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Durchflusszytometrische BALF-Diagnostik Gliederung 1. Lymphozytenidentifizierung 2. Durchflusszytometrie als Methode 3. Bearbeitung der Proben 4. Typische Befunde und Probleme 5. Blick in die Zukunft Dagmar Riemann Institut für Med. Immunologie Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg [email protected] 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 Medizinische Fakultät 28.03.2012 1 Lymphozyten als Zellen des Immunsystems haben viele verschiedene Funktionen Morphologisch gleich aussehende Zellen mit unterschiedlichen Funktionen 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 Medizinische Fakultät 28.03.2012 2 Wie identifiziert man Lymphozytensubpopulationen? über den Nachweis spezieller Oberflächenmoleküle! Methode Immunfluoreszenz: Nachweis eines Antigens mit Hilfe eines Fluoreszenzgekoppelten Antikörpers 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 3 Lymphozyten lassen sich über ihre Oberflächenmoleküle unterscheiden Anfärben mit Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern CD16 CD19 CD56 CD20 Kein CD3! NK-Zellen B-Zellen OberflächenIgG T-Zellrezeptor (TCR) CD8 CD3 T-Helferzellen CD3 T-zell- CD4 rezeptor zytotoxische T-Zellen 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 4 Immunfluoreszenz Auswertung der Lymphozytentypisierung über viele Jahre am Fluoreszenz-Mikroskop Nachteile: - Wenige Zellen gezählt (Statistik schlecht) - Intensität der Fluoreszenz schlecht quantifizierbar - Schwierigkeiten bei Mehrfarbanalyse Mühsame Methode 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 5 Neue Methode: Durchflusszytometrie Definition Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften Vorteile: Nachteil: 28.03.2012 schnelle Methode (1000 Zellen/s), viele Zellen in kurzer Zeit analysierbar (statistische Sicherheit) Intensität in feiner Abstufung messbar multiparametrisch, mehrere Fluoreszenzen und Streulicht parallel messbar keine morphologische Information zur Fluoreszenz (Kern oder Oberfläche? Granulär oder fein verteilt?) Zytologie in der Pneumologie Nov2011 6 Streulicht-Messung von Leukozyten im Durchflusszytometer Leukozyten lassen sich aufgrund ihrer Streulichteigenschaften unterteilen in Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten (Separierung der Lymphozyten unnötig). entspricht Granularität entspricht Zellgröße Im Blut scheint alles ganz einfach! 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 7 Bearbeitung der Zellen der BALF -Filtration und Zentrifugation der Zellen -Zellzahl bestimmt -Inkubation der Zellen mit Antikörpern und Vitalitätsfarbstoff (4 Fluoreszenzfarben gleichzeitig) -Messen der Probe am Durchflusszytometer Ca. 50 Alveolarmakrophagen pro Alveole -parallel: Anfertigen eines Zytospin-Präparates Befunderstellung aus Zusammenschau der Immunfluoreszenz-Daten und der Morphologie Achtung: die klin. Verdachtsdiagnose ist wichtig und sollte –wie Raucherstatus bzw. Allergenexposition- mitgeteilt werden ebenso wie immunsuppressive Therapie 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 8 Gate auf Lymphozyten Erythrozyten & Epithel & Debris Granulozyten Makrophagen Monozyten Seitwärtsstreulicht Lymphozyten CD45 als Panleuko-Molekül 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 9 Helfer-T-Zellen Die Zahl der Lymphozytensubpopulationen lässt sich mit 2 Röhrchen in einer 4-Farbmessung am Durchflusszytometer ermitteln Zytotox.T-Zellen NK-Zellen B-Zellen SSC= Seitswärtsstreulicht T-Zellen T-Zellen 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 Medizinische Fakultät 28.03.2012 10 Informationen aus unserem BAL-Befund Institut für Med. Immunologie Zellzahl Anteil an Erys Vitalität der Leukos (7-AAD) Lymphozytenanteil an den Leukos Leuko-Differenzierung aus dem Zytospin, Evt. Eisenfärbung Prozentsatz an T-, B- und NK-Zellen (% der Lymphozyten) CD4+ Helfer und CD8+ zytotox. T-Zellen (% der Lymphozyten) T-Zellaktivierung (HLA-DR als Maß für Interferon-gamma-Sekretion CD57 als Maß für abgelaufene T-Zellteilungen) Zusätzliche Möglichkeiten: Monoklonalität der B-Zellen bzw. der T-Zellen Anteil an CD1a+ dendrit. Zellen (Diagnose Histiozytosis X) Regulatorische T-Helferzellen 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 11 30 Jahre BALF-Typisierung Granulomatöse Lungenerkrankungen Hoher Lymphozytenanteil Fibrosierende Lungenerkrankungen Granulozytäre Komponente viel Frust bei der Zuordnung einzelner Erkrankungen zur leukozytären Zusammensetzung -Je höher Ratio CD4/CD8, desto eher Sarkoidose (und nicht EAA) -Erhöhte Gesamtzellzahl -bestehend aus Lymphozyten- ohne erhöhte Neutrophile oder Eosinophile, ist eher Sarkoidose Ein Lymphozytenanteil <30% zusammen mit erhöhtem Granulozytenwert erhöht die Wahrscheinlichkeit einer fibros. Lungenerkrankung von 16 auf 33%... FACS-Daten werden erst durch die Integration mit anderen Befunden hilfreich 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 12 Beispielbefunde Mittlere Zellzahl 38% Lymphozyten Ratio CD4/CD8 13,3 Bild passt zu Sarkoidose 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 13 Beispielbefunde Hohe Zellzahl, fast ausschließlich Lymphozyten (84% der Leukos) Ratio CD4/CD8 2,8 Bild passt zu Sarkoidose 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 14 Warum gibt es die hohen interindividuellen Schwankungen der Zusammensetzung der BALF-Immunzellen? Bisher kaum Studien, die Geschlecht, Alter, Dauer der Immunstimulation, Raucherstatus, klinischen Verlauf oder andere Testparameter mit einbeziehen, unser Wissen ist mangelhaft! Bilder variieren mit der Krankheitsphase, z.B. in EAA ist BALF-Zellprofil von der vergangenen Zeit der Antigeninhalation abhängig… Der immunologische Wissenszuwachs der letzten Jahre hat bisher kaum zu neuen zellulären Markermolekülen beigetragen (ökonom. Interessen?) Hochauflösende Computertomographie-Daten müssen jetzt neu mit FACSDaten assoziiert werden 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 15 CD4 ist kein ausreichender Marker, um T-Zellfunktion zu beschreiben 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 TH17-Zellen erhöht in zystischer Fibrose und in Bronchiektasen (2011) 16 Regulatorzellen lassen sich mit Hilfe von 4-FarbImmunfluoreszenz bestimmen CD127 CD4 R3: 10,2% der Helferzellen sind Regulatorzellen CD3 PercP CD25 APC Messung der Regulatorzellen als CD127 dim/CD25++ Helfer-T-Zellen Daneben Nachweis des intrazellulären foxP3-Transkriptionsfaktors (nach Zellpermeabilisierung) 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 17 Die T-Zellfunktion kann durch Rezeptoren mit positiven und negativen Signalen gesteuert werden Medizinische Fakultät 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 18 Die Bedeutung der Charakterisierung von Immunzellen in der BALF wird in Zukunft zunehmen, Oberflächenmoleküle müssen durch funktionelle Assays ergänzt werden. Neben den Lymphozyten gelangen zunehmend auch Makrophagen und dendrit. Zellen in den Fokus des klinischen Interesses. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! [email protected] 28.03.2012 Zytologie in der Pneumologie Nov2011 19
