Datei

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
i
Abbildungsverzeichnis
v
Tabellenverzeichnis
vii
1 Einleitung
1.1 Tumorentstehung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1 Epidemiologie von Kopf–Hals–Karzinomen
1.2 Die Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1 Angeborene Immunantwort . . . . . . . . . .
1.2.2 Adaptive Immunantwort . . . . . . . . . . .
1.3 Immunogenität von Tumoren . . . . . . . . . . . . .
1.4 Tumorantigene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Immunevasion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6 Monozyten / Makrophagen . . . . . . . . . . . . . .
1.6.1 Zytokine und Chemokine . . . . . . . . . . .
1.6.2 Immunsuppression durch Tumoren . . . . .
1.6.3 Tumorassoziierte Makrophagen . . . . . . .
1.7 PGE , Cox und NSAIDs . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8 Zielsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2 Material
2.1 Antikörper . . . . . . . . . . . . . .
2.2 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . .
2.3 Chemikalien, Geräte und Sonstiges
2.4 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . .
2.5 Zellinien . . . . . . . . . . . . . . .
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3 Methoden
3.1 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1 Kultivierung permanenter Zellinien . . .
3.1.2 Zellzahlbestimmung . . . . . . . . . . . .
3.1.3 Aufbewahrung von Zellinien . . . . . . .
3.1.4 Rekultivierung eingefrorener Zellen . . .
3.1.5 Generieren von Zellkultur–Überständen
3.1.6 Ausfällen von Zellkultur–Überständen .
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Inhaltsverzeichnis
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
Isolierung von Monozyten . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Buffy Coats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Vollblut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.3 Aufbereitung der PBMZs . . . . . . . . . . . .
3.2.4 Anreicherung von Monozyten . . . . . . . . .
Nukleäre „Run-On“-Experimente . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Isolierung der Kerne aus Monozyten . . . . . .
3.3.2 „Run-On“-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.3 Hybridisierung der RNA auf cDNA–Filter . .
3.3.4 Waschen der cDNA–Filter . . . . . . . . . . . .
2–D Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Monozytenaufbereitung für die 2D–PAGE . .
3.4.2 1. Dimension: Isoelektrische Fokussierung . .
3.4.3 2. Dimension: SDS–PAGE . . . . . . . . . . . .
3.4.4 Färbemethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protein–Analysen über Maldi–ToF . . . . . . . . . . .
3.5.1 Trypsinverdau . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.2 Beschichten der Ankerplatte . . . . . . . . . .
3.5.3 MALDI–ToF Analyse . . . . . . . . . . . . . . .
Bakterienkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.1 Vermehrung und Aufbewahrung . . . . . . . .
3.6.2 Transformation von E. coli . . . . . . . . . . . .
Präparative Plasmidaufarbeitung . . . . . . . . . . . .
Agarose–Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . .
Isolierung von DNA–Fragmenten aus Agarose–Gelen
Transfektion von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.10.1 Lipofectamin–Transfektion . . . . . . . . . . .
3.10.2 Elektroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . .
FACS–Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11.1 Extrazelluläres FACS . . . . . . . . . . . . . . .
3.11.2 Intrazelluläres FACS . . . . . . . . . . . . . . .
Matrigel–Migrationsversuche . . . . . . . . . . . . . .
Westernblot (Immunblot) . . . . . . . . . . . . . . . .
Enzymimmunoassay (ELISA) und Bio-Plex–Messung
MTT Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sonstige . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4 Ergebnisse
4.1 Tumor–induzierte differentielle Genexpression in Monozyten . . . . .
4.1.1 Etablierung eines zellulären Systems zur Untersuchung von
Tumor–induzierten Veränderungen in Monozyten . . . . . . . .
4.1.2 Veränderungen im Proteom von Monozyten . . . . . . . . . . .
4.1.3 Veränderungen im Transkriptom von Monozyten . . . . . . . .
4.2 Interleukin-1 in primären Monozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 Tumorzellen induzieren die Produktion von IL-1 in primären
Monozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.2 Induziertes IL-1 wird sezerniert . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Inhaltsverzeichnis iii
4.2.3
4.2.4
4.3
4.4
Interleukin-1 – ein Tumormarker? . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tumorzell–Überstände regulieren die Expression zusätzlicher
Zytokine in Monozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Das Plasminogen Aktivator System in primären Monozyten . . . . . . .
4.3.1 Konditionierte Karzinomzell–Überstände induzieren die Produktion von intrazellulärem PAI-2 in Monozyten . . . . . . . . .
4.3.2 Regulation des Urokinase–Rezeptors auf Monozyten durch konditionierten Karzinomzell–Überstand . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.3 Tumorzell–Überstände beeinflussen die Migration von Monozyten durch extrazelluläre Matrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Etablierung zusätzlicher Systeme zur Untersuchung der Immunsuppression durch Tumore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.1 Ein zelluläres System zur Untersuchung von Cox-1 bzw. Cox-2–
vermittelten Veränderungen in Monozyten . . . . . . . . . . . . .
4.4.2 Identifikation löslicher Faktoren von Karzinomzellen . . . . . . .
5 Diskussion
5.1 Tumor-induzierte differentielle Genexpression in Monozyten . . . . . .
5.1.1 Etablierung zellulärer Systeme zur Untersuchung von Tumor–
induzierten Veränderungen in Monozyten . . . . . . . . . . . .
5.1.2 Veränderungen im Proteom und Transkriptom von Monozyten
5.2 Interleukin–1 in primären Monozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Konditionierter Karzinomzell–Überstand induziert die Produktion von IL-1 in primären Monozyten . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2 IL-1 – ein Tumormarker? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3 Konditionierter Karzinomzell–Überstand reguliert die Expression zusätzlicher Zytokine in Monozyten . . . . . . . . . . . . .
5.3 Das Plasminogen Aktivator System in primären Monozyten . . . . . .
5.3.1 Konditionierter Karzinomzell–Überstand induziert die Produktion von PAI-2 in primären Monozyten . . . . . . . . . . . . . .
5.3.2 Konditionierter Karzinomzell–Überstand beeinflußt die Expression des Urokinase–Rezeptors auf Monozyten sowie die Migration von Monozyten durch extrazelluläre Matrix . . . . . . . . .
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. 104
. 104
. 106
6 Zusammenfassung
109
Literaturverzeichnis
111
Abkürzungsverzeichnis
121
Danksagung
125
Lebenslauf
127