Abortive Replikation des Respiratory Syncytial Virus in
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Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung................................................................................................ 8 1.1 Das Immunsystem...................................................................................... 8 1.2 Dendritische Zellen..................................................................................... 1.2.1 Herkunft dendritischer Zellen........................................................... 8 9 1.2.2 Unreife dendritische Zellen.............................................................. 10 1.2.3 Reife dendritische Zellen.................................................................. 11 1.2.4 Antigenpräsentation.......................................................................... 11 1.2.5 Einteilung dendritischer Zellen........................................................ 12 1.2.5.1 Myeloide dendritische Zellen.............................................. 12 1.2.5.2 Plasmazytoide dendritische Zellen...................................... 12 1.2.5.3 Langerhanszellen................................................................. 13 1.3 Zytokine...................................................................................................... 15 1.3.1 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor........................ 15 1.3.2 Tumuor-necrosis-factor α................................................................. 15 1.3.3 Transforming-growth-factor β.......................................................... 16 1.3.4 Interleukin-4..................................................................................... 17 1.4 Respiratory Syncytial Virus........................................................................ 18 1.4.1 Epidemiologie................................................................................... 18 1.4.2 Klinik................................................................................................ 18 1.4.3 Therapie............................................................................................ 19 1.4.4 Prophylaxe........................................................................................ 19 1.4.5 Aufbau des RS-Virus........................................................................ 20 1.5 Methoden zum Virusnachweis in dendritischen Zellen............................. 22 1.6 Fragestellung.............................................................................................. 24 3 2 Material, Methoden und Probanden.................................................... 25 2.1 Methoden................................................................................................... 25 2.1.1 Stammzellspender............................................................................. 25 2.1.2 Isolierung der Zellen......................................................................... 25 2.1.2.1 Isolierung der mononukleären Zellen über den Ficoll-Gradienten................................................................. 25 2.1.2.2 Isolierung von CD34+ Zellen über die MiniMACS-Säule... 26 2.1.2.2.1 Prinzip der MiniMACS-Säule............................. 2.1.2.2.2 26 Durchführung...................................................... 26 2.1.3 Kultivierung und Anzucht von dendritischen Zellen....................... 27 2.1.3.1 Anzucht bis Tag 7................................................................ 27 2.1.3.2 Ernten und Einfrieren angezüchteter Zellen........................ 27 2.1.3.3 Weiterkultur von Tag 7 bis Tag 14...................................... 28 2.1.4 Infektion der dendritischen Zellen mit RSV..................................... 28 2.1.5 RSV-spezifische Real-Time PCR..................................................... 29 2.1.6 Untersuchung der dendritischen Zellen im Fluoreszenzmikroskop. 30 2.1.6.1 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen....................... 30 2.1.6.2 Färbung der Zellen............................................................... 30 2.1.6.3 Immunfluoreszenzmikroskopie........................................... 30 2.1.7 Messung des intrazellulären RSV-Antigens im Durchflusszytometer......................................................................... 31 2.1.7.1 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen....................... 31 2.1.7.2 Messung im FACScanTM..................................................... 31 2.1.8 Bestimmung des Virustiters im Überstand....................................... 32 2.2 Material....................................................................................................... 33 3 Ergebnisse................................................................................................ 37 3.1 Die RSV-Replikation ist in TGF-β-Zellen vermindert............................... 37 3.2 Untersuchung des P-Proteins...................................................................... 38 3.2.1 Das P-Protein liegt als Vakuole im Zytoplasma............................... 38 3.2.2 Der Durchmesser der P-Protein Vakuole ist bei den TGF-β-Zellen größer....................................................................... 40 4 3.3 TGF-β-Zellen enthalten weniger RSV-Proteine als IL-4-Zellen............... 40 3.4 Die Virusfreisetzung ist in TGF-β-Zellen geringer als in IL-4-Zellen....... 41 4 Diskussion................................................................................................ 43 4.1 Verteilung der Langerhanszellen in Haut und Lunge................................. 43 4.2 P-Proteinexpression in dendritischen Zellen.............................................. 44 4.3 Infektion dendritischer Zellen mit RSV..................................................... 45 4.4 Infektion von Makrophagen mit RSV........................................................ 46 4.5 Infektion dendritischer Zellen mit dem Masernvirus................................. 47 4.6 Infektion dendritischer Zellen mit HIV...................................................... 47 4.7 Bedeutung von Langerhanszellen für die Abwehr von Pathogenen........... 48 4.8 Langerhanszellen sind in der Lunge erst nach dem ersten Lebensjahr vorhanden.................................................................................................. 48 5 Zusammenfassung.................................................................................. 51 6 Literaturverzeichnis.............................................................................. 53 5
