Optische Identifikation von Tumorgewebe unter dem Einfluss der

Optische Identifikation von Tumorgewebe
unter dem Einfluss der Laserablation:
Grundlagenstudie für die Etablierung einer
gewebespezifisch gesteuerten Tumorerkennung und Lasertumorresektion im
Kopf-Hals-Bereich
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.
Vorgelegt von
Andreas Amann
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
15. Juli 2014
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Priv.-Doz. Dr. Dr. F. Stelzle
Prof. Dr. Dr. E. Nkenke
Meinen lieben Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
2
3
Zusammenfassung ................................................................. 1
1.1
Hintergrund und Ziele ................................................................ 1
1.2
Methoden ................................................................................... 1
1.3
Ergebnisse und Beobachtungen ............................................... 2
1.4
Praktische Schlussfolgerungen ................................................. 2
Summary ................................................................................ 3
2.1
Background................................................................................ 3
2.2
Methods ..................................................................................... 3
2.3
Results ....................................................................................... 4
2.4
Practical Conclusions ................................................................ 4
Einleitung ................................................................................ 5
3.1
Epidemiologie ............................................................................ 5
3.2
Konventionelle Diagnostik und Behandlungsmethoden ............ 6
3.3
Lasertherapie ............................................................................. 7
4
Ziele ........................................................................................ 9
5
State of the Art ...................................................................... 10
5.1
5.1.1
Licht-Biogewebe-Wechselwirkungen: Autofluoreszenz ............ 10
5.1.2
Autofluoreszenzbasierte Differenzierung von pathologischem
Gewebe .................................................................................... 11
5.2
6
Optische Gewebedifferenzierung ............................................ 10
Laser ........................................................................................ 14
5.2.1
Vorteile des Lasers................................................................... 16
5.2.2
Nachteile des Lasers ................................................................ 17
5.2.3
Gewebeveränderungen durch die Ablation .............................. 18
Material und Methode ........................................................... 20
6.1
Gewebe ................................................................................... 20
6.2
Versuchsaufbau ....................................................................... 22
6.2.1
Setup Laser .............................................................................. 22
6.2.2
Setup Lichtfaser ....................................................................... 23
6.2.3
Anregung und Detektion ........................................................... 26
6.3
6.3.1
Festlegung der Messpunkte ..................................................... 27
6.3.2
Rote Messpunkte ..................................................................... 29
6.3.3
Blaue Messpunkte .................................................................... 29
6.3.4
Datenerhebung ........................................................................ 30
6.4
7
8
9
Versuchsdurchführung ............................................................ 27
Statistik .................................................................................... 38
Ergebnisse............................................................................ 40
7.1
Histopathologische Auswertung .............................................. 40
7.2
Autofluoreszenz vor Laserablation .......................................... 42
7.3
Autofluoreszenz nach Laserablation ....................................... 46
7.4
Vergleich vor und nach Laserablation ..................................... 50
Diskussion ............................................................................ 51
8.1
Diskussion der Ergebnisse ...................................................... 51
8.2
Schlussfolgerung ..................................................................... 59
Literaturverzeichnis ............................................................... 60
10 Abkürzungsverzeichnis ......................................................... 67
11 Danksagung ......................................................................... 68
12 Lebenslauf………………………………………………………..69
1
1 Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Plattenepithelkarzinome stellen mehr als 90% der bösartigen Neoplasien der
Mundhöhle dar. Bei der Therapie dieser Tumoren mit einem Laser wird dieser meist handgesteuert, der Operateur muss sich dabei auf visuelle Eindrücke sowie auf seine Erfahrung verlassen. Mit optischen Analyseverfahren zur
Gewebedifferenzierung könnte ein objektiver und zuverlässiger Feedbackmechanismus geschaffen werden, der den Laser während der Ablation präzise steuert. Es ist bislang jedoch unklar, ob Tumorgewebe auch dann noch
differenziert werden kann, wenn sich dessen optische Eigenschaften durch
die Laserablation verändern. Ziel dieser Studie ist es, die optische Identifikation von Tumorgewebe unter dem Einfluss der Laserablation zu untersuchen.
1.2 Methoden
Die Versuche wurden an oraler plattenepithelialer gesunder Schleimhaut (im
Randbereich des Tumorresektates) und an oralen Plattenepithelkarzinomen
durchgeführt. Das Gewebe stammte von 12 Resektaten, welche von der
Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik des Universitätsklinikums
Erlangen im Zuge einer Tumoroperation entfernt wurden. An jedem Resektat
wurden Autofluoreszenzdaten an nicht mit dem Laser abladiertem und an
abladiertem Gewebe erhoben. Es wurden 4 Messpunkte in tumorfreier
epithelialer und 4 Messpunkte in maligner epithelialer Schleimhaut gewählt.
Jeweils 2 der 4 Punkte wurden vor der Laserablation und die anderen 2 nach
der Ablation gemessen. Das Ausmaß der Laserablation sowie Malignität und
Dignität der Messpunkte wurden histopathologisch überprüft. Die histopathologische Auswertung gilt hierbei als Goldstandard bei der Beurteilung der
Gewebeeigenschaften. Für die Ablation wurde ein Er:YAG-Laser (2,94 µm,
Glissando)
mit
einer
Energie
von
500
mJ,
einer
Frequenz
von
10 Hz, einer Pulsdauer von 350 µs und einer Pulszahl von 30 Pulsen verwendet. Das Gewebe wurde durch eine Lichtquelle (200 Watt Hg) zur Autofluoreszenz angeregt, die Daten wurden mit einem Spektrometer (QE 65000,
2
200–950 nm) detektiert. Die Weiterleitung des Lichts erfolgte mit einem Lichtfasersystem (QR600-7-SR125BX, 200–1100 nm). Die detektierten Autofluoreszenzspektren wurden mit einer principal component analysis (PCA), gefolgt von einer linear discriminant analysis (LDA) analysiert und differenziert.
Um die Differenzierbarkeit des Gewebes darzustellen, wurden die area under
the curve (AUC), die Spezifität und die Sensitivität berechnet.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
An nicht abladiertem Gewebe konnte gesunde Schleimhaut von Plattenepithelkarzinomen mit einem Klassifikationsfehler von 23%, einer AUC
von 0.82, einer Sensitivität von 76% und einer Spezifität von 78% unterschieden werden. Bei den mit dem Laser abladierten Messpunkten war diese
Differenzierung mit einem Klassifikationsfehler von 13%, einer AUC von 0.92,
einer Sensitivität von 84% und einer Spezifität von 90% möglich.
1.4 Praktische Schlussfolgerungen
Auch nach der Laserablation, die Veränderungen am Gewebe verursacht,
kann mit der Autofluoreszenzspektroskopie gesunde epitheliale Schleimhaut
von oralen Plattenepithelkarzinomen differenziert werden. Die vorgelegte
Arbeit legt die Grundlage für die optische Identifikation von Plattenepithelkarzinomen auch nach der Laserablation und für einen optischen Feedbackmechanismus zur Lasersteuerung. Weitere Untersuchungen müssen durchgeführt werden, um zu überprüfen, wie diese Ergebnisse von ex vivo nach in
vivo übertragen werden können.
3
2 Summary
2.1 Background
More than 90 % of oral neoplasia turn out to be oral squamous cell carcinomas. If these tumors are medicated with a laser, which is usually controlled
manually, the surgeon must rely on visual impressions as well as on his experience. Optical analysis methods could provide an objective and reliable
feedback mechanism, which controls the laser precisely during ablation. So
far, however, it has been unclear whether tumor tissue can still be differentiated when changing its optical features by laser ablation. The aim of this
study is to examine the optical identification of tumor tissue under the influence of laser ablation.
2.2 Methods
The experiments were performed on oral squamous healthy mucosa (in the
border area of the resected tumor) and on oral squamous cell carcinomas.
The tissue originated from 12 resections that were removed by the Clinic of
Oral and Maxillofacial Surgery of the University Hospital Erlangen in the
course of tumor surgery. At each tissue resected, autofluorescence data
were taken from both not ablated and with an Er:YAG-laser ablated tissue. 4
measuring points in tumor-free epithelial mucosa and 4 measuring points in
malignant epithelial mucosa were chosen. Of these 4 points 2 were measured before and the other 2 after ablation. The degree of laser ablation as
well as malignancy and dignity of the measuring points were examined histopathologically. The histopathological evaluation is the gold standard in the
assessment of tissue properties. For ablation, an Er:YAG laser (2.94 µm,
Glissando) was used with an energy of 500 mJ, a frequency of 10 Hz, a
pulse duration of 350 µs and a pulse rate of 30 pulses. The tissue was excited by a light source (200 watt Hg) for autofluorescence, the data was detected with a spectrometer (QE 65000, 200-950 nm). The forwarding of the light
was performed with a light fiber system (7-QR600 SR125BX, 200-1100 nm).
The detected autofluorescence spectra were analyzed and differentiated with
4
a principal component analysis (PCA) followed by a linear discriminant analysis (LDA). To show the differentiability of the tissue, the area under the
curve (AUC), specificity and sensitivity were calculated.
2.3 Results
At non-ablated tissue, healthy mucosa could be distinguished from squamous cell carcinoma with a classification error of 23%, an AUC of 0.82, a
sensitivity of 76% and a specificity of 78%. At the laser ablated measuring
points this differentiation was possible with a classification error of 13%, an
AUC of 0.92, a sensitivity of 84% and a specificity of 90%.
2.4 Practical Conclusions
Even after laser ablation, which causes changes in the tissue, healthy epithelial mucosa can be differentiated from oral squamous cell carcinoma with autofluorescence spectroscopy. The work presented here set the base for the
optical identification of squamous cell carcinomas even after laser ablation
and for an optical feedback mechanism to control the laser. Further research
has to be done to prove how these results can be transferred from ex vivo to
in vivo.
5
3 Einleitung
3.1 Epidemiologie
Bösartige Tumoren gehören zu den häufigsten Todesursachen weltweit.
2008 gab es 12,7 Millionen Neuerkrankungen und mehr als 7,6 Millionen Todesfälle [28]. Die wachsende Zahl der Weltbevölkerung, eine höhere Lebenserwartung sowie der erhöhte Konsum kanzerogener Stoffe werden als
Gründe für eine steigende Zahl der Neuerkrankungen angegeben [48].
Oropharyngeale Tumoren gehören zu den häufigsten Tumoren überhaupt,
sie stellen die sechsthäufigste bösartige Neoplasie dar. Mehr als 90 % der
bösartigen Neoplasien der Mundhöhle sind Plattenepithelkarzinome [4, 50].
Die 5-Jahres-Überlebensrate der Plattenepithelkarzinome liegt bei 40 bis
50%, wobei sich die Prognose bei zunehmendem Tumorstadium deutlich
verschlechtert [43, 51].
Plattenepithelkarzinome können verschiedene Entstehungsursachen haben.
So können Papillomviren zu oralen Plattenepithelkarzinomen führen, ebenso
gilt ein jahrelanger Tabak- und Alkoholkonsum als Entstehungsursache [33,
70]. In 11% bis 67% der Fälle entstehen Tumoren der Mundhöhle aus
Präkanzerosen [93]. Diese Präkanzerosen treten häufig als Leukoplakie und
Erythroplakie auf. Das potentielle Entartungsrisiko dieser prämalignen Veränderungen beläuft sich auf 10% bis 90% [95, 105]. Früherkennung und eine
schnelle Therapieeinleitung führen zu einer besseren Heilungschance und zu
einer signifikant höheren Lebensqualität der Patienten [43]. Nur 22% der
Tumoren befinden sich bei Erstvorstellung im T1-Stadium, der Großteil oraler
Plattenepithelkarzinome wird erst in einem späteren Stadium erkannt (T2 bis
T4) [42]. Durch die Diagnose in einem späten Stadium werden meist große
operative Eingriffe mit einem ausgedehnten Gewebsverlust nötig. Die Metastasierung erfolgt meist lymphogen in die regionären Lymphknoten, die
5-Jahres-Überlebensrate ist bei Lymphknotenmetastasen signifikant niedriger [115].
6
3.2 Konventionelle Diagnostik und Behandlungsmethoden
Nach aktuellen Behandlungsrichtlinien gilt die klinische Kontrolle der Mundhöhle als das Mittel der Wahl zur Früherkennung oraler pathologischer Veränderungen [41, 84]. Bei verdächtigen Schleimhautveränderungen wird zunächst eine Anamnese erhoben. Danach sollten mögliche auslösende Faktoren der Veränderung minimiert oder ausgeschaltet werden. Nach zwei Wochen wird eine erneute Kontrolle der verdächtigen Veränderung vorgenommen. Als behandlungsnotwendig gelten diejenigen Läsionen, die nach zwei
Wochen keine Rückbildungstendenz zeigen und sich keiner anderen Grunderkrankung zuordnen lassen [23]. Besteht ein klinischer Verdacht oder ist
nach zwei Wochen keine Rückbildungstendenz zu erkennen, sind weitere
Schritte anzugehen, zentral sind hier die Biopsie sowie bildgebende Verfahren [58]. Das Tumorstaging erfolgt nach histologischer Sicherung, wenn ein
Karzinom nachgewiesen wurde.
Nachdem ein Plattenepithelkarzinom diagnostiziert und die notwendigen
Voruntersuchungen inklusive Staging abgeschlossen wurden, erfolgt die
Therapie. Die Therapie kann aus einer reinen chirurgischen Behandlung,
einer alleinigen Strahlentherapie, einer Kombination von Strahlen- und Chemotherapie oder aus der Kombination von chirurgischer, Strahlen- und Chemotherapie bestehen (abhängig von Tumorgröße und –lokalisation, Allgemeinzustand, funktionellen und ästhetischen Konsequenzen, Behandlungserfolg). Bei der operativen Therapie wird eine R0 Resektion (tumorfreie Resektionsränder) angestrebt, die intraoperativ mit der Schnellschnittdiagnostik
verifiziert werden kann. Eine verfehlte R0 Resektion verschlechtert die Prognose signifikant, deshalb kann eine Nachresektion nötig sein. Selbst bei klinisch unauffälligem Halsbefund besteht das Risiko einer okkulten Metastasierung. Deshalb wird die elektive Halslymphknotenausräumung generell
empfohlen [58]. Das genaue Ausmaß der Ausräumung der Lymphknoten
(Neck Dissection) richtet sich nach Lage und Größe der Tumoren. Die vollständige Exzision des Tumors ist das wesentliche Ziel der kurativen Tumortherapie. Ohne weitere Hilfsmittel wie der Schnellschnittdiagnostik ist
meist nicht klar, ob die Resektionsränder tumorfrei sind, dies beeinflusst aber
wesentlich die Rezidiv- und Überlebensrate des Patienten [116]. Der Opera-
7
teur weiß durch die präoperative Diagnostik, wie sich die ungefähre Tumorausdehnung darstellt, jedoch muss er sich während der Operation auf seine
Erfahrung und andere, zeitaufwändige diagnostische Verfahren wie die
Schnellschnittdiagnostik verlassen, um sicher zu gehen, dass er den Tumor
komplett entfernt hat. Diese Verfahren sind zeitintensiv, der aufwändige Prozess der histologischen Aufbereitung zur Klassifikation der Malignität gilt aber
als Goldstandard [27]. Insbesondere dann, wenn die Schnellschnittdiagnostik
ergibt, dass sich noch Tumorgewebe im Operationssitus befindet, ist eine
Verlängerung der Operationszeit zu erwarten. Es muss dann das restliche
pathologische Gewebe entfernt und anschließend das Procedere der
Schnellschnittdiagnostik wiederholt werden.
3.3 Lasertherapie
Laser werden bei pathologischen Veränderungen der Mundschleimhaut zum
einen bei der Entfernung gutartiger Veränderungen wie Fibrome, Lipome,
Papillome oder bei prämalignen Veränderungen wie Leukoplakien oder Lichen angewendet [108]. Es konnte gezeigt werden, dass nach der Behandlung oraler Leukoplakien mit einem Laser in 89% der Fälle keine Rezidive
auftraten [110]. Zum anderen werden Laser bei der Resektion kleiner, intraepithelialer Tumoren angewendet [49, 50]. Hierbei wird der Laser vor allem als ein oberflächlich abtragendes Instrument eingesetzt, das durch visuelle Kontrolle des Chirurgen gesteuert wird. In allen medizinischen Fachbereichen wird die Laserablation meist mit der menschlichen Hand gesteuert
[96].
Bei Karzinomen, die in tiefere Gewebeschichten reichen, kann die Lasertherapie aufgrund des fehlenden visuellen und taktilen Zugangs durch den Chirurgen zu iatrogenen Schäden an gesundem Gewebe führen. Die laserchirurgische Behandlung hat sich deshalb bisher nur für die oberflächliche Entfernung von Tumoren klinisch durchgesetzt, weil nur dabei der Laserabtrag
durch visuelle Kontrolle des Operateurs durchgeführt werden kann [40, 110,
114].
8
Wenn der Laser auch bei in tiefere Gewebeschichten reichende Tumoren
angewendet werden soll, sollte die Laserablation unabhängig von der visuellen und taktilen Kontrolle des Chirurgen gesteuert werden können. In der Industrie werden Laser im Gegensatz zur Medizin meist computer- oder robotergestützt eingesetzt [66, 79, 90]. Es gibt nunmehr in der Medizin erste Ansätze zur computergestützten Laserablation, mit der eine objektive und sichere Kontrolle der Ablation gewährleistet werden soll [5, 11].
9
4 Ziele
Bei der konventionellen Tumorresektion mit einem Skalpell wird durch die
Einhaltung
eines
Sicherabstandes,
die
intraoperative
Schnellschnitt-
diagnostik sowie die postoperative histologische Aufarbeitung des Gewebes
eine vollständige Entfernung des malignen Gewebes angestrebt. Wenn der
Laser in der Tumorchirurgie als Alternative zu einem Skalpell als universell
einsetzbares Instrument angewendet werden soll, sollte ein Feedbacksystem
geschaffen werden, mit dem der Laser tumorspezifisch gesteuert werden
kann. Mit diesem System sollte nicht nur oberflächlich, sondern auch in
tieferen,
nicht
einsehbaren
Gewebeschichten
noch
vorhandenes
Tumorgewebe identifiziert werden können. So könnte die Laserablation
gesteuert und dann gestoppt werden, wenn das Tumorgewebe komplett
entfernt wurde. Als Feedbacksystem zur Identifikation von pathologischem
Gewebe
können
Voraussetzung
ist,
berührungslose,
dass
optische
pathologisches
Analyseverfahren
Gewebe
auch
dienen.
nach
der
Laserablation mit diesen optischen Analyseverfahren identifiziert werden
kann. Dann kann der Laser in Verbindung mit optischen Messmethoden
berührungslos und tumorspezifisch Gewebe abladieren.
Ziel der ex vivo Studie an humanen oralen Geweberesektaten war es
deshalb,
gegenüber
die
Differenzierbarkeit
von
oralem
pathologischem
Epithel
oralem gesundem Epithel unter dem Einfluss einer Er:YAG-
Laserablation mit optischen Messmethoden zu untersuchen. Als optisches
Analyseverfahren wurde die Autofluoreszenzspektroskopie gewählt.
10
5 State of the Art
5.1 Optische Gewebedifferenzierung
5.1.1 Licht-Biogewebe-Wechselwirkungen: Autofluoreszenz
Die Anwendung der Autofluoreszenz in der Medizin als diagnostisches Hilfsmittel gehört zu den spektroskopischen Analyseverfahren. Mit Licht bestrahlte Atome und Moleküle werden in einen Zustand höherer Energie versetzt.
Beim Übergang vom Zustand höherer Energie zurück in den Grundzustand
wird die zuvor aufgenommene Energie in Form von elektromagnetischer
Strahlung frei. Fluorophore sind solche Atome und Moleküle, die zuerst
Energie aufnehmen, um diese dann in Form von elektromagnetischer Strahlung wieder freizusetzen. Fluorophore des Gewebes sind NADH, Tryptophan
oder Porphyrine [47]. Jene Eigenschaften können bei der Untersuchung von
Gewebe mit Autofluoreszenz genutzt werden. Die Eigenschaften der frei
werdenden elektromagnetischen Strahlungen sind gewebespezifisch. Durch
Detektion und Darstellung der verschiedenen Wellenlängen mittels Spektrometer können Rückschlüsse auf das bestrahlte Gewebe gezogen werden.
Die Fluoreszenzspektren ändern sich, wenn sich die Konzentration der Fluorophore ändert. Darüber hinaus kommt es zu Intensitäts- und Formänderungen abhängig vom Zellmetabolismus, der Epitheldicke oder der bakteriellen Besiedelung [70, 94]. Die Absorptionseigenschaften des eingestrahlten
Lichts sind abhängig vom Oxy- und Desoxyhämoglobingehalt [76]. Tumorzellen haben einen erhöhten Zellmetabolismus, der zu einer Veränderung des
NADH und NAD+ Gehaltes führt. Der Nachweis vermehrter NADH-Bildung
mit Autofluoreszenz kann als Nachweis eines erhöhten Zellstoffwechsels
dienen und Rückschlüsse auf malignes Gewebe geben [14, 26, 80]. Das Mononukleotid Flavin ist ein Koenzym bei der aeroben Glykolyse und fluoresziert stark, wenn es durch blaues Licht angeregt wird. Bei bösartig verändertem Gewebe läuft die Glykolyse meist anaerob ab, somit kann die verstärkte
Fluoreszenz ein Hinweis auf malignes Gewebe sein [27]. Pathologische Pro-
11
zesse führen zu veränderten optischen Eigenschaften des Gewebes durch
Veränderungen der Epitheldicke und/oder des Kollagengehaltes [80]. Außerdem können maligne Transformationen und ein damit einhergehender vergrößerter Zellkern zu einer verstärkten Streuung des eingestrahlten Lichts
führen [16, 18]. Zum Beispiel kann das eingestrahlte Licht bei einer Hyperkeratose die stark fluoreszendierende Kollagenschicht weniger stark zur Autofluoreszenz anregen, da die über der Kollagenschicht liegende verbreiterte
Epithelschicht einen großen Teil der ausgesandten Strahlung absorbiert [21].
Studien zeigten, dass verschiedene Fluorophore wie Porphyrine in Tumorgewebe vermehrt vorkommen, vermehrtes Fluorophorvorkommen kann damit Hinweise auf malignes Gewebe geben [45, 117]. Autofluoreszenz ist also
ein optisches Analyseverfahren, mit dem Rückschlüsse auf malignes Gewebe gezogen werden können. Das Verfahren ist schmerzfrei für den Patienten,
kostengünstig und berührungslos, was zu einer verbesserten Hygiene beiträgt. Es ist in seiner Wiederholbarkeit kaum beschränkt, gesundheitliche
Risiken sind nicht zu erwarten. Insgesamt ist das Verfahren schnell und einfach durchzuführen, auch eine klinische Anwendung im Sinne einer Mundhöhlenkontrolle mit Autofluoreszenzverfahren ist technisch umsetzbar [106].
5.1.2 Autofluoreszenzbasierte Differenzierung von pathologischem
Gewebe
Die Früherkennung von prämalignem und malignem Gewebe ist sehr bedeutend, da die Heilungschance erhöht, die Invasivität des Eingriffs verringert
und die Lebensqualität für den Patienten verbessert werden können [43, 44].
Bei der Therapie maligner Veränderungen gewährleistet eine vollständige
Entfernung des Tumors beste Heilungschancen für den Patienten [83].
Grundsätzlich besteht die Gefahr der Feldkanzerisierung, was der Forderung
nach einer vollständigen Tumorentfernung zusätzlichen Ausdruck verleiht
[43, 120]. In einer Arbeit von Yang et al. wurde das Gewebe zur Autofluoreszenz durch einen Xenon Laser bei einer Wellenlänge von 365 nm angeregt.
Die ex vivo Studie an humanem resiziertem Gewebe umfasste über 50 Resektate, darunter Magen, Zunge, Unterkiefer und Speiseröhre. Im Gegensatz
zu peripherem Tumorgewebe konnten bei Gewebe im Tumorzentrum wegen
12
der zunehmenden Zellnekrose keine für Epithel gewebespezifischen Autofluoreszenzpeaks festgestellt werden. Dennoch konnten in malignem Gewebe
zwei charakteristische Peaks bei 630 und 690 nm der detektierten Autofluoreszenzdaten gefunden werden. Diese Peaks entstehen laut Yang et al.
nicht durch die Tumorzellen selbst, sondern durch Porphyrine, die beim Zerfall von Hämoglobin entstehen. Diese Porphyrine lagern sich in Tumorgewebe an und können als Nachweis von malignem Gewebe dienen. Mit dieser
Methode konnte eine Übereinstimmung der Tumordifferenzierung von 89%
mit der traditionellen Biopsie erreicht werden [117]. In einer Studie von Gillenwater et al. wurde Licht mit den Wellenlängen von 337, 365 und 410 nm
zur Autofluoreszenzanregung ausgesendet. Eine Lichtfaser bestrahlte das
orale Gewebe mit Licht und detektierte gleichzeitig die Autofluoreszenzspektren. Die in vivo Studie wurde an 8 gesunden Patienten durchgeführt und an
15 Patienten, die unter einer prämalignen Veränderung oder einem Plattenepithelkarzinom litten. Die Intensität der Autofluoreszenzspektren war bei
gesundem Gewebe höher als bei bösartig verändertem. Die beste Differenzierung zwischen gesundem Gewebe und Plattenepithelkarzinomen gelang
bei den Anregungswellenlängen von 337 und 410 nm. Bei 337 nm konnte
eine Sensitivität von 88% und eine Spezifität von 100% erreicht werden [31].
In einer in vivo Studie mit 70 gesunden Patienten und 155 Patienten mit gutoder bösartigen Veränderungen, von denen 16 Läsionen Plattenepithelkarzinome waren, erfolgte die Anregung zur Autofluoreszenz über eine Xenonlampe bei den Wellenlängen 365, 385, 405, 420, 435 und 450 nm. Die Weiterleitung des Anregungslichts und die Detektion der Spektren erfolgte über
eine Lichtfaser. Die Unterscheidung von Tumor und gesundem Gewebe gelang mit einer Sensitivität von 94% und einer Spezifität von 94%. Die Wellenlänge des eingestrahlten Lichts veränderte die Ergebnisse nicht signifikant
[20]. Tabelle 1 zeigt weitere Methoden und Ergebnisse, mit denen gesundes
orales Gewebe von malignen Veränderungen durch die Autofluoreszenzspektroskopie differenziert werden kann.
13
Autor und
Wellenlänge
ex vivo/
Läsio-
Jahr
Anregung
in vivo
nen
Coghlan, L.
350-370 nm
In vivo
31
et al. (2000)
400- 450 nm
Tiere
[17]
Methode
Ergebnis
Auswertung
Sens. 90 %
einer Fluores-
Spez. 90 %
zenzAnregungsEmissionsMatrix
Kolli, V. R.
200- 430 nm
et al. (1995)
In vivo
19
Mensch
[55]
Auswertung des
Sign. Un-
Wellenlängen-
terschied
verhältnisses
von Emission
und Anregung
Inaguma,
410 nm
M. et al.
In vivo
121
Mensch
(1999)
Auswertung
Porphyrinty-
porphyrin-
pische Fluo-
typischer Peaks
reszenz bei
[45]
85% der
Tumoren
und 3% des
gesunden
Gewebes
Schantz,
290- 415 nm
S.P. et al.
In vivo
35
Mensch
Maximum der
Maximum
Anregung
geringer bei
(1998)
Verlust der
[92]
Tumordifferenzierung
Betz, C. S.
375- 440 nm
et al. (1999)
In vivo
36
Mensch
[7]
Messen der
Geringere
Intensität bei
Intensität der
511 nm
Spektren bei
Tumoren
Onizawa, K.
et al. (1996)
[73]
360 nm
In vivo
Mensch
32
Aufnahme der
Sens. 88%
Autofluoreszenz
Spez. 94 %
mit einer Kamera
Tabelle 1: Differenzierung von oralen Tumoren und gesundem Gewebe mit der berührungslosen Autofluoreszenzspektroskopie
14
In einer Arbeit von Roblyer et al. konnte bei einer Anregungswellenlänge von
405 nm mit einer Sensitivität von 100% und einer Spezifität von 91% orale
gesunde Schleimhaut von einer Dysplasie beziehungsweise einem invasiven
Tumor differenziert werden. Die in vivo Studie mit 67 Patienten beschreibt die
Möglichkeit, mit der Autofluoreszenzspektroskopie eine „optische Landkarte“
des Gewebes zu entwerfen. Damit konnte präoperativ die Lokalisation und
Ausdehnung der Gewebeveränderung dargestellt werden [88].
Die Übertragung dieser Technik - der optischen Differenzierung von physiologischem und pathologischem Gewebe - von der präoperativen in eine intraoperative Diagnostik wurde bislang nicht ausreichend wissenschaftlich untersucht.
5.2 Laser
Moderne Laser basieren auf dem System einer selektiven Photothermolyse.
Hierbei werden Laser mit einer Wellenlänge und einer bestimmten Pulsdauer
eingesetzt, die spezifisch von sogenannten Zielmolekülen absorbiert werden. Diese Zielmoleküle heißen Chromophore und können zum Beispiel Melanin, Hämoglobin oder Wasser sein. Bei Lasern, deren ausgesandte Wellenlängen weniger spezifisch für Chromophore sind, also nicht so spezifisch für
bestimmte Gewebearten, kommt es häufiger zu Schäden an umliegendem
Gewebe [1, 71].
Der Er:YAG-Laser hat eine Wellenlänge von 2.94 µm. Diese Wellenlänge
entspricht fast dem Absorptionsmaximum von Wasser (3 µm), der Absorptionskoeffizient für die Wellenlänge des Er:YAG-Lasers von Wasser beträgt
ca. 10.000/cm [36]. Wasser ist der Chromophor, der in biologischem Gewebe
am häufigsten vorkommt, der Wassergehalt bestimmt maßgeblich die optischen und thermischen Eigenschaften des Gewebes [36, 113]. Die Energie
des Lasers wird sehr gut und schnell von Wasser, das sich im beschossenen
Gewebe befindet, aufgenommen [25]. Die Temperatur steigt dabei sehr
schnell an, bis das Wasser kocht. Es kommt zu einer Mikroexplosion im beschossenen Gewebe, da der Dampfdruck durch das Kochen des Wassers
15
schlagartig ansteigt [9, 82]. In Folge dessen lösen sich kleine Mikropartikel
aus dem Gewebe.
Mit einem Er:YAG-Laser können ausreichende Ablationsraten pro Puls erreicht werden (über 400 µm für Weichgewebe und 90 µm für Hartgewebe),
die ein schnelles chirurgisches Schneiden gewährleisten [112]. Bei diesem
Vorgang wird fast die gesamte Laserenergie in Wärme umgewandelt, die
dann das Wasser zum Kochen bringt. Die Energie wird nur selektiv von dem
direkt beschossenen Gewebe aufgenommen, dadurch kommt es im umliegenden Gewebe kaum zu thermischen Schäden mit einem sehr kleinen Nekrosebereich. Dieser Nekrosebereich kann auf maximal 50 µm um die Ablationsstelle herum beschränkt werden [39].
Dies führt zu einer schnellen
Wundheilung von Hart- und Weichgewebe mit nur geringem Risiko einer
Narbenbildung [52, 72, 119].
Studien zeigen, dass bei der Laserablation der Wundheilungsprozess der
Haut durch die entstehende Wärme sogar positiv beeinflusst werden kann
[13]. In einer Arbeit von Pourzarandian et al. konnte sieben Tage nach der
Ablation mit einem Er:YAG-Laser an abladiertem Knochengewebe eine zellreiche Granulationsschicht mit Fibroblasten und Osteoblasten festgestellt
werden, 14 Tage nach Ablation war eine signifikant höhere Knochenneubildung zu sehen als nach der Ablation mit einem CO2-Laser oder nach rein
mechanischem Bohren [81]. Des Weiteren können durch die Ablation mit
einem Er:YAG-Laser sehr präzise Schnitte sowohl für Hart- als auch für
Weichgewebe durchgeführt werden [46, 56]. Obwohl Studien gezeigt haben,
dass die Koagulation auch in tieferen Bereichen unter der Epidermis-DermisGrenze durch die Ablation mit einem Er:YAG-Laser leicht unterstützt werden
kann, gilt der fehlende blutstillende Effekt als Nachteil des Er:YAG-Lasers
[63]. Trotzdem kann der Er:YAG-Laser als Alternative zu kaltschneidenden
Methoden bei minimaler mechanischer und thermischer Belastung fungieren
[29]. Aufgrund seiner kurzen Pulsdauer kann mit dem Er:YAG- Laser zuverlässig und ohne große Nekroserisiken Knochen geschnitten werden [11, 85].
16
5.2.1 Vorteile des Lasers
Das Standardwerkzeug zum Entfernen eines Tumors ist das Skalpell. Jedoch
bietet das Schneiden mit einem Skalpell einige Nachteile. Zum einen kann
die Sicht für den Operateur auf das Operationsgebiet durch das Skalpell verschlechtert oder unmöglich gemacht werden. Zum anderen kann es durch
eine mechanische Irritation des Gewebes dazu kommen, dass Tumorzellen
in andere Gewebeschichten verteilt werden [62].
Eine alternative Methode zum Skalpell bietet die chirurgische Laserablation
von Tumorgewebe. Mit dieser Methode können vor allem oberflächliche Behandlungen von oralem pathologischem Gewebe durchgeführt werden [50,
108]. Tierexperimentelle Studien zeigten, dass der therapeutische Effekt bei
Anwendung eines Lasers größer ist als beim Schneiden mit einem Skalpell.
Die laseroperierten Tiere hatten sowohl eine längere Überlebensrate als
auch längere Intervalle ohne Rezidive [62, 109]. Die Behandlung mit einem
Laser hat weitere Vorteile gegenüber dem Schneiden mit einem Skalpell. Die
Laserablation ist berührungslos und es kommt nicht zur Kompression von
Gewebe in der unmittelbaren Umgebung zur Schnittstelle. Darüber hinaus
lassen sich durch einen Laser grazilere Schnitte durchführen, was gerade im
Bereich des Kopfes ein wesentlicher Vorteil ist. Durch berührungsloses Arbeiten wird die Hygiene verbessert. Der Operateur hat eine bessere Übersicht über die Operationsstelle, da im Moment des Schneidens kein Skalpell
die Sicht auf die Schnittstelle verschlechtert [107]. Ein weiterer Vorteil der
Laserchirurgie ist die flexible Schnittgeometrie, die es auch erlaubt, schwer
zugängliche Bereiche zu erreichen [11, 102]. Deswegen werden Laser auch
in der endoskopischen Chirurgie eingesetzt [97]. Außerdem konnte gezeigt
werden, dass die Überlebenswahrscheinlichkeit verbliebener Tumorzellen in
dem Gewebe, das vorher mit einem Laser abladiert wurde, sehr gering ist
[74].
17
5.2.2 Nachteile des Lasers
Trotz der vielen Vorteile der Laserchirurgie gibt es einen wesentlichen Nachteil. Beim Schneiden mit einem Skalpell kann der Operateur sehr gut abschätzen, in welchem Gewebe er sich befindet, da er direkt mit seiner Hand
am Skalpell schneidet und beispielsweise merkt, wenn er auf Knochen trifft.
Bei der Laserchirurgie schneidet der Lichtstrahl berührungsfrei, das heißt,
dem Operateur fällt es schwer, den Laserabtrag genau zu steuern. Der Operateur kann nur bei oberflächlicher Anwendung des Lasers durch direkte visuelle Kontrolle des Ablationsfeldes beurteilen, in welchem Gewebe der Laser gerade schneidet. Die Anwendung von Lasern in der Medizin hat sich
daher momentan nur bei der Behandlung von oberflächlichen Gewebeschichten klinisch durchgesetzt. So werden zum Beispiel die Hornhaut und
Netzhaut des Auges [57], die respiratorische Schleimhaut [54], die parodontale Schleimhaut und Zähne [22, 30, 60, 89], die äußere Haut [12, 68] und
kleinere oberflächliche Tumoren [40, 110, 114] mit einem Laser behandelt.
Soll das Schneiden mit einem Skalpell durch das mit einem Laser ersetzt
werden, sollte auch in tieferen Gewebeschichten abladiert werden. Der Operateur hat dann keine visuelle Kontrolle, in welchen Gewebeschichten gerade
mit dem Laser geschnitten wird [56, 102]. Dies kann zu ungewollten Schäden
an tieferen gesunden Gewebeschichten führen [78]. Insbesondere im Kopfund Halsbereich befinden sich viele anatomische Strukturen wie Nerven und
Blutgefäße, die sehr nahe nebeneinander liegen und geschont werden müssen [109]. Werden diese Strukturen zerstört, kann es zu motorischen, ästhetischen und sensorischen Einschränkungen sowie zu Einschränkungen der
Sensibilität kommen [6, 67, 75].
Bei der Behandlung von Tumoren mit einem Laser muss sich der Operateur
auf seine Erfahrung, die visuellen Eindrücke während der Operation und auf
die präoperativ diagnostizierte Tumorausdehnung verlassen, um den gesamten Tumor zu entfernen. Nach der Laserablation ist es nicht immer möglich,
die Tumorfreiheit durch eine histopathologische Untersuchung zu überprüfen,
da das Gewebe karbonisiert ist. Somit fehlen objektive Kriterien zur Sicherstellung, dass das pathologische Gewebe komplett entfernt wurde. Die voll-
18
ständige Exzision des Tumors ist aber, wie bereits erläutert, ein wesentlicher
Aspekt in der kurativen Tumortherapie. Nur dadurch werden beste Heilungschancen für den Patienten gewährleistet [83].
5.2.3 Gewebeveränderungen durch die Ablation
Durch die Ablation kommt es zu Veränderungen am Gewebe. Diese Veränderungen sind histologisch feststellbar.
Autor und Jahr
Gewebeveränderung nach Laserablation
Chen, B. et al. (2008)
Nekrose der epidermalen Zellen, intravaskuläre
[15]
Thrombosen, perivaskuläre Entzündung, Ödeme
in Blutgefäßen
Rico, P. J. et al. (2000)
Pyknose, Verlust der Zellstruktur, Koagulations-
[87]
nekrose
Zaffe, D. et al. (2004)
Bläschen, Erosionen, Ödeme
[119]
D'Arcangelo, C. et al.
Wundheilung verzögert, Kollagendenaturierung
(2007) [19]
Luomanen, M. (1987)
Entzündungszellen, verzögerte Revaskularisie-
[61]
rung
Tabelle 2: Gewebeveränderungen nach Laserablation
Vaporisation, Karbonisation und Koagulation sind Vorgänge, die während der
Laserablation am Gewebe stattfinden. In einer Studie von McKenzie et al.
konnten nach der Laserablation diese drei Zonen beobachetet werden: Karbonisations-, Vakuolisierungs- und Koagulationszone [65]. Die Veränderungen des Gewebes durch eine Laserablation sind nicht nur histologisch feststellbar, sondern es ändern sich auch die optischen Eigenschaften des beschossenen Gewebes. So können bei hohen Energiedosen wegen der Karbonisationszone die Absorptionsquote des eingestrahlten Lichts erhöht und
das optische Spektrum geschwächt werden. Dagegen kann es bei geringer
19
Koagulation des Gewebes zu einer Erhöhung der Reflexionsrate des eingestrahlten Lichts kommen [118]. Die Vakuolisierungszone besteht aus Blasen
und Aufwölbungen, die durch das kochende Wasser bei der Laserablation
entstehen. Die Koagulationszone entsteht durch die Koagulation von Proteinen. Durch die entstehende Koagulation von Blutgefäßen entsteht ein hämostatischer Effekt [34]. Die daraus resultierende Veränderung der Gewebedurchblutung kann auch zu einer Veränderung der optischen Eigenschaften
des Gewebes führen, da die Absorptionsquote wesentlich vom Oxy- und
Desoxyhämoglobingehalt des Gewebes abhängt [76]. Die genannten Veränderungen sind auch an pathologischem Gewebe zu erkennen [21, 88].
20
6 Material und Methode
6.1 Gewebe
Die Versuche wurden ex vivo an Resektaten von Plattenepithelkarzinomen
der Mundhöhle durchgeführt. Das für die Versuche benötigte Gewebe
stammte von Patienten der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen, alle Patienten befanden sich zur
Behandlung eines oralen, primär aufgetretenen Plattenepithelkarzinoms in
stationärer Behandlung und wurden einer Operation unterzogen. Als für die
Studie geeignet galten alle erstmals aufgetretenen oralen Plattenepithelkarzinome (also keine Rezidive oder Nachresektionen), die operativ entfernt
werden mussten. Außerdem musste auf dem Resektat genug Platz sein, um
alle Messungen mit ausreichendem Abstand voneinander (mindestens 5mm)
durchzuführen.
Tabelle 3 zeigt die Häufigkeitsverteilung der TNM-Klassifikation des Patientenguts, während Tabelle 4 die Lokalisation der Resektate zeigt. Die Patientenkohorte bestand aus zehn männlichen und zwei weiblichen Patienten, das
Durchschnittsalter lag bei 61,8 Jahren.
TNM
T
N
M
Klassifikation
Anzahl
1
4
2
3
3
3
4
2
0
8
1
0
2
4
0
5
1
7
Tabelle 3: TNM-Klassifikation des Patientenguts
21
Lokalisation
Anzahl
Unterkiefer
4
Mundboden
4
Zunge
2
Wange
1
retromolar
1
Tabelle 4: Lokalisation der Resektate
Alle Patienten, die als potentielle Teilnehmer an der Studie galten, wurden
vor der Operation über die Teilnahme aufgeklärt. Das Resektat wurde nach
dessen
konventioneller
Resektion
durch
einen
Mund-Kiefer-
Gesichtschirurgen des Universitätsklinikums Erlangen zunächst nicht in Formalin, sondern in isotoner Kochsalzlösung (NaCl 0.9%, 100ml, B.Braun
Melsungen AG) in einer Plastikbox bei konstant 22 Grad Celsius gelagert.
Der Zeitrahmen zwischen der Resektion des Tumors und dessen Abholung
für die Versuchsdurchführung betrug maximal 30 Minuten. Die Versuche
wurden immer am Operationstag mit einer gesamten ex vivo Zeit von maximal 3 Stunden bei 22 Grad Celsius durchgeführt.
Die Studie wurde durch die Ethik-Kommission der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg genehmigt (Antragsnummer: 245-12 B).
22
Abbildung 1: Resektat nach Abholung in der OP-Abteilung. Fadenmarkierungen
wurden vom Chirurgen angebracht
6.2 Versuchsaufbau
6.2.1 Setup Laser
Für die Laserablation wurde ein Er:YAG-Laser (2,94 µm, Glissando, WaveLight TM, Germany) mit einer Energie von 500 mJ (3.97 J/cm²/Puls), einer
Frequenz von 10 Hz und einer Pulsdauer von 350 µs verwendet. Die Pulszahl betrug 30 Pulse, die Pause zwischen den Pulsen 110 µs. Während der
Laserablation wurde das Gewebe durch ein Spraysystem mit Kochsalzlösung
(NaCl 0.9%, 100ml, B.Braun Melsungen AG) gekühlt. Die Temperatur der
Kühlflüssigkeit betrug 22 Grad Celsius. In einer 10 Resektate umfassenden
Vorversuchsreihe wurde die für die Studie verwendete Laserenergie evaluiert. An den 10 Gewebsresektaten wurde jeweils gesundes epitheliales Ge-
23
webe sowie malignes epitheliales Gewebe mit verschiedenen Laserenergien
beschossen. Nach der histopathologischen Auswertung der Messpunkte bezüglich der Ablationstiefe und –breite wurde die Laserenergie auf 500 mJ
festgelegt.
6.2.2 Setup Lichtfaser
Für die Weiterleitung des Lichts wurde ein Lichtfasersystem (QR600-7SR125BX, 200–1100 nm; Ocean Optics W, Dunedin, Florida, USA) benutzt.
Dieses System bestand aus insgesamt drei Fasern, die y- förmig angeordnet
waren. Eine Faser endete an der Lichtquelle (Abbildung 2, a) und bestand
aus sechs einzelnen Fasern. Die an der Lichtquelle endende Faser diente
dazu, das durch die Lichtquelle ausgesandte Licht an das Gewebe weiterzuleiten. Die zweite Faser endete am Spektrometer (Abbildung 2, b) und bestand aus einer zentralen Faser, die dazu diente, das durch das Gewebe
emittierte Licht aufzunehmen und an das Spektrometer weiterzuleiten. Die
dritte Faser (Anregungs- und Aufnahmefaser), die in Abbildung 2 als c markiert ist, endete direkt am Gewebe (Abbildung 2, d) und diente einerseits zur
Bestrahlung des Gewebes mit dem Licht aus der Lichtquelle und andererseits zum Detektieren des durch das Gewebe emittierten Lichts. Diese dritte
Faser war die Messsonde und hatte insgesamt sieben Fasern - die sechs
Fasern der Lichtquelle (Anregungsfasern) und die zentrale Faser (Aufnahmefaser) für das Spektrometer.
24
Abbildung 2: Lichtfasersystem
Der optimale Abstand der Messsonde zum Ablationsspot wurde während der
10 Resektate umfassenden Vorversuchsreihe evaluiert. Zunächst wurde der
Abstand auf 15 mm festgelegt. Es zeigte sich dabei, dass der Lichtkegel, den
die Messsonde auf den Ablationsspot warf, größer war als der abladierte
Spot selbst. So musste davon ausgegangen werden, dass nicht nur das abladierte Gewebe durch das ausgesandte Licht zur Autofluoreszenz angeregt
wurde, sondern ebenfalls das umliegende Gewebe, das zwar durch den
Lichtkegel bestrahlt, jedoch vorher nicht abladiert wurde. Dadurch wurden
nicht nur die optischen Eigenschaften des abladierten Gewebes detektiert,
sondern auch die des nicht abladierten.
25
Abbildung 3: optische Messung direkt am Ablationsort mit 15 mm Messabstand
a) Spektrometer
c) Reflection/backscattering probe
b) Lichtquelle
d) Gewebe
Der Abstand der Messsonde zur Gewebeoberfläche wurde auf 5 mm reduziert. Damit konnte sichergestellt werden, dass ausschließlich das durch den
Laser abladierte Gewebe zur Autofluoreszenz angeregt wurde und auch nur
die optischen Eigenschaften des vorher mit dem Laser abladierten Gewebes
detektiert wurden.
26
Abbildung 4: Ausbreitung des Lichtkegels bei einem Messsonde-Gewebe-Abstand
von 5 mm
6.2.3 Anregung und Detektion
Das Gewebe wurde durch eine Lichtquelle (Mercury, Newport 200 Watt Hg;
Oriel Apex Fiber Illuminator; Oriel Instruments, Stratford, Connecticut, USA)
mit einem Filter bei 377 nm (Bandpassfilter 377 ± 50 nm, Edmund Optics,
Karlsruhe, Deutschland) zur Autofluoreszenz angeregt. Die Weiterleitung des
Lichts erfolgte mit dem in Kapitel 6.2.2. erläuterten Lichtfasersystem. Das
vom Gewebe zurückgestrahlte Licht wurde mit einem Spektrometer detektiert
(QE 65000, 200–950 nm; Ocean OpticsW, Dunedin, Florida, USA). Mit dem
Programm Spectra Suite wurden die Daten graphisch am Computer dargestellt, es wurden 30 Messungen pro Messpunkt mit einer Integrationszeit von
50 ms durchgeführt.
Um die Messergebnisse nicht durch eine zu hohe Tageslichteinstrahlung zu
beeinflussen, wurde der Messraum verdunkelt. Jedoch wurden die Versuche
nicht in kompletter Dunkelheit durchgeführt, da dies praxisferne Operationsbedingungen wären.
27
Abbildung 5: Setup für die Versuchsdurchführung
6.3 Versuchsdurchführung
6.3.1 Festlegung der Messpunkte
Das Gewebe wurde zunächst vorsichtig gereinigt. Dies geschah durch Abtupfen mit einem in isotoner Kochsalzlösung (NaCl 0.9%, 100ml, B.Braun
Melsungen AG) getränkten Wattestäbchen. Insgesamt wurden 8 Messpunkte
festgelegt: 4 in der als tumorfrei klassifizierten Schleimhaut (im Bereich der
gesunden Schleimhaut, die als Sicherheitsabstand bei der Resektion des
Tumors mit entfernt wurde) und 4 Messpunkte in der als Plattenepithelkarzinom klassifizierten Schleimhaut. Die Festlegung der Messpunkte auf dem
Resektat erfolgte visuell und mit der Erfahrung eines Facharztes für Mund-,
Kiefer- und Gesichtschirurgie. Die anschließende histopathologische Auswertung durch das Pathologische Institut des Universitätsklinikums Erlangen
28
überprüfte, ob die Klassifikation vor den Versuchen (als Tumor beziehungsweise als gesunde Schleimhaut) dem tatsächlichen Sachverhalt entsprach.
Der Abstand zwischen den einzelnen Messpunkten betrug immer mindestens
5 mm. Dadurch wurde vermieden, dass ein Teil des Gewebes durch den Laser mehrfach beschossen wurde, außerdem konnte das Pathologische Institut dadurch die Messpunkte eindeutig voneinander unterscheiden, was eine
sichere Aussage über die Malignität der untersuchten Schleimhautareale ermöglichte.
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Verteilung der Messpunkte
Die insgesamt 8 Messpunkte wurden mit einer Nadel, an der ein Plastikfähnchen angebracht war, markiert. Es wurden je 2 Messpunkte im Tumor und im
tumorfreien Resektionsrand mit an Nadeln befestigten roten Plastikfähnchen
markiert, außerdem je 2 Messpunkte im Tumor und im tumorfreien Resektionsrand mit an Nadeln befestigten blauen Plastikfähnchen.
29
6.3.2 Rote Messpunkte
Die rot markierten Messpunkte wurden zuerst mit dem Laser abladiert, anschließend wurden die optischen Eigenschaften des abladierten Epithels erhoben. Eine Datenerhebung vor der Laserablation fand an diesen Messpunkten nicht statt.
6.3.3 Blaue Messpunkte
Bei den blau markierten Messpunkten wurden die Autofluoreszenzdaten erhoben und es wurde keine Laserablation durchgeführt. Da die Messpunkte
nicht abladiert wurden, konnte die Histopathologie diese Messpunkte genau
in dem Zustand auswerten, in dem die Punkte auch gemessen wurden. Hätte
an diesen Punkten anschließend an die Datenerhebung eine Laserablation
stattgefunden, so hätte histologisch nicht mehr der Zustand des Gewebes
vor der Laserablation erfasst werden können. Folglich hätte nicht sicher
nachgewiesen werden können, ob die Autofluoreszenzdaten vor Laserablation tatsächlich im tumorfreien Gewebe beziehungsweise im Tumor aufgenommen wurden und ob tatsächlich Epithel gemessen wurde.
Durch Einkerbungen in den Plastikfähnchen bei den roten und bei den blauen Messpunkten konnte außerdem erkannt werden, ob sich der Messpunkt in
der als Tumor beziehungsweise in der als tumorfrei klassifizierten Schleimhaut befand. Die Nadelmarkierungen zeigten also zwei Parameter auf: ob es
sich bei dem markierten Punkt um als Tumor oder als gesunde Schleimhaut
klassifiertes Gewebe handelte und ob eine Laserablation stattfand oder nicht.
Die Nadelmarkierungen wurden jeweils vor der Messung und der Ablation
des Messpunktes entfernt und anschließend wieder angebracht.
30
6.3.4 Datenerhebung
Zunächst wurden die Daten für Autofluoreszenz vor der Laserablation aufgenommen. Hierzu wurden alle 4 blau markierten Messpunkte gemessen.
Nachdem das Instrumentarium für die Versuche, wie bereits in Kapitel 6.2.
beschrieben, aufgebaut war, wurde das Gewebe so platziert, dass die Oberfläche des zu messenden Areals senkrecht zur Messsonde stand. Der Abstand der Messsonde zur Oberfläche des Gewebes betrug 5mm. Anschließend wurden 30 Messungen für jeden der 4 blau markierten Messpunkte
gemacht. Damit waren die Daten vor der Laserablation erhoben und es wurden keine weiteren Untersuchungen an den blau markierten Messpunkten
durchgeführt.
Abbildung 7: optische Messung vor Ablation
a) Spektrometer
c) Reflection/backscattering probe
b) Lichtquelle
d) Gewebe
31
Abbildung 8: Messung der Autofluoreszenzdaten vor Laserablation
Anschließend wurde an allen 4 rot markierten Schleimhautarealen eine Laserablation durchgeführt. Für die Ablation wurde ein Er:YAG-Laser mit den
bereits beschriebenen Einstellungen verwendet. Das Resektat wurde so
platziert, dass seine Oberfläche senkrecht zum Laserstrahl ausgerichtet war.
Der Abstand des Lasers zur Oberfläche des Gewebes betrug 4,5 cm. Die
Schleimhaut wurde mit 30 Laserpulsen unter Spraywasserkühlung (NaCl
0.9%, 100ml, B. Braun Melsungen AG) bei 22 Grad Celsius abladiert. Nach
der Ablation jedes Messpunktes wurde die Linse des Lasers sorgfältig mit
Isopropanol (teslanol IP-Isopropanol, wentronic-Electronic Components Handels GmbH, Braunschweig) gereinigt, um eine Kontamination der Linse mit
Gewebe des Präparates und eine damit einhergehende Leistungseinschränkung des Lasers zu verhindern.
32
Abbildung 9: Gewebeablation
a) Laser
d) Gewebe
Danach wurden an den 4 abladierten Messpunkten die Daten zur Autofluoreszenz nach der Laserablation erhoben. Dies geschah in gleicher Weise
und mit den gleichen Messinstrumenten wie bei der Datenerhebung der blau
markierten Punkte.
33
Abbildung 10: optische Messung direkt am Ablationsort nach Laserablation
a) Spektrometer
c) Reflection/backscattering probe
b) Lichtquelle
d) Gewebe
Der Tumor wurde danach in Formalin (Formaldehydlösung 4%, Otto Fischbar
GmbH & Co. KG, Saarbrücken) gelegt und umgehend an die OP-Abteilung
zurückgegeben, das Gewebe wurde dann in üblicher Art und Weise an das
Pathologische Institut weitergegeben. Um genau zu wissen, ob die im Versuch als Tumor beziehungsweise tumorfreies Gewebe nadelmarkierten
Schleimhautareale tatsächlich richtig klassifiziert wurden, untersuchte das
Pathologische Institut die markierten Messpunkte hinsichtlich ihrer Malignität.
Außerdem wurde das Ausmaß der Laserablation untersucht.
Die Tumorresektate wurden formalinfixiert an das Pathologische Institut weitergegeben. Die Aufarbeitung der Präparate hinsichtlich der studienrelevanten Fragestellung erfolgte im Rahmen des Routine-Zuschnitts der
34
Großpräparate. Die Schnittführung wurde nach Sicherung der für die Tumordiagnostik und den R-Status relevanten Gewebsentnahmen an die Lokalisation der gesetzten Nadelmarkierungen angepasst. Hierbei wurde jeweils
ein Schnitt entlang der Nadelmarkierung durchgeführt, so dass der Stichkanal zur Darstellung kam. Nach Entfernung der Nadel wurde der Stichkanal
mit einem feinen Pinsel tuschemarkiert. Danach erfolgten Gewebeentnahmen unter Einschluss des jeweiligen Stichkanals und deren Einbettung in
getrennte Kapseln. Im Anschluss wurden Paraffinblöcke angefertigt und die
für die Studie relevanten, gesondert gekennzeichneten Blöcke unter vorsichtigem Anschneiden in mindestens drei Schnittstufen aufgearbeitet, bis der
Stichkanal auf dem histologischen Schnittpräparat zur Darstellung kam.
Die Präparate wurden mit einem Färbeautomat (ST5010 Autostainer XL, Leica Biosystems Nussloch GmbH) in HE-Färbung gefärbt.
Im Rahmen der histopathologischen Begutachtung der jeweiligen Schnittpräparate konnte der jeweilige Messpunkt hinsichtlich seiner Dignität sowie hinsichtlich des Vorhandenseins und der Tiefenausdehnung der Laserablation
untersucht werden. Die histologische Begutachtung als Goldstandard bei der
Differenzierung von pathologischem Gewebe konnte somit als Qualitätskontrolle fungieren und verhindern, dass bei der Auswertung der Daten einzelne
Messpunkte fälschlicherweise als Tumor beziehungsweise tumorfreies Gewebe klassifiziert wurden. Um eine Vergleichbarkeit der Daten zu schaffen,
wurde darauf geachtet, dass vor und nach Laserablation die gleiche Gewebeart auf ihre optischen Eigenschaften untersucht wurde. Durch die histopathologische Aufarbeitung wurde also untersucht, ob alle markierten Messpunkte tatsächlich im Epithel - entweder in malignem oder gesundem - lagen
und dadurch die optischen Eigenschaften des Epithels gemessen wurden.
Des Weiteren konnte an den rot markierten abladierten Messpunkten durch
die Histopathologie festgestellt werden, wie viel des Epithels durch die Ablation entfernt wurde und ob die Basallamina noch intakt war.
Mit diesem Verfahren wurde sichergestellt, dass auch nach der Laserablation durch die lichtbasierten Analyseverfahren nur die optischen Eigenschaften des epithelialen Gewebes und nicht die des subepithelialen Gewebes
aufgenommen wurden.
35
Abbildung 11: Histologischer Schnitt eines Messpunktes in gesunder epithelialer
Schleimhaut. Der Stichkanal der Nadelmarkierung und die Tusche zur Markierung
des Stichkanals sind deutlich zu erkennen. HE-Färbung
36
Abbildung 12: Histologischer Schnitt eines Messpunktes in maligner epithelialer
Schleimhaut. Der Stichkanal der Nadelmarkierung und die Tusche zur Markierung
des Stichkanals sind zu erkennen. HE-Färbung
Abbildung 13: Präparat nach allen Messungen mit Nadelmarkierungen
37
Abbildung 14: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs
Laser
Er:YAG-Laser 2,94 µm, Glissando, WaveLight TM, Germany
Lichtfasersystem
QR600-7-SR125BX,
200–1100 nm; Ocean Optics W, Dunedin,
Florida, USA
Lichtquelle
Mercury, Newport 200 Watt Hg, Bandpassfilter 377 ± 50 nm, Edmund Optics, Karlsruhe, Deutschland
Spektrometer
QE 65000, 200–950 nm; Ocean OpticsW,
Dunedin, Florida, USA
Tabelle 5: Übersicht Materialien
38
6.4 Statistik
Alle aufgenommenen Daten wurden zur Klassifikation in gesunde epitheliale
Schleimhaut und maligne epitheliale Schleimhaut einem mathematischen
Algorithmus unterzogen. Um die Güte dieses Klassifikationsverfahrens zu
testen, wurden die Vorhersagen des Modells mit den tatsächlichen Klassen
(Tumor bzw. tumorfrei) verglichen. Es wurde in dieser Studie eine leave-oneout-cross-validation durchgeführt. Dabei wurden die Autofluoreszenzdaten
eines Patienten aus dem gesamten Datenpool aller Patienten herausgenommen. Die Daten aller Patienten (ohne den Herausgenommenen) wurden
zum Anlernen des Verfahrens benutzt. Danach wurden die Klassen (Tumor
oder tumorfrei) der Daten des einen herausgenommenen Patienten mit dem
vorher angelernten Verfahren vorhergesagt und mit der tatsächlichen Klasse
(aus der histopathologischen Auswertung ersichtlich) verglichen. Dieser Vorgang wurde bei allen Patienten wiederholt. Es wurden also nacheinander die
Patienten einzeln aus dem gesamten Datenpool herausgenommen, ein Verfahren angelernt und dann die Klassenzugehörigkeit der Daten des herausgenommenen Patienten vorhergesagt. Durch den Vergleich der Vorhersage
mit der histopathologischen Auswertung konnte der Klassifikationsfehler für
die Daten jedes Patienten ermittelt werden.
Das Verfahren zur Klassifikation der Daten beinhaltete die principal component analysis (PCA) zur Variablenreduktion, da die linear discriminant analysis (LDA) nur mit weniger Variablen umgehen kann. Die Anzahl der principal
components (Hauptkomponenten) der beiden Klassen (Tumor und tumorfrei)
betrug zwischen 50 und 250. Die Anzahl der Hauptkomponenten wurde für
jedes Modell (alle Modelle innerhalb der leave-one-out-cross-validation) extra
bestimmt, so dass der Klassifikationsfehler, der mit dem angelernten Verfahren erreicht wurde, minimal war. Die Bestimmung der Anzahl der Hauptkomponenten erfolgte wiederum mit einer leave-one-out-cross-validation, allerdings nur von den Daten, die zum Lernen des Verfahrens benutzt wurden
(also ohne den anfangs heraus genommenen Patienten, von dem die Fehlerquoten ermittelt werden sollten). Daraus wurden die Fehler für 50, 100,
150, 200 und 250 principal components berechnet. Es wurde dann die Anzahl der Hauptkomponenten gewählt, die die niedrigste Fehlerquote hatte.
39
Das Ergebnis der LDA zeigte die Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zur
Klasse „Tumor“, die Klassifikation erfolgte dann mit einem Cutpoint von 0.5.
Für die Erstellung der receiver-operating-characteristics (ROC)-Kurve wurden die Sensitivitäten und Spezifitäten für alle möglichen Cutpoints berechnet. Der optimale Cutpoint liegt dort, wo auch der Youden-Index (Sensitivität+Spezifität-1) maximal ist. Um die Differenzierbarkeit von malignem und
gesundem Gewebe vor und nach der Laserablation darzustellen und zu vergleichen, wurden die Sensitivitäten und Spezifitäten sowie die area under the
ROC-curve (AUC) berechnet.
40
7 Ergebnisse
7.1 Histopathologische Auswertung
Insgesamt wurden 12 Resektate untersucht, bei jedem Resektat gab es 4
blau (keine Laserablation) und 4 rot (Laserablation) markierte Messpunkte.
Bei jedem Messpunkt wurden 30 Messungen durchgeführt. Damit umfasste
die Versuchsreihe theoretisch 48 blaue Messpunkte mit insgesamt 1440
Messungen und 48 rote Messpunkte mit insgesamt 1440 Messungen. In der
histopathologischen Auswertung wurden die markierten Messpunkte auf ihre
tatsächliche Malignität untersucht. Des Weiteren konnte die Tiefe der Ablation sowie das Vorhandensein von Plattenepithel an den Messpunkten überprüft werden.
Die Auswertung ergab, dass insgesamt 3 blau markierte Messpunkte (keine
Laserablation) nicht aus Epithel, sondern aus Weichgewebe bestanden. Die
Daten dieser Messpunkte wurden nicht berücksichtigt. Außerdem wurde 1
blau markierter Messpunkt während der Versuchsreihe fälschlicherweise als
tumorfreie Schleimhaut klassifiziert. Dieser Messpunkt wurde dann nachträglich als malignes Epithel gewertet und ging als solches in die statistische
Auswertung ein. Für die statistische Auswertung wurden insgesamt 45 blau
markierte Messpunkte verwendet, bei denen jeweils 30 Messungen durchgeführt wurden. 15 der 1350 Messungen waren fehlerhaft und wurden deshalb
nicht in die statistische Auswertung einbezogen, es wurden also 1335 Messungen ausgewertet.
Bei den rot markierten Messpunkten ergab die histopathologische Auswertung, dass insgesamt 8 Messpunkte nicht aus Epithel, sondern aus Weichund Granulationsgewebe bestanden. Auch diese Messpunkte wurden statistisch nicht berücksichtigt. Darüber hinaus wurde ein rot markierter Messpunkt
während der Versuchsreihe fälschlicherweise als Tumor klassifiziert. Dieser
Messpunkt wurde nachträglich als gesundes Epithel gewertet und ging als
solcher in die statistische Auswertung ein. Es wurden insgesamt 40 rot markierte Messpunkte in die statistische Auswertung aufgenommen, bei jedem
41
Punkt wurden 30 Messungen durchgeführt. 3 dieser Messungen waren fehlerhaft, es wurden also 1197 Messungen ausgewertet.
keine Laserablation-blau
Laserablation-rot
Schleimhaut
22
21
epithelialer Tumor
23
19
gesamt
45
40
tumorfreie epitheliale
Tabelle 6: Übersicht über die Anzahl der ausgewerteten Messpunkte
blau: Messung der Autofluoreszenzdaten ohne Laserablation
rot: zuerst Laserablation, dann wurden die Autofluoreszenzdaten des abladierten
Gewebes gemessen
Die Ablation umfasste nahezu die gesamte Breite des Epithels, ohne jedoch
das Epithel komplett zu entfernen, die Basallamina war intakt. Der Ablationskrater hatte einen Durchmesser von ca. 4 mm und eine Tiefe von ca.
0,35 mm. Außerdem war der Ablationsspot makroskopisch gut zu erkennen.
Es konnte also sichergestellt werden, dass ausreichend viel Gewebe abladiert wurde, um eine Gewebsveränderung zu erreichen und außerdem die
Ablationsraten hoch genug waren, um einen in die Praxis umsetzbaren Ablauf zu simulieren. Gleichzeitig war der Laserabtrag nur so groß, dass ein
Rest des Epithels auch nach der Ablation noch vorhanden und die Basallamina intakt war. Damit wurden durch die anschließenden optischen Analyseverfahren die optischen Eigenschaften des Epithels und nicht die des subepithelialen Gewebes gemessen.
42
Abbildung 15: Histologische Darstellung des Ablationsspots bei einer Laserenergie
von 500 mJ. HE-Färbung
7.2 Autofluoreszenz vor Laserablation
Der Klassifikationsfehler zur Unterscheidung zwischen Tumor und tumorfreier Schleimhaut lag vor der Ablation bei 23%. Die Differenzierung der Gewebearten konnte mit einer Sensitivität von 76% und einer Spezifität von 78%
durchgeführt werden. Tabelle 7 zeigt die Konfusionsmatrix für die Autofluoreszenz vor Laserablation mit einem standardmäßigen Cutpoint von 0.5. Die
Werte der receiver operating characteristics (ROC)-Kurve sind Abbildung 16
zu entnehmen. Hier wurde ein Cutpoint von 0.4835 gewählt. Die area under
the curve (AUC) beträgt 0.82. In Abbildung 17 sind beispielhaft drei Spektren
der Autofluoreszenz dargestellt.
43
epitheliale gesun-
epithelialer Tumor
de Schleimhaut
(durch Histologie
(durch Histologie
verifiziert)
verifiziert)
als epitheliale ge-
506
168
674
139
522
661
645
690
1335
sunde Schleimhaut vorausgesagt
als epithelialer
Tumor vorausgesagt
gesamt
Tabelle 7: Konfusionsmatrix vor Laserablation mit Anzahl der Messungen
44
Abbildung 16: ROC vor Laserablation
45
46
Abbildung 17: Spektren der Autofluoreszenz vor Laserablation. Zu sehen sind beispielhaft die Spektren dreier Resektate
rot: epithelialer Tumor
grün: gesunde epitheliale Schleimhaut
7.3 Autofluoreszenz nach Laserablation
Tumor und tumorfreie Schleimhaut konnten nach der Ablation mit einem
Klassifikationsfehler von 13% unterschieden werden. Die Sensitivität lag bei
84%, die Spezifität bei 90%. In Tabelle 8 ist die Konfusionsmatrix für die Autofluoreszenz nach Laserablation mit einem standardmäßigen Cutpoint von
0.5 zu sehen. Die Werte der ROC-Kurve mit einem Cutpoint von 0.4835 können aus Abbildung 18 entnommen werden. Die AUC betrug 0.92. Abbildung
19 zeigt beispielhaft drei Spektren der Versuchsreihe nach Laserablation.
47
tatsächlich epithe-
tatsächlich epithe-
liale gesunde
lialer Tumor
Schleimhaut
(durch Histologie
(durch Histologie
verifiziert)
verifiziert)
als epitheliale ge-
564
92
656
66
475
541
630
567
1197
sunde Schleimhaut vorausgesagt
als epithelialer
Tumor vorausgesagt
gesamt
Tabelle 8: Konfusionsmatrix nach Laserablation mit Anzahl der Messungen
48
Abbildung 18: ROC nach Laserablation
49
50
Abbildung 19: Spektren der Autofluoreszenz nach Laserablation. Zu sehen sind beispielhaft die Spektren dreier Resektate
rot: epithelialer Tumor
grün: gesunde epitheliale Schleimhaut
7.4 Vergleich vor und nach Laserablation
Beim Vergleich der Ergebnisse vor und nach Laserablation fällt auf, dass die
Unterscheidung von malignem und gesundem Gewebe nach der Laserablation besser gelang als davor. Der Klassifikationsfehler war vor der Laserablation um 10 Prozentpunkte höher als danach, die AUC betrug vor der Laserablation 0.82, danach hatte sie einen Wert von 0.92. Die Gewebedifferenzierung konnte vor der Laserablation mit einer Sensitivität von 76% und einer
Spezifität von 78% durchgeführt werden, nach der Ablation gelang dies mit
einer Sensitivität von 84% und einer Spezifität von 90%.
51
8 Diskussion
8.1 Diskussion der Ergebnisse
In der vorliegenden ex vivo Studie wurde die optische Differenzierbarkeit von
oralem malignem und oralem gesundem Gewebe vor und nach einer
Er:YAG-Laserablation untersucht. Dafür wurden an 12 Resektaten Autofluoreszenzdaten des Gewebes vor und nach der Ablation an ausgewählten
Messpunkten aufgenommen und ausgewertet. Durch die histopathologische
Untersuchung der Messpunkte konnten die Malignität des Gewebes sowie
das Ausmaß der Laserablation festgestellt werden. Mit dem Vergleich der
Messdaten vor und nach der Ablation konnten Unterschiede in der Differenzierbarkeit von gesundem und malignem Gewebe durch die Laserablation
untersucht werden. Insbesondere wurde der Einfluss der Laserablation auf
das optische Spektrum des abladierten Gewebes im Detail betrachtet. Der
Einsatz einer fluoreszenzbasierten Gewebedifferenzierung zur Steuerung der
Laserablation setzt voraus, dass die Gewebedifferenzierung mit der Fluoreszenzspektroskopie auch nach der Laserablation möglich ist.
In der Literatur wird die fluoreszenzbasierte Spektroskopie vorwiegend im
Sinne einer präoperativen Methode zur Gewebedifferenzierung von maligner
und gesunder Schleimhaut beschrieben (vgl. Tabelle 1). Hierfür ist es nicht
nötig, das Gewebe mit einem Laser zu abladieren, das Verfahren ist berührungslos, schnell durchzuführen, nicht gesundheitsgefährdend und potentiell
unendlich oft wiederholbar. Diese Studien können ohne Risiken für den Patienten in vivo durchgeführt werden. In vorgelegter Arbeit sollte die Gewebedifferenzierung nach der Laserablation untersucht werden, dies setzt eine Ablation des Gewebes voraus. Ziel war hier zunächst, im Sinne einer ex vivo
Grundlagenstudie zu klären, ob optische Analyseverfahren auch für eine
Tumoridentifikation unter Laseranwendung verwendet werden können. Damit
sollte die Grundlage für eine sensorbasierte tumorspezifische Laserchirurgie
erarbeitet werden. Die ex vivo Zeit von maximal 3 Stunden nach der Tumor-
52
resektion unterscheidet sich nicht signifikant von anderen ex vivo Studien zur
autofluoreszenzbasierten Spektroskopie [10, 77].
Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit zeigen, dass gesundes von malignem
Gewebe vor der Laserablation mit einer Sensitivität von 76% und einer Spezifität von 78% differenziert werden kann. Diese Ergebnisse sind vor dem
Hintergrund der verschiedenen Differenzierungskriterien, die in der Literatur
angegeben werden, zu diskutieren.
Fluoreszenz bei 630 nm wird von Porphyrin hervorgerufen, Peaks im Autofluoreszenzspektrum bei dieser Wellenlänge werden mit der Anreicherung
von Porphyrin in Tumorgewebe erklärt und können somit ein Differenzierungskriterium
zur
Identifikation
von
malignem
Gewebe
sein
[53, 64]. In einer Studie von Inaguma et al. konnte festgestellt werden, dass
bei 85% der Karzinome, die bei einer Wellenlänge von 410 nm angeregt
wurden, porphyrin-typische Autofluoreszenzen zu beobachten sind [45]. Die
Autofluoreszenzpeaks bei 630 nm sind in der vorgelegten Arbeit nicht bei
allen Spektren zu erkennen. Die Entstehung dieser Peaks wird mit der vermehrten Entstehung von Porphyrin durch den Zerfall von Hämoglobin erklärt. Dieser Prozess findet vor allem bei zunehmender Zellnekrose im Tumorzentrum statt. In der vorgelegten Arbeit wurden jedoch vier Messpunkte
im Tumor festgelegt, das heißt, nicht alle diese Punkte konnten genau im
Tumorzentrum platziert werden. Somit ist davon auszugehen, dass die Zellnekrose an einigen Messpunkten noch nicht in dem Maße wie in der Studie
von Yang et al. fortgeschritten war. Die porphyrin-typische Fluoreszenz zur
Gewebedifferenzierung wird in einer anderen Studie durch Mikroorganismen,
die sich auf nekrotischem Gewebe ansiedeln, beschrieben [73]. Diese in vivo
Studie ist jedoch nicht mit der vorgelegten ex vivo Studie vergleichbar, da
sich die Zusammensetzung der Oberflächenbestandteile des Gewebes im
Zuge der Resektion und anschließenden Lagerung verändert.
Die Fluoreszenzspektroskopie zur Unterscheidung von malignem und gesundem Gewebe basiert des Weiteren auf einer Intensitätsabschwächung
der aufgenommenen Spektren [37, 53]. In einer Arbeit von Gillenwater et al.
konnte bei Betrachtung des gesamten Autofluoreszenzspektrums festgestellt
werden, dass die Intensität des Spektrums bei maligne verändertem Gewebe
53
geringer ist als bei gesundem. Zusammen mit dem porphyrin-typischen Peak
bei 630 nm als Diskriminierungsparameter konnte so eine Sensitivität von
82% und eine Spezifität von 100% zur Unterscheidung von gut- und bösartigem Gewebe erzielt werden [31]. Auch in einer Studie von Betz et al. wurde
eine geringere Intensität der Spektren bei maligne verändertem Gewebe
festgestellt [7]. Hauptverantwortlich für diese Intensitätsabschwächung sind
die Dickenzunahme des Epithels, vermehrte Streuung des Lichts durch das
Epithel, Keratinverlust im Epithel und verstärkte Lichtabsorption durch Hämoglobin (stärkere Durchblutung im Tumorgewebe) [70, 94]. Außerdem
kommt es zum Verlust von NADH und FAD. Beide sind wesentliche Fluorophore des Gewebes und fluoreszieren normalerweise stark [47]. Diese Intensitätsunterschiede sind auch in der vorgelegten Arbeit zu erkennen. Alle
Spektren weisen im Bereich von 450 - 650 nm Intensitätsunterschiede auf:
Die Intensität der Autofluoreszenz ist bei gesunder Schleimhaut höher als bei
bösartig veränderter. Somit kann auch in der vorgelegten Arbeit die Intensität
der Spektren als Differenzierungskriterium herangezogen werden.
Form und Intensität der Autofluoreszenzspektren sind stark von den gewählten Wellenlängen abhängig, mit denen das Gewebe zur Autofluoreszenz angeregt wird [86, 111]. In einer in vivo Studie von Heintzelman et al. wurden
die Anregungswellenlängen evaluiert, mit denen die Detektion oraler Neoplasien am besten gelang. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass mit den
Anregungswellenlängen von 350, 380 und 400 nm die besten Ergebnisse
erzielt werden konnten [38]. In anderen Arbeiten, die die Differenzierung oraler Tumoren von gesundem oralem Gewebe mit der berührungslosen Autofluoreszenzspektroskopie untersuchten, wurden ebenfalls vor allem Anregungswellenlängen im Bereich von 300 - 450 nm gewählt (vgl. Tabelle 1). Beim Vergleich dieser Studien ist jedoch keine bestimmte Wellenlänge
oder ein engerer Wellenlängenbereich zu erkennen, mit dem die Gewebedifferenzierung signifikant besser gelang als mit anderen Wellenlängen. Diese
fehlende Optimierung der Anregungswellenlänge wird als limitierender Faktor
zur besseren Gewebedifferenzierung mit der Autofluoreszenzspektroskopie
beschrieben [17]. Allerdings konnte in einer Arbeit von de Veld et al. beobachtet werden, dass sich die Ergebnisse zur Differenzierung von gesundem
und malignem Gewebe nicht signifikant für unterschiedliche Anregungswel-
54
lenlängen unterscheiden [20]. Hier liefert die Literatur also zum Teil widersprüchliche Ergebnisse, aufschlussreiche Studien zur Optimierung der Anregungswellenlängen fehlen [38]. Es ist jedoch festzuhalten, dass die in der
vorgelegten Arbeit gewählte Anregungswellenlänge von 377 nm im gleichen
Bereich wie die in anderen Studien liegt. Somit ist vom gleichen Maß der Autofluoreszenzanregung auszugehen wie in vergleichbaren Arbeiten.
Orale maligne Schleimhaut konnte von oraler gesunder nach der Laserablation mit einer Sensitivität von 84% und einer Spezifität von 90% differenziert
werden. Die Differenzierung gelang nach der Laserablation besser als davor.
Durch die Laserablation wurden also die Messergebnisse beeinflusst.
Beim Vergleich der Autofluoreszenzdaten zur Gewebedifferenzierung vor
und nach Laserablation ist zu beachten, dass es gewisse Störfaktoren gibt,
die die Fluoreszenzspektren und damit die Qualität der Differenzierung beeinflussen. Vor der Laserablation wurde darauf geachtet, dass die Oberfläche frei von Verschmutzungen war. Dies konnte jedoch nur visuell überprüft
werden, folglich konnten nicht alle Verschmutzungen auf dem Gewebe vor
den Messungen sicher entfernt werden. Es kann deshalb davon ausgegangen werden, dass sich vereinzelt Blutrückstände auf dem zu messenden
Areal befanden. Die fluoreszierenden Eigenschaften des Gewebes sind abhängig von reflektierenden und absorbierenden Vorgängen des eingestrahlten Lichts. Der Oxy- und Desoxyhämoglobingehalt des lichtbestrahlten Gewebes sind mitentscheidend für die Absorptionseigenschaften des eingestrahlten Lichts [21]. Durch nicht entfernte Blutbestandteile kann das aufgenommene Fluoreszenzspektrum verändert werden, somit ist das Spektrum
nicht mehr nur abhängig vom lichtbestrahlten Epithel. Diese Blutbestandteile
können sich sowohl auf gesundem als auch auf malignem Gewebe befinden
und können dazu führen, dass sich die optischen Spektren der verschiedenen Gewebearten nicht mehr so stark voneinander unterscheiden. Dies kann
zu einer Verschlechterung der Diskriminierung von malignem und gesundem
Gewebe führen, da die lichtbasierten Messmethoden auf dem Prinzip eines
charakteristischen Spektrums für jede Gewebeart beruhen [88].
Durch die Laserablation wurde oberflächlich Gewebe abgetragen (vgl. Abbildung 15). Dadurch wurden auch Blutrückstände auf der Gewebeoberfläche
55
entfernt. Durch die Autofluoreszenzmessungen nach der Laserablation wurden somit nur die optischen Spektren des Gewebes ohne Verschmutzungen
aufgenommen. Dies kann zu einer Verbesserung der Gewebedifferenzierung
nach Laserablation im Vergleich zur Differenzierung vor der Ablation führen.
Ähnliche Beobachtungen konnten in einer anderen Arbeit gemacht werden:
Die Laserablation führte dazu, dass mit der Fluoreszenzspektroskopie Fettvon Nervengewebe nach der Ablation besser differenziert werden konnte als
davor. Als Grund dafür wird die Entfernung der lipidreichen Schicht um den
Nerv durch die Laserablation angegeben. Dadurch unterscheidet sich die
Gewebezusammensetzung und somit das optische Spektrum des Fett- und
Nervengewebes nach der Laserablation stärker als zuvor [100].
Die Differenzierung von malignem und gesundem Gewebe mit optischen
Messmethoden konnte in anderen Studien mit Sensitivitäten und Spezifitäten
von jeweils über 0.90 durchgeführt werden [7, 8, 17, 21, 24, 31, 32]. Durch
die bereits beschriebenen Verunreinigungen auf der Gewebeoberfläche, die
durch die Laserablation entfernt wurden, konnten diese Sensitivitäten und
Spezifitäten bei den Autofluoreszenzmessungen vor der Laserablation nur
annähernd erreicht werden. Ziel der Studie war es, die Einflüsse der Laserablation auf die optischen Eigenschaften des Gewebes zu untersuchen. Vaporisation, Karbonisation und Koagulation sind Vorgänge, die während der
Laserablation am Gewebe stattfinden [65]. Histologisch sind Nekrosen, Bläschen, Kollagendenaturierung und kleine Entzündungen feststellbar [15, 19,
61, 87, 119]. Die optischen Eigenschaften des Gewebes werden durch die
Laserablation ebenfalls beeinflusst. Die Absorptionsquote des eingestrahlten
Lichts und damit das optische Spektrum kann durch die Karbonisationszone
erhöht und das optische Spektrum damit geschwächt werden, dagegen kann
es bei geringer Koagulation des Gewebes zu einer Erhöhung der Reflexionsrate des eingestrahlten Lichts kommen [118]. Die Absorptionsquote des eingestrahlten Lichts ist weiterhin vom Oxy- und Desoxyhämoglobingehalt des
Gewebes abhängig [76]. Durch die Koagulation von Proteinen kommt es im
abladierten Gewebe zu einem hämostatischen Effekt und einer Veränderung
der Gewebedurchblutung, was zu veränderten Oxy- und Desoxyhämoglobingehalten führt [34]. Diese genannten Veränderungen sind auch an pathologischem Gewebe zu erkennen [21, 88].
56
Nach der Laserablation konnten gesunde und maligne Schleimhaut mit einer
Sensitivität von 84% und einer Spezifität von 90% unterschieden werden.
Diese Ergebnisse zeigen zum einen, dass die Beseitigung der Gewebeverunreinigungen auf der Oberfläche durch den Laser zu einer Verbesserung
der Ergebnisse führte. Zum anderen gelang die Unterscheidung von maligner
und gesunder Schleimhaut nach der Laserablation mit vergleichbaren Sensitivitäten und Spezifitäten wie in anderen Arbeiten, bei denen die prätherapeutische Identifikation maligner Schleimhaut im Vordergrund stand, folglich keine Laserablation durchgeführt wurde und somit nicht die histologischen und
im optischen Spektrum feststellbaren Veränderungen durch die Ablation berücksichtigt wurden [7, 8, 17, 21, 24, 31, 32]. Die Veränderung der optischen
Eigenschaften des Gewebes und ihre Auswirkungen auf die optische Malignitätsdiagnostik sind jedoch ein wichtiger Faktor zur Implementierung eines
berührungslosen, optischen Feedback-Mechanismus, welcher auf direktem
Wege die Laserablation steuern kann. Hierbei ist die Unterscheidung von
malignem und gesundem Gewebe elementar, um nicht pathologisch verändertes Gewebe zu schonen und im Operationssitus verbliebenes, malignes
Gewebe zu identifizieren und zu entfernen. Die Autofluoreszenzspektroskopie zur Differenzierung von maligner und gesunder Schleimhaut, die in vorgelegter Arbeit mit einer Sensitivität von 84% und einer Spezifität von 90%
gelang, kann hier als Grundlage für einen solchen optischen FeedbackMechanismus dienen.
In
vorgelegter
Studie
wurde
die
autofluoreszenzbasierte
Gewebe-
differenzierung ohne Korrektur durch die Diffuse Reflexion untersucht. Die
Fluorophorkonzentration gilt als die wichtigste Gewebeeigenschaft zur optischen Differenzierung des Gewebes. Deswegen wird in der Literatur eine
Korrektur der Originaldaten der Fluoreszenzspektroskopie diskutiert, um die
Fluoreszenzen der Fluorophore ohne Einflüsse wie Streuung und Absorption
von Licht darzustellen (intrinsische Fluoreszenz) [35, 94]. Die einfachste Methode, um das aufgenommene Spektrum von diesen Einflüssen zu bereinigen, ist die Korrektur des Autofluoreszenzspektrums mit den Spektren der
Diffusen Reflexion [3, 20, 69]. Wenn jedoch die Fluoreszenzspektroskopie
als Feedback-System zur Lasersteuerung eingesetzt werden soll, sollte dieses System im Sinne eines real-time Analyseverfahrens sehr schnell das
57
Gewebe identifizieren können. Die Korrektur des Fluoreszenzspektrums mit
der Diffusen Reflexion ist aber zeitintensiv, da zusätzlich zur Autofluoreszenz
auch die Daten der Diffusen Reflexion erfasst werden müssen. Die rein autofluoreszenzbasierte Gewebedifferenzierung ohne Korrektur ermöglicht eine
schnelle Datenerfassung und erlaubt trotz der fehlenden Korrektur Rückschlüsse auf die Fluorophorzusammensetzung des Gewebes. Außerdem
können durch die Detektion der Streuungs- und Absorptionsvorgänge zusätzliche Informationen über das Gewebe erfasst werden [76, 118].
Es wurden bereits erste Ansätze zur computergestützten Lasersteuerung
untersucht. Eine Arbeit von Sotsuka et al. beschreibt die Steuerung einer
Laser-Osteotomie durch einen Computer. Die Ablation wurde mittels der
CAD/CAM-Technologie gesteuert (computer aided design/computer aided
manufactoring) [96]. Die computergestützte Lasersteuerung diente hier allerdings vor allem dazu, den Abstand des Lasers vom Knochen konstant zu
halten und nicht dazu, verschiedene Gewebearten voneinander zu unterscheiden. Eine andere Möglichkeit des computergesteuerten Lasereinsatzes
stellt die präoperative Planung und Festlegung der Ablation auf der Basis
bildgebender Verfahren dar. Eine ex vivo Studie von Burgner et al. setzt hier
an. Die Ablation wird präoperativ anhand eines CTs geplant und dann autonom robotergestützt anhand der Planung durchgeführt. So konnten Schnitte
durchgeführt werden, die maximal 0,5 mm von der präoperativen Planung
abwichen [11]. Dieser Ansatz kann aber nicht als ein real-time Analyseverfahren zur intraoperativen Gewebedifferenzierung herangezogen werden, da
intraoperativ keine Informationen über das Gewebe gewonnen werden können. Die intraoperative Steuerung der Laserablation konnte in einer anderen
Arbeit durch Detektion der thermischen Veränderungen um das abladierte
Gewebe erfolgreich durchgeführt werden. Durch Rückkopplung des Detektionssystems mit der Lasersteuerung konnte die Ablation gestartet beziehungsweise gestoppt werden, wenn bestimmte präoperativ festgelegte Kontrollkriterien eintraten [5]. Hier zeigt sich, dass es technisch umsetzbar ist, die
Laserablation im real-time Verfahren zu steuern, um auch auf intraoperativ
eintretende Gewebsveränderungen reagieren zu können.
58
Erste Studien zur Lasersteuerung mit Hilfe optischer Analyseverfahren gibt
es bereits. Es konnte die Differenzierung gesunder Gewebearten nach der
Laserablation mit dem optischen Analyseverfahren der Diffusen Reflexion mit
einer AUC von 0.97 durchgeführt werden [100]. Andere ex vivo und in vivo
Studien zeigen ebenfalls, dass optische Messmethoden als FeedbackMechanismus zur Lasersteuerung dienen können [7, 98, 99, 101]. Allerdings
muss berücksichtigt werden, dass nur gesunde Gewebearten untersucht
wurden und die Diffuse Reflexion als Analyseverfahren gewählt wurde. In der
Neurochirurgie konnte ein Konzept entworfen werden, durch das Gehirntumoren mit einem robotergestützten Lasersystem therapiert werden können.
Der Laser wird hier intraoperativ mittels der autofluoreszenzbasierten Identifikation von Tumorgewebe gesteuert [2, 59]. Die Autofluoreszenzspektroskopie basiert in diesen Studien jedoch auf der präoperativen Gabe von
5-Aminolävulinsäure, die das Gewebe zur Autofluoreszenz anregt. Die Identifikation von Tumorgewebe wurde in vorliegender Studie ohne die systematische oder lokale Gabe von Fluoreszenzverstärkern untersucht. Dies garantiert einen einfachen und in der Praxis umsetzbaren Einsatz ohne gesundheitliche Risiken für den Patienten.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass ein autofluoreszenzbasiertes
Rückkopplungssystem als Grundlage zur Lasersteuerung dienen kann. Jedoch gibt es auch einige Einschränkungen, deren Folgen noch zu untersuchen sind.
Für die Versuchsreihe wurde ein Er:YAG-Laser ausgewählt. Die Energie des
Lasers wird sehr gut vom Wasser im Gewebe absorbiert, da die Wellenlänge
des Lasers (2,94 µm) sehr nahe am Absorptionsmaximum von Wasser
(3 µm) liegt [25]. Gleichzeitig wird die Laserenergie nur spezifisch von einem
sehr kleinen Teil des Gewebes aufgenommen (vom direkt abladierten Gewebe) und es kann gezielt abladiert werden, ohne das umliegende Gewebe zu
schädigen. Der Er:YAG-Laser ist in der Lage, sowohl Hart- als auch Weichgewebe schnell zu abladieren, gleichzeitig gibt es nur geringe thermische
Schäden am umliegenden Gewebe [39, 46]. Bei anderen Lasern (Nd:YAG-,
Ho:YAG-, lang gepulste CO2-Laser) kommt es zu größeren Karbonisationszonen, da diese Laser Wellenlängen aussenden, die nicht so spezifisch von
59
bestimmten Gewebearten absorbiert werden [112]. Die Veränderung des
optischen Spektrums durch eine Er:YAG-Ablation ist deshalb nicht direkt
übertragbar auf die Veränderungen, die durch andere Laser ausgelöst werden. Es gibt zwar aufschlussreiche Studien über die Bearbeitung von Gewebe mit verschiedenen Lasern, jedoch wird dort der Laser mit der Hand gesteuert. Es fehlen Methoden, mit denen die Ablation durch einen objektiven
Kontrollmechanismus gesteuert werden kann[56, 103, 104]. Bei Betrachtung
der Ergebnisse der ex vivo Studie ist zu beachten, dass eine direkte in vivo
Übertragung nicht möglich ist. Ex vivo ist der Wassergehalt des Gewebes
geringer. Durch die fehlende Blutzirkulation ist der Blutgehalt ebenfalls geringer, was zu einer zunehmenden Deoxygenierung des Hämoglobins führt [76,
91]. Es sind weitere in vivo Studien nötig, um den Einfluss der Blutzirkulation
auf das optische Spektrum nach der Laserablation zu untersuchen. Zudem
sollte die Datenmenge zum Einfluss der Laserablation auf die optische Gewebedifferenzierbarkeit vergrößert werden, um die Grundlage für eine in vivo
Implementierung des Systems zu schaffen.
8.2 Schlussfolgerung
Die Ergebnisse nach Laserablation zeigen das Potential der Autofluoreszenzspektroskopie, gesundes von malignem Gewebe auch unter dem Einfluss der Laserablation schnell und zuverlässig zu differenzieren. Die vorgelegte Arbeit kann hier als Grundlage für ein optisches Feedbacksystem dienen, mit dem im real-time Verfahren eine Gewebeidentifikation möglich ist
und somit die Laserablation gesteuert werden kann. Damit kann es in der
Zukunft gelingen, die Vorteile der Laserablation mit den Vorteilen der optischen Analyseverfahren zu verbinden. Zeitaufwändige Methoden wie die
Schnellschnittdiagnostik und die Abhängigkeit des Therapieerfolgs von den
Erfahrungen des Chirurgen könnten dann in den Hintergrund treten. Um zu
überprüfen, wie die vorgelegten Ergebnisse in eine in vivo Anwendung umgesetzt werden können, sind weitere Untersuchungen notwendig.
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10 Abkürzungsverzeichnis
Hg
Quecksilber
J
Joule
mJ
Millijoule
Hz
Hertz
PCA
principal Component Analysis
PCs
principal components
AUC
area under the curve
ROC
receiver operating characteristic
LDA
linear discriminant analysis
NAD
Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid
FAD
Flavin- Adenin- Dinukleotid
%
Prozent
vgl
vergleich
CAD/ CAM
computer aided design/
computer aided manufacturing
cm
Zentimeter
cm²
Quadratzentimeter
mm
Millimeter
µm
Mikrometer
nm
Nanometer
ml
Milliliter
NaCl
Natriumchlorid
HE
Hämatoxylin-Eosin
CT
Computertomographie
68
11 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Dr. Florian Stelzle für die Planung
der Versuche sowie für Motivation, Gespräche und Hilfe auch über die Dissertation hinaus. Seine Anleitung zur wissenschaftlichen Tätigkeit und seine
zuverlässige Betreuung haben wesentlichen Anteil am Gelingen dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F.W. Neukam, Direktor der Klinik
und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg, gilt mein Dank für die Schaffung der notwendigen Voraussetzungen zur Durchführung dieser Arbeit in der Klinik.
Herrn Dr. med. dent. Christian Knipfer danke ich für die gewissenhafte Betreuung und fachliche Unterstützung. Mein persönlicher Dank gilt meinem
Projektpartner und Freund Bastian Bergauer für die freundschaftliche und
erfolgreiche Zusammenarbeit.
Ich danke Frau Dr. Katrin Brunner und Herrn Dr. Werner Adler für die wertvolle und tatkräftige Unterstützung. Ihre Ratschläge und Anregungen waren
mir stets eine große Hilfe.
Ich danke meinen Großeltern, meinen Freunden und meiner Freundin für die
treue Unterstützung und den großen Rückhalt. Am Ende gilt ein ganz besonderer Dank meinen lieben Eltern und meinem Bruder Thomas. Durch ihre
unentwegte Hilfe und großzügige Unterstützung in allen Jahren haben sie die
vorliegende Dissertation erst ermöglicht.
69
12 Lebenslauf
Andreas Malte Amann
Adresse
Kobergerstr. 29
90408 Nürnberg
Geboren
03.11.1987
in Nürnberg
Eltern
Elke Amann
Georg Amann
Geschwister
Thomas Amann
Familienstand
ledig
Staatsangehörigkeit
deutsch
Bildungsgang
1994- 1996
Grund- und Teilhauptschule Bartholomäusstraße,
Nürnberg
1996- 1998
Grundschule Thoner Espan, Nürnberg
1998- 2007
Peter-Vischer-Schule, Nürnberg
Abteilung Gymnasium
2007
Abitur an der Peter-Vischer-Schule, Nürnberg
Note: 1,6
WS 2007/ 2008 WS 2012/ 2013
Studium der Zahnmedizin an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
März 2010
Zahnärztliche Vorprüfung
Note: 1,5
November 2012
Zahnärztliche Prüfung
Note: 1,6
November 2012
Approbation als Zahnarzt
Seit 01.10.2013
Assistenzzahnarzt in der Praxis Dr. Felix Sippel,
Nürnberg