette, trotz ihrer unbekannten Sequenz, bestimmt werden (Sequenz siehe Anhang). Die so erhaltenen VH und VL Domänen wurden dann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) an die konstanten Domänen (CH bzw. CL) der humanen IgG Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 fusioniert und in Expressionsvektoren kloniert. Durch transiente Transfektion der erhaltenen Konstrukte in HEK293T Zellen und die anschließende Aufreinigung aus dem Zellkulturüberstand mithilfe von Protein G erhielt man die entsprechenden Antikörper. Die Integrität und Reinheit der produzierten Antikörper wurde mittels reduzierender Polyacrylamid (PAA)-gelelektrophorese nachgewiesen. Durch Reduktion der Disulfidbrücken wurden die zwei schweren Ketten mit einer Größe von ca. 55kDa von den zwei leichten Ketten mit einer Größe von etwa 30kDa getrennt. Eine Ausnahme bildete hier IgG3 dessen schwere Kette aufgrund einer verlängerten hinge Region eine Größe von ca. 60kDa aufweist. Wie in Abb. 5A zu sehen ist, zeigten sich nach Auftrennung von je 2µg Protein und Färbung mit Coomassie Blau die Fragmente der schweren bzw. leichten Ketten in den erwarteten Größen. Bei IgG2 war die Bandenintensität merklich vermindert, obwohl die gleiche Menge Protein aufgetrennt wurde. Bei allen vier Proben war keine Degradation der Antikörper oder eine Verunreinigung durch andere Proteine sichtbar. Die Erkennung der hergestellten Antikörper durch einen Sekundärantikörper, der gegen humanes IgG gerichtet ist, wurde in enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA) überprüft. Die Vertiefungen einer ELISA-Platte wurden mit je 50ng IgG beschichtet und anschließend mit einem Merretichperoxidase (HRP)-gekoppelten, Fc-spezifischen Antikörper detektiert. Die gemessene optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450nm betrug, nach Abzug des Hintergrundes bei einer Wellenlänge von 650nm, im Mittel von 3 unabhängigen Experimenten 0,75±0,08 für IgG1, 0,69±0,08 für IgG2, für IgG3 0,68±0,12 und 15 Ergebnisse für IgG4 0,58±0,9. Im ELISA konnte demnach keine unterschiedliche Erkennung der verschiedenen IgG Subklassen durch den Sekundärantikörper festgestellt werden (Abb. 5B). Abb. 5: Humane anti-TNP IgG Varianten (Klon 7B4). Die variablen Regionen des HybridomAntikörpers 7B4 wurden kloniert und an die humanen konstanten IgG Regionen fusioniert. A) Gelektrophoretische Auftrennung der produzierten 7B4 IgG1-4 unter reduzierenden Bedingungen. Die Proteine wurden durch Anfärbung mit Coomassie Blau sichtbar gemacht. B) ELISA zur Kontrolle vergleichbarer Erkennung der IgG Subklassen durch den Sekundärantikörper (anti-human IgG-HRP). C) Analyse der Bindung von 7B4 IgG1-4 an TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA mittels ELISA. Nicht nur die Integrität der produzierten Antikörper ist für die Herstellung von Immunkomplexen relevant sondern auch eine vergleichbare Bindung des entsprechenden Antigens - in diesem Fall TNP. Diese Bindung wurde für die produzierten 7B4 IgG in einem ELISA bestimmt. Hierfür wurden jeweils 100ng TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA pro Vertiefung einer ELISA-Platte beschichtet und anschließend mit 1ng IgG1-4 inkubiert. Der Nachweis des gebundenen IgG erfolgte mittels einem HRP-konjugiertem, Fc-spezifischen Antikörpers und Bestimmung der OD bei 450nm. Im ELISA konnte eine signifikant verstärkte TNP-4BSA-Bindung von IgG1 (0,65±0,07) im Vergleich zu IgG2 (0,18±0,09) und IgG4 (0,29±0,04) gemessen werden. Auch IgG3 (0,55±0,07) interagierte signifikant besser mit TNP-4-BSA als IgG2 und IgG4. Die Bestimmung der Bindung an TNP-26-BSA zeigte ebenfalls eine signifikant verbesserte Interaktion von IgG1 (0,64±0,15) im Vergleich zu IgG2 (0,14±0,01) und IgG4 (0,25±0,05). Die Bindung von IgG3 war an TNP-26-BSA (0,37±0,07) in Bezug auf TNP-4-BSA signifikant vermindert. Die anderen IgG Subtypen interagierten vergleichbar mit TNP-4-BSA und TNP-26-BSA (Abb. 5C). 2. Stabile Expression von humanen FcγR in CHO Zellen Die humanen Fc Rezeptoren, FcγRIA, die beiden Varianten des FcγRIIA (131H bzw. 131R) und der inhibitorische FcγRIIB wurden von Frau Anne Bärenwaldt kloniert, stabil in CHO Zellen exprimiert und für diese Experimente zur Verfügung gestellt. Ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen von FcγRIIIA und den Membran-eingelagerten und 16 Ergebnisse intrazellulären Bereichen von FcγRIIB (in dieser Arbeit kurz eFcγRIIIA), welches ebenfalls stabil auf der Oberfläche von CHO Zellen exprimiert wird, wurde von Herrn Jeffrey Ravetch (New York, USA) bereit gestellt. Abb. 6: Stabile Expression der humanen FcγR in CHO Zellen. A) Histogrammdarstellung der durchflusszytometrischen Analyse der FcγR-Expression. B) Quantifizierung des Anteils FcγRexprimierender Zellen aus 3 unabhängigen Experimenten. Die Kontrolle der Oberflächenexpression der einzelnen stabilen Klone erfolgte per Durchflusszytometrie mithilfe von FcγR-spezifischen Antikörpern. Abb. 6A zeigt exemplarisch die Fluoreszenzintensität der Expression, während in Abb. 6B der Anteil FcγR positiver Zellen an der Gesamtpopulation in 3 unabhängigen Experimenten dargestellt ist. In den entsprechenden Zelllinien exprimierten 85,6%±6,5 (FcγRIA), 75,8%±1,2 (FcγRIIA131H), 94,3%±1,6 (FcγRIIA131R), 96,1%±1,6 (FcγRIIB) und 96,1%±2,0 (eFcγRIIIA) der Zellen den jeweiligen FcγR. Eine Verunreinigung der Zelllinien mit den anderen stabilen Klonen war nicht zu beobachten. 3. Bindung von Immunkomplexen an FcγR Mithilfe der FcγR exprimierenden CHO Zellen wurde die Bindung der verschiedenen humanen IgG Subtypen an FcγR in vitro untersucht. Durch Herstellung der Immunkomplexe mit TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA konnte außerdem der Einfluss der Größe dieser Immunkomplexe auf die Bindung analysiert werden. Nach der Inkubation der Immunkomplexe mit den FcγR exprimierenden CHO-Zellen erfolgte die Detektion der gebundenen Immunkomplexe per Durchflusszytometrie mittels gegen den Fc Teil der 7B4 IgG Varianten gerichteter Phycoerythrin (PE)-konjugierter Antikörper. Abb. 7 zeigt die arithmetischen Mittelwerte der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) aus 3 unabhängig durchgeführten Experimenten. 17 Ergebnisse Abb. 7: In vitro Bindungsanalyse humaner IgG Immunkomplexe an stabil exprimierte FcγR. Immunkomplexe wurden aus 7B4 IgG und TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA generiert und ihre Bindung an untransfizierte (A) und mit FcγRIA (B), FcγRIIA131H (C), FcγRIIA131R (D), FcγRIIB (E) und eFcγRIIIA (F) stabil transfizierte CHO Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. Gezeigt sind die arithmetischen Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten. Der Hintergrund der Bindung von TNP-4-BSA Immunkomplexen an untransfizierte CHOZellen lag bei Fluoreszenzintensitäten von 4,2±0,6 (IgG1), 7,8±1,9 (IgG2), 4,4±0,9 und 14,1±18,2. Bei Untersuchung von TNP-26-BSA Immunkomplexen erhöhte sich der Hintergrund auf 16,6±6,1 (IgG1), 21,3±14,6 (IgG2), 16,4±7,7 (IgG3) bzw. 19,0±7,1 (IgG4). Für IgG1 war dieser Anstieg signifikant. Allerdings blieben die gemessenen Werte deutlich unter den Werten einer spezifischen Interaktion (Vgl. Abb. 7A mit 7B-F). An FcγRIA exprimierende Zellen banden die getesteten IgG Subtypen vergleichbar stark. Es gab keine signifikante Veränderung der Fluoreszenzintensitäten bei Verwendung von TNP-4BSA oder TNP-26-BSA. Mit MFI-Werten für IgG1 von 87,9±27,4 im Komplex mit TNP-4-BSA bzw. 139,3±54,7 im Komplex mit TNP-26-BSA, für IgG2 von 103,4±58,5 (TNP-4-BSA) bzw. 100,4±50,8 (TNP-26-BSA), für IgG3 von 109,0±54,0 (TNP-4-BSA) bzw. 144,7±60,0 (TNP-26BSA) und IgG4 97,2±57,2 (TNP-4-BSA) bzw. 142,6±54,7 (TNP-26-BSA) war eine deutlich verstärkte Bindung im Vergleich zu untransfizierten Zellen zu erkennen (Abb. 7B). 18 Ergebnisse Bei der Bindung an die hochaffine Variante des FcγRIIA (FcγRIIA131H) für IgG2 wurden signifikante Unterschiede sowohl für die unterschiedlichen IgG Subtypen als auch für die Verstärkung der Interaktion in Abhängigkeit von der Immunkomplexgröße deutlich. Sowohl IgG1-TNP-4-BSA (147,3±19,9) als auch IgG1-TNP-26-BSA (325,3±62,0) Immunkomplexe banden signifikant besser an FcγRIIA131H als IgG2-TNP-4-BSA (41,3±1,7) bzw. IgG2-TNP26-BSA (78,3±8,1) Immunkomplexe. Ebenfalls signifikant im Vergleich zu IgG2 war die stärkere Bindung von IgG3. Komplexe von IgG3 mit TNP-4-BSA banden mit einer Fluoreszenzintensität von 122,7±29,9, die durch Verwendung von TNP-26-BSA noch auf 479,0±35,4 gesteigert wurde. Im Vergleich zu IgG1 und IgG3 TNP-4-BSA Immunkomplexen zeigten IgG4 Immunkomplexe eine signifikant schwächere FcγR-Bindung. Mit TNP-4-BSA wurden MFI-Werte von 43,5±6,4, mit TNP-26-BSA von 252,7±68,4, erzielt. Ein ähnliches Ergebnis wurde für TNP-26-BSA Immunkomplexe erhalten. Alle mit TNP-26-BSA komplexierten IgG interagierten signifikant besser mit FcγRIIA131H als die jeweiligen TNP-4BSA Immunkomplexe (Abb. 7C). Die Fluoreszenzintensitäten für die Immunkomplexbindung an die niedrigaffine Variante des FcγRIIA (FcγRIIA131R) waren allgemein niedriger als bei den anderen untersuchten FcγR. Besonders schwach war die Bindung von TNP-4-BSA Immunkomplexen. Sie bewegte sich für IgG2 (13,3±4,9) und IgG4 (9,3±2,8) im Bereich der Hintergrundbindung an untransfizierte CHO Zellen. Die mittlere Bindung von IgG1 betrug 37,1±12,9 und war damit signifikant höher als die Bindung von IgG2 und IgG4. Zu IgG3 (61,6±33,8) gab es keine signifikanten Differenzen. Mit TNP-26-BSA erzeugte Komplexe banden bei allen Isotypen besser an FcγRIIA131R aber nur für IgG1 war der Unterschied signifikant. IgG1- (153,3±66,5) und IgG3TNP-26-BSA (203,0±107,1) Immunkomplexe banden signifikant besser als IgG2-TNP-26BSA (20,2±7,9) Immunkomplexe. IgG4 (43,8±23,8) band im Komplex mit TNP-26-BSA zwar besser als IgG2 aber immer noch sehr schwach. An den niedrigaffinen inhibitorischen FcγRIIB, der an Aminosäureposition 131 ebenfalls ein Arginin trägt, banden die Immunkomplexe in einem ähnlichen Muster wie an FcγRIIA131R. TNP-4-BSA Immunkomplexe mit IgG1 (14,2±5,5), IgG2 (4,8±1,3), IgG3 (31,6±19,4) oder IgG4 (9,6±4,3) interagierten kaum stärker mit der stabil exprimierenden Zelllinie als mit den untransfizierten Kontrollzellen. Im Unterschied dazu kam es zu einer signifikant verbesserten FcγR-Interaktion bei Verwendung von TNP-26-BSA auf 86,3±38,7 (IgG1), 10,4±0,9 (IgG2) und 44,2±16,6 (IgG4). Die Fluoreszenzintensität von IgG3 (125,5±89,8) Immunkomplexen war dagegen nur leicht erhöht. Betrachtet man die einzelnen Isotypen, so zeigte sich eine signifikante Steigerung der Immunkomplexbindung für IgG1 und IgG4 im Vergleich zu IgG2. Das aus den extrazellulären Domänen von FcγRIIIA und den Transmembran- und intrazellulären Sequenzen von FcγRIIB bestehende Fusionsprotein (eFcγRIIIA) band nach 19 Ergebnisse Expression in CHO Zellen, im Vergleich zu den anderen getesteten FcγR, am stärksten an TNP-4-BSA Immunkomplexe. Nur bei IgG3 und IgG4 war eine weitere signifikante Verbesserung der Bindung durch Verwendung von TNP-26-BSA zu erreichen. TNP-4-BSA (IgG1: 262,7±21,1, IgG3: 237,7±22,6) wie auch TNP-26-BSA (IgG1: 287,3±30,9, IgG3: 364,7±53,5) enthaltende Immunkomplexe zeigten erneut eine höhere Fluoreszenzintensität als die jeweiligen IgG2 (87,4±18,4 für TNP-4-BSA, 91,0±17,4 bei TNP-26-BSA) Komplexe. IgG4-TNP-4-BSA Immunkomplexe (67,4±8,7) banden signifikant schwächer als die entsprechenden Immunkomplexe für IgG1 und IgG3. Mit TNP-26-BSA komplexiertes IgG4 (255,0±35,8) zeigte zwar eine signifikant verminderte Bindung bezogen auf IgG3, interagierte aber signifikant besser mit eFcγRIIIA als IgG2. Diese Experimente weisen auf eine bessere Interaktion von IgG1 und IgG3 Immunkomplexen mit den niedrigaffinen humanen FcγR hin. Die Verwendung von TNP-26BSA im Gegensatz zu TNP-4-BSA führt zu Immunkomplexen die i.A. verstärkt an FcγR binden können. Der hochaffine FcγRIA scheint dagegen keine veränderte Affinität für die einzelnen IgG Subtypen oder Immunkomplexvarianten zu besitzen. 4. Einfluss der N297 Glykosylierung auf die FcγR-Bindung Um den Einfluss der IgG Glykosylierung der schweren Ketten auf die Interaktion mit FcγR zu untersuchen, wurden die Antikörper zunächst mit dem Enzym PNGaseF behandelt, dass die Zuckerketten direkt am Asparagin 297 (N297) hydrolysiert. Die Vollständigkeit dieser Deglykosylierung wurde mittels PAA-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen und anschließendem Lektin Blot unter Verwendung von lens culinaris agglutinin (LCA) kontrolliert. Nach Färbung des PAA-Gels mit Coomassie Blau zeigten sich die schweren Ketten der unbehandelten IgG1, IgG2 und IgG4 bei etwa 55kDa und die schwere Kette von IgG3 bei etwa 60kDa. Die Proteinbanden der PNGaseF behandelten IgG erschienen dagegen bei einem leicht erhöhten Molekulargewicht. Es waren keine Banden auf Höhe der unverdauten schweren Ketten zu sehen. LCA bindet an die Mannose-haltige Zuckerketten, wie sie bei der N297 Glykosylierung der schweren und leichten Ketten auftreten können. Da der 7B4 Antikörper jedoch keine Asparagin gekoppelten Zuckerketten in der leichten Kette enthält, wurden im Lektin Blot nur die schweren Ketten der unbehandelten IgG, nicht aber die leichten Ketten, angefärbt. Nach PNGaseF-Verdau konnten durch LCA keine Zuckerreste detektiert werden. Dies weist auf eine vollständige Hydrolyse hin. Wie am unveränderten Laufverhalten bei der Gelelektrophorese zu sehen war, wurden die leichten Ketten mit einer Größe von etwa 30kDa nicht durch PNGaseF beeinflusst (Abb. 8A). 20 Ergebnisse Abb. 8: Einfluss der N297 Glykosylierung auf die FcγR Bindung der Immunkomplexe in vitro. A) Kontrolle der Deglykosylierung der IgG Subklassen durch PNGaseF mittels reduzierender PAAGelektrophorese gefolgt von Coomassie Blau Färbung bzw. Lektin Blot. B-F) Durchflusszytometrische Analyse der Bindung von TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA Immunkomplexen in Abhängigkeit vom Glykosylierungsstatus. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der PNGaseF-behandelten IgG wurden auf die Werte der unbehandelten IgG normalisiert. Die relative FcγR Bindung [AU] beträgt 1,0 bei einer gleichen Interaktion von verdauten und unverdauten Immunkomplexen. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus je 3 unabhängig durchgeführten Experimenten. Die durch PNGaseF-Behandlung deglykosylierten Antikörper wurden für die Herstellung von Immunkomplexen mit TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA verwendet und die in vitro Bindung an stabil exprimierte FcγR im Vergleich zu unbehandelten IgG Immunkomplexen durchflusszytometrisch bestimmt. Abb. 8B-F zeigen die relativen Mittelwerte der FcγR Bindung aus drei unabhängigen Experimenten, wobei eine relative Bindung von 1,0AU bedeutet, dass es keinen Einfluss der Glykosylierung auf die jeweilige IgG-FcγR Interaktion gab. Wie in Abb. 8B zu sehen ist, wurde die Bindung der humanen IgG1 und IgG3 an den hochaffinen FcγRIA nicht wesentlich von der Deglykosylierung beeinflusst. Nach PNGaseFBehandlung erreichten TNP-4-BSA Immunkomplexe eine Bindung von 0,7AU±0,06 (IgG1) bzw. 0,72AU±0,08 (IgG3). Mit einer reduzierten relativen Signalintensität von 0,25AU±0,02 21 Ergebnisse bzw. 0,45AU±0,09 zeigten IgG2 und IgG4 dagegen eine größere Abhängigkeit von den N297-Zuckerketten. Immunkomplexe, die stattdessen mit TNP-26-BSA generiert wurden, schienen tendenziell besser mit FcγRIA interagieren zu können. Die relativen Werte stiegen auf 0,89AU±0,05 für IgG1, 0,44AU±0,03 für IgG2, 0,97AU±0,08 für IgG3 und 0,65AU±0,04 für IgG4. Jedoch ist dieser Unterschied nur für IgG1 und IgG2 signifikant. Im Gegensatz zu FcγRIA wird die Interaktion der TNP-4-BSA Immunkomplexe mit der hochaffinen Variante des FcγRIIA131H fast vollständig durch Behandlung der IgG mit PNGaseF verhindert. IgG1 Immunkomplexe zeigten nach PNGaseF nur noch eine relative Bindung von 0,01AU±0,0 und IgG2 von 0,05AU±0,01. Auch IgG3 (0,02AU±0,0) und IgG4 (0,06AU±0,04) interagierten praktisch nicht mehr mit FcγRIIA131H. Die Verwendung von TNP26-BSA führte nicht zu einer verstärkten Interaktion. Die relativen Werte stiegen nicht signifikant auf 0,11AU±0,03 (IgG1), 0,19AU±0,08 (IgG2), 0,14AU±0,05 (IgG3) und 0,08AU±0,06 (IgG4) (Abb. 8C). Auch die Interaktion von TNP-4-BSA Immunkomplexen mit dem niedrigaffinen FcγRIIA131R wurde durch Vorbehandlung von IgG1 und IgG3 mit PNGaseF blockiert. So banden verdaute IgG1 mit einer Stärke von 0,08AU±0,01 und IgG3 mit 0,1AU±0,0. IgG2 (0,45AU±0,13) und IgG4 (0,34AU±0,13) zeigten dagegen eine bessere Interaktion. Außer für IgG3, bei dem ein signifikanter Anstieg der relativen Signalintensität auf 0,24AU±0,04 zu beobachten war, verbesserte sich die Interaktion nicht unter Verwendung von TNP-26-BSA. Sie stagnierte bei 0,18AU±0,06 (IgG1), 0,42AU±0,12 (IgG2) bzw. 0,37AU±0,37 (IgG4) (Abb. 8D). Wie in Abb. 8E dargestellt, ist die Affinität von FcγRIIB ebenfalls stark vom Glykosylierungsstatus der IgG abhängig. Unabhängig von der Generierung der Immunkomplexe mit TNP-4-BSA oder TNP-26-BSA zeigten IgG1 (0,11AU±0,02 für TNP-4BSA bzw. 0,22AU±0,06 für TNP-26-BSA), IgG3 (0,11AU±0,02 für TNP-4-BSA bzw. 0,20AU±0,02 für TNP-26-BSA) und IgG4 (0,20AU±0,06 für TNP-4-BSA bzw. 0,28AU±0,12 für TNP-26-BSA) nur eine niedrige relative Signalintensität. Dagegen konnte PNGaseFbehandelter IgG2 (0,73AU±0,09 für TNP-4-BSA bzw. 0,57AU±0,09 für TNP-26-BSA) vergleichsweise gut mit FcγRIIB interagieren. Für eFcγRIIIA zeigte sich ein verminderter Einfluss der IgG Glykosylierung. So verschlechterte sich die relative Bindung von TNP-4-BSA Immunkomplexen für IgG1 nur auf 0,5AU±0,15 und für IgG3 auf 0,29AU±0,31. Deglykosylierte IgG2 (0,08AU±0,03) und IgG4 (0,03AU±0,01) Immunkomplexe banden dagegen nicht an eFcγRIIIA. Die Verwendung von TNP-26-BSA schien die Defekte bei der FcγR-Interaktion nach PNGaseF-Behandlung für IgG1 (1,16AU±0,12) und IgG3 (0,96AU±0,32) aufzuheben, während die Bindung von IgG2 22 Ergebnisse (0,15AU±0,04) und IgG4 (0,07AU±0,04) dadurch nur leicht verbessert wurde. Allerdings war die Verbesserung für IgG2, nicht aber für IgG1 und IgG3 signifikant (Abb. 8F). Zusammenfassend wurde im ersten Teil dieser Dissertation eine systematische Analyse der Bindung von humanen IgG Antikörpern in Form definierter Immunkomplexe an die humanen FcγR in vitro durchgeführt. Hierbei zeigten die humanen IgG Isotypen IgG1 und IgG3 eine stärkere Bindung an FcγR als IgG2 und IgG4. Immunkomplexe, die mit TNP-26-BSA generiert werden, banden im Allgemeinen besser als mit TNP-4-BSA hergestellte Immunkomplexe (Tab. 1). Die Glykosylierung der IgG schweren Ketten bestimmt dagegen wesentlich die Interaktion mit den niedrigaffinen FcγR. In vitro schien der Polymorphismus von FcγRIIA (und FcγRIIB) an Aminosäureposition 131 die Affinität nicht nur für IgG2 sondern auch für die anderen IgG-Subtypen zu beeinflussen. Tab 1: Übersicht der Interaktion humaner IgG Subklassen mit den humanen FcγR. Die Bindung wurde wie folgt bewertet: - (MFI <30), + (31 < MFI < 100), ++ (101 < MFI < 200), +++ (301 < MFI). 23 Ergebnisse II. Untersuchung von Antikörpereffektorfunktionen im humanisierten Mausmodell Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die Untersuchung von Einflussfaktoren auf IgG Effektorfunktionen in vivo. Exemplarisch sollte der Einfluss der FcγR Polymorphismen FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V auf die Antikörper-induzierte Zell-vermittelte Zytotoxizität (ADCC) analysiert werden. Hierfür wurde zunächst ein humanisiertes Mausmodell etabliert und charakterisiert. In diesem experimentellen System erfolgte schließlich die Depletion von B-Zellen durch Injektion CD20 spezifischer IgG-Fc Varianten. 1. Herstellung von anti-CD20 IgG Subtypen (Klon 1F5) In den humanisierten Mäusen sollte die Interaktion von humanem IgG und FcγR in vivo untersucht werden. Eine durch diese Interaktion induzierte Effektorfunktion ist die ADCC. Daher wurde beispielhaft die durch IgG induzierte und über ADCC vermittelte B-ZellDepletion ausgewählt. Hierfür wurde zunächst der gegen das humane Oberflächenprotein CD20 gerichtete Hybridom-Antikörper (Klon 1F5) kloniert, auf die humanen IgG Subklassen humanisiert und durch transiente Transfektion produziert. Abb. 9: Anti-CD20 IgG Fc Varianten (Klon 1F5). A) Elektrophoretische Auftrennung unter reduzierenden Bedingungen gefolgt von der Färbung der Proteine mit Coomassie Blau. B) Kompetitionsassay zum Vergleich der Antigenbindung. Die hergestellten Antikörper wurden mit dem parentalen, fluoreszenzmarkierten Hybridomantikörper auf LCL1.11 Zellen koinkubiert. Anschließend erfolgte die durchflusszytometrische Bestimmung der Reduktion der Fluoreszenzintensität (n=3). C) Bestimmung der C1q Bindung durch die humanen IgG Subklassen mittels ELISA (n>4). Die Integrität und Reinheit der produzierten Antikörper wurde mittels PAA-Gelelektrophorese und nachfolgender Coomassie-Blau-Färbung überprüft. Die schweren Ketten von IgG1, IgG2 und IgG4 erschienen jeweils bei einer Größe von etwa 55kDa. Dagegen war die schwere 24 Ergebnisse Kette von IgG3 mit 60kDa deutlich größer. Die leichten Ketten zeigten sich etwa bei 30kDa. Es konnten keine weiteren Proteine oder Spaltprodukte beobachtet werden (Abb. 9A). Im weiteren Verlauf wurden die produzierten Antikörper auf ihre Antigenbindung getestet, da Varianzen in der Affinität für CD20 IgG-abhängige Unterschiede in der B-Zell-Depletion verursachen könnten. Zunächst erfolgte hierfür die Fluoreszenzmarkierung des parentalen Hybridom-Antikörpers. Dieser wurde mit steigenden Konzentrationen der produzierten humanen 1F5 IgG gemischt und mit der humanen CD20 exprimierenden B-Zell-Linie LCL1.11 inkubiert. Unter diesen experimentellen Bedingungen konkurrierten die verschiedenen Antikörper um die vorhandenen CD20-Moleküle und sowohl die Assoziationsals auch die Dissoziationskonstanten konnten verglichen werden. Bei der durchflusszytometrischen Analyse wurde die maximale Fluoreszenzintensität bei alleiniger Inkubation mit dem fluoreszenzmarkierten Antikörper erreicht. Die Kompetition mit den unmarkierten 1F5 IgG führte zu einer Reduktion der Fluoreszenzintensität. In Abb. 9B ist die sog. CH50 dargestellt, d.h. die Konzentration der 1F5 IgG bei der die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) 50% betrug. 1F5 IgG1 erreichte die 50%ige Reduktion der MFI bei einer Konzentration von 47,2ng/µl±13. Der hergestellte 1F5 IgG2 band mit einer CH50 von 107,7ng/µl±43 nur etwa halb so gut. Die CH50 für IgG3 betrug 53,9ng/µl±7,7. Sie war damit mit der Bindung von IgG1 vergleichbar. Dagegen war die Bindung von IgG4 signifikant schwächer als bei IgG1 und IgG3. Erst bei einer Konzentration von 99,2ng/µl±13,8 konnte IgG4 die MFI um 50% vermindern. Mittels ELISA wurden die produzierten 1F5 IgG weiterhin auf die Bindung des humanen Komplementfaktors C1q untersucht. Hierfür wurden zunächst je 100ng der 1F5 IgG mit 2ng/µl C1q Protein inkubiert. Das gebundene C1q wurde anschließend mit einem HRPkonjugiertem C1q-spezifischen Antikörper bei einer Wellenlänge von 450nm detektiert. Nach Abzug des Hintergrundsignals bei einer Wellenlänge von 650nm banden IgG1 (0,12±0,07) und IgG3 (0,11±0,05) signifikant besser an C1q als IgG2 (0,03±0,02) und IgG4 (0,01±0,0) (Abb. 9C). Diese Versuche zeigen, dass die hergestellten 1F5 IgG in ihrer Struktur intakt sind und ihr Antigen CD20 binden. Bei 1F5 IgG2 und 1F5 IgG4 scheint die Affinität für CD20 allerdings vermindert. 2. Eigenschaften von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen Für die Etablierung des humanisierten Mausmodells wurde ein bereits im Vorfeld dieser Dissertation im Labor generierter immundefizienter Mausstamm verwendet. Hierzu wurden Rag2/γc-/- Mäuse mit Fcγ-/- Mäusen verpaart (Abb. 10A). Eine Deletion des Rag2 Gens führt zu einer frühen Blockade in der Entwicklung von B- und T-Zellen. Eine Nullmutation im Gen 25 Ergebnisse der gemeinsamen Signalkette (γc) der Interleukin-Rezeptoren führt zusätzlich zu einer Inhibierung der NK-Zell-Entwicklung. Nach der Zerstörung der Knochenmarkszellen im Empfängertier durch Bestrahlung, können die Mäuse daher mit Spender-Stammzellen rekonstituiert werden ohne dass es zu Abstoßungsreaktionen kommt. Die erzeugten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse verfügen zusätzlich über eine Deletion der gemeinsamen Signalkette der murinen aktivierenden FcγR (Fcγ), die essentiell für deren Oberflächenexpression ist. Dies ist notwendig, da humane IgG auch an die FcγR der Maus binden und dadurch FcγRvermittelte Effekte auslösen können. Abb. 10: Charakterisierung von Rag2/γc/Fcγ-/Mäusen. A) Durch Verpaarung von -/-/Rag2/γc und Fcγ Mäusen wurden Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse erzeugt. B) Durchflusszytometrische Analyse der murinen Leukozytenpopulationen in Rag2/γc/Fcγ-/- im Vergleich zu C57BL/6 und Rag2/γc-/Mäusen. C) Histogrammdarstellung der durchflusszytometrischen Bestimmung der Expression muriner FcγR auf PBMCs in Rag2/γc/Fcγ-/- im Vergleich zu Rag2/γc-/Mäusen. Eine durchflusszytometrische Analyse der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen im Vergleich zu Rag2/γc-/- und C57BL/6 Mäusen ist in Abb. 10B dargestellt. Die Frequenzen der Zellpopulationen im Blut wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen charakteristische Oberflächenantigene in je 3 Mäusen bestimmt. In C57BL/6 Mäusen waren 30,1%±10,5 der lebenden Zellen im Blut TCRß exprimierende T-Zellen und 46,1%±21,7 B220+ B-Zellen. 2,4%±1,0 der Zellen konnten aufgrund des Oberflächenmarkers NK1.1+ als NK Zellen identifiziert werden. Myeloide Zellen, d.h. Monozyten und Granulozyten, die auf ihrer Zelloberfläche CD11b nicht aber NK1.1 tragen, machten 21,1%±10,9 der analysierten Zellen aus. In Rag2/γc-/- und Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen konnten dagegen keine NK1.1+ (0,0%±0,0) Zellen und nur sehr geringe Anteile von TCRβ+ (0,9%±0,9 bzw. 0%±0,0) und B220 exprimierenden Zellen (0,6±0,2 bzw. 0,4%±0,0) nachgewiesen werden. 98,9%±0,7 26 Ergebnisse (Rag2/γc-/-) bzw. 98,7%±0,2 (Rag2/γc/Fcγ-/-) der untersuchten Zellen waren CD11b+ Monozyten und Granulozyten. Zusätzlich zu den Zellpopulationen wurde auch der Expressionsstatus der FcγR mittels Durchflusszytometrie untersucht. Hierfür wurden je 2 Rag2/γc-/- Mäuse, die über die Fcγ Kette verfügen und daher alle FcγR exprimieren, mit den erzeugten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen verglichen. Während der hochaffine FcγRI in Rag2/γc-/- Mäusen auf dem Großteil der analysierten PBMCs exprimiert wurde, konnte er auf den PBMCs von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen nicht detektiert werden. Der monoklonale Antikörper 2.4G2, der sowohl den inhibitorischen FcγRIIB als auch den aktivierenden FcγRIII erkennt, band in Rag2/γc-/- Mäusen an alle analysierten PBMCs. Auch in Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen kam es zu einer Erkennung der Zellen durch 2.4G2. Das positive Signal bei dieser Färbung wird durch die Expression des inhibitorischen FcγRIIB verursacht, der nicht Fcγ-abhängig ist. Ein FcγRIII-spezifischer Antikörper zeigte keine Bindung an Zellen aus Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen im Gegensatz zu Rag2/γc-/- Mäusen. Der aktivierende FcγRIV wurde ebenfalls nur in Rag2/γc-/- Mäusen nicht aber in Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen detektiert (Abb. 10C). Die ausgeprägte FcγR-Expression in Rag2/γc-/- Mäusen hatte ihre Ursache im Fehlen von FcγR negativen Zellen z.B. TLymphozyten. Wie auch bei Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen fanden sich im Blut vor allem CD11b+, FcγR exprimierende Monozyten und Granulozyten (Abb. 10B). 3. Aufreinigung und Analyse von humanen hämatopoetischen Stammzellen Für die Rekonstitution von humanisierten Mäusen wurden humane CD34+ hämatopoetische Stammzellen (HSC) benötigt, die aus Nabelschnurblut aufgereinigt wurden. Das Nabelschnurblut wurde für diese Zwecke von Mitarbeitern des Klinikums Fürth unter Zustimmung der Spender zur Verfügung gestellt. Die Aufreinigung erfolgte über eine Dichtegradientenzentrifugation zur Aufkonzentrierung von Leukozyten, gefolgt von der positiven Selektion mittels an magnetische Partikel gekoppelter anti-CD34 Antikörper. Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse der aufkonzentrierten Leukozyten vor der weiteren Selektion sowie der aufgereinigten Stammzellen sind in Abb. 11 zusammengefasst. In den 3 analysierten Nabelschnurblutproben bestand mit 1,8%±1,0 nur einer kleiner Teil der aufkonzentrierten Leukozyten aus CD34+ HSC (Abb. 11A). Der Anteil dieser Population wurde durch die spezifische Aufreinigung über CD34-spezifische Antikörper im Mittel von 8 untersuchten Proben auf 80%±11,6 gesteigert. Der geringe Anteil CD38+ Zellen von 10,8%±7,3 deutete auf den weitgehend undifferenzierten Zustand dieser aufgereinigten HSC hin (Abb. 11B). Bei den CD34- Zellen handelte es sich zum größten Teil um CD19+ B-Zellen (57,2%±16,1). Die aufgereinigte Fraktion enthielt aber auch kleinere 27 Ergebnisse Populationen von CD3+ T-Zellen (4,5%±2,9), CD56+ NK-Zellen (3,3%±0,9) und durch die Expression von CD33+ gekennzeichnete myeloide Zellen (16,9%±9,0) (Abb. 11C). Die übrigen Zellen wurden nicht näher bestimmt. Im arithmetischen Mittel konnten durch die Aufreinigung ca. 14.000 Zellen/ml Nabelschnurblut gewonnen werden. Abb. 11: Isolation hämatopoetischer Stammzellen. Durchflusszytometrische Analyse CD34+ Zellen in der Gesamtzellpopulation im Nabelschnurblut (A) bzw. nach der Aufreinigung der HSC (B). C) Durchflusszytometrische Identifizierung der CD34 negativen Zellen in der angereicherten Stammzellpopulation. 4. Genotypisierung der FcγR Polymorphismen Die Polymorphismen in den Genen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA wurden nach Isolation der genomischen DNA aus dem Nabelschnurblut durch Amplifikation mit Allelspezifischen Primern bestimmt. Für die Effizienz der PCR ist dabei die Bindung der letzten Base des Primers an die Ausgangs-DNA entscheidend. Daher wurden für die Allelspezifische PCR Primer verwendet, die sich ausschließlich in dieser Base unterschieden. Die Auswertung erfolgte durch elektrophoretische Auftrennung der Amplifikationsprodukte in Ethidiumbromid-haltigen Agarosegelen und Analyse unter UV-Licht. Da die allelspezischen Primer bis auf 1 Nukleotid identisch waren, konnten in jedem Fall PCR-Produkte amplifiziert werden. Allerdings war die Effizienz wesentlich schlechter und die Intensität der DNABanden demnach geringer. Zur Alleltypisierung von FcγRIIA131H/R wurde in einer ersten PCR zunächst ein 517bp großes, FcγRIIA spezifisches Fragment amplifiziert, das das Exon 4 und den zu typisierenden Polymorphismus enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde direkt in die zweite, Allel-spezische PCR eingesetzt. Für die Amplifikation des Arginin-kodierenden Allels wurde ein sense Primer mit einem endständigen Guanin verwendet, für das Histidin-kodierende Allel verfügte der 28 Ergebnisse Primer am 3´-Ende stattdessen über ein Adenin. Beispielhaft ist das Ergebnis der drei möglichen Allelkombinationen in Abb. 12A dargestellt. Die Wasserkontrolle zeigte keine unspezifschen Banden außer Signalen mit einer Größe von 30-60bp, die durch überschüssigen Primer in der Reaktion verursacht wurden. Ein spezifisches Produkt mit einer Größe von 271bp war dagegen bei Zugabe von DNA zu sehen. Im Fall einer homozygot hochaffinen Probe (FcγRIIA131H) war eine intensive Bande bei Verwendung des Alanin-Primers zu sehen, aber nur eine sehr schwache Bande bei Verwendung des GuaninPrimers. Bei der homozygot niedrigaffinen Probe (FcγRIIA131R) entstand dagegen mehr PCRProdukt nach Verwendung des Guaninprimers. Vergleichbar intensive Banden bei beiden PCR-Ansätzen kennzeichneten eine heterozygote Probe (FcγRIIA131H/R). Abb. 12: FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Genotypisierung. Gelelektophoretische Auftrennung der Produkte der Genotypisierungs-PCRs zur Bestimmung von FcγRIIA131H/R (A) bzw. FcγRIIIA158F/V (B). C) Statistische Verteilung der einzelnen Kombinationen unter 439 typisierten Stammzellproben. Für die Genotypisierung von FcγRIIIA158F/V wurde ebenfalls zunächst ein FcγRIIIA spezisches Fragment von 394bp amplifiziert, das die polymorphe Base in Exon 4 enthielt. Die zweite, Allel-spezische PCR wurde mit Allel-spezifischen antisense Primern durchgeführt. Während der Primer mit einem Thymin am 3´-Ende seiner Sequenz der Amplifikation des Phenylalanin-kodierenden Allels diente, führte ein an dieser Stelle befindliches Guanin zur Amplifikation des Valin-kodierenden Allels. Demzufolge zeigte die Genotypisierung einer homozygot hochaffinen Probe (FcγRIIIA158V) ein stärkeres Signal mit dem Guaninendständigen Primer. Bei einer homozygot niedrigaffinen Probe (FcγRIIIA158F) entstand mehr PCR-Produkt bei Verwendung des Thymin-Primers und bei einer heterozygoten Probe entstanden zwei in ihrer Bandenintensität vergleichbare PCR-Produkte. Weitere Banden z.B. durch überschüssige Primer oder unspezifische Amplifikation waren nicht zu detektieren (Abb. 12B). Sowohl für die FcγRIIA als auch für die FcγRIIIA Allel-spezifischen PCR Reaktionen wurde durch Klonierung und Sequenzierung der erhaltenen PCR-Produkte die Anwesenheit der jeweiligen Nukleotidaustausche verifiziert. 29 Ergebnisse Die Frequenzen der Allelkombinationen, die durch die Genotypisierung von 439 Stammzellproben bestimmt wurden, sind in Abb. 12C zusammengefasst. Unter den gespendeten Nabelschnurblutproben fanden sich alle möglichen Kombinationen der untersuchten FcγR Polymorphismen. Am häufigsten traten Proben mit der Kombination FcγRIIA131H/R – FcγRIIIA158F/V auf. Am seltensten war die Kombination FcγRIIA131R/R – FcγRIIIA158V/V. Im Durchschnitt lag die Wahrscheinlichkeit des niedrigaffinen, Arginin- kodierenden Allels für FcγRIIA bei 47,7%±5,7 während das hochaffine, Histidin-kodierende Allel mit einer Wahrscheinlichkeit von 52,3%±5,7 auftrat. Das niedrigaffine, Phenylalaninkodierende Allel war dagegen für FcγRIIIA wahrscheinlicher (57,2%±5,6) als das hochaffine, Valin-kodierende Allel (42,8%±5,6). Nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz der Populationsgenetik ergibt sich für eine ideale, ausreichend große Bevölkerungsgruppe eine gleichmäßige Verteilung des Auftretens der einzelnen Allele. Die Wahrscheinlichkeiten können anhand einer mathematischen Formel bestimmt werden: p2 + 2pq + q2 = 1 Hierbei stehen p2 und q2 für die Wahrscheinlichkeiten des homozygoten Auftretens der beiden Allele und 2pq für die Wahrscheinlichkeit des Heterozygotie. Für die bestimmten Wahrscheinlichkeiten der Polymorphismen ergab sich demnach eine ideale Verteilung: 5. p2 2pq q2 p2 + 2pq + q2 = FcγRIIA: 0,23 0,5 0,28 1,01 FcγRIIIA: 0,30 0,55 0,15 1,0 Rekonstitution von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen mit humanen HSC Für die Rekonstitution von immundefizienten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen wurden diese zunächst sublethal in einer Cäsium137 Gammabestrahlungsanlage bestrahlt. Danach erfolgte die intravenöse Injektion von mindestens 50.000 humanen HSC. Im Alter von ca. 12 Wochen wurde peripheres Blut entnommen, die PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und mit spezies-spezifischen Antikörpern, die gegen den Oberflächenmarker CD45 auf Leukozyten gerichtet sind, angefärbt. In der Maus liegt CD45 in den Allotypen CD45.1 oder CD45.2 vor, wobei rekonstituierte Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse durch den Marker CD45.2 gekennzeichnet sind. Anschließend wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Grad der Humanisierung wurde über das Verhältnis von hCD45+ humanen Zellen zu mCD45.2+ hämatopoetischen Zellen der Maus ermittelt. Abb. 13A zeigt beispielhaft die Verteilung der Zellen in einer peripheren Blutprobe mit 22,4% humanen Zellen und 76,9% hämatopoetischen Zellen der Maus. 30 Ergebnisse Abb. 13: Rekonstitution von Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen mit humanen HSC. A) Beispielhafte durchflusszytometrische Bestimmung der Humanisierungseffizienz im peripheren Blut über das relative Verhältnis von murinen mCD45.2+ und humanen hCD45+ Zellen. B) Rekonstitution humanisierter Mäuse in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis. Angegeben ist der Anteil der bis zum Altern von 12 Wochen verstorbenen und der analysierten Mäuse, die im peripheren Blut entweder hCD45+ Zellen enthielten (humanisiert) oder nicht humanisiert waren. + C) Durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils hCD45 Zellen im peripheren Blut 12 Wochen alter humanisierter Mäuse in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis. D) Gesamtüberblick hCD45+ Zellen im peripheren Blut, in der Milz und im Knochenmark der unbehandelten humanisierten Mäuse. Die arithmetischen Mittelwerte sind angezeigt. Die Transplantationseffizienz wurde für steigende Bestrahlungsdosen zwischen 3,5Gy und 6Gy ermittelt (Abb 13B). Bei der niedrigsten getesteten Dosis wurden insgesamt 36 Mäuse rekonstituiert. 36,1% dieser Mäuse verstarben innerhalb von 12 Wochen. Ein Alter von 12 Wochen erreichten demnach 63,9% der Mäuse und konnten somit untersucht werden. Von allen transplantierten Tieren waren 4 Mäuse humanisiert. Dies entsprach einem Anteil von 31 Ergebnisse 11,1% an der Gesamtpopulation. Der Anteil der humanen Zellen lag bei 10,8%±15,8 (Abb. 13C). Nach Bestrahlung mit 4Gy und Transplantation der humanen hämatopoetischen Stammzellen verstarben von 80 Tieren innerhalb von 12 Wochen 19 Mäuse (23,8%). Analysiert werden konnten nach 12 Wochen 76,2% der Gesamtpopulation. Im peripheren Blut von insgesamt 13 Mäusen oder 16,3% fanden sich hCD45+ Zellen. Im arithmetischen Mittel lag der Anteil der humanen Zellen in diesen Mäusen bei 14,6%±13,1. 6 Mäuse (42,9%) von den 14 transplantierten Tieren verstarben nach der Bestrahlung mit 4,25Gy. In der untersuchten Population befanden sich 4 Mäuse mit durchschnittlich 9,4±8,9% hCD45+ Zellen. Der Anteil der humanisierten Mäuse betrug also 28,6%. Insgesamt 29 Mäuse wurden vor der Transplantation mit 4,5Gy bestrahlt. Bis zum Alter von 12 Wochen verstarben hiervon 13,8% der Tiere. Von den untersuchten Mäusen waren 5 Tiere, d.h. 17,2% der Population, im arithmetischen Mittel zu 23,6%±13,7 humanisiert. Die höchste Humanisierungseffizienz in Bezug auf den Anteil humanisierter Mäuse wurde bei einer Bestrahlungsdosis von 4,75Gy erzielt. Von 29 transplantierten Mäusen verstarben zwar 13,8% vor dem Alter von 12 Wochen, aber von den verbliebenen Mäusen waren 14 Tiere, also 48,3% der injizierten Mäuse, humanisiert. Auch der Anteil der humanen Zellen war mit 22,4%±20,7 im Mittel relativ hoch. Bei der höchsten Bestrahlungsdosis (6Gy) kam es wieder zu einer Abnahme des Anteils humanisierter Mäuse. Von allen getesteten Bestrahlungsdosen wurden bei 6Gy aber im Mittel der höchste Humanisierungsgrad erzielt. Nach Rekonstitution von 65 Tieren verstarben innerhalb von 12 Wochen 25 Mäuse (38,5%). Insgesamt waren 21,5% der Mäuse (7 Tiere) humanisiert, die mit 32,5%±28,1 humaner Zellen im peripheren Blut aber die beste Rekonstitution zeigten. Zusammenfassend zeigt Abb. 13D den Anteil der humanen Zellen in allen für Experimente verwendeten Mäusen unabhängig von der Bestrahlungsdosis. Der Anteil humaner Zellen betrug im peripheren Blut durchschnittlich 21,4%±20,8, in der Milz 44,7%±40,8 und im Knochenmark 55,6%±10,9. 6. Charakterisierung der humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse Nach der Transplantation der Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse mit humanen hämatopoetischen Stammzellen entwickelten sich innerhalb von 12 Wochen humane hämatopoetische Zellen. Im Folgenden sollten diese Zellen näher charakterisiert werden. Hierfür wurden humanisierte Mäuse hinsichtlich der einzelnen Leukozytenpopulationen im Blut und in den lymphatischen 32 Ergebnisse Organen Milz und Knochenmark mittels Durchflusszytometrie untersucht. Zum Vergleich wurden adulte humane Proben analysiert. 6.1) Leukozytenpopulationen im humanen Immunsystem Die einzelnen Leukozytenpopulationen im humanen Blut sind exemplarisch in Abb. 14 dargestellt. Insgesamt konnten die Proben von 6 Spendern analysiert werden. Die größte Population im humanen Blut stellten mit 64,9%±12,2 CD3+ T-Zellen dar. Der Anteil CD19+ BZellen betrug 10,0%±2,9. Im Mittel konnten im peripheren Blut zusätzlich CD56+ NK-Zellen (13,4%±3,5), CD33+ myeloide Zellen (Monozyten bzw. Granulozyten) (5,9%±5,3), und CD11c exprimierende dendritische Zellen (DC) (5,5%±2,7) identifiziert werden. Der Oberflächenmarker CD11c war dabei nicht nur auf DCs sondern auch auf CD33+ Zellen vorhanden. Als DCs wurden daher nur CD11c einzelpositive Zellen gewertet. Im Gegensatz zum peripheren Blut konnten in den 4 analysierten Milz-Proben 27,5%±8,5 der Leukozyten als CD3+ T-Zellen identifiziert werden. CD19+ B-Zellen waren dagegen die größte Leukozytenpopulation (55,9%±9,4). Auch in der Milz konnten im Durchschnitt 19,7%±9,3 CD56+ Zellen detektiert werden. Weiterhin betrug der Anteil CD11c+ DCs 7,3%±2,0 und der Anteil CD33+ Zellen 8,8%±8,5. Bei der Analyse der Leukozytenpopulationen in 2 humanen adulten Knochenmarksproben konnten CD19+ B-Zellen im Mittel zu 23,6%±11,4 detektiert werden. CD3 exprimierende T-Zellen waren zu 34,3%±5,4 vorhanden. 7,9%±3,0 der Leukozyten konnten als CD56+ NK-Zellen, 5,2%±3,8 als CD11c+ DCs und 15,6%±0,3 als CD33 exprimierende myeloide Zellen identifiziert werden. Eine weitere Zellpopulation im Knochenmark waren CD34+ Vorläuferzellen. Ihr Anteil betrug 2,2%±0,4 der analysierten Zellen. 33 Ergebnisse Abb. 14: Durchflusszytometrische Identifikation humaner Leukozytenpopulationen im humanen peripheren Blut, in der Milz und im Knochenmark. Die entsprechenden einfachpositiven Zellpopulationen B(CD19+), T- (CD3+), NK-Zellen (CD56+), myeloide Zellen + (CD33 ), dendritische Zellen (CD11c+) und CD34+ Vorläuferzellen sind umrandet. 6.2) Leukozytenpopulationen in der humanisierten Maus Das Auftreten der unterschiedlichen Leukozytenpopulationen wurde auch in humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen untersucht. Wegen geringer Zellzahlen wurde das periphere Blut von 15 humanisierten Mäusen zu einer Probe vereint. Für Milz und Knochenmark konnten die Zellpopulationen in 4 PBS-behandelten, humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen im Alter von 12 Wochen bestimmt werden. Wie in Abb. 15 zu sehen, traten im peripheren Blut der humanisierten Mäuse zu diesen frühen Zeitpunkt der Rekonstitution mit 88,5% fast ausschließlich CD19+ B-Zellen auf. Nur 5,5% der Leukozyten waren CD3+ T-Zellen. Weiterhin konnten eine CD33+ Monozytenpopulation (3,3%) und eine CD11c+ DC-Population (5,3%) identifiziert werden. CD56 exprimierende NK-Zellen waren mit 1,0% der Leukozyten kaum im Blut detektierbar. Auch in der Milz humanisierter Mäuse traten bevorzugt CD19+ BZellen auf (92,3%±1,6). Eine deutliche T-Zell-Population von 1,7%±0,6 ließ sich aber abgrenzen. Außerdem konnten wieder myeloide Zellen (1,1%±0,6), NK-Zellen (0,8%±0,5) und dendritische Zellen (9,4%±11,7) nachgewiesen werden. Im Knochenmark war der Anteil der CD19+ B-Zellen von den 3 analysierten Organen mit 80,7%±4,4 am geringsten. CD3+ TZellen waren zu 0,4%±0,3 in den analysierten Leukozyten vorhanden. Stattdessen konnte 34 Ergebnisse eine große Population CD33 exprimierender Zellen (8,8%±1,1) identifiziert werden. CD11c+ DCs waren zu 6,3%±10,4 vorhanden, wogegen erneut kaum CD56+ NK-Zellen (1,6%±1,5) detektiert werden konnten. Wie auch im humanen Knochenmark fanden sich in den humanisierten Mäusen auch CD34+ Vorläuferzellen (2,9%±1,8). Abb. 15: Durchflusszytometrische Identifikation humaner Leukozytenpopulationen im peripheren Blut, in der Milz und im Knochenmark humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/Mäuse. Die entsprechenden einfachpositiven Zellpopulationen B(CD19+), T- (CD3+), NK-Zellen (CD56+), myeloide Zellen + (CD33 ), dendritische Zellen (CD11c+) und CD34+ Vorläuferzellen sind umrandet. Das Vorhandensein der humanen Leukozyten konnte neben durchflusszytometrischen Analysen auch durch Immunfluoreszenzfärbungen von Milzschnitten nachgewiesen werden. Mittels fluoreszenzmarkierter spezifischer Antikörper erfolgte der Nachweis humaner CD19+ bzw. CD20+ B-Zellen in der Milz. Obwohl diese B-Zellen nicht zufällig verteilt schienen, war eine follikuläre Organisation zu diesem frühen Zeitpunkt noch nicht zu erkennen. Weiterhin konnten in der Milz humane CD3+ T-Zellen detektiert werden. Durch Verwendung von Antikörpern gegen CD33 wurden myeloide Zellen, d.h. Monozyten oder Granulozyten, identifiziert. Diese Zellen schienen zufällig über die Milz verteilt zu sein (Abb. 16). Zusammenfassend bestätigen durchflusszytometrische Analysen von Blut, Milz und Knochenmark das Vorhandensein humaner Leukozyten, d.h. B- und T-Lymphozyten, NKZellen, Monozyten und DCs, in den humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen. B-Zellen sind dabei die größte Zellpopulation. 35 Ergebnisse Abb. 16: Immunfluoreszenzfärbung der Milz humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/-Mäuse. Die einzelnen Leukozyten wurden mithilfe fluoreszenzmarkierter spezifischer Antikörper gegen CD19, CD20, CD3 bzw. CD33 angefärbt. 6.3) Expression humaner FcγR in humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen Da das humanisierte Mausmodell zur Untersuchung von Einflussfaktoren auf die humane IgG-FcγR Interaktion in vivo verwendet werden soll, wurden die humanisierten Mäuse hinsichtlich der Oberflächenexpression der humanen FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA untersucht. Hierfür wurden die möglichen Effektorzellen der ADCC, CD33+ Monozyten/Granulozyten und CD56+ NK-Zellen, in Blut, Milz und Knochenmark 12 Wochen alter humanisierter Mäuse durchflusszytometrisch analysiert. Für eine bessere Einordnung der Ergebnisse wurden erneut auch humane Vergleichsproben untersucht (Abb. 17). CD33+ myeloide Zellen im humanen peripheren Blut zeigten eine deutliche Expression der aktivierenden FcγRIA und FcγRIIA und des inhibitorischen FcγRIIB. In Bezug auf den aktivierenden FcγRIIIA konnten zwei Populationen unterschieden werden: Alle Zellen waren FcγRIIIA positiv, aber ein kleiner Teil der Zellen zeigte ein sehr hohes Expressionsniveau. Aus humanisierten Mäusen gewonnene CD33 exprimierende Zellen zeichneten sich durch eine vergleichbare Expression des hochaffinen FcγRIA und des niedrigaffinen FcγRIIIA aus. Bei letztem fehlte aber die stark positive FcγRIIIA Population. Die Signalintensität bei der Färbung von FcγRIIA und besonders FcγRIIB war im Vergleich zu humanen Zellen allerdings vermindert (Abb. 17A). In der humanen Milz wie auch der Milz aus den humanisierten Mäusen waren CD33+ Zellen durch die Expression von FcγRIA und FcγRIIA charakterisiert. FcγRIIB konnte, wie schon im Blut, stärker auf humanen Zellen detektiert werden. Auf Zellen aus den humanisierten Mäusen schien er sehr schwach vorhanden zu sein. FcγRIIIA konnte nur auf einem kleinen Teil der humanen CD33+ Zellen detektiert werden. Auf der Zelloberfläche von myeloiden Zellen der humanisierten Mäuse war FcγRIIIA vorhanden (Abb. 17B). Auch im Knochenmark waren humane CD33+ Zellen durch die Expression von FcγRIA 36 Ergebnisse und FcγRIIA gekennzeichnet. Dagegen schienen FcγRIIB und FcγRIIIA auf einem Großteil der Zellen nicht exprimiert zu sein. Es konnte jeweils nur eine kleine positive Population identifiziert werden. Vor allem im Vergleich zu CD33+ Zellen der Milz fand sich in den humanisierten Mäusen eine stärkere Expression von FcγRIA und FcγRIIIA aber eine verminderte Signalintensität von FcγRIIA. FcγRIIB konnte nicht detektiert werden (Abb. 17C). Abb. 17: Expression humaner FcγR auf CD33+ Zellen. Durchflusszytometrische Analyse in peripherem Blut (A), in der Milz (B) und im Knochenmark (C) von humanen Proben (oben) bzw. in der humanisierten Maus (unten). Neben CD33+ myeloiden Zellen wurden als weitere mögliche ADCC-Effektorzellpopulation auch CD56+ NK-Zellen in Bezug auf die Expression von FcγRIIIA, dem einzig bekannten FcγR auf NK-Zellen, untersucht (Abb 18). In humanem Blut, Milz und Knochenmark ließen sich NK-Zellen in 2 Populationen aufteilen. Während jeweils ein Teil der Zellen keine Expression zeigte, konnte FcγRIII in der zweiten Population sehr stark nachgewiesen 37 Ergebnisse werden. NK-Zellen aus humanisierten Mäusen wiesen im Blut eine schwache FcγRIIIAExpression auf. In der Milz schienen die CD56+ Zellen dagegen FcγRIIIA negativ zu sein. Im Knochenmark war die FcγRIIIA-Expression den humanen NK-Zellen vergleichbar. Abb. 18: Expression humaner FcγR auf NK-Zellen. Durchflusszytometrische Analyse der CD56+ Zellen in peripherem Blut (A), in der Milz (B) und im Knochenmark (C) von humanen Proben (oben) bzw. in der humanisierten Maus (unten). Mittels Durchflusszytometrie konnte die grundsätzliche Expression von humanen FcγR auf den Effektorzellen der ADCC, myeloiden und NK-Zellen, nachgewiesen werden. Das Expressionsmuster weicht dabei aber teilweise von dem der menschlichen Zellen ab. 6.4) CD20 Expression in humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen Im humanisierten Mausmodell sollte beispielhaft die ADCC-vermittelte B-Zell-Depletion nach Gabe von anti-CD20 Antikörpern untersucht werden. Daher wurden die IgM- und IgM+ BZellen der humanisierten Mäuse hinsichtlich der Expression des Oberflächenmarkers CD20+ durchflusszytometrisch untersucht. Sowohl im humanen Blut (94,5%) als auch im Blut humanisierter Mäuse (96,9%) war der Großteil der CD19+ Zellen durch die Expression von IgM, nicht aber CD10 gekennzeichnet. Innerhalb der CD19+ B-Zell-Population in der Milz exprimierten dagegen im Mittel 64,1%±21,7 der Zellen sowohl IgM als auch CD10. Im Knochenmark waren es dagegen nur 36,4%±31,2. Dies weist auf eine Zunahme des Anteils reiferer B-Zell-Populationen von Knochenmark und Milz in die Peripherie hin (Abb. 19A). Bei der Analyse der CD20-Expression in den identifizierten B-Zell-Populationen zeigte sich eine vergleichbar geringe Expression in den IgM-/CD10+ B-Zell-Vorläuferzellen in Milz und Knochenmark (Abb. 19B). Im Blut konnten IgM-/CD10+ Zellen nicht detektiert werden. Im Gegensatz dazu war die CD20-Expression in IgM+ B-Zellen im Blut und in der Milz deutlich stärker ausgeprägt als im Knochenmark (Abb. 19C). 38 Ergebnisse Abb. 19: CD20 Expression in BZellen. Durchflusszytometrische Analyse von CD19+ B-Zellen in humanem Blut und in Blut, Milz und Knochenmark humanisierter Mäuse. A) Dotplot der ausgewählten CD19+ Populationen. B) Histogrammdarstellung der CD20 Oberflächenexpression IgM- BZellen. C) Histogrammdarstellung der CD20 Oberflächenexpression in IgM+ BZellen. Im Weiteren erfolgte die durchflusszytometrische Analyse der verschiedenen B-ZellEntwicklungsstadien in den humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen. Insbesondere lag der Fokus der Untersuchungen auf der CD20 Expression in den einzelnen B-Zell-Populationen in Milz und Knochenmark. Die CD34+/CD10+ B-Zell-Vorläufer, die sog. Pro-B-Zellen, konnten v.a. im Knochenmark detektiert werden (Abb. 20A). In der Milz fanden sich dagegen die reiferen, CD19+/IgM+ B-Zell-Stadien. Ein Großteil dieser Zellen exprimierte zusätzlich IgD, den Marker naiver B-Zellen. In der Milz konnten IgM+/CD27+ Gedächtnis-B-Zellen in geringer Zahl identifiziert werden (Abb. 20B). CD138+ Plasmazellen waren in der Milz der untersuchten Mäuse nicht vorhanden (Daten nicht gezeigt). Wie in Abb. 20A zu sehen, zeigten die frühen B-Zell-Vorläufer im Knochenmark noch keine Expression von CD20. Dagegen konnte CD20 auf auf den IgM+ B-Zellen der Milz in hoher Intensität nachgewiesen werden (Abb. 20B). 39 Ergebnisse Abb. 20: Stadien der B-Zell-Entwicklung in Milz und Knochenmark humanisíerter Mäuse. A) Durchflusszytometrische Bestimmung früher B-Zell-Vorläuferzellen (CD19+/CD34+/CD10+) im Knochenmark und CD20-Expression in diesen Zellen. B) Analyse reiferer B-Zell-Populationen in der Milz und die jeweilige CD20-Expression der markierten Population. 7. IgG-vermittelte B-Zell-Depletion in humanisierten Mäusen Nach der Herstellung der anti-CD20 Antikörper und der Charakterisierung der humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse wurde nun die IgG-vermittelte B-Zell-Depletion in vivo untersucht. Hierfür erfolgte die intravenöse Injektion der produzierten 1F5 IgG Subklassen in unterschiedlichen Dosen in humanisierte Mäuse. Die Abnahme der B-Zellen im peripheren Blut und den lymphatischen Organen Milz und Knochenmark konnte daraufhin mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden. Für die Experimente wurden humanisierte Mäuse im Alter von 11-13 Wochen verwendet, die im peripheren Blut mind. 3% humane Zellen aufwiesen. 7.1) Fc-Abhängigkeit der 1F5 IgG induzierten B-Zell-Depletion Anti-CD20 Antikörper depletieren B-Zellen über verschiedene direkte als auch Fc-vermittelte Mechanismen, wie etwa die Aktivierung der Komplementkaskade oder die Bindung an zelluläre FcγR. Deswegen sollte zunächst untersucht werden, in welchem Ausmaß die 1F5 IgG induzierte B-Zell-Depletion vom IgG Fc Fragment abhängt. Hierfür wurde das Fc Fragment des 1F5 Antikörpers, durch Verdau mit Pepsin, entfernt. Das dabei entstehende F(ab)2-Fragment bindet weiterhin an CD20. Sowohl der unverdaute 1F5 IgG1 als auch das F(ab)2 Fragment wurden im äquimolaren Verhältnis in humanisierte Mäuse injiziert und die B-Zell-Depletion im peripheren Blut analysiert. Die nach Injektion verbliebenen CD19+ Zellen wurden auf den Ausgangswert bezogen. Die errechneten Mittelwerte sind in Abb. 21 dargestellt. Die Injektion von 1F5 IgG1 reduzierte innerhalb von 24 Stunden den Anteil der CD19+ B-Zellen auf 6,7%±5,6. Diese Depletion war signifikant besser als nach Applikation 40 Ergebnisse des F(ab)2-Fragments, bei dem der Anteil der B-Zellen im Mittel mit 91,2%±55,5 nahezu unverändert blieb. Abb. 21: Fc-Abhängigkeit der B-Zell-Depletion. Unbehandelter (n=19) und Pepsin-verdauter anti-CD20 IgG1 (n=4) wurden intravenös in humanisierte Mäuse injiziert und der Anteil der CD19+ Zellen vor und 24h nach Injektion durchflusszytometrisch bestimmt. Als Alternative zum F(ab)2 Fragment wurde eine mutierte Variante des 1F5 IgG1 injiziert, die an Aminosäureposition 297 ein Alanin anstelle des Asparagin trägt (N297A). Diese Mutation verhindert die für eine effiziente Interaktion mit FcγR bzw. C1q notwendige Glykosylierung der IgG schweren Kette. Während die Injektion des 1F5 IgG1 zu einer Reduktion der BZellen im peripheren Blut auf 6,7%±5,6 führte, zeigte sich bei Gabe von 1F5 IgG1 N297A eine verschlechterte B-Zell-Depletion. Innerhalb von 24h nach Injektion nahm der Anteil der CD19+ Zellen auf 15,2%±16,3 ab (Abb. 22). Abb. 22: Fc-Abhängigkeit der B-Zell-Depletion. Je 10µg 1F5 IgG1 (n=19) oder 1F5 IgG1 N297A (n=5) wurden intravenös in humanisierte Mäuse injiziert und der Anteil der CD19+ Zellen vor und 24h nach Injektion durchflusszytometrisch bestimmt. 7.2) B-Zell-Depletion in Blut, Milz und Knochenmark Die Effizienz der 1F5 IgG vermittelten B-Zell-Depletion wurde durch Injektion von 100µg Antikörper in humanisierte Mäuse im Blut, in der Milz und im Knochenmark bestimmt. Die durchflusszytometrische Analyse erfolgte 3 Tage nach der Injektion von PBS bzw. anti-CD20 IgG1 in je 2 Mäuse. Zusätzlich wurde je eine Maus mit den anti-CD20 IgG Subtypen IgG2 und IgG3 injiziert. Außerdem wurde der Anteil der B-Zellen im peripheren Blut von 8 Patienten, die sich einer Behandlung mit einem therapeutischen anti-CD20 IgG1 Antikörper (Rituximab) unterziehen, vor und 24 Stunden nach Rituximab-Gabe bestimmt. 41 Ergebnisse Abb. 23: Anti-CD20 IgG induzierte B-Zell-Depletion. A) Exemplarische Darstellung der durchflusszytometrischen Analyse der CD19+/IgM+ B-Zell-Population im Blut, in der Milz und im Knochenmark humisierter Mäuse (3 Tage nach Gabe von PBS bzw. 1F5 IgG1) und im Blut von Rituximab-Patienten (vor bzw. 24h nach Antikörpergabe). B) Quantifizierung des Anteils CD19+/IgM+ Zellen nach Gabe von Rituximab (n=8) bzw. Injektion von PBS (n=4) oder 100µg 1F5 IgG1 (n=2). C) Immunfluoreszenz CD19+ Zellen in der Milz einer PBS und einer 1F5 IgG1 behandelten humanisierten Maus. D) Quantifizierung des Anteils CD19+/IgM+ Zellen nach Injektion von 100µg 1F5 IgG2 bzw IgG3 (n=1). In Abb. 23A ist je ein typisches Beispiel einer PBS- bzw. 1F5 IgG1 behandelten humanisierten Maus und eines humanen Patienten unter Rituximab-Therapie dargestellt. Die statistische Auswertung ist in Abb. 23B gezeigt. Die Leukozyten im peripheren Blut der PBSbehandelten humanisierten Mäuse bestanden im Mittel zu 77%±15,9 aus reifen B-Zellen, die durch die Koexpression von CD19 und IgM auf der Zelloberfläche gekennzeichnet sind. Im weiteren konnte im Blut mancher humanisierter Mäuse eine CD19+/IgM- Population identifiziert werden. Im Gegensatz dazu exprimierten im humanen peripheren Blut alle CD19+ 42 Ergebnisse B-Zellen auch IgM. Der Anteil der reifen B-Zellen betrug hier aber nur 16,1%±12,9 der PBMCs. In der Milz PBS-behandelter humanisierter Mäuse waren 74,5%±9,2 der Leukozyten reife B-Zellen. Im Knochenmark betrug deren Anteil an der Leukozytenpopulation 36,5%±21,4. In beiden Organen waren prominente Populationen von CD19+/IgM- B-Zell-Vorläufern zu beobachten. Die Injektion von 100µg 1F5 IgG1 führte im peripheren Blut zu einer effizienten Depletion der reifen B-Zellen. Im Vergleich zu den PBSbehandelten Mäusen waren nach 3 Tagen im Mittel nur noch 0,6%±0,3 CD19+/IgM+ Zellen vorhanden. Im Blut der Rituximab-behandelten Patienten sank der Anteil CD19+/IgM+ Zellen signifikant auf 9,6%±5,8. In der Milz waren die CD19+/IgM+ Zellen nach Injektion von 1F5 IgG1 auf 8,2%±8,7 reduziert. Im Knochenmark kam es zu einer verminderten Depletion auf 57,1%±15,0 in 1F5 IgG injizierten Tieren (Abb. 23B). Je eine weitere humanisierte Rag2/γc/Fcγ-/- Maus wurde mit 100µg 1F5 IgG2 bzw. IgG3 injiziert. Die Gabe von 1F5 IgG2 führte zu einer Reduktion der IgM+/CD19+ B-Zellen auf 16,3% in der Milz und 21,8% im Knochenmark. Nach Injektion von 1F5 IgG3 konnten in der Milz noch 6,6% und im Knochenmark 21,1% IgM+/CD19+ B-Zellen detektiert werden (Abb. 23D). Die Depletion von B-Zellen nach anti-CD20 IgG1 Gabe konnte in der Milz auch durch Immunfluoreszenzfärbung mit einem CD19-spezifischen Antikörper gezeigt werden. Während in Schnitten PBS-behandelter Mäuse die CD19+ Zellen lose verteilt vorlagen, konnten diese in IgG-behandelten Milzschnitten nicht mehr beobachtet werden (Abb. 23C). Zusammenfassend führt die Injektion von anti-CD20 IgG zu einer effizienten Depletion von CD19+/IgM+ B-Zellen im peripheren Blut, in der Milz und im Knochenmark humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse. 7.3) Depletion reifer B-Zell-Populationen Milz und Knochenmark In der Milz und im Knochenmark der humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- erfolgte die genauere durchflusszytometrische Analyse der depletierten B-Zell-Populationen. In Abb. 23 sind exemplarisch die Ergebnisse je einer PBS- und einer mit 100µg 1F5 IgG1 behandelten Maus an Tag 3 nach der Injektion dargestellt. In der Milz humanisierter Mäuse konnten sehr frühe B-Zell-Vorläufer, die CD10+/CD34+ ProB-Zellen, nur in geringer Anzahl in den Kontrollmäusen und in den depletierten Mäusen identifiziert werden. Die Koexpression von CD10 und IgM kennzeichnet reifere B-ZellEntwicklungsstufen. In der Milz humanisierter Mäuse machen diese Zellen den Großteil der Leukozyten aus. Die Injektion von 1F5 IgG führt zu einer Verminderung CD10+/IgM+ Zellen aber nicht zu einer vollständigen Depletion. Dahingegen konnten die CD10+/IgM- B-ZellVorläufer weiter detektiert werden. Naive B-Zellen aus, die bisher keinen Antigenkontakt hatten, sind durch die Koexpression von IgM und IgD gekennzeichnet. Diese Zellen werden durch die Injektion von 1F5 IgG fast vollständig depletiert. IgM+/CD27+ Gedächtnis-B-Zellen 43 Ergebnisse waren ebenfalls nur in Kontrollmäusen nicht aber in IgG behandelten Mäusen vorhanden (Abb. 24A). Abb. 24: 1F5 IgG induzierte Depletion von B-Zell-Subpopulationen in humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/Mäusen. Dargestellt ist exemplarisch die durchflusszytometrische Analyse früher und reiferer CD19+ B-Zellen in je einer PBS-behandelten Kontrollmaus und einer mit 100µg 1F5 IgG1 injizierten Maus. A) Milz. B) Knochenmark. Im Knochenmark wurden CD10+/CD34+ Pro-B-Zellen sowohl nach Gabe von PBS als auch 1F5 IgG identifiziert. Im Vergleich zur Kontrollmaus waren CD10+/IgM+ B-Zellen in der IgGbehandelten Maus kaum vermindert. Die reiferen IgM+/IgD+ Stadien der B-Zell-Entwicklung, waren dagegen nur in PBS-injizierten Mäusen vorhanden. Gedächtnis-B-Zellen konnten im Knochenmark nicht detektiert werden (Abb. 24B). Die Gabe von hohen Dosen (100µg) 1F5 IgG verursacht in der Milz und im Knochenmark eine Depletion von reifen B-Zellen, die durch die Koexpression von IgM und IgD gekennzeichnet sind. CD10-exprimierende B-Zellen werden dagegen nur eingeschränkt depletiert. CD20+ Zellen konnten nach 1F5 IgG Injektion nicht nachgewiesen werden. 44 Ergebnisse 7.4) 1F5 IgG vermittelte B-Zell-Depletion im Blut Letztendlich wurde das humanisierte Mausmodell verwendet, um den Einfluss der FcγR Polymorphismen auf die Interaktion von IgG und FcγR und damit die biologische Wirksamkeit der IgG Subklassen in vivo zu untersuchen. Die Dosis der intravenös injizierten IgG wurde hierfür von 100µg auf 10µg pro Maus reduziert um mögliche Unterschiede in der Depletionseffizienz besser verfolgen zu können. Die durchflusszytometrische Bestimmung der B-Zellen wurde im peripheren Blut vor und 1, 3 und 7 Tage nach Antikörpergabe in je 3 Mäusen durchgeführt. Dabei wurde die Zellzahl aller CD19+ Zellen bestimmt, da B-Zellen im Blut CD19 und IgM koexprimieren. Zunächst wurde die B-Zell-Depletion der verschiedenen 1F5 IgG Subtypen im genetischen Hintergrund FcγRIIA131H/R und FcγR158F/V verglichen. Beispielhaft ist die B-Zell-Depletion im peripheren Blut durch IgG1 bzw. IgG4 in Abb. 25A gezeigt. Vor Injektion (Tag 0) bestanden die PBMCs beider Proben fast ausschließlich aus CD19+ Zellen. Schon 24h nach Injektion von IgG1 kam es zu einer drastischen Reduktion der B-Zellen von 2896 auf 226. Bis zu Tag 3 konnte dann ein leichter Anstieg auf 278 Zellen beobachtet werden. Eine weitere Erholung der CD19+ Zellen konnte im Blut nicht beobachtet werden. An Tag 7 waren nur 227 der analysierten PBMCs B-Zellen. Die Injektion von 10µg IgG4 führte in der abgebildeten humanisierten Maus zunächst nur zu einer verminderten Abnahme der B-Zellen von 1557 auf 814 nach 24h. Bis zu Tag 3 nach Antikörpergabe kam es nochmals zu einer Reduktion auf 67 CD19+ Zellen. Zur Analyse an Tag 7 kam es zu einer leichten Erholung. Es konnten 199 B-Zellen detektiert werden. Abb. 25B zeigt die Quantifizierung und den Zeitverlauf der B-Zell-Depletion für alle IgG Subklassen. Als Ausgleich für variable Nullwerte der B-Zell-Population, wurden für jede einzelne Maus die bestimmten B-Zellen vor Injektion auf 100% festgelegt und die Werte nach Antikörpergabe entsprechend umgerechnet. Im Mittel führte die Gabe von 1F5 IgG1 an Tag 1 zu einer Depletion auf 7,8%±2,2 der PBMCs. An Tag 3 war die B-Zell-Population auf 8,8%±5,5 reduziert, bevor sie an Tag 7 nochmals leicht auf 6,2%±2,4 sank. IgG2 depletierte innerhalb von 24h schlechter als IgG1. An Tag 1 betrug der Anteil der B-Zellen an den PBMCs noch 23,0%±24,8, an Tag 3 fiel er auf 8,9%±9,9 und am Tag 7 nach Antikörpergabe lag er bei 7,7%±6,2. Auch die Injektion von 1F5 IgG3 verursachte eine Abnahme der B-ZellPopulation auf 22,9%±7,7 nach 24h. Im weiteren Verlauf erreichten die B-Zellen einen Anteil von 5,2%±1,8 nach 3 Tagen bzw. 10,1%±2,3 an Tag 7 nach Antikörperinjektion. Im Vergleich zu IgG1, IgG2 und IgG3 war die B-Zell-Depletion innerhalb von 24h nach Gabe von 1F5 IgG4 schwächer ausgeprägt. Während es zunächst zu einer Abnahme der B-Zellen auf 66,7%±42,1 an Tag 1 kam, erreichten die B-Zellen mit 11%±9,0 an Tag 3 und 15%±12,8 an Tag 7 ähnliche Werte wie bei Injektion von 1F5 IgG1, IgG2 und IgG3. 45 Ergebnisse Abb. 25: Anti-CD20 IgG induzierte Depletion im peripheren Blut humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/(FcγRIIA131H/R, FcγIIIA158F/V). A) Beispiel einer durchflusszytometrischen Analyse des Zeitverlaufs der B-Zell-Depletion nach Injektion von 1F5 IgG1 bzw. IgG4. B) Quantifizierung CD19+ Zellen während der IgG induzierten B-Zell-Depletion an Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach Antikörpergabe. Der jeweilige Anteil der B-Zellen wurde auf den Ausgangswert der individuellen Mäuse umgerechnet (Tag 0: 100%). Linien markieren den arithmetischen Mittelwert der untersuchten Mäuse. Diese Experimente zeigen die durch 1F5 IgG induzierte Abnahme der B-Zellen im peripheren Blut humanisierter Mäuse. Die IgG Subklassen 1, 2 und 3 weisen in Gegenwart der FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Varianten eine vergleichbare biologische Wirksamkeit auf. Auch 1F5 Antikörper der Subklasse IgG4 waren unter diesen experimentellen Bedingungen, wenn auch verzögert, in der Lage B-Zellen effizient zu depletieren. 46 Ergebnisse 7.5) Einfluss der FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Polymorphismen Die IgG induzierte B-Zell-Depletion im peripheren Blut humanisierter Mäuse wurde genutzt um die biologische Wirksamkeit der IgG Antikörper in Abhängigkeit von FcγRIIA131H/R bzw. FcγRIIIA158F/V zu analysieren. Humanisierten Mäusen, die entweder homozygot die hochaffine oder die niedrigaffine Variante des jeweiligen FcγR exprimierten, wurden je 10µg IgG1 oder IgG2 intravenös injiziert. Mittels Durchflusszytometrie konnte der Anteil der CD19+ Zellen an den PBMCs vor und 24h nach Antikörpergabe bestimmt werden. Abb. 26: Anti-CD20 IgG induzierte B-Zell-Depletion im peripheren Blut humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/-in Abhängigkeit vom FcγRIIA131H/R Polymorphismus. Der Anteil der CD19+ Zellen an Tag 1 nach Injektion von 1F5 IgG1 (A) bzw. IgG2 (B) wurde auf den Ausgangswert der individuellen Mäuse umgerechnet (Tag 0: 100%). Linien markieren den arithmetischen Mittelwert der untersuchten Mäuse. Nach Injektion von 1F5 IgG1 kam es in Mäusen, die den niedrigaffinen FcγRIIA131R/R exprimierten, zu einer Reduktion der B-Zellen auf 7,7%±7,9. In Gegenwart von FcγRIIA131H/H konnte nur eine minimal verstärkte B-Zell-Depletion beobachtet werden. Der Anteil der CD19+ Zellen betrug im Durchschnitt 4,0%±3,4 (Abb. 26A). Deutlicher aber dennoch nicht signifikant war die Allelabhängigkeit der Depletion für 1F5 IgG2. 24h nach Antikörperinjektion konnten im peripheren Blut von FcγRIIA131R/R Mäusen noch 21,1%±32,1 B-Zellen identifiziert werden. Bei FcγRIIA131H/H sank der Anteil der CD19+ Zellen dagegen auf 5,3%±3,3 ab (Abb. 26B). Im peripheren Blut von FcγRIIIA158F/F exprimierenden Mäusen führte die Injektion von IgG1 zu einer Abnahme der CD19+ auf 5,5%±4,6. Bei Vorhandensein von FcγRIIIA158V/V wurden die B-Zellen dagegen nur auf 7,4%±9,0 reduziert (Abb. 27A). Auch IgG2 verursachte in FcγRIIIA158F/F Mäusen eine Depletion der B-Zellen auf 23,0%±31,1. Die biologische Wirksamkeit von IgG2 erhöhte sich in Anwesenheit des hochaffinen FcγRIIIA158V/V, da der Anteil der CD19+ Zellen nur noch 9,0%±6,3 betrug (Abb. 27B). Dieser Unterschied war nicht signifikant. 47 Ergebnisse Abb. 27: 1F5 IgG induzierte B-Zell-Depletion im peripheren Blut humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/- in Abhängigkeit vom FcγRIIIA158F/V Polymorphismus. Der Anteil der CD19+ Zellen an Tag 1 nach Injektion von 1F5 IgG1 (A) bzw. IgG2 (B) wurde auf den Ausgangswert der individuellen Mäuse umgerechnet (Tag 0: 100%). Linien markieren den arithmetischen Mittelwert der untersuchten Mäuse. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse auf einen Einfluss der FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Polymorphismen auf die B-Zell-Depletion durch IgG2 hin. 8. anti-CD20 IgG vermittelte Regulation von FcγR In den humanisierten Mäusen kommt es nach Injektion von 1F5 IgG zur Depletion von BZellen. Die bisherigen Ergebnisse lassen vermuten, dass dies zumindest teilweise von der Interaktion der IgG mit FcγR abhängig ist. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die Induktion der ADCC auf die Oberflächenexpression der FcγR auswirkt. In mit PBS bzw. 100µg IgG injizierten humanisierten Mäusen wurde daher die FcγR-Expression von CD33+ myeloiden und CD56+ NK-Zellen in Milz und Knochenmark mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zum Vergleich erfolgten diese Untersuchungen auch im peripheren Blut der Rituximab-behandelten Patienten. Abb. 28 zeigt die Veränderungen in der FcγR Expression in 1F5 IgG behandelten humanisierten Mäusen. Die durchflusszytometrisch bestimmten MFIs der einzelnen FcγR wurden auf die in PBS-behandelten Kontrollmäusen erhaltenen Werte bezogen. In der Milz humanisierter Mäuse kam es, nach Injektion der 1F5 IgG, auf der Oberfläche von CD33+ Zellen zu einer Reduktion des FcγRIIA-Signals auf 0,65AU±0,11. Noch ausgeprägter war die Abnahme des inhibitorischen FcγRIIB (0,43AU±0,2). Dagegen waren im Mittel weder FcγRIA (0,94AU±0,17) oder FcγRIIIA (1,17AU±1,18) durch die IgG Injektion verändert (Abb. 28A). Im Knochenmark kam es ebenfalls zu Veränderungen der FcγR Expression auf CD33+ Zellen. Die Signalintensität des hochaffinen FcγRIA stieg auf 1,54AU±0,76 an. Dagegen konnte FcγRIIA (0,77AU±0,4) nur vermindert detektiert werden. FcγRIIB wurde auf der Zelloberfläche verstärkt identifiziert (1,16AU±0,55) und FcγRIIIA blieb mit 1,0AU±0,41 48 Ergebnisse unverändert (Abb. 28B). Auf CD56+ NK-Zellen kam es zu einer verstärkten Detektion von FcγRIIIA nach IgG Injektion. In der Milz konnte im Mittel eine Steigerung auf 2,88AU±1,14 und im Knochenmark auf 1,53AU±2,1 nachgewiesen werden (Abb. 28C). Abb. 28: Veränderte FcγR Expression auf CD33+ Zellen in Milz (A), Knochenmark (B) und auf CD56+ Zellen (C) humanisierter Rag2/γc/Fcγ-/Mäuse. Durchflusszytometrische Bestimmung der Oberflächenexpression der FcγR. Die MFI der mit 100µg 1F5 IgG-behandelten Mäuse wurde auf die MFI der PBS-Kontrollmäuse normalisiert. Auch im peripheren Blut der Rituximab-Patienten wurde der FcγR Expressionsstatus auf myeloiden Zellen und NK-Zellen bestimmt. In Abb. 29 sind die MFI vor und 24h nach Rituximab-Gabe dargestellt. Während es in CD33+ Zellen zu einer signifikant verstärkten Expression von FcγRIA nach IgG Applikation kam (Abb. 29A), schien die Signalintensität von FcγRIIA abzunehmen (Abb. 29B). Für FcγRIIB kam es dagegen zu einer signifikanten Herunterregulation auf der Oberfläche von CD33+ Zellen (Abb. 29C). Auch bei der Expression von FcγRIIIA konnte eine Abnahme nach Rituximab-Gabe beobachtet werden (Abb. 29D). In CD56+ NK-Zellen war die MFI von FcγRIIIA signifikant vermindert (Abb. 29E). Die Ergebnisse zeigen eine veränderte FcγR-Expression auf myeloiden Zellen und NK-Zellen nach Applikation von anti-CD20 IgG Antikörpern sowohl im humanisierten Mausmodell als auch in humanen Patienten. 49 Ergebnisse Abb. 29: Veränderte FcγR Expression in Rituximab-behandelten Patienten vor und 24h nach IgG Gabe im peripheren Blut. Durchflusszytometrische Bestimmung der Oberflächenexpression (MFI) von A) FcγRIA, B) FcγRIIA, C) FcγRIIB und D) FcγRIIIA auf CD33+ Zellen. E) Analyse der FcγRIIIAExpression auf CD56+ Zellen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass im zweiten Teil der Arbeit ein humanisiertes Mausmodell etabliert wurde, das durch ein humanes Immunsystem mit B- und T-Lymphozyten, myeloiden Zellen, NK-Zellen und DCs gekennzeichnet ist. Die Injektion von 1F5 IgG führte zu einer Fc-abhängigen Depletion reifer B-Zellen im Blut, in der Milz und im Knochenmark. Für den Isotyp IgG2 war diese Depletion durch die FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V Polymorphismen beeinflusst. Während der B-Zell-Depletion kam es zu veränderten FcγR-Expressionsmustern auf den CD33+ und CD56+ Effektorzellen der ADCC. 50 Diskussion E. Diskussion I. In vitro Bindung von Immunkomlexen an humane FcγR Im ersten Teil dieser Dissertation wurde die Bindung von humanen IgG Immunkomplexen an humane FcγR untersucht. IgG Antikörper treten im Serum in monomerer Form oder, in Verbindung mit Bindungsaffinitäten ihrem und Antigen, als -spezifitäten Immunkomplexe humaner FcγR auf. Publizierte basieren Daten vorwiegend zu auf Untersuchungen zur Interaktion von monomerem IgG und löslichen FcγR mittels surface plasmon resonance (SPR) und ELISA. So zeigen SPR Analysen eine starke Bindung von IgG1, 3 und 4, nicht aber von IgG2, an den hochaffinen FcγRIA. IgG1 und IgG3 interagieren zudem mit FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA, während IgG2 und IgG4 für diese Rezeptoren nur eine geringe Affinität aufweisen [62, 127]. In ELISA Experimenten kann dagegen keine Bindung von IgG2 an FcγRIIA und FcγRIIB detektiert werden [55]. In weiterführenden Studien wurde der Einfluss von Polymorphismen in den Genen der aktivierenden FcγRIIA, bei dem es zu einem Aminosäureaustausch an Position 131 von Arginin zu Histidin kommt, und FcγRIIIA, bei dem an Aminosäureposition 158 Phenylalanin oder Valin auftritt, untersucht. Während FcγRIIA131H die Interaktion mit humanem IgG2 ermöglicht [128], scheint sich der Polymorphismus mit Bindungskonstanten von 1-4x106M-1 dagegen kaum auf die Interaktion mit IgG1, IgG3 und IgG4 auszuwirken [62]. In vitro Versuche mittels ELISA zeigen außerdem eine verbesserte Interaktion von FcγRIIIA158V mit IgG1 und IgG3. Im Gegensatz zu FcγRIIIA158F, ist FcγRIIIA158V auch in der Lage mit IgG4 zu interagieren [63, 65]. Dies konnte durch SPR Analysen bestätigt werden, bei denen alle IgG, vor allem aber IgG2, verstärkt mit FcγRIIIA158V interagieren [62]. Mithilfe dieser Analysen konnte eine gewisse Subklassenspezifität der humanen FcγR für monomere IgG nachgewiesen werden. Unter in vivo Bedingungen ist vorwiegend die FcγRBindung von Immunkomplexen relevant, da die Aktivierung der Immunzellen und damit die Induktion von Antikörpereffektorfunktionen durch Kreuzvernetzung mehrerer FcγR initiiert wird [41]. In der Literatur ist die Herstellung von Immunkomplexen sowohl durch F(ab)2vermittelte Kreuzvernetzung der IgG, durch Hitzeaggregation [62] als auch durch chemische Kopplung [13] beschrieben. In dieser Arbeit wurden Immunkomplexe gezielt und Antigenspezifisch generiert, indem gegen das Hapten TNP-gerichtete IgG Antikörper (Klon 7B4) und TNP-gekoppeltes BSA koinkubiert wurden. Diese standardisierten Immunkomplexe ermöglichen unter Verwendung von TNP-BSA in verschiedenen Kopplungsstufen zusätzlich eine Steuerung der Immunkomplexgröße. Zur Analyse der Immunkomplexbindung wurden der hochaffine FcγRIA und die niedrigaffinen FcγRIIA, FcγRIIB und eFcγRIIIA, d.h. ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen von FcγRIIIA und den intrazellulären 51 Diskussion Domänen von FcγRIIB, stabil in CHO Zellen exprimiert (vgl. Abb. 6). Für FcγRIIA, nicht aber FcγRIIIA, konnten auch die polymorphen Varianten 131H und 131R untersucht werden. Auf diese Weise konnten wir eine vergleichbare Interaktion der humanen IgG Subklassen mit dem hochaffinen FcγRIA zeigen. Dagegen interagierten IgG1 und IgG3 Antikörper besser mit den niedrigaffinen FcγR als IgG2 und IgG4. Eine Bindung dieser beiden Subklassen konnte nur für FcγRIIIA und den polymorphen FcγRIIA131H festgestellt werden. Überhaupt wurde für FcγRIIA131H eine verstärkte Interaktion mit allen IgG beobachtet. Der inhibitorische FcγRIIB, der an Aminosäureposition 131 ebenfalls ein Arginin trägt, zeigte mit allen humanen IgG Subklassen die schwächste Interaktion (vgl. Abb. 7). Damit stimmen unsere Ergebnisse mit bisherigen Studien F(ab)2-vermittelter Immunkomplexe an stabil exprimierte FcγR überein [62]. Dennoch könnte die in dieser Arbeit bestimmte allgemein verminderte Interaktion von IgG2 und IgG4 auch auf eine verringerte Bindung an TNP-BSA zurückzuführen sein (vgl. Abb. 5C). Da für die Klonierung der einzelnen Subklassen die gleichen variablen Domänen verwendet wurden, kann dies nur durch einen Einfluss der konstanten Regionen auf die Antigenbindung erklärt werden. In unserem experimentellen System stellten wir zudem eine verstärkte Bindung von TNP-26-BSA im Vergleich zu TNP-4-BSA Immunkomplexen an die niedrigaffinen FcγR fest. Dies weist darauf hin, dass nicht nur die Affinität sondern auch die Avidität einen Einfluss auf die IgG-FcγR Interaktion hat, wodurch Differenzen zwischen in vitro und in vivo Beobachtungen erklärt werden könnten. Auch wenn in dieser Arbeit nicht gezeigt werden konnte, dass mit TNP-26-BSA generierte Immunkomplexe tatsächlich größer sind als mit TNP-4-BSA hergestellte Komplexe, so ist die Bindung einer höheren Anzahl von anti-TNP IgG an BSA mit 26 TNP-Molekülen und eine stärkere Vernetzung verschiedener TNP-BSA-Komplexe dennoch wahrscheinlich. Mittels Größenausschluss-Chromatographie könnte diese Hypothese bewiesen werden. Eine verstärkte Bindung von TNP-26-BSA Immunkomplexen an die niedrigaffinen FcγR kann dagegen nicht auf eine verbesserte Interaktion mit 7B4 IgG zurückgeführt werden (vgl. Abb. 5). Sowohl für murine als auch humane IgG Antikörper ist die Glykosylierung am Asparagin 297 der schweren Ketten als essentiell für eine Interaktion mit FcγR beschrieben. Eine Mutation des N297 zu Alanin verhindert in SPR Analysen die Bindung an FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA [56]. Auch nach der enzymatischen Deglykosylierung mit Endoglykosidase S (EndoS) kann keine Interaktion der monomeren IgG1, 3 und 4 mit FcγRIIA und FcγRIIB detektiert werden [55]. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der N297 Glykosylierung auf die Bindung von TNP-BSA Immunkomplexen an stabil exprimierte FcγR untersucht. Hierfür wurden die 7B4 IgG mit dem Enzym PNGaseF deglykosyliert, das alle mannoseenthaltenden Zuckerketten direkt am Asparagin schneidet. Somit wird, im Gegensatz zu EndoS, eine vollständige Deglykosylierung ähnlich der N297A Mutation erreicht. Durch die 52 Diskussion PNGaseF Behandlung konnte die Immunkomplexbindung an die niedrigaffinen FcγRIIA131H, FcγRIIA131R und FcγRIIB reduziert aber nicht vollständig unterbunden werden. IgG1 und IgG3 Immunkomplexe waren dagegen in ihrer Interaktion mit FcγRIIIA weniger von der Deglykosylierung beeinflusst. Der hochaffine FcγRIA interagierte mit den deglykosylierten IgG1 und IgG3 Immunkomplexen nur unwesentlich schlechter als mit den unbehandelten Antikörpern. Bei diesen Untersuchungen wurde weiterhin deutlich, dass größere Immunkomplexe in vitro eine durch Deglykosylierung verursachte reduzierte Affinität durch eine höhere Avidität teilweise kompensieren können (vgl. Abb. 8). Für murine IgG ist die N297 Glykosylierung in vivo essentiell um FcγR-vermittelte Effekte induzieren zu können [1, 54]. Inwiefern sich die Deglykosylierung von IgG auf die Induktion von Antikörpereffektorfunktionen durch humane FcγR in vivo auswirkt, konnte dagegen bisher nicht untersucht werden. Auch im Hinblick auf derartige Fragestellungen wurde im Folgenden ein humanisiertes Mausmodell etabliert, dass der Untersuchung der humanen IgG-FcγR Interaktion dient. II. Etablierung eines humanisierten Mausmodells Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell etabliert, welches sich durch ein humanes Immunsystem auszeichnet. Mithilfe dieses Modells war es möglich, humane Antikörpereffektorfunktionen, die durch die Interaktion von IgG und FcγR induziert werden, zu analysieren. Inbesondere sollten Einflussfaktoren auf diese Interaktion wie z.B. Polymorphismen der humanen aktivierenden FcγR untersucht werden. Aufgrund von fehlenden Modellsystemen konnten derartige Untersuchungen bisher nicht in vivo durchgeführt werden. Wie bereits in der Literatur beschrieben, kann durch Transplantation von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Rag2/γc-/- Mäuse eine Rekonstitution des humanen Immunsystems erreicht werden. Die Immundefizienz dieser Tiere, die durch das Fehlen von funktionellen B- und T-Lymphozyten und NK-Zellen verursacht wird, verhindert die Abstoßung der transplantierten Zellen [102, 107]. Für die Etablierung unseres humanisierten Mausmodells wurden dagegen Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse verwendet. Die zusätzliche Deletion der Fcγ Kette in diesen Mäusen ist notwendig, da humane IgG an die murinen FcγR binden und darüber Antikörpereffektorfunktionen auslösen können. Da Rag2/γc/Fcγ-/- keine aktivierenden murinen FcγR exprimieren (vgl. Abb. 10), werden die zu analysierenden IgG-induzierten Effekte nur von humanen Immunzellen vermittelt. Vor dem Zelltransfer wurden die neugeborenen Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse zusätzlich sublethal bestrahlt, um die murinen Immunzellen zu zerstören und damit eine Einnistung der humanen Zellen zu erleichtern. Die Rekonstitution der Mäuse erfolgte mit aus Nabelschnurblut aufgereinigten, CD34+ humanen 53 Diskussion hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Die in dieser Arbeit verwendeten Stammzellpräparationen enthielten im Mittel 80% weitgehend undifferenzierte CD34+ HSC (vgl. Abb. 11). Für diese Zellen ist beschrieben, dass sie nach dem Xenotransfer zu einer langanhaltenden Humanisierung und der Entwicklung aller Leukozytenarten in den Empfängermäusen führen [107, 129]. Problematisch ist dagegen der Transfer von ebenfalls in unseren aufgereinigten Stammzellproben enthaltenen T- und NK-Zellen. Diese Zellen können direkt die sog. graft versus host disease auslösen, d.h. das murine Empfängergewebe schädigen. Dies ist in unserem humanisierten Mausmodell nicht wahrscheinlich, da die von uns transplantierten Stammzellproben nur sehr geringe Mengen von T- und NK-Zellen enthielten. Die Transplantation von HSC in bestrahlte Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse führte zur Entwicklung humaner Immunzellen, die innerhalb von 3 Monaten im peripheren Blut nachgewiesen werden konnten. Insgesamt wiesen 24% der xenotransplantierten Mäuse humane Zellen im Blut auf. Die Effizienz der Humanisierung und der Anteil der humanen Zellen hing dabei stark von der verwendeten Bestrahlungsdosis ab. Durch Erhöhung der Dosis von 3,5Gy auf 6Gy konnte der Anteil hCD45 exprimierender Zellen im Mittel auf 32% gesteigert werden. Allerdings traten große individuelle Schwankungen zwischen den Mäusen auf. Die Sterblichkeit der Mäuse lag innerhalb von 12 Wochen zwischen 14% (bei 4,5Gy und 4,75Gy) und 43% (bei 4,25Gy), wobei Bestrahlungsdosen über 6Gy in allen Fällen tödlich waren. Daraus ergeben sich als optimale Dosen 4,75Gy, bei der die meisten humanisierten Mäuse generiert werden konnten, und 6Gy, bei der der Anteil humaner Zellen maximal war (vgl. Abb. 13). Eine mögliche Steigerung der Humanisierungseffizienz durch eine Erhöhung der Anzahl transplantierter HSC wurde nicht konsequent untersucht. In der Regel wurden 50.000 HSC pro Maus transplantiert. Eine Injektion von bis zu 76.000 Zellen schien die Effizienz nicht zu verbessern. Bisherige Studien mit humanisierten Mäusen zeigen, dass die Rekonstitution in Abhängigkeit vom Alter der Mäuse, des verwendeten immundefizienten Stammes und der injizierten Zellzahl, zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führt: Nach dem Xenotransfer von HSC in adulte NOD/scid Mäuse konnten 1-30% humane Zellen im Blut und in der Milz nachgewiesen werden [105]. Eine deutliche Steigerung wurde durch Verwendung von NOD/scid/γc-/- Mäusen erzielt. Adulte Mäuse enthielten nach der Transplantation im Blut 25% [106] und neugeborene Mäuse in Blut, Milz und Knochenmark sogar 50-70% humane Zellen [104]. Der intrahepatische Transfer in neugeborene Rag2/γc-/Mäuse führte mit 60-65% humanen Zellen in Milz und Knochenmark [107] ebenfalls zu sehr guten Ergebnissen. Trotzdem in dieser Arbeit die scheinbar optimalen Bedingungen auf den neu generierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mausstamm angewendet wurden, ist die Humanisierungseffizienz und vor allem der Anteil der humanisierten Mäuse geringer als in der Literatur beschrieben und bedarf somit weiterer Optimierung. Da als mögliche Ursache 54 Diskussion eine reduzierte Strahlensensitivität der murinen Zellen in Frage kommt, generieren wir momentan neue auf Rag2/γc/Fcγ-/- basierende Mausstämme durch Einkreuzung anderer genetischer Hintergründe mit einer erhöhten Strahlensensitivität. Der wichtige Einfluß des genetischen Hintergrundes wird durch den Rag2/γc-/- Mausstamm belegt, der auf einen reinen C57BL/6 Hintergrund gekreuzt wurde und kaum noch humanisierbar ist [130]. Die humanisierten Mäuse wurden mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz auf das Vorhandensein der humanen Leukozytenpopulationen untersucht. Diese Analysen wurden hauptsächlich in Blut, Milz und Knochenmark durchgeführt, da es zu diesem frühen Zeitpunkt noch nicht zur Ausbildung von Lymphknoten kam. Hierbei konnten humane Proben zum Vergleich herangezogen werden, die von freiwilligen Spendern im Labor oder über Frau Prof. Dr. Diana Dudziak zur Verfügung gestellt wurden. Im Alter von etwa 12 Wochen konnten in Blut, Milz und Knochenmark der humanisierten Mäuse humane B- und TLymphozyten, NK-Zellen, dendritische Zellen und CD33 exprimierende myeloide Zellen identifiziert werden. Anhand von Größe und Granularität der Zellen handelte es sich dabei vermutlich großteils um Monozyten und nicht um Granulozyten. FcγRIIIB exprimierende Granulozyten konnten nur in sehr geringem Maße nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Im Knochenmark wurde außerdem eine CD34+ Vorläufer-Zell-Population identifiziert. Dies deutet auf die erfolgreiche Einnistung der transplantierten Zellen hin und gewährleistet somit eine andauernde Hämatopoese. In allen drei untersuchten Organen machten B-Zellen den Großteil der Leukozyten aus (vgl. Abb. 15). Dieser Überschuss an BZellen zu diesem frühen Zeitpunkt nach der Transplantation ist auch für andere humanisierte Mausmodelle [107] und Menschen nach Knochenmarkstransplantation beschrieben (persönliche Kommunikation). Diese Zellen schienen den normalen Reifungsprozess vom Knochenmark ausgehend in die Milz und die Peripherie zu durchlaufen, der durch eine Zunahme IgM exprimierender B-Zellen gekennzeichnet ist. Bei CD20 handelt es sich um einen weiteren B-Zell-spezifischen Oberflächenmarker, dessen Expression während der BZell-Differenzierung zunimmt [131], was in dieser Arbeit bestätigt werden konnte (vgl. Abb. 19 und 20). Eine Antigen-vermittelte Aktivierung der B-Zellen und die daraufhin induzierte Bildung von Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen konnte in unseren naiven humanisierten Mäusen kaum beobachtet werden. Zusammenfassend scheint es, wie in der Literatur beschrieben, nach dem Transfer humaner HSC zur andauernden Differenzierung der lymphoiden und myeloiden hämatopoetischen Linien zu kommen [104, 105]. Eine Langzeitbeobachtung unserer humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse und eine Überprüfung der Funktionalität des Immunsystems wurde dagegen bisher nicht durchgeführt. Grundsätzlich können in humanisierten Mäusen aber B- und T-Zell-vermittelte Immunantworten nachgewiesen werden [104]. 55 Diskussion Nach Identifikation der verschiedenen Immunzellen wurden die Mäuse auch hinsichtlich der Expression der humanen FcγR auf myeloiden Zellen und NK-Zellen untersucht. Während CD33+ myeloide Zellen in Blut, Milz und Knochenmark die humanen aktivierenden FcγRIA und FcγRIIA in ähnlichem Ausmaß exprimierten wie die humanen Zellen, war das Expressionsniveau des inhibitorischen FcγRIIB stark reduziert. Auch bei FcγRIIIA gab es größere Abweichungen, da die stark exprimierende humane Population in den humanisierten Mäusen nicht identifiziert werden konnte. Stattdessen schienen die Zellen alle intermediär FcγRIIIA+ zu sein (vgl. Abb. 17). Humane NK-Zellen sind durch eine starke Expression des aktivierenden FcγRIIIA als einzigem FcγR gekennzeichnet. In der humanisierten Maus konnte diese Expression vor allem im Knochenmark bestätigt werden. In der Milz humanisierter Mäuse konnte keine eindeutige NK-Zell-Population identifiziert werden (vgl. Abb. 18). Die durchflusszytometrischen Analysen deuten sowohl in der humanen Milz als auch im humanisierten Mausmodell auf eine geringe Anzahl von NK-Zellen hin (vgl. Abb. 14 und 15). Es bleibt festzuhalten, dass in dieser Arbeit ein neues humanisiertes Mausmodell etabliert werden konnte, dass sich durch die Anwesenheit von humanen CD20 tragenden BLymphozyten und humanen FcγR exprimierenden Effektorzellen auszeichnet. Die fehlende Expression der aktivierenden murinen FcγR ermöglicht erstmals die Analyse der humanen IgG-FcγR Interaktion und von humanen Antikörpereffektorfunktionen wie der IgG-vermittelten B-Zell-Depletion in vivo. III. Anti-CD20 IgG vermittelte B-Zell-Depletion im humanisierten Mausmodell Die Depletion von B-Zellen ist ein vielfach angewendetes Verfahren in der Therapie von Leukämie- und Entzündungskrankheiten, bei dem entartete bzw. pathogene Antikörperproduzierende B-Zellen zerstört werden. Ein klassisches Beispiel hierfür ist die Behandlung von Non-Hodgkin Lymphomen und der Rheumatoiden Arthritis mit dem therapeutischen Antikörper Rituximab. Dieser monoklonale IgG der Subklasse 1, der gegen das B-Zellspezifische Oberflächenantigen CD20 gerichtet ist, führt nach Injektion über verschiedene Fc abhängige und unabhängige Mechanismen zu einer Reduktion der B-Zellen. Hierbei scheint Rituximab seine Wirkung vorwiegend über die Antikörper-induzierte Zell-vermittelte Zytotoxizität (ADCC) mithilfe von FcγR auszuüben [131, 132]. Die IgG-induzierte Depletion von B-Zellen wurde daher als experimentelles System ausgewählt, um im humanisierten Mausmodell Einflussfaktoren auf die Interaktion von humanem IgG und FcγR in vivo zu untersuchen. 56 Diskussion Hierfür wurde zunächst der gegen humanes CD20 gerichtete 1F5 Antikörper, der ebenfalls in der Therapie von B-Zell-Lymphomen eingesetzt wurde [133], in den humanen IgG Subklassen kloniert und produziert. Die Injektion dieser 1F5 IgG führt in humanisierten Mäusen zur Depletion von B-Zellen (vgl. Abb. 23). Zunächst sollte der Wirkmechanismus, d.h. die Abhängigkeit der Depletion von der Interaktion der Antikörper mit FcγR, ermittelt werden. Die Applikation des aus 1F5 IgG1 generierten F(ab)2 Fragments führte kaum zu einer B-Zell-Depletion, wodurch die essentielle Rolle des IgG Fc Fragments gezeigt werden konnte (vgl. Abb. 21). Die Applikation eines mutierten 1F5 IgG1, dessen schwere Kette keine Asparagin-verknüpften Glykosylierungen aufweist (N297A), führte im Gegensatz zum F(ab)2 Fragment zu einer effizienten Reduktion der B-Zellen (vgl. Abb. 22). Frühere Publikationen zeigen, das aufgrund der N297A Mutation keine Interaktion mit FcγR [56] und dem Komplementfaktor C1q [134] stattfindet. Während die fehlende C1q Bindung in dieser Arbeit bestätigt wurde (Daten nicht gezeigt), weisen die von uns durchgeführten in vitro Experimente auf eine Interaktion von FcγRIA und FcγRIIIA mit deglykosyliertem IgG1 hin. Demzufolge könnte die B-Zell-Depletion nach Gabe von N297A in vivo durch FcγRIA und FcγRIIIA, nicht aber C1q, vermittelt sein. Ein direkter Einfluss der IgG auf B-Zellen wie beispielsweise eine Hemmung der Proliferation oder eine Induktion der Apoptose, wie sie für Rituximab beschrieben wurden [132], könnte zusätzlich zur Fc vermittelten Depletion stattfinden. Auch die teilweise verminderte Oberflächenexpression der niedrigaffinen FcγR auf den myeloiden Effektorzellen deutet auf eine FcγR-Abhängigkeit der B-Zell-Depletion hin. Nach Gabe von anti-CD20 IgG konnten wir sowohl in den humanisierten Mäusen als auch im untersuchten Patientenblut eine Abnahme von FcγRIIA und FcγRIIB detektieren (vgl. Abb. 28 und 29). Die Reduktion der FcγR war im Blut stärker ausgeprägt als in der Milz und schien dadurch mit der Effizienz der B-Zell-Depletion zu korrelieren. Im Knochenmark kam es, passend zu einer verminderten B-Zell-Depletion, dagegen kaum zu Veränderungen. Zum einen deutet die reduzierte Oberflächenexpression auf eine Phagozytose der B-ZellImmunkomplexe hin. Andererseits wäre auch eine mangelnde Erkennung der FcγR bei der durchflusszytometrischen Analyse aufgrund gebundener Immunkomplexe denkbar. Die Injektion von 100µg 1F5 IgG führte zu einer effizienten Depletion reifer (CD19+/IgM+) BZellen im Blut, in der Milz und im Knochenmark (vgl. Abb. 23). Hierbei konnten bei der niedrigen Anzahl analysierter Mäuse geringe Unterschiede zwischen den untersuchten IgG Subtypen festgestellt werden. Während IgM+/CD19+ B-Zellen in der Milz durch IgG1, 2 und 3 vergleichbar depletiert wurden, deuten die Ergebnisse auf eine gute IgG2- und IgG3- nicht aber IgG1-induzierte Reduktion der Zellen im Knochenmark hin. Die möglicherweise verminderte Depletion IgM+ B-Zellen im Knochenmark, im Vergleich zu Blut und Milz, ist 57 Diskussion vermutlich auf eine veränderte Expression des CD20-Moleküls zurückzuführen, da das CD20 Expressionsniveau innerhalb der CD19+/IgM+ Zellen im Vergleich zu Blut und Milz stark reduziert war (vgl. Abb. 19). Das Expressionsniveau von CD20 wird auch im Menschen als ein bestimmender Faktor für die Rituximab-Sensitivität angenommen [132]. Erstmals war es im humanisierten Mausmodell auch möglich, eine genaue Analyse der depletierten humanen B-Zell-Populationen in Milz und Knochenmark durchzuführen. IgM negative B-Zellen wie z.B. die CD10 und CD34 exprimierenden Pro-B-Zellen wurden durch 1F5 IgG nicht depletiert, da diese Zellen kein CD20 auf ihrer Oberfläche tragen. Dagegen wurde eine Reduktion von CD20 exprimierenden unreifen (CD10+/IgM+) bzw. naiven (IgM+/IgD+) B-Zellen beobachtet. Die Depletion von Gedächtnis-B-Zellen (CD27+) und Plasmazellen konnte dagegen im humanisierten Mausmodell nur eingeschränkt analysiert werden, da diese Zellen in den naiven Mäusen nur selten auftraten (vgl. Abb. 24). Ein möglicher Einfluss der verwendeten IgG Subklasse auf die Effizienz der B-Zell-Depletion wurde im Blut durch Injektion von je 10µg 1F5 IgG bestimmt. Diese Dosisreduktion wurde durchgeführt, da die bisherigen Ergebnisse bei Injektion von 100µg 1F5 IgG darauf hindeuteten, dass bei dieser Dosis kaum Subklassen-spezifische Unterschiede existieren. Alle injizierten IgG waren, in unterschiedlichem Ausmaß, in der Lage B-Zellen zu depletieren. Dabei kam es schon innerhalb von 24h zur Reduktion der peripheren B-Zellen, deren Anteil bis zum Ende des Beobachtungszeitraums an Tag 7 nach der Injektion stark erniedrigt blieb. Da die Halbwertszeit von IgG Antikörpern im Serum mehr als 1 Woche beträgt [135], könnte dies auf eine Depletion von frisch ins Blut eingewanderten B-Zellen zurückzuführen sein. Vermutlich kommt es dadurch nicht zur Rekonstitution der peripheren B-Zell-Population durch Zellen aus Milz und Knochenmark. Die ausgeprägteste B-Zell-Depletion an Tag 1 nach Antikörpergabe trat bei 1F5 IgG1 und IgG3 auf (vgl. Abb. 25). Dies bestätigt die in vitro Ergebnisse dieser Arbeit, nach denen IgG1 und IgG3 Antikörper effizient mit allen FcγR interagieren können. möglicherweise über Außerdem eine können Interaktion diese mit Subklassen dem nach CD20-Bindung Komplementfaktor C1q die Komplementkaskade aktivieren, was zur Komplement-vermittelten Lyse der B-Zellen führen würde. Die humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse exprimieren die Proteine des murinen Komplementsystems (Daten nicht gezeigt), die aber eine große Ähnlichkeit mit den humanen Proteinen aufweisen [136]. Eine Beteiligung des Komplementsystems an der 1F5 IgG induzierten B-Zell-Depletion ist also wahrscheinlich, wurde aber in dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Auch die Injektion von 1F5 IgG2 führte zu einer effizienten Reduktion der peripheren B-Zellen. IgG2 Antikörper binden vor allem an den hochaffinen FcγRIA und an die polymorphen FcγRIIA131H und FcγRIIIA158V. Da die verwendeten Mäuse den genetischen Hintergrund FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V aufwiesen, ist eine IgG2 vermittelte B-ZellDepletion über diese FcγR wahrscheinlich. Ein Beteiligung des Komplementsystems ist auch 58 Diskussion für IgG2 möglich, da dieser Isotyp in vitro schwach mit C1q interagierte (vgl. Abb. 9). IgG4 Immunkomplexe zeigten in vitro ebenfalls eine starke Bindung an FcγRIA, FcγRIIA131H und FcγRIIIA158V. In vivo war bei Injektion von 1F5 IgG4 die schwächste B-Zell-Depletion innerhalb von 24 Stunden zu beobachten. Erst nach 3 Tagen erreichten die B-Zellen das Level der IgG1-vermittelten Depletion. Dies deutet darauf hin, dass IgG4, der in vitro nicht mit C1q interagierte, im humanisierten Mausmodell FcγR-vermittelte Effektorfunktionen ausübt und widerspricht damit der Anwendung von therapeutischen Antikörpern der Subklasse IgG4, wenn Fc vermittelte Effekte unerwünscht sind [135]. Die in vitro ermittelte reduzierte Affinität von 1F5 IgG2 und IgG4 Antikörpern für CD20 ist möglicherweise ein weiterer Grund für eine verminderte B-Zell-Depletion (vgl. Abb. 9). Das humanisierte Mausmodell sollte der Untersuchung von Einflussfaktoren auf die IgGFcγR Interaktion in vivo dienen. Unterschiede bei der im Blut bestimmten B-Zell-Depletion zwischen einzelnen Mäusen könnten einerseits durch eine hohe Varianz der Humanisierungseffizienz erklärt werden. Im Blut der verwendeten humanisierten Mäuse traten zwischen 3% und 80% humane Zellen auf. Andererseits bestanden die PBMCs, bedingt durch ein Alter der Mäuse von nur 12 Wochen, fast ausschließlich aus B-Zellen. Eine verminderte B-Zell-Depletion könnte somit z.B. durch einen Mangel an FcγR exprimierenden Effektorzellen bedingt sein. Aufgrund der verschiedenen Stammzellproben, die für die Rekonstitution benutzt wurden, können außerdem individuelle genetische Einflussfaktoren in den humanisierten Mäuse nicht ausgeschlossen werden. So besteht die Möglichkeit, dass humanisierte Mäuse z.B. mit dem polymorphen und damit in seiner Funktion 232T eingeschränkten FcγRIIB (FcγRIIB ) generiert worden sind. Eine reduzierte Funktionalität des inhibitorischen FcγRIIB würde sich direkt positiv auf die B-Zell-Depletion auswirken. IV. Einfluss der FcγR Polymorphismen in vivo Mögliche Einflussfaktoren auf die biologische Wirksamkeit von IgG Antikörpern in vivo sind Polymorphismen in den Genen der aktivierenden humanen FcγRIIA (131H/R) und FcγRIIIA (158F/V). Diese Polymorphismen führen zur Expression von FcγR Varianten, die in vitro eine veränderte Affinität für IgG Antikörper aufweisen. In vivo konnte ein Einfluss der FcγR Polymorphismen dagegen bisher nicht eindeutig nachgewiesen werden. Einen ersten Hinweis geben epidemiologische Studien, in denen die polymorphen FcγR Varianten mit dem therapeutischen Erfolg von monoklonalen Antikörpern, wie beispielsweise Rituximab, assoziiert sind. Daher wurden die für die Rekonstitution verwendeten hämatopoetischen Stammzellen hinsichtlich der FcγR Polymorphismen typisiert und entsprechende humanisierte Mäuse generiert. Anhand der 1F5 IgG induzierten B-Zell-Depletion konnte somit die in vivo Relevanz der FcγR Polymorphismen analysiert werden. 59 Diskussion Obwohl in vitro Experimente eine verstärkte Interaktion von FcγRIIA131H und FcγRIIIA158V mit den humanen IgG Antikörpern zeigen [62], was in dieser Arbeit für FcγRIIA bestätigt werden konnte, scheint es im humanisierten Mausmodell keinen signifikanten Einfluss der FcγR Polymorphismen auf die IgG-induzierte B-Zell-Depletion zu geben. Die intravenöse Gabe von 10µg 1F5 IgG1 führte in FcγRIIA131H und FcγRIIA131R Mäusen zu einer vergleichbaren Reduktion der peripheren B-Zellen (vgl. Abb. 26). In humanisierten Mäusen, die den niedrigaffinen FcγRIIIA158F exprimieren, trat eine leicht verbesserte B-Zell-Depletion im Vergleich zum hochaffinen FcγRIIIA158V auf (vgl. Abb. 27). Auch bei den bereits in der Therapie befindlichen monoklonalen Antikörpern handelt es sich zumeist um Antikörper der Subklasse IgG1 [135]. Epidemiologische Studien von Patienten, die mit Rituximab behandelt werden, zeigen eine bessere Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers bei der Behandlung des follikulären Non-Hodgkin Lymphoms in Gegenwart von FcγRIIA131H [137, 138] und FcγRIIIA158V [68, 138]. Unter unseren bisherigen experimentellen Bedingungen können wir diese Ergebnisse in vivo nicht bestätigen, wofür verschiedene Gründe ausschlaggebend sein könnten. Ein sehr wichtiger Aspekt ist die Tatsache, dass die humanisierten Tiere im Alter von 11-13 Wochen selbst kein humanes Serum IgG aufweisen. Dies spielt insbesondere für die Regulation der Funktion der Aktivität des hochaffinen FcγRIA eine wichtige Rolle. FcγRIA wird auf Monozyten und Makrophagen exprimiert, denen eine Beteiligung an der IgG vermittelten B-Zell-Depletion zugeschrieben wird [139]. Durch die hohen Mengen an Serum IgG (etwa 9mg/ml) ist dieser Rezeptor im Blut normalerweise mit IgG gesättigt und kann nicht mehr an Immunkomplexe binden. Im humanisierten Mausmodell fehlt diese Sättigung, wodurch der hochaffine FcγRIA in der Lage ist, mit den 1F5 IgG zu interagieren. Somit könnte FcγRIA im humanisierten Mausmodell, im Gegensatz zu therapeutischen Antikörpern im Menschen, an der B-Zell-Depletion beteiligt sein. Anhaltspunkte hierfür geben auch die in vitro Befunde im ersten Teil der Arbeit, in denen gezeigt werden konnte, dass FcγRIA mit Immunkomplexen aller IgG Subklassen interagieren kann. Durch Blockierung des FcγRIA mittels spezischer Antikörper oder Sättigung durch Gabe von monomerem IgG vor Injektion der 1F5 IgG soll diese Frage geklärt werden. Eine weitere Erklärung für diese Befunde könnte die von uns verwendete Menge an B-Zell depletierenden IgG Subklassenvarianten sein. Um den Einfluss der FcγR Polymorphismen auf die B-Zell-Depletion zu untersuchen, wurden je 10µg IgG pro Maus injiziert. Diese Dosis wurde gewählt, da bei 10µg eine effiziente aber noch nicht vollständige Depletion der BZellen im peripheren Blut stattfindet und bei höheren Dosen wie z.B. 100µg weder ein Einfluss der verwendeten IgG Subklasse noch der FcγR Polymorphismen zu erkennen war. Möglicherweise ist eine Dosis von 10µg, besonders in Anwesenheit von FcγRIA, dennoch zu hoch um im humanisierten Mausmodell einen Einfluss der FcγR Polymorphismen im Blut zu 60 Diskussion detektieren. Daher sollen in Zukunft niedrigere Dosen und vor allem auch andere Gewebe in die Analyse einbezogen werden. Bei der Anwendung von Rituximab im Menschen werden mit 375mg/m2 wesentlich höhere Dosen des IgG verwendet. Als Vergleich zum humanisierten Mausmodell bestand im Rahmen einer Kooperation mit Dr. Meidenbauer (Medizinische Klinik V, Universitätsklinikum Erlangen) die Möglichkeit humanes Patientenblut vor und 24 Stunden nach der Gabe von Rituximab zu untersuchen. In allen analysierten Patienten kam es nach Antikörpergabe zu einer effizienten Reduktion der peripheren BZellen. Hierbei konnten ebenso keine Unterschiede zwischen Patienten mit den jeweiligen FcγR Polymorphismen festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Eine Analyse der B-ZellDepletion in Milz oder Knochenmark konnte nicht durchgeführt werden. Weiterhin kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch eine Komplement-vermittelte BZell-Depletion eine Rolle spielen könnte. Wie bereits erwähnt, sind besonders Antikörper der Subklassen IgG1 und IgG3 in der Lage Komplement-abhängige Effektorfunktionen zu induzieren. Zudem ist die Komplement-vermittelte Lyse von B-Zellen für den anti-CD20 IgG1 Rituximab in in vitro Experimenten beschrieben worden [132]. Wegen ihrer eingeschränkten Bindung an humane FcγR werden IgG2 Antikörper im Gegensatz zur Subklasse IgG1 bisher nur selten als Therapeutika eingesetzt [135]. Dennoch führte die Injektion von 1F5 IgG2 im humanisierten Mausmodell zu einer effizienten Reduktion der peripheren B-Zellen. In Abhängigkeit der FcγR Polymorphismen zeigte sich eine leicht verbesserte Depletion in Gegenwart von sowohl FcγRIIA131H als auch FcγRIIIA158V (vgl. Abb. 26 und 27). Als mögliche Erklärungen für die verstärkte B-Zell-Depletion durch diese Varianten in vivo, kommen neben der höheren Affinität, die eine verstärkte Effektorzellaktivierung bedingt [64], auch ein erhöhtes Expressionsniveau des FcγR auf den Effektorzellen der B-Zell-Depletion [70] in Frage. Dies konnte im humanisierten Mausmodell bisher nicht untersucht werden. Da IgG2 Antikörper in vitro schwach mit C1q interagieren können, wäre auch hier ein geringer Einfluss des Komplementsystems auf die IgG2 induzierte B-Zell-Depletion möglich. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Dissertation Einflussfaktoren auf die Interaktion von humanen IgG Antikörpern und FcγR in vitro und in vivo analysiert. In vitro wurde die FcγR Interaktion wesentlich durch die verwendete IgG Subklasse, die Größe der IgG-Immunkomplexe und deren Glykosylierung und durch Polymorphismen in den aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA beeinflusst. In einem humanisierten Mausmodell konnte die biologische Wirksamkeit der IgG Antikörper anhand der Antikörper-induzierten B-ZellDepletion in vivo untersucht werden. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurden die IgG Subklassen hinsichtlich ihrer in vivo Aktivität verglichen. Außerdem wurden erste Hinweise gewonnen, die auf einen Einfluss der FcγR Polymorphismen bei IgG-vermittelten Effektorfunktionen hindeuten. Durch eine Optimierung des humanisierten Mausmodells in 61 Diskussion Bezug auf die Humanisierungseffizienz und eine Anpassung an humane IgG-Serumspiegel, bietet das in dieser Arbeit etablierte Modell die Möglichkeit weitergehende Untersuchungen humaner Antikörpereffektorfunktionen in vivo durchzuführen. 62 Material und Methoden F. Material und Methoden I. Material 1. Chemikalien, Plastik- und Verbrauchsmaterialen Soweit nicht anders angegeben, stammen alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien, Reagenzien, Plastik- und Verbrauchsmaterialen von den Firmen Greiner-Bio-One (Frickenhausen), Sarstedt (Numbrecht), Nunc (Wiesbaden), Millipore (Schwalbach), VWR (Ismaning), J. Peske (Aidling-Arnhofen), Roth (Karlsruhe), Eppendorf (Hamburg), Corning (Wiesbaden), Miltinyi Biotec (Bergisch-Gladbach), Roche (Mannheim), Sigma (Steinheim), Thermo Fisher Scientific (Rockford, USA), Invitrogen (Darmstadt), New England Biolabs (Frankfurt). 2. Puffer und Lösungen Alle Puffer und Lösungen wurden wie im Methodenteil beschrieben und mit Reinstwasser (bidest) hergestellt. Fötales Kälberserum (FCS) wurde vor der Verwendung bei 56°C für 30min hitzeinaktiviert. 3. Kommerzielle Kits Kit Firma, Herkunft 5´-RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends Invitrogen, Darmstadt Alexa FluorR 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit Molecular Probes, Leiden, NL Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, human Miltenyi Biotec, BergischGladbach DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit Invitrogen, Darmstadt FITC Labeling Kit KPL, Gaitherburg, USA PureLink HiPure Maxiprep Kit Invitrogen, Darmstadt QiaAmp DSP Blood Mini Kit Qiagen, Hilden Qiaquick Gel extraction Kit Qiagen, Hilden RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Invitrogen, Darmstadt 63 Material und Methoden 4. Antikörper und Konjugate Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper zusammengefasst. Mit * gekennzeichnete Konjugationen wurden mit den obengenannten Kits vorgenommen. Gegen humane Antigene gerichtete Antikörper: 64 Antigen Konjugat Klon Anwendung Verdünnung Hersteller CD3 CD3 CD4 CD8 CD10 CD11c CD11c CD14 CD16 CD16 CD16B CD19 CD19 CD19 CD19 CD20 CD20 CD20 CD21 CD23 CD27 CD32 CD32 CD32B CD33 CD33 CD34 CD34 CD38 CD45 CD45 CD45 CD56 CD56 CD64 CD64 CD89 CD138 IgD IgM IgM IgM PE PerCP APC PE PerCP FITC biotin PE FITC FITC PE FITC PE PE PE-Cy7 FITC* Alexa647* Alexa647* APC PE PE FITC Alexa647 biotin* APC PE-Cy7 FITC PE APC PerCP APC APC-H7 FITC PE FITC FITC PE PE biotin FITC PE biotin UCHT1 UCHT1 RPA-T4 Hit8α MEM78 3.9 3.9 M5E2 3G8 3G8 CLB-gran11.5 HIB19 HIB19 HIB19 SJ25C1 1F5 1F5 1F5 B-ly4 M-L233 L128 3D3 FUN-2 2B6 P67-6 P67-6 8.G12 8.G12 HB-7 2D1 HI30 2D1 NCAM16.2 NCAM16.2 10.1 10.1 A59 MI-15 IA6-2 G20-127 G20-127 G20-127 IF FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS MACS FACS FACS FACS IF FACS FACS FACS IF FACS FACS FACS MACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS MACS FACS FACS FACS FACS IF FACS 1:10 1:200 1:50 1:50 1:50 3µl 1:50 1:50 1:50 1:10 1:25 1:25 1:50 1:10 1:50 1:500 1:600 1:10 1:25 1:25 1:50 1:10 1:400 1:200 1:25 1:50 3µl 1:25 1:300 1:25 1:25 1:300 1:30 1:20 1:50 1:10 1;25 1:25 1:200 1:25 1:10 1:200 IgG Fc PE FACS 1:1000 IgG Fc HRP ELISA 1:10000 BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen ebioscience ebioscience BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen Eigenproduktion Eigenproduktion Eigenproduktion BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen Eigenproduktion BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen Jackson Immunoresearch Bethyl Material und Methoden Gegen Antigene der Maus gerichtete Antikörper: Antigen Konjugat Klon Anwendung Verdünnung Hersteller FcγRI FcγRIIB/III FcγRIIB/III FcγRIII FcγRIV B220 TCRb CD11b NK1.1 CD45.1 CD45.2 CD45.2 Alexa647* unkonjugiert PE PE Alexa647 APC FITC PerCP-Cy5.5 PE Biotin FITC biotin X54-517.1 2.4G2 2.4G2 275003 9E9 RA3-6B6 H57-597 M1/70 PK136 A20 Ly5.2 104 FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS FACS 1:400 1:100 1:100 1:50 1:400 1:400 1:200 1:400 1:200 1:100 1:300 1:100 BD Pharmingen Eigenproduktion BD Pharmingen R&D Eigenproduktion BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen Biolegend Biolegend BD Pharmingen BD Pharmingen Verwendete Sekundärantikörper: Antigen Konjugat Klon Anwendung Verdünnung Hersteller Biotin Biotin APC-Cy7 HRP Streptavidin Streptavidin FACS ELISA 1:1000 1:10000 BD Pharmingen BD Pharmingen 5. Oligonukleotide Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide stammen von der Firma Biomers.net, Ulm. 6. Software Software Firma, Herkunft Verwendung Adobe Reader 8.0 Adobe Systems, USA Textverarbeitung AxioVision LE 4.6 Zeiss, Jena Mikroskopie FACSDiva Becton Dickinson, USA Durchflusszytometrie EasyWin32 Herolab, Wiesloch Geldokumentaion Flowjo Tree Star, USA Durchflusszytometrie GraphPad Prism 3.03 GraphPad Software Inc., USA Graphische Darstellung MS Excel 2003 Microsoft, USA Statistik MS PowerPoint 2003 Microsoft, USA Präsentation MS Word 2003 Microsoft, USA Textverarbeitung Softmax Pro Molecular Devices, USA ELISA VectorNTI 10.3 Invitrogen, Darmstadt Sequenzbearbeitung 65 Material und Methoden II. Methoden 1. Klonierung der 7B4 und 1F5 IgG Antikörper 1.1) Klonierung der variablen Regionen Die variablen, für die Antigenerkennung verantwortlichen, Domänen der monoklonalen Antikörper 1F5 und 7B4 (beide vom IgG2a Isotyp der Maus) wurden aus den entsprechenden Hybridomzelllinien kloniert. Da die kodierenden Sequenzen der variablen Bereiche von schwerer (VH) und leichter (VL) Kette unbekannt waren, wurde von der bekannten Sequenz der konstanten Regionen (CH bzw. CL) ausgehend eine 5´-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) durchgeführt um das Startcodon zu ermitteln. Hierzu wurde zunächst die Gesamt-RNA aus 6x106 (1F5) bzw. 1x107 (7B4) Zellen mit dem „RNeasy Mini Kit“ (Quiagen, Hilden) isoliert. Diese wurde anschließend entsprechend der Anleitung des Herstellers mit dem „5´-RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends“ weiterverarbeitet (Invitrogen, Darmstadt). Die 5´RACE beinhaltet die Reverse Transkription von 3µg RNA in komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) unter Verwendung eines Gen-spezifischen Primers (Primer #1 bzw. #3, sh. Tabelle 2), die Aufreinigung der cDNA und das Anhängen eines homopolymeren Schwanzes an das 3´-Ende durch das Enzym Terminale Desoxynukleotid Transferase (TdT). Die so aufbereitete cDNA konnte für die Amplifikation der variablen Regionen mithilfe eines weiteren Gen-spezischen Primers (Primer #2 bzw #4) und dem im Kit enthaltenen „Abridged Anchoring Primer“ verwendet werden. Die Produkte der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden elektrophoretisch in einem 1%igem Agarosegel mit 40ng/ml Ethidiumbromid aufgetrennt, die entsprechenden Fragmente einer Größe von je ca. 750bp aus dem Gel ausgeschnitten und mittels dem „Qiaquick Gel extraction Kit“ (Qiagen, Hilden) entsprechend der Herstellerhinweise aufgereinigt. Anschließend erfolgte die Klonierung mithilfe des „Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit“ (Invitrogen, Darmstadt) in den Vektor pCRII-TOPO-blunt. Nach der Transformation in chemisch kompetente Bakterien („One-Shot chemically competent E.Coli“, Invitrogen, Darmstadt) wurde die Plasmid-DNA mithilfe der Minilysat-Methode präpariert und die erhaltene DNA sequenziert. Durchgehende offene Leserahmen wurden anhand einer BLAST-Analyse hinsichtlich Homologien zu anderen schweren und leichten Ketten getestet. Anhand der erhaltenen Sequenzen erfolgte das Primerdesign für die Klonierung der schweren und leichten Ketten. 1.2) Klonierung der schweren und leichten Ketten Korrekte variable Regionen und die bereits vorhandenen konstanten Domänen der humanen IgG Subtypen (bereitgestellt von Prof. Dr. Nimmerjahn) wurden mittels PCR durch 98°C 2min, 30 Zyklen von 98°C 15sec, 56°C 15sec, 72°C 45sec und eine finale Elongation von 5min bei 72°C amplifiziert. Die Fragmente mit einer Größe von ca. 500bp (variable 66 Material und Methoden Domänen), ca. 1000bp bzw. etwa 250bp (konstante Domäne der leichten Kette) wurden anschließend gelelektrophoretisch aufgereinigt. Mithilfe einer zweiten PCR konnten die VH und CH (schwere Kette) bzw. VL und CL (leichte Kette) Regionen fusioniert werden. Die Amplifikation erfolgte bei 98°C 2min, 30 Zyklen von 98°C 15sec, 56°C 15sec, 72°C 1min und eine finale Elongation von 5min bei 72°C. Die Reaktionsbedingungen lauteten für diese Klonierungsreaktionen je 50µl Ansatz wie folgt: je 1µM Primer, 0,2mM dNTPs (NEB, Frankfurt), 0,5µl Phusion High Fidelity DNA Polymerase (NEB, Frankfurt), 1x Phusion High Fidelity Reaktionspuffer. Sowohl die erhaltenen schweren Ketten als auch der eukaryonte Expressionsvektor pBos wurden mit den Restriktionsenzymen (alle NEB, Frankfurt) EcoRI und KpnI geschnitten. Anschließend wurden 200ng der schweren Ketten in 60ng pBos mithilfe von 1µl des Enzyms T4 DNA Ligase (NEB, Frankfurt) für 1h bei RT ligiert. Die leichten Ketten wurden mit NcoI und XhoI verdaut und in den mit NcoI und XhoI geschnittenen eukaryonten Expressionsvektor pCMV ligiert. Primer # Klonierung VH und VL (5´-RACE) Klonierung der schweren Ketten Klonierung der leichten Ketten Orientierung Sequenz (5´Æ3´) antisense gacagggatccagagtt 1 Gen-spezifischer Primer 1 (VH) 2 Gen-spezifischer Primer 2 (VH) antisense gtactctagaggtcaaggtcactggctca 3 Gen-spezifischer Primer 1 (VL) antisense cctgttgaagctcttgaca 4 Gen-spezifischer Primer 2 (VL) antisense gtactctagagggtgaagttgatgtcttgtc 5 Amplifikation 7B4 VH sense cgtagaattcaccaccatgggttggctgtggaact 6 Amplifikation 1F5 VH sense cgtagaattcaccaccatgggatggagttgtatcatc 7 Amplifikation IgG1/2/4 CH antisense cggggtacccgtcatttacccggagacagg 8 Amplifikation IgG3 CH antisense cggggtacccgctatttacccggagacagg 9 Amplifikation VH antisense tgagctcacggtgagagtggtgccttggccccag 10 Amplifikation CH sense tcaccgtgagctcagcctccaccaaggggc 11 Amplifikation 7B4 VL sense cgtagaattcaccaccatggattttctggtgcagatt 12 Amplifikation 1F5 VL sense cgtagaattcaccaccatggattttcaagtgcagattt 13 Amplifikation CL antisense cggctcgagcgctaacactctcccctgttgc 14 Amplifikation CL sense gggaccaagcttgagatcaaac 15 Amplifikation VL antisense tccagcttggtcccccctc Tabelle 2: Für die Klonierung der 7B4 und 1F5 IgG verwendete Primer. 1.3) Herstellung von chemisch kompetenten E.coli TOP10 Bakterien Chemisch kompetente E.coli TOP10 Bakterien wurden im Labor erzeugt. Hierfür wurde eine Übernachtkultur der Bakterien in LB-Medium (Luria/Miller) ohne Antibiotikum bei 37°C und 230rpm durchgeführt. 2ml dieser Kultur wurden in 400ml frisches LB-Medium überführt und bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,3 bei einer Wellenlänge von 600nm weiter kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien für 15min bei 4000rpm zentrifugiert, in 100ml 100mM MgCl2 resuspendiert und 5min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien für 5min bei 4000rpm und 4°C zentrifugiert und das Pellet in 100ml 100mM CaCl2 aufgenommen, gefolgt von einer 20-minütigen Inkubation auf Eis. Nach einer weiteren Zentrifugation wurden 67 Material und Methoden die Bakterien in 10ml 100mM CaCl2 mit 10% Glycerol resuspendiert, in vorgekühlte 1,5ml Reaktionsgefäße aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung der chemisch kompetenten Bakterien erfolgte bei -80°C. 1.4) Transformation von E.coli TOP10 Bakterien Der Ligationsansatz wurde für 30min mit 100µl der chemisch kompetenten TOP10 E.coli auf Eis inkubiert und anschließend für 45sec einem Hitzeschock bei 42°C unterzogen. Nach Zugabe von 500µl vorgewärmtem LB-Medium ohne Zusatz von Antibiotika wurden die Bakterien für mind. 30min bei 37°C und 300rpm kultiviert. Die transformierten Bakterien wurden schließlich auf LB-Agar-Platten (50ng/ml Carbenicillin) ausplattiert und über Nacht (ÜN) bei 37°C kultiviert. 1.5) Isolation von Plasmid DNA aus Bakterien E.coli TOP10 Bakterien wurden ÜN in LB-Medium (5ml für die Plasmidpräpariation im kleinen Maßstab, 500ml für die Plasmidpräparation im großen Maßstab) mit 50ng/ml Carbenicillin bei 37°C und 230rpm ÜN kultiviert. Im kleinen Maßstab wurde Plasmid-DNA mithilfe der Minilysatmethode durch alkalische Lyse isoliert. Hierfür wurde 1ml der Übernachtkultur für 10min bei 5000rpm zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 100µl Puffer 1 (50mM Tris, 10mM EDTA, 100µg/ml RNAse A, pH 7,5) resuspendiert. Anschließend erfolgte die alkalische Lyse durch Zugabe von Puffer 2 (0,2M NaOH, 1% SDS) für 5min bei Raumtemperatur (RT). Nach der Neutralisierung mit 150µl 3M Kaliumacetat pH 5,5 wurden die lysierten Bakterien für 20min bei 13000rpm zentrifugiert. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wurde dann in 1ml 96% Ethanol überführt und für 30min bei 13000rpm und 4°C gefällt. Das DNA-Pellet wurde mit 500µl 70% Ethanol für 5min bei 13000rpm gewaschen und in 50µl bidest aufgenommen. Im großen Maßstab wurde die Plasmid-DNA mithilfe des „PureLink HiPure Maxiprep Kit“ (Invitrogen, Darmstadt) entsprechend der Anleitung des Herstellers aufgereinigt. Die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 und 280nm bestimmt. Zur Kontrolle der aufgereinigten Plasmide wurden sie mit Restriktionsendonukleasen geschnitten und das Ergebnis mittels Agarose-Gelelektrophorese ausgewertet. 1.6) Sequenzierung Die klonierten Konstrukte wurden mithilfe der in Tabelle 3 angegebenen Primer sequenziert. Die Analyse der Sequenzen wurde mit der ContigExpressTM (Invitrogen, Darmstadt) Software und BLASTTM durchgeführt. Für multiple Sequenzvergleiche wurde ClustalWTM verwendet. 68 Material und Methoden Primer # 16 17 18 19 20 21 22 23 Orientierung Sequenz (5´-3´) Ta antisense sense sense antisense sense antisense sense sense atttaggtgacactatag aatacgactcactataggg cggtgggaggtctatataag caactagaaggcacagtcg ggagactgaagttagg ccattataagctgcaataaac ggatgggctggataaacac cactgggtaaagcagacacc 46°C 50°C 58°C 58°C 56°C 56°C 55°C 55°C pCRII-TOPO-Blunt pCRII-TOPO-Blunt pCMV pCMV PBos PBos 7B4 IgG, schwere Kette 1F5 IgG, schwere Kette Tabelle 3: Für die Plasmidsequenzierung verwendete Primer. 2. Produktion der 7B4 und 1F5 IgG Antikörper 2.1) Transiente Transfektion von HEK293T Zellen HEK293T Zellen wurden Kalziumphosphatmethode für die transfiziert. Antikörperproduktion Hierzu wurden transient HEK293T mithilfe Zellen in der 14cm Zellkulturschalen bis zu einer Konfluenz von 70% kultiviert. Vor der Transfektion wurden die Zellen mit 24ml frischem DMEM-Medium (ergänzt mit 5% FCS, 1% Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin) versorgt. Pro Schale, wurde für die Transfektion ein DNA Mix aus je 30µg Plasmid (schwere Kette enthaltender pBos-Vektor und leichte Kette enthaltender pCMV-Vektor), 6µl Helferplasmid, 2,65ml bidest, 300µl 2,5M CaCl2 und 10µl 100µM Chloroquin hergestellt. Dieser Mix wurde tropfenweise mit 3ml vorgewärmtem 2xHBS (50mM Hepes, 280mM NaCl2, 1,2mM Na2HPO4, pH 7,09) gemischt und auf die Zellen getropft. Nach 6-8h wurde die Transfektion durch Austauschen des Medium auf 30ml Produktionsmedium (DMEM mit 10% Nutridoma SP, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin) abgestoppt. Die Zellen wurden für 6-7 Tage kultiviert. 2.2) Aufreinigung der Antikörper Die produzierten Antikörper wurden nach 6-7 Tagen aus dem Zellkulturüberstand der transfizierten HEK293T-Zellen aufgereinigt. Die Zellkulturüberstände wurden hierfür zunächst durch Zentrifugation und Sterilfiltration durch einen 22µm Filter von Zelltrümmern befreit. Die Präzipitation wurde durch schrittweise Zugabe von 60% (w/w) Ammoniumsulfat unter Rühren bei 4°C erreicht. Am nächsten Tag wurden die Zellkulturüberstände bei 6000rpm und 4°C für 1h zentrifugiert und das Pellet in Phosphate-Buffered Saline (PBS, 137mM NaCl, 3mM KCl, 6,5mM Na2HPO4, 1,5mM KH2PO4) aufgenommen. Die gefällten Antikörper wurden dann ÜN bei 4°C gegen PBS dialysiert, bevor sie mithilfe von Protein-GSepharose (Roche, Mannheim) ÜN bei 4°C aufgereinigt werden konnten. Nach gründlichem Waschen der Protein-G-Sepharose mit PBS wurden die Antikörper mit 0,1M Glycin/HCl pH 2,5 eluiert und erneut ÜN bei 4°C gegen PBS dialysiert. Anschließend wurde möglicherweise vorhandenes LPS entfernt, die Lösung durch Zentrifugation mit VivaSpin 4 (Millipore, 69 Material und Methoden Schwalbach) einkonzentriert, die Konzentration der Antikörper spektrophotometrisch mithilfe von „BioRad Protein Assay“ (BioRad, München) bei einer Wellenlänge von 600nm bestimmt und die Reinheit und Integrität der Präparation mittels Polyacylamidgelelektrophorese überprüft. Aliquots der aufgereinigten Antikörper wurden bei -80°C aufbewahrt. 2.3) Entfernung von LPS-Kontaminationen Für die Entfernung einer möglichen Kontamination der produzierten Antikörper durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) wurden die kalte Antikörperpräparationen mit 10% Triton-X114 durch vortexen gemischt und 15min auf Eis inkubiert. Nach erneutem vortexen erfolgte eine 10min Inkubation bei 42°C bis zur Trübung der Lösung. Anschließend wurde die Mischung für 5min bei 2000xg zentrifugiert und die obere Phase mitsamt den produzierten Antikörpern abgenommen. 3. Proteinmodifikationen 3.1) Biotinylierung Je 200µg monoklonale Antikörper wurden mit dem „DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit“ (Invitrogen, Darmstadt) in einem Reaktionsvolumen von 200µl entsprechend der Herstelleranweisung biotinyliert. 3.2) Konjugation von FITC-Fluorochromen Je 250µg monoklonale Antikörper wurden mithilfe des „SureLinkTM FITC Labeling Kit“ (KPL, Gaitherburg, MD, USA) in einem Reaktionsvolumen von 500µl entsprechend der Anweisungen des Herstellers mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Gruppen konjugiert. 3.3) Konjugation von Alexa647-Fluorochromen Je 100µg monoklonale Antikörper wurden in einem Reaktionsvolumen von 100µl mit Alexa647-Fluorochromen konjugiert. Hierfür wurde das “Alexa FluorR 647 Monoclonal Antibody Labeling Kit“ (Molecular Probes, Leiden, NL) laut der Herstelleranweisung verwendet. 3.4) Herstellung von F(ab)2 Fragmenten 500µg 1F5 IgG1 Antikörper wurden gegen 0,1M Natriumcitrat-Puffer pH 3,5 für 2h bei RT dialysiert. Anschließend wurde 1µg/µl Pepsin (1mg/ml aufgelöst in 0,1M Natriumcitrat-Puffer pH 3,5) (Roche, Mannheim) zugegeben, der Ansatz für 2h bei 37°C verdaut und für 2h bei RT gegen PBS dialysiert. 70 Material und Methoden 4. In vitro Analyse der 7B4 IgG Bindung an FcγR 4.1) Affinität der 7B4 IgG für TNP Die Affinität der klonierten und produzierten 7B4 IgG für ihr Antigen, das Hapten 2-,4-,6Trinitrophenyl (TNP), wurde in enzyme-linked immunoabsorbant assays (ELISA) überprüft. Da TNP ein sehr kleines Molekül ist, wird es für Experimente an größere Proteine wie z.B. BSA konjugiert. TNP-BSA gibt es in verschiedenen Kopplungsraten. In dieser Arbeit wurde BSA mit 4 bzw. 26 TNP-Molekülen verwendet. Für die Quantifizierung der Affinität wurden je 100ng TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA in 100µl 0,05M Carbonate/Bicarbonate Puffer (pH 9,6) pro Vertiefung einer 96-well high binding microlon elisa Platte (Greiner-Bio-One, Frickenhausen) gekoppelt. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurden die Vertiefungen je 3x mit PBS / 0,05% Tween-20 gewaschen. Nach der Kopplung für 1h bei RT, folgte die Blockierung unspezifischer Interaktionen durch Inkubation mit 200µl PBS / 1% BSA für 1h bei RT. Anschließend wurden je 1ng der 7B4 IgG in 100µl PBS / 1% BSA zugegeben. Die gebundenen Antikörper wurden mit 100µl 1:10000 in PBS / 1% BSA verdünntem Meerettich-Peroxidase (HRP) konjugierten F(ab)´2 Fragment, das gegen die IgG Fc Region gerichtet ist, nachgewiesen. Die Meerettich-Peroxidase verursachte nach Zugabe von 50µl TMB-Substrat eine Farbreaktion, die durch 50µl 6% Orthophosphorsäure abgestoppt wurde. Die Intensität des Farbumschlages konnte bei einer Wellenlänge von 450nm in einem „VersaMax tunable microplate reader“ (Molecular Devices, Ismaning) detektiert werden. Der Hintergrund wurde bei einer Wellenlänge von 650nm vermessen. Um die Konzentration der produzierten 7B4 IgG zu kontrollieren, wurden 100ng der 7B4 IgG pro Vertiefung aufgebracht, gefolgt vom Blockierungsschritt und der direkten Detektion mit dem HRP-konjugiertem anti-IgG Fc F(ab)´2. Nach Zugabe von 50µl Substrat wurde die chemische Reaktion mit 50µl 6% Orthophosphorsäure abgestoppt und die Intensität des Farbumschlages bei den Wellenlängen 450nm und 650nm bestimmt. 4.2) FcγR Expression in stabil transfizierten CHO Zellen Die humanen aktivierenden FcγRIA, die beiden polymorphen Varianten des FcγRIIA (131H und 131R) und der inhibitorische FcγRIIB wurden durch Frau Anne Bärenwaldt kloniert und stabil in CHO-Zellen exprimiert. Ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen von FcγRIIIA und den Transmembran- und intrazellulären Anteilen von FcγRIIB (in dieser Arbeit eFcγRIIIA genannt), das ebenfalls stabil in CHO Zellen exprimiert wird, wurde von Jeffrey Ravetch (New York, USA) zur Verfügung gestellt. Die Expression der FcγR wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Dafür wurden die Zellen mit 0,05% Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst. Je 1x105 Zellen wurden in die 71 Material und Methoden Vertiefungen einer 96-well-Platte gegeben und für 5min bei 4°C und 1400rpm zentrifugiert. Die Färbung mit den FcγR-spezifischen, Fluoreszenz-markierten Antikörpern (siehe F.I.4) erfolgte pro Ansatz in 50µl FACS-Puffer (PBS / 2% FCS / 0,05% Natriumazid) für 15min auf Eis. Es wurden 10.000 lebende Zellen am FACS Calibur (BD, Heidelberg) eingelesen. Für die Auswertung wurde die „Flow Cytometry Analysis Software“ (Flowjo, Version 7.6.1) verwendet. 4.3) Anreicherung FcγR exprimierender CHO Zellen Eine Anreicherung FcγR exprimierender Zellen durch magnetische Zellsortierung wurde durchgeführt, wenn der Anteil FcγR+ Zellen an der Gesamtpopulation unter 80% sank. Hierfür wurden die Zellen mit 0,05% Trypsin/EDTA von der Zellkulturschale abgelöst und in MACS-Puffer (PBS / 2% FCS) aufgenommen. Alle Inkubations- und Waschschritte wurden mit MACS-Puffer durchgeführt. Nach einer Inkubation mit den jeweiligen FITC-markierten FcγR-spezifischen Antikörpern für 30min auf Eis wurden anti-FITC MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) Partikel für weitere 30min auf Eis zugegeben. Die so markierten Zellen konnten dann über eine MACSR Separation Column (Größe LS, Miltenyi Biotec, BergischGladbach) aufgereinigt und wieder in Kultur genommen werden. 4.4) Immunkomplexbindung an FcγR exprimierende CHO Zellen Um die Bindung von IgG Immunkomplexen an FcγR zu untersuchen, wurden zunächst Immunkomplexe aus je 1µg IgG und 0,5µg TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA in 100µl PBS pro Ansatz durch Inkubation für 3h bei 60rpm und RT generiert. Die FcγR exprimierenden CHO Zellen wurden mit 0,05% Trypsin-EDTA von den Zellkulturschalen abgelöst und je 1x105 Zellen vorgelegt. Je 100µl der Immunkomplexe wurden mit den auf Eis vorgekühlten Zellen vermischt und für 1h bei 4°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die gebundenen Immunkomplexe wurden durch Inkubation mit Phycoerithrin-konjugierem IgG-Fc spezischem F(ab)´2 Fragment für 15min auf Eis angefärbt. Für die lebend-tot-Diskriminierung wurden die Zellen anschließend mit Propidiumjodid (1:5000 in FACS-Puffer) gefärbt. Es wurden 10.000 lebende Zellen am FACS Calibur (Becton Dickonson, Heidelberg) eingelesen. Für die Auswertung wurde die „Flow Cytometry Analysis Software“ (Flowjo, Version 7.6.1) verwendet. 4.5) Einfluss der Glykosyslierung auf die Immunkomplexbindung Um den Einfluss der Glykosyslierung auf die Bindung von TNP-BSA Immunkomplexen an die humanen FcγR zu analysieren, wurden zunächst die 7B4 IgG mit 50U Peptide:NGlykosidase F (PNGaseF, New England Biolabs, Frankfurt) pro µg IgG ÜN bei 37°C verdaut. Anschließend wurden die Immunkomplexe wie in Punkt 4.4. beschrieben generiert und ihre Bindung an FcγR exprimierende CHO Zellen untersucht. Die Kontrolle des PNGaseF72 Material und Methoden Verdaus erfolgte über die gelelektrophoretische Auftrennung der Antikörper unter reduzierenden Bedingungen. Anschließend wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert und ein Lektin-Blot durchgeführt. Hierfür erfolgte zunächst die Blockierung der Membran mit in Tris-buffered saline (TBS, 0,5M Tris, 0,15M NaCl) verdünntem Western Blocking Reagent (1:10, Roche, Mannheim). Danach wurde die Membran mit biotinyliertem lens culinaris agglutinin (LCA, 1:1000 in TBS / 1mM MgCl2 / 1mM CaCl2 / 1mM MnCl2, Vector Laboratories, USA). Anschließend wurden die Zuckerreste mit Alkalischer Phosphatasekonjugiertem anti-biotin Antikörper (1:1000 in TBS, Sigma, Steinheim) detektiert. Durch die Zugabe des Substrats NBT/BCIP (1:50, Roche, Mannheim) verdünnt in NBT/X-Puffer (0,1M Tris-HCl pH 9,5 / 0,1M NaCl / 0,05M MgCl2) kommt es zur Anfärbung glykosylierter Proteine. 5. In vitro Analyse der Bindung von 1F5 IgG an LCL1.11 Zellen Die CD20 exprimierende, humane B-Zell-Linie LCL1.11 wurde verwendet, um die Antigenbindung der klonierten und produzierten anti-CD20 IgG (Klon 1F5) zu testen. Hierfür wurden 1x105 LCL1.11 entweder mit 10ng/µl Alexa647 konjugierten 1F5 mIgG2a oder mit einem Mix aus diesem Antikörper und steigenden Mengen (40ng/µl bis 160ng/µl) der zu testenden 1F5 IgG in 50µl FACS-Puffer für 15min auf Eis inkubiert. Die beiden Antikörper konkurrieren somit um die Antigenbindung. Dadurch können sowohl die Assoziation als auch die Dissoziation der Fluoreszenzintensität produzierten (MFI) der Antikörper Bindung verglichen des 1F5 werden. Die mittlere mIgG2a-Alexa647 wurde durchflusszytometrisch durch Analyse von 5000 Zellen am FACSCanto II bestimmt. Rechnerisch wurde schließlich die CH50 der 1F5 IgG ermittelt, d.h. die notwendige Konzentration um das 1F5 mIgG2a-Alexa647 Signal um 50% zu reduzieren. 6. In vitro Analyse der C1q Bindung durch 1F5 IgG Die Bindung der humanen IgG Subklassen an den humanen Komplementfaktor C1q wurde mittels ELISA bestimmt. Hierfür wurden je 100ng 1F5 IgG in 100µl 0,05M Carbonate/Bicarbonate Puffer (pH 9,6) pro Vertiefung einer 96-well high binding microlon elisa Platte (Greiner-Bio-One, Frickenhausen) gekoppelt. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurden die Vertiefungen je 3x mit PBS / 0,05% Tween-20 gewaschen. Nach der Kopplung für 1h bei RT, folgte die Blockierung unspezifischer Interaktionen durch Inkubation mit 200µl PBS / 3% BSA / 0,1% Gelatine / 0,05% Tween-20 für 1h bei RT. Anschließend wurden je 20ng/µl C1q (AbD Serotec, UK) in 100µl PBS / 3% BSA / 0,1% Gelatine / 0,05% Tween-20 zugegeben. Das gebundene C1q Protein wurde mit 100µl 1:500 in PBS / 3% BSA / 0,1% Gelatine / 0,05% Tween-20 verdünntem HRP-konjugierten und gegen humanes C1q gerichteten Antikörper (AbD Serotec, UK) nachgewiesen. Die 73 Material und Methoden Meerettich-Peroxidase verursachte nach Zugabe von 50µl TMB-Substrat eine Farbreaktion, die durch 50µl 6% Orthophosphorsäure abgestoppt wurde. Die Intensität des Farbumschlages konnte bei einer Wellenlänge von 450nm in einem „VersaMax tunable microplate reader“ (Molecular Devices, Ismaning) detektiert werden. Der Hintergrund wurde bei einer Wellenlänge von 650nm vermessen. 7. Humane hämatopoetische Stammzellen 7.1) Aufreinigung humaner hämatopoetischer Stammzellen Humane hämatopoetische Stammzellen (HSC) wurden aus Nabelschnurblut, das unter Einwilligung der Spender für diesen Zweck vom Klinikum Fürth zur Verfügung gestellt wurde, aufgereinigt. Das Nabelschnurblut wurde bis zur Aufarbeitung bei 4°C max. ÜN gelagert. Für die Aufreinigung wurden Proben mit >25ml Blut verwendet, die zunächst im Verhältnis 1:1 mit PBS vermischt und dann für 25min bei 1800rpm und 12°C über einen Pancoll Dichtegradienten durch Zentrifugation aufgetrennt wurden. Anschließend konnte der Leukozytenring abgenommen und nach einem Waschschritt in PBS für 5min bei 1400rpm und 4°C die CD34 exprimierenden Zellen mit dem „Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, human“ (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) isoliert werden. Das Protokoll beinhaltet die Blockierung der humanen Fc Rezeptoren und die Inkubation mit magnetischen anti-CD34 Partikel (je 30min auf Eis). Die an die Partikel gebundenen Stammzellen wurden anschließend mit MACSR Separation Column (Größe LS, Miltenyi Biotec, BergischGladbach) separiert und in Einfriermedium (FCS / 10% DMSO) aufgenommen. Die Stammzellproben wurden bis zu ihrer Verwendung in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. 7.2) Durchflusszytometrische Analyse von Nabelschnurblut und HSC Aufgereinigte hämatopoetische Stammzellen wurden hinsichtlich der Qualität der Aufreinigung durchflusszytometrisch analysiert. Hierfür wurden die Stammzellproben aufgetaut, in PBS gewaschen, für 5min bei 1400rpm und 4°C zentrifugiert und in FACSPuffer aufgenommen. Die Zellen wurden jeweils in einem Volumen von 50µl für 15min auf Eis gefärbt. Die verwendeten Antikörper und die entsprechenden Verdünnungen im Kapitel E.I. Material aufgeführt. Für die lebend-tot-Diskriminierung wurden die Zellen anschließend mit dem Kernfarbstoff DAPI inkubiert. Parallel zu den isolierten Stammzellproben wurden auch Leukozyten aus Nabelschnurblut vor der CD34-MACS-Aufreinigung durchflusszytometrisch analysiert. Hierfür wurden Proben nach der Pancoll-Dichtegradientenzentrifugation entnommern, in PBS gewaschen und in FACS-Puffer aufgenommen. Das Färbeprotokoll war identisch mit der Stammzellanalyse. Die durchflusszytometrische Analyse von 10000 lebenden Zellen erfolgte am FACS Canto II (Becton Dickinson). 74 Material und Methoden 8. Genotypisierung der FcγR Allele 8.1) Isolation von genomischer DNA aus humanem Nabelschnurblut Vor Beginn der Aufreinigung der humanen hämatopoetischen Stammzellen wurden 200µl Vollblut entnommen und bis zur Weiterverarbeitung bei -20 °C aufbewahrt. Die genomische DNA wurde mithilfe des „QiaAmp DSP Blood Mini Kit“ (Qiagen, Hilden) entsprechend der Herstelleranweisungen isoliert und bei -20 °C gelagert. 8.2) Genotypisierung mittels allelspezifischer PCR Für die aufgereinigten Nabelschnurblutproben wurden die Polymorphismen in den kodierenden Genen von FcγRIIA (131H/R) und FcγRIIIA (158F/V) mittels allelspezifischer PCR bestimmt (Abb. 30). Primer # FcγRIIA FcγRIIIA 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 † 1. PCR 1. PCR* 2. PCR, allelspezifisch* 2. PCR, allelspezifisch* 2. PCR† 1. PCR 1. PCR 2. PCR# 2. PCR, allelspezifisch# 2. PCR, allelspezifisch# Orientierung Sequenz (5´Æ3´) Ta sense antisense sense sense antisense sense antisense sense antisense antisense ggagaaaccatcatgctgag cagcatgggcagctcttc gaaaatcccagaaatttttcca gaaaatcccagaaatttttccg caattttgctgctatgggc gtgtctttcaggctggctg cgagattaaactattctggtc tcacatatttacagaatggcaaagg tttgggagtaaaaatgtgtcttcagaga gttgggagtaaaaatgtgtcttcagaga 56°C 56°C 60°C 60°C 60°C 58°C 58°C 64°C 64°C 64°C Tabelle 4: Verwendete Primer für die Genotypisierung von FcγRIIA131H/R und FcγRIIIA158F/V. Die Sequenzen der Primer wurden zum Teil verschiedenen Publikationen entnommen: † Norris et al [140], * Carlsson et al [87], # Leppers van der Straat et al [141] Für die Genotypisierung von FcγRIIA131H/R wurde in einer ersten PCR ein 995bp großes, FcγRIIA spezifisches Fragment amplifiziert. Die Reaktionsbedingungen waren je 25µl Ansatz wie folgt: 50ng genomische DNA, je 0,4µM Primer, 0,2mM dNTPs, 1µl DMSO, 0,2µl Taq DNA Polymerase und 2,5µl 10x Taq Standard Reaktionspuffer. Die Amplifikation erfolgte bei 94°C 5min, 56°C 5min, 72°C 5min gefolgt von 30 Zyklen aus 94°C 1min, 56°C 1min und 72°C 2min. Die abschließende Elongation fand 10min bei 72°C statt. 1µl dieser ersten PCR wurde in die zweite, Allel-spezifische PCR, eingesetzt. Die weiteren Komponenten je 20µl Ansatz waren: je 0,5µM Primer, 125µM dNTPs, 1µl DMSO, 7,5mM MgCl2, 0,2µl Taq DNA Polymerase und 2µl 10x Taq Standard Reaktionspuffer. Die Amplifikation des 249bp großen Fragments erfolgte durch 30 Zyklen von 94°C 15sec, 60°C 15sec, 72°C 30sec und einer abschließenden Elongation von 72°C für 5min. Die Analyse erfolgte durch elektrophoretische Auftrennung in einem 1,5%igem Agarosegel. Analog wurde für die Genotypisierung von FcγRIIIA158F/V in einer ersten PCR ein 1366bp großes, FcγRIIIA spezifisches Fragment amplifiziert. Hierfür wurden 50ng genomische DNA, 75 Material und Methoden je 0,5µM Primer, 0,2mM dNTPs, 0,2µl Taq DNA Polymerase und 2,5µl 10x Taq Standard Reaktionspuffer in einem 25µl Ansatz gemischt. Die Amplifikation erfolgte bei 94°C 5min, gefolgt von 30 Zyklen bestehend aus 94°C 1min, 58°C 30sec und 72°C 2min. Die finale Elongation fand für 10min bei 72°C statt. In die Allel-spezifische zweite PCR wurde 1µl der ersten PCR zusammen mit je 0,5µM Primer, 125µM dNTPs, 0,2µl Taq DNA Polymerase und 2µl 10x Taq Standard Reaktionspuffer in einem Reaktionsvolumen von 20µl gemischt. Die Amplifikation des 131bp Produkts erfolgte bei einer initialen Denaturierung von 2min bei 94°C, 30 Zyklen von 94°C 15sec, 64°C 15sec und 72°C 30sec und einer letzten Elongation von 5min bei 72°C. Die Analyse erfolgte durch elektrophoretische Auftrennung in einem 2%igem Agarosegel. Abb. 30: Graphische Darstellung der Sequenzen von FcγRIIA (A) und FcγRIIIA (B) und der für die Genotypisierung verwendeten Primer. Intronsequenzen sind verkürzt dargestellt. Die Position der zu bestimmenden Polymorphismen FcγRIIA131H/R bzw. FcγRIIIA158F/V sind mit einem * gekennzeichnet. 9. Rekonstitution von humanisierten Rag2/γc/Fcγ-/- Mäusen Neugeborene Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse (nicht älter als 3 Tage) wurden in einer Cäsium137 Gammabestrahlungsanlage mit Dosen zwischen 3,5 und 6Gy bestrahlt. Nach 4-6 Stunden erfolgte die intravenöse Injektion von 45.000 bis 76.000 HSC in 30µl PBS. Die Mäuse wurden im Alter von 11 bis 13 Wochen auf den Erfolg der Rekonstitution durchflusszytometrisch untersucht und in Experimenten verwendet. 10. Probengewinnung und durchflusszytometrische Analysen 10.1) Präparation von Maus-Leukozyten aus dem Blut Peripheres Blut wurde aus dem retro-orbitalen Venenplexus der Maus mithilfe von Hämatokritkapillaren (Brand, Wertheim) abgenommen und in EDTA-enthaltenden Röhrchen gesammelt. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden die Erythrozyten 2x für 2min mit 500µl Erythrozyten-Lyse-Puffer (0,15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0,1mM Na2EDTA, pH 7,3) 76 Material und Methoden lysiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von PBS abgestoppt, die Zellen bei 600xg für 5min zentrifugiert, mit 1ml PBS gewaschen und schließlich in FACS-Puffer aufgenommen. 10.2) Präparation von humanen Leukozyten aus dem Blut Peripheres Blut wurde aus dem retro-orbitalen Venenplexus der Maus mithilfe von Hämatokritkapillaren abgenommen und in EDTA-enthaltenden Röhrchen gesammelt. Humanes Blut wurde aus dem Ohrläppchen von freiwilligen Spendern (Mitarbeiter der Arbeitsgruppe) gewonnen. Für die durchflusszytometrische Analyse von humanen Leukozyten (human oder humanisierte Maus) wurde das Blut 1:1 mit PBS verdünnt, auf das gleiche Volumen Pancoll überschichtet und für 25min bei 1800rpm und 12°C mittels Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt. Danach konnte die Leukozytenschicht abgenommen und die Zellen in FACS-Puffer aufgenommen werden. 10.3) Präparation von Leukozyten aus Milz und Knochenmark Leukozyten aus der Milz und dem Knochenmark wurden wie folgt aus humanisierten Mäusen präpariert: Nach dem Töten der Mäuse durch kraniale Dislokation wurde die Milz entfernt. Eine Hälfte der Milz wurde für spätere Immunfluoreszenzfärbungen in TissueTekR O.C.T. Compound (Sakura Finetek, NL) eingebettet, während die andere Hälfte der Milz durch einen 70µm Sieb gestrichen wurde um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Milzzellen wurden anschließend durch ein 40µm Sieb filtriert, bevor sie mit PBS für 5min bei 1400rpm und 4°C gewaschen und in FACS-Puffer aufgenommen wurden. Je nach Anzahl der FACSFärbungen wurde für die Isolation von Leukozyten aus dem Knochenmark zunächst ein oder beide Hinterbeine abgeschnitten und von Haut und Muskeln befreit. Ober- und Unterschenkel wurden getrennt, jeweils die Knochenenden abgeschnitten und das Knochenmark mit einer 20G Kanüle und PBS ausgespült. Eine Einzelzellsuspension wurde durch Filtration durch ein 40µm Sieb erzielt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in FACS-Puffer aufgenommen. Humane Milz- und Knochenmarksproben wurden für Forschungszwecke vom Universitätsklinikum Erlangen über Prof. Dr. Diana Dudziak (Labor für Biologie Dendritischer Zellen, Erlangen) zur Verfügung gestellt. Diese Proben wurden einer Pancoll- Dichtegradienten-Aufreinigung unterzogen, bevor sie für die durchflusszytometrische Färbung verwendet wurden. 10.4) Durchflusszytometrische Färbung und Analyse Die FACS-Färbung der isolierten Leukozyten wurde in 96-well-Platten durchgeführt. Gefärbt wurde jeweils in einem Volumen von 50µl für 15min auf Eis. Mit der Ausnahme der durchflusszytometrischen Untersuchung der FcγR Expression auf Leukozyten der Maus, wurden die Zellen vor der FACS-Färbung mit dem monoklonalen Antikörper 2.4G2 inkubiert. 77 Material und Methoden Diese auch Fc Block genannte Behandlung blockiert die Interaktion der mFcγRIIB und mFcγRIII mit den Fc Regionen der FACS-Antikörper und verringert damit das Risiko falschpositiver Signale. Die verwendeten Antikörper und die entsprechenden Verdünnungen sind in Abschnitt E.I. Material aufgeführt. Für die lebend-tot-Diskriminierung wurden die Zellen anschließend mit dem Kernfarbstoff DAPI inkubiert. Die durchflusszytometrische Analyse der gefärbten Proben erfolgte am FACS Canto II (Becton Dickinson). Für die Auswertung der Daten wurde die FACSDiva Software verwendet. Es wurden ausschließlich lebende Zellen nach dem Duplettenaussschluss analysiert. 11. Immunfluoreszenz-Analyse der humanisierten Mäuse Nach dem Töten der Versuchstiere durch kraniale Dislokation wurde die Milz entnommen, halbiert und eine Hälfte in TissueTekR O.C.T. compound gefüllte TissueTek 4566 Cryomold Gefäße (beides Sakura Finetek, NL) eingebettet und auf Trockeneis durchgefroren. Die Organe wurden bis zur Anfertigung von Gewebeschnitten bei -80°C gelagert. 6µm Kryoschnitte wurden auf SuperFrost plus-Objektträger (Menzel-Gläser, Braunschweig) aufgezogen, ÜN bei RT getrocknet, 150sec in -20°C kaltem Aceton fixiert und erneut ÜN getrocknet. Die Schnitte wurden bis zur Färbung bei -20°C gelagert. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden die Schnitte aufgetaut, mit einem ImmedgePen (Vector Laboratories, USA) umrandet und nach kurzer Trocknung und Waschen in PBS in eine feuchte Kammer überführt. Eine unspezifische Antikörperbindung wurde zunächst durch Inkubation mit PBS / 5% Ziegenserum blockiert, bevor je 20µl der entsprechenden Antikörperverdünnungen für 1h bei RT aufgebracht wurden. Nach einem letzten Waschen der Schnitte in PBS wurden sie mit Fluoromount (Sigma, Steinheim) eingedeckelt und nach kurzer Trocknung am Axiovert 200M (Zeiss, Jena) ausgewertet. 12. 1F5 IgG vermittelte B-Zell-Depletion Die anti-CD20 1F5 IgG wurden wie beschrieben (siehe Absatz E.II.1.) kloniert und produziert. Um die IgG-induzierte B-Zell-Depletion im Blut zu untersuchen, wurden 10µg IgG pro Maus intravenös in die Schwanzvene injiziert. Die Zellzahl der CD19+ B-Zellen wurde innerhalb der humanen, hCD45+ Leukozytenpopulation durchflusszytometrisch vor und nach Injektion (Tag 1, Tag 3, Tag 7) bestimmt. Für eine Analyse der B-Zell-Depletion in Milz und Knochenmark wurden 100µg 1F5 IgG pro Maus intravenös in die Schwanzvene injiziert und die Mäuse 3 Tage nach Injektion durchflusszytometrisch untersucht. 78 Material und Methoden 13. Zellkultur Im Rahmen dieser Arbeit wurden HEK293T (human embryonal kidney), CHO (chinese hamster ovary) Zellen (adhärente Zelllinien) und die humane B-Zell-Linie LCL1.11 (Suspensionszelllinie) verwendet. FcγR stabil exprimierende CHO Zellen wurden von Frau Anne Bärenwaldt zur Verfügung gestellt. Die eFcγRIIIA-exprimierenden CHO-Zellen stammen von Jeffrey Ravetch (New York, USA). Die in Suspension wachsenden 1F5 und 7B4 Hybridomzelllinien wurden bei ATCC erworben bzw. von Birgitta Heyman (Lund, Schweden) zur Verfügung gestellt. HEK293T Zellen wurden in DMEM / 5% FCS / 1% Penicillin/Streptomycin / 1% Glutamin kultiviert. Für die Antikörperproduktion wurden sie in protein-freies Medium (DMEM / 10% Nutridoma SP / 1% Penicillin/Streptomycin / 1% Glutamin) umgesetzt. Für alle anderen Zelllinien wurde RPMI1640 Medium verwendet bei dem 10% FCS / 1% Penicillin/ Streptomycin / 1% Glutamin / 1% Natriumpyruvat und 1% non-essential amino acids zugesetzt wurden. Die verwendeten Zelllinien wurden unter Standardbedingungen kultiviert (37°C, 5% CO2, feuchte Atmosphäre). Die Zellen wurden alle 2-3 Tage passagiert, bei adhärenten Zellen unter Verwendung von 0,25% Trypsin/EDTA. Exakte Zellzahlen wurden mithilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. 14. Versuchstierhaltung Alle verwendeten Versuchstiere wurden in den zentralen Tierversuchseinrichtungen der Medizinischen und Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, d.h. zunächst im Franz-Penzold-Zentrum (FPZ), später im Biologisch Technischen Entwicklungsgebäude (BTE), in isolated ventilated cages (IVC) unter specific pathogen free (SPF)-Bedingungen gehalten. Wie von The Jackson Laboraties empfohlen, wurde das Trinkwasser der immundefizienten Rag2/γc-/- und Rag2/γc/Fcγ-/- Mäuse durch Zugabe von HCl auf einen pH Wert von ca. 3,0 eingestellt. Für die Versuche wurden männliche und weibliche Tiere im Alter von 11-13 Wochen eingesetzt. C57BL/6 Mäuse wurden von Janvier (Frankreich) bezogen. Die Rag2/γc-/- Mäuse stammen von Hergen Spits (Niederlande) und die FcγR-/- wurden von Jeffrey Ravetch (USA) zur Verfügung gestellt. 15. Statistik Für die statistische Auswertung wurden je 2 Datengruppen mit dem Student´schen T-Test verglichen. P-Werte kleiner 0,05 wurden als signifikant (*), p-Werte zwischen 0,01 und 0,001 79 Material und Methoden als verstärkt signifikant (**) und p-Werte kleiner 0,001 als hochsignifikant (***) bewertet. Die statistische Auswertung erfolgte mit Microsoft Office Excel 2003. 80 Literaturverzeichnis G. Literaturverzeichnis 1. Albert, H., et al., In vivo enzymatic modulation of IgG glycosylation inhibits autoimmune disease in an IgG subclass-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(39): p. 15005-9. 2. Schroeder, H.W., Jr. and L. Cavacini, Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125(2 Suppl 2): p. S41-52. 3. Ravetch, J.V., et al., Structural heterogeneity and functional domains of murine immunoglobulin G Fc receptors. Science, 1986. 234(4777): p. 718-25. 4. Unkeless, J.C. and H.N. Eisen, Binding of monomeric immunoglobulins to Fc receptors of mouse macrophages. J Exp Med, 1975. 142(6): p. 1520-33. 5. Weinshank, R.L., A.D. Luster, and J.V. 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J Immunol Methods, 2000. 242(1-2): p. 127-32. 88 Anhang H. Anhang I. Sequenzen und Vektorkarten 1. Sequenzen der klonierten Antikörper: Schwere Ketten Nach Durchführung der 5’-RACE und Klonierung der erhaltenen PCR-Produkte ergab die Sequenzierung der variablen Regionen der schweren Ketten von 7B4 und 1F5 Antikörpern folgende DNA-Sequenz: 7B4 VH atgggttggctgtggaacttgctattcctgatggcagctgcccaaagtgcccaaccaca 60 gatccagttggtacagtctggacctgaggtgaaggagcctggagagacagtcaggatct 120 cctgcaaggcttctggatataccttcacagcccatggaatgggctgggtgaaacaggct 180 ccaggaaagggtttaaggtggatgggctggataaacacctactctggagtgccagcata 240 tgttgatgacttcaagggacggtttgccttttatctggaaacctctgccagcactgtct 300 atttgcagatcaataacgtcaaagatgaagacacggctacatatttctgtggaagatgg 360 gctatggttacgacgtgctttgacacctggggccaaggcaccactctcaccgtgagctc 420 a 421 1F5 VH atgggatggagttgtatcatcctcttcttggtagcaacagctgcaggtgtccactcccag 60 gtgcaactgcggcagcctggggctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatgacc 120 tgcaaggcttctggctacacatttaccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacct 180 ggacagggcctggaatggattggagctatttatccaggaaatggtgatacttcctacaat 240 cagaagttcaaaggcaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatg 300 cagctcagcagtctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcgcactac 360 ggtagtaactacgtagactactttgactactggggccaaggcaccactctcaccgtgagc 420 tca 423 Diese variablen Regionen wurden an die folgenden konstanten Regionen der humanen schweren Ketten fusioniert: IgG1 CH gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg 60 ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg 120 tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca 180 ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc 240 tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagccc 300 aaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga 360 ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct 420 gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg 480 tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac 540 89 Anhang agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag 600 gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc 660 aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgag 720 ctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc 780 gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg 840 ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg 900 cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg 960 cagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga 999 IgG2 CH gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgag 60 agcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg 120 tggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca 180 ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgacctccagcaacttcggcacccagacc 240 tacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgc 300 aaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttc 360 ctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgc 420 gtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggc 480 atggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgt 540 gtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgc 600 aaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggg 660 cagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaac 720 caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgg 780 gagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgac 840 ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaac 900 gtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctc 960 tccctgtctccgggtaaatga 981 IgG3 CH gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctctggg 60 ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg 120 tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca 180 ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc 240 tacacctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagctc 300 aaaaccccacttggtgacacaactcacacatgcccacggtgcccagagcccaaatcttgt 360 gacacacctcccccgtgcccacggtgcccagagcccaaatcttgtgacacacctccccca 420 tgcccacggtgcccagagcccaaatcttgtgacacacctcccccatgcccacggtgccca 480 gcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggatacc 540 cttatgatttcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac 600 cccgaggtccagttcaagtggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag 660 ccgcgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcac 720 caggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc 780 90 Anhang cccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggacagccccgagaaccacaggtgtacacc 840 ctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa 900 ggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcagcgggcagccggagaacaac 960 tacaacaccacgcctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc 1020 accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacatcttctcatgctccgtgatgcatgag 1080 gctctgcacaaccgcttcacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag 1134 IgG4 CH gcctccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgag 60 agcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg 120 tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca 180 ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacc 240 tacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtcc 300 aaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtc 360 ttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacg 420 tgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggat 480 ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtac 540 cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaag 600 tgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa 660 gggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaag 720 aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggag 780 tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc 840 gacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggagggg 900 aatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagc 960 ctctccctgtctccgggtaaatga 984 2. Sequenzen der klonierten Antikörper: Leichte Ketten Nach Durchführung der 5’-RACE und Klonierung der erhaltenen PCR-Produkte ergab die Sequenzierung der variablen Regionen der leichten Ketten von 7B4 und 1F5 Antikörpern folgende DNA-Sequenz: 7B4 VL atggattttctggtgcagattttcagcttcttgctaatcagtgcctcagtgtcaatgtcc 60 agaggagaaaatgtggtcacccagtctccaggaatcatgtctgcatctccaggggacaag 120 gtcaccatgacctgcagggccagcccaagtgtaacttccagtcacttgcactggtatcag 180 cagaagtcaggtggctcccccaaactctggatttatagcacatacaacttggcttctggg 240 gtccctggtcgcttcagtggcagtgggtctggggcctcttactctctcacaatcagcagt 300 gtggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtacagaagttattcagtcacg 360 ttcggaggggggaccaagctgga 383 91 Anhang 1F5 VL atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgctccagtcataatgtcc 60 agaggacaaattgttctctcccagtctccagcaatcctttctgcatctccaggggagaag 120 gtcacaatgacttgcagggccagttcaagtttaagtttcatgcactggtaccagcanaag 180 ccaggatcctcccccaaaccctggatttatgccacatccaacctggcttctggagtccct 240 gctcgcttcagtggcagcgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagagtggag 300 gctgaagatgctgccacttatttctgccatcagtggagtagtaacccgctcacgttcggc 360 gctgggaccaagctgga 377 Diese variablen Regionen wurde mittels PCR an die folgende konstante Region der κ leichten Kette fusioniert: CL (κ Leichte Kette) gatcaaacgaactgtggctgcaccatcggtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt 60 gaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaa 120 agtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacaga 180 gcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga 240 ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgt 300 cacaaagagcttcaacaggggagagtgttag 331 3. Vektorkarten Abb. 31: In dieser Arbeit wurden für die Klonierung und Expression der schweren Ketten der Vektor pBos, für die leichten Ketten der Vektor pCMV verwendet. Zwischenschritte der Klonierung erfolgten in pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen, Darmstadt). 92 Anhang II. Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer A Alanin A647 Alexa647 Abb. Abbildung ADCC Antikörper-induzierte Zell-vermittelte Zytotoxizität APC Allophycocyanin AU engl. arbitrary units, willkürliche Einheiten BLAST engl. basic local alignment search tool bp Basenpaare BSA engl. bovine serum albumin, Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa CD engl. cluster of differentiation cDNA engl. complementary DNA, komplementäre DNA CH konstante Domänen der schweren Ketten CHO engl. chinese hamster ovary CL konstante Domäne der leichten Kette DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DC engl. dendritic cell, dendritische Zelle DNA engl. Desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphate ELISA engl. enzyme linked immunosorbant assay EndoS Endoglykosidase S engl. englisch F Phenylalanin FACS engl. Fluorescence activated cell sorting, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung Fc engl. fragment christallyzable FcR Fc Rezeptor FCS engl. Fetal calf serum, Fötales Kälberserum FcγR Fcγ Rezeptor FITC Fluoresceinisothiocyanat g engl. gravitational force Gy Gray 93 Anhang H Histidin h lat. hora, Stunde ddH2O doppelt destilliertes Wasser HEK engl. human embryonal kidney HRP engl. horseraddish peroxidase HSC hämatopoetische Stammzellen Ig Immunglobulin IL Interleukin ITAM engl. immunoreceptor tyrosine based activation motif ITIM engl. immunoreceptor tyrosyine based inhibitory motif kDa Kilodalton KM Knochenmark lat. lateinisch LPS Lipopolysaccharid M Molar MACS engl. magnetic assisted cell sorting, Magnetische Zellsortierung MFI Mittlere Fluoreszenzintensität min Minuten ml Milliliter mM Nanomolar N Asparagin ng Nanogramm NK-Zellen Natürliche Killer Zellen nm Nanometer NOD non-obese diabetic OD Optische Dichte PBMC engl. peripheral blood mononuclear cells PBS engl. phosphate-buffered saline, Phosphate-gepufferte Saline PCR engl. polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion PE Phycoerythrin PerCP Peridininchlorophyll pH lat. Pondus Hydrogenii, “Stärke des Wasserstoffs” PNGaseF Peptid N:Glykosidase F R Arginin RA Rheumatoide Arthritis RACE engl. rapid amplification of cDNA ends Rag engl. recombinase activating gene RNA engl. Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure 94 Anhang rpm engl. rotations per minute RT Raumtemperatur scid engl. severe combined immunodeficiency sec Sekunde SLE Systemischer Lupus Erythematodes sog. sogenannte SPR engl. surface plasmon resonance TCR engl. T cell receptor, T-Zell-Rezeptor TdT Terminale Desoxynukleotid Transferase TNP 2,4,6-Trinitrophenyl U engl. unit, Einheit ÜN über Nacht UV ultraviolett V Valin v.a. vor allem vgl. vergleiche VH variable Region der schweren Ketten VL variable Region der leichten Ketten z.B. zum Beispiel γc IL 2 Rezeptor Signalkette 95 Anhang III. Eigene Publikationen 1. Zeitschriftenartikel Lux A, Baerenwaldt A, Albert H, Woigk M, Dudziak D, Nimmerjahn F. A novel humanized mouse model to study human Immunoglobulin G activity in vivo. (Manuskript eingereicht) Nimmerjahn F, Lux A, Albert H, Woigk M, Lehmann C, Dudziak D, Smith P, Ravetch JV. FcγRIV deletion reveals its central role for IgG2a and IgG2b activity in vivo. PNAS. 2010. Lux A, Aschermann S, Biburger M, Nimmerjahn F. The pro and anti-inflammatory activities of immunoglobulin G. Ann Rheum Dis. 2010 Jan;69 Suppl 1:i92-96. Aschermann S, Lux A, Baerenwaldt A, Biburger M, Nimmerjahn F. The other side of immunoglobulin G: suppressor of inflammation. Clin Exp Immunol. 2010 May;160(2):161-7. 2. 04/2009 Posterpräsentation und Vorträge Vortrag, 7. Mitarbeiterkolloquium, Bayrisches Genomforschungs- netzwerk (BayGene), München 10/2008 Posterpräsentation, 3rd European Workshop on Immune-Mediated Inflammatory Diseases, London, UK 06/2008 Vortrag 6. Mitarbeiterkolloquium, Bayrisches Genomforschungs- Bayrisches Genomforschungs- netzwerk (BayGene), München 07/2007 Vortrag, 5. Mitarbeiterkolloquium, netzwerk (BayGene), München 96 Anhang IV. Lebenslauf Angaben zur Person Name Anja Lux, geb. Richter Geburtstag 21.09.1982 Geburtsort Altenburg Familienstand verheiratet Nationalität deutsch Schul- und Berufsausbildung seit 05/2010 Promotion an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Lehrstuhl für Genetik, Arbeitsgruppe: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn 08/2007 – 04/2010 Promotion am Universitätsklinikum Erlangen, Medizinische Klinik III – Rheumatologie und Immunologie, Arbeitsgruppe Prof. Dr. Falk Nimmerjahn 10/2006 - 04/2007 Diplomarbeit an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Lehrstuhl für Experimentelle Medizin II, Arbeitsgruppe: Prof. Dr. Jürgen Behrens Titel: “Search for Conductin interacting proteins on the mitotic spindle“ 08/2006 Ablegen der Diplomprüfungen (Note: 1,0) 08/2004 Ablegen des Vordiploms (Note: 1,5) 10/2002 –04/2007 Studium der Molekularen Medizin an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg 08/1993 – 05/2001 Platanengymnasium Altenburg Abschluss: Allgemeine Hochschulreife (Note: 1,3) 08/1989 – 08/1993 Grundschule Siegfried-Flack-Straße, Altenburg Auslandsaufenthalte 08/2008 – 12/2008 Laborpraktikum, Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam, Niederlande, Arbeitsgruppe: Dr. Arnoud Sonnenberg 08/2001 – 08/2002 AuPair Aufenthalt in den USA Zusätzliche Qualifikationen 09/2010 Fortbildungsveranstaltung für Projektleiter und Beauftragte für Biologische Sicherheit (BBS) (Universität Freiburg) 07/2010 Aufbaukurs für den Umgang mit umschlossenen radioaktiven Stoffen erhöhter Aktivitäten (Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe) 03/2006 Seminar „Einführung in die Versuchstierkunde und tierexperimentelle Techniken“ – Kategorie: B-FELASA (Universität Erlangen-Nürnberg) 02/2006 Grundkurs in Strahlenschutz (Universität Erlangen-Nürnberg) 97 Danksagung I. Danksagung Bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Falk Nimmerjahn möchte ich mich für die Möglichkeit bedanken, dass ich dieses spannende aber auch herausfordernde Thema bearbeiten durfte. Vielen Dank sage ich auch für die ausgezeichnete Betreuung während der letzten Jahre. Auch heute noch sind Sie immer für Fragen offen und stehen mir stets mit Rat und Tat zur Seite. Ich bin dankbar, dass ich von Ihnen lernen darf. Bei Prof. Dr. Hans-Martin Jäck bedanke ich mich für die zeitnahe Erstellung des Zweitgutachtens dieser Dissertation. Prof. Dr. Georg Schett und Prof. Dr. Lars Nitschke danke ich für ihre Bereitschaft in diesem Promotionsverfahren als Prüfer fungiert zu haben. Bei meiner lieben Kollegin Anne Bärenwaldt, die mir in den letzten Jahren auch zu einer guten Freundin geworden ist, bedanke ich mich für viele anregende Diskussionen und den regen Austausch von Ideen, die praktische Unterstützung und nicht zuletzt für das ausdauernde Korrekturlesen dieser Arbeit. Du weißt, wie schwer ich mich teilweise getan habe. Noch dazu hattest du immer ein offenes Ohr auch außerhalb des Laboralltags. Danke! Bei den anderen - den alteingesessenen sowie den neuen und auch vergangenen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Heike Albert, Susanne Aschermann, Markus Biburger, Sybille Böhm, Heike Danzer, Angela Dick, Birgit Lehmann, Johanna Rothamer, Inessa Schwab, Michaela Seeling, Melissa Woigk und Jessica Zöller bedanke ich mich für die nette Zusammenarbeit. Jeden Tag gern ins Labor zu gehen, egal wie die Experimente gerade laufen, hat auch viel mit euch zu tun. Meiner Familie, allen voran meinen Eltern, danke ich für ihre andauernde Unterstützung bei allen meinen Projekten. Auch wenn ich mittlerweile mein eigenes Leben führe, seid ihr doch immer nahe bei mir und steht mir immer mit guten Ratschlägen und konstruktiver Kritik zur Seite. Meinem Mann Stefan danke ich, dass er ist, wie er ist. Mit einer unendlichen Geduld und Verständnis, hast du mich stets wieder aufgerichtet, die Dinge ins rechte Licht gerückt und mir auch mal den notwendigen „Tritt in den Hintern“ verpasst. Ich liebe dich! 98