Die Rolle des CD95/CD95L-Systems bei der Aktivierung

Die Rolle des CD95/CD95L-Systems bei der
Aktivierung primärer humaner T-Lymphozyten
DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Maren Paulsen
Kiel
2010
Referent:
Professor Dr. Stefan Rose-John
Korreferent:
Professor Dr. Dr. Thomas Bosch
Tag der mündlichen Prüfung:
29. Januar 2010
Zum Druck genehmigt:
29. Januar 2010
gez.
Professor Dr. Lutz Kipp, Dekan
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Todesfaktor CD95L ist bekannt für seine Fähigkeit apoptotischen Zelltod in
CD95-sensitiven Zellen zu induzieren. Es häufen sich jedoch seit einiger Zeit Hinweise auf
zusätzliche anti-apoptotische Funktionen des CD95/CD95L-Systems in verschiedenen
Zellsystemen. Genaue molekulare Mechanismen der retrograden Signalgebung über CD95L
wie auch der anti-apoptotischen Aktivität von CD95 sind dabei jedoch weitgehend unbekannt,
insbesondere im Kontext der Aktivierung ruhender humaner T-Lymphozyten.
Ein Aspekt der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung des Todesfaktors
CD95L
als
kostimulatorischer
bzw.
inhibitorischer
Rezeptor
im
Rahmen
der
TZR/CD3/CD28-induzierten Aktivierung primärer humaner T-Zellen. Hier konnten wir eine
Blockade der T-Zellproliferation bei gleichzeitiger Stimulation über CD3/CD28 und CD95L
mit immobilisierten, nicht aber mit löslichen Fusionsproteinen und Antikörpern nachweisen.
Bereits
frühe
Phasen
der
Signalinduktion
Ras/Raf/MEK/ERK1/2-Signaltransduktionsweg
waren
waren
auch
betroffen.
Neben
Schlüsselmoleküle
dem
der
proximalen TZR-Signalgebung wie PLCγ, LAT und ZAP-70 inhibiert. Die Untersuchungen
zu diesem Themenbereich wurden Anfang 2009 publiziert (142).
Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit der Todesrezeptor CD95 als potenziell
kostimulatorischer
Rezeptor
untersucht.
Interessanterweise
konnte
für
CD95
ein
dosisabhängiger Einfluss auf die TZR/CD3/CD28-Signalgebung in T-Zellen nachgewiesen
werden. So konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konzentration der CD95-Agonisten in
einer kompletten Blockade der T-Zell-Signalwege resultiert. Diese Befunde decken sich in
allen untersuchten Parametern mit den Mitte 2009 publizierten Daten der Arbeitsgruppe um
Gudrun Strauß (53). Im Gegensatz dazu führten geringere Konzentrationen zu einer deutlich
gesteigerten Proliferation. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde dieser Effekt erstmals
für eine Reihe unterschiedlicher CD95-Agonisten (Fusionsproteine und mAK) dokumentiert.
Die
gesteigerte
Zellteilungsrate
ging
einher
mit
verstärkter
Expression
von
Aktivierungsmarkern, erhöhter IL-2-, TNFα- und IFNγ-Produktion, verstärkter MAPKAktivierung und der Hochregulation von Zellzyklusproteinen. Weiterhin zeigten die Zellen
eine erhöhte Apoptose-Resistenz, die mit dem Auftreten von p22-FLIP, cFLIPR/S und NF-κBZielgenen wie Bcl-X korrelierte. Im Einklang mit der inzwischen auch in der Literatur
Zusammenfassung
dokumentierten Notwendigkeit der Caspase-Aktivierung im Rahmen der Proliferation, war
die Prozessierung der Caspasen-3 und -8 unter diesen Bedingungen ebenfalls gesteigert.
Erste Untersuchungen
an mutierten Mäusen, deren CD95L nur aus der
Transmembran- und extrazellulären Domäne besteht, unterstützen nicht die Annahme, dass
CD95L als retrograder Signalgeber fungieren kann. Weitere Untersuchungen sind jedoch
notwendig, um diese Frage abschließend zu klären. Das kostimulatorische Potenzial von
CD95 bei der Aktivierung ruhender T-Zellen wurde allerdings auch bei der Verwendung von
murinen Milzzellen und humanen Agonisten untermauert.
Zusammenfassend hat das CD95/CD95L-System eindeutig eine modulatorische
Funktion im Rahmen der Aktivierung primärer T-Lymphozyten. Unsere Befunde und die
diskutierten Daten anderer Arbeitsgruppen weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen
gering exprimiertem CD95L auf APZ und CD95 auf T-Zellen im Zuge einer Immunantwort
zunächst zur verstärkten Aktivierung, Proliferation und Expansion der T-Zellen führt. Im
weiteren Verlauf der Immunreaktion wird CD95L auf APZ oder benachbarten T-Zellen
vermehrt exprimiert und trägt durch Inhibition der Aktivierung weiterer T-Zellen zur
Beendigung der Immunantwort bei. Aktivierte T-Zellen werden über denselben Rezeptor
durch die Induktion von Apoptose eliminiert, während primäre T-Zellen durch Blockade des
Signals 1 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wird postuliert, dass Pathogene wie
HIV über die Induktion von CD95L auf T-Zellen und APZ die gegen virusinfizierte Zellen
gerichtete Immunantwort supprimieren.
Summary
Summary
The death factor CD95L is best known for its capacity to induce apoptotic cell death in
CD95-sensitive cells. Recently however, emerging evidence pointed at additional antiapoptotic functions of the CD95/CD95L-system in various cellular systems. The exact
molecular mechanisms regulating CD95L reverse signaling or the anti-apoptotic activity of
CD95 in the context of primary human T cell activation had not been elucidated.
One aspect of the present work addresses the investigation of CD95L as a
costimulatory receptor for TCR/CD3/CD28-induced activation of primary human T
lymphocytes. Here we detected a complete block of T cell proliferation by simultaneous
stimulation via CD3/CD28 and CD95L with immobilized, but not soluble fusion proteins or
antibodies. Most early T cell signaling events that we tested were negatively affected.
Specifically, besides the Ras/Raf/MEK/ERK1/2 signal transduction pathway and calcium
flux, key molecules of proximal TCR-signaling including LAT, ZAP-70 and PLCγ were
inhibited. Our results on the putative retrograde signaling through CD95L were recently
published in the journal “International Immunology”.
Moreover, we analyzed the role of the death receptor CD95 as a potential
costimulatory molecule. We could demonstrate that CD95 influences the TCR/CD3/CD28induced activation and signaling of primary T cells in a dose- or threshold-dependent manner.
In agreement with recent data by others, high doses of CD95-agonists resulted in a complete
block of T cell activation. In our hands, however, the same agonists used at low
concentrations drastically augmented T cell proliferation. We confirmed the dose-dependency
for a number of different CD95 agonists (i.e. various fusion proteins and monoclonal
antibodies). CD95 costimulation was associated with non-apoptotic processing of caspase-3
and -8, enhanced MAPK activation and with higher levels of cell-cycle regulator proteins,
anti-apoptotic proteins including p22-FLIP, cFLIPR/S and the NF-κB target gene Bcl-X. The
alterations led to a massive proliferation of the whole population with a uniform upregulation
of activation markers and the enhanced production of IL-2, TNFα and IFNγ. Moreover, the
cells displayed increased apoptosis resistance.
Summary
To address the contribution of the intracellular region of CD95L in this context, we
used mutated mice devoid of this domain (available through Martin Zörnig, Frankfurt).
However, the initial experiments did not support the idea of a CD95L retrograde signaling
capacity whereas the costimulatory potential of CD95 was also supported in this scenario.
In summary, we show that the CD95/CD95L system may direct the activation of
primary human T lymphocytes. From our results, in conjunction with recent observations
reported by others, one can hypothesize that the interaction of CD95 with low level CD95L
(as for instance present on antigen presenting cells (APC)) augments primary T cell activation
and expansion at the onset of an immune response. If activated APC upregulate CD95L,
based on the threshold level, the same set of molecules will elicit the termination of the
immune response by the induction of cell death in activated T cells and by inhibiting the
activation of resting T cells. Concerning retrograde CD95L signaling and its impact on T cell
function, further experiments and more detailed analyses of immune parameters are required
using the different mutant mice that are meanwhile available.