Inhibition der Signaltransduktion von Toll-like

Inhibition der Signaltransduktion von
Toll-like-Rezeptoren
durch Annexin 1 auf der Oberfläche
apoptotischer Zellen
Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
vorgelegt von:
Diplom-Biochemikerin Andrea Mahr
aus Lichtenfels
November 2008
Tag der mündlichen Prüfung: __________________
Andrea Mahr
Der experimentelle Teil der vorliegenden Dissertation an der NaturwissenschaftlichMathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg wurde in der Zeit
von April 2005 bis Oktober 2008 unter der Leitung von Prof. Dr. P. H. Krammer in der Abteilung Immungenetik des Deutschen Krebsforschungszentrums in Heidelberg durchgeführt.
Erstgutachter:
Herr Prof. Dr. Lutz Gissmann
Abteilung Genomveränderungen und Karzinogenese
Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
Zweitgutachter:
Herr Prof. Dr. Peter H. Krammer
Abteilung Immungenetik
Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
I
Andrea Mahr
Zusammenfassung
Apoptotische Zellen entstehen kontinuierlich im Rahmen der Entwicklung und Gewebehomöostase multizellulärer Organismen. Ihre Beseitigung erfolgt durch Phagozyten wie
Dendritische Zellen (DC). Während die Aufnahme von Pathogenen DC aktiviert und zur
Auslösung einer Immunantwort führt, wirkt die Phagozytose apoptotischer Zellen antiinflammatorisch. Dies dient dem Schutz des Organismus vor Immunreaktionen gegen „Selbst“-Antigene aus apoptotischen Zellen und damit vor Autoimmunerkrankungen. Durch welche Mechanismen apoptotische Zellen DC beeinflussen ist jedoch weitgehend ungeklärt. In dieser
Arbeit wurde gezeigt, dass das Protein Annexin 1, das spezifisch auf der Oberfläche
frühapoptotischer Zellen präsentiert wird, zu deren antiinflammatorischem Effekt beiträgt,
indem es die Signaltransduktion von Toll-like Rezeptoren (TLR) und somit die Aktivierung
von DC hemmt.
Die Modulation der Immunantwort durch apoptotische Zellen und insbesondere durch das
Protein Annexin 1 wurde in in vitro-Experimenten mit DC oder DC-ähnlichen Zelllinien aus
Maus und Mensch untersucht. Vorinkubation mit apoptotischen Zellen oder rekombinantem
Annexin 1 führt zu einer verminderten Aktivierbarkeit der DC durch TLR-Liganden. Dies zeigt
sich in einer reduzierten Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie TNF, bei unveränderter
Produktion des antiinflammatorischen Zytokins IL-10. Der Einfluss auf die Zytokinsekretion
spiegelt sich in einer entsprechenden Regulation der Zytokin-mRNAs wider. Genexpressionsanalysen zeigen einen globalen negativ regulatorischen Einfluss von Annexin 1 auf die
durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierten proinflammatorischen Gene. Diese Effekte beruhen auf einer Inhibition der TLR-induzierten Signaltransduktion. Vorinkubation mit Annexin 1
bewirkt eine Reduktion der TLR-induzierten Phosphorylierung und Aktivierung von MAPKinasen sowie eine verminderte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB. Die Regulation
betrifft beide TLR-induzierte Signalwege, die von den Adaptormolekülen MyD88 bzw. TRIF
abhängen: MyD88- und TRIF-abhängige Zytokine sind gleichermaßen inhibiert, und ein Effekt von Annexin 1 ist auch in MyD88-defizienten Mäusen zu beobachten. Dementsprechend
beeinflusst Annexin 1 sowohl die Aktivierung über den ausschließlich TRIF-abhängigen
TLR3 als auch die MyD88-abhängige Signaltransduktion von TLR2 und dem IL-1-Rezeptor.
Die Stimulierbarkeit der DC über den nicht mit den TLR verwandten TNF-Rezeptor wird
durch Annexin 1 ebenfalls vermindert, was auf eine umfassendere Inhibition proinflammatorischer Signaltransduktion hinweist. Experimente mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid
weisen darauf hin, dass der antiinflammatorische Effekt von einer durch Annexin 1 induzierten Proteinsynthese abhängt. Die Analyse der Annexin 1-vermittelten Effekte auf DC trägt
zum Verständnis des Mechanismus bei, wie apoptotische Zellen das Immunsystem
beeinflussen und möglicherweise zu peripherer Toleranz führen.
II
Andrea Mahr
Summary
Apoptotic cells are generated continuously during development and tissue homeostasis
of multicellular organisms. They are removed by phagocytes such as dendritic cells (DC). In
contrast to pathogens, which activate DC upon uptake and lead to initiation of an immune
response, apoptotic cells show an anti-inflammatory effect on DC. This
protects the
organism from immune reactions against self-antigens derived from apoptotic cells and, thus,
from autoimmune diseases. Mechanistically, however, not much is known about the
tolerogenic effect of apoptotic cells. This work shows that the protein annexin 1, which is
presented specifically on the surface of early apoptotic cells, contributes to the antiinflammatory effect by inhibiting the signal transduction of Toll-like receptors (TLR) and thus
the activation of DC.
The modulation of the immune response by apoptotic cells and the protein annexin 1 in
particular was investigated in in vitro experiments, using DC or DC-like cell lines derived from
mouse or humans. Pre-incubation with apoptotic cells or recombinant annexin 1 leads to a
reduced reactivity of DC towards TLR ligands. This results in a reduced secretion of proinflammatory cytokines such as TNF, whereas the production of the anti-inflammatory
cytokine IL-10 is unaffected. The influence on the secretion is mirrored by a corresponding
regulation of the cytokine mRNAs. Gene expression analyses show a global negative impact
of annexin 1 on LPS-induced proinflammatory genes. These effects are due to an inhibition
of TLR-induced signal transduction. Pre-incubation with annexin 1 leads to a reduction of
TLR-induced activation of MAP-kinases and NF-κB. Both pathways induced by TLR,
depending on the adaptors MyD88 and TRIF, respectively, are affected: MyD88- and TRIFdependent cytokines are inhibited to a similar extent, and the effect of annexin 1 can still be
observed in MyD88-deficient mice. Correspondingly, annexin 1 inhibits activation mediated
by the TRIF-dependent TLR3 as well as the MyD88-dependent signal transduction of TLR2
and the IL-1 receptor. The reactivity of the DC towards TNF, which acts via a non-TLRrelated receptor, is reduced by annexin 1 as well, indicating a broad inhibition of proinflammatory signal transduction pathways. Experiments using the translational inhibitor
cycloheximide indicated that the anti-inflammatory effect of annexin 1 depends on protein
synthesis. The analysis of the effects of annexin 1 on DC contributes to a better
understanding of the mechanism how apoptotic cells influence the immune system and
possibly lead to peripheral tolerance.
III
Andrea Mahr
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
II
Summary
III
I. Einleitung
1
I.1.
Dendritische Zellen bilden die Schnittstelle zwischen angeborener
und adaptiver Immunität
I.2.
I.3.
I.1.1. Angeborene und adaptive Immunität
1
I.1.2. Professionelle Antigen präsentierende Zellen
2
Pathogen-assoziierte Strukturen werden von Toll-like Rezeptoren erkannt
4
I.2.1. Toll-like Rezeptoren
4
I.2.2. Weitere PRR-Klassen
7
TLR-Signaltransduktion führt zur Aktivierung der DC
8
I.3.1. Initiation der Signaltransduktion durch Adaptormoleküle
8
I.3.2. Signaltransduktion von TLR4
9
I.3.3. Signaltransduktion anderer TLR
I.4.
1
Die TLR-Signaltransduktion wird auf mehreren Ebenen negativ reguliert
12
13
I.4.1. Regulation durch extrazelluläre oder membranständige Moleküle
oder durch verminderte Expression der Signalmoleküle
I.5.
I.6.
I.7.
13
I.4.2. Intrazelluläre Inhibitoren einzelner Signalmoleküle
13
I.4.3. Inhibitoren mit mehreren Angriffspunkten
14
I.4.4. TLR-induzierte Apoptose
15
I.4.5. Endotoxin-Toleranz
16
DC können Immuntoleranz vermitteln
17
I.5.1. Mechanismen der T-Zell-Toleranz
17
I.5.2. Entstehung immunogener und tolerogener DC in vivo
19
I.5.3. Charakteristika tolerogener DC
20
I.5.4. Erzeugung tolerogener DC in vitro
21
Apoptotische Zellen beeinflussen professionelle Phagozyten
22
I.6.1. Einfluss apoptotischer Zellen auf die Phagozytose
22
I.6.2. Anti-inflammatorische Beeinflussung der Phagozyten durch apoptotische Zellen
25
Annexin 1 ist ein antiinflammatorisches Protein
auf der Oberfläche apoptotischer Zellen
28
I.7.1. Die Annexin-Familie
28
I.7.2. Annexin 1
31
I.8. Zielsetzung
35
IV
Andrea Mahr
II Material und Methoden
II.1. Material
36
36
II.1.1. Häufig verwendet Puffer
36
II.1.2. Biologisches Material
37
II.1.3. Oligodesoxyribonukleotide
37
II.1.4. Antikörper
38
II.1.5. Reagenzien
39
II.1.6. Geräte und Material
41
II.2. Methoden
II.2.1.
42
Zellbiologische Methoden
42
II.2.1.1. Kultivierung eukaryotischer Zellen
42
II.2.1.2. Präparation humaner Monozyten und Differenzierung zu DC
42
II.2.1.3. Präparation muriner Knochenmarkszellen und Differenzierung zu DC
43
II.2.1.4. Differenzierung der U-937 Zellen
44
II.2.1.5. Präparation primärer humaner neutrophiler Granulozyten
44
II.2.1.6. Apoptoseinduktion
44
II.2.1.7. Kokultur-Experimente mit Phagozyten und apoptotischen Zellen
45
II.2.1.8. Experimente mit Phagozyten und rekombinantem Annexin 1
45
II.2.1.9. Transfektion der Zelllinie Raw264.7
46
II.2.1.10. Reporter-Experimente mit Raw264.7 Zellen
46
II.2.1.11. Messung der Aktivität der p38 Kinase in Raw264.7 Zellen
47
II.2.2.
48
Proteinchemische Methoden
II.2.2.1. Aufreinigung von rekombinantem Annexin 1
48
II.2.2.2. Bestimmung von Proteinkonzentrationen
49
II.2.2.3. LPS-Dekontamination
50
II.2.2.4. Bestimmung der LPS-Konzentration
50
II.2.2.5. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
50
II.2.2.6. Lyse eukaryotischer Zellen
51
II.2.3.
51
Immunologische Methoden
II.2.3.1. ELISA
51
II.2.3.2. Durchflusszytometrische Messung von Apoptosemerkmalen
52
II.2.3.3. Western Blot
53
II.2.4.
53
Molekularbiologische Methoden
II.2.4.1. Transformation kompetenter Bakterien
53
II.2.4.2. Isolierung von Plasmid-DNA
54
II.2.4.3. Isolierung von RNA
54
II.2.4.4. RNA-Qualitätsbestimmung mit dem Agilent Chip
54
II.2.4.5. Reverse Transkription
55
II.2.4.6. Quantitative Real Time-PCR
55
II.2.4.7. Genexpressionsanalysen
56
V
Andrea Mahr
III. Ergebnisse
57
III.1. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die LPS-induzierte
Zytokinsekretion in humanen und murinen DC
57
III.2. Annexin 1 inhibiert die Zytokinsekretion nach TLR-Stimulation
auch in Gegenwart der LPS-blockierenden Substanz Polymyxin B
62
III.3. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsynthese
auf Ebene der mRNA
64
III.4. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen
70
III.5. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivität von NF-κB
73
III.6. Annexin 1 inhibiert den MyD88- und den TRIF-abhängigen Weg
74
III.7. Annexin 1 inhibiert die Signaltransduktion des TNF-Rezeptors
77
III.8. Die Annexin 1-vermittelte Suppression ist an eine Proteinsynthese gekoppelt
79
IV. Diskussion
83
IV.1. Apoptotische Zellen und Annexin 1 inhibieren die Sekretion proinflammatorischer
Zytokine in DC
83
IV.2. Die Zytokinregulation erfolgt auf der Stufe der mRNA
86
IV.3. Annexin 1 inhibiert die Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB
87
IV.4. Annexin 1 beeinflusst MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege der TLR sowie die
Signaltransduktion weiterer proinflammatorischer Rezeptoren
89
IV.5. Der inhibierende Effekt von Annexin 1 ist proteinsyntheseabhängig
90
IV.6. Modell zum Wirkmechanismus von Annexin 1 auf DC
91
IV.7. Rekombinantes Annexin 1 zeigt inhibitorische Effekte unabhängig von
kontaminierendem LPS
IV.8. Ausblick
V. Anhang
V.1. Referenzen
94
96
98
98
V.2. Tabellen zu den Genexpressionsanalysen
112
V.3. Abkürzungsverzeichnis
115
V.6. Erklärung
119
V.7. Danksagung
120
VI
I. Einleitung
Andrea Mahr
I. Einleitung
I.1.
Dendritische Zellen bilden die Schnittstelle zwischen angeborener und
adaptiver Immunität
I.1.1. Angeborene und adaptive Immunität
Alle multizellulären Organismen besitzen Abwehrmechanismen, die durch eindringende
Erreger aktiviert werden und den Körper durch Beseitigung dieser Erreger vor Infektionen
schützen. Das Immunsystem der Vertebraten verwendet sowohl angeborene als auch erworbene
Mechanismen
zur
Abwehr
von
Pathogenen.
Zellen
des
angeborenen
Immunsystems erkennen Krankheitserreger mit Hilfe von Rezeptoren für bestimmte, weit
verbreitete pathogene Merkmale und bekämpfen sie durch Mechanismen wie Phagozytose,
Lyse oder Apoptose-Induktion. So können Pathogene unmittelbar nach dem Eindringen
durch eine schnelle Reaktion abgewehrt werden. Bei unvollständiger Elimination durch die
angeborenen Mechanismen werden sie in der Folge durch die erworbene oder adaptive Immunantwort bekämpft. Die Komponenten des adaptiven Immunsystems, B- und T-Zellen,
werden erst mehrere Tage nach der Infektion aktiviert. Sie verwenden antigenspezifische
Rezeptoren, die durch somatische Rekombination und Mutation entstehen und auf den jeweiligen Erreger abgestimmt sind. Dies ermöglicht eine gezielte und effektive Abwehr von
Pathogenen sowie die Etablierung eines immunologischen Gedächtnisses zwecks schneller
spezifischer Reaktion bei einer Neuinfektion mit dem gleichen Erreger. Die Verwendung von
Rezeptoren, die durch zufällige Mechanismen entstehen, birgt jedoch die Gefahr, dass sich
das destruktive Potenzial des Immunsystems auch gegen den Organismus selbst richtet.
Daher sind Mechanismen notwendig, die eine Unterscheidung zwischen harmlosen „Selbst“Antigenen einerseits sowie „Fremd“- Antigenen bzw. Gefahrensignalen andererseits ermöglichen. Ein Teil der potenziell autoreaktiven T- und B-Zellen wird schon am Ort der Entstehung in Thymus und Knochenmark unschädlich gemacht (siehe I.5.1.). Eine Aktivierung der
verbleibenden autoreaktiven Zellen muss in der Peripherie verhindert werden. Diese Aufgabe
wird von Zellen des angeborenen Immunsystems übernommen. Nur wenn diese mit Hilfe
ihrer pathogenspezifischen Rezeptoren einen Erreger als solchen identifiziert haben, aktivieren sie eine spezifische Immunantwort. Die Komponenten des adaptiven Immunsystems sind
somit in der Regel auf eine Aktivierung durch das angeborene Immunsystem angewiesen.
Eine wichtige Rolle spielen hierbei die Antigen präsentierenden Zellen (antigen presenting
cells, APC), in erster Linie Dendritische Zellen (dendritic cells, DC).
1
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.1.2. Professionelle Antigen präsentierende Zellen
Zu den professionellen APC des Immunsystems gehören B-Zellen, Makrophagen und
DC. Die Gemeinsamkeit dieser Klasse von Zellen besteht in der konstitutiven Expression von
MHC-II (major histocompatibility complex II) -Molekülen auf ihrer Oberfläche, und somit in der
Fähigkeit, aufgenommene Antigene den CD4+ T-Zellen zu präsentieren. Daneben können sie
wie alle kernhaltigen Zellen den CD8+ T-Zellen Antigene über MHC-I präsentieren. Die verschiedenen Typen professioneller APC erfüllen jedoch im Immunsystem unterschiedliche
Aufgaben.
B-Zellen können mit Hilfe ihres membranständigen B-Zell-Rezeptors nur spezifische Antigene aufnehmen. In den sekundären lymphatischen Organen präsentieren sie diese Antigene CD4+ T-Helferzellen. Diese B-Zell-T-Zell-Interaktion ist im Fall der meisten Antigene
Voraussetzung für die Aktivierung der B-Zelle und für die Reifung zur Antikörper produzierenden Plasmazelle. Da CD4+ T-Helferzellen nur nach Stimulation durch Antigen präsentierende DC dazu in der Lage sind, B-Zellen zu aktivieren, ist die Abhängigkeit der spezifischen
Immunantwort vom angeborenen Immunsystem gewährleistet.
Bei Makrophagen steht weniger die Funktion als APC im Vordergrund, sondern ihre Fähigkeit zur Phagozytose. Sie sind darauf spezialisiert, am Ort der Entzündung Pathogene
aufzunehmen und zu töten. Werden sie durch pathogenassoziierte Merkmale (siehe I.2.),
oder durch Zytokine wie Interferon γ (IFNγ) aktiviert, so eliminieren sie aufgenommene Pathogene durch Verdau in ihren Lysosomen, sowie durch Produktion reaktiver Sauerstoff- und
Stickstoff-Moleküle (oxidative burst). Außerdem sezernieren sie proinflammatorische Mediatoren, die zur Migration und Aktivierung weiterer Immunzellen führen. Antigenpräsentation
durch Makrophagen ist weniger für die initiale Aktivierung naiver T-Zellen wichtig, als vielmehr für die Verstärkung der Aktivität von Effektor-T-Zellen am Ort der Entzündung (Male
2006).
DC hingegen fungieren im Rahmen einer Immunantwort als hauptsächliche Vermittler der
Aktivierung naiver T-Zellen (Priming). Damit stellen sie das zentrale Bindeglied zwischen
angeborener und adaptiver Immunität dar. Eine Voraussetzung für diese Funktion ist die
Lokalisation der DC im Körper. Unreife DC befinden sich hauptsächlich in der Peripherie: In
der Haut (epidermale Langerhans-Zellen sowie dermale DC), in den meisten Organen und im
Bindegewebe (interstitielle DC) sowie in den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Verdauungs- und Atemtraktes (mukosale DC) (Sato & Fujita 2007). DC sind somit ideal positioniert, um eindringende Pathogene zu entdecken und werden oft als „Wachtposten“ des
Immunsystems bezeichnet. Des Weiteren verfügen DC über vielfältige Möglichkeiten der
Aufnahme von Pathogenen. Sie sind fähig zur Phagozytose, Makropinozytose und Endozytose. Die Erkennung pathogener Strukturen führt zur Aktivierung der DC und zu einer verringerten Phagozytoseaktivität. Infolge einer Hochregulation sogenannter Homing-Rezeptoren
2
I. Einleitung
Andrea Mahr
wie CCR7 kommt es zur Migration der DC in die Lymphknoten. Zudem werden vermehrt
MHC-II-Moleküle mit gebundenen Peptiden auf der Oberfläche präsentiert, wodurch im
Zusammenhang mit ebenfalls verstärkt exponierten kostimulatorischen Molekülen wie CD80,
CD86 und CD40 eine Stimulation spezifischer T-Zellen möglich wird. Die Fähigkeit zur
Phagozytose teilen die DC mit Makrophagen, jedoch ist die Expression von MHC-II-PeptidKomplexen auf DC um ein Vielfaches höher als auf anderen APC. Während in Makrophagen
antigene Proteine in Lysosomen meist vollständig degradiert werden, besitzen DC spezialisierte Vesikel, die sogenannten MHC-II-reichen Kompartimente oder MIICs, in welchen die
Antigene nur partiell verdaut und auf MHC-II-Proteine geladen werden (Banchereau &
Steinman 1998; Delamarre et al. 2005). Schließlich sind DC in hohem Maße fähig zur
sogenannten Kreuzpräsentation (cross presentation) von Peptiden: Sie können aufgenommene Antigene nicht nur über MHC-II, sondern auch über MHC-I präsentieren. Ihre Phagosomen weisen eine geringere Aktivität proteolytischer Enzyme auf als die der Makrophagen,
und die Senkung des pH-Werts im Rahmen der Reifung der Phagosomen ist verzögert. Dies
erlaubt den Export teilweise verdauter Proteine in das Zytosol, von wo aus sie der Präsentation über MHC-I zugänglich werden. Somit können DC nicht nur mit CD4+, sondern auch mit
CD8+ T-Zellen interagieren (Savina & Amigorena 2007).
Ob DC T-Zellen aktivieren, hängt unter anderem von der Art der aufgenommenen Antigene ab. Zu den beschriebenen Reifungsprozessen mit nachfolgender Aktivierung von CD4+
und CD8+ T-Zellen kommt es, wenn DC körperfremdes oder mit Gefahrensignalen behaftetes
Material aufnehmen, etwa Pathogene oder virusbefallene Zellen. Jedoch beobachtet man
auch die Phagozytose und Präsentation körpereigenen Materials, etwa in Form apoptotischer Zellen. In diesem Fall wäre eine nachfolgende Aktivierung der adaptiven Immunantwort
schädlich, da eine Immunreaktion gegen körpereigenes Gewebe und somit eine Autoimmunerkrankung die Folge sein könnte. Viele Publikationen zeigen, dass DC in einer solchen
Situation das adaptive Immunsystem in entgegengesetzter Weise beeinflussen, und Toleranz auslösen (siehe I.5., I.6.). Somit stellen DC das Bindeglied zwischen angeborener und
adaptiver Immunität dar: einerseits als Initiatoren spezifischer Immunantworten, andererseits
als Auslöser peripherer Toleranz gegen Selbst-Antigene.
3
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.2. Pathogen-assoziierte Strukturen werden von Toll-like Rezeptoren erkannt
Während die adaptive Immunantwort gegen individuelle Antigene eines bestimmten
Erregers gerichtet ist, detektieren Zellen des angeborenen Immunsystems ein breites
Spektrum von Pathogenen. Dies geschieht durch die Erkennung Pathogen-assoziierter
molekularer Strukturen (Pathogen-associated molecular patterns oder PAMP) (Medzhitov &
Janeway 1997). Beispiele für PAMP sind Moleküle wie Lipopolysaccharid (LPS) oder
doppelsträngige RNA, die in vielen Pathogenklassen verbreitet und für das Pathogen
essenziell sind, sodass sie trotz des Selektionsdrucks des Immunsystems gegen derartige
Strukturen nicht verändert werden können. PAMP werden von sogenannten Pattern
Recognition Rezeptoren (PRR) auf der Oberfläche von Zellen des angeborenen
Immunsystems erkannt. Einige PRR vermitteln ausschließlich Phagozytose, andere führen
durch eine proinflammatorische Signaltransduktion zur Aktivierung der Zielzelle.
I.2.1. Toll-like Rezeptoren
Toll-like Rezeptoren (TLR) stellen eine wichtige Klasse von PRR dar. Nachdem der
Rezeptor Toll in der Fruchtfliege zunächst als eines der Moleküle identifiziert wurde, die für
die dorsoventrale Achsenbildung des Embryos wichtig sind (Anderson et al. 1985a;
Anderson et al. 1985b), erkannte man bald auch seine Funktion im Immunsystem der Fliege
bei der Abwehr von Pilzinfektionen (Lemaitre et al. 1996). Schließlich zeigte sich für die Tollhomologen Proteine in Vertebraten, die TLR, ebenfalls eine Rolle bei der Immunabwehr. Die
Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems über TLR führt bei Vertebraten in
einem weiteren Schritt zur Auslösung einer adaptiven Immunantwort (Medzhitov et al. 1997).
TLR kommen sowohl auf der Zelloberfläche als auch intrazellulär vor. Zu den Oberflächenrezeptoren gehören TLR1, 2, 4 und 6, die Lipide erkennen, sowie TLR5 und 11, deren
Liganden Proteine sind. Im Zellinneren findet man TLR3, 7, 8 und 9, die bakterielle oder
virale Nukleinsäuren detektieren. Einen Überblick über die TLR mit Beispielen für die jeweiligen Liganden gibt Tabelle I.1. Im Menschen wurden bislang elf, in der Maus 13 TLR
beschrieben (Kawai & Akira 2006; Kawai & Akira 2007). Im Menschen ist TLR11 jedoch nicht
funktionell (Zhang et al. 2004), in der Maus ist dies vermutlich für TLR8 der Fall (Jurk et al.
2002). Für die Signaltransduktion der TLR ist die Bildung von Homodimeren oder, vor allem
im Fall von TLR2, von Heterodimeren notwendig (Kawai & Akira 2006). Verschiedene TLR2Heterodimere erkennen verschiedene Liganden. Dadurch können z.B. diacylierte Lipopeptide
(TLR2/TLR6) von triacylierten Lipopeptiden (TLR2/TLR1) unterschieden werden (Takeuchi et
al. 2001; Takeuchi et al. 2002).
Es wurden auch endogene Liganden für TLR beschrieben. Meist sind dies Substanzen,
die aus nekrotischen oder spätapoptotischen Zellen stammen und somit bei einem normalen
Gleichgewicht zwischen Zelltod und Aufnahme apoptotischer Zellen durch Phagozyten nicht
4
I. Einleitung
Andrea Mahr
freigesetzt werden (Übersicht über endogene Liganden: Marshak-Rothstein 2006; Kono &
Rock 2008). In einigen Fällen ist bei der Interpretation dieser Daten jedoch Vorsicht geboten,
vor allem im Fall vermeintlicher TLR4-Liganden. Hier besteht die Gefahr einer Kontamination
mit dem extrem potenten TLR4-Stimulus LPS, von dem geringste Mengen für eine Aktivierung genügen. Für bestimmte Hitzeschockproteine (Hsp60 und Hsp70), die zunächst als
endogene TLR4 Liganden beschrieben wurden, wurde gezeigt, dass die gefundene Aktivität
von einer solchen Kontamination herrührte (Bausinger et al. 2002; Gao & Tsan 2003).
Dagegen bestätigen mehrere Publikationen eine Rolle von endogenem Chromatin als Ligand
für TLR9. Dies ist interessant im Zusammenhang mit der Pathogenese systemischer Autoimmunkrankheiten wie dem Systemischem Lupus Erythematosus (SLE): Da TLR9 mit endosomalen Strukturen assoziiert intrazellulär vorkommt, findet eine Bindung an körpereigenes
Chromatin nicht statt. Kommt es jedoch infolge einer unzureichenden Beseitigung apoptotischer Zellen zur Freisetzung von Chromatin-Protein-Komplexen, so können diese von spezifischen B-Zellen aufgenommen werden und intrazellulär an TLR9 binden, wodurch es zur
Autoantikörperbildung kommt. In der Folge können sich Immunkomplexe aus Immunglobulin
und Chromatin bilden, die über Fc-Rezeptoren in Phagozyten gelangen. Dies ermöglicht
wiederum die Bindung des Chromatins an TLR9, und es kommt zur Aktivierung der Zielzelle.
Körpereigene DNA könnte somit als „Auto-Adjuvans“ wirken (Boule et al. 2004; MarshakRothstein 2006; Baccala et al. 2007). Eine ähnliche Rolle bei der Pathogenese von SLE
wurde für endogene snRNAs (small nuclear RNAs) vorgeschlagen. Auch diese werden in
Anwesenheit entsprechender Antikörper aus SLE-Seren von Phagozyten aufgenommen, wo
sie über TLR7 oder TLR8 stimulatorisch wirken können (Vollmer et al. 2005).
5
I. Einleitung
Rezeptor
TLR1/TLR2
Andrea Mahr
Liganden (Beispiele)
Quelle der Liganden
triacylierte Lipopeptide
Bakterien-Zellwand
Pam3CSK4
diacylierte Lipopeptide wie
MALP-2 (macrophage
activating lipopeptide, 2kDa)
TLR2/TLR6
Pam2CSK4
Peptidoglycan
Lipoteichonsäure
TLR2/Dectin-1
Zymosan
Doppelsträngige RNA
TLR3
Poly(I:C)
Synthetisches Analog
Referenzen
Takeuchi et al. 2002
triacylierter Lipopeptide
Bakterien-Zellwand;
Mykoplasmen
Takeuchi et al. 2001
Synthetisches Analog
diacylierter Lipopeptide
Bakterien-Zellwand
Zellwand gram-positiver
Takeuchi et al. 1999
Bakterien
Zellwand von Pilzen /
Hefen
Gantner et al. 2003
Viren
Synthetisches Analog
Alexopoulou et al. 2001
doppelsträngiger RNA
Zellwand gram-negativer
TLR4
Lipopolysaccharid
TLR5
Flagellin
Bakterielle Flagellen
Hayashi et al. 2001
einzelsträngige RNA
Viren
Diebold et al. 2004;
TLR7;
TLR8
Moleküle der Imidazochinolinund Resiquimod (R-848)
TLR9
Hypomethylierte CpG-DNA
TLR10
Ligand unbekannt
Poltorak et al. 1998
Agrawal & Kandimalla
einige siRNAs
Familie wie Imiquimod (R-837)
TLR11
Bakterien
2004; Sioud 2005
Synthetische Moleküle mit
Hemmi et al. 2002;
antiviraler Aktivität
Jurk et al. 2002
Bakterien, Viren
Hemmi et al. 2000
Hasan et al. 2005
unbekannte Komponente
Uropathogene Bakterien
Zhang et al. 2004
Profilin-ähnliches Protein
Toxoplasma gondii
Yarovinsky et al. 2005
Tabelle I.1: TLR und Beispiele für ihre Liganden.
Grau unterlegt sind TLR, die intrazellulär (an endosomale Strukturen gebunden) vorliegen.
6
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.2.2. Weitere PRR-Klassen
Zu den PRR gehören neben den TLR weitere Rezeptorklassen. Wichtige Vetreter sind
C-Typ-Lektin Rezeptoren (CLR), NOD-like Rezeptoren (nucleotide binding oligomerization
domain-like receptors, NLR) und RIG-like Rezeptoren (retinoid induced gene-I-like receptors,
RLR).
CLR sind Zelloberflächenrezeptoren, die pathogenspezifische Kohlenhydrate erkennen
und für die Internalisierung von Pathogenen von Bedeutung sind. Hierzu gehören z.B. DCSIGN, der Makrophagen-Mannoserezeptor (MMR), DEC-205 (Decalektin, 205 kDa) und
Dectin-1, ein Rezeptor für β-Glucan (Cambi & Figdor 2003). Die Rezeptoren der NLR-Familie
befinden sich intrazellulär. Man unterteilt sie in NOD-Rezeptoren und NALP (NACHT-, LRRand pyrin domain containing protein)-Rezeptoren. Beispiele sind NOD1 und NOD2, die
Bestandteile des Peptidoglycan der bakteriellen Mureinschicht erkennen (Kanneganti et al.
2007). Die RLR sind Rezeptoren mit RNA-Helicase-Domäne (Creagh & O'Neill 2006). Dazu
gehören RIG-I (retinoic acid inducible gene 1) und MDA5 (melanoma differentiation
associated antigen 5), die beide virale doppelsträngige RNA erkennen (Meylan & Tschopp
2006; Meylan et al. 2006).
Eine weitere Möglichkeit der Erkennung von Pathogenen anhand charakteristischer
Strukturen auf ihrer Oberfläche stellen Rezeptoren für Komplement und die Fc-Teile von
Antikörpern dar, die durch das Immunsystem „markierte“ Erreger binden.
7
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.3. TLR-Signaltransduktion führt zur Aktivierung der DC
I.3.1. Initiation der Signaltransduktion durch Adaptormoleküle
TLR bilden zusammen mit den Rezeptoren für IL-1 und IL-18 eine Proteinfamilie, deren
Mitglieder sich durch eine intrazelluläre TIR- (Toll/IL-1 Rezeptor-) Domäne auszeichnen. Die
extrazelluläre Domäne besteht bei den TLR aus Leucin Rich Repeats (Martin & Wesche
2002). Der initiale Schritt der Signaltransduktion ist die Interaktion der TIR-Domäne mit intrazellulären Adaptormolekülen, die ebenfalls TIR-Domänen aufweisen. Bislang wurden fünf
solcher Adaptoren beschrieben. Dies sind MyD88, Mal (auch TIRAP genannt), TRIF (auch
als TICAM-1 bezeichnet), TRAM (TICAM-2) und der negative Regulator SARM (O'Neill &
Bowie 2007). Eine Übersicht gibt Tabelle I.2.
Adaptor
Bezeichnung
MyD88
Myeloid differentiation primary response gene 88
Mal / TIRAP
TRIF / TICAM1
TRAM / TICAM2
SARM
Referenzen
Medzhitov et al. 1998;
Kawai et al. 1999
MyD88 adaptor like /
Horng et al. 2001;
TIR domain containing adaptor protein
Fitzgerald et al. 2001
TIR domain containing adaptor protein inducing IFNβ /
TIR domain containing adaptor molecule 1
Yamamoto et al. 2002b;
Hoebe et al. 2003;
Oshiumi et al. 2003
TRIF related adaptor molecule /
Fitzgerald et al. 2003;
TIR domain containing adaptor molecule 2
Yamamoto et al. 2003;
Sterile α- and armadillo-motif-containing protein
Carty et al. 2006
Tabelle I.2 : Adaptormoleküle der TLR
Die verschiedenen TLR unterscheiden sich in der Verwendung der Adaptormoleküle.
TLR4 bindet alle vier bekannten aktivierenden Adaptoren: MyD88, das die gleichzeitige Bindung von Mal erfordert (Yamamoto et al. 2002a), sowie TRIF, das gemeinsam mit TRAM
rekrutiert werden muss (Fitzgerald et al. 2003). Dadurch werden bei TLR4 als einzigem TLR
sowohl ein MyD88-abhängiger als auch ein MyD88-unabhängiger (TRIF-abhängiger)
Signaltransduktionsweg aktiviert. Die meisten anderen TLR führen nur zu MyD88-abhängiger
Signaltransduktion, wobei der Ko-Adaptor Mal nicht in allen Fällen erforderlich ist. Benötigt
wird er außer bei TLR4 auch bei TLR2, der wie erwähnt Heterodimere mit TLR1 oder TLR6
bilden kann, nicht aber bei den intrazellulären TLR. TLR3 ist als einziger TLR ausschließlich
TRIF-abhängig (O'Neill & Bowie 2007). Die Funktion des Adaptors SARM besteht in der negativen Regulation des TRIF-abhängigen Signalwegs von TLR3 und TLR4 durch direkte Bindung an TRIF (Carty et al. 2006).
8
I. Einleitung
Andrea Mahr
Die Verwendung unterschiedlicher Adaptormoleküle sowie Abweichungen in der nachfolgenden Signaltransduktion der verschiedenen TLR ermöglichen eine auf das aktivierende
Pathogen abgestimmte Reaktion der Zelle. Eine weitere Feinabstimmung ermöglichen
Wechselwirkungen und Synergismen der verschiedenen Signale bei gleichzeitiger Aktivierung mehrerer TLR (Trinchieri & Sher 2007).
I.3.2. Signaltransduktion von TLR4
Die TLR-abhängige Signaltransduktion wurde in zahlreichen Publikationen zusammenfassend dargestellt (Takeda & Akira 2005; Kawai & Akira 2007; Watts et al. 2007). Aktivierung von TLR hat drei wesentliche Folgen: Zum einen die Produktion und Sekretion
proinflammatorischer Zytokine, zum anderen die Präsentation kostimulatorischer Moleküle
auf der Zelloberfläche, und bei vielen TLR auch die Sekretion von Typ I IFN. Die Signaltransduktion von TLR4 ist vereinfacht in Abbildung I.1 dargestellt.
I.3.2.1. MyD88-abhängiger Weg
MyD88-abhängig wird im Signaltransduktionsweg von TLR4 zunächst IRAK4 (InterleukinRezeptor assoziierte Kinase 4) rekrutiert. Die Bindung von IRAK4 an MyD88 erfolgt durch
eine homologe Wechselwirkung zwischen den Todesdomänen der beiden Moleküle. Daraufhin bindet IRAK1 und wird phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Dissoziation
vom Rezeptor und ermöglicht die Wechselwirkung mit einem Signalkomplex, zu dem TRAF6
(TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 6) gehört. TRAF6 fungiert als E3 Ubiquitin-Ligase, die sich
selbst, in Kooperation mit dem als E2-Ligase wirkenden Komplex aus Ubc13 und Uev1A, mit
einer K63-verknüpften Poly-Ubiquitin-Kette versieht. Diese Poly-Ubiquitinierung bewirkt eine
Bindung an TAK1 (TGFβ-aktiverte Kinase 1), zusammen mit den TAK1 bindenden Proteinen
TAB1 und TAB2 (Wang et al. 2001a; Kawai & Akira 2007). Gebundenes TAK1 wird durch
Auto-Phosphorylierung aktiviert (Kishimoto et al. 2000). TAK1 kann zum einen als MAPKKK
(Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase Kinase) fungieren, zum anderen kann es auch den
IKK (IκB-Kinase)-Komplex aktivieren (Wang et al. 2001a). Somit werden entweder auf diesem direkten Weg, oder über Phosphorylierung weiterer Mediatoren durch TAK1, sowohl der
MAP Kinase- als auch der NF-κB Signaltransduktionsweg aktiviert. Am Ende der MAP-Kinase-Kaskade steht die Phosphorylierung der MAP-Kinasen p38, JNK und Erk, die ihrerseits
Transkriptionsfaktoren wie AP-1 durch Phosphorylierung aktivieren. Zudem wirkt vor allem
p38 auch an der posttranskriptionalen Stabilisierung der mRNAs proinflammatorischer Zytokine wie TNF mit (Brook et al. 2000). Für die Aktivierung von NF-κB wird zunächst IKKβ
durch TAK1 phosphoryliert und durch TRAF6 ubiquitiniert (Yamamoto et al. 2006; Adhikari et
al. 2007). Durch die Aktivität des IKK-Komplexes werden an NF-κB gebundene inhibitorische
Moleküle (IκB) phosphoryliert, die im unstimulierten Zustand die nukleäre Translokation
und/oder die DNA-Bindung von NF-κB verhindern. Infolge der Phosphorylierung dissoziieren
9
I. Einleitung
Andrea Mahr
diese Inhibitoren ab, werden ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, sodass NF-κB-abhängige Transkription möglich wird. Zusätzlich wird die NF-κB-Aktivität durch weitere
Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Acetylierung gesteuert (Perkins
2006). Der MyD88-abhängige Weg führt somit zu einer Transkription AP-1- und NF-κBabhängiger Gene. Hierzu gehören die proinflammatorischen Zytokine TNF, IL-1, IL-6 und
viele andere.
Diese Darstellung ist aus Gründen der Übersichtlichkeit sowie aufgrund teilweise unsicherer oder kontroverser Daten vereinfacht. Beispielsweise sind in dem TRAF6 enthaltenden
Signalkomplex noch weitere Moleküle vertreten, wie z.B. ECSIT (evolutionary conserved
signalling intermediate in TLR signalling), das MEKK1 aktivieren kann, oder p62, das die
atypische Proteinkinase PKCζ bindet (Martin & Wesche 2002). Zudem werden die MAPKinasen vermutlich differenziell über verschiedene Wege reguliert. Neben TAK1 sind hierbei
weitere MAPKKKs beteiligt. So wurde gezeigt, dass eine von der MAPKKK Tpl2 abhängige
Erk-Aktivierung für die posttranskriptionale Regulation von TNF verantwortlich ist (Dumitru et
al. 2000). Die MAPKKK Ask-1 wird ebenfalls durch TRAF6 aktiviert. Dieser Prozess hängt
zusätzlich von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies ab (Matsuzawa et al. 2005).
Die Bedeutung des MyD88-abhängigen Wegs zeigt sich bei MyD88-defizienten Mäusen
(Adachi et al. 1998; Kawai et al. 1999): Diese können im Gegensatz zum Wildtyp nach LPSStimulation bestimmte Zytokine wie TNF, IL-1β und IL-6 nicht produzieren und sind weniger
anfällig gegenüber einem Endotoxin-Schock (Kawai et al. 1999). Andere Zytokine werden
jedoch auch in Abwesenheit von MyD88 sezerniert. Dabei handelt es sich um Typ I IFN
sowie IFN-abhängige Gene wie IP-10, RANTES und MCP-1 (Kawai et al. 2001; Doyle et al.
2002; Serbina et al. 2003). Außerdem kommt es wie beim Wildtyp zur Expression
kostimulatorischer Moleküle auf der Zelloberfläche (Kaisho et al. 2001). Diese MyD88unabhängigen Effekte hängen zusammen, denn Typ I IFN induzieren über einen autokrinen
Mechanismus die Sekretion IFN-abhängiger Gene und sind auch wesentlich verantwortlich
für die Oberflächenexpression von CD40, CD80 und CD86 (Montoya et al. 2002; Hoebe et
al. 2003). MyD88-defiziente Mäuse weisen zudem noch immer eine LPS-induzierte
Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB auf, die jedoch im Vergleich zum Wildtyp zeitlich
verzögert eintritt (Kaisho et al. 2001; Kawai et al. 2001). Diese Beobachtungen an MyD88defizienten Mäusen ließen auf die Existenz des MyD88-unabhängigen Signalwegs schließen.
10
I. Einleitung
Andrea Mahr
Abb.I.1. Signaltransduktion von TLR4. LPS bindet an den TLR4-Rezeptorkomplex, der auch MD2 und CD14
enthält (Jiang et al. 2005; nicht gezeigt). Es folgt eine Aktivierung zweier Signalwege, von denen einer durch die
Bindung der Adaptoren MyD88 und Mal eingeleitet wird, der andere über die Adaptoren TRIF und TRAM. Die
Signaltransduktion führt zur Aktivierung von NF-κB und weiterer Transkriptionsfaktoren und somit zur Expression
von proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen sowie Typ I IFN. Die Induktion von Typ I IFN hängt zusätzlich
von IRF3 ab, das über den TRIF-Signalweg aktiviert wird. Typ I IFN wirken autokrin durch JAK-STAT-abhängige
Signaltransduktion über den IFNα/β-Rezeptor (IFNAR) und spielen eine Rolle bei der Induktion IFN-abhängiger
Gene sowie bei der Oberflächenexpression von Aktivierungsmarkern (nicht gezeigt). Weitere Erläuterungen siehe
Text.
I.3.2.2. MyD88-unabhängiger Weg
Der MyD88-unabhängige Signalweg wird durch die Bindung des Adaptors TRIF an TLR4
eingeleitet. TRIF-abhängige Signalwege sind verantwortlich für alle im Falle einer MyD88Defizienz noch beobachteten zellulären Reaktionen, denn in MyD88/TRIF doppeltdefizienten Mäusen ist keine Reaktion auf LPS mehr nachweisbar (Yamamoto et al. 2003;
Hoebe et al. 2003). Die – zeitlich verzögerte – Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen
erfolgt durch die Bindung von RIP1 (Rezeptor-interagierendes Protein 1) an TRIF. Daraufhin
wird der TRAF6 und TAK1 enthaltende Komplex rekrutiert (Cusson-Hermance et al. 2005),
der auch im MyD88-abhängigen Weg zur Aktivierung dieser Signalwege führt. Der molekulare Mechanismus der NF-κB-Aktivierung ist noch nicht vollständig aufgeklärt und zelltypabhängig unterschiedlich. Neuere Erkenntnisse zeigen eine Rolle von TRADD (TNF-receptor 1
associated via death domain) im TRIF-abhängigen Signalweg auf, denn Bindung von
TRADD an RIP1 ist essenziell für dessen Ubiquitinierung, vermutlich durch Rekrutierung von
TRAF-Molekülen, analog zu seiner Funktion in der durch TNF-Rezeptor 1 vermittelten
11
I. Einleitung
Andrea Mahr
Signaltransduktion (Chen et al. 2008; Ermolaeva et al. 2008; Pobezinskaya et al. 2008). Es
wurde auch postuliert, dass TRIF direkt mit TRAF6 interagiert (Sato et al. 2003). Andere
Publikationen zeigen jedoch, dass zumindest in murinen Makrophagen TRAF6 für die TRIFabhängige NF-κB Aktivierung nicht notwendig ist (Gohda et al. 2004). Neben der Aktivierung
von MAP-Kinasen und NF-κB kommt es im TRIF-abhängigen Weg zusätzlich zur Aktivierung
des IFN-regulierenden Faktor 3 (IRF3), indem TRAF3 sowie die als nichtkanonische IKKs
bekannten Moleküle Tank bindende Kinase 1 (TBK1) und IKKi rekrutiert werden. Diese
phosphorylieren direkt IRF3, welches infolgedessen dimerisiert und in den Zellkern gelangt.
IRFs sind, neben anderen Transkriptionsfaktoren wie AP-1 und NF-κB, essenziell für die
Induktion von Typ I IFN und IFN-abhängigen Genen (Hacker et al. 2006; Oganesyan et al.
2006). Daraus erklärt sich die Abhängigkeit dieser Gruppe von Genen vom TRIF-Signalweg.
In TRIF-defizienten Mäusen ist eine LPS-induzierte Expression von IFN und IFN-abhängigen Genen nahezu nicht mehr möglich (Yamamoto et al. 2003). Das Gleiche gilt für die
Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle (Hoebe et al. 2003). Interessant ist, dass
als MyD88-abhängig bezeichnete Zytokine wie TNF, IL-1 und IL-6 ebenfalls nicht mehr induzierbar sind (Yamamoto et al. 2003). Dies lässt darauf schließen, dass es keine Dichotomie
zwischen MyD88- und TRIF-abhängigen Genen gibt, sondern dass MyD88 für die TRIFabhängigen Gene abkömmlich ist, der TRIF-Signalweg jedoch für beide Gruppen essenziell
ist.
I.3.3. Signaltransduktion anderer TLR
Andere TLR unterscheiden sich von TLR4 sowohl in der Verwendung der Adaptormoleküle als auch in der nachfolgenden Signaltransduktion. Ein wesentlicher Unterschied zeigt
sich z.B. in der Regulation von IFN und IFN-abhängigen Genen. Diese ist zwar im Fall einer
Stimulation mit LPS von TRIF und der Aktivierung von IRF3 abhängig, jedoch kommt es bei
TLR7, 8 und 9, die nur an MyD88 binden, ebenfalls zur Sekretion von Typ I IFN. Verantwortlich ist in diesem Fall eine MyD88-abhängige Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF7
(Uematsu & Akira 2007). Dies spielt eine Rolle bei plasmazytoiden DC, die von allen Immunzellen die höchste TLR7- und TLR9-Expression aufweisen und die hauptsächlichen Produzenten von Typ I IFN darstellen (Colonna et al. 2004).
12
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.4. Die TLR-Signaltransduktion wird auf mehreren Ebenen negativ reguliert
Um überschießende Immunreaktionen und Autoimmunität zu vermeiden, wird die TLRSignaltransduktion durch verschiedene Mechanismen negativ reguliert (Übersicht in Liew et
al. 2005; Abb. I.2.). Viele der bekannten Regulationsmechanismen werden als direkte Folge
der TLR-Stimulation im Sinne einer negativen Rückkoppelung aktiviert. Die Regulation erfolgt
auf verschiedenen Stufen, in vielen Fällen rezeptornah.
I.4.1. Regulation durch extrazelluläre oder membranständige Moleküle oder durch verminderte Expression der Signalmoleküle
Extrazellulär treten lösliche TLR auf, die die Signaltransduktion der zellmembranständigen Rezeptoren inhibieren. Ein Beispiel ist löslicher TLR4 (soluble TLR4, sTLR4), der möglicherweise mit den Korezeptoren CD14 und MD2 wechselwirkt, und so deren Bindung an
TLR4 verhindert (Iwami et al. 2000). Des Weiteren wird die Expression der TLR sowie der
Adaptoren reguliert. Die E3 Ubiquitin-Ligase TRIAD3A führt z.B. zum proteasomalen Abbau
von TLR4 und TLR9 (Chuang & Ulevitch 2004). TGFβ supprimiert die LPS-Signaltransduktion, indem es die Expression von TLR4 hemmt (McCartney-Francis et al. 2004) und den
proteasomalen Abbau von MyD88 einleitet (Naiki et al. 2005). Ebenfalls auf der Stufe des
Rezeptors oder der Adaptormoleküle greifen verschiedene Transmembranrezeptoren inhibitorisch in die Signaltransduktion ein. Dazu gehören IL-1 receptor like-1 (IL1RL1, auch ST2L)
(Brint et al. 2004) und single immunoglobulin IL-1 receptor related (SIGGIR) (Wald et al.
2003), die wie TLR zur Familie der Rezeptoren mit TIR-Domäne gehören und daher mit den
TIR-Domänen des Rezeptors oder der Adaptoren wechselwirken können. Schließlich bewirkt
auch der Transmembranrezeptor triggering receptor expressed on myeloid cells-2 (TREM-2),
dessen Ligand noch unbekannt ist, eine Hemmung der TLR-induzierten Zytokinsekretion,
wobei der genaue Angriffspunkt im TLR-Signalweg noch ungeklärt ist (Sharif & Knapp 2008).
I.4.2. Intrazelluläre Inhibitoren einzelner Signalmoleküle
Auch intrazellulär sind viele negative Regulatoren der TLR-Signaltransduktion bekannt.
Zuerst entdeckt wurde Tollip (Toll interagierendes Protein), das direkt an TLR bindet (Bulut et
al. 2001; Zhang & Ghosh 2002). Eine verkürzte Spleiß-Variante von MyD88, MyD88s, bindet
MyD88 und inhibiert die Rekrutierung von IRAK-4 (Janssens et al. 2003 ; Burns et al. 2003).
Ebenfalls auf der Stufe der IRAKs wirkt IRAK-M, das auch bei der Entstehung von EndotoxinToleranz (siehe I.4.5.) eine Rolle spielt (Kobayashi et al. 2007). Eine selektive Hemmung des
TRIF-Signalwegs erfolgt durch die Src-homology 2 domain-containing protein tyrosine
phosphatase 2 (SHP-2), die an TBK1 bindet (An et al. 2006). Die Proteinphosphatase Calcineurin, die bei der T-Zell-Rezeptor Signaltransduktion eine aktivierende Rolle spielt, hemmt
die Signaltransduktion von TLR2 und TLR4 durch Bindung an den Rezeptor oder die Adapto13
I. Einleitung
Andrea Mahr
ren MyD88 oder TRIF (Kang et al. 2007). Das Zinkfinger-Protein A20 inhibiert TLR-Signalwege durch Deubiquitinierung von TRAF6 (Boone et al. 2004). Da TRAF6 sowohl im MyD88abhängigen als auch im TRIF-abhängigen Weg eine Rolle spielt, können so beide Wege
zugleich beeinflusst werden. Auch eine Regulation in rezeptorferneren Abschnitten des Signalwegs ist denkbar. Die MAP-Kinase Signalwege werden z.B. durch verschiedene
Phosphatasen reguliert (Übersicht in Liu et al. 2007).
I.4.3. Inhibitoren mit mehreren Angriffspunkten
Einige inhibitorische Mechanismen greifen an mehreren Stellen der TLR-Signalwege
zugleich ein. Ein Beispiel ist die durch Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) induzierte
Signaltransduktion (Fukao & Koyasu 2003). Diese hemmt zum einen die LPS-induzierte
Aktivität von MAP-Kinasen wie p38 (Fukao et al. 2002), zum anderen wird die NF-κB-abhängige Transkription blockiert. Die Inhibition betrifft sowohl den MyD88-abhängigen als auch
den TRIF-abhängigen Weg. Diese Beobachtungen könnten zum Teil auf eine direkte Bindung von PI3K an TRIF zurückzuführen sein (Aksoy et al. 2005). Zudem führt PI3K über eine
Aktivierung von Proteinkinase B (PKB oder Akt) zu einer Inhibition von Glycogen Synthase
Kinase 3β (GSK3β). Dadurch wird die hemmende Wirkung von GSK3β auf den Transkriptionsfaktor CREB (cAMP Responsive Element Binding Protein) aufgehoben. Aktives CREB
kann nun mit NF-κB um den Ko-Transkriptionsfaktor CBP (CREB-bindendes Protein) kompetitieren (Martin et al. 2005).
Eine weitere Möglichkeit der umfassenden Inhibition der TLR-Signalwege ist die Aktivierung des Transkriptionsfaktors STAT3, z.B. durch IL-10 oder Vascular Endothelial Growth
Factor (VEGF). STAT3 induziert ein antiinflammatorisches Genexpressionsprogramm
(Murray 2005), das zu einem tolerogenen Phänotyp der DC führt. Dies spielt z.B. bei der
Immunevasion von Tumoren eine Rolle, da in Tumor-infiltrierenden DC häufig STAT3 aktiviert ist (Yu et al. 2007). Aktivierung STAT3-abhängiger Transkription ist möglicherweise ein
entscheidendes Kriterium für eine tolerogene Funktion von APC (Cheng et al. 2003).
Mitglieder der Familie der Suppressors of Cytokine Signalling (SOCS) spielen ebenfals
eine inhibitorische Rolle. SOCS1 hemmt die Signaltransduktion von TLR4 (Nakagawa et al.
2002; Kinjyo et al. 2002) und anderen TLR an mehreren Stellen. Zum einen inhibiert es die
STAT1-Signaltransduktion, die nach TLR-Stimulation sekundär infolge der Sekretion von
Typ I IFN ausgelöst wird (Baetz et al. 2004), zum anderen führt es zur Degradation des
Adaptors Mal und hemmt somit die Signaltransduktion von TLR2 und TLR4 (Mansell et al.
2006). Expression von SOCS2 kann zur proteasomalen Degradation von TRAF6 führen
(Machado et al. 2008). SOCS3 hemmt die Ubiquitinierung von TRAF6 (Frobose et al. 2006).
Jedoch hat es auch aktivierende Effekte, vor allem durch die Inhibition des antiinflammatorischen Transkriptionsfaktors STAT3. SOCS3 ist daher nicht rein antiinflammatorisch, sondern
scheint DC in Richtung TH2-induzierender Aktivität zu modulieren (Yoshimura et al. 2007).
14
I. Einleitung
Andrea Mahr
Schließlich gibt es Berichte, dass auch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors PPARγ
antiinflammatorisch wirkt. Hierbei wurde eine Inhibition von MAP-Kinasen wie auch von
NF-κB gezeigt (Appel et al. 2005).
Abb. I.2.: Negative Regulation der TLR-Signaltransduktion.
Negative Regulatoren der TLR-Signalwege greifen an unterschiedlichen Stellen an. Dadurch kann es sowohl zu
einer selektiven Inhibition des MyD88-abhängigen (gelb) als auch des TRIF-abhängigen (blau) Signalwegs
kommen. Ein Effekt auf beide Arme der TLR-Signaltransduktion wird beobachtet, wenn die Hemmung direkt am
Rezeptor erfolgt oder ein Signalmolekül betrifft, das sowohl MyD88- als auch TRIF-abhängig aktiviert wird (grün).
Einige inhibitorische Mechanismen haben viele Angriffspunkte und führen daher ebenso zu einer Hemmung
beider Signalwege (orange). Weitere Erläuterungen siehe Text.
I.4.4. TLR-induzierte Apoptose
TLR-Stimulation kann in verschiedenen Zelltypen zu Zelltod führen (Choi et al. 1998;
Aliprantis et al. 1999), vor allem wenn die NF-κB Aktivität inhibiert ist (Kitamura 1999). Offensichtlich können TLR-abhängig sowohl proinflammatorische und überlebensfördernde NF-κBSignalwege als auch Apoptose induziert werden, ähnlich wie es für den TNF-Rezeptor
bekannt ist (Wajant et al. 2003). Sowohl MyD88- als auch TRIF-abhängig kann Zelltod
ausgelöst werden (Übersicht in Salaun et al. 2007). MyD88 hat eine Todesdomäne, über die
IRAK4 rekrutiert wird (siehe I.3.2.). Diese Todesdomäne kann jedoch auch an das Protein
FAS-associated via death domain (FADD) binden, woraufhin Caspase-8 rekrutiert und aktiviert wird (Aliprantis et al. 1999; Aliprantis et al. 2000). Die TRIF-abhängige Apoptose wird
von einem RIP-Bindemotiv in TRIF vermittelt (Kaiser & Offermann 2005).
15
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.4.5. Endotoxin-Toleranz
Einige der genannten negativen Regulatoren spielen eine Rolle bei der sogenannten Endotoxin-Toleranz, einem Zustand der vorübergehenden Nicht-Reaktivität gegenüber weiterer
Stimulation nach vorhergehender Aktivierung durch TLR-Liganden. (West & Heagy 2002;
Fan & Cook 2004). In vivo spielt dieser Effekt eine Rolle bei der Eindämmung von Immunreaktionen und senkt z.B. die Lethalität bei Sepsis. Man unterscheidet eine frühe Phase, die
sich in Änderungen der Signaltransduktion in Immunzellen manifestiert, und eine späte
Phase, die durch gegen LPS gerichtete Antikörper vermittelt wird. In vitro kann man Endotoxin-Toleranz z.B. bei aus Sepsis-Patienten gewonnenen monozytischen Zellen beobachten,
oder bei Makrophagen, die für drei bis 24 Stunden einem schwachen Endotoxin-Stimulus
ausgesetzt waren (West & Heagy 2002). Außer LPS können auch andere TLR-Liganden
eine solche Toleranz induzieren, und dabei in manchen Fällen auch die Stimulierbarkeit
durch nicht verwandte TLR-Stimuli beeinflussen, im Sinne einer „cross tolerance“ (Sato et al.
2002; Dalpke et al. 2005). In der Forschung birgt das Phänomen der Endotoxin-Toleranz die
Gefahr von Artefakten, die z.B. durch Kontaminationen mit dem potenten TLR4-Stimulus LPS
in aufgereinigten rekombinanten Proteinen entstehen.
Die Entstehung von Endotoxin-Toleranz auf zellulärer Ebene beinhaltet mehrere Mechanismen. Zum einen gibt es Hinweise auf eine Herunterregulation von TLR (Nomura et al.
2000). Daneben spielt die Induktion oder Aktivierung intrazellulärer negativer Regulatoren
eine Rolle, die zum Teil durch die autokrine Wirkung LPS-induzierter und sezernierter löslicher Substanzen vermittelt wird. Beispiele sind die transforming growth factor β (TGFβ)-abhängige Hochregulation der Src homology 2 containing inositol 5’ phosphatase (SHIP) (Sly et
al. 2004) und die zum Teil TNF-abhängige Induktion von IRAK-M (van 't Veer et al. 2007).
Zudem führt LPS direkt sowie indirekt über die Sekretion von Typ I IFN und nachfolgende
Aktivierung von STAT1 zur Expression von SOCS1 (Kinjyo et al. 2002; Nakagawa et al.
2002), das zur negativen Rückkoppelung der Signaltransduktion beiträgt.
Die Vielzahl der beteiligten Moleküle weist auf einen komplexen Mechanismus hin, der an
mehreren unabhängigen Stellen inhibierend wirkt. Zum Teil erfolgt die Hemmung rezeptornah. So wurde gezeigt, dass die Rekrutierung von MyD88 an den Rezeptor und die IRAK1Phosphorylierung vermindert ist (Medvedev et al. 2002). Aber auch rezeptorferne Schritte
sind betroffen, etwa die Aktivierung von MAP-Kinasen, die durch Phosphatasen wie MAPKinase-Phosphatase 1 (MKP-1) reguliert wird (Nimah et al. 2005). Der Effekt betrifft sowohl
die Aktivierung der MAP-Kinasen, als auch die durch NF-κB und IRF3 vermittelte
Signaltransduktion, und erstreckt sich auf den MyD88- und auf den TRIF-abhängigen Signalweg (Sato et al. 2002). Die Transkription fast aller LPS-induzierten MyD88- und TRIFabhängigen proinflammatorischen Zytokine ist bei Endotoxin-Toleranz vermindert (Mages et
al. 2007). Einige der antiinflammatorischen LPS-induzierten Gene sind jedoch nicht inhibiert
16
I. Einleitung
Andrea Mahr
oder sogar verstärkt exprimiert, wie etwa der lösliche IL-1-Rezeptor-Antagonist (Learn et al.
2000).
I.5. DC können Immuntoleranz vermitteln
I.5.1. Mechanismen der T-Zell-Toleranz
Das Repertoire der T-Zell-Rezeptoren gewährleistet Reaktivität gegen eine große Vielfalt
von Pathogenen, da es durch somatische Rekombination der Gene für die Ketten des T-ZellRezeptors entsteht. Da es bei diesem zufälligen Ereignis auch zur Ausbildung autoreaktiver
T-Zell-Rezeptoren kommt, muss es Mechanismen geben, die die Entstehung oder die Aktivierung autoreaktiver T-Zellen verhindern. Diese werden als zentrale und periphere Toleranz
klassifiziert (Abb. I.3.).
Als zentrale Toleranz bezeichnet man die Elimination autoreaktiver T-Zellen bei ihrer
Reifung im Thymus im Rahmen der sogenannten negativen Selektion. Die Selbst-Antigene
werden hierbei von Epithelzellen der thymischen Medulla (medullar thymic epithelial cells
oder mTEC) oder von DC präsentiert. Die thymische Expression von Antigenen, die
ansonsten nur in bestimmten Organen oder Entwicklungsstadien auftreten, ist dabei zum
Großteil durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors AIRE (autoimmune regulator) bedingt
(Kyewski & Klein 2006). Bei starker Bindung an diese Antigene werden die entsprechenden
Thymozyten deletiert. Da die zentrale Toleranz jedoch nicht alle Antigene abdeckt, muss es
auch in der Peripherie die Möglichkeit geben, autoreaktive T-Zellen unschädlich zu machen.
Ein möglicher Mechanismus der peripheren Toleranz ist erstens die sogenannte Ignoranz. Dazu kommt es, wenn etwa die T-Zellen ihr Antigen unter normalen Umständen nicht
antreffen, z.B. infolge fehlender Prozessierung und Präsentation oder aufgrund der Lokalisation des Antigens. Zweitens können autoreaktive T-Zellen durch Induktion von Apoptose
deletiert werden. Dies geschieht z.B. in bestimmten „immunprivilegierten“ Körperteilen wie
der vorderen Augenkammer, dem Gehirn oder den Hoden. Zusätzlich sorgen hier Zytokine
wie TGFβ oder IL-10 zu einer Hemmung der T-Zell-Aktiverung. Drittens kann in den
autoreaktiven T-Zellen Anergie induziert werden, ein Zustand der Nicht-Reaktivität gegenüber Antigenen. Viertens können regulatorische T-Zellen die Aktivität autoreaktiver T-Zellen
hemmen (Male 2006). Die als „natürliche“ regulatorische T-Zellen (nTreg) bezeichneten
CD4+CD25+
T-Zellen,
deren
regulatorische
Eigenschaften
von
der
Aktivität
des
Transkriptionsfaktors FoxP3 abhängen, entstehen im Rahmen der zentralen Toleranz im
Thymus, sowie in der Peripherie unter dem Einfluss von TGFβ (Kretschmer et al. 2005). Im
Immunsystem des Darmes entstehen FoxP3+ Treg unter dem Einfluss CD103+ DC, wobei
ebenfalls TGFβ sowie Retinsäure eine Rolle spielen (Coombes et al. 2007). Während diese
FoxP3+ Treg andere T-Zellen zellkontaktabhängig hemmen, gibt es weitere Typen regulatorischer Zellen, die über die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine (IL-10 bzw. TGFβ) wir17
I. Einleitung
Andrea Mahr
ken, die sogenannten Tr1- sowie TH3-Zellen. Diese entstehen in der Peripherie aus naiven
CD4+ T-Zellen, z.B. unter dem Einfluss tolerogener DC in der Lunge (Akbari et al. 2001;
Jonuleit & Schmitt 2003). Daneben gibt es noch weitere, darunter CD8+ (Hoglund 2006) und
doppelt negative regulatorische T-Zellen (Thomson et al. 2006).
Abb. I.3.: Mechanismen der zentralen und peripheren Toleranz und Rolle der DC.
Zentrale Toleranz wird im Thymus induziert. Dort präsentieren mTEC und DC den sich entwickelnden T-Zellen
(TC) Selbst-Peptide auf MHC-Molekülen und führen zur negativen Selektion hochaffiner autoreaktiver
Thymozyten. Zudem kommt es im Thymus zur Entstehung von nTreg. Da einige potenziell autoreaktive T-Zellen
dennoch in die Peripherie gelangen, müssen sie dort durch Mechanismen der peripheren Toleranz unter Kontrolle
gehalten werden. Dazu zählen Ignoranz, Deletion, Anergie und Hemmung durch Treg. DC übernehmen eine
wichtige Funktion bei der Etablierung peripherer Toleranz. Unter bestimmten Bedingungen, etwa unter dem
Einfluss von IL-10, TGFβ oder von antiinflammatorischen Signalen auf der Oberfläche apoptotischer Zellen,
bilden sie einen tolerogenen Phänotyp aus und führen zu peripherer T-Zell-Toleranz. Es wurde auch beobachtet,
dass DC Antigene aus der Peripherie in den Thymus transportieren, wo sie zur zentralen Toleranz beitragen
(Bonasio et al. 2006; nicht gezeigt). Neben ihrer Funktion in der Induktion von Toleranz (links, blau) vermitteln DC
auch die Auslösung von Immunantworten (rechts, orange). Nach Antigenaufnahme in Anwesenheit von
Gefahrensignalen reifen sie und können spezifische T-Zellen aktivieren. Dies macht DC zur zentralen Instanz bei
der Entscheidung über Tolerierung oder Abwehr von Antigenen. Weitere Erläuterungen siehe Text.
18
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.5.2. Entstehung immunogener und tolerogener DC in vivo
DC spielen eine wichtige Rolle bei der Auslösung peripherer Toleranz. Ob DC immunogen oder regulatorisch bzw. tolerogen sind, hängt von ihrem Reifungsstatus ab, und dieser
wiederum von dem Milieu, dem die DC ausgesetzt waren.
Gefahrensignale wie etwa TLR-Liganden führen zu einer vollständigen Reifung der DC.
Reife DC aktivieren T-Zellen durch Präsentation des Antigens über MHC (Signal 1) bei
gleichzeitiger Expression kostimulatorischer Moleküle wie CD80, CD86 und CD40 (Signal 2)
und Sekretion von Zytokinen (Signal 3) (Lutz & Schuler 2002).
DC werden hingegen tolerogen, wenn sie Antigene aufnehmen, ohne Gefahrensignalen
ausgesetzt zu sein. Welche Art von Toleranz diese DC auslösen, hängt dabei von der Art der
Antigenaufnahme und der Umgebung ab, denn je nach gewähltem System ergaben sich
unterschiedliche Ergebnisse. Wurde das Antigen in vivo im steady state in DC eingebracht,
entweder als Fusionsprotein mit einem Antikörper gegen den DC-spezifischen Phagozytoserezeptor DEC-205 (Hawiger et al. 2001; Bonifaz et al. 2002) oder nach Integration in apoptotische Zellen (Liu et al. 2002a), kam es nach initialer Proliferation antigenspezifischer T-Zellen zu deren Deletion durch Apoptose. Andere Publikationen weisen darauf hin, dass auch
andere Formen der T-Zell-Toleranz denkbar sind. In in vitro –Experimenten konnte z.B. durch
unreife DC eine Form von regulatorischen T-Zellen (Tr1 Zellen) generiert werden (Jonuleit et
al. 2000). Auch in vivo-Experimente in Mäusen (Menges et al. 2002) und sogar in Menschen
(Dhodapkar et al. 2001 ; Dhodapkar & Steinman 2002) demonstrierten die Induktion IL-10
produzierender T-Zellen durch unreife bzw. semireife (siehe I.5.3.) DC. Der wesentliche Unterschied zwischen diesen Gruppen von Experimenten besteht darin, dass in den zuletzt
genannten Studien die DC nicht in vivo sondern außerhalb des Körpers mit Antigen beladen
wurden (Steinman et al. 2003).
In vivo ist das wahrscheinlichste Szenario einer Entstehung tolerogener DC durch Antigenaufnahme im steady state die Phagozytose apoptotischer Zellen (siehe I.6.2). Zusätzlich
kann das Mikromilieu am Ort der Antigenaufnahme die DC beeinflussen. Tumorzellen geben
beispielsweise Mediatoren wie IL-10, VEGF und TGFβ ab, die eine antiinflammatorische
Wirkung auf DC haben (Igney & Krammer 2002). Jiang et al. (2007) beschreiben einen
möglichen Mechanismus, nach dem geweberesidente DC (z.B. Langerhans Zellen der Haut)
auch im steady state die Fähigkeit zur Migration erlangen und tolerogene Eigenschaften erhalten können. Als residente Zellen wechselwirken DC über das Adhäsionsmolekül
E-Cadherin mit den umliegenden Zellen, z.B. Keratinozyten, sowie mit anderen DC. Die
Cluster-Bildung unreifer DC in vitro beruht ebenfalls auf solchen Wechselwirkungen. Zerstörung dieser Wechselwirkung führt zur Oberflächenexpression des Chemokinrezeptors CCR7,
der für die Migration zum Lymphknoten erforderlich ist. Dies geht einher mit einer nur geringen Präsentation kostimulatorischer Moleküle und fehlender Sekretion proinflammatorischer
19
I. Einleitung
Zytokine.
Zumindest
Andrea Mahr
teilweise
beruhen
diese
Effekte
auf
β-Catenin-abhängiger
Signaltransduktion. Injektion dieser DC in Mäuse induzierte die Bildung IL-10-produzierender
regulatorischer T-Zellen und konnte die Ausbildung von Experimenteller Autoimmuner
Encephalomyelitis (EAE) verhindern (Jiang et al. 2007).
I.5.3. Charakteristika tolerogener DC
Man nahm zunächst an, dass tolerogene DC einen unreifen Phänotyp haben (Jonuleit et
al. 2000) und Antigene über MHC (Signal 1) in Abwesenheit kostimulatorischer Moleküle
oder proinflammatorischer Zytokine (Signal 2 und 3) präsentieren. Diese Hypothese ist jedoch nach neueren Erkenntnissen nicht ganz zutreffend, da ein gewisser Grad von Reifung
sowohl für die Migration der DC als auch für eine ausreichende Antigen-Präsentation erforderlich ist.
Lutz & Schuler (2002) sprechen von semireifen DC als den eigentlichen tolerogenen DC
und definieren diese als DC, die zwar Antigene und eine – im Vergleich zu reifen DC
geringere – Menge kostimulatorischer Moleküle präsentieren, jedoch gewisse proinflammatorische Zytokine (Signal 3), vor allem TH1-Antworten auslösende Zytokine (Morelli & Thomson
2007), nicht sezernieren. Dieses Konzept entspricht der Beobachtung, dass migrierende DC,
die apoptotische Zellen oder andere Antigene im steady state aufgenommen haben, tatsächlich einen gewissen Grad an Reifung aufweisen (Akbari et al. 2001; Blankenstein & Schuler
2002). Auch DC, die in vitro mit TNF behandelt wurden, haben einen semireifen Phänotyp
und antiinflammatorische Eigenschaften (Menges et al. 2002). Eine weitere Studie zeigt,
dass DC nach Aufnahme apoptotischer Zellen einen gewissen Grad an Reifung aufweisen
und zur Toleranz von CD8+ T-Zellen (cross tolerance) gegenüber Antigenen aus den
verwendeten apoptotischen Zellen führen (Albert et al. 2001). Die von Jiang et al. (2007) in
Abwesenheit von Gefahrensignalen erzeugten DC, die sich funktionell als tolerogen erwiesen
(siehe I.5.2.) entsprechen ebenfalls einem semireifen Phänotyp.
Vermutlich gibt es mehrere Entstehungswege und somit auch verschiedene Typen tolerogener DC. Deren charakteristische Merkmale sind jedoch unzureichend bekannt. Allgemein
kann man postulieren, dass eine tolerogene DC zur Ausübung ihrer Funktion die Fähigkeit
zur Migration aufweisen und gegenüber proinflammatorischen Stimuli wie TLR-Liganden eine
verminderte Reaktivität besitzen sollte (Morelli & Thomson 2007). Andere denkbare Eigenschaften, die aber nicht zwingend in allen Fällen gegeben sein müssen, sind die Oberflächenexpression negativ kostimulatorischer Moleküle wie PDL-1 (programmed cell death
ligand 1) (Guleria et al. 2007; Probst et al. 2005), sowie inhibitorischer Rezeptoren wie immunoglobulin-like transcript 4 (ILT-4). Letztere werden z.B. durch suppressorische T-Zellen
in DC induziert (Chang et al. 2002). Außerdem wurde für regulatorische DC die Sekretion
antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 (z.B. Akbari et al. 2001) sowie die Expression von
20
I. Einleitung
Andrea Mahr
Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) beschrieben. Dieses Tryptophan depletierende Enzym
erzeugt Abbauprodukte, die T-Zell-Apoptose fördern (Mellor & Munn 2004).
I.5.4. Erzeugung tolerogener DC in vitro
Die Charakterisierung tolerogener DC und die Wege ihrer Entstehung sind von großem
klinischem Interesse, da sie als therapeutisches Mittel zur Induktion von Toleranz gegenüber
Transplantaten oder Allergenen oder zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten in Frage
kommen.
Es gibt viele Möglichkeiten der in vitro-Generation tolerogener DC, was vermutlich eine
ähnliche Vielfalt in vivo widerspiegelt. Ein Beispiel ist die Behandlung unreifer DC mit IL-10
oder TGFβ (Morelli & Thomson 2007). IL-10 wirkt hauptsächlich durch Aktivierung von
STAT3 und die dadurch induzierte Genexpression (El Kasmi et al. 2006). Mit IL-10 behandelte DC können zu Anergie von T-Zellen führen (Jonuleit et al. 2001; Steinbrink et al. 1997).
Weitere Substanzen, die tolerogene Effekte auf DC haben, sind Prostaglandin E2, das die
cAMP-Synthese aktiviert, 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3, das Antioxidans N-Acetyl-Cystein,
und Cobalt-Protoporphyrin, welches Hämoxygenase induziert. Auch bereits als Immunsuppressiva oder Antiphlogistika zugelassene Medikamente, z.B. Corticosteroide oder Aspirin, haben neben ihren Effekten auf T-Zellen auch tolerogene Wirkung auf DC. DC, die ex
vivo mit Donor-Antigen gepulst und mit Rapamycin behandelt wurden, können zur Entstehung von Treg führen und Transplantatabstoßung verhindern (Turnquist et al. 2007). Behandlung von DC mit HLA-G, dem Liganden für den inhibitorischen Rezeptor ILT-4 führt
ebenfalls zu einem tolerogenen Phänotyp (Ristich et al. 2005).
21
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.6. Apoptotische Zellen beeinflussen professionelle Phagozyten
I.6.1. Einfluss apoptotischer Zellen auf die Phagozytose
Im Rahmen der normalen Gewebehomöostase sterben im Menschen durchschnittlich
etwa 100 000 Zellen pro Sekunde einen apoptotischen Zelltod (Vaux & Korsmeyer 1999).
Diese werden rasch von professionellen Phagozyten aufgenommen (Parnaik et al. 2000),
darunter auch von DC (Albert et al. 1998). In der Maus ist vor allem der CD8+ DC-Subtyp auf
die Aufnahme apoptotischer Zellen spezialisiert (Iyoda et al. 2002).
Ist die Phagozytose apoptotischer Zellen gestört, kann es zu einer sekundären
(spätapoptotischen) Nekrose kommen. Dabei geht die Membranintegrität verloren, sodass
Moleküle aus dem Zellinneren frei werden, die ähnlich wie PAMPs proinflammatorisch
wirken. Neben den pathogenassoziierten Strukturen gibt es also auch endogene Moleküle,
die „Gefahrensignale“ darstellen (Matzinger 1994; Matzinger 2002). Diese auch als
„Alarmine“ bezeichneten Substanzen werden gemeinsam mit den PAMP als DAMP (damage
associated molecular patterns) zusammengefasst (Bianchi 2007).
Beispiele für solche „endogene Adjuvanzien“ sind Harnsäure (Shi et al. 2003), ATP
(Hanley et al. 2004) und das DNA-bindende Protein high mobility group box 1 (HMGB1)
(Scaffidi et al. 2002). In der Diskussion sind auch Hitzeschockproteine, die Polypeptide binden und eine Immunantwort gegen diese auslösen könnten (Binder et al. 2000; Binder et al.
2007). Während einige Publikationen, vor allem über endogene TLR4-Liganden, kritisch zu
sehen sind (siehe I.2.2.), ist die Existenz endogener proinflammatorischer Substanzen an
sich ein generell akzeptiertes Paradigma. Als strukturelle Voraussetzung für die immunstimulatorische Funktion wurde ein Auftreten hydrophober Bereiche an der Moleküloberfläche
vorgeschlagen (Seong & Matzinger 2004).
Die Existenz solcher Substanzen macht die schnelle Aufnahme apoptotischer Zellen unabdingbar für die Vermeidung von Autoimmunität. (Übersicht über PRR-Liganden aus apoptotischen Zellen: Kono & Rock 2008).
I.6.1.1. „Find me“-Signale zur Rekrutierung der Phagozyten
Um eine schnelle Entsorgung zu gewährleisten, sezernieren apoptotische Zellen sogenannte „Find me“-Signale, die professionelle Phagozyten anlocken. Ein Beispiel ist
Lysophosphatidylcholin, das im Rahmen des apoptotischen Prozesses infolge einer
Caspase-abhängigen Aktivierung der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) aus
Phosphatidylcholin entsteht (Lauber et al. 2003).
22
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.6.1.2. „Eat me“-Signale zur Induktion der Phagozytose
Zur weiteren Beschleunigung ihrer Aufnahme präsentieren apoptotische Zellen auf ihrer
Oberfläche „Eat me“-Signale, die an Rezeptoren auf der phagozytischen Zelle binden (Übersicht in Lauber et al. 2004). Das bekannteste „Eat me“-Signal ist Phosphatidylserin, das sehr
früh im Verlauf der Apoptose von der Innenseite der Plasmamembran nach außen verlagert
wird (Tanaka & Schroit 1983; Fadok et al. 1992). Einige Publikationen berichten, dass
Phosphatidylserin auf apoptotischen Zellen für die effektive Vermittlung der Phagozytose
oxidiert sein muss (Kagan et al. 2002; Borisenko et al. 2004). Phagozyten besitzen Rezeptoren, die Phosphatidylserin entweder direkt oder über Brückenmoleküle erkennen. Von dem
zunächst als Phosphatidylserin-Rezeptor vorgeschlagenen Molekül (Fadok et al. 2000)
zeigte sich später, dass es keine direkte Rolle bei der Phagozytose spielt (Bose et al. 2004)
und dass es intranukleär lokalisiert ist (Mitchell et al. 2006; Cui et al. 2004; Cikala et al.
2004). Kürzlich wurden weitere Moleküle als Phosphatidylserin-Rezeptoren identifiziert.
TIM-4 und TIM-1 aus der Familie der T-Zell Immunglobulin- und Mucin-Domänenenthaltenden Proteine (Miyanishi et al. 2007; Kobayashi et al. 2007) erkennen
Phosphatidylserin über ihre Immunglobulin-Domäne. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor
BAI 1 (brain specific angiogenesis inhibitor 1) bindet über seine extrazelluläre Thrombospondin-ähnliche Domäne an Phosphatidylserin (Park et al. 2007). Eine weitere Publikation beschreibt Stabilin-2 als Phosphatidylserin-Rezeptor (Park et al. 2008). Die Erkennung von
Phosphatidylserin ist also redundant, und zu den direkten Phosphatidylserin-Rezeptoren
kommen weitere, die Phosphatidylserin über Brückenmoleküle erkennen. Eine Übersicht
über diese und weitere „Eat-me“ Signale gibt Tabelle I.3. Auch Annexin 1 findet man an
Phosphatidylserin gebunden auf der Oberfläche frühapoptotischer Zellen (Arur et al. 2003;
Weyd 2005). Eine Rolle als „Eat-me“-Signal konnte in unserem Labor jedoch nicht bestätigt
werden (Weyd 2005).
Neben dem Auftreten von „Eat-me“-Signalen kommt es auch zu einem Verlust von
„Don’t-eat-me“-Signalen wie CD31 oder CD47 und damit zu einer verminderten Abstoßung
der Phagozyten (Brown et al. 2002 ; Gardai et al. 2005). Infolge der vielfältigen
Mechanismen für das Auffinden und die Aufnahme apoptotischer Zellen geschieht die
Beseitigung
durch
professionelle
Phagozyten
sehr
schnell.
Die
Aufnahme
durch
nichtprofessionelle Phagozyten wie etwa Epithelzellen erfolgt mit einer um mehrere Stunden
verzögerten Kinetik. Offensichtlich spielen hier andere Signale eine Rolle, die erst später
auftreten, und die nichtprofessionelle Phagozytose hat allenfalls eine Bedeutung als
unterstützendes System, wenn der schnellere Mechanismus versagt (Parnaik et al. 2000).
23
I. Einleitung
Ligand auf der
apoptotischen Zelle
Andrea Mahr
Brückenmolekül
Rezeptor auf der
phagozytischen Zelle
Referenzen
Miyanishi et al. 2007 ;
-
TIM-4, TIM-1
-
BAI1
Park et al. 2007
-
Stabilin-2
Park et al. 2008
Kobayashi et al. 2007
Savill et al. 1990 ;
MFG-E8
Vitronectin-Rezeptor
Hanayama et al. 2002 ;
(αvβ3-Integrin)
Borisenko et al. 2004 ;
Rubartelli et al. 1997
Phosphatidylserin
Mer-Tyrosinkinase
Protein S
Mer (TAM-Familie)
β2-GPI
β2-GPI-Rezeptor
Calreticulin
CD91 (LRP)
Gardai et al. 2005
Annexin 1
?
Arur et al. 2003
Scavenger Rezeptoren
Platt et al. 1996 ;
OxLDL-ähnliche
Bereiche der
-
Plasmamembran
ThrombospondinBindestellen
Thrombospondin-1
C3b/bi-Bindestellen
C3b/bi
Kollektin-Bindestellen
Kollektine
(veränderte
C1q
Zuckerstrukturen)
SP-A, SP-D
Verändertes ICAM3
Ishimoto et al. 2000 ;
Gas6
-
Scott et al. 2001
Anderson et al. 2003
Balasubramanian et al.
1997
SR-A
Platt et al. 1999 ;
LOX-1
Oka et al. 1998 ;
CD68
Erdosova et al. 2002;
CD36
Ren et al. 1995
Komplex aus CD36 und
dem Vitronectin Rezeptor
Savill et al. 1992
CR3 (αMβ2-Integrin);
Takizawa et al. 1996 ;
CR4 (αxβ2-Integrin)
Mevorach et al. 1998
Komplex aus Calreticulin
Ogden et al. 2001 ;
und CD91 (LRP)
Vandivier et al. 2002
CD14
Devitt et al. 1998 ;
Moffatt et al. 1999
Tabelle I.3: Brückenmoleküle („Synapse“) zwischen apoptotischen und phagozytischen Zellen.
MFG-E8 = milk fat globule-EGF-factor 8; Gas6 = Growth arrest specific gene 6; β2-GPI = β2-Glycoprotein I; LRP
= low density lipoprotein (LDL) receptor related protein, auch α2-Makroglobulin-Rezeptor; oxLDL = oxidized Low
Density Lipoprotein; SR-A = Scavenger Receptor, Class A; LOX-1 = Lectin-like oxidized LDL receptor 1; CR3 ,
CR4 = complement receptor 3, 4; SP-A, SP-D = Surfactant Protein A, D; ICAM3 = intercellular adhesion
molecule 3.
24
I. Einleitung
Andrea Mahr
Defekte in der Phagozytose apoptotischer Zellen wurden mit der Pathogenese chronischer entzündlicher Erkrankungen und systemischer Autoimmunkrankheiten in Verbindung
gebracht. Bei Mäusen mit einer genetischen Defizienz verschiedener „Eat-me“ Signale, etwa
der Brückenmoleküle C1q oder MFG-E8 oder des Mer-Tyrosinkinase Rezeptors, ist die Aufnahme apoptotischer Zellen deutlich gestört, und zugleich findet man Symptome einer
Autoimmunkrankheit, die dem Systemischen Lupus erythematodes (SLE) ähneln (Botto
1998; Hanayama et al. 2004; Cohen et al. 2002). Im Falle von Mer kann dies auch mit einem
Verlust negativ regulatorischer Signaltransduktion zusammenhängen (Sen et al. 2007; siehe
I.6.3.). Beim Menschen sind Komplementdefekte ebenfalls mit dem Auftreten von SLE assoziiert (Taylor et al. 2000). Vermutlich führt in diesen Fällen die fehlende Beseitigung der Autoantigene zur Bildung von Autoantikörpern und folglich zum Auftreten der Krankheit (Rosen &
Casciola-Rosen 1999, Rodenburg et al. 2000).
I.6.2. Anti-inflammatorische Beeinflussung der Phagozyten durch apoptotische Zellen
Vieles spricht dafür, dass apoptotische Zellen nicht nur aktiv ihre eigene Beseitigung beschleunigen, sondern auch den Reifungszustand der phagozytierenden Zellen beeinflussen.
Die Aufnahme sterbender Zellen ist also wahrscheinlich kein „Null-Ereignis“, wie zunächst
(z.B. Stern et al. 1996) angenommen wurde. Nach der Aufnahme apoptotischer Zellen
migrieren DC zu den Lymphknoten (Huang et al. 2000) und präsentieren das aufgenommene
Material den T-Zellen (Albert et al. 1998). Dies führt vermutlich zu T-Zell-Toleranz, da die
Antigenaufnahme in Abwesenheit von Gefahrensignalen bzw. unter dem Einfluss antiinflammatorischer Signale der apoptotischen Zellen stattgefunden hat. Tatsächlich findet man in
Milz und Lymphknoten einen großen Anteil an DC mit einer niedrigen Expression kostimulatorischer Marker (Wilson et al. 2003), die diesen tolerogenen DC aus der Peripherie entsprechen könnten. Der inhibierende Einfluss apoptotischer Zellen auf DC wird durch eine Vielzahl
von Daten belegt.
I.6.2.1. Einfluss apoptotischer Zellen auf die Zytokinsekretion von Makrophagen und
DC
Die Aufnahme apoptotischer Zellen durch professionelle Phagozyten beeinflusst deren
Fähigkeit zur TLR-induzierten Zytokinsekretion in antiinflammatorischer Weise. Voll et al.
(1997) zeigten dies mit humanen Monozyten bzw. mononukleären Blutzellen (peripheral
blood mononuclear cells, PBMCs). Nach Vorinkubation mit apoptotischen Zellen sezernierten diese nach einem LPS-Stimulus weniger TNF, IL-1 und IL-12, jedoch mehr IL-10. Dieser
Effekt wurde zumindest teilweise durch die Bindung der apoptotischen Zellen an CD36 vermittelt. Viele der nachfolgenden Studien verwendeten Makrophagen, um den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Zytokinsekretion zu zeigen. Die Studien weichen teilweise in den
Ergebnissen für einzelne Zytokine ab, jedoch zeigt sich insgesamt ein negativ regulatorischer
25
I. Einleitung
Andrea Mahr
Einfluss apoptotischer Zellen auf proinflammatorische Mediatoren bei gleichzeitig unveränderter oder erhöhter Sekretion antiinflammatorischer Zytokine. Fadok et al. (1998) zeigten für
humane Makrophagen einen negativen Effekt apoptotischer Zellen auf die Sekretion von
TNF, IL-1β, IL-8, IL-10 und weitere, während die Produktion von TGFβ, Platelet Activating
Factor (PAF) und Prostaglandin E2 gefördert wurde. Die zuletzt genannten Mediatoren
führten dabei in auto- oder parakriner Weise zur Inhibition der proinflammatorischen Zytokine. McDonald et al. (1999) zeigten ähnliche Daten für die murine Makrophagen-Zelllinie
J774. Eine Studie von Huynh et al. (2002) demonstrierte einen antiinflammatorischen
Einfluss apoptotischer Zellen auf Makrophagen in vivo. In entzündete Bauchhöhlen oder
Lungen injizierte apoptotische Zellen wurden durch Makrophagen aufgenommen, die
dadurch zur Sekretion von TGFβ angeregt wurden. In der Folge kam es zu einem
schnelleren Abklingen der Entzündung im Vergleich zu nicht mit apoptotischen Zellen
behandelten Tieren und zu einer geringeren Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie
TNF. In diesem Modell war Phosphatidylserin auf der Oberfläche apoptotischer Zellen
essenziell für den Effekt.
Auf die Zytokinsekretion von DC haben apoptotische Zellen einen ähnlichen Einfluss. Für
humane, mit GM-CSF aus Monozyten differenzierte DC wurde z.B. gezeigt, dass apoptotische Zellen die LPS-induzierte Sekretion von IL-12 hemmten, während die IL-10-Produktion
gesteigert wurde (Urban et al. 2001). Die TNF-Sekretion war in diesem Fall unbeeinflusst.
Ähnliche Daten ergaben sich mit murinen DC – auch hier wurde IL-12 negativ, IL-10 hingegen positiv beeinflusst (Stuart et al. 2002). Im Gegensatz zu den Studien in Makrophagen
spielte in keinem der beschriebenen Fälle ein auto- oder parakriner Effekt antiinflammatorischer Zytokine (TGFβ oder IL-10) eine Rolle.
Manche Studien beschreiben eine Produktion antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10
(Gao et al. 1998) und TGFβ (Chen et al. 2001) durch die apoptotischen Zellen selbst. Ob
diese löslichen Mediatoren für die tolerogene Beeinflussung von Phagozyten ausreichen, ist
jedoch fraglich, denn mehrere Studien zeigen, dass der suppressive Effekt Zellkontakt zwischen apoptotischer und aufnehmender Zelle erfordert (Cvetanovic & Ucker 2004; Johann et
al. 2006).
I.6.2.2.
Einfluss apoptotischer Zellen auf DC-Reifung und Fähigkeit zur T-Zell-
Stimulation
Die erwähnten Studien mit humanen bzw. murinen DC, die einen tolerogenen Effekt
apoptotischer Zellen auf die Zytokinproduktion zeigten, beschreiben übereinstimmend auch
eine Inhibition der durch LPS-Stimulation ausgelösten Reifung. Die Hochregulation der Aktivierungsmarker CD86 (Urban et al. 2001; Stuart et al. 2002) und CD83 wurde ebenso wie die
Oberflächenexpression von MHC-II (Urban et al. 2001) durch apoptotische Zellen vermindert.
T-Zellen, die mit derart behandelten DC inkubiert wurden, zeigten eine geringere Proliferation
26
I. Einleitung
Andrea Mahr
(Urban et al. 2001; Stuart et al. 2002) und eine verminderte Sekretion von IFNγ und IL-4
(Urban et al. 2001). Ähnliches beschreibt eine neuere Studie (Williams et al. 2008), die eine
durch apoptotische Zellen induzierte, IFNγ-vermittelte Aktivierung des Enzyms IDO in den
DC als Ursache für die verminderte T-Zell Stimulation beschreibt.
Die Aufnahme apoptotischer Zellen macht DC aber vermutlich nicht völlig unfähig zur
Ausbildung eines immunogenen Phänotyps. Eine solche Annahme würde bedeuten, dass
jede Infektion mit intrazellulären Erregern, die mit Apoptose der Wirtszelle verbunden ist,
Toleranz gegen den Erreger auslösen würde. Im Falle einer Infektion in vivo ist die Stimulation vermutlich sehr stark, sodass eine vollständige Reifung der Phagozyten möglich ist.
Somit ergibt sich das Modell, dass in Abwesenheit einer Infektion die Aufnahme apoptotischer Zellen durch DC zu peripherer Toleranz gegen Selbst-Antigene führt. Im Rahmen einer
Infektion, wenn hohe Konzentrationen pathogener Stimuli auftreten, können jedoch alle DC,
auch nach eventueller vorheriger Aufnahme apoptotischer Zellen, vollständig reifen und eine
Immunantwort auslösen.
Die verminderte Aktivierbarkeit durch kleine Konzentrationen an proinflammatorischen
Stimuli ist nur eines von mehreren Charakteristika tolerogener DC (siehe I.5.3.). In letzter
Instanz ist von Interesse, welche Veränderungen durch die Aufnahme apoptotischer Zellen in
DC induziert werden, die letztendlich die tolerogene Funktion verursachen. Möglicherweise
weisen die entstehenden DC den in I.5.3. beschriebenen semireifen Phänotyp auf. In vitroStudien zeigten entweder keine oder eine nur schwach ausgeprägte Hochregulation kostimulatorischer Moleküle auf DC durch die Aufnahme apoptotischer Zellen (Stuart et al. 2002;
Williams et al. 2008). In einem System aus primären humanen DC und mit iC3b opsonisierten apoptotischen Zellen wurde eine Herunterregulation kostimulatorischer Moleküle auf den
phagozytierenden Zellen beobachtet, die einherging mit einer vermehrten Oberflächenexpression des Chemokinrezeptors CCR7, der eine Migration zu den Lymphknoten ermöglicht
(Verbovetski et al. 2002).
27
I. Einleitung
I.7.
Andrea Mahr
Annexin 1 ist ein antiinflammatorisches Protein auf der Oberfläche
apoptotischer Zellen
I.7.1. Die Annexin-Familie
I.7.1.1. Vorkommen der Annexine
Die Annexine bilden eine evolutionär konservierte Proteinfamilie. Sie kommen in Tieren,
Pflanzen, Pilzen und Protisten vor, nicht aber in den bisher untersuchten Hefen und Bakterien. Die zwölf Annexine der Wirbeltiere werden als Annexin A1-A11 sowie Annexin A13 bezeichnet, vereinfachend kann jedoch der wirbeltierspezifische Buchstabe A weggelassen
werden. Annexine sind ubiquitär exprimiert, jedoch gibt es gewebespezifische Unterschiede
(„Annexin-Fingerabdruck“) (Gerke & Moss 2002).
Während einige Annexine (vor allem Annexin 2 und 11) fast ubiquitär exprimiert sind,
treten andere (vor allem Annexin 3, 9, 10 und 13) vermutlich eher gewebespezifisch auf.
Dies lässt sich aus der Häufigkeit der mit den jeweiligen Annexinen übereinstimmenden
Expressed Sequence Tags aus verschiedenen Datenbanken ableiten (Morgan & Fernandez
1998; Morgan et al. 1999).
I.7.1.2. Struktur der Annexine
Annexine sind dadurch charakterisiert, dass sie in Anwesenheit von Kalzium reversibel
über negativ geladene Phospholipide (wie Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und
Phosphatidsäure) an Membranen binden können. Daher stammt ihr Name (engl. to annex =
anheften, binden). Die Membranbindung findet über den evolutionär konservierten C-terminalen Teil (Kerndomäne) der Annexine statt, der aus vier (im Fall von Annexin 6 jedoch acht)
sogenannten Annexin-Repeats von je etwa 70 Aminosäuren besteht (Gerke & Moss 2002).
Der N-Terminus liegt auf der membranabgewandten Seite der Annexine. Die N-Termini der
verschiedenen Annexine unterscheiden sich in Länge (vier Aminosäuren bei Annexin 4 bis
mehr als 100 Aminosäuren bei Annexin 7 und 11) und Primärsequenz sowie posttranslationalen Modifizierungen (Abb. I.4.), und sind daher vermutlich für die Vermittlung der
unterschiedlichen Funktionen der verschiedenen Annexine verantwortlich. Zudem enthalten
sie bisweilen Motive für Phosphorylierungen, Bindung an verschiedene Liganden und
proteolytische Spaltung (Übersicht bei Raynal et al. 1993).
28
I. Einleitung
Annexin
1
2
Andrea Mahr
Struktur /
Expression
Zahl der Aminosäuren
IS: Granulozyten, T-Zellen, Makrophagen, Hassall-Körperchen
VS: Epithel des Verdauungstrakts von Zunge bis Ösophagus
NS: Neuronen, Ependymzellen, Mikroglia, Hypophyse
S: vor allem oberflächliche Schichten des Epithels von Respira346 tions- und Urogenitaltrakt, Prostata, Plazenta (Syncytiotrophoblast), Haut
IS: Hassall-Körperchen, Retikulumzellen im Lymphgewebe
VS: Epithelzellen von Drüsengängen und Myoepithelzellen von
der Zunge bis zum Magen
339 NS: Ependymzellen
S: respiratorisches Epithel (alle Schichten), Pankreas, Plazenta
3
323
IS: Granulozyten, Monozyten
S: Plazenta, Prostata
4
IS: Hassall-Körperchen
VS: Epithel, vor allem im unteren Bereich (Magen bis Dickdarm)
NS: Neuronen, Oligodendrozyten, Ependymzellen
319 S: Plazenta
5
IS: Milz
S: Chondrozyten, Lunge, Leber, Niere; Haut, Herz, Uterus, Pla320 zenta, Skelettmuskel
6
IS : reife T- und B-Lymphozyten
VS : Inselzellen des Pankreas ; sekretorische Epithelien
673 S: Leydig-Zellen, Plazenta
7
IS: Milz (mRNA)
NS: Gehirn (mRNA)
S: Muskel, Lunge, Erythrozyten; Leber (mRNA), Niere (mRNA),
488 Fibroblasten (mRNA), Plazenta (mRNA)
8
S: Lunge, Haut, Leber, Niere (schwache Expression)
327
9
345
10
324
11
S: Keratinozyten; eventuell in geschichteten Plattenepithelien,
nicht jedoch in anderen Epithelien
S: Hepatozyten, vermindert exprimiert in hepatozellulärem Karzinom (mRNA)
IS: Granulozyten, T- und B-Zellen (spezifische Herunterregulation
in aktivierten CD8+ T-Zellen);
VS: Dick- und Dünndarm, Pankreas
S: Herzmuskel, Lunge, Leber, Niere, Hoden, Prostata, Plazenta,
505 Ovar .
13
VS: Dünn- und Dickdarm (spezifisch)
316
29
I. Einleitung
Andrea Mahr
Tabelle I.4.: Struktur der humanen Annexine und Expressionsmuster.
Die schematische Darstellung der Struktur der Annexine zeigt die Annexin-Repeats in blau, die N-Termini in rot.
Mit Ausnahme von Annexin 13, das myristoyliert ist (Myr) sind die N-Termini acetyliert (Ac). Auch weitere
Modifikationen, vor allem Phosphorylierungen, finden hauptsächlich in den N-Termini statt (nicht gezeigt).
Während die Membranbindung über die C-terminale Domäne erfolgt, wird die Bindung an Liganden im
Allgemeinen durch den N-Terminus vermittelt. Dementsprechend beruhen strukturelle und funktionelle
Unterschiede zwischen den Annexinen hauptsächlich auf den N-Termini, die sich in ihrer Länge und
Zusammensetzung stark unterscheiden.
Die Expressionsdaten beruhen auf Studien zur Lokalisation der Proteine (bzw. mRNAs, wo angegeben) in
primären humanen Geweben. Expression in Zelllinien wurde aufgrund der häufig beobachteten veränderten
Expression der Annexine bei maligner Entartung (Mussunoor & Murray 2008) nicht berücksichtigt. Beschrieben ist
die Expression im Immunsystem (IS), Verdauungssystem (VS), Nervensystem (NS) und sonstigen Geweben (S).
Nicht für alle Annexine liegen vergleichende Studien für die Expression in verschiedenen Geweben vor, daher ist
die Liste zwangsläufig unvollständig. Im Fall von Annexin 1, 2 und 4 (Dreier et al. 1998), Annexin 6 (Clark et al.
1991), Annexin 5 und 8 (Kirsch et al. 2000; Reutelingsperger et al. 1994) sowie Annexin 11 (Hofmann et al. 2008)
liegen Analysen vor, die die Expression in vielen Geweben vergleichend gegenüberstellen. Für Annexin 7 ist die
Expression für einige Gewebe auf Proteinebene belegt, eine vergleichende Studie zeigt daneben eine
umfassendere Analyse auf mRNA-Ebene (Salzer et al. 2002; Magendzo et al. 1991). Für andere Annexine, deren
Expression vermutlich auf wenige Gewebe beschränkt ist, beruhen die Angaben auf Publikationen, die keine
umfassende Expressionsanalyse beinhalten. Dazu gehören das in Darmzellen exprimierte Annexin 13 (Wice &
Gordon 1992), das als Autoantigen in Pemphigus vulgaris identifizierte und auf Keratinozyten exprimierte Annexin
9 (auch Annexin 31 genannt; Morgan & Fernandez 1998; Nguyen et al. 2000), Annexin 3 (Le Cabec et al. 1992 ;
Kollermann et al. 2008) und Annexin 10 (Liu et al. 2002b).
I.7.1.3. Funktionen der Annexine
Für Annexine wurden intra- und extrazelluläre Funktionen beschrieben. Diese sind sehr
vielfältig und vermutlich können einige davon redundant von mehreren Annexinen übernommen werden.
Als membranbindende Proteine sind Annexine intrazellulär an der Organisation von
Membranstrukturen beteiligt. Einige Annexine (1, 2, 4, 6 und 7) können zudem an zwei
Membranen gleichzeitig binden, einige (Annexin 1, 2 und 5) verknüpfen die Membran mit
Zytoskelettbestandteilen wie F-Actin. Dies ermöglicht Funktionen bei Endo- und Exozytose
sowie beim Vesikeltransport (Mayran et al. 2003 ; Creutz 1992 ; Gerke et al. 2005).
Extrazelluläre Funktionen wurden vor allem für Annexin 1, 2 und 5 beschrieben. Während
Annexin 1 eine Funktion im Immunsystem zugeschrieben wird (siehe I.7.2.4.), fungiert
Annexin 2 auf Zelloberflächen als Ko-Rezeptor für Plasminogen und Plasminogen-Aktivator
und ist daher an der Fibrinolyse beteiligt (Kim & Hajjar 2002; Ling et al. 2004). Annexin 5
wirkt antithrombotisch durch die Verhinderung der Bindung von Koagulationsfaktoren an
Phospholipide. Dies spielt vor allem in der Plazenta eine Rolle. Beim Anti-Phospholipidsyndrom, das durch erhöhtes Thromboserisiko und vermehrte Schwangerschaftsverluste
30
I. Einleitung
Andrea Mahr
gekennzeichnet ist, spielen Antikörper gegen Phospholipide und Phospholipid-bindende
Proteine wie β2-GPI und Annexin 5 eine Rolle (Rand 2000).
I.7.2. Annexin 1
I.7.2.1. Struktur von Annexin 1
Annexin 1 (346 Aminosäuren, ca. 37 kDa) besteht wie alle Annexine aus einer C-terminalen membranbindenden Kerndomäne und einem N-Terminus (Abb. I.5.). Im Fall von
Annexin 1 ist dieser 40 Aminosäuren lang und enthält Motive für die Phosphorylierung durch
Proteinkinase C und für Wachstumsfaktor-Rezeptorkinasen wie EGF (epidermal growth
factor)-Rezeptor und HGF (hepatic growth factor )-Rezeptor (Oudinet et al. 1993; Haigler et
al. 1987; Skouteris & Schroder 1996). Zudem ist die erste Aminosäure, ein Alanin, acetyliert.
Die Konformation von Annexin 1 ändert sich in Abhängigkeit von der Kalzium-Konzentration:
In Abwesenheit von Kalzium ist der N-Terminus in die Kerndomäne integriert, bei höheren
Konzentrationen nimmt er dagegen eine exponierte Position ein (Rosengarth & Luecke
2003). Möglicherweise entspricht diese Konformationsänderung einem Übergang vom
inaktiven in den aktiven Zustand des Proteins. Zudem enthält der N-Terminus mehrere
Schnittstellen für Proteasen. Im Verlauf der Apoptose kann er z.B. unter Verbleib eines 33
kDa Restfragments abgespalten werden (Debret et al. 2003; Riess 2006). Ein N-terminales
Peptid ähnlicher Größe wird auch durch die Spaltung durch Humane Leukozyten-Elastase
(HLE) freigesetzt. Diese spaltet Annexin 1, nachdem es während der Anheftung von
Neutrophilen an das Endothel externalisiert wurde (Rescher et al. 2006). Auch für Proteinase
3 auf der Oberfläche aktivierter Neutrophiler wurde eine Funktion bei der Spaltung von
Annexin 1 beschrieben (Vong et al. 2007). Während der Translokation zwischen
verschiedenen Vesikeln in Neutrophilen werden die ersten acht Aminosäuren des NTerminus entfernt, vermutlich von einer membranständigen Metalloprotease der Vesikel und
der Plasmamembran (Movitz et al. 1999; Movitz & Dahlgren 2000), bei Sekretion aus der
Prostata (siehe I.7.2.3) die ersten 29 Aminosäuren (Christmas et al. 1991).
Die meisten Autoren nehmen an, dass die Funktion von Annexin 1 durch den N-Terminus
vermittelt wird. In einer großen Zahl von Publikationen haben N-terminale Peptide, zumeist
das 25 Aminosäuren lange sogenannte „Ac2-26“ (bisweilen „Ac1-25“) Peptid gleiche oder
ähnliche Effekte wie das Gesamtprotein, allerdings erst in höheren Konzentrationen (im
zweistelligen µM-Bereich) (Walther et al. 2000). Die oben beschriebene Spaltung von
Annexin 1 könnte daher alternativ als Inaktivierung des Proteins oder als Freisetzung des
aktiven Teils interpretiert werden. Allerdings sollte man die mit Peptiden durchgeführten
Experimente kritisch betrachten, bis die Identität des aktiven Teils von Annexin 1 abschließend geklärt ist.
31
I. Einleitung
Andrea Mahr
Als aktiver Teil von Annexin 1 wird außerdem ein Nonapeptid aus der Kerndomäne, das
sogenannte Antiflammin-2, diskutiert (Zouki et al. 2000). Inzwischen wurde auch schon
postuliert, dass Antiflammin-2 kooperativ mit dem N-Terminus an den Formylpeptidrezeptor
(FPR) bindet (Kamal et al. 2006), der als Rezeptor für Annexin 1 beschrieben wurde (siehe
I.7.2.5).
Abb. I.4.: Struktur von Annexin 1.
Annexin 1 enthält C-terminal vier Annexin-Repeats, die in der Annexin-Familie stark konserviert sind. Die Bindung
an negativ geladene Phospholipide erfolgt in Abhängigkeit von Kalzium und wird über drei Typ II- (gelb) und drei
Typ III- (orange) Kalziumbindungsstellen vermittelt. Innerhalb des dritten Repeats befindet sich die AntiflamminSequenz (grün), die zum Teil für die antiinflammatorischen Eigenschaften verantwortlich gemacht wird. Die NTermini der Annexine unterscheiden sich stark voneinander und werden im Allgemeinen als funktionsvermittelnd
angesehen. Der N-Terminus von Annexin 1 ist acetyliert und kann durch verschiedene Kinasen an Serin,
Threonin oder Tyrosin phosphoryliert werden (P). Außerdem kann eine Isopeptidbindung zwischen einem Glutamin des N-Terminus und einem Lysin (Transglutaminierung, tG) ausgebildet werden. Auf diese Weise kann
Annexin 1 kovalent verknüpfte Dimere bilden (Ando et al. 1991). Zudem wurde eine Bindung des N-Terminus an
Liganden wie S100A11 (Mailliard et al. 1996) und den FPR (Perretti et al. 2001) beschrieben. Verschiedene
Proteasen können N-terminale Fragmente abspalten. Weitere Erläuterungen siehe Text.
I.7.2.2. Expression von Annexin 1
Die Expression von Annexin 1 ist gewebe- und entwicklungsspezifisch reguliert. Eine
starke Expression beobachtet man in vielen Leukozyten, vor allem in neutrophilen Granulozyten und Monozyten (Morand et al. 1995). In Neutrophilen macht Annexin 1 einen Anteil von
etwa zwei Prozent des Gesamtproteingehaltes aus (Francis et al. 1992). Außerdem wird es
in Makrophagen, DC, NK- und T-Zellen exprimiert, nicht oder kaum jedoch in B-Zellen. In
Zellen des Nervensystems wurde Annexin 1 ebenfalls nachgewiesen (Dreier et al. 1998). In
manchen Geweben ist die Regulation entwicklungsspezifisch: In der Leber wurde Annexin 1
z.B. nur während der frühen Embryonalentwicklung und der Regeneration nachgewiesen
(Masaki et al. 1994).
32
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.7.2.3. Externalisierung von Annexin 1
Der Mechanismus der Annexin-Externalisierung ist generell noch unbekannt. Da
Annexine keine sekretorischen Signalsequenzen aufweisen und ihre Sekretion nicht mit Inhibitoren des klassischen Sekretionswegs blockiert werden kann (Comera & Russo-Marie
1995), wird ein alternativer Mechanismus, möglicherweise unter Beteiligung eines ABCTransporters, angenommen (Danielsen et al. 2003 ; Chapman et al. 2003). Annexin 1 wird in
verschiedenen Situationen externalisiert: Von verschiedenen Zelltypen wie Leukozyten oder
Astrozyten wird es nach Behandlung mit Glukokortikoiden induziert und sezerniert (Comera
& Russo-Marie 1995; Perretti & Flower 1996; Mizuno et al. 1997). Bei der Anheftung von
neutrophilen Granulozyten an das Gefäßendothel wird Annexin 1 ebenfalls nach außen
transportiert und hemmt die Extravasation der Neutrophilen (Perretti et al. 1996). Außerdem
gelangt es in frühen Stadien der Apoptose auf die Zelloberfläche (Arur et al. 2003; Weyd
2005). Annexin 1 wird auch von der Prostatadrüse abgegeben und kommt in hohen
Konzentrationen in der Samenflüssigkeit vor (Christmas et al. 1991).
I.7.2.4. Bekannte Funktionen von Annexin 1
Neben den für Annexine typischen intrazellulären Funktionen wie Membranaggregation,
Endo- und Exozytose, sowie einer proliferationshemmenden Funktion im EGF-Rezeptor-Signalweg (Croxtall et al. 1993) wurden für Annexin 1 vor allem immunologische Funktionen
beschrieben (Übersicht in Perretti & Gavins 2003; Parente & Solito 2004; Lim & Pervaiz
2007). Schon lange ist bekannt, dass Annexin 1 zumindest teilweise die Wirkung von Glukokortikoiden vermittelt. Dies geschieht durch die Inhibition der Phospholipase A2 (PLA2)
(Wallner et al. 1986). Die Spezifität dieses Effekts wurde zwar angezweifelt, da die Hemmung auch von einer Bindung des Phospholipid-Substrats anstelle des Enzyms kommen
könnte (Bastian et al. 1993), mittlerweile wurde jedoch gezeigt, dass zelluläre PLA2 (cPLA2)
im Gegensatz zu löslicher PLA2 (sPLA2) spezifisch durch Annexin 1 gehemmt wird (Kim et
al. 1994). Auch beobachtet man gesteigerte PLA2-Aktivität, wenn Annexin 1 durch siRNA
herunterreguliert ist (Solito et al. 1998). Ein weiterer gut charakterisierter Effekt von
Annexin 1 ist die Hemmung der Extravasation von Neutrophilen und Monozyten durch das
Gefäßendothel (Getting et al. 1997; Lim et al. 1998). Möglicherweise desensitiviert Annexin 1
in diesem Fall chemotaktische Rezeptoren (siehe I.7.2.5). Dazu beitragen könnte auch ein
weiterer durch Annexin 1 vermittelter Effekt, die Induktion der Spaltung (Shedding) des
Adhäsionsmoleküls L-Selektin, das für den Prozess der Extravasation wichtig ist und durch
die Spaltung inaktiviert wird (Strausbaugh & Rosen 2001; de Coupade et al. 2003).
Weiterhin gibt es Publikationen, die einen Einfluss von Annexin 1 auf die Produktion pround antiinflammatorischer Mediatoren durch phagozytische Zellen zeigen. Es wurde
beobachtet, dass Annexin 1 in LPS-stimulierten Makrophagen die IL-10 Produktion steigert,
33
I. Einleitung
Andrea Mahr
dagegen aber die Synthese der mRNAs von IL-12 sowie der induzierbaren NO-Synthase
(iNOS) hemmt (Ferlazzo et al. 2003).
Die Bedeutung der antiinflammatorischen Effekte von Annexin 1 zeigt sich in Annexin 1defizienten Mäusen (Hannon et al. 2003). Diese zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber
inflammatorischen Stimuli, die mit einer verstärkten Auswanderung von Leukozyten zum Ort
der Entzündung verbunden ist. Die Anwendung von Glukokortikoiden zur Therapie der induzierten Entzündungen hat einen im Vergleich zum Wildtyp stark verminderten Effekt.
I.7.2.5. Die Annexin 1-Rezeptoren
Der Rezeptor, über den extrazelluläres Annexin 1 seine Effekte vermittelt, ist nach
Walther et al. (2000) und Perretti et al. (2001) identisch mit dem Rezeptor für formylierte Peptide, dem FPR. Auch die verwandten Proteine FPRL1 und FPRL2 (FPR-like 1 und 2) wurden
als Annexin 1-Rezeptoren beschrieben (Ernst et al. 2004). Für diese Rezeptoren, insbesondere für FPRL1, wurde ein weites Spektrum strukturell nicht verwandter Liganden beschrieben, die in mehreren Fällen nur schwach binden (Übersicht in Le et al. 2002). Mehrere
Befunde belegen die Rolle der FPR-Familie als Annexin 1-Rezeptoren. So ist z.B. in FPRdefizienten Mäusen oder in Anwesenheit spezifischer FPR-Inhibitoren der Annexin 1-Effekt
auf die Migration von Neutrophilen stark vermindert, und Transfektion von HEK293-Zellen mit
dem FPR verleiht diesen die Fähigkeit, Annexin 1 zu binden. Die Bindung der Rezeptoren
der FPR-Familie an Annexin 1 ist mit einer Dissoziationskonstante um 1 µM (Walther et al.
2000) etwa 10 000 mal schwächer als ihre Bindung an formylierte Peptide. Die Verwendung
der gleichen Rezeptoren für das antiinflammatorische Molekül Annexin 1 wie für Chemotaxis
und Zellaktivierung auslösende formylierte Peptide aus Bakterien oder Mitochondrien
erscheint erklärungsbedürftig. Eine mögliche Erklärung ist die Desensitivierung des Rezeptors durch Annexin 1: Der FPR ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, dessen Aktivierung
letztlich zu einem Kalziumsignal und zur Aktivierung von MAP-Kinasen führt. Walther et al.
(2000) beobachteten, dass geringe Konzentrationen an Annexin 1-Peptiden (um 20 µM) zur
Inhibition einer nachfolgend durch fMLP ausgelösten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies
durch Neutrophile führen. Hohe Konzentrationen der gleichen Peptide jedoch (um 200 µM)
lösen selbst ein oxidatives Signal aus. Dies führen die Autoren darauf zurück, dass bei
schwacher Stimulation nur das Kalziumsignal ausgelöst wird, es aber nicht zur vollen Aktivierung von MAP-Kinasen kommt. Die abgeschwächte Aktivität des Signalwegs führt jedoch zu
Desensitivierung des FPR selbst sowie anderer chemotaktischer Rezeptoren. Dieses Phänomen der homologen und heterologen Desensitivierung ist für G-Protein gekoppelte
Rezeptoren gut beschrieben worden und beinhaltet Phosphorylierung und Internalisierung
von Rezeptoren (Ali et al. 1999). Inwiefern eine Aktivierung des FPR andere Signalwege wie
die von TLR beeinflussen kann, ist unbekannt.
34
I. Einleitung
Andrea Mahr
I.8. Zielsetzung
Die Reaktion des Immunsystems gegenüber einem bestimmten Antigen wird in erster
Linie durch DC festgelegt. Während gegenüber Pathogenen eine adaptive Immunantwort
ausgelöst wird, werden harmlose Fremdantigene und Komponenten des eigenen Körpers
toleriert. Die Entscheidung über eine immunogene oder tolerogene Reaktion hängt von
Signalen ab, die die DC bei der Antigenaufnahme erhalten. Pathogene enthalten Strukturen,
die über proinflammatorische Rezeptoren wie TLR zu einer Reifung der DC führen. Die Aufnahme von Selbst-Antigenen in Form apoptotischer Zellen beeinflusst die DC hingegen in
antiinflammatorischer Weise. Welche Moleküle der apoptotischen Zellen diesen Effekt ausüben und durch welche Signalwege er vermittelt wird, ist noch unvollständig untersucht.
Annexin 1 ist ein Protein, das in frühen Stadien der Apoptose auf die Zelloberfläche gelangt
(Arur et al. 2003; Weyd 2005) und die durch TLR Stimulation induzierte Aktivierung der DC
hemmt (Weyd 2005; Dörner 2007).
In dieser Arbeit sollten die Effekte von Annexin 1 auf die TLR-vermittelte Signaltransduktion untersucht werden. Mit Hilfe eines in vitro Systems mit primären DC oder DC-ähnlichen
Zelllinien sollten die Effekte apoptotischer Zellen und des aufgereinigten Proteins Annexin 1
auf die Transkription und Sekretion verschiedener TLR-induzierter Zytokine charakterisiert
werden. Eine Genexpressionsanalyse in Annexin 1-behandelten und –unbehandelten TLRstimulierten DC sollte weiteren Aufschluss über die Effekte auf mRNA-Ebene geben. Der
Einfluss von Annexin 1 auf die intrazelluläre Signaltransduktion sollte anhand der Aktivierung
von Signaltransduktionsmolekülen wie MAP-Kinasen und NF-κB charakterisiert werden. Die
Interferenz des Annexin 1-Effekts mit dem MyD88- und/oder TRIF-abhängigen Signalweg
sollte durch separate Analyse MyD88- und TRIF-abhängiger Zytokine sowie durch die Verwendung von DC aus MyD88-defizienten Mäusen beurteilt werden. Durch den Einsatz verschiedenartiger proinflammatorischer Stimuli, deren Signaltransduktion mit den TLR4Signalwegen mehr oder weniger verwandt ist, sollte beurteilt werden, ob der Effekt von
Annexin 1 sich nur auf bestimmte TLR erstreckt, oder ob eine umfassendere Inhibition
proinflammatorischer Signalwege vorliegt. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob
Annexin 1 seine Effekte über die Induktion einer Proteinsynthese vermittelt. Zur Abgrenzung
der Annexin 1-abhängigen Wirkungen von durch kontaminierendem LPS ausgelösten tolerogenen Effekten sollten Schlüsselexperimente mit der LPS-neutralisierenden Substanz
Polymyxin B durchgeführt werden. Die Charakterisierung des Effekts von Annexin 1 auf die
proinflammatorische Signaltransduktion in DC gibt einen Einblick in einen möglichen Mechanismus der durch apoptotische Zellen ausgelösten peripheren Toleranz.
35
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II. Material und Methoden
II.1.
Material
II.1.1. Häufig verwendet Puffer
Puffer
Zusammensetzung
Lysepuffer
500 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10 mM Imidazol, 5 mM Tris (pH 7),
(prokaryotisch)
0,5 mg/ml Lysozym, 1 % (w/v) Complete Proteaseinhibitoren
Hac
0,5 M Essigsäure, pH 3,4
NH4Ac
5 mM Ammoniumacetat, pH 5
Spaltungspuffer
50 mM Tris-HCl (pH 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT
150 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM PMSF,
Lysepuffer (eukaryotisch)
10 % (w/v) Glycerol, 1 % (w/v) Triton X-100,
1 Tablette Complete Proteaseinhibitoren / 500 ml Puffer
Sammelgel (SDS-PAGE)
Trenngel (SDS-PAGE)
24 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5 % (w/v) Acrylamid, 0,1 % (w/v) SDS,
0,1 % (w/v) APS, 0,1 % (w/v) TEMED
37,5 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10-12 % (w/v) Acrylamid,
0,1 % (w/v) SDS, 0,03 % (w/v) APS, 0,1 % (w/v) TEMED
Probenpuffer reduzierend (5x) 50 % (v/v) Glycerol, 10 % (w/v) SDS, 50 mM Tris (pH 6,8),
(SDS-PAGE)
25 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0,25 mg/ml Bromphenolblau
Laufpuffer (SDS-PAGE)
25 mM Tris-Base, 0,19 M Glycin, 1 % (w/v) SDS
Coomassie-Lösung
0,26 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 40 % Methanol, 10 % Eisessig
Entfärber (Coomassie)
30 % Ethanol, 10 % Essigsäure
Transferpuffer (Western Blot)
25 mM Tris, 0,19 M Glycin, 20 % (v/v) Methanol, 0,037 % (w/v) SDS
TBS (Tris-buffered saline)
50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6
TBST
TBS, 0,05 % (w/v) Tween-20
Coating-Puffer 1 (ELISA)
100 mM Natriumcarbonat, pH 9,6
Coating-Puffer 2 (ELISA)
200 mM Natriumphosphat, pH 6,5
ELISA-Puffer
PBS, 10 % (v/v) FCS
Citratpuffer (ELISA)
0,03 M Zitronensäure, 0,07 M Natriumcitrat, pH 5,0
OPD-Substratlösung (ELISA)
0,5 mg/ml o-Phenylendiamin, 0,1 % (v/v) H2O2
Annexin-Bindungspuffer
10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4
PBS
137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4,
pH 7,4
PBST
PBS, 0,05 % (w/v) Tween-20
MACS-Puffer
PBS, 0,5 % (w/v) HSA, 2 mM EDTA
FACS-Puffer
Annexin-Bindungspuffer, 10 % (v/v) FCS
36
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.1.2. Biologisches Material
Mausstämme
Stamm
Charakterisierung
C57BL/6
Inzuchtstamm; im hauseigenen Tierstall gezüchtet
C57BL/MyD88-KO
Mausstamm mit fehlender Expression von MyD88 (Adachi et al. 1998)
Eukaryotische Zelllinien
Zelllinie
Herkunft
Referenz
Jurkat
Humanes T-Zell-Lymphom
Schneider et al. 1977
U-937
Humanes Histiozytom
Sundstrom & Nilsson 1976
Murine Monozyten / Makrophagen, aus
Raw264.7
Abelson-Leukämie-Virus induziertem Tumor
Raschke et al. 1978
Plasmide
Plasmid
Verwendung
Referenz / Firma
pET-41a(+)
Bakterielle Proteinexpression
Novagen, Madison, USA
pTATA-Luc, 4 x NF-κB
pGL4.74[hRluc/TK]
Firefly-Luziferase-Reporterplasmid zur Messung
der NF-κB-Aktivität in eukaryotischen Zellen
Plasmid zur konstitutiven Expression von RenillaLuziferase in eukaryotischen Zellen
Li-Weber et al. 2000
Promega, Mannheim
Plasmid zur Expression von Green Fluorescent
Protein (GFP) in eukaryotischen Zellen, zur Clontech, Heidelberg
pGFP-N1
Bestimmung der Transfektionseffizienz
II.1.3. Oligodesoxyribonukleotide
Oligodesoxyribonukleotide wurden bei der Firma MWG bestellt.
Primer für die quantitative PCR wurden mit ultrareinem Wasser auf eine Konzentration
von 100 µM eingestellt und vor der Verwendung auf 5 µM (1:20) verdünnt. Die Sequenzen
wurden
mit
Hilfe
des
Programms
Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/
primer3_www.cgi) anhand folgender Kriterien ausgewählt: Länge zwischen 18 und 25
Nukleotiden, Schmelztemperatur 55-70°C, GC-Gehalt 40-60 %. Um eine Verfälschung der
RT-PCR-Ergebnisse durch eventuelle DNA-Kontaminationen zu vermeiden, wurden nur
intronüberspannende Primer verwendet, sodass genomische DNA aufgrund der größeren
Länge der Sequenz nicht amplifiziert wurde, oder ein derartiges Produkt anhand seiner höheren Schmelztemperatur identifiziert werden konnte. Hierfür wurde die Fluoreszenz der PCRProdukte während eines Temperaturgradienten (55°C-95°C) im Anschluss an die quantitative
SYBR-Green-PCR gemessen.
37
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
Oligo-dT-Primer wurden mit RNAse-freiem Wasser auf 50 µM eingestellt und für die Reverse Transkription verwendet.
Primer
Sequenz (5’ – 3’)
CD3_fw
ATG GAG TTC GCC AGT CGA GA
CD3_rev
CAT TGG GCA ACA GAG TCT GCT
GAPDH_fw
GGT GAA GGT CGG AGT CAA CGG A
GAPDH_rev
GAG GGA TCT CGC TCC TGG AAG A
IL-1B_fw
TCA AGT GTC TGA AGC AGC CAT
IL-1B_rev
AGA TTC GTA GCT GGA TGC CG
IL-10_fw
TAC AGC AGA GGA ACC TCC AGT C
IL-10_rev
ATG CAG GTA CAG CGT ACA GTT C
IL-8_fw
AGA CAG CAG AGC ACA CAA GC
IL-8_rev
ACT CCT TGG CAA AAC TGC AC
Oligo-dT
TTT TTT TTT TTT TTT TTT
TNF_fw
CAT CTT CTC GAA CCC CGA GTG A
TNF_rev
CCT CTG ATG GCA CCA CCA G
II.1.4. Antikörper
Antikörper
Isotyp
Firma
Erk1
Maus IgG1
BD Transduction Laboratories; Heidelberg
IκBα
Kaninchen, polyklonal
Santa Cruz, Heidelberg
Phospho-Akt (Thr 308)
Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
Phospho-Akt (Ser 473)
Maus IgG2b
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
Phospho-ATF2
Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
Phospho-Erk
Kaninchen, polyklonal
Promega, Mannheim
Phospho-GSK3β
Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
Phospho-IκBα
Kaninchen IgG
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
Phospho-JNK
Kaninchen, polyklonal
Promega, Mannheim
Phospho-p38
Kaninchen, polyklonal
Promega, Mannheim
Phospho-STAT3 (Tyr 705)
Kaninchen IgG
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
SOCS1
Maus IgG1κ
Zymed, München
SOCS3
Maus IgG2b
Serotec, Düsseldorf
Tubulin
Maus IgG1
Sigma, München
Als Sekundärantikörper für den Western Blot dienten an HRP (engl. horse radish
peroxidase = Meerrettich-Peroxidase) gekoppelte polyklonale anti-Maus- bzw. anti-Kaninchen-IgG Antikörper aus der Ziege (Santa Cruz, Heidelberg). Biotinylierter monoklonaler
38
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
Anti-Annexin 1-Antikörper (DAC5) wurde von Heiko Weyd zur Verfügung gestellt (Weyd
2005).
II.1.5. Reagenzien
Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen Serva (Heidelberg),
Fluka (Neu-Ulm), Sigma (München), Roth (Karlsruhe) und Merck (Darmstadt) bezogen.
Produkt
Hersteller
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)
Pierce, Rockford, IL, USA oder Sigma, München
Absolutely RNA® Microprep Kit
Stratagene, La Jolla, CA, USA
Ammoniumperoxodisulfat
Sigma, München
Ampicillin
Sigma, München
Annexin 5-FITC
Immunotools, Friesoythe
BCA (bicin choninic acid) –Kit
Pierce, Rockford, IL, USA
Benzonase
Merck, Darmstadt
Biocoll-Lösung
Biochrom, Berlin
Bovines Serumalbumin (BSA)
Sigma, München
CL4B-Sepharose
Sigma, München
Complete Proteaseinhibitor
Roche, Mannheim
Cycloheximid
Sigma, München
Desoxyribonukleotid- (dNTP-) Mix
Sigma, München
Dual Luciferase Reporter Assay System
Promega, Mannheim
Enhanced Chemoluminescence- (ECL)-Lösungen
Amersham, Little Chalfont, Großbritannien
ELISA matched antibodies für humanes IL-8
Immunotools, Friesoythe
EndoFree Plasmid Maxi Kit
Macherey-Nagel, Düren
Fötales Kälberserum (FCS)
Gibco BRL, Karlsruhe
Glutamax
Gibco BRL, Karlsruhe
GM-CSF, human (Leukine®)
Schering, Berlin
GM-CSF, murin
Immunotools, Friesoythe
GSH-Sepharose-Kügelchen
Amersham, Little Chalfont, Großbritannien
Humanes Serumalbumin (HSA)
Baxter, Unterschleißheim
IgG-Sepharose
Amersham, Little Chalfont, Großbritannien
IFNγ, human
Immunotools, Friesoythe
IL-1, human
Peprotech, Hamburg
IL-4, human
Immunotools, Friesoythe
IL-8, human
Immunotools, Friesoythe
Isopropylthiogalactosid (IPTG)
Roth, Karlsruhe
Kanamycin
Sigma, München
Limulus Amöbozyten-Lysat- (LAL-) Endotoxin Kit
Cambrex, Walkersville, USA
39
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
LAL-Wasser
Cambrex, Walkersville, USA
LB-Medium
Invitrogen, Carlsbad, USA
LPS (aus E. coli 026:B6)
Sigma, München
LPS (ultrarein)
Invivogen, Toulouse, Frankreich
MACS-LS-Säulen
Miltenyi, Gladbach
Magnesiumchlorid
Applied Biosystems, Darmstadt
Magnetische Kügelchen, gekoppelt an Anti-CD14
Miltenyi, Gladbach
β-Mercaptoethanol
Neolab, Heidelberg
Natrium-Desoxycholat
Keller, Mannheim
N-t-Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe
(Inhibitor des FPR)
MP Biomedicals, Eschwege
OptiEIA Zytokin-ELISA Kits
BD Pharmingen, Heidelberg
p38 MAP Kinase Assay Kit
Cell Signaling, Danvers, MA, USA
Pam2CSK4
Invivogen, Toulouse, Frankreich
Pam3CSK4
Invivogen, Toulouse, Frankreich
10 x PCR Buffer II
Applied Biosystems, Darmstadt
Penicillin / Streptomycin
Gibco BRL, Karlsruhe
Phorbolmyristoylacetat (PMA)
Sigma, München
Phosphatidylserin
Sigma, München
PolyFect
Quiagen, Hilden
Polymorphprep
Axis Shield, Oslo, Norwegen
Polymyxin B
Sigma, München
Poly(I:C)
Sigma, München oder Invivogen, Toulouse,
Frankreich
PreScission Protease
Amersham, Little Chalfont, Großbritannien
Reverse Transkriptase
Applied Biosystems, Darmstadt
RNA 6000 Nano Chip Kit
Agilent Technologies, Waldbronn
RNAse-Inhibitor
Applied Biosystems, Darmstadt
RNAse ZAP
Ambion, Austin, TX, USA
RPMI-Medium (pulverisiert)
Gibco BRL, Karlsruhe
Streptavidin-Agarose
Invitrogen, Karlsruhe
Streptavidin-HRP
Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA
Streptavidin- PE
BD Pharmingen, Heidelberg
SYBR Green PCR Core Reagents
Applied Biosystems, Darmstadt
Tetramethylendiamin (TEMED)
Sigma, München
TNF, human
Calbiochem, La Jolla, CA, USA
Triton X-114
Sigma, München
Trypsin / EDTA
Gibco BRL, Karlsruhe
40
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.1.6. Geräte und Material
Es wurden ausschließlich gammabestrahlte Zellkulturmaterialien (Kulturschalen, Kulturflaschen, Pipetten und Zentrifugenröhrchen etc.) der Firmen Renner (Dannstadt), Falcon
(Becton Dickinson, San Jose, USA), Greiner (Frickenhausen) und Nunc (Wiesbaden) verwendet. 6-Loch-Platten für die Differenzierung humaner DC wurden von Corning/Fisher (San
Francisco, CA, USA) bezogen. Für ELISAs wurden 96-Loch-Platten mit halber Fläche der
Firma Corning B.V. (Schiphol-Rijk, Niederlande) verwendet.
Gerät / Material
96-Loch-Platten und Deckel für quantitative PCR,
MicroAmp
Hersteller
Applied Biosystems, Darmstadt
Agilent 2100 Bioanalyzer
Agilent Technologies, Waldbronn
Chip Priming Station
Agilent Technologies, Waldbronn
Dialyseschläuche
Spectrapor, Roth, Karlsruhe
ELISA-Reader
Victor, Wallac, Turku, Finnland
Endotoxin-Säulen
Detoxi-Gel, Pierce, Rockford, USA
Entwicklungsmaschine
Classic E.O.S., Agfa, Köln
Filme zur Detektion von Chemilumineszenz
(Hyperfilm ECL)
Amersham, Little Chalfont, Großbritannien
Filterpapier (Chromatographiepapier)
Whatman, Dassel
Gefrierschrank –20°C
Liebherr, Ochsenhausen
Gefrierschrank –80°C
Forma Scientific (Thermo), Dreieich
Geltrockner
Modell 583, Biorad, München
Hüllen für Chemilumineszenz-Filme
Rego, Augsburg
Inkubator für die Zellkultur
Steri-Cult, Forma Scientific (Thermo), Dreieich
Kühlzentrifuge
Megafuge 3.0 RS, Heraeus (Thermo), Dreieich
Luminometer Lumat LB9507
Berthold Technologies
Mikroskop
Axiovert 25, Zeiss, Jena
Nitrocellulose-Membran (Hybond)
Amersham, Little Chalfont, Großbritannien
Schüttler für Bakterienkulturen
HAT Infors, Infors AG, Bottmingen, Schweiz
SDS-PAGE & Westernblot-Apparatur
Mini Protean II, BioRad, München
Sezierbesteck
Fine Science Tools, Heidelberg
Sterile Werkbank
SteriGRAD Hood, Baker, Sanford, USA
Tischzentrifuge
Biofuge Fresco, Heraeus (Thermo), Dreieich
Ultrazentrifuge Sorvall Evolution RC
Thermo Electron, Waltham, USA
UV-Strahler Stratalinker 2400
Stratagene, La Jolla, USA
Zellseparator
Midi-MACS, Miltenyi, Gladbach
Zählkammer nach Neubauer
HBG, Lützellinden
41
II. Material und Methoden
II.2.
II.2.1.
Andrea Mahr
Methoden
Zellbiologische Methoden
II.2.1.1. Kultivierung eukaryotischer Zellen
Alle Arbeiten zur Kultivierung eukaryotischer Zellen wurden unter einer sterilen Werkbank
durchgeführt. Eukaryotische Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C, 95 % Luftfeuchtigkeit
und 5 % CO2 kultiviert. Das verwendete Kulturmedium variierte je nach Zelltyp.
Zelltyp
Primäre humane DC
U-937
Primäre murine DC
Raw264.7
Medium
Zusammensetzung
Differenzierungsmedium
RPMI, 1 % Glutamax, 1 % AB-Serum;
für humane DC
1000 U/mL GM-CSF, 500 U/mL IL-4
Supplementiertes RPMI
RPMI, 1 % Glutamax, 10 % FCS
U-937 Differenzierungsmedium
Differenzierungsmedium
für murine DC
RPMI, 1 % Glutamax, 10 % FCS,
10 µg/mL PMA
RPMI, 1 % Glutamax, 5% FCS ;
10 % Überstand der GM-CSF produzierenden Zelllinie GM-PC
Supplementiertes DMEM
DMEM, 1 % Glutamax, 10 % FCS
Supplementiertes RPMI
RPMI, 1 % Glutamax, 10 % FCS
GM-PC-Medium
RPMI, 1 % Glutamax, 5 % FCS
Primäre humane
Neutrophile
J16
GM-PC
II.2.1.2. Präparation humaner Monozyten und Differenzierung zu DC
Die Präparation von Monozyten erfolgte aus 250-500 mL heparinisiertem Vollblut. Je
15 mL Biocoll-Lösung wurden mit 35 mL Blut langsam überschichtet und zentrifugiert
(700 x g; 20 min; 20°C; ohne Bremse). Der Ring mit den mononukleären Zellen wurde abgenommen und nach Verdünnung mit einem etwa gleichen Volumen RPMI-Medium abzentrifugiert (200 x g, 15 min, 20°C, mit Bremse). Es folgten zwei weitere Waschschritte (gleiche
Zentrifugationsbedingungen), in denen das Pellet in 100 mL RPMI-Medium aufgenommen
und abzentrifugiert wurde. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurden die Zellen in
20 mL PBS aufgenommen und gezählt.
Die Isolierung der Monozyten aus den mononukleären Zellen erfolgte mit einem CD14„Magnetic-Bead-Kit“ der Firma Miltenyi. Die Lymphozyten wurden in 80 µL MACS-Puffer je
1·107 Zellen resuspendiert und nach Zugabe von 10 µL anti-CD14-Kügelchen-Suspension je
1·107 Zellen für 15 min bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Suspension über eine mit 3 mL MACS Puffer äquilibrierte MACS-LS-Säule in einem magnetischen
42
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
Zellseparator gegeben. Die Säule wurde dreimal mit je 3 mL MACS-Puffer gewaschen. Dann
wurde sie aus dem Magnetfeld entfernt und die CD14-positiven Monozyten wurden mit 5 mL
MACS-Puffer eluiert. Die Zellen wurden gezählt, pelletiert (10 min bei 300 x g und 20°C) und
in einer Konzentration von 1,5·106 Zellen in RPMI mit 1 % Glutamax und 1 % AB-Serum in 6Loch-Platten ausgesät (3 mL pro Loch). Etwa 1 h später waren die Monozyten adhärent und
das Medium konnte gegen Differenzierungsmedium für humane DC (3 mL pro Loch) ausgetauscht werden. Nach drei Tagen wurden pro Loch 0,5 mL Medium mit 3500 U/mL GM-CSF
und 1500 U/mL IL-4 zugegeben. Nach insgesamt sechs Tagen wurden die unreifen DC vorsichtig mit dem Zellkultur-Überstand abgenommen und für weitere Experimente verwendet.
In Fällen, in denen die Kultur viele apoptotische DC aufwies, wurden die Zellen vor Verwendung bei geringer Geschwindigkeit (700 rpm bzw. 100 x g) 10 min bei 20°C pelletiert und in
frischem Medium aufgenommen.
II.2.1.3. Präparation muriner Knochenmarkszellen und Differenzierung zu DC
Murine DC wurden aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark der
Beinknochen gewonnen. Für die Sektion wurde durch Alkohol sterilisiertes Sezierbesteck
verwendet. Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet und mit den Extremitäten auf einer
Unterlage fixiert. Alle weiteren Arbeiten fanden unter einer sterilen Werkbank statt. Die Haut
über den Beinen wurde durch einen Schnitt von Hüfte bis Ferse geöffnet und die Knochen
durch Entfernung der Muskeln freigelegt. Femur und Tibia wurden unterhalb der Hüfte bzw.
oberhalb des Knöchels durchtrennt und samt Kniegelenk in eine mit PBS gefüllte Petrischale
gegeben. Nach Entfernung des Kniegelenks und letzter Gewebereste wurden die Knochen in
eine zweite Petrischale mit PBS gegeben. Das Knochenmark wurde mit Hilfe einer 23GKanüle aus den Röhrenknochen gespült und durch Aufziehen mit einer Kanüle in eine 1 mLSpritze mechanisch homogenisiert. Die Zellsuspension wurde durch ein 40 µm Zellsieb in ein
50 mL-Röhrchen überführt und zweimal mit RPMI / 1 % Glutamax / 5 % FCS gewaschen
(Zentrifugationen für 10 min bei 460 x g und 4°C).
Die Differenzierung zu DC erfolgte mit Hilfe eines GM-CSF-haltigen Überstands der murinen Zelllinie GM-PC. Hierfür wurden je 1,5·106 hämatopoetische Vorläuferzellen in 1 mL
Differenzierungsmedium für murine DC in einer 24-Loch-Platte ausgesät. Nach zwei Tagen
wurde das Medium vollständig erneuert, nach zwei weiteren Tagen wurde nochmals 50 %
des Mediums durch neues Medium ersetzt. Weitere zwei bis drei Tage später wurden die DC
für Experimente verwendet. In einigen Fällen wurde statt des Zellüberstands rekombinantes
GM-CSF verwendet. In diesem Fall wurden je 2·106 hämatopoetische Vorläuferzellen in
10 mL RPMI-Medium / 1 % Glutamax / 10 % FCS mit 1000 U/mL murinem GM-CSF in einer
sterilen unbeschichteten Kulturschale ausgesät. Nach drei Tagen wurden 10 mL Medium mit
1000 U/mL GM-CSF zugefügt. Weitere drei bis vier Tage später wurden die DC verwendet.
43
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.2.1.4. Differenzierung der U-937 Zellen
U-937 Zellen sind humane monozytische Zellen, die in Suspension wachsen. Durch verschiedene Substanzen können sie zu adhärenten Zellen differenziert werden, die in ihrem
Phänotyp Makrophagen bzw. DC ähneln. 4-5·106 U-937-Zellen wurden in 30 mL supplementiertem RPMI in einer 75 cm2-Zellkulturflasche ausgesät und mit 10 µg/mL PMA für drei bis
vier Tage differenziert. Die differenzierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und für
4 min mit Trypsin / EDTA vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Nach Abstoppen der proteolytischen Reaktion mit 12 mL Medium wurden die Zellen pelletiert (5 min bei 460 x g und
4°C) und sofort für die weitere Verwendung ausplattiert, um ein Aggregieren der Zellen in
Suspension zu verhindern.
II.2.1.5. Präparation primärer humaner neutrophiler Granulozyten
Primäre humane neutrophile Granulozyten wurden durch Dichtezentrifugation aus 80 mL
heparinisiertem Vollblut isoliert. Je 4 mL Polymorphprep wurden mit je 5 mL Blut in 15 mLRöhrchen vorsichtig überschichtet und zentrifugiert (40 min bei 470 x g und 20°C, ohne
Bremse). Nach der Zentrifugation flotieren die mononukleären Lymphozyten auf dem Polymorphprep, während sich die polymorphkernigen Neutrophilen als Ring in der Interphase
sammeln. Die Erythrozyten werden unter diesen Bedingungen pelletiert. Der obere Ring aus
mononukleären Lymphozyten wurde vorsichtig entfernt. Die Neutrophilen der unteren Ringe
wurden vereinigt und zum Ausgleich der Molarität in ein gleiches Volumen 0,45 % NaCl-Lösung gegeben. Nach Zentrifugation (10 min bei 820 x g und 20°C) wurde der Überstand verworfen und die verbliebenen Erythrozyten durch einminütige Inkubation in eiskalter 0,2 %
NaCl-Lösung hypoton lysiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von 5 mL eiskalter 1,6 % NaClLösung gestoppt, und die Neutrophilen nach erneuter Zentrifugation in einer Konzentration
von 2·106 Zellen/mL in supplementiertem RPMI in 6-Loch-Zellkulturplatten (3 mL pro Loch)
ausgesät und bis zur weiteren Verwendung im Brutschrank inkubiert.
II.2.1.6. Apoptoseinduktion
Für diese Arbeit wurden verschiedene Typen apoptotischer Zellen verwendet. Jurkat TZellen wurden mit 50 mJ/cm² UV-C-Strahlung bestrahlt (6-Loch-Platten, 2,5 mL einer
1 Mio/mL Zellsuspension pro Loch) und für 2 h in supplementiertem RPMI bei 37°C inkubiert.
Primäre Neutrophile starben nach Entnahme aus dem Körper durch Entzug von Überlebenssignalen spontan und zeigten etwa 24 h nach Blutentnahme die typischen Charakteristika
frühapoptotischer Zellen. Murine Thymozyten wurden erhalten, indem ein Thymus mit Hilfe
eines Zellsiebs und dem Kolben einer 2 mL-Spritze homogeni-siert wurde. Die Zellsuspension wurde auf 2 Mio Zellen/mL eingestellt und in 6-Loch-Platten (5 mL pro Loch) inkubiert.
Nach etwa 6 h wiesen die Thymozyten durch spontanen Zelltod einen frühapoptotischen
Phänotyp auf.
44
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.2.1.7. Kokultur-Experimente mit Phagozyten und apoptotischen Zellen
Um zu untersuchen, ob apoptotische Zellen die Zytokinsekretion und Signaltransduktion
von Phagozyten beeinflussen, wurden Kokultur-Experimente durchgeführt. Das gewählte
Medium entsprach jeweils dem Kulturmedium der verwendeten Phagozyten (siehe II.2.1.1.).
Waren die apoptotischen Zellen zunächst in einem anderen Medium kultiviert worden, so
wurden sie vor dem Experiment abzentrifugiert (1200 rpm, 10 min, 20°C) und in dem Phagozyten-Medium aufgenommen.
Experimente zur Messung der Zytokinsekretion wurden in 48-Loch-Platten durchgeführt.
Hier wurden je 1·105 Phagozyten pro Loch in 500 µL ausgesät. Nach einer mindestens 30minütigen Inkubationszeit, in der die Zellen adhärieren konnten, wurden apoptotische Zellen
in einem Volumen von 250 µL hinzugegeben. Das Verhältnis zwischen apoptotischen Zellen
und Phagozyten betrug je nach Experiment zwischen 2:1 und 10:1. Nach einer Inkubationszeit von 4 h (wenn nicht anders angegeben) erfolgte die Stimulation der Zellen mit TLR-Stimuli. Etwa 18 h nach der Stimulation wurden 250 µL Überstand abgenommen und im ELISA
auf die Sekretion von Zytokinen untersucht.
Für Experimente zur quantitativen Erfassung der LPS-induzierten mRNA-Regulation von
U-937 Zellen in An- und Abwesenheit apoptotischer Zellen wurden 6-Loch-Platten verwendet. In diese wurden 1-2·106 U-937 Zellen in 2 mL Medium ausplattiert. Nach vollständiger
Adhärenz der U-937 Zellen wurde das Medium abgenommen und durch frisches Medium mit
oder ohne apoptotische Zellen ersetzt. 4 h später wurden die Zellen stimuliert, und nach
verschiedenen Zeitintervallen lysiert. Für die RNA-Isolierung wurde das NucleoSpin RNAII Kit
von Macherey-Nagel verwendet.
II.2.1.8. Experimente mit Phagozyten und rekombinantem Annexin 1
Um den Einfluss von rekombinantem Annexin 1 auf Phagozyten zu untersuchen, wurden
analog zu den Kokultur-Experimenten mit apoptotischen Zellen Experimente mit rekombinantem humanem und murinem Annexin 1 durchgeführt.
Für Experimente zur Bestimmung der Zytokinsekretion wurden je 1·105 Phagozyten pro
Loch in 500 µL in einer 48-Loch-Platte ausgesät. Nach Adhärenz der Zellen – frühestens
30 min nach dem Ausplattieren – wurde lösliches Annexin 1 in einer Konzentration zwischen
1 und 10 µg/mL zugegeben. Meist wurde mit löslichem Annexin 1 über Nacht inkubiert, in
einigen Fällen auch kürzer. Im Fall der U-937 Zellen wurde kein lösliches, sondern über
Phosphatidylserin an die Platte gebundenes Annexin 1 verwendet. Hierfür wurden die Platten
zunächst über Nacht mit in Methanol gelöstem Phosphatidylserin inkubiert (200 µL einer
0,3 µg/mL Lösung). Das Methanol verdunstet und eine mit Phosphatidylserin beschichtete
Platte bleibt zurück. Die Löcher wurden zweimal mit 500 µL PBS gewaschen und mit Annexin-Bindepuffer bzw. 1-5 µg Annexin 1 pro Loch in Annexin-Bindepuffer inkubiert. Nach 1-2 h
wurde der Annexin-Bindepuffer entfernt und 1·105 U-937 Zellen pro Loch ausgesät. Nach
45
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
einer Inkubationszeit von 4 h wurden die Zellen stimuliert. Nach etwa 18 h konnten die Überstände mittels ELISA analysiert werden.
Um den Einfluss von Annexin 1 auf die mRNA-Induktion in primären humanen DC zu
untersuchen, wurden 3-5·105 Zellen pro Loch einer 24-Loch-Platte in 1 mL ausgesät. Nach
Adhärenz der Zellen wurde Annexin 1 in löslicher Form in der jeweils angegebenen
Konzentration (meist 5 µg/mL) zugegeben. In Experimenten mit dem Translationsinhibitor
Cycloheximid wurde dieses in der Konzentration 10 µg/mL etwa 30 min vor dem Annexin 1
zu den Zellen gegeben. Ebenso wurde die LPS-blockierende Substanz Polymyxin B
(10 µg/mL) vor Zugabe von Annexin 1 in das Kulturmedium pipettiert. Die Stimulation erfolgte
am nächsten Tag. Die Lyse der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation
sowie die RNA-Isolierung wurde mit dem „Absolutely RNA Microprep Kit“ von Stratagene
durchgeführt.
II.2.1.9. Transfektion der Zelllinie Raw264.7
Für die Durchführung von Reporter-Experimenten wurden Raw264.7 Zellen in 75 cm2
Zellkulturflaschen über Nacht in DMEM mit 1 % Glutamax und 10 % FCS (0,3 Mio Zellen
pro mL, 15 mL pro Flasche) kultiviert. Am nächsten Tag betrug die Konfluenz der Zellen zwischen 50 und 80 %. Kurz vor der Transfektion wurde das Medium entfernt, die Zellen einmal
mit warmem PBS gewaschen, und 10,5 mL neues Medium zugegeben. Für die Transfektion
wurden 10,5 µg des Plasmids pTATA-Luc 4 x NF-κB und 0,5 µg des Kontrollplasmids
pGL4.74[hRluc/TK] in 700 µL DMEM ohne Zusätze verdünnt und mit 70 µL des
Transfektionsreagens PolyFect vermischt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 4,2 mL DMEM mit 1 % Glutamax und 10 % FCS zu dem Ansatz pipettiert, und
das Transfektionsgemisch auf die Zellen gegeben. Am folgenden Tag konnten die Zellen
abtrypsiniert und für Reporterexperimente eingesetzt werden.
II.2.1.10. Reporter-Experimente mit Raw264.7 Zellen
Die gemäß 2.1.9. transfizierten Zellen wurden abtrypsiniert, in frischem Medium aufgenommen und in 24-Loch-Platten ausplattiert (5·105 Zellen in 1 mL pro Loch). Nach etwa
30-60 min wurden 3 µg/mL rekombinantes Annexin 1 bzw. apoptotische Zellen im Verhältnis
5:1 zu den Phagozyten gegeben und für 6-10 h inkubiert. Stimuliert wurde mit LPS für
8-12 h. Die weiteren Schritte erfolgten mit dem „Dual Luciferase Reporter Assay System“ der
Firma Promega nach dem Protokoll des Herstellers. Die Proben wurden mit 100 µL des im
Kit enthaltenen Lysepuffers lysiert. Das gewählte System, das die Bestimmung der Aktivität
zweier verschiedener Luziferasen in der gleichen Probe erlaubt, ermöglicht eine Normierung
der NF-κB-induzierten Luziferase-Aktivität auf die Transfektionseffizienz. Das Plasmid
pTATA-Luc 4 x NF-κB kodiert für eine Luziferase aus Glühwürmchen (Firefly) unter einem
NF-κB-abhängigen Promotor. Die Menge an exprimierter Firefly-Luziferase hängt somit von
46
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
der induzierten NF-κB-Aktivität ab. Das kotransfizierte Plasmid pGL4.74[hRluc/TK] kodiert für
eine Luziferase aus dem Organismus Renilla reniformis unter dem Promoter der Tyrosinkinase (TK) aus dem Herpes simplex Virus. Dieser Promotor weist eine konstitutive Aktivität
auf. Da die Plasmide zusammen und somit mit der gleichen Effizienz transfiziert werden,
kann man durch Normierung der Firefly-Luziferase-Aktivität auf die Aktivität der RenillaLuziferase transfektionsbedingte Unterschiede zwischen verschiedenen Proben ausgleichen.
Die Messung der Luziferase-Aktivität erfolgte in einem Lumat LB 9507 Luminometer (Berthold Technologies) nach folgendem Protokoll:
Injektion des Firefly-Luziferase-Substrats
(50 µL)
Verzögerung
(2 sec)
Messung
(10 sec)
Injektion des Renilla-Luziferase-Substrats (50 µL)
Verzögerung
(2 sec)
Messung
(10 sec)
Die Reaktion der Firefly-Luziferase wurde durch den Puffer des Renilla-LuziferaseSubstrats abgestoppt, sodass die beiden Reaktionen getrennt voneinander in der gleichen
Probe analysiert werden konnten.
II.2.1.11. Messung der Aktivität der p38 Kinase in Raw264.7 Zellen
Die Messung der Aktivität der p38 Kinase wurde mit dem p38 Kinase Assay Kit der Firma
CellSignaling durchgeführt. Raw264.7 Zellen wurden für diesen Zweck in Petrischalen ausgesät (2-3 Mio Zellen pro Platte in 10 mL). Nach etwa 1 h wurde Annexin 1 (5 µg/mL) zugegeben und über Nacht mit den Zellen inkubiert. Das Medium wurde vollständig abgenommen
und durch neues Medium, mit oder ohne LPS, ersetzt. Nach verschiedenen Zeitspannen
wurde das Medium abgenommen, die Zellen einmal mit PBS gewaschen, und schließlich mit
1 mL des im Kit enthaltenen Kinase-Lysepuffers für 5 min auf Eis lysiert. Die Lysate wurden
in 1,5 mL Reaktionsgefäße überführt. Zwecks höherer Effizienz der Lyse wurden die
Reaktionsgefäße 4 x 5 sec lang im Ultraschallbad behandelt, wobei zwischen den Ultraschallbehandlungen mit Eis gekühlt wurde. Schließlich wurden die Gefäße für 10 min bei
13000 rpm (18000 x g) und 4°C abzentrifugiert. Die klaren Überstände wurden abgenommen
und bei –80°C gelagert oder direkt für Immunpräzipitation und Kinaseaktivitätsmessungen
eingesetzt.
Für die Immunpräzipitation der phosphorylierten p38 Kinase wurde ein Mastermix angesetzt, der pro Reaktion folgende Komponenten enthielt: 20 µL des an Kügelchen immobilisierten monoklonalen, gegen Phospho-p38 gerichteten Antikörpers, 50 µL KinaseLysepuffer, 10 µL CL4B-Sepharose, 20 µL Streptavidin-Agarose, 0.5 µg DAC5-Biotin. Die
CL4B-Kügelchen wurden zugesetzt, um ein größeres und deutlicher sichtbares Pellet zu
erhalten. Das System aus Streptavidin-Agarose-Kügelchen und biotinyliertem Antikörper
47
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
diente als Ladekontrolle. Der biotinylierte Antikörper lässt sich im Western Blot durch Färbung mit Streptavidin-HRP nachweisen. Er wird durch die Streptavidin-Agarose-Kügelchen
präzipitiert und geht bei den Waschschritten im gleichen Ausmaß verloren wie die durch AntiPhospho-p38 Kügelchen präzipitierte phosphorylierte Kinase. Eventuelle durch das Waschen
bedingte Verluste an p38 Kinase spiegeln sich daher in Verlusten an biotinyliertem Antikörper wider. Diese vom Hersteller nicht vorgesehene Ladekontrolle war nötig, da nicht die Gesamtmenge an p38 Kinase präzipitiert wurde, sondern nur die phosphorylierte Form. Dadurch ist es nicht möglich, eventuelle waschbedingte Verluste durch Färbung gegen die
gesamte p38 Kinase abzuschätzen. Zu 80 µL dieses Mastermixes wurden 300 µL Zelllysat
gegeben und über Nacht rotierend inkubiert.
Für die Messung der Kinaseaktivität wurden die Präzipitate 30 sec bei 14000 x g abzentrifugiert, 2 x mit je 500 µL Kinase-Lysepuffer und 2 x mit je 500 µL des ebenfalls im Kit
enthaltenen Kinase-Puffers gewaschen und schließlich in Kinasepuffer mit 200 µM ATP und
1 µg ATF2 aufgenommen. Die Reaktion der ATP-abhängigen Phosphorylierung von ATF2
durch die p38 Kinase wurde für 30 min bei 30°C unter leichtem Schütteln durchgeführt und
durch Zugabe von SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Proben wurden für 2 min auf 95°C erhitzt
und konnten bei –20°C gelagert werden. Im Western Blot wurde phosphoryliertes ATF2 mit
Hilfe eines spezifischen Antikörpers detektiert.
II.2.2.
Proteinchemische Methoden
II.2.2.1. Aufreinigung von rekombinantem Annexin 1
Humanes und murines Annexin 1 wurden durch Expression in Bakterien gewonnen. Für
die Aufreinigung waren die Proteine am C-Terminus mit einer Sequenz aus Protein A versehen, die durch eine Spaltung mit Prescission Protease entfernt werden konnte. Die Konstrukte zur bakteriellen Expression wurden von Isabel Vogler zur Verfügung gestellt (Vogler
2005). Die Expression erfolgte in BL21(DE3)pLysS pTK1 E. coli-Zellen mit Hilfe des Vektors
pET-41a(+).
Für die Aufreinigung wurde eine Vorkultur in 300 mL LB-Medium mit 50 µg/mL
Kanamycin angeimpft und bei 37°C unter Schütteln (220 rpm) inkubiert. Am nächsten
Morgen wurde die Vorkultur 1:10 verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,6 unter Schütteln
kultiviert. Die Expression von Annexin 1 wurde durch 1 mM IPTG induziert. Nach 4 h wurden
die Bakterien 30 min bei 2070 x g und 4°C abzentrifugiert und einmal mit PBS gewaschen.
Das Pellet wurde gewogen und in einem vierfachen Volumen an bakteriellem Lysepuffer
unter Schütteln 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lyse erfolgte durch fünfmaliges
Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschließendes Auftauen im Wasserbad bei 37°C.
Unterdessen wurden pro mL Lysat 200 µL IgG-Sepharose 6-Kügelchen in einem Zentrifu48
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
genröhrchen mit je 50 mL der folgenden Puffer für 10 min bei 4°C rollend äquilibriert: 2 x
TBST, 1 x HAc, 1 x TBST 1 x HAc, 2 x TBST. Die Zentrifugationen erfolgten für 5 min bei
2500 x g und 4°C. Das Lysat wurde mit Benzonase im Verhältnis 1:2000 versetzt und
30-60 min bei Raumtemperatur geschüttelt, bis die Suspension nur noch leicht-viskos war.
Nach einer Zentrifugation für 30 min bei 13300 x g und 4°C wurde der Überstand des
Bakterienlysats auf die äquilibrierten Sepharose-Kügelchen gegeben und 1-2 h bei 4°C rollend inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kügelchen 5 min bei 2500 x g und 4°C
zentrifugiert und nach vollständigem Entfernen des Überstandes mit je 50 mL der folgenden
Puffer je 10 min bei 4°C rollend gewaschen: 3 x TBST, 1 x NH4Ac, 1 x Spaltungspuffer. Zu je
100 µL Kügelchen wurden 250 µL Spaltungspuffer und 8 Einheiten PreScission-Protease
gegeben, um das Annexin 1-Konstrukt von der Protein A-Domäne zu trennen, die an den
Kügelchen verblieb. Die Proteolyse erfolgte rollend über Nacht bei 4°C. Am nächsten Morgen wurden die IgG-Kügelchen 10 min bei 1840 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand
in ein neues Röhrchen überführt. Die Kügelchen wurden ein weiteres Mal mit einem kleinen
Volumen Spaltungspuffer gewaschen. Die Überstände beider Zentrifugationen wurden vereinigt.
Die PreScission-Protease trug ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag und wurde im
folgenden Schritt über eine Inkubation mit GSH-Kügelchen aus der Präparation entfernt. Für
3 Liter Ursprungskultur wurden 4 mL GSH-Kügelchen 5 min bei 460 x g und 4°C pelletiert
und der Überstand vollständig entfernt. Die Äquilibrierung der Kügelchen erfolgte durch
zweimaliges Waschen mit 50 mL kaltem PBS. Die Proteinlösung wurde zugegeben und das
Gemisch 2 h bei 4°C rollend inkubiert. Die anschließende Zentrifugation erfolgte für 5 min bei
460 x g und 4°C und wurde mehrfach wiederholt, um in der Lösung verbliebene GSH-Kügelchen zu entfernen. Schließlich wurde die Proteinlösung über Nacht gegen PBS dialysiert
(MWCO 10 000 Da), wobei der Puffer ein- bis zweimal gewechselt wurde.
II.2.2.2. Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Die Konzentration von Proteinen in Lösung kann über verschiedene Verfahren bestimmt
werden. Eine einfache Methode ist der Nachweis mit Hilfe von Kupfersulfat und Bicinchoninsäure (BCA). Zunächst reduzieren die Peptidbindungen des Proteins Cu2+ zu Cu+. Die
Cu+-Ionen werden von je zwei Molekülen BCA chelatiert; es entsteht ein violetter löslicher
Komplex, dessen Absorption bei 560 nm bestimmt werden kann. Die Reaktion wird durch
Detergenzien und reduzierende Reagenzien gestört. Die Bestimmung wurde mit einem BCAKit der Firma Pierce nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. 10 µL der Proteinlösungen bzw. eines BSA-Standards wurden in 96-Loch-Platten mit 100 µL BCA-Färbelösung
versetzt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Die Intensität der Färbung wurde über die Messung der Absorption bei 560 nm im ELISA-Reader bestimmt.
49
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.2.2.3. LPS-Dekontamination
Bakteriell exprimierte Proteine enthalten große Mengen Endotoxin, die DC und
Makrophagen stimulieren. Das bakteriell exprimierte Annexin 1 wurde entweder durch Bindung an säulengekoppeltes Polymyxin B (Detoxigel, Pierce) oder durch Waschen mit dem
Detergens Triton X-114 dekontaminiert.
Für die Dekontamination mit Hilfe der Detoxigel Säulen wurden alle Puffer mit endotoxinfreiem Wasser angesetzt und vor Gebrauch entgast. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumen 1 % (w/v) Natrium-Desoxycholat regeneriert, mit 5 Säulenvolumen endotoxinfreiem
Wasser gewaschen und mit 5 Säulenvolumen endotoxinfreiem PBS äquilibriert. Ein Säulenvolumen Proteinpräparat wurde auf die Säule gegeben und 15 min bei 4°C mit der Matrix
inkubiert. Das Protein wurde mit PBS eluiert, dessen NaCl-Gehalt auf 0,5 M erhöht worden
war, um die Effizienz der Elution zu erhöhen. Nach Regeneration mit 5 Säulenvolumen 1 %
Natrium-Desoxycholat wurde die Säule zur Dekontamination weiterer Proteinlösungen verwendet oder bis zum nächsten Gebrauch in 25 % Ethanol bei 4°C gelagert.
Die Dekontamination mit Triton X-114 erfolgte nicht im Anschluss, sondern während der
Proteinreinigung. Das an die IgG-Sepharose gebundene Annexin 1 wurde mit Triton X-114
(0,1 % in TBS) gewaschen (1 L/g Bakterienpellet). Um das Detergens zu entfernen, wurde im
Anschluss daran so lange mit TBS gewaschen, bis Triton X-114 anhand einer fotometrischen
Messung bei 232 nm nicht mehr nachweisbar war.
II.2.2.4. Bestimmung der LPS-Konzentration
Der LPS-Gehalt der Annexin 1-Präparationen wurde mit Hilfe des Limulus-AmöbozytenLysat (LAL)-Tests der Firma Cambrex bestimmt. Der Test basiert auf der Aktivität eines
Enzyms aus Amöbozyten des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus), das durch LPS
aktiviert wird. Wird Amöbozytenlysat mit einer LPS-haltigen Probe versetzt, steigt die
Enzymaktivität proportional zur LPS-Konzentration und kann über die Abspaltung von pNitroanilin (Absorption bei 405 nm) aus einem farblosen Peptidsubstrat bestimmt werden. Die
Proben wurden je nach erwartetem LPS-Gehalt 1:10 bis 1:1000 in endotoxinfreiem Wasser
verdünnt und auf 37°C vorgewärmt. Als Standard dienten Verdünnungen einer LPS-Lösung
mit Konzentrationen zwischen 2 und 0,125 Europäischen Units (EU) LPS (1 EU entspricht
ungefähr 0,1 ng/mL LPS). 50 µl Probe wurden mit 50 µl vorgewärmtem Amöbozyten-Lysat
versetzt. Nach 6 min Inkubation bei 37°C folgte die Zugabe des Substrates. Nach
zehnminütiger Inkubation wurde die Reaktion mit 10-prozentiger SDS-Lösung abgestoppt
und die Absorption der Proben bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt.
II.2.2.5. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Polyacrylamid-Gelelekrophorese dient der Auftrennung von Proteingemischen nach
Größe (Laemmli 1970). Das Gel besteht aus einem polymerisierten Gemisch aus Acrylamid
50
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
und Bisacrylamid. Durch das Verhältnis der beiden Chemikalien kann die Porengröße des
entstehenden Gels variiert und dem Molekulargewicht der aufzutrennenden Proteine angepasst werden. Die aufzutrennende Proteinlösung wird mit einem Natriumdodecylsulfat (SDS)und β-Mercaptoethanol-haltigen Puffer versetzt und erhitzt. Dadurch werden die Proteine
denaturiert, und Dodecylsulfat lagert sich mit seinem hydrophoben Rest an die Aminosäureketten an. Die Anzahl der angelagerten SDS-Moleküle ist annähernd proportional zum Molekulargewicht des Proteins. Da jedes Dodecylsulfat-Molekül eine negative Ladung besitzt,
wandern die Proteine im Gel Richtung Anode. Die Laufweite verhält sich umgekehrt
proportional zum dekadischen Logarithmus der Masse.
Die Gele bestanden aus einem 5-prozentigem Sammelgel und einem 10 bis 12prozentigem Trenngel. Die Gelzusammensetzung ist bei den Puffern aufgeführt. Die Polymerisation wurde mit Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumperoxodisulfat
(APS) gestartet. Das Trenngel war etwa 55 mm hoch, das Sammelgel 15 mm, die Dicke betrug etwa 1,5 mm. Die Proteinproben wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 3 min
bei 95°C denaturiert. Die Auftrennung erfolgte für 1-2 h bei 40 mA pro Gel (Spannungsbegrenzung 140 V). Die Gele wurden direkt für Western Blots verwendet.
II.2.2.6. Lyse eukaryotischer Zellen
Eukaryotische Zellen wurden für 5-10 min bei 460 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand vollständig entfernt. Das Pellet wurde in ca. 100 µl eukaryotischen Lysepuffer pro 1·106
Zellen gründlich resuspendiert und unter gelegentlichem Schütteln 30 min auf Eis lysiert. Die
Entfernung von Zellresten erfolgte durch eine Zentrifugation für 30 min bei 12 000 x g und
4°C. Die Proteinkonzentration wurde durch einen BCA-Assay bestimmt. Bis zur weiteren
Verwendung konnten die Lysate bei –20°C gelagert werden.
II.2.3.
Immunologische Methoden
II.2.3.1. ELISA
Der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) dient der Detektion von Proteinen in
Lösung. Das Protein wird durch spezifische Antikörper erkannt und die Bindung durch eine
Enzymreaktion sichtbar gemacht. Im Gegensatz zum Western Blot wird das Protein beim
ELISA nicht denaturiert und kann in seiner nativen Struktur vom Antikörper erkannt werden.
Zur Bestimmung der Konzentration von humanem und murinem TNF, von murinem
MCP-1 sowie humanem IP-10 und IL-10 wurden OptiEIA-Kits der Firma BD Pharmingen
verwendet, die nach dem Sandwich-ELISA-System aufgebaut sind. Zur Messung von humanem IL-8 dienten Reagenzien der Firma Immunotools. Protein-Standards und Antikörper
wurden nach Herstellerangaben verdünnt. Das Volumen der Proben und des Standards
51
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
betrug abweichend von den Angaben des Herstellers 50 µl pro Loch, da 96-Loch-Platten mit
der Hälfte der Standard-Fläche verwendet wurden. Für den Nachweis von murinem TNF
wurde der Coating-Puffer 2 (pH 5,5) verwendet, für alle anderen der Coating-Puffer 1
(pH 9,6).
Die Beschichtung der Platten mit Capture-Antikörper in Coating-Puffer erfolgte über
Nacht bei 4°C. Am nächsten Morgen wurden die Platten fünfmal mit PBST gewaschen und
zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur mit
ELISA-Puffer inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurde der Zellkulturüberstand auf die
Platten gegeben und 1,5 h inkubiert. Im Anschluss wurden die Platten fünfmal gewaschen
und für 1 h bei Raumtemperatur mit dem Detektions-Antikörper und Streptavidin-HRP inkubiert. Nach achtmaligem Waschen erfolgte die Entwicklung mit OPD-Substratlösung
(1-10 min). Die Reaktion wurde mit 25 µl 1,5 M H2SO4 abgestoppt und die Farbintensität bei
490 nm im ELISA-Reader bestimmt.
II.2.3.2. Durchflusszytometrische Messung von Apoptosemerkmalen
Ein Durchflusszytometer ermöglicht die Analyse von Oberflächenmolekülen einzelner
Zellen. Die Zellen einer Suspension werden im Gerät vereinzelt und mit ein oder zwei
LASER-Strahlen verschiedener Wellenlänge bestrahlt. Wurden die Oberflächenmoleküle mit
Antikörpern oder Molekülen markiert, die an fluoreszierende Farbstoffe gekoppelt sind, so
werden diese durch den LASER zur Emission von Licht einer höheren Wellenlänge angeregt. Dies wird vom Gerät mit Hilfe mehrerer Detektoren quantifiziert. In fixierten Zellen ist
auch der Nachweis intrazellulärer Proteine möglich.
Zur Beurteilung der Apoptose wurde die Externalisierung von Phosphatidylserin durch
Bindung von an Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) gekoppeltes Annexin 5 gemessen. Die
Externalisierung von Phosphatidylserin ist ein Merkmal frühapoptotischer Zellen. Spätapoptotische Zellen, deren Membranintegrität zerstört ist, können durch Färbung mit 7-AAD nachgewiesen werden. Der Farbstoff, der in Zellen mit intakter Membran nicht eindringen kann,
interkaliert in spätapoptotischen Zellen in deren DNA und kann über seine Fluoreszenz
detektiert werden.
Zunächst wurden 0,5-1·105 Zellen pro Färbung durch fünfminütige Zentrifugation bei
3500 rpm (5000 x g) bei 4°C pelletiert. Die Pellets wurden in FACS-Puffer aufgenommen und
mit den Färbereagenzien versetzt (Annexin 5-FITC 1:25; 7-AAD 1:200). Nach 15-minütiger
Inkubation auf Eis wurden die Färbeansätze mit je 1 mL FACS-Puffer versetzt und abzentrifugiert. Nach Aufnahme in 200 µL FACS-Puffer konnten die Proben im Durchflusszytometer
gemessen werden. Zur Auswertung diente die Software Cell Quest Pro.
52
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.2.3.3. Western Blot
Der Western Blot dient dem Nachweis spezifischer Proteine in einem nach Größe aufgetrennten Proteingemisch. Die in einem SDS-Gel aufgetrennten Proteine werden elektrophoretisch auf eine Membran transferiert. Hierfür werden Gel und Membran zwischen Anodenund Kathodenplatte gebracht, wobei mit Transferpuffer benetzte Filterpapiere den Kontakt zu
den Elektroden herstellen. Nach dem Transfer können spezifische Proteine mit Hilfe Peroxidase-gekoppelter Antikörper und einem chemilumineszenten Substrat auf einem lichtsensitiven Film sichtbar gemacht werden.
50 µg Zelllysat oder 1-2 µg rekombinantes Protein wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt
und mit dem Semi-Dry-Verfahren auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Der Transfer
erfolgte über einen Zeitraum von 2 h bei 0,8 mA/cm2 Membran. Die Spannung wurde auf 6 V
beschränkt.
Nach dem Transfer wurden die freien Bindungsstellen der Membran durch einstündige
Inkubation in 5 % BSA in TBST abgesättigt. Die Inkubation mit dem Erstantikörper erfolgte je
nach Antikörper für 4-16 h. Die Antikörper wurden in den vom Hersteller angegebenen Verdünnungen in TBS/0,1 % BSA eingesetzt. Nach drei zehnminütigen Waschschritten mit
TBST wurde die Membran für ca. 1 h mit einem HRP-gekoppelten Zweitantikörper inkubiert
(Verdünnung 1:10000 in TBST/0,1 % BSA). Nach dreimaligem Waschen mit TBST und Entfernung des Detergens durch zweimaliges kurzes Waschen mit TBS wurde frisch angesetzte
ECL-Lösung zugegeben. Das Detektionsenzym HRP katalysiert mit den in dieser Lösung
enthaltenen Substraten eine Reaktion, die unter Chemilumineszenz abläuft. Diese wurde mit
Hilfe eines lichtsensitiven Films detektiert.
II.2.4.
Molekularbiologische Methoden
II.2.4.1. Transformation kompetenter Bakterien
E.coli BL21(DE3)pLysS pTK1 Bakterien (Invitrogen, Karlsruhe), die nach der CaCl2-Methode kompetent gemacht und bei –80°C gelagert worden waren, wurden auf Eis aufgetaut.
Zu 40 µL Bakteriensuspension wurden 2 µL Plasmid-DNA gegeben und einige Minuten auf
Eis inkubiert. Der Ansatz wurde dann auf einer auf 37°C vorgewärmten LB-Agarplatte (LBMedium mit 20 mg/mL Agar) ausgestrichen, die Antibiotika (Kanamycin oder Amipicillin,
50 µg/mL) für die Selektion enthielt. Dieser Temperatursprung (Hitzeschock) führte zur Aufnahme des Plasmids durch die Bakterien. Nach Inkubation über Nacht konnten einzelne
Klone in flüssiges antibiotikahaltiges LB-Medium angeimpft werden, um daraus das Plasmid
zu isolieren.
53
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
II.2.4.2. Isolierung von Plasmid-DNA
Zur Präparation von Plasmiden im Miniansatz wurden ca. 1,5 mL einer 3 mL Übernachtkultur (37°C) der Bakterien bei 13000 rpm in einer Tischzentrifuge 1 min lang abzentrifugiert.
Das Bakterienpellet wurde in 250 µL P1-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM Glucose; 10
mM EDTA; 100 µg/mL RNAse A) resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe
von 250 µL P2-Puffer (0,2 M NaOH; 1 % SDS) für 5 min bei Raumtemperatur. Dann wurde
der Ansatz mit 300 µL eisgekühltem P3-Puffer (3 M Kaliumacetat, pH 4,8) 5 min lang auf Eis
neutralisiert. Das Präzipitat aus Protein und genomischer DNA wurde durch Zentrifugation
(13000 rpm, 10 min, 4°C) pelletiert. Die Plasmid-DNA wurde aus 500 µL Überstand mit 2
Volumina Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur gefällt und abzentrifugiert (10 min, 13000
rpm, 4°C). Das Pellet wurde einmal mit 70-prozentigem Ethanol gewaschen, 20 min luftgetrocknet, und in 50 mL TE-Puffer gelöst. Die erhaltene DNA-Menge lag jeweils bei 30-50 µg.
Präparationen im Maxiansatz wurden mit dem EndoFree Plasmid Maxi Kit der Firma
Qiagen durchgeführt. Mit dieser Methode wurde verunreinigendes LPS auf weniger als
0,1 EU/µg DNA reduziert. Dies war nötig, um zu verhindern, dass die mit den Plasmiden
transfizierten Makrophagen aktiviert wurden. Zudem erhöht ein geringer LPS-Gehalt die
Transfektionseffizienz. Die Präparation erfolgte nach Angaben des Herstellers.
II.2.4.3. Isolierung von RNA
Die Isolierung von RNA erfolgte im Fall der U-937 Zellen mit dem NucleoSpin® RNA II Kit
der Firma Macherey-Nagel, das für 1-5·106 Zellen pro Lysat verwendet werden kann. Aus
humanen DC wurde RNA mit dem Absolutely RNA® Microprep Kit der Firma Stratagene
isoliert. Dieses Verfahren wurde aufgrund der limitierten Zellausbeute aus einer Blutspende
gewählt, da es für kleinere Zellzahlen (1-5·105 Zellen pro Lysat) optimiert ist. Die Isolierung
erfolgte nach dem jeweiligen Herstellerprotokoll. Das Prinzip der Isolierung war in beiden
Fällen die selektive Bindung der Nukleinsäuren an eine Silica-Membran, die mehrmals
gewaschen wurde, um verunreinigende Substanzen zu entfernen. DNA wurde durch
Inkubation mit einer RNAse-freien DNAse abgebaut. Nach weiterem Waschen der Membran
wurde die RNA mit RNAse-freiem Wasser eluiert. Zur Reinigung der Arbeitsgeräte wurde 70prozentiger Ethanol sowie RNAse ZAP verwendet. Stets wurden Pipettenspitzen mit Filtern
benutzt.
II.2.4.4. RNA-Qualitätsbestimmung mit dem Agilent Chip
Die Qualität der isolierten RNA wurde mit dem RNA 6000 Nano Chip Kit der Firma
Agilent untersucht. Die Analyse erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Sie basiert auf
dem Prinzip einer miniaturisierten Kapillarelektrophorese (Lab-on-a-Chip-Verfahren). Dabei
wird ein Minichip verwendet, der aus einem Netzwerk untereinander verbundener Kanäle
besteht. In die Löcher des Chips wurde zunächst ein Gel gegeben, das mit einem
54
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
Fluoreszenzfarbstoff versetzt worden war. Das Gel wurde mit Hilfe der Chip Priming Station
der Firma Agilent durch Überdruck gleichmäßig verteilt. Dann wurden die RNA-Proben sowie
ein Molekulargewichts-Standard aufgetragen. Es folgte eine spannungsinduzierte Größentrennung der RNA-Fragmente nach Molekulargewicht in einem entsprechenden Gerät
(Agilent 2100 Bioanalyzer). Mittels einer LASER-induzierten Fluoreszenzdetektion erhielt
man am Ende des Laufs ein Elektropherogramm für jede Probe.
Anhand der Signale für 28S und 18S rRNA und deren Verhältnis zueinander, sowie anhand des Auftretens von Abbauprodukten wurde von der Software ein sogenannter RIN-Wert
(RNA Integrity Number) auf einer Skala von 1 bis 10 ermittelt. Die RIN-Skala (Schroeder et
al. 2006) hat sich mittlerweile als Qualitätsstandard für RNA durchgesetzt. Dabei entspricht 1
einer vollständig degradierten RNA, und 10 einer völlig intakten RNA. RNA-Proben mit einer
RIN unterhalb von 5 sollen laut Empfehlung des Herstellers nicht für quantitative Analysen
der mRNA verwendet werden. RIN-Werte zwischen 8 und 10 entsprechen einer sehr hohen
Qualität.
II.2.4.5. Reverse Transkription
Mittels Reverser Transkription (RT) kann aus Gesamt-RNA cDNA hergestellt werden.
Oligo-dT-Desoxyribonukleotide hybridisieren an das PolyA-Ende der mRNAs und werden als
Primer für die RT-Reaktion eingesetzt. Zunächst wurde die RNA mit Oligo-dT-Primern für
10 min bei 72°C denaturiert. Danach wurde der Reaktionsansatz (1 U/µL RNAse-Inhibitor,
1 mM dNTPs, 1 x PCR Buffer II, 5 mM MgCl2, 0,5 U/µL Reverse Transkriptase in 100 µL) für
45 min bei 42°C inkubiert und anschließend für 5 min bei 90°C inaktiviert.
II.2.4.6. Quantitative Real Time-PCR
Bei der quantitativen Real Time-PCR werden wie bei der konventionellen PCR-Methode
DNA-Abschnitte vervielfältigt. Dem Reaktionsgemisch wird jedoch zusätzlich ein Farbstoff
zugesetzt (SYBR Green), der in DNA interkaliert. Das Einlagerungsprodukt aus DNA und
Farbstoff kann durch LASER-Licht zur Fluoreszenz angeregt werden. Dies wird ausgenutzt,
um bereits während der Reaktion den Anstieg der PCR-Produkte über den Anstieg der Fluoreszenz nachzuweisen. Da der Anstieg in Proben, die eine höhere Ausgangskonzentration
an der jeweiligen cDNA haben, schneller geht als in geringer konzentrierten Proben, lassen
sich die Proben so quantitativ bestimmen. Die PCR wurde im ABI PRISM 7700 SequenzDetektor durchgeführt. Von jeder Probe wurden Triplikate in einem Reaktionsvolumen von je
25 µL gemessen.
55
II. Material und Methoden
Andrea Mahr
Reaktionsschema (Ansatz pro Triplikat):
Primerkonzentration (nM)
300 / 300
500 / 500
900 / 900
Primer (forward) (µL)
5,3
8,8
15,8
Primer (reverse) (µL)
5,3
8,8
15,8
SYBR-Green-Mix (µL)
27,6
27,6
27,6
Wasser
31,9
24,8
10,9
Der SYBR-Green-Mix enthielt 300 µL 10 x SYBR-Green-Puffer, 360 µL 25 mM MgCl2,
240 µL dNTPs (je 10 mM), 15U/µL Hot Gold Star Taq-Polymerase und 30 U/µL Uracil-NGlycosylase. Alle verwendeten Primer wurden in einer Konzentration von 500 nM eingesetzt,
bis auf die Primer für GAPDH (900 nM) und TNF (300 nM). Die im Kit in limitierender Menge
enthaltenen Enzyme wurden ohne Änderung des Protokolls bisweilen durch andere Produkte
(HotGoldStar DNA Polymerase und Uracil-N-Glycosylase, Eurogentec, Köln) ersetzt.
II.2.4.7. Genexpressionsanalysen
Genexpressionsanalysen wurden mit Hilfe von Illumina Sentrix® Human Ref-8 Chips
durchgeführt. Hierfür wurde RNA wie beschrieben aus 1,5·106 humanen DC pro Probe isoliert. Aus einem Drittel der isolierten RNA wurde cDNA hergestellt, der Rest wurde für die
Analysen verwendet, die durch das RZPD (Ressourcenzentrum Primärdatenbank) durchgeführt wurden. Die Auswertung erfolgte mit der Software Illumina Bead Studio.
56
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
III. Ergebnisse
III.1.
Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die LPS-induzierte
Zytokinsekretion in humanen und murinen DC
Die Aufnahme apoptotischer Zellen durch DC löst in der Regel keine Immunantwort aus,
sondern zeigt antiinflammatorische Effekte oder führt sogar zur Induktion von Toleranz (Savill
et al. 2002; Steinman & Nussenzweig 2002). Die Phagozytose apoptotischer Zellen wird
durch apoptosespezifische Oberflächenmoleküle vermittelt (Lauber et al. 2004). Daher liegt
es nahe, dass auch die inhibitorische Wirkung auf die Phagozyten auf spezifischen Molekülen auf der Oberfläche der apoptotischen Zellen beruht. Das Protein Annexin 1 wird in einem
frühen Stadium der Apoptose, etwa zeitgleich mit der Exposition von Phosphatidylserin, aus
dem Zytosol auf die Zelloberfläche transloziert. Daher könnte Annexin 1 ein antiinflammatorisches Signal darstellen, das sterbende Zellen an DC übermitteln (Weyd 2005).
Um den Effekt apoptotischer Zellen bzw. des Proteins Annexin 1 auf DC zu untersuchen,
wurden in vitro-Experimente durchgeführt, in denen DC oder DC-ähnliche Zelllinien mit
apoptotischen Zellen oder rekombinantem Annexin 1 vorinkubiert und später mit TLR-Liganden stimuliert wurden. Die dadurch induzierte Aktivierung der DC ließ sich je nach Dauer der
Stimulation durch verschiedene zelluläre Effekte nachweisen, beginnend mit der intrazellulären Signaltransduktion bis hin zur Sekretion von Zytokinen und der Expression von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche (Abb. III.1). Eine antiinflammatorische Beeinflussung der
DC durch die Vorinkubation sollte sich in einer verminderten Aktivierbarkeit äußern. Die Stimuli wurden in sehr geringen Konzentrationen eingesetzt, da eine Inhibition am besten
beobachtet werden kann, wenn der Stimulus in nicht sättigenden Konzentrationen verwendet
wird. Im Fall der Zelllinien wurden aus diesem Grund regelmäßig Titrationskurven der TLRLiganden gemessen, um für die folgenden Experimente eine Konzentration im linearen Bereich der Titrationskurve auszuwählen.
Als apoptotische Zellen dienten mit 50 mJ/cm2 UV-C bestrahlte Jurkat-T-Zellen zwei bis
vier Stunden nach der Bestrahlung oder spontan sterbende primäre humane neutrophile
Granulozyten einen Tag nach ihrer Isolierung. Neben diesen humanen apoptotischen Zellen
wurden auch apoptotische murine Thymozyten eingesetzt. In allen Fällen wiesen die verwendeten Zellen einen frühapoptotischen Phänotyp auf, bei dem frühe Merkmale der Apoptose wie die Exposition von Phosphatidylserin und morphologische Veränderungen bereits
nachweisbar waren, die Zellmembran jedoch noch intakt war (Daten nicht gezeigt). Die Wahl
frühapoptotischer Zellen spiegelt die Situation in vivo wider, da professionelle Phagozyten
apoptotische Zellen im Normalfall rasch beseitigen. Spätapoptotische (sekundär nekrotische)
Zellen mit zerstörter Membranintegrität treten daher in vivo kaum auf (Parnaik et al. 2000).
57
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.1. Experimenteller Aufbau. Primäre DC oder Modell-Zelllinien wurden mit apoptotischen Zellen oder
Annexin 1 vorinkubiert und mit einem TLR-Ligand stimuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation
konnten die dadurch hervorgerufenen Vorgänge und deren Beeinflussung durch die Inkubation analysiert werden.
Intrazelluläre Signaltransduktion tritt unmittelbar nach der Stimulation auf. Es folgt die Expression bestimmter
mRNAs und die Sekretion von Zytokinen. Zwei Tage nach der Stimulation exprimieren reife DC Aktivierungsmarker auf der Oberfläche und besitzen somit die Fähigkeit zur T-Zell-Stimulation.
Als Phagozyten wurden primäre humane und murine DC sowie verschiedene Zelllinien
eingesetzt. Primäre humane DC wurden durch Differenzierung mit GM-CSF und IL-4 aus
humanen Monozyten gewonnen. Murine DC stammten aus isolierten Knochenmarkszellen
der Maus nach Differenzierung mit murinem GM-CSF. Zelllinien kamen zum Einsatz, um die
mit den primären Zellen erhaltenen Ergebnisse zu ergänzen bzw. zu untermauern. Als Modell für humane DC wurde die Zelllinie U-937 nach Differenzierung mit PMA verwendet. Bei
U-937 Zellen handelt es sich um eine aus einem histiozytischen Lymphom gewonnene
humane monozytische Zelllinie. Die Differenzierung bewirkt eine Adhärenz der Zellen, die mit
der Ausbildung DC- bzw. Makrophagen-ähnlicher Eigenschaften einhergeht (Dörner 2007).
Daneben wurde die murine Makrophagen-Zelllinie Raw264.7 eingesetzt. Makrophagen
ähneln DC in der Signaltransduktion insofern, als sie durch TLR-Stimuli aktivierbar sind und
sich durch apoptotische Zellen hemmen lassen (Fadok et al. 1998; McDonald et al. 1999).
Die infolge der LPS-Stimulation sezernierten Zytokine wurden mittels ELISA quantifiziert
(Abb. III.2.). Im humanen System inhibierten apoptotische Zellen die Sekretion des
proinflammatorischen Zytokins TNF (Abb. III.2.A, E). Bemerkenswerterweise zeigte eine
Vorinkubation mit Annexin 1 (1-5 µg/mL) ebenfalls einen hemmenden Effekt auf die TNFSekretion (Abb. III.2.B, F). Die Inhibition war dosisabhängig und lag je nach Experiment im
Bereich einer 20-80-prozentigen Reduktion. Im Fall der U-937 Zellen wurde Annexin 1 nicht
löslich hinzugegeben, sondern an eine mit Phosphatidylserin beschichtete Oberfläche
gebunden, auf der anschließend die Phagozyten ausgesät wurden. In dieser Form hemmte
es die TNF-Produktion deutlich (Abb. III.2.B), während es in löslicher Form nahezu inaktiv
58
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
war (Daten nicht gezeigt). U-937 Zellen sezernierten nach LPS-Stimulation auch das
antiinflammatorische Zytokin IL-10. Dieses war jedoch im Gegensatz zu TNF durch Inkubation mit apoptotischen Zellen oder Annexin 1 nur sehr schwach oder nicht reduziert (Abb.
III.2.C, D), es lag also keine globale Inhibition der Zytokinsynthese vor. In humanen DC
führte die Stimulation mit den verwendeten niedrigen LPS-Konzentrationen nicht zu einer
signifikanten Sekretion von IL-10 (Daten nicht gezeigt).
Mit Raw 264.7 Zellen (Abb. III.3.A, C) und mit murinen DC (Abb. III.3.B, D) ergaben sich
analoge Ergebnisse für den Einfluss apoptotischer Zellen auf die TNF-Sekretion. Sowohl
humane als auch murine apoptotische Zellen (Abb. III.3.A bzw. III.3.B) als auch humanes
und murines Annexin 1 (Abb. III.3.C bzw. III.3.D) konnten die TNF-Sekretion in vergleichbarem Maß wie im humanen System unterdrücken. Die Suppression muriner DC durch humane
apoptotische Zellen bzw. humanes Annexin 1 weist auf eine Kreuzreaktivität hin. Diese
besteht auch in der entgegengesetzten Richtung, insofern als murine apoptotische Zellen
auch humane DC inhibieren (Heiko Weyd, persönliche Kommunikation).
Diese Ergebnisse machen deutlich, dass sowohl apoptotische Zellen als auch rekombinantes, aufgereinigtes Annexin 1 in der Lage sind, die LPS-induzierte Sekretion des
proinflammatorischen Zytokins TNF in humanen und murinen DC zu unterdrücken. Das
Ausmaß der Inhibition war experimentabhängig und lag meist im Bereich von 20-80 %, wobei
Annexin 1 bisweilen ebenso potent war wie apoptotische Zellen. Der Effekt zeigt eine Kreuzreaktivität zwischen den Spezies Mensch und Maus.
59
III. Ergebnisse
Abb. III.2.
Andrea Mahr
Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsekretion LPS-stimulierter
humaner Phagozyten.
5
A) 1· 10 PMA-differenzierte U-937 Zellen wurden mit apoptotischen Jurkat T-Zellen (aJ) in den angegebenen
Verhältnissen für 4 h vorinkubiert und dann mit verschiedenen LPS-Konzentrationen stimuliert. Die sezernierte
Menge an TNF wurde 16 h später
im ELISA gemessen. B) Vertiefungen von Zellkulturplatten wurden mit
5
Phosphatidylserin und danach mit 5 µg Annexin 1 (Anx1) beschichtet. Nach 2 h wurden 1· 10 PMA-differenzierte
U-937 Zellen in die beschichteten Vertiefungen ausgesät. Weitere 4 h später folgte die Stimulation mit 5 ng/mL
LPS. Die TNF-Konzentration wurde 16 h später im ELISA bestimmt. C) Wie A, die IL-10 Konzentration wurde im
5
ELISA bestimmt. D) Wie B, die IL-10 Konzentration wurde im ELISA bestimmt. E) 1· 10 humane DC wurden mit
apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) in den angegebenen Verhältnissen für 4 h vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS
5
stimuliert. Nach 16 h wurde die TNF-Konzentration in den Überständen mittels ELISA gemessen. F) 1· 10 hu-
mane DC wurden für 6 h mit den angegebenen Konzentrationen an Annexin 1 vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS
stimuliert. Nach 16 h wurde die TNF-Konzentration im ELISA gemessen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von Triplikaten an. Die Daten sind repräsentativ für jeweils mindestens drei unabhängige Experimente.
60
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.3. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsekretion LPS-stimulierter
muriner DC und Makrophagen.
A) 1· 105 Raw 264.7 Zellen wurden im Verhältnis 5:1 mit apoptotischen humanen Neutrophilen (aNΦ) für 6 h
5
vorinkubiert und mit den angegebenen LPS-Konzentrationen stimuliert. B) 1· 10 primäre murine DC wurden im
Verhältnis 5:1 mit apoptotischen murinen Thymozyten (aT) inkubiert und 4 h später mit den angegebenen LPS5
Konzentrationen stimuliert. C) 1· 10 Raw 264.7 Zellen wurden mit 5 µg/mL löslichem humanen Annexin 1 (Anx1)
5
über Nacht inkubiert und mit den angegebenen LPS-Konzentrationen stimuliert. D) 1· 10 primäre murine DC
wurden mit
7 µg/mL murinem Annexin 1 für 6 h inkubiert und mit den angegebenen LPS-Konzentrationen
stimuliert. Die Konzentrationsbestimmung des Zytokins TNF erfolgte in allen Fällen 16 h nach Stimulation mittels
ELISA. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von Triplikaten an. Jedes der gezeigten Resultate ist
repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente.
61
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
III.2. Annexin 1 inhibiert die Zytokinsekretion nach TLR-Stimulation auch in
Gegenwart der LPS-blockierenden Substanz Polymyxin B
Die Inhibition der TNF-Produktion durch rekombinantes Annexin 1 ist ein Hinweis auf
eine mögliche Rolle dieses Proteins bei der Vermittlung des antiinflammatorischen Effekts
apoptotischer Zellen. Die Verwendung bakteriell exprimierter und aufgereinigter Proteine in
Experimenten mit DC oder Makrophagen birgt jedoch die Gefahr, dass bakterielle Substanzen, die bei der Aufreinigung nicht vollständig entfernt wurden, das Ergebnis verfälschen.
Dies betrifft insbesondere das in E.coli reichlich vorhandene und durch die üblichen Aufreinigungsmethoden kaum vollständig zu entfernende LPS, das in geringsten Mengen zu einer
Stimulation der Zellen über TLR4 führt. Bei Untersuchungen zur Suppression der TLRSignaltransduktion besteht hier vor allem die Gefahr von Artefakten, die durch EndotoxinToleranz auftreten können. Hierbei handelt es sich um eine Phase vorübergehender
Nichtreaktivität gegenüber weiterer TLR-Stimulation nach Kontakt mit LPS (siehe I.4.5.). Da
in dem verwendeten Protokoll nach mehrstündiger Vorinkubation mit einem aus Bakterien
gewonnenen Protein eine Hemmung der Reaktion auf einen nachfolgenden TLR-Stimulus
beobachtet wurde, kann man ohne weitere Kontrollen nicht darauf schließen, ob Annexin 1
oder das in der Präparation enthaltene LPS diesen Effekt verursacht.
Aus dem in dieser Arbeit verwendeten Annexin 1 wurde LPS weitgehend entfernt. Dies
geschah entweder durch selektive Bindung des LPS an säulengekoppeltes Polymyxin B,
oder durch ausgiebiges Waschen von säulengebundenem Annexin 1 mit dem Detergens
Triton X-114. Geringe Reste von LPS verblieben jedoch in der Präparation, wie mit Hilfe des
LAL-Tests zum Nachweis von LPS bestimmt wurde. Die Endkonzentration des durch das
Annexin in das Kulturmedium eingebrachten LPS betrug je nach Annexin 1-Präparation in
etwa zwischen 0,02 und 1 EU/mL (2-100 pg/mL).
Um zu beurteilen, inwiefern mit Endotoxin-Toleranz durch diese Verunreinigung zu rechnen ist, wurden die Zellen mit entsprechenden LPS-Konzentrationen anstelle von Annexin 1
vorinkubiert und dann stimuliert. Die Toleranzinduktion war zelltypabhängig unterschiedlich
stark ausgeprägt. Im Fall der humanen DC war die Zytokinproduktion tatsächlich vermindert,
während im U-937 System kein inhibitorischer Effekt sichtbar war (Daten nicht gezeigt sowie
H. Weyd, persönliche Kommunikation). Im murinen System wurde der Einfluss einer
Vorinkubation mit entsprechenden LPS-Konzentrationen noch nicht getestet, jedoch konnte
hier ein Annexin 1-spezifischen Antikörper zumindest in einigen Experimenten den inhibitorischen Effekt der Proteinpräparation aufheben, was auf einen spezifischen Annexin 1-Effekt
hindeutet (Dörner 2007).
62
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Um die antiinflammatorischen Eigenschaften von Annexin 1 unter Ausschluss einer möglichen Endotoxin-Toleranz auch bei primären humanen DC zu beurteilen, wurde dem Kulturmedium das Antibiotikum Polymyxin B zugesetzt, das an LPS bindet und dadurch dessen
Effekt neutralisiert. Die verwendete Konzentration von Polymyxin B (10 µg/mL) zeigte in der
FACS-Analyse von Zelltodmerkmalen vernachlässigbare Toxizität auf die Zellen (Daten nicht
gezeigt). Sie führte jedoch zu einer vollständigen Inhibition der TNF- und IL-8-Sekretion nach
Stimulation der DC mit 10 ng/mL LPS, einer verglichen mit der kontaminierenden LPSMenge um mehr als 1000-fach höheren Konzentration (Daten nicht gezeigt). Als Stimulus
wurde anstelle von LPS das bakterielle triacylierte Lipopeptid Pam3CSK4 verwendet. Die
Stimulierbarkeit der DC durch diesen Liganden, der an das Heterodimer aus TLR2 und TLR1
bindet, wurde durch Polymyxin B nicht beeinflusst (Abb. III.4.D). Die Pam3CSK4-induzierte
Sekretion von TNF, IL-8 und IL-6 wurde durch Annexin 1 in Anwesenheit von Polymyxin B
um durchschnittlich 50 % verringert (Abb. III.4. A-C). Die Inhibition humaner DC durch
Annexin 1 war in Anwesenheit von Polymyxin B meist kaum vermindert (Abb. III.4.D), was
darauf schließen lässt, dass Endotoxin-Toleranz bei dem beobachteten Effekt keine große
Rolle spielt. In einigen Experimenten war die LPS-Toleranz deutlicher zu erkennen, sie trug
aber nie mehr als etwa 40 % zu dem beobachteten antiinflammatorischen Effekt der
Annexin 1-Präparation bei (Daten nicht gezeigt). Die Potenz von Polymyxin B zeigte sich bei
Verwendung stark LPS-kontaminierter Annexin 1- Präparationen. Diese führten bereits ohne
weitere LPS-Stimulation zu einer hohen TNF-Produktion, die jede weitere TLR-Stimulation
um Größenordnungen übertraf. In Anwesenheit von Polymyxin B kehrte sich der Effekt
solcher kontaminierter Präparationen jedoch um, und die Pam3CSK4-induzierte TNFSekretion wurde inhibiert (Abb. III.4.D). Auch für andere Stimuli und für Effekte auf mRNAund Signaltransduktionsebene wurde beobachtet, dass die antiinflammatorische Wirkung der
Annexin 1-Präparation auch in Anwesenheit von Polymyxin B noch vorhanden war
(Abb.III.16.B, C, Abb.III.17.E und Daten nicht gezeigt).
Insgesamt ergibt sich das Bild, dass humane DC zwar auf geringe LPS-Konzentrationen
durchaus mit Endotoxin-Toleranz reagieren können, dass diese jedoch bei Verwendung des
bakteriell exprimierten Annexin 1 nahezu keine Rolle spielt. Der inhibierende Effekt ist folglich
auch in primären humanen DC vielmehr dem Annexin 1 selbst zuzuschreiben.
63
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.4. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Zytokinsekretion auch in Gegenwart der LPSneutralisierenden Substanz Polymyxin B.
A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 10 µg/mL Polymyxin B sowie 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) über Nacht
inkubiert und mit 4 ng/mL Pam3CSK4 (PAM3) stimuliert. Am nächsten Tag wurde die Konzentration des sezernierten TNF im ELISA bestimmt. B) Wie A, die IL-8 Konzentration wurde im ELISA bestimmt. C) Wie A, die IL-6
5
Konzentration wurde im ELISA bestimmt. D) 1· 10 primäre humane DC wurden in An- oder Abwesenheit von 10
µg/mL Polymyxin B (PoMB) mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht inkubiert. Das verwendete Annexin 1 war dabei
entweder mit Hilfe von säulengebundenem Polymyxin B von verunreinigendem LPS dekontaminiert worden, oder
die Präparation enthielt noch große Mengen LPS (*). Nach über Nacht Inkubation wurden die Zellen mit 4 ng/mL
Pam3CSK4 stimuliert. Die Konzentration an sezerniertem TNF wurde im ELISA bestimmt.
III.3. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsynthese
auf Ebene der mRNA
Die Produktion von Zytokinen wird auf mehreren Ebenen reguliert. Neben der Transkription können das Spleißen der prä-mRNA, die mRNA-Stabilität oder posttranslationale
Schritte wie etwa die Spaltung bestimmter Zytokine wie IL-1β oder TNF durch Proteasen
sowie die Sekretion betroffen sein. Aufgrund der Vielfalt an Regulationsmechanismen stellt
sich die Frage, ob sich die beobachtete Regulation der Zytokine durch Annexin 1 bzw.
apoptotische Zellen schon auf der Ebene der mRNA-Transkripte widerspiegelt. Um dies zu
untersuchen, wurden zunächst U-937 Zellen mit apoptotischen Jurkat-T-Zellen vorinkubiert
und mit LPS stimuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation wurden die Zellen
geerntet
und
die
RNA
isoliert.
Die
Qualität
der
isolierten
RNA
wurde
durch
64
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Kapillarelektrophorese unter Verwendung von RNA Nano Chips der Firma Agilent untersucht
und war jeweils sehr hoch (RIN zwischen 8 und 10). Quantitative PCR gab Aufschluss über
die Kinetik der transkriptionellen Zytokinregulation und die Beeinflussung durch apoptotische
Zellen. Es zeigte sich, dass die Menge an TNF mRNA relativ rasch anstieg, nach etwa einer
Stunde ein Maximum erreichte, und innerhalb von fünf Stunden wieder abfiel. In Anwesenheit apoptotischer Zellen war die Menge an TNF mRNA im Vergleich zur Kontrolle zu jedem
Zeitpunkt reduziert (Abb. III.5.A). Die IL-10 mRNA wurde in ähnlicher Weise wie TNF durch
LPS hochreguliert, jedoch mit unterschiedlicher Kinetik. Das Expressionsmaximum trat später auf und die Expression hielt länger an. Die Anwesenheit apoptotischer Zellen hatte in
Analogie mit den für sezerniertes IL-10 gefundenen Daten keinen signifikanten Einfluss auf
die Menge an IL-10 mRNA (Abb. III.5.B).
Abb. III.5. Die Hemmung der Zytokinproduktion durch Annexin 1 erfolgt auf Ebene der mRNA.
A) 3· 106 U-937 Zellen wurden mit apoptotischen Jurkat T-Zellen (aJ) für 4 h inkubiert. Nach Entfernung nicht
phagozytierter apoptotischer Zellen durch Medienwechsel wurden die U-937 Zellen für verschiedene Zeiten mit
10 ng/mL LPS stimuliert. Mittels quantitativer RT-PCR wurde die Induktion der TNF mRNA gemessen. B) Wie A,
5
die Induktion der IL-10 mRNA wurde mit quantitativer RT-PCR bestimmt. C) 4· 10 primäre humane DC wurden
mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Nach verschiedenen
Inkubationszeiten wurde die Induktion der TNF mRNA mit quantitativer RT-PCR bestimmt. D) Wie C, die Induktion
der IL-8 mRNA wurde mittels quantitativer PCR gemessen.
65
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Ein Problem bei der Untersuchung von Effekten im Kokultur-System aus Phagozyten und
apoptotischen Zellen sind mögliche Kontaminationen mit apoptotischem Zellinhalt, die nur
bei den behandelten Phagozyten auftreten und eventuell selbst durch Abwaschen der nicht
phagozytierten apoptotischen Zellen vor Herstellung der Lysate nicht ausgeschlossen werden können. Daher wurde die Menge an CD3 mRNA in den RNA-Präparationen untersucht.
Diese für die apoptotischen Jurkat-T-Zellen spezifische mRNA fand sich tatsächlich selektiv
in den behandelten U-937 Zellen wieder, jedoch nur in sehr geringen Mengen (Daten nicht
gezeigt).
In weiteren Experimenten wurden die Phagozyten mit rekombinantem Annexin 1 anstelle
apoptotischer Zellen vorinkubiert. Stimulation primärer humaner DC mit LPS führte wie bei
den U-937 Zellen zu einem schnellen und vorübergehenden Anstieg der TNF mRNA, mit
einem Maximum ca. zwei Stunden nach Stimulation. In Anwesenheit von Annexin 1 waren
die Transkriptmengen zu jedem beobachteten Zeitpunkt reduziert, in dem gezeigten Experiment (Abb. III.5.C) um mehr als 50 %. Ebenso konnte eine Reduktion der induzierten IL-8
mRNA beobachtet werden (Abb. III.5.D). Ähnliche Experimente wurden mit vergleichbaren
Ergebnissen auch mit dem TLR2-Stimulus Pam3CSK4 durchgeführt (vgl. Abb. III.16.C und
Abb. III.17.E). In diesen Experimenten wurde vor der Inkubation mit Annexin 1 die LPS-inhibierende Substanz Polymyxin B zugegeben, um Endotoxin-Toleranz auszuschließen.
Um zu untersuchen, wie Annexin 1 das globale Transkriptionsprofil LPS-stimulierter humaner DC beeinflusst, wurden zwei unabhängige Genexpressionsanalysen (Microarrays)
durchgeführt. In einem Experiment betrug die Vorinkubationszeit mit Annexin 1 vier Stunden,
im anderen Fall wurden die DC zusätzlich über Nacht mit Annexin 1 inkubiert. Von einem Teil
der RNA wurde im Vorfeld cDNA synthetisiert, um die Suppression der mRNAs von TNF und
IL-1β zu beurteilen. Abb. III.6.A und B zeigen beispielhaft für eines der beiden Experimente,
dass die mRNAs dieser Zytokine durch Annexin 1 signifikant herunterreguliert waren. Dies
wurde als Kriterium verwendet, um für die restliche RNA das gesamte Transkriptionsprofil zu
analysieren. Ein weiteres Kriterium für die Verwendung der RNA für diese Zwecke war die
Annexin 1-abhängige Herunterregulation der Zytokine auf der Ebene der sezernierten Proteine in einem Experiment, das mit DC der gleichen Zellpräparation parallel durchgeführt
wurde (ELISA; Daten nicht gezeigt). Abb. III.6.C zeigt die Expressionsmuster verschiedener
proinflammatorischer Gene, wie sie mit Hilfe des Microarrays gemessen wurden. Gezeigt
sind die Ergebnisse für alle Gene, die sich (1.) unter den 20 durch LPS am höchsten induzierten mRNAs befanden und die (2.) bekanntermaßen DC-typische proinflammatorische
Zytokine oder – im Fall von Cyclooxygenase 2 (COX2) – Enzyme darstellen. Für alle Gene,
die diesen Kriterien entsprachen, ergab sich das gleiche Muster der Regulation (Abb. III.6.C):
Anwesenheit von Annexin 1 ohne weitere Stimulation für fünf Stunden oder über Nacht führte
zu einer schwachen Hochregulation, wobei dies nach Inkubation über Nacht noch ausge66
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
prägter war. Durch Stimulation mit LPS für eine Stunde wurde die Expression sehr stark erhöht. Diese Hochregulation war jedoch in Anwesenheit von Annexin 1 deutlich schwächer,
vor allem im Fall von IL-6, IL-1β, COX2, IL-23α, IL-1α und IL-12β. TNF und IL-8 waren weniger stark betroffen. Eine Wiederholung des Experiments lieferte ein vergleichbares Ergebnis
(Abb. III.6.D). Zwar war die Induktion der einzelnen Gene in beiden Experimenten (donorabhängig) unterschiedlich stark, jedoch konnte das Muster der Regulation durch Annexin 1 reproduziert werden.
Abb. III.6. Die transkriptionelle Inhibition durch Annexin 1 umfasst die wichtigsten LPS-induzierten
proinflammatorischen Gene.
A) 1,5· 106 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für 4 h oder über Nacht (üN) inkubiert und
für 1 h mit 1 ng/mL LPS stimuliert oder unbehandelt belassen. Aus einem Teil der gewonnenen RNA wurde cDNA
synthetisiert, und die Menge an induzierter TNF mRNA mittels quantitativer PCR bestimmt. B) Wie A, die Induktion der IL-1β mRNA wurde mittels quantitativer PCR gemessen. C) Wie A, ein Teil der gewonnenen RNA wurde
mit Hilfe eines Illumina Sentrix® Human Ref-8 Chips analysiert. Gezeigt sind die durch LPS am stärksten indu6
zierten proinflammatorischen Gene. D) In einem weiteren Experiment wurden 1,5· 10 primäre humane DC für 4 h
mit 5 µg/mL Annexin 1 inkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Nach quantitativer PCR-Analyse für einige Kontrollgene (analog zu A, B) wurde ein Teil der RNA für die Analyse in einem weiteren Illumina Sentrix ® Human
Ref-8 Chip verwendet.
Eine Diskrepanz mit den durch quantitative PCR erhaltenen Daten zeigte sich im Fall der
TNF mRNA. Diese zeigte sich im Microarray durch Annexin 1 nicht signifikant reduziert. Die
67
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Ursache für diesen Widerspruch ist unklar, jedoch wurde zur Klärung der widersprüchlichen
Ergebnisse in einem anderen Labor eine unabhängige quantitative PCR mit anderen Primern
sowie einer anderen Methode (Taqman PCR) durchgeführt. Hierbei ergab sich ebenfalls eine
mehr als 50-prozentige Herunterregulation der LPS-induzierten TNF mRNA (Christina
Falschlehner, persönliche Kommunikation). Für IL-1β stimmte der Chip mit der Kontrolle im
Regulationsmuster überein.
Insgesamt wurden etwa 120 Gene durch LPS mehr als zweifach induziert (blau in
Abb.III.7.A). Ein Teil dieser Gene war nach vorheriger Inkubation mit Annexin 1 vermindert
exprimiert, z.B. IL-1α, COX2, Pentraxin 3 (PTX3) und Early Growth Response 1 (Egr1).
Andere Gene waren nicht betroffen (z.B. NFKBIA, das Gen für IκBα), und eine weitere
Gruppe sogar verstärkt induziert (z.B. TRAF1) (Abb.III.7.B). Dieses Regulationsmuster war in
beiden Analysen weitgehend reproduzierbar. Ein auffälliger Unterschied zwischen den
beiden Analysen lag darin, dass LPS nur im gezeigten Fall – möglicherweise donorspezifisch
– zur Induktion von IFNβ und von IFN-abhängigen Genen wie CXCL10 (IP-10), IFNstimuliertem Gen 15 (ISG15) und weiteren (in Klammern in Abb.III.7.A) führte. In ähnlicher
Weise gehörten nur in der gezeigten Analyse bestimmte IFN-abhängige Gene (in Klammern
in Abb.III.7.B) zur durch Annexin 1 positiv regulierten Gruppe. Abgesehen davon war der
Einfluss von Annexin 1 auf LPS-regulierte Gene in beiden Analysen sehr ähnlich.
Interessant ist auch die durch Inkubation mit Annexin 1 selbst verursachte Genregulation
(Abb.III.7.C und Tabellen V.1. und V.2. im Anhang). Viele Gene waren in beiden Analysen
mit gleicher Tendenz reguliert. Reproduzierbar herunterreguliert waren z.B. Egr1, IL-8Rezeptor β (IL8RB) und CD14. Unter den induzierten Genen waren auch einige, die durch
LPS ebenfalls hochreguliert wurden, vor allem Zytokine und Chemokine wie IL-1β, IL-8, IL-6
und CCL20. Diese wurden durch Annexin 1 jedoch wesentlich schwächer beeinflusst als
durch LPS. Da die Genexpressionsanalysen nicht unter Verwendung der LPS-blockierenden
Substanz Polymyxin B durchgeführt wurden, muss in weiteren Experimenten geklärt werden,
ob das beobachtete Regulationsmuster ausschließlich durch Annexin 1 selbst hervorgerufen
wurde. Die Expressionsprofile nach (fünfstündiger) Annexin 1- und (einstündiger) LPSBehandlung sind zumindest nicht identisch, denn durch Annexin 1 wurden auch nicht LPSinduzierte Gene verstärkt exprimiert, z.B. Regulator of G-Protein Signalling 16 (RGS16),
CCR7 und SOCS2, während einige LPS-induzierte Gene wie Egr-1 durch Annexin 1 deutlich
herunterreguliert wurden (Abb.III.7.C). Ein Teil der Beobachtungen wurde zudem auch unter
Ausschluss von LPS-Effekten bestätigt: Die Induktion von TNF, IL-8 und IL-1β durch
Annexin 1 war in Anwesenheit von Polymyxin B bei einigen Spendern nicht mehr feststellbar,
bei anderen jedoch nach wie vor schwach vorhanden. Die Annexin 1-vermittelte Hemmung
der LPS-induzierten Expression dieser Gene ist auch unter Ausschluss von LPS-Effekten
deutlich (Abb. III.17.E und Daten nicht gezeigt).
68
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Insgesamt zeigt sich ein deutlicher negativ regulatorischer Einfluss von Annexin 1 auf die
Transkription proinflammatorischer Gene in LPS-stimulierten humanen DC. Die nach
Vorinkubation mit Annexin 1 selbst hochregulierten Gene umfassten einen Teil der LPSinduzierten Gene sowie weitere Transkripte. Zumindest ein Teil der beobachteten Effekte ist
somit auf die Aktivität von Annexin 1 selbst zurückzuführen, eine endgültige Klärung kann
jedoch nur eine Genexpressionsanalyse in Anwesenheit von Polymyxin B liefern.
g
A
Expression in LPS-stimulierter Probe
[willkürliche Einh.]
CCL3
TNF
104
Abb. III.7. Annexin 1 beeinflusst das
NFKBIA
IL1β
Transkriptionsprofil humaner DC.
CCL4
CCL20
IL-6
IL-8
6
1,5· 10
IL-1α
DUSP2
primäre humane DC wurden mit
5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für 4 h vorinku-
(ISG15)
IL-23α
CXCL2
Egr1
(IFNβ1)
COX2
3
10
biert und für 1 h mit 1 ng/mL LPS stimuliert
oder unbehandelt belassen. Gezeigt ist der
Einfluss von Annexin 1- bzw. LPS-Be-
SOCS2
(CXCL10)
handlung auf die Regulation aller signifikant
IFIT3
102
LPS
2
3
4
102
103
104
exprimierten
Gene
für
das
auch
in
Abb.III.6.D gezeigte Experiment. Die dia-
Expression in unstimulierter Probe [willkürliche Einh.]
B
Expression in Anx1/ LPS-stimulierter Probe
[willkürliche Einh.]
gonalen Linien zeigen Identität (fett) und
SOCS2
104
4
ISG20
NFKBIA
CCR7
EBI3
STAT1
RELB
(ISG15)
TNF
(IFIT3)
CCL20
TRAF1
IL-6
(IFI44L)
IL-8
ZFP36
DUSP2
IL23α
CCXL2
IL-1α
CD14
(CXCL10)
103
3
RGS16
TNC
IFNβ1
1022
IL-1β
Egr1
10 2
10 3
102
LPS
Anx1
COX2
PTX3
RGS18
10 4
103
104
Expression in LPS-stimulierter Probe [willkürliche Einh.]
zweifache Änderung (dünn) der Expression
nach oben und unten an. Vor allem im
rechten oberen Quadranten (stark exprimierte Gene) kann eine weniger als zweifache Änderung auch signifikant sein. Durch
LPS mehr als zweifach induzierte Gene
sind durch fettgedruckte blaue Punkte
markiert
und
beschriftet.
direkt
Durch
oder
LPS
mit
Pfeilen
weniger
als
zweifach induzierte sowie inhibierte Gene
sind durch einfache Punkte markiert und
C
Expression in Anx1-behandelter Probe
[willkürliche Einh.]
mit Linien versehen. Gene, die in der
ISG20
CCR7
TNFAIP2
DUSP5
unabhängigen Analyse nicht in der gleichen
DUSP1
Weise reguliert waren wie im gezeigten
(Mx1)
1044
Bcl3
Fall, sind in Klammern gesetzt.
(IFIT2)
IL1β
A) Gezeigt ist die Änderung der Genregula-
SOCS2
IL-6
3
103
CCL20
CD14
IL-8
unstimulierten DC. B) Gezeigt ist die Ände-
(CXCL10)
rung der Genregulation durch Annexin 1-
RGS16
10
tion durch LPS-Stimulation im Vergleich zu
22
IL-8RB
Anx1
Egr1
2
102
3
4
103
104
Expression in unstimulierter Probe [willkürliche Einh.]
Vorbehandlung im Vergleich zu mit einfacher LPS-Stimulation behandelten DC. C)
Gezeigt ist die Änderung der Genregulation
durch 5 h Annexin 1-Behandlung.
69
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
III.4. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen
Die Reduktion der mRNA-Expression TLR-induzierter Zytokingene durch Annexin 1 lässt
vermuten, dass bereits die TLR-induzierten Signalwege inhibiert werden. Eine Folge der
TLR-Stimulation ist die Aktivierung der MAP-Kinasen p38, JNK und Erk. Um zu beurteilen, ob
Annexin 1 diese beeinflusst, wurde die Phosphorylierung der MAP-Kinasen in Zelllysaten von
U-937 und humanen DC im Western Blot untersucht. Kinetiken zeigten, dass in beiden Zelltypen eine Stimulation mit LPS zu einem raschen Anstieg der Phosphorylierung von p38 und
JNK führt. Eine maximale Phosphorylierung wurde nach etwa 30 Minuten beobachtet. Eine
Phosphorylierung von Erk trat durch Stimulation mit den sehr gering gewählten LPS-Konzentrationen jeweils nicht auf (Abb. III.8.A, B).
Abb. III.8. LPS-Stimulation führt in U-937 Zellen und humanen DC zur Phosphorylierung von MAP-Kinasen.
A) 1,5· 106 PMA-differenzierte U-937 Zellen wurden für die angegebenen Zeitintervalle mit 10 ng/mL LPS stimuliert und anschließend lysiert. Die Phosphorylierung von Erk, p38 und JNK wurde mittels Western Blot analysiert.
6
B) 1· 10
primäre humane DC wurden für verschiedene Zeitintervalle mit 1 ng/mL LPS stimuliert und anschlie-
ßend lysiert. Die Analyse der Phosphorylierung von Erk, p38 und JNK erfolgte mittels Western Blot.
Zur Untersuchung des Effekts von Annexin 1 auf die LPS-induzierte Phosphorylierung
von MAP-Kinasen wurden U-937 Zellen in An- oder Abwesenheit von Annexin 1 für
30 Minuten mit verschiedenen LPS-Konzentrationen stimuliert. Dabei zeigte sich, dass die
Phosphorylierung von p38 und JNK in Anwesenheit von Annexin 1 leicht abgeschwächt war
(Abb. III.9.A, B).
70
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.9. Annexin 1 inhibiert die Phosphorylierung von p38 und JNK in U-937 Zellen.
A) Annexin 1 (Anx1) wurde an mit Phosphatidylserin beschichtete Zellkulturplatten gebunden. Nach 2 h wurden
6
PMA-differenzierte U-937 Zellen in die beschichteten Vertiefungen ausgesät. Nach weiteren 4 h wurden
1,5· 10
die Zellen mit den angegebenen LPS-Konzentrationen für 30 Minuten stimuliert. Die Lysate wurden im Western
Blot bezüglich der Phosphorylierung von p38 untersucht. B) Wie A, im Western Blot wurde die Phosphorylierung
der JNK Kinase analysiert.
Mit humanen DC ergab sich ein ähnliches Bild (Abb. III.10.). Aufgrund begrenzter Zellausbeuten konnte nicht in jedem Experiment die Phosphorylierung aller MAP-Kinasen untersucht werden. Von insgesamt acht unabhängigen Experimenten war in drei Fällen die
Phosphorylierung von p38 in Anwesenheit von Annexin 1 leicht reduziert. Dies war zu allen
untersuchten Zeitpunkten nach der Stimulation erkennbar (Abb. III.10.A). In zwei Experimenten zeigte sich eine sehr deutliche Reduktion der Phosphorylierung. In einem dieser
Fälle wurde auch die Phosphorylierung von JNK und Erk bestimmt, die ebenfalls reduziert
war (Abb. III.10.B). In drei Experimenten war im Western Blot keine Änderung durch
Annexin 1 sichtbar.
Abb. III.10. Annexin 1 inhibiert die Phosphorylierung von p38,
JNK und Erk in primären humanen DC.
6
A) 1· 10
primäre humane DC wurden mit 3 µg/mL Annexin 1 (Anx1)
über Nacht inkubiert und mit 1 ng/mL LPS für die angegebenen
Zeitintervalle stimuliert. Die Phosphorylierung von p38 wurde in den
Lysaten mittels Western Blot bestimmt. B) 1· 10
6
primäre humane
DC wurden mit 3 µg/mL Annexin 1 für 6 h vorinkubiert und für 30 min
mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Phosphorylierung der MAP Kinasen
p38, JNK (Pfeilspitzen) und Erk in den Lysaten wurde im Western
Blot analysiert.
71
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Eine leichte Reduktion der p38-Phosphorylierung wurde auch mit Raw264.7 Zellen
beobachtet (Abb. III.11.B oben). Die Ergebnisse ließen vermuten, dass Annexin 1 die Aktivierung von MAP-Kinasen hemmt, sie jedoch nicht vollständig verhindert. Da im Western Blot
die Hemmung in einigen Fällen schwer zu beurteilen war, wurde zur unabhängigen Bestätigung der Ergebnisse die Aktivität der p38 Kinase in Lysaten von Raw264.7 Zellen bestimmt.
Aktivitätsmessungen von Kinasen stellen den funktionell relevanten Parameter dar, und
ermöglichen eine sensitivere Messung, da jedes einzelne aktive Kinase-Molekül eine große
Menge an Substrat phosphorylieren kann. Zu diesem Zweck wurde die phosphorylierte
Kinase immunpräzipitiert und mit den Substraten ATP sowie ATF-2 inkubiert. Die Menge an
phosphoryliertem ATF-2 wurde im Western Blot bestimmt. Da nicht die gesamte p38 Kinase,
sondern nur die phosphorylierte Form präzipitiert wurde, war es nicht möglich, eventuelle
beim Waschen der Präzipitate entstandene Verluste an aktiver Kinase durch Detektion der in
den einzelnen Proben noch enthaltenen Gesamtmenge an p38 zu beurteilen. Um eine Ladekontrolle zu erhalten, wurde den Lysaten daher ein biotinylierter Antikörper (DAC5-Biotin)
sowie an Agarose-Kügelchen gekoppeltes Streptavidin zugegeben (Abb. III.11.A).
Abb. III.11. Annexin 1 senkt die LPS-induzierte
Aktivität der p38 Kinase in Raw 264.7 Zellen.
A) Prinzip der Kinase-Aktivitätsmessung mit Ladekontrolle. Aus den stimulierten Zelllysaten wurde die
phosphorylierte Kinase mit Hilfe von an Agarose gekoppeltem Anti-Phospho-p38 Antikörper präzipitiert.
Die Aktivität der isolierten Kinase wurde anhand der
ATP-abhängigen Phosphorylierung des Substrats
ATF-2 analysiert. Phosphoryliertes ATF-2 wurde im
Western Blot quantifiziert. Als Ladekontrolle diente ein
System aus Streptavidin-Agarose und einem biotinylierten Antikörper (DAC5). Dieser wurde durch spezifische Bindung des Biotin an das an Agarose gekoppelte Streptavidin präzipitiert und konnte mittels
Streptavidin-HRP im Western Blot quantifiziert werden.
6
B) 4· 10
Raw 264.7 Zellen wurden mit 4 µg/mL
Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und für die
angegebenen Zeitintervalle mit 5 ng/mL LPS stimuliert. Ein Teil der Lysate wurde für die Bestimmung
von Phospho-p38 im Western Blot verwendet (WB).
Aus einem Teil der Lysate wurde die phosphorylierte
p38 Kinase präzipitiert und ihre Aktivität anhand der
Phosphorylierung von ATF-2 wie in A beschrieben im
Western Blot ermittelt (KA).
72
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Der Verlust an präzipitertem biotinyliertem Antikörper entspricht dem Verlust an phosphorylierter Kinase und kann im Western Blot durch Detektion mit Streptavidin-HRP quantifiziert
werden. Zwei von drei unabhängigen Experimenten mit diesem System zeigten eine
Reduktion der p38 Kinase-Aktivität. Die Kinase-Aktivitätsmessung war dabei jeweils deutlich
sensitiver als die Quantifizierung der phosphorylierten Kinase im Western Blot (Abb. III.11.B).
Insgesamt weisen die Ergebnisse auf eine Hemmung der Aktivität von MAP-Kinasen
durch Annexin 1 hin. Am besten wurde dies bislang für p38 untersucht. Das Ausmaß der
Hemmung war jedoch variabel und die Reduktion war im Durchschnitt nicht größer als
30-40 %.
III.5. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivität von NF-κB
Neben MAP-Kinasen wird TLR-abhängig auch der Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert.
Dieser spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Expression proinflammatorischer
Zytokingene. Um den Einfluss von Annexin 1 auf diesen Prozess zu beurteilen, wurde zunächst im Western Blot der Effekt auf die Phosphorylierung und Degradation von IκBα im
Western Blot bestimmt. Dabei zeigte sich jedoch, dass bei den verwendeten geringen LPSKonzentrationen keine signifikante Änderung dieser Parameter zu beobachten war (Daten
nicht gezeigt). Vermutlich war wie im Fall der Erk-Phosphorylierung (Abb. III.8.) die Methode
nicht sensitiv genug zur Erfassung geringer Unterschiede. Eine sensitivere Methode zur Bestimmung der NF-κB-Aktivität stellen Experimente mit NF-κB Reporterplasmiden dar. Hierfür
wurde die Zelllinie Raw264.7 verwendet. Im Gegensatz zu humanen DC konnte diese
Zelllinie relativ effizient mit einem Reporterplasmid transfiziert werden, das Firefly-Luziferase
unter einem NF-κB-abhängigen Promoter exprimiert. Mit GFP-Reporterplasmiden wurde in
Vorversuchen beobachtet, dass die erreichte Transfektionseffizienz bei etwa 30 % lag. Mit
anderen Transfektionsreagenzien wurde aufgrund der generellen Schwierigkeiten bei der
Transfektion von Makrophagen (Dokka et al. 2000) noch geringere Effizienzen erreicht. Zur
Normierung der NF-κB-induzierten Luziferase-Aktivität auf die Transfektionseffizienz wurde
ein Plasmid kotransfiziert, das Renilla-Luziferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven
Promotors kodiert. Nach der Transfektion wurden die Zellen in An- oder Abwesenheit von
Annexin 1 oder apoptotischen humanen Neutrophilen inkubiert und mit LPS für acht Stunden
stimuliert. Messung der NF-κB-induzierten Luziferase-Aktivität in den Lysaten ergab, dass
diese in Anwesenheit von Annexin 1 oder apoptotischen Zellen um etwa 50 % reduziert war
(Abb. III.12.). Die gezeigten Daten sind repräsentativ für zwei von vier Experimenten. In den
anderen beiden Fällen war die Inhibition weniger ausgeprägt. Unterschiede im Ausmaß der
Inhibition sind möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die Reaktivität der Zellen gegenüber den verwendeten LPS-Konzentrationen schwankte. Bei zu hoher Stimulation ist eine
Inhibition der Signaltransduktion erschwert.
73
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Insgesamt erkennt man jedoch eine deutliche Reduktion der LPS-induzierten NF-κB-Aktivität durch Annexin 1 in Raw264.7 Zellen.
Abb. III.12. Apoptotische Zellen und Annexin 1 inhibieren die Aktivität von NF-κB in der Zelllinie Raw 264.7
5· 105 Raw 264.7 Zellen, die mit dem NF-κB Reporterplasmid pTATA-Luc 4 x NF-κB sowie dem Kontrollplasmid
pGL4.74[hRluc/TK] transient transfiziert waren, wurden mit apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) im Verhältnis 5:1
oder mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für 6 h vorinkubiert. Dann wurden sie mit den angegebenen LPSKonzentrationen für 8 h stimuliert und anschließend lysiert. Die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB wurde
luminometrisch analysiert. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von Triplikaten an.
III.6. Annexin 1 inhibiert den MyD88- und den TRIF-abhängigen Weg
Die Stimulation von TLR führt zur Aktivierung von Signaltransduktionsvorgängen, die
durch Bindung verschiedener Adaptormoleküle an den Rezeptor eingeleitet werden. Man
unterscheidet MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege. Im Fall der Stimulation mit LPS
werden beide Adaptoren gebunden (Yamamoto et al. 2003; Hoebe et al. 2003). Eine Hemmung der Produktion von Zytokinen wie TNF sowie der Signaltransduktion von MAP-Kinasen
und NF-κB kann aus der Inhibition jedes der beiden Signalwege resultieren. Um zu analysieren, welcher der beiden Wege durch Annexin 1 reguliert wird, wurden mehrere Wege beschritten.
Zum einen wurde die Sekretion des Chemokins IP-10 nach LPS-Stimulation bestimmt.
Dieses gehört zu einer Gruppe von Zytokinen, die im Falle einer TLR4-Stimulation nur von
der Aktivität des TRIF-abhängigen Signalwegs abhängen. Andere Zytokine wie TNF, IL-6
oder IL-1 sind dagegen von beiden Adaptoren abhängig (Yamamoto et al. 2003). Vorinkubation humaner DC mit apoptotischen Neutrophilen (Abb. III.13.A) oder Annexin 1 (Abb.
III.13.B) führte zu einer Verminderung der IP-10 Sekretion. Wie im Fall von TNF betrug die
Reduktion je nach Experiment 30 bis 80 %. Dies weist auf eine Beteiligung des TRIF-Signalwegs hin.
74
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.13. Annexin 1 beeinflusst die Sekretion des MyD88-unabhängigen Zytokins IP-10 nach LPS-Stimulation.
A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) in den angegebenen Verhältnissen
für 6 h vorinkubiert und anschließend mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Konzentration des sezernierten MyD88unabhängigen Zytokins IP-10 wurde im ELISA bestimmt. B) 1· 10
5
primäre humane DC wurden mit den angege-
benen Konzentrationen an löslichem Annexin 1 (Anx1) über Nacht vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert.
Die Konzentration des sezernierten IP-10 wurde im ELISA ermittelt.
Eine weitere Möglichkeit, die Beteiligung des TRIF-Signalwegs zu beurteilen, ist die Verwendung des TLR3-Stimulus Poly(I:C). Dieser führt in humanen DC nicht zu einer signifikanten Sekretion von TNF, jedoch zu hoher IP-10-Sekretion. Diese war in Anwesenheit von
Annexin 1 stark reduziert (Abb. III.14.A). Da TLR3 ausschließlich den Adaptor TRIF bindet,
zeigt dies ebenso eine Interferenz der Annexin 1-Signaltransduktion mit diesem Signalweg.
Andere Rezeptoren führen nur zur Aktivierung MyD88-abhängiger Signaltransduktion.
Ein Beispiel ist TLR2. In Heterodimeren mit TLR1 bzw. TLR6 erkennt dieser Rezeptor bakterielle tri- bzw. di-acylierte Lipopeptide bzw. deren synthetische Analoga Pam3CSK4 und
Pam2CSK4. Eine Vorinkubation mit Annexin 1 konnte auch die TLR2-vermittelte TNF-Sekretion signifikant inhibieren (Abb. III.14.B). Ein weiterer Rezeptor, der ausschließlich einen
MyD88-abhängigen Signalweg aktiviert, ist der mit den TLR verwandte IL-1 Rezeptor.
Stimulation humaner DC mit IL-1 alleine führte nur zu einer sehr geringen Sekretion von TNF
(Abb.
III.14.C)
und
anderen
Zytokinen
(Daten
nicht
gezeigt).
Die
gemessenen
Zytokinkonzentrationen lagen in einem Bereich, der in der Nähe der Detektionsgrenze des
ELISA lag und in dem folglich nicht von exakten Messwerten ausgegangen werden kann.
Daher wurde der Kultur gleichzeitig mit dem IL-1-Stimulus das synergistisch wirkende Zytokin
IFNγ zugesetzt. IFNγ-Stimulation alleine bewirkt keine Sekretion von TNF, erhöht aber die
IL-1 induzierte Sekretion (Sizemore et al. 2004; Abb. III.14.C). Die durch derartige Stimulation hervorgerufene TNF-Sekretion wurde durch Annexin 1 inhibiert. Auch die durch Synergismus mit IFNγ erhöhte LPS-induzierte TNF-Sekretion wurde durch Annexin 1 reduziert
(Abb. III.14.C). Die Hemmung der durch TLR2 und den IL-1 Rezeptor ausgelösten Effekte
durch Annexin 1 in humanen DC lässt darauf schließen, dass auch die MyD88-abhängige
Signaltransduktion inhibiert wird.
75
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.14. Annexin 1 hemmt die Signaltransduktion rein MyD88-abhängiger sowie rein TRIF-abhängiger
Rezeptoren.
A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit den angegebenen Annexin 1 (Anx1)-Konzentrationen über Nacht
vorinkubiert und mit 5 µg/mL des TLR3 Liganden Poly(I:C) stimuliert. Nach 16 h wurde die Konzentration von IP5
10 in den Überständen mittels ELISA gemessen. B) 1· 10 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1
über Nacht inkubiert und mit TLR2 Stimuli (3 ng/mL Pam2CSK4 bzw. 9 ng/mL Pam3CSK4) für weitere 16 h
5
stimuliert. Die TNF-Sekretion wurde im ELISA analysiert. C) 1· 10 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL
Annexin 1 über Nacht vorinkubiert und mit 100 ng/mL IL-1 bzw. 1 ng/mL LPS in An- oder Abwesenheit von 100
U/mL IFNγ stimuliert. Die Konzentration des sezernierten TNF wurde 16 h später mittels ELISA bestimmt.
Im murinen System eröffnet die Verfügbarkeit von MyD88-defizienten Mäusen (Adachi et
al. 1998; Kawai et al. 1999) eine weitere Möglichkeit, die Effekte auf den TRIF-Signalweg
gesondert zu untersuchen. MyD88-defiziente Mäuse können bestimmte (MyD88-abhängige)
Zytokine nicht sezernieren, darunter TNF und IL-6. Daher wurde das TRIF-abhängige
Chemokin MCP-1 im ELISA bestimmt. Annexin 1 reduzierte die durch Poly(I:C) oder LPS
induzierte Sekretion von MCP-1 in MyD88 defizienten Mäusen in vergleichbarem Ausmaß
wie im Wildtyp (Abb. III.15.A, B). Dies zeigt auch im Maussystem einen Effekt von Annexin 1
auf den TRIF-abhängigen Signalweg.
Insgesamt zeigen mehrere unabhängige Befunde, dass Annexin 1 sowohl MyD88- als
auch TRIF-abhängige Signalwege der TLR inhibiert.
76
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.15. Annexin 1-vermittelte Effekte treten auch in Abwesenheit des MyD88-abhängigen Signalwegs
auf.
5
A) 1· 10 primäre murine DC aus C57/BL6 Wildtyp-Mäusen wurden für 6 h mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1)
vorinkubiert und mit 5 µg/mL Poly(I:C) bzw. 3 ng/mL LPS stimuliert. Die Konzentration des sezernierten
Chemokins MCP-1 wurde 16 h später im ELISA gemessen. B) Wie A, hier wurden primäre murine DC aus
MyD88-defizienten Mäusen verwendet.
III.7. Annexin 1 inhibiert die Signaltransduktion des TNF-Rezeptors
Die Signalwege von TLR und dem verwandten IL-1-Rezeptor weisen große Ähnlichkeiten
hinsichtlich der Initiation der Signaltransduktion auf und bewirken in ähnlicher Weise eine
Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB. Eine Stimulation des TNF-Rezeptors führt ebenfalls zur Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen. Hinsichtlich der Initiation der
Signaltransduktion gibt es jedoch Unterschiede zwischen den TLR und dem TNF-Rezeptor
(vgl. Abb.I.1. und III.16.A). Zwar spielen die Proteine RIP1 und TRADD sowohl im TNFRezeptor-Signalweg als auch im TRIF-abhängigen Arm der TLR-Signaltransduktion eine
Rolle (Chen et al. 2008; Ermolaeva et al. 2008; Pobezinskaya et al. 2008), TNF-Rezeptoren
binden jedoch nicht an die TLR-typischen Adaptoren MyD88 und TRIF, und auch weitere
wichtige Schritte wie die Aktivierung der IRAKs spielen keine Rolle. Anstelle von TRAF6 hat
in
der
TNF-Signaltransduktion
TRAF2
eine
wichtige
Funktion.
Aufgrund
dieser
unterschiedlichen Initiation ähnlicher proinflammatorischer Effekte bot die Untersuchung
TNF-induzierter
Signaltransduktion
eine
weitere
Möglichkeit,
Hinweise
auf
den
Wirkmechanismus von Annexin 1 zu erhalten. Hierfür wurde die Induktion verschiedener
proinflammatorischer mRNAs in humanen DC nach TNF-Stimulation in An- und Abwesenheit
von Annexin 1 mittels quantitativer PCR bestimmt. Die Messung auf RNA-Ebene wurde
gewählt, da die Mengen an sezernierten Zytokinen wie TNF und IL-8 nach TNF-Stimulation
bei humanen DC spenderabhängig oft unterhalb der Detektionsgrenze des ELISAs lagen
(Daten nicht gezeigt). Bei Stimulation mit in der Literatur häufig verwendeten TNFKonzentrationen von 10-50 ng/mL wurde die Synthese bzw. Stabilität der durch TNF
induzierten TNF und IL-8 mRNA durch Vorinkubation mit Annexin 1 nicht unterdrückt. In
77
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
diesen Konzentrationen war jedoch die Stimulation der Zellen bereits im Sättigungsbereich
(Daten nicht gezeigt). In Experimenten mit geringer Stimuluskonzentration im Bereich 0,25
bis 2 ng/mL konnte jedoch ein inhibitorischer Effekt beobachtet werden (Abb. III.16.B), der
mit den nach TLR-Stimulation erhaltenen Resultaten vergleichbar war (Abb. III.16.C).
Daraus wird ersichtlich, dass Annexin 1 nicht ausschließlich die TLR-Signaltransduktion
inhibiert, sondern auch die Stimulierbarkeit mit proinflammatorischen Zytokinen wie TNF
reduziert.
Abb.
III.16.
Annexin 1
inhibiert
die
durch
das
proinflammatorische
Zytokin
TNF
vermittelte
Zytokininduktion.
A) Die Signaltransduktion von TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) unterscheidet sich in den rezeptornahen Abschnitten
stark von der TLR-Signaltransduktion. Nach Rekrutierung von TRADD binden RIP1 und TRAF2, wodurch es zur
TRAF2-vermittelten Ubiquitinierung (Ub.) von RIP1 kommt. Dies ist die Voraussetzung für die nachfolgende
Aktivierung proinflammatorischer Signalwege. Die Signaltransduktion von TLR4 weist sowohl Ähnlichkeiten
(orange) als auch Unterschiede zur TNF-induzierten Signaltransduktion auf. Insbesondere gibt es Unterschiede in
den rezeptornahen Abschnitten und in der Verwendung unterschiedlicher TRAFs (orange umrandet).
5
B, C) 3· 10 primäre humane DC wurden in Anwesenheit von Polymyxin B mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht
inkubiert und mit den angegebenen Konzentrationen an humanem TNF für 1 h (B) bzw. mit 4 ng/mL Pam3CSK4
für 3 h (C) stimuliert. Die Induktion der TNF mRNA wurde mittels quantitativer PCR untersucht.
78
III. Ergebnisse
III.8.
Andrea Mahr
Die Annexin 1-vermittelte Suppression ist an eine Proteinsynthese
gekoppelt
Neben der Beeinflussung proinflammatorischer Signaltransduktion sind auch die unmittelbaren Effekte von Interesse, die Annexin 1 in der Zelle induziert und über die in der Folge
der antiinflammatorische Zustand der DC erreicht wird. Diese Fragestellung zielt in letzter
Instanz auf den Rezeptor für Annexin 1 sowie dessen Signaltransduktion ab. Ob die
beschriebenen Annexin 1-Rezeptoren der Neutrophilen – der FPR und seine Homologen
(Walther et al. 2000; Perretti et al. 2001; Ernst et al. 2004) – im Fall von DC diese Funktion
ausüben, ist noch unklar. Bislang gaben zumindest Experimente mit spezifischen Inhibitoren
des FPR und seiner Homologen keine Hinweise darauf, denn diese konnten den antiinflammatorischen Effekt von Annexin 1 nicht aufheben (Daten nicht gezeigt). Auch die unmittelbaren intrazellulären Effekte von Annexin 1 nach Rezeptorbindung sind noch unbekannt.
Western Blot-Experimente zur Untersuchung der Aktivierung verschiedener bekannter Inhibitoren der TLR-Signaltransduktion verliefen negativ. Untersucht wurden im Einzelnen die
Phosphorylierung von Akt und GSK3β, die Induktion von SOCS1 und SOCS3 sowie die
Phosphorylierung von STAT3. Letztere wurde zwar durch die verwendeten Annexin 1-Präparationen induziert, dies wurde jedoch durch Zugabe von Polymyxin B verhindert und war daher auf verunreinigendes LPS zurückzuführen (Daten nicht gezeigt). Obwohl nicht ausgeschlossen ist, dass bei der Wahl anderer experimenteller Bedingungen eventuell Effekte
sichtbar würden, gibt es dennoch zur Zeit keinerlei Anhaltspunkte für eine Beteiligung der
genannten Faktoren (Daten nicht gezeigt).
Möglicherweise
beinhaltet
der
Wirkmechanismus
von
Annexin 1
die
Synthese
antiinflammatorisch wirkender Proteine, die die Signaltransduktion entweder intrazellulär
inhibieren, oder sezerniert werden und die Zelle dann autokrin beeinflussen. Erste Hinweise
darauf lieferten Kinetiken, bei denen apoptotische Zellen bzw. Annexin 1 für verschieden
lange Zeitintervalle vor der TLR-Stimulation mit humanen DC inkubiert wurden. Im Fall der
apoptotischen Neutrophilen war eine Hemmung der TNF-Sekretion zwar selbst bei Zugabe
unmittelbar vor der LPS-Stimulation erkennbar, die Hemmung war jedoch ausgeprägter,
wenn die DC für vier oder zehn Stunden mit den apoptotischen Zellen vorinkubiert wurden
(Abb. III.17.A). Dies weist darauf hin, dass bei dem Suppressionsmechanismus apoptotischer
Zellen zumindest teilweise längerfristige Prozesse eine Rolle spielen, die eine Proteinsynthese beinhalten könnten. Im Fall von Annexin 1 war die Vorinkubationszeit noch wichtiger.
Vor allem im Fall der humanen DC wurde nur bei Inkubation über Nacht ein deutlicher und
reproduzierbarer Hemmeffekt beobachtet. Bei kürzerer Inkubation war der Effekt nur
schwach ausgeprägt oder nicht vorhanden (Abb. III.17.B).
79
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Um die mögliche Beteiligung einer Proteinsynthese weiter zu analysieren, wurde die
Translation durch Zugabe von Cycloheximid inhibiert. Die verwendete Cycloheximid-Konzentration von 10 µg/mL verhinderte die Sekretion von durch 10 ng/mL LPS induziertem TNF
und IL-8 vollständig (Daten nicht gezeigt), somit war die Translation effizient gehemmt. Sollte
Annexin 1 seinen Effekt durch die Induktion einer Proteinsynthese vermitteln, so wäre in
Anwesenheit des Inhibitors eine Aufhebung des hemmenden Effekts zu erwarten. Gemessen
wurde die Menge der induzierten TNF mRNA (Abb. III.17.C-F). Während Annexin 1 ohne
vorherige Zugabe von Cycloheximid die Induktion der TNF mRNA durch LPS unterdrückte
(Abb. III.17.C), kam es in Anwesenheit von Cycloheximid bei DC der gleichen Präparation
nach Vorinkubation mit Annexin 1 zu einer gesteigerten Produktion der RNA durch den LPSStimulus (Abb. III.17.D). Diese Superinduktion war in manchen Fällen noch wesentlich
ausgeprägter als in dem gezeigten Experiment. Der Effekt wurde durch den Inhibitor somit
nicht nur aufgehoben, sondern überraschenderweise sogar umgekehrt.
Überraschend war weiterhin, dass in Anwesenheit von Cycloheximid die Inkubation mit
Annexin 1 allein über Nacht bereits zu einer hohen Expression der TNF mRNA führte. Cycloheximid allein hatte dagegen allenfalls eine sehr schwache Erhöhung der TNF mRNA zur
Folge. Diese Befunde konnten mit U-937 Zellen reproduziert werden (Daten nicht gezeigt).
Äquivalente Experimente wurden auch in Anwesenheit von Polymyxin B unter Verwendung
des TLR2-Liganden Pam3CSK4 durchgeführt, um Artefakte durch Endotoxin-Toleranz auszuschließen. Auch in diesen Experimenten ergab sich ein vergleichbares Resultat
(Abb.III.17.E, F).
Ein Problem bei der Verwendung von Translationsinhibitoren in Experimenten mit TLRStimulation ist die Superinduktion bestimmter Zytokin-mRNAs in Anwesenheit des Inhibitors,
die die Interpretation der Daten erschwert. Im verwendeten System wurde die LPS-induzierte
TNF mRNA durch Cycloheximid in einigen Fällen leicht erhöht, in anderen Fällen war sie
nicht beeinflusst (Abb. III.17.C, D). Im Fall der Stimulation mit Pam3CSK4 war die Steigerung
der TNF mRNA Synthese durch Cycloheximid wesentlich ausgeprägter (Abb.III.17.E, F).
Ein denkbarer Grund für die Superinduktion könnte sein, dass IκB-Proteine nach der
TLR-induzierten Degradation infolge der Translationsinhibition nicht mehr neusynthetisiert
werden und dadurch die NF-κB-Aktivität steigt. Im Western Blot wurde allerdings im Fall
humaner DC selbst nach 24-stündiger Inkubation mit 10 µg/mL Cycloheximid keine Reduktion von IκBα festgestellt. Wurden die Zellen zusätzlich mit 1 ng/mL LPS stimuliert, so war
ebenfalls, unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Cycloheximid, keine Änderung der
IκBα-Menge feststellbar (Daten nicht gezeigt). Ein deutlicher Effekt von Cycloheximid zeigte
sich jedoch im Western Blot auf die Phosphorylierung der p38 Kinase, die in Anwesenheit
des Inhibitors innerhalb weniger Minuten stark anstieg und auch nach 20-stündiger Inkubation noch unverändert hoch war (Daten nicht gezeigt).
80
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Abb. III.17. Die durch apoptotische Zellen bzw. Annexin 1 vermittelten Effekte sind abhängig von Proteinsynthese.
A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 5· 105 apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) für die angegebenen Zeitintervalle vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS über Nacht stimuliert. Die Konzentration des Zytokins TNF wurde im
5
ELISA ermittelt. B) 1· 10 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für die angegebenen Zeitin-
tervalle vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS über Nacht stimuliert. Die Konzentration des Zytokins TNF wurde im
5
ELISA ermittelt. C) 4· 10 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht vorinkubiert und für 2 h
mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Induktion der TNF mRNA wurde in den Lysaten mittels quantitativer RT-PCR
untersucht. D) Wie C, zur gleichen Präparation humaner DC wurde kurz vor der Inkubation mit Annexin 1 Cyclo5
heximid (10 µg/mL) zu den Zellen gegeben. E) 4· 10 primäre humane DC wurden in Anwesenheit von Polymyxin
B mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht vorinkubiert und für 3 h mit 4 ng/mL Pam3CSK4 stimuliert. Die Induktion der
TNF mRNA wurde in den Lysaten mittels quantitativer RT-PCR untersucht. F) Wie E, zur gleichen Präparation
humaner DC wurde kurz vor Inkubation mit Annexin 1 Cycloheximid (10 µg/mL) zu den Zellen gegeben.
81
III. Ergebnisse
Andrea Mahr
Die Effekte des Inhibitors auf die TLR-induzierten Zytokin-mRNAs selbst liegen somit
eventuell an einer Aktivierung der p38 Kinase und stellen einen unvermeidlichen Störfaktor
dar. Zusammenfassend lässt sich dennoch schlussfolgern, dass Translationsinhibition den
hemmenden Effekt von Annexin 1 ins Gegenteil umkehrt, was auf die Beteiligung einer Proteinsynthese hindeutet. Die Induktion proinflammatorischer mRNAs durch Annexin 1 selbst
unter den Bedingungen einer Translationsinhibition ist ein Befund, dessen Ursache noch der
Klärung bedarf.
82
IV. Diskussion
Andrea Mahr
IV. Diskussion
Wenn DC Antigene in Form apoptotischer Zellen aufnehmen, kommt es in vivo zur Etablierung peripherer Toleranz (Hugues et al. 2002; Ferguson et al. 2002; Liu et al. 2002a). In
vitro spiegelt sich dies in einer verminderten Stimulierbarkeit der DC durch proinflammatorische Stimuli wie TLR-Liganden wider, die sich in verminderter Zytokinsekretion,
Hochregulation von Aktivierungsmarkern und Fähigkeit zur T-Zell-Stimulation äußert (Stuart
et al. 2002; Williams et al. 2008; Weyd 2005; Dörner 2007). Der antiinflammatorische Effekt
wird durch Moleküle auf der Oberfläche apoptotischer Zellen vermittelt, von denen bislang
nur wenige beschrieben sind. Es gibt Hinweise auf eine Rolle des ThrombospondinRezeptors CD36 (Voll et al. 1997; Urban et al. 2001), auf die C3bi-bindenden
Komplementrezeptoren CR3 (CD11b/CD18) und CR4 (CD11c/CD18) (Skoberne et al. 2006),
sowie auf Phosphatidylserin (Huynh et al. 2002 ; Kim et al. 2004 ; Ramos et al. 2007 ; Park
et al. 2008) und Phosphatidylserin-bindende Proteine wie Gas6, das an die MerTyrosinkinase der DC bindet (Sen et al. 2007). In unserem Labor wurde als neues
antiinflammatorisches Molekül auf der Oberfläche frühapoptotischer Zellen Annexin 1
identifiziert, das ebenfalls an Phosphatidylserin bindet (Weyd 2005; Dörner 2007). In einem
anderen Kontext wurde es bereits als antiinflammatorisch beschrieben, vor allem als
Vermittler der Glukokortikoid-Wirkung und als Inhibitor der Extravasation von Neutrophilen
(Übersicht in Parente & Solito 2004; Lim & Pervaiz 2007). Zusätzlich wurde es auf
apoptotischen Zellen als „Eat-me“-Signal beschrieben (Arur et al. 2003), was jedoch in
unserem Labor nicht bestätigt werden konnte (Weyd 2005). Vielmehr wurde ein suppressiver
Effekt auf DC nachgewiesen (Weyd 2005; Dörner 2007). In dieser Arbeit konnte gezeigt
werden,
dass
Annexin 1
ein
tolerogenes
Signal
an
DC
übermittelt,
indem
es
proinflammatorische Signaltransduktionswege hemmt. Durch eine Inhibition der TLRinduzierten Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB kommt es zu einer verminderten
mRNA-Expression und Sekretion proinflammatorischer Zytokine. Der hemmende Effekt
beruht vermutlich auf einer Annexin 1-induzierten Proteinsynthese und betrifft sowohl den
MyD88- als auch den TRIF-abhängigen Signalweg der TLR sowie auch TNF-induzierte
Signaltransduktionsprozesse.
IV.1. Apoptotische Zellen und Annexin 1 inhibieren die Sekretion proinflammatorischer Zytokine in DC
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass apoptotische Jurkat-T-Zellen sowie apoptotische
Neutrophile die LPS-induzierte TNF-Sekretion in U-937 Zellen (Abb.III.2.A) und primären
humanen DC (Abb. III.2.E) hemmen. Differenzierte U-937 Zellen können apoptotische Zellen
phagozytieren und reagieren auf LPS mit Zytokinsekretion sowie Expression von Aktivie83
IV. Diskussion
Andrea Mahr
rungsmarkern auf der Oberfläche. Die Fähigkeit zur T-Zell-Aktivierung ist jedoch wesentlich
geringer ausgeprägt als bei primären DC. Diese Eigenschaften erlauben eine Verwendung
der Zelllinie als DC-Modell (Dörner 2007). Die IL-10 Sekretion der U-937 Zellen ist im
Gegensatz zu TNF nicht beeinflusst (Abb. III.2.C). In humanen DC ist ein Einfluss auf IL-10
nicht zu beurteilen, denn diese produzierten im hier verwendeten System keine signifikanten
Mengen dieses Zytokins. Dies könnte zumindest teilweise an der Anwesenheit von IL-4 im
Differenzierungsmedium liegen, das die IL-10 Produktion in DC hemmt (Yao et al. 2005).
Die differenzielle Beeinflussung von TNF und IL-10 weist auf einen spezifischen negativ
regulatorischen Effekt auf proinflammatorische Mediatoren hin. Es handelt sich also nicht um
ein unspezifisches Abschalten der phagozytierenden Zellen. Auch eine Apoptose-Induktion
ist ausgeschlossen, was zusätzlich durch Messung von Apoptose-Markern im FACS bestätigt
wurde (Daten nicht gezeigt). Zudem ist der Effekt spezifisch für apoptotische Zellen, denn im
Gegensatz zu den UV-behandelten apoptotischen Zellen zeigten J16 Zellen, die durch 20minütige Inkubation bei 55°C nekrotisch gemacht wurden, in dem verwendeten System keine
antiinflammatorischen Effekte auf primäre humane DC (Heiko Weyd, persönliche Kommunikation).
Das gleiche Muster der Regulation von TNF und IL-10 wurde auch bei Verwendung von
Annexin 1 anstelle apoptotischer Zellen beobachtet (Abb. III.2.B, D, F). Die verwendeten
Annexin 1-Konzentrationen
im
einstelligen
µg/mL-Bereich
entsprechen
mit
hoher
Wahrscheinlichkeit Konzentrationen, die in vivo auftreten können. So liegt der Annexin 1Gehalt apoptotischer Zellen in der Größenordnung von etwa 2 µg pro Million Zellen (Dörner
2007). Apoptotische Zellen und Annexin 1 hemmen auch die Sekretion von IL-8, IL-6 und IP10 (Abb.III.4.B, C; Abb.III.12., III.13, und Daten nicht gezeigt). Auch in murinen Raw264.7
Zellen sowie primären murinen DC wird die Sekretion von Zytokinen und Chemokinen wie
TNF (Abb.III.3) sowie MCP-1 (Abb.III.14.) unterdrückt. Im murinen System ist die Produktion
von IL-10 ebenfalls negativ reguliert, wohingegen IL-13 durch die Vorbehandlung
unbeeinflusst bleibt (Dörner 2007). Insgesamt beeinflussen Annexin 1 und apoptotische Zellen die Zytokinproduktion von Phagozyten in ähnlicher Weise. Dies ist eine Indikation für eine
Rolle von Annexin 1 bei der Vermittlung des antiinflammatorischen Effekts. Die endgültige
Verbindung zwischen dem hemmenden Effekt apoptotischer Zellen und dem Protein
Annexin 1 auf ihrer Oberfläche stellt z.B. die Blockierung des Effekts durch Annexin 1spezifische Antikörper dar. Dies wurde für das murine System bereits gezeigt (Dörner 2007).
Diese Daten sind im Einklang mit einem Großteil der Publikationen zum Einfluss apoptotischer Zellen auf die Zytokinproduktion von DC (Urban et al. 2001 ; Stuart et al. 2002 ;
Williams et al. 2008) und anderen Phagozyten (Voll et al. 1997; Fadok et al. 1998; McDonald
et al. 1999 ; Huynh et al. 2002), und ergänzen sie um die Reproduzierbarkeit mit Annexin 1.
Vor allem in murinen und humanen Makrophagen wurde beschrieben, dass apoptotische
84
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Zellen auch zu einer Induktion antiinflammatorischer Mediatoren wie TGFβ führen, die für die
Suppression der proinflammatorischen Zytokine verantwortlich sind (Fadok et al. 1998;
McDonald et al. 1999 ; Huynh et al. 2002). In humanen DC wurde jedoch beobachtet, dass
TGFβ und IL-10 keine Rolle bei der Vermittlung des Effekts spielen (Stuart et al. 2002). Auch
mit den nach unserem Protokoll generierten humanen DC wurde keine erhöhte Produktion
von TGFβ nach Inkubation mit apoptotischen Zellen festgestellt (Daten nicht gezeigt und
Weyd, persönliche Kommunikation). Für das Signal apoptotischer Zellen wurde eine Kreuzreaktivität zwischen verschiedenen Spezies beobachtet (Cvetanovic et al. 2006). In Übereinstimmung damit wurde im hier verwendeten System ebenfalls eine Kreuzreaktivität des humanen Signals im murinen System gefunden, sowohl für apoptotische Neutrophile als auch
für Annexin 1 (Abb. III.3.A, C).
Im Gegensatz zu den beschriebenen Daten und trotz der rein logischen Überlegung,
dass apoptotische Zellen als Träger von Selbst-Antigenen tolerogen sein sollten, gibt es
auch Berichte über immunogene Effekte apoptotischer Zellen, etwa über erfolgreiche Tumorvakzinierung und Tumortherapie mit apoptotischen Zellen in Tiermodellen (Scheffer et al.
2003). Auch die Sekretion des Chemokins IL-8 oder des murinen IL-8-Homologs MIP-2 durch
Makrophagen oder Endothelzellen infolge der Aufnahme apoptotischer Zellen wurde beschrieben (Kurosaka et al. 1998; Misawa et al. 2001 ; Kirsch et al. 2007). Als kritischer Faktor
für die immunogene Wirkung apoptotischer Zellen wurde die Externalisierung des Chaperons
Calreticulin beschrieben. Da diese nur nach Apoptoseinduktion mit Anthrazyklinen, nicht
jedoch mit Etoposid oder Mitomycin D auftrat, wurde postuliert, dass die Art der
Apoptoseinduktion für die immunologische Wirkung von Bedeutung ist (Obeid et al. 2007).
Bislang gibt es keine endgültige Erklärung für die beiden diametral entgegengesetzten
Theorien über die anti- oder proinflammatorische Wirkung apoptotischer Zellen. Die Assoziation vermehrt auftretender apoptotischer Zellen mit Autoimmunkrankheiten (siehe I.6.1.) weist
darauf hin, dass deren Rolle ambivalent sein kann. Möglicherweise spielt das Stadium der
Apoptose eine Rolle. Es könnte sein, dass spätapoptotische (sekundärnekrotische) Zellen
die DC-Reifung im Gegensatz zu frühapoptotischen Zellen fördern (Sauter et al. 2000; Ip &
Lau 2004). Allerdings gibt es auch Hinweise auf eine Kontinuität des antiinflammatorischen
Effekts im spätapoptotischen Stadium (Patel et al. 2006; Scaffidi et al. 2002). Möglicherweise
beruhen die Unterschiede auf verschiedenen Kultivierungsmethoden der Phagozyten oder
der apoptotischen Zellen. Bei einer auch nekrotische Zellen beinhaltenden Zellpräparation
überwiegen womöglich die in I.6.1. erwähnten proinflammatorischen Mediatoren, die bei
Verlust der Membranintegrität freigesetzt werden. Die vorliegende Arbeit unterstützt die
Hypothese einer antiinflammatorischen Wirkung frühapoptotischer Zellen.
85
IV. Diskussion
Andrea Mahr
IV.2. Die Zytokinregulation erfolgt auf der Stufe der mRNA
Die Produktion von Zytokinen wird auf mehreren Ebenen stringent reguliert. Daher kann
die durch Annexin 1 und apoptotische Zellen vermittelte Hemmung der Zytokinsekretion verschiedene Ursachen haben. Die meisten Zytokine werden auf der Ebene der Transkription
reguliert. Die basale Expression ist meist verschwindend gering, wird durch Stimulation erhöht, und geht nach kurzer Zeit wieder auf das Ausgangsniveau zurück. Promotoren von
Zytokingenen enthalten meist mehrere Bindestellen für aktivierende wie auch inhibierende
Transkriptionsfaktoren (Ye & Young 1997). Denkbar ist weiterhin eine Kontrolle des RNASpleißens, da manche Stimuli zwar die Synthese einer prä-mRNA fördern, diese jedoch nicht
prozessiert wird (Jarrous & Kaempfer 1994). Daneben gehören Zytokingene zu den Genen,
die in großem Ausmaß über die Stabilität ihrer mRNA sowie über die Translationseffizienz
reguliert werden. Wichtig hierfür sind cis-aktive Elemente wie die AU-reichen Elemente
(ARE) am 3’ Ende der mRNA, die von ARE-bindenden Proteinen erkannt werden. Bindung
des Proteins Tristetraprolin führt z.B. zu Destabilisierung der TNF mRNA, während andere
Proteine wie TIA-1 (T-Zell internes Antigen 1) die Translationsrate senken. Auch stabilisierende Proteine wie HuR sind beschrieben worden (Brennan & Steitz 2001). Schließlich gibt
es posttranslationale Regulationsschritte, wie die Spaltung von IL-1β oder TNF durch Proteasen wie das IL-1-konvertierende Enzym (IL-1 converting enzyme, ICE, auch Caspase 1)
(Fantuzzi & Dinarello 1999) oder die Metalloprotease TNF-konvertierendes Enzym (TNFα
converting enzyme, TACE) (Black et al. 1997; Moss et al. 1997).
Auf welcher Ebene apoptotische Zellen die Zytokinproduktion regulieren, ist noch wenig
untersucht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass apoptotische Jurkat-T-Zellen die Induktion
der TNF mRNA durch LPS inhibieren, während die Expression der IL-10 mRNA unverändert
bleibt (Abb.III.5.A, B). Diese Daten entsprechen den Ergebnissen auf der Ebene der sezernierten Zytokine. Eine Hemmung der TNF mRNA beobachteten auch Fadok et al. 1998 in primären humanen Makrophagen und Cvetanovic & Ucker 2004 in murinen Raw264.7
Makrophagen. Im Gegensatz dazu beschreiben McDonald et al. 1999 keinen Einfluss
apoptotischer Zellen auf die Menge an induzierter TNF mRNA in murinen J774 Makrophagen
trotz reduzierter Menge an sezerniertem TNF. Die teilweise kontroversen Daten beruhen
eventuell auf den unterschiedlichen verwendeten Zelltypen. Außerdem haben Studien zum
Effekt apoptotischer Zellen auf intrazelluläre Prozesse wie die mRNA-Synthese den Nachteil,
dass ein gemischtes Zellsystem aus Phagozyten und apoptotischen Zellen untersucht wird.
Selbst wenn die nicht phagozytierten apoptotischen Zellen vor der TLR-Stimulation oder vor
der Lyse der Zellen durch Waschen entfernt werden, ist die RNA der apoptotischen Zellen in
den Phagozyten noch nachweisbar und könnte das Ergebnis verfälschen. So sind geringe
Mengen an CD3 mRNA in Lysaten von U-937 Zellen nachweisbar, wenn diese apoptotische
Jurkat T-Zellen phagozytiert haben (Daten nicht gezeigt). CD3 kommt als Bestandteil des T86
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Zell-Rezeptors nicht in mononukleären Phagozyten wie den U-937 vor und stammt daher aus
den aufgenommenen Jurkat-T-Zellen. Es kann davon ausgegangen werden, dass auch ein
gewisser Prozentsatz an GAPDH mRNA in diesen Proben von den apoptotischen Zellen herrührt. Da die gemessenen TNF-Transkriptmengen auf die Menge an GAPDH mRNA normiert
wurden, könnte es sein, dass die Werte nach Aufnahme apoptotischer Zellen sich alleine dadurch etwas verringern. Die Verunreinigungen mit apoptotischer RNA waren sehr gering und
können mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht die Reduktion der induzierten TNF mRNA Menge
um etwa 50 % erklären. Dennoch ist es bei intrazellulären Untersuchungen generell vorteilhaft, mit dem rekombinanten Protein Annexin 1 anstelle apoptotischer Zellen zu arbeiten, um
mögliche Kontaminationen durch apoptotischen Zellinhalt zu vermeiden. In humanen DC
führt Annexin 1 zu einer Reduktion der LPS-induzierten TNF- und IL-8 mRNAs (Abb. III.5.C,
D; Abb.III.6.A, B).
Genexpressionsanalysen weisen auf einen globalen hemmenden Effekt von Annexin 1
auf die TLR-induzierte Produktion proinflammatorischer Zytokine hin. Durch einstündige LPSStimulation stark induzierte Zytokine wie IL-1α, IL-1β, TNF, IL-12, IL-6, IL-8, IL-23, und IL-12
werden infolge einer Vorinkubation mit Annexin 1 vermindert exprimiert (Abb.III.6.C, D). Auch
andere proinflammatorische Gene wie die Chemokine CCL20 und CXCL2 sind negativ reguliert, ebenso das Gen für das proinflammatorische Enzym COX2. Einige Gene wie z.B.
NFKBIA sind nicht durch Annexin 1 reguliert, während eine weitere Gruppe infolge der Vorinkubation sogar noch verstärkt induziert wird, wie etwa ISG15 und TRAF1. Es liegt also keine
generelle Inhibition LPS-abhängiger Signaltransduktion vor, sondern eine differenzielle Beeinflussung.
Die Genexpressionsanalysen wurden in Abwesenheit der LPS-inhibierenden Substanz
Polymyxin B durchgeführt. Für die mRNAs für TNF, IL-1β und IL-8 konnte der negativ regulatorische Einfluss jedoch in zahlreichen Experimenten auch unter Ausschluss von LPS-Toleranz bestätigt werden. Ob die Regulation bestimmter mRNA-Transkripte auf einer Herunterregulation der Transkription oder auf einer Destabilisierung der mRNA beruht, muss noch
geklärt werden. In der Literatur finden sich Hinweise auf eine Beteiligung negativ regulatorischer Transkriptionsfaktoren am antiinflammatorischen Effekt apoptotischer Zellen (Kim et al.
2004).
IV.3. Annexin 1 inhibiert die Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB
Der antiinflammatorische Effekt apoptotischer Zellen auf die Zytokinproduktion von Phagozyten ist durch viele Studien belegt. Die zugrundeliegenden Veränderungen in der
Signaltransduktion wurden jedoch bisher nur von wenigen Gruppen untersucht und sind somit noch nicht ausreichend charakterisiert.
87
IV. Diskussion
Andrea Mahr
LPS-Stimulation führt sowohl in U-937 Zellen als auch in humanen DC zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen p38 und JNK. Phosphorylierung der Erk MAP-Kinase ist ebenfalls
beschrieben, ist jedoch unter den in dieser Arbeit gewählten Bedingungen nicht zu
beobachten (Abb. III.8.A, B). Vermutlich beruht dies einerseits auf der relativ hohen basalen
Erk-Phosphorylierung, andererseits an den geringen LPS-Konzentrationen, die gewählt wurden, um in Experimenten mit Annexin 1 einen möglichen hemmenden Effekt besser
beobachten zu können. Inkubation mit Annexin 1 bewirkt in U-937 Zellen eine leicht verminderte LPS-induzierte Phosphorylierung von p38 und JNK (Abb. III.9.A, B), in humanen DC
eine Inhibition sowohl der basalen als auch der LPS-induzierten Phosphorylierung von p38,
Erk und JNK (Abb. III.10.A, B) und in Raw264.7 murinen Makrophagen eine Hemmung der
Phosphorylierung und Aktivierung der p38 Kinase (Abb. III.11.). Der Effekt ist donorabhängig
bisweilen nur schwach ausgeprägt, und kann durch Kinase-Aktivitätsmessung deutlicher
beobachtet werden als durch Detektion im Western Blot. In der Literatur wurde in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Daten ebenfalls eine Hemmung basaler und M-CSF
induzierter Erk-Phosphorylierung in murinen Makrophagen gezeigt (Patel et al. 2006; Reddy
et al. 2002). Daneben ist eine Hemmung der durch AP-1 ausgelösten Transkription beschrieben worden. Dieser Transkriptionsfaktor wird ebenfalls durch MAP-Kinasen aktiviert
(Cvetanovic & Ucker 2004). Abweichend von den Befunden dieser Arbeit wurde hierbei allerdings eine gesteigerte Phosphorylierung von p38 und JNK beobachtet (Patel et al. 2006).
Sen et al. (2007) finden in LPS-stimulierten murinen DC keine signifikante Hemmung der
Phosphorylierung von MAP-Kinasen im Vergleich zu einem signifikanten Effekt auf NF-κB.
Möglicherweise beruhen die Unterschiede auf den verwendeten Zelltypen. Zudem wurden in
dieser Arbeit nur die Effekte des Proteins Annexin 1 auf intrazelluläre Signaltransduktion untersucht, da apoptotische Zellen ebenfalls Signaltransduktionsmoleküle beinhalten, die nicht
von denen der DC unterschieden werden können. Die Verwendung eines rekombinanten
Proteins liefert daher aussagekräftigere Ergebnisse als die Verwendung apoptotischer
Zellen.
Die LPS-induzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB wird durch apoptotische
Zellen wie auch durch Annexin 1 um etwa 50 % reduziert (Abb.III.12.). In Übereinstimmung
hiermit wurde in murinen Makrophagen eine durch Vorinkubation mit apoptotischen Zellen
verminderte Aktivierbarkeit von NF-κB beschrieben. Diese ging nicht mit sichtbaren Änderungen der Degradation von IκBα, der nukleären Lokalisation oder der DNA-Bindung von
NF-κB einher (Cvetanovic & Ucker 2004). In murinen DC wurde eine Hemmung schon auf
der Stufe des IKK-Komplexes beobachtet, die durch das Molekül Gas6 auf apoptotischen
Zellen vermittelt wurde. Gas6 bindet an die Mer-Tyrosinkinase und aktiviert so den PI3KSignalweg (Sen et al. 2007). PI3K-Aktivierung durch apoptotische Zellen wird auch von
Reddy et al. (2002) gezeigt. Die Effekte von Mer und anderen Proteinen der TAM (Tyro3, Axl,
88
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Mer)-Tyrosinkinasen auf die TLR-Signaltransduktion wurden auch mit einer Induktion von
SOCS1 und SOCS3 in Verbindung gebracht (Rothlin et al. 2007). Mit Annexin 1 liegt nun ein
weiteres Molekül vor, das die Aktivität von NF-κB in DC inhibieren kann. Über welchen
Rezeptor dies geschieht, ist noch nicht bekannt. Studien mit spezifischen Inhibitoren lieferten
keine Hinweise auf eine Beteiligung des als Annexin 1-Rezeptor beschriebenen FPR (Daten
nicht gezeigt). Auch erwiesen sich vorläufige Experimente zu einer möglichen Beteiligung
des PI3K-Signalwegs – der z.B. auch durch den FPR eingeleitet wird – sowie von SOCS1
und SOCS3 als negativ (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer beschriebener Effekt
apoptotischer Zellen, die Aktivierung des Transkriptionsfaktors PPARγ bzw. anderer PPARs
(Johann et al. 2006 ; Ramos et al. 2007 ; Majai et al. 2007) wurde in dieser Arbeit nicht näher
untersucht.
IV.4. Annexin 1 beeinflusst MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege der TLR
sowie die Signaltransduktion weiterer proinflammatorischer Rezeptoren
Die TLR-Signaltransduktion umfasst Signalwege, die von verschiedenen Adaptoren
abhängen. Im Wesentlichen unterscheidet man MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege.
Die Einteilung erfolgte anhand von Untersuchungen MyD88-defizienter Mäuse, die nach
LPS-Stimulation die sogenannten MyD88-abhängigen Zytokine nicht produzieren können,
während es nach wie vor zur Expression der MyD88-unabhängigen (TRIF-abhängigen)
Zytokine kommt (Kawai et al. 2001). Nach Untersuchung TRIF-defizienter Mäuse zeigte sich,
dass in Abwesenheit des TRIF-Signalwegs weder MyD88-unabhängige noch –abhängige
Zytokine produziert werden. Der TRIF-Signalweg ist folglich für jegliche Zytokinsekretion
essenziell (Yamamoto et al. 2003; Hoebe et al. 2003).
Um zu beurteilen, welcher der beiden Signalwege von der Inhibition durch Annexin 1
betroffen ist, wurden mehrere Wege beschritten. Apoptotische Zellen und Annexin 1
hemmen nicht nur die Sekretion MyD88-abhängiger Zytokine wie TNF (Abb.III.2.), IL-8 und
IL-6 (Abb.III.4.), sondern auch TRIF-abhängige Zytokine wie IP-10 (Abb.III.13.) und MCP-1
(Abb.III.15.A). Dies lässt auf eine Interferenz der Annexin 1-Signaltransduktion mit dem
TRIF-Signalweg schließen, dessen Aktivierung für beide Gruppen von Zytokinen wichtig ist.
Dementsprechend zeigten Experimente mit MyD88-defizienten Mäusen, dass bei ausschließlicher Benutzung des TRIF-Signalwegs die Effekte einer LPS-Stimulation weiterhin
durch Annexin 1 blockierbar sind (Abb.III.15.B). Redundante Information ergibt sich aus der
Hemmbarkeit des rein TRIF-abhängigen TLR3 durch Annexin 1 (Abb.III.14.A). Offensichtlich
bewirkt Annexin 1 aber auch eine Hemmung des MyD88-abhängigen Wegs, da die rein
MyD88-abhängige Signaltransduktion über TLR2 (Abb.III.14.B) sowie den IL-1-Rezeptor
ebenfalls betroffen ist (Abb.III.14.C). Die Signalwege von TLR und dem IL-1 Rezeptor ähneln
sich hinsichtlich der Initiation der Signaltransduktion und bewirken eine Aktivierung von MAP89
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Kinasen und NF-κB. Die Stimulation des TNF Rezeptors führt ebenfalls zur Aktivierung von
NF-κB und MAP-Kinasen, jedoch geschieht dies nicht über MyD88- und TRIF-abhängige
Wege. Die initialen Komponenten sind vielmehr das Adaptorprotein TRADD (TNF receptor
associated death domain), die Kinase RIP1 und die Ubiquitin-Ligase TRAF2 (Aggarwal
2003). Da Annexin 1 auch die Induktion der TNF-induzierten TNF mRNA inhibiert
(Abb.III.16 B), beeinflusst es offensichtlich Proteine, die in beiden Signalwegen eine Rolle
spielen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen für Annexin 1 wurde beschrieben, dass
apoptotische Zellen neben der LPS-Stimulation auch die Aktivierung durch CD40L und TNF
hemmen (Urban et al. 2001).
Ein Einfluss auf beide Arme der TLR-Signaltransduktion lässt sich mit mehreren Modellen
erklären. Eine Möglichkeit ist eine Inhibition direkt am Rezeptor, wie in I.4. beschrieben. Da
Annexin 1 jedoch neben der TLR-abhängigen auch die TNF-induzierte Signaltransduktion
hemmt, ist eine Hemmung direkt am TLR unwahrscheinlich. Ein weiterer denkbarer Mechanismus ist die Inhibition eines Moleküls, das an MyD88- und TRIF-abhängigem Signalweg
gleichermaßen beteiligt ist, wie z.B. TRAF6 (Hacker et al. 2000; Wang et al. 2001b; Jiang et
al. 2004). Da für die TNF-Signaltransduktion jedoch TRAF2 die wesentliche Rolle spielt, ist
eine TRAF6-spezifische Hemmung unwahrscheinlich. Möglicherweise werden Annexin 1abhängig
verschiedene
TRAFs
inhibiert.
Für
das
laut
Genexpressionsanalysen
(Abb.III.7.B, C und Tabelle V.1.) durch Annexin 1 induzierte SOCS2 wurde beispielsweise
gezeigt, dass es den proteasomalen Abbau von TRAF6 und TRAF2 induziert (Machado et al.
2008). Das ebenfalls induzierte A20 deubiquitiniert TRAF6 im TLR-Signalweg sowie RIP1 im
TNF-Rezeptor-Signalweg (Lee et al. 2000; Boone et al. 2004). Schließlich ist auch eine
Inhibition an mehreren Stellen in beiden Signalwegen denkbar, wie es für verschiedene
regulatorische Mechanismen gezeigt wurde. (siehe I.4.3.). Dazu käme es unter anderem
infolge der Induktion eines antiinflammatorischen Genexpressionsprogramms, wie es z.B.
nach IL-10-Stimulation der Fall ist (Williams et al. 2004; Murray 2005).
IV.5. Der inhibierende Effekt von Annexin 1 ist proteinsyntheseabhängig
Der hemmende Effekt apoptotischer Zellen auf die Produktion proinflammatorischer
Zytokine von Phagozyten wie humanen Monozyten (Voll et al. 1997) und murinen Raw264.7
Makrophagen (Cvetanovic & Ucker 2004) ist bei längerer Vorinkubationszeit verstärkt. Mit
humanen DC konnte die Zeitabhängigkeit in dieser Arbeit bestätigt werden (Abb.III.17. A). Im
Fall von Annexin 1 war die Dauer der Vorinkubation noch entscheidender als im Fall apoptotischer Zellen. Vor allem bei humanen DC erwies es sich als essenziell, über Nacht zu inkubieren, da sonst keine oder nur sehr geringe inhibitorische Effekte beobachtet wurden
(Abb.III.17.B). Möglicherweise verwenden apoptotische Zellen mehrere Mechanismen zur
Hemmung von DC, von denen einige schnell wirken, während andere erst nach längerer
90
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Inkubation eine Rolle spielen. Annexin 1 könnte gemäß dieser Hypothese eines der Signale
sein, deren Auswirkung erst später zum Tragen kommt. Der zeitfordernde Prozess beinhaltet
vermutlich die Synthese von Proteinen. In Anwesenheit von Cycloheximid kann kein inhibitorischer Annexin 1-Effekt mehr beobachtet werden, vielmehr wird die TLR-induzierte Menge
an mRNA Transkripten von TNF und IL-8 erhöht (Abb.III.17.C, D und Daten nicht gezeigt).
Diese Befunde stehen im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cvetanovic & Ucker (2004) mit
murinen Raw264.7 Makrophagen, die keinen Effekt von Cycloheximid auf den hemmenden
Einfluss apoptotischer Zellen beobachten. Der Unterschied könnte zum einen auf der
Verwendung muriner Makrophagen anstelle humaner DC beruhen, zum anderen auf der
Verwendung apoptotischer Zellen vs. Annexin 1. In der vorliegenden Studie wurden wie
erwähnt intrazelluläre Effekte bewusst nur unter Verwendung des rekombinanten Proteins
untersucht, da apoptotisches Material die Ergebnisse verfälschen könnte.
Ein Phänomen, das die Interpretation der mit Cycloheximid gewonnenen Daten
erschwert, ist die Verstärkung der TLR-induzierten Transkription durch den Inhibitor selbst
(Abb.III.17.D, F). Superinduktion verschiedener mRNAs durch Cycloheximid mit oder ohne
zusätzliche Stimulation wurde bereits beschrieben. Ausmaß und Ursache der Induktion sind
zelltypabhängig. Die Ursache kann in der Inhibition der Proteinsynthese selbst liegen, wenn
labile inhibitorische Proteine für die negative Regulation der Induktion verantwortlich sind
(Hayes & Zoon 1993). Derartige Proteine können z.B. die Stabilität der mRNA regulieren
(Ross 1995). Zudem kann es zur Aktivierung von NF-κB kommen, wenn IκB- Proteine nicht
in ausreichendem Ausmaß (re-)synthetisiert werden (Newton et al. 1996), was jedoch gemäß
Western Blot-Analysen zumindest für IκBα im vorliegenden System nicht der Fall ist (Daten
nicht gezeigt). Stattdessen wurde eine starke Phosphorylierung der p38 Kinase durch Cycloheximid gefunden (Daten nicht gezeigt), die eine mögliche Ursache für die Superinduktion
darstellt. Die Aktivierung von MAP-Kinasen durch Proteinsynthese-Inhibitoren wurde bereits
beschrieben. Sie ist ein Charakteristikum des durch Translationsinhibition ausgelösten ribotoxischen Stresses, der zelltypabhängig mehr oder weniger ausgeprägt ist und ebenfalls zur
Superinduktion von Zytokin-mRNAs beitragen kann (Bunyard et al. 2003; Hershko et al.
2004; Itani et al. 2003).
Welche Proteine synthetisiert werden, und ob diese intrazellulär oder nach Sekretion in
autokriner Weise die TLR-Signaltransduktion hemmen, kann durch Analyse der DC-Überstände oder durch Genexpressionsanalysen nach Inkubation mit apoptotischen Zellen bzw.
Annexin 1 ermittelt werden.
IV.6. Modell zum Wirkmechanismus von Annexin 1 auf DC
Gemäß den Ergebnissen dieser Arbeit inhibiert Annexin 1 die TLR-induzierte Transkription proinflammatorischer Zytokine auf transkriptioneller Ebene. Die Interferenz mit dem TLR91
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Signalweg findet oberhalb der Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB statt und betrifft sowohl den MyD88- als auch den TRIF-abhängigen Weg. Neben den TLR wird auch die
Signaltransduktion des TNF-Rezeptors inhibiert. Der Effekt beruht mit hoher Wahrscheinlichkeit auf der Induktion von Proteinsynthese durch Annexin 1. Die synthetisierten Proteine
können intra- oder extrazellulär wirken und die Zelle antiinflammatorisch beeinflussen. Abb.
IV.1. zeigt ein Modell, das diese Befunde berücksichtigt.
Abb. IV.1. Modell zum Wirkmechanismus von Annexin 1 auf humane DC.
Annexin 1 beeinflusst DC durch Bindung an einen Oberflächenrezeptor, dessen Signaltransduktion die Synthese
antiinflammatorischer Proteine induziert. Alternativ könnte Annexin 1 auch von der DC aufgenommen werden und
intrazelluläre Zielmoleküle beeinflussen. Die synthetisierten Proteine wirken entweder intrazellulär, oder nach
Sekretion in autokriner Weise. Ein mögliches intrazellulär wirkendes Protein ist SOCS2, das durch Einleitung des
proteasomalen Abbaus von TRAF6 und TRAF2 die TLR- und TNF-Rezeptor-vermittelte Signalwege hemmt.
Alternativ könnte es z.B. durch A20 zu Deubiquitinierung von Signalmolekülen wie TRAF6 im TLR-Signalweg
sowie RIP1 im TNF-Rezeptor-Signalweg kommen. MAP-Kinase-Phosphatasen wie DUSP1 und DUSP5 könnten
MAP-Kinasen inaktivieren. Auch eine Hemmung der Transkription proinflammatorisch wirkender Proteine ist
denkbar, etwa des Transkriptionsfaktors Egr1. Als autokrin wirkende Faktoren könnten Zytokine wie TNF und IL-6
wirken, die ähnlich wie beim Phänomen der TNF-Toleranz zu einer verminderten Stimulierbarkeit der DC durch
proinflammatorische Stimuli führen. Das durch Annexin 1 hervorgerufene Genexpressionsprogramm führt zu einer
Hemmung von TLR-Signalwegen oberhalb von MAP-Kinasen und NF-κB sowie zur Hemmung der TNF-Rezeptorinduzierten Gentranskription. Bei unterdrückter Proteinsynthese (*) kann die Signaltransduktion von Annexin 1
auch proinflammatorisch sein und die TLR-Signaltransduktion verstärken.
92
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Erste Hinweise auf antiinflammatorisch wirkende Gene, die durch Annexin 1 induziert
werden, ergeben sich aus den Genexpressionsanalysen (Abb. III.7.C und Tabelle V.1.). So
ist
das
durch
Annexin 1
induzierte
SOCS2
ein
negativer
Regulator
der
TLR-
Signaltransduktion, der in unreifen, nicht aber in reifen DC exprimiert wird (Jackson et al.
2004). SOCS2 inhibiert die JAK-STAT-abhängige Signaltransduktion verschiedener Zytokine
(Yoshimura et al. 2007). Es hemmt auch Signale über TLR und den TNF-Rezeptor durch
Induktion des proteasomalen Abbaus von TRAF6 und TRAF2, nachdem es durch Bindung
von Lipoxin A4 an den Ah (aryl hydrocarbon)-Rezeptor sowie den FPRL1 induziert wurde
(Machado et al. 2008). Letzterer soll neben Lipoxin A4 auch Annexin 1 binden (Ernst et al.
2004). Das ebenfalls induzierte A20 ist ein bekannter negativer Regulator der TLR- und TNFSignaltransduktion (Boone et al. 2004), und die Phosphatasen DUSP1 und DUSP5
inaktivieren MAP-Kinasen (Lang et al. 2006; Mandl et al. 2005). Die Regulation muss jedoch
noch durch quantitative PCR und vor allem auf Proteinebene bestätigt werden.
Neben der Induktion verschiedener Gene fällt die deutliche und reproduzierbare
Herunterregulation des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors Egr1 auf. Da Egr1 durch MAPKinasen induzierte Transkription proinflammatorischer Zytokine vermittelt, könnte eine
Herunterregulation ebenfalls zum tolerogenen Effekt beitragen (Xu et al. 2001; Faour et al.
2005). Ein weiterer Befund ist die Induktion des Chemokinrezeptors CCR7, der für die Migration in lymphatische Gewebe benötigt wird (Forster et al. 2008). Wichtig sind hier natürlich
die Untersuchung der Induktion auf Proteinebene sowie die Oberflächenexpression.
Daneben führt Annexin 1 auch zur schwachen Expression von extrazellulär wirkenden
Zytokinen und Chemokinen wie TNF, IL-1β, IL-8 und CCL20. Da die Analysen in Abwesenheit der LPS-inhibierenden Substanz Polymyxin B durchgeführt wurden, muss noch geklärt
werden, inwiefern diese Induktion auf geringe Mengen an kontaminierendem LPS zurückzuführen ist. Vorläufige Experimente weisen darauf hin, dass eine schwache Induktion der
mRNAs für TNF, IL-8 und IL-1β auch unter Ausschluss von LPS-Effekten auftritt. Einige
durch Annexin 1 regulierte Transkripte sind IFN-regulierte Gene. Einige dieser Gene waren
jedoch nur in einer der beiden Analysen induziert (in Klammern in Abb.III.7.C), für die
anderen mRNAs, wie ISG20 und GBP1, steht eine Bestätigung durch quantitative PCR noch
aus. Insgesamt ist die Induktion der als proinflammatorisch geltenden Zytokine durch
Annexin 1 ein vorläufiger Befund. Es könnte jedoch durchaus sein, dass eine schwache
Aktivierung der DC ein Teil des Annexin 1-spezifischen Effekts ist, passend zu der Hypothese, dass DC nach Aufnahme apoptotischer Zellen nicht völlig unreif bleiben, da sie sonst
weder zur Migration in die Lymphknoten noch zur Antigen-Präsentation fähig wären (Lutz &
Schuler 2002). Eine schwache Aktivierung ist auch in einigen Fällen auf der Ebene der
sezernierten Proteine sowie der kostimulierenden Oberflächenmoleküle zu beobachten
(Daten nicht gezeigt, sowie Weyd und Dörner, persönliche Kommunikation). Zudem wirken
93
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Zytokine wie TNF, IL-1β und IL-6 zwar proinflammatorisch, wenn sie bei der Reaktion von
Phagozyten auf Pathogene in großen Mengen sezerniert werden, können für sich genommen und in kleinen Konzentrationen jedoch antiinflammatorisch wirken, ähnlich wie man es
bei der LPS-Toleranz beobachtet. Hierfür finden sich zahlreiche Beispiele: Bei der TNFToleranz, die durch Inkubation mit geringen Mengen an TNF ausgelöst wird, kommt es zu
einer verminderten Stimulierbarkeit mit TNF und anderen proinflammatorischen Stimuli im
Wesentlichen infolge der TNF-abhängigen Aktivierung des Transkriptionsfaktors C/EPBβ, der
die NF-κB-abhängige Induktion proinflammatorischer Gene hemmt (Buck et al. 2001; Weber
et al. 2003; Zwergal et al. 2006). Das Immunsuppressivum Rapamycin übt antiinflammatorische Effekte auf Phagozyten aus, indem es zunächst die Sekretion von IL-1β induziert, die
dann in der Folge zur erhöhten Expression des TLR-inhibierenden Moleküls ST2 führt
(Turnquist et al. 2008). Die durch die Bindung des MHC-Klasse 1b Moleküls HLA-G an ILT-4
ausgelöste Sekretion von IL-6 führt über STAT3-abhängige Signaltransduktion zu einer
Hemmung der DC-Reifung (Liang et al. 2008). Somit ist die schwache Induktion
proinflammatorischer Gene eine Möglichkeit der Toleranzinduktion. Diese Hypothese lässt
sich durch Experimente mit blockierenden Antikörpern gegen die entsprechenden Zytokine
untersuchen.
Viele der durch Annexin 1 regulierten Gene haben keine etablierte immunologische
Funktion. Da in dem gewählten experimentellen System jedoch nur sehr lange
Vorinkubationszeiten mit Annexin 1 untersucht wurden, ist eine mögliche transkriptionelle
Hochregulation anderer antiinflammatorischer Gene zu anderen Zeitpunkten nicht ausgeschlossen. Dies kann durch eine Kinetik untersucht werden, bei der die DC auch für kürzere
Zeiten mit Annexin 1 inkubiert werden. Ähnliches gilt für eine Beurteilung des Effekts auf die
durch LPS induzierten antinflammatorischen Zytokine. Um deren Regulation zu beobachten,
müsste die gewählte Zeitdauer der LPS-Stimulation verlängert werden. Nach einer Stunde
beobachtet man im Wesentlichen nur eine Hochregulation proinflammatorischer Gene, während antiinflammatorische Zytokine erst nach längerer Zeit exprimiert werden.
IV.7. Rekombinantes Annexin 1 zeigt inhibitorische Effekte unabhängig von
kontaminierendem LPS
Aus dem bakteriell exprimierten rekombinanten Annexin 1 konnte das kontaminierende
LPS zwar weitgehend entfernt werden, dennoch blieben geringe Mengen zurück. Daher wurden zusammen mit dem Protein je nach Präparation etwa 0,02-1 EU/mL (1-100 pg/mL) LPS
in die Kultur eingebracht, und es besteht die Gefahr artifizieller Effekte durch EndotoxinToleranz. Daher wurden wichtige Experimente dieser Arbeit in Anwesenheit des LPS-inhibierenden Reagens Polymyxin B wiederholt. Die verwendete Konzentration an Polymyxin B von
10 µg/mL inhibiert die Zytokinproduktion humaner DC durch Stimulation mit mehr als
94
IV. Diskussion
Andrea Mahr
10 ng/mL an ultrapurem LPS (Daten nicht gezeigt). Polymyxin B ist ein kationisches
Polypeptid mit einer über Amidbindung verknüpften Fettsäure. Es bindet an saure Gruppen
und Fettsäuren von Lipid A im LPS-Molekül und verhindert so dessen Aktivität. Es inhibiert
nicht alle LPS-Typen gleichermaßen (Cavaillon & Haeffner-Cavaillon 1986), da einige Typen
aufgrund verschiedener Modifikationen eine geringere Affinität zu Polymyxin B aufweisen
(Nummila et al. 1995; Rocque et al. 1988). Die Aktivität des in den Annexin 1-Präparationen
enthaltenen LPS wurde jedoch durch Polymyxin B effizient inhibiert (Abb.III.4.D). Daher kann
davon ausgegangen werden, dass die mit Polymyxin B reproduzierten Effekte nicht auf
Endotoxin-Toleranz beruhen. Im Einzelnen wurden die Effekte auf die Sekretion der Zytokine
TNF, IL-6 und IL-8 (Abb.III.4.) sowie die Regulation der mRNAs für TNF, IL-8 und IL-1β nach
Pam3CSK4-Stimulation humaner DC (Abb.III.16.C und Daten nicht gezeigt) mehrmals und
damit eindeutig reproduziert. Dabei zeigte sich, dass bei Hemmung des LPS tatsächlich
bisweilen weniger starke Effekte auftraten. Allerdings beruht nur ein kleiner Teil der
beobachteten Effekte auf Endotoxin-Toleranz. Für U-937 Zellen müssen die entsprechenden
Experimente noch unter Verwendung von Polymyxin B wiederholt werden, um die Hemmung
der TNF-Produktion bei gleichbleibender Produktion von IL-10 (Abb. III.2.A-D; Abb. III.5.A, B)
zu verifizieren. Die Inhibition der TNF-Signaltransduktion durch Annexin 1 (Abb.III.16.B)
sowie die Aufhebung des Annexin 1-Effekts durch Cycloheximid (Abb.III.17.E, F) wurden in
Anwesenheit von Polymyxin B mehrfach reproduziert. Das Gleiche gilt für die Effekte auf die
TLR3-Signaltransduktion, wobei sich hier die Zugabe von Polymyxin B auch aus dem Grund
als sinnvoll erwies, da das von Sigma bezogene Poly(I:C) mit großen Mengen an LPS
kontaminiert war (Daten nicht gezeigt). Effekte auf die MAP-Kinasen p38 und JNK konnten in
jeweils einem Experiment – wenn auch in schwacher Ausprägung – nachgewiesen werden.
Die Resultate zur Inhibition der MAP-Kinasen wie auch von NF-κB bedürfen jedoch noch der
Validierung (laufende Experimente). Ebenso empfiehlt sich eine Wiederholung der
Genexpressionsanalysen zwecks Ausschluss der Endotoxin-Toleranz-Effekte bei der
Interpretation der Daten.
Insgesamt ist ein Großteil der beobachteten Effekte Annexin 1-spezifisch, für andere
muss die Beteiligung von Annexin 1 noch validiert werden. Dies kann durch Durchführung
der Experimente in Anwesenheit von Polymyxin B erfolgen, das LPS-Effekte verhindert.
Weitere Kontrollen können dazu dienen, einen Einfluss jeglicher bakterieller Produkte auszuschließen. Zum einen kann als negative Kontrolle ein Protein verwendet werden, das nach
der gleichen Prozedur wie Annexin 1 aufgereinigt wurde und somit eine vergleichbare Menge
an kontaminierenden bakteriellen Substanzen enthält. Eine Inaktivität des Kontrollproteins im
verwendeten System wäre ein weiterer Hinweis für die Spezifität des Annexin 1-Effekts. In
Experimenten mit Annexin 5 als Kontrollprotein zeigte sich zunächst ebenfalls ein
hemmender Effekt. Da nicht auszuschließen ist, dass mehrere Annexine DC in redundanter
95
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Weise inhibieren, wird derzeit ein Antitrypsin als mögliches Kontrollprotein aufgereinigt (Björn
Linke, persönliche Kommunikation). Letztendlich sollte völlig LPS-freies, aus eukaryontischen
Zellen aufgereinigtes Annexin 1 sowie eine Blockierbarkeit der Effekte durch Annexin 1spezifische
Antikörper
Aufschluss
über
die
ausschließlich
Annexin 1-abhängigen
Phänomene geben.
IV.8. Ausblick
In dieser Arbeit wurde ein Einfluss von Annexin 1 bzw. apoptotischen Zellen auf die
proinflammatorische Signaltransduktion von Phagozyten, insbesondere von DC, gezeigt. Die
vermutlich am Effekt beteiligte Proteinsynthese kann durch Genexpressionsanalysen weiter
untersucht werden. Die bisherigen Analysen weisen auf die Induktion einiger antiinflammatorischer Proteine hin, von denen einige, wie z.B. SOCS2 und A20, im Einklang mit der
beobachteten Inhibition von MyD88- und TRIF-abhängigem Signalweg sowie der TNFabhängigen Signaltransduktion wären. Auch ein Effekt der schwach induzierten Zytokine wie
etwa TNF und IL-1β ist möglich, da diese zu Toleranz gegen weitere proinflammatorische
Stimulation führen könnten. Daneben könnte die Herunterregulation von Genen wie Egr-1
oder CD14 eine Rolle spielen. Die Resultate müssen unter Ausschluss von EndotoxinToleranz sowie auf Proteinebene bestätigt werden. Außerdem muss in Kinetiken untersucht
werden, ob nach unterschiedlich langen Inkubationszeiten mit Annexin 1 weitere mögliche
Mediatoren des Effekts transkriptionell reguliert werden. Mögliche autokrine Faktoren können
durch Experimente mit blockierenden Antikörpern, Zwei-Kammer-Experimente, oder Analyse
der Überstände von mit apoptotischen Zellen inkubierten DC identifiziert werden. Bei ersten
Versuchen mit einem Zwei-Kammer-System erwies sich als Störfaktor, dass apoptotische
Neutrophile antiinflammatorische Substanzen ins Medium abgeben, die DC inhibieren und
den Effekt möglicher DC-sezernierter autokriner Faktoren überlagern (Daten nicht gezeigt).
An welchen Stellen TLR-Signalwege durch den Annexin 1-Effekt gehemmt werden, kann
in einem System untersucht werden, in dem z.B. HEK293-Zellen mit verschiedenen
Signaltransduktionsmolekülen transfiziert werden. HEK293-Zellen exprimieren keine TLR,
besitzen aber die Komponenten des Signalwegs, sodass sie nach Transfektion mit TLR auf
TLR-Liganden mit IL-8-Produktion reagieren (Yang et al. 1998; Chow et al. 1999).
Expression verschiedener Signaltranduktionsmoleküle führt zu einer Initiation des TLRSignalwegs an unterschiedlichen Stellen unterhalb des Rezeptors. Tritt weiterhin ein inhibitorischer Effekt von Annexin 1 auf, so weist dies auf eine Inhibition von Molekülen hin, die dem
transfizierten Protein nachgeschaltet sind. Die bisherigen Daten unterstützen eine Inhibition
von Molekülen, die sowohl im TLR- als auch im TNF-Rezeptor-Signalweg vorkommen, möglicherweise TRAFs oder die allgemeinen Regulatoren von NF-κB oder MAP-Kinasen.
96
IV. Diskussion
Andrea Mahr
Die Untersuchung des Wirkmechanismus von Annexin 1 trägt zur Aufklärung eines möglichen Mechanismus der durch apoptotische Zellen vermittelten peripheren Toleranz bei. Das
Auftreten spätapototischer Zellen durch vermehrte Apoptose oder verminderte Phagozytose
wurde mit der Entstehung von Autoimmunkrankheiten in Verbindung gebracht (Rosen &
Casciola-Rosen 1999; Rodenburg et al. 2000). Dies könnte daran liegen, dass die Signale
frühapoptotischer Zellen an Phagozyten essenziell für die Etablierung und Aufrechterhaltung
der Toleranz sind. Umgekehrt haben die Beobachtungen eine Implikation für die Krebstherapie, da die Behandlung von Tumoren mit Chemotherapeutika oder Bestrahlung Apoptose in
den Krebszellen auslöst. Dies ist zwar erwünscht im Hinblick auf die Beseitigung des
Tumors, jedoch könnte als Nebeneffekt eine Induktion von Toleranz gegen Tumorantigene
auftreten. Bei einer nicht vollständigen Elimination des Tumorgewebes durch die Therapie
wäre dadurch mit Problemen durch verminderte Abstoßung des Tumors durch das Immunsystem zu rechnen. Daher sind gängige Methoden der Krebstherapie vor diesem Hintergrund
zu überdenken.
Die Erzeugung von Toleranz durch apoptotische Zellen oder Annexin 1 könnte auch
direkte klinische Verwendbarkeit erlangen, etwa bei der Behandlung von Allergien oder der
Verhinderung von Transplantatabstoßungen (Übersicht: Morelli 2006). Im Mausmodell unterstützt die vorherige Injektion apoptotischer Zellen des Donors die Akzeptanz eines Transplantats durch das Immunsystem, etwa bei Knochenmarkstransplantationen (Bittencourt et
al. 2001) oder Herztransplantation (Wang et al. 2006). Auch bei der sogenannten extrakorporalen Photopherese könnten apoptotische Zellen eine Rolle spielen. Diese Behandlung wird
bei kutanen T-Zell-Lymphomen wie dem Sézary Syndrom eingesetzt, zeigt jedoch auch
Erfolge bei der Therapie von Transplantatabstoßungen und Autoimmunerkrankungen wie
Sklerodermie. Aus dem Blut des Patienten werden bei dieser Therapie Leukozyten
entnommen und mit einem Psoralen-Derivat behandelt, das DNA bindet und die Zellen
dadurch fotoaktiviert. Durch UV-A Bestrahlung wird DNA-Schädigung mit nachfolgender
Apoptose ausgelöst und die Zellen werden reinfundiert. Nach welchem Mechanismus die
Methode zur Heilung derart unterschiedlicher Erkrankungen führt, ist noch ungeklärt. Eine
Theorie ist, dass die im Photopherese-Präparat enthaltenen Phagozyten die apoptotischen
T-Zellen
aufnehmen,
wodurch
sie
einen
tolerogenen
Phänotyp
erhalten
und
Immunreaktionen gegen Transplantate oder Autoantigene verhindern können (Peritt 2006;
Oliven & Shechter 2001). Die Verfügbarkeit eines Proteins, das antiinflammatorische Effekte
auf DC ausübt, stellt gegenüber der Verwendung apoptotischer Zellen einen großen Vorteil
dar und würde eine wesentlich besser reproduzierbare und dosierbare Therapie
ermöglichen.
97
V. Anhang
Andrea Mahr
V. Anhang
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Andrea Mahr
V.2. Tabellen zu den Genexpressionsanalysen
Tabelle V.1. und V.2. zeigen die in zwei unabhängigen Genexpressionsanalysen reproduzierbar durch Annexin 1 positiv (V.1.) bzw. negativ regulierten (V.2.) Gene auf.
Tabelle VI.1.: Durch Annexin 1 mehr als zweifach induzierte Gene
Zytokine und Chemokine
CCL1
CCL19
MIP-3β
CCL20
MIP-3α
CCL4
MIP-1β
CCL5
RANTES
CCL8
MCP-2
END1
Endothelin 1
CSF-1
colony stimulating factor 1
EBI-3
Epstein Barr Virus-induziertes Gen 3
IL-15
IL-1α
IL-1β
IL-4I1
IL-6
IL-8
TNF
Signaltransduktionsmoleküle
DUSP1
DUSP5
BIRC3/MALT2
CDGAP
DDIT4
GADD45B
IRAK2
MARCKSL1
NFKB1
NFKB2
NFKBIZ
OPTN
PIM1
PIM3
RELB
RGS1
RGS16
RHOF
SLAMF1
SLAMF7
SOCS2
SPRED2
TBC1D4
TNFAIP3 (A20)
TRAF1
TRIP10
dual specificity phosphatase 1
dual specificity phosphatase 5
baculoviral IAP repeat-containing 3
Cdc42 GTPase-activating protein
DNA-damage-inducible transcript 4
growth arrest and DNA-damage-inducible, β
IL-1 Rezeptor assoziierte Kinase 2
MARCKS-like 1
NF-κB p105 / p50
NF-κB p100 / p49
NF-κB ζ
Optineurin
Pim-1 Onkogen
Pim-3 Onkogen (vorhergesagt)
v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B, NF-κB 3 (avian)
regulator of G-protein signalling 1
regulator of G-protein signalling 16
ras homolog gene family, member F
signaling lymphocytic activation molecule family member 1
SLAM family member 7
suppressor of cytokine signaling 2
sprouty-related, EVH1 domain containing 2.
TBC1 domain family, member 4
TNFα-induziertes Protein 3
TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor 1
Thyroidhormon-Rezeptor-interagierendes Protein 10
112
V. Anhang
Andrea Mahr
Transkriptionskontrolle
BCL3
B-cell CLL/lymphoma 3 (IκB-ähnliches Molekül)
BHLHB5
basic helix-loop-helix domain containing, class B, 5
CASZ1
castor zinc finger 1
EZH2
enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)
LHX2
LIM homeobox 2
POU2F2
POU domain, class 2, transcription factor 2
(OCT2)
ZC3H12A
zinc finger CCCH-type containing 12A
Rezeptoren und Oberflächenmoleküle
ABCA1
ATP-binding cassette, sub-family A, member 1
CCR7
chemokine (C-C motif) receptor 7
CD40
ICAM1
intercellular adhesion molecule 1 (CD54)
MCOLN2
Mucolipin 2
Enzyme
CYP27B1
MTHFS
SOD2
CLC
Cytochrom P450, Familie 27, Subfamilie B, Polypeptid 1
5,10-Methenyltetrahydrofolat-Synthetase
Superoxid-Dismutase 2 (mitochondrial)
Charcot-Leyden crystal protein
IFN-induzierbar
GBP1
guanylate binding protein 1, IFN-inducible
ISG20
interferon stimulated exonuclease gene 20kDa
Weitere
ABTB2
ADM (AM)
BTG3
C10ORF10
C15ORF48
EHD1
GRAMD1A
IER3
LOC342897
LOC401433
LYPD3
MGC42105
MYO1G
PVR
SLC1A3
SNX10
TNC
TNFAIP2
TNFAIP6
TNIP2
TUBB
TUBB2B
UBD
Ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 2
Adrenomedullin
BTG family, member 3
chromosome 10 open reading frame 10
chromosome 15 open reading frame 48
EH-domain containing 1
GRAM domain containing 1A
immediate early response 3
similar to F-box only protein 2
hypothetical gene
LY6/PLAUR domain containing 3
hypothetical protein
Myosin 1G
Poliovirus-Rezeptor
solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate transporter), 3
sorting nexin 10
Tenascin C (Hexabrachion)
TNFα-induziertes Protein 2
TNFα-induziertes Protein 6
TNFAIP3 interagierendes Protein 2
Tubulin β
Tubulin β 2B
Ubiquitin D
113
V. Anhang
Andrea Mahr
Tabelle VI.2.: Durch Annexin 1 mehr als zweifach inhibierte Gene
Signaltransduktionsmoleküle
BLNK
RGS18
B-cell linker (auch SLP-65, BASH)
regulator of G-protein signalling 18
Transkriptionskontrolle
EGR1
NFE2
MAFB
early growth response 1
nuclear factor (erythroid-derived 2)
v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B (avian)
Rezeptoren und Oberflächenmoleküle
CD86
ADORA3
CD14
CD1D (CD1A)
IL8RB
MS4A6A
TMEM37
CD86
Adenosin A3-Rezeptor, Transkriptvariante 3
CD14
CD1d
IL-8-Rezeptor β
membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6A
Transmembran-Protein 37
Weitere
C17ORF44
FAM19A3 (TAFA-3)
GIMAP4
LOC340843
MARCH1
chromosome 17 open reading frame 44
family with sequence similarity 19 (chemokine (C-C motif)-like), member A3
GTPase, IMAP family member 4
similar to protein of unknown function
membrane-associated ring finger (C3HC4) 1
114
V. Anhang
Andrea Mahr
V.3. Abkürzungsverzeichnis
7-AAD
7-Aminoactinomycin D
A
Adenin
ABC-Transporter ATP binding cassette-Transporter
AP-1
activator protein 1
APC
antigen presenting cell
Ask
apoptosis signal regulating kinase
ATF2
activating transcription factor 2
BAI1
brain-specific angiogenesis inhibitor 1
BCA
bicin choninic acid
BSA
bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
cAMP
cyclic adenosine monophosphate
CCL
CC-Chemokin-Ligand
CCR
CC-Chemokin-Rezeptor
CD
cluster of differentiation
COX2
Cyclooxygenase 2
CR
complement receptor
CXCL
CXC-Chemokin-Ligand
DAC5
detector of apoptotic cells 5
DNA
deoxyribonucleic acid
DC
dendritic cell
DC-SIGN
DC specific intracellular adhesion molecule 3 grabbing non-integrin
DEC-205
Decalektin, 205 kDa
DNAse
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxyribonukleosid-Triphosphat(e)
DTT
Dithiothreitol
ECL
enhanced chemoluminescence
EDTA
Ethylendiamin-Tetraacetat
EGF
epidermal growth factor
Egr1
early growth response 1
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
Erk
extracellular signal regulated kinase
FACS
fluorescence activated cell sorting
Fc
fragment crystallizable
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluoreszein-Isothiocyanat
115
V. Anhang
Andrea Mahr
fMLP
Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin
FoxP3
forkhead box P3
FPR
Formyl-Peptid-Rezeptor
FPRL
FPR-like
GAPDH
Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase
Gas6
growth arrest specific 6
GBP1
guanylate binding protein 1
GFP
green fluorescent protein
GM-CSF
granulocyte macrophage colony stimulating factor
GSH
Glutathion (reduziert)
GSK3β
Glykogensynthase-Kinase 3β
HAc
Essigsäure
HEK293
human embryonic kidney 293 (Zelllinie)
HLA
Humanes Leukozyten-Antigen
HMGB1
high mobility group box 1
HRP
horse radish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)
HSA
Humanes Serumalbumin
IDO
Indolamin-2,3-Dioxygenase
IFN
Interferon
IκBα
inhibitor of NF-κB α
IKK
IκB-Kinase
IL
Interleukin
ILT-4
immunoglobulin-like transcript 4
IP-10
IFNγ-inducible protein 10 (CXCL10)
IPTG
Isopropyl-Thiogalactosid
IRAK
IL-1-Rezeptor assoziierte Kinase
IRF
IFN-regulierender Faktor
ISG
IFN-stimuliertes Gen
JAK
Janus-Kinase
JNK
c-Jun N-terminale Kinase
LAL
Limulus Amöbozyten-Lysat
LPS
Lipopolysaccharid
LRR
Leucin rich repeat
MACS
magnetic cell sorting
Mal / TIRAP
MyD88 adaptor like / TIR domain containing adaptor protein
MAPK
mitogen activated protein kinase
MAPKKK
mitogen activated protein kinase kinase kinase
MCP-1
monocyte chemoattractant protein 1 (CCL2)
M-CSF
macrophage colony stimulating factor
116
V. Anhang
Andrea Mahr
MD2
myeloid differentiation 2
MEKK
mitogen Erk kinase kinase
Mer
(expressed in) monocytes and tissues of endothelial and reproductive origin
MFG-E8
milk fat globule EGF factor 8
MHC
major histocompatibility complex
MIP-2
macrophage inflammatory protein 1
MyD88
myeloid differentiation primary response gene 88
MyD88s
soluble MyD88
NF-κB
nuclear factor κ B
NFKBIA
NF-κB inhibitor, α (Gen für IκBα)
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
OPD
o-Phenylendiamin
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Pam2CSK4
(S)-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-I-cysteinyl(S)-seryl-(S)-lysyl-(S)-lysyl-(S)-lysyl-(S)-lysin
Pam3CSK4
N-palmitoyl-(S)-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]—I-cysteinyl(S)-seryl-(S)-lysyl-(S)-lysyl-(S)lysyl-(S)-lysin
PAMP
pathogen associated molecular pattern
PBS
phosphate buffered saline
PBST
phosphate buffered saline with Tween 20
PI3K
Phosphatidylinositol-3-Kinase
PKC
Proteinkinase C
PLA2
Phospholipase A2
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
Poly(I:C)
Polyinosin-Polycytidylsäure
PPAR
Peroxisom-Proliferator aktivierter Rezeptor
PRR
pattern recognition receptor
PTX3
Pentraxin 3
RANTES
regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted (CCL5)
RIN
RNA integrity number
RIP1
Rezeptor-interagierendes Protein 1
RNA
ribonucleic acid
RNAse
Ribonuklease
SARM
sterile α- and armadillo-motif-containing protein
SDS
sodium dodecyl sulfate
SLE
Systemischer Lupus Erythematodes
SOCS
suppressor of cytokine signalling
STAT
signal transducer and activator of transcription
TAB
TAK1-bindendes Protein
117
V. Anhang
Andrea Mahr
TAK1
TGFβ-aktivierte Kinase
TAM
Tyro3-Axl-Mer
TBK
Tank-bindende Kinase
TBS
Tris buffered saline
TBST
Tris buffered saline with Tween 20
TEMED
N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin
TGFβ
transforming growth factor β
TH
T-Helfer
TIM
T-Zell-Immunglobulin-und Mucin-Domäne
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF
Tumornekrosefaktor
Tpl2
tumor progression locus 2
TRAF
TNF-Rezeptor assoziierter Faktor
TRAM /
TRIF related adaptor molecule /
TICAM-2
TIR domain containing adaptor molecule 2
Treg
regulatorische T-Zelle(n)
TRIAD3A
two RING fingers and DRIL (double ring finger linked) 3A
TRIF /
TIR domain containing adaptor protein inducing ifnb /
TICAM-1
TIR domain containing adaptor molecule 1
U
Uracil
Ubc13
ubiquitin conjugating enzyme 13
Uev1A
ubiquitin E2 variant 1A
VEGF
vascular endothelial growth factor
vgl.
vergleiche
vs.
versus, gegenüber
z.B.
zum Beispiel
118
V. Anhang
Andrea Mahr
V.6. Erklärung
Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und
ohne fremde Hilfe angefertigt habe. Diese Arbeit wurde bisher an keiner anderen Universität
oder an einem anderen Fachbereich als Dissertation, Diplomarbeit oder ähnliche
Prüfungsarbeit eingereicht.
Heidelberg, im Oktober 2008-10-19
---------------------------------------Andrea Mahr
119
V. Anhang
Andrea Mahr
V.7. Danksagung
Zunächst gilt mein Dank Prof. Dr. Peter H. Krammer für die interessante Themenstellung und die
Betreuung meiner Arbeit. Ich möchte mich bedanken für seinen kritischen Blick auf Daten und Interpretationen und seine wissenschaftliche Unterstützung mit dem Hintergrund jahrzehntelanger Erfahrung. Ich schätze seine Begeisterung für die Wissenschaft wie auch die kritische Herangehensweise,
die er der ganzen Gruppe vermittelt.
Weiterhin möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Lutz Gissmann bedanken, der diese Arbeit
als Erstgutachter betreut. Ich bin ihm dankbar für die unkomplizierte Betreuung und die beratenden
Gespräche.
Dr. Alexander Dalpke danke ich ganz besonders für seine Bereitschaft, mich als externer Gutachter fachkundig zu beraten. Er hatte immer ein offenes Ohr und half mir sowohl durch seine Erfahrungen im Gebiet der TLR-Signaltransduktion wie auch durch Reagenzien und MyD88-defiziente
Mäuse. Auch Dr. Konrad Bode und Dr. Alexander Weber danke ich für hilfreiche Gespräche und Reagenzien.
Mein Dank geht auch an Dr. Bernhard Korn für die nette und fachkundige Unterstützung bei den
Genexpressionsanalysen.
Ein ganz besonderes Dankeschön gilt meinen Kollegen, ohne deren fachliche und moralische
Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Insbesondere danke ich allen derzeitigen und
ehemaligen Mitgliedern der Annexin-Gruppe: Dr. Heiko Weyd, Dr. Lucie Dörner, Dr. Dagmar Riess,
Björn Linke, Isabel Vogler, Bartec Berger und Julia Winter. Die enge Zusammenarbeit in diesem
Projekt war sehr fruchtbar und hat viel Spaß gemacht. Nur durch den gemeinsamen Einsatz konnte
das Annexin-Projekt von so vielen Seiten beleuchtet werden, und der wissenschaftliche und
technische Austausch war auch für meine Arbeit unverzichtbar.
Ich danke auch der gesamten Gruppe für die große Hilfsbereitschaft und den fachlichen Rat, die
die Bearbeitung meines Projekts sehr erleichtert haben. Danke für die freundschaftliche Atmosphäre,
durch die mir diese Arbeit viel Freude bereitet hat. Ich danke Dr. Rüdiger Arnold und der T-ZellGruppe für Gespräche und Reagenzien, und Cosima Kretz für gute Ratschläge bei den Annexin-Treffen und ihre Hilfsbereitschaft bei technischen Fragen. Christina Falschlehner aus der Walczak-Gruppe
danke ich für die Durchführung einiger quantitativer PCRs.
Für hervorragende technische Hilfe möchte ich mich bei meinen Auszubildenden Ann-Catherine
Klein und Christina Scheiner sowie bei Marlene Pach bedanken. Auch Sandra Pfrang, Linda Linke,
Denise Eberle und Daniela Muth danke ich für ihre gelegentliche technische Hilfe.
Ein Dank geht auch an Heidi Sauter für ihre administrative Unterstützung.
Die Präparation humaner DC wäre nicht möglich gewesen ohne die vielen Blutspender, bei denen
ich mich an dieser Stelle ebenfalls ganz herzlich bedanken möchte. Ebenso unverzichtbar waren Kollegen, die bereit waren, frühmorgens eine halbe Stunde zu opfern, um Blut abzunehmen: Bartec
Berger, Julia Heid, Dr. Annegret Kuhn, Raphael Klembt, Dr. Frank Westermann, Jan-Peter Linke,
Karina Drobbe, Dr. Christoffer Gebhardt und einige andere Mediziner, die aushalfen wenn gerade Not
am Mann war. Vielen Dank auch an sie.
Schließlich möchte ich meinen Freunden sowie insbesondere meinen Eltern und Brüdern danken,
die mich in allen Situationen tatkräftig unterstützt haben.
DANKE.
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