1.2 Dendritische Zellen - Ruhr
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef Hospital Bochum - Universitätsklinik – der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann Interaktion des RS-Virus mit ruhenden und cytokinaktivierten dendritischen Zellen Inaugural Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Andrea Wülfrath aus Wuppertal 2012 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer Koreferent: Jun.- Prof. Dr. rer. nat Tenbusch Tag der mündlichen Prüfung: 15.10.2013 Abstract Andrea Wülfrath Interaktion des RS-Virus mit ruhenden und cytokinaktivierten dendritischen Zellen Problem: Das RS-Virus hat eine große Bedeutung bei schweren pulmonalen Erkrankungen von Säuglingen in den ersten Lebensmonaten. Bis heute gibt es keine zufriedenstellende pathophysiologische Erklärung, warum einige Kinder schwer an einer RSV-Infektion erkranken und andere (v.a. ältere Kinder jenseits des ersten Lebensjahres) nicht. Ein Erklärungsansatz beschäftigt sich mit der Tatsache, dass vor Vollendung des ersten Lebensjahres die dendritischen Zellen (inflammatorische dendritische Zellen), angelockt durch das Entzündungsmilieu der Infektion, aus der Blutbahn einwandern und erst nach dem ersten Lebensjahr immunkompetente, gewebsständige (langerhansähnliche) dendritische Zellen als fester Bestandteil im Lungenepithel vorhanden sind. Damit ist es interessant, die Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen genauer zu betrachten, um mögliche Ursachen für schwere Verläufe einer RSV-Infektion im ersten Lebensjahr zu finden. Methode: Als Modell für die inflammatorischen dendritischen Zellen wurden in der vorliegenden Arbeit cytokinaktivierte dendritische Zellen genutzt und mit ruhenden dendritischen Zellen (als Modell für langerhansähnliche dendritische Zellen) verglichen. Für beide Zelltypen wurden aus Nabelschnurblut mittels MACs-Sortierung CD34+ Stammzellen gewonnen, zu welchen IL-4 zugegeben wurde. Zur Aktivierung wurde ein Cytokincocktail bestehend aus TNF–α, PGE2, IL-6 und IL-1a genutzt, so dass im Anschluss sowohl ruhende als auch aktivierte dendritische Zellen zur Verfügung standen. Nach Inkubation beider Zelltypen mit dem RS-Virus erfolgte die Messung der Expression mehrerer Reifungsmarker (CD208, HLA-DR, TLR4, CD86, CCR6 und CD83) bei ruhenden und cytokinaktivierten dendritischen Zellen mit und ohne RSV-Zugabe. Darüber hinaus erfolgte die Messung der intrazellulären RSV-Replikation, der Menge der infektiösen Partikel im Überstand sowie der Ausschüttung von IL-6 und IL-8. Nach Co-Kultur von T-Zellen mit ruhenden und aktivierten dendritischen Zellen mit und ohne RSV-Infektion, erfolgte die Messung der Cytokine (IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-10), die durch die T-Zellen produziert wurden. Ergebnis: In dieser Arbeit konnte mit den in vitro Versuchen gezeigt werden, dass aktivierte dendritische Zellen mehr infektiöse RSV-Partikel als ruhende dendritische Zellen freisetzen. Des Weiteren kommt es nach RSV-Infektion von aktivierten dendritischen Zellen zu keiner weiteren Expression von Aktivierungsmarkern, jedoch zu einer Zunahme der Expression des TLR-4, einem spezifischen Oberflächenrezeptors, der an der Aufnahme von RSV in die dendritischen Zellen beteiligt ist. Werden die RSV-infizierten, aktivierten dendritischen Zellen mit T-Zellen in Co-Kultur gebracht, so kommt es einerseits bei der primären Immunantwort zu einer verminderten IFN-γ-Produktion und andererseits zu einer gesteigerten IL-10 Produktion im Rahmen der sekundären Immunantwort. Die Ausschüttung des Cytokins IL-6, nicht aber die Ausschüttung des Cytokins IL-8 wird bei den cytokinaktivierten dendritischen Zellen durch die RSV-Infektion gesteigert. Diskussion: Die cytokinaktivierten dendritischen Zellen zeigen eine erhöhte Infizierbarkeit mit RSV, so dass zu vermuten ist, dass die im ersten Lebensjahr an der Immunantwort beteiligten inflammatorischen dendritischen Zellen zu einer Ausbreitung des Virus über die Lymph- und Blutbahn führen. Dieses kann dann wiederum zu einem schweren Verlauf der RSV-Infektion mit systemischen Komplikationen beitragen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine RSV-Infektion zu keiner weiteren Expression von Aktivierungsmarkern auf aktivierten dendritischen Zellen führt. Die bei der Cokultur von aktivierten dendritischen Zellen nach RSV-Infektion mit T-Zellen beobachtete verminderte IFN-γ-Produktion in der primären Immunantwort und die gesteigerte IL-10-Produktion in der sekundären Immunantwort könnten eine effektive antivirale Immunantwort hemmen und so zu einer Ausbreitung des RS-Virus beitragen. Darüber hinaus induziert RSV bei den cytokinaktivierten dendritischen Zellen eine gesteigerte IL-6Produktion, welches als endogenes Pyrogen zur Entwicklung von Fieber, wie es für RSVBronchiolitiden im Säuglingsalter typisch ist, beitragen könnte. Alle diese Ergebnisse legen nahe, dass inflammatorische dendritische Zellen im Säuglingsalter eine schwere RSV-Infektion mit einer ausgeprägten systemischen Reaktion begünstigen könnten. Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ................................................................................................................................. 9 1.1 Das Respiratory Syncytial Virus ..................................................................................... 11 1.1.1 Beschreibung des Virus.............................................................................................. 11 1.1.2 Epidemiologie ............................................................................................................. 14 1.1.3 Klinik der RSV Infektion.............................................................................................. 18 1.1.4 Histologie .................................................................................................................... 20 1.1.5 Diagnostik ................................................................................................................... 20 1.1.6 Therapie und Prophylaxe ........................................................................................... 21 1.1.7 Folgen/Probleme der RSV-Infektion........................................................................... 23 1.2 Dendritische Zellen ......................................................................................................... 26 1.2.1 Erstbeschreibung der dendritischen Zellen (DC) ....................................................... 26 1.2.2 Funktion und Herkunft von dendritischen Zellen ........................................................ 26 1.2.3 Einteilung der dendritischen Zellen ............................................................................ 27 1.2.3.1 Plasmazytoide dendritische Zellen............................................................... 28 1.2.3.2 Myeloide dendritische Zellen........................................................................ 29 1.2.4 Formen der DCs in der Lunge .................................................................................... 31 1.2.5 Funktion im Immunsystem.......................................................................................... 33 1.2.6 Maturation................................................................................................................... 33 1.2.7 T-Zellaktivierung ......................................................................................................... 36 1.2.8 Charakterisierung von dendritischen Zellen in vitro ................................................... 37 1.2.9 Auswirkungen des Entzündungsmilieus..................................................................... 38 1.2.10 Reifungsmarker dendritischer Zellen.......................................................................... 40 1.2.10.1 CCR6............................................................................................................ 40 1.2.10.2 CD83 ............................................................................................................ 40 1.2.10.3 CD86 ............................................................................................................ 41 1.2.10.4 TLR4............................................................................................................. 41 1.2.10.5 HLA-DR ........................................................................................................ 42 1.2.10.6 CD208 .......................................................................................................... 42 1.2.11 Cytokinproduktion durch dendritische Zellen ............................................................. 43 1.3 1.2.11.1 IFN-α ............................................................................................................ 43 1.2.11.2 IFN-β ............................................................................................................ 43 1.2.11.3 IL-6 ............................................................................................................... 44 1.2.11.4 IL-8 ............................................................................................................... 44 T-Zellen........................................................................................................................... 46 1.3.1 Beschreibung der T-Zellen ......................................................................................... 46 1.3.2 Entwicklung der T-Zellen ............................................................................................ 46 1.3.3 Formen der T-Zellen und deren Funktion im Immunsystem ...................................... 48 1.3.3.1 CD8+ T-Zellen............................................................................................... 49 1.3.3.2 CD4+-T-Zellen .............................................................................................. 49 1.3.3.2.1 TH-1 und TH-2 Zellen ...................................................................... 50 1 1.3.4 1.4 1.3.3.2.2 Regulatorische T-Zellen................................................................... 52 1.3.3.2.3 TH-17 T-Zellen................................................................................. 53 1.3.3.3 T-Gedächtniszellen ...................................................................................... 54 1.3.3.4 NK-T-Zellen .................................................................................................. 54 T-Zell spezifische Interleukine und Interferone .......................................................... 55 1.3.4.1 IFN-γ............................................................................................................. 55 1.3.4.2 IL-4 ............................................................................................................... 56 1.3.4.3 IL-13 ............................................................................................................. 56 1.3.4.4 IL-10 ............................................................................................................. 57 Immunreaktion des Organismus nach RSV-Infektion..................................................... 59 2 Fragestellung ......................................................................................................................... 66 3 Material und Methoden .......................................................................................................... 67 3.1 Material ........................................................................................................................... 67 3.1.1 Labormaterialien und technische Geräte ................................................................... 67 3.1.2 Viren ........................................................................................................................... 69 3.1.3 Hep-2 Zellen ............................................................................................................... 69 3.1.4 Antikörper ................................................................................................................... 69 3.1.5 Nährmedien, Gebrauchs- und Pufferlösungen........................................................... 71 3.2 3.2.1 Methoden ........................................................................................................................ 75 Gewinnung der Zellpopulationen................................................................................ 76 3.2.1.1 Sammeln ...................................................................................................... 76 3.2.1.2 Gradient und Waschen................................................................................. 76 3.2.1.3 Ergebnis der Zentrifugation .......................................................................... 77 3.2.1.4 Magnetische Zellseparation ......................................................................... 79 3.2.1.4.1 Überblick .......................................................................................... 79 3.2.1.4.2 Durchführung ................................................................................... 80 3.2.1.4.3 Einfrieren des Durchlaufs ................................................................ 80 3.2.1.5 Kultivierung der CD34+ Zellen und Differenzierung zu DC .......................... 80 3.2.1.6 Ausdifferenzierung und Cytokin-Stimulation der DCs.................................. 81 3.2.1.6.1 3.2.1.7 3.2.2 3.3 Stimulation mit dem Cytokincocktail ................................................ 82 Vorbereitung des RS-Virus .......................................................................... 82 Infektion der ruhenden und aktivierten DCs mit RSV................................................. 83 Messungen der Reifemarker sowohl bei ruhenden DCs als auch bei aktivierten DCs nach Zugabe von RSV.................................................................................................... 84 3.3.1 Fluoreszenz-Färbung der Reifemarker ...................................................................... 84 3.3.1.1 Färbung der Oberflächenmarker (TLR-4, CD86, CCR6, HLA-DR und CD83) ........................................................................................................... 85 3.3.1.2 3.3.2 3.4 Antikörper-Markierung des intrazellulären CD208 ....................................... 86 Durchflusszytometrische Analyse............................................................................... 86 Messung der Cytokinproduktion durch dendritische Zellen sowie der Zahl der infektiösen Partikel.......................................................................................................... 88 3.4.1 RSV – spezifische Realtime PCR............................................................................... 88 2 3.4.2 Bestimmung des Virustiters im Überstand ................................................................. 89 3.4.3 Messung der Cytokine mittels ELISA ......................................................................... 90 3.5 Cokultur von dendritischen Zellen mit naiven T-Zellen................................................... 91 3.5.1 Isolation und T-Zell-Stimulation .................................................................................. 91 3.5.2 Intrazelluläre Cytokin-Färbung ................................................................................... 93 3.6 4 Statistik ........................................................................................................................... 94 Ergebnisse ............................................................................................................................. 95 4.1 Oberflächenmarker der dendrischen Zellen ................................................................... 95 4.1.1 Die gemessene Expression von TLR4 ist bei DCs nach Cytokinstimulation im Falle einer RSV-Infektion deutlich höher.................................................................... 95 4.1.2 Die Expression des CD86 ist bei cytokinaktivierten DCs signifikant erhöht im Vergleich zu ruhenden DCs........................................................................................ 96 4.1.3 Die Expression des CD208 zeigt bei aktivierten DCs eine deutliche Steigerung der Expression im Vergleich zu ruhenden DCs................................................................ 97 4.1.4 Bei den Oberflächenmarkern HLA-DR, CD83 und CCR-6 zeigten sich durch die Aktivierung bzw. RSV-Exposition statistisch keine signifikanten Unterschiede ......... 98 4.2 4.1.4.1 HLA-DR Expression ..................................................................................... 98 4.1.4.2 CD83-Expression ......................................................................................... 99 4.1.4.3 CCR-6-Expression ..................................................................................... 100 Messung der intrazellulären Virusreplikation, der Freisetzung infektiöser Partikel und Ausschüttung der Cytokine IL-6 und IL-8 ..................................................................... 101 4.2.1 RSV-Replikation bei ruhenden und aktivierten DCs................................................. 101 4.2.2 Titer infektiöser Partikel im Überstand infizierter DCs.............................................. 102 4.3 Cytokinproduktion von infizierten dendritischen Zellen ................................................ 103 4.4 Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-13 und IL-10 durch cokultivierte T-Zellen..................... 104 4.4.1 IFN-γ-Produktion durch T-Zellen .............................................................................. 105 4.4.2 Die IL-4-Produktion durch T-Zellen .......................................................................... 106 4.4.3 Die IL-13-Produktion durch T-Zellen ........................................................................ 108 4.4.4 Die IL-10-Produktion durch T-Zellen ........................................................................ 109 5 Diskussion............................................................................................................................ 110 5.1 Cytokinaktivierte dendritische Zellen setzen im Vergleich zu ruhenden dendritischen Zellen mehr infektiöse RSV-Partikel frei....................................................................... 111 5.2 Eine RSV-Infektion führt zu keiner weiteren Expression von Aktivierungsmarkern auf aktivierten dendritischen Zellen .................................................................................... 113 5.3 RSV infizierte aktivierte dendritische Zellen induzieren in cokultivierten T-Zellen in der primären Immunantwort eine verminderte Interferon-γ Produktion und eine gesteigerte IL-10 Produktion in der sekundären Antwort ............................................. 114 5.4 RSV steigert die IL-6, nicht aber die IL-8 Produktion von cytokinaktivierten dendritischen Zellen...................................................................................................... 116 5.5 6 Zusammenfassung ....................................................................................................... 118 Literaturverzeichnis.............................................................................................................. 119 3 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A B C D E F G Abb. AG AK APC bzw. CBMC CDCPD cpm DC ELISA FACS FCS FDC FITC FSC g GM-CSF H h HBSS Hep2 I ICAM IDC IFN Ig IL KBR µl MACS MFI MHC min ml MNZ MOI NK NO OVA PBMC PBS PDC PE PFU PG RNA ROS K M N O P R HLA Abbildung Antigen Antikörper Antigen-präsentierenden Zellen Beziehungsweise Cord Blood Mononuclear Cells Cluster of Differentiation Citrat-Phosphat-Dextrose Counts per minute Dendritic Cell (Dendritische Zelle) Enzyme Linked Immunosorbent Assay Fluorescence activated cell sorting Fetal Calf Serum Follikuläre dendritische Zellen Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat Forward scatter Gravitationskonstante Granulocyte-Makrophage Colony-Stimulating Factor Stunde Hanks balanced salt solution, steril Human Epitelial Cells Human Leukocyte Antigen Intercellular adhesion molecule Interdigitierende dendritischen Zellen Interferon Immunglobulin Interleukin Komplementbindungsreaktion Mikroliter Magnetic Associated Cell Sorting Mittlere Fluoreszenz Intensität Major Histocompatibility Complex Minute Milliliter Mononukleäre Zelle(n) Multiplicity of infection Natürliche Killerzelle(n) Stickstoffmonoxid Ovalbumin Peripheral Blood Mononuclear Cell Phosphate Buffered Saline Plasmazytoide DC Phycoerythrin Plaque forming unit Prostaglandin Ribonuclein Acid (Ribonukleinsäure) Reactive oxygen species 4 rpm S T V RSV sec SCF SF SSC STAT Tab. Tc TCR TGF THTH-1 TH-2 TLR TNF TNF-α VLA vs. Revolutions per minute = Umdrehungen pro Minute Respiratory syncytial virus Sekunde stemm cell factor Stammzellfaktor Sideward scatter Signal Transducers and Activator of Transcription Tabelle cytotoxische CD8+ T-Lymphozyten T-Zell-Rezeptor Transforming Growth Factor T-Helfer-Lymphozyten Typ1-T-Helferzellen Typ2-T-Helferzellen Toll Like Receptor Tumor Nekrose Faktor Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha Very late antigen versus 5 TABELLENVERZEICHNIS: Tabelle 1: Proteine des RS-Virus mit ihren jeweiligen Funktionen ................................................................... 13 Tabelle 2: Subpopulationen myeloider DCs ..................................................................................................... 30 Tabelle 3: Labormaterial und der verwendete Geräte ...................................................................................... 67 Tabelle 4: Monoklonale Antikörper für die magnetische Zellsortierung ............................................................ 69 Tabelle 5: Antikörper für die Oberflächenmoleküle der DCs ............................................................................ 70 Tabelle 6: Testkits für die Messung der Cytokine im Überstand ...................................................................... 70 Tabelle 7: Antikörper für die Färbung der intrazellulären Zytokine ................................................................... 70 Tabelle 8: Kits, Medien und Lösungen zum direkten Gebrauch ....................................................................... 71 Tabelle 9: Zellkulturzusätze.............................................................................................................................. 72 Tabelle 10: IFN-γ -Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik ................................................................ 106 Tabelle 11: IL-4 -Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik .................................................................. 107 Tabelle 12: IL-13-Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik ................................................................. 108 Tabelle 13: IL-10-Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik ................................................................. 109 6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines RS-Virus........................................... 11 Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines RSV mit Lipid-Doppelmembran............................... 12 Abbildung 3: Schematische Darstellung des RSV-Genoms........................................................ 14 Abbildung 4: Auftreten der RSV-Infektion im dualen RSV-Rhythmus von Januar 1996 bis Mai 2004 .................................................................................................. 15 Abbildung 5: Entwicklung von dendritischen Zellen (DC)............................................................ 28 Abbildung 6: Reifung von dendritischen Zellen. .......................................................................... 35 Abbildung 7: Die an der Interaktion zwischen DC und T-Zelle beteiligten Liganden und Cytokine........................................................................................................... 36 Abbildung 8: Entwicklung der T-Zellen. ....................................................................................... 48 Abbildung 9: Rolle des INF-γ in der Differenzierung der T-Helfer-Antwort zugunsten einer TH-1-Antwort ................................................................................................. 56 Abbildung 10: Eindringen des RSV in das Bronchialepithel und intrazelluläre Signale, ............... 60 Abbildung 11: Zelluläre Reaktionen nach RSV-Infektion .............................................................. 61 Abbildung 12: Abhängigkeit des Verlaufs einer RSV-Infektion vom Typ der Immunantwort. ....... 64 Abbildung 13: Zeitplan der Zellisolation und Anzucht von dendritischen Zellen und naiven T-Zellen....................................................................................................... 75 Abbildung 14: Schichtung nach Zentrifugation über den Dichtegradienten .................................. 78 Abbildung 15: Magnetische Zellseparation.................................................................................... 79 Abbildung 16: Induktion und Messung der Reifungsmarker.......................................................... 84 Abbildung 17: Durchflusszytometrische Messung von Oberflächenmarkern dendritischer Zellen. ............................................................................................... 87 Abbildung 18: Messung von Cytokinen und RSV im Überstand dendritischer Zellen................... 89 Abbildung 19: Cokultur von dendritischen Zellen mit naiven T-Zellen. ......................................... 92 Abbildung 20: Durchflusszytometrische Messung der intrazellulären Cytokine............................ 93 Abbildung 21: Expression von TLR-4 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV............................. 96 7 Abbildung 22: Expression von CD86 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. ............................ 96 Abbildung 23: Expression von CD208 in CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV.............................. 97 Abbildung 24: Expression von HLA-DR auf ruhenden DCs und aktivierten DCs unter Einfluß von RSV.................................................................................................................. 98 Abbildung 25: Expression von CD83 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. ............................ 99 Abbildung 26: Expression von CCR-6 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV.......................... 100 Abbildung 27: Zahl der RSV Kopien in infizierten DCs. .............................................................. 101 Abbildung 28: Infektiöse Partikel im Überstand bei ruhenden und aktivierten DCs. ................... 102 Abbildung 29: Produktion von IL-6 durch aktivierte und ruhende DCs. ...................................... 103 Abbildung 30: Produktion von IL-8 durch aktivierte und ruhende DCs. ...................................... 103 Abbildung 31: IFN-γ-Produktion durch cokultivierte T-Zellen. ..................................................... 105 Abbildung 32: IL-4-Produktion durch cokultivierte T-Zellen......................................................... 107 Abbildung 33: IL-13-Produktion durch cokultivierte T-Zellen....................................................... 108 Abbildung 34: IL-10-Produktion durch cokultivierte T-Zellen....................................................... 109 8 1 Einleitung Infekte des Respirationstraktes sind die häufigsten Erkrankungen im Säuglingsund Kleinkindalter. Mit ca. 30 % ist das RS-Virus hierbei eine der häufigsten Ursachen für die Infektion der Atemwege. Es sind bei 95 % der Kleinkinder bis zum 2. Lebensjahr Antikörper gegen RSV nachweisbar. Bei etwa 2 % der RSV-Infektionen nimmt die Krankheit einen schweren Verlauf mit Dyspnoe und verminderter Sauerstoffsättigung, so dass eine stationäre Behandlung erforderlich ist. Bis zu 5 % der stationär behandelten Säuglinge werden im Laufe der Erkrankung beatmungspflichtig. Über die pathophysiologischen Mechanismen, die als Ursache hinter einem schweren Verlauf der Erkrankung in den ersten Lebensmonaten stehen, ist bisher wenig bekannt. Darüber hinaus konnte in Studien gezeigt werden, dass Kinder, die eine schwere RSV-Infektion durchgemacht haben, häufiger an kindlichem Asthma leiden, als Kinder ohne schweren Verlauf der Infektion. In der neueren Zeit finden sich immer mehr Hinweise, dass es auch eine umgekehrte Beziehung zwischen RSV und Asthma gibt. So vermutet Thomsen et al. (Thomsen et al., 2009), dass die genetische Prädisposition für Asthma auch eine Prädisposition für eine schwere RSV-Infektion darstellt. Es konnte in der Studie, die eineiige und zweieiige Zwillingspärchen miteinander verglich, gezeigt werden, dass schwere RSV-Infektionen und Asthma miteinander vergesellschaftet sind. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass eine schwere RSV-Infektion häufiger bei Kindern mit einer positiven Asthma-Anamnese bzw. positiver Familienanamnese auftritt. Auf Grund der hohen Anzahl der Infektionen stellt sich die Frage, wann eine Infektion einen schweren Verlauf nimmt und welche immunologischen Voraussetzungen hierfür entscheidend sind. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die Reife des Immunsystems zum Zeitpunkt der Erstinfektion mit RSV eine entscheidende Rolle für die Schwere der Erkrankung und Folgeerkrankungen spielt. Erst nach Erreichen des ersten Lebensjahres sind DCs im Lungengewebe als fester Bestandteil nachweisbar. In der Zeit zuvor erfolgt die lokale Immunabwehr durch eingewanderte inflammatorische DCs (Tschernig et al., 2006). Im Zeitraum vor Vollendung des ersten Lebensjahres verlaufen die RSV-Infektionen deutlich schwerer. Die DCs, 9 die an der Immunabwehr vor Erreichen des ersten Lebensjahres beteiligt sind, wandern als inflammatorische DCs angelockt durch die Entzündung ein. Um nun im Labor Bedingungen zu schaffen, die mit den Bedingungen im lebenden Organismus vergleichbar sind, wurden in dieser Arbeit dendritische Zellen aus CD-34+ Nabelschnurblutstammzellen gewonnen und unter dem Einfluss von IL-4 in vitro zu dendritischen Zellen differenziert. Diese sind als ruhende dendritische Zellen, wie sie auch im Atemtrakt vorkommen, anzusehen (Schauer et al., 2004; Shortman and Naik, 2007; Villadangos and Schnorrer, 2007). Zusätzlich wurde mittels eines Cytokincocktails bestehend aus TNF-α, IL-1a, IL-6 und PGE2, ein Entzündungsmilieu simuliert, in dem dendritische Zellen aktiviert werden, im Sinne von eingewanderten inflammatorischen DCs myeloider Herkunft. Die so gewonnenen ruhenden und cytokinaktivierten dendritischen Zellen sind geeignet, die in vivo ablaufende Immunantwort im Labor zu simulieren (Bartz et al., 2003a; Caux et al., 1997; Caux et al., 1999; Demedts et al., 2005; Hussell et al., 2004; Krilov, 2001; Sung et al., 2006; Thomas et al., 1993; Valladeau et al., 1999; Waris et al., 1992). 10 1.1 Das Respiratory Syncytial Virus 1.1.1 Beschreibung des Virus Das RS-Virus (Respiratory Syncytial Virus) wurde erstmals 1956 bei erkrankten Laborschimpansen isoliert (Blount, Jr. et al., 1956), die die Zeichen eines oberen Atemwegsinfektes aufwiesen. Erst später wurde dieses Virus in Zusammenhang mit Bronchiolitis bzw. Infektionen des unteren Respirationstraktes insbesondere bei Säuglingen und Kleinkindern gebracht (Chanock et al., 1957). Das RS-Virus gehört zu der Gattung der Pneumoviren, der Familie der Paramyxoviridae. Zu dieser Familie gehören auch das Parainfluenza Virus Typ 1-4 sowie das Masern- und Mumps-Virus. Das RS-Virus ist von einer Hülle umgeben und besitzt, wie für die Familie der Paramyxoviridae typisch, ein helikales Kapsid. Die Hülle besteht aus einer LipidDoppelmembran, die aus der Zellmembran der Wirtszelle stammt. Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines RS-Virus. (Public Health Image Library (PHIL) des CDC, 1981) http://phil.cdc.gov/phil/details.asp, letzter Zugriff 13.06.2012 11 Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines RSV mit Lipid-Doppelmembran, transmembranösen Oberflächen-Proteinen und RNA-Einzelstrang sowie RNA-Polymerase (modifiziert nach Hall, CB., (Hall, 2001)) Das Genom des RS-Virus besteht aus einem einzelnen Strang RNA von negativer Polarität, der 15,2 Kilobasen enthält, und kodiert 11 Proteine in insgesamt 10 Genen (Chanock et al., 1957; Huang and Wertz, 1982). 12 Tabelle 1: Proteine des RS-Virus mit ihren jeweiligen Funktionen* Transmembranöse Oberflächen-Proteine Anheftung an die Wirtszelle (Attachment) G Protein protektives Antigen Chemokine ligand 1 (CX3CL1) - Mimik TLR-4 Antagonist Fusion F-Protein mit der Zellmembran und Eindringen ins Zellinnere (Entry) Neutralisierendes und protektives Antigen TLR agonist SH inhibiert TNF-α Signalweg verhindert Apoptose Innere Hüll-Membran M Zusammenlagerung zum fertigen Virus (Assembly) Nucleokapsid-Proteine N Nukleoprotein RNA Umhüllung mit Kapsid P Phosphoprotein Cofaktor der RNA Synthese L RNA-Polymerase M2-1 Transkriptionsfaktor Regulatorisches Protein M2-2 reduziert virale Transkription erhöht RNA-Replikation Nicht-strukturelle Proteine Inhibierung der Typ 1 IFN Induktion NS1 Inhibierung des Typ 1 IFN Signalweg NS2 Aktivierung PI3K und NF-κB Verhindern Apoptose *Nach Collins und Graham sowie Fuentes et al. (Collins and Graham, 2008; Fuentes et al., 2007) 13 Man unterscheidet die 2 Subtypen A und B des RS-Virus, die aber keine Unterschiede in Ihrer Epidemiologie oder Klinik aufweisen, sondern sich lediglich in der Form des G-Proteins unterscheiden (Taylor et al., 1989). Abbildung 3: Schematische Darstellung des RSV-Genoms modifiziert nach einer Abbildung von Collins und Murphy (Collins and Murphy, 2005). Das Fusionsprotein (F) ist für die Penetration in die Zelle notwendig. Durch seine stabile Struktur ist es ein Angriffspunkt für neutralisierende Antikörper. Zudem sorgt das F-Protein für die Ausbreitung des Virus innerhalb der Zellen, indem es zu einer Verschmelzung infizierter Zellen mit nicht infizierten Zellen führt (Synzytienbildung). Das Glykoprotein (G) ist für die Anheftung an die Zelle notwendig und ist das Unterscheidungsmerkmal der beiden RSV-Subtypen A und B. Das L-Protein (L) dient dem Virus als RNA-Polymerase. Die beiden Matrixproteine (M1, M2) sind für die Anheftung des Nukleokapsid an die Hülle verantwortlich bzw. für die Regulation der Transkription der Virusproteine notwendig. Die beiden nicht-strukturellen Proteine haben eine immunmodulatorische Funktion, u. a. indem sie die Interferon Typ 1 Produktion hemmen. Ein weiterer Faktor für die Ausbreitung von RSV liegt in der relativ hohen Umweltresistenz (das RS-Virus kann stundenlang auf kontaminierten Oberflächen überleben), der aber eine hohe Empfindlichkeit gegen Desinfektionsmittel und Detergenzien gegenüber steht. 1.1.2 Epidemiologie RSV-Infektionen häufen sich saisonal in den Herbst- und Wintermonaten. Vergleicht man mehrere Jahre miteinander, so findet sich ein so genannter dualer Rhythmus mit einem frühen Beginn der Epidemie im Oktober/November im ersten 14 Jahr. Diese weist insgesamt mehr Erkrankungen auf als die Periode im darauf folgenden Jahr. Diese Periode beginnt dann deutlich später im Jahr, teilweise erst im Januar, dauert dann aber auch zum Teil bis in den April hinein. Die zweite, später beginnende Phase verläuft wesentlich schwächer als die frühe Periode. Der duale Rhythmus der RSV-Infektion innerhalb der Jahre 1996-2004 wird in der Abbildung 4 graphisch dargestellt (Terletskaia-Ladwig et al., 2005; Weigl et al., 2001). Abbildung 4: Auftreten der RSV-Infektion im dualen RSV-Rhythmus von Januar 1996 bis Mai 2004 (Quelle: Terletskaia-Ladwig et al. 2005) Etwa 10.000 Krankenhausaufenthalte pro Jahr werden in Deutschland durch eine RSV-Infektion verursacht. Bei Infektionen des Respirationstraktes eines Säuglings im ersten Lebensjahr ist das RS-Virus der häufigste verursachende Erreger (Meissner, 1994). Etwa 0,5-2 % der Kinder mit einem RSV-Infekt müssen stationär behandelt werden. Diese Kinder gehören besonders häufig zur Altersgruppe der 2 - 6 Monate alten Säuglinge (Glezen et al., 1986). Insgesamt ist das RS-Virus für 5090 % der stationär behandlungsbedürftigen Bronchiolitiden verantwortlich (Hall, 2001). So konnte in einer Studie aus Deutschland nachgewiesen werden, dass RSV für die stationäre Behandlung von 1,2 % aller Kinder unter 2 Jahren verantwortlich ist (Weigl et al., 2001). Bis zum dritten Lebensjahr haben dann fast 100 % der Kleinkinder Kontakt mit RSV gehabt. Bei ca. 82 % der Kinder sind bereits bis zum 2. Lebensjahr 15 Antikörper gegen RSV nachweisbar, am Ende des ersten Lebensjahres bei 69 % der Kinder. Bis zu 50 % der Kinder haben bis zum zweiten Lebensjahr mindestens zwei Infektionen mit RSV durchgemacht (Glezen et al., 1986). Ein Grund für die hohe Infektionsrate bei Kindern mit ca. einem halben Lebensjahr ist der Verlust des bis dahin bestehenden Nestschutzes durch die diaplazentar übertragenen Antikörper der Mutter, die etwa bis Ende des zweiten Lebensmonats abgebaut sind (Wang et al., 1997). Ein weiterer Grund ist, dass Säuglinge noch nicht die Fähigkeit besitzen, Antikörper gegen die glykolierten Proteine (Proteine G und F des RSV) zu bilden und somit auf die Antikörper der Mutter angewiesen sind. In einer Studie von Glezen et al. konnte nachgewiesen werden, dass die Schwere der Erkrankung innerhalb der ersten 6 Lebensmonate umgekehrt proportional zu den mütterlichen Antikörpern ist (Glezen et al., 1981). Erst Kinder ab dem zweiten Lebenshalbjahr bilden schützende Antikörper gegen glykosilierte Epitope und können somit neutralisierende Antikörper bilden (Forster et al., 1995). Auch Stillen scheint ein protektiver Faktor zu sein, dieses konnten Holberg et al. nachweisen (Holberg et al., 1991). Im Allgemeinen verläuft eine RSV-Infektion v. a. bei Kindern unter einem Jahr zu einem erhöhten Anteil schwer und befällt auch den unteren Respirationstrakt. So entwickeln nach einer RSV-Exposition ca. 40 % der Kinder eine Bronchiolitis bzw. 25% eine Pneumonie. Insgesamt 1-2 % der mit RSV infizierten Kleinkinder müssen sogar wegen einer schweren Infektion der unteren Atemwege stationär behandelt werden (Psarras et al., 2004; Simoes, 1999). 58 % der infizierten und stationär behandelten Kinder sind zum Zeitpunkt der Infektion unter 6 Monate alt, 17 % zwischen 6-11 Monate alt, 18 % sind 12-24 Monate alt (Hall et al., 2009). Darüber hinaus müssen etwa 2-5 % der stationär behandelten Kinder während der Erkrankung maschinell beatmet werden (Leader and Kohlhase, 2002). Eine RSV-Infektion kann sogar tödlich verlaufen, wenn sie von einer bakteriellen Superinfektion oder anderen Atemwegserkrankungen begleitet wird oder Vorerkrankungen vorliegen. Eine tödlich verlaufende RSV-Infektion findet man vor allem in den ersten zwei Lebensjahren (Nair et al., 2010). Etwa 1-2 % der schweren RSV-Infektionen verlaufen tödlich (La Via et al., 1993; Robert Koch Institut, 2011). In den USA z.B. sind ca. 500 Todesfälle /Jahr, die auf eine RSV- 16 Infektion zurückzuführen sind. In Risikogruppen für schwere RSV-Infektionen kommt es jedoch zu einer Mortalität von bis zu 5 %. Umgekehrt findet sich bei 60-70 % der Säuglinge, die wegen einer Bronchiolitis stationär behandelt werden, RSV als verursachende Erkrankung (Hall, 1999). Im Gegensatz zu anderen Erkrankungen finden sich keine Unterschiede bei der Inzidenz der RSV-Infektion innerhalb der Europäischen Union. So lässt sich überall in der EU eine vergleichbare Inzidenz feststellen (Weigl et al., 2001). Als Risikofaktoren für eine schwere RSV-Infektion bei Säuglingen und Kleinkindern wurden von Simoes für Industrieländer folgende Faktoren identifiziert (Simoes, 2003): • Frühgeburtlichkeit < 35 SSW • Männliches Geschlecht • Viele Geschwister, v. a. im Kindergartenalter • Rauchen im Haushalt • Niedriger sozioökonomischer Status • Kein oder geringes Stillen • Tagesbetreuung anderer Kinder • Immunschwäche • Lungenerkrankungen oder neuromuskuläre Erkrankungen • Entlassung von Frühgeborenen in den Monaten Oktober bis Dezember Die Immunität, die einer Primärantwort gegen das RS-Virus folgt, ist weder ausreichend, um vor einer Reinfektion zu schützen, noch dauerhaft wirksam. Sie hinterlässt lediglich einen Schutz, der vor schweren Reinfektionen schützt (Hall, 2001). Jede weitere Infektion verläuft dadurch deutlich milder als die erste Infektion. Bei Erwachsenen konnte nachgewiesen werden, dass ein niedriger Anitkörper-Titer mit einer höheren Wahrscheinlichkeit einer Reinfektion mit RSV korreliert (Hall et al., 1991). 17 1.1.3 Klinik der RSV Infektion Übertragen wird das RS-Virus über Schmier- und Tröpfcheninfektion. Das RSVirus wird primär über den oberen Respirationstrakt aufgenommen. Das Virus kann aber auch über die Konjunktiven des Auges eindringen (Bitko et al., 2007). Die Inkubationszeit des RS-Virus beträgt 2-8 Tage. Die Infektion an sich klingt nach etwa ein bis drei Wochen ab. Primär ist der obere Respirationstrakt betroffen, bei schweren Verläufen greift die Infektion auf den unteren Respirationstrakt über. Die Symptome der RSV-Infektion sind jedoch abhängig von der Ausbreitung sehr unterschiedlich. Die Symptome reichen von leichtem Schnupfen bis hin zu einer Pneumonie oder gar einer beatmungspflichtigen Bronchiolitis. Auch ein Keuchhusten-ähnliches Krankheitsbild mit inspiratorischem Stridor kann als Folge einer RSV-Infektion auftreten. Einen stummen Verlauf gibt es jedoch so gut wie gar nicht. Die Ursache für ein Übergreifen der RSV-Infektion auf den unteren Respirationstrakt scheint entweder die Verschleppung der Viren durch Aspiration oder die Ausbreitung des Virus innerhalb der Zellen von proximal nach distal zu sein. Bei Patienten im Säuglingsalter verlaufen etwa 75 % der Erkrankungen als Infektion der oberen Luftwege mit Rhinitis, meistens begleitet durch Fieber und eventuell vermindertem Appetit (Hof and Dörries, 2005). Häufig wird die Infektion von einer Otitis media begleitet und es findet sich eine Konjunktivitis. Eine Otitis findet sich in etwa 40 % der Fälle (Krilov et al., 1987; Krilov, 2001). In einigen Fällen kann die Infektion im weiteren Verlauf auf die unteren Atemwege übergreifen und als eine interstitielle Bronchiolitis bzw. Pneumonie oder als eine obstruktive Bronchitis in Erscheinung treten. Diese Infektion unterhalb des Larynx findet man in 25 % bis 40 % der Fälle. Risikofaktoren für einen schweren Verlauf sind u.a. Alter unter 4 Monaten sowie eine Immunschwächung z.B. nach Transplantation (Holberg et al., 1991). Ist der untere Respirationstrakt betroffen, findet sich eine Verlegung und Verengung der Bronchiolen. Die Zeichen einer Mitbeteiligung der Bronchiolen sind u.a. Tachypnoe, exspiratorisches Giemen, abgeschwächtes Atemgeräusch und feinblasige Rasselgeräusche. Zusätzlich zeigt sich ein hypersonorer Klopfschall auf Grund einer Überblähung der Lunge. Das Kind wird dyspnoisch, dieses zeigt sich vor allem durch Nasenflügeln und eine deutliche Flankenatmung. Die O2Sättigung kann auf <90 % absinken (Hall et al., 1979). Es kann sogar zu einer 18 respiratorischen Partial- oder Globalinsuffizienz kommen, so dass das Kind für einige Tage beatmungspflichtig wird oder zumindest zeitweise der Bedarf zusätzlicher Sauerstoffzufuhr über eine Nasensonde besteht. Bei sehr kleinen Kindern findet sich ein eher untypisches Bild. So kann sich die Infektion lediglich durch Unruhe oder verminderte Aktivität (i. S. von Schlappheit und Trinkunlust) bemerkbar machen. Jedoch sind auch ein sepsisähnliches Bild oder sogar ApnoeEpisoden möglich. Bei Erwachsenen hingegen tritt die Infektion häufig lediglich mit Symptomen eines banalen Infektes des oberen Respirationstraktes auf. Es gibt jedoch auch schwerer verlaufende Infektionen bei Erwachsenen. So wurde durch Han et al. nachgewiesen, dass ca. 2-9 % der Pneumonien bei Erwachsenen durch RSV verursacht werden (Han et al., 1999). Ältere Erwachsene, die an chronischen Herz- oder Lungenerkrankungen leiden, oder ein suprimiertes Immunsystem aufweisen, haben ein erhöhtes Risiko bei Reinfektion an einer schweren RSV-Infektion zu erkranken. Duncan et al. konnten nachweisen, dass eine Herzerkrankung eine RSV-Infektion deutlich begünstigt. So wurde bei 91 % der hospitalisierten Patienten, die an einer Herzerkrankung litten, eine nosokomiale Infektion mit RSV nachgewiesen, wohingegen nur 31 % der Patienten ohne Herzleiden an RSV erkrankten. Zudem fand sich ein deutlich höherer Virus-Titer im Nasopharyngealsekret bei beatmeten Patienten im Vergleich zu nicht-beatmeten Patienten. Bei Patienten mit Vorerkrankungen des Respirationstrakts konnte dies ebenfalls im Vergleich zu gesunden Patienten nachgewiesen werden (Duncan et al., 2009). Die Rekonvaleszenz bei unkompliziertem Verlauf liegt bei 1-2 Wochen. Aber auch nach Verschwinden der Symptome können die Patienten das Virus weitere 1-3 Wochen ausscheiden. (CDC (Centers for Desease Control and Prevention), 2011) 19 1.1.4 Histologie Histologisch lassen sich eine Hyperämie und ein Ödem des Epithels nachweisen (Hof and Dörries, 2005). Zusätzlich finden sich Infiltrate aus mononukleären Zellen. Entsteht in der Folge eine schwere RSV-Bronchiolitis, so ist diese durch die Nekrose des Bronchiolusepithels gekennzeichnet, während das Ödem und Hypersekretion das Lumen obstruieren. 1.1.5 Diagnostik Im Vordergrund der Diagnosestellung „RSV-Infektion“ stehen klinische Zeichen, sowie das typische Infektionsalter und der Zeitpunkt des Auftretens der Infektion in den Phasen der jahreszeitlichen Häufung. Klinische Zeichen einer RSV-Infektion sind auskultatorisches Knistern und exspiratorisches Giemen über der Lunge, hypersonorer Klopfschall, sowie Nasenflügeln und Einziehungen der Thoraxwand. Bei jungen Säuglingen können Apnoen als erstes Symptom auftreten. Zudem kann man eine pulsoxymetrisch gemessene Sauerstoffsättigung zwischen 85-90% messen. Radiologisch zeigt sich ein diffuses Bild mit streifigen Verdichtungen, Dystelektasen und Zeichen einer Überblähung (Khamapirad and Glezen, 1987). Labortechnisch besteht die Möglichkeit eines RSV-Schnell-Tests (Schauer et al., 2007). Der Virusnachweis durch ELISA, Immunfluoreszenz oder PCR aus dem Nasen-Pharynx-Sekret ist ebenfalls möglich. Der Antigen-Nachweis mittels ELISA hat eine Sensitivität von 80-90 %, wobei der Test je sensitiver reagiert, je jünger die Patienten sind (Englund, 1999; Schauer et al., 2007). Als Goldstandard in der Diagnostik einer RSV-Infektion gilt immer noch die Zellkultur in der der zytopathische Effekt nachgewiesen wird. Diese wird aber nur noch als „Kontrolle“ der anderen Verfahren in klinischen Studien angewendet, da die Zellkultur mit einer Anzuchtdauer von bis zu 7 Tagen einen zu langen Nachweiszeitraum für den klinischen Alltag besitzt. 20 1.1.6 Therapie und Prophylaxe Die Therapie besteht vor allem in einer symptomatischen Therapie, da es keine spezifische antivirale Therapie gegen das RS-Virus gibt. In leichten Fällen bieten sich als rein symptomatische Therapie KochsalzInhalationen, fiebersenkende Medikamente und abschwellende Nasentropfen an. Kinder mit einer schweren RSV-Infektion werden zur Überwachung und intensiveren Therapie stationär aufgenommen. Sie werden bei ausreichender Flüssigkeitszufuhr klinisch und mittels Monitor überwacht, wobei ein besonderes Augenmerk der Sauerstoffsättigung gilt. Die Gabe von abschwellenden Nasentropfen und das tracheale Absaugen sollen den Atemwegswiderstand senken. Als zusätzliche Maßnahmen stehen Oberkörperhochlagerung, Sauerstoffgabe und ausreichend Ruhe zur Verfügung. Sollten diese Maßnahmen nicht ausreichend sein, kann zusätzlich mit ß-2Sympathomimetikum sowie Adrenalin inhaliert werden. Des Weiteren können nach einigen Studien inhalative bzw. systemisch verabreichte Steroide die Schwere der Erkrankung mildern und die Krankheitsdauer verkürzen, wobei der Einsatz der Steroide umstritten ist (van Woensel et al., 2003). Sie haben aber keinen Einfluss auf das Outcome der Patienten. In neuen Studien wurde die Wirksamkeit der bisher üblichen Therapiemaßnahmen untersucht. Eber konnte 2011 nachweisen, dass lediglich die Therapie mit einer hypertonen Kochsalzlösung einen messbaren Erfolg in der Therapie der akuten RSV-Infektion bringt. Alle andere Therapieansätze sind nach seinen Untersuchungen nicht routinemäßig einzusetzen, jedoch sollte im Einzellfall vom klinischen Erfolg abhängig, über eine Anwendung entschieden werden (Eber, 2011). Eine weitere Therapiemöglichkeit besteht im Einsatz des Virustatikums Ribavirin, welches allerdings nur in der Frühphase der Erkrankung erfolgversprechend ist und nicht als Standard-Therapieverfahren eingesetzt wird. Als weitere Therapieoptionen stehen noch IFN-α, DNAse und die Gabe von Surfactant zur Verfügung. 21 In schweren Fällen stellt sich eine partielle bzw. sogar globale respiratorische Insuffizienz ein, so dass eine CPAP-Beatmung bzw. eine Intubation mit kontrollierter Beatmung notwendig wird. Seit 1999 gibt es die Möglichkeit der passiven Immunisierung durch den monoklonalen Antikörper der IgG1-Subklasse Palivizumab (Handelsname Synagis®), der gegen das F-Protein des RS-Virus gerichtet ist. Dieser stört die Fusion viraler und zellulärer Membranen, wodurch das Eindringen des Virus in die Wirtszelle verhindert wird (Welliver, 1998). In Deutschland wird, vor allem aus wirtschaftlichen Gründen, laut AWMF-online Leitlinie, die Anwendung von Palivizumab beschränkt auf • Kinder, die in der 35. Schwangerschaftswoche oder früher geboren wurden und zu Beginn der RSV-Saison jünger als 6 Monate sind, • Kinder unter 2 Jahren, die innerhalb der letzten 6 Monate wegen bronchopulmonaler Dysplasie behandelt wurden, • Kinder unter 2 Jahren mit hämodynamisch signifikanten angeborenen Herzfehlern. Diese Leitlinie ist eine Konsensusbildung der Deutschen Gesellschaft für Pädiatrische Infektiologie (DGPI), der Deutschen Gesellschaft für Pädiatrische Kardiologie (DGPK), der Gesellschaft für Pädiatrische Pneumologie (GPP) und der Gesellschaft für Neonatologie und Pädiatrische Intensivmedizin (GNPI). Der Antikörper wird während der RSV-Saison in 5 intramuskuläre Injektionen (i.m.) im Abstand von 3-4 Wochen verabreicht, wobei mit der ersten i.m. Injektion im November zu Beginn der RSV Saison begonnen wird. Die Sicherheit und Effizienz von Palivizumab wurde in der IMPACT-RSV-Studie, einer randomisierten, doppelblinden, placebo-kontrollierten Studie nachgewiesen. Bei der Untersuchung Palivizumab im Vergleich zu einem Placebo konnte eine signifikante Reduktion der Zahl von Hospitalisierungen infolge RSV-Erkrankungen in der Gruppe die Palivizumab erhielt, nachgewiesen werden. Der Anteil der Hospitalisierungen sank von 10,6 % der Placebogruppe auf 4,8 % der Palivizumab-Gruppe. Zudem konnte Palivizumab die Zahl der intensivpflichtig verlaufenden RSVInfektionen reduzieren, nicht aber die Dauer des Intensivaufenthaltes bei schwerer RSV-Infektion (Suresh, 1999). 22 Jedoch ist eine Impfung mit attenuierten oder abgetöteten Viren bislang nicht möglich. Derzeit wird an der Entwicklung eines Impfstoffes durch mehrere Arbeitsgruppen gearbeitet. Einige Arbeitsgruppen arbeiten an Vaccinen die das gereinigte Protein F oder Kombinationen aus den Oberflächenmolekülen F, G und oder M enthalten. In klinischen Studien zeigten diese bisher nur eine unzureichende Wirkung, die zeitlich begrenzt war. Ein Impfstoff löste sogar eine allergische Reaktion vom Typ II aus. Neben den Oberflächenmolekülen gibt es noch andere Ansatzstellen für die Impfstoffentwicklung: attenuierte Viren bzw. rekombinante Impfstoffe oder einen adenoviralen Vektor. Bei allen Ansätzen zur Entwicklung eines Impfstoffes müssen zwei wesentliche Punkte berücksichtigt werden, zum einen, dass der Impfstoff keinen klinischen Effekt hat, zum anderen aber eine ausreichende Immunantwort im menschlichen Organismus auslöst. Der Impfschutz sollte möglichst dauerhaft im Vergleich zur erreger-induzierten Immunität sein und zu keiner Verschiebung der Immunantwort führen. Ein Beispiel für eine zugunsten der TH-2-Antwort verschobenen Immunantwort ist der in den 1960er Jahren entwickelte Impfstoff mit Formalin inaktiviertem Virus (Olson and Varga, 2007). Hier kam es zu mehreren Todesfällen nach der Immunisierung. Bei der Obduktion der verstorbenen Kinder sowie in Versuchen mit Mäusen / Affen von Ponnuraj et al. im Jahr 2001 ließ sich eine ausgeprägte Eosinophilie des Lungenepithels nachweisen, ohne dass IFN-γ beteiligt war (Ponnuraj et al., 2001). 1.1.7 Folgen/Probleme der RSV-Infektion Das Hauptproblem der RSV-Infektion ist, dass es immer wieder zu schweren Verläufen kommt. Dieses tritt vor allem bei Kindern innerhalb der ersten 6 Lebensmonate auf. Bis heute sind die genauen Pathomechanismen hinter diesen schweren Verläufen unklar. Es wird vermutet, dass sie in der Unreife des Immunsystems also durch die Abwesenheit der DCs im ersten Lebensjahr im Lungengewebe begründet sind. Ein weiteres Problem der RSV-Infektion ist die nosokomiale Infektion vor allem bei Frühgeborenen sowie Kleinkinder mit chronischer Grunderkrankung bei langen Krankenhausaufenthalten. So beobachteten Berner et al, dass innerhalb einer zehnjährigen Beobachtungsperiode 66 % der nosokomialen RSV-Infektionen bei 23 Frühgeborenen auftraten. Dabei infizierten sich 75 % dieser Kinder in den ersten 3 Lebensmonaten (Berner et al., 2001). Häufigster Übertragungsort mit 50 % ist dabei die Intensivstation. Somit ist die Verhütung nosokomialer Infektionen ein Ansatzpunkt für die Prävention schwerer RSV-Infektionen (Hall and Douglas, Jr., 1981). Es konnte in Mausmodellen nachgewiesen werden, dass das RS-Virus weit nach Beendigung der klinischen Symptomatik im Organismus persistiert. So konnten Schwarze et al. im Mausmodell virales Genom sowie messenger RNA 100 Tage nach der eigentlichen Infektion in Lungenproben nachweisen. Wurden zusätzlich CD4+ und CD8+ T-Zellen ausgeschaltet, so konnte das Virus erneut einen Infekt auslösen (Berner et al., 2001; Schwarze et al., 2004). Einige Studien haben gezeigt, dass eine RSV-Infektion in den ersten Lebensjahren, die mit einer schweren Bronchiolitis einhergeht, ein erhöhtes Risiko für eine Asthma-Entwicklung darstellt. Schauer et al. konnten 2002 bei einer Beobachtung von Kindern im ersten Jahr nach einer schweren RSV-Infektion mit Bronchiolitis nachweisen, dass diese zu fast 70 % eine Obstruktion der Atemwege aufwiesen. Bei ca. 30 % traten sogar rezidivierende Obstruktionen auf. Zudem war das Gesamt-IgE bei 33 % der Kinder, die eine RSV-Infektion durchgemacht haben, im Vergleich zu 2,3 % der Kinder in der Kontrollgruppe, erhöht. Speziell das für inhalative Allergene spezifische IgE war im Vergleich zur Kontrollgruppe sogar deutlich erhöht (Schauer et al., 2002). Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, dass Kinder die wegen einer schweren RSV-Infektion stationär behandelt werden mussten, ein deutlich erhöhtes Allergierisiko in der Kindheit (gemessen im Alter von 7 Jahren) haben (Sigurs et al., 2000). So konnten Stein et al. in einer Studie nachweisen, dass Kinder nach einer RSVInfektion deutlich häufiger Asthma bzw. rezidivierende, obstruktive Lungenerkrankungen bis zum 13. Lebensjahr aufweisen. Im Vergleich zu Kindern nach einer Parainfluenza-Infektion litten fast doppelt so viele Kinder nach einer RSV-Infektion an rezidivierenden, obstruktiven Lungenerkrankungen. Im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe (1 %) sogar 23 mal mehr Kinder (Stein et al., 1999). Einige Studien z.B. von Silvestri et al. begrenzten den RSV-Effekt auf einen Zeitraum, der bis ins Jugendlichenalter reichte. Eine schwere RSV-Infektion in den 24 ersten 6 Lebensmonaten ging in dieser Studie gehäuft mit der Entwicklung eines kindlichen Asthmas/ rezidivierender, obstruktiver Bronchitiden einher, welche aber zwischen dem 11. und 13. Lebensjahr verloren gingen (Silvestri et al., 2004). Es konnte in neueren Studien nachgewiesen werden, dass eine schwere RSVInfektion, die vor allem die tiefen Atemwege betrifft, eine bis zu mehrere Jahre anhaltende Hyperreagibilität - über das 13. Lebensjahr hinaus - des Bronchialsystems nach sich ziehen. 2010 untersuchten Sigurs et al. Patienten 18 Jahre nach einer schweren RSVInfektion, die sie innerhalb des ersten Lebensjahres durchgemacht hatten. In dieser Follow-up Studie konnte gezeigt werden, dass die Patienten zu einem deutlich höheren Anteil (39 %) weiterhin unter Asthma litten, im Vergleich zur Kontrollgruppe mit 9 %. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass 41 % im Vergleich zu 14 % in der Kontrollgruppe im Alter von 18 Jahren eine ganzjährige Allergie aufwiesen, ebenso konnte ein Asthma mit einer frühen allergischen Sensibilisierung bei 30 % im Vergleich zu 1 % in der Kontrollgruppe nachgewiesen werden (Sigurs et al., 2010). In diesem Zusammenhang interessant ist eine Studie, die Kinder nach passiver RSV-Immunisierung im Vergleich zu nicht immunisierten Kindern betrachtet. Die Autoren kommen zu dem Ergebnis, dass die Gruppe, die das Immunglobulin erhielt, eine deutlich höhere Rate an normalen Lungenfunktionen hat. Zusätzlich weist diese Gruppe einen geringeren Anteil an Kindern mit einer atopischen Erkrankung auf. Untersucht wurden die Kinder 7 und 10 Jahre nach der passiven Immunisierung (Wenzel et al., 2002). 25 1.2 Dendritische Zellen Dendritische Zellen (im Weiteren nur als DCs bezeichnet) gehören zu den Antigen-präsentierenden Zellen (APC) (Masten and Lipscomb, 1999). APC sind heterogen in Bezug auf Lokalisation, Phänotyp (Expression ihrer Zelloberflächenmoleküle) und Funktion. Neben dendritischen Zellen können auch Monozyten, Makrophagen und B-Lymphozyten Antigene präsentieren. In dem nun folgenden Kapitel soll ein Überblick über die Familie der dendritischen Zellen gegeben werden. 1.2.1 Erstbeschreibung der dendritischen Zellen (DC) Beschrieben wurden die DCs erstmals 1973 von Steinman und Cohn, die diese in der Milz von Mäusen entdeckten (Steinman and Cohn, 1973). Sie benannten die Zellen nach ihrer Morphologie, den baumartigen Cytoplasma-Ausläufern (griechisch dendros = Baum bzw. lat. dendriticus = verzweigt), dendritische Zellen. In den 80iger Jahren erkannte man, dass die im 19. Jahrhundert von Langerhans beschriebenen Langerhanszellen in der Epidermis ebenfalls zu dieser Gruppe von Zellen gehören. 1.2.2 Funktion und Herkunft von dendritischen Zellen Die dendritischen Zellen gelten als Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem. Sie steuern die Ausdifferenzierung Antigenspezifischer Effektorzellen (T-Zellen) und induzieren somit eine langfristige systemische Immunität. Die DCs entstammen aus CD34+ Stammzellen des Knochenmarks. Von dort aus wandern sie in die peripheren Gewebe oder ins Blut. Je nach Umgebungsmilieu entstehen verschiedene Untergruppen der DCs mit unterschiedlicher Lokalisation und Funktion. Eine Übersicht über die verschiedenen Untergruppen der DCs gibt die Abbildung 5. Die DCs weisen eine hohe Dichte der antigenprozessierenden Strukturen wie Endosomen, Lysosomen und die Birbeck Granula auf. DCs findet man in fast allen Geweben des Körpers als dichtes Netzwerk, wo sie als Wächterzellen fungieren. 26 Als unreife DCs verweilen sie im jeweiligen Gewebe oder kreisen im Blut bis zum Antigen-Kontakt. Treffen sie auf ein fremdes Antigen, beginnt in den regionären Lymphknoten die Maturation der DCs mit Prozessierung und Präsentation des Antigens über MHC-Moleküle. So lösen sie über die Präsentation des Antigens eine spezifische T-Zell-Antwort aus (Hart, 1997). Während der embryonalen Entwicklung lassen sich die DCs ab der 6. Gestationswoche im Dottersack des Embryo nachweisen, ab der 12. Woche im Thymus, Lymphknoten, Milz sowie in nicht lymphatischen Organen. Die DCs haben eine durchschnittliche Lebensdauer von 8 bis 14 Tagen. So konnte in Tierexperimenten mit Ratten neben einer geringen Dichte im Säuglingsalter auch eine verminderte Fähigkeit zur Maturation gemessen werden (Nelson et al., 1994). Zusätzlich konnte bei Säuglingen eine deutlich verminderte IL-12-Produktion im Vergleich zu Erwachsenen gemessen werden. Was zu einer reduzierten TH-1-Antwort führt (Langrish et al., 2002). 1.2.3 Einteilung der dendritischen Zellen Alle dendritischen Zellen stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab. Durch verschiedene Reize und unterschiedliche Einflüsse von Chemokinen und Cytokinen entstehen verschiedene Untergruppen der DC. Diese Untergruppen der DCs lassen sich wiederum nach verschiedenen Kriterien unterteilen. Sie lassen sich auf Grund der Morphologie und der Oberflächenmerkmale in myeloide dendritische Zellen (mDC) und plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) unterteilen. Die wichtigsten Unterschiede bei der Unterteilung in myeloide und plasmazytoide (lymphoide) dendritische Zellen sowie die für die Differenzierung notwendigen Cytokine und deren typischen Oberflächenmarker finden sich in der Abbildung 5. Diese ist nach einer Abbildung von Vermaelen und Pauwels modifiziert (Vermaelen and Pauwels, 2005). 27 hämatopoetische Stammzelle CD34+ myeloide Vorläuferzelle lymphoide Vorläuferzelle GM-CSF +SCF + TNF-α CD14- CD1a+ Vorläuferzelle CD14+ CD1aVorläuferzelle GM-CSF +SCF +TNF-α +TGF-β GM-CSF + IL-4 epitheliale DC = LangerhansZelle CD11c + CD1a LAG E-cadherin Langerin S100 IL 12 Abbildung 5: myeloide DC CD11c + CD33 BDCA-1 + BDCA-3 TLR-2 + TLR-4 IL 12 plasmacytoide DC = PDC = DC 2 CD123 = IL-3R CD45RA BDCA-2 + BDCA-4 TLR-7 TLR-9 MHC-II CD11c - IFN α/β Entwicklung von dendritischen Zellen (DC). Aus einer myeloiden Vorläuferzelle entstehen epitheliale DCs, sowie myeloide DCs. Zusätzlich entstehen aus lymphoiden Vorläuferzellen plasmazytoide DCs (modifiziert nach Vermaelen und Pauwels, 2005). 1.2.3.1 Plasmazytoide dendritische Zellen Die plasmazytoiden DCs haben ihre Bezeichnung auf Grund der gemeinsamen Vorläuferzellen mit Lymphozyten sowie ihrer morphologischen Ähnlichkeit zu lymphoiden Zellen erhalten. Die plasmazytoiden DCs sind CD11c negativ und exprimieren keine weiteren myeloiden Marker. Demgegenüber steht eine hohe Expression von CD123 (IL-3 Rezeptor), CD62L (=L-Selectin, ein Marker für Lymphozyten) und CD4. Kommt es zu einer Antigen-Präsentation, werden durch die plasmazytoiden dendritischen Zellen Typ1 Interferone, hier vor allem IFN-α und IFN-β, produziert. Diese haben einen antiviralen Effekt. Zusätzlich dienen die plasmazytoiden DCs der Regulation der Immunantwort, indem sie Autoantigene den Thymozyten präsentieren und eine Apoptose bei autoaggressiven T-Zellen hervorrufen. 28 1.2.3.2 Myeloide dendritische Zellen Die dendritischen Zellen mit myeloider Herkunft werden nach ihrer Lokalisation in interdigitierende dendritische Zellen und Langerhans-Zellen unterteilt. Beide Untergruppen der myeloiden DCs finden sich in Haut und Schleimhäuten u.a. auch im Atmungsepithel (s. Kapitel Lunge). Die Herkunft follikulärer dendritischer Zellen (FDC) ist noch ungeklärt. Sie sind vor allem im Bereich der Lymphfollikel in der Nähe der B-Zellen lokalisiert. Hier werden den B-Zellen durch die follikulären dendritischen Zellen Antigen-Antikörper-Komplexe präsentiert. Die follikulären dendritischen Zellen besitzen keine MHC-II-Moleküle und dienen lediglich der Antigen-Stimulation der B-Zellen. Eine Übersicht gibt die Tabelle 2, diese wurde nach einer Übersichtsarbeit von Satthaporn et al. modifiziert (Satthaporn and Eremin, 2001). 29 Tabelle 2: Subpopulationen myeloider DCs * Langerhans-Zellen = epitheliale DC Herkunft Lokalisation DC14- und CD1a finden sich in der Epidermis der Haut und Schleimhäuten Eigenschaften kostimulatorische Moleküle CD80 (B7-1) CD86 (B7-2) CD83 ICAM1 (CD54) CD58(LFA-3) Interdigitierende dendritische Zellen (IDC) = Myeloide DC + DC14 und CD1a- im gesamten Körper, - v. a. jedoch in den T-Zell-Regionen von Milz, Thymus, Lymphknoten, Tonsillen und Peyer-Plaques kostimulatorische Moleküle CD80 (B7-1) CD86 (B7-2) CD83 ICAM1 (CD54) CD58(LFA-3) AntigenProzessierung ja ja Besonderheiten Birbeck-Granula E-cadherin Langerin S100 ja ja ja TGF-ß CD68 Faktor XIIIa MHC-II CR1 FcγR Maturationssignal Synonyme CD11c + + - TGF-ß DC - epitheliale DC ja ja nein nein TNF GM-CSF IL-13 IL-4 - interstitielle CD - myeloide DC - IL-4 DC ja Follikuläre dendritische Zellen (FDC) - vor allem in den Keimzentren von Lymphfollikeln (z. B. im Lymphknoten, Peyer-Plaques). - B-Zellregion im LK - negativ für Marker hämatopoetischer Zelllinien - kein MHC - dienen der konstanten AntigenStimulation der B-Zellen - langlebig - radioresistent - keine Phagozytose; - lösen keine primäre Immunantwort aus nein ja + CR 2 +CR3 nein ? *modifiziert nach einer Übersichtsarbeit von Hall and Douglas und Satthaporn et al. (Hall and Douglas, Jr. 1981; Satthaporn and Eremin 2001) 30 1.2.4 Formen der DCs in der Lunge In der Lunge finden sich die immaturen DCs vor allem in den Bronchien und den weiter distalen Abschnitten des Respirationstraktes, wo sie ein Netzwerk bilden (Holt et al., 1990). In der Lunge finden sich zwei unterschiedliche Typen der DCs: Zum einen intraepitheliale DCs, die den Langerhanszellen ähneln, zum anderen interstitielle DCs, welche weiter differenziert sind als die intraepithelialen DCs (Holt and Stumbles, 2000). Die Langerhanszellen der Lunge finden sich vor allem im Bronchial-Epithel. Sie zeigen die typischen Merkmale der Langerhanszellen wie Birbeck Granula sowie CD1a und Langerin als Oberflächenmarker (Sung et al., 2006). Demedts et al. konnten zusätzlich zu den bereits bekannten CD1a+ Langerhanszellen zusätzliche 3 DC-Subtypen nachweisen. Sie fanden im Lungengewebe nach Lobektomie oder Pneumektomie: - myeloide DCs Typ 1 CD1c Typ 2 CD141 / CD11c - plasmazytoide DCs / CD11c CD303 / CD123 - epitheliale DCs (Langerhans) (Demedts et al., 2005) Zusätzlich ändert sich die Zahl der DCs in der Lamina propria der Trachea innerhalb des ersten Lebensjahres. Im Mausmodell lassen sich solche Veränderungen ebenfalls beobachten: Schon in der Fetalzeit sind mesenchymale DCs in der Lunge der Mäuse nachweisbar. Die DCs der Mucosa lassen sich bereits einige Wochen nach der Geburt nachweisen, sie erreichen eine ähnliche Dichte wie bei erwachsenen Mäusen etwa zum Zeitpunkt des Abstillens. Die „Besiedlung“ erfolgt dann von proximal (Nasenschleimhaut) nach distal (Bronchien) (Vermaelen and Pauwels, 2005). Beim Menschen zeigt sich ein ähnliches Bild, wobei die vollständige Besiedlung erst mit einem Jahr nachweisbar ist. So konnten Tschernig at al eine Zunahme der DCs nach dem ersten Lebensjahr nachweisen. In dieser Studie wurde post mortem die Menge der in der Lunge vorhandenen DCs (langerhansähnliche DCs) bei Kindern unter einem Jahr untersucht. Bei gesunden Kindern konnten keine DCs intraepithelial nachgewiesen werden. Erst bei Kindern, die vor ihrem Tod an einem Atemwegsinfekt litten, konnten sich auch DCs nachweisen lassen. Waren die Kinder älter als ein Jahr, waren regelhaft DCs vorhanden (Tschernig et al., 2006). 31 In einer Dissertation von Horstkemper 2010 konnte gezeigt werden, dass in vitro TGF-ß DCs (langerhansähnliche Zellen) im Vergleich zu IL-4 DCs (myeloide Zellen) einen Abfall der produzierten Viruspartikel und der viralen RNA aufweisen, wohingegen es zu einer Zunahme der produzierten Viruspartikel bei den IL-4 DCs kam. In dieser Arbeit wurde vermutet, dass es sich bei diesem Effekt um einen Produktionsfehler in der viralen Morphogenese handelt. So ist zu vermuten, dass die nach dem ersten Lebensjahr vorhandenen Langerhanszellen (vergleichbar mit TGF-ß DCs) in der Lage sind, die Virusreplikation und Produktion der Viruspartikel zu vermindern (Horstkemper, 2010). Zusätzlich zu den unterschiedlichen Formen der DCs in der Lunge konnte den einzelnen Subtypen jeweils unterschiedliche Lokalisation nachgewiesen werden: So konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass die Langerhanszellen der Lunge v. a. in der Basallamina des Bronchialepithels und in den Wänden der Arteriolen zu finden sind, wohingegen die anderen DCs der Lunge weiter distal der Basallamina zu finden sind (Sung et al., 2006). Die nahe Lage der Langerhans DCs zur Epitheloberfläche und deren Expression der Tight-Junction Proteine, ermöglicht ihnen die Öffnung von Tight Junction und die Migration hierdurch bzw. das Herausstrecken der Dendriten ins Lumen des Respirationstraktes. Die DCs werden abhängig von einer bestehenden Infektion aus dem Blut ins Lungengewebe rekrutiert. So lösen inhalierte Viren / Bakterien eine massive Einwanderung von DCs in die Lunge aus. So konnte die Arbeitsgruppe um McWilliam bei Mäusen eine DC-Einwanderung innerhalb von 2 Stunden nach Antigen-Kontakt nachweisen (McWilliam et al., 1994). Geleitet werden die DCs durch Gradienten von inflammatorischen Chemokinen, diese eingewanderten DCs werden auch als inflammatorische DCs bezeichnet. Sie bestimmen auch die Immunantwort in der Lunge bei Kindern unter einem Jahr. 32 1.2.5 Funktion im Immunsystem Den dendritischen Zellen kommt im Immunsystem eine Art „Wächterfunktion“ zu. Ihre Funktion besteht in der Antigen-Aufnahme und der anschließenden Präsentation des Antigen den T-Lymphozyten in den Lymphknoten. Daher gehörten die DCs zu den professionellen APC. Sie besitzen als alleinige Antigenpräsentierende Zellen die Fähigkeit, naive T-Zellen zu aktivieren und sind somit der erste Schritt der spezifischen Immunantwort. Die dendritischen Zellen entwickeln sich über myeloiden Vorläuferzellen aus CD34+ Zellen des Knochenmarks (Caux et al., 1997). Zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung werden sie als progenitor DC bezeichnet, gelangen sie ins Blut, werden sie als precursor DC bezeichnet. Sie wandern ins Gewebe und werden dort ortsansässig, zu diesem Zeitpunkt werden sie als immature bzw. ruhende DC bezeichnet. Dieses ortsansässigen geschieht Zellen oder auf Grund über von Oberflächenmarkern Chemokinreizen, die durch der ein Entzündungsgeschehen ausgeschüttet werden. 1.2.6 Maturation Die Maturation beschreibt den Wandel der immaturen DCs, die eine hohe Phagozytosefähigkeit (Antigenaufnahme) besitzt, hin zu einer T-Zell stimulierenden reifen DC. Dieser Prozess benötigt etwa 48 Stunden. Durch die Aufnahme des Antigens über Phagozytose, Pinozytose oder Endozytose und dessen Prozessierung beginnt die Maturation der DCs. Eingeleitet wird die Maturation durch den Kontakt mit Pathogenen oder Mediatoren wie TNF-α, IL-1 und PGE-2 (Thery and Amigorena, 2001). Während der Maturation verliert die DC die Fähigkeit zu phagozytieren und es werden spezifische Oberflächenmarker, die der T-Zell-Stimulierung dienen, stärker ausgeprägt. Zu Oberflächenmarkern der reifen DC gehören p55, DC-LAMP und CD83. Zudem erscheinen auf der Zelloberfläche vermehrt MHC-II-Moleküle sowie CD86. Zusätzlich verliert die reife DC Oberflächenmoleküle, die sie so von anderen Monozyten unterscheidet. Hierunter fallen CD14, CD32 und CD64 (Satthaporn and Eremin, 2001). 33 Zusätzlich kommt es zu einer Veränderung des exprimierten CytokinrezeptorMusters. Der Reifungsprozess kann durch einen der 3 folgenden Faktoren induziert werden: 1. Aufnahme eines exogenen Antigens und Prozessierung von diesem zu kurzen Peptidfragmenten und Präsentation über MHC-II (Turley et al., 2000) 2. Das Vorhandensein proinflammatorischer Cytokine (TNF-α, Interferone, IL1ß oder IL-18). Fehlen diese, kommt es zu einer Produktion von IL-10 und TGF-ß durch die DCs, was zu einer verminderten oder gar fehlenden Immunantwort führen kann. 3. Interaktion des DC Oberflächenmoleküls CD40 mit dem T-Zell Molekül CD40L (O'Sullivan and Thomas, 2003a) Die folgende Abbildung zeigt die Veränderungen der Oberflächenmoleküle im Vergleich einer unreifen und einer reifen DC. Modifiziert nach Sallusto et al, Hart und Satthaporn und Eremin (Hart, 1997; Sallusto et al., 1995; Satthaporn and Eremin, 2001). 34 - Hohes intrazelluläres MHC-II Expression von CD1a Aktive Endozytose für bestimmte Partikel und Proteine; Anwesenheit von FcgR und aktive Phagozytose fehlende Fähigkeit zur T-Zell Stimulation Adhäsions und kostimulatorische Moleküle fehlen (CD40/54/58/80/86) niedrig/fehlend: CD25, CD83, p55, DEC-205, 2A1antigen Reaktion auf GM-CSF, aber nicht auf M-CSF und G-CSF Reifung gehemmt durch IL-10 Aktin CD32+ viel Mannose-Rezeptor - - Abbildung 6: Dendriten zur Fortbewegung Æ hohe Mobilität Antigen Aufnahme: MakrophagenMannose-Rezeptor-, DEC-205Rezeptor Antigen-Präsentation: hohe MHC Klasse I und II Expression Hohe Dichte an Molekülen die für die T-Zell-Bindung und Costimulation, (z. B. CD40, CD54/ICAM-1, CD58/LFA-3, CD80/B7-1 und CD86/B7-2) wichtig sind hohe IL-12 Produktion Æ Resistenz gegen IL-10 abhängige, DChemmende Moleküle Fehlen von makrophagen-typischen Oberflächenmarkern wie CD14, CD115/c niedriges CD68, Myeloperoxidase und Lysozym, CCR 7 wird erhöht exprimiert Æ dient der Wanderung in die regionalen LK wenig bis keine Pinozytose / Phagozytose kein Aktin CD32- Reifung von dendritischen Zellen. Die Funktion ändert sich von einer Antigenaufnehmenden Zelle hin zur Antigen-präsentierenden Zelle. Hierbei ändern sich auch die Oberflächenmarker sowie die intrazellulären Eigenschaften. Zusätzlich zu den Veränderungen auf der Zelloberfläche kommt es zu Veränderungen im Zellinnern: Das Zytoskelett wird umgebaut. Währenddessen beginnt die Wanderung der DCs in den regionalen Lymphknoten. Geleitet werden die DCs durch viele verschiedene Stimuli. Hierunter fallen z.B. Chemokine oder inflammatorische Cytokine wie TNF und IL-1 (Cella et al., 1997). Ein Chemokin ist z.B. CCL21 (Vermaelen et al., 2001). CCL21 wird durch den Rezeptor CCR7 erkannt, der auf ausgereiften dendritischen Zellen vermehrt exprimiert wird. CCR7 dient der DC als Migrationshilfe, da sich die DC entlang des CCL21-Gradienten bewegt (Vermaelen and Pauwels, 2005). In der T-Zell-Region des LK angekommen, präsentiert die DC über MHC-II den 35 T-Zellen die prozessierten Moleküle und aktiviert diese, wenn das präsentierte Peptid durch die T-Zelle erkannt wird. Je nach Erregertyp kann die dendritische Zelle die Art der T-Zell-Antwort steuern (Saint-Vis et al., 1998a). Pulendran et al. konnten zeigen, dass die Langerhans-Zellen (CD14- und CD1a+) und mDC (CD14+ und CD1a-) beide IL-1α/β, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, TNF α/β sowie GM-CSF ausschütten. Kommt es zu einem CD40-Kontakt, so schütten die Langerhans-Zellen (CD14- und CD1a+) IL-12 aus, die mDC (CD14+ und CD1a-) jedoch IL-10 und IL-12 (Pulendran et al., 2001). In dieser Arbeit soll auch geklärt werden, ob das Umgebungsmilieu der DC die Art der T-Zell-Antwort oder ausgeschüttete Cytokinmuster beeinflusst. 1.2.7 T-Zellaktivierung Die T-Zelle im Lymphknoten erkennt die über MHC-I bzw. MHC-II präsentierten Antigen über ihren spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR). Dadurch bilden T-Zelle und DC einen Cluster (Stoll et al., 2002). Da diese Verbindung alleine nicht ausreichend stabil ist, sind zusätzliche Adhäsionsmoleküle auf den Oberflächen beider Zellen notwendig, die die immunologische Synapse stabilisieren. Die daran beteiligten Liganden werden in der folgenden Abbildung 7 aufgezeigt (Hart and Prickett, 1993; Prickett et al., 1992; Starling et al., 1995). Abbildung 7: Die an der Interaktion zwischen DC und T-Zelle beteiligten Liganden und Cytokine. Das Antigen wird mittels MHC-II dem TCR präsentiert (Modifiziert nach Immunologie Holländer (Holländer Georg A., 2005) und Diederik (Diederik et al., 2001)). 36 Die Abbildung 7 zeigt eine Übersicht über die an der T-Zelle / DC-Synapse beteiligten Liganden sowie das über MHC-II präsentierte Antigen. Von der DC werden verschiedene Cytokine hierunter IL-12, IL-15 und IFN-α, IL-4 sowie IL-10 ausgeschüttet. Für die endgültige T-Zellaktivierung sind 3 Signale verantwortlich: 1. Adhäsion: Der erste Kontakt zwischen T-Lymphozyt und DC erfolgt antigenunabhängig über Adhäsionsmoleküle und ihre Liganden - Die vorübergehenden Verbindungen zwischen T-Zelle und DC werden durch Schritt 2 und 3 stabilisiert. 2. Antigen-Präsentation: Erkennung des MHC-II gebundenes Peptid mittels TCR 3. Kostimulation von CD80 bzw. CD86 mit dem CD28 Oberflächenmarker der auf der T-Zelle exprimiert wird (Dilioglou et al., 2003). CD80 und CD86 werden zusammen mit MHC-II im Rahmen der Maturation exprimiert. Sie induzieren die CD40L Expression. Des Weiteren ist die Interaktion von CD40 mit CD40L notwendig. Beide Signale zusammen sind verantwortlich für die optimale und abgestimmte Bildung der TH-polarisierenden Cytokine vor allem IL-2 (O'Sullivan and Thomas, 2003b). Cytokine, die von DCs und anderen Zellen sezerniert werden, bestimmen die Differenzierung der TH-Antwort: eine Umwandlung zu einer TH-1 Zelle wird ausgelöst durch IL-12, IFN-γ und IFN-α, eine TH-2-Antwort hingegen durch IL-4 (Ohshima and Delespesse, 1997; Wenner et al., 1996). Zusätzlich werden sowohl von der DC als auch von der T-Zelle Chemokine und Cytokine ausgeschüttet, die eine Modulation der Immunantwort bewirken, im Sinne eines Feedback-Mechanismus. Die an dieser Verbindung beteiligten Moleküle sind in der Abbildung 7 dargestellt. 1.2.8 Charakterisierung von dendritischen Zellen in vitro Die meisten Einblicke in die Biologie und Interaktion von dendritischen Zellen mit anderen Zellen wurden in vitro gewonnen. Die Zellen wurden aus Monozyten des peripheren Blutes oder aus CD34+Stammzellen unter Zugabe spezifischer Cytokine angezüchtet. In Versuchen von 37 Caux et al. ließen sich aus CD34+ Stammzellen nach Zugabe von GM-CSF und TNF-α zwei unterschiedliche DC Untergruppen nachweisen. Diese reifen bis zum 12. Tag der Kultur heran (Caux et al., 1992). Desweiteren konnte diese Arbeitsgruppe nachweisen, dass eine der beiden Vorläuferzellen (CD1a+) BirbeckGranula, LAG-Antigen sowie E-cadherin exprimieren. Diese Oberflächenmarker finden sich in vivo auf epidermalen Langerhanszellen. Die andere Subpopulation an Vorläuferzellen (CD14+ - später auch CD1a+) exprimierten an ihrer Oberfläche CD2, CD9, CD68, und Faktor XIIIa. Diese Oberflächemarker sind wiederum charakteristisch für intradermale DCs (Caux et al., 1997). In Versuchen konnte aus CD14+ Monozyten, die aus peripheren Blutmonozyten isoliert wurden (PBMC) und denen GM-CSF und IL-4 zugegeben wurden, eine einheitliche Population unreifer DCs gewonnen werden, die die Eigenschaften inflammatorischer DCs besitzen (Holländer Georg A., 2005; Sallusto and Lanzavecchia, 1994). Diese Zellen wandern als inflammatorische DCs auch bei der Immunreaktion in der Lunge bei Kindern innerhalb des ersten Lebensjahres ein, da diese noch keine Langerhans DCs in der Lunge besitzen. Angelockt werden diese Zellen durch einen Cytokincocktail, der aus einer Entzündungreaktion resultiert. 1.2.9 Auswirkungen des Entzündungsmilieus In dieser Arbeit wurden diese unreifen DCs mit DCs verglichen, die mit einem Cytokincocktail behandelt wurden. Dieser Cytokincocktail bestand aus IL-1, IL-6 sowie PGE2 und dient der Simulation eines Entzündungsmilieus. Die hinzugefügten Stimulantien IL-1, IL-6 sowie PGE2 führen zu einer frühzeitigen Maturation der DCs. Interleukin-1 (IL-1) ist ein zentraler Mediator der proinflammatorischen Immunreaktion und zielt auf die Rekrutierung und Aktivierung von immunkompetenten Zellen. So konnten Vermaelen et al. nachweisen, dass es bei einer bestehenden allergischen Entzündungsreaktion in den Atemwegen zu einer vorzeitigen Hochregulation der T-Zell kostimulatorischen Moleküle CD40 und B7-2 kommt. (Vermaelen and Pauwels, 2003). Das Entzündungsmilieu scheint also verantwortlich für eine vorzeitige Maturation der DCs zu sein. 38 IL-1 ist neben den viralen Bestandteilen ein wesentlicher Faktor, der die Maturation der DCs hervorruft (Thery and Amigorena, 2001). IL-6 hat ebenfalls einen proinflammatorischen Effekt auf die dendritischen Zellen. PGE2 ist ebenso wie IL-1 notwendig, um eine Maturation der DCs einzuleiten. PGE gehört zu der Familie der Arachnoidonsäuren (Goodwin and Ceuppens, 1983) und ist ein proinflammatorischer Mediator. Zusätzlich ist PGE2 in der Lage, die T-Zellproliferation zu inhibieren und eine Verminderung der TH-1 Cytokine wie IL-1 und IFN-γ herbeizuführen. Im Gegensatz dazu hat PGE2 aber keinen Einfluss auf die TH-2 Cytokine. In Bezug auf die Stimulation der DC führt PGE2 neben der Maturation, der Anteil der aktivierten DCs ist nach PG Zugabe erhöht (Zhou and Tedder, 1995), zu einer gesteigerten Fähigkeit T-Zellen zu stimulieren (Jonuleit et al., 1997; Rieser et al., 1997). Des Weiteren wurde durch (Kalinski et al., 1997a; Kalinski et al., 1997b; Kalinski et al., 1998) beobachtet, dass es nach PG Stimulation (und IL-1ß und TNF-α) zu einer verminderten IL-12 Produktion der stimulierten DCs kommt und die T-ZellAntwort in Richtung TH-2 verschoben wird. Es wurde eine verminderte Produktion von IL-2 und IFN-γ beobachtet, sowie eine Erhöhung der IL-4 und IL-5 Produktion. Dieses spricht für eine Verschiebung der T-Zell-Antwort in Richtung einer TH-2 Antwort. Zusätzlich konnte bereits Kalinski eine Aktivierung der TH-17 Zellen durch PGE2 nachweisen (Kalinski, 2012). Möglicherweise ist hier ein Ansatzpunkt für Therapiemöglichkeiten. Findet man einen Weg gezielt die Aktivierung der TH17 Zellen zu verhindern, so könnte eine folgende Hyperreagibilität und Verschiebung in Richtung TH-2 verhindert bzw. reduziert werden. Denn Wakashin et al. konnten einen Zusammenhang zwischen IL-23 bzw. TH-17 Zellen nachweisen (Wakashin et al., 2009). Zusammengefasst lässt sich durch die Zugabe dieser drei Stoffe eine Aktivierung der DCs und eine Verschiebung der T-Zell-Antwort in Richtung TH-2 herbeiführen. 39 1.2.10 Reifungsmarker dendritischer Zellen 1.2.10.1 CCR6 Der CCR-Rezeptor 6 wird durch das CCR6 Gen kodiert und wird auch als CD196 bezeichnet. An den CCR6 bindet CCL20. Dieses Protein gehört zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Exprimiert wird der Rezeptor vor allem durch unreife dendritische Zellen und Memory-T-Zellen. Der Ligand dieses Rezeptors ist ein inflammatorisches Protein, welches durch Makrophagen gebildet wird (MIP-3 Alpha). Es hat sich gezeigt, dass dieser Rezeptor für die B-Zell-Reifung und Antigen-gesteuerte B-ZellDifferenzierung wichtig ist. Zusätzlich ist er für die Einwanderung von DC und TZellen während der Entzündungsreaktion notwendig. Der Rezeptor CCR6 auf den DCs spielt eine entscheidende Rolle bei einer Einwanderung der DC bei einer allergischen Reaktion. Die entzündlich veränderten Lungenepithelzellen produzieren vermehrt CCL20 welches die DCs anlockt (Cook et al., 2000b; Lundy et al., 2005). Ebenso wird durch die Epithelen GM-CSF produziert, welches eine Proliferation der DC auslöst. Auch bei allergischen Reaktionen in der Lunge spielt CCR6 bzw. das dann vermehrt ausgeschüttete CCL20 eine Rolle. Lundy et al. konnten bei CCR6-knockout-Mäusen eine deutliche verminderte Einwanderung von DCs nach Allergenkontakt feststellen (Lundy et al., 2005). 1.2.10.2 CD83 CD83 ist ein membrangebundenes Glykoprotein und gehört zu Ig-Superfamilie. CD83 ist ebenfalls ein Oberflächenmolekül, welches erst bei der Aktivierung exprimiert wird und ist somit ein Maß für die Maturation der DCs. Vor der Maturation ist CD83 auf immaturen DCs nicht nachweisbar. CD83 ist wichtig für die T-Zell-Aktivierung. Ein Beispiel für die Bedeutung des CD83-Oberflächenmarkers zeigt, dass einige Viren die Suppression des CD83 als Methode verwenden, die Immunreaktion des Wirtes zu modulieren bzw. zu vermindern. So konnten Salio et al. bei DCs nach Infektion mit dem Herpes simplex Virus Typ 1 nachweisen, dass es durch das Virus zu einer Reduktion des CD83 Oberflächenmarkers kommt. Dieses hat zur Folge, dass die entsprechenden DCs eine verminderte Fähigkeit zur T-ZellAktivierung besitzen (Salio et al., 1999). Es scheint, dass CD83 ein wichtiger 40 Faktor in der T-Zell-Aktivierung ist. Dieses wird durch Versuche von Prechtel et al. unterstützt. Die Arbeitsgruppe verhinderte durch selektives „gene silencing“ durch „small interfering RNAs (siRNAs)“ eine Expression des CD83 Markers, ohne dass andere Funktionen oder Oberflächenmarker beeinträchtigt wurden. Bei anschließenden Versuchen zur T-Zell-Aktivierung zeigte sich dann eine deutlich verminderte Fähigkeit der DCs (ohne den CD83 Marker) zur T-Zell-Aktivierung. Zudem fand sich eine Veränderung der ausgeschütteten Cytokine, hier vor allem IL-6 und TNF-α (Prechtel et al., 2007). 1.2.10.3 CD86 Der Oberflächenmarker CD86 ist für die T-Zellaktivierung notwendig. 2 Proteine sind auf der T-Zelloberfläche für die Bindung des CD86 Moleküls notwendig, CD28 und / oder CTLA-4. Um T-Zellen zu aktivieren, benötigt CD86 die Kostimulation durch CD80. CD86 nimmt, nachdem es die T-Zellen gebunden hat, Einfluss auf deren IL-12 Produktion. Bei unreifen DCs ist vor Antigen-Kontakt CD86 nicht nachweisbar. Dieser Marker wird erst während der Maturation der DCs exprimiert und ist somit ein Maß für den Maturationsgrad der DCs (Hart, 1997). 1.2.10.4 TLR4 Der TLR4 (Toll-like Rezeptor 4), auch als CD284 bezeichnet, gehört zu einer Gruppe von Rezeptoren die als PRRs (Pattern Recognition Receptors) bezeichnet werden und dienen der Erkennung von PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns). Sie spielen eine wichtige Rolle in der Aktivierung des antigenspezifischen erworbenen Immunsystems bzw. dessen Modulation. Der TLR4Rezeptor interagiert mit LY96 und CD14. Über den intrazellulären TRIAP / MYD88 und TRAM / TRIF Signalweg führt der Rezeptor zu einer NFκ-B-Aktivierung, einer Produktion proinflammatorischer Cytokine und Typ I Interferone (Lu et al., 2008). TLR-4 ist ein Rezeptor, der bei der Aktivierung der angeborenen Immunantwort bei einer Infektion mit dem RSV-Virus, aktiviert wird. Die Aktivierung des TLR-4 erfolgt über das F-Protein des RSV. Kurt-Jones et al. konnten zeigen, dass bei TLR-4 Knockoutmäusen das RSV deutlich länger nachweisbar war im Vergleich zu normalen Mäusen (Kurt-Jones et al., 2000). Ausserdem konnten Haynes et al. zusätzlich eine verminderte Produktion von IL-12 nachweisen (Haynes et al., 2001). 41 TLR-4 auf der Oberfläche der DCs ist der Bindungspartner des F-Proteins des RSVirus und dient der Penetration des Virus in die Zellen (Openshaw and Tregoning, 2005). 1.2.10.5 HLA-DR Das HLA (human leukocyte antigen) System, zu dem die MHC-Komplexe gehören, sind Oberflächenmarker, die auf die Antigen-Präsentation spezialisiert sind. HLA ist auf dem Chromosom 6 zu finden. Ihnen ist gemeinsam, dass sie in der Zellmembran verankerte Glykoproteine sind. Ihre Funktion liegt in der Selbsterkennung des Organismus und der Abwehr gegen Mikroorganismen. Die MHC-Moleküle sind in drei große Gruppen unterteilt: • Die erste Gruppe der HLA-Moleküle findet sich auf allen kernhaltigen Zellen des Organismus. Die Funktion der MHC-I Moleküle besteht in der Präsentation von viralen Peptiden an CD8+ T-Zellen. Man unterscheidet die Isotypen HLA-A, HLA-B und HLA-C (Delves and Roitt, 2000a; Delves and Roitt, 2000b). • Die zweite Gruppe der MHC-Moleküle, hierzu gehört auch das untersuchte HLA-DR, werden auf allen immunkompetenten Zellen des Organismus exprimiert, sie dienen der Antigen-Präsentation an CD4+ T-Zellen (Shankarkumar et al., 2002). HLA-DR wird auch auf immaturen DCs exprimiert. Nach der Maturation kommt es zu einer vermehrten Expression auf der Zelloberfläche (Hart, 1997). • Zur dritten Gruppe der HLA-Moleküle gehören unter anderem die plasmalöslichen Complement-Faktoren C2 und C4. 1.2.10.6 CD208 CD208 wird auch als DC-Lamp bezeichnet, wobei Lamp für cell lysosomal associated membran Protein steht. CD208 ist ein Marker für mature DCs. CD208 findet man intrazellulär auf der Hülle der MHC-II beinhaltenden Vesikel (MHC class II-containing intracellular compartments (MIIC)). Nach Antigen-Kontakt erfolgt die Einleitung der Maturation. Sowohl MHC-II als auch CD208 werden vermehrt gebildet (Saint-Vis et al., 1998b). Im weiteren Verlauf der Maturation werden die intrazellulären MHC-II-Moleküle mit dem prozessierten Antigen beladen. Die so gebildeten MHC-II-Peptid-Komplexe 42 werden von CD208 getrennt. Die MHC-II-Peptid-Komplexe werden auf der Oberfläche der DCs exprimiert und präsentieren dort den T-Zellen das Antigen. CD208 verbleibt hingegen intrazellulär in Lysosomen, die perinukleär gelegen sind (Salaun et al., 2004). Möglicherweise haben sie dann im Anschluss einen regulatorischen Einfluss auf die Lysosomen. 1.2.11 Cytokinproduktion durch dendritische Zellen 1.2.11.1 IFN-α IFN-α ist ein Glykoprotein aus 166AS. IFN-α wird nicht durch immature plasmazytoide DC produziert (Hart, 1997). Es wird als Reaktion auf die Erkennung von intrazellulären viraler oder bakterieller Nukleinsäuren ausgeschüttet. Bindet IFN-α an den Rezeptor, erfolgt intrazellulär die Aktivierung des JAK-STAT-Signalweges. Als Produkt wird vermehrt IL-6 und IFN-γ produziert. Hauptsächlich wird das IFN-α von virusinfizierten Zellen ausgeschüttet und hemmt in den umgebenden Zellen die weitere Virussynthese. Zusätzlich kommt es durch IFN-α zu einer vermehrten MHC-I Expression. Auch konnte in Studien nachgewiesen werden, dass HIV- und HSV-infizierte Zellen vermehrt IFN-α ausschütten (Ghanekar et al., 1996) . 1.2.11.2 IFN-β Das IFN-β bindet an den gleichen Rezeptor wie IFN-α. Es hat daher eine ähnliche Wirkung wie IFN-α. 43 1.2.11.3 IL-6 Neben dendritischen Zellen wird das IL-6 auch von Monozyten, Makrophagen und T-Zellen, Endothelzellen und Epithelzellen gebildet. Ca. 6 Stunden nach Bakterienkontakt wird IL-6 produziert. Das ausgeschüttete IL-6 führt bei B-Zellen zur Produktion von Immunglobulinen. Ein Faktor der die Produktion von IL-6 bewirkt, ist die Virusinfektion der Zelle (Ghanekar et al., 1996). IL-6 aktiviert nach Bindung an den IL-6-Rezeptor mit GP130 intrazellulär den JAK-STAT Pathway (Heinrich et al., 1998). Stimulatoren für die Produktion des IL-6 sind IL-1, TNF-α und TGF-β. Im Gegensatz dazu wird die Produktion des IL-6 durch IL-4, IL-10 und Glukokortikoide gehemmt. Ein weiterer Faktor der zur Freisetzung führt, ist Hypoxie bzw. Trauma. Man findet auch eine physiologische Erhöhung des IL-6 im Serum durch Muskelkontraktion (Febbraio and Pedersen, 2005). IL-6 hat 2 Rollen im Immungeschehen. Einmal als proinflammatorisches Molekül. So dient es in der Neonatologie / Intensivmedizin als früher Entzündungsmarker. Des Weiteren hat IL-6 eine antiinflammatorische Wirkung, diese beinhaltet einen inhibitorischen Effekt auf TNF-α und IL-1 sowie wie Aktivierung von IL-1ra und IL-10. Der Effekt von IL-6 auf T-Zellen besteht in einer Steigerung der Proliferation und Differenzierung sowie der Produktion von IL-2. Bei B-Zellen führt IL-6 zu einer endgültigen Maturation zu einer Antikörper produzierenden Zelle (Kishimoto et al., 1995). 1.2.11.4 IL-8 Das IL-8 wird ebenfalls von dendritischen Zellen aber auch durch Makrophagen und epitheliale Zellen produziert. Man findet IL-8 aber auch in Endothelzellen, wo das IL-8 in Weibel-Palase-Bodies bis zu ihrer Ausschüttung gespeichert werden. Die Ausschüttung des IL-8 wird durch die Aktivierung der TLR aktiviert. Das dadurch ausgeschüttete IL-8 führt dann zu einer Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten (neutrophil chemotactic Faktor). Haupt-Bindungsprotein für das IL-8 ist der CXCR1- und CXCR2-Rezeptor, der an das G-Protein gekoppelt ist. Dem IL-8 wird eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Bronchiolitis zugeschrieben, die vor allem durch virale Infektionen verursacht wird. IL-8 ist ein 44 wichtiger Faktor in der Entstehung und Aufrechterhaltung eines Entzündungsgeschehens. So kann ein erhöhter Nachweis von IL-8 auf das Vorliegen einer (lokalen) Entzündungsreaktion hinweisen. Genetische Studien bei RSV-Infektionen in England haben gezeigt, dass Polymorphismen im IL-8 Gen mit unterschiedlicher Schwere der RSV-Infektion einhergehen. Eine Variante mit erhöhter IL-8 Ausschüttung war bei Kindern mit RSV-Bronchiolitis deutlich häufiger vertreten als in einer Vergleichsgruppe (Hull et al., 2000). 45 1.3 T-Zellen 1.3.1 Beschreibung der T-Zellen Die T-Zellen sind eine Unterform der Lymphozyten und sind an der erworbenen Immunantwort, der zellvermittelten Cytotoxizität sowie der Hypersensitivitätsreaktion vom Spättyp beteiligt. T-Zellen sind ausschließlich in der Lage, Antigene in Form von Oligopeptiden, die ihnen mittels MHC-I bzw. MHC-II präsentiert werden, zu erkennen. Diese Besonderheit bezeichnet man als MHC-Restriktion. Funktion der aktivierten T-Zellen ist die Regulation der Immunantwort durch: - Freisetzung regulierender Cytokine und Chemokine - Hilfe bei der Antikörperproduktion - Suppression virusinfizierter Zellen - Hilfe bei der Zerstörung von Bakterien Der TCR (T-Zell-Rezeptor) ist ein Heterodimer, aufgebaut aus der α-Kette und der ß-Kette. Beide Ketten bestehen sowohl aus einem konstanten Anteil als auch aus einem variablen Anteil, der für die Peptiderkennung verantwortlich ist. Der variable Anteil entsteht durch somatische Rekombination. 1.3.2 Entwicklung der T-Zellen Die Entwicklung der T-Zellen ist von der positiven und negativen Selektion im Thymus geprägt und ist entscheidend für die Fähigkeit der T-Lymphozyten. Hierdurch wird sichergestellt, dass die reifen T-Lymphozyten Fremd-Antigene nur dann erkennen, wenn diese über MHC präsentiert werden. Zudem wird verhindert, dass Selbst-Antigen eine Immunreaktion auslösen (Takahama, 2006; Yin et al., 2006). Das Mikromilieu und die spezifischen Zellen (Stromazellen) des Thymus sind für die T-Zellreifung notwendig. Diese gliedert sich in mehrere Unterschritte, in denen sich die Oberflächenmarker der T-Zellen ändern. Sie können verschiedenen 46 Regionen des Thymus zugeordnet werden. Lymphoblastische Vorläuferzellen aus dem Knochenmark siedeln sich über den Blutweg in der Thymusrinde an. In der ersten Phase der Entwicklung, die in der Thymusrinde stattfindet, fehlt den T-Lymphozyten sowohl CD4 als auch CD8, sie sind doppelt negativ. Sie besitzen einen prä TCR (ß-Kette und prä α-Kette). Im weiteren Verlauf erfolgt ein Rearrangement der Gene der ß-Kette und die Zelle exprimiert den sogenannten Prä-TCR, der als Rezeptor für Wachstumssignale gilt. Im weiteren Verlauf der Reifung werden die Thymozyten doppelt positiv, d.h. sie besitzen sowohl CD8 als auch CD4. Nun werden die Gene der α-Kette kombiniert und bei erfolgreicher Zusammenstellung mit der ß-Kette kombiniert, so dass ein vollständiger und funktionierender TCR entsteht. Nun kann die Toleranzinduktion in einem 2-stufigen Selektionsprozess beginnen. Der erste Schritt geschieht durch die Thymusepithelzellen in der Thymusrinde. Es findet eine Positiv-Selektion statt, es überleben nur T-Zellen, die in der Lage sind den MHC-I- bzw. II-Rezeptor der Thymusepithelzellen zu erkennen. Je nach erkannter HLA-Klasse geht der nicht passende Co-Rezeptor CD4 oder CD8 verloren: HLA-Klasse II-Moleküle erkennende T-Zellen behalten CD4 und verlieren CD8, bei der HLA-Klasse I erkennende T-Zellen ist es genau umgekehrt, sie behalten CD8 und verlieren CD4 (Laky and Fowlkes, 2005). Im zweiten Schritt, der im Thymus-Mark stattfindet, gibt es eine negative Selektion. Thymozyten, die über ihren T-Zell-Rezeptor körpereigene Zellen erkennen (hohe Affinität) und daraufhin eine autoreaktive Immunantwort auslösen würden, werden selektiert und der Apoptose zugeführt. Präsentiert werden diese körpereigenen HLA-Peptide durch Makrophagen oder DCs. Nachdem die T-Zellen den Thymus durchlaufen haben, emigrieren nur ca. 1-2 % der T-Zellen und siedeln sich in den LK und der Milz an. Der Thymus produziert in den ersten zwei Lebensjahrzehnten ca. 5 x 1011 T-Lymphozyten, die auch nach der Einstellung der Thymusfunktion für die lebenslange erworbene Immunität verantwortlich sind. Im Laufe des „Erwachsenwerden des Organismus“ kommt es zu einer Thymusinvolution. Im Normalfall unterliegen die T-Zellen der T-Zell-Homöostase. Beim Fehlen einer Infektion wird durch chemische Signale die Homöostase aufrechterhalten. Kommt es zu einer Infektion, wird das Gleichgewicht zu Gunsten der Immunabwehr verschoben. 47 1.3.3 Formen der T-Zellen und deren Funktion im Immunsystem Dabei werden zwei große Gruppen von T-Zellen unterschieden, die CD8 positiven T-Zellen und die CD4 positiven T-Zellen. Hinzu kommen noch zwei Arten von TZellen die regulatorischen T-Zellen und die T-Gedächtniszellen. Alle vier Subtypen von T-Zellen sollen nun im Weiteren beschrieben werden. lymphoide Stammzelle Thymus Zelle: CD4+ und CD8+ 4% CD3+/CD4-/CD8- 25% CD4-/CD8+ 71% + - CD4 /CD8 TH-1 Zellen •Aktivierung von B-Zellen, APC, TC-Zellen und TH-Zellen •Runter- regulation der TH-2-Antwort •Steigerung der zellvermittelten Immunität •Ausschüttung von: IL-2, IFN-y, TNF-α TH-2 Zellen •Umwandlung und Differenzierung der B-Zellen •Aktivierung von T-regulatorische Zellen •CD4+/CD25+ •Ausschüttung von: IL-4, IL-10, TGF-ß TH-17 Zellen cytotoxische T-Zellen •chronisch- entzündliche Immunprozesse •Ausschüttung von: IL-17 Eosinophilen •Runter- regulation der Th1 Antwort •Klassenwechsel •↑ Antikörper Produktion •Ausschüttung von: IL-4, IL-5, IL-6, IL9, L-10, IL-13 Abbildung 8: Entwicklung der T-Zellen. + Aus CD4 T-Zellen entstehen TH-1- oder TH-2-Zellen bzw. T-regulatorische Zellen oder + TH-17-Zellen. Aus den CD8 T-Zellen entwickeln sich cytotoxische T-Zellen (Johnson and Kraft, 2001). 48 1.3.3.1 CD8+-T-Zellen Die CD8+ T-Zellen sind in der Lage, über MHC-I präsentierte Peptide zu erkennen. Strukturell besteht das MHC-I aus einer membrangebundenen ß-Kette und einer daran nicht kovalent assoziierten α2-Mikroglobulin-(α2m)-Einheit. MHC-Klasse-I wird auf nahezu allen kernhaltigen Zellen des Körpers exprimiert und bindet im Prinzip alle Peptide, die von der Zelle stammen oder endogen in ihr produzierte Proteine von Viren oder Parasiten, nachdem diese im Proteasom prozessiert wurden. CD8+ T-Zellen kommen vor allem im Knochenmark sowie in den lymphatischen Geweben des Magen-Darm-Traktes, Atmungsorganen und den Harnwegen vor. Erkennt die T-Zelle das über MHC-I präsentierte Peptid, kommt es zu einer IL-2 induzierten Expansion des T-Zell-Klons. Kommt es nun zu einem Kontakt zwischen der infizierten Zelle und dem T-Zell-Klon, schüttet dieser Perforine und Cytokine aus, welche zu einer Zerstörung der Zellmembran führen. So kommt es zu einer Abtötung der Zelle und des darin enthaltenen Virus / Mikroorganismus. Schüttet die T-Zelle lediglich Cytokine wie Interferon-γ aus, so wird der intrazelluläre Erreger getötet, die infizierte Zelle überlebt aber. Dieses wird als nicht cytotoxische Effektorfunktion bezeichnet. 1.3.3.2 CD4+-T-Zellen Die zweite große Gruppe der T-Zellen sind die CD4+-T-Zellen. Sie erkennen Peptide, die über MHC-II präsentiert werden. Ihre wichtigste Aufgabe liegt in der T-Zell-B-Zell Kooperation und der Regulierung der T-Zellantwort der CD8+-TZellen. MHC-II, Bindungspartner der CD4+-T-Zellen, hingegen bindet nur Peptide, die nicht von der präsentierenden Zelle selbst, sondern von Proteinen stammen, die diese von außen (exogen) aufgenommen hat. Nur spezielle Zelltypen, die so genannten antigenpräsentierenden Zellen (APC), wie DC, Makrophagen, B-Zellen und verschiedene Typen von Epithel- und Stromazellen, exprimieren MHC-KlasseII. Die MHC-Klasse-II besteht aus je einer membrangebundenen α- und ß-Kette. Um Proteine für das Immunsystem sichtbar zu machen, müssen sie im Innern der Zelle durch Phagolysosomen in kurze Peptide gespalten werden und anschließend an MHC-Moleküle gebunden werden. 49 1.3.3.2.1 TH-1 und TH-2 Zellen Die Untergruppe der CD4+-T-Zellen gliedert sich wiederum in vier Untergruppen in TH-1 und TH-2 T-Zellen sowie in T-regulatorische Zellen oder Th-17-Zellen. Die TH-1 und TH-2 T-Zellen unterscheiden sich in Ihrer Cytokinausschüttung und der nachfolgenden Zell-Aktivierung nach Peptiderkennung. Zu welcher Unterart sich die CD4+-Zellen entwickeln, entscheiden die durch die APC´s ausgeschütteten Cytokine (Janeway et al., 2002). Zuerst wurden diese Unterschiede am Mausmodell nachgewiesen (Mosmann et al., 2005; Mosmann and Coffman, 1989). Später wurde diese Differenzierung auch für humane CD4+-T-Zellen nachgewiesen (Salgame et al., 1991). Die TH-1-Zellen schütten nach Antigen-Kontakt zum einen IL-2 aus, welches eine T- und B-Zellproliferation bewirkt. Zum anderen wird IFN-γ ausgeschüttet, welches Makrophagen und NK-Zellen aktiviert, die bei der Viruselimination eine entscheidende Rolle spielen. Zusätzlich löst IFN-γ in Endothelzellen die Präsentation von MHC-Molekülen aus. Eine weitere Wirkung des IFN-γ besteht darin, dass es die IL-4 Synthese durch TH-2-Zellen vermindert, und somit die Antikörper-Bildung durch B-Zellen nach TH-2-Aktivierung vermindert. IFN-γ hat ebenfalls einen direkten Einfluss auf die Apoptose und Proliferation der antigenpräsentierenden Zellen (Billiau, 1996a; Billiau, 1996b; Boehm et al., 1997). TNF-α, welches ebenfalls ausgeschüttet wird, aktiviert Makrophagen und führt zu einer Induktion und zusammen mit IL-1 zu einer Aufrechterhaltung der AkutPhase-Reaktion. Zusätzlich wird noch durch TNF-α und TNF-ß das Endothel aktiviert, so dass Leukozyten aus dem Lumen der Gefäße ins Gewebe migrieren können. Ein zusätzlicher Effekt des TNF-ß ist die Ausschüttung von Lymphotoxin, welches einen cytotoxischen Effekt hat und eine Cytostase bzw. Cytolyse bewirkt. Nach einer TH-1-Antwort wird Expression der Oberflächenmoleküle CD40, CD80, CD86 und MHC-II gesteigert. Bei der TH-1-Antwort handelt es sich vor allem um eine proinflammatorische Reaktion. Die TH-2 Differenzierung der CD4+-Zellen wird ausgelöst durch Aktivierung des Antigenrezeptors durch antigenbeladene MHC-II sowie IL-2. Es folgt eine Zellteilung und die Ausschüttung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 sowie Lymphotoxin A. IL-4 fördert die Differenzierung und Aktivierung der B-Zellen und somit die Synthese von Antikörpern. IL-4 und IL-10 sorgen für die Herunterregulierung der TH-1-Antwort und der damit verbundenen IFN-γ 50 Ausschüttung und die daraus resultierende zellvermittelte Immunität, ebenso wie IL-13. Das IL-5 fördert ebenfalls die B-Zell-Differenzierung und des weiteren die IgA-Synthese und Aktivierung der eosinophilen und basophilen Granulozyten sowie von Mastzellen. IL-4 spielt eine Hauptrolle in der TH-2-Antwort: Es inhibiert die zelluläre Immunantwort und inhibiert die Synthese und Wirkung von IFN-γ. Ryan konnte 1997 zeigen, dass IL-4 bei der Entstehung von allergischen Symptomen eine wichtige Rolle spielt, da es die Immunglobulin-Synthese der B-Zellen in Richtung IgE (weniger IgM) verschiebt (Ryan, 1997). IL-5 fördert Wachstum und Differenzierung eosinophiler Granulozyten. Mori et al. konnten 1995 nachweisen, dass das von Eosinophilen und Mastzellen produzierte IL-5 eine ebenfalls gesteigerte IgE Produktion verursacht (Mori et al., 1995). IL-13 fördert zusätzlich die mukosale Sekretion sowie die Hyperreagibilität der Atemwege. 51 1.3.3.2.2 Regulatorische T-Zellen Die regulatorischen T-Zellen sind eine Untergruppe der CD4+-T-Zellen. Sie dienen der Selbsttoleranz, indem sie die überschießende Reaktion auf intakte körpereigene Zellen verhindern. In den letzten Jahren sind insgesamt 3 Subpopulationen der regulatorischen TZellen entdeckt worden: CD4+-CD25+-T-regulatorische Zellen IL-4, IL-10 und TGF-ß TH-3 Lymphozyten TGF-ß Tr1 (T regulatorisch 1) IL-10 Im Folgenden wird auf die CD4+, CD25+ T-regulatorischen Zellen eingegangen, da diese Einfluss auf die Immunreaktion in der Lunge haben. Sie bilden etwa 5-10 % der CD4+ T-Zellpopulation in der Peripherie von gesunden Menschen. Die CD4+-CD25+ regulatorischen T-Zellen besitzen die Oberflächenmarker CD4+ und CD25+, durch welche sie sich von den TH-1 / TH-2 (CD25-) Zellen unterscheiden. Sie schütten vor allem IL-4, IL-10 und TGF-ß aus. Eine weitere wichtige Funktion der regulatorischen T-Zellen ist das Abfangen von Wachstumsund Differenzierungsfaktoren und die Begrenzung der klonalen Expansion von BZellen. Die Zellen Transkriptionsfaktor lassen FOXP3 sich über (Forkhead box den intrazellulär protein 3) gelegenen identifizieren. Als Oberflächenmarker zur Identifikation dient der Interleukin-7-Rezeptor (IL-7R, CD127). Jonuleit et al. konnten nachweisen, dass die hemmenden Effekte der CD4+-CD25+ regulatorischen T-Zellen durch einen Zell-Zell-Kontakt zu konventionellen TH-Zellen ausgelöst werden. Durch diesen Kontakt werden TRegulatorzellen aktiviert. Diese produzieren dann inhibierende Mediatoren, hier vor allem TGF-β, welches wiederum - unabhängig vom Zell-Zell-Kontakt - zu einer Supression weiterer T-Effektorzellen führt (Jonuleit et al., 2002). Es finden sich sowohl T-regulatorische Zellen thymalen Ursprungs, als auch in der Peripherie generierte Zellen. Die im Thymus generierten Zellen werden als „natürliche regulatorische T-Zellen“ bezeichnet. Die in der Peripherie vorkommenden regulatorischen T-Zellen, die erst als immunologische Reaktion auf die Interaktion mit Antigen-präsentierenden Zellen entstehen, werden als „adaptive regulatorische T-Zellen“ bezeichnet. Die Bedeutung der peripheren Tregulatorischen Zellen konnten Josefowicz et al. bei Mäusen zeigen. Bei Mäusen, 52 denen komplett die peripheren T-regulatorischen Zellen fehlten, fand sich spontan eine ausgeprägte TH-2 abhängige allergische Reaktion und Asthma. Daraus lässt sich schließen, dass die peripheren T-regulatorischen Zellen einen Einfluss auf allergische Entzündungen der Mucosa haben (Josefowicz et al., 2012). Auch einen direkten Effekt der T-regulatorischen Zellen auf DCs konnten durch Onishi et al. und Shevach et al. nachgewiesen werden. T-regulatorische Zellen besitzen auf ihrer Oberfläche das inhibitorische Molekül CTLA-4. CTLA-4 kann mit CD86 bzw. CD80 auf der DC interagieren. Dieses bewirkt eine verminderte Expression der costimulatorischen Moleküle auf der Oberfläche der DC. Dies hat den Effekt, dass es zum einen zu einer verminderten Maturation der DC kommt, zum anderen ist ihre Fähigkeit andere Zellen zu stimulieren deutlich herabgesetzt (Onishi et al., 2008; Shevach, 2009). 1.3.3.2.3 TH-17 T-Zellen Die TH-17 T-Zellen haben ihren Namen von dem hauptsächlich produzierten IL17. Die Entstehung der TH-17 Zellen erfolgt durch TGF-ß und IL-6 sowie IL-23, diese bewirken eine Vermehrung der Zellpopulation (Torchinsky et al., 2009). Die TH-17 Zellen haben zwar auch einen proentzündlichen Effekt wie die TH-1 Zellen, jedoch haben sie keine Bedeutung im akuten Entzündungsgeschehen und sind vor allem für chronisch-entzündliche Immunprozesse verantwortlich. Sie sind sogar in der Lage, eine effiziente TH-1 Immunantwort durch das ausgeschüttete IL-17 zu unterdrücken und eine Erreger-Elimination zu verhindern. Nach Aktivierung schütten die TH-17 Zellen IL-17F, IL-6, IL-21, IL-22, IL-26 und TNF-α aus. Diese Cytokine bewirken eine Produktion von proinflammatorischen Cytokinen, Chemokinen und Metalloproteasen, die zu einer Entzündungsreaktion sowie einer Gewebezerstörung führen. Erhöhte Konzentrationen von IL-17 wurden bei Patienten mit allergischem Asthma im Trachealsekret gefunden, was für eine bedeutende Rolle bei der chronischen Entzündungsreaktion spricht (Barczyk et al., 2003). So konnten Kudo et al. nachweisen, dass Knock-out Mäusen, denen das αVβ8-Integrin auf dendritischen Zellen fehlte, nicht in der Lage waren, TH-17 Zellen zu generieren. Diese Mäuse waren aber vor einer allergischen Reaktion der Atemwege geschützt (Kudo et al., 2012). Die physiologische Funktion der TH-17 Zellen besteht in der Abwehr von Pilzen im Organismus. 53 1.3.3.3 T-Gedächtniszellen Die T-Gedächtniszellen dienen dem Schutz des Organismus bei erneutem Erregerkontakt. Sie sind dann in der Lage schnellere und effizientere Sekundärantwort zu vermitteln. Die T-Gedächtniszellen entstehen sowohl aus CD4+ als auch aus CD8+ T-Zellen, nach deren Kontakt mit einem Antigen. Sie speichern die spezifische Immunreaktion auf ein bestimmtes Antigen. Nach der Immunreaktion bzw. der Antigen-Erkennung kommt es zu einer klonalen Expansion der erkennenden T-Zelle. Von den an der Immunantwort beteiligten TZellen sterben etwa 5 % nach der Immunantwort nicht ab, sondern wandeln sich zu T-Gedächtniszellen um (Bannard et al., 2009). Die Persistenz dieser T-Gedächtniszellen ist MHC- und Antigen-unabhängig. Wenn der Organismus wieder mit demselben Antigen konfrontiert wird, lösen die T-Gedächtniszellen eine schnelle und effektive Immunantwort aus, indem sie sich erneut in T-Helferzellen umwandeln. Entscheidend für die Differenzierung zur T-Gedächtniszelle scheint der TCRRezeptor zu sein. So konnten Teixeiro et al. im Mausmodell nachweisen, dass Mäuse mit TCR-Mutation zwar T-Effektorzellen bilden konnten, jedoch nicht in der Lage waren T-Gedächtniszellen zu bilden (Teixeiro et al., 2009). Es werden 2 Untergruppen der T-Gedächtniszellen unterschieden: Es gibt einmal die „Central memory T-cells“ (TCM). Diese Untergruppe der T- Gedächtniszellen exprimiert L-selectin und CCR7. Sie schütten IL-2, jedoch kein IFN-γ oder IL-4 aus. Die zweite Population der T-Gedächtniszellen sind die sogenannten „effector memory T-cells“ (TEM). Sie exprimieren auf ihrer Oberfläche kein L-Selectin oder CCR7. Sie schütten nach Aktivierung vor allem IFN-γ und IL-4 aus (Sallusto et al., 2000). 1.3.3.4 NK-T-Zellen Die NK-T-Zellen gehören zu den cytotoxischen α-β-Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei der Reduktion von Autoimmunreaktionen. Sie besitzen keine antigenbezogenen Rezeptoren und können über MHC-I präsentierte Peptide erkennen. Sie besitzen einen T-Zell-Rezeptor der Lipide auf CD1d Molekülen erkennen kann und weisen zusätzlich einen eigentlich für NK-Zellen typischen Oberflächenmarker auf (CD56 und CD161). Nach Aktivierung produzieren diese 54 Zellen Perforin und Granzym sowie IFN-γ, TNF und TH-2-Cytokine wie IL-4, IL-10 und IL-13 (Mendiratta et al., 1997). Für die Antigen-Erkennung besitzen die T-Zellen den T-Zellrezeptor, der aus einer α-Kette sowie einer β-Kette besteht und jeweils aus einer konstanten Region und einer variablen Region aufgebaut ist. Die zu erkennenden Glykolipide werden über CD1d durch die APC der NK-T-Zelle präsentiert. Die Erkennung erfolgt dann über den TCR. Zu dieser Einheit der Antigen-Erkennung gehört ebenfalls der CD3 Komplex. Akbari et al. konnten im Mausmodell nachweisen, dass Mäusen, denen das Gen für die NK-T-Zellen (V(α)14i NK-T-Zellen) fehlte, nicht in der Lage waren, eine Hyperreagibilität des Respiratrionstraktes im Sinne eines allergischen Asthmas zu entwickeln (Akbari et al., 2003). Van Kaer konnte in seiner Arbeit nachweisen, dass NK-T-Zellen in der Lage sind, die T-Zell-Antwort in Richtung einer TH-2Antwort zu polarisieren (Van Kaer, 2004). 1.3.4 T-Zell spezifische Interleukine und Interferone 1.3.4.1 IFN-γ Das IFN-γ ist ein Glykoprotein aus 143AS. IFN-γ bindet an den IFN-γ-Rezeptor, der wiederum aus zwei Untereinheiten besteht. Intrazellulär wird dann über den JAK-STAT-Signalweg eine Modulation der Transkription von Genen hervorgerufen. IFN-γ wird vor allem von den TH-1-Zellen nach Kontakt mit antigen präsentierenden Zellen (APC) ausgeschüttet. Es ist also ein Marker für die TH-1Antwort. IFN-γ hat eine aktivierende Wirkung auf Makrophagen und erhöht die intrazelluläre Lysosomeaktivität. Zusätzlich führt IFN-γ zu einer Suppression der TH-2-Antwort und zu einer erhöhten Expression von MHC-I Molekülen auf der Oberfläche der T-Zellen. Zusätzlich hat es einen gegenregulatorischen Effekt auf die Immunantwort durch Induktion der Apoptose von Mastzellen. Zudem verhindert IFN-γ den Isotypenswitch der Immunglobuline zur IgE-Produktion (Teixeira et al., 2005). IFN-γ wird nur durch reife DCs ausgeschüttet (Hart, 1997). 55 Abbildung 9: Rolle des INF-γ in der Differenzierung der T-Helfer-Antwort zugunsten einer TH-1Antwort. Modifiziert nach Teixeira et al. (Teixeira et al., 2005). 1.3.4.2 IL-4 IL-4 spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Immunabwehr als auch bei der Entzündungsreaktion (Weiss and Brown, 2001). Die Hauptfunktion liegt in der TZell-Kommunikation. IL-4 führt bei den T-Zellen zu einer Proliferation und setzt Differenzierungsreize, so dass die Entzündungsreaktion in Richtung humorale Abwehrreaktion verschoben wird. IL-4 wird ebenso wie IL-10 zu den antiinflammatorischen Cytokinen gerechnet. Produziert wird das IL-4 hauptsächlich durch TH-2-Zellen bzw. Makrophagen. Die intrazelluläre Signaltransduktion erfolgt über den JAK-STAT-Signalweg. Die TH-0Zellen wandeln sich durch das IL-4-Signal in TH-2-Zellen um. Diese schütten daraufhin weiteres IL-4 aus, was zu einer autokrinen positiven Rückkopplung führt. Weiterhin führt IL-4 zur Stimulation bereits aktiver B-Zellen. Hier kommt es als Reaktion auf das IL-4 zu einem Klassenwechsel von IgG oder IgM zu IgE. Zusätzlich führt IL-4 zu einer Hochregulation der MHC-II-Expression. 1.3.4.3 IL-13 IL-13 wird hauptsächlich durch T-Zellen produziert und spielt eine entscheidende Rolle bei der TH-2-Antwort. Zielzellen des ausgeschütteten IL-13 sind B-Zellen, Eosinophile, Fibroblasten und Mastzellen sowie Makrophagen. IL-13 bindet an den IL-13Rα1. Gebildet wird dieser Rezeptor durch einen Teil des IL-4 Rezeptors. 56 Intrazellulär folgt der Bindung des IL-13 an den Rezeptor die Aktivierung der JAK1 bzw. sowie TYK2, die wiederum STAT 3 bzw. 6 aktivieren. Dieses konnte durch Wills-Karp et al. nachgewiesen werden (Wills-Karp and Finkelman, 2008). Wills-Karp konnte 2004 nachweisen, dass IL-13 eine entscheidende Rolle bei der Asthma-Pathogenese spielt (Wills-Karp, 2004). Es konnte auch im Tiermodell nachgewiesen werden, dass alleine IL-13 als TH-2 Cytokin für eine Hyperreagibilität und für die Aufrechterhaltung des allergischen Asthmas verantwortlich ist. Eine zusätzliche Funktion des IL-13 liegt in der Gegenregulation der TH-1-Antwort (Finkelmann et al., 2001). Durch die Produktion von Chemokinen durch die Aktivierung des JAK-STAT-Wegs veranlasst IL-13 die Migration von esoinophilen Granulozyten sowie Mastzellen ins umliegende Gewebe. Dieser Signalweg stellt einen zentralen Pathomechanismus bei der allergischen Immunreaktion Typ I dar (Kuperman et al., 2002). Bei Patienten mit allergischer Rhinitis konnten erhöhte IL-13-Werte im Blut nachgewiesen werden. Es lässt sich ebenfalls eine erhöhte Rezeptordichte feststellen. Zudem konnten Li et al. nachweisen, dass dieser Effekt IL-4 unabhängig ist (Li et al., 1998). 1.3.4.4 IL-10 IL-10 gehört zur Gruppe der Cytokine und ist ein Glykopeptid, bestehend aus 160 Aminosäuren. Es wird vor allem von Monozyten, TH-2-Lymphozyten und regulatorischen T-Zellen sezerniert. Auch DCs besitzen die Fähigkeit IL-10 zu produzieren, so konnten Zhou et al. nachweisen, dass ruhende CD83 positive DC IL-10 mRNA besitzen (Zhou and Tedder, 1995). Eine entscheidende Funktion des IL-10 besteht in der Hemmung der Bildung von Cytokinen der TH-1-Antwort. Hierunter fallen IFN-γ, IL-2 und TNF-β. Zusätzlich wirkt IL-10 verlängernd auf das Überleben, Vermehrung und die Antikörperproduktion von B-Lymphozyten. Es blockt den nukleären Faktor NFκB. Zu den proinflammatorischen Cytokinen die durch die NF-κB-Aktivierung ausgeschüttet werden, gehören TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, and IL-12. IL-10 hemmt indirekt die Aktivierung von T-Zellen durch APC. Dieses geschieht durch eine Hemmung der Bildung von Tumornekrosefaktor, IL-1 (zusätzlich synergistische Förderung der Bildung eines Interleukin-1-Rezeptorantagonisten), 57 IL-2 und IL-6 in antigenpräsentierenden Zellen wie z.B. Monozyten und dendritischen Zellen. Zusätzlich zu der Hemmung der Aktivierung wird die T-ZellAntwort von der TH-1 hin zu einer TH-2-Antwort geleitet (Chen and Zlotnik, 1991; Fiorentino et al., 1989). IL-10 fördert die Proliferation der B-Lymphozyten und ihre Differenzierung zu Mastzellen. Andererseits hemmt es die IgE-Bildung in Gegenwart von Monozyten. IL-10 reduziert zwar die Bildung bzw. Aktivierung neuer APC, hemmt aber nicht bereits ausdifferenzierte dendritische Zellen in ihrer Aktivität, da diese keinen IL-10-Rezeptor mehr exprimieren. IL-10 ist ein physiologischer Antagonist zu IL-12. Die Bedeutung des IL-10 in der Immunmodulation bzw. Downregulation der Immunantwort, zeigt das Geschehen während des septischen Schocks. Ein Anstieg des IL-10 kann hier zu einer Immunparalyse führen (Volk et al., 2000). Auch die periphere Toleranz wird durch regulatorische T-Zellen beeinflusst, die IL-10 produzieren (Sakaguchi, 2004). Auch nimmt IL-10 eine wichtige Funktion bei der natürlichen Regulation des immunologischen Gleichgewichtes in den Lungen ein (Akbari et al., 2001; Akbari et al., 2002). Eine Studie konnte zeigen, dass allergische Erkrankungen direkt durch ein Ungleichgewicht zwischen IL-10-produzierenden regulatorischen T-Zellen und TH2-Zellen entstehen (Akdis et al., 2004). Auf Grund dieser Ergebnisse gilt IL-10 als ein vielversprechender Kandidat für die Behandlung von allergischen Krankheiten (Hawrylowicz and O'Garra, 2005). 58 1.4 Immunreaktion des Organismus nach RSV-Infektion Das RS-Virus dringt über den Nasen–Rachenraum in den Organismus ein. Von dort aus gelangt es entweder von Zelle zu Zelle oder durch Aspiration in den unteren Respirationstrakt. Das RS-Virus heftet sich dort an der apikalen Seite der Zilien der Epithelzellen an (Zhang et al., 2002) . Dies geschieht zum einen über das Glykoprotein G, das spezifisch an den Chemotaxinrezeptor CX3CR1 bindet und für die Anheftung des Virions an die Zielzelle verantwortlich ist (Levine et al., 1987; Tripp et al., 2001). Als weiteres Glykoprotein der Virushülle dient das Fusionsprotein F, das spezifisch an den Endotoxinrezeptor TLR4 der Zilienzelle bzw. der DC bindet, der Fusion der Virushülle mit der Zellmembran (Walsh et al., 1986). Auf den infizierten Zellen wird das F-Protein exprimiert. Als weitere spezifische Rezeptoren auf der Epithelzelle dienen Annexin II und L-Selectin (Malhotra et al., 2003). In der Wirtszelle finden die RSV-Replikation, das Budding und die Freisetzung der fertigen Viren statt. Dabei dienen die viruseigenen Proteine NS1 / NS2 dazu, die Produktion von Interferon-α / -β zu unterdrücken. Beide Interferone besitzen eine virusstatische Funktion. Die Virusproteine M1 und M2 inhibieren zum einen die Transkriptase-Aktivität der Nukleokapsidproteine während der Verpackung und zum anderen vermitteln sie die Fusion des Nukleokapsids mit der Hülle (Garcia et al., 1993). Das L-Protein dient dabei als Hauptuntereinheit der RNA-Polymerase und das P-Protein als Transkriptions- und Replikationsfaktor (Stec et al., 1991). Sind genügend negative RNA-Stränge und Viruspartikel vorhanden, werden reife Virionen freigesetzt (Budding). Der größte Teil der viralen Bestandteile verbleibt allerdings in den infizierten Zellen, da ein Teil der Virusproteine zu viel produziert wird und nicht für die Bildung neuer Virionen benötigt wird (Bachi, 1988; Huang and Wertz, 1982). Durch die Bindung an den TLR-Rezeptor wird intrazellulär der Transkriptionsfaktor „Kernfaktor Kappa B“ (NFκB) ausgeschüttet. Die in die Zelle gelangten RSVProteine führen zu einer Produktion reaktiver Sauerstoffradikalen (ROS) und damit zu einer Aktivierung von STAT 1+3. NFκB und STAT 1+3 führen zu einer Ausschüttung von Typ 1 Interferonen und Chemokinen im Rahmen einer frühen Immunantwort aus der Epithelzelle (Doyle and O'Neill, 2006). 59 Neben den Typ 1 Interferonen, wie Interferon-α, werden zum Beispiel CCL5 , TNF, CCL11 ausgeschüttet, die auf neutrophile und eosinophile Granulozyten chemotaktisch wirken (Tristram et al., 1998). Entzündungsmediatoren werden NK-Zellen Durch die Ausschüttung dieser und neutrophile Granulozyten angelockt. Die viralen NS-Proteine inhibieren den Signalweg über IRF3, so dass kein IFN-ß ausgeschüttet wird (Openshaw and Tregoning, 2005) . Die Bedeutung der ausgeschütteten Chemokine wird deutlich, wenn man Versuche mit Mäusen betrachtet, die eine defekte Chemokinproduktion aufweisen: Diese Mäuse haben einen deutlich schwächeren Verlauf der RSV-Infektion als Mäuse mit intakter Chemokinbildung (Miller et al., 2004). Abbildung 10: Eindringen des RSV in das Bronchialepithel und intrazelluläre Signale, Quelle: (Openshaw and Tregoning, 2005) Zunächst wird der angeborene, unspezifisch reagierende Teil des Immunsystems aktiviert. Erst im folgenden Schritt beginnt die Aktivierung der erworbenen Immunantwort. Diese beginnt damit, dass ortsansässige unreife DCs das RS-Virus aufnehmen, und sich auf den Weg zu den lokalen Lymphknoten machen. Auf dem Weg dorthin vollziehen sie die Maturation und werden zu reifen DCs. Im Lymphknoten angekommen, präsentieren sie den CD4+-T-Zellen mittels MHC-II die Viruspartikel. Am Ende der Kaskade aus DC, CD4+-T-Zellen und cytotoxischen 60 T-Zellen steht die Antikörper-Produktion durch B-Zellen ca. 7-9 Tage nach Infektion. Durch alle beteiligten Zellen des Immunsystems werden Cytokine freigesetzt. Dazu gehören IFN-γ, IL2, IL-4, IL-5, IL-9 sowie IL-12. Eine Übersicht über den Ablauf nach Eindringen des RS-Virus in den Organismus innerhalb der ersten 9 Tage gibt die Abbildung 11. Abbildung 11: Zelluläre Reaktionen nach RSV-Infektion Tag 1-3 unspezifische Immunantwort, Tag 4-7 Induktion der spezifischen Immunantwort, Tag 7-9 Effektorphase der spezifischen Immunantwort (Openshaw and Tregoning, 2005). Zu den ersten Zellen der humoralen Immunantwort, die durch die Chemokine aus den infizierten Epithelzellen angelockt werden, gehören die neutrophilen Granulozyten. Sie sind für die Gewebezerstörung in den Atemwegen verantwortlich. Die Zahl der neutrophilen Granulozyten steigt proportional zu der Stärke der Entzündung und Dauer der Infektion (Wang and Forsyth, 2000). 61 Als weitere Zellen der primären Immunantwort wandern Makrophagen ein, die sich aus Monozyten aus dem Blut differenzieren. Sie setzen Cytokine frei, sobald sie mit RSV in Kontakt kommen. Darunter fallen: IL-1ß, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, TNFα und Prostaglandin E2 (Bartz et al., 2002). Die Ausschüttung dieser Cytokine dient zum einen der Permeabilitätssteigerung der Gefäße und der Rekrutierung von weiteren Zellen der Immunabwehr wie neutrophile Granulozyten, NK-Zellen und eosinophilen Granulozyten. Die durch das infizierte Epithel ausgeschütteten chemotaktischen Cytokine RANTES (regulated and normal T cell expressed and secreted) und MIP1alpha (Macrophage inflammatory protein-1-alpha) sorgen für die Einwanderung von Eosinophilen und Monozyten (Becker and Soukup, 1999). Die eingewanderten Eosinophilen degranulieren und setzen ein cytotoxisches Protein (Eosinophil cationic protein (ECP), welches bei der Pathogenese des Asthma Bronchiale eine entscheidende Rolle spielt) frei und führen so zu einer Obstruktion der Atemwege (Garofalo et al., 1992). Diese massive Degranulation von Eosinophilen konnte im Lungengewebe von Kindern, die nach einer RSVImpfung verstorben waren, nachgewiesen werden, (Chin et al., 1969). Die dendritischen Zellen sind dafür verantwortlich, die T-Zell-Antwort zu aktivieren, in dem sie in die LK einwandern und dort das aufgenommene Antigen nach Prozessierung den naiven T-Zellen zu präsentieren. Sowohl im Mausmodell (Beyer et al., 2004) als auch bei Kindern (Gill et al., 2005) mit RSV-Infektion konnte nachgewiesen werden, dass es zu einer vermehrten Einwanderung von zirkulierenden DCs aus dem Blut kommt. Nach Infektion der Zellen mit RSV kommt es reaktiv zu einer Prostaglandin E2, IL-10 und IL-11 Freisetzung (Bartz et al., 2002). Zusätzlich hemmt eine RSV Infektion die Fähigkeit der DCs, T-Zellen zur Interferon-γ Produktion anzuregen (Bartz et al., 2003b). Der entscheidende Schritt zur vollständigen Viruselimination ist im Anschluss an die unspezifische Immunabwehr, die die Entzündungsreaktion räumlich begrenzt, die Aktivierung der T-Zellen durch DCs. So konnte gezeigt werden, dass es bei Kindern mit einem T-Zell-Defekt zu keiner vollständigen Viruselimination kommt. Bei diesen Kindern persistiert das Virus im Respirationstrakt und kann noch über Monate ausgeschieden werden. Dagegen ist bei immun gesunden Kindern die Ausscheidung auf Wochen begrenzt (Hall et al., 1986). 62 Die cytotoxischen T-Lymphozyten (CD8+) erkennen virusinfizierte Zellen und töten diese ab. Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass die cytotoxischen TZellen für die Elimination des RS-Virus eine entscheidende Rolle spielen: Übertrug man die cytotoxischen T-Zellen auf RSV-infizierte Mäuse, so wurde die Virusausscheidung nach einiger Zeit beendet. Als negativer Effekt dieser Zellen konnte aber eine überschießende Immunreaktion beobachtet werden, die einen schweren Krankheitsverlauf bei den Tieren auslöste (Graham et al., 2000) . Das Maß der cytotoxischen T-Zell-Reaktion variiert von Alter zu Alter. So hatten Kinder unter 5 Jahren etwa zu 1/3 eine cytotoxische Reaktion auf das RS-Virus, Kinder die älter waren aber bis zu 2/3 (Chiba et al., 1989). Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, dass ¾ der Kinder, die erstmalig mit RSV infiziert waren (RSV-Ausscheidung und Infekt der unteren Atemwege), mit einer cytotoxischen Immunantwort reagierten. In den Folgejahren wiesen diese Kinder weniger RSVInfektionen auf. Je ausgeprägter die Immunantwort durch cytotoxische TLymphozyten war, desto höher war ebenfalls die Interferon-γ Produktion und umso geringer war die IL-4 Bildung (Mbawuike et al., 2001). Die Ausprägung der T-Helferzellen (CD4+-Zellen) ist abhängig vom präsentierten Antigen. So bewirkt das F-Protein, dass es in der Folge zu einer TH-1-Antwort kommt und das G-Protein (ebenso wie der in den 60er Jahren verwendete Impfstoff) zu einer TH-2-Antwort führt (Graham et al., 2000). Bei der TH-1-Antwort wird vor allem IFN-γ produziert und es kommt zu einer IgG Ausschüttung. Zusätzlich aktiviert wird die TH-1-Antwort-Kaskade über IL-12, welche zusätzlich NK-Zellen aktiviert, die wiederum cytotoxische T-Zellen aktivieren. Das ausgeschüttete IFN-γ unterdrückt eine TH-2-Antwort und unterstützt ebenfalls die IgG Bildung (Graham et al., 2000). Die TH-2-Antwort ist von einem verstärkten Krankheitsablauf mit erhöhter Schleim-Bildung und Histaminausschüttung sowie einer Eosinophilie und Mastzellaktivierung geprägt. Es kommt im Verlauf der Immunreaktion zu einer IgE Produktion. Im Verlauf der TH-2 Reaktion kommt es über ausgeschüttetes IL-4 zu einer Unterdrückung der TH-1-Antwort. Kommt es zu einem TH-2 geprägten Verlauf der RSV- Infektion, so findet man ein verstärktes Krankheitsgeschehen. So konnte bei Kindern mit schwer verlaufender Erkrankung eine verminderte 63 Interferon-γ Produktion also eine herabgesetzte TH-1 Reaktion nachgewiesen werden (Schauer et al., 2004). Abbildung 12: Abhängigkeit des Verlaufs einer RSV-Infektion vom Typ der Immunantwort. Die vorherrschenden Cytokine und ihre Wechselwirkung bei Genesung (TH-1) oder schwerem Verlauf (TH-2) (Openshaw and Tregoning, 2005). Im Modell der primären Immunantwort (Kultur naiver T-Zellen mit DCs die mit RSV infiziert wurden) konnte gezeigt werden, dass in diesen Kulturen weniger Interferon-γ produziert wurde, was für eine Verschiebung der T-Helferzell-Antwort in Richtung TH-2 spricht (Bartz et al., 2003b). Dieser Effekt wurde auch bei Kindern mit schwerer Bronchiolitis beobachtet (Schauer et al., 2004). Bei einer ausgeprägten TH-2-Antwort konnte eine spätere Allergisierung beobachtet werden (Schauer et al., 2002; Sigurs et al., 2000). Erfolgt die RSV-Infektion nach einer Influenza-Infektion, so kommt es anschließend zu keiner TH-2-Antwort mehr (Walzl et al., 2000). Einen Zusammenhang von genetischer Prädisposition und Verschiebung zur TH2-Antwort wurde durch Legg et al. nachgewiesen. Diese Arbeitsgruppe beobachtete eine Gruppe von Kindern mit einem Elternteil mit allergischem Asthma. Wurde bei diesen eine Infektion mit RSV nachgewiesen, so wurden diese Kinder in zwei Gruppen unterteilt, die eine Gruppe mit Infekt der oberen Luftwege und eine andere mit Bronchiolitis. In der Gruppe mit Bronchiolitis zeigte sich im 64 Naso-pharyngealsekret ein deutlich erhöhtes IL-4 / Interferon-γ. Zudem war in der Bronchiolitisgruppe die mRNA sowie die Expression von Interferon-γ und IL-12 reduziert. Zudem konnte IL-18 ein Induktor der Interferon-γ Produktion vermindert nachgewiesen werden. In dieser Studie konnte ein Einfluss der Virusmenge auf die Schwere des Verlaufs ausgeschlossen werden, jedoch zeigte sich in der Bronchiolitisgruppe eine deutlich verlängerte Eliminationszeit im Vergleich zur Gruppe mit Infekt der oberen Atemwege (Legg et al., 2003). 65 2 Fragestellung In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen in der Induktion der Immunantwort gegen das Respiratory syncytial Virus (RSV) eine wichtge Rolle spielen. In den Atemwegen von Kindern unter einem Lebensjahr, die an schweren RSV Infektionen erkranken können, finden sich im Gegensatz zu den Atemwegen älterer Probanden nur inflammatorische dendritische Zellen. Als Modell für diese inflammatorischen dendritischen Zellen sollen in der vorliegenden Arbeit cytokinaktivierte myeloide dendritische Zellen, die aus Stammzellen des Nabelschnurblutes angezüchtet wurden, untersucht werden. Im Vergleich zu ruhenden dendritischen Zellen, die nicht mit Zytokinen vorbehandelt wurden, soll geklärt werden: Ob bei einer RSV-Infektion in vitro Unterschiede hinsichtlich 1. der Expression von Oberflächenmarkern (CD208, HLA-DR, TLR-4, CD86, CCR6 und CD83) auf den dendritischen Zellen 2. der intrazelluläre RSV-Replikation sowie die infektiösen Partikel im Überstand der dendritischen Zellen 3. des durch die dendritischen Zellen ausgeschütteten IL-6 und IL-8 und 4. der Induktion der Cytokine (IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-10) in cokulturtivierten T-Zellen bestehen. 66 3 Material und Methoden 3.1 Material Die im Rahmen der vorliegenden Versuche verwendeten Reagenzien und Geräte sind im Folgenden aufgelistet und nach Gruppen zusammengestellt. 3.1.1 Labormaterialien und technische Geräte Tabelle 3: Labormaterial und der verwendete Geräte Labormaterial Zusatzbezeichnung Firma 15 ml Polypropylene 15ml/High-Clarity Falcon/Becton Dickinson, Conical Tube Polypropylene Heidelberg;. Conical Tube 50ml Polypropylene Blue Max Falcon/Becton Dickinson, Conical Tube Heidelberg; Auflichtmikroskop Zeiss Auflichtmikroskop CK2 Brutschrank (CO2- Olympus Optikal Co. Heraeus, Düsseldorf Inkubator) Cryo Tubes Durchflusszytometer Nunc Cryo Tube, Nunc GmbH & Co.KG, 1,8ml Roskilde (Dänemark) FACScanTM Becton Dickinson, Heidelberg Durchlichtmikroskop Zeiss, Jena FACS-Röhrchen Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg Gewebekulturplatte mit 24-well Flachboden 24-well MULTIWELLTM Gewebekulturplatte mit 96-well Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg Falcon/Becton Dickinson, 67 Flachboden 96-well MULTIWELLTM Heidelberg MiniMACS (Magnet) AutoMacs Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach NanoDrop PeqLab, Erlangen Fluorspektrometer Pipette Eppendorf reference Eppendorf AG, Hamburg 50-200μl Pipette Eppendorf reference Eppendorf AG, Hamburg 10-100μl Pipette Pipette, elektrische Finnpipette 200- Thermo Fisher Scientific, 1000μl Waltham, USA Pipetus Hirschmann Laborgeräte; Eberstadt Pipetten steril 10ml Polystyren 10ml Serological Falcon/Becton Dickinson, Pipets Heidelberg 5,0 ml Falcon/Becton Dickinson, Reagenzgläser mit Heidelberg Rundboden Rotorgene detection Corbett Life Science, System Sidney, Australien Ständer MACS MACS Multistand AutoMacs Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Stickstoffbehälter Messer, Chronos Biosafe, Krefeld Szintillationszähler Trennsäule Tubes 1209 RackBeta Liquid LKB Wallac, Mount Scintillation Counter Waverley, Australien MACS-Trennsäule Typ 25MS Columns, steril Safe-Lock-Tubes AutoMacs Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Eppendorf AG, Hamburg, 1,5ml Zählkammer nach Neubauer BD, Heidelberg Zählkammer nach Fuchs- BD, Heidelberg Rosenthal Zellerntegerät (cell Titertek, Oslo, Norwegen 68 Harvester) Zellkulturplatte 96 Vertiefungen, (MICROTESTTM) Flachboden, mit Falcon/BD, Heidelberg Deckel Zellsieb Cell Strainer 40μm Falcon/Becton Dickinson, Nylon Heidelberg Zentrifuge Megafuge 1.0 R Heraeus, Düsseldorf Zentrifuge Omnifuge 2.0RS Heraeus, Düsseldorf 3.1.2 Viren Respiratorisches Syncytial Virus (RSV), Stamm Long (ATCC VR-26) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA) bezogen. 3.1.3 Hep-2 Zellen Hep-2 Zellen American Type Culture Collection-LGC Standards, Wesel 3.1.4 Antikörper Tabelle 4: Monoklonale Antikörper für die magnetische Zellsortierung Antikörper Hersteller FcR-Blocking Reagenz Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach anti-CD34, MicroBeads Miltenyi-Biotec, Bergisch-Gladbach 69 Tabelle 5: Antikörper für die Oberflächenmoleküle der DCs Antikörper gegen Hersteller Oberflächenmoleküle CCR6, PE markiert HLA-DR, PE markiert BD Biosciences, Heidelberg, CD86, PE markiert Germany TLR-4, PE markiert CD83, PE markiert CD208, PE markiert CD1a-FITC Beckmann Coulter, Krefeld, Germany Riedel-de Haen, Seelze BD Biosciences, Heidelberg, Germany Tabelle 6: Testkits für die Messung der Cytokine im Überstand Antikörper Hersteller Quantikine® ELISA – Human IL-6 Immunoassay Quantikine® ELISA – Human IL-8 R&D Systems, Inc., Minneapolis Immunoassay Tabelle 7: Antikörper für die Färbung der intrazellulären Zytokine Antikörper Hersteller Anti-IFN-γ-FITC Anti-IL-4-FITC BD Biosciences, Heidelberg, Anti-IL-10-FITC Germany Anti-IL-13-FITC 70 3.1.5 Nährmedien, Gebrauchs- und Pufferlösungen Tabelle 8: Kits, Medien und Lösungen zum direkten Gebrauch Lösung bzw. Medium Hersteller Aceton Sigma-Aldrich, Deisenhofen Biocoll Separation Solution, Biochrom AG, Berlin Dichte 1,077 g/ml, isoton Citrat-Phosphat-Dextrose Sigma-Aldrich, Steinheim Solution (= CPD) DAPI Invitrogen, Karlsruhe DMEM-Medium, Dulbecco´s Gibco, Karlsruhe Modified Eagle Medium DMSO (Dimethylsulfoxid):, min. Sigma-Aldrich Biochemie GmbH, 99,5 % Hamburg FCS Fetales Kälberserum Biochrom KG, Berlin, Charge 0766G HEPES Pufferlösung 1M Biochrom AG, Berlin Hep-Flush(100U/ml): 009850-04, POM/Leo, U.K. Mycoplasmen Detection Kit Minerva Biolabs Octagam Octapharma Deutschland GmbH OLAamp® Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden Paraformaldehyd Riedel-de Haen, Seelze PBS-Dulbeco (Phosphate Buffered Saline), w/o Ca/Mg; low endotoxin, steril PCR®-TOPO Vektor Biochrom AG, Berlin Invitrogen, Karlsruhe Phalloidin Invitrogen, Karlsruhe QIAamp® ViralRNA Mini Kit Qiagen, Hilden Quanti TectTM Probe RT-PCR Kit Qiagen, Hilden RNA-Polymerase T7 Invitrogen, Karlsruhe RNA-Standard Invitrogen, Karlsruhe Saponin Riedel-de Haen, Seelze Sodium Pyruvat: L-0473, Biochrom AG, Berlin Türcksche Lösung: Fluka Chemie AG, Buchs, Ch 93770 VLE-RPMI 1640, mit 2,0g/l Biochrom AG, Berlin NaHCO3, ohne L-Glutamin 71 Tabelle 9: Zellkulturzusätze Zellkulturzusatz Hersteller GM-CSF; PromoKine, PromoCell GmbH, Heidelberg IL-1A Human Recombinant tebu-bio Germany, Offenbach IL-6 Human Recombinant tebu-bio Germany, Offenbach Kanamycin, 5mg/ml; Biochrom AG, Berlin L-Glutamin 200mM Biochrom AG, Berlin Na-Pyruvat; Biochrom AG, Berlin Nicht-essentielle Aminosäuren Biochrom AG, Berlin Partricin, 50μg/ml; Biochrom AG, Berlin Penicillin/Streptomycin Biochrom AG, Berlin 10.000U/ml PGE2 Sigma-Aldrich Biochemie GmbH, Hamburg rekombinantes humanes IL-4 PeproTech, London, über TEBU, Offenbach Stammzellfaktor (SCF) PeproTech, London, über TEBU, Offenbach TGF-ß PeproTech, Hamburg TNF-α R&D Systems GmbH, Wiesbaden Verwendete Medien und Lösungen zur Gewinnung und Sortierung der PBMC a) Lösung zum Auffüllen, Verdünnen und Waschen 500 ml + b) PBS-Dulbeco s.o. 3 ml (= 0,6 %) CPD s.o. Lösung für die Sammelröhrchen 50 ml (= 94,34%) CPD s.o. + 1 ml (= 1,89%) Hepes s.o. + 1 ml (= 1,89%) Kanamycin + 1 ml (= 1,89%) Partricin 72 Verwendete Medien und Lösungen für die Anzucht und die Kultivierung der Zellen a) Kulturmedium (RPMI ++) 500 ml VLE RPMI . + 5,75ml v/v L-Glutamin-Lösung, 200 mM s.o. + 5,75ml nicht-essentielle Aminosäuren + 5,75ml Na-Pyruvat + 10ml Kanamycin + 57ml FCS b) Einfriermedium 22 ml 22,5 ml 5 ml 0,5 ml RPMI 1640 FCS Dimethyl Sulfoxide Kanamycin Verwendete Medien für die Infizierung und die Kultivierung der Zellen a) Infektionsmedium: HEPES versetztes DMEM-Medium 1% 50 μg/ml hitzeinaktiviertem fötalen Kalbserum (FKS) Gentamycin b) Gewebekultur Medium Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) 10 % 50 μg/ml hitzeinaktiviertem fötalen Kalbserum (FKS) Gentamycin Verwendete Medien und Lösungen für die Analyse a) Saponin Puffer: 100 µl HBSS o. + 0,1 % Saponin + 0,01 M Hepes Puffer 73 Lösungen zur Stimulation a) Anzüchtung von DC pro ml Zellsuspension 10 µl/ml SCF = Stammzellfaktor 10 µl/ml GMCSF 25 µl/ml TNF-α b) IL-4-Cocktail pro ml Zellsuspension 37,5 ng/ml IL-4 100 ng/ml GM-CSF 2,5 ng/ml TNF-α c) Cytokincocktail pro ml Zellsuspension 10 ng/ml 100 ng/ml 1 µg/ml 10 ng/ml IL-1 α IL-6 PGE2 TNF- α 74 3.2 Methoden Die Methodik der Versuche setzt sich zusammen aus mehreren Einzelschritten, dem Sammeln des Nabelschnurblutes, der Zellsortierung, der Anzucht dendritischer Zellen, Einfrieren und Lagern der DC und T-Zellen, sowie dem Infizieren der Zellen mit RSV und der anschließenden Messreihen. Abbilung 13 gibt einen Überblick über die Abfolge der einzelnen Schritte: Nabelschnurblut Dichtegradientenzentrifugation Æ mononukleäre Zellen Tag 0 7 Tage Anzucht CD34+ Zellen 4 Tage Differenzierung Gewinnung CD34 Zellen durch Magnetseparation Durchfluss = alle CD34mononukleären Zellen einschließlich naive TZellen 7d Kultur nach Zugabe von SF, GM-CSF, TNF-α Tag 7 3 Tage Aktivierung und Infektion + Lagerung bei -196°C Lagerung bei -196°C + GM-CSF + TNF-α + IL-4 Vorbereitung des RS-Virus Tag 11 ohne Cytokine TNF–α, PGE2, IL-6, IL-1a = ruhende DC =aktivierte DC Tag 13 Tag 14 Inkubation für 2,5h mit RSV ab Tag 14 Beginn der Messreihen; - Messung der Oberflächenmarker (CD208, HLA-DR, CD86, CCR6, TLR-4 und CD83) nach Aktivierung bzw. bei ruhenden DCs (Abbildung 16) - Messung der Cytokine im Überstand (IL-6, IL-8), Virus im Überstand und der RSV-Replikation nach RSV-Zugabe (Abbildung 17) - Beginn der Cokultur mit naiven T-Zellen (Abbildung 18) Abbildung 13: Zeitplan der Zellisolation und Anzucht von dendritischen Zellen und naiven T-Zellen. Tag 0-7 Anzucht der DCs aus DC34+-Zellen, Tag 7-11 Differenzierung durch Zusatz von IL-4 und Tag 12-14 teilweise Aktivierung und am Tag 13 Infektion. Parallel Gewinnung der T-Zellen sowie Vorbereitung des RSV. 75 3.2.1 Gewinnung der Zellpopulationen 3.2.1.1 Sammeln Das Nabelschnurblut wurde in der Augusta Krankenanstalt in Bochum in steril befüllten konischen 50 ml Röhrchen gesammelt. Gefüllt waren die Röhrchen mit 7ml Sammellösung (s. o.) die eine puffernde und keimhemmende Wirkung besitzt. Das Blut wurde einige Minuten post Partum aus der V. umbilicalis der Plazenta entnommen. Anschließend wurden die Röhrchen bei Zimmertemperatur dunkel gelagert. Die Eltern hatten zuvor ihr schriftliches Einverständnis gegeben. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität genehmigt. Es gab keine Auswahlkriterien die ein bestimmtes Kollektiv ein- bzw. ausgeschlossen haben. Waren in den Röhrchen weniger als 30 ml Nabelschnurblut, bzw. waren sie älter als 24 h oder fanden sich bei der visuellen Kontrolle Gerinnsel, so wurden diese Röhrchen verworfen. Die Weiterverarbeitung im Labor fand unter sterilen Kautelen unter einer Abluft-Arbeitsbank statt. 3.2.1.2 Gradient und Waschen Im nächsten Schritt wurden nun die Mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes vom Plasma und den Erythrozyten und neutrophilen Granulozyten mittels Dichtegradient getrennt und anschließend mehrmals gereinigt. Dazu wurde das Blut in mehrere kleine Portionen von 6-8 ml aufgeteilt (je nach Menge die gesammelt wurde), und mit PBS + 0,6 % CPD (Verdünnungslösung / Waschlösung s. o.) aufgefüllt und vermischt, so dass ein Verdünnungsverhältnis von ca. 1:4 entstand. Das verdünnte Blut wurde nun mit 15 ml Biocoll (1,077 g/ml) unterschichtet, so dass jedes Röhrchen mit 50 ml Flüssigkeit, bestehend aus 2 sauber voneinander getrennten Phasen, gefüllt war. Die Röhrchen wurden anschließend bei 400 x g für 35 min zentrifugiert. Dabei wurde die Bremsfunktion der Zentrifuge ausgeschaltet, um ein Durchmischen der Phasen durch den Bremsvorgang zu verhindern. Bei der hier verwendeten Zentrifugation handelt es sich um eine isopyknische Zentrifugation, eine Gleichgewichtszentrifugation. Die Zellen werden nach Gestalt, Größe und Schwebdichte aufgeteilt. Die Zellen wandern während der 76 Zentrifugation zu dem Punkt, der ihrer eigenen Dichte entspricht, wobei sich die Partikel / Zellen mit höchster Dichte am Ende der Zentrifugation am Boden des Röhrchens wiederfinden. In diesen Versuchen wurde eine Biocoll-Lösung mit einer Dichte von 1,077g/ml verwendet. Hierbei handelt es sich um ein Polysaccharid mit einem dichteerhöhenden Additiv. Daher war die Dichte der Flüssigkeit höher als die der Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten und der von uns gesuchten Vorläuferzellen sowie des Plasmas. Nur die Erythrozyten und die meisten Granulozyten (basophile, neutrophile und eosinophile) sind schwerer als das Biocoll und setzen sich daher am Boden des Gefäßes ab. Auf Grund der unterschiedlichen Größe und Form der Zellen können aber Verunreinigungen der MNCs mit Erythrozyten oder Granulozyten entstehen. 3.2.1.3 Ergebnis der Zentrifugation In den Röhrchen waren nach der Zentrifugation deutlich 3 Schichten voneinander abgrenzbar: Eine rötliche Schicht bestehend aus Erythrozyten und den meisten Granulozyten, darüber eine Schicht Biocoll sowie einer gelblich-klaren Schicht mit einer milchigtrüben Interphase. Diese Interphase enthielt alle mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes, auch CBMC genannt. Hierunter fanden sich Lymphozyten, Monozyten und NK-Zellen. Die Thrombozyten verbleiben zum Großteil im Plasma, da die kurze Zentrifugationszeit nicht für eine Sedimentation ausreichend ist. Schematisch ist die Schichtung innerhalb der Tubes in Abbildung 14 dargestellt. Im nächsten Schritt mussten nun die mononukleären Zellen, die sich als Interphase zwischen Biocoll und Plasma fanden, gewonnen werden. Anschließend wurden die so gewonnenen Zellen mehrmals mit PBS gereinigt, um das eigentlich genotoxische Biocoll von den Zellen zu entfernen. Dieses geschah in zwei Schritten mit jeweils anschließender Zentrifugation. Zunächst für 10 min mit 300 x g zentrifugiert, danach für 15 min mit 200 x g. Ergebnis war ein Pellet, bestehend aus den CBMC, das sich am Boden des Röhrchens abgesetzt hatten. 77 verdünntes Nabelschnurblut Plasma CBMC Biocoll Biocoll Abbildung 14: Erythrozyten, neutrophile Granulozyten Schichtung nach Zentrifugation über den Dichtegradienten. Am Boden der Röhrchen setzen sich alle kernhaltigen Zellen ab, darüber liegt das Biocoll. Oberhalb dessen sind die mononukleären Zellen (CBMC). In der obersten und größten Schicht findet sich das Plasma. Dieses wurde vorsichtig resuspendiert und anschließend mit der Waschlösung auf 25 ml aufgefüllt. Es folgte eine erneute Zentrifugation für 15 min mit 300 x g. Bei diesem Schritt wurden die Thrombozyten, die sich noch in der Lösung befanden, entfernt. Um eine erste Schätzung der Menge der vorhandenen Zellen zu bekommen, wurden im nächsten Schritt die Zellen mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Zur Gewinnung einer Zellsuspension, wurde das entstandene Pellet resuspendiert und auf 25 ml aufgefüllt. Eine Probe von 10 µl wurde mittels Türkscher-Lösung (Verhältnis 1:10) angefärbt. Wurden weniger als 108 Zellen gezählt, so wurde an dieser Stelle die Aufbereitung abgebrochen, da für die weiteren Schritte laut Hersteller des MiniMacs Systems mindestens 1x108 Zellen notwendig sind. Fielen bei der Verarbeitung der Probe Schwebstoffe oder Gewebestücke auf, dann wurde vor der nächsten Zentrifugation ein Filter-Zwischenschritt eingefügt. Der Filter (s.o.) wurde nach Herstellerangaben verwendet. Die Suspension mit den CBMC wurde für 10 min mit 300 x g zentrifugiert. 78 3.2.1.4 Magnetische Zellseparation 3.2.1.4.1 Überblick Bei der magnetischen Zellseparation wurden die CD34+ Zellen von den übrigen CBMC getrennt. Hierfür wurde die magnetische Zellseparation verwendet, bei der magnetische Antikörper verwendet werden. Ein Schema der magnetischen Zellseparation findet sich in der folgenden Abbildung. Abbildung 15: Magnetische Zellseparation. Die mit den magnetischen Antikörpern markierten Zellen bleiben zwischen den Magneten hängen, die nicht markierten Zellen laufen durch. Die markierten Zellen können im Anschluss eluiert werden. Das FcR Blocking Reagenz wird verwendet, um die unerwünschte Bindung der Antikörper an die Fc-Rezeptoren zu verhindern. Unter die Fc-Rezeptor exprimierenden Zellen fallen B-Zellen, Monozyten und Makrophagen. Dieses zusätzliche Reagenz soll die Reinheit der magnetisch isolierten Zellen erhöhen. 79 3.2.1.4.2 Durchführung Alle Schritte der magnetischen Zellseparation wurden eisgekühlt durchgeführt. Die zuvor zentrifugierte Zellsuspension wurde nun abgegossen und mit weiterem Puffer resuspendiert. Anschließend wurden pro 108 Zellen 100µl Fc-Blocking Reagenz (s.o.) zur Suspension gemischt und in gleicher Menge CD34 Micro Beats hinzugefügt, anschließend im Kühlschrank für 30 min inkubiert und danach nochmals für 10 min mit 300 x g zentrifugiert. Daraufhin wurde nach Resuspendierung die Zellsuspension auf die Separationssäule, die zuvor mit 1 ml PBS-Lösung angefeuchtet wurde, gegeben. Die durchtropfende Flüssigkeit (= Durchlauf) wurde in einem Tube aufgefangen. Die Restflüssigkeit in der Separationssäule wurde nach Entfernen aus dem Magnetfeld anschließend mittels eines Stempels herausgepresst. Hier fanden sich CD34+ Zellen (Positivselektion) Dieser Vorgang wurde mit einer zweiten Säule wiederholt. Hierbei wurde statt Puffer als Spüllösung Nährmedium (s.o.) verwendet. Ziel dieses zweiten Schrittes war es, eine Reinheit von CD34+ von 95-99 % zu erhalten. Der Durchlauf wurde mittels Neubauer-Zählkammer unter dem Lichtmikroskop gezählt. Die CD34+ Zellen wurden in der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer gezählt, nachdem sie mit Türckscher Lösung angefärbt wurden. 3.2.1.4.3 Einfrieren des Durchlaufs Der Durchlauf wurde nun nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (10 min, 300 x g) im Einfriermedium aufgenommen. Die gezählten Zellen wurden so aufgeteilt, dass pro Cryo-Tube maximal 2 x 107 Zellen/Tube gelöst in 1 ml Einfriermedium bei -80° C. eingefroren wurden. Anschließend wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff weitergelagert, bis sie für die Versuche aufgetaut wurden. 3.2.1.5 Kultivierung der CD34+ Zellen und Differenzierung zu DC Ziel der Kultivierung war eine Vermehrung der Zellen und eine Umwandlung der CD34+ Zellen in DCs. Die CD34+ Zellen sollen später auf die Wells einer 24 Lochplatte (s.o.) verteilt werden, aber maximal 1,5 x 105 CD34+ Zellen pro Well. Entsprechend der errechneten Zahl an Wells wurde der CD34+ Zellen-Suspension Nährmedium 80 zugegeben. Zusätzlich wurde pro ml Suspension (= pro Well) die DC Stimulationslösung (s. o.) zugegeben: Nachdem die Suspension auf die Wells verteilt war, wurde die Lochplatte in einen Inkubator mit einer konstanten Temperatur von 37° C, einer Luftfeuchte von 85 % und einem CO2 Gehalt von 5 % gestellt. Der Tag des Ansetzens wurde als Tag 0 gerechnet. Im weiteren Verlauf wurden die Zellen in der Kultur täglich mittels eines inversen Mikroskops (s. o.) überprüft. Hierbei wurde auf Bakterienverunreinigungen, Verfärbungen des Mediums und Entwicklung der Zellen geachtet. Hatte sich ein Rasen auf dem Boden der Wells gebildet, wurde die Zellsuspension eines Wells halbiert und mit Nährmedium aufgefüllt. Die Zellen wurden aber spätestens am dritten Tag der Kultur das erste Mal geteilt, da dieser Vorgang auch einen Wachstumsreiz für die Zellen darstellte. Der Kultur wurden die drei Wachstumsfaktoren Stammzellfaktor (SF), GM-CSF und TNF-α zugegeben. Diese bewirkten hierbei eine Reifung und Differenzierung der CD34+ Zellen zu DCs. Nach 7 Tagen Kultur wurden die Zellen geerntet, gezählt und eingefroren. Die Zellsuspension aus den Wells wurde für 10 min zentrifugiert (300 x g) und das dabei entstandene Pellet mit Einfriermedium (s.o.) resuspendiert und 7 anschließend jeweils 1 ml mit maximal 2 x 10 Zellen/ml in ein vorgekühltes CryoTube gefüllt. Die Zellen wurden bei -37° C. eingefroren und später in flüssigem Stickstoff bei -196° C eingelagert. 3.2.1.6 Ausdifferenzierung und Cytokin-Stimulation der DCs Die eingefrorenen DCs wurden aufgetaut und dreimalig mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit Türkscher Lösung angefärbt und in der Neubauer Zählkammer gezählt. Die Zellen wurden so mit Kulturmedium verdünnt, dass 4 x 105 Zellen/ml in der Lösung zu finden waren. Die Suspension wurde dann auf eine 24 Well Platte mit 1 ml/ Well verteilt. Es erfolgte eine weitere Ausdifferenzierung in IL-4 und GM-CSF-haltigem Medium (s. o.) für 4 Tage. Diese Zell-Suspensionen wurden weitere 4 Tage (= 11 Tage Gesamt-Kultur) bei 37° C und 5 % CO2 im Brutschrank kultiviert. Dabei erfolgte keine weitere Teilung der Kultur. Die so stimulierten Zellen wurden für die weiteren Versuche verwendet. 81 3.2.1.6.1 Stimulation mit dem Cytokincocktail Die Hälfte der Zellen wurde am 11. Tag (jeweils 4 x 105 Zellen/ml) mit dem Cytokincocktail (10 ng/ml IL-1-α, 100ng/ml IL-6, 1 µg/ml PGE2, 10 ng/ml TNF-α) stimuliert und für weitere 48 Stunden in 1 ml RPMI, 10 % FCS, 4 % Zellkulturzusätzen inkubiert. Die andere Hälfte der DCs wurde in diesem Zeitraum lediglich mit Nährmedium kultiviert, so dass an Tag 13 der Gesamtkultur sowohl ruhende DCs als auch aktivierte DCs zur Verfügung standen. 3.2.1.7 Vorbereitung des RS-Virus Die Hep-2-Zellen wurden in einer mit Trypsin vorbehandelten Kulturflasche ausgedünnt und für 1 Tag bei 37° C. und 0 % CO2 inkubiert. Hep-2-Zellen sind humane Tumorzellen einer Larynx-Carzinom-Linie mit großen Zellkernen und häufigen Mitosen. Erstbeschreiber dieser Zellen waren Moore et al. (Moore et al., 1955; Simoes, 1999). Mit dem RSV-Stamm (RSV long strain) vom ATCC (American Type Culture Collection, VR-26) wurden die vorbereiteten Hep-2-Zellen mit einer MOI von 0,1 infiziert und für weitere 3 Tage unter gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, inkubiert. Das hierbei verwendete Kulturmedium der infizierten Hep-2-Zellen bestand aus DMEM / Hepes + 1 % PSN + 5 % FCS. Zeigten die infizierten Zellen Zeichen der fortgeschrittenen Infektion, den so genannten cytopathischen Effekt, so wurden diese weiter untersucht. Unter dem cytopathischen Effekt bei Infektion mit RS-Viren versteht man die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen, so genannten Synzytien, die ca. 36 – 48 Stunden nach Infektion entstehen. Am 5. Tag wurden die infizierten Zellen geerntet, mit Ultraschall zerstört und anschließend 10 min. bei 1000 rpm zentrifugiert. Zur weiteren Erhöhung der Reinheit des Virus und zur Trennung von restlichen Bestandteilen des Kulturmediums, wurden die Viren über einen SucroseGradienten nach Fernie und Gerin weiter isoliert (Fernie and Gerin, 1980). Hierzu wurde 5 g Sucrose mit 50 ml HN-Puffer vermengt und 2 ml hiervon unter die Virus-Lösung gegeben. Es erfolgte eine erneute Zentrifugation mit 2 h bei 82 60000 g (= 30.000 rpm) bei 8° C. Wobei das Pellet die Zelltrümmer der Hep-2 Zellen enthält und im Überstand das Virus zu finden ist. Aus dem Überstand wurde anschließend eine Titerbestimmung durchgeführt. Diese erfolgte mittels einer dekadischen Verdünnungsreihe, wobei die Verdünnungsstufe als Virus-Titer gilt, bei der gerade noch eine Infektion der Zellen nachgewiesen werden konnte. Die Maßeinheit für die Konzentration infektiöser Partikel in einer Probe pro ml wird in plaque forming units (pfu) angegeben. Es erfolgte eine Färbung der infizierten Zellen wodurch das Zytoplasma der Zellen braun angefärbt wurde. Die Verdünnungsstufe, bei der noch eine Braunfärbung nachweisbar war, wurde als Virus-Titer bestimmt. Anschließend wurde das Virus mit einem Titer von 2 x 106 PFU/ml in 50µl und 100µl Portionen bei – 80° C. eingefroren. Zusätzlich erfolgte eine Testung auf Mykoplasmen: Die Hep-2-Zellen und das RS-Virus wurden mittels eines Mykoplasmen Detection Kit (siehe Beschreibung Minerva Biolabs) nach Anweisung des Herstellers auf Mykoplasmen getestet. 3.2.2 Infektion der ruhenden und aktivierten DCs mit RSV An Tag 13 der Gesamtkultur wurden jeweils 200µl der ruhenden DCs und der aktivierten DCs nach vorherigem Abpipettieren des Mediums mit 500 µl Virus (= MOI von 20) infiziert. Eine MOI von 20 bedeutet ein Verhältnis von 20 Viruspartikeln auf eine DC. Die optimale Virusmenge zur Infektion von DCs wurde in Vorexperimenten ausgetestet. Zu einer Kontrollgruppe wurde statt Virus 500 µl DMEM zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 2,5 h. Danach wurde der Überstand sowie die restlichen Viren vorsichtig abpipettiert und durch RPMI mit 10 % FCS und 4 % Zellkulturzusätzen ersetzt. Es erfolgte eine weitere Inkubation für insgesamt ca. 24 Stunden wie bei Thurau et al. beschrieben (Thurau et al., 1998). Vorversuche haben gezeigt, dass 85 % der DCs zu diesem Zeitpunkt noch lebend waren. 83 3.3 Messungen der Reifemarker sowohl bei ruhenden DCs als auch bei aktivierten DCs nach Zugabe von RSV 3.3.1 Fluoreszenz-Färbung der Reifemarker Am Tag 14 erfolgten dann die Messungen der Oberlächenmarker. Sowohl bei den ruhenden DCs als auch bei den cytokin-aktivierten DCs, jeweils mit und ohne RSV-Infektion, wurden die Oberflächenmarker CCR6, HLA-DR, CD86, TLR-4 und CD83 bzw. das intrazellulär gelegene CD208 mittels Fluoreszenzfärbung als Maß 3 Tage Aktivierung und Infektion 4 Tage Differenzierung 7 Tage Anzucht für ihren Reifegrad gemessen. Tag 0 Gewinnung der Zelllinien siehe Abbildung 13 Tag 7 + GM-CSF + TNF-α + IL-4 Tag 11 ohne Cytokine = ruhende DC Tag 13 Inkubation für 2,5h mit RSV + TNF–α, PGE2, IL-6 = aktivierte DCs Inkubation für 2,5h mit RSV Tag 14 Messung der Fluoreszenz der mit Phycoerythrin beladenen Reifungsmarker und der Fluoreszenz des gebundenen CD1a-FITC mittels FACS-Methode Abbildung 16: Induktion und Messung der Reifungsmarker. Nach Differenzierung in ruhende und aktivierte DCs, erfolgt bei der Hälfte der DCs die RSV-Infektion (Tag 13). Am 14. Tag Markierung der Reifungsmarker (CCR6, HLA-DR, CD86, CD208, CD83 und TLR-4) auf CD1a exprimierenden Zellen. 84 Die markierten Reifemarker waren: Für jeden - TLR-4 - CD86 - CCR6 - HLA-DR - CD83 - CD208 Oberflächenmarker erfolgte eine separate Anfärbung und entsprechende Messungen. Das intrazellär gelegene CD208 wurde nach Fixierung der Zelle mittels eines Fluoreszenzfarbstoffs angefärbt. 3.3.1.1 Färbung der Oberflächenmarker (TLR-4, CD86, CCR6, HLA-DR und CD83) Hierfür wurden die kultivierten Zellen 10 min auf Eis gesetzt, geerntet und mit 300 x g für 10 min zentrifugiert. Es erfolgte ein zweimaliges Waschen und eine Verdünnung auf 2 x 105/ml Zellen mittels HBSS. Zur Blockierung der FcRezeptoren erfolgte die Zugabe von Octagam. Im Anschluss erfolgte eine Inkubation für 20 min bei 4° C mit jeweils 10µl des verdünnten Antikörpers gegen das jeweilige Oberflächenmolekül bzw. das jeweilige co-stimulierende Molekül. Die verwendeten Antikörper waren bereits vom Hersteller mit Phycoerythrin konjugiert. Zusätzlich wurde nach erneutem Waschen in einem weiteren Schritt das DCspezifische CD1a mittels CD1a-FITC gegengefärbt. Hierfür wurden die DCs mit 5µl des Antikörpers ebenfalls für 20 min bei 4° C inkubiert. Nach einem erneuten Waschen der Zellen erfolgte im Anschluss die Messung im FACScan®. Die fluoreszierenden Moleküle Phycoerythrin und FITC werden bei der Messung im FACS durch einen Argon-Laser mit 488 nm Wellenlänge angeregt. Das hierdurch emittierte Licht, welches durch das Zurückspringen einzelner Elektronen in energieärmere Niveaus entsteht, besitzt eine charakteristische Wellenlänge von 578 nm beim Phycoerythrin. Die charakteristische Wellenlänge von FITC liegt bei 519 nm. Dieses emittierte Licht (Fluoreszenz) korreliert mit der Dichte der jeweiligen Oberflächenmarker auf der gemessenen Zelle. Für alle Messreihen wurden zuvor Isotypenmessungen zur Bestimmung der Messfelder durchgeführt. 85 3.3.1.2 Antikörper-Markierung des intrazellulären CD208 Es erfolgte eine Fixierung der Zellen in eiskaltem HBSS mit 4 % Paraformaldehyd für 4 min. Nach erneutem Waschen mit PBS erfolgte die Fixierung der Zellen mit 100 µl HBSS + 0,1 % Saponin + 0,01 mM Hepes Puffer. Im Anschluss erfolgt die Inkubation mit dem PE-markierten CD208-Antikörper. Die DC-spezifische Markierung des CD1a mittels CD1a-FITC erfolgte vor der Fixierung der Zellen und nicht im Anschluss wie oben beschrieben. Die anschließende Messung erfolgte wie oben beschrieben. Es wurden stets in Summe 24 Messungen d.h. 6 Messreihen für die Messung der Oberflächenmarker mit und ohne RSV-Infektion bei ruhenden und aktivierten DCs durchgeführt. 3.3.2 Durchflusszytometrische Analyse Die Analyse erfolgte im FACScan® mit einer Filter-Ausstattung für - FITC (350 nm) (FL-1) - PE (585 nm) (FL-2) - Tricolor Emissionen in dunklem Rot (< 650 nm) (FL-3) 10-15 tausend Ereignisse wurden gezählt und in einer Tabelle ausgegeben und mit der CeLL Quest ® Software analysiert. In der Abbildung 17 sind als Beispiel die Ergebnisse einer Messung der in dieser Arbeit verwendeten FACS-Analysen dargestellt. Hierbei passieren die hydrodynamisch fokussierten Zellen einzeln den ArgonIonen-Laser. Dieser Laser emittiert Licht einer genau definierten Wellenlänge. Trifft der Laserstrahl auf eine Zelle, entstehen Streulichtsignale. Das sogenannte “Vorwärtsstreulicht“ (engl.: forward scatter, FSC), gemessen in einem Winkel von 3-10°, erlaubt eine Aussage über die Größe der Zelle, wohingegen das im rechten Winkel zur Laser-Lichtquelle gemessene “Seitwärtsstreulicht“ (engl.: side scatter, SSC) ein Maß für deren Granularität ist. In einem Dot-Plot wird der Forward-Scatter gegen den Side-Scatter aufgetragen. Jede Zellpopulation bildet, abhängig von ihren Lichtstreueigenschaften in der graphischen Darstellung von FSC und SSC (gegeneinander aufgetragen) eine Punktwolke. Mit Hilfe eines Gates wurde die zu erfassende Zellpopulation 86 ausgewählt (Abbildung 17 A). CD1a wurde als Marker für dendritische Zellen verwendet. Zur Abgrenzung der CD1a positiven Zellen wurde der Messbereich Abbildung 17: Durchflusszytometrische Messung von Oberflächenmarkern dendritischer Zellen. (A) Identifizierung lebender Zellen im Forward-Sideward Scatter (B) Setzen einer Auswerteregion für FITC positive Zellen anhand der negativen Kontrolle (C) Identifizierung der CD1a/CCR6 positiven Zellen und (D) Expression von CCR6 auf CD1a positiven dendritischen Zellen im Histogramm. Die Ergebnisse werden als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben. (R2 in Abbildung 17 C) anhand des Hintergrundsignals (Abbildung 17 B) festgelegt und die Ergebnisse für den zu messenden Marker (CCR6) in einem Histogramm dargestellt. Die Ergebnisse wurden als MFI (Mittlere Fluoreszenz Intensität) angegeben. 87 3.4 Messung der Cytokinproduktion durch dendritische Zellen sowie der Zahl der infektiösen Partikel 3.4.1 RSV – spezifische Realtime PCR Die Quantifizierung der RSV RNA in der RT-PCR (Ternette et al., 2007) wurde dankenswerterweise im Institut für Virologie der Ruhr Universität Bochum (Dr. Grunwald) vorgenommen. Dazu wurde virale RNA mit dem QIAamp ® Viral RNA Mini Kit gemäß der Anweisung des Herstellers isoliert. Die RNA wurde in 50 µl Elutionspuffer eluiert. Die Gesamtmenge der zellulären RNA wurde mit Hilfe eines NanoDrop Fluorospektrometers bestimmt. Für die RT-PCR wurde das QuantiTect ™ Probe RT-PCR Kit der Firma Qiagen mit SYBR-Green verwendet. Der RNA-Standard wurde unter Verwendung des TOPO TA Cloning Kits im PCR-TOPO ®-Vektor kloniert und in einer vitroTranskription mit Hilfe der T7 RNA Polymerase hergestellt. Die Menge der in vitro transkribierten RNA wurde unter Verwendung des Ribo-Green RNA Kits gemessen, die so die Bestimmung der Kopienzahl des RNA-Standards ermöglichte. Der RNA-Standard wurde seriell in Zehnerschritten verdünnt und in jedem Assay mitgeführt. Für die RT-PCR wurden der Vorwärts-Primer RSA-1 5´-AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA und der gegenläufige Primer RSA-2 5´-GCACATCATAATTAGGAGTATCAAT, verwendet (modifiziert nach van Elden et al. 2003 (van Elden et al., 2003)) . Die Amplifizierung und Messung erfolgte in einem Rotorgene System der Firma Corbett Life Science in einem initialen Zyklus zur Aktivierung der DNA-Polymerase für 1 h bei 50°C und 15 min bei 95°C, gefolgt von 45 Zyklen mit 15s bei 95°C und 1 min bei 60°C. Während der Amplifikation wurde das Amplifikat anhand der Fluoreszenzemission in Echtzeit quantifiziert. Die Spezifität der PCR-Produkte wurde durch eine Schmelzpunktanalyse von 45 °C bis 95 °C sichergestellt. 88 7 Tage Anzucht 4 Tage Differenzierung 3 Tage Aktivierung und Infektion Tag 0 Gewinnung der Zelllinien siehe Abbildung 13 Tag 7 GM-CSF + TNF-α + IL-4 Tag 11 ohne Cytokine = ruhende DCs Tag 13 TNF–α, PGE2, IL-6 = aktivierte DCs Inkubation für 2,5h mit RSV Inkubation für 2,5h mit RSV Tag 14 Messungen – 24h nach Infektion Cytokine (IL-6 und IL-8) im zellfreien Überstand mittels Elisa-KIT Die RNAKopienzahl, wurde mittels Realtime PCR gemessen Austitration virushaltiger Überstände auf HeP2 Zellen 24h Inkubation Bestimmung des Virustiters mittels mikroskopischer Beurteilung der infizierten HepZellen Abbildung 18: Messung von Cytokinen und RSV im Überstand dendritischer Zellen. Am Tag 1 wurden ruhende und aktivierte DCs 2,5h mit RSV inkubiert. 24h nach Infektion erfolgte dann die Messung der Cytokine IL-6 und IL-8, die RNA-Menge und die Bestimmung des RSV-Titers im Überstand. 3.4.2 Bestimmung des Virustiters im Überstand Zum Nachweis der Menge der freigesetzten infektiösen Partikel im Überstand der infizierten dendritischen Zellen wurden die Überstände in einer zweifachen Verdünngsreihe auf Hep-2-Zellen in eine 96-Well-Microtiterplatte ausgesät. Die Konzentration der Hep-2-Zellen bertug 2 x 104 Zellen/100µl/Well. Es erfolgte eine 89 Inkubation für 24h bei 37°C und 5% CO2. Der Virus-Titer wurde im Anschluss durch eine lichtmikroskopische Untersuchung der Hep-2-Zellen durchgeführt. Der Titer wurde ermittelt durch die Verdünnungsstufe bei der die letzte infizierte Hep-2Zelle zu sehen war. 3.4.3 Messung der Cytokine mittels ELISA Die Cytokine wurden quantitativ im zellfreien Überstand bestimmt. Hierzu wurden Elisa Kits für IL-6 und IL-8 der Firma R&D Systems® verwendet. Der cytokinspezifische Antikörper (gegen IL-6 bzw. IL-8) war bereits auf einem Kunststoffträger (96 Well-Platte) fixiert (sog. Capture-Antikörper). Alle Reagenzien und die Verdünnungsreihe der Standardtestlösung wurden nach Anweisungen des Herstellers vorbereitet. 100 µl der gepufferten Protein-Basislösung wurden in jedes Well pipettiert. Im Anschluss wurden 100 µl des zu testenden Überstandes und der zuvor vorbereiteten Verdünnungsreihe der Standardtestlösung hinzugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Abpippettieren des Überstandes erfolgte die viermalige Reinigung mit je 400 µl Waschlösung. Nach Entfernung der Waschlösung wurden in jedes Well 200µl eines polyklonalen Antikörpers gegen IL-6 bzw. IL-8 (sog. Detection-Antikörper), an den das Enzym horseradish peroxidase gebunden ist, gegeben. Es erfolgte erneut eine Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit anschließender Reinigung mit Waschlösung und Entfernung des Überstandes. Nun wurden 200µl der Substratlösung (Farbreagenz) in jedes Well gegeben und 20 Minuten in Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 50µl der Stop-Lösung (2-N-Schwefelsäure), welche eine Farbveränderung von Blau zu Gelb zur Folge hatte. Die eigentliche Messung erfolgte im Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm. Als Leerwert für die Standardverdünnungen und Probenmessungen diente der Verdünnungspuffer. Anhand der jeweiligen Standardkurve wurde für jede Probe der Extinktionswert und damit der Zytokingehalt ermittelt. Die Daten wurden aus insgesamt 6 Kulturen gewonnen. Wie üblich wurden stets in Summe 24 Messungen d.h. 6 Messreihen für die Messung der Cytokine mit und ohne RSV-Infektion bei ruhenden und aktivierten DCs durchgeführt. 90 3.5 Cokultur von dendritischen Zellen mit naiven T-Zellen 3.5.1 Isolation und T-Zell-Stimulation Nach dem Auftauen des Durchlaufs, der bei der Gewinnung der CD-34+ Zellen als Nebenprodukt angefallen war, wurden die CD4+CD45RA+ T-Zellen mittels Negativsortierung mit anti-HLA-DR, anti-Glycophorin, anti-CD8, anti-CD56, antiCD45RO aussortiert. Dabei wurde das AutoMacs System verwendet. Es erfolgte eine Kultur von 1 x 106 CD4+CD45RA+ T-Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FCS. Die T-Zellen wurden anschließend mit 1 x 105 ruhenden bzw. aktivierten dendritischen Zellen, die entweder RSV infiziert waren oder nicht, inkubiert. Der Suspension wurde 0,1 ng/ml TSST-1 zugegeben. Das TSST-1 bindet als bakterielles Superantigen sowohl an MHC-II der DC als auch an den TZellrezeptor Vβ-Elementen (TCR-Vβ2) der T-Zellen. Es wurde TSST-1 verwendet, da die Expression von TCR-Vβ2 T-Zellen leicht mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann. In der Kultur war TSST-1 alleine ohne dendritische Zellen nicht in der Lage, eine T-Zell-Reaktion oder eine Cytokinproduktion zu induzieren oder zu modifizieren. Die Zellen wurden in einer 24 Well Platte kultiviert. 91 7 Tage Anzucht Anzucht der DCs siehe Abbildung 13 Lagerung der angezüchteten DCs bei -196°C siehe Abbildung 13 4 Tage Differenzierung GM-CSF + TNF-α + IL-4 TNF–α, PGE2, IL-6 = aktivierte DCs 3 Tage Aktivierung und Infektion ohne Cytokine = ruhende DCs Inkubation für 2,5h mit RSV (MOI 20) Tag 0 Inkubation für 2,5h mit RSV (MOI 20) Start der Cokulturen DC + T-Zellen + TSST Tag 3 21 Tage Cokultur Lagerung der autologen T-Zellreichen Fraktion bei -196°C siehe Abb. 13 Negativselektion von CD4+CD45RA+ TZellen Tag 3 Messung T-Zellcytokine Tag 5 Tag 5 Messung T-Zellcytokine Tag 7 Tag 7 Messung T-Zellcytokine Restimulation mit neupräparierten DC + TSST Tag 14 Messung T-Zellcytokine Tag 14 Restimulation mit neupräparierten DC + TSST Tag 21 Messung T-Zellcytokine Tag 21 Abbildung 19: Cokultur von dendritischen Zellen mit naiven T-Zellen. Differenzierung, Aktivierung und Infektion der DCs vor Beginn der Cokultur von TZellen, DCs und TSST. Restimulation mit jeweils frisch präparierten DCs und TSST an Tag 7 und 14. An Tag 3, 5, 7, 14 und 21 der Cokultur Messung der intrazellulären Cytokine. 92 3.5.2 Intrazelluläre Cytokin-Färbung Die Cytokinfärbung erfolgt 3, 5, 7, 14 und 21 Tage nach Beginn der Cokultur nachdem von Jung beschriebenen Verfahren (Jung et al., 1993). Sechs Stunden vor der Zytokinmessung erfolgte eine zusätzliche Stimulation mit 2,4 µg/ml PHA und 1 ng/ml PMA. In den letzten 4 h unter Zugabe von 1,3 µM/ml Monensin. Es erfolgt die Fixierung in eiskaltem HBSS mit 4 % Paraformaldehyd für 4 min. Nach erneutem Waschen erfolgt die Permeabilisierung der Zellwand mittels 100 µl HBSS + 0,1 % Saponin + 0,01 mM Hepes Puffer. Danach erfolgt die Inkubation mit Anti-IL-4-PE und anti-IFN-γ-Biotin oder mit Anti-IL-10-PE und anti-IL-13-Biotin. TCR-Vß2 positive T-Zellen wurden mit FITC gekoppelten TCR-Vß2-Antikörpern angefärbt (20 min bei 4° C). Vor der durchflusszytometrischen Analyse erfolgte zusätzlich die Inkubation mit Streptavidin–Tricolor für 20 min bei 4°C, das an das Biotin, der entsprechend markierten Antikörper, band. Die Messung erfolgte mit einem FACScan®. Es wurden 10.000-15.000 Ereignisse aufgenommen. Abbildung 20: Durchflusszytometrische Messung der intrazellulären Cytokine. Naive Lymphozyten wurden mit dendritischen Zellen und TSST-1 für 3 bis 7 Tage kultiviert und vor der Messung mit PHA, PMA (6h) und Monensin (4h) nachstimuliert (A) Identifizierung von Lymphozyten im Forward-Sideward Scatter (B) Setzen einer Auswerteregion für Vβ2 positive Zellen (R2) (C) Messung der Cytokinexpression. Die Ergebnisse wurde als prozentualer Anteil an den Vβ2 positiven T-Zellen angeben. 93 3.6 Statistik Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Programms Graph Pad Prism 4.0 (Graphpad software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die Daten der durchflußzytometrischen Analyse der Reifemarker wurden im Friedman-Test und nachfolgendem Dunns-Test analysiert. Die Daten zur Virusreplikation und Cytokinproduktion von aktivierten und nicht aktivierten dendritischen Zellen wurden mit Hilfe des Wilcoxon-Vorzeichen-RangTest verglichen. Die Daten der sequentiellen Untersuchung intrazellulärer Cytokine in Cokulturen wurden im zweifaktoriellen ANOVA für verbundene Stichproben und einem nachgeschalteten Bonferroni Posttest zum Vergleich verschieden behandelter Kulturen analysiert. 94 4 Ergebnisse 4.1 Oberflächenmarker der dendrischen Zellen Aus Nabelschnurstammzellen wurden dendritische Zellen zunächst für 7 Tage mit GM-CSF, TNF-α und SCF angezüchtet und dann über weitere 4 Tage mit GMSCF, TNF-α und IL-4 differenziert. Zur Vorbereitung der Experimente wurden zunächst die Hälfte der dendritischen Zellen mit einem Cocktail proinflammatorischer Zytokine aktiviert und nach 2 Tagen jeweils zur Hälfte mit RSV infiziert und für einen weiteren Tag inkubiert, so dass 4 unterschiedliche Gruppen dendritischer Zellen zur durchflußzytometrischen Analyse vorlagen. Gemeseen wurde die jeweilige Expression der Marker auf CD1a positiven Zellen. Die Ergebnisse wurden als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben. Es wurden jeweils 6 Experimente durchgeführt. 4.1.1 Die gemessene Expression von TLR4 ist bei DCs nach Cytokinstimulation im Falle einer RSV-Infektion deutlich höher Zwischen RSV infizierten und nicht infizierten ruhenden CD1a positiven dendritischen Zellen zeigte sich hinsichtlich der TLR-4 Expression kein signifikanter Unterschied. Dagegen exprimieren die aktivierten dendritischen Zellen nach RSV Infektion deutlich mehr TLR-4 als die aktivierten dendritischen Zellen ohne Infektion und die in ruhendem Zustand infizierten dendritischen Zellen. 95 2500 * TLR-4 [MFI] 2000 * ns 1500 1000 Kontrolle RSV ns 500 0 Abbildung 21: ruhende DC aktivierte DC Expression von TLR-4 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DC), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von TLR-4 auf CD1a positiven Zellen. ns nicht signifikant, * p<0,05. 4.1.2 Die Expression des CD86 ist bei cytokinaktivierten DCs signifikant erhöht im Vergleich zu ruhenden DCs Die CD86 Expression wurde durch den Cytokincocktail unabhängig von der RSVInfektion gesteigert. Eine RSV-Infektion hat jedoch vor und nach Aktivierung CD86 [MFI] keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Expression des exprimierten CD86. Abbildung 22: 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 ns Kontrolle RSV ** ** ns ruhende DC aktivierte DC Expression von CD86 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von CD86 auf CD1a positiven Zellen. ns nicht signifikant, ** p<0,01 96 4.1.3 Die Expression des CD208 zeigt bei aktivierten DCs eine deutliche Steigerung der Expression im Vergleich zu ruhenden DCs Sowohl mit als auch ohne RSV ist die CD208-Expression bei den aktivierten DCs fast doppelt so hoch wie im Vergleich zu ruhenden Zellen. * CD208 [MFI] 750 500 * ns 250 0 Abbildung 23: Kontrolle RSV * ruhende DC aktivierte DC Expression von CD208 in CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von CD208 in CD1a positiven Zellen. ns nicht signifikant,, * p<0,05 97 4.1.4 Bei den Oberflächenmarkern HLA-DR, CD83 und CCR-6 zeigten sich durch die Aktivierung bzw. RSV-Exposition statistisch keine signifikanten Unterschiede 4.1.4.1 HLA-DR Expression Vergleicht man die HLA-DR Expression der ruhenden wie auch der aktivierten DCs jeweils mit bzw. ohne RSV-Infektion miteinander, so findet sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zelltypen, unabhängig von der Aktivierung durch den Cytokincocktail und der RSV-Infektion. ns HLA-DR [MFI] 2500 2000 Kontrolle RSV ns 1500 1000 500 0 Abbildung 24: ns ns ruhende DC aktivierte DC Expression von HLA-DR auf ruhenden DCs und aktivierten DCs unter Einfluß von RSV. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von HLA-DR auf CD1a positiven Zellen. ns nicht signifikant 98 4.1.4.2 CD83-Expression Vergleicht man die CD83-Expression der ruhenden wie auch der aktivierten DCs jeweils mit bzw. ohne RSV-Infektion miteinander, so findet sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zelltypen, unabhängig von der Aktivierung durch den Cytokincocktail und der RSV-Infektion. ns 700 ns CD83 [MFI] 600 500 ns 400 300 200 100 0 Abbildung 25: Kontrolle RSV ns ruhende DC aktivierte DC Expression von CD83 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von CD83 auf CD1a positiven Zellen. ns nicht signifikant 99 4.1.4.3 CCR-6-Expression Vergleicht man die CCR-6-Expression der ruhenden wie auch der aktivierten DCs jeweils mit bzw. ohne RSV-Infektion miteinander, so findet sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zelltypen, unabhängig von der Aktivierung durch den Cytokincocktail und der RSV-Infektion. 1500 ns CCR6 [MFI] ns 1000 ns ns 500 0 Abbildung 26: Kontrolle RSV ruhende DC aktivierte DC Expression von CCR-6 auf CD1a+ DCs unter Einfluß von RSV. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von CCR6 auf CD1a positiven Zellen. ns nicht signifikant 100 4.2 Messung der intrazellulären Virusreplikation, der Freisetzung infektiöser Partikel und Ausschüttung der Cytokine IL-6 und IL-8 Wie in den vorangegangenen Experimenten wurde aus Nabelschnurstanmzellen angezüchtete dendritische Zellen entweder für 2 Tage mit einem proinflammatorischen Cytokincocktail aktiviert oder als ruhende dendritische Zellen unbehandelt gelassen. Beide Populationen wurden dann nach einem Tag mit RSV infiziert und nach einem weiteren Tag analysiert. 4.2.1 RSV-Replikation bei ruhenden und aktivierten DCs Aus den dendritischen Zellen wurde RNA isoliert und die RSV spezifische RNA wurde in einer RT-PCR quantifiziert. In den ruhenden DCs findet man 8,5 x 107 Kopien. Dagegen weisen aktivierte DCs eine deutlich höhere Kopienzahl von 2,6 x 108 Kopien auf. Zahl der Kopien 10 9 10 8 10 Abbildung 27: 7 ruhende DC aktivierte DC Zahl der RSV Kopien in infizierten DCs. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 RT-PCR. 101 4.2.2 Titer infektiöser Partikel im Überstand infizierter DCs Die Überstände der infizierten dendritischen Zellen wurden in vierer Schritten auf Hep-2-Zellen austitriert. Anhand der höchsten Verdünnung, die eine mikroskopisch nachweisbare Infektion zeigte, wurde der Titer infektiöser Partikel berechnet. Auch hier zeigte sich ein signifikant höherer Wert bei aktivierten DCs Infektiöse Partikel [Titer] (p<0,0014). Abbildung 28: 1024 256 64 16 p= 0.0014 4 1 ruhende DC aktivierte DC Infektiöse Partikel im Überstand bei ruhenden und aktivierten DCs. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Titration infektiöser Partikel im Überstand. 102 4.3 Cytokinproduktion von infizierten dendritischen Zellen Die Menge des ausgeschütteten IL-6 und IL- 8 wurde 48 h nach Infektion mit dem RS-Virus, im zellfreien Überstand im ELISA gemessen. Die aktivierten dendritischen Zellen produzieren im Mittel doppelt soviel IL-6 wie die ruhenden dendritischen Zellen. Dieser Unterschied ist statistisch hoch signifikant (p<0,0014). Dagegen zeigte sich kein Unterschied hinsichtlich der IL-8 Produktion. IL6 [pg/ml] 300 200 100 0 Abbildung 29: p=0.0014 ruhende DC aktivierte DC Produktion von IL-6 durch aktivierte und ruhende DCs. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung von IL-6 im Überstand. 5500 p=0.4597 IL8 [pg/ml] 4500 3500 2500 1500 500 ruhende DC aktivierte DC Abbildung 30: Produktion von IL-8 durch aktivierte und ruhende DCs. Nach Anzucht und Differenzierung am Tag 11 Zusatz von proinflammatorischen Cytokinen (aktivierte DCs), am Tag 13 RSV Infektion und am Tag 14 Messung von IL-8 im Überstand. 103 4.4 Produktion von IFN-γ, IL-4, IL-13 und IL-10 durch cokultivierte T-Zellen Es sollte der Effekt einer RSV-Infektion und einer Voraktivierung der dendritischen Zellen mit proinflammatorischen Cytokinen auf die Cytokinproduktion cokultivierter T-Zellen untersucht werden. Zur Vorbereitung wurden aus Nabelschnurblut Stammzellen isoliert und wie in den vorangegangenen Experimenten weiter zu dendritischen Zellen ausdifferenziert. In Vorexperimenten hatte es sich gezeigt, dass proliferierende Stammzellen nach 7 Tagen Kultur mit GM-SCF, TNF-α und SCF ohne Verluste aliquotiert und bei -196°C eingeforen werden können. Auch die lymphozytenreiche CD34- Fraktion der Nabelschnurblutzellen wurde bis kurz vor Beginn der Cokultur in flüssigem Stickstoff (-196°C) gelagert. Ein Aliquot der dendritischen Zellen wurde 7 Tage jeweils vor Beginn der Cokultur und vor den Restimulationen aufgetaut und vorbereitet. Die Vorbereitung bestand jeweils in einer Ausdifferenzierungsphase in GM-CSF, TNF-α und IL-4 für 4 Tage für alle dendritischen Zellen und einer Aktivierungs- und Infektionsphase für 3 Tage, in der die vier zu untersuchenden Populationen dendritischer Zellen jeweils unterschiedlich behandelt wurden: ruhend/nicht infiziert; ruhend/infiziert; aktiviert/nicht infiziert; aktiviert/infiziert. Die T-Zell-reiche Fraktion wurde kurz vor Beginn der Cokultur aufgetaut und es wurden die naiven T-Zellen isoliert. Sie wurden dann mit den 4 unterschiedlich aktivierten und infizierten Populationen dendritischer Zellen und dem Superantigen TSST-1 cokultiviert. Am Tag 7 und 14 wurden jeweils neu präparierte dendritische Zellen und TSST-1 zur Restimulation in die vorhandenen Kulturansätze gegeben. Messungen der intrazellulären T-Zellcytokine wurden während der Primärreaktion (Tag 3, 5 und 7 der Cokultur) sowie der Sekundärreaktion nach Restimulation (Tag 14 und 21) vorgenommen (Abbildung 19). Angegeben wird jeweils der prozentuale Anteil cytokinproduzierender Zellen an den Vβ2 tragenden T-Zellen. Es wurden jeweils 6 Ansätze gemessen. Im Folgenden werden die Ergebnisse und die entscheidenden Unterschiede der Reaktionen dargestellt. 104 4.4.1 IFN-γ-Produktion durch T-Zellen Die ruhenden nicht infizierten DCs induzieren am 3. Tag nach T-Zell-Kontakt ein erstes Maximum der IFN-γ Produktion bei 44 %. Danach kommt es dann zu einem Abfall am 5. Tag auf etwa 26 %. Anschließend steigt die produzierte Menge wieder langsam bis Tag 14 (37 %) an, um anschließend weiter, bis zu einem weiteren Maximalwert von ca. 67 % an Tag 21, anzusteigen. Werden die ruhenden dendritischen Zellen mit RSV infiziert, so zeigt die induzierte IFN-γ einen gleichmäßigeren, zunächst langsameren Anstieg. Es fehlt die vorher beschriebene Spitze am 3. Tag. Am 3. Tag zeigt sich damit ein hochsignifikanter Unterschied zu den nicht infizierten Kulturen. Im weiteren Verlauf findet sich ein gleichmäßiger Anstieg. Nach 21 Tagen findet man eine etwas höhere Produktion von ca. 71 %. Die aktivierten dendritischen Zellen zeigen sowohl in den infizierten als auch auch bei den nicht infizierten Kulturen eine, im Vergleich zu den Kulturen mit ruhenden dendritischen Zellen, hochsignifikant geringere Produktion von IFN-γ. Anteil Interferon-γ produzierender Zellen [%] 80 70 60 50 40 ruhende DC Aktivierte DC ruhende DC + RSV Aktivierte DC + RSV 30 20 10 0 0 3 5 7 14 21 Tage Abbildung 31: IFN-γ-Produktion durch cokultivierte T-Zellen. Naive T-Zellen wurden mit verschieden vorbehandelten DCs und TSST-1 cokultiviert und am 7. und am 14. Tag mit gleich vorbehandelten DCs restimuliert. Am Tag 3, 5, 7, 14, 21 erfolgte die intracelluläre Cytokinmessung in den Vβ2 tragenden T-Zellen. Es wurden 6 Experimente durchgeführt. Mittelwert +/- SE. 105 Tabelle 10: IFN-γ -Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik* Tag der Messung der IFN-γ Produktion ruhende DCs vs. ruhende DCs + RSV aktivierte DCs v.s. aktivierte DCs + RSV ruhende DCs v.s. aktivierte DCs ruhende DCs + RSV v.s. aktivierte DCs + RSV 3 5 7 14 21 *** ns ns * ns ns ns ns ns ns *** *** ns ** *** *** * *** *** *** *Ergebnisse der Kulturen mit ruhenden bzw. aktivierten DCs mit und ohne RSV-Infektion wurden für jeden Zeitpunkt miteinander verglichen. ns nichtsignifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 4.4.2 Die IL-4-Produktion durch T-Zellen Unterschiede in der Interleukin 4 Produktion zeigen sich in der Spätphase der Primärreaktion am Tag 7 sowie in der Sekundärreaktion und hier am deutlichsten am Tag 21. Die aktivierten dendritischen Zellen induzieren die niedrigste Rate an IL-4 produzierenden Zellen. Im Vergleich dazu induzieren ruhende dendritische Zellen und RSV infizierte dendritische Zellen deutlich mehr IL-4 produzierende Zellen, ohne dass es allerdings zu einem additiven Effekt von Infektion und Cytokinaktivierung kommt. 106 Anteil IL-4 produzierender Vβ2 tragender T-Zellen [%] 25 20 15 10 ruhende DC Aktivierte DC ruhende DC + RSV Aktivierte DC + RSV 5 0 0 3 5 7 14 21 Tage Abbildung 32: IL-4-Produktion durch cokultivierte T-Zellen. Naive T-Zellen wurden mit verschieden vorbehandelten DCs und TSST-1 cokultiviert und am 7. und am 14. Tag mit gleich vorbehandelten DCs restimuliert. Am Tag 3, 5, 7, 14, 21 erfolgte die intracelluläre Cytokinmessung in den Vβ2 tragenden T-Zellen. Es wurden 6 Experimente durchgeführt. Mittelwert +/- SE. Tabelle 11: IL-4 -Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik* Tag der Messung der IL-4 Produktion ruhende DCs vs. ruhende DCs + RSV aktivierte DCs vs. aktivierte DCs + RSV ruhende DCs vs. aktivierte DCs ruhende DCs + RSV vs. aktivierte DCs + RSV 3 5 7 14 21 ns ns ns ns ** ns ns ns ** ns ns ns ns * *** ns ns *** ns ns *Ergebnisse der Kulturen mit ruhenden bzw. aktivierten DCs mit und ohne RSV-Infektion wurden für jeden Zeitpunkt miteinander verglichen. ns nichtsignifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 107 4.4.3 Die IL-13-Produktion durch T-Zellen Die Interleukin-13 Produktion in den Kulturen ist am geringsten, in denen ruhende dendritische Zellen eingesetzt wurden. Sowohl die Aktivierung als auch die RSV Infektion führen zu einer signifikanten Steigerung der Interleukin-13 produzierenden T-Zellen, die signifikant in der Spätphase der Primärreaktion (Tag Anteil IL-13 produzierender Vb2 tragender T-Zellen [%] 7) und in der Spätphase der Sekundärreaktion (Tag 21) nachweisbar ist. ruhende A k tivie r te ruhende A k tivie r te 25 DC DC D C + RS V D C + RS V 20 15 10 5 0 0 3 5 7 14 21 T age Abbildung 33: IL-13-Produktion durch cokultivierte T-Zellen. Naive T-Zellen wurden mit verschieden vorbehandelten DCs und TSST-1 cokultiviert und am 7. und am 14. Tag mit gleich vorbehandelten DCs restimuliert. Am Tag 3, 5, 7, 14, 21 erfolgte die intracelluläre Cytokinmessung in den Vβ2 tragenden T-Zellen. Es wurden 6 Experimente durchgeführt. Mittelwert +/- SE. Tabelle 12: IL-13-Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik* Tag der Messung der IL-13 Produktion ruhende DCs vs. ruhende DCs + RSV aktivierte DCs v.s. aktivierte DCs + RSV ruhende DCs v.s. aktivierte DCs ruhende DCs + RSV v.s. aktivierte DCs + RSV 3 5 7 14 21 ns ns *** ns *** ns ns * ns ns ns ns * ns ns ns ns *** ns ns *Ergebnisse der Kulturen mit ruhenden bzw. aktivierten DCs mit und ohne RSV-Infektion wurden für jeden Zeitpunkt miteinander verglichen. ns nichtsignifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 108 4.4.4 Die IL-10-Produktion durch T-Zellen Auch die Interleukin-10 Produktion ist in Kulturen mit RSV infizierten dendritischen Zellen in der Spätphase der Sekundärreaktion signifikant gesteigert. Die alleinige Aktivierung mit dem Cytokincocktail führt aber eher zu einer Abnahme des Anteils Anteil IL-10 produzierender Vβ2 tragender T-Zellen [%] IL-10 produzierender T-Zellen. 12 10 8 6 4 2 0 Abbildung 34: ruhende D C Aktivierte D C ruhende D C + RSV Aktivierte D C + RSV 0 3 5 7 14 21 IL-10-Produktion durch cokultivierte T-Zellen. Naive T-Zellen wurden mit verschieden vorbehandelten DCs und TSST-1 cokultiviert und am 7. und am 14. Tag mit gleich vorbehandelten DCs restimuliert. Am Tag 3, 5, 7, 14, 21 erfolgte die intracelluläre Cytokinmessung in den Vβ2 tragenden T-Zellen. Es wurden 6 Experimente durchgeführt. Mittelwert +/- SE. Tabelle 13: IL-10-Produktion durch T-Zellen in Cokultur, Statistik* Tag der Messung der IL-10 Produktion ruhende DCs vs. ruhende DCs + RSV aktivierte DCs v.s. aktivierte DCs + RSV ruhende DCs v.s. aktivierte DCs ruhende DCs + RSV v.s. aktivierte DCs + RSV 3 5 7 14 21 ns ns ns ns *** ns ns ns ns *** ns ns ns ns * ns ns ns ns ns *Ergebnisse der Kulturen mit ruhenden bzw. aktivierten DCs mit und ohne RSV-Infektion wurden für jeden Zeitpunkt miteinander verglichen. ns nichtsignifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 109 5 Diskussion Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von dendritischen Zellen bei RSVInfektionen weiter aufzuklären. Aus Vorarbeiten ist bereits bekannt, dass dendritische Zellen mit RSV infiziert werden können und dass dadurch ihre Funktion beeinflusst wird. RSV infizierte dendritische Zellen induzieren weniger IFN- γ produzierende T-Zellen als nicht infizierte dendritische Zellen. Außerdem ist bekannt, dass das Ausmaß der Infektion vom Typ der dendritischen Zellen abhängt. Langerhans-Zellen setzen deutlich weniger Viren frei als ruhende dendritische Zellen (Horstkemper, 2010). Bei Kindern im 1. Lebensjahr kann eine RSV-Infektion einen schweren Verlauf nehmen. In diesem Alter weist die Atemwegsschleimhaut keine ruhenden gewebsständigen dendritischen Zellen auf. Lediglich bei Infekten wandern inflammatorische dendritische Zellen in das Atemwegsepithel ein (Tschernig et al., 2001). Es stellte sich deshalb die Frage, ob es funktionelle Unterschiede zwischen ruhenden dendritischen Zellen und inflammatorischen, durch Cytokine aktivierten dendritischen Zellen gibt. In vitro konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, - dass aktivierte dendritische Zellen mehr infektiöse RSV-Partikel freisetzen als ruhende dendritische Zellen - dass eine RSV-Infektion zu keiner weiteren Expression von Aktivierungsmarkern auf aktivierten dendritischen Zellen führt, wohl aber zu einer Zunahme der Expression des für die Aufnahme für RSV spezifischen Rezeptors TLR-4 - dass RSV infizierte aktivierte dendritische Zellen in cokultivierten T-Zellen in der primären Immunantwort eine verminderte IFN-γ-Produktion und eine gesteigerte IL-10 Produktion in der sekundären Antwort induzieren und - dass RSV die IL-6, nicht aber die IL-8 Produktion, von cytokinaktivierten dendritischen Zellen steigert. Diese in vitro Befunde geben zwar kein vollständiges Bild der in vivo ablaufenden Prozesse, bilden aber eine Grundlage für Überlegungen zur möglichen Rolle von dendritischen Zellen in der Immunantwort des Säuglings gegen RSV. 110 5.1 Cytokinaktivierte dendritische Zellen setzen im Vergleich zu ruhenden dendritischen Zellen mehr infektiöse RSVPartikel frei Neben der erhöhten Freisetzung von RSV-Partikeln zeigen cytokinaktivierte dendritische Zellen auch eine erhöhte Kopienzahl an RSV-RNA. Diese Befunde könnten durch eine erhöhte Infektionsrate oder durch eine erhöhte Replikation innerhalb der cytokinaktivierten dendritischen Zellen bedingt sein. Interessanterweise exprimieren cytokinaktivierte dendritische Zellen, die mit RSV infiziert wurden, vermehrt TLR-4 auf ihrer Oberfläche. TLR-4 ist ein bekannter Rezeptor für RSV (Kurt-Jones et al., 2000). Es ist deshalb nicht auszuschließen, dass es sich bei der RSV-Infektion von cytokinaktivierten dendritischen Zellen um einen sich selbst verstärkenden Effekt handelt, bei dem bereits infizierte Zellen über die verstärkte Expression des RSV-Rezeptors zusätzlich weitere Viren aufnehmen könnten. Auf aktivierten dendritischen Zellen sind von anderen Arbeitsgruppen zusätzlich auch andere Rezeptoren für das RSV wie CD209 (Johnson et al., 2004) oder CX3CR (Choi et al., 2012) beschrieben worden, die die erleichterte Aufnahme des Virus durch diese Zellen ebenfalls unterstützen könnten (Geijtenbeek et al., 2000; Piqueras et al., 2006). Für die Rolle von TLR-4 in der Pathophysiologie von schweren RSV-Infektionen sprechen zusätzlich eine Reihe von genetischen Untersuchungen. Diese konnten zeigen, dass ein schwerer Verlauf einer RSV-Infektion mit bestimmten Polymorphismen des TLR-4 Gens assoziiert ist (Gagro et al., 2004; Ramet et al., 2010; Tal et al., 2004). Neben der erhöhten Aufnahme von Viren könnte auch eine gesteigerte Replikation für die hohe Konzentration von infektiösen RSV-Partikeln im Überstand aktivierter dendritischen Zellen verantwortlich sein. Auch Zellen der Monozyten Linie U937 geben im aktivierten Zustand deutlich mehr RSV-Partikel ab. Kürzlich konnten Zhao et al. hierfür einen möglichen Mechanismus beschreiben. In aktivierten U937 Zellen kommt es zu einer Expression von hemmenden SOCS Proteinen, die sich auch hemmend auf antivirale Mechanismen auswirken könnten, so dass sich RSV in diesen Zellen verstärkt replizieren kann (Zhao et al., 2007). Diese Mechanismen könnten auch in aktivierten dendritischen Zellen eine Rolle spielen. 111 Die erhöhte Infektionsrate und Replikation von RSV in aktivierten dendritischen Zellen könnten in der Pathophysiologie der RSV-Infektion im Säuglingsalters eine entscheidende Rolle spielen. Die Hauptrolle der Replikation spielt aber sicherlich das Bronchialepithel. Dies konnten Villenave et al. kürzlich noch einmal eindrücklich an ex vivo Kulturen von kindlichem Bronchialepithel demonstrieren. Allerdings konnten sie auch zeigen, dass das Epithel die Viren apikal in das Bronchiallumen hinein sezerniert. Eine Abgabe der Viren am basalen Pol der Zellen und somit zur Körper zugewandten Seite, konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (Villenave et al., 2012). Gerade die schwere Form der Säuglings-Bronchiolitis zeichnet sich jedoch durch eine nicht lokalisierte, sondern durch eine systemische, den gesamten Körper beeinträchtigende Infektion aus. Interessanterweise mehren sich Hinweise, dass im Blut infizierter Säuglinge RSVirusmaterial nachgewiesen werden kann (Rohwedder et al., 1998). Einer japanischen Arbeitsgruppe gelang es nachzuweisen, dass RSV im peripheren Blut infizierter Kinder an mononukleäre Zellen gebunden ist (Yui et al., 2003). Aufgrund der guten Infizierbarkeit aktivierter dendritischer Zellen, die den Hauptteil dendritischer Zellen in den frühkindlichen Atemwegen ausmachen (Tschernig et al., 2006), und des Wanderungsverhaltens dieser Zellen erscheint es deshalb als durchaus möglich, dass bronchial infizierte dendritische Zellen in das Körperinnere wandern und über die Blutbahn Virusmaterial verteilen. Statt einer lokal begrenzten Infektion wie bei Erwachsenen, könnte es so zu der bei Säuglingen auftretenden schweren systemischen Infektion kommen. Da Epithelzellen kurzlebig sind und sich regelmäßig erneuern, stellt sich darüber hinaus die Frage, welche Zellen die Persistenz von RS-Viren ermöglichen. Auch hier könnten dendritische Zellen eine Rolle spielen. So konnte in Langzeitkulturen gezeigt werden, dass RSV in dendritischen Zellen über mehrere Monate persistiert und bei entzündlichen Reizen, wie einer Erhöhung der Konzentration von exogenem Stickoxid, freigesetzt werden kann (Hobson and Everard, 2008). Ähnlich könnte auch eine Reaktivierung von dendritischen Zellen durch Cytokine zu einer verstärkten Freisetzung von RS-Virusmaterial beitragen. Kürzlich konnte RSV, neben anderen Atemwegs-Viren, in hypertrophierten Adenoiden nachgewiesen werden, die somit ein Reservoir für Atemwegs-Viren darstellen. Tonsillen sind reich an dendritischen Zellen (Proenca-Modena et al., 2012). Im Hinblick auf die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist es denkbar, dass die dendritischen Zellen der Adenoide RS-Viren beherbergen. 112 Jahreszeitlich bedingt kommt es immer wieder zu Coinfektionen von RSV mit anderen Atemwegsviren (Franz et al., 2010). Im Rahmen einer solchen Coinfektion könnte es dann zu einer Reaktivierung und einer erneuten Ausscheidung von RS-Viren kommen. Das betreffende Kind gäbe dann mit seinen Sekreten RS-Viren an andere Kinder weiter. Diese Vermutungen sind jedoch zum jetzigen Zeitpunkt hochspekulativ, würden aber eine genaue Analyse der Lokalisation von Virusmaterial in Tonsillen, im Rahmen zukünftiger Forschungsprojekte rechtfertigen. 5.2 Eine RSV-Infektion führt zu keiner weiteren Expression von Aktivierungsmarkern auf aktivierten dendritischen Zellen Cytokinaktivierte dendritische Zellen unterscheiden sich von ruhenden dendritischen Zellen nicht nur durch eine Freisetzung von infektiösen RSVPartikeln, sondern in grundlegenden funktionellen immunologischen Parametern. Zur Charakterisierung der cytokinaktivierten dendritischen Zellen wurden Oberflächenmarker gemessen. Dabei zeigte sich, dass die Cytokine zu einer deutlichen Steigerung der Expression von CD208 und CD86 führen. CD208 (DC-Lamp) ist ein lysosomales Glykoprotein, das in der lysosomalen Membran exprimiert wird (Saint-Vis et al., 1998b). Es wird angenommen, dass das hochglykolisierte CD208 die lysosomale Membran vor der Degradierung durch die aggressiven lysosomalen Enzyme geschützt. Es ist bekannt, dass insbesondere in der terminalen Reifung, die Expression von CD208 in dendritischen Zellen ansteigt, so dass die Expression von CD208 als Reifemarker gesehen werden muss (Bartz et al., 2003a). Auch die Expression von CD86, einem costimulierenden Molekül auf der Oberfläche dendritischer Zellen, war auf den cytokinaktivierten dendritischen Zellen signifikant erhöht (Linsley et al., 1994). Dagegen fand sich auch nach Stimulationen mit proinflammatorischen Cytokinen kein signifikanter Anstieg der Reifungsmarker HLA-DR (Antigenpräsentation (Pinet et al., 1995)), CD83 (Costimulation von T-Zellen (Prechtel and Steinkasserer, 2007)) und CCR6 (Chemokinrezeptor (Cook et al., 2000a)). Damit unterscheidet sich die Akktivierung durch den Cytokincocktail von der Aktivierung durch andere Stimuli , wie z.B. der synthetischen Doppelstrang-RNA 113 Poly-IC, die in vergleichbaren Experimenten zur vermehrten Expression aller Aktivierungsmarker führt (Rothoeft et al., 2007). Durch den Cytokincocktail werden die dendritischen Zellen also nur partiell aktiviert. Dabei spielt offensichtlich das im Cocktail enthaltene Prostaglandin E2 eine Rolle. Jüngere Arbeiten haben gezeigt, dass myeloide dendritische Zellen unter dem Einfluss von Prostaglandin E die Immunantwort eher supprimieren als steigern (Kalinski, 2012). Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen, die mit RSV infiziert wurden, selbst Prostaglandin E produzieren (Bartz et al., 2002). Eine Infektion mit RSV führt ebenfalls zu keiner vollständigen Aktivierung von dendritischen Zellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen hier mit den Vorbefunden im Einklang (Bartz et al., 2002; Rothoeft et al., 2007). Bemerkenswerterweise zeigten RSV-Infektion und die Stimulation mit dem Prostaglandin E haltigen Cytokincocktail keinen additiven Effekt. Die cytokinaktivierten dendritischen Zellen bleiben auch nach RSV Infektion nur partiell aktiviert, so dass keine zusätzlichen Reifungsmarker nach RSV-Infektion durch die cytokinaktivierten DCs exprimiert werden. Die eingeschränkte Funktion der antigenpräsentierenden Zellen ist auch bei klinisch manifesten RSVInfektionen nachweisbar. So hat eine kürzliche genomweite Expressionsanalyse im Blut RSV infizierter Patienten gezeigt, dass Gene für die Antigenpräsentation, wie sie auch in dendritischen Zellen exprimiert sind, insgesamt deutlich supprimiert werden (Bucasas et al., 2012). 5.3 RSV infizierte aktivierte dendritische Zellen induzieren in cokultivierten T-Zellen in der primären Immunantwort eine verminderte Interferon-γ Produktion und eine gesteigerte IL-10 Produktion in der sekundären Antwort Die partielle Aktivierung der dendritischen Zellen interferiert mit ihrer Fähigkeit, TZellen zu aktivieren. In der vorliegenden Arbeit wurden Cokulturen zwischen naiven T-Zellen und unterschiedlich vorbehandelten dendritischen Zellen angelegt. Ein Antigenreiz wurde durch das Superantigen TSST simuliert. Die Cytokinproduktion der durch TSST stimulierten Vβ2 tragenden T-Zellen wurde über 3 Wochen verfolgt. 114 Dabei zeigt sich in Abhängigkeit vom zeitlichen Verlauf und vom untersuchten Cytokin ein differenziertes Bild. Die Fähigkeit der dendritischen Zellen, weiterhin TZellen zu stimulieren, ist sowohl bei aktivierten als auch bei RSV-infizierten dendritischen Zellen vorhanden. Es verschiebt sich aber das Muster der durch die T-Zellen ausgeschütteten Cytokine. In der Cokultur von T-Zellen mit ruhenden DCs wird die IFN -γ-Produktion durch eine RSV-Infektion in den ersten Tagen, also in der primären Reaktion, deutlich unterdrückt. Dieses entspricht mehrfach vorbeschriebenen Befunden (Bartz et al., 2003b; Rothoeft et al., 2007; Schauer et al., 2004). Schon die nicht infizierten, aber cytokinaktivierten dendritischen Zellen, induzieren im Vergleich zu den ruhenden dendritischen Zellen deutlich weniger IFN-γ. Auch dieser Effekt ist in der Literatur bereits seit langem bekannt (Kalinski et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die durch die cytokinaktivierten DCs induzierte reduzierte IFN-γ-Produktion, auch unter Einfluss von RSV niedrig bleibt. Es ist gut nachvollziehbar, dass die Reduktion des antiviral wirkenden IFN-γ permissiv für die Ausbreitung einer RSV-Infektion ist (Goodbourn et al., 2000). Die Menge des produzierten IFN-γ wurde schon mehrfach mit der Schwere der RSVErkrankung in Verbindung gebracht. So konnten Schauer et al. nachweisen, dass bei Kindern mit schwerer RSV-Infektion, in vitro unter Einfluß von RSV wenig IFN-γ gebildet wird (Schauer et al., 2004). Daher ist anzunehmen, dass bei vorhandenem Entzündungsmilieu nicht ausreichend IFN-γ produziert werden kann, um eine suffiziente Viruselimination herbeizuführen. Zusätzlich findet sich in vergleichbaren Tierexperimenten (Boelen et al., 2002) (Gonzalez et al., 2008) und klinischen Studien (Kristjansson et al., 2005) neben einer Verminderung der Interferon-γ Produktion eine erhöhte Produktion von TH-2 Cytokinen IL-4 und IL-13. In der vorliegenden Arbeit zeigt die Induktion der TH-2 Cytokine kein einheitliches Bild. Während in der Memory-Antwort die IL-13Produktion gesteigert wird, ist jedoch durch RSV die IL-4-Produktion eher gehemmt. Es ist wahrscheinlich, dass die beschriebenen Unterschiede auf eine noch nicht vollständige Polarisierung der T-Gedächtniszellen zurückzuführen sind (Rothoeft et al., 2007). 115 Dagegen ist die Bildung von IL-10 unter Einfluss von RSV in der Spätreaktion sowohl bei den ruhenden, als auch bei den aktivierten DCs, gesteigert. Das Fehlen dieses, auf RSV eher suppressiv wirkende Cytokin, könnte zusätzlich zu einer weiteren Ausbreitung der Virusinfektion beitragen (Loebbermann et al., 2012). IL-10 wirkt regulatorisch und antiinflammatorisch. Es hemmt ablaufende Entzündungreaktionen. So konnten Stampfli et al. in Tierexperimenten nachweisen, dass es nach Gen-Transfer von IL-10 in vorher allergisch sensibilisierten Mäusen, zu einem Rückgang der Entzündungsreaktion mit einer verminderten Anzahl an mononukleären Zellen, Neutrophilen und Eosinophilen in der bronchoalveolären Lavage kam (Stampfli et al., 1999). Sowohl Loebbermann als auch Stampfli brachten im Tierexperiment hohe IL-10 Spiegel mit einem milderen Verlauf der RSV-Infektion in Verbindung. Welche Rolle eine gegebenenfalls gesteigerte IL-10 Produktion bei Patienten mit schweren RSV Infektionen hat, muss in weiteren Studien geklärt werden. 5.4 RSV steigert die IL-6, nicht aber die IL-8 Produktion von cytokinaktivierten dendritischen Zellen. Neben der Fähigkeit, die Cytokinproduktion in T-Zellen zu induzieren, produzieren dendritische Zellen auch selbst Cytokine. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb der Einfluss von RSV auf die IL-6 und die IL-8 Produktion untersucht. Die Menge des ausgeschütteten IL-6 ist nach Infektion mit RSV bei den aktivierten DCs deutlich höher als bei den ruhenden Zellen. IL-6 ist neben IL-1β als endogenes Pyrogen bekannt. Das am Ort der Entzündung entstehende IL-6 induziert dabei Prostaglandin E, welches dann zentral fieberauslösend wirkt (Kozak et al., 1998). Bereits in Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass IL-6 nach einer RSV-Infektion von antigenpräsentierenden Zellen ausgeschüttet wird (Bartz et al., 2002). In der vorliegenden Arbeit zeigte sich nun, dass diese Produktion bei den cytokinaktivierten DCs noch zusätzlich gesteigert ist. Auch dieser Befund deutet darauf hin, dass bei Vorhandensein cytokinaktivierter DCs der klinische Verlauf einer RSV-Infektion, auch im Hinblick systemischer Symptome, schwerer verlaufen kann, als unter dem Einfluss ruhender DCs. 116 Auch konnten Gil et al. im Nasensekret von RSV-Infizierten erhöhte Werte von IL-6 nachweisen (Gill et al., 2005). Des Weiteren konnten Pino et al. nachweisen, dass sich bei Kindern ein Jahr nach einer schweren RSV-Infektion weiterhin eine nasale Hypersekretion von IL-6 zeigte (Pino et al., 2009). Die untersuchten Zellen setzten zwar IL-8 frei, allerdings zeigte sich hier keine Steigerung bei den cytokinaktivierten dendritischen Zellen. Darüber hinaus ist aus der Literatur bekannt, dass im Rahmen einer RSV Infektion das Epithel eine Quelle für IL-8 darstellt. IL-8 wirkt als chemotaktischer Faktor, vor allen Dingen für Neutrophile (Baggiolini et al., 1994). Ein weiterer Aspekt des IL-8 besteht in seinem Zusammenhang mit der Schwere der Erkrankung. So konnten Hemalatha et al. nachweisen, dass sich bei einer frischen RSV-Infektion bis zum 5. Tag erhöhte IL-8 und IL-2 Werte im Nasopharyngeal-Sekret nachweisen lassen (Hemalatha et al., 2010). Smyth et al. konnten sogar nachweisen, dass die Menge des ausgeschütteten IL-8 mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung zu bringen ist (Smyth et al., 2002). Ein Einfluss von IL-6 oder IL-8 auf die intrazelluläre RSV-Replikation in Makrophagen konnte durch Cirino et al. ausgeschlossen werden (Cirino et al., 1993). 117 5.5 Zusammenfassung Innerhalb des ersten Lebensjahres sind keine DCs fest in der Lunge vorhanden. Erst nach dem ersten Lebensjahr lassen sich DCs als Langerhans-DCs in der Lunge nachweisen (Tschernig et al., 2001). Während des ersten Lebensjahres wandern die an der Abwehr beteiligten DCs als inflammatorische DCs aus dem Blut ein. Da die RSV Infektion im ersten Lebensjahr besonders schwer verlaufen kann, ist die Interaktion von inflammatorischen dendritischen Zellen mit RS-Viren von besonderem Interesse. Als Modell für die inflammatorischen dendritischen Zellen wurden in der vorliegenden Arbeit cytokinaktivierte dendritische Zellen angezüchtet und mit ruhenden dendritischen Zellen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass aktivierte dendritische Zellen mehr infektiöse RSV-Partikel freisetzen als ruhende dendritische Zellen. Da das Atemwegepithel RSV in das bronchiale Lumen freisetzt, sich dendritische Zellen aber über die Lymph- und Blutbahn im Körper ausbreiten können, könnte die verstärkte Infizierbarkeit und Replikation der cytokinaktivierten dendritischen Zellen zu einem schweren Verlauf mit systemischen Komplikationen beitragen, wie er im ersten Lebensjahr vorkommen kann. Weiterhin konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine RSVInfektion zu keiner weiteren Expression von Aktivierungsmarkern auf aktivierten dendritischen Zellen führt und in cokultivierten T-Zellen in der primären Immunantwort eine verminderte IFN-γ Produktion und eine gesteigert IL-10 Produktion in der sekundären Antwort induziert. RSV könnte so eine effektive antivirale Immunantwort hemmen. Darüber hinaus induziert RSV eine gesteigerte IL-6 Produktion in cytokinaktivierten dendritischen Zellen. IL-6 als endogenes Pyrogen könnte so zur Entwicklung von Fieber, wie es für RSV-Bronchiolitiden im Säuglingsalter typisch ist, beitragen. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass inflammatorische dendritische Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer schweren RSV-Infektion im Säuglingsalter spielen könnten. 118 6 Literaturverzeichnis Akbari,O., DeKruyff,R.H., and Umetsu,D.T. (2001). Pulmonary dendritic cells producing IL-10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen. Nat. Immunol. 2, 725-731 Akbari,O., Freeman,G.J., Meyer,E.H., Greenfield,E.A., Chang,T.T., Sharpe,A.H., Berry,G., DeKruyff,R.H., and Umetsu,D.T. (2002). Antigen-specific regulatory T cells develop via the ICOS-ICOS-ligand pathway and inhibit allergen-induced airway hyperreactivity. Nat. Med. 8, 1024-1032 Akbari,O., Stock,P., Meyer,E., Kronenberg,M., Sidobre,S., Nakayama,T., Taniguchi,M., Grusby,M.J., DeKruyff,R.H., and Umetsu,D.T. (2003). 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Auch meinem Freund gilt ein besonderer Dank für seine Geduld, seine stete Ermutigung und die seelische Unterstützung. Lebenslauf Persönliche Daten Name Andrea Wülfrath, Geburtsdatum 21.03.1980 Geburtsort Wuppertal Nationalität Deutsch Familienstand ledig Allgemeine Ausbildung 1987-1991 Grundschule Haselrain in Wuppertal 1991-2000 Carl-Duisberg-Gymnasium in Wuppertal Medizinischer Werdegang 2000-2003 Ausbildung zur Kinderkrankenschwester im Helios Klinikum Wuppertal 2003-2009 Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum im Modellstudiengang Seit 2010 Weiterbildung zum Facharzt Pädiatrie im Helios Klinikum Wuppertal
