zwischen naiven T-Zellen und dendritischen Zellen
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. H. L. Rieger Methodische Grundlagen zur Untersuchung der „immunologischen Synapse“ zwischen naiven T-Zellen und dendritischen Zellen Inaugural Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Friedrich Tobias Ingo Rothoeft aus Essen 2001 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. U. Schauer Korreferent: Prof. Dr. med. S. Gatermann Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2001 Inhaltsverzeichnis I Verzeichnis der Abbildungen.................................................................................. V Verzeichnis der Tabellen...................................................................................... VII Verzeichnis der Abkürzungen................................................................................IX 1. Einleitung.............................................................................................................1 1.1 Das Nervensystem ......................................................................................... 1 1.2 Die neuronale Synapse .................................................................................. 1 1.3 Das Immunsystem ......................................................................................... 3 1.3.1 Dendritische Zellen................................................................................. 5 1.3.2 Ursprung ................................................................................................. 6 1.3.2.1 Vorläuferzellen dendritischer Zellen und ihre Eigenschaften................................................................................. 9 1.3.2.2 Ausreifung und Migration ............................................................. 10 1.3.3 T-Helfer-Lymphozyten ......................................................................... 12 1.3.3.1 Ursprung und Migration naiver T-Helfer-Zellen........................... 12 1.3.3.2 Aktivierung und Differenzierung................................................... 13 1.3.3.2.1 Die „immunologische Synapse“ ............................................. 13 1.3.3.2.2 Interaktion dendritischer Zellen und naiver T-HelferZellen ...................................................................................... 20 1.3.3.3 Migration aktivierter Lymphozyten............................................... 25 1.4 Bedeutung der „immunologischen Synapse“ .............................................. 26 1.5 Fragestellungen............................................................................................ 26 2. Material und Methoden......................................................................................29 2.1 Material........................................................................................................ 29 2.2 Methoden ..................................................................................................... 35 2.2.1 Blutspender ........................................................................................... 35 2.2.2 Isolierung und Kultivierung der Zellen ................................................ 35 2.2.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut ................. 35 2.2.2.2 Isolierung von Zellen aus Nabelschnurblut ................................... 36 2.2.2.3 Isolierung von CD34+ Stammzellen .............................................. 37 2.2.2.4 Anzüchtung dendritischer Zellen aus CD34+ Stammzellen .......... 38 2.2.2.5 Separation der Subpopulationen dendritischer Zellen................... 39 2.2.2.5.1 Isolierung CD1a+ dendritischer Zellen ................................... 39 2.2.2.5.2 Isolierung CLA+ dendritischer Zellen .................................... 39 2.2.2.6 Isolierung CD45RA+ Lymphozyten .............................................. 40 2.2.3 Bewertung der Fixierung und Permeabilisierung der Zellen an PBMCs................................................................................................ 41 2.2.3.1 Vorbereitung der PBMCs............................................................... 41 2.2.3.2 Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen............................. 42 Inhaltsverzeichnis II 2.2.3.2.1 Färbung der Zellmembranen mit CarbocyaninFarbstoffen .............................................................................. 42 2.2.3.2.2 Färbung mit Succinimidyl-Estern........................................... 42 2.2.3.3 Anfertigung von Zytozentrifugen-Präparaten................................ 43 2.2.3.4 Fixierung der Zellen ...................................................................... 44 2.2.3.5 Permeabilisierung der Zellen......................................................... 45 2.2.3.6 Färbung der Oberflächenmarker.................................................... 45 2.2.3.7 Färbung intrazellulärer Zytokine ................................................... 45 2.2.3.8 Immunfluoreszenz-Mikroskopie.................................................... 46 2.2.4 Bewertung der Fixierung und Permeabilisierung der Zellen an DCs ..................................................................................................... 46 2.2.4.1 Vorbereitung dendritischer Zellen ................................................. 46 2.2.4.2 Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen............................. 47 2.2.4.3 Fixierung und Permeabilisierung................................................... 47 2.2.4.4 Durchflußzytometrische Messung ................................................. 47 2.2.5 Anzüchtung von Clustern aus dendritischen Zellen und CD45RA+ Lymphozyten..................................................................... 48 2.2.5.1 Ko-Kultur dendritischer Zellen und CD45RA+ Lymphozyten ............................................................................... 48 2.2.5.2 Beobachtung der Zellen in Kultur ................................................. 49 2.2.5.3 Verbringung der Cluster auf Objektträger ..................................... 49 2.2.5.4 Beobachtung der Zellen bei der Herstellung der Präparate ........... 50 2.2.6 Fixierung und Färbung intrazellulärer Zytokine in Clustern................ 50 2.2.6.1 Anfärbung mit einem monoklonalen Erstantikörper ..................... 50 2.2.6.2 Anfärbung mit zwei monoklonalen Erstantikörpern ..................... 51 2.2.6.3 Anfärbung mit polyklonalem Erstantikörper................................. 51 2.2.6.4 Immunfluoreszenz-Mikroskopie.................................................... 51 2.2.7 Ergänzende Messungen im FACS ........................................................ 52 2.2.7.1 Anteil CD1a+ dendritischer Zellen ................................................ 52 2.2.7.2 Entwicklung der Subpopulationen dendritischer Zellen in Kultur........................................................................................... 52 2.2.7.3 Reinheit der sortierten Subpopulationen ....................................... 53 2.2.7.4 Messung intrazellulärer Zytokine in Ko-Kulturen aus dendritischen Zellen und Lymphozyten....................................... 53 2.2.7.5 Durchflußzytometrische Messung der Clusterbildung .................. 54 2.2.8 Elektronenmikroskopie......................................................................... 55 2.2.8.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Cluster ......................... 55 2.2.8.2 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) der Cluster............. 55 Inhaltsverzeichnis III 2.2.8.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) der Subpopulationen dendritischer Zellen ......................................... 56 2.2.8.4 Digitale Bildbearbeitung................................................................ 57 3. Ergebnisse..........................................................................................................58 3.1 Bewertung der Fixierung und Permeabilisierung ........................................ 58 3.1.1 Bewertung der Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung an dendritischen Zellen......................................... 58 3.1.1.1 Fixierung........................................................................................ 58 3.1.1.2 Permeabilisierung .......................................................................... 59 3.1.2 Bewertung der Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung an PBMCs............................................................. 60 3.1.2.1 Fixierung........................................................................................ 60 3.1.2.2 Permeabilisierung .......................................................................... 64 3.1.2.3 Verteilung der Zytokine in PBMCs ............................................... 65 3.2 Zellfarbstoffe ............................................................................................... 67 3.2.1 Fluoreszenzfarbstoffe in der Fluoreszenzmikroskopie und im Durchflußzytometer ............................................................................ 67 3.2.2 Fluoreszenzfarbstoffe und Zellfunktion ............................................... 67 3.2.3 Fluoreszenzfarbstoffe und Zellmorphologie......................................... 67 3.3 Anzüchtung von Clustern aus dendritischen Zellen und CD45RA+ Lymphozyten.............................................................................................. 68 3.3.1 Ko-Kultur dendritischer Zellen und CD45RA+ Lymphozyten............. 68 3.3.2 Verbringung der Cluster auf Objektträger ............................................ 69 3.3.2.1 Kulturgefäße .................................................................................. 72 3.3.2.2 Verbringung der Zellen auf Objektträger....................................... 73 3.4 Färbung intrazellulärer Zytokine ................................................................. 74 3.4.1 Anfärbung von IL-4.............................................................................. 74 3.4.2 Anfärbung von IFN-γγ............................................................................ 75 3.4.3 Kontrolle der Zytokinfärbung im FACS............................................... 75 3.5 Morphologie der Cluster.............................................................................. 75 3.5.1 Aufbau der Cluster................................................................................ 75 3.5.2 Kontakte zwischen den Zellen.............................................................. 79 3.5.3 Verteilung der Zytokine innerhalb der Zellen und der Cluster ............. 93 3.6 Subpopulationen dendritischer Zellen ......................................................... 93 3.6.1 Entwicklung der Subpopulationen in Kultur ........................................ 93 3.6.2 Isolation der Subpopulationen .............................................................. 97 3.7 Einflüsse von Brefeldin A ......................................................................... 103 4. Diskussion .......................................................................................................104 4.1 Fixierung und Permeabilisierung............................................................... 104 Inhaltsverzeichnis IV 4.1.1 Fixierung............................................................................................. 105 4.1.2 Permeabilisierung ............................................................................... 108 4.3 Brefeldin A ................................................................................................ 110 4.4 Antikörper.................................................................................................. 112 4.5 Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen.......................................................... 114 4.6 Anzüchtung und Verbringung auf Objektträger ........................................ 116 4.7. Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten................................. 118 4.7.1 Aufbau der Cluster.............................................................................. 118 4.7.2 Kontakte zwischen den Zellen............................................................ 120 4.7.3 Verteilung der Zytokine innerhalb der Cluster ................................... 123 4.7.4 Zytokinmuster in den Clustern ........................................................... 125 4.8 Subpopulationen dendritischer Zellen ....................................................... 126 5. Zusammenfassung ...........................................................................................128 6. Literaturverzeichnis .........................................................................................130 7. Anhang.............................................................................................................153 7.1 Einflüsse von Fixierung und Permeabilisierung auf Autofluoreszenz und Morphologie dendritischer Zellen ......................... 153 7.2 Einflüsse von Fixierung und Permeabilisierung auf die Anfärbung dendritischer Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen ..................................... 158 Danksagung .........................................................................................................165 Lebenslauf............................................................................................................166 Verzeichnis der Abbildungen V Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1: Verteilung der Oberflächenmoleküle im Kontaktbereich............. S.17 Abbildung 2: Die Formierung der „immunologischen Synapse“....................... S.17 Abbildung 3: Verschiedene Oberflächenmoleküle im Größenvergleich............ S.18 Abbildung 4: Verteilung der Oberflächenmoleküle in der „immunologischen Synapse“ anhand ihrer Größe...................................................................... S.18 Abbildung 5: Umverteilung der Oberflächenmoleküle eines T-Lymphozyten nach Aktivierung...............................................................S.19 Abbildung 6: Reorientierung des MTOC........................................................... S.19 Abbildung 7: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung I................S.61 Abbildung 8: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung II...............S.61 Abbildung 9: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung III............. S.63 Abbildung 10: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung IV............S.63 Abbildung 11: Verteilungsmuster von Zytokinen nach Inkubation mit BFA I...S.66 Abbildung 12: Verteilungsmuster von Zytokinen nach Inkubation mit BFA II.................................................................................................... S.66 Abbildung 13: Zytokinproduktion in der Ko-Kultur...........................................S.70 Abbildung 14: Anteil der IFN-γ-produzierenden Zellen in der Ko-Kultur.........S.70 Abbildung 15: Anteil der IL-4-produzierenden Zellen in Kultur........................S.71 Abbildung 16: Anteil der IFN-γ- und IL-4-produzierenden Zellen in Kultur.....S.71 Abbildung 17: Cluster in Kultur I....................................................................... S.77 Abbildung 18: Cluster in Kultur II......................................................................S.77 Abbildung 19: Cluster in Kultur III.................................................................... S.78 Abbildung 20: Cluster in Kultur IV.....................................................................S.78 Abbildung 21: Kontakte zwischen Zellen I........................................................ S.80 Abbildung 22: Kontakte zwischen Zellen II....................................................... S.81 Abbildung 23: Kontakte zwischen Zellen III......................................................S.81 Abbildung 24: Kontakte zwischen Zellen IV......................................................S.82 Abbildung 25: Kontakte zwischen Zellen V....................................................... S.82 Abbildung 26: Kontakte zwischen Zellen VI......................................................S.83 Abbildung 27: Kontakte zwischen Zellen VII.................................................... S.83 Abbildung 28: Kontakte zwischen Zellen VIII...................................................S.84 Abbildung 29: Kontakte zwischen Zellen IX......................................................S.85 Abbildung 30: Kontakte zwischen Zellen X.......................................................S.85 Abbildung 31: Kontakte zwischen Zellen XI......................................................S.86 Abbildung 32: Kontakte zwischen Zellen XII.................................................... S.86 Abbildung 33: Kontakte zwischen Zellen XIII...................................................S.87 Abbildung 34: Kontakte zwischen Zellen XIV................................................... S.87 Verzeichnis der Abbildungen VI Abbildung 35: Kontakte zwischen Zellen XV.................................................... S.88 Abbildung 36: Kontakte zwischen Zellen XVI...................................................S.89 Abbildung 37: Kontakte zwischen Zellen XVII................................................. S.89 Abbildung 38: Kontakte zwischen Zellen XVIII................................................S.90 Abbildung 39: Kontakte zwischen Zellen XIX...................................................S.90 Abbildung 40: Kontakte zwischen Zellen XX....................................................S.91 Abbildung 41: Kontakte zwischen Zellen XXI...................................................S.91 Abbildung 42: Kontakte zwischen Zellen XXII................................................. S.92 Abbildung 43: Kontakte zwischen Zellen XXIII................................................S.92 Abbildung 44: Zytokinsekretion I.......................................................................S.94 Abbildung 45: Zytokinsekretion II......................................................................S.94 Abbildung 46: Zytokinsekretion III.................................................................... S.95 Abbildung 47: Zytokinsekretion IV.................................................................... S.95 Abbildung 48: Zytokinsekretion V......................................................................S.96 Abbildung 49: Zytokinsekretion VI....................................................................S.96 Abbildung 50: Subpopulationen dendritischer Zellen im FACS........................ S.98 Abbildung 51: Expression von CLA in Kultur................................................... S.98 Abbildung 52: Anteil CD1a+ und CD1a+/CLA+ Zellen in der Kultur.................S.99 Abbildung 53: Anteil CD14+ und CD14+/CLA+ Zellen in der Kultur................ S.99 Abbildung 54: Anteil CD1a-/CD14- und CD1a-/CD14-/CLA+ Zellen in der Kultur................................................................................................... S.100 Abbildung 55: Anteil CD1a+/CD14+ und CD1a+/CD14+/CLA+ Zellen in der Kultur................................................................................................... S.100 Abbildung 56: Langerhans-Zelle I....................................................................S.101 Abbildung 57: Langerhans-Zelle II...................................................................S.102 Abbildung 58: Langerhans-Zelle III................................................................. S.102 Abbildung 59: Kontaktstelle zwischen einer dendritischen Zelle und einer T-Zelle im Transmissionselektronenmikroskop.........................S.122 Abbildung 60: Schematische Darstellung der Kontaktstelle zwischen einer dendritischen Zelle und einer T-Zelle...............................................S.122 Verzeichnis der Tabellen VII Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: Oberflächenmarker myeloider und lymphoider dendritischer Zellen.............................................................................................................S.8 Tabelle 2: Kostimulatorische Moleküle und ihre Funktion.................................S.23 Tabelle 3: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung........................S.64 Tabelle 4: Fluoreszenzfarbstoffe und Zellmorphologie...................................... S.68 Tabelle 5: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung frisch aufgetauter dendritischer Zellen....................................................................................S.153 Tabelle 6: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung frisch aufgetauter dendritischer Zellen....................................................................................S.154 Tabelle 7: Mittlere Fluoreszenz frisch aufgetauter dendritischer Zellen, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm...... S.154 Tabelle 8: Mittlere Fluoreszenz frisch aufgetauter dendritischer Zellen, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm...... S.155 Tabelle 10: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Stimulation mit GM-CSF (24h).................................................................S.155 Tabelle 11: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Stimulation mit GM-CSF (24h).................................................................S.156 Tabelle 12: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Stimulation mit GM-CSF (24h), mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm...................................................................................S.156 Tabelle 13: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Stimulation mit GM-CSF (24h), mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm...................................................................................S.157 Tabelle 14: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO................................................................................S.158 Tabelle 14: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO................................................................................S.159 Tabelle 15: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm...................................................................................................S.159 Tabelle 16: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm...................................................................................................S.160 Tabelle 17: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL....................................................................................S.160 Tabelle 18: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL.........................................................................................S.161 Verzeichnis der Tabellen VIII Tabelle 19: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation bei 480nm, Emission bei 530nm...................................................................................................S.161 Tabelle 20: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation bei 480nm, Emission bei 580nm...................................................................................................S.162 Tabelle 21: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE......................................................................................S.162 Tabelle 22: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE......................................................................................S.163 Tabelle 23: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm...................................................................................................S.163 Tabelle 24: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm...................................................................................................S.164 Verzeichnis der Abkürzungen IX Verzeichnis der Abkürzungen APZ Antigen-präsentierende Zelle CBMC cord blood mononuclear cells CCR CC chemokine receptor CD cluster of differentiation CLA cutaneous lymphocyte antigen Con A Concanavalin A CXCR CXC chemokine receptor CLSM confocal laser scanning microscope cSMAC central supramolecular activation clusters DDSA Dodecenyl-Bernsteinsäureanhydrid DMP 2,4,6-Tris-(Dimethylaminomethyl)-Phenol DMSO Dimethyl Sulfoxid DNA deoxyribonucleic acid ELC Epstein-Barr-virus-induced gene 1 ligand chemokine FACS fluorescence activated cell sorter FCS fetal calf serum FSC forward light scatter GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor HEPES Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure HEV high endothelial venules HPLC high-performance liquid chromatography ICAM intercellular adhesion molecule IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin ITAM immunoreceptor tyrosine-base activation motifs LAT linker for activation of T cells Lck lymphoid cell kinase LFA leukocyte function-associated antigen LPS Lipopolysaccharid MIIC multilamellar major histocompatibility complex class II compartments Verzeichnis der Abkürzungen MACS magnetic cell sorter MAdCAM-1 mucosal adressin-cell adhesion molecule 1 MALT mucosa associated lymphatic tissue MCP monocyte chemotactic protein M-CSF macrophage-colony stimulating factor MHC major histocompatibility complex MIP macrophage inflammatory protein MLR mixed lymphocyte reaction MNA Methyl-Norbonen-2,3-Dicarbonsäure-Anhydrid NFAT nuclear factor of activated T cells PARC pulmonary and activation-regulated chemokine PBMC peripheral blood mononuclear cells PHA Phytohaemagglutinin PKC-θ protein kinase C-θ PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat PNAd peripheral node adressin PPD tuberculin purified protein derivative pSMAC peripheral supramolecular activation clusters PWM pokeweed mitogen REM Rasterelektronenmikroskop RNA ribonucleic acid SCF stem cell factor SHP-1 Src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase SKSD Streptokinase-Streptodornase SLC secondary lymphoid tissue chemokine SMAC supramolecular activation clusters SSC sideward light scatter TARC thymus and activation-regulated cytokine TEM Transmissionselektronenmikroskop TGF transforming growth factor Th T-Helfer-Zelle TNF tumor necrosis factor TZR T-Zell-Rezeptor ZAP 70 ζ-associated protein X 1. Einleitung 1 1. Einleitung Der Mensch verfügt über zwei adaptive Organsysteme, die erst im Kontakt mit der Umwelt in den ersten Lebensjahren zur vollen Funktion gelangen: Das Nervensystem und das Immunsystem. Bei beiden Systemen gewährleisten Kontakte zwischen Zellen die Verarbeitung und Speicherung von Informationen. Die Kontakte zwischen Nervenzellen werden als Synapsen bezeichnet; eine Bezeichnung, die sich vom griechischen synaptein (aneinander befestigen) ableitet. Für die Kontakte zwischen immunkompetenten Zellen kam in den letzten Jahren die Bezeichnung „immunologische Synapse“ auf, deren Berechtigung noch umstritten ist. 1.1 Das Nervensystem Das Nervensystem ermöglicht dem Menschen die Interaktion mit seiner Umgebung. Seine wichtigsten Funktionen sind die Wahrnehmung, die Integration des Wahrgenommenen, das Denken und Fühlen und die Auslösung angemessener Verhaltensweisen. Das Nervensystem erfüllt seine Aufgabe auf der Grundlage von Prinzipien, die hier stark vereinfacht dargestellt werden: Periphere Sinnesreize werden von Rezeptoren aufgenommen und über afferente Nervenfasern dem zentralen Nervensystem zugeleitet, das die ankommenden Impulse integriert. Die Verarbeitung wird von zahlreichen, hintereinandergeschalteten Neuronen geleistet. Diese Neuronenkette endet schließlich an einer efferenten, meist motorischen Nervenfaser, welche die Impulse des zentralen Nervensystems an ein peripheres Erfolgsorgan weitergibt. 1.2 Die neuronale Synapse Die Informationen werden zwischen den einzelnen Nervenzellen über spezialisierte Kontaktstellen weitergegeben, die Synapsen. Diesen Begriff führte Sherrington 1897 in Fosters „A Text Book Of Physiology“ ein. Er bezeichnete damit einen langfristig bestehenden Kontakt ohne Kontinuität der Substanz, der die Weitergabe von Informationen in nur eine Richtung gestattet. 1. Einleitung 2 Es existieren zwei verschiedene Typen von Synapsen: elektrische und chemische. Numerisch überwiegen chemische Synapsen bei weitem, an denen nach Depolarisation der Nervenendigung ein Überträgerstoff freigesetzt wird. Dieser bindet an der postsynaptischen Membran an Rezeptoren, worauf sich Ionenkanäle öffnen. Bei direkt ligandengesteuerten Kanälen ist die Bindungs- und Ionenkanalfunktion in einem Molekül vereinigt. Indirekt ligandengesteuerte Kanäle verfügen über G-Proteine, die nach Ligandenbindung an das Rezeptormolekül entweder direkt Kanäle öffnen oder über second messengers wirken. Wachstum und Verbindung von Nervenzellen werden über frühe Erfahrungen und Interaktionen mit der Umgebung gesteuert. Lernen, Gedächtnis und Erinnerung, also die Aufnahme, Abgabe und Speicherung von Information durch neuronale Netzwerke, ist die biologische Grundlage der Anpassung individuellen Verhaltens an die Umwelt. Ohne diese Vorgänge wäre weder das Überleben des Einzelnen noch das seiner Art möglich, denn es könnten weder Erfolge planvoll wiederholt noch Mißerfolge gezielt vermieden werden. Alle Lernprozesse sind Ausdruck der Plastizität des Nervensystems. Unter Lernen versteht man den Erwerb neuen Verhaltens, das bisher im Verhaltensrepertoire des Organismus nicht vorkam. Damit wird Lernen von der Reifung unterschieden, bei der genetisch programmierte Wachstumsprozesse zu plastischen Veränderungen des zentralen Nervensystems führen, die als unspezifische Voraussetzung für Lernprozesse fungieren. Neuronaler Plastizität liegen elektrochemische Veränderungen an den Spines der Nervenzellen zugrunde. Unter Plastizität versteht man eine Modifikation der neuronalen Antwort durch Veränderung der Effizienz der Transmission. Kurzfristige Veränderungen werden durch eine verstärkte Ausschüttung von Transmittern an der präsynaptischen Membran vermittelt. Langfristige Veränderungen werden durch Modulation zytoplasmatischer Faktoren (second messenger) an der postsynaptischen Membran vermittelt, die zu einer stärkeren Antwort pro Transmittereinheit führen. Zusätzlich werden rückkoppelnde Signale an die präsynaptische Membran gesandt. Diese funktionelle Plastizität wird auf der morphologischen Ebene widergespiegelt, da sich mit der Aktivität der Synapse auch ihre Struktur ändert. Durch diese Vorgänge werden allerdings nicht nur bestehende Synapsen gestärkt 1. Einleitung 3 oder neue geschaffen, sondern auch nicht benutzte Synapsen geschwächt. Das Ausmaß der Aktivität steuert die Ausschüttung von nerve growth factor, so daß nicht aktive Synapsen absterben oder ihre Funktion verlieren. Die Steuerung dieser Vorgänge ist jedoch noch weitgehend unklar1,2. Zusammenfassend kann man sagen, daß plastische Synapsen zwischen den Neuronen den Ort des Lernens darstellen. 1.3 Das Immunsystem Das Immunsystem ist eine Organisation von Zellen und Molekülen, die auf verschiedene Funktionen in der Infektabwehr spezialisiert sind. Gegen eindringende Mikroben gibt es zwei grundlegend unterschiedliche Abwehrformen: Die Antwort des unspezifischen Immunsystems (angeboren) läuft immer gleich ab, auch wenn das auslösende Agens mehrfach auftritt. Das spezifische Immunsystem (erworben) besitzt die Fähigkeit, die antigene Struktur in Erinnerung zu behalten, so daß bei wiederholtem Kontakt mit dem auslösenden Antigen eine raschere und stärkere Reaktion erfolgt. Darüber hinaus hat das spezifische Immunsystem die Fähigkeit, entartete körpereigene Zellen phagozytierenden Zellen anzugreifen. Das unspezifische Immunsystem beruht auf (Neutrophile, Monozyten und Makrophagen), Zellen, die inflammatorische Mediatoren sezernieren (Basophile, Eosinophile und Mastzellen) und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Die molekulare Komponente des unspezifischen Immunsystems besteht aus dem Komplementsystem, den akute-Phase Proteinen und Zytokinen wie den Interferonen. Die Reaktionen des spezifischen Immunsystems werden in den Lymphknoten, der Milz und dem Mucosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) generiert, den sogenannten sekundären lymphatischen Geweben. Dort treten Lymphozyten mit Antigen-präsentierenden Zellen in Kontakt. Die Mediatoren der spezifischen Immunität sind T- und B-Lymphozyten. T-Helfer-Zellen regulieren die Immunantwort und dienen der Unterstützung von zytotoxischen T-Zellen und B-Lymphozyten. Sie fördern die Elimination intrazellulärer Erreger durch die Aktivierung von Makrophagen. Zytotoxische T-Zellen eliminieren virusinfizierte und maligne entartete Zellen. 1. Einleitung 4 B-Zellen bilden Immunglobuline, Antigen-spezifische Antikörper, die an die Umgebung abgegeben werden und sich gegen extrazelluläre Antigene richten. T-Lymphozyten erwerben durch ihre Aktivierung Effektorfunktionen und wandern zum Ort der Entzündung, wo sie mit Antigen-tragenden Parenchymzellen und Leukozyten interagieren. Diese Interaktion findet entweder mit Eosinophilen, Basophilen und Mastzellen (T-Helfer 2 Reaktion) oder Makrophagen und Neutrophilen (T-Helfer 1 Reaktion) statt. Zu Beginn einer Immunantwort oder als Reaktion auf einen singulären Reiz entstehen Th0-Zellen. Diese Zellen sezernieren hauptsächlich IL-2 und können in geringen Mengen eine große Zahl weiterer Zytokine (z.B. IL-4, IL-5, IL-10, IFNγ, TNF-α) synthetisieren. Th0-Zellen können durch Stimulation zu Th1- oder Th2-Zellen differenzieren, die größere Mengen eines schmaleren Zytokinspektrums sezernieren. Die Th1-Reaktion fördert durch Abgabe bestimmter Zytokine (bevorzugt IL-2, IFN-γ, TNF-α/β) die zelluläre Immunität durch Aktivierung zytotoxischer und phagozytierender Zellen wie zytotoxischer T-Zellen, natürlicher Killerzellen und Makrophagen. Die Th2-Reaktion (bevorzugt IL-4, IL-5, IL-13) aktiviert eosinophile und basophile Granulozyten sowie Mastzellen und führt zu einer Antikörperproduktion durch B-Zellen. Der Isotyp der sezernierten Antikörper wird ebenfalls durch T-Helfer-Zellen kontrolliert. Diese Einteilung in Th1- und Th2-Zellen ist nicht als eindeutig anzusehen. Neben den oben erwähnten Zytokinen sezernieren Lymphozyten noch einige andere (IL-6, IL-10, GM-CSF), die jedoch nicht definitiv der Th1- oder Th2Gruppe zugeordnet werden können3. Die Aktivierung geschieht in den T-Zell-Bereichen sekundärer lymphatischer Organe durch Kontakt mit Antigen-präsentierende Zellen (APZ), die in der Peripherie aufgenommene Antigene präsentieren. Der Antigenkontakt ruft eine klonale Expansion der aktivierten Lymphozyten hervor und bestimmt ihre weitere Differenzierung4. Die Kontaktstelle zwischen T-Lymphozyten und Antigenpräsentierenden Zellen wird als „immunologische Synapse“ bezeichnet. Der T-Zell-Rezeptor (TZR) erkennt Antigenfragmente, die auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle an Moleküle des major histocompatibility 1. Einleitung 5 complex (MHC) gebunden sind. Von diesen Molekülen existieren zwei verschiedene Typen: MHC-Klasse I und II. MHC-Klasse I werden zur Stimulation zytotoxischer T-Zellen, MHC-Klasse II zur Stimulation von T-Helfer-Zellen benötigt. Intrazelluläre und extrazelluläre Antigene werden in den Antigen-präsentierenden Zellen verarbeitet, binden an MHC-Klasse I Moleküle und stimulieren zytotoxische T-Zellen, die Zielzellen direkt zerstören können. Extrazelluläre Antigene werden von Antigen-präsentierenden Zellen aufgenommen und auf MHC-Klasse II Molekülen an Antigen-spezifische THelfer-Zellen präsentiert. Als Antigen-präsentierende Zellen können B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen fungieren. Dendritische Zellen sind spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen und spielen in der primären Immunantwort eine besonders kritische Rolle: Nur sie sind in der Lage, naive T-Helfer-Zellen zu aktivieren und ein immunologisches Gedächtnis zu schaffen. Gegenüber Eigenantigenen induzieren dendritische Zellen eine T-Zell Toleranz und vermindern Autoimmunreaktionen5,6,7,8. Zytotoxische T-Zellen werden durch ein Zusammenspiel von T-Helfer-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen aktiviert. B-Zellen, die Vorläufer der Antikörper-produzierenden Plasmazellen, können native Antigene über ihre B-Zell-Rezeptoren erkennen. Ihre Proliferation, Differenzierung und die Antikörperproduktion werden durch Interaktion mit THelfer-Zellen und dendritischen Zellen reguliert. Das immunologische Gedächtnis beruht auf verschiedenen langlebigen T- und BGedächtniszellen, die eine erhöhte Reaktivität gegen Krankheitserreger aufweisen, denen das Immunsystem bereits zuvor begegnet ist. Spezifisches und unspezifisches Immunsystem ergänzen sich in der Infektabwehr. 1.3.1 Dendritische Zellen Dendritische Zellen wurden erstmals 1868 von Langerhans in der Epidermis identifiziert und als Langerhans-Zellen bezeichnet9. Ihre Präsenz in anderen Organen und ihre Funktion wurden erst ab 1973 von Steinman und Kollegen in der Maus10 und ab 1982 auch beim Menschen weiter charakterisiert11. 1. Einleitung 6 Die Kriterien, die einen Leukozyten als dendritische Zelle definieren, gelten nur für voll ausgereifte dendritische Zellen. Dazu gehören unter anderem die charakteristische Morphologie, eine hohe Expression von MHC-Komplexen und kostimulatorischen Molekülen an der Zelloberfläche sowie die ausgeprägte Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Unreife dendritische Zellen weisen hingegen keine für diese Zellreihe spezifischen Marker auf und sind eine sehr heterogene Population7,8. 1.3.2 Ursprung Dendritische Zellen entstehen aus CD34+ Stammzellen des Knochenmarks. Vorläuferzellen dendritischer Zellen finden sich in geringer Frequenz im Interstitium fast aller Organe (ausgenommen das Gehirn). Dendritische Zellen stellen eine sehr heterogene Gruppe dar, von der mehrere Subpopulationen im menschlichen Blut vorhanden sind, die aus verschiedenen Vorläuferzellen entstehen können; es können jedoch auch verschiedene reife dendritische Zellen aus derselben Vorläuferzelle hervorgehen. Die Art der in vitro erzeugten Subpopulationen ist von der Methode der Anzucht dieser Zellen abhängig: 1. Erzeugung dendritischer Zellen aus CD34+ hämatopoietischen Stammzellen a) CD34+ Stammzellen aus Nabelschnurblut oder Knochenmark werden in FCShaltigem Medium kultiviert und mit TNF-α und GM-CSF stimuliert. Nach 12 Tagen exprimiert die Mehrheit dieser Zellen CD1a und entspricht nach morphologischen und phänotypischen Kriterien (CD4, CD40, CD54, CD80, CD86, hohe Expression von MHC-Klasse II) dendritischen Zellen. Auch induzieren sie eine starke Proliferation naiver T-Lymphozyten. Einige dieser Zellen (ca. 20%) weisen einen für Langerhans-Zellen typischen Phänotyp auf (Birbeck-Granula, Lag+, E-cadherin+, Langerin+)12,13. Durch Zugabe von TGF-β kann der Anteil der Langerhans-Zellen auf bis zu 80% gesteigert werden14. b) CD34+ Stammzellen, die mit GM-CSF und TNF-α in FCS-haltigem Medium kultiviert werden, entwickeln sich in zwei verschiedenen Richtungen. Zwischen 1. Einleitung 7 dem fünften und siebten Tag in Kultur entstehen zwei verschiedene Subpopulationen dendritischer Zellen, deren Unterscheidungsmerkmal die Expression von CD1a und CD14 ist. Die Entwicklung beider Subpopulationen ist von endogen gebildetem TGF-β abhängig. CD1a+ CD14- Zellen werden zu CD1a+ CD14- Langerhans-Zellen (BirbeckGranula, Lag+, E-cadherin+, Langerin+). CD1a- CD14+ Zellen werden zu CD1a+ CD14- interstitiellen dendritischen Zellen (keine Birbeck-Granula, Lag-, E-cadherin-, CD68+, Faktor XIII+) oder zu CD1aCD14+ Makrophagen. Beide Subpopulationen sind starke Stimulatoren naiver T-Zellen, wohingegen nur die CD1a+ CD14- interstitiellen dendritischen Zellen naive B-Zellen zur Differenzierung anregen können12,13,14,15,. c) CD1a- CD14+ Vorläuferzellen, die aus CD34+ Stammzellen mit GM-CSF und TNF-α in FCS-haltigem Medium kultiviert werden, differenzieren nach Zugabe von TGF-β oder M-CSF zu Langerhans-Zellen, dendritischen Zellen oder Makrophagen. CD14+ CD11b- Zellen differenzieren unter dem Einfluß von exogenem TGF-β zu CD1a+ CD14- Langerhans-Zellen (Birbeck-Granula, Lag+, E-cadherin+, Langerin+). Nach Zusatz von M-CSF entstehen Makrophagen (CD1a-, CD14+, CD11b+, E-cadherin-). CD14+ CD11b+ differenzieren unter Einwirkung von exogenem TGF-β zu dendritischen Zellen (CD1a+, CD14-, CD11b+) oder nach Zugabe von M-CSF zu Makrophagen14,16. 2. Erzeugung dendritischer Zellen aus mononukleären Zellen Aus CD14+ Monozyten aus dem peripheren Blut lassen sich durch Kultur mit IL-4 und GM-CSF oder IL-13 und GM-CSF dendritische Zellen gewinnen. Diese dendritischen Zellen weisen die Kriterien unreifer dendritischer Zellen auf (geringe Expression von CD80 und CD86, intrazytoplasmatische Expression von MHC-Klasse II, hohe Antigenaufnahme und geringe Stimulation naiver T-Zellen). Eine Stimulation dieser Zellen mit LPS, TNF-α, T-Zell-Signalen wie CD40L oder vielen anderen Stimuli führt zur Ausreifung. 1. Einleitung 8 Durch Stimulation mit TGF-β, GM-CSF und IL-4 entstehen aus CD14+ Monozyten Langerhans-Zellen (CD1a+, E-cadherin+, CLA+, Birbeck-Granula). Auch aus Vorläuferzellen neutrophiler Granulozyten lassen sich durch entsprechende Stimulation dendritische Zellen erzeugen17,18,19,20. 3. Lymphoide dendritische Zellen Darüber hinaus gibt es CD4+ CD3- CD11c- plasmazytoide Zellen, die in Anwesenheit von IL-3 und nach Aktivierung durch CD40 zu dendritischen Zellen werden können. Diese Zellen haben auch im unreifen Zustand nur eine geringe Fähigkeit, Antigene aufzunehmen, und können nicht zu Makrophagen differenzieren. Der Ursprung dieser Zellen ist noch nicht geklärt21,22. In vivo sind zumindest zwei verschiedene Subpopulationen dendritischer Zellen vorhanden. Nach phänotypischen Merkmalen lassen sich im peripheren Blut eine myeloide und eine lymphoide Population dendritischer Zellen unterscheiden (Tab. 1). Wie diese Subpopulationen sich zu den verschiedenen gewebsständigen dendritischen Zellen, wie den Langerhans-Zellen, verhalten, ist zur Zeit noch unklar23. Tabelle 1: Oberflächenmarker myeloider und lymphoider dendritischer Zellen5,6,7,8,23 Im peripheren Blut befinden sich eine myeloide und eine lymphoide Population dendritischer Zellen, die sich durch die Oberflächenmarker unterscheiden. myeloid lymphoid CD1c+ CD1c- CD4+/- CD4+ CD11c+ CD11c- CD33+ CD33- CD45RA- CD45RA+ CD123- CD123+ Expression verschiedener 1. Einleitung 9 1.3.2.1 Vorläuferzellen dendritischer Zellen und ihre Eigenschaften Die aus CD34+ Stammzellen entstehenden Vorläuferzellen gelangen aus dem Knochenmark über den Blutkreislauf in nicht-lymphatische Organe, in denen sie als gewebsständige Zellen verbleiben. Es handelt sich bei ihnen um unreife dendritische Zellen, die in der Haut als Langerhans-Zellen bezeichnet werden. Unreife dendritische Zellen zeichnen sich durch verschiedene Eigenschaften aus: Sie exprimieren eine große Zahl von Adhäsionsmolekülen, welche die Migration und den Verbleib in peripheren Geweben ermöglichen. Langerhans-Zellen exprimieren zu diesem Zweck zusätzlich E-cadherin und CLA7,8. Die Migration von Langerhans-Zellen in die Haut wird über den Zytokinrezeptor CCR6 gesteuert. Die Rezeptoren inflammatorischer Zytokine (CCR1, CCR2, CCR5), die auf unreifen dendritischen Zellen exprimiert werden, kontrollieren ihre Migration in entzündetes Gewebe24. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt zur Reorganisation des Zytoskeletts und zur Mobilisierung der Zellen8. Die Zellen haben eine hohe Kapazität zur Antigenaufnahme und -verarbeitung. Die Aufnahme der Antigene erfolgt über mindestens vier verschiedene Mechanismen: (1) Makropinozytose, (2) rezeptorvermittelte Endozytose über Fcγund Fcε-Rezeptoren und C-Typ Lectin-Rezeptoren (Mannose Rezeptor), (3) Phagozytose, (4) apoptotische Zellen über CD36 und den Vitronectin Rezeptor α(v)β37,8. Langerhans-Zellen haben eine geringere Kapazität zur Antigenaufnahme. Sie zeigen eine von anderen dendritischen Zellen verschiedene Expression von Fcγund Fcε-Rezeptoren und verfügen nicht über einen Mannose-Rezeptor. Ihre endozytotischen Möglichkeiten sind stark eingeschränkt7,8. Langerhans-Zellen verfügen im Gegensatz zu anderen dendritischen Zellen über einen als Langerin (CD207) bezeichneten Rezeptor, der wahrscheinlich ebenfalls in die Antigenaufnahme involviert ist und bei Internalisierung die Bildung von BirbeckGranula induziert25,26. Unreife dendritische Zellen weisen eine hohe intrazelluläre Expression von MHCKlasse II Molekülen auf: MHC-Klasse II Moleküle sammeln sich intrazellulär in 1. Einleitung 10 MHC-Klasse II reichen Kompartimenten (MIIC) an, die eine multivesikuläre oder multilamelläre Struktur haben. Die aufgenommenen Antigene werden mit den intrazellulär stark exprimierten MHC-Klasse II Molekülen zusammengebracht und zu Antigen-MHC-Klasse II Komplexen zusammengefügt. Zur Stimulation zytotoxischer T-Zellen müssen die entsprechenden Antigene auf MHC-Klasse I Molekülen präsentiert werden. Dies kann über eine virale Infektion dendritischer Zellen geschehen, bei der die viralen Antigene aus dem Zytosol ins endoplasmatische Retikulum transportiert und dort an MHC-Klasse I Moleküle gebunden werden. Auf MHC-Klasse I Molekülen können jedoch über einen noch unklaren Mechanismus auch Antigene präsentiert werden, die nicht aus dem Zytosol stammen, zum Beispiel Transplantationsantigene. Auch Eigenantigene aus apoptotischen Zellen können präsentiert werden, um eine Toleranz zytotoxischer T-Zellen zu induzieren6,7,8. Die Expression des Zytokinrezeptors CCR7, der die Migration in sekundäre lymphatische Gewebe steuert, ist gering24. Ebenfalls gering ausgeprägt ist die Expression kostimulatorischer Moleküle (CD40, CD54, CD58, CD80, CD86) und die Synthese von IL-12, so daß die Zellen nur schlecht Lymphozyten stimulieren können6,7,8. 1.3.2.2 Ausreifung und Migration Die Ausreifung dendritischer Zellen ist mit ihrer Wanderung über die Blutbahn oder afferente Lymphgefäße in sekundäre lymphatische Organe verbunden und umfaßt die Verwandlung einer phagozytierenden Zelle in eine Antigenpräsentierende Zelle. Dieser Prozeß beginnt in der Peripherie nach Antigenaufnahme (LPS, bakterielle DNA oder Doppelstrang RNA), Kontakt mit inflammatorischen Botenstoffen (IL-1, IL-6, TNF-α und Prostaglandine) und wird erst während der Interaktion mit T-Zellen im Lymphknoten beendet (u.a. CD40CD40L Interaktion)6,7,8. Im Laufe dieser Ausreifung verlieren die Zellen ihre Fähigkeit zur Antigenaufnahme, die Zahl der Fc-Rezeptoren geht zurück. 1. Einleitung 11 Dem Stimulus zur Ausreifung folgend wird die Synthese von MHC-Klasse II Molekülen kurzzeitig erhöht und führt zu einer stabilen Präsentation (>100h) von Antigen-beladenen MHC-Klasse II Komplexen auf der Oberfläche8. Die Adhäsions-Moleküle spielen sowohl bei der Wanderung dendritischer Zellen in die sekundären lymphatischen Organe als auch bei der Etablierung einer Interaktion mit T-Zellen eine Rolle. CD54 und CD102 werden wahrscheinlich zur Regulation der Migration und der Interaktion mit T-Zellen benötigt. CD50 vermittelt wohl eine Verbindung zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen. CD49d β-Integrin wird zum Verlassen der Blutgefäße in den Lymphknoten benötigt. CD44, ein Rezeptor für Hyaluronsäure, findet sich während der Migration zu den sekundären lymphatischen Organen ebenfalls verstärkt auf der Zelloberfläche. Ebenfalls verstärkt wird im Laufe der Ausreifung die Expression kostimulatorischer Moleküle wie CD40, CD54, CD58, CD80 und CD867,8. Die Zytokinrezeptoren und die Zytokinproduktion verhalten sich uneinheitlich; einige werden vermindert, andere vermehrt exprimiert. Nach Stimulation sezernieren dendritische Zellen kurzzeitig inflammatorische Zytokine (MIP-1α, MIP-1β und IL-8). Die Produktion dieser Zytokine findet wahrscheinlich noch in peripheren Geweben statt und führt zur Migration unreifer dendritischer Zellen und Effektor-Zellen (Makrophagen, Neutrophile und TZellen) an den Ort der Entzündung. Während der Ausreifung verlieren dendritische Zellen ihre Rezeptoren für inflammatorische Zytokine, während die Rezeptoren für lymphoide Zytokine verstärkt exprimiert werden (CCR7). Dies erlaubt den dendritischen Zellen die Wanderung in die T-Zell Areale sekundärer lymphatischer Organe24. Die Expression verschiedener Zytokinrezeptoren in Abhängigkeit der Ausreifung dendritischer Zellen wird als der wichtigste Einfluß auf die Migration der Zellen angesehen7,8. Stimulierte dendritische Zellen sezernieren in den lymphatischen Organen Zytokine, die ausreifende dendritische Zellen (ELC) und naive Lymphozyten (MDC, TARC, PARC, ELC) anlocken. Dadurch wird sichergestellt, daß auch nach Wanderung der ersten Welle dendritischer Zellen in die sekundären lymphatischen Gewebe Antigene aufgenommen werden und weitere aktivierte dendritische Zellen für die T-Zell Stimulation zur Verfügung stehen24. Dies ist besonders 1. Einleitung 12 wichtig, da aktivierte dendritische Zellen nur eine begrenzte Lebensdauer haben27. Eine andere Möglichkeit ist, daß die beim Absterben freigesetzten Antigene von anderen dendritischen Zellen aufgenommen und erneut präsentiert werden28. Darüber hinaus fördern diese Chemokine wahrscheinlich die Etablierung einer Verbindung zwischen dendritischen Zellen und naiven Lymphozyten24,29. Weitere Zytokine (IL-1, IL-6, IL-12) fördern die Proliferation der aktivierten Lymphozyten6,7,8. 1.3.3 T-Helfer-Lymphozyten T-Helfer-Lymphozyten exprimieren verschiedene Oberflächenmarker und Zytokine, welche die Aktivität anderer Zellen des Immunsystems beeinflussen. THelfer-Zellen tragen in der Regel den Oberflächenmarker CD4. 1.3.3.1 Ursprung und Migration naiver T-Helfer-Zellen T-Helfer-Zellen entwickeln sich aus pluripotenten CD34+ Stammzellen des Knochenmarks, die zu T-, B- oder NK-Zellen differenzieren können. Dieser Prozeß umfaßt die Wanderung der Vorläuferzellen in die primären lymphatischen Organe, in denen sie weiter differenzieren: T-Lymphozyten entstehen im Thymus (T= Thymus), B-Lymphozyten im Knochenmark (B= bone marrow). Die Zellen verlassen die primären lymphatischen Organe als naive TLymphozyten (gekennzeichnet durch den CD45RA Oberflächenmarker)30, die noch keinen Antigenkontakt hatten. Naive T-Helfer-Zellen gelangen, gesteuert von Zytokinrezeptoren (CCR7, CXCR4), durch die Blutbahn in die sekundären lymphatischen Organe. Der Austritt der Zellen aus der Blutbahn in die Lymphknoten erfolgt in speziellen Venulen (HEV= high endothelial venules), die Liganden (PNAd oder MAdCAM1) für die Adhäsionsmoleküle naiver Lymphozyten (L-Selectin) tragen. Zum Eintritt in die Milz sind keine speziellen Adhäsionsvorgänge notwendig31,32. In den sekundären lymphatischen Organen suchen die Zellen Antigenpräsentierende Zellen nach passenden Antigenen ab. 1. Einleitung 13 1.3.3.2 Aktivierung und Differenzierung Naive T-Zellen haben eine hohe Aktivierungs-Schwelle. Um eine Reaktion gegen das präsentierte Antigen hervorzurufen, müssen die T-Zellen sowohl über den TZell-Rezeptor-CD3-ζ-Komplex (Signal 1) als auch über kostimulatorische Signale (Signal 2) aktiviert werden (siehe Tabelle 2). Eine Präsentation von Antigenen auf MHC Molekülen ohne Kostimulation ruft eine Anergie der T-Zellen diesem Antigen gegenüber hervor. Die Aktivierung der Zellen ist untrennbar mit der weiteren Differenzierung zu Th1- oder Th2-Effektor- oder Memory-Zellen verbunden. Die kostimulatorischen Signale werden über verschiedene Signalmoleküle und ihre Rezeptoren sowohl humoral als auch über direkten Kontakt weitergegeben. Die Aktivierung naiver T-Zellen findet an einer Kontaktstelle zwischen APZ und T-Zellen statt, die als „immunologische Synapse“ bezeichnet wird. Diese „immunologische Synapse“ ist ein äußerst komplexes Gebilde, das aus vielen kostimulatorischen Molekülen, Adhäsionsmolekülen und TZR-MHC-Komplexen besteht und sich im Verlauf der Interaktion verändert. 1.3.3.2.1 Die „immunologische Synapse“ Der Begriff „immunologische Synapse“ wurde geprägt, um auf die Ähnlichkeiten der Kontaktstellen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen mit neuronalen Synapsen hinzuweisen33,34. Untersuchungen zeigten schon vor längerer Zeit, daß sich T-Zellen nach der Erkennung von Antigenen auf Antigen-präsentierenden Zellen oder Zielzellen auf diese ausrichten. Das Mikrotubulusorganisationszentrum (MTOC) und der GolgiApparat positionieren sich zwischen dem Nucleus des Lymphozyten und der Zielzelle35. T-Zell-Rezeptor, CD3, CD4 und verschiedene Adhäsionsmoleküle mit ihren Liganden (LFA-1/CD54, CD28/B7) reichern sich an der Kontaktstelle zwischen CD4+ Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen an36. Die Verteilung von Molekülen an den Kontaktstellen wurde erstmals 1998 von Abraham Kupfer und Mitarbeitern beschrieben. Diese Arbeitsgruppe untersuchte die Verbindungen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden B-Zellen. Die Untersuchungen wurden an Zellen vorgenommen, die nach Aufbau einer 1. Einleitung 14 Verbindung fixiert und mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt wurden. An den Kontaktstellen verteilten sich die Oberflächen-Moleküle auf verschiedene Areale und formten so charakteristische Verbindungen zwischen den Zellen, sogenannte supramolecular activation clusters (SMAC)37,38. Diese Ergebnisse wurden durch Versuche gestützt, welche die Kinetik dieser Synapsen an lebenden T-Zellen studierten, die mit planen Membranen interagierten, in die Antigen-tragende MHC Moleküle und CD54 inkorporiert waren. Diese Moleküle waren mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert39. T-Zell-Rezeptor und MHC Moleküle, CD28 und sein Ligand CD80 sowie intrazytoplasmatische Signalmoleküle (z.B. Protein Kinase C-θ) befanden sich im Zentrum dieser Verbindung (cSMAC=central supramolecular activation clusters) 37,38,39. Durch die Aktivierung von CD28 wurden sogenannte rafts zur Kontaktstelle transportiert. Hierbei handelt es sich um Mikrodomänen, die sich in ihrer Lipidzusammensetzung von der Plasmamembran abheben und reich an Kinasen und Adapter-Molekülen sind. An diese sind mehrere Proteine assoziiert, die für die Signaltransduktion von Bedeutung sind40,41,42. Rafts sind an ihrer Oberfläche nur mit kleinen Molekülen besetzt und enthalten viel Cholesterin, was diesen Membranbezirken eine hohe Rigidität verleiht. Diese Eigenschaften fördern die Interaktionen im Bereich der cSMAC43. Um diese zentrale Position formte sich ein Ring aus LFA-1, CD54 und Talin (pSMAC=peripheral supramolecular activation clusters)37,38,39. Das Adhäsionsmolekül CD2 und sein Ligand CD58 lagen am äußeren Rande der cSMAC, jedoch innerhalb der pSMAC44,45. Das einzige Molekül, das sicher von den Kontaktstellen ausgeschlossen ist, ist CD43. Diesem Molekül werden regulatorische Funktionen bezüglich der Interaktion von T-Zellen mit anderen Zellen zugeschrieben46 (Abb. 1). Die Etablierung der Kontaktstellen dauerte mehrere Minuten und ließ sich in mindestens drei Phasen unterteilen: Zu Beginn der Interaktion (in den ersten 30 Sekunden) wurde ein innerer Bezirk von CD54 Molekülen gebunden, den MHC Moleküle in einem äußeren Ring umgaben. Diese Phase der Interaktion wurde als „Junktions-Formierung“ bezeichnet. Wenn der T-Zell-Rezeptor auf passende MHC-Antigen-Komplexe traf, wurden innerhalb von Minuten die MHC Moleküle in das Zentrum der Verbindung transportiert. Diese Phase wurde als „MHCTransport“ bezeichnet. Die stabile Ansammlung von MHC Molekülen im 1. Einleitung 15 Zentrum und CD54 Molekülen in der Peripherie führte dann zur dritten Phase, die als „Stabilisationsphase“ bezeichnet wurde und den oben beschriebenen SMAC ähnelte. Der gesamte Vorgang nahm 30 Minuten in Anspruch (Abb. 2). Der Transport der MHC Moleküle in das Zentrum der Kontaktstelle war von der Funktion des Zytoskeletts abhängig. Die Anzahl der MHC Moleküle in den cSMAC war von der Halbwertszeit der TZR-MHC Interaktion abhängig und blieb nach Etablierung der stabilen Verbindung konstant. Die MHC Moleküle, die sich im Zentrum der Verbindung befanden, wurden nicht ausgetauscht. Ob die TZell-Rezeptoren ebenfalls im Zentrum der Verbindung verbleiben, ist unklar39. Zumindest während der Antigenerkennung scheinen TZR-MHC-Komplexe sich beständig neu zu formieren und wieder zu dissoziieren47. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, daß TZR-MHC-Komplexe nur während der Etablierung der stabilen Verbindung einem schnellen Umsatz unterliegen39. Topologische Modelle postulieren eine Umverteilung der Oberflächenmoleküle entlang der „immunologischen Synapse“ entsprechend ihrer Länge: Die extrazellulären Anteile des TZR und der MHC Moleküle messen ca. 5nm, die der Integrine ca. 20nm. CD43 (~45nm) und CD45 (~28-50nm) sind in ihren extrazellulären Abmessungen deutlich größer48 (Abb. 3). Diese Unterschiede werden nicht durch Unebenheiten in der Zelloberfläche ausgeglichen, da die gegenüberliegenden Zellmembranen durch Adhäsionsmoleküle (CD2/CD58) parallel gehalten werden49,50. Kürzere Moleküle, deren Länge ungefähr der des MHC-T-Zell-RezeptorKomplexes (15-20nm) entspricht, würden sich demnach im Zentrum der Synapse befinden, wohingegen längere Moleküle wie Integrine und CD45 in der Peripherie zu finden wären. CD2 und sein Ligand CD58 überbrücken mit ihren extrazellulären Domänen eine Distanz von ~15nm, weshalb als Funktion von CD2/CD58 die Stabilisierung und Verbesserung der TZR-MHC-Interaktion durch Optimierung der Distanz zwischen den Zellmembranen vermutet wird45,51,52 (Abb. 4). Der Aufbau der „immunologischen Synapse“ wird vermutlich durch aktive Prozesse des Zytoskeletts gesteuert und beinhaltet zwei verschiedene Komponenten: Die Umverteilung von Oberflächenmolekülen und die polarisierte Sekretion von zytoplasmatischen Vesikeln. 1. Einleitung 16 Die Umverteilung von Oberflächenmolekülen, die der Aktivierung des TZR36,38,39 oder der Bindung kostimulatorischer Rezeptorenpaare (CD2/CD58, CD28/B7, LFA-1/CD54)44,53,54,55 folgt, kann durch Inhibitoren des Zytoskeletts verhindert werden39,53 (Abb. 5). T-Lymphozyten sind zur polarisierten Sekretion zytoplasmatischer Vesikel fähig56, um sowohl den Inhalt der Vesikel (u.a. Zytokine)36 als auch die Vesikel-Membranen (die bei naiven T-Zellen vermutlich rafts enthalten)57 gezielt an die Kontaktstelle zu bringen. Diese gezielte Ausschüttung von Zytokinen spielt in der Aktivierung der Zellen eine wichtige Rolle: Bei einer Bindung mehrerer B-Zellen an eine T-Helfer-Zelle proliferiert nur die B-Zelle, die an der Seite der T-Helfer-Zelle liegt, an der Zytokine sezerniert werden56. Dies deutet auf synergistische Effekte zwischen der „immunologischen Synapse“ und der lokalen Sekretion von Zytokinen hin. Die Richtung der Zytokinsekretion wird durch die Position des MTOC und des Golgi-Apparates bestimmt. Die Ausrichtung des MTOC und des Golgi-Apparates in Richtung einer benachbarten Zelle wird ebenfalls durch Aktivierung des TZR initiiert36,55 (Abb. 6). Wie der über das Zytoskelett vermittelte Aufbau der „immunologischen Synapse“ die beschriebene Selektivität erreicht, ist noch unklar. Es besteht die Möglichkeit, daß durch den engen Kontakt zwischen kleineren Molekülen (CD2/CD58) im Zentrum der Synapse und durch den äußeren Ring aus Integrinen größere Moleküle am Eintritt in den Bereich der Synapse gehindert werden43. Durch diesen Aufbau erreichen in der „immunologischen Synapse“ unspezifische Signale eine hohe Spezifität, da sie nur zwischen Zellen ausgetauscht werden, die über den passenden TZR-MHC-Komplex verfügen. Die genauen Aufgaben der „immunologischen Synapse“ sind noch unklar. Die Formierung der „immunologischen Synapse“ ist unter anderem von der Aktivierung des TZR abhängig, so daß die initiale Stimulation des TZR nicht Aufgabe der „immunologischen Synapse“ sein kann. Die „immunologische Synapse“ wird wahrscheinlich zur vollen Aktivierung und Differenzierung von TZellen benötigt. Diese Vermutung wird durch verschiedene Untersuchungen gestützt: Zum einen korreliert der Aufbau der „immunologischen Synapse“ mit voller Aktivierung von T-Zellen38,39, zum anderen wird die volle Aktivierung von T-Zellen durch Blockade des Zytoskeletts verhindert58. 1. Einleitung Abbildung 1: Verteilung der Oberflächenmoleküle im Kontaktbereich45 T-Zell-Rezeptor und MHC Moleküle, CD28 und sein Ligand CD80 sowie intrazytoplasmatische Signalmoleküle (z.B. Protein Kinase C-θ) befinden sich im Zentrum der Verbindung (cSMAC=central supramolecular activation clusters). Um diese zentrale Position formt sich ein Ring aus LFA-1, CD54 und Talin (pSMAC=peripheral supramolecular activation clusters). Das Adhäsionsmolekül CD2 und sein Ligand CD58 liegen am äußeren Rande der cSMAC, jedoch innerhalb der pSMAC. CD43 liegt außerhalb der Kontaktstellen. Abbildung 2: Die Formierung der immunologischen Synapse39 Zu Beginn der Interaktion wird ein innerer Bezirk von CD54 Molekülen gebunden, den MHC Moleküle in einem äußeren Ring umgeben. Diese Phase der Interaktion wird als „Junktions-Formierung“ bezeichnet (links). Wenn der T-ZellRezeptor auf passende MHC-Antigen-Komplexe trifft, werden die MHC Moleküle in das Zentrum der Verbindung transportiert. Diese Phase wird als „MHC-Transport“ bezeichnet (mitte). Die stabile Ansammlung von MHC Molekülen im Zentrum und CD54 Molekülen in der Peripherie führt zur „Stabilisationsphase“ (rechts). 17 1. Einleitung Abb. 3: Verschiedene Oberflächenmoleküle im Größenvergleich45 Die extrazellulären Anteile des TZR und der MHC Moleküle messen ca. 5nm, die der Integrine ca. 20nm. CD43 (~45nm) und CD45 (~28-50nm) sind in ihren extrazellulären Abmessungen deutlich größer. Abb. 4: Verteilung der Oberflächenmoleküle in der „immunologischen Synapse“ anhand ihrer Größe45 Kürzere Moleküle, deren Länge ungefähr der des MHC-T-Zell-RezeptorKomplexes (15-20nm) entspricht, befinden sich im Zentrum der Synapse, wohingegen längere Moleküle wie Integrine und CD45 in der Peripherie zu finden sind. CD2 und sein Ligand CD58 überbrücken mit ihren extrazellulären Domänen eine Distanz von ~15nm, weshalb als Funktion von CD2/CD58 die Stabilisierung und Verbesserung der TZR-MHC-Interaktion durch Optimierung der Distanz zwischen den Zellmembranen vermutet wird. Als Legende für die verschiedenen Moleküle vergleiche Abbildung 3. 18 1. Einleitung Abbildung 5: Umverteilung der Oberflächenmoleküle eines T-Lymphozyten nach Aktivierung45 Die Aktivierung des TZR und die Bindung kostimulatorischer Rezeptorenpaare (zum Beispiel CD2/CD58, CD28/B7) durch eine Antigen-präsentierende Zelle (APZ) lösen die Umverteilung der Oberflächenmoleküle der T-Zelle aus. Abbildung 6: Reorientierung des MTOC55 Die Richtung der Zytokinsekretion wird durch die Position des MTOC und des Golgi-Apparates bestimmt. Die Ausrichtung des MTOC und des Golgi-Apparates in Richtung einer benachbarten Zelle wird durch Aktivierung des TZR und die Bindung kostimulatorischer Rezeptoren initiiert. Ein Lymphozyt (A) ist an einen Fibroblasten (B) gebunden, der nach Transfektion MHC-Klasse II Moleküle und CD54 exprimiert (links). Die Zellen wurden fixiert und mit farbstoffgekoppelten Antikörpern angefärbt. An der Kontaktstelle sammelt sich Talin an (mitte). Das MTOC des Lymphozyten richtet sich auf den Fibroblasten aus (rechts). 19 1. Einleitung 20 1.3.3.2.2 Interaktion dendritischer Zellen und naiver T-Helfer-Zellen Die Interaktion zwischen einzelnen T-Zell-Rezeptor-CD3-ζ-Komplexen (TZR) und ihren Liganden nimmt nur wenige Sekunden in Anspruch, wohingegen die Aktivierung einer T-Zelle durch eine Antigen-präsentierende Zelle mehrere Stunden erfordert. Dieser lange Kontakt ist notwendig, um durch andauernde Stimulation die Gen-Transkription aufrecht zu erhalten und den Zell-Zyklus voranzutreiben58. Die andauernde Aktivierung der T-Zellen wird durch eine serielle Stimulation erreicht. T-Zell-Rezeptoren lösen sich nach Aktivierung durch Interaktion mit MHC Molekülen wieder von selbigen und werden internalisiert. Die MHC Moleküle stehen danach zur Bindung an weitere T-Zell-Rezeptoren bereit59. Die Problematik dieser seriellen Stimulation bezüglich der Stabilität der „immunologischen Synapse“ wurde im vorhergehenden Abschnitt angesprochen. Der Kontakt zwischen den einzelnen Peptid-MHC Komplexen und dem TZR muß über einen längeren Zeitraum gehalten werden, da die Erkennung von präsentierten Antigenen auf MHC Molekülen nicht sofort zur Aktivierung des TZR führt. Auf die Erkennung von Antigenen erfolgt eine Serie von Phosphorylierungen des TZR, die eine gewisse Zeit in Anspruch nehmen. Die Aktivierung der T-Zelle beruht auf der Fähigkeit des Liganden, den TZR für eine genügend lange Zeit zu immobilisieren47,60. Als ITAM bezeichnete Bereiche an Untereinheiten des TZR, namentlich CD3 und ζ (CD247), werden durch an CD4 gebundene Lck phosphoryliert. Dies führt zur Aktivierung von ZAP-70, das wiederum den T-Zell-Rezeptor-Komplex aktiviert und den raft-assoziierten Adapter LAT phosphoryliert. Dieser aktiviert dann eine nachgeordnete Signalkaskade, die letztendlich Proliferation und Differenzierung der T-Zelle auslöst. Eine negative Kontrolle dieser Vorgänge erfolgt unter anderem durch die Phosphatasen CD45 und SHP-14,47. Werden diese Prozesse erfolgreich beendet, werden die Signale zur Aktivierung der Zelle weitergegeben. Werden diese Prozesse vorzeitig abgebrochen, resultiert die Anergie der T-Zelle. Der eigentliche Prozeß der Stimulation, das heißt die am T-Zell-Rezeptor-CD3-ζKomplex stattfindenden Veränderungen, ist noch ungeklärt. 1. Einleitung 21 Bei naiven T-Zellen muß dieser Vorgang über kostimulatorische Moleküle verstärkt werden, da sie nur über wenig Lck und rafts an ihrer Oberfläche verfügen. Die Kostimulation ist eminent wichtig für die Aktivierung naiver T-Zellen. Die im Verlauf der Aktivierung auftretenden Veränderungen in Motilität, Morphologie und intrazellulären Calciumspiegeln wurden bei Interaktion mit planen Membranen oder B-Zellen als Antigen-präsentierenden Zellen nur in Anwesenheit von spezifischen Antigenen gesehen. Wenn dendritische Zellen als Antigenpräsentierende Zellen benutzt wurden, konnten diese Veränderungen auch in Abwesenheit von spezifischen Antigenen und MHC-Klasse II Molekülen induziert werden61,62. Die Kostimulation über Oberflächenmarker und ihre Liganden stellt keinen einheitlichen Mechanismus dar. Das bisher bekannte Konzept ging davon aus, daß die verschiedenen Rezeptoren verschiedene Signale weitergeben, die auf nachgeordneter Ebene (z.B. im Nucleus) integriert werden. Dies scheint zumindest für einige Rezeptoren oder einzelne Funktionen verschiedener Rezeptoren nicht zu stimmen. Die Kostimulation über CD28 und seine Liganden CD80/CD86 auf dendritischen Zellen vermittelt einen engen Kontakt von rafts zu T-Zell-Rezeptoren, die an MHC Moleküle gebunden sind. Diese initialisieren die Phosphorylierung von ITAM durch an die rafts gebundene Lck42,43. Zumindest diese Funktion der Kostimulation über CD28 ist also die Verstärkung der Signale des TZR und nicht die Erzeugung eines qualitativ differenten Signals. Die Aufgaben und Funktionen der vielen kostimulatorischen Moleküle in der Aktivierung naiver T-Helfer-Zellen sind bislang noch nicht vollständig verstanden. Auch gibt es bislang keine sichere Unterteilung in Adhäsionsmoleküle und kostimulatorische Signale. Die Kostimulation über die membranständigen Moleküle beeinflußt die Induktion der Synthese verschiedener Zytokine in T-Zellen und dendritischen Zellen. Aktivierte T-Zellen beginnen nach Stimulation über TZR und CD28 unter anderem die Synthese von IL-2, das als autokriner Wachstumsfaktor dient. Kontinuierliche Stimulation von T-Zellen führt zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie NFAT im Zellkern und zur Proliferation. Nach 1. Einleitung 22 ungefähr zwanzig Stunden kommt es zur ersten Zellteilung, der im Abstand von jeweils sechs Stunden weitere folgen4,63. Neben der Proliferation wird auch die Entwicklung der T-Helfer-Zellen in Th1oder Th2-Richtung durch den Kontakt mit Antigen-präsentierenden Zellen bestimmt. Die Aktivierung der Zellen über den TZR, kostimulatorische Moleküle und Zytokine führt zu einer Differenzierung der Zelle in Th1- oder Th2-Richtung, in Effektor- oder Memory-Zelle4,64,65. Die Regulation der Entwicklung in Th1- oder Th2-Richtung ist noch nicht vollständig verstanden. Aus diesem Grund wird hier nur ein Überblick über wichtige Einflüsse auf die Differenzierung der Zellen gegeben: Die Differenzierung der Zellen in Th1- oder Th2-Richtung wurde bislang als Ergebnis der Einwirkung verschiedener Zytokine auf die Zellen angesehen. Insbesondere die von Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen produzierten IL-4, IL-12, IFN-α und IFN-γ sind hier hervorzuheben. Von dendritischen Zellen produziertes IL-12 und IFN-γ induzieren die Entwicklung von Th1-Zellen. Von Lymphozyten produziertes IFN-γ verstärkt die Entwicklung in Th1 Richtung durch Verstärkung der IL-12 Synthese in dendritischen Zellen und Aufrechterhaltung der IL-12-Rezeptor Expression auf Lymphozyten6,7,8. Die Entwicklung einer Th2-Reaktion setzt die Anwesenheit von IL-4 voraus, das in Lymphozyten und unter gewissen Umständen wahrscheinlich auch in dendritischen Zellen66,67 synthetisiert wird. Intensität und Dauer des über den TZR vermittelten Stimulus beeinflussen ebenfalls die weitere Entwicklung naiver T-Zellen. Antigene, die mit hoher Affinität an den TZR binden, induzieren eine Entwicklung in Th1-Richtung, solche mit niedriger Bindungsaffinität eine Entwicklung in Th2-Richtung68,69,70,71. Die an diesem Vorgang beteiligten MHC Moleküle können die Bindungsaffinität ebenfalls beeinflussen72. Die Bindungsaffinität der Moleküle beeinflußt wahrscheinlich die Dissoziationsrate der TZR-MHC-Komplexe73. 1. Einleitung 23 Die Zahl der aktivierten TZR beeinflußt ebenfalls die Th1-/Th2-Entwicklung. Geringe Antigenmengen bewirken die Entwicklung von Th2-Zellen, hohe Dosen dagegen eine Entwicklung in Th1-Richtung74,75. Schließlich beeinflußt auch die Dauer der Interaktion zwischen T-Zelle und APZ die weitere Differenzierung, da die Entwicklung in Th2-Richtung eine längere Stimulation über den TZR erfordert76. Kostimulatorische Moleküle modulieren ebenfalls die Th1/Th2 Antwort. Sie treten im Verlauf der Interaktion in Abhängigkeit von verschiedenen Stimuli zu verschiedenen Zeitpunkten auf. Tabelle 2 gibt einen Überblick über einige wichtige kostimulatorische Moleküle und ihre Funktion. Tabelle 2: Kostimulatorische Moleküle und ihre Funktion Naive T-Zellen haben eine hohe Aktivierungs-Schwelle. Eine Reaktion gegen präsentierte Antigene erfordert die Aktivierung verschiedener Arten von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen. Signal 1 wird über den T-Zell-RezeptorCD3-ζ-Komplex, Signal 2 über kostimulatorische Moleküle vermittelt; Signal 2 beeinflußt unter anderem auch die Differenzierung in Th1- oder Th2-Richtung. Rezeptor T-Zelle CD28 Ligand dendritische Zelle Funktion B7-1 (CD80) und B7-2 induziert IL-2, IL-4, IL- (CD86) 10, IL-1377,78, verhindert Anergie und Apoptose79, Adhäsion ⇑, induziert ICOS, Organisation des Zytoskeletts55, Transport von rafts zu TZR53,54 ICOS B7RP-180 nur auf aktivierten T Zellen, induziert IFN-γ, IL-4, IL-5 & IL-10, induziert CD40L80,81,82 CTLA-4 B7-1 (CD80) und B7-2 gegenreguliert (CD86) Stimulation über CD28, erschwert Aktivierung 1. Einleitung 24 von T-Zellen, fördert Th1 Antwort83,84 LFA-1 (CD11a/CD18) CD54 (ICAM-1), CD102 induziert IL-2, fördert (ICAM-2), Th1 Antwort85, Adhäsion CD50 (ICAM-3) ⇑, Organisation des Zytoskeletts55 CD2 CD58 (LFA-3) Induziert IL-10, IFN-γ, TGF-β86, Adhäsion ⇑, Organisation des Zytoskeletts49,50,51 CD27 CD70 (CD27L) auf aktivierten T-Zellen, Funktion bei Interaktionen zwischen T-Zellen und zwischen T-Zellen und B-Zellen87 OX 40 (CD134) OX 40L auf aktivierten T-Zellen, verstärkt IL-2 und Th2 Zytokine, fördert Th2 Antwort88,89,90 4-1BB (CDw137) 4-1BBL (CDw137L) auf aktivierten CD4+ und CD8+, induziert je nach Kontext Th1 oder Th287 RANKL (TRANCE) RANK (TRANCE-R) Induziert IL-1, IL-6 & IL-12 in DCs, erhöht Vitalität dendritischer Zellen91,92 CD40L (CD154) CD40 Induziert Expression kostimulatorischer Moleküle auf DCs (CD54, B7), induziert IL-12 in DCs, fördert Th1 Antwort, erhöht Vitalität dendritischer Zellen7,8 1. Einleitung 25 Die aktivierten T-Zellen differenzieren im Verlauf der beschriebenen Aktivierung und Differenzierung zu Th1- oder Th2-Zellen. Dieser Vorgang erfordert mehrere Zellteilungen und die Veränderung der Chromatinstruktur der aktivierten Zellen in mehreren Genloci. Diese Differenzierung schließt die stabile Synthese verschiedener Zytokine (IFN-γ vs. IL-4) 93,94,95,96 und die Expression verschiedener Oberflächenmarker ein31,32,97. Die oben beschriebenen Th-Reaktionen erfolgen nach Stimulation durch dendritische Zellen, die eine sehr heterogene Zellreihe darstellen. Darüberhinaus werden die stimulatorischen Fähigkeiten dendritischer Zellen durch verschiedene Stimuli und den Grad der Ausreifung modifiziert: CD40L und LPS induzieren die Produktion von IL-12 und somit eine Th1-Reaktion. TNF-α und IL-1 führen nicht zu einer Produktion von IL-12; PGE2 unterdrückt diese sogar. Somit wird eine Th2-Reaktion gefördert6,7,8,98. Daraus ergibt sich die Frage, ob verschiedene Subpopulationen dendritischer Zellen verschiedene Immunreaktionen hervorrufen oder ob die Immunreaktion vom Aktivierungs- und Ausreifungsgrad der dendritischen Zellen abhängig ist21,22,23. 1.3.3.3 Migration aktivierter Lymphozyten Die Th1- und Th2-Effektor-Zellen übernehmen verschiedene Funktionen und migrieren zu Entzündungsherden (Zytokinrezeptoren CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 auf Th1-Zellen, CCR2,CCR3,CCR4 auf Th2-Zellen) oder interagieren mit B-Lymphozyten (CCR4) in lymphatischen Geweben31,32,97. Zu diesem Zweck verändert sich auch das Spektrum der exprimierten Adhäsionsmoleküle. Die meisten Effektor-Zellen sterben nach kurzer Zeit ab; einige Antigen-erfahrene Zellen verbleiben jedoch als Memory-Zellen in lymphatischen (CCR7+) und peripheren Geweben (CCR7-)99 und führen zu raschen Immunantworten, falls ein bekanntes Antigen wieder auftritt. 1. Einleitung 26 1.4 Bedeutung der „immunologischen Synapse“ Sowohl beim Nervensystem als auch beim Immunsystem gilt bezüglich der Kontaktstellen die alte Erkenntnis: „Das also war des Pudels Kern“100. Auch beim Immunsystem kann man zusammenfassend sagen, daß die Kontaktstellen zwischen Antigen-präsentierenden Zellen und Lymphozyten den Ort des immunologischen Lernens darstellen. Bezogen auf die erste Definition des Begriffes Synapse von Sharrington, der von einem Kontakt ohne Kontinuität sprach, ist die Bezeichnung „immunologische Synapse“ sicherlich haltbar. Der von Sharrington weiterhin geforderte Informationsfluß in nur eine Richtung ist bei der „immunologischen Synapse“ in Bezug auf die hauptsächliche Information sicherlich ebenfalls richtig. Zwar werden dendritische Zellen wesentlich durch die mit ihnen interagierenden Lymphozyten beeinflußt; aber auch Nervenzellen sind wesentlich von ihren Zielzellen abhängig, um ihre Funktion ausfüllen zu können. 1.5 Fragestellungen Lymphozyten werden durch Kontakt mit Antigen-präsentierenden Zellen aktiviert. Bisher wurden in der Literatur nur Untersuchungen der Kontaktstellen zwischen B- und T-Zellen, respektive zwischen T-Zellen und Lipidmembranen, in die verschiedene Adhäsionsmoleküle und kostimulatorische Moleküle inkorporiert worden waren, beschrieben. Die Aktivierung naiver Lymphozyten erfordert jedoch die Interaktion mit dendritischen Zellen. Das Ergebnis der Aktivierung von Lymphozyten durch dendritische Zellen ist gleichzeitig die Polarisierung in Th1- oder Th2-Richtung. Wenn unterschiedliche Subpopulationen oder Ausreifungsstadien dendritischer Zellen verschiedene Th Antworten induzieren, dann sollten sich in vitro durch gezielten Einsatz verschiedener Stimuli oder verschiedener Subpopulationen dendritischer Zellen verschiedene Th Antworten induzieren lassen. Diese Induktion unterschiedlicher Reaktionen sollte sich am Aufbau der „immunologischen Synapse“ widerspiegeln. Interaktionen zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten innerhalb der Cluster wurden bislang noch nicht dargestellt. 1. Einleitung 27 Es ist mittlerweile möglich, dendritische Zellen in großem Umfang in vitro zu erzeugen, mit einem Durchflußzytometer genau zu typisieren, und die Subpopulationen mit Hilfe der magnetischen Zellisolierung voneinander zu trennen. Ebenso ist die Gewinnung einer großen Zahl von Lymphozyten und die Separation verschiedener Subpopulationen von Lymphozyten möglich. Angesichts dieser Möglichkeiten stellt sich die Frage, wie man die Interaktionen zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten genauer untersuchen kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Grundlagen zur genaueren Untersuchung der Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten. Die gemeinsame Kultivierung der Zellen sollte eine möglichst große Zahl von Clustern hervorbringen und ihre unbeschadete Isolierung erlauben. Die Zellen sollten dabei in Kultur zu beobachten sein, um die Entwicklung der Cluster über den Kulturzeitraum zu dokumentieren. Um den Aufbau der „immunologischen Synapse“ zu untersuchen, sollten Fixierung und Permeabilisierung der Präparate die Morphologie der Zellen nur gering beeinträchtigen. Außerdem müssen zahlreiche extra- und intrazelluläre Moleküle, insbesondere die Zytokine IFN-γ und IL-4, anfärbbar bleiben. Die Zellen sollten weiterhin so markiert werden, daß die verschiedenen Zelltypen innerhalb der Cluster sicher voneinander differenziert werden können. Die Isolierung verschiedener Zelltypen oder Subpopulationen verschiedener Zelltypen sollte eine möglichst selektive Kultur der angestrebten Zellen ermöglichen. Zusammenfassend läßt sich fragen, wie man Zellverbände aus dendritischen Zellen und Lymphozyten am besten isolieren und zur weiteren Analyse vorbereiten kann. Zur Lösung dieser Fragestellung wird folgende Strategie angewandt: 1) Die zur Darstellung von Zytokinen und Oberflächenmarkern gebräuchlichen Methoden zur Fixierung und Permeabilisierung sind auf Lymphozyten abgestimmt. Deshalb werden verschiedene Methoden zur Fixierung und 1. Einleitung Permeabilisierung 28 im Durchflußzytometer in ihren Auswirkungen auf dendritische Zellen beurteilt. 2) Die Anfärbung von Zytokinen und Oberflächenmarkern in Abhängigkeit von Fixierung und Permeabilisierung wird an leicht gewinnbaren Lymphozyten unter dem Fluoreszenzmikroskop überprüft. 3) Zur Fragestellung der Kultur und Isolierung der Cluster werden verschiedene Methoden überprüft. 4) Es werden verschiedene Farbstoffe zur Anfärbung der Zellen in Kultur und ihre Auswirkungen auf die Funktion der Zellen im Durchflußzytometer bewertet. Auch die Auswirkungen der Fixierung und Permeabilisierung auf die Zellfarbstoffe wird untersucht. 5) An den isolierten Clustern wird mit der gewählten Fixierung und Permeabilisierung erneut Fluoreszenzmikroskop die Anfärbung überprüft. Dieser von Zytokinen Schritt wird unter dem mit dem Durchflußzytometer kontrolliert. 6) Die Muster der Zytokinsekretion innerhalb der Cluster werden mit einem Fluoreszenzmikroskop dargestellt. 7) Die isolierten Cluster werden elektronenmikroskopisch dargestellt. 8) Subpopulationen dendritischer Zellen werden isoliert und charakterisiert. 2. Material und Methoden 29 2. Material und Methoden 2.1 Material -Aceton, >99,5%: Best. Nr. A-42006, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Adobe Photoshop 5.5 Software: Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA -Amphotericin B (250µg/ml): Best. Nr. K0293, Biochrom, Berlin -Anonpore-Membranen, 0,02µm, 10mm Zellkultur-Einsätze: Best. Nr. 162243, Nunc, Roskilde, DK -Antikörper: anti-CD1a PE: Maus Anti-CD1a: Klon: HI149 IgG1, Best. Nr. 34225X, Pharmingen, Hamburg anti-CD3 FITC: Maus anti-CD3: Klon SK7 IgG1, Best. Nr. 349201, Becton Dickinson, Heidelberg anti-CD3 tricolor: Maus anti-CD3: Klon S4.1 IgG2a, Best. Nr. MHCD 0306, MEDAC, Hamburg anti-CD4 FITC: Maus anti-CD4: Klon SK3 IgG1, Best. Nr. 340133, Becton Dickinson, Heidelberg anti-CD14 tricolor: Maus anti-CD14: Klon TUK4 IgG2a, Best. Nr. MHCD 1406, MEDAC, Hamburg anti-HLA-DR FITC: Maus anti-HLA-DR: Klon L243 IgG2a, Best. Nr. 347363, Becton Dickinson, Heidelberg anti-CLA FITC: Ratte anti-CLA: Klon HECA-452 IgM, Best. Nr. 35824X, Pharmingen, Hamburg anti-IFN-γ FITC: Maus anti-IFN-γ: Klon 4S.B3 IgG1, Best. Nr. 18904A, Pharmingen, Hamburg anti-IFN-γ PE: Maus anti-IFN-γ: Klon 4S.B3 IgG1Best. Nr. 554552, Pharmingen, Hamburg anti IL-4 PE: Maus anti-IL-4: Klon 8D4-8 IgG1, Best. Nr. 554516, Pharmingen, Hamburg anti-IFN-γ: Maus anti-IFN-γ: Klon 4S.B3 IgG1, Best. Nr. 18901A, Pharmingen, Hamburg 2. Material und Methoden 30 Maus anti-IFN-γ: Klon 45-15 IgG1, Geschenk von Dr. Christoph Heusser anti-IL-4: Maus anti-IL-4: Klon 8D4-8 IgG1, Best. Nr. 18651A, Pharmingen, Hamburg Ratte anti-IL-4: Klon MP4-25D2 IgG1, Best. Nr. 18501A, Pharmingen, Hamburg Ziege anti-IL-4: polyklonal IgG, Best. Nr. BAF204, R&D Systems, Wiesbaden Maus anti IL-4: Klon 4D9 IgG1, Geschenk von Dr. Christoph Heusser anti-IL-6: Maus anti-IL-6: Klon MQ2-13A5 IgG1, Best. Nr. 18871A, Pharmingen, Hamburg IgG1 FITC Maus: Klon MOPC-21 IgG1, Best. Nr. 20604A, Pharmingen, Hamburg IgG1 PE Maus: Klon MOPC-21 IgG1, Best. Nr. 20605A, Pharmingen, Hamburg Ziege anti-Maus IgG Alexa 488: Best. Nr. A-11029, Molecular Probes, Leiden NL Ziege anti-Maus IgG Alexa 568: Best. Nr. A-11031, Molecular Probes, Leiden NL Ziege anti-Maus IgG Alexa 594: Best. Nr. A-11032, Molecular Probes, Leiden NL Ziege anti-Ratte IgG Alexa 594: Best. Nr. A-11007, Molecular Probes, Leiden NL Neutravidin Alexa 488: Best. Nr. A-11232, Molecular Probes, Leiden NL Streptavidin Alexa 594: Best. Nr. A-11227, Molecular Probes, Leiden NL -Auflichtmikroskop: CK2, Olympus Optical Co., Hamburg -autoMACS: Best. Nr. 201-01, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach -autoMACS-Säulen: Best.Nr. 130-021-101, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach -Avidin-Biotin Blocking-Reagenz: Best. Nr. SP-2001, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA -BEEM-Kapselhalter: Best. Nr. G 364, Plano, Wetzlar 2. Material und Methoden 31 -BEEM-Kapseln, pyramidenförmig: Best. Nr. G 360-2, Plano, Wetzlar -Brefeldin A (BFA): Best. Nr. B-7651, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Brutschrank (CO2 Inkubator): Heraeus, Düsseldorf -Citrat-Phosphat-Dextran Solution (CPD): Best. Nr. C-7165, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Cryo-Röhrchen, 1,8ml: Best. Nr. 340711, Nunc, Roskilde, Dänemark -CFSE (5-6-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidylester): Best. Nr. C-1157, Molecular Probes, Leiden NL -Deckgläschen -Deckgläschen, rund: Best. Nr. OKR1, Öhmen Labortechnik, Essen -DiL (DiLC18, 1,1´Dioctadecyl-3,3,3´,3´-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat): Best. Nr. D-282, Molecular Probes, Leiden NL -DiO (DiOC18, 3,3´Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat): Best. Nr. D-275, Molecular Probes, Leiden NL -DMSO (Dimethyl Sulfoxid), >99,5%: Best. Nr. D-5879, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -DMSO, 100%AD: Best. Nr. D-8386, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Durchflußzytometer FACScan: Becton Dickinson, Heidelberg -Eindeckmedium VECTASHIELD: Best. Nr. H-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA -Epon 812: Best. Nr. 45345, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Eponbeschleuniger DMP 30 [2,4,6-Tris-(Dimethylaminomethyl)-Phenol]: Best. Nr. 45348, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Eponhärter DDSA (Dodecenyl-Bernsteinsäureanhydrid): Best. Nr. 45346, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Eponhärter MNA (Methyl-Norbonen-2,3-Dicarbonsäure-Anhydrid): Best. Nr. 45347 Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Essigsäure, 100%: Best. Nr. A-6283, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Ethanol, reinst: Best. Nr. 32205, Ridel-de Haen, Seelze -FCS (fetales Kälberserum): Best. Nr. S0115, Chargen-Nr. 417L, Biochrom, Berlin -Feinwaage: Sartorius, Göttingen -Ficoll-Trennlösung, Dichte 1,077g/ml, isoton: Best. Nr. L6115, Biochrom, Berlin -Fluoreszenzmikroskop: BH-2, Olympus Optical Co., Hamburg 2. Material und Methoden 32 -Formaldehyd: Best. Nr. HAT 50-1-28, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Fuchs-Rosenthal-Zählkammer -Glutaraldehyd: Best. Nr. 49630, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -GM-CSF (granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor): Leucomax 150, Best. Nr. 25756.01.00, Novartis, Nürnberg -Grids, Kupfer: Best. Nr. G 2200 C, Plano, Wetzlar -Grids, Nickel: Best. Nr. G 2200 N, Plano, Wetzlar -HBSS (Hank‘s balanced salt solution), steril: Best. Nr. L2045, Biochrom, Berlin -Heparin: Vetren 200, Byk Gulden, Konstanz -HEPES-Puffer (Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure), 1M: Best. Nr. L1613, Biochrom, Berlin -HPLC-Wasser: Best. Nr. 4218, J.T.Baker, Deventer, NL -Ionomycin: Best. Nr. I-0634, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -konfokales Laser-Raster-Mikroskop: Leica CLSM, Leica Microsystems, Bensheim -konische Röhrchen, 50ml: Typ Blue Max, Best. Nr. 2070 Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg -konische Röhrchen, 15ml: Typ Blue Max Jr., Best. Nr. 2096 Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg -Lab Tek II Chamber Slide System, Glas: Best. Nr. 154534, Nunc, Roskilde, Dänemark -Lab Tek II Chamber Slide System, Permanox: Best. Nr. 177445, Nunc, Roskilde, Dänemark -L-Glutamin, 200mM: Best. Nr. K0282, Biochrom, Berlin -Lysis II Softwarepaket: Becton Dickinson, Heidelberg -MicroBeads: anti-CD1a: Best. Nr. 130-051-001, Miltenyi Biotech, BergischGladbach anti-CD34: CD34-Zell-Isolations-Kit, Best. Nr. 130-046-701, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach anti-CD45 RA: Best. Nr. 130-045-901, Miltenyi Biotech, BergischGladbach anti-FITC: Best. Nr. 130-048-701, Miltenyi Biotech, BergischGladbach 2. Material und Methoden 33 -MiniMACS: Best.Nr. 130-042-102, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach -Mini-MACS Säulen: LS-Säulen (zur Isolation von CD45RA+ Zellen): Best. Nr. 130-042-401, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach MS-Säulen (zur Isolation von CD34+ Zellen): Best. Nr. 130-042-201, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach -Natriumazid: Best. Nr. 6688, Merck, Darmstadt -Natrium-Borhydrat: Nr. S-9125, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Natriumhydroxid: Best. Nr. 6203, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Neubauer-Zählkammer -nicht essentielle Aminosäuren: Best. Nr. KO293, Biochrom, Berlin -Nonidet P-40 (NP-40) [PEG(9)p-t-octylphenol]: Best. Nr. N-6507, SigmaAldrich, Deisenhofen -Objektträger -Paraformaldehyd (PFA): Best. Nr. 2213, Riedel-de Haen, Seelze -Penicillin/Streptomycin (10.000IU/ml/10.000µg/ml): Best. Nr. A2213, Biochrom, Berlin -petriPerm 50 Kulturschale, hydrophob: Best. Nr. 76077304, In Vitro, Osterode -Pikrinsäure, gesättigte Lösung: Best. Nr. 925-40, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -PHA (Phytohaemagglutinin): Best. Nr. M5030, Biochrom, Berlin -PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat): Best. Nr. P-8139, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Poly-L-Lysin: Best. Nr. P-5899, Sigma-Aldrich, Deisenhofen -Polypropylene Reagenzglas (Rundboden, FACS-Röhrchen): Falcon/BD2053, Heidelberg -Polystyrene Reagenzglas (Rundboden, FACS-Röhrchen): Falcon/BD2050, Heidelberg -Raster-Elektronen-Mikroskop: DSM 950, Zeiss, Oberkochem -Reaktionsgefäße, 1,5ml: Best. Nr. 3810, Eppendorf, Hamburg -RPMI 1640: Best. Nr. F1215, Biochrom, Berlin -Rundboden-Röhrchen, 13ml: Best. Nr. 62.515.006, Sarstedt, Numbrecht -Saponin: Best. Nr. 16109, Riedel-de Haen, Seelze 2. Material und Methoden 34 -Scanner: Umax Power Look 3000, Diavision, Dortmund -Scanware 3.15 Softwarepaket: Leica Microsystems, Bensheim -SCF (stem cell factor): Best. Nr. 300-07, Pepro Tech Inc., Rocky Hill, USA -Serologische Pipette 10ml, steril: Falcon/BD7530, Heidelberg -Sterilfilter FP030/2, Porengröße 0,45µm: Best. Nr. 311643, Schleicher & Schuell, Dassel -TNF-α (tumor necrosis factor-α): R&D Systems, Best. Nr. 210-TA-010, Wiesbaden -Tuerk‘sche Lösung: Best. Nr. 93770, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Transmissions-Elektronen-Mikroskop: EM 900, Zeiss, Oberkochem -Triton X-100 [PEG(9-10)p-t-octylphenol]: Best. Nr. 37240, Serva, Heidelberg -Ultraschall-Mixer -Ultrostain 1: Best. Nr. 705529, Leica Microsystems, Bensheim -Ultrostain 2: Best. Nr. 705530, Leica Microsystems, Bensheim -Uranylacetat: Best. Nr. 94260, Fluka Chemie, Buchs, Schweiz -Waage: Best. Nr. U-5000D, Sartorius Göttingen -Zellkulturplatte, 24 Vertiefungen, Flachboden: Best. Nr. 3047, Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg -Zellkulturplatte, 96 Vertiefungen, Flachboden: Best. Nr. 3072, Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg -Zellschaber: Best. Nr. 3085, Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg -Zelltrichter: Best. Nr. 5991040, Shandon, Pittsburgh, USA -Zentrifuge: Omnifuge 2.0RS, Heraeus, Düsseldorf Centrifuge 5415C, Eppendorf, Hamburg Microcentrifuge 7200J, Denver Instruments Company, Denver, USA -Zytozentrifuge: Cytospin2 , Shandon, Pittsburgh, USA 2. Material und Methoden 35 2.2 Methoden 2.2.1 Blutspender Die nachfolgenden Untersuchungen wurden an Zellen durchgeführt, die aus zwei verschiedenen Kollektiven gewonnen wurden: Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) wurden aus dem Blut gesunder, menschlicher Freiwilliger isoliert. Die CD34+ Stammzellen und CD45RA+ Lymphozyten wurden aus dem Nabelschnurblut gesunder Neugeborener sortiert, die in der Augusta-KrankenAnstalt oder im St. Elisabeth-Hospital in Bochum geboren worden waren. 2.2.2 Isolierung und Kultivierung der Zellen 2.2.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut Heparinisiertes Blut wurde im Verhältnis 1:2 mit Hank‘s balancierter Salzlösung (HBSS) vermischt, in 50ml Röhrchen über Ficoll (spezifische Dichte 1,077g/ml) geschichtet und 20 Minuten lang bei 660g zentrifugiert. Die dabei entstandene Interphase, die mononukleäre Zellen enthielt, wurde vorsichtig abgesaugt und zweimal mit HBSS für 10 Minuten bei 300g und einmal für 15 Minuten bei 200g gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in RPMI 1640, supplementiert mit 4% Zusatzlösungen, bestehend aus 200mM L-Glutamin, 100mM NatriumPyruvat, nicht essentiellen Aminosäuren (100x), 10.000IU/ml Penicillin und 10.000µg/ml Streptomycin gemischt im Verhältnis 1:1:1:0,5:0,5 und 10% FCS aufgenommen und nach Anfärbung mit Türk‘scher-Lösung in einer NeubauerZählkammer gezählt. Die so isolierten Zellen wurden in dem beschriebenen Kulturmedium auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml eingestellt. 2. Material und Methoden 36 2.2.2.2 Isolierung von Zellen aus Nabelschnurblut Die dendritischen Zellen wurden aus CD34+ Stammzellen angezüchtet, die mittels einer miniMACS-Säule nach dem Protokoll des Herstellers (Miltenyi) aus dem Nabelschnurblut gesunder Neugeborener sortiert wurden. Verschiedene Subpopulationen dendritischer Zellen wurden mit dem autoMACS der Firma Miltenyi nach entsprechenden Protokollen separiert. Die eingesetzten CD45RA+ Lymphozyten wurden ebenfalls mittels einer MACSSäule nach dem Protokoll von Miltenyi aus dem Nabelschnurblut gesunder Neugeborener sortiert. Die MACS Technologie (magnetic cell separation) ist eine Methode zur magnetischen Isolierung verschiedener Zelltypen. Nach magnetischer Markierung von Oberflächenantigenen mit paramagnetischen MicroBeads werden die Zellen durch eine Säule geschickt, die in einem Magneten aufgehängt ist. Die magnetisch markierten Zellen werden in der Säule zurückgehalten, während die anderen Zellen hindurchlaufen. Wenn die Säule aus dem Magneten entfernt wird, können die markierten Zellen eluiert werden. Dies ermöglicht sowohl eine positive als auch eine negative Selektion. Bei der positiven Selektion werden die Zielzellen markiert und in der Säule zurückgehalten. Bei der negativen Selektion werden die unerwünschten Zellen markiert und von den anderen getrennt. Die magnetische Markierung von Oberflächenantigenen kann auf zwei verschiedene Arten erreicht werden: Direkte magnetische Markierung: Die MicroBeads sind an Antikörper gekoppelt, die gegen Oberflächenmarker gerichtet sind. Indirekte magnetische Markierung: Zuerst werden die Zellen mit Antikörpern inkubiert, die gegen Oberflächenmarker gerichtet sind. Diese Antikörper sind mit FITC, PE, Biotin oder Haptenen konjugiert. Danach werden die Zellen mit MicroBeads inkubiert, die an Anti-FITC Antikörper, Anti-PE Antikörper, Streptavidin oder anti-Hapten Antikörper gekoppelt sind. Das autoMacs ermöglicht durch eine Automatisierung der Separationsvorgänge den Umgang mit sehr großen Zellzahlen. Es lassen sich auch Populationen sehr 2. Material und Methoden 37 großer und adhärenter Zellen separieren, die mit herkömmlichen MACS-Säulen nicht aufgetrennt werden können. Von den möglichen Strategien zur Separation der Zellen seien hier zwei erwähnt: Positive Selektion (POSSEL): Ermöglicht eine Anreicherung der Zielzellen mit hoher Reinheit auf Kosten der Ausbeute. Positive Selektion im sensitiven Modus (POSSEL_S): Ermöglicht eine Anreicherung von Zellen, deren magnetische Markierung aufgrund geringer Antigenexpression schwächer ist. Die Reinheit ist geringer als im POSSELModus, die Ausbeute dafür höher. 2.2.2.3 Isolierung von CD34+ Stammzellen Das Nabelschnurblut (20-50ml) wurde nach Abnabelung des Neugeborenen unter sterilen Bedingungen aus der Vena umbilicalis der Plazenta abgenommen und in 50ml Röhrchen gegeben. Diese enthielten bereits 7ml einer Pufferlösung, die aus Citrat-Phosphat-Dextran Solution (CPD), supplementiert mit 2% HEPES-Puffer, 2% Amphotericin B (250µg/ml), 1% Penicillin (10.000IU/ml)/Streptomycin (10.000µg/ml) bestand. Das Nabelschnurblut wurde mit HBSS im Verhältnis 1:2 verdünnt, in 50ml Röhrchen mit 15ml Ficoll unterschichtet und 20 Minuten bei 660g zentrifugiert. Die entstandene Interphase, die mononukleäre Zellen und Stammzellen enthielt, wurde abgesaugt und einmal mit Puffer (HBSS, 5mmol EDTA, 0,5% BSA) für 10 Minuten bei 300g und zweimal für 15 Minuten bei 200g gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in Puffer aufgenommen und nach Anfärbung mit Türk‘scher Lösung in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer gezählt. Die Zellen wurden dann in 250µl Puffer für bis zu 108 Zellen aufgenommen und anschließend mit 100µl humanem IgG und Hapten-konjugierten anti-CD34 Antikörpern für bis zu 108 Zellen für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Für größere Zellzahlen wurden die Mengen entsprechend angepaßt. Nach der Inkubation wurden die Zellen in Puffer für 10 Minuten mit 300g gewaschen und der Überstand vollständig entfernt. Zur Inkubation mit MicroBeads, die an die Hapten-konjugierten anti-CD34 Antikörper binden, wurden die Zellen auf eine Konzentration von 108 Zellen pro 350µl eingestellt und entsprechend mit 100µl MicroBeads pro 108 Zellen für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden 2. Material und Methoden 38 dann erneut mit Puffer für 10 Minuten bei 300g gewaschen und auf eine Konzentration von 108 Zellen pro 500µl eingestellt. Die Zellsuspension wurde auf eine mit Puffer gespülte MS MACS-Säule gegeben, die nach Durchlauf der Zellsuspension viermal mit je 500µl Puffer durchgespült wurde. Die Säule wurde dann aus dem Separator entfernt und die retinierten CD34+ Zellen wurden mit 500µl Puffer aus der Säule gedrückt. Dieser Vorgang wurde noch einmal mit dem Durchlauf wiederholt. Die Zellen wurden danach in ein 15ml Röhrchen überführt und in einer Konzentration von 1,5x105 Zellen/ml in dem schon beschriebenen Kulturmedium aufgenommen. 2.2.2.4 Anzüchtung dendritischer Zellen aus CD34+ Stammzellen Dendritische Zellen wurden in Anlehnung an ein von Caux und Mitarbeitern beschriebenes Protokoll aus CD34+ Stammzellen angezüchtet12. Die CD34+ Stammzellen Ausgangskonzentration wurden von für 1,5x105 insgesamt Zellen/ml 14 Tage in Kulturmedium einer in Flachbodenplatten gezüchtet. Zu Beginn wurden die Zellen mit 2,5ng/ml TNF-α, 100ng/ml GM-CSF und 100ng/ml SCF stimuliert. Am achten Tag wurde mit 2,5ng/ml TNF-α und 100ng/ml GM-CSF nachstimuliert. Bei Bedarf wurden die Zellkulturen geteilt und mit frischem Medium versorgt. Nach 14 Tagen wurden die Zellen geerntet. Nach Zählung in einer NeubauerZählkammer und Messung des Anteils CD1a+ dendritischer Zellen mit einem FACScan Durchflußzytometer (siehe 2.2.7.1) wurden die Zellen sofort verwendet oder eingefroren. Zur sofortigen Verwendung wurden die Zellen mit Kulturmedium auf eine Konzentration von 105 CD1a+ dendritischen Zellen/ml eingestellt. Zum Einfrieren wurden die Zellen in einer Konzentration von 2x107 Zellen/ml in Einfriermedium (RPMI 1640, supplementiert mit 0,5% Penicillin 100IU/ml, 0,5% Streptomycin 100µg/ml, 10% DMSO und 45% FCS) aufgenommen und jeweils 1ml in ein Cryo-Röhrchen pipettiert. Anschließend wurden die Cryo-Röhrchen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Bei Bedarf wurden die Zellen mit 35°C warmem HBSS aus den Cryo-Röhrchen entnommen und zweimal mit HBSS gewaschen. Dann wurden sie mit Kulturmedium auf die benötigte Konzentration eingestellt. 2. Material und Methoden 39 Die Entwicklung der einzelnen Subpopulationen in der Kultur wurde mit Hilfe eines FACScan Durchflußzytometers verfolgt (siehe 2.2.7.2). 2.2.2.5 Separation der Subpopulationen dendritischer Zellen Nach dem Ernten wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 300g in HBSS gewaschen und anschließend in 20ml HBSS aufgenommen. Die Zellzahl wurde in einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und die Zellen erneut 10 Minuten lang bei 300g zentrifugiert. 2.2.2.5.1 Isolierung CD1a+ dendritischer Zellen Die Zellen wurden an Tag 5 der Kultur geerntet und wie oben beschrieben zur Isolation vorbereitet. Das Pellet wurde in 60µl HBSS für 107 Zellen aufgenommen und 15 Minuten lang bei 4°C mit 20µl anti-CD1a MicroBeads und 20µl Blocking-Reagenz pro 107 Zellen inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit 10ml HBSS für 10 Minuten bei 300g gewaschen und je nach Zellzahl in drei (107 Zellen) bis fünf (5x107) ml HBSS aufgenommen. Die Zellen wurden dann im autoMACS im Modus POSSEL_S sortiert, anschließend 10 Minuten lang bei 300g in HBSS gewaschen und mit HBSS auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml eingestellt. 2.2.2.5.2 Isolierung CLA+ dendritischer Zellen Die Zellen wurden an Tag 10 der Kultur geerntet und wie oben beschrieben zur Isolation vorbereitet. Das Pellet wurde in HBSS 15 Minuten lang bei 4°C mit einem FITC-markierten anti-CLA Antikörper inkubiert. Für je 107 Zellen wurden 200µl dieses Antikörpers und 20µl Blocking-Reagenz eingesetzt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen 10 Miuten lang bei 300g in HBSS gewaschen. Das Pellet wurde resuspendiert und 15 Minuten lang bei 4°C mit anti-FITC MicroBeads inkubiert. 2. Material und Methoden 40 Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit 10ml HBSS für 10 Minuten bei 300g gewaschen und je nach Zellzahl in drei (107 Zellen) bis fünf (5x107) ml HBSS aufgenommen. Die Zellen wurden dann im autoMACS im Modus POSSEL sortiert, anschließend 10 Minuten lang bei 300g in HBSS gewaschen und mit HBSS auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml eingestellt. Die Reinheit der Sortierungen wurde mit einem FACScan Durchflußzytometer kontrolliert (siehe 2.2.7.3). 2.2.2.6 Isolierung CD45RA+ Lymphozyten Das Nabelschnurblut wurde wie oben beschrieben aufbereitet. Zur Separation der mononukleären Zellen wurde das Blut in 50ml Röhrchen mit 15ml Ficoll unterschichtet und 20 Minuten bei 660g zentrifugiert. Die entstandene Interphase, die mononukleäre Zellen und Stammzellen enthielt, wurde abgesaugt und einmal mit Puffer (HBSS, 5mmol EDTA, 0,5% BSA) für 10 Minuten bei 300g und zweimal für 15 Minuten bei 200g gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in Puffer aufgenommen und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Zellen wurden dann in 80µl Puffer für bis zu 107 Zellen aufgenommen und mit 20µl anti-CD45RA MicroBeads pro 107 Zellen für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 10 Minuten bei 300g mit Puffer gewaschen und in einem Volumen von 500µl pro 108 Zellen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann auf die bereits mit Puffer gespülte LS MACSSäule gegeben, die nach Durchlauf der Zellsuspension noch dreimal mit je 500µl Puffer durchgespült wurde. Die in der Säule retinierten CD45RA+ Lymphozyten wurden nach Entfernung der Säule aus dem Separator mit 1ml Puffer ausgewaschen, in ein 15ml Röhrchen überführt und nach Zählung in einer Neubauer Zählkammer eingefroren (siehe 2.2.2.4) oder zur sofortigen Verwendung mit Kulturmedium auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml eingestellt. 2. Material und Methoden 41 2.2.3 Bewertung der Fixierung und Permeabilisierung der Zellen an PBMCs An Lymphozyten wurden sechs verschiedene Fixierungen und drei Methoden der Permeabilisierung anhand der Färbung von Zellen untersucht: Die Zellen wurden direkt mit verschiedenen Farbstoffen gefärbt (DiO, DiL, CFSE). Die Oberflächenmarker der Zellen wurden mit direkt FITC-markierten, monoklonalen anti-CD3, anti-CD4 und anti-HLA-DR Antikörpern gefärbt. Intrazelluläre Zytokine wurden indirekt angefärbt. Hierzu wurden folgende monoklonale, nicht konjugierte Antikörper aus der Maus verwendet: Anti-IFN-γ (Klon 45-15) anti-IL-4 (Klon 4D9 & Klon 8D4-8) und anti-IL-6 (Klon MQ213A5). Als Zweitantikörper zur Durchführung der indirekten Immunfluoreszenz standen anti-Maus Antikörper aus der Ziege zur Verfügung (Alexa 488/568/594). Auf die Anfärbbarkeit von Zytokinen hin wurden nur noch die Kombinationen der einzelnen Fixierungen mit Saponin getestet, da sich bei den ersten Versuchen mit Aceton, Glutaraldehyd und Paraformaldehyd zeigte, daß sich bei der Verwendung von NP-40 und Triton X-100 intrazelluläre Zytokine nur erheblich schwächer als bei der Verwendung von Saponin anfärben ließen. 2.2.3.1 Vorbereitung der PBMCs Die Färbungen von Oberflächenmarkern wurden an frisch isolierten Zellen untersucht. Um Zytokine anfärben zu können, wurden die Zellen für 5-6 Stunden mit 0,5µM PMA und 0,1ng/ml Ionomycin stimuliert. Hierzu wurden die Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/ml in 24 Well Flachbodenplatten in dem beschriebenen Medium kultiviert. Um Zytokine intrazellulär anzureichern, wurde die Zellkultur bei einigen Versuchen mit Brefeldin A in einer Konzentration von 10µg/ml versetzt. Das Brefeldin wurde 3 Stunden vor dem Ernten zugegeben. 2. Material und Methoden 42 2.2.3.2 Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen Die Zellen wurden direkt nach der Isolation gefärbt. 2.2.3.2.1 Färbung der Zellmembranen mit Carbocyanin-Farbstoffen In 0,5ml Ethanol wurden 3mg 1,1´Dioctadecyl-3,3,3´,3´- Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiL) in einem Eppendorf-Hütchen gelöst, kurz per Ultraschall gemischt, mit Ethanol auf 1,5 ml aufgefüllt und 5 Minuten lang bei 11.000g zentrifugiert. 0,5ml des Überstandes (Konzentration: 2mg/ml) wurden zu 9,5ml Kulturmedium pipettiert, um eine Farbstoffkonzentration von 100µg/ml zu erhalten. 3mg 3,3´Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat (DiO) wurden in einer Mischung aus 450µl Ethanol und 50µl DMSO gelöst, im Wasserbad auf 50°C erhitzt und ebenfalls per Ultraschall vermischt. Die Mischung wurde dann mit 900µl Ethanol und 100µl DMSO aufgefüllt und ebenfalls für 5min bei 11.000g zentrifugiert. 0,5ml des Überstandes (Konzentration: 2mg/ml) wurden zu 9,5ml Kulturmedium pipettiert, um eine Farbstoffkonzentration von 100µg/ml zu erhalten. Die zu färbenden Zellen wurden auf eine Konzentration von 1x106/ml Kulturmedium eingestellt und bei 37°C mit den Membranfarbstoffen für eine Stunde inkubiert. Alle 15 Minuten wurden die Zellen vorsichtig durchgemischt. DiL auf eine Konzentration von 7,5µg/ml Kulturmedium eingestellt, DiO auf eine Konzentration von 30µg/ml. Nach einer Stunde wurden die Röhrchen mit HBSS aufgefüllt und 10 Minuten lang bei 300g zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert, mit 25 ml HBSS + 5% FCS aufgefüllt und erneut 10 Minuten lang bei 300g zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen mit Medium in einem definierten Volumen aufgenommen und die Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die für die Kultur benötigte Zellkonzentration wurde mit Kulturmedium eingestellt. 2. Material und Methoden 43 2.2.3.2.2 Färbung mit Succinimidyl-Estern 4,6mg 5-6-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidylester (CFSE) wurden in 2ml DMSO bei 37°C gelöst, um eine 5mmol Stammlösung zu erstellen. Die zu färbenden Zellen wurden mit HBSS auf eine Konzentration von 3x106/ml eingestellt und 15min bei 37°C mit 5µmol CFSE inkubiert. Anschließend wurden die Röhrchen mit HBSS aufgefüllt und die Zellen für 10 Minuten bei 300g gewaschen. Das Pellet wurde resuspendiert und noch einmal mit HBSS gewaschen. Die Zählung der Zellzahl und die Einstellung der benötigten Zellkonzentration erfolgte wie bei den Carbocyanin-Farbstoffen. 2.2.3.3 Anfertigung von Zytozentrifugen-Präparaten Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit 20g auf Objektträger aufzentrifugiert. Die Objektträger wurden direkt vor Verwendung mit Poly-L-Lysin beschichtet, um eine Adhäsion der Zellen zu ermöglichen. Die Isolation von Clustern wurde an PBMCs erprobt, die für 24 Stunden mit 2,4µg/ml PHA stimuliert worden waren. Die Zytozentrifugen-Präparate wurden dabei mit möglichst geringer Drehzahl angefertigt, um die räumliche Struktur der Cluster zu erhalten und die auf die Zellen einwirkenden Belastungen zu reduzieren. Die Zytozentrifugen-Präparate wurden mit Beschleunigungen zwischen 5 und 55g angefertigt. Die Objektträger wurden direkt vor Verwendung mit Poly-L-Lysin beschichtet, um eine Adhäsion der Zellen zu ermöglichen. 500µl des Überstandes wurden aus den Wells abgenommen und verworfen. Das restliche, die Zellen enthaltende Medium, wurde mit einer abgeschnittenen 1000µl Eppendorf-Pipettenspitze vorsichtig resuspendiert. Je 100µl dieser Zellsuspension wurden mit einer abgeschnittenen 200µl Eppendorf-Pipettenspitze aufgenommen und auf Objektträger aufzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen 2x mit eiskaltem HBSS gewaschen, um auf den Objektträgern verbliebenes Permeabilisierung erfolgten Kulturmedium dann wie zu oben beseitigen. Fixation beschrieben. Vor und der Permeabilisierung wurden die Zellen für 10 Minuten bei 37°C mit 5% FCS in 2. Material und Methoden 44 HBSS überschichtet, um die Hintergrund-Färbung zu reduzieren. Danach wurde zweimal mit HBSS gewaschen. 2.2.3.4 Fixierung der Zellen Alle nachfolgend beschriebenen Fixierungsmittel (mit Ausnahme des Acetons) wurden vor Verwendung durch Filter der Porengröße 0,45µm filtriert, um Verunreinigungen auszuschließen. Methode A: Die Zellen wurden für 5 Minuten bei 4°C in 4% Formaldehyd in HBSS fixiert. Danach wurde zweimal mit eiskaltem HBSS gewaschen. Das Formaldehyd wurde frisch aus Paraformaldehyd hergestellt. Diese Methode wird als Fixierung mit Paraformaldehyd bezeichnet. Methode B: Die Fixierung erfolgte für 10 Minuten mit 1% Glutaraldehyd in HBSS, anschließend wurde zweimal mit HBSS gewaschen. Versuchsweise wurden die Zellen nach dem zweiten Waschen mit HBSS noch für 30 Minuten mit 0,1% Natrium-Borhydrat in HBSS inkubiert und anschließend zweimal mit eiskaltem HBSS gewaschen. Methode C: Die Zellen wurden für 15min mit 3,7% Formaldehyd in HBSS fixiert, anschließend wurde zweimal mit eiskaltem HBSS gewaschen. Methode D: Die Zellen wurden 15 Minuten lang mit Fixierlösung inkubiert, die aus 0,5% Glutaraldehyd und 3% Formaldehyd (frisch aus Paraformaldehyd hergestellt) in HBSS bestand. Danach wurde zweimal mit HBSS gewaschen. Versuchsweise wurden die Zellen nach dem zweiten Waschen mit HBSS noch für 30 Minuten mit 0,1% Natrium-Borhydrat in HBSS inkubiert und danach zweimal mit eiskaltem HBSS gewaschen. 2. Material und Methoden 45 Methode E: Die Zellen wurden für 10 Minuten bei 4°C mit Fixierlösung inkubiert: 95% Ethanol und 5% Essigsäure. Danach wurde zweimal mit eiskaltem HBSS gewaschen. Versuchsweise wurden die Zellen permeabilisiert, um eine bessere Anfärbung intrazellulärer Zytokine zu erreichen. Methode F: Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 4°C mit Aceton fixiert und zweimal mit HBSS gewaschen. Die Zellen wurden teilweise permeabilisiert, um die Anfärbung intrazellulärer Zytokine zu verbessern. 2.2.3.5 Permeabilisierung der Zellen Die beschriebenen Fixierunsgmethoden wurden mit der Permeabilisierung der Zellen mit Saponin, NP-40 und Triton X-100 kombiniert. Die Reagentien wurden in einer Konzentration von 0,1%, NP-40 und Triton X-100 auch in einer Konzentration von 0,5% eingesetzt. Die fertigen Lösungen wurden durch Verdünnung der Detergentien in HBSS mit 0,01M HEPES-Puffer erreicht. Die Zellen wurden jeweils 15 Minuten permeabilisiert. 2.2.3.6 Färbung der Oberflächenmarker Die Antikörper waren in HBSS + 0,01M HEPES-Puffer + Detergens in einer Konzentration von 5µg/ml gelöst, die Inkubationszeit lag bei 20 Minuten bei 37°C. Überschüssige Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen mit Permeabilisierungspuffer entfernt. Abschließend wurde zweimal mit HBSS-Acid gewaschen. Die Präparate wurden mit 25µl Vectashield H-1000 eingedeckt. 2.2.3.7 Färbung intrazellulärer Zytokine Für die intrazelluläre Anfärbung von Zytokinen wurden die Präparate für je 30 Minuten bei 37°C mit dem Primärantikörper und danach mit dem 2. Material und Methoden 46 Sekundärantikörper inkubiert (gelöst in HBSS + 0,01M HEPES-Puffer + Detergens). Die Konzentration der Antikörper lag bei 1, 5 oder 10µg/ml. Dazwischen wurde zweimal für 5 Minuten mit HBSS + 0,01M HEPES-Puffer + Detergens gewaschen. Nach Abschluß der Färbung wurde zweimal für 5 Minuten mit HBSS-Acid + 0,01M HEPES-Puffer + Detergens gewaschen. Vor dem Eindecken mit 25µl Vectashield H-1000 wurde zweimal mit HBSS-Acid gewaschen. Zur Anfärbung von IL-4 ohne vorherige Inkubation der Zellen mit BFA wurden beide beschriebenen Primärantikörper (siehe 2.2.3) in einer Konzentration von je 5µg/ml gleichzeitig eingesetzt. 2.2.3.8 Immunfluoreszenz-Mikroskopie Die Auswertung der Präparate erfolgte mit einem Olympus BH-2 FluoreszenzMikroskop mit HBO 100W Quecksilber-Dampflampe. Die Bilder wurden über eine CCD-Kamera mit angeschlossenem PC mit Image-Pro Software aufgenommen. Das Mikroskop war mit auf die Farbstoffe abgestimmten Bandpaß-Filtern ausgerüstet. Alternativ wurde die Auswertung mit einem konfokalen Laser-Raster-Mikroskop (CLSM) der Firma Leica vorgenommen. Die Bilder wurden über einen angeschlossenen PC mit Scanware 3.15 Software aufgenommen. 2.2.4 Bewertung der Fixierung und Permeabilisierung der Zellen an DCs Die oben beschriebenen Fixierungen und Permeabilisierungen wurden auch an dendritischen Zellen im FACS untersucht. Die Zellen wurden nach Färbung mit DiO, DiL, CFSE und auch ungefärbt eingesetzt. 2.2.4.1 Vorbereitung dendritischer Zellen Die Bewertung der Fixierungen wurde an frisch aufgetauten oder 24 Stunden in Kulturmedium mit 10ng/ml GM-CSF in einer Konzentration von 5x105 Zellen/ml kultivierten dendritischen Zellen vorgenommen. 2. Material und Methoden 47 2.2.4.2 Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen Die Färbung dendritischer Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen erfolgte wie beschrieben (siehe 2.2.3.2). 2.2.4.3 Fixierung und Permeabilisierung Die Zellen wurden 10 Minuten auf Eis gestellt und geerntet. Jeweils 1ml wurde in ein FACS-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang mit eiskaltem HBSS bei 300g gewaschen. Anschließend erfolgten Fixation und Permeabilisierung wie beschrieben. Die Fixierung mit Aceton wurde in Polypropylene-Röhrchen, die anderen Fixierungen wurden in Polystyrene-Röhrchen vorgenommen. Die Zellen wurden zum Waschen zweimal für 10 Minuten bei 300g in HBSS-Acid zentrifugiert. Das verbliebene Zell-Pellet wurde schließlich zur Messung in 150µl HBSS-Acid aufgenommen. 2.2.4.4 Durchflußzytometrische Messung Die Zellen wurden mit Hilfe eines FACScan Durchflußzytometers charakterisiert. Die Zellgröße wurde anhand des Vorwärtsstreulichtes (FSC= forward light scatter), die Zellgranulierung anhand des Seitwärtsstreulichtes (SSC= sideward light scatter) bestimmt. Drei Fluoreszenzemissionen im Wellenlängenbereich von 530nm, 580nm und 660nm wurden gemessen. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgte durch einen 15mW Laser bei 480nm. Diese fünf Parameter wurden in einem Computer gespeichert und mit Hilfe des Lysis II Softwarepaketes ausgewertet. Diese fünf Parameter wurden an jeweils 104 Zellen simultan gemessen. 2. Material und Methoden 48 2.2.5 Anzüchtung von Clustern aus dendritischen Zellen und CD45RA+ Lymphozyten 2.2.5.1 Ko-Kultur dendritischer Zellen und CD45RA+ Lymphozyten Es wurde das in Abschnitt 2.2.1 beschriebene Kulturmedium verwendet. Die Kulturdauer lag zwischen 48 Stunden und 7 Tagen. Alle nachfolgend beschriebenen Pipettiervorgänge erfolgten vorsichtig mit abgeschnittenen Pipettenspitzen, um die Belastung der Cluster möglichst gering zu halten. Die Zellen wurden 10 Minuten vor dem Ernten auf Eis gestellt und mit Zellschabern aus den Kulturgefäßen gelöst. Die Konzentration der Zellen betrug jeweils 5x105 CD45RA+ Lymphozyten und 5x104 CD1a+ dendritischen Zellen pro ml Kulturmedium. Der Anteil der CD1a+ dendritischen Zellen an der Gesamtpopulation dendritischer Zellen lag zwischen 20 und 35%. In weiteren Ansätzen wurden die Zellen erst nach 24h Kultur in 10fach erhöhter Konzentration oder nach 24h in 10fach erhöhter Konzentration und anschließender Trennung der Cluster von einzelnen Zellen in den oben beschriebenen Konzentrationen kultiviert. Mögliche Auswirkungen dieses Vorgehens auf die Zytokinproduktion wurden im FACS gemessen (siehe 2.2.7.4). Die Trennung der Cluster von einzelnen Zellen erfolgte in Anlehnung an eine 1989 von Romani und Steinman beschriebene Methode101. Hierbei wurden 5ml Kulturmedium mit den darin enthaltenen Zellen in einem 13 ml Röhrchen über eine Säule aus 5ml RPMI 1640 und FCS im Verhältnis 1:1 geschichtet. Die Cluster sedimentierten dann für eine Stunde bei 1g und 4°C ab. Die oberen 9ml wurden anschließend vorsichtig abgesaugt. Das verbleibende Medium mit den darin enthaltenen Clustern wurde auf 5ml aufgefüllt und in 24 Well Flachbodenplatten gegeben. Versuchsweise wurden auch die im abgenommenen Volumen enthaltenen Zellen weiter kultiviert. Bei einigen Versuchen wurden die Zellen vor Beginn der Ko-Kultur wie beschrieben mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt (siehe 2.2.3.2). Die Auswirkungen dieser Färbungen auf die Zytokinproduktion wurden im FACS gemessen (siehe 2.2.7.4). 2. Material und Methoden 49 Um die Cluster in möglichst großer Zahl zu erhalten und nicht zu deformieren, wurden die Zellen in nachstehenden Kulturgefäßen angezüchtet: 1) Anzüchtung in 24 Well Flachbodenplatten 2) Anzüchtung in Petriperm-Schalen 3) Anzüchtung auf Deckgläsern in 24 Well Flachbodenplatten 4) Anzüchtung auf Anonpore-Membranen 5) Anzüchtung auf Objektträgern 6) Anzüchtung in 12ml Röhrchen in 10fach erhöhter Konzentration für die ersten 12 Stunden, dann Kultur in 24 Well Flachbodenplatten; bei einigen Versuchen Trennung der Cluster von Einzelzellen durch Sedimentation über eine Säule aus 50% FCS und 50% RPMI 1640 für eine Stunde bei 4°C 2.2.5.2 Beobachtung der Zellen in Kultur Die Zellen wurden während der Kultur mit einem OLYMPUS CK2 Auflichtmikroskop beobachtet. Die Dokumentation erfolgte mit einer 35mm Kleinbildkamera. Die Diapositive wurden mit einem Umax Power Look 3000 und der Adobe Photoshop 5.5 Software gescanned und als Tif-Bitmap gespeichert. 2.2.5.3 Verbringung der Cluster auf Objektträger 1) Zytozentrifugation mit 5g für 5 Minuten auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger nach Anzüchtung in 24 Well Flachbodenplatten oder PetripermSchalen 2) Anzüchtung auf Anonpore-Membranen 3) Anzüchtung auf Deckgläsern mit und ohne Zentrifugation 4) Anzüchtung auf Objektträgern mit und ohne Zentrifugation 5) Anzüchtung in 24 Well Flachbodenplatten, anschließend Überführung der Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger oder Chamber-Slides mit Glasböden und acht Kammern, auf die sie für 30 Minuten bei 37°C und 8% CO2 aufsedimentierten, für 5 Minuten bei 5g aufzentrifugiert wurden oder eine Kombination beider Verfahren. 2. Material und Methoden 50 2.5.4 Beobachtung der Zellen bei der Herstellung der Präparate Die Anzahl der Cluster zu Beginn der Isolierung und nach Fixierung und Permeabilisierung wurde unter einem OLYMPUS CK2 Auflichtmikroskop verglichen. 2.2.6 Fixierung und Färbung intrazellulärer Zytokine in Clustern In den Clustern sollten IL-4 und IFN-γ angefärbt werden, wofür die nachfolgend beschriebenen Antikörperkombinationen getestet wurden. Die Anfärbung intrazellulärer Zytokine für das Fluoreszenzmikroskop wurde mit der etablierten Färbung intrazellulärer Zytokine zur Messung im FACS kontrolliert (siehe 2.2.7.4). Zur Anfärbung mit einem monoklonalen Erstantikörper wurden die Zellen teilweise 18 Stunden vor dem Ernten mit 10µg/ml BFA inkubiert. Die Auswirkung einer Inkubation der Zellen mit Brefeldin A auf die Bildung von Clustern wurde ebenfalls im FACS untersucht (siehe 2.2.7.5). Die Zellen wurden nach der bereits beschriebenen Methode A fixiert. Das Paraformaldehyd wurde durch Filter der Porengröße 0,45µm filtriert. Die Präparate wurden für je 45 Minuten bei 37°C in folgender Reihenfolge mit Antikörpern inkubiert (gelöst in HBSS + 0,01M HEPES-Puffer + 0,1% Saponin). 2.2.6.1 Anfärbung mit einem monoklonalen Erstantikörper Anfärbung mit einem monoklonalen Erstantikörper und passendem farbstoffgekoppelten Zweitantikörper. Die Zellen wurden teilweise 18 Stunden vor dem Ernten mit 10µg/ml Brefeldin A inkubiert: Maus anti-IFN-γ (Klon 45-15, 5µg/ml) Ziege anti-Maus Alexa 488/568/594 (5µg/ml) oder Maus anti-IL-4 (Klon 8D4-8, 5µg/ml) & Ziege anti-Maus Alexa 488/568/594 (5µg/ml) 2. Material und Methoden 51 oder Ratte anti-IL-4 (Klon MP4-25D2, 5µg/ml) & Ziege anti-Ratte Alexa 594 (5µg/ml) 2.2.6.2 Anfärbung mit zwei monoklonalen Erstantikörpern Anfärbung mit zwei monoklonalen Erstantikörpern und passendem farbstoffgekoppelten Zweitantikörper ohne Inkubation mit BFA: Maus anti-IL-4 (Klon 4D9, 5µg/ml & Klon 8D4-8, 5µg/ml) & Ziege anti-Maus Alexa 488/568/594 (5µg/ml) 2.2.6.3 Anfärbung mit polyklonalem Erstantikörper Anfärbung mit biotinyliertem, polyklonalem Erstantikörper und Streptavidin gekoppeltem Farbstoff ohne Inkubation mit BFA: polyklonal Ziege anti-IL-4 (5µg/ml) & Neutravidin Alexa 488 (5µg/ml) oder Streptavidin Alexa 594 (5µg/ml) Hier wurde auch noch zusätzlich vor Aufbringen der Antikörper mit je zwei Tropfen Avidin und Biotin bei 37°C für je 15min geblockt. Dazwischen wurde je zweimal für 5 Minuten mit HBSS + 0,01M HEPES-Puffer + 0,1% Saponin gewaschen. Nach Abschluß der Färbung wurde zweimal für 5 Minuten mit HBSS-Acid + 0,01M HEPES-Puffer + 0,1% Saponin gewaschen. Vor dem Eindecken mit 25µl Vectashield H-1000 wurde zweimal mit HBSS-Acid gewaschen. 2.2.6.4 Immunfluoreszenz-Mikroskopie Die Auswertung der Zellkulturen erfolgte mit einem Olympus BH-2 Fluoreszenzmikroskop, wie bereits beschrieben (siehe 2.2.3.8). 2. Material und Methoden 52 Die Präparate wurden auf das Vorhandensein, die Zahl und die Form der Cluster untersucht. Darüberhinaus wurde die Qualität der verschiedenen Färbungen geprüft. 2.2.7 Ergänzende Messungen im FACS Die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen wurden mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt, die direkt mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert waren. Alle Antikörper wurden in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen benutzt. 2.2.7.1 Anteil CD1a+ dendritischer Zellen Zur Bestimmung des Anteils CD1a+ dendritischer Zellen wurde nach Beendigung der Kultur ein Well (5x105 Zellen) geerntet. Das Kulturmedium wurde durch Waschen mit HBSS für 10 Minuten bei 300g entfernt. Die Zellen wurden dann 15 Minuten lang bei 4°C mit anti-CD1a PE Antikörper in einem Volumen von 100µl inkubiert. Als Verdünnungspuffer wurde HBSS-Acid benutzt. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen mit HBSS-Acid für 5 Minuten bei 200g entfernt. Zur Messung wurden die Zellen in 150µl HBSS-Acid aufgenommen. 2.2.7.2 Entwicklung der Subpopulationen dendritischer Zellen in Kultur Zur Bestimmung des Verlaufs der verschiedenen Subpopulationen wurde täglich ein Well (5x105 Zellen) geerntet. Die Zellen wurden auf Eis gestellt und in ein FACS-Röhrchen überführt. Um das Kulturmedium zu entfernen, wurden sie 10 Minuten lang bei 300g mit HBSS gewaschen. Die Zellen wurden dann 15 Minuten lang in einem Volumen von 100µl bei 4°C mit Antikörpern (anti-CD1a PE, anti-CD14 tricolor, anti-CLA FITC) wie oben inkubiert. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen mit HBSS-Acid für 5 Minuten bei 200g entfernt. Zur Messung wurden die Zellen in 150µl HBSS-Acid aufgenommen. 2. Material und Methoden 53 2.2.7.3 Reinheit der sortierten Subpopulationen Die Färbung der CD1a+ Subpopulation erfolgte wie oben beschrieben. Die CLA+ dendritischen Zellen wurden zur Messung nur für 10 Minuten bei 200g in HBSS-Acid gewaschen und in 150µl HBSS-Acid aufgenomen, da die autoMACS-Sortierung über FITC-markierte Antikörper erfolgte. 2.2.7.4 Messung intrazellulärer Zytokine in Ko-Kulturen aus dendritischen Zellen und Lymphozyten Die Messung intrazellulärer Zytokine erfolgte in Anlehnung an die von Jung entwickelte Methode102. Die Zellen wurden 18 Stunden vor dem Ernten mit 10µg/ml BFA inkubiert. Die Ansätze der Zellkultur wurden 10 Minuten lang auf Eis gestellt und anschließend geerntet. Die Zellen wurden in 15ml Probenröhrchen überführt und mit HBSS für 10 Minuten bei 300g gewaschen. Danach wurde 10 Minuten lang mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd fixiert und zweimal 10 Minuten lang mit HBSS gewaschen. Das Zell-Pellet wurde für 20 Minuten in Saponinpuffer (0,1% Saponin & 0,01M HEPES in HBSS) permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen in FACS-Röhrchen überführt und mit Antikörpern gegen Oberflächenantigene und Zytokine (anti-CD3 tricolor, anti-IFNγ FITC oder PE und anti-IL-4 PE) simultan für 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Außerdem wurde ein Kontrallansatz mitgeführt, der mit FITC- und PE-markierten IgG1Antikörpern inkubiert wurde. Als Verdünnungspuffer wurde Saponin-Puffer benutzt. Die nicht gebundenen Antikörper wurden mit 1ml Saponinpuffer für 10 Minuten bei 300g ausgewaschen. Danach wurde erneut 10 Minuten lang bei 300g mit HBSS-Acid gewaschen. Für die durchflußzytometrische Messung wurden die Zellen in 150µl HBSS-Acid aufgenommen. Innerhalb der Population der CD3+ Lymphozyten wurde der prozentuale Anteil der Zytokin-produzierenden Zellen bestimmt. Zum Vergleich mit der mikroskopischen Betrachtung wurden IL-4 und IFN-γ parallel zur Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop im Durchflußzytometer bestimmt. 2. Material und Methoden 54 Zur Kontrolle der Auswirkungen der unterschiedlichen Zell-Konzentrationen in der Ko-Kultur auf die Zytokinproduktion wurden IL-4 und IFN-γ an Tag 2, 4 und 6 gemessen. Die Auswirkungen der Färbung mit DiO und CFSE auf die Zytokinproduktion (IL-4 und IFN-γ) wurden anhand vergleichender Ko-Kulturen gemessen, von denen je eine aus mit Farbstoffen gefärbten dendritischen Zellen oder Lymphozyten angelegt wurde. Die andere blieb ungefärbt. 2.2.7.5 Durchflußzytometrische Messung der Clusterbildung Die Messung der Clusterbildung zwischen Lymphozyten und dendritischen Zellen erfolgte nach dem Protokoll von Gant, Shakoor und Hamblin103. Um den Einfluß von Brefeldin A auf die Bildung von Clustern zu messen, wurden DiL gefärbte dendritische Zellen und DiO gefärbte Lymphozyten zusammen in Kultur gegeben. Zu einigen dieser Kulturen wurde 18 Stunden vor dem Ernten je 10µg/ml BFA zugesetzt, um vergleichende Messungen durchführen zu können. Die Zellen wurden 2, 5 und 7 Tage lang kultiviert. Die Ansätze der Zellkulturen wurden 10 Minuten lang auf Eis gestellt und anschließend geerntet. Die Zellen wurden in 15ml Probenröhrchen überführt und mit HBSS für 10 Minuten bei 300g gewaschen. Danach wurde 10 Minuten lang mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd fixiert und anschließend für 10 Minuten mit HBSS bei 300g gewaschen. Das Zellpellet wurde in HBSS aufgenommen. Für die durchflußzytometrische Messung wurden je 250µl Zellsuspension in ein FACSRöhrchen überführt. Die Analyse erfolgte durch Aufnahme der Ereignisse, die entweder im grünen, im roten oder in beiden Fluoreszenzbereichen auftraten. Die Anzahl der „roten“ Ereignisse relativ zu der Summe der „roten“ und „rot-grünen“ Ereignisse entsprach der Prozentzahl der geclusterten dendritischen Zellen. 2. Material und Methoden 55 2.2.8 Elektronenmikroskopie 2.2.8.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Cluster Die Erstellung der Präparate zur Rasterelektronenmikroskopie erfolgte analog der Erstellung der Präparate zur Immunfluoreszenzmikroskopie. Die Cluster wurden in 24 Well Flachbodenplatten angezüchtet und anschließend auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Chamber-Slides mit Permanoxböden und acht Kammern überführt, auf die sie für 30 Minuten bei 37°C und 8% CO2 aufsedimentierten und für 5 Minuten bei 5g aufzentrifugiert wurden. Das verbliebene Kulturmedium wurde mit HBSS-Acid abgewaschen. Danach wurden die Zellen mit einem Karnovsky-Pikrinsäure-Gemisch (3% Paraformaldehyd + 0,5% Glutaraldehyd + 0,2% Pikrinsäure in HBSS) für 10 Minuten bei 4°C fixiert und erneut mit HBSS-Acid gewaschen. Mit einem Olympus IMT-2 Phasenkontrastmikroskop wurden die Kammern auf den Gehalt an Clustern überprüft und so die für die weitere Untersuchung geeigneten Kammern ausgewählt. Nach dem Entfernen der Kammeraufsätze erfolgte eine Lufttrocknung. Die Böden der ausgewählten Kammern wurden herausgeschnitten, auf Aluminium-Probenhalter geklebt und mit einem Sputter Coater unter Argonschutzatmosphäre mit Gold besputtert. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte mit dem Rasterelektronenmikroskop DSM 950 der Firma Zeiss und einer 35mm Kleinbildkamera. 2.2.8.2 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) der Cluster Die Zellen wurden in 24-Lochplatten angezüchtet, 10 Minuten vor dem Ernten auf Eis gestellt und mit Zellschabern aus den Kulturgefäßen gelöst. Alle nachfolgenden Pipettiervorgänge erfolgten vorsichtig mit abgeschnittenen Pipettenspitzen, um die Belastung der Cluster möglichst gering zu halten. Die Cluster aus Lymphozyten und dendritischen Zellen wurden vorsichtig in BEEM-Kapseln überführt. In diesen sedimentierten sie für 10 Minuten bei 37°C und 8% CO2 und wurden für 5 Minuten bei 5g zentrifugiert. Anschließend wurde das Kulturmedium vorsichtig abgeschüttet und das Pellet mit HBSS-Acid 2. Material und Methoden 56 überschichtet. Dieser Vorgang wurde wiederholt. Danach wurden die Zellen mit einem Karnovsky-Pikrinsäure-Gemisch für 10 Minuten bei 4°C fixiert und in HBSS-Acid aufgenommen. Die sedimentierten Pellets wurden 10 Minuten lang in phosphatgepuffertem 2%igen Osmiumtetroxid nachfixiert, mit Aqua bidest. gespült und mit gesättigter Uranylacetatlösung für 10 Minuten kontrastiert. Nach Waschen mit Aqua bidest. wurden die Pellets 20 Minuten lang in 100%igem Methanol entwässert und über Nacht mit einem Epon-Propylenoxid-Gemisch (Epon-Gebrauchslösung und Propylenoxid im Verhältnis 1:1) infiltriert. Die Epon Gebrauchslösung wurde aus 50ml Stammlösung A (31ml Epon 812 + 50ml Eponhärter DDSA), 50ml Stammlösung B (50ml Epon 812 + 45ml Eponhärter MNA) und 1,5ml Beschleuniger DMP 30 erstellt. Am folgenden Morgen wurden die Pellets in Epon 812 ausgegossen und bei 80°C im Vakuum ausgehärtet. Nach erfolgter Aushärtung wurden Ultradünnschnitte (0,1-0,2 µm) angefertigt, auf 200-mesh Kupfernetzchen (Grids) aufgezogen und im Leica EM Stain kontrastiert: Die Dünnschnitte wurden mit HPLC-Wasser gespült und mit 0,5% Uranylacetatlösung (Ultrostain 1) 45 Minuten lang kontrastiert. Danach wurde mit HPLC-Wasser gespült. Nach einer Kontrastierung für 15 Minuten mit 0,5% Bleicitratlösung (Ultrostain 2) wurde noch einmal mit HPLC-Wasser gespült. Die Grids wurden aus dem Gerät entnommen und noch einmal vorsichtig mit Aqua bidest. gespült. Überschüssige Flüssigkeit wurde mit Filterpapier von der Rückseite der Grids entfernt. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte mit einem Zeiss EM 900 Transmissionselektronenmikroskop und einer Planfilmkamera. 2.2.8.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) der Subpopulationen dendritischer Zellen Die Zellen wurden an Tag 5 (CD1a+) oder Tag 10 (CLA+) geerntet und die einzelnen Subpopulationen wie beschrieben im autoMACS aufgetrennt (siehe 2.2.5.1/2.2.5.2). Nach Separation der verschiedenen Subpopulationen wurden die Zellen zweimal mit HBSS für 10 Minuten bei 300g gewaschen. Das Pellet wurde 2. Material und Methoden 57 in 1ml HBSS-Acid aufgenommen und in BEEM-Kapseln überführt. Das weitere Vorgehen erfolgte dann wie oben beschrieben. 2.2.8.4 Digitale Bildbearbeitung Die mit einer Kleinbildkamera am REM erstellten Diapositive und die mit einer Planfilmkamera am TEM erstellten Negative wurden mit einem Umax Power Look 3000 und der Adobe Photoshop 5.5 Software gescanned und als Tif-Bitmap gespeichert. 3. Ergebnisse 58 3. Ergebnisse 3.1 Bewertung der Fixierung und Permeabilisierung 3.1.1 Bewertung der Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung an dendritischen Zellen Die Einflüsse von Fixierung und Permeabilisierung auf Autofluoreszenz, Morphologie und Anfärbung dendritischer Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen wurden im Durchflußzytometer gemessen. Als Referenzwerte wurden die Lichtbrechungs-Eigenschaften und die Autofluoreszenz nicht fixierter und nicht permeabilisierter Zellen genommen. Die dendritischen Zellen wurden entweder direkt nach dem Auftauen verwendet oder vorher 24 Stunden lang mit GM-CSF in einer Konzentration von 10ng/ml kultiviert. Die Einflüsse von Fixierung und Permeabilisierung auf Lymphozyten wurden nicht gemessen, da für die nach diesen Versuchen ausgewählte Fixierung und Permeabilisierung mit Paraformaldehyd-Saponin ausreichende Ergebnisse (siehe 4.1.1 und 4.1.2) vorlagen. 3.1.1.1 Fixierung Die Fixierung mit Paraformaldehyd und einem Formaldehyd-Glutaraldehyd Gemisch führte zu nur geringen Veränderungen der Lichtbrechungs-Eigenschaften dendritischer Zellen. Bei Verwendung von Glutaraldehyd und Formaldehyd blieb die Morphologie ebenfalls gut erhalten. Nach Fixierung der Zellen mit Aceton oder Ethanol-Eisessig waren die Lichtbrechungs-Eigenschaften dendritischer Zellen stark verändert. Die Autofluoreszenz der Zellen wurde durch Verwendung von Glutaraldehyd oder einer Formaldehyd-Glutaraldehyd Kombination verstärkt. Zwar ließ sich diese Autofluoreszenz durch Waschen der Zellen mit Natrium-Borhydrat stark 3. Ergebnisse 59 vermindern, erreichte aber nicht das niedrige Niveau der anderen Fixierungen (siehe 7.1). Die Fixierung beeinflußte die Anfärbung der Zellen mit Carbocyanin-Farbstoffen (DiO und DiL) und Succinimidyl-Estern (CFSE). Die Fixierung mit Aceton und Ethanol-Eisessig verminderte die Fluoreszenz von DiO und DiL beträchtlich. Alle anderen Fixierungen beeinträchtigten die spezifische Fluoreszenz dieser Farbstoffe nicht, allerdings störte die unspezifische Fluoreszenz bei Fixierung mit Glutaraldehyd und Formaldehyd-Glutaraldehyd ganz erheblich. Die mögliche Reduzierung der unspezifischen Fluoreszenz durch NatriumBorhydrat führte auch zu einer starken Verminderung der spezifischen Fluoreszenz der Farbstoffe. Die Färbung der Zellen mit CFSE wurde durch die Fixantien nicht beeinträchtigt (siehe 7.2). 3.1.1.2 Permeabilisierung Die Permeabilisierung mit Saponin beeinflußte die Lichtbrechungs-Eigenschaften dendritischer Zellen weit weniger als die Permeabilisierung mit NP-40 oder Triton X-100. Die Autofluoreszenz der Zellen wurde jedoch durch Permeabilisierung mit Saponin in geringem Ausmaß erhöht (siehe 7.1). Die Permeabilisierung der Zellen mit NP-40 und Triton X-100 verminderte die spezifische Fluoreszenz der Carbocyanin-Farbstoffe, wohingegen die Permeabilisierung mit Saponin zu einer Verstärkung der spezifischen Fluoreszenz führte. Die Fluoreszenz nach Färbung der Zellen mit CFSE wurde durch die Permeabilisierung nicht verändert (siehe 7.2). 3. Ergebnisse 60 3.1.2 Bewertung der Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung an PBMCs Die Kompatibilität der Fixierung und Permeabilisierung mit der Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen und Antikörpern gegen Oberflächenmarker und intrazelluläre Zytokine wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Zellen wurden mit DiO, DiL oder CFSE gefärbt. Die Anfärbung der Oberflächenmarker erfolgte mit direkt markierten, monoklonalen Antikörpern, die Zytokine wurden indirekt dargestellt. Die Zellen wurden vor Anfärbung der Zytokine mit PMA-Ionomycin stimuliert und mit Brefeldin A inkubiert. 3.1.2.1 Fixierung Die nachfolgend beschriebenen Eigenschaften der Fixierungsmethoden bezüglich der Färbung von Zytokinen stellen jeweils nur die Kombination mit Saponin dar. Bei den ersten Versuchen mit Aceton, Glutaraldehyd und Paraformaldehyd zeigte sich, daß bei der Permeabilisierung der Zellen mit NP-40 und Triton X-100 intrazelluläre Zytokine nur erheblich schwächer als bei der Verwendung von Saponin anfärbbar waren. Die Fixation mit Paraformaldehyd führte zu nur geringer Eigenfluoreszenz. Die Anfärbung von Oberflächenmarkern, Zytokinen und Zellmembranen war vollkommen unproblematisch. Die Fluoreszenz nach Färbung intrazellulärer Zytokine wies eine perinukleäre, lokale Verteilung oder auch eine schwächere, ring- oder streifenförmige Anordnung auf (Abb. 7 und Abb. 8). Im Mikroskop ließen sich die einzelnen Zellen in den Clustern gut voneinander abgrenzen. Die Präparate konnten allerdings höchstens zwei Tage im Kühlschrank aufbewahrt werden. Die Fixation mit Formaldehyd wies eine geringe Eigenfluoreszenz auf. Die Anfärbung von Oberflächenmarkern, Zellmembranen und intrazellulären Zytokinen war wie bei der Fixierung mit Paraformaldehyd problemlos möglich; die Zellen wiesen unter dem Mikroskop eine unbeeinträchtigte Struktur auf. Diese Art der Fixation war nur wenige Tage haltbar. 3. Ergebnisse Abbildung 7: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung I Anfärbung von IFN-γ in einem Lymphozyten nach Paraformaldehyd-SaponinBehandlung. IFN-γ ruft eine lokale perinukleäre Fluoreszenz hervor. Weiterhin erkennbar sind tubuläre Strukturen, die dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat entsprechen (Fluoreszenzmikroskop, 250x Vergrößerung). Abbildung 8: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung II Ring-/streifenförmiges Fluoreszenzmuster in einem Lymphozyten nach Anfärbung von IFN-γ. Die Zelle wurde mit Paraformaldehyd fixiert und mit Saponin permeabilisiert (Fluoreszenzmikroskop, 250x Vergrößerung). 61 3. Ergebnisse 62 Mit Glutaraldehyd fixierte Zellen wiesen eine sehr starke Eigenfluoreszenz auf, die sich allerdings durch die Verwendung von 0,1% Natrium-Borhydrat vermindern lies. Die Anfärbbarkeit von Oberflächenmarkern und intrazellulären Zytokinen war sehr schlecht. Die Anfärbung mit Zellfarbstoffen war gut möglich, wurde jedoch durch die hohe Eigenfluoreszenz behindert (Abb. 9). Die Morphologie der Zellen war sehr gut erhalten, die Präparate konnten lange aufbewahrt werden. Die kombinierte Fixation mit Formaldehyd-Glutaraldehyd wies eine stärkere Eigenfluoreszenz der Zellen auf als bei alleiniger Fixierung mit Formaldehyd. Auch hier konnte diese durch Natrium-Borhydrat vermindert werden. Die Darstellung der Oberflächenmarker und Zytokine war schlecht. Die Kombination mit den verschiedenen Zellfarbstoffen wurde durch die höhere Eigenfluoreszenz behindert. Die Zellstruktur wurde nicht beeinträchtigt. Diese Fixation erlaubte eine lange Aufbewahrung der Präparate. Die Fixation mit Ethanol-Essigsäure zerstörte sämtliche Membranepitope. Die Eigenfluoreszenz war recht gering, die Anfärbung intrazellulärer Zytokine und der Zellmembranen nicht möglich. Die Anfärbung mit CFSE wurde nicht beeinträchtigt. Unter dem Mikroskop konnten die Zellgrenzen nicht mehr erkannt werden. Die Haltbarkeit war gut. Die Fixation mit Aceton bot bei ebenfalls geringer Eigenfluoreszenz eine gute Darstellung membranärer Bindungsstellen und intrazellulärer Zytokine, die in Kombination mit einem Detergens noch verbessert werden konnte. Die Zytokine wiesen jedoch ein anderes Verteilungsmuster als nach Fixierung mit Paraformaldehyd auf. Die Strukturen von endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat waren nicht klar abzugrenzen (Abb. 10). Die Anfärbung der Zellmembranen wurde durch die Verwendung von Aceton stark beeinträchtigt, die Anfärbung mit CFSE blieb unbeeinträchtigt. Auch hier waren Zellgrenzen nicht mehr klar zu erkennen. Die Präparate waren nur wenige Tage haltbar. 3. Ergebnisse 63 Abbildung 9: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung III Anfärbung von CD3 auf Lymphozyten nach Fixierung mit Glutaraldehyd. Erkennbar ist lediglich eine starke unspezifische Fluoreszenz (Aufnahme mit einem Leica CLSM, 50x Objektiv). Abbildung 10: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung IV Anfärbung von IFN-γ in einem Lymphozyten nach Fixation mit Aceton. Die Fluoreszenz ist, im Vergleich zu den Ergebnissen nach Paraformaldehyd-SaponinBehandlung, in Richtung Nucleus verschoben (Aufnahme mit einem Leica CLSM, 50x Objektiv). 3. Ergebnisse 64 Tabelle 3: Auswirkungen von Fixierung und Permeabilisierung Die Kompatibilität der verschiedenen Fixationen mit der Färbung von Zytokinen (IFN-γ, IL-4, IL-6), Oberflächen (CD3, CD4, HLA-DR), Membranfarbstoffen (DiO, DiL) und Zellfarbstoffen (CFSE) sowie die Erhaltung der Morphologie wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht und wie folgt bewertet: ++ sehr gut Fixierung + gut - schlecht Zytokine -- sehr schlecht Ober- DiO & flächen DiL CFSE Zellstruktur Paraformaldehyd ++ + ++ ++ ++ Formaldehyd ++ + ++ ++ ++ Glutaraldehyd - - - + ++ - - -- + ++ - - + + ++ - - - + ++ Ethanol-Eisessig -- -- -- Aceton ++ ++ + Glutaraldehyd + Borhydrat FormaldehydGlutaraldehyd Formaldehyd-Glutaraldehyd + Borhydrat -- ++ - 3.1.2.2 Permeabilisierung Die Färbung der Zellen wurde auch durch die Permeabilisierung beeinflußt. Die Verwendung von Saponin führte zu einer diskreten Erhöhung der Eigenfluoreszenz, die bei Triton X-100 und NP-40 nicht auftrat. Dafür beeinträchtigte Saponin nicht die Fluoreszenz der Membranfarbstoffe, die durch 3. Ergebnisse 65 die beiden anderen Detergentien stark vermindert oder sogar eliminiert wurde. Die Färbung der Zellen mit CFSE wurde durch die Permeabilisierung nicht beeinflußt. Die Anfärbung von Oberflächenmarkern wurde ebenfalls durch die Detergentien beeinflußt. Die Fluoreszenz der angefärbten Antigene war nach Permeabilisierung der Membran mit NP-40 und Triton X-100 wesentlich schwächer als bei Verwendung von Saponin. Auf die Anfärbbarkeit von Zytokinen hin wurden, wie bereits erwähnt, nur noch die Kombinationen der einzelnen Fixierungen mit Saponin getestet. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung von 0,1% Saponin erzielt. Bei Benutzung von NP-40 und Triton X-100 in einer Konzentration von 0,1% war die Anfärbung intrazellulärer Zytokine unter ansonsten gleichen Bedingungen (Fixierung mit Paraformaldehyd oder Aceton) wesentlich schwächer. Die Anhebung der Konzentration dieser Detergentien auf 0,5% zur Verbesserung der Permeabilisierung führte dazu, daß sich keine intrazellulären Zytokine mehr anfärben ließen. 3.1.2.3 Verteilung der Zytokine in PBMCs In Zellen, die mit Brefeldin A inkubiert worden waren, ließen sich IL-4, IL-6 und IFN-γ problemlos anfärben. IL-4 wies dabei die schwächste Färbung auf. Bei Verzicht auf BFA ließ sich IL-4 mit einem monoklonalen Antikörper nicht mehr anfärben. Durch gleichzeitige Inkubation mit zwei monoklonalen Antikörpern ließ sich IL-4 wieder anfärben. Das Verteilungsmuster der Zytokine innerhalb der Zellen wurde durch die Verwendung von BFA deutlich verändert: Die hier untersuchten Zytokine zeigten, wie in 3.1.2.1 beschrieben, eine perinukleäre, lokale Immunfluoreszenz. Bei einigen Zellen fand sich auch eine schwächere, ring- oder streifenförmige Anordnung der Färbung. Anhand dieser Verteilung ließen sich die Zytokine im Golgi-Apparat oder im endoplasmatischen Retikulum lokalisieren. Durch die Inkubation mit Brefeldin A wurde dieses Verteilungsmuster innerhalb der Zellen aufgehoben. Die Fluoreszenz war über eine wesentlich größere Fläche verteilt und füllte teilweise das gesamte Zytoplasma aus. Der Golgi-Apparat und das endoplasmatische Retikulum konnten nicht mehr klar abgegrenzt werden (Abb. 11 und Abb. 12). 3. Ergebnisse 66 Abbildung 11: Verteilungsmuster von Zytokinen nach Inkubation mit BFA I Nach Inkubation mit BFA führt die Anfärbung von IFN-γ zu einem veränderten Fluoreszenzmuster. Organellen sind nicht mehr auszumachen, die Fluoreszenz füllt das gesamte Zytoplasma aus (Fixation mit Paraformaldehyd, Permeabilisierung mit Saponin, Leica CLSM, 50x Objektiv). Abbildung 12: Verteilungsmuster von Zytokinen nach Inkubation mit BFA II Anfärbung von IFN-γ nach Inkubation mit BFA. Die Morphologie der Zelle wird zerstört. Die Beobachtung einer gerichteten Abgabe von Zytokinen wäre nicht möglich (Paraformaldehyd-Saponin, Leica CLSM, 50x Objektiv). 3. Ergebnisse 67 3.2 Zellfarbstoffe 3.2.1 Fluoreszenzfarbstoffe in der Fluoreszenzmikroskopie und im Durchflußzytometer Die Verwendung von CFSE führte zu einer homogenen Anfärbung der Zellen. Die Anfärbung der Zellen mit Membranfarbstoffen brachte eine wesentlich ungleichmäßigere Verteilung der Fluoreszenz innerhalb der Zellen hervor, da die Carbocyanin-Farbstoffe die Membranen der Zellen anfärben. Die Fluoreszenz war somit in membranreichen Kompartimenten der Zellen wesentlich höher als in membranarmen. Durch die Anfärbung aller Membranen ließen sie jedoch durch Kolokalisation die genaue Bestimmung des Ortes der Zytokinsynthese in den Organellen zu. Problematisch war die Verwendung von DiL. Aufgrund seiner Exzitations- und Emissionscharakteristik rief dieser Farbstoff immer ein störendes Signal im Wellenlängenbereich von FITC hervor. 3.2.2 Fluoreszenzfarbstoffe und Zellfunktion Die Membranfärbung von Lymphozyten mit DiO führte, wie im FACS nachgewiesen werden konnte, nicht zu einer Veränderung der Zytokinproduktion im Vergleich zu ungefärbten Zellen. Die Zahl der IL-4 produzierenden Zellen lag in allen Ansätzen bei ungefähr 15%; IFN-γ wurde von 1% der Zellen produziert. Die Färbung mit CFSE beeinträchtigte die Zytokinproduktion ebenfalls nicht. Sowohl die gefärbte als auch die ungefärbte Kultur bildeten kein IFN-γ, in der mit CFSE-gefärbten dendritischen Zellen angelegten Ko-Kultur bildeten 13% der Lymphozyten IL-4, in der anderen 12%. 3.2.3 Fluoreszenzfarbstoffe und Zellmorphologie Durch die Anfärbung mit Zellfarbstoffen wurden die Lichtbrechungs- Eigenschaften dendritischer Zellen verändert. 3. Ergebnisse 68 Die in Tabelle 4 dargestellten Werte wurden im FACS an nicht fixierten und nicht permeabilisierten dendritischen Zellen ermittelt, die 24 Stunden lang mit GM-CSF in einer Konzentration von 10ng/ml stimuliert wurden. Tabelle 4: Fluoreszenzfarbstoffe und Zellmorphologie Die Einflüsse von Fluoreszenzfarbstoffen (CFSE, DiO und DiL) auf die Lichtbrechungs-Eigenschaften dendritischer Zellen wurden im FACS untersucht. ungefärbt CFSE DiO DiL Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung 640 652 508 670 Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung 620 667 581 629 3.3 Anzüchtung von Clustern aus dendritischen Zellen und CD45RA+ Lymphozyten 3.3.1 Ko-Kultur dendritischer Zellen und CD45RA+ Lymphozyten Das Verhältnis von dendritischen Zellen zu T-Lymphozyten wurde immer im Verhältnis 1:10 belassen. Die absolute Anzahl der Zellen und die Kulturdauer wurden jedoch bei einigen Versuchen variiert. Die Konzentration der CD45RA+ Lymphozyten betrug normalerweise 5x105 pro ml Kulturmedium, die der CD1a+ dendritischen Zellen 5x104 pro ml Kulturmedium (1:10). In weiteren Ansätzen wurden die Zellen erst nach einer Kulturdauer von 24 Stunden in 10fach erhöhter Konzentration (10fach) oder nach 24 Stunden in 10fach erhöhter Konzentration mit anschließender Trennung der Cluster von einzelnen Zellen (Sediment) in den oben beschriebenen Konzentrationen kultiviert (siehe 2.2.5.1). Die Anzüchtung der Zellen in verschiedenen Konzentrationen erfolgte, um Einflüsse der Zellzahlen auf die Clusterbildung zu überprüfen. Die Anzüchtung der Zellen in 10fach erhöhter Konzentration führte nicht zu einer schnelleren Bildung von Clustern. 3. Ergebnisse 69 Aus dem abgenommenen Volumen der Gradienten, in denen die Cluster von einzelnen Zellen getrennt werden sollten, waren problemlos weitere Cluster anzüchtbar. Die vergleichende Messung dieser Kulturen im FACS (Abb. 13) ergab über einen Zeitraum von 6 Tagen nur geringe Unterschiede in der Produktion von IFN-γ und IL-4 zwischen den verschiedenen Ansätzen. Der Anteil der IFN-γ-produzierenden Zellen lag durchgehend im Bereich von 1% (Abb.14). Der Anteil der IL-4-produzierenden Zellen befand sich an Tag 2 der Ko-Kultur zwischen 10% und 15%. An Tag 4 produzierten zwischen 12% und 14% dieser Zellen IL-4. An Tag 6 fiel der Anteil der IL-4-produzierenden Zellen auf unter 10% (Abb. 15). In allen Ansätzen war im Verlauf der Ko-Kultur eine Anzahl von Lymphozyten vorhanden, die sowohl IL-4 als auch IFN-γ produzierten (Abb. 16). 3.3.2 Verbringung der Cluster auf Objektträger Die PHA-stimulierten Cluster aus Lymphozyten wurden in 24-Lochplatten kultiviert, aus denen sie nach Resuspendierung mit einer 1ml Eppendorf-Pipette mit abgeschnittener Pipettenspitze problemlos vollständig entnommen werden konnten. Auf die Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten ließ sich dieses Verfahren nicht ohne weiteres übertragen, da die dendritischen Zellen in den 24Lochplatten stark adhärierten und die Cluster durch die Resuspendierung zerstört wurden. Um die Cluster einer möglichst geringen mechanischen Belastung auszusetzen, wurden für die Anzüchtung zwei verschiedene Verfahren eingesetzt: Zum einen die Anzucht in Gefäßen, aus denen sich die Zellen möglichst leicht entnehmen ließen, zum anderen die Anzucht in Behältnissen, in denen die Zellen möglichst gut adhärierten, um aus diesen Präparate erstellen zu können. 3. Ergebnisse 70 Abbildung 13: Zytokinproduktion in der Ko-Kultur Im FACS wurden anhand der Vorwärts- und der Seitwärts-Lichtbrechung die Lymphozyten (R1) identifiziert (links oben). Innerhalb der mit dem Oberflächenmarker CD3 (R2) ausgestatteten Lymphozytenpopulation (rechts oben) wurden die Zellen bestimmt (links unten), die entweder IFN-γ (R4), IL-4 (R5) oder IFN-γ und IL-4 (R6) produzierten. Die verschiedenen Regionen wurden anhand der Isotypkontrolle gesetzt (rechts unten). 1.5 1:10 10x Sediment 1.0 % 0.5 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abbildung 14: Anteil der IFN-γ-produzierenden Zellen in Kultur Ein Teil der T-Lymphozyten in der Ko-Kultur aus dendritischen Zellen und Lymphozyten produzierte IFN-γ. Der Anteil der IFN-γ-produzierenden T-Zellen lag im Bereich von 1%. 71 3. Ergebnisse % 20 1:10 10x Sediment 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abbildung 15: Anteil der IL-4-produzierenden Zellen in Kultur Ein Teil der T-Lymphozyten in der Ko-Kultur aus dendritischen Zellen und Lymphozyten produzierte IL-4. Der Anteil der IL-4-produzierenden T-Zellen lag an Tag 2 der Ko-Kultur zwischen 10% und 15%. An Tag 4 der Ko-Kultur produzierten zwischen 12% und 14% der Zellen IL-4. Der Anteil der IL-4produzierenden Zellen fiel an Tag 6 auf unter 10%. 30 1:10 10x Sediment % 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abbildung 16: Anteil der IFN-γ- und IL-4-produzierenden Zellen in Kultur Ein Teil der T-Lymphozyten in der Ko-Kultur aus dendritischen Zellen und Lymphozyten produzierte sowohl IFN-γ als auch IL-4. Zu Beginn der Ko-Kultur produzierte nur ein kleiner Teil der T-Zellen beide Zytokine. Der Anteil dieser Zellen stieg an Tag 6 auf bis zu 25% an. 3. Ergebnisse Auch die 72 mit PHA-stimulierten Lymphozyten etablierte Methode der Zytozentrifugation auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger ließ sich nicht problemlos auf Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten übertragen, da diese sich auch hier als wesentlich empfindlicher erwiesen. 3.3.2.1 Kulturgefäße Die Anzüchtung der Zellen wurde zuerst in 24-Lochplatten vorgenommen, aus denen die Zellen nach vorsichtiger Durchmischung mit abgeschnittenen 1ml Eppendorf-Pipettenspitzen entnommen wurden. Bei entsprechend vorsichtiger Behandlung ließ sich eine ausreichende Anzahl an Clustern aus den Wells entnehmen, es verblieb allerdings immer eine große Anzahl von Clustern auf dem Boden des Wells. Dieses Problem ließ sich auch dadurch nicht lösen, daß die Zellen 10 Minuten vor dem Ernten auf Eis gestellt wurden. Die Zahl der Cluster blieb ungefähr gleich, was allerdings auch zeigte, daß die Abkühlung auf 4°C den Zusammenhalt innerhalb der Cluster nicht herabsetzte. Bei stärkerer Durchmischung ließen sich zwar alle Zellen entnehmen, in den entsprechenden Präparaten fanden sich dann allerdings keine Cluster mehr. Durch die vorsichtige Verwendung von Zellschabern, nachdem die Zellen für 10 Minuten auf Eis gestellt worden waren, konnte die Anzahl der extrahierbaren Cluster deutlich erhöht werden. Das Problem der Adhäsion ließ sich auch durch die Verwendung von hydrophob beschichteten Petriperm-Schalen nicht lösen. Auch in diesen Kulturgefäßen adhärierten die Zellen recht stark und ließen sich mit oder ohne Abkühlung auf 4°C schlecht aus den Gefäßen entnehmen. Die adhärente Anzüchtung auf Deckgläschen, die in 24-Lochplatten eingelegt waren, zeigte auch keine befriedigenden Ergebnisse, da die meisten Cluster bei der Entnahme der Deckgläschen aus den Kulturschalen abgespült wurden und lediglich einzelne Zellen und nur wenige kleine Cluster zurückblieben. Nach Färbung mit Membranfarbstoffen konnte man erkennen, daß es sich bei einzeln liegenden Zellen um dendritische Zellen handelte, die entweder keine Cluster gebildet hatten oder die von Clustern getrennt worden waren. 3. Ergebnisse 73 Das Problem der mangelnden Haftung der Cluster an den Deckgläschen ließ sich auch durch Zentrifugation der Kulturschalen vor Entnahme der Deckgläschen nicht lösen. Die Handhabung dieser Lösung war sehr unbefriedigend. Die adhärente Anzüchtung auf Anonpore-Membranen brachte ebenfalls keine befriedigenden Ergebnisse. Die Cluster adhärierten auch auf diesem Untergrund schlecht; wie auch bei den Deckgläschen waren nur einzelne dendritische Zellen zu sehen. Darüber hinaus wiesen die Anonpore-Membranen auch eine starke Eigenfluoreszenz auf und ließen sich sehr schlecht handhaben. Ein weiterer Nachteil dieser Methode im Vergleich zu allen anderen war die fehlende Möglichkeit, die Kulturen unter dem Mikroskop beobachten zu können. Die Anzüchtung auf Objektträgern (Chamber Slides) ließ sich hervorragend handhaben, allerdings adhärierten auch auf dieser Unterlage nur wenige Zellen. 3.3.2.2 Verbringung der Zellen auf Objektträger Die Erstellung von Präparaten war nach einer Kulturdauer von 24 Stunden möglich. Die Größe der Cluster lag nach dieser Zeit bei ungefähr 6 Zellen. Die Erstellung von Präparaten wurde mit zunehmender Kulturdauer schwieriger, da die Cluster enorm an Größe zu- und an Stabilität abnahmen. Die Zentrifugation der Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger mittels einer Zytozentrifuge brachte keine guten Ergebnisse, da sich nur einige kleine Cluster isolieren ließen. Die im Kulturmikroskop sichtbaren größeren Cluster gingen vollständig verloren. Die räumliche Struktur wurde weitgehend zerstört. Dieses Problem ließ sich auch durch Verwendung der geringst möglichen Drehzahl der Zytozentrifuge nicht vermeiden. Nach Inkubation der Zellen mit Brefeldin A ließen sich keine Cluster isolieren. Auf den Objektträgern fanden sich dann nur noch einzelne Zellen, welche die typische Morphologie dendritischer Zellen aufwiesen. Die Pipettierung der Cluster auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger und anschließende Sedimentation brachte keine optimalen Ergebnisse, da 3. Ergebnisse 74 insbesondere größere Cluster beim anschließenden Waschen der Objektträger verloren gingen. Die besten Ergebnisse brachte die Kombination beider Methoden. Die Cluster sedimentierten dabei zuerst auf Objektträger auf. Die Objektträger wurden anschließend noch mit 5g für zehn Minuten zentrifugiert. Durch diese Methode wurde auch die räumliche Struktur der Cluster nicht beeinträchtigt. 3.4 Färbung intrazellulärer Zytokine Die Anfärbung intrazellulärer Zytokine wurde mit verschiedenen AntikörperKombinationen vorgenommen. Die Färbungen wurden an Lymphozyten erprobt, die mit PMA-Ionomycin stimuliert und vor der Färbung mit Brefeldin A inkubiert wurden. Die Blockade der Zytokinsekretion war bei Clustern aus dendritischen Zellen und Lymphozyten, wie in Abschnitt 3.3.2.2 dargestellt, nicht durchführbar. Da aus diesen Gründen auf die Anreicherung intrazellulärer Zytokine durch die Verwendung von BFA verzichtet wurde, erwies sich die Anfärbung der nun in geringerer Konzentration vorliegenden intrazellulären Zytokine als problematisch. 3.4.1 Anfärbung von IL-4 Die Anfärbung von intrazellulärem IL-4 erwies sich als schwierig. Die Kombinationen eines monoklonalen Antikörpers und eines entsprechenden Zweitantikörpers (Maus anti-IL-4, Klon 8D4-8 oder Klon 4D9 & Ziege anti-Maus Alexa 488/568/594, bzw. Ratte anti-IL-4, Klon MP4-25D2 & Ziege anti-Ratte Alexa 594) ermöglichte nur unter Verwendung von BFA eine Färbung, ohne BFA ließ sich intrazelluläres IL-4 nicht mehr darstellen. Erst die Anfärbung mit gleichzeitiger Verwendung zweier monoklonaler Erstantikörper und passendem Zweitantikörper (Maus anti-IL-4, Klon 4D9 & Klon 8D4-8 & Ziege anti-Maus Alexa 488/568/594) ermöglichte eine gute Anfärbung ohne Verwendung von BFA. Unter Verwendung eines biotinylierten, polyklonalen Erstantikörpers in Verbindung mit einem Streptavidin-gekoppelten Farbstoff (polyklonal anti-IL-4 & 3. Ergebnisse 75 Neutravidin Alexa 488/Streptavidin Alexa 594) war die Anfärbung von intrazellulärem IL-4 nicht möglich. Ab dem zweiten Kulturtag konnte IL-4 angefärbt werden. Mit zunehmender Kulturdauer nahm die Anfärbbarkeit von IL-4 ab und die unspezifische Fluoreszenz in den Clustern enorm zu, so daß die Beobachtung der Expression von IL-4 mit zunehmender Kulturdauer schwieriger wurde. 3.4.2 Anfärbung von IFN-γ Problemlos erfolgte hingegen die intrazelluläre Anfärbung von IFN-γ unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers und entsprechendem Zweitantikörper (Maus anti-IFN-γ, Klon 45-15, Ziege anti-Maus Alexa 488/568/594) auch ohne BFA. Der Nachweis von IFN-γ in Clustern gelang nicht. 3.4.3 Kontrolle der Zytokinfärbung im FACS Die Messung intrazellulärer Zytokine im FACS im Vergleich zur Untersuchung der Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop erbrachte übereinstimmende Ergebnisse. Bei beiden Methoden war ab dem zweiten Tag IL-4 nachweisbar, IFN-γ wurde nur in sehr geringem Ausmaß oder gar nicht gesehen. 3.5 Morphologie der Cluster 3.5.1 Aufbau der Cluster Unter dem Mikroskop waren nach zwei bis drei Stunden in allen Kulturen kleinere Cluster zu erkennen (Abb. 17 und Abb. 18). Nach acht bis zwölf Stunden waren größere Cluster von sechs bis zehn Zellen sichtbar (Abb. 19). Anhand der Morphologie konnten in Kultur und im Präparat anhand von Färbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen zwei verschiedene Arten von 3. Ergebnisse 76 Clustern identifiziert werden: Cluster, die nur aus Lymphozyten bestanden und Cluster, die aus dendritischen Zellen und Lymphozyten bestanden. Die nur aus Lymphozyten bestehenden Cluster waren in der Regel recht klein. Sie umfaßten meistens nur zwei Zellen. Die aus Lymphozyten und dendritischen Zellen bestehenden Cluster umfaßten nach wenigen Stunden ungefähr vier bis sechs Zellen. Die Cluster nahmen dann mit zunehmender Kulturdauer immer weiter an Größe zu und umfaßten nach sieben Tagen bis zu mehrere Dutzend Zellen (Abb. 20). Diese großen Cluster waren mechanischen Belastungen gegenüber sehr empfindlich und wiesen unter dem Fluoreszenzmikroskop eine sehr starke Autofluoreszenz und unspezifische Antikörperbindung auf. Die Morphologie der Cluster wurde im Rasterelektronenmikroskop untersucht. Dendritische Zellen und Lymphozyten ließen sich anhand ihrer Morphologie unterscheiden. Dendritische Zellen hatten eine recht glatte Oberfläche. Vom Zellkörper aus erstreckten sich viele Fortsätze in die Peripherie. Diese waren entweder sehr lang und fein oder kurz und breitbasig. Die Lymphozyten hatten ebenfalls eine glatte Zelloberfläche. Sie waren jedoch deutlich kleiner als dendritische Zellen und wiesen auch keine Fortsätze auf. Auch im Transmissionselektronenmikroskop waren die Zellen gut zu differenzieren. Die dendritischen Zellen zeigten eine unregelmäßige Oberfläche. Im Zytoplasma waren zahlreiche Mitochondrien und Vakuolen sichtbar. Endoplasmatisches Retikulum und Lysosomen waren schwach ausgeprägt. Der gelappte Zellkern hatte eine unregelmäßige Struktur mit einem breiten Rand aus Heterochromatin und kleinen Nukleoli. Auch hier sah man die beschriebenen Zytoplasmafortsätze. In sehr geringer Zahl fanden sich Zellen mit völlig glatter Oberfläche, die durch ihren gelappten Zellkern als Zellen der myeloischen Reihe identifiziert werden konnten. Die Lymphozyten hatten eine sehr glatte Oberfläche. Der rundliche Zellkern war gelegentlich eingekerbt. Darin war dichtes, grobscholliges Chromatin sichtbar. 3. Ergebnisse 77 Abbildung 17: Cluster in Kultur I Cluster aus einer dendritischen Zelle und mehreren Lymphozyten nach 3 Stunden in Kultur. Die Zellen unterscheiden sich durch ihre Größe (100x). Abbildung 18: Cluster in Kultur II Nach 3 Stunden in Kultur sind kleinere Cluster sichtbar. Dendritische Zellen und Lymphozyten unterscheiden sich durch ihre Morphologie (100x). 3. Ergebnisse Abbildung 19: Cluster in Kultur III Cluster nach 6 Stunden in Kultur. Die Cluster haben eine Größe von sechs bis zehn Zellen (100x). Abbildung 20: Cluster in Kultur IV Nach 7 Tagen in Kultur umfassen die Cluster mehrere Dutzend Zellen (25x). 78 3. Ergebnisse 79 3.5.2 Kontakte zwischen den Zellen Unter dem Raster- und dem Transmissionselektronenmikroskop wurden verschiedene Arten von Kontaktstellen zwischen den Zellen in den Clustern beobachtet (Abb. 21). Zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten waren zwei verschiedene Arten von Kontaktstellen zu erkennen. Zum einen erstreckten sich von den dendritischen Zellen aus Zytoplasmafortsätze unterschiedlicher Morphologie über Entfernungen von bis zu 10µm zwischen den Zellen (Abb.22 bis Abb. 25), zum anderen lagen Lymphozyten den dendritischen Zellen direkt an (Abb. 26 bis Abb. 28). An den Kontakten, die zwischen den Zytoplasmabrücken und Lymphozyten gebildet wurden, betrug der Abstand zwischen den parallelen Zellmembranen etwa 20 nm (Abb. 29 und Abb. 30). Die direkten Kontakte zwischen den Zellen bildeten zwei verschiedene Bereiche aus, die aneinander angrenzten: In dem einem lagen die Zellmembranen in einem Abstand von ca. 20nm parallel zueinander, in dem anderen in einem Abstand von etwa 80-100nm (Abb. 31 bis Abb. 35). Die Kontaktstellen zwischen den dendritischen Zellen zeigten sich als dichtes Konglomerat von Zytoplasmafortsätzen sehr unterschiedlichen Aussehens. An den Kontaktstellen befanden sich die Membranen in einem Abstand von etwa 20nm parallel zueinander. Die Zellen lagen einander nicht direkt an (Abb. 36 bis Abb. 41). Lymphozyten bildeten grundsätzlich breite Kontaktstellen aus und lagen direkt aneinander an (Abb. 42 und Abb. 43). 3. Ergebnisse 80 Abbildung 21: Kontakte zwischen Zellen I Rasterelektronenmikroskopische Darstellung eines Clusters nach 48 Stunden in Kultur. Die Kontakte zwischen den Zellen sind klar zu erkennen. Lymphozyten liegen entweder direkt an dendritischen Zellen oder sind über Zytoplasmafortsätze mit diesen verbunden. Die dendritischen Zellen nehmen über Zytoplasmafortsätze miteinander Kontakt auf. Lymphozyten haben direkte Kontaktstellen miteinander und sind dabei zum Teil an dendritische Zellen gebunden (1.404x). 3. Ergebnisse 81 Abbildung 22: Kontakte zwischen Zellen II Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten. Von einer dendritischen Zelle aus erstrecken sich Zellfortsätze in Richtung eines Lymphozyten (Rasterelektronenmikroskop, 3.959x). Abbildung 23: Kontakte zwischen Zellen III Ein Zellfortsatz einer dendritischen Zelle bei der Kontaktaufnahme mit einem Lymphozyten (Transmissionselektronenmikroskop, 12.000x). 3. Ergebnisse Abbildung 24: Kontakte zwischen Zellen IV Verbindung zwischen einer dendritischen Zelle und einem Lymphozyten über mehrere Zytoplasmafortsätze (Rasterelektronenmikroskop, 4.670x). Abbildung 25: Kontakte zwischen Zellen V Eine dendritische Zelle bei der Kontaktaufnahme mit einem Lymphozyten (Transmissionselektronenmikroskop, 4.400x). 82 3. Ergebnisse 83 Abbildung 26: Kontakte zwischen Zellen VI Kontakt zwischen einem Lymphozyten und einer dendritischen Zelle. Die beiden Zellen sind durch mehrere kurze Zellausläufer miteinander verbunden. Der Lymphozyt beginnt, sich auf die dendritische Zelle auszurichten (Rasterelektronenmikroskop, 5.000 x). Abbildung 27: Kontakte zwischen Zellen VII Kontakt zwischen einer dendritischen Zelle und einem Lymphozyten über kurze Zytoplasmafortsätze. Der Lymphozyt ist noch nicht auf die dendritische Zelle ausgerichtet (Transmissionselektronenmikroskop, 12.000x). 3. Ergebnisse Abbildung 28: Kontakte zwischen Zellen VIII Direkter Kontakt zwischen einem Lymphozyten und einer dendritischen Zelle. Der Lymphozyt hat einen schmalen Zytoplasmasaum auf die dendritische Zelle ausgerichtet (Transmissionselektronenmikroskop, 7.000x). 84 3. Ergebnisse 85 Abbildung 29: Kontakte zwischen Zellen IX Auch bei stärkerer Vergrößerung ist an den Kontaktstellen im Rasterelektronenmikroskop kein synaptischer Spalt erkennbar. Es ist nicht klar zu erkennen, von welcher Zelle der Kontakt ausgeht (10.000x). Abbildung 30: Kontakte zwischen Zellen X Im Transmissionselektronenmikroskop ist bei extremer Vergrößerung ein synaptischer Spalt erkennbar. Die Membranen liegen im Abstand von 20nm parallel zueinander. Zwischen beiden Membranen ist eine dichtere Zone erkennbar, welche die Kontakte verschiedener Adhäsionsmoleküle darstellen könnte (250.000x). 3. Ergebnisse 86 Abbildung 31: Kontakte zwischen Zellen XI Die Kontaktstelle bei höchster Auflösung. Die Membranen liegen im Abstand von 20nm parallel zueinander. Zwischen den Membranen ist eine Verdichtung zu erkennen, die auf die Ansammlung von Adhäsionsmolekülen hinweisen könnte (Transmissionselektronenmikroskop, 250.000x). Abbildung 32: Kontakte zwischen Zellen XII Im Randbereich der Kontaktstelle weichen die Membranen auseinander und liegen dann im Abstand von etwa 80-100nm parallel (Transmissionselektronenmikroskop, 250.000x). 3. Ergebnisse Abbildung 33: Kontakte zwischen Zellen XIII Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer „immunologischen Synapse“. Ein Lymphozyt liegt direkt an einer dendritischen Zelle an (5.000x). Abbildung 34: Kontakte zwischen Zellen XIV Die „immunologische Synapse“. Der Lymphozyt hat sich auf die dendritische Zelle ausgerichtet (Transmissionselektronenmikroskop, 7.000x). 87 3. Ergebnisse Abbildung 35: Kontakte zwischen Zellen XV Ein Lymphozyt in einem größeren Cluster. Der Lymphozyt liegt direkt an einer dendritischen Zelle an, die ihrerseits Kontaktstellen zu anderen Zellen hat. Eine weitere dendritische Zelle bildet einen Zellausläufer in Richtung des Lymphozyten aus (Rasterelektronenmikroskop, 5.000x). 88 3. Ergebnisse Abbildung 36: Kontakte zwischen Zellen XVI Kontakte zwischen dendritischen Zellen. Die Zellen stehen über Zellausläufer verschiedenen Kalibers miteinander in Verbindung. Direkte Kontakte kommen nicht vor (Rasterelektronenmikroskop, 2.000x). Abbildung 37: Kontakte zwischen Zellen XVII Multiple Kontakte zwischen dendritischen Zellen. Die Zellen sind jeweils mit mehreren anderen Zellen in Kontakt (Rasterelektronenmikroskop, 3.943x). 89 3. Ergebnisse Abbildung 38: Kontakte zwischen Zellen XVIII Dendritische Zellen stehen über Zellausläufer unterschiedlichster Morphologie miteinander in Kontakt (Transmissionselektronenmikroskop, 7.000x). Abbildung 39: Kontakte zwischen Zellen XIX Kontakte zwischen dendritischen Zellen bei starker Vergrößerung. Die Zellmembranen liegen im Abstand von ungefähr 20nm parallel zueinander (Transmissionselektronenmikroskop, 250.000x). 90 3. Ergebnisse 91 Abbildung 40: Kontakte zwischen Zellen XX Dendritische Zellen bilden zu allen Seiten Fortsätze aus, um mit anderen Zellen in Kontakt zu treten (Transmissionselektronenmikroskop, 3.000x). Abbildung 41: Kontakte zwischen Zellen XXI Die Kontaktstellen zwischen dendritischen Zellen weisen nur eine einzige Domäne auf. Die Zellmembranen liegen immer im Abstand von ungefähr 20nm parallel zueinander (Transmissionselektronenmikroskop, 250.000x). 3. Ergebnisse 92 Abbildung 42: Kontakte zwischen Zellen XXII Lymphozyten bilden untereinander breite Kontaktzonen aus. Die Zellen stehen außerdem noch in Kontakt zu einer dendritischen Zelle (Rasterelektronenmikroskop, 5.000x). Abbildung 43: Kontakte zwischen Zellen XXIII Drei miteinander in Kontakt stehende Lymphozyten. Zwei der Zellen sind darüber hinaus an eine Antigen-präsentierende Zelle gebunden (Rasterelektronenmikroskop, 5.000x). 3. Ergebnisse 93 3.5.3 Verteilung der Zytokine innerhalb der Zellen und der Cluster Die Identifizierung Zytokin-produzierender Zellen wurde durch die charakteristische Verteilung der intrazellulären Zytokine stark vereinfacht. Die hier untersuchten Zytokine zeigten entweder eine perinukleäre, lokale Immunfluoreszenz oder eine schwächere, ring- oder streifenförmige Anordnung der Färbung. Die Zytokinsekretion erfolgte stets gerichtet an eine benachbarte Zelle (Abb. 44). In den Clustern fanden sich unterschiedliche Muster der Zytokinabgabe: In Clustern, die aus dendritischen Zellen und Lymphozyten bestanden, wurden die Zytokine von einem Lymphozyten entweder (1) in Richtung einer anliegenden dendritischen Zelle (Abb.45), (2) von einem Lymphozyten, der einer dendritischen Zelle anlag, zu einem benachbarten Lymphozyten, welcher der dendritischen Zelle nicht anlag (Abb. 46) oder (3) von einem Lymphozyten, der einer dendritischen Zelle anlag, zu einem benachbarten Lymphozyten, welcher der dendritischen Zelle ebenfalls anlag (Abb. 47 und Abb. 48), sezerniert. In Clustern, die nur aus Lymphozyten bestanden, wurden die Zytokine in Richtung eines benachbarten Lymphozyten abgegeben (Abb. 49). 3.6 Subpopulationen dendritischer Zellen 3.6.1 Entwicklung der Subpopulationen in Kultur CD34+ Stammzellen wurden nach Isolation aus Nabelschnurblut 14 Tage lang mit rekombinanten Zytokinen kultiviert. Die Oberflächenstrukturen veränderten sich dabei. Anhand der Expression von CD1a und CD14 ließen sich vier verschiedene Subpopulationen unterscheiden, deren jeweiliger Anteil an der Gesamtzahl der Zellen sich im Laufe der Kultur veränderte. In jeder Subpopulation exprimierte ein Teil der Zellen den Oberflächenmarker CLA. 3. Ergebnisse Abbildung 44: Zytokinsekretion I Cluster aus einer Ko-Kultur im Fluoreszenzmikroskop. IL-4 wurde mit monoklonalen Antikörpern angefärbt. Die Sekretion erfolgt gerichtet zu einer benachbarten Zelle (250x). Abbildung 45: Zytokinsekretion II Zwei Lymphozyten (A und B) sezernieren IL-4 (grün gefärbt) in Richtung einer dendritischen Zelle (C). Die dendritische Zelle wurde mit DiL angefärbt, das sowohl im roten als auch im grünen Fluoreszenzbereich emittiert und so die gelbliche Fluoreszenz erzeugt (250x). 94 3. Ergebnisse Abbildung 46: Zytokinsekretion III Ein Cluster aus Lymphozyten (mit DiO grün angefärbt) und dendritischen Zellen. Die dendritischen Zellen liegen eher im Randbereich. IL-4 (rot angefärbt) wird im Zentrum des Clusters ausgeschüttet. Ein Teil der Zytokin-produzierenden Zellen hat Kontakt zu dendritischen Zellen (250x). Abbildung 47: Zytokinsekretion IV Ein Lymphozyt (A) sezerniert IL-4 (grün angefärbt) in Richtung eines anderen Lymphozyten (B). Beide Zellen liegen einer dendritischen Zelle (C) an, die mit DiL rot angefärbt wurde (250x). 95 3. Ergebnisse Abbildung 48: Zytokinsekretion V Einer dendritischen Zelle (A), die mit CFSE grün angefärbt wurde, liegt mit großer Kontaktfläche ein Lymphozyt (B) an. Die Zytokinsekretion (IL-4, rot angefärbt) erfolgt in Richtung eines anderen Lymphozyten (C), der ebenfalls Kontakt zu der dendritischen Zelle hat (250x). Abbildung 49: Zytokinsekretion VI Ein aus zwei Lymphozyten bestehender Cluster. Die Zellmembranen sind mit DiO grün angefärbt. Im Golgi-Apparat ist intrazelluläres IL-4 (rot) zu erkennen (250x). 96 3. Ergebnisse 97 Die CD1a-/CD14- Population nahm im Verlauf ab, wohingegen der Anteil der CD1a+/CD14+ Zellen stetig zunahm. Die Expression von CD1a stieg ab dem neunten Tag der Kultur an, um ab dem zwölften Tag wieder abzufallen. CD14 zeigte eine gegensätzliche Kinetik. Die Expression von CD14 nahm vom siebten bis zum elften Tag in Kultur ab, um danach wieder anzusteigen. Die dendritischen Zellen wiesen in der Kultur noch keine festgelegte Prägung der Oberflächenmarker auf (Abb. 50 bis Abb. 55). 3.6.2 Isolation der Subpopulationen Aus der Gesamtheit dendritischer Zellen, die aus CD34+ Stammzellen angezüchtet wurden, wurden an Tag 5 und Tag 10 der Kultur zwei Subpopulationen mit Hilfe des autoMACS isoliert. Die Isolation der CLA+ dendritischen Zellen fand an Tag 10 statt, da hier ihr Anteil in der Kultur am höchsten war. Die CD1a+ dendritischen Zellen wurden an Tag 5 isoliert, da zu diesem Zeitpunkt die Zellen in Kultur noch eindeutig in CD1a+/CD14- oder CD1a-/CD14+ differenziert sind13. Die Reinheit der Sortierungen wurde im FACS kontrolliert. Der Anteil der CD1a+ Zellen lag bei >95%, derjenige der CLA+ Zellen bei >90%. Die Subpopulationen wurden im Transmissionselektronenmikroskop untersucht. Die CD1a+ dendritischen Zellen zeigten eine unregelmäßige Oberfläche. Im Zytoplasma waren zahlreiche Mitochondrien und viele Vakuolen zu sehen. Endoplasmatisches Retikulum und Lysosomen waren schwach ausgeprägt. Auch hier waren die entweder langen und dünnen oder kurzen und breitbasigen Zytoplasmafortsätze sichtbar. Die dendritischen Zellen zeigten einen gelappten Kern mit unregelmäßiger Struktur und einem breiten Rand aus Heterochromatin und kleinen Nukleoli. In einem Teil der Zellen waren Birbeck-Granula in stäbchen- oder tennisschlägerartiger Form und lamelläre Körperchen zu sehen. Die CLA+ dendritischen Zellen wiesen die typische Morphologie von LangerhansZellen auf. Die Zellen hatten eine rundliche Form mit einem exzentrisch gelegenen Nucleus. Im Zytoplasma lagen lamelläre Körperchen und BirbeckGranula in der beschriebenen Form (Abb. 56 bis Abb. 58). 3. Ergebnisse 98 Abbildung 50: Subpopulationen dendritischer Zellen im FACS Im Durchflußzytometer gemessene Subpopulationen dendritischer Zellen. Mit Hilfe der Vorwärts- (FSC) und der Seitwärts-Lichtbrechung (SSC) wurde zunächst eine Region für vitale Zellen gelegt (links). Für diese Region wurden die mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gegen CD1a und CD14 gefärbten Zellen dargestellt (rechts). 15 CLA 10 % 5 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tag Abbildung 51: Expression von CLA in Kultur Ein Teil der dendritischen Zellen exprimierte den Oberflächenmarker CLA. Der Anteil der CLA+ Zellen war an Tag 10 der Kultur am höchsten. 99 3. Ergebnisse 40 CD1a+ CD1a+CLA+ % 30 20 10 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tag Abbildung 52: Anteil CD1a+ und CD1a+/CLA+ Zellen in der Kultur Kinetik der Expression von CD1a in Kultur. Ein Teil der Zellen trägt außerdem den Oberflächenmarker CLA. Die CD1a+/CLA+ Kurve stellt den Anteil der CD1a+ Zellen an der CLA+ Population dar. 50 CD14 CD14+CLA+ % 40 30 20 10 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tag Abbildung 53: Anteil CD14+ und CD14+/CLA+ Zellen in der Kultur Kinetik der Expression von CD14. Ein Teil der Zellen exprimiert CLA. Die CD14+/CLA+ Kurve stellt den Anteil der CD14+ Zellen an der CLA+ Population dar. 100 3. Ergebnisse 75 CD1a-CD14CD1a-CD14-CLA+ % 50 25 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tag Abbildung 54: Anteil CD1a-/CD14- und CD1a-/CD14-/CLA+ Zellen in der Kultur Der Anteil der CD1a-/CD14- Zellen in der Kultur nimmt im Laufe der Zeit ab. CLA kann auf einem Teil der Zellen angefärbt werden. Die CD1a-/CD14-/CLA+ Kurve stellt den Anteil der CD1a-/CD14- Zellen an der CLA+ Population dar. 40 CD1a+CD14a+ CD1a+CD14+CLA+ % 30 20 10 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tag Abbildung 55: Anteil CD1a+/CD14+ und CD1a+/CD14+/CLA+ Zellen in der Kultur Der Anteil der CD1a+/CD14+ Zellen in der Kultur wächst beständig an. Zum Teil exprimieren diese Zellen CLA. Die CD1a+/CD14+/CLA+ Kurve stellt den Anteil der CD1a+/CD14+ Zellen an der CLA+ Population dar. 3. Ergebnisse 101 Abbildung 56: Langerhans-Zelle I Elektronenmikroskopische Darstellung einer Langerhans-Zelle. Die Zelle weist eine unregelmäßige Oberfläche auf. Im Zytoplasma sind zahlreiche Mitochondrien und viele Vakuolen zu sehen. Endoplasmatisches Retikulum und Lysosomen sind schwach ausgeprägt (Transmissionselektronenmikroskop, 7.000x). 3. Ergebnisse 102 Abbildung 57: Langerhans-Zelle II Eine Langerhans-Zelle bei starker Vergrößerung. Im Zytoplasma erkennt man Birbeck-Granula in stäbchenartiger Form (Transmissionselektronenmikroskop, 85.000x). Abbildung 58: Langerhans-Zelle III Eine Langerhans-Zelle bei starker Vergrößerung. Im Zytoplasma erkennt man Birbeck-Granula in tennisschlägerartiger Form (Transmissionselektronenmikroskop, 85.000x). 3. Ergebnisse 103 3.7 Einflüsse von Brefeldin A Im Gegensatz zu Lymphozyten, die mit PHA stimuliert und mit Brefeldin A inkubiert wurden, ließen sich aus mit Brefeldin A inkubierten Ko-Kulturen (dendritische Zellen und Lymphozyten) keine verwertbaren Präparate erstellen. Auch nach kürzester Inkubation mit BFA (eine Stunde) erwiesen sich die aus dendritischen Zellen und Lymphozyten gebildeten Cluster als sehr instabil. Aus nicht mit BFA inkubierten Ko-Kulturen, die mit DiL und DiO angefärbt worden waren, konnten regelmäßig Zytozentrifugen-Präparate angefertigt werden, auf denen zumindest einige kleine Cluster zu sehen waren. Nach Inkubation dieser Zellen mit BFA (Inkubationszeiten achtzehn, zehn, fünf und eine Stunde) gelang dies nur einmal. In Kultur konnte nach achtzehnstündiger Inkubation einer Ko-Kultur aus dendritischen Zellen und Lymphozyten mit BFA eine Verminderung der Anzahl der Cluster gesehen werden, die in einer parallel angesetzten Kultur, die nicht mit BFA inkubiert worden war, nicht zu beobachten war. Eine Validierung dieser Beobachtung wurde durch die Messung der Clusterbildung im FACS versucht. Nach dieser Messung bildeten die mit Brefeldin A inkubierten Ko-Kulturen mehr Cluster als die nicht inkubierten (4-5% zu 2-3,5%). In Zellen, die mit Brefeldin A inkubiert worden waren, ließen sich verschiedene Zytokine problemlos anfärben. IL-4 wies dabei die schwächste Färbung auf. Bei Verzicht auf BFA ließ sich IL-4, wie in Abschnitt 3.4.1 beschrieben, nur noch mit aufwendigen Methoden anfärben. Die Auswirkungen von BFA auf das Verteilungsmuster intrazellulärer Zytokine wurde zuvor im Abschnitt 3.1.2.3 beschrieben. 4. Diskussion 104 4. Diskussion Lymphozyten werden an Kontaktstellen mit Antigen-präsentierenden Zellen aktiviert, die man als „immunologische Synapse“ bezeichnet. Die Aktivierung naiver Lymphozyten erfordert die Interaktion mit dendritischen Zellen, die als einzige Antigen-präsentierende Zellen naive Lymphozyten stimulieren und polarisieren können. Die Grundlagen zur Erforschung der „immunologische Synapse“ wurden an einem etablierten humanen in-vitro System, der gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) untersucht. Ko-Kulturen aus dendritischen Zellen und allogenen naiven Lymphozyten wurden auf Kinetik und Aufbau der Cluster, Kontaktstellen und Zytokinproduktion untersucht, nachdem in Vorversuchen die Eignung verschiedener Färbungen, Fixierungen, Permeabilisierungen und Methoden zur Isolation der Cluster überprüft wurden. Um selektive Ko-Kulturen mit verschiedenen Subpopulationen dendritischer Zellen anlegen zu können, wurde die Entwicklung der Zellen in Kultur verfolgt, einige Subpopulationen wurden separiert. 4.1 Fixierung und Permeabilisierung Die intrazelluläre Anfärbung von Antigenen erfordert die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen, um die Antigene zu stabilisieren und das Eindringen der Antikörper in Zelle, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat und Nucleus zu ermöglichen. Die Fixation mit Paraformaldehyd mit nachfolgender Permeabilisierung mit Saponin, die Standardmethode zur Messung intrazellulärer Zytokine im Durchflußzytometer, ist nur für T-Zellen und Monozyten optimiert104. In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch die morphologische Darstellung von Clustern aus dendritischen Zellen und Lymphozyten gefordert, was die Evaluierung verschiedener Fixantien und Detergentien ratsam erscheinen ließ. 4. Diskussion 105 4.1.1 Fixierung Die Fixierung stabilisiert Antigene und verankert sie innerhalb der Zelle, so daß Antigenverluste durch die Permeabilisierung auf ein Minimum reduziert werden. Ein ideales Fixierungsmittel sollte zu möglichst geringer Eigenfluoreszenz führen, die Eigenschaften der zu untersuchenden Antigene und die Form der Zellen aber nicht verändern. Zur Fixierung eignen sich alle Chemikalien, die Gewebe oder Zellen konservieren und dabei die Strukturen möglichst gut erhalten. Es werden zwei Gruppen von Fixierungsmitteln unterschieden: Quervernetzende und koagulierende Fixierungsmittel. Zu den quervernetzenden Fixierungsmitteln gehören Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd. Die sich bei der Fixierung abspielenden chemischen Vorgänge sind weitgehend unklar. Bekannt ist jedoch, daß es zu einer Vernetzung der Aminogruppen der Zellproteine kommt. Zu den koagulierenden Fixierungsmitteln gehören Aceton und Ethanol-Eisessig. Sie denaturieren Proteine und permeabilisieren die Zellen durch die Extraktion von Phospholipiden aus der Zellmembran. Auch bei den koagulierenden Fixierungsmitteln kommt es zu einer schwachen Quervernetzung. Da jede Fixierung einen chemischen oder physikochemischen Eingriff in die Zellstruktur darstellt, werden die zu färbenden Antigene durch die verschiedenen Fixierungsmittel in ihren Eigenschaften unterschiedlich stark beeinflußt. Alle evaluierten Fixantien sind von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben und auf ihre Kompatibilität mit immunhistochemischen Methoden zum Nachweis membranärer und intrazytoplasmatischer Antigene untersucht worden. Die Einschätzungen der Eignung der verschiedenen Chemikalien wichen dabei erheblich voneinander ab. Suthipintawong und Mitarbeiter105 beschrieben eine gute Immunoreaktivität nach Fixierung mit Aceton oder Formaldehyd, jedoch eine mangelhafte Eignung von Glutaraldehyd. Dinges und Mitarbeiter106 bewerteten Glutaraldehyd und Aceton als geeignete Fixierungen, Formaldehyd, Paraformaldehyd und Ethanol-Eisessig dagegen als ungeeignet. 4. Diskussion 106 Sander und Mitarbeiter107 benutzten zum Nachweis intrazellulärer Zytokine und membranärer Antigene eine Fixation mit Paraformaldehyd. Immunfärbungen von Oberflächenmarkern und Zytokinen waren nach Fixation mit Paraformaldehyd, Formaldehyd und Aceton weitgehend möglich. CD4 Oberflächenmarker konnten nur nach Fixierung mit Aceton problemlos angefärbt werden, Paraformaldehyd und Formaldehyd verringerten die Anfärbbarkeit bereits. Diese Effekte konnten durch Anfärbung der entsprechenden Oberflächenmarker vor der Fixierung umgangen werden. Eine Methode, die für viele Oberflächenmarker von Walker und Mitarbeitern108 und Jason und Larned109 beschrieben wurde. Kommerziell verfügbares Formaldehyd besteht in der Regel aus einer 37%igen wäßrigen Lösung, der zur Stabilisierung ungefähr 10% Methanol110 zugesetzt werden. Der pH dieser Lösung kann im sauren Bereich liegen. Da sich Formaldehyd durch Oxidation zu Ameisensäure und durch Reduktion zu Methanol umwandelt, wird es zur Färbung empfindlicher Präparate frisch durch Erhitzen aus Paraformaldehyd hergestellt111. Eine Überlegenheit des Paraformaldehyd in Bezug auf die untersuchten Antigene war jedoch nicht vorhanden. Aceton ermöglichte zwar die Anfärbung aller gewünschten Antigene, beeinträchtigte jedoch durch die Zerstörung des Golgi-Apparates und eine Verschiebung der Organellen in Diffusionsrichtung bei der Fixation die Morphologie112. Die Elimination der Fluoreszenz von DiO und DiL war ebenfalls sehr störend. Nach Fixation mit Glutaraldehyd und Ethanol-Eisessig waren Immunfärbungen nicht mehr möglich. Die Fixierung mit Glutaraldehyd zog außerdem eine sehr starke Autofluoreszenz nach sich. Das Dialdehyd Glutaraldehyd dringt nur langsam in Gewebe ein und führt zu einer sehr starken Quervernetzung. Diese erhält die Morphologie sehr gut, kann jedoch zur Maskierung von Epitopen führen113. Ethanol-Eisessig zerstört die Morphologie der Zellen. Auch hier kommt es zu einer Auflösung des Golgi-Apparates112. Das eigentliche Fixierungsmittel ist das Ethanol, der Eisessig wird aufgrund seiner guten Gewebegängigkeit als Vorfixierung benutzt113. 4. Diskussion 107 Die Fixation mit Glutaraldehyd-Formaldehyd ließ Immunfärbungen nur eingeschränkt zu und brachte ebenfalls eine starke Autofluoreszenz hervor, welche die schwachen Färbungen beeinträchtigte. Die Kombination dieser beiden Fixantien, welche die stärkere Vernetzung des Glutaraldehyd mit dem guten Durchdringungsvermögen des Formaldehyd kombiniert, führt zu einer sehr guten Konservierung der Morphologie. Durch die geringe Konzentration des Glutaraldehyds in der Fixierungslösung ist die Quervernetzung geringer und somit eine Immunfärbung möglich113. Auch nach Kombination der Glutaraldehyd und Glutaraldehyd-Formaldehyd Fixierungen mit Natrium-Borhydrat ließen sich intrazelluläre Zytokine und Oberflächenmarker nur schlecht oder gar nicht anfärben, obwohl die Autofluoreszenz Anfärbbarkeit der Zellen deutlich zytoplasmatischer herabgesetzt Strukturen, die wurde. durch Glutaraldehyd-induzierten Schiff‘schen Basen erfolgen soll 114 Die bessere Reduktion von , ließ sich nicht auf die hier anzufärbenden Zytokine übertragen. Darüber hinaus wurde auch die Fluoreszenz von DiO und DiL durch die Verwendung von Natrium-Borhydrat und Ethanol-Eisessig eliminiert; mit CFSE gefärbte Zellen blieben unbeeinträchtigt. Die im Durchflußzytometer bestimmten Lichtbrechungs-Eigenschaften menschlicher dendritischer Zellen zeigten, daß diese in ihrer Struktur durch Glutaraldehyd-Formaldehyd und Paraformaldehyd auf schwachem Niveau ungefähr gleich stark beeinträchtigt wurden. Die Fixierung der Zellen mit einer kommerziellen Formaldehydlösung oder Glutaraldehyd führte zu einer stärkeren Veränderung der LichtbrechungsEigenschaften bei stimulierten dendritischen Zellen, während die Struktur unstimulierter Zellen weitgehend erhalten blieb. Die Lichtbrechungs- Eigenschaften nach Fixierung mit Glutaraldehyd ließen sich durch die Verwendung von Natrium-Borhydrat noch leicht verbessern. Aceton und Ethanol-Eisessig Lichtbrechungs-Eigenschaften. führten zu extremen Veränderungen der 4. Diskussion 108 Für die elektronenmikroskopischen Präparate wurde Karnovsky115-Pikrinsäure verwendet, ein Gemisch aus Glutaraldehyd, Formaldehyd und Pikrinsäure. Die vorteilhaften Eigenschaften eines Glutaraldehyd-Formaldehyd Gemisches zur morphologischen Darstellung wurden bereits beschrieben. Pikrinsäure ist als Zusatz zu Fixierungslösungen gebräuchlich und fällt Proteine aus113. 4.1.2 Permeabilisierung Durch Permeabilisierung der Zellen mit Saponin erreicht man eine Anfärbbarkeit von membranären Proteinen und intrazellulären Proteinen und Zytokinen, die nach Verwendung von Detergentien wie Triton X-100 oder NP-40 nicht erreicht wird. Auch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln wie Aceton oder Ethanol allein oder in Kombination mit den genannten Detergentien führt nicht zu vergleichbaren Ergebnissen. Dies könnte daran liegen, daß die zu färbenden Antigene in ihrer Struktur durch die verwendeten Lösungsmittel und Detergentien verändert oder gelöst und aus der Zelle ausgewaschen werden116. Saponin weist eine hohe Affinität zu Cholesterin auf. Es handelt sich dabei um ein pflanzliches Glykosid aus der Rinde des Quillaja-Baumes, das aus einem an eine hydrophile Kohlenhydratkette angehängten Steroid oder Triterpen besteht117. Da Saponin hauptsächlich mit Cholesterol interagiert, bleibt die Struktur der Zellen in der lichtmikroskopischen Betrachtung und im Durchflußzytometer weitgehend intakt. Die Expression der meisten Oberflächenmarker wird nicht verändert118. Wenn Zellen, die mit 4% PFA fixiert und mit 0,1% Saponin permeabilisiert wurden, mit Antikörpern in einer Lösung ohne Zusatz von Saponin inkubiert werden, scheinen die Zellmembranen für die Antikörper undurchlässig zu sein107,116,124. Es wird angenommen, daß Saponin in die Zellmembranen anstelle von Cholesterin eingefügt wird und die Zellen auf reversible Art permeabilisiert116. Dies ist wahrscheinlich auch der Grund dafür, daß sich nach Permeabilisierung mit Saponin in Mitochondrien und Nuclei liegende Antigene nicht anfärben lassen, da die Membranen dieser Strukturen sehr cholesterinarm sind (0% bzw. 5%). In cholesterinreichen Plasmamembranen konnten nach Behandlung mit Saponin im Elektronenmikroskop ringförmige Komplexe nachgewiesen werden117,119,120,121, in deren Zentrum eine Pore von ungefähr 8nm Durchmesser 4. Diskussion 109 vermutet wird122. Da allerdings auch größere Moleküle wie Ferritin (12nm) in mit 0,4% Glutaraldehyd und 0,15% Saponin fixierte und permeabilisierte Knochenmarkszellen eindringen können123, sind auch größere Poren nach einer Permeabilisierung mit Saponin zu vermuten. Der durch die Behandlung mit Saponin erzielte Grad der Permeabilität wird durch die Art der Fixation wesentlich mitbestimmt. Insbesondere der Zugang zu intrazellulären Räumen wie endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat ist von der verwendeten Fixierung abhängig114,123,124. Die nichtionischen Detergentien NP-40 [PEG(9)p-t-octylphenol] und Triton X100 [PEG(9-10)p-t-octylphenol] sind relativ milde in ihrer Wirkung und denaturieren Proteine normalerweise nicht125,126. Die Lichtbrechungseigenschaften und die Membranstrukturen auf ultrastruktureller Ebene werden durch die Verwendung von Triton X-100 jedoch stärker verändert als durch Saponin123,127,128 und auch einige intrazelluläre Proteine (lysosomale Membran-Glykoproteine und intramembranäre Proteine) sind nach Behandlung der Zellen mit Triton X-100 anstatt von Saponin schlechter oder überhaupt nicht darstellbar129. NP-40 und Triton X-100 sind zur Darstellung membranärer Proteine ungeeignet, da sie LipidLipid und Protein-Lipid Verbindungen aufspalten130 und offenbar auch nach Fixation noch zum Verlust der entsprechenden Antigene führen. Vorteile bietet Triton X-100 allerdings bei der Anfärbung intranukleärer Strukturen und bei der Permeabilisierung von Membranen, die sehr cholesterinarm sind, wie z.B. mitochondriale Membranen (0%) und Kernmembranen (5%). Warum die Interleukine und Oberflächenmarker nach einer Permeabilisierung der Zellen mit Triton X-100 oder NP-40 nicht dargestellt werden konnten, ist unklar. Es besteht die Möglichkeit, daß sie nach einer Behandlung der Zellen mit den genannten Detergentien aus den Zellen ausgewaschen werden, da die durch Paraformaldehyd oder Formaldehyd erreichte Quervernetzung nicht ausreicht, um die Antigene an Ort und Stelle festzuhalten. Dafür spricht die Abnahme der spezifischen Fluoreszenz bei Verwendung von Triton und NP-40 in höheren Konzentrationen (0,5% statt 0,1%) ohne Zunahme der unspezifischen Fluoreszenz. Eine andere Möglichkeit wäre, daß Triton X-100 und NP-40 die Antikörperbindenden Strukturen der entsprechenden Antigene verändern. Da jedoch sowohl die Verwendung von Aceton und Triton X-100 zur Anfärbung von IFN-γ131 als 4. Diskussion 110 auch auf Antigen-Antikörper-Reaktionen basierende Immunpräzipitationen der Membranantigene unter Verwendung von NP-40 Triton X-100 beschrieben sind132, ist dies unwahrscheinlich. Ebenfalls dagegen spricht, daß Abraham Kupfer und Mitarbeiter in Zellen aus der Maus nach Fixierung mit Paraformaldehyd und Permeabilisierung mit Triton X100 sowohl membranäre Antigene als auch IL-4 anfärben46,56. Diese Methode ist jedoch nicht zwingend auf humane Zellen übertragbar, da murine Zellen generell anders permeabilisiert werden als humane Zellen148. 4.3 Brefeldin A Zur Anfärbung intrazellulärer Zytokine wurden die kultivierten Zellen 18 Stunden vor dem Ernten mit Brefeldin A in einer Konzentration von 10µg/ml inkubiert, um die Zytokine in den Zellen anzureichern und so einer Färbung zugänglich zu machen. BFA ist ein makrozyklisches Lacton, das in einer Reihe von Pilzen aus Palmitat synthetisiert wird133 und in damit behandelten Zellen die Proteinsekretion in einem frühen Schritt hemmt. Der Block liegt im prä-Golgi Kompartiment, wie die Ansammlung von Membranproteinen und sekretorischen Proteinen im endoplasmatischen Retikulum zeigt, die sowohl im Elektronen- als auch im Immunfluoreszenzmikroskop nachgewiesen wurde134,135,136. Der Transport zwischen den einzelnen Golgi-Zisternen und dem endoplasmatischen Retikulum wird von nicht Clathrin-beschichteten Vesikeln durchgeführt, deren Formation von der Rekrutierung zytosolischer Proteine, den Coatomeren abhängt. Dieser Schritt wird durch BFA verhindert137,138. Sobald keine Vesikel mehr gebildet werden, beginnt der Golgi-Apparat sich in tubulärer Form entlang der Mikrotubuli zu erstrecken und mit dem endoplasmatischen Retikulum zu verschmelzen. Schon nach 10 Minuten Inkubation mit BFA bei 37°C ist der Golgi-Apparat nicht mehr zu erkennen. Enzyme, die normalerweise im Golgi-Apparat zu finden sind, werden im endoplasmatischen Retikulum verteilt. Ein Transport von Proteinen aus diesem neuen Organelle heraus findet nicht mehr statt135, die Ausschüttung von Zytokinen wird unterbunden139,140. Die immunfluoreszenzmikroskopische Darstellung von Zytokinen in Zellen, die mit BFA inkubiert worden waren, ergab ein vollständig anderes Verteilungsmuster als 4. Diskussion 111 in Zellen, die nicht mit BFA inkubiert worden waren. Für die Darstellung von Clustern unter besonderer Berücksichtigung der Morphologie ist BFA somit nicht geeignet. Die Beobachtung, daß die Cluster unter dem Einfluß von BFA instabil werden, ließ sich nicht validieren. Zwar wurde die Messung der Zelladhäsion nach dem Protokoll von Gant, Shakoor und Hamblin103 durchgeführt, brachte allerdings das Ergebnis hervor, daß Cluster nach Inkubation mit BFA geringfügig stabiler sind als ohne BFA. Allerdings stellt sich hier die Frage, ob man die Clusterung von Zellen in Kultur überhaupt mit einem FACScan messen kann, das für die Untersuchung einzelner Zellen gedacht ist. Die Kapillare, in der die Messung stattfindet, ist für die meisten der unter dem Kulturmikroskop sichtbaren Cluster groß genug (ca. 19mm x 0,2mm); jedoch dürften Zellen, die durch die Breite des Clusters an die Wände der Kapillare gedrückt werden, nicht mehr im Strahlengang des Lasers liegen und somit einer Beobachtung unzugänglich sein. Da die Cluster in der Regel beim Pipettieren zerstört wurden, dürften sie auch den Ansaugvorgang in das Gerät nicht überstehen. Für die Beobachtung abnehmender Stabilität nach Inkubation mit BFA sprechen mehrere Veröffentlichungen: Zum einen werden nach Inkubation mit BFA keine Proteine und somit auch keine Zytokine mehr sezerniert, zum anderen verändert sich auch die Expression von Oberflächenmarkern auf den Zellen. Nylander und Kallies141 sowie Picker und Mitarbeiter140 zeigten, daß sich nach fünfstündiger Inkubation mit BFA unter gleichzeitiger Stimulation mit PMA-Ionomycin die Expression von CD69 Oberflächenmarkern auf CD4+ Lymphozyten aus der Maus von über 50% auf unter 10% verringerte. McCarthy und Mitarbeiter142 untersuchten die Ausprägung von Adhäsionsmolekülen auf dendritischen Zellen, die aus peripherem Blut gewonnen worden waren. Die Verwendung von BFA während der Isolation verringerte die Zahl der Zellen, die CD18, CD29 und CD54 exprimierten, im Vergleich zu Zellen, die ohne Verwendung von BFA isoliert worden waren, erheblich (CD18: ~90% zu ~50%, CD29: ~80% zu ~30%, CD54: ~90% zu ~40%). Die mittlere Fluoreszenzintensität bei der Anfärbung von CD18 und CD54 sank um ungefähr 45%. BFA verhindert die Präsentation von endogen synthetisierten Antigenen auf MHC-Klasse I und MHC-Klasse II Molekülen, jedoch nicht die Stimulation 4. Diskussion 112 alloreaktiver T-Zellen, die gegen MHC-Klasse I oder II Moleküle gerichtet sind143,144,145,146. St.-Pierre und Watts145 zeigten zwar, daß auch die Aktivierung von alloreaktiven T-Zellen nach einer Inkubation mit BFA vermindert werden kann, führten dies jedoch auf toxische Effekte des BFA zurück, obwohl sie geringere Konzentrationen benutzen als andere Gruppen144. MHC-Klasse II Komplexe auf der Oberfläche aktivierter dendritischer Zellen haben eine Halbwertzeit von mehreren Tagen147, so daß die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Inkubationszeiten nicht ausreichen, um die Stimulation alloreaktiver Lymphozyten zu verhindern. Zusammenfassend kann man aussagen, daß die Verwendung von Brefeldin A in der Fluoreszenzmikroskopie zur morphologischen Analyse von Clustern aus dendritischen Zellen und Lymphozyten schwere Nachteile einbringt, da es die Morphologie der Zellen verändert und die Isolation der Cluster erschwert. 4.4 Antikörper Die initialen Färbungen wurden an PBMCs gesunder Erwachsener durchgeführt, da diese sehr einfach zu gewinnen sind und die Ko-Kultur von dendritischen Zellen und Lymphozyten für die Etablierung der Immunfluoreszenz zu aufwendig war. Die Färbungen der Oberflächenmarker wurden mit Farbstoff-gekoppelten monoklonalen Antikörpern an unstimulierten Zellen vorgenommen, da sich die Oberflächen unter Stimulation verändern können148. Um Zytokine intrazellulär anzureichern wurden die Zellen mit PMA-Ionomycin149 stimuliert und mit BFA inkubiert. Diese Stimulation wurde gewählt, da die Zellen nach fünfstündiger Inkubation das Maximum der Produktion sowohl von IFN-γ als auch von IL-4 erreichen. Unter diesem Regime ließen sich IFN-γ und IL-4 problemlos anfärben. Die Zytokine wurden mit verschiedenen unmarkierten monoklonalen Antikörpern aus der Maus und der Ratte durchgeführt, um in Kombination mit hoch kreuz-adsorbierten Sekundärantikörpern mehrere Zytokine und Oberflächenmarker gleichzeitig anfärben zu können. Die Problematik der Färbung der Oberflächenmarker wurde bereits geschildert (siehe 4.1.1 und 4.1.2). Da die Verwendung von Antikörpern gegen Oberflächenmarker die 4. Diskussion 113 Variationsbreite der Antikörperkombinationen zur Markierung intrazellulärer Zytokine einschränkte, wurde diese zugunsten der Färbung der Zellen mit Membran- und Zellfarbstoffen verlassen. IFN-γ ließ sich mit beiden verwendeten monoklonalen Antikörpern aus der Maus (Klone 45-15 und 4S.B3) gleich stark anfärben, bei der Färbung von IL-4 ergab der Maus anti-IL-4 Antikörper 4D9 ein stärkeres Signal als die beiden anderen (Maus anti-IL-4: Klon 8D4-8, Ratte anti-IL4: Klon MP4-25D2). Bei der Verwendung der hoch kreuz-adsorbierten Sekundärantikörper kam es zu keiner unerwünschten Färbung bei Kombination mit den jeweils nicht passenden Primärantikörpern oder den gegen Oberflächenmarker gerichteten Antikörpern. Da bei der Anfärbung der Cluster kein BFA verwendet werden konnte und keine Zytokine mehr intrazellulär anfärbbar waren, wurden die Versuche mit den PBMCs ohne BFA wiederholt. Dabei konnte nur noch IFN-γ angefärbt werden; die anzufärbende Menge an intrazellulärem IL-4 reichte offensichtlich nicht mehr aus, um ein genügend starkes Fluoreszenzsignal zu erzeugen. Da sich IL-4 intrazellulär nicht anreichern ließ, sollte die Färbung durch die Besetzung mehrerer Epitope durch verschiedene Antikörper auf den vorhandenen IL-4 Molekülen verstärkt werden. Die daraufhin versuchte Anfärbung von intrazellulärem IL-4 mit einem biotinylierten polyklonalen anti-IL-4 Antikörper aus der Ziege mißlang, da die spezifische Färbung sehr schwach und die entstehende Hintergrundfluoreszenz durch Bindung an endogenes Biotin150 so hoch war, daß das spezifische Verteilungsmuster der Zytokine in den Zellen nicht mehr klar zu erkennen war. Die von Andersson und Mitarbeitern149 beschriebene Kombination mehrerer monoklonaler Antikörper, die verschiedene Epitope besetzen, ermöglichte dann jedoch wieder ohne Verwendung von BFA die Anfärbung von intrazellulärem IL4 ohne Verstärkung der Hintergrundfluoreszenz. Die simultane Anfärbung von IFN-γ wurde nicht weiterverfolgt, da sich im FACS zeigte, daß IFN-γ in den Clustern nur in sehr geringen Mengen produziert wird. Die angefärbten Zytokine lagen in der Regel perinukleär und reflektierten die Akkumulation im Golgi-Apparat. In einigen Zellen konnte man auch eine ringoder streifenförmige Immunfluoreszenz in der Nähe des Nucleus beobachten. Diese Verteilungsmuster wurden auch von anderen Autoren beschrieben und sprechen somit für eine spezifische Färbung107,151,152. 4. Diskussion 114 4.5 Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen Um die Zytokinproduktion innerhalb der Cluster den verschiedenen Zellen zuordnen und ihre räumlichen Beziehungen zueinander klären zu können, sollten die verschiedenen Populationen durch Fluoreszenz-Färbungen voneinander differenziert werden. Da es sich sowohl bei den gegen Oberflächenmarker als auch bei den gegen Zytokine gerichteten Antikörpern zum großen Teil um IgG1 Antikörper aus der Maus handelte, waren Kreuzreaktionen zu befürchten. Die Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen, die direkt in die Zellen inkorporiert werden, ermöglichte die Differenzierung der einzelnen Zellen in den Clustern, ohne die Färbung intrazellulärer Zytokine einzuschränken. Diese Färbungen wurden mit CFSE, DiO und DiL durchgeführt. CFSE [5-(6)-Carboxyfluorescein-Succinimidylester] ist ein unpolares Fluorescein-Derivat, daß als Ester die Zellmembranen lebender Zellen durchdringt und nach Spaltung durch intrazelluläre Esterasen in ein fluoreszierendes Molekül umgewandelt wird. Dieses verbleibt nach kovalenter Bindung an intrazelluläre Makromoleküle im Zytoplasma153. Im Tierversuch waren CFSE-markierte Lymphozyten trotz deutlicher Verminderung der Fluoreszenz auch 8 Wochen nach Injektion noch in der Milz der Tiere nachweisbar. Nach Färbung mit CFSE sank die Proliferationsfähigkeit muriner T-Lymphozyten nach ConA Stimulation leicht ab, jedoch nicht in signifikantem Ausmaß153. Die Zell-Viabilität von Lymphozyten betrug nach der Färbung mit CFSE >99%, die Proliferationsrate von Lymphozyten nach Stimulation mit PHA oder PWM war allerdings vermindert. Darüber hinaus verminderte die Färbung mit CFSE auch die chemotaktische Antwort neutrophiler Zellen auf Casein und die Superoxidproduktion nach Stimulation mit PMA. In einem Adhäsionsassay, der mit fluoreszenzmarkierten neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten an Endothelzellen mit und ohne IL1-Stimulation durchgeführt wurde, verringerte sich die Adhäsionsfähigkeit der mit CFSE markierten Lymphozyten im Vergleich zu den mit DiL markierten Lymphozyten deutlich, die Neutrophilen wurden nicht beeinträchtigt154. In eigenen Versuchen, in denen die Einflüsse einer CFSE-Markierung der dendritischen Zellen auf die IL-4-Produktion der Lymphozyten in Ko-Kulturen 4. Diskussion 115 untersucht wurde, konnte keine Veränderung der Zytokinproduktion festgestellt werden. Bei DiL (1,1´-Dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethylindocarbocyanin) und DiO (3,3´Dioctadecyloxacarbocyanin) handelt es sich um lipidlösliche CarbocyaninFarbstoffe, die sowohl lebende als auch fixierte Zellen (bei entsprechender Fixation) nicht selektiv anfärben. Cyanin-Farbstoffe sind bilateral symmetrische Ringstrukturen, deren Hälften jeweils aus einem positiv geladenen, konjugierten Ring mit langer Hydrocarbon-Seitenkette bestehen. Bei Carbocyanin-Farbstoffen werden die Ringe durch drei Methin-Gruppen miteinander verbunden. Die Ringstruktur und die Anzahl der zwischengeschalteten Methin-Gruppen bestimmen die Fluoreszenzeigenschaften der Moleküle, während die Hydrocarbon-Seitenketten die Position der Moleküle in der Membran bestimmen. Durch endozytotische Prozesse und laterale Diffusion werden alle Membranen in der Zelle angefärbt155. Bei Inkubation mit diesen Farbstoffen werden die Moleküle in die Plasmamembran inkorporiert. Die Hydrocarbon-Ketten werden dabei parallel zu den Phospholipiden in die Lipid-Doppelschicht eingefügt, während die Chromophore parallel zur Zelloberfläche liegen156. Beide Farbstoffe wirken sich auch in sehr hohen Konzentrationen (50µg/ml für DiL, 100µg/ml für DiO) nicht negativ auf die Proliferationsfähigkeit von PBMCs nach Stimulation mit Antigenen (PPD oder SKSD) oder Mitogenen (PHA) aus. Ebenso konnte in diesen Versuchen gezeigt werden, daß die Farbstoffe für mindestens 120 Stunden in Lymphozyten stabil bleiben und nicht von Zelle zu Zelle übertragen werden103. Auf die Funktion dendritischer Zellen aus der Maus in der MLR hat DiL keine Auswirkung157, nachteilige Effekte einer Färbung der Lymphozyten mit DiO auf die Zytokinproduktion konnten in eigenen Versuchen ebenfalls nicht gesehen werden. Die Zellen wurden schließlich mit CFSE gefärbt, da mit diesem Farbstoff eine homogenere Anfärbung der Zellen zu erreichen ist. Bei Verwendung der Carbocyanin-Farbstoffe waren insbesondere die Ausläufer der dendritischen Zellen so schwach angefärbt, daß die Zellgrenzen nicht eindeutig zu bestimmen waren. Darüberhinaus war auch die Intensität der Färbung mit CFSE, insbesondere bei längerer Kulturdauer, höher. 4. Diskussion 116 4.6 Anzüchtung und Verbringung auf Objektträger Um die Interaktion dendritischer Zellen mit naiven Lymphozyten zu untersuchen, wurden die Zellen in einer allogenen gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) zusammengebracht. Die allogene MLR ist das in-vitro Korrelat der zellulären Immunantwort und wird als finaler Test der Gewebeverträglichkeit in der Transplantationsmedizin eingesetzt. Die Stimulation beruht auf einer Unverträglichkeit der Lymphozyten mit den allogenen MHC Molekülen. Es erwies sich als schwierig, die Cluster so zu kultivieren, daß sich problemlos Präparate erstellen ließen. Da Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten mechanischen Belastungen gegenüber sehr empfindlich sind und durch Pipettiervorgänge zerstört werden können101,158, andererseits jedoch zu einem gewissen Grad in den Kulturgefäßen adhärieren, ist es schwierig, sie aus den Kulturgefäßen auf Objektträger zu transferieren. Zuerst wurde versucht, die Zellen in 24-Lochplatten oder nicht adhärenten Petriperm-Schalen zu züchten und anschließend Zytozentrifugen-Präparate anzufertigen. Die Cluster wurden mit abgeschnittener Pipettenspitze aus den Kulturschalen entnommen und in Zelltrichter transferiert. Problematisch war bereits die Entnahme der Cluster aus den Kulturschalen. Bei der Resuspendierung mit einer Pipette wurden viele Cluster zerstört; ohne Resuspendierung ließen sich nur wenige Cluster entnehmen. Trotz Verwendung der niedrigsten möglichen Drehzahl der Zytozentrifuge ließen sich nur wenige Cluster auf diese Weise gewinnen, deren Morphologie stark durch diese Behandlung beeinträchtigt wurde. Die Zytozentrifugation mit anschließender kurzfristiger Inkubation in Medium, um den Zellen Zeit zur Erholung zu geben, war zu Beginn der Untersuchungen von Clustern aus dendritischen Zellen und Lymphozyten Standard11. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die weitere Inkubation nach der Zentrifugation verzichtet, da auf den Objektträgern nur wenige Cluster zu beobachten waren. Auch die Sedimentation auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger brachte keine vollständig befriedigenden Ergebnisse, da beim Aufbereiten der Präparate insbesondere größere Cluster verloren gingen. Diese Methode scheint jedoch momentan der Standard zu sein, um Cluster aus Antigen-präsentierenden Zellen und Lymphozyten zu isolieren56,159. 4. Diskussion 117 Als geeignete Methode zur Isolierung der Cluster erwies sich die Anzucht der Zellen in 24-Lochplatten, aus denen sie nach vorsichtiger Lösung mit Zellschabern entnommen werden konnten. Die Cluster sedimentierten anschließend auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger, die abschließend zentrifugiert wurden. Auf diese Weise konnten auch größere Cluster in genügender Zahl isoliert werden, die zudem in ihrer Morphologie nur unwesentlich beeinflußt wurden. Die Anzüchtung der Zellen auf Anonpore-Membranen, Deckgläschen und Objektträgern scheiterte an der geringen Adhärenz dendritischer Zellen. Zwar sind dendritische Zellen als nicht adhärent definiert11, die Probleme bei der Entnahme der Zellen aus den Kulturschalen deuteten jedoch auf eine gewisse Haftung am Untergrund hin. Bei diesen Versuchen waren auf den Präparaten immer nur einzeln liegende Zellen, die weit verzweigte Ausläufer bildeten, zu sehen. Nach Färbung der Zellen mit Membranfarbstoffen vor dem Ansatz der Ko-Kultur ließen sich diese Zellen, in Übereinstimmung mit ihrer Morphologie, als dendritische Zellen identifizieren. Ob diese Zellen keine Cluster gebildet hatten oder die gebundenen T-Zellen abgewaschen worden waren, ließ sich nicht klären. Im Kulturmikroskop waren jedoch Zellen von sehr ähnlicher Morphologie zu beobachten, die mit T-Zellen Cluster gebildet hatten. Es wurde nicht versucht, die offenbar auf Kollagen I, Fibronectin oder Hyaluronsäure mögliche adhärente Anzucht dendritischer Zellen, die aus PBMCs gewonnen wurden160,161,162,163, auf die Ko-Kultur aus dendritischen Zellen und TLymphozyten aus CBMCs zu übertragen. Denn diese Stoffe üben auch einen Stimulus auf dendritische Zellen aus, der von verschiedenen Autoren entweder der Bindung von Matrixproteinen durch Oberflächenmarker (Fibronectin durch CD29160 oder CD29 und CD49e161, Hyaluronsäure durch CD44162) oder dem in kommerziellen Kollagen-, Fibronectin- und Hyaluronsäurezubereitungen enthaltenen LPS zugeschrieben wird163. Die Modulation der Zytokinproduktion, der Ausprägung der Oberflächenmarker und der Stimulationsfähigkeit dendritischer Zellen und somit die unvorhersehbare Beeinflussung des gesamten Experiments ließen dieses Vorgehen als nicht ratsam erscheinen. 4. Diskussion 118 4.7. Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten 4.7.1 Aufbau der Cluster Die Art der in den Clustern befindlichen Zellen ist nicht ganz klar. Die Ko-Kultur wurde aus myeloiden dendritischen Zellen und CD45RA+ Zellen angesetzt. Zum Zeitpunkt der Versuche war Stand der Forschung, daß CD45RA von B-, T- und NK-Zellen exprimiert wird, nicht jedoch von dendritischen Zellen164. Mittlerweile ist bekannt, daß auch lymphoide dendritische Zellen CD45RA auf ihrer Oberfläche haben21,23,165. Somit ist es wahrscheinlich, daß sich neben myeloiden dendritischen Zellen, B-, T- und NK-Zellen auch lymphoide dendritische Zellen in den Clustern befinden. Der Einfluß der NK-Zellen in der Kultur ist als gering anzusehen, obwohl diese Zellen immunmodulatorische Fähigkeiten aufweisen. Die allogenen dendritischen Zellen werden, zumindest in der Frühphase der Ko-Kultur, nicht von NK-Zellen abgetötet, da deren zytotoxische Aktivität durch die Erkennung von MHC-Klasse I Molekülen inhibiert wird166,167,168. NK-Zellen können in der MLR die stimulatorischen Fähigkeiten der Antigen-präsentierenden Zellen verändern, jedoch ist dieser Effekt bei naiven T-Zellen zu vernachlässigen169,170,171. In der syngenen Ko-Kultur bilden aus Nabelschnurblut gezüchtete NK-Zellen Cluster mit dendritischen Zellen. Die Produktion von IFN-γ in den NK-Zellen wird angeregt und die zytotoxische Aktivität verstärkt172. Die geringe Synthese von IFN-γ in den Ko-Kulturen (siehe 3.3.1) schließt eine starke Interaktion dendritischer Zellen mit NK-Zellen aus. Eine direkte Stimulation von T-Zellen durch NK-Zellen findet nicht statt170. Die beobachtete Bildung von Clustern nach wenigen Stunden der Ko-Kultur, die verstärkte Zytokinsynthese ab dem zweiten Tag der Kultur und die enorme Vergrößerung der Cluster stimmen mit Beschreibungen von Steinman und Kollegen173 überein, die in der allogenen MLR eine Bindung der meisten alloreaktiven T-Zellen innerhalb der ersten acht Stunden beschrieben. Die DNASynthese in den aktivierten T-Zellen begann am zweiten Tag der Kultur. Ebenfalls ab dem zweiten Tag der Kultur wurde eine Proliferation der T-Zellen beobachtet, welche an den folgenden drei bis vier Tagen exponentiell anstieg. 4. Diskussion 119 Die nach fünf bis sieben Tagen in Kultur beobachteten Cluster wiesen eine Größe von mehreren Dutzend Zellen auf und waren extrem zerbrechlich. Unter dem Fluoreszenzmikroskop zeigte sich eine sehr starke Autofluoreszenz und unspezifische Anfärbung mit Antikörpern, ohne daß Zytokine anfärbbar waren. Dies spricht für Ansammlungen toter Zellen. Dabei kann es sich um Lymphozyten oder dendritische Zellen handeln. Aktivierte Lymphozyten werden durch übermäßige Stimulation apoptotisch63; aktivierte dendritische Zellen haben nach Interaktion mit T-Zellen eine geringe Lebensdauer27. Auch die Abtötung durch NK-Zellen ist in Betracht zu ziehen, die Wachstumsverhältnissen auch syngene Zellen abtöten 174 bei sehr beengten . Die Trennung der Cluster von einzelnen Zellen nach 24 Stunden in Kultur durch Sedimentation über einen Gradienten führte zu unterschiedlichen Ergebnissen. In der vorliegenden Arbeit konnten aus den einzelnen Zellen weitere Cluster angezüchtet werden, wohingegen Steinman und Kollegen173 eine fehlende Proliferation und Clusterbildung dieser Zellen beschrieben. Eine Möglichkeit dafür ist, daß es sich bei diesen Zellen um B-Zellen handelt, die erst nach einer gewissen Zeit in Kultur in die Cluster eintreten175. Zum anderen könnte es sich um Zellen handeln, welche die Cluster bereits wieder verlassen haben. Die genaue Dauer des Kontaktes zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten ist unbekannt. Die Etablierung der charakteristischen, aus einem zentralen Kern (cSMAC) und einem peripheren Anteil (pSMAC) bestehenden, Kontaktstelle erfordert etwa 30 Minuten39 (siehe 1.3.3.2.1). Die Polarisierung von naiven TZellen zu Th2-Zellen nimmt mehrere Tage in Anspruch, in denen eine andauernde Aktivierung über den TZR und den IL-4 Rezeptor erforderlich ist. Für Th1-Zellen ist dieser Zeitraum kürzer und erfordert nicht die durchgehende Stimulation des TZR65,76. Ob die Lymphozyten in dieser Zeit an eine einzige dendritische Zelle gebunden bleiben oder konsekutiv von mehreren dendritischen Zellen stimuliert werden, ist ebenfalls nicht bekannt. 4. Diskussion 120 4.7.2 Kontakte zwischen den Zellen Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten wurden bereits mehrfach gezeigt, ohne dabei die Kontaktstellen in hoher Auflösung zu präsentieren11,61,158. Zwischen den Zellen bildeten sich verschiedene Kontaktformen. 1) Kontakte zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten: Zum einen erstreckten sich von den dendritischen Zellen Zytoplasmafortsätze über Entfernungen von bis zu 10µm zu den Lymphozyten. An den Kontaktstellen lagen die Zellmembranen in einem Abstand von 20nm parallel zueinander. Die Lymphozyten zeigten dabei eine rundliche Form. Zum anderen lagen Lymphozyten direkt an dendritischen Zellen an und richteten sich mit breiten Kontaktzonen auf diese aus. Die Kontaktzone bildete zwei Bereiche: Die Zellmembranen befanden sich in einem Abstand von 20nm und daran anschließend in einem Abstand von 80-100nm parallel zueinander. Diese verschiedenen Kontakte stellen entweder einen zeitlichen Ablauf oder grundsätzlich unterschiedliche Kontakte zwischen dendritischen Zellen und verschiedenen Lymphozytenpopulationen dar. Für die zeitliche Abfolge spricht, daß dendritische Zellen Zytoplasmafortsätze in Richtung von Lymphozyten ausstrecken. Wahrscheinlich bilden dendritische Zellen aktiv Fortsätze aus159, die in Kontakt mit T-Zellen treten. Ebenfalls für die zeitliche Abfolge spricht eine Beobachtung von Dustin und Mitarbeitern: TZellen, die mit planen Membranen interagieren, in die CD58 inkorporiert ist, bilden schmale Kontakte mit der Lipidmembran und behalten ihre rundliche Form. Nach der Inkorporation von CD54 in die planen Membranen bilden sich nach Ausrichtung der Zelle zur Membran hin breite Kontaktzonen aus44. An den primären Kontaktstellen bilden sich über CD2-CD58 Interaktion parallele, eng aneinander liegende Membrandomänen aus, in denen TZR-CD3-ζ-Komplexe nach passenden Antigen-MHC-Klasse II Komplexen suchen44. Eine korrekte Erkennung eines passenden Antigen-MHC-Klasse II Komplexes führt dann zur Aktivierung der Zelle und der folgenden Anlagerung weiterer Adhäsionsmoleküle und kostimulatorischer Moleküle (unter anderem CD54/LFA-1)176, die zu den 4. Diskussion 121 beschriebenen breiten Kontaktstellen führt. Schließlich kommt es zur Ausbildung einer „immunologischen Synapse“. Die im Elektronenmikroskop sichtbaren Kontaktstellen entsprechen nicht ganz den bisherigen Angaben in der Literatur (Abb. 59). Die bisher beschriebene „immunologische Synapse“ weist in ihrer Mitte einen engen Kontakt im Abstand von 15-20nm auf, darum herum einen Abstand der Membranen von 40nm. Die kreisförmige Kontaktfläche soll dabei einen Umfang von 2-10µm haben44,45 (Abb. 60). Diese Untersuchungen wurden an murinen Zellen durchgeführt, die an den Kontaktstellen ein etwas anderes Rezeptorenmuster als humane Zellen aufweisen44,45. 2) Zwischen dendritischen Zellen bilden sich nur Kontakte über Zellfortsätze aus, in denen die Membranen im Abstand von 20nm zueinander parallel liegen. Diese Kontaktstellen werden wahrscheinlich ebenfalls über CD2-CD58 Interaktion zusammengehalten, da beide Adhäsionsmoleküle auf dendritischen Zellen exprimiert sind21. Da es nicht zur Ausbildung von TZR-MHC-Komplexen kommt, bilden sich keine breitflächigen Kontakte aus. 3) Zwischen Lymphozyten bilden sich grundsätzlich breite Kontaktstellen aus. Teilweise sind dabei beide Lymphozyten an dendritische Zellen gebunden, was dafür spricht, daß dieser Kontakt vom gleichzeitigen Kontakt zur dendritischen Zelle abhängig ist. Zur Erläuterung der Bedeutung dieser Kontaktstelle siehe 4.7.3. Für die Ausbildung grundsätzlich unterschiedlicher Kontakte spricht die Tatsache, daß die eingesetzten CD45RA+ Zellen eine sehr heterogene Gruppe darstellen (siehe 4.7.1). Ebenso wie sich die Kontakte zwischen dendritischen Zellen von denen zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten deutlich unterscheiden, könnten die verschiedenen Kontakte zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten grundsätzlich unterschiedlichen Zellen darstellen. verschiedene Kontaktformen zwischen 4. Diskussion 122 Abbildung 59: Kontaktstelle zwischen einer dendritischen Zelle und einer T-Zelle im Transmissionselektronenmikroskop Im zentralen Bereich liegen die Zellmembranen in einem Abstand von ca. 20nm parallel zueinander, im peripheren Bereich in einem Abstand von etwa 80-100nm. Abbildung 60: Schematische Darstellung der Kontaktstelle zwischen einer dendritischen Zelle und einer T-Zelle45 Im Bereich des zentralen Kontaktes (cSMAC) werden die Zellen durch Interaktion von CD2 (orange) und CD58 (gelb) im Abstand von 20nm parallel gehalten. Dieser Abstand ermöglicht die optimale Präsentation von AntigenMHC-Klasse II Komplexen an die T-Zell-Rezeptoren (rot). Im Bereich des peripheren Kontaktes (pSMAC) vergrößert sich der Abstand zwischen den Zellmembranen auf 40nm. Dort befinden sich die Adhäsionsmoleküle LFA-1 und CD54 (grün). Von der Kontaktstelle ausgeschlossen sind große Moleküle wie CD43 (blau). Als Legende für die Moleküle vergleiche Abbildung 3. 4. Diskussion 123 Bei den dargestellten Kontakten sind zunächst Artefakte auszuschließen, die durch die Zentrifugation der Zellen entstanden sein könnten. In den dargestellten Kontaktzonen liegen die Zellmembranen in einem Abstand von ungefähr 20nm parallel, was den in der Literatur angegebenen Abständen von ungefähr 15-20nm für die durch CD2-CD58 Interaktion parallel gehaltenen Zellmembranen entspricht49,50,51. Auch morphologisch entsprechen die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen breiteren Kontaktstellen den in einer Arbeit von Delon und Mitarbeitern gezeigten Kontaktstellen zwischen Antigen-gepulsten dendritischen Zellen und spezifischen T-Zellen im Mausmodell61. Auf beiden Seiten des Spaltes zwischen den Zellen sind deutliche Verdichtungen in den Membranen sichtbar, die auf die Anlagerung von Adhäsionsmolekülen hindeuten; eine Tatsache, die ebenfalls die Annahme einer echten Kontaktstelle stützt. 4.7.3 Verteilung der Zytokine innerhalb der Cluster Die Zytokine werden von den Lymphozyten gerichtet zu benachbarten Zellen abgegeben. In den beobachteten Clustern fanden sich vier verschiedene Muster der Zytokinsekretion: (1) Von einem Lymphozyten zu einer anliegenden dendritischen Zelle, (2) von einem Lymphozyten, der einer dendritischen Zelle anliegt, zu einer benachbarten CD45RA+ Zelle, welche der dendritischen Zelle nicht anliegt, (3) von einem Lymphozyten, der einer dendritischen Zelle anliegt, zu einer benachbarten CD45RA+ Zelle, welche der dendritischen Zelle ebenfalls anliegt und (4) von einem Lymphozyten zu einer benachbarten CD45RA+ Zelle ohne Beteiligung einer myeloiden dendritischen Zelle. Die Zytokinsekretion von einem Lymphozyten zu einer anliegenden dendritischen Zelle (oben 1) entspricht dem in der Literatur beschriebenen Fall der Stimulation eines naiven Lymphozyten durch eine Antigen-präsentierende Zelle. Die Etablierung eines passenden TZR-MHC-Komplexes hat stattgefunden; die Zellen sind durch Reorganisation des Zytoskeletts nach Kontakt verschiedener Rezeptorenpaare aufeinander ausgerichtet55. 4. Diskussion 124 Unklar ist, warum in den beiden anderen beschriebenen Fällen T-Helfer-Zellen, die an einer dendritische Zelle anliegen, ihre Zytokine in Richtung einer syngenen CD45RA+ Zelle sezernieren (oben 2 und 3). Die Zytokine werden aus einem Lymphozyten in Richtung des mikrotubulusorganisierenden Zentrums (MTOC) sezerniert56, das die Ausrichtung des Golgi-Apparates bestimmt. Diese Polarisierung der Zelle wird durch Bindung des TZR-CD3-ζ-Komplexes an MHC-Klasse II Moleküle ausgelöst55. Der Grund für die Ausrichtung der Zytokinsekretion auf eine bestimmte Zelle ist unbekannt. Abraham Kupfer und Mitarbeiter56 beschrieben 1994 Cluster aus Antigenspezifischen T- und B-Zellen im Mausmodell. T-Helfer-Zellen, an die sich mehrere B-Zellen gebunden hatten, gaben Zytokine selektiv nur in Richtung der B-Zelle ab, auf die das MTOC der T-Zelle ausgerichtet war. Kupfer nahm als wahrscheinliche Begründung dieser Ausrichtung die Reihenfolge der Bindung der B-Zellen an die T-Zelle an. Das MTOC würde demnach auf die zuerst gebundene B-Zelle ausgerichtet. Die nachfolgend gebundenen B-Zellen könnten nicht ausreichend viele T-Zell-Rezeptoren rekrutieren, um eine Reorientierung des MTOC zu erreichen oder aber würden unabhängig von präsentierten Antigenen gebunden (siehe 1.3.3.2.1). Eine weitere Erklärung könnte die inhärente Polarität von T-Zellen sein177. TZellen sind auf ihrer Oberfläche gegenüber einer Antigenpräsentation nicht überall gleich empfindlich. Eine Zelle, die auf den sensitiven Bereich trifft, ruft wesentlich leichter eine Reaktion hervor als eine dem nicht sensitiven Bereich anliegende Zelle. Die Lymphozyten könnten also über Kontaktstellen mit dendritischen Zellen verfügen, ihre Zytokine aber in Richtung einer anderen Zelle sezernieren. Sowohl B- als auch T-Zellen rufen in der syngenen MLR keine Aktivierung von T-Zellen hervor178. Entweder präsentieren diese Zellen Antigene, die sie während der Kultur aufgenommen haben179,180 (z.B. in RPMI 1640 und FCS enthaltene xenogene Proteine) oder diese Art der Zytokinsekretion hängt von der vorhergehenden Aktivierung durch dendritische Zellen ab. Aktivierte B-Zellen binden sich in der syngenen MLR an nicht naive T-Zellen179 und interagieren mit diesen181,182. 4. Diskussion 125 Dendritische Zellen können auch in der syngenen MLR Lymphozyten stimulieren160, so daß es sich auch um Kontakte zwischen Lymphozyten und lymphoiden dendritischen Zellen handeln könnte. Diese Überlegungen gelten auch für den Kontakt zwischen zwei CD45RA+ Zellen (oben 4). 4.7.4 Zytokinmuster in den Clustern In Clustern aus dendritischen Zellen und naiven, neonatalen T-Zellen konnte fast nur IL-4 angefärbt werden, was einem Th2 Zytokinmuster entspricht. In der Literatur finden sich Hinweise, daß in der allogenen MLR aus adulten Zellen an Tag 1 IL-2 und anschließend weitere Interleukine gebildet werden (IFN-γ, IL-4)5. Die sehr geringe Produktion von Th1 Zytokinen im vorliegenden Modell ist wahrscheinlich in der Verwendung neonataler Zellen begründet. Im Mausmodell beobachtet man in der allogenen MLR mit neonatalen Zellen hauptsächlich Th2 Zytokinmuster183. Beim Menschen wird die Frage, ob neonatale Zellen bevorzugt eine Th1- oder Th2-Reaktion zeigen, als völlig offen angesehen184. Neonatale, humane T-Zellen sind nach PMA-Ionomycin Stimulation in der Lage, sowohl Th1 als auch Th2 Zytokinmuster zu produzieren, die adulten Zellen entsprechen185. Allerdings beeinflußt die Unreife neonataler Antigen-präsentierender Zellen ebenfalls die Polarisierung in Th1- oder Th2-Richtung und führt eher zu einem Th2 Zytokinmuster186. Ebenfalls möglich ist eine Beeinflussung der Zytokinproduktion in den Clustern durch die in der Kultur vorhandenen lymphoiden dendritischen Zellen, denen einige Arbeitsgruppen die Auslösung einer Th2-Reaktion unterstellen21,22. Zwar kann schon eine geringe Anzahl dendritischer Zellen eine starke Immunreaktion hervorrufen11, die vergleichsweise geringe Anzahl lymphoider dendritischer Zellen im Vergleich zur Zahl der myeloiden dendritischen Zellen in der MLR macht aber eine reine Th2 Antwort durch diese Zellen extrem unwahrscheinlich. Die Fraktion aller dendritischen Zellen macht ca. 0,1-1% der Leukozyten aus11; im Blut von Neonaten findet man jedoch 30-60% Lymphozyten, die zum größten Teil naiv sind185. Der Anteil der lymphoiden dendritischen Zellen an der CD45RA+ Population ist somit gering. 4. Diskussion 126 4.8 Subpopulationen dendritischer Zellen Die in Anlehnung an eine Methode von Caux und Mitarbeitern12 aus Nabelschnurblut gezüchteten dendritischen Zellen können durch Expression der Oberflächenmarker CD1a und CD14 in vier Subpopulationen eingeteilt werden: Es handelt sich um undifferenzierte Zellen (CD1a-, CD14-), eine doppelt positive Mischpopulation (CD1a+, CD14+), monozytäre Zellen (CD1a-, CD14+) und eine dendritische Form (CD1a+, CD14-). Die Entwicklung der verschiedenen Subpopulationen in Kultur legt den Schluß nahe, daß die Zellen in Kultur noch plastisch, also noch nicht ausdifferenziert sind. Die einzelnen Vorläuferzellen weisen keine statische Expression der Oberflächenmarker auf (siehe 3.6.1). Auch in der Literatur ist beschrieben, daß Vorläuferzellen dendritischer Zellen durch Modulation endogener Zytokine oder durch Zugabe exogener Zytokine in ihrer Differenzierung beeinflußt werden können14,16. Die Trennung der Subpopulationen mit Hilfe des autoMACS ermöglicht die selektive Verwendung verschiedener Subpopulationen dendritischer Zellen zur Ko-Kultivierung mit Lymphozyten, um die Einflüsse verschiedener Subpopulationen auf die Polarisierung naiver T-Zellen zu untersuchen21,22,23. Die Sortierung der Zellen erfolgte nach den Oberflächenmarkern CD1a und CLA. Die Trennung nach CD1a ist die etablierte Methode zur Erzeugung von Langerhans-Zellen, die sich aus CD1a+ Zellen entwickeln sollen12,13. Die Sortierung dieser Zellen erfolgte an Tag 5 der Kultur, da zu diesem Zeitpunkt noch eine eindeutige Differenzierung in CD1a+ CD14- und CD1a- und CD14+ Zellen vorliegt13. Alternativ wurden die Zellen nach CLA aufgereinigt. Zur Sortierung wurde die stärkste Expression von CLA in der Kultur abgewartet, die an Tag 10 stattfand (siehe 3.6.1)187. CLA ist ein Ligand für E-Selectin (CD62E), der immunkompetenten Zellen den Eintritt in die Haut ermöglicht. Die Expression von CLA definiert im peripheren Blut die Vorläuferzellen der Langerhans-Zellen188 und befindet sich auf unreifen Langerhans-Zellen in der Haut189. 4. Diskussion 127 Über die Sortierung dendritischer Zellen nach dem Oberflächenmarker CLA konnten Langerhans-Zellen einfach aufgereinigt werden. Der Nachweis von Birbeck-Granula, die sich exklusiv in Langerhans-Zellen befinden, charakterisiert diese Zellen eindeutig. Die vorliegenden Ergebnisse, daß sich CLA auch auf CD14+ Zellen befindet, stimmen mit den Angaben von Jaksits und Mitarbeitern überein, welche die Anzüchtung von Langerhans-Zellen aus CD14+ Vorläuferzellen16 beschrieben. Diese Anzüchtung von Langerhans-Zellen ist abhängig von der Anwesenheit von TGF-β, das auch von Zellen in Kultur gebildet wird14. Auch die Tatsache, daß nicht alle CD14+ Vorläuferzellen in Anwesenheit von TGF-β zu LangerhansZellen werden16, stehen mit den vorliegenden Ergebnissen in Einklang, da die CD14+/CLA+ Fraktion nur einen Teil der CD14+ Zellen darstellt. Die Tatsache, daß alle vier Subpopulationen dendritischer Zellen CLA exprimieren und über diesen Marker Langerhans-Zellen isoliert werden können, unterstützt die Annahme der Plastizität dieser Zellen. 5. Zusammenfassung 128 5. Zusammenfassung Zahlreiche in-vitro Untersuchungen beschäftigen sich mit der „immunologischen Synapse“. Bislang wurden meistens einzelne T-Zellen untersucht, die mit planen Membranen interagierten, oder es wurden B-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen eingesetzt. Ziel der Arbeit war, Untersuchungen an der „immunologischen Synapse“ zwischen T-Zellen und dendritischen Zellen zu ermöglichen. Cluster aus dendritischen Zellen und Lymphozyten sollten in großer Zahl isoliert werden. Alle Komponenten der „immunologischen Synapse“ sollten in einem untersuchbaren Zustand sein. Die Isolierung der verschiedenen Zelltypen vor der Kultur ermöglicht die selektive Verwendung verschiedener Zellen. Die Methode zur Isolierung naiver TZellen ist jedoch verbesserungswürdig, da von der CD45RA+ Population zu viele störende Einflüsse ausgehen können. Gut geeignet erscheint die Isolierung verschiedener Subtypen dendritischer Zellen, die eine saubere Trennung der Zellen ermöglicht. Cluster aus immunkompetenten Zellen lassen sich am einfachsten isolieren, wenn die Zellen sehr schonend behandelt werden. Die Zellen sollten in 24-Lochplatten kultiviert werden, aus denen sie zum gewählten Zeitpunkt entnommen werden. Vorher sollte man die Zellen mit einem Zellschaber vorsichtig lösen. Die Zentrifugation in einer Zytozentrifuge war ungeeignet. Die Sedimentation auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger erhielt die Morphologie der Cluster sehr gut. Um einen zu hohen Zellverlust bei der weiteren Aufbereitung der Präparate zu vermeiden, sollten die Objektträger nach der Sedimentation für eine kurze Zeit bei geringer Beschleunigung zentrifugiert werden. Die Behandlung der Zellen mit Paraformaldehyd-Saponin stellt das geeignete Vorgehen dar, um Oberflächenmarker und intrazelluläre Zytokine anzufärben. Alle anderen Protokolle weisen schwere Nachteile auf. Die Anfärbung intrazellulärer Zytokine ist aufwendig. Da Zytokine aufgrund der negativen Eigenschaften von Brefeldin A nicht intrazellulär angereichert werden 5. Zusammenfassung 129 können, sind zur Anfärbung eventuell mehrere Antikörper notwendig, die verschiedene Epitope besetzen. Die hier untersuchten Zellfarbstoffe sind gut geeignet, um die verschiedenen Zellen identifizieren zu können. Eine Beeinflussung der Zellen durch die Färbung kann praktisch ausgeschlossen werden. Der Erfolg dieser Vorarbeiten erbrachte auch Erkenntnisse über die Interaktionen der Zellen in der MLR. Im Elektronenmikroskop waren zwischen dendritischen Zellen und Lymphozyten zwei verschiedene Kontaktformen zu beobachten. Die über Zytoplasmafortsätze gebildeten Kontakte waren schmal. Die Zellmembranen lagen im Abstand von 20nm parallel zueinander. Die direkten Kontakte waren breiter ausgebildet und bestanden aus zwei Domänen. Die Membranen waren in beiden Domänen parallel ausgerichtet. In der einen betrug der Abstand 20nm, in der anderen 80-100nm. Diese Daten stimmen nicht mit Untersuchungen an Zellen aus der Maus überein. Murine Zellen weisen an Kontaktflächen zu anderen Zellen ein etwas anderes Rezeptorenmuster auf. Dendritische Zellen traten nur über Zytoplasmafortsätze miteinander in Kontakt. Die Membranen lagen an diesen Kontaktstellen parallel im Abstand von 20nm. Lymphozyten hatten untereinander nur direkte Kontaktstellen. Teilweise verfügten sie außerdem noch über Kontaktstellen zu Antigen-präsentierenden Zellen. Das Sekretionsmuster der Zytokine spiegelt die verschiedenen Kontaktstellen der Lymphozyten wider. Die Zytokine wurden stets gerichtet an eine benachbarte Zelle abgegeben. Dies war aber nicht in allen Fällen eine Antigen-präsentierende Zelle. Einige Lymphozyten verfügten über Kontaktstellen zu dendritischen Zellen, sezernierten ihre Zytokine jedoch zu benachbarten Lymphozyten. Insgesamt ist diese Arbeit als Fundament zu betrachten. Wesentliche Ansatzpunkte zur weiteren Untersuchung sind: 1) Die Abhängigkeit der Zellkontakte und der Zytokinsekretion von Adhäsionsmolekülen. 2) Veränderung der Kontaktstellen und Modulation der Zytokinproduktion durch verschiedene Stimuli. 6. Literaturverzeichnis 130 6. Literaturverzeichnis 1 Kuno, M. The Synapse: Function, Plasticity, And Neurotropism Oxford University Press Oxford (1995) 2 Schmidt, R.F., Thews, G., Lang, F. Physiologie des Menschen, 28. Auflage Springer Verlag Berlin Heidelberg New York (2000) 3 Abbas, A.K., Murphy, K.M., Sher, A. 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Anhang 154 Tabelle 6: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung frisch aufgetauter dendritischerZellen nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 244 Paraformaldehyd 280 241 191 169 Glutaraldehyd 365 326 301 294 352 354 313 306 331 273 202 186 395 405 346 351 Ethanol-Eisessig 468 404 357 378 Aceton 693 723 734 764 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 7: Mittlere Fluoreszenz frisch aufgetauter dendritischer Zellen, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 6 Paraformaldehyd 5 8 2 3 131 200 184 184 59 66 52 53 5 7 2 2 201 34 26 26 Ethanol-Eisessig 4 6 2 2 Aceton 5 11 5 5 Glutaraldehyd Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 155 Tabelle 8: Mittlere Fluoreszenz frisch aufgetauter dendritischer Zellen, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 5 Paraformaldehyd 4 8 2 2 Glutaraldehyd 80 116 115 115 29 36 24 25 4 7 2 2 28 47 41 42 Ethanol-Eisessig 4 6 2 3 Aceton 5 12 5 6 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 9: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Stimulation mit GM-CSF (24h) nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 435 Paraformaldehyd 455 443 368 369 Glutaraldehyd 398 410 403 389 397 394 371 370 513 503 431 440 467 492 446 452 Ethanol-Eisessig 288 282 276 292 Aceton 291 289 291 333 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang Tabelle 10: 156 Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Stimulation mit GM-CSF (24h) nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 394 Paraformaldehyd 430 388 357 336 Glutaraldehyd 461 424 413 396 420 397 394 377 578 537 481 476 546 522 546 541 Ethanol-Eisessig 550 572 556 527 Aceton 428 497 488 513 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 11: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Stimulation mit GMCSF (24h), mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 12 Paraformaldehyd 12 12 5 5 Glutaraldehyd 164 253 197 192 104 109 94 94 15 19 6 7 702 570 377 385 Ethanol-Eisessig 6 7 4 5 Aceton 9 12 8 7 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 157 Tabelle 12: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Stimulation mit GMCSF (24h), mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 6 Paraformaldehyd 11 11 5 4 Glutaraldehyd 106 171 134 127 47 58 44 46 14 19 7 8 366 372 279 286 Ethanol-Eisessig 6 7 4 6 Aceton 9 11 8 7 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 158 7.2 Einflüsse von Fixierung und Permeabilisierung auf die Anfärbung dendritischer Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen Tabelle 13: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 508 Paraformaldehyd 566 582 474 450 Glutaraldehyd 611 661 675 644 640 702 676 658 505 685 458 429 640 685 685 662 Ethanol-Eisessig 412 561 522 511 Aceton 535 513 545 557 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 159 Tabelle 14: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 581 Paraformaldehyd 559 534 459 443 Glutaraldehyd 675 690 716 698 632 719 675 669 509 575 453 492 731 741 704 696 Ethanol-Eisessig 451 637 581 558 Aceton 759 806 775 779 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 15: mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 611 Paraformaldehyd 598 719 34 26 Glutaraldehyd 185 608 865 91 52 34 52 29 555 770 29 38 939 1131 127 124 Ethanol-Eisessig 82 62 31 9 Aceton 6 109 82 42 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 160 Tabelle 16: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiO, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 7 Paraformaldehyd 7 5 21 22 Glutaraldehyd 20 21 42 49 2 6 10 15 6 5 19 22 34 37 36 23 Ethanol-Eisessig 32 1 1 1 Aceton 1 1 7 2 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 17: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 670 Paraformaldehyd 797 825 682 680 Glutaraldehyd 716 760 756 758 724 775 769 768 759 777 625 656 756 767 786 778 Ethanol-Eisessig 575 582 583 597 Aceton 531 627 661 642 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 161 Tabelle 18: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 629 Paraformaldehyd 607 552 462 475 Glutaraldehyd 590 567 551 556 575 675 627 619 569 546 444 483 589 587 550 552 Ethanol-Eisessig 644 641 627 613 Aceton 770 871 894 876 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 19: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation bei 480nm, Emission bei 530nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 17 Paraformaldehyd 20 47 29 26 Glutaraldehyd 652 890 698 698 376 446 353 353 17 37 24 24 51 61 75 75 Ethanol-Eisessig 25 61 25 25 Aceton 58 117 72 74 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 162 Tabelle 20: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit DiL, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation bei 480nm, Emission bei 580nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 158 Paraformaldehyd 205 392 9 5 Glutaraldehyd 65 247 2 1 1 1 1 1 175 327 5 4 185 303 55 48 Ethanol-Eisessig 6 2 2 1 Aceton 1 1 1 1 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 21: Mittlere Vorwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 652 Paraformaldehyd 785 804 693 700 Glutaraldehyd 672 727 738 738 536 728 774 774 697 596 550 550 764 748 764 769 Ethanol-Eisessig 406 459 438 451 Aceton 325 424 432 419 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 163 Tabelle 22: Mittlere Seitwärts-Lichtbrechung dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 667 Paraformaldehyd 689 623 553 577 Glutaraldehyd 714 707 684 701 622 606 654 694 567 502 461 478 687 701 678 667 Ethanol-Eisessig 617 647 535 525 Aceton 550 671 694 653 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd Tabelle 23: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 530nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 780 Paraformaldehyd 811 845 833 851 Glutaraldehyd 537 601 724 694 530 574 802 978 697 634 641 687 764 1008 1064 866 Ethanol-Eisessig 454 430 437 408 Aceton 495 485 609 579 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 7. Anhang 164 Tabelle 24: Mittlere Fluoreszenz dendritischer Zellen nach Färbung mit CFSE, mittlere Fluoreszenz bei Exzitation mit 480nm, Emission bei 580nm nicht permeabilisiert Saponin NP-40 TX-100 nicht fixiert 7 Paraformaldehyd 7 9 6 7 Glutaraldehyd 11 14 12 12 7 6 5 8 7 8 5 6 8 13 12 11 Ethanol-Eisessig 6 6 7 6 Aceton 6 5 2 6 Glutaraldehyd + Borhydrat Formaldehyd FormaldehydGlutaraldehyd 165 Danksagung Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. Schauer, der mir diese Arbeit ermöglichte und sie mit großem Interesse, Wohlwollen und konstruktiver Kritik begleitete. Herrn Prof. Dr. med. Morgenroth danke ich für die freundliche Erlaubnis, das konfokale Laser-Raster-Mikroskop und die Elektronenmikroskope der Abteilung für allgemeine und spezielle Pathologie der Ruhr-Universität Bochum zu benutzen. Herrn Dr. med. Bartz sowie Herrn Ghafoorian danke ich für eine hervorragende kollegiale Zusammenarbeit und anregende Diskussionen. Herrn Anhenn schulde ich Dank für großzügige Hilfe bei den in der Abteilung für allgemeine und spezielle Pathologie der Ruhr-Universität Bochum durchgeführten Untersuchungen. Frau Hoffmann verdanke ich die dendritischen Zellen. Schließlich danke ich sehr herzlich Frau Baumeister, Frau Kruip und Frau Michel, die als Technische Assistentinnen erheblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Meinem Bruder Daniel danke ich herzlich für seine Hilfe am Computer. 166 Lebenslauf persönliche Daten Name: Friedrich Tobias Ingo Rothoeft Anschrift: Löwenzahnweg 27 a Geburtsdatum: 10. Februar 1974 Geburtsort: Essen (NRW) Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Eltern: Prof. (em.) Dr. Dietrich R. Rothoeft, MPA (Harvard) (Universitätsprofessor der Rechte und Richter am OLG Düsseldorf i.R.) und Roswitha Rothoeft geb. Endemann Geschwister: Diplom-Ökonom Dietrich Daniel Rothoeft, geboren 12.5.1972 Schulausbildung 1980-1984 Gemeinschafts-Grundschule „Gräfin Imma“ in Bochum-Stiepel 1984-1993 Gymnasium am Ostring in Bochum; Abschluß: Abitur Zivildienst 1993-1994 Zivildienst (01.07.1993 bis 30.09.1994) in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum; dabei PflegehelferLehrgang in Herbstein (Hessen) 167 Universität SS 1995 bis WS 1996/97 Studium der Medizin in Hamburg, Absolvierung des Physikums im Frühjahr 1997 SS 1997 bis SS 2000 Studium der Medizin in Essen, Absolvierung des ersten medizinischen Staatsexamens im Frühjahr 1998, Absolvierung des zweiten medizinischen Staatsexamens im Sommer 2000 seit Herbst 2000 Praktisches Jahr 1. Tertial: Chirurgie im St.-Josef-Hospital - Universitätsklinik - in Bochum 2.Tertial: Innere Medizin im St. Josef-Hospital - Universitätsklinik - in Bochum 3. Tertial: Pädiatrie im Kinderspital in Zürich, CH Famulaturen Sommer 1997 Zweimonatige Famulatur in der Chirurgischen Klinik des St.-Josef Hospitals - Universitätsklinik in Bochum Frühjahr 1999 Fünfwöchige Famulatur in der Klinik für Kinderund Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum (Früh- und Neugeborenen Intensivstation) Sommer 1999 Fünfwöchige Famulatur im Royal Hospital for Sick Children in Edinburgh, GB Sommer 1999 Vierwöchige Famulatur in der Kinderarztpraxis Dres. Meyer in Bochum 168 Frühjahr 2000 Dreiwöchige Famulatur in der Kinderchirurgischen Klinik des Marienhospitals - Universitätsklinik - in Herne Praktika/sonstige Berufserfahrung 1994-1995 Beschäftigung als Pflegehelfer ohne Examen auf der Isolierstation der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum Sommer 1995 Beschäftigung auf der neurologisch- pneumologischen Station Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum 1995-1998 Tätigkeit als studentische Hilfskraft im Schlaflabor der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum Frühjahr 1996 Praktikum für einen Monat auf der Intensivstation für Brandverletzungen im Bergmannsheil - Universitätsklinik - in Bochum Sommer 1996 Beschäftigung auf der neurologisch- pneumologischen Station der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum WS 1996-1997 Anstellung im Institut für Anatomie der Universität Hamburg als Vorpräparand 1997-1999 Anstellung als studentische Aushilfe auf der Frühgeborenen-Station der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - Universitätsklinik - in Bochum
