Universitätsklinikum Ulm, Klinik für Anästhesiologie Prof. Dr. med. Dr
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Universitätsklinikum Ulm, Klinik für Anästhesiologie Prof. Dr. med. Dr. med. h. c. Michael Georgieff Sektion Experimentelle Anästhesiologie Leiter: Prof. Dr. rer. nat. E. Marion Schneider Regulation der Apoptose in-vivo aktivierter, kultivierter antigenpräsentierender Zellen durch natürliche Killerzellen und den purinergen P2X7-Rezeptor Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Sarah Mathilde Dagenbach aus Stuttgart 2014 Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer nat. Thomas Wirth Erster Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. E. Marion Schneider Zweiter Berichterstatter: PD Dr. med. Ramin Lotfi Tag der Promotion: 21.05.2015 Meinen Eltern I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis........................................................................ I Abkürzungsverzeichnis .............................................................. III 1. Einleitung ......................................................................... 1 1.1 Zellen des Immunsystems ................................................. 1 1.1.1 Antigenpräsentierende Zellen (APC) .......................... 1 1.1.2 NK-Zellen ................................................................. 2 1.2 P2X-Rezeptoren ................................................................. 8 1.2.1 Der P2X7-Rezeptor ................................................... 8 1.2.2 ATP ........................................................................ 11 1.3 Patienten ......................................................................... 12 1.4 Ziel der Arbeit.................................................................. 13 2. Material und Methoden ................................................... 14 2.1 Geräte, Software, Verbrauchsmaterialien ......................... 14 2.2 Chemikalien und Lösungen ............................................. 16 2.3 Ansätze für Medien und Lösungen ................................... 16 2.4 Antikörper ....................................................................... 17 2.5 Zelllinien ......................................................................... 19 2.6 Methoden ........................................................................ 19 2.6.1 Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) .................................................. 19 2.6.2 Zellkultivierung ...................................................... 20 2.6.3 Dokumentation der Interaktion von Effektor- und Zielzellen ................................................................ 21 2.6.4 Immunphänotypisierung ........................................ 23 2.6.5 Caspase-Assay ....................................................... 25 2.6.6 Cytotox-Glo-Assay .................................................. 27 2.6.7 Zytokinbestimmung ............................................... 27 2.6.8 Elektrophysiologie .................................................. 27 II 2.6.9 SNPs des P2RX7 .................................................... 28 2.6.10 Statistische Auswertung……………………………..….28 3. Ergebnisse ....................................................................... 29 3.1 Phänotyp kultivierter APC ............................................... 29 3.2 NK-Zellsubpopulation und Immunphänotyp kultivierter APC ............................................................... 30 3.3 Morphologie der Interaktion............................................. 32 3.3.1 Lichtmikroskopie ................................................... 32 3.3.2 Fluoreszenzmikroskopie ......................................... 34 3.3.3 Elektronenmikroskopie .......................................... 38 3.4 Zell-induzierte Apoptose .................................................. 39 3.4.1 Interaktion der NK-92 und K562 ............................ 42 3.4.2 Interaktion der NK-92 und der APC gesunder Spender .................................................. 45 3.4.3 Interaktion der NK-92 und Patienten-APC .............. 46 3.4.4 Interaktion IL-2 aktivierter Lymphozyten und APC gesunder Spender .................................................. 50 3.4.5 Interaktion IL-2 aktivierter Lymphozyten und Patienten-APC ........................................................ 54 3.5 Purinerge Rezeptorstimulation unreifer APC .................... 59 3.5.1 P2RX7-Genotyp kultivierter APC ............................ 59 3.5.2 ATP-induzierte Caspaseaktivität kultivierter APC .... 60 3.5.3 Elektrophysiologie kultivierter APC ........................ 65 4. Diskussion ...................................................................... 69 5. Zusammenfassung ........................................................... 85 6. Literaturverzeichnis ........................................................ 85 Anhang...................................................................................... IX Danksagung ............................................................................ XVI Lebenslauf .............................................................................. XVII III Abkürzungsverzeichnis Abb. . . . . . . . . . . Abbildung ADP . . . . . . . . . . Adenosindiphosphat AK . . . . . . . . . . . Antikörper AMP . . . . . . . . . . Adenosinmonophosphat Apaf-1 . . . . . . . . apoptotic protease activating factor 1 APC . . . . . . . . . . Antigenpräsentierende Zelle ATP . . . . . . . . . . Adenosintriphosphat BAD . . . . . . . . . . Bcl-2 antagonist of cell death BAX . . . . . . . . . . Bcl-2 associated X protein BCL-2 . . . . . . . . . B-Cell Lymphoma-2 BID . . . . . . . . . . BH3 Interacting Domain Death Agonist BSA . . . . . . . . . . bovine serum albumin bzw. . . . . . . . . . beziehungsweise CCR . . . . . . . . . . C-C chemokine receptor CD . . . . . . . . . . . cluster of differentiation CTL . . . . . . . . . . cytotoxic T lymphocyte CTLR . . . . . . . . . c-type lectin-like receptors d............ Tage Da . . . . . . . . . . . Dalton DC . . . . . . . . . . . dendritic cell (dendritische Zelle) DD . . . . . . . . . . . death domain ddNT . . . . . . . . . didesoxynucleotide DED . . . . . . . . . . death effector domain DISC . . . . . . . . . . death inducing signaling complex DNA . . . . . . . . . . Desoxyribonukleinsäure et al. . . . . . . . . . . und Mitarbeiter FACS . . . . . . . . . . fluorescence-activated cell sorting FADD . . . . . . . . . . fas-associating protein with death domain Fas . . . . . . . . . . . fibroblast associated surface antigen FcR . . . . . . . . . . . fragment crystallizable receptor FCS . . . . . . . . . . . fötales Kälberserum IV FITC . . . . . . . . . . Fluoreszein-Isothiocyanat FSC . . . . . . . . . . forward scatter g............. Gramm GZMB . . . . . . . . . . Granzym B h............. Stunde HLA . . . . . . . . . . . human leukozyte antigen HLA-II. . . . . . . . . . human leukozyte antigen-II HLA-DR. . . . . . . . . human leukozyte antigen-DR HLH . . . . . . . . . . . Hämophagozytische Lymphohistiozytose ICE . . . . . . . . . . . . IL-1 converting enzyme iDC . . . . . . . . . . . . immature dendritic cells IFN . . . . . . . . . . . . Interferon Ig . . . . . . . . . . . . . Immunglobulin IL . . . . . . . . . . . . . Interleukin ILT . . . . . . . . . . . . Ig-like transcript ILT2 . . . . . . . . . . . Ig-like transcript 2 iNKR . . . . . . . . . . inhibitory natural killer cell receptors KIR . . . . . . . . . . . . killercell immunoglobulin-like receptors LCH . . . . . . . . . . . Langerhans Zell Histiozytose LIR . . . . . . . . . . . . leucocyte immunoglobulin-like receptor LPS . . . . . . . . . . . . Lipopolysaccharide M............. Mol = mol/Liter M2 . . . . . . . . . . . . Th2-aktivierte Makrophagen MAS . . . . . . . . . . . Makrophagenaktivierungsyndrom mDC . . . . . . . . . . . mature myeolid dendritic cells MFI . . . . . . . . . . . mean fluorescence intensity MHC . . . . . . . . . . . major histocompatibility complex MIA . . . . . . . . . . . . multi-individual array min . . . . . . . . . . . . Minuten ml . . . . . . . . . . . . . Milliliter mut . . . . . . . . . . . . mutiert n.............. Stichprobengröße nA . . . . . . . . . . . . . Nanoampere V NaN3 . . . . . . . . . . . Natriumazid NCR . . . . . . . . . . . . natural cytotoxicity receptors NK . . . . . . . . . . . . . Natürliche Killerzelle NKG2A . . . . . . . . . . natural killer cell group 2A NKp . . . . . . . . . . . . natural killer cell p-related Protein NO . . . . . . . . . . . . . Stickstoffmonoxid P2RX7 . . . . . . . . . . Genlocus, der für den purinergen P2X7-Rezeptor …………………………… kodiert P2X7-Rezeptor . . . . purinerger-2X7-Rezeptor pF . . . . . . . . . . . . . Picofarad PBMC . . . . . . . . . . . Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes PBS . . . . . . . . . . . . phosphate buffer saline PCR . . . . . . . . . . . . polymerase chain reaction PE . . . . . . . . . . . . Phycoerythrin pH . . . . . . . . . . . . potentia Hydrogeni rpm . . . . . . . . . . . rotations per minute RT . . . . . . . . . . . . Raumtemperatur SBE . . . . . . . . . . . single base extension SI. . . . . . . . . . . . . Stimulationsindex SNP . . . . . . . . . . . single nucleotide polymorphism SSC . . . . . . . . . . . . sideward scatter STS . . . . . . . . . . . . Staurosporin Tab. . . . . . . . . . . . Tabelle tBid . . . . . . . . . . . truncated BH3 interacting domain death agonist TCR . . . . . . . . . . . T-Zell-Rezeptor Th1 . . . . . . . . . . . T helper cell type 1 Th2 . . . . . . . . . . . T helper cell type 2 TNF . . . . . . . . . . . Tumornekrosefaktor TNF-R . . . . . . . . . . Tumornekrosefaktor-Rezeptor TR1 . . . . . . . . . . . regulatory T cells class 1 TRADD. . . . . . . . . . TNFR-associated death domain TRAIL . . . . . . . . . . TNF related apoptosis inducing ligand TRAIL-R . . . . . . . . TNF related apoptosis inducing ligand receptor VI U............. unit (Enzymeinheit) UTP . . . . . . . . . . . Uridintriphosphat wt . . . . . . . . . . . . Wildtyp µl . . . . . . . . . . . . . Mikroliter 1 1. Einleitung 1.1 Zellen des Immunsystems 1.1.1 Antigenpräsentierende Zellen (APC) Zu den professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC) zählen BZellen, Makrophagen (MΦ) und dendritische Zellen (DC). Ihnen gemeinsam ist die Fähigkeit, Eigen- oder Fremdantigene aufzunehmen und diese über HLA-II-Moleküle den T-Lymphozyten zu präsentieren. Diese TCR-HLA-II-Kontakte von Lymphozyten und APC werden durch die kostimulatorische B7-Oberflächenmoleküle (z.B. CD80, CD86) stabilisiert. Die immunologische Funktion dendritischer Zellen variiert abhängig von deren Reifestatus. Die Hauptfunktion der unreifen DC (iDC) liegt vor allem in der Phagozytose von Antigenen im Gewebe oder in der Blutbahn. Dagegen sind reife DC (mDC) für die Antigenpräsentation und die Generierung einer adäquaten Immunantwort von elementarer Bedeutung (Sallusto et al. 1998, Saeki et al. 1999, Mellman u. Steinmann 2001). Die Reifung der DC erfolgt über Zytokine, welche beispielsweise nach Kontakt mit den T-Zellen sezerniert werden. So kann eine Reifungsinduktion über Rezeptoren für die Antigenerkennung, über Zytokinrezeptoren oder über das Reifungssignal CD40 durch aktivierte TZellen erfolgen (O'Sullivan u. Thomas 2003). Im Rahmen des Reifungsprozesses kommt es in den DC zur Minimierung von Phagozytoseassoziierten Genen, während ihre Fähigkeiten zur Antigenpräsentation und Migration zunehmen. Dies erfolgt unter anderem durch den Rezeptor CCR7, der es ihnen ermöglicht, in die Lymphknoten zu migrieren (Sallusto et al. 1998). Im unreifen Zustand sind die DC noch nicht in der Lage, lösliche Mediatoren und Zytokine zu produzieren und weisen eine geringe Expression von HLA-II (z.B. HLA-DR), CD1a, CD80 und CD86 auf (de Saint-Vis et al. 1998, Bryant u. Ploegh 2004). Demzufolge sind iDC - im Gegensatz zu mDC - nicht in der Lage eine adäquate Immunantwort über die T-Zellstimulation zu initiieren. Reife DC sind - verglichen mit 2 Makrophagen und B-Zellen - das wichtigste Element der spezifischen Immunität. Neben T-Zellen stimulieren auch NK-Zellen (natürliche Killerzellen) die Reifung der DC (Gerosa et al. 2002). Auf der einen Seite sezernieren die DC Zytokine wie IFN-α, IL-12, IL-15, oder IL-18, und unterstützen die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen (Walzer et al. 2005). Auf der anderen Seite können NK-Zellen durch die Sekretion von IFN-γ DC aktivieren. Auf Rezeptorebene erfolgt diese Interaktion wahrscheinlich über den NK-ZellRezeptor NKp30, CD40 sowie über CD80 (Wilson et al. 1999). Eine weitere Besonderheit der NK-DC-Zellinteraktion ist die Tatsache, dass NK-Zellen direkten Einfluss auf die DC-Populationsgröße haben. Dabei sind die unreifen DC, im Gegensatz zu reifen DC, sensitiver für die autologe NK-Lyse (Wilson et al. 1999). 1.1.2 NK-Zellen NK-Zellen sind - wie Granulozyten, Monozyten und DC – zelluläre Elemente des angeborenen Immunsystems und kontrollieren maligne und virusinfizierte Zellen (Cerwenka u. Lanier 2001). Ihre Namensgebung beruht auf ihrer Fähigkeit, ohne vorherige Sensibilisierung lysieren zu können (Lanier et al. 1986). NK-Zellen können auf unterschiedliche Weise Zielzellen eliminieren. Diese werden in 1.1.2.1 und 1.1.2.2 vorgestellt. 1.1.2.1 Granzym B-vermittelte Apoptose NK-Zellen und zytotoxische Lymphozyten (CTL) eliminieren virusinfizierte oder maligne Zellen über Granzym B (Sayers et al. 1998). Dieser Mechanismus ist in Abbildung 1 dargestellt. Granzym B liegt in den CTL in sauren Vesikeln vor. Dort ist Granzym B zusammen mit Perforin an Serglycin gebunden. Dieser Komplex wird im Rahmen eines exozytotischen Prozesses aus der Effektorzelle frei. Nach Aktivierung kann Granzym B direkt über Caspase-3 die Apoptosekaskade initiieren (Darmon et al. 1995, Adrain et al. 2005). Außerdem ist Granzym B in der Lage, über den Verlust der 3 mitochondrialen Integrität die Apoptosekaskade zu starten (Sutton et al. 2000, Waterhouse et al. 2004). Granzym B kann - genau wie der Todesrezeptor - den mitochondrialen Weg durch Spaltung von BID in aktives tBID (truncated Konformationsänderung BID) von initiieren. BAX und Durch die darauffolgende BAD in der äußeren Mitochondrienmembran und deren Permeabilisierung kommt es zur Freisetzung von Cytochrom c und im Anschluss daran zur Aktivierung der Caspasekaskade (Alimonti et al. 2001, Lieberman 2003, Waterhouse et al. 2005). Abb. 1: Granzym B interagiert in der Zielzelle entweder mit Procaspase-3 (1) oder mit BID (2). Bei einer Aktivierung von BID über tBID sowie der mitochondrialen Proteine BAD/BAX erfolgt die Permeabilisierung der Mitochondrienmembran. Es kommt zur Freisetzung von Cytochrom c. Cytochrom c bindet an APAF1. Zusammen mit Procaspase9 bilden sie das Apoptosom. Hierbei wird Procaspase-9 autokatalytisch aktiviert, das wiederum Caspase-3 prozessiert. Im Fall einer Aktivierung von Procaspase-3 wird die Apoptosekaskade direkt über die Spaltung von Caspase-3 eingeleitet. (Apaf1 = apoptotic protease activating factor 1; ATP = Adenosintriphosphat; BAD = Bcl-2 antagonist of cell death; BAX= Bcl-2 associated x protein; BID = BH3 interacting domain death agonist). Nach Lieberman 2003. 4 1.1.2.2 Rezeptorvermittelte Apoptose Im Rahmen des rezeptorvermittelter Weges - auch extrinsischer Weg genannt - wird der Stimulus zum Zelltod von extern initiiert (Abb. 2). Hierbei binden spezifische apoptoseinduzierende Liganden der NK-Zellen an den Todesrezeptor der Zielzelle. Dies führt durch eine Signalkaskade zur Aktivierung des Caspasekomplexes (Jin u. El-Diery 2005): Die transmembranären Todesrezeptoren TNF-RI, CD95, TRAIL-RI, TRAILRII gehören zur Gruppe der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren (TNF-R). Sie zeichnen sich durch eine homologe cysteinreiche extrazelluläre Domäne (Smith et al. 1994, Gruss u. Dower 1995) sowie durch eine zytoplasmatische Todesdomäne (death domain = DD) aus (Tartaglia et al. 1993, Nagata 1997). Der am besten beschriebene Rezeptor dieser Familie ist der FAS Rezeptor (CD95) (Itoh et al. 1991). Die Liganden der TNF-Familie, zu denen unter anderem TNF-α, CD95L und TRAIL zählen, sind homotrimere Proteine, die durch Bindung an die TNF-Rezeptoren diese aktivieren (Dhein et al. 1992, Banner et al. 1993, Wiley et al. 1995). Nach Ligandenbindung an den jeweiligen Rezeptor oligomerisieren die Rezeptoren und es kommt unter Rekrutierung spezifischer Adapterproteine zur Bildung des Todesrezeptorkomplexes DISC (death inducing signaling complex). Das Adapterprotein FADD (fas associating protein with dead domain) wird an den Rezeptorkomplex rekrutiert und vermittelt über die DED (death effector domain) die Bindung von Procaspase-8 (Boldin et al. 1996, Fernandes-Alnemri et al. 1996, Ashkenazi u. Dixit 1998). Daraufhin wird Procaspase-8 prozessiert und zu Caspase-8 aktiviert. 5 Abb. 2: Nach Binden des Liganden (TNF, CD95-Ligand, TRAIL) an den Todesrezeptor (TNF-Rezeptor-I, CD95, TRAIL-Rezeptor) kommt es unter Rekrutierung spezifischer Adapterproteine (TRADD, Todesrezeptorkomplexes FADD) DISC. und Daraufhin Procaspase-8 wird zur Procaspase-8 zur Bildung des aktiven Form prozessiert (Caspase-8). Caspase-8 aktiviert Procaspase-3 und in Folge wird die Effektorcaspase-3 induziert. FADD = Fas-associating protein with death domain; TRADD = TNFR-associated death domain). Nach Schütze et al. 2008. 1.1.2.3 Phänotyp der NK-Zellen NK-Zellen umfassen 5-15% der zirkulierenden Lymphozyten und exprimieren als phänotypisches Charakteristikum das Oberflächenprotein CD56. Anhand der CD56-Expression werden die NK-Zellen in zwei Subpopulationen eingeteilt. Die erste Subpopulation exprimiert CD56 nur schwach (circa 95% der NK-Zellen), ist allerdings positiv für den IgGRezeptor FcRIII (CD16). Diese NK-Subpopulation wird demnach als CD56dim/CD16+ bezeichnet. Sie weist eine hohe zytotoxische Aktivität auf, wohingegen die Sekretion von IFN-γ oder TNF-α vergleichsweise gering ist. 6 Die zweite NK-Subpopulation, die entsprechend viel CD56 und kein CD16 exprimiert (CD56bright/CD16-), sezerniert im Umkehrschluss tendenziell mehr IFN-γ oder TNF-α. Außerdem besitzt sie aufgrund einer geringen Anzahl zytotoxischer Granula eine entsprechend geringere Toxizität (Robertson et al. 1996, Cooper et al. 2001). Desweiteren konnte CD57 als Reifemarker CD56dim/CD16+ NK-Population identifiziert werden (Lopez et al 2010). Eine weitere Subgruppe stellen die Zytokin-induzierten Killerzellen dar. Sie sind positiv für CD3 und CD56 und haben eine hohe zytolytische Aktivität (Lu und Negrin 1994, Pievani et al 2011). Mittlerweile hat man weitere CD56+ Subpopulationen entdeckt, welche möglicherweise abhängig von ihrer Gewebe- und Organlokalisation unterschiedliche Aufgaben wahrnehmen (Jonges et al. 2001). Inhibitorische und aktivierende Rezeptoren gewährleisten die Regulation der NK-Zellen. Dabei führen positive und negative Signale über die entsprechenden Rezeptoren zu einer Inhibition oder Aktivierung der NKZellen (Lanier 2003). Diese Mechanismen sollen körpereigenes Gewebe vor NK-Zellangriffen schützen (Sivori et al. 1997, Pende et al. 1999). Durch die Rezeptoren sind NK-Zellen in der Lage gesunde von infizierten oder transfizierten Zellen inhibierenden und zu unterscheiden. aktivierenden Die Balance Zellkontaktsignalen zwischen sowie die Stimulation über Mediatoren bestimmen die Aktivität der NK-Zellen. Entscheidend für das grundlegende Verständnis der Regulation von NKZellen war die „Missing-self-Hypothese“ (Karre et al. 1986). Diese Hypothese basiert auf Erkennungsmechanismus der der Beobachtung, NK-Zelle dass Eigenschaften durch den körpereigener Zellen detektiert werden, die auf infizierten oder fremden Zellen nicht zu finden sind. Weitere Studien konnten zeigen, dass es sich bei den gesuchten Eigenschaften um HLA-I Moleküle handelt, welche auf malignen und durch Viren oder Bakterien infizierten Zellen schwächer exprimiert werden (D'Urso et al. 1991, De Lerma Barbaro et al. 2005). Die damals aufgestellte „Missing-self-Hypothese“ konnte nun durch neuere Erkenntnisse erweitert werden. So wurde beispielweise gezeigt, dass NKZellen auch unabhängig der HLA- I Expression Zellen lysieren (Chervenak 7 u. Wolcott 1988, Leiden et al. 1989). Diese Beobachtung wurde mittlerweile durch die neu aufgestellte "Induced-self-Hypothese“ gestützt. Hier wurde gezeigt, dass bestimmte Liganden für NK-Zellen auf Zielzellen nach Stimulation stärker exprimiert werden können. Durch die gesteigerte Expression können so inhibitorische Signale übergangen werden, sodass die Zielzelle trotz ausreichender HLA-I Expression lysiert wird (Watzl 2003). 1.1.2.4 Regulation der NK-Zellen NK-Zellen exprimieren eine Reihe von aktivierenden und inhibitorischen Rezeptoren, die ihre zytolytische und sekretorische Aktivität regulieren. Zu den aktivierenden Rezeptoren gehören die NCR (natural cytotoxicity receptors), die auf den NK-Zellen durch NKp30, NKp44 und durch NKp46 präsentiert werden (Moretta et al. 2001). Diese Rezeptoren sind spezifisch für NK-Zellen, wobei NKp44 auf NK-Zellen nur bei Aktivierung und NKP46 und NKp30 konstitutiv exprimiert werden. Einen wesentlichen Beitrag zur Regulation der NK-Zellen haben die inhibitorischen Rezeptoren. Die inhibitorischen Rezeptoren umfassen die KIRs (killercell immunoglobulin-like receptors), CTLR (C-type lectin-like receptors) und die Ig-ähnlichen Transkripte (IG-like transcripts, ILT/LIR). 1.1.2.5 Die Zelllinie NK-92 Die NK-92-Zelllinie wurde ursprünglich aus einem 50-jährigen Patienten mit progredientem Non-Hodgkin-Lymphom isoliert und zeigt Charakteristika aktivierter NK-Zellen. Sie weist eine hohe zytolytische Aktivität gegenüber soliden und hämatologischen Tumoren auf (Klingemann et al. 1996, Yan et al. 1998, Tam et al. 1999). Die hohe zytolytische Aktivität erklärt sich unter anderem durch die hohe Konzentration an Perforin und Granzymen. Die NK-92 ist auf Grund ihres klonalen Ursprungs eine homogene Zelllinie, die sich durch das Fehlen von fast allen inhibitorischen Rezeptoren auszeichnet (Tonn et al. 2001). Die drei inhibitorischen Rezeptoren, die auf der NK-92-Zelllinie 8 nachgewiesen werden konnten sind CD85J (ILT2), CD94/NKG2A und KIR2DL4 (Maki et al. 2001, Kirwan u. Burshtyn 2005). Außerdem besitzen sie im Gegensatz zu den aktivierten Killerzellen keinen Fc-Rezeptor (CD16-) (Gong et al. 1994). Charakteristisch für den Immunphänotyp der NK-92-Zelllinie ist die Expression von CD2, CD7, C11a, CD28, CD45, CD54 und CD56, wobei CD1, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD20, CD23, CD34 und HLA-DR nicht exprimiert werden. 1.2 P2X-Rezeptoren Die P2X-Rezeptoren bilden ligandengesteuerte Ionenkanäle. Sie werden von den P2Y-Rezeptoren, den G-Protein gekoppelten Rezeptoren, unterschieden (O'Connor et al. 1991). Die P2X-Rezeptoren werden nahezu auf allen Geweben exprimiert, so auch auf hämatopoetischen Zellen (Di Virgilio et al. 1996, Burnstock 2007). Die Untereinheiten der sieben P2XRezeptoren bilden einen ATP-gesteuerten Kationenkanal, welcher permeabel für Na+, K+ und Ca2+ ist. Die Bindung von ATP führt an dem P2X-Rezeptor durch Konformationsänderung zur Öffnung des Kanals, woraufhin es zu einem schnellen Influx von Na+- und Ca2+- Ionen sowie zu einem Ausstrom an Kaliumionen kommt. Infolgedessen depolarisiert und die Zellmembran. 1.2.1 Der P2X7-Rezeptor Der P2X7-Rezeptor ist einer der sieben Untereinheiten der P2X-Familie und wird auf Monozyten, Makrophagen, DC, Mikroglia, Lymphozyten, Mast- und Endothelzellen exprimiert (Collo et al. 1997, Di Virgilio et al. 2001). Der P2X7-Rezeptor extrazellulärem ATP (>100 wird durch hohe Konzentrationen von μM) aktiviert und vermittelt einen Calciuminflux in die Zellen. Eine dauerhafte Stimulation resultiert in der Bildung einer unselektiven Membranpore, durch die Moleküle bis zu einer Masse von 900 Da passieren können (Di Virgilio 1995). 9 Der P2X7-Rezeptor ist ein wichtiger Modulator des Immunsystems und ist an der Aktivierung des Inflammasoms beteiligt. Die Aktivierung des Inflammasoms durch den P2X7-Rezeptor resultiert in der Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins IL-1β (Ferrari et al. 2006). Der P2X7-Rezeptor ist auch im Zusammenhang mit den APC immunologisch bedeutsam. Ihm wird eine entscheidende Bedeutung hinsichtlich der T-Zellaktivierung durch APC zugeschrieben (Matzner et al. 2008, Schenk et al. 2008). Außerdem spielt der P2X7-Rezeptor bei der Zelltodinitiation eine wichtige Rolle. Eine längere Stimulation des P2X7 über 15-30 Minuten führt zum Tod der Zelle, weshalb der P2X7-Rezeptor auch als zytolytischer Rezeptor bezeichnet wird (Ferrari et al. 1999, North 2002, Wen et al. 2003). Abhängig vom Zelltyp sowie der Länge der ATP-Stimulation variiert der Zelluntergang jedoch zwischen apoptotischem und nekrotischem Zelltod (Di Virgilio et al. 1998). 1.2.1.1 Polymorphismen des P2RX7 Der P2X7-Rezeptor ist ein Protein, das vom P2RX7 Gen kodiert wird. Die Funktionalität des P2X7-Rezeptors wird unter anderem durch genetische Polymorphismen beeinflusst (Buell et al. 1998). Verschiedene Mutationen führen über einen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) zu einer Beeinträchtigung („loss of function“) oder zu einer Aktivierung des P2X7Rezeptors („gain of function“) (Gu et al. 2001, Cabrini et al. 2005). In der Arbeit wurde der Fokus auf die zwei funktionellen Einzelnukleotidpolymorphismen SNP1513 („„loss-of-function““) und SNP489 („„gain-offunction““) gelegt, die beide häufig miteinander assoziiert sind (Stokes et al. 2010). Für den SNP489 ist eine erhöhte elektrophysiologische Aktivität der Pore und ein gesteigerter Calcium-Influx dokumentiert, während der SNP1513 mit reduzierter ATP-induzierter Apoptose, IL-1β-Sekretion und abgeschwächtem Barium-Influx assoziiert ist (Gu et al. 2001, Wiley et al. 2002, Sluyter et al. 2004, Cabrini et al. 2005). 10 Abb. 3: Der P2X7-Rezeptor hat zwei transmembranäre Domänen (M1, M2) mit intrazellulärer Amino- (N) und Carboxylgruppe (C). ATP bindet an die extrazelluläre Domäne. Dabei kommt es zur Aktivierung des P2X7-Rezeptors. Der SNP489 (His155>Tyr) in der extrazellulären Domäne führt zu einem „„gain-of-function““, während der SNP1513 (Glu496>Ala) in der Carboxylgruppe durch den Austausch der Base Glutamin durch Alanin in einem „„loss-of-function““-Effekt resultiert. 11 1.2.2 ATP Extrazelluläre Nukleotide wie ATP, ADP und UTP sind physiologische Agonisten der P2-Rezeptoren, wobei in dieser Arbeit ausschließlich der Effekt von ATP untersucht wurde. ATP liegt im Organismus intrazellulär in einer Konzentration von 5-10 mM vor, wohingegen die extrazelluläre Konzentration im nanomolaren Bereich deutlich geringer ist. Durch Einflüsse wie chronische oder akute Entzündungen (Bodin u. Burnstock 1998, Lader et al. 2000), Zerfall von Zellen infolge einer Tumortherapie oder eines Traumas, wird vermehrt ATP freigesetzt (Panenka et al. 2001, Neary et al. 2003, Martins et al. 2009). Entsprechend der Expression funktioneller P2-Rezeptoren auf nahezu allen immunologisch wirksamen Zellen, hat der Agonist ATP ein weitreichendes Regulationspotential. Durch Aktivierung des P2X7 führt ATP über die Prozessierung durch ICE (IL-1 converting enzyme, Caspase1) zur Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-18. Dabei spielt das durch P2X7-Stimulation sezernierte IL-1β eine wichtige Rolle als proinflammatorisches Zytokin und ebenso bei der DC-Reifung (Sallusto et al. 1995, Wesa u. Galy 2001). 12 1.3 Patienten In dieser Arbeit wurden APC aus Heparinblut von Patienten mit verschiedenen inflammatorischen Krankheitsbildern isoliert: Vier Patienten litten unter neoplastischen Erkrankungen. Darunter war Patient #11096 mit einem Oligoastrozytom, Patientin #11081 mit einem Endometrium-Karzinom, Patient #11137 mit einem Prostata-Karzinom und Patient #11093 mit einer unklaren neoplastischen Erkrankung. Patient #11176 litt unter chronischen Schmerzen bei Fibromyalgie. Bei den folgenden drei Patienten bestand der klinische Verdacht auf eine Hämophagozytose. Dabei war bei den Patienten #10991 und #11082 die Verdachtsdiagnose eine Hämophagozytotischen Lymphohistiozytose (HLH) erkrankt und bei Patient #11095 war die Arbeitsdiagnose ein Makrophagenaktivierungssyndrom (MAS) als Komplikation eines Morbus Behçets. Patient #11151 erkrankte im Rahmen einer nekrotisierenden Fasziitis an einer Sepsis und Patient #11215 war ebenfalls septisch. 13 1.4 Ziel der Arbeit Zahlreiche entzündliche Erkrankungen gehen mit einer relativen Monozytose einher. Ein Teil dieser monozytären Zellen ist aufgrund ihrer Differenzierung in M2 Makrophagen nicht in der Lage, eine adäquate Immunantwort zu generieren oder verstärken pathologische Prozesse, wie Tumorwachstum und Hämophagozytose (Gabrilovich 2004, Suenaga et al. 2006, Fainaru et al. 2010). Ausgehend davon ergaben sich die folgenden zu bearbeitenden Fragestellungen: - Aus welchen Zellen setzt sich die relative Monozytose zusammen? - Welche Bedeutung haben NK-Zellen für die Kontrolle von unreifen APC? - Gibt es einen Zusammenhang zwischen der Aktivierung und relativen Vermehrung monozytärer Zellen und dem auf ihnen exprimierten P2X7-Rezeptors? 14 2. Material und Methoden 2.1 Geräte, Software, Verbrauchsmaterialien Geräte Bezeichnung Hersteller Axiovert Mikroskop Zeiss, Jena Centrifuge C5-6R-Zentrifuge BD Biosciences, Heidelberg Cytospin3 Shandon ThermoScientifics, Waltham EM 10 Zeiss, Jena EPC-9 Patch-Clamp Verstärker List Darmstadt FACS Calibur flow cytometer BD Biosciences, Heidelberg Fluoreszenzmikroskop Leica DM IRBE Leica, Wetzlar GlomaxTM 96 microplate luminometer Promega, Mannheim Inkubator ThermoScientifics, Waltham Lichtmikroskop Telaval 31 Zeiss, Jena L/M.SPS-8 Perfusionssystem List Darmstadt MPCU-3 Drucksteuerung Lorenz, Lindau Multipette plus Eppendorf, Hamburg Immulite Siemens, München Vortex Genie2 Scientifc Industries, New York Olympus cLSM Olympus, Hamburg Zeiss 510 cLSM Zeiss, Jena Software Bezeichnung Hersteller CellQuestTM Pro software BD Biosciences, Heidelberg Carl Zeiss LSM Zeiss, Jena Graphpad Prism 5.0 Graph Pad, La Jolla Gimp Gimp LibreOffice Libreoffice TIDA-Software Heka, Lambrecht 15 Microsoft Excel Microsoft, Redmond Microsoft Word Microsoft, Redmond Verbrauchsmaterialien Plastik/Glas Bezeichnung Hersteller 24 Well Zellkulturplatte ThermoScientifics, Waltham F96 MicroWell™ Plates Polystyrene ThermoScientifics, Waltham Objektträger 76-26 mm Menzel, Braunschweig Polypropylenröhrchen 14 ml BD Biosciences, Heidelberg Pipettenspitzen 100 µl Biozym, Oldendorf Ibidi 1μl Slide, Flow Chamber Ididi, München Serologiepipetten (2-10ml) Falcon Novoglas, Villmergen Shandon Filter Cards ThermoScientifics, Waltham Zellkulturflaschen (T25, T75) ThermoScientifics, Waltham Zentrifugenröhrchen 12ml Greiner Bio-one, Frickenhausen Caspase-Assay Bezeichnung Hersteller Caspase-Glo® 3/7 Assay Promega, München Caspase-Glo® 8 Assay Promega, München Caspase-Glo® 9 Assay Promega, München CytoTox-Glo® Promega, München Fluoreszenzfärbung Bezeichnung Hersteller Annexin V Fluorescence Microscopy Kit RnD Systems, Wiesbaden Calcein AM Fluorescent Dye BD Biosciences, Heidelberg DiC12 LifeTechnologies, Karlsruhe Hemacolor®Rapid 1-3 Merck, Darmstadt Hoechst 33342 Sigma-Aldrich, Taufkirchen 16 PKH26 red Sigma-Aldrich, Taufkirchen PKH67 green Sigma-Aldrich, Taufkirchen 2.2 Chemikalien und Lösungen Bezeichnung Hersteller Ampuwa, 1000ml Plastipur Fresenius, Bad Homburg ATP A2383 Sigma-Aldrich, Taufkirchen Cellfix BD Biosciences, Heidelberg CsA Sandimmun Novartis, Basel Cytotox/Cytoperm™ BD Biosciences, Heidelberg DPBS LifeTechnologies Karlsruhe FCS Biochrom, Merck Ficoll, Biocoll Separationslösung Merck, Darmstadt Gentamycinsulfat/Refobacin Merck, Darmstadt HBSS Invitrogen Merck, Darmstadt Interleukin-2/Proleukin Novartis, Basel Natriumazid, NaN3 Merck, Darmstadt Normal Rabbit Serum Dako Cytomation, Hamburg Perm Wash Buffer BD Biosciences, Heidelberg RPMI 1640+Glutamax+25mM Hepes Life Technologies, Regensburg 2.3 Ansätze für Medien und Lösungen Stammmedium RPMI1640, 25mM Hepes, 10% FCS, 100U/ml Gentamycinsulfat IL-2-Medium RPMI1640, 10% FCS, 103IU IL-2, 17 Gentamycinsulfat 60µg/ml FACS-Puffer Oberflächenmarkierung FACS-Puffer zytoplasmatische PBS mit 0,1% BSA, 0,1% NaN3, Perm Wash Buffer Markierung 2.4 Antikörper Tab. 1: Antikörper für die Immunphänotypisierung Spezifität Klon Subtyp CD1a HI149 CD2 Synonym Konjugation Hersteller IgG1κ FITC BD Biosciences, Heidelberg 39C1.5 IgG2a PE BD Biosciences, Heidelberg CD3 UCHT1 IgG1 FITC BD Biosciences, Heidelberg CD4 T4R01 IgG1 PE BD Biosciences, Heidelberg CD8 B9.11 IgG1 PE BD Biosciences, Heidelberg CD11b 2LPM19c IgG1 PE Dako Cytomation, Hamburg CD14 TÜK4 IgG2a PE Dako Cytomation, Hamburg CD16 NKP15 IgG1 FITC BD Biosciences, Heidelberg CD33 WM53 IgG1 PE BD Biosciences, Heidelberg CD47 B6H12 IgG1 FITC BD Biosciences, Heidelberg CD56 MY31 IgG1 PE BD Biosciences, Heidelberg CD64 22 IgG1 CD80 MAB102 IgG1 CD85j HPF1 IgG1 CD86 B-T/CD86 IgG1 IAP BD Biosciences, Heidelberg FITC BD Biosciences, Heidelberg ILT2, LIR-1 APC eBiosciences, Frankfurt B70/B72 FITC Diaclone 18 Rabbit C5a- IgG Rezeptor DX22 IgG1 CD95 DX2 CD120a CD88 C85-C4124 PE Bionity, Berlin CD94 KLRD1 FITC eBiosciences, Frankfurt IgG1 FAS PE BD Biosciences, Heidelberg H398 IgG2a TNF-R1A FITC AbD Serotec, Düsseldorf CD178 Alf-2.1a IgG1 FITC Ancell, Lörrach CD196 R6H1 IgG1 CCR6 PE eBiosciences, Frankfurt CD179 3D12 IgG2a CCR7 PE BD Biosciences, Heidelberg CD253 RIK-2 IgG1 TRAIL PE BD Biosciences, Heidelberg CD261 DJR1 IgG1 PE eBiosciences, Frankfurt CD303 AC144 IgG1 BDCA2 FITC CD304 AD5-17F6 IgG1 BDCA4 PE CD337 P30-15 IgG1 NKp30 PE BD Biosciences, Heidelberg B18.1 IgG1 FITC Enzo Life Sciences, Lörrach L243 IgG2a PE BD Biosciences, Heidelberg X49 IgG1 FITC BD Biosciences, Heidelberg X39 IgG2a PE BD Biosciences, Heidelberg W6/32 HL IgG1 FITC Thermo Scientifics, Waltham aktives GZMB HLA DR CD95L, FAS-Ligand DR4 TrailRezeptor-1 Milteny Biotec, Bergisch Gladbach Milteny Biotec, Bergisch Gladbach Isotypkontrolle Simultest γ1/γ2a Isotypkontrolle Simultest γ1/ γ2a HLA- I HLA-Klasse I 19 Perforin δG9 FITC BD Biosciences, Heidelberg 2D1 FITC BD Biosciences, Heidelberg CD14 MφP9 PE BD Biosciences, Heidelberg TCRα/β WT31 FITC BD Biosciences, Heidelberg Simultest Leucogate IgG2b CD45/ 2.5 IgG1 T-ZellRezeptor Zelllinien NK-92 Killerzelllinie K562 Erythroleukämiezelle, MHC-I negativ 2.6 Methoden 2.6.1 Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) Die Lymphozyten und APC für die Versuchsansätze wurden aus PBMC durch die Ficollzentrifugation aus heparinisiertem Vollblut isoliert. Ficolldichtezentrifugation Die Ficoll-Separationslösung Auftrennung der Separationsmuster, (Dichte verschiedenen wobei die 1,077 g/ml) Blutbestandteile Lymphozyten ermöglicht in und ein eine typisches PBMC den Interphasenring bilden. Das heparinisierte Blut (10 IE /ml) von Patienten und Blutspendern wurde in PBS verdünnt, diese Suspension auf Ficoll-Lösung aufgeschichtet und bei 2000 rpm zentrifugiert. Die Interphase wurde abgenommen, mit PBS aufgefüllt und gewaschen. Die im Ficoll-Röhrchen 20 sedimentierten Granulozyten wurden in Eppendorf-Cups verteilt und für die DNA-Präparation eingefroren. Bestimmung der Zellzahl Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit der Neubauer-Zählkammer. Die Zellkonzentration wird dadurch ermittelt, dass die Zellen in einem Großquadranten (16 Felder) gezählt und mit 104 multipliziert werden. Dabei wurde darauf geachtet, nur vitale Zellen - erkennbar an ihrer Membranstruktur und Lichtbrechung im Phasenkontrastmikroskop auszuzählen. Adhärenzdepletion Auf Grund des unterschiedlichen Adhärenzverhaltens der peripheren mononukleären Zellen war es möglich, lymphozytäre von APC zu trennen. In diesem Fall wurden 1-5 x 106 Zellen in 5 ml RPMI-Medium überführt. Die Zellkulturflasche wurde dabei liegend für mindestens eine Stunde zur Adhärenzdepletion inkubiert. Dabei setzten sich die Monozyten am Flaschenboden ab und adhärierten, wobei die Lymphozyten im Medium schwammen. Der Überstand aus überwiegend lymphozytären Zellen wurde vorsichtig mit eine sterilen Pipette abgenommen, abzentrifugiert und die Zellen in IL-2 Medium aufgenommen. Die Lymphozyten wurden anschließend in eine 24-Well-Costarplatte gegeben, wobei die Zellzahl 2 x 105 pro Well nicht überschritten wurde. Die verbliebenden mononukleären Zellen wurden weiter mit RPMI-Medium in der Zellkulturflasche kultiviert. 2.6.2 Zellkultivierung Die Kultivierung der Zellen erfolgte in dem für den jeweiligen Zelltyp erforderlichen Medium. Die Temperatur betrug durchgehend 37,5 °C bei 5 % CO2. Die Luftfeuchtigkeit hatte eine Sättigung von 99 %. Der Zustand der Zellkulturen wurde hinsichtlich Vitalität und Proliferationsverhalten mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop beurteilt. 21 Kultivierung von adhärenten Zellen Die Kultivierung der APC erfolgte in 25 cm2 liegenden Zellkulturflaschen. Das Medium (RPMI1640, 10 % FCS, Gentamycin) betrug 5 ml pro Flasche und die Zelldichte betrug 1 x 105/ml. Um kultivierte APC anzureichern, wurden die adhärenten Zellen 14 bis 36 Tage kultiviert. Kultivierung von nicht-adhärenten Zellen Die Lymphozyten wurden als nicht adhärente Zellfraktion in 24-WellPlatten (Costar) mit 103 IU IL-2/ml aktiviert. Wenn eine Zelldichte von > 6 x 105 Blasten/ml erreicht war, wurden die Wells 1:1 gesplittet und mit neuem Medium aufgefüllt. Kultivierung von Zelllinien Die Zelllinie NK-92 wurde in 25 cm2 stehenden Zellkulturflaschen mit jeweils 15 ml IL-2 Medium inkubiert, alle 72 h gesplittet und mit neuem Medium versehen. Die K562 Zelllinie wurde in 75 cm2 Zellkulturflaschen ebenfalls in stehenden Zellkulturflaschen im Medium ohne IL-2 kultiviert. 2.6.3 Dokumentation der Interaktion von Effektor- und Zielzellen Zytozentrifugation Für die Beurteilung der Morphologie von Zellen eignen sich Zytozentrifugenpräparate. Hierzu wurde pro Ansatz ein Zellpellet aus 1 x 104 Zellen in 350 μl PBS mit 0,05 % FCS aufgenommen und die Suspension in die Zentrifugeneinsätze pipettiert, die bei 300 rpm für 5 Minuten in der Zytozentrifuge (Shandon Cytospin 3) zentrifugiert wurden. Anschließend wurde das Präparat für 4 h getrocknet. 22 May-Grünwald-Giemsa-Färbung Die May-Grünwald-Giemsa-Färbung ist eine Differentialfärbung, die mit Hilfe eines Fixativs (Methanol), mit sauren (Eosin; Säurefuchsin) und basischen (Methylenblau, Brilliantkresylblau) Farbstoffen eine Unterscheidung verschiedener Strukturen möglich macht. Dabei binden positiv geladene basische Substanzen an negative Ladungen und färben sich somit bläulich. Die rötlichen, sauren Farbstoffe binden entsprechend an positive Ladungen. Demzufolge färbt sich das Zytoplasma blau, die Zellmembran gräulich und die Kerne färben sich violett. Das hier verwendete Färbeset „Hemacolor“ besteht aus drei Lösungen: In der ersten Lösung wurden die Präparate mit Methanol fixiert und in der zweiten mit rotem sowie in der dritten Zytozentrifugenpräparate Lösungen getaucht, mit wurden blauem jeweils gewaschen, Reagenz fünfmal getrocknet in und gefärbt. die Die jeweiligen unter dem Lichtmikroskop ausgewertet. Fluoreszenzmikroskopie Für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung wurden jeweils 5 x 105 ml NK-Zellen entweder mit PKH67 green oder mit CelltracerTM Calcein green und jeweils 5 x 104/ml APC mit dem rot fluoreszierenden DIOC12 oder PKH26 markiert. Hierzu wurden die Zellen mit HBSS für 5 min bei 820 rpm gewaschen und die NK-Zellen in HBBS in einer Endkonzentration von 10 μM Calcein bzw. 2 μM PKH67 green und 10 μg/ml DIOC12 bzw. 2 μM PKH26 red markiert. Die PKH-Farbstoffe wurden bei RT für 5 min inkubiert. Zum Anhalten der Reaktion wurde Zellkulturmedium zugegeben. Calcein und DIOC12 wurden für 20 min bei 37,5 °C im Dunkeln inkubiert. Zur Beurteilung der Interaktion der kultivierten APC mit IL-2 aktivierten Lymphozyten wurden die Zellen in einem IBIDI μ-Slide im Fluoreszenzmikoskop Leica TCS-NT untersucht. 23 Elektronenmikroskopie Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden nach einer modifizierten Methode von Buser und Walther erstellt (Buser u. Walther 2008). Die Zellen wurden auf Saphir-Platten aufgebracht und die lebenden Zellen durch die Kryofixation durch Compact-1 gefroren (Wohlwend GmbH, Sennwald, Switzerland). Das Medium bestand aus Azeton mit 0,2 % Osmiumtetroxid, 0,1 % Uranylacetat and 5 % Wasser. Die chemische Fixierung erfolgte durch 2,5 % Glutardialdehyd in 0,1 M Na- Cacodylatpuffer bei Raumtemperatur. Die kryofixierten Proben wurden in EPON 812 eingebettet. Die Ultradünnschnitte (80 nm) wurden an dem Leica microtome E hergestellt, mit 0,2 % Bleicitrat kontrastiert und bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV am EM 10 (Zeiss, Oberkochen, Germany) untersucht. 2.6.4 Immunphänotypisierung Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie - FACS (fluorescence activated cell sorting) - ist eine Methode zur Analyse des phänotypischen Expressionsprofils. Zur Messung wird die Zellsuspension über eine Stahlkapillare in eine Messküvette eingebracht. Dabei werden die eingezogenen Zellen stark beschleunigt und resultierende Streuung Photomultiplikatoren bestehende des Zellkonglomerate Laserlichts eingefangen und an gibt der aufgetrennt. Zelle wird Aufschluss Die durch über die entlang des physikalischen Zelleigenschaften. Die Photomultiplikatoren registrieren zum einen die einfallenden Lichtstrahls detektierte Vorwärts-Lichtstreuung (forward scatter; FSC; x-Achse), zum anderen die im 90° Winkel dazu einfallende seitliche Lichtstreuung (sideward scatter, SSC, y-Achse). Dabei korreliert die Vorwärts-Lichtstreuung mit der Größe der Zelle. Die seitliche Lichtstreuung liefert Aufschluss über die Granularität der Zelle. Mit den so erhaltenen Daten zur Größe und Plasma-Kern-Relation lassen sich im 24 Diagramm die Granulozyten von Lymphozyten und Monozyten differenzieren. Phänotypisierung Eine immunologische Phänotypisierung der Zellpopulation erfolgte mit Hilfe fluoreszierender, monoklonaler Antikörper. Die fluoreszierenden Antikörper binden spezifisch an die Oberflächenproteine der Zelle und werden durch das Laserlicht angeregt. Der angeregte Fluoreszenzfarbstoff absorbiert die Energie des Laserlichts und emittiert Photonen einer bestimmten Wellenlänge. Diese Photonen werden von Photomultiplikatoren detektiert. Ihre Anzahl ist proportional zur Menge der gebundenen Antikörper. Die Markierung erfolgte in dieser Arbeit durch die direkte Markierung. Als Negativkontrolle fungierten Fluoreszenz-markierte IgG1 und IgG2a Antikörper, die keine Bindungsspezifität für Leukozyten aufweisen, sogenannte Isotypkontrollen. Die verwendete Positivkontrolle (sog. Leukogate) war CD45 (LCA = leukocyte common antigen) für alle Leukozyten und CD14 Leukozyten für Makrophagen und DC. Die eingesetzten monoklonalen Antikörper zur FACS-Analyse waren FITC (Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat), PE (Phycoerytrhin) sowie APC (Allophycocyanin) markiert. Oberflächenmarkierung Die Zellen wurden aus der Kultur entnommen, mit PBS gewaschen und auf Eis gestellt. Auf das Zellpellet wurde 20 µl Kaninchenserum zugesetzt, um evtl. Fc-Rezeptoren zu blockieren und 300 µl FACS-Puffer (PBS mit 0,1 % BSA, 0,1 % NaN3, 0,5 % FCS) gegeben. Die Zellsuspension wurde auf die FACS Röhrchen verteilt, unter Lichtabschluss inkubiert, mit FACSPuffer gewaschen, mit 100 µl Cellfix fixiert und am Durchflusszytometer gemessen. 25 Zytoplasmatische Markierung Für den Nachweis von intrazellulären Proteinen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, auf Eis gestellt und Cytofix/Cytoperm gegeben, um eine Permeabilisation der Zellwände zu erreichen. Der Ansatz wurde mit dem Perm/Wasch-Puffer gewaschen und das Sediment mit Kaninchenserum versetzt. Für jeden Ansatz wurden 1 x 105 Zellen verwendet und für 30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein weiterer Waschgang mit Perm/Wasch. Der Überstand wurde verworfen und mit 100 µl Cellfix fixiert. Messung und Auswertung Die Messung der markierten Zellen erfolgte an einem FACS-Caliburgerät und die Auswertung mit der Cell-Quest-Software. Für die Messung der Lymphozyten- und APC-Zellkulturen wurde entsprechend der Population eine geeignete Verstärkerspannung der FSC (x-Achse) und SSC (y-Achse) gewählt. In dem vorliegenden Scatter wurde anschließend die zu untersuchende Zellpopulation ausgewählt („gating“) und hinsichtlich der Expression der fluoreszierenden Antikörper untersucht. Es wurden zwei Kanäle - beispielsweise FITC und PE - in einem Punktediagramm gegenübergestellt. Mittels der Quadranteneinteilung ließ sich die Negativkontrolle definieren und es war möglich, die Messung der spezifischen Marker für die Phänotypisierung zu untersuchen. Die Auswertungsmethode durch Quadranten erlaubte eine qualitative Einteilung des Expressionsverhaltens in die Kategorien „doppelt positiv“, „doppelt negativ“ oder „einfach positiv“. Die Zellen konnten folglich als positiv oder negativ für den jeweiligen Antikörper angegeben werden. 2.6.5 Caspase-Assay Mit Hilfe des Caspase-Glo-Assays wurde die Aktivität der Caspase-3/7, -8 und -9 bestimmt. Das Prinzip der Caspase-Glo-Assays beruht auf der Spaltung eines luminogenen Substrats für die betreffende Caspase (Caspase-3/7: Z-DEVD-aminoluciferin; Caspase-8: Z-LETD-amino- 26 luciferin; Caspase-9: Z-LEHD-aminoluciferin). Dieses selektive Substrat wird in Anwesenheit aktiver Caspasen zu Aminoluciferin umgesetzt. Das Enzym Luciferase reagiert mit Aminoluciferin. Als Folge kommt es zu einer Lichtemission, die durch das Luminometer detektiert wird. Die folgenden Assays wurden als Dubletten angelegt. Caspase-Assay nach ATP-Stimulation Ein wesentlicher Aspekt war der apoptotische Einfluss von ATP auf die APC. Hierzu wurden die APC der Spender in einer Zellkonzentration von 4 x 104/ml in eine 96-Well-Platte (Nunclon surface 136101) mit 50 µl vorgegeben und 1 mM ATP in E13 Puffer und RPMI-Medium in einem Volumen von 150 µl dazugegeben. Als Positivkontrolle wird Staurosporin in einer Endkonzentration von 4 µM und als Negativkontrolle RPMI in einem Volumen von 150 µl dazupipettiert. Nach 3 h Inkubation bei 37,5 °C wurde 150 µl Überstand abgenommen und zu den Ansätzen 50 µl Caspase Substrat zugegeben und nach 30 min bei RT im Luminometer gemessen. Die Ansätze wurden als Dubletten angelegt. Caspase-Assay nach Effektorzell-Koinkubation Um den Einfluss der Koinkubation von Effektor- und Zielzellen auf die Caspaseaktivität zu untersuchen, wurden 4 x 104/ml Zielzellen (APC bzw. K562) und 2 x 105/ml Effektorzellen (IL-2 aktivierte Lymphozyten bzw. NK-92) in Dubletten à 50 µl in 96-Well- Platten (Nunclon surface 136101) vorgelegt. Als Positivkontrolle werden zu den 50 µl Zellsuspension 150 µl RPMI Medium und Staurosporin in einer Endkonzentration von 4 µM hinzugegeben, als Negativkontrolle 150 µl RPMI. Für den Effektor/Zielzellen-Ansatz wurden zu den 50 µl Zielzellen 50 µl der Effektorzellen hinzupipettiert und weitere 100 µl RPMI, um die Volumina anzugleichen. Der Ansatz wurde für 3 h bei 37,5 °C inkubiert und nach Absetzen der Zellen 150 µl Überstand abpippetiert. Zu den verbleibenden 50 µl wurde jeweils 50 μl Caspase-3/7-Substrat zugegeben und nach 30 min Inkubation bei RT die Caspaseaktivität im Luminometer erfasst. 27 2.6.6 Cytotox-Glo-Assay Die APC-Lyse der NK-92 wurde mit dem Cytotox-Glo-Assay untersucht. Der Zytotoxizitäts-Assay erlaubt die Bestimmung toter Zellen über die "dead-cell protease activity” mittels eines luminogenen Peptidsubstrats, dem AAF-Glo (Alanyl-alanyl-phenylalanaylaminoluciferin). In Kombination mit dem Lyse-Reagenz ermöglicht der Assay auch die Aussage über die totale Zellzahl im Well. Im Versuchsansatz wurden die K562-Zellen in einer Konzentration von 1 x 104/ml pipettiert und die NK-92 in der Ratio 1:2,5, 1:5, 1:10 und 1:20 dazugegeben. Die Assays wurden als Dubletten angelegt. 2.6.7 Zytokinbestimmung Mit dem Immulite (Siemens), einem Chemilumineszenzverfahren, wird aus Zellkultur-Überständen die Konzentration an Zytokinen bestimmt. In dieser Arbeit wurden jeweils 20 µl der Überstände von APC- und Lymphozytenzellkulturen auf Interleukin-10 untersucht. 2.6.8 Elektrophysiologie Für die Patch-Clamp-Messung wurden die APC-Kulturen für 6 h in eine Petrischale mit Medium überführt, in dem TNF-α in einer Konzentration von 10 ng/ml vorlag. Die Zellen inkubierten bei 37,5 °C über Nacht, wobei TNF-α zum erforderlichen Adhärieren der APC führte. Für die Messung wurde in der Petrischale eine der APC ausgewählt und eine mit E13-Puffer gefüllte Glaskapillare mit Hilfe des Micromanipulators 5171 in die Nähe der Zelle manövriert. Der Überdruck in der Kapillare wurde durch eine Wassersäule von 10 cm aus E13-Puffer erzeugt, der bei Kontakt mit der Zelle minimiert wurde. Daraufhin lagerte sich die Zelle an die Kapillare an. Anschließend wurde die Zelle mit Unterdruck oder unterstützend mit einem Stromschlag eröffnet. Über Zuläufe wurde die Zelle nun fünfmal hintereinander mit 1 mM ATP stimuliert. 28 2.6.9 SNPs des P2RX7 MIA (multi-individual-array) MIA ist eine Methode, die es ermöglicht, parallel verschiedene Proben auf einen SNP zu untersuchen (Geistlinger et al. 2012). Hierzu wurden die DNA-Sequenzen der zu untersuchenden SNP durch asymmetrische PCR vervielfältigt und mit einem SBE (single base extension) Primer versetzt. Die Mischung findet im PCR-Well statt, in welchem auch die PCR-Loci vervielfältigt werden. Die Hybride wurden durch spezifisch aminoterminierte SBE-Primer kovalent auf dem Chip gebunden. Der Test-Spot erscheint aufgrund des Einbaus fluoreszenzmarkierter ddNTPs (didesoxynucleotide triphosphates) rot, grün oder gelb. (Geistlinger et al. 2012). 2.6.10 Statistische Auswertung Die Auswertung der erhobenen Daten erfolgte durch den Median unter anderem als Darstellung der 25. und 75. Perzentile bzw. von Mittelwert und Standardabweichung. Als Verfahren wurde der Mann-Whitney-U-Test für unverbundene Stichproben angewandt und zur Berechnung des pWertes ein Signifikanzniveau von α = 5 % (p < 0,05) festgelegt. Die Berechnungen zur Statistik wurden mit dem Programm GraphPad Prism vs. 5.0 erstellt. 29 3. Ergebnisse 3.1 Phänotyp kultivierter APC Die phänotypische Charakterisierung der kultivierten PBMC erfolgte mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Nach Adhärenzdepletion und 2-5 wöchiger Zellkultur exprimierten die hier kultivierten PBMC Marker für APC. Als Kontrolle zu den Patienten-APC dienten Zellisolate von Blutspendern. Die phänotypische Analyse der kultivierten Patienten APC zeigte, dass alle kultivierten Patienten-APC, die für CD178 positiv waren, auch CD11c exprimierten (CD11c: Median der Kontrollen: 34,8 %, n=4; Median der Patienten: 79,8 %, n=6) und auch positiv für CD14 waren (Median der Kontrollen: 61,5%, n=4; Median der Patienten: 68,7 %, n=10). Das Expressionsmuster entspricht dem von DC mit myeloischer Differenzierung. Dabei exprimierten die Patienten-APC CD14 in höherer und insbesondere CD11c in deutlich höherer Dichte. Intrazellulär waren die Zellen Fas-Ligand (CD178) positiv (Median der Kontrollen 95,8 %, n=2; Median der Patienten: 32,5 %, n=7). Die Kontrollen- und PatientenAPC waren für HLA-DR vergleichbar positiv (Median der Kontrollen 88,3 %, n=4; Median von Patienten: 92,88 %, n=10). Für die ko- stimulatorischen B7-Moleküle (CD80, CD86) waren die kultivierten APC nur schwach positiv. Dabei waren CD80 und CD86 auf den Patienten – verglichen mit den gesunden Probanden - geringer exprimiert. Der Median der Kontroll-APC für CD80 lag bei 11,1 % (n=4) und der Median der Patienten-APC lag bei 1,4 % (n=8). Für CD86 lag der Median der Kontrollen bei 46,2 % (n=4) und der Median der Patienten bei 15,3 %, (n=8). Der Differenzierungsmarker CCR7 war ebenfalls in einer sehr geringen Expressionsdichte nachweisbar (Median der Kontrollen 1,3 %, n=4; Median der Patienten: 2,0 %, n=8). Eine Patienten-APC-Kultur war hierbei im Vergleich sehr stark positiv für CCR7 (#11263: 89,8 %). Die Expression von CD1a war in beiden Gruppen ähnlich schwach (Median der Kontrollen Median 1,4%, n=4; Median der Patienten: 2,8 %, n=6). 30 % positive Zellen gegateter APC-Kulturen 100 Kontrolle Patient 80 60 40 20 0 14 CD Abb. 4: c 11 CD DR AL H 80 CD 86 CD R7 CC 1a CD yt. 8z 17 CD Antigenexpressionmuster der kultivierten unreifen APC von gesunden Blutspendern (Kontrollen: #10719, #10837, #10838, #10927) und Patienten mit inflammatorischen Erkrankungen (Patienten: #11081, # 11082, #11091, #11093, #11095, #11096, #11137, #11151, #11215, #11263). Prozent (%) positive Zellen gegateter APC-Kulturen (y-Achse) von CD14, CD64, CD11c, HLA-DR, CD80, CD86, CCR7, CD1a, CD178 zytoplasmatisch (x-Achse). Darstellung als Dotplot und Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 7 und Tabelle 8. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.2 NK-Zellsubpopulation und Immunphänotyp kultivierter APC NK-Zellen sind in der Lage, die Populationsgröße unreifer APC direkt durch die Zelltod-Induktion zu limitieren. Im folgenden Teil der Arbeit wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen dem vermehrten Auftreten unreifer APC und der geringen Anzahl an NK-Zellen untersucht. Hierzu wurden APC aus Patienten mit verminderten NK-Zellen - definiert als < 5 % CD16+/CD56+ NK-Zellen im Vollblut - und Patienten mit normaler NKZell-Verteilung der (≥ 5 % CD16+/CD56+ NK-Zellen im Vollblut) hinsichtlich ihres Reifestatus analysiert. Dabei konnte bei Patienten mit 31 geringer NK-Zellpopulation entsprechend mehr unreife APC in der APCKultur mit niedrigerer HLA-DR-, CD80- und CD86-Expression detektiert werden, als bei Probanden mit normaler NK-Zellverteilung (Abb. 5). Die Patienten mit normaler NK-Zellverteilung waren zu 11,0 % (Median) positiv für CD16/CD56, zu 3,6 % (Median) positiv für CD3/CD56 und zu 9,2 % (Median) positiv für CD57/CD56 (n=5). In den APC-Kulturen der Patienten mit normaler NK-Zellverteilung waren 97,3 % (Median) positiv für HLA-DR, 2,3 % (Median) positiv für CD80 und 30,4 % positiv für CD86 (n=4-5). Die Patienten mit geringer NK-Zellpopulation waren zu 3,5 % (Median) positiv für CD16/CD56, 2,2 % (Median) positiv für CD3/CD56 und zu 2,4 % (Median) positiv für CD57/CD56 (n=8). Gleichzeitig waren die APC-Kulturen mit geringer NK-Zellpopulation zu 38,2 % (Median) positiv für HLA-DR, zu 1,4 % (Median) positiv für CD80 und zu 3,2 % % positive NK-Zellen A Abb. 5: Phänotypische Analyse % positive APC 25 B der NK-Zellen 10 0 CD86 0 CD57+/CD56+ 20 CD86 15 CD57+/CD56+ 10 CD80 5 CD80 CD3+/CD56+ 0 CD3+/CD56+ 80 HLA-DR 60 HLA-DR CD16+/CD56+ 40 CD16+/CD56+ 20 (Median) positiv für CD86 (n=3-4). (CD16+/CD56+; CD3+/CD56+; CD57+/CD56+, y-Achse) von Patienten ohne NK-Zelldysfunktion (> 5 % NK-Zellen, schwarze Punkte) mit den Patientennummern #11081, #11093, #11137, #11291 sowie #11096 und mit NK-Zelldysfunktion (< 5 % NK-Zellen, weiße Punkte) mit den Patientennummern #11082, #11088, #11091, #11095, #11236, #10981, #11177 und #11176 als Prozent (%) positive Zellen (A). Abbildung B zeigt die Antigenexpression (HLADR, CD80, CD86, y-Achse) der APC-Kulturen von Probanden ohne NK-Dysfunktion mit den Probandennummern #11081, #11093, #11137, #11291 und #11096 (weiße Punkte) sowie die Antigenexpression der APC-Kulturen mit NK-Dysfunktion der Patientennummern #11082, #11091, #11095 und #7242 (schwarze Punkte) in Prozent (%) kultivierter APC (x-Achse). (•) = Median, die untere Grenze stellt die 25. Perzentile, die obere die 75. Perzentile dar. Rohdaten im Anhang Tabellen 7-9. Universitätsklinikum Ulm 2009. 32 3.3 Morphologie der Interaktion Die Interaktion von APC und NK-Zellen mit Hilfe der Licht-, Fluoreszenzund Elektronenmikroskopie ist im Folgenden dargestellt. Unreife APC wurden mit autologen und allogenen, IL-2 aktivierten Lymphozyten und einem Zielzell-Effektor-Zellverhältnis koinkubiert und das von Kontaktverhalten 1:10 über drei ausgewertet. Stunden Um die Interaktionsmuster vergleichen und standardisieren zu können, wurden die APC zusätzlich mit der hoch zytotoxischen Zelllinie NK-92 koinkubiert. Als Positivkontrolle diente die Koinkubation von NK-92 mit der leukämischen Zelllinie K562. 3.3.1 Lichtmikroskopie Das Kontaktverhalten der Effektorzellen (IL-2 aktivierte Lymphozyten; NK92) und deren Zielzellen (APC und K562) wurde lichtmikroskopisch ausgewertet. Hierzu wurden die Zellsuspensionen der dreistündigen Koinkubation der Zielzellen mit den Effektorzellen auf Zytopräparaten Giemsa gefärbt und die Interaktionen ausgewertet. Es konnten drei verschiedene Kontaktverhalten dokumentiert werden: Kontakt-Verhalten I: Die Effektorzellen konfigurierten sich kappenartig über die Zielzellen. Dieses Kontaktverhalten wurde in der Koinkubation von NK-92 mit der Todesrezeptor-negativen K562 sowie in der Mehrzahl der Koinkubationen von NK-92 mit den unreifen APC beobachtet. Kontakt-Verhalten II: IL-2 aktivierte Lymphozyten und NK-92 wölbten sich in die APC vor, sodass einige Effektorzellen nahezu vollständig von den APC umschlossen wurden. Dieses Muster wurde unter anderem in einer Koinkubation von Perforin-mutierten (Pf-/-) aktivierten Lymphozyten mit unreifen APC dokumentiert. Aber auch in weiteren Koinkubationen von NK-92 und aktivierten Lymphozyten mit autologen unreifen APC konnte dieses Verhalten beobachtet werden. 33 Kontakt-Verhalten III: NK-92 und IL-2 aktivierte Lymphozyten zeigten beim Kontakt mit den unreifen APC hakenähnliche Fortsätze, die tendenziell auf den Kern der Zielzelle ausgerichtet waren. Das Verhalten III konnte maßgeblich in den Koinkubationen von NK-92 bzw. IL-2 aktivierten Lymphozyten mit den unreifen APC dokumentiert werden. Abb. 6: Schema des beobachteten Kontaktverhaltens der Koinkubation von Effektorzellen (NK-92 und IL-2 aktivierte Lymphozyten) mit den Zielzellen (APC und K562) in der Hellfeldmikroskopie. Verhalten I zeigt den Zelltod der APC durch Granzym B/Perforinkompetente, kappen-artige formierten Effektorzellen. Kontaktverhalten II zeigt das taschenartige Umschließen der teilweise Perforin (Pf-/-) mutierten Effektorzellen. Kontaktverhalten III stellt die hakenähnlichen Fortsätze von NK-92 und aktivierten Lymphozyten in Koinkubation mit den Zielzellen dar. 34 Das Kontaktverhalten wurde zusätzlich zur Hellfeldmikroskopie auch fluoreszenzAuswirkungen und der elektronenmikroskopisch unterschiedlichen untersucht. Kontaktformen auf Mögliche die Zell- induzierte Apoptose wurden in Kapitel 3.3.2 ermittelt. 3.3.2 3.3.2.1 Fluoreszenzmikroskopie Morphologie der Koinkubation von NK-92 und K562 Die Visualisierung der Interaktion von NK-92 und K562 erfolgte mit der Fluoreszenzmikroskopie. Die NK-92 wurde hierzu mit dem grün fluoreszierenden Calcein gefärbt, K562 mit dem rot fluoreszierenden DiC12 markiert und diese zusammen über 60 Minuten koinkubiert. Die Effektor-Target-Ratio betrug 1:10. Daraufhin erfolgte die Analyse der Interaktion am Fluoreszenzmikroskop (Abb. 7). 35 Abb. 7: Koinkubation der fluoreszenzgefärbten NK-92 (grün) und K562 (rot) nach 10 Minuten (A) und als Vergrößerung der Zellaggregate (B). Zoom der zytotoxischen NK-92APC-Synapse nach 30 Minuten Koinkubation (C) und das Blebbing der K562 nach 60 Minuten (D). Balken 5 µM. Universitätsklinikum Ulm 2008. 3.3.2.2 Morphologie der Koinkubation von NK-92 und IL-2aktivierten Lymphozyten mit APC Parallel zu den Apoptose-Assays wurde die Interaktion lebender APC eines Patienten mit Sepsis und von NK-92- oder autologen IL-2-aktivierten Lymphozyten mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Hierzu wurden die Membranfarbstoffe PKH26 oder PKH74 eingesetzt. Die InteraktionsAnalyse zeigte das Blebbing der APC durch die Effektorzellen NK-92 (Abb. 8A). Diese Kontaktverhalten entspricht dem beobachtet „Kontaktverhalten 36 I“, das bereits in der Lichtmikroskopie festgestellt werden konnte. In wenigen Fällen wurde das Umschließen der Effektorzellen (hier NK-92) – entsprechend dem „Kontaktverhalten II“ - von den unreifen APC von beobachtet (Abb. 8B). Analog zum oben Lichtmikroskopie beschriebenen konnten auch in „Kontaktverhalten der III“ in der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung hakenähnliche Fortsätze der Effektorzellen dokumentiert werden. Die Fortsätze der Effektorzellen orientierten sich stets in Richtung des Zellkerns der APC (Abb. 8C). 37 Abb. 8: Kontaktverhalten I (Pfeil) mit der Koinkubation von NK-92 (grün) und unreifen APC #10063 mit Sepsis (rot). Die NK-92 konfiguriert sich über die apoptotische APC mit Blebs (A). Kontaktverhalten II (Pfeil) der IL-2 aktivierten Lymphozyten von # 10063 und unreifen APC von # 10063. Teilweise Aufnahme der Effektorzellen durch APC (B). Kontaktverhalten III (Pfeil) der IL-2 aktivierten Lymphozyten des septischen Patienten #10063, die sich haken-artig zum Zellkern der autologen APC konfiguieren(C). Universitätklinikum Ulm 2009. 38 3.3.3 Elektronenmikroskopie Um die beobachtete Ingestion der Effektorzellen in die APC - entsprechend dem Kontaktverhalten II - genauer untersuchen zu können, wurden zusätzliche elektronenmikroskopische Aufnahmen der Koinkubation angefertigt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass einige unreife APC die Effektorzellen mit Zellmembranen umhüllen. Abb. 9: Koinkubation der IL-2 stimulierten Lymphozyten von #10063 mit Sepsis und den autologen unreifen APC von #11063 mit Umschließen der Effektorzellen durch die APCMembran (A). Umschließen der Effektorzellen durch die Zellmembran der APC (roter Pfeil) von #10063 (B). Balken in Mikrometer (μm). Universitätklinikm Ulm 2009. 39 3.4 Zell-induzierte Apoptose Um mögliche Auswirkungen der verschiedenen Formen der Interaktion für die Zell-induzierte Apoptose - wie z. B. eine Resistenz unreifer APC gegenüber Zell-induzierter Apoptose - zu ermitteln, wurden die unreifen APC mit zytotoxischen Zellen koinkubiert. Für die Etablierung des Apoptose-Assays der hier untersuchten Effektor- und Zielzellen und zur Gewährleistung der korrekten Auswertung und Vergleichbarkeit der Caspase-Assays wurden die nachfolgenden Untersuchungen vorgezogen. Caspase-3/7-Aktivität in Abhängigkeit der Zellkonzentration Für die adäquate Auswertung des Caspase-Assays muss ein linearer Zusammenhang zwischen Zellkonzentration und Lumineszenz (RLU) bestehen. Um diesen Zusammenhang zu ermitteln, wurden exemplarisch verschiedene Zellkonzentrationen der natürliche Killerzellinie NK-92 in 96Well Platten als Dubletten titriert. Die Anfangskonzentration betrug 0,25 x 105/ml und die Endkonzentration betrug 2 x 105/ml. Die Untersuchung am Luminometer erfolgte nach drei Stunden Inkubation. Bei 0,25 x 105/ml lag der Mittelwert ± Standardabweichung der Lumineszenz bei 26727 ± 1440 RLU, bei 0,5 x 105/ml 57063 ± 2458 RLU, bei 1 x 105 / ml 159662 ± 704,3 RLU, bei 1,5 x 105/ml 244136 ± 40704 RLU und bei 2 x 105 / ml 290578 ± 14495 RLU. 40 Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 350000 250000 150000 50000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 5 NK-92 in 10 /ml Abb. 10: Caspase-3/7-Aktivität der NK92-Dubletten als Lumineszenz in Relative Light Units (RLU; y- Achse) folgender NK-92-Zellkonzentrationen: 0,25 x 105 ml, 0,5 x 105 ml, 1,0 x 105 ml, 1,5 x 105 ml und 2,0 x 105 ml (x-Achse). Darstellung als Dotplot. Universitätsklinikum Ulm 2009. Konstitutive Caspase-3/7-Aktivität der APC in Zellkultur Um große Schwankungen der spontanen Caspase-3/7-Aktivität in der Zellkultur auszuschließen, wurden die hier getesteten unreifen APCPopulationen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Zellkultur untersucht. An Tag 3, Tag 12, Tag 20, Tag 27 sowie am Tag 29 der Zellkultur wurden diese nach drei Stunden Inkubation in der 96-Well Platte als Dubletten am Luminometer gemessen. Der Mittelwert ± Standardabweichung der Lumineszenz lag an diesen Tagen jeweils bei 151793 ± 43022 RLU, 46177 ± 6490 RLU, 12842 ± 984 RLU, 66696 ± 9710 RLU und 24729 ± 750 RLU. Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 200000 150000 100000 50000 0 3d 12d 20d 27d 29d Abb. 11: Caspase-3/7-Aktivität der APC-Dubletten in RLU (Relative Light Unit, y-Achse) nach 3, 12, 20, 27 und 29 Tagen Kultur (d; x-Achse). Patientennummern der APC: #12330, #12308, #12288, #12284 mit Hämophagozytose und #12318 mit Fibromyalgie. Darstellung als Dotplot. Universitätsklinikum Ulm 2011. 41 Zeitlicher Verlauf der Apoptoseinduktion durch NK-Zellen Die Apoptoseinduktion der Effektorzellen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen. Die Caspase-3/7-Aktivität der NK92 und Zielzellen wurde nach einer Stunde sowie nach zwei und drei Stunden untersucht. Abbildung 12 zeigt, die Apoptose-Rate der Koinkubation von NK-92 mit K562 oder NK-92 mit der APC des Blutspenders #10846 über ein, zwei und drei Stunden. NK-92 + K562 NK-92 + APC 400000 Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 400000 300000 200000 100000 Abb. 200000 100000 0 0 A 300000 1h 2h 3h B 1h 2h 3h 12: Caspase-3/7-Aktivität in RLU (Relative Light Unit, y-Achse) der Effektor- Target-Apoptose von NK-92, K562 in (A) und NK-92 mit APC von Patient #10846 in (B) nach 1, 2 und 3h (Stunden; x-Achse). Darstellung als Dotplot. Universitätsklinikum Ulm 2009. Annexin-V positive APC-Populationen Analog zu dem Caspase-Assay wurde die Apoptoseinduktion unreifer APC mit Annexin-V verifiziert. Hierzu wurden die unreifen APC mit PKH26 rot gefärbt und mit den unkolorierten Effektorzellen koinkubiert. Danach wurde Annexin FITC hinzupipettiert und die apoptotischen Zellen identifiziert. Folglich konnte gezeigt werden, dass ein detektierter Caspase3/7-Anstieg auf die Apoptose der unreifen APC und nicht auf die der Effektorzelle zurückzuführen ist. 42 3.4.1 Interaktion der NK-92 und K562 Um die Zytotoxizität der Killerzellinie zu verifizieren, erfolgte eine Phänotypsieriung der NK-92 sowie eine Interaktionsanalyse der NK-92 mit der Zielzelle K562. 3.4.1.1 Immunphänotypisierung der NK-92 Die Stabilität der kultivierten NK-92-Zelllinie wurde am FACS überprüft und auf ihre antigenspezifischen Charakteristika hin untersucht. Dabei ist die NK-92 negativ für CD23, CD3, CD8, CD16, CD14, ILT3, wohingegen CD94, NKp30, CD2, ILT2 (CD85J) auf den Zellen exprimiert wurde. Die intrazelluläre Analyse zeigte, dass die NK-92 stark positiv für Granzym-GRANZYM BB, Perforin und TRAIL, aber auch für FAS-Ligand positiv waren. Dagegen konnte der P2X7-Rezeptor intrazellulär nicht nachgewiesen werden. 43 Abb. 13: Phänotypisierung der NK-92. Dotplot der Durchflusszytometrie Antigenpositiver Zellen für FITC (x-Achse), PE und APC (y-Achse). CD23-, CD2+ (A); CD3-, CD8(B); CD16(-), ILT2+ (CD85J) (C); CD14-, ILT3-(CD85K) (D); CD178+(FAS-L), Granzym B+ (E); CD94+, NKp30+ (F); Perforin+ (G); P2X7-Rezeptor- (H) und TRAIL + (H). 44 3.4.1.2 Apoptoseinduktion und Zytotoxizität der NK-92 gegenüber K562 Caspase-Assay der NK-92 mit K562 Die Apoptoseinduktion von NK-92 auf ihre Zielzelle K562 wurde mit Hilfe des Caspase-3/7-Assays untersucht. Um dies auch für unterschiedliche Target-Effektor-Ratios darzustellen, wurde die Zellkonzentration von 1 x 104/ml der K562 konstant gehalten und die NK-92 in folgenden Konzentrationen in eine 96-Well Platte dazutitriert: 0,25 x 105/ml, 0,5 x 105/ml, 1,0 x 105/ml, 2,0 x 105/ml. Die Lumineszenz-Messung nach drei Stunden Koinkubation ist in Abbildung 14 A dargestellt. Hierzu wurde die spontane Caspaseaktivität der NK-92 und K562 als Lumineszenz addiert und die Summe mit der direkten Koinkubation verglichen. Dabei führte die Koinkubation der Killerzelllinie NK-92 mit der Zielzelllinie K562 verglichen mit der Kontrolle - zu einem deutlichen Anstieg der Caspase3/7-Aktivität. Dies wurde auch als Stimulationsindex (SI) im Vergleich zur Kontrolle erfasst: 2,17 SI, 2,16 SI, 1,67 SI, 1,69 SI. LDH-Assay der NK-92 und K562 Parallel zur Apoptoseinduktion wurde die Zytotoxizität der NK-92 auf die Zielzellen K562 mit dem Cytotox-Assay nach drei Stunden Koinkubation bestimmt (Abb. 14B). Der Cytotox-Assay basiert auf der Detektion von Licht als Folge einer LDH-abhängigen Reaktion und erfasst somit den Verlust der Membranintegrität der untersuchten Zellen. In diesem Ansatz wurden analog zum Apoptose-Ansatz die Zielzellen in einer Konzentration von 1x104/ml in die 96-Wellplatte pipettiert und die Effektorzelle jeweils in der Ratio 1:2,5; 1:5; 1:10 und 1:20 zugegeben. Die Kontrolle für die absolute Zytotoxizität wurde mit einem Lyse-Reagenz durchgeführt. Die Stimulationsindices für die jeweilige Effektor-Zielzellen-Ratio im Vergleich zur Kontrolle betrugen 1,39 SI, 1,35 SI, 1,31 SI und 1,28 SI. 45 2000000 600000 Kontrolle Koinkubation K562 + NK-92 500000 LDH Lumineszenz (RLU) Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 1500000 400000 300000 200000 1000000 500000 100000 0 0 1 : 2,5 A 1 : 10 1:5 Zielzellen : Effektorzellen 1 : 20 1 : 2,5 B 1:5 1 : 10 Zielzellen : Effektorzellen 1 : 20 Abb. 14: Caspase-3/7-Aktivität (A) und LDH-Aktivität (B) als Lumineszenz in RLU (Relative Light Units, y-Achse) der Kontrolle (schwarzer Balken) und Koinkubation von K562 und NK-92 (weißer Balken) in unterschiedlichen Target-Effektor-Ratios (x-Achse). Darstellung als Mittelwert und Standardabweichung. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.4.2 Interaktion der NK-92 und der APC gesunder Spender 3.4.2.1 Caspase-3/7-Assay der APC gesunder Spender mit NK-92 Die APC-Kulturen zweier Blutspender (#10837, #10838) wurden über drei Stunden mit Koinkubation den NK-92 am Luminometer Apoptoseinduktion der inkubiert NK-92 und erfasst. als die Caspaseaktivität Abbildung 15 Caspase-3/7-Aktivität getesteten Kontrollen. (#10837: 1,16 SI, #10838: 1,37 SI). zeigt in der die beiden 46 Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 1500000.0 1000000.0 500000.0 0.0 C AP #1 083 Ko K-92 +N 7 C# AP 10 8 3 Ko K-92 +N 8 Abb. 15: Apoptoseinduktion als Lumineszenz der Caspase-3/7-Aktivität in RLU (Relative Light Units; y-Achse) der kultivierten APC der gesunden Probanden (#10837; #10838) durch NK-92 im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (Ko) (x-Achse). Darstellung als Mittelwert und Standardabweichung. Universitätsklinikum Ulm 2009 3.4.3 Interaktion der NK-92 und Patienten-APC In diesem Teil der Arbeit wurden unreife APC von Patienten verschiedener immunologischer Erkrankungen auf die Suszeptibilität gegenüber Zellinduzierter-Apoptose untersucht. Um eine stabile Zytotoxizität der Effektorzellen zu gewährleisten wurde die Killerzelllinie NK-92 als Effektorzelle eingesetzt. Die APC dieser Patienten mit neoplastischen Erkrankungen, Fibromyalgie, Hämophagozytosesyndromen (Hämophagozytotische Lymphohistiozytose, Makrophagenaktivierungssyndrom) und septischem Schock wurden über 15-36 Tage kultiviert und für den Apoptose-Assay mit der Killerzelllinie NK-92 koinkubiert (Abb. 16). Als Kontrolle dienten die unreifen APC zweier Blutspender. Die Apoptoserate wurde mit dem Anstieg der Caspase-3/7-Aktivität ermittelt. Dabei variierten die Caspase-Level der APC-NK-92- Koinkubationen deutlich und es wurde sowohl eine Zunahme der Caspaseaktivität, als auch eine Abnahme der Caspaseaktivität gemessen. Abbildung 16 fasst die NK-92-induzierte Caspaseaktivität der 47 verschiedenen Patienten als Stimulationsindex (SI) zusammen. Anhand der Diagnose konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Im Vergleich zu den Blutspendern (Median: 1,3 SI) kam es in den unreifen APC der Patienten mit neoplastischen Erkrankungen (Median: 1,0 SI), hämophagozytotischen Krankheitsbildern wie HLH und MAS (Median: 1,0 SI) wie auch in den APC von Patienten mit septischen Schock (Median: 1,0 SI) zu tendenziell weniger Caspase-3/7-Aktivität. Lediglich der Fibromyalgie-Patient war - verglichen mit den Blutspendernsensitiver für eine NK-92 induzierte Apoptose. Hier konnte eine mittlere Apoptoserate von 1,3 SI (Median) detektiert werden. SI (Stimulationsindex) Caspase-3/7 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ie se gie der n las yto e p yal z p o m o s t Ne ro ag Blu ph Fib o m Hä Abb. 16: s psi Se NK-92-induzierte APC-Apoptose als Stimulationsindex der Caspase-3/7- Aktivität (y-Achse) von gesunden Probanden (Blutspender: #10837, #10838) und Patienten verschiedener immunologischer Diagnosen wie Neoplasien (#11093, #11096, #11081, #11137), Hämophagozytose (#11095, #10991, #11082), Sepsis (#11216, #11151) und Fibromyalgie (#11176) (x-Achse). Darstellung als Dotplot und Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 10. Universitätsklinikum Ulm 2009. 48 3.4.3.1 Immunphänotyp der Patienten-APC in Abhängigkeit zur NK-92-Sensitivität Im nachfolgenden Abschnitt wurden die Patienten-APC auf phänotypische Besonderheiten untersucht. Für die Analyse wurden die APC-Kulturen entsprechend der induzierten Apoptose in der Koinkubation mit NK-92 als NK-92-sensitiv (Caspase-3/7-positiv; n=4) oder NK-92-insensitiv (Caspase-3/7-negativ, n=4) unterschieden. Diese APC-Kulturen wurden auf die Expression der Antigene CD14, CD80, CD86 und CCR7 phänotypisch untersucht (Abb. 17). Dabei zeigte sich, dass die Caspase3/7-negativen APC-Kulturen im Mittel stärker positiv für CD14 waren (Caspase-3/7-negativ: Median 74,4 %; n=4/ Caspase-3/7-positiv: Median 44,2; n=4). Dagegen konnte CD80 (Caspase-3/7-negativ: Median 1,0 % n=4/ Caspase-3/7-positiv: Median 5,7%; n=3) und CCR7 (Caspase-3/7negativ: Median 0,7 %; n=4/ Caspase-3/7-positiv: Median 4,6%, n=3) vermehrt auf NK-92-sensitiven APC-Kulturen nachgewiesen werden. Für die Expression von TRAIL-Rezeptor und FAS-Ligand konnte ebenfalls kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Deutlich höher waren die Caspase-3/7-positiven APC-Kulturen für CD86 (Caspase-3/7-negativ: Median 3,2 %, n=4/ Caspase-3/7-positiv: Median 49,3 %, n=3, Mann-Whitney Test p=0,0571). Da CD86 ein bedeutendes Triggermolekül der NK-Zell-induzierten Zytotoxizität ist, ist ein linearer Zusammenhang zwischen der CD86-Expression auf den NK-92-sensitiven APC und der Apoptoseinduktion möglich. Diese Korrelation wurde untersucht und in Abbildung 18 A als lineare Regression veranschaulicht. So stieg die Caspase-3/7-Aktivität der Koinkubation von NK-92 und APC mit der Anzahl CD86+ APC (Steigung: 0,02 ± 0,004; n=7). 80 60 40 20 0 A 40 30 20 10 0 B CD86 % positive Zellen gegateter APC 100 CD80 % positive Zellen gegateter APC CD14 % positive Zellen gegateter APC % positive Zellen gegateter APC 49 80 60 40 20 0 CCR7 15 10 5 0 D C Abb. 17: Expressionsdichte der Antigene CD14 (A), CD80 (B), CD86 (C) und CCR7 (D) gegateter APC-Populationen in Prozent (%, y-Achse). (●) = Caspase-3/7-negative (Patientennummern #11137, #11151, #11081 und #10927) und (○) Caspase-3/7- positive (Patientennummern #11093, #11095, #11096, und #11216) der APC-NK-92Koinkubationen (x-Achse). Darstellung als Dotplot und Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 7 und Tabelle 8. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.4.3.2 Korrelation der CD86 Expression und IL-10 Konzentration Im nächsten Abschnitt sollte eine mögliche Ursache für die unterschiedliche CD86-Expression identifiziert werden. Da CD86 unter anderem dem Einfluss des Zytokins Interleukin-10 (IL-10) unterliegt, wurde nachfolgend die Konzentration von IL-10 in den NK-92-sensitiven und NK-92-insensitiven APC bestimmt. Hierzu wurde Interleukin-10 in den Überständen der APC-Kulturen am Immulite untersucht. Abbildung 18 B zeigt, dass die IL-10-Konzentrationen bei steigendem prozentualem Anteil der CD86 positiven Zellen in der APC-Kultur fällt (Steigung: -0,06 ± 0,02; n=6). 3.4.3.3 IL-10 in APC-Kultur Die Suszeptibilität der APC für die NK-92-induzierte Apoptose wurde mit den Konzentrationen des immunmodulatorischen Zytokins IL-10 in den APC-Kulturen verglichen. Hierbei fiel auf, dass in den APC mit geringerer 50 NK-92-induzierter Apoptose die Konzentrationen an IL-10 im Mittel höher waren als in den NK-92-sensitiven APC-Populationen. In Abbildung 18 C wird deutlich, dass die Sensitivität der APC für NK-92-induzierte Apoptose mit steigender IL-10-Konzentration im APC-Überstand abnimmt (Steigung:-0,24 ± 0,05; n=7). 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 A 0 10 20 30 40 50 B 60 2.5 6 2.0 5 IL-10 (pg/ml) im APC-Überstand NK92-APC-Apoptose Caspase-3/7 (SI) NK92-APC-Apoptose Caspase-3/7 (SI) 2.5 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.7 1.4 2.1 2.8 3.5 4.2 4.9 5.6 4 3 2 1 0 C 0 10 % CD86 APC 20 30 40 50 60 + IL-10 (pg/ml) APC-Überstand + % CD86 APC Abb. 18: CD86+-positive Zellen der gegateten APC-Populationen #11137, #11176, #11081, #11151, #10991, # 10927, #11096, #11093 und #11095 als Prozent positive APC (%, x-Achse) in Abhängigkeit von der NK-92-induzierten APC-Apoptose (Darstellung als Dubletten, y-Achse) als Stimulationsindex (SI) der Caspase-3/7-Aktivität (A). CD86+ Zellen und die Konzentration an Interleukin-10 in Pikogramm pro Milliliter (IL-10 pg/ml) im Überstand der APC-Kulturen (B). Konzentration des Interleukin-10 (IL-10) im Überstand der APC-Kultur in Pikogramm pro Milliliter (pg/ml, x-Achse) in Abhängigkeit der NK-92-induzierten APC-Apoptose (NK92-APC-Apoptose; y-Achse). Abgebildet sind die Caspase-3/7-Stimulationsindices (SI, Darstellung als Dubletten, y-Achse) der Koinkubation von Patienten-APC und NK-92 (C). R2 = 0,5977, p-Wert = 0,002 (A); R2 = 0,6665, p-Wert = 0,0475 (B); R2 = 0,6446, p-Wert = 0,001 (C). Darstellung als Dotplot und lineare Regression. Rohdaten im Anhang Tabelle 11. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.4.4 Interaktion IL-2 aktivierter Lymphozyten und APC gesunder Spender In diesem Versuch wurden unreife APC-Populationen zweier Blutspender (APC #10837; APC #10838) mit den IL-2-aktivierten Lymphozyten eines weiteren Blutspenders (Ly #10927) über drei Stunden koinkubiert und die Apoptoseinduktion der aktivierten Lymphozyten auf die APC bestimmt. Primär erfolgte die Lymphozytenpopulationen. Immunphänotypisierung der APC und 51 3.4.4.1 Phänotypisierung der APC und IL-2 aktivierter Lymphozyten-Populationen gesunder Spender Um den Phänotyp der APC von zwei gesunden Blutspendern (#10837; #10838), wie auch von den IL-2-aktivierten Lymphozyten (#10927) zu erfassen, wurden die jeweiligen Populationen gegated und analysiert. Immunphänotyp der APC-Population Die Untersuchung der beiden APC-Kulturen (#10838, #10837) zeigte insofern hinsichtlich des Phänotyps ein homogenes Muster, als beide APCPopulationen ähnlich hohe Expressionsdichten für Antigene von DC und auch für monozytäre Zellen bzw. für Makrophagen aufwiesen (Abb. 19). Charakteristisch für den dendritischen Zelltyp: beide APC-Populationen waren stark positiv für CD11c, für die intrazelluläre FAS-LigandExpression (CD178) und für CCR6. Des Weiteren waren über ein Drittel der Zellen positiv für BDCA4. Im Gegensatz dazu waren die APC negativ für BDCA2, CD1a und für den Marker aktivierter DC (CD83). Dagegen konnten auch monozytäre Marker wie CD14 und Siglec-3 (CD33) sowie das Integrin-Liganden CD11b (Komplementrezeptor 3b) nachgewiesen werden. Hinsichtlich der Differenzierung waren mehr #10838-APC positiv für CD80 sowie für extrazelluläres CCR7 (Daten nicht gezeigt). Zudem wurde eine höhere Ratio aus der mittleren Expressionsdichte von HLA-DR/HLA-I für die #10838 APC dokumentiert (APC #10837: 0,12, APC #10838: 0,26). Im Gegensatz dazu waren weniger APC der der APC #10838 positiv für das kostimulatorische B7-2 Molekül CD86. Apoptose-relevante Rezeptoren wie TRAIL-Rezeptor1 (DR4), FAS (CD95) und TNF-Rezeptor (CD120a) konnten nur auf wenigen APC der Kontrolle-2 detektiert werden, wohingegen diese Antigene auf den Zellen des ersten Probanden (APC #10837) nicht nachgewiesen werden konnten. Zusammenfassend handelte es sich bei den hier untersuchten Zellen um unreife APC, die sowohl phänotypische Eigenschaften von DC wie auch 52 von Makrophagen zeigten. Dabei waren die APC-#10838 stärker positiv für Reifemarker als auch für apoptoseinduzierende Rezeptoren. % positive Zellen gegateter APC-Population 100 APC # 10837 APC # 10838 80 60 40 20 0 14 D33 CD C 1 CD 1b R RI 4 6 I 1 L 0 c 86 A- LA-D IL- FA S FR S- CCR D8 CD 11 DCA L A A C D H F B H TN C TR Abb. 19: Prozent (%) positive Zellen der gegateten APC-Populationen (#10837, #10838, yAchse) für die Antigene CD14, CD33, CD11b, CD11c, BDCA4, FAS-L (intrazellulär), CCR6 (intrazellulär), CD80, CD86, HLA-I, HLA-DR, TRAIL-Rezeptor1 (DR4), FAS (CD95) und TNF-R1 (CD120a) (x-Achse) zweier gesunder Spender (APC #10837 und APC #10838). Universitätsklinikum Ulm 2009. Immunphänotyp der IL-2-aktivierten Lymphozyten Die IL-2-aktivierten Lymphozyten eines weiteren gesunden Probanden (#10927) wurden aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes angereichert und mit Interleukin-2 (IL-2) stimuliert. Die phänotypische Analyse der gegateten Lymphozyten ergab, dass diese Population aus aktivierten T-Zellen (CD3+, TCRa/b+, CD4+, CD8+, CD25+), aber auch aus NK-Zellen (CD56+, CD16+, NKp30+, CD94+) bestand. 53 Die zytoplasmatische Untersuchung der isolierten Lymphozyten zeigte, dass nahezu alle Zellen aktives Granzym B enthielten und partiell positiv für Perforin und TRAIL waren. Gleichzeitig konnte kein intrazelluläres FAS-L (CD178) nachgewiesen werden. Tab. 2: Antigenexpression der gegateten Lymphozyten-Population des Blutspenders #10927 als Prozent positive Zellen (% gegated). Universitätsklinikum Ulm 2009. Oberflächenantigen CD4 CD8 CD16 CD56 CD2 % gegated 81,9 20,8 12,2 30,5 86,9 Oberflächenantigen CD3 TCR a/b NKp30 CD94 CD25 % gegated 93,9 92,8 94,1 10,2 51,3 Zytoplasmatisches Antigen GZMB Perforin CD178 TRAIL CD25 % gegated 91,0 6,6 0,0 23,5 44,8 3.4.4.2 Caspase-Assay von APC mit allogenen, IL-2 aktivierten Lymphozyten gesunder Spender Die APC-Populationen zweier gesunder Probanden (APC #10837; APC #10838) wurden jeweils mit den IL-2 aktivieren Lymphozyten eines weiteren gesunden Spenders (Ly #10927) koinkubiert und die Apoptoserate mittels Caspase-3/7-Aktivität detektiert. Die Assays wurden als Dubletten angelegt. Wie in Abbildung 20 dargestellt, kam es bei einem der beiden APC-Spender zu einer Steigerung (APC #10837), bei dem anderen zu einer Abnahme der Caspase-3/7-Aktivität (APC #10838). Aufgrund dessen, dass in beiden Versuchen die aktivierte LymphozytenPopulation desselben Spenders (Ly #10927) zum gleichen Zeitpunkt eingesetzt wurde, liegt es nahe, dass nicht das zytotoxische Potential der Lymphozyten entscheidend für die fehlende APC-Apoptose war, sondern die Eigenschaften der APC-Kulturen den Ausschlag gaben. So war die unreife APC-Kultur #10837 stärker positiv für CD86 und gleichzeitig negativ für Todesrezeptoren (Abb. 19). Im Apoptose-Assay mit den zytotoxischen Lymphozyten war die APC #10837 mit einer Stimulation der 54 Caspase-3/7-Aktivität (1,13 SI) – verglichen mit der APC #10838 (0,94 SI) - sensitiver für die Angriffe der zytotoxischen Lymphozyten. Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 1200000.0 900000.0 600000.0 300000.0 0.0 C AP 837 #10 Ko 0927 y #1 +L C AP 838 #10 Ko 0927 y #1 +L Abb. 20: Apoptoseinduktion als Lumineszenz der Caspase-3/7-Aktivität in RLU (Relative Light Units; y-Achse) durch die IL-2-aktivierten Lymphozyten des Blutspenders (Ly #10927) mit den unreifen APC der Blutspender #10837 und #10838 im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (Ko). Darstellung als Mittelwert und Standardabweichung. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.4.5 Interaktion IL-2 aktivierter Lymphozyten und PatientenAPC 3.4.5.1 Phänotypisierung der APC und IL-2 aktivierter Lymphozyten von Patient #11235 Analog zu der Zell-induzierten Apoptose durch IL-2 aktivierte Lymphoyzten in gesunden Spendern wurde die Zell-induzierte Apoptose in verschiedenen Patienten untersucht. Die unreifen APC und IL-2- aktivierten Lymphozyten wurden aus einem Patienten (#11235) mit 55 Hämophagozytosesyndrom isoliert und kultiviert, um sie dann im Apoptose-Assay zu überprüfen. Phänotypisierung der IL-2-aktivierten Lymphozyten Die Lymphozytenpopulation des ersten Patienten (#11235) mit Hämophagozytosesyndrom zeigte am Tag 36 der Zellkultur in der Durchflusszytometrie einen prozentual hohen Anteil zytotoxischer T-Zellen (CD8+) sowie auch CD16+ und CD56+ NK-Zellen (Tab. 3). Die intrazelluläre Analyse ergab einen hohen Anteil an Perforin, TRAIL und FAS-Ligand positiven Zellen, während aktives Granzym B (GZMB) nicht detektiert wurde. Die APC-Kultur dieses Patienten konnte aufgrund der geringen Zellzahl in der Probe nicht phänotypisiert werden. Tab. 3: Antigenexpression der gegateten Lymphozyten-Population als Prozent positive Zellen (% gegated). Universitätsklinikum Ulm 2009. Oberflächenantigen CD4 CD8 CD16 CD56 CD2 % gegated 33,8 42,5 2,3 22,9 0,0 Oberflächenantigen CD3 TCR a/b NKp30 CD94 CD25 % gegated 95,4 66,6 13,7 0,1 9,6 Zytoplasmatisches Antigen GZMB Perforin CD178 15,3 96,5 % gegated 0,5 TRAIL 46,5 CD25 2,5 3.4.5.2 Caspase-3/7-Assay der IL-2 aktivierten Lymphozyten und APC des Patienten #11235 Die Koinkubation der Patienten-APC mit autologen, IL-2-aktivierten TZellen wurde am Tag 35 der Zellkultur am Luminometer untersucht. In Abbildung 21 konnte gezeigt werden, dass die Koinkubation zytotoxischer Lymphozyten mit den autologen APC zu einer deutlichen Stimulation der mittleren Caspase-3/7-Aktivität führte (2,79SI). 56 Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 30000 20000 10000 0 Ko y + L 5 Cs AP #1 #1 5 123 123 Abb. 21: Apoptose in Lumineszenz der Caspase-3/7-Aktivität als RLU (Relative Light Units; y-Achse) durch die IL-2-aktivierten Lymphozyten des Patienten #11235 mit Hämophagozytosesyndrom mit dessen autologen, unreifen APC im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (Ko). Darstellung als Mittelwert und Standardabweichung. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.4.5.3 Phänotypisierung der APC und IL-2 aktivierten Lymphozyten von Patient #11137 Für diesen Ansatz wurden Lymphozyten und autologe APC aus mono- nukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) eines Patienten mit Prostatakarzinom isoliert. Die unreifen APC dieses Patienten (#11137) wurden in einem weiteren Versuch der Apoptoseinduktion durch die Killerzellinie NK-92 ausgesetzt. Primär folgt die Typisierung der autologen Lymphozyten- und APC-Populationen. Phänotypisierung der IL-2-aktivierten Lymphozyten Die isolierten Lymphozyten von Patient #11137 wurden über 30 Tage mit IL-2 aktiviert und danach hinsichtlich ihres Expressionsprofils am Durchfluss-Zytometer untersucht (Tab. 4). Die Analyse der fluoreszenzmarkierten Antikörper dieses Patienten mit Prostatakarzinom ergab, dass - verglichen mit Patient #11235 - weniger zytotoxische Lymphozyten (CD8+) in dessen Zellpopulation nachweisbar waren. Jedoch 57 war der Anteil an NK-Zellen (CD16+; CD56+) sowie der Anteil an Granzym B- und Perforin-positiven Zellen höher. Der prozentuale Anteil für TRAIL und FAS-Ligand war vergleichbar mit Patient #11235. Tab. 4: Antigenexpression der gegateten Lymphozyten-Population des Patienten-2 mit Prostatakarzinom in Prozent positiver Zellen (% gegated). Universitätsklinikum Ulm 2009. Oberflächenantigen CD4 CD8 CD16 CD56 CD2 % gegated 74,1 13,6 15,7 20,8 93,4 Oberflächenantigen CD3 TCR a/b NKp30 CD94 CD25 % gegated 85,9 84,8 90,2 13,4 70,4 Zytoplasmatisches Antigen GZMB Perforin CD178 TRAIL CD25 % gegated 88,0 58,5 89,3 34,4 69,5 Phänotypisierung der APC von Patient #11137 Die APC-Kultur des Patienten mit Prostatakarzinom war mit der APC eines dendritischen Phänotyps vereinbar, wobei auch viele Zellen für monozytäres CD14 positiv waren (Tab. 5). Die Expressionsdichte für HLADR war - verglichen mit anderen APC – hoch, und die Ratio von HLA-DR zu HLA-I war mit 1,8 ebenfalls deutlich erhöht. Auch CD86, ein kostimulatorisches Molekül, war in dieser Population exprimiert, weshalb es sich bei diesen APC um eine relativ ausdifferenzierte Population handelt. Tab. 5: Antigenexpression der gegateten APC-Population des Patienten-2 mit Prostatakarzinom als Prozent positive Zellen (% gegated). Universitätsklinikum Ulm 2009. Oberflächenantigen CD14 CD11b % gegated 94,8 96,6 93,5 Oberflächenantigen CD80 CD86 HLA-I 1,4 60,5 98,5 % gegated CD64 BDCA4 CCR7 DR4 91,4 2,7 0,5 CD88 CD47 1,0 57,6 HLA-DR 98,1 58 3.4.5.4 Caspase-3/7-Assay der IL-2 aktivierten Lymphozyten und APC von Patient #11137 Die Koinkubation der APC mit der autologen Lymphozytenpopulation resultierte in einer relativ schwach ausgeprägten Apoptoserate (SI=Stimulationsindex) der APC (Abb. 22). Die mittlere Stimulation des als der Caspase-3/7-Aktivität lag bei 1,15SI. Caspase-3/7 Lumineszenz (RLU) 15000 10000 5000 0 Ko y C AP 7 113 #1 +L 7 113 #1 Abb. 22: APC-Apoptose von Patient #11137 (APC #11137) durch autologe, IL-2-aktivierte Lymphozyten (Ly #11137), verglichen mit der Kontrolle (Ko; x-Achse). Caspase-3/7Aktivität als Lumineszenz (Lumineszenz in Relative Light Units; y-Achse). Darstellung als Mittelwert und Standardabweichung. Universitätsklinikum Ulm 2009. 59 3.5 Purinerge Rezeptorstimulation unreifer APC 3.5.1 P2RX7-Genotyp kultivierter APC Der P2X7-Rezeptor ist ein auf monozytären Zellen exprimierter purinerger Rezeptor, dem eine entscheidende Rolle hinsichtlich der Apoptoseinduktion und der Inflammationsreaktion zugeschrieben wird. Im folgenden Abschnitt wurden die kultivierten APC auf funktionsrelevante Einzelnukleotidpolymorphismen des P2RX7 untersucht. 3.5.1.1 Häufigkeit funktioneller SNPs des P2RX7 in gesunder Population Die Häufigkeit der beiden funktionellen SNPs SNP489 und SNP1513 des P2RX7 wurden in 522 gesunden Probanden einer süddeutschen Bevölkerung auf diese beiden Polymorphismen getestet. Dabei waren 65,5 % für den „„gain-of-function““ Polymorphismus SNP489 C→T mutiert und 34,9 % für den „„loss-of-function““ SNP1513A→C. Eine genauere Unterteilung der Polymorphismen in heterozygote und homozygote Mutationen der jeweiligen SNPs zeigte, dass 45,0 % homozygot und 20,5 % heterozygot für SNP489 und 31,2 % homozygot und 3,6 % heterozygot für SNP1513 waren. Der Fokus dieser Arbeit lag unter anderem auf den Eigenschaften von Zellen, die SNP489 und SNP1513 mutiert waren. 3.5.1.2 SNPs des P2RX7 bei Patienten Analog zur Untersuchung der gesunden Kontrolle wurden die Häufigkeiten der „gain“- und „„loss-of-function““ SNPs bei 45 Patienten mit immunologischen Erkrankungen wie Hämophagozytose, MAS, Fibromyalgie, Sepsis und auch bei Patienten mit malignen Veränderungen bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Patienten einen höheren Anteil an funktionellen Polymorphismen hatten. Analog war die Häufigkeit des Wildtyps der SNPs in den Patienten minimiert. Die genaue 60 Analyse ist in Tabelle 6 dargestellt. Tab. 6: Häufigkeit der Einzelnukleotidpolymorphismen des P2RX7-Rezeptors in einer gesunden süddeutschen Population und in dem hier untersuchtem Patientenkollektiv dargestellt in Prozent (%), n = nicht untersucht. P2RX7-Genotyp 3.5.2 SNP489 C>T SNP1513 A>C Kontrolle % Patienten % wt wt 29,7 % 20,0 % wt mut 4,8 % 4,4 % mut wt 35,4 % 42,2 % mut mut 30,1 % 35,5 % n mut 34,9 % 37,8 % mut n 65,5 % 75,6 % ATP-induzierte Caspaseaktivität kultivierter APC Der Effekt von ATP auf die unreifen APC wurde anhand der Freisetzung der Initiatorcaspase-8 und -9 und der Effektorcaspasen-3/7 bestimmt. Die Messung der Initiatorcaspasen diente der Identifikation einer möglichen Apoptosekaskade über den mitochondrialen Weg (Caspase-9) oder über eine Caspase-8-abhängige Kaskade. Die APC wurden über drei Stunden mit 1mM ATP stimuliert und die Caspase-Freisetzung mittels Lumineszenz-Assays mit der spontanen Caspase-Freisetzung verglichen. Als Positivkontrolle wurde 4 µM Staurosporin (STS) verwendet. STS ist in der Lage, eine Caspase-3/7 und -8-assoziierte Apoptose zu induzieren (Ferrari et al. 1998; Nicolier et al. 2009). Die ATP-und STS-induzierte Caspase-Freisetzung ist in Abbildung 23 dargestellt. Die ATP- und auch die STS-Stimulation der APC-Kulturen resultierte in keiner Änderung der Caspase-8-Aktivität (Median ATP: 1,1 SI, Median STS: 1,1 n=18). Auch der mitochondriale Weg der Caspase-Initiation über Caspase-9 wurde durch ATP nur sehr gering, durch die Positivkontrolle STS jedoch deutlicher stimuliert (Median ATP: 1,1 SI; Median STS: 1,7 SI; n=7). Für die Effektorcaspase-3/7 konnte durch ATP eine tendenzielle Inhibition und 61 durch STS eine deutliche Stimulation nachgewiesen werden (Median ATP: 0,9 SI; Median STS: 1,8 SI; n=21). Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3/7 ATP ATP STS ATP 4 Stimulationsindex 3 2 1 0 STS STS Abb. 23: Induktion der Caspaseaktivität nach ATP- und STS-Stimulation. Die APCKulturen wurden über 3h mit 1mM ATP oder 4 µM Staurosporin (STS) inkubiert (xAchse) und die Änderung der Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-3/7-Aktivität zur unbehandelten Kontrolle als Stimulationsindex (SI, y-Achse) dokumentiert. Darstellung als Dotplot und Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 12-14. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.5.2.1 ATP-induzierte Caspaseaktivität und SNPs des P2RX7 Die ATP- und STS-induzierte Caspaseaktivität wurde hinsichtlich des P2RX7-Genotyps der unreifen APC-Populationen untersucht. Hierbei wurden die induzierten Caspasen-3/7,-8 und -9 des Wildtypes (n=5) mit den funktionellen Polymorphismen SNP489 (n=4), SNP1513 (n=1) und der 62 Kombination aus SNP489 und SNP1513 (SNP489/1513; n=4) verglichen (Abb. 24). Die ATP-Stimulation der unterschiedlich mutierten APC führte im Vergleich zum Wildtyp zu keiner signifikanten Änderung der CaspaseModulation. Wie bereits in Vorexperimenten gezeigt, konnte keine Caspase-Freisetzung durch ATP induziert werden (Abb. 23). Entsprechend lag der Median der Stimulation durch ATP von Caspase-8 und Caspase3/7 im Wildtyp bei jeweils 1,1 SI und 1,0 SI, siehe Abb. 24. Der Median des „„gain-of-function““ SNP489 unterschied sich ebenfalls nur gering vom Wildtyp und zeigte eine Inhibition von Caspase-8 und keine Stimulation von Caspase-3/7 (0,9 SI; 0,9 SI). Der Median der APC Kultur des „„loss-offunction““ SNP1513 lag nach Addition von ATP bei 1,0 SI für Caspase-8 und bei 0,8 SI für Caspase-3/7. Der mutierte Haplotyp für SNP489 und SNP1513 führte in den vier untersuchten APC-Kulturen zu einer Inhibition der Caspase-8 und Caspase-3/7 von 0,7 SI bzw. 0,9 SI (Median). 3.5.2.2 STS-induzierte Caspaseaktivität und SNPs des P2RX7 Als Positivkontrolle für die Caspase-Freisetzung wurden 4 µM Stauro- sporin eingesetzt. Staurosporin führte in allen APC-Kulturen zu einer mittleren Aktivierung der Effektorcaspase-3/7 und auch die Induktion der Initiatorcaspase-8 wurde in nahezu allen Populationen detektiert. Lediglich in zwei SNP489/1513 mutierten APC-Populationen wurde keine Steigerung der Caspase-8-Aktivität dokumentiert. Wie in Abb. 24 dargestellt, führte Staurosporin im Wildtyp (n=3-4) zu einer deutlichen Stimulation von Caspase-8 (Median: 3,2 SI) und Caspase-3/7 (Median 5,5 SI). Die für SNP489 mutierten APC (n=4) zeigten eine Caspase-8 und Caspase-3/7-Freisetzung von jeweils 1,6 SI (Median) beziehungsweise (Median 2,1 SI). Die SNP1513 mutierte APCKultur wies eine Aktivierung der Caspase-8 1,0 (Median) und der Caspase-3/7 von Interessanterweise 3,8 SI war der nach Median STS-Inkubation der (Median) Caspase-Freisetzung auf. von 63 SNP489/1513 mutierten APC - verglichen mit dem Wildtyp deutlich niedriger (Caspase-8: 0,9 SI, Caspase-3/7: 1,7 SI). Wildtyp SNP 489 SNP1513 SNP489/1513 10 ATP Stimulationsindex 8 STS 6 4 2 0 /7 -8 ase ase-3 p s Ca Casp /7 -8 ase ase-3 p s Ca Casp /7 -8 ase ase-3 p s Ca Casp /7 -8 ase ase-3 p s Ca Casp Abb. 24: ATP- und STS-induzierte Caspase-Modulation der P2RX7-Genotypen. APCKulturen des P2RX7 Wildtyp, SNP489, SNP1513, sowie SNP489 assoziiert mit SNP1513 (SNP489/1513) wurden über 3 h mit 1 mM ATP oder 4 µM Staurosporin (STS) inkubiert (x-Achse). Die jeweilige Stimulation durch ATP oder STS wurde als Stimulationsindex (SI) von Caspase-8 und Caspase-3/7 (y-Achse) zur unbehandelten Kontrolle erfasst. Darstellung als Dotplot und Universitätsklinikum Ulm 2009. Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 12-14. 64 3.5.2.3 Effekt von CsA und ATP auf die STS-induzierte APCCaspase-3/7-Aktivität Der Effekt von ATP und Cyclosporin A (CsA) wurde zum einen auf die Spontan-Apoptoserate und zum anderen auf die Staurosporin-induzierte Apoptose der genotypisierten APC untersucht. Die Apoptose wurde durch die induzierte Freisetzung von Caspase-3/7 als Stimulationsindex erfasst. Dabei konnte kein eindeutiger Effekt von ATP auf die spontane Caspase3/7-Aktivität dokumentiert werden (Daten nicht gezeigt). Jedoch führte ATP (1,0 SI), mehr noch CsA (0,7 SI) wie auch die Kombination von ATP mit CsA (0,7 SI)- zu einer deutlichen Abnahme der durch Staurosporin (STS) induzierten Apoptose (1,8 SI) (Abb. 25). Der Effekt der jeweiligen Stimulationen war unabhängig von den hier untersuchten SI der Caspase-3/7-Aktivität Polymorphismen des P2X7-Rezeptors. 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 S ST S+ ST P AT S+ ST A Cs S+ ST A s +C P AT Abb. 25: Caspase-3/7-Aktivität der unreifen APC nach dreistündiger Stimulation durch Staurosporin (STS), durch die Kostimulation mit Adenosintriphosphat (STS+ATP), Cyclosporin A (STS+CsA) und ATP plus Cylosporin A (STS+ATP+CsA) (SI, y-Achse). Darstellung als Dotplot und Universitätsklinikum Ulm 2009. Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 15-16. 65 3.5.3 Elektrophysiologie kultivierter APC Mit Hilfe des Patch-Clamping wurde die Ionenflussaktivität des P2X7- Rezeptors während der ATP-Stimulation erfasst. Die kultivierten APC wurden fünf Mal mit ATP-stimuliert und das maximale und mittlere Signal dokumentiert. Um genetische Auswirkungen des P2RX7-Genotyps auf die Aktivität der P2RX7-Pore zu berücksichtigen, wurden die untersuchten APC-Populationen hinsichtlich zweier funktioneller Einzelnukleotid- polymorphismen (SNP) mittels der MIA-Methode genotypisiert. 3.5.3.1 Elektrophysiologie und SNPs des P2RX7 Die genetischen Varianten der 489 C→T (n=1), 1513 A→C (n=1) und der gleichzeitigen Mutation für SNP489 und SNP1513 des P2RX7 (n=4) sowie deren Wildtypen (n=6) wurden genotypisch analysiert. In Abhängigkeit der Polymorphismen wurden die APC auf die ATP-induzierten elektrophysiologischen Charakteristika mit der Patch-Clamp Methode analysiert. Für die APC-Kulturen mit der SNP489 C→T Mutation konnten hierbei höhere Signale als im Wildtyp dokumentiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten die APC mit dem SNP1513 A→C wie auch die APC mit der gleichzeitigen Mutation für SNP489 C→T mit SNP1513 A→C schwächere Patchsignale (Abb. 26). 3.5.3.1.1 Elektrophysiologie der ATP- und CsA- Stimulation Da CsA (Cyclosporin A) bereits den Ethidium-Influx von P2X-defizienten Makrophagen stimulieren konnte, wurde ein möglicher elektro- physiologischer Effekt von CsA mit der Patch-Clamp Technik untersucht. Hierzu wurden die APC nach fünfmaliger ATP-Applikation (1 mM) zweimalig mit 100 µM Cyclosporin A kostimuliert. Dabei zeigte sich, dass einige APC-Kulturen unter dem Einfluss von Cyclosporin A mit einer Verstärkung des Patch-Signals reagierten, während andere APC durch CsA eine geringere Signalantwort erfuhren. Die genotypische Analyse der Patchclamp-Messung zeigte, dass die SNP489/1513 mutierte APC- 66 Population mit einer verstärkten CsA-Antwort reagierte, wohingegen der Wildtyp durch CsA keine Stimulation erfuhr (Abb. 26). Um diesen Zusammenhang näher zu untersuchen, folgten CsA-ATP-Kostimulationen von APC-Kulturen verschiedener P2RX7-Genotypen. Abb. 26: Stimulation der unreifen APC für 5s (Sekunden, x-Achse) mit 1 mM ATP in Nanoampere (nA; y-Achse). Gezeigt sind die 1., 3. und 5. Stimulation mit ATP (graue Linie), der Maximalwert der Messung (schwarze Linie) sowie die Stimulation des Wildtyps und der SNP489/1513 mutierten APC mit 100 µM Cyclosporin A (rote Linie). Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.5.3.1.2 P2RX7- Genotyp und CsA-Antwort Inwiefern der P2RX7-Genotyp mit der oben dokumentierten CsA-Antwort assoziiert ist, wurde nachfolgend untersucht. Hierzu wurden die ATP- und CsA-induzierten Maximalwerte der funktionellen Polymorphismen des P2RX7 miteinander verglichen. Dabei fiel auf, dass der Median der CsAAntwort von Wildtyp-APC (ATP: 6,4 nA/ ATP+CsA: 6,3 nA; n=5) sowie von SNP489-mutierten APC (ATP: 9,0 nA/ ATP+CsA: 8,1 nA; n=1) und SNP1513-mutierten APC (ATP: 5,0 nA/ ATP+CsA: 4,3 nA; n=1) keine Reaktion auf CsA zeigten oder mit einer Reduktion des Maximalsignals reagierten. Dahingegen zeigte der Median der APC mit Mutationen für SNP489 mit SNP1513 (ATP: 3,7 nA/ ATP+CsA: 4,2 nA; n=6) eine Verstärkung des Signals (Abb. 27). 67 Maximum der Stimulation in nA 10 ATP ATP + CsA 8 6 4 2 0 SNP489 - + - + SNP1513 - - + + Abb. 27: Maximale Patch-Signale der APC der Patienten nach ATP, sowie nach gleichzeitiger Stimulation mit CsA als Nanoampere (nA; y-Achse) in Wildtyp (#7986, #11039, #11081, #11215, #11217), SNP489 (#7539), SNP1513 (#11263) und SNP489 in Kombination mit SNP1513-mutierten APC (#7963, #8129, #9077, #9108, #11053, #11263) (x-Achse). Darstellung als Dotplot und Median. Rohdaten im Anhang Tabelle 17. Universitätsklinikum Ulm 2009. 3.5.3.1.3 ATP- und CsA-Stimulation der APC mit SNP489/1513 In der Zusammenschau fiel auf, dass APC mit dem Polymorphismus für SNP489 und SNP1513 (SNP489/1513) (mut) - verglichen mit dem Wildtyp (wt) - niedrigere ATP-induzierte Signale aufwiesen (Median der wt-APC: 105,4 pA/pF; Median mut-APC: 29.61 pA/pF). Dieser Zusammenhang wurde in fünf Wildtyp APC und sieben APC mutiert für den Einzelnukleotidpolymorphismus 489 C→T/1513 A→C in Abbildung 28 A 68 dargestellt. Der Mann-Whitney Test ergab eine signifikante Reduktion der ATP-induzierten Stromdichte in SNP489/1513 mutierten APC (p=0,0025). Parallel dazu führte die Stimulation mit ATP und Cyclosporin der mutierten APC zu einer deutlichen Verstärkung des Signals (Median von Ratio ATP+CsA/ATP in wt: 1,4 und in mut: 3,5). Der Mann-Whitney Test zeigte einen signifikanten Unterschied von p=0,0079. Dieser 7 180 Ratio (CsA+ATP)/ATP der APC Stimulation der APC mit ATP in pA/pF Zusammenhang ist in Abbildung 28 B dargestellt. 120 60 5 4 3 2 1 0 0 A 6 wt m ut B wt m ut Abb. 28: Stromdichte in Picoampere pro Picofarad (pA/pF; y-Achse) nach der Stimulation mit 1 mM Adenosintriphosphat (ATP) der Wildtyp–APC (wt) (#7986, #11039, #11081, #11215, #11217) und gleichtzeitig SNP489/1513 mutierten APC (mut) ( #7963, #8129, #8815, #9108, #9077, #11053, #11263) als Dotplot und Median (A). Effekt von Ciclosporin A (CsA) auf die Stromdichte (pA/pF) als Ratio von ATP plus CsA gegenüber der alleinigen ATP-Stimulation (Ratio ATP+CsA/ATP; y-Achse) in Wildtyp-Patienten (#7986, #11039, #11081, #11215, #11217) und SNP489/1513 mutierten Patienten (#7963, #8815, #9077, #11053, #11263) auf der x-Achse als Dotplot mit Median (B). Rohdaten im Anhang Tabelle 17. Universitätsklinikum Ulm 2009. 69 4. Diskussion 4.1 Phänotyp kultivierter PBMC Die phänotypische Analyse der kultivieren PBMC zeigte, dass die kulitiverten PBMC typische Marker für APC exprimierten. Die APC hatten einen unreifen Phänotyp (CCR7-), der primär Antigene von myeloiden DC (CD11c+, CD178+) und zugleich Antigene von Monozyten und Makrophagen (CD14+) exprimierte. Verglichen mit den gesunden APCKontrollen waren die Patienten-APC ähnlich positiv für CD14 und HLADR, wohingegen CD11c deutlich stärker exprimiert wurde. Jedoch waren die Patienten-APC schwächer positiv für die Reifemarker wie CD80 und CD86. Die Expression von CD1a war in der Patienten- und Probandenpopulation vergleichbar gering. 4.2 NK-Zellsubpopulation und unreife APC Die Analyse der NK-Zellpopulation im Vollblut der Probanden ergab, dass Patienten mit geringerer Anzahl an NK-Zellen vermehrt unreife APC in der APC-Zellkultur aufwiesen. Zytotoxische Zellen, unter ihnen die NK-Zellen, sind in der Lage, die Populationsgröße der APC durch Initiierung des Zelltodes zu minimieren. Die hier erbrachten zytotoxischer Zellen Ergebnisse als Kontrollinstanz Populationen unterstreichen. Ist geringere NK-Zellpopulation Auswirkungen auf den könnten ihre unreifer die gegenüber APC. hat APC- durch eine dies Diese Bedeutung unreifen Kontrollfunktion geschwächt, Pool somit womöglich könnten ohne ausreichende Limitierung durch NK-Zellen in einer größeren Anzahl in vivo persistieren. So konnte bereits nachgewiesen werden, dass die Anzahl unreifer DC in Lymphknoten von Mäusen durch NK-Zellen reguliert wird (Giroux et al. 2007). Außerdem scheint eine genetische oder erworbene NK- 70 Zelldysfunktion verantwortlich für die Persistenz von Viruserkrankungen sowie für die Proliferation unreifer APC im Rahmen von hämophagozytotischen Erkrankungen zu sein (Schneider et al. 2003). Auch in weiteren Krankheitsbildern war die Regulation der unreifen APC durch NK-Zellen herabgesetzt und ist somit kennzeichnend für die Bedeutung der zellulären Kontrolle von APC durch NK-Zellen (Fauriat et al. 2005, Walzer et al. 2005). In dem ersten Teil der Arbeit lag der Fokus auf der Interaktion von unreifen APC mit den NK-Zellen, beziehungsweise IL-2-aktivierten Lymphozyten. Die Interaktion der Effektor- und Zielzellkonstellationen wurde über verschiedene Verfahren visualisiert. In diesem Zusammenhang wurde die Zell-induzierte Apoptose dieser Effektorzellen auf unreife APC-Populationen durch einen Apoptose-Assay dokumentiert. Die unreifen APC wurden aus gesunden Probanden und Patienten mit immunologischen Erkrankungen isoliert und mit der Zelllinie NK-92 sowie autologen oder allogenen Interleukin-2 stimulierten Lymphozyten koinkubiert. Die Interaktion dieser Effektor- und Zielzellen wurde zum einen durch den Caspase-Assay und zum anderen parallel dazu auch licht- und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Die parallele mikroskopische Dokumentation der Apoptose diente dazu, die gemessene Caspase-Freisetzung nach der Koinkubationen den unreifen APC zuordnen zu können. 4.3 Morphologie Um das Anreichern unreifer APC näher zu untersuchen, wurde die Interaktion der unreifen APC mit den verschiedenen Effektorzellen licht-, fluoreszenz- und elektronenmikroskopisch untersucht. Dabei konnten drei unterschiedliche Kontaktverhalten dokumentiert werden. 71 4.3.1 Kontaktverhalten I Das Kontaktverhalten I zeichnet sich durch das kappen-artige Aufsetzen der Effektorzellen (NK-Zellen und IL-2 aktivierte Lymphozyten) aus. Diese Form der immunologischen Synapse wurde primär bei den hoch zytotoxischen NK-92 mit den unreifen APC, wie auch bei den NK-92 mit den K562 beobachtet vergleichbar mit der (siehe Kontaktverhalten schon oft I Abb. 7). beschriebenen Sie ist zytotoxischen immunologischen Synapse von NK- und Zielzellen (Vyas et al. 2001). Da die Effektorzellen NK-92 stark positiv für Granzym B und Perforin sind (Abb. 13) und der schnelle Zielzelltod durch Granzym und Perforin ausgelöst wird, kann davon ausgegangen werden, dass die Zielzellen APC und K562 über einen Granzym B-abhängigen Zelltod getötet wurden (Maki et al. 2001). Zudem ist die leukämische Zelllinie K562 aufgrund fehlender Todesrezeptoren resistent gegenüber dem Rezeptor-vermitteltem Zelltod und so liegt es nahe, dass dem kappen-artigen Kontaktverhalten I ein Granzym B-induzierter Zelltod zu Grunde liegt (Hietakangas et al. 2003). 4.3.2 Kontaktverhalten II Ein weiteres Interaktionsmuster wurde als Kontaktverhalten II bezeichnet. Diese Form beschreibt das weite Hineinreichen der Effektorzellen in das Zytoplasma der APC. Dieses Muster wurde unter anderem bei Perforinmutierten (Pf -/-), IL-2 aktivierten Lymphozyten mit unreifen APC dokumentiert. Folglich ist es möglich, dass der Zelltod über einen Todesrezeptor-abhängigen Weg (CD95, TRAIL-R oder TNF-R) initiiert wird, oder aber diese Form der Interaktion nicht zum Zelltod der Zielzelle führt. In einigen Fällen wurden die Effektorzellen komplett von den unreifen APC aufgenommen. Dies konnte in der Fluoreszenzmikroskopie durch verschiedene Schnittebenen und in der Elektronenmikroskopie durch die Darstellung der umschließenden APC-Membran belegt werden (Abb. 9). Eine solche Form der Zell-in-Zell-Interaktion wurde bereits von NK-Zellen 72 mit Tumorzelllinien beobachtet (Xia et al. 2008, Wang et al. 2009). Möglicherweise führt das Umschließen der zytotoxischen Zellen zur Ausschaltung der Effektorzelle und begünstigt somit das Tumorwachstum. Es bleibt jedoch fraglich, ob die Internalisation von zytotoxischen Zellen durch unreife APC – wie in dem hier geschilderten Kontext - die Akkumulation der APC zur Folge haben kann. Zwar könnte die Internalisation zum Ausschalten der zytotoxischen Zellen führen und somit das Überleben der unreifen APC durch die fehlende Limitierung durch NK-Zellen begünstigen, jedoch ist die Internalisation ein Phänomen, was prozentual gesehen im unteren einstelligen Bereich lag. Somit ist es unwahrscheinlich, dass die relativ minimale Dezimierung von NK-Zellen allein ursächlich für die fehlende APC-Regulation ist. Nichtsdestotrotz könnte dieser Mechanismus einen Gegenangriff der APC darstellen, der es ihnen ermöglicht, der Regulation durch zytotoxische Zellen zu entgehen. Zudem könnte die Internalisation, wie bereits in Melanomzellen gezeigt, unter schwierigen Konditionen einen Überlebensvorteil durch aufgenommene T-Zellen bieten (Lugini et al. 2006). Festzuhalten bleibt, dass der genaue Mechanismus der hier dokumentierten EffektorzellInternalisierung genauer untersucht und hinsichtlich der möglichen Zellin-Zellphänomene - wie Emperipolese, Entose oder andere Prozesse eingeordnet werden muss (Overholtzer et al. 2007, Xia et al. 2008). 4.3.3 Eine Kontaktverhalten III besondere Form der immunologischen Synapse wurde als Kontaktverhalten III deklariert. Hier kam es bei den Effektorzellen (IL-2 aktivierte Lymphozyten und teilweise auch NK-92) zu einem hakenförmigen Fortsatz, der sich in Richtung des Zielzellkerns ausrichtete. Die Bedeutung dieses Interaktionsmusters bleibt offen. (APC) 73 4.4 Zell-induzierte Apoptose 4.4.1 NK-92-induzierte Apoptose und Zytotoxizität Die Koinkubation von NK-92 mit der leukämischen Zielzelle K562 resultierte in einer deutlichen Apoptose der K562. Die Apoptose wurde in einem Assay durch den Anstieg der Caspase-3/7-Aktivität detektiert. Um die Caspaseinduktion der Apoptose der Zielzelle zuordnen zu können, wurden Diese zusätzlich Aufnahmen fluoreszenzmikrokopische zeigen das Blebbing Aufnahmen der K562 angefertigt. während der Koinkubation mit der Killerzelllinie NK-92. Parallel dazu wurde die Zytotoxizität der NK-92 mittels eines LDH-Assays untersucht. Die NK-92 führte zur Lyse der K562, was durch den Anstieg der LDH-Aktivität bestätigt wurde. Die detektierte Zytotoxizität war jedoch geringer als die erfasste Apoptoserate, weshalb für die folgenden Untersuchungen der Apoptose-Assay eingesetzt wurde. 4.4.2 NK-92-induzierte Apoptose der APC gesunder Probanden Die dreistündige Koinkubation von NK-92 und APC gesunder Blutspender führte zu einem deutlichen Anstieg der Caspase-3/7-Aktivität. Die Etablierung der Zelllinie NK-92 für den Apoptose-Assay erfolgte zum einen, da sich die Anreicherung von NK-Zellen in den IL-2-aktivierten Lymphozytenpopulationen schwierig gestaltete. Zum anderen stellt die stabile Zytotoxizität der nicht MHC-restringierten NK-92-Zelllinie eine konstante Größe im Apoptose-Assay dar. Durch die Abwesenheit nahezu aller inhibitorischen Rezeptoren hat die NK-92 ein hohes zytotoxisches Potenzial. Lediglich KIR2DL4, NKG2D und ILT2 (CD85J) werden als inhibitorische Rezeptoren von ihr exprimiert (Maki et al. 2001). Auch weisen die NK-92 eine hohe Konzentration an Granzym B und Perforin auf, was ihre Zytotoxizität zusätzlich verstärkt. Die induzierte Apoptose durch NK-92 beruht maßgeblich auf dem durch Granzym B induzierten Zelltod (Maki et al. 2001) und der daraus folgenden Aktivierung der 74 Caspase-Kaskade. Die Apoptose-Kaskade durch Granzym B resultiert in der Aktivierung der Effektorcaspase-3 (Darmon et al. 1995, Adrain et al. 2005), weshalb sich der hier eingesetzte Caspase-3/7-Assay eignet. Allerdings wurde auch von einem durch Granzym B induziertem Caspaseunabhängigen Zelltod berichtet (Sarin et al. 1997, Trapani et al. 1998). Um den Caspase-unabhängigen Zelltod durch die NK-92-Zytolyse zu ermitteln, wurde parallel zum Caspase-Assay ein LDH-Assay durchgeführt. Die NK-92 wurde mit der Leukämiezelllinie K562 in verschiedenen Effektor-Target-Ratios über drei Stunden koinkubiert und die folgende Caspase- und LDH-Freisetzung gemessen (Abb. 14). Dabei zeigte sich, dass der Caspase-Assay, verglichen mit dem LDH-Assay, sensitiver für den NK-92-induzierten Zelltod war. Deshalb liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der NK-92-induzierten Apoptose. Die APCApoptose wurde durch einen Caspase-3/7-Assay sowie licht- und fluoreszenzmikroskopisch über Gram- und Annexin-V-Färbungen dokumentiert. 4.4.3 NK-92-induzierte Apoptose unreifer APC von Patienten Der Vergleich der induzierten APC-Apoptose der untersuchten Patienten erbrachte keinen eindeutigen Unterschied in der Suszeptibiliät gegenüber NK-92. Jedoch waren die unreifen APC aus Patienten mit hämophagozytotischen und septischen Erkrankungen – verglichen mit den gesunden Kontrollen - weniger sensitiv für die NK-92-induzierte Apoptose. Anders verhielten sich die APC des an Fibromyalgie erkrankten Patienten. Hier lag die Apoptoserate der Koinkubation von APC mit NK-92 höher als die mittlere Rate der Blutspender. Die APC-Apoptose der Patienten mit neoplastischen Erkrankungen war vergleichbar mit der aus gesunden Kontrollen. In einigen APC-Populationen konnte im Rahmen der Koinkubation mit NK-92 keine Caspase-Freisetzung gemessen werden. Für die weitere 75 Auswertung wurden die APC-Populationen deshalb in NK92-sensitive APC (Caspase-3/7-positiv) und NK92-nicht-sensitive APC (Caspase-3/7- negativ) eingeteilt. Da das zytotoxische Potential der NK-92 durch die konstante IL-2Aktivierung in dem Apoptose-Assay als stabil zu beurteilen ist, variiert lediglich der Phänotyp der Zielzellen. Somit bietet die Immunphänotypisierung der Zielzellen (Patienten-APC) eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Sensitivität der APC. Sie zeigte, dass vor allem die NK92-sensitiven APC (Caspase-3/7-positiv) weniger monozytäre Antigene (CD14), jedoch mehr intrazelluläres FAS-Ligand, TRAIL-Rezeptor und CD86 exprimierten. Demzufolge waren die APC vom dendritischen Zelltyp sensitiver für die Caspase-3/7-abhängige, NK-92induzierte-Apoptose. Möglicherweise war auch die höhere Expressionsdichte des TRAIL-Rezeptors von Bedeutung. Die NK-92 exprimiert das TRAIL-Protein (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand). Es gehört zur TNF-Familie und kann in verschiedenen Tumorzellen zur Apoptose führen (Pitti et al. 1996, Kim et al. 2001, Maki et al. 2001, Kandasamy u. Srivastava 2002). Ein weiteres Erklärungsmodell für die Caspase-3/7-Suppression auf der kontaktabhängigen Ebene ist die Blockierung des Zelltodes durch inhibitorische Rezeptoren. Hierfür kommen die drei iNKR (inhibitory NKReceptors) der NK-92 in Frage: KIR2DL4, CD94/NKG2A und ILT2. Die inhibitorischen Rezeptoren interagieren mit verschiedenen HLA-I Antigenen, jedoch konnte eine Reduktion der zytotoxischen Aktivität der NK-92 durch eine höhere Expression auf Zielzellen hier nicht gezeigt werden. In der weiteren phänotypische Analyse der NK92-nicht-sensitiven APC (Caspase-3/7-negativ) waren im Vergleich zu den NK92-sensitiven APC weniger APC positiv für das kostimulatorische B7-Molekül CD86 (MannWhitney-Test: p=0,0571). Dementgegen war für die mittlere Expressionsdichte des B7-Moleküls CD80 sowie für die Anitigene CD14, CD64, CD178 nachweisbar. und DR4 kein Unterschied in dieser Deutlichkeit 76 Im Hinblick auf die Sensitivität der APC gegenüber den NK-92 ist vor allem die Expression von CD86 interessant. So konnte in dieser Arbeit ein möglicher Zusammenhang zwischen den CD86-positiven APC und der NK92-induzierter Apoptose erbracht werden. CD86 ist ein wichtiges kostimulatorisches Molekül der APC, das unter anderem für die Interaktion mit NK-Zellen einen hohen Stellenwert hat. CD86 ist ein bedeutendes Triggermolekül und relevant für das zytotoxische Potential von NK-Zellen (Costa et al. 2002). Entsprechend konnte belegt werden, dass die Blockade von CD86 auf Target- oder die Blockade von CD28 auf Effektorzellen die zytolytische Aktivität der NK-92 limitieren kann (Tam unveröffentlichte Befunde). 4.4.3.1 Effekt von IL-10 auf die N92-induzierte APC-Apoptose Die Expression von CD86 auf APC hängt nicht nur direkt mit der DCAktivierung zusammen (Caux et al. 1994), sondern kann auch direkt durch die Konzentration eines immunmodulatorischen Zytokins moduliert werden. Demgemäß konnte in den NK-92-insensitiven APC (Caspase-3/7negativ) auch eine höhere Konzentration an Interleukin-10 (IL-10) nachgewiesen werden, die direkt mit einer niedrigeren Expression von CD86 und einer reduzierten NK-92-induzierten APC-Apoptose korrelierte. So konnte bereits gezeigt werden, dass Interleukin-10 in der Lage ist spezifisch die Expression von CD86 zu reduzieren, wohingegen die Expression von CD80 auf DC nicht beeinflusst wurde (Buelens et al. 1995). Diese Daten stützen die in dieser Arbeit beschriebenen Zusammenhänge. Möglicherweise ist IL-10 für die Unterschiede im Phänotyp der unreifen APC verantwortlich und nimmt somit Einfluss auf die Sensitivität gegenüber Zell-induziertem Zelltod (Alter et al. 2010). Zudem könnte ein weiterer - durch IL-10 ausgelöster - Effekt eine Rolle in dieser Untersuchung spielen. So wurde bereits eine durch IL-10 induzierte Rückdifferenzierung von unreifen DC hin zu monozytären, makrophagenähnlichen Vorstufen mit einer höheren phagozytotischen 77 Kapazität dokumentiert (Fortsch et al. 2000). Dementsprechend konnte auch hier in den NK-92-insensitiven unreifen APC-Populationen (Caspase3/7-negativ) eine höhere Expression des Monozytenmarkers CD14 nachgewiesen werden. Möglicherweise führte die höhere Konzentration an IL-10 zu einer verstärkten CD14 Expression der APC. Ferner verhindert IL-10 die Differenzierung von Monozyten in DC und bietet somit ein weiteres Erklärungsmodell für das Anreichern unreifer APC (Allavena et al. 1998). Den Einfluss von IL-10 auf die Immunantwort konnte bereits in früheren Studien für antigenpräsentierende Zellen dargelegt werden. So kommt es durch IL-10 zu einer Differenzierung von Monozyten zu M2Makrophagen, welche zwar eine starke phagozytitische Kapazität haben, jedoch nicht in der Lage sind eine effektive zytotoxische Immunantwort zu generieren (Mantovani et al. 2002). In weiteren Studien führten durch IL10 generierte unreife DC zu einer insuffizienten T-Zellstimulation und folglich zu anergischen T-Zellen (Steinbrink et al. 1997). Daraus wiederum resultierte die Unterdrückung der phänotypischen Reifung von DC (Vendetti et al. 2000). Analog dazu postulierten Efron und Moldawer in ihrem Modell eine durch IL-10 modulierte Immunreaktion der unreifen DC hin zu einer TH2- oder TR1-gerichteten Antwort, die zur Abschwächung des Immunsystems führt (Efron u. Moldawer 2003). Zusammenfassend lassen die in diesen Messreihen erbrachten Ergebnisse den Schluss zu, dass IL-10 den Phänotyp der APC beeinflussen kann und durch verstärkte CD14-Expression sowie durch Inhibition der DCDifferenzierung den Pool unreifer APC erhöht. Parallel dazu ist IL-10 in der Lage, die Expression von CD86 auf APC konzentrationsabhängig zu minimieren und beeinflusst somit die Sensitivität gegenüber NK-Zellen negativ (Abb. 18). Die Herkunft der erhöhten IL-10 Konzentrationen im Überstand der APC-Kultur könnte zum einen von CD4+-Lymphozyten stammen (Schneider et al. 2011) oder von ATP-stimulierten APC selbst sezerniert werden (Hasko et al. 2000). In Bezug auf die IL-10 Sekretion sollte auch eine Assoziation mit Viruserkrankungen in Betracht gezogen werden. Entsprechend gelang es unsere Arbeitsgruppe vor kurzem, eine Verbindung zwischen erhöhten IL-10 Konzentrationen in CD4+- 78 Lymphozytenpopulationen septischer Patienten zu chronischen EBVInfektionen herzustellen (Schneider et al. 2011). Allerdings weisen die Ergebnisse in dieser Arbeit darauf hin, dass das IL-10 vornehmlich aus den APC-Kulturen stammt, da die Lymphozytenpopulationen zu Beginn der Zellkultur von den APC separiert wurden. Jedoch lässt sich nicht ausschließen, dass verbleibende Lymphozyten zu der IL-10 Sekretion in den APC-Kulturen beigetragen haben. Die Sekretion von IL-10 durch APC erfolgt unter anderem auch nach ATPStimulation (Hasko et al. 2000). Da die ATP-induzierte IL-10 Sekretion von Einzelnukleotidpolymorphismen des P2X7-Rezeptors beeinflusst wird, wurde eine mögliche Assoziation im nachfolgenden Teil näher untersucht (Denlinger et al. 2005). 4.4.4 APC-Apoptose durch allogene, IL-2-aktivierte Lymphozyten gesunder Spender Um die Sensitivität unreifer APC gegenüber der Zell-induzierter Apoptose zu messen, wurden APC zweier gesunder Probanden mit allogenen, IL-2aktivierten Lymphozyten eines weiteren gesunden Probanden koinkubiert und die Caspase-3/7-Aktivität dokumentiert. Dabei konnte nur in einem der beiden Probanden Caspase-Freisetzung durch die zytotoxischen Lymphozyten detektiert werden. Da die IL-2-aktivierten Lymphozyten vom selben Spender und zur selben Zeit eingesetzt wurden, kann eine Variabilität der Lymphozyten-Zytotoxizität ausgeschlossen werden. Die phänotypische Analyse der Interleukin-2 aktivierten Zellen des gesunden Probanden ergab, dass es sich aufgrund der hohen CD3- und CD25Expression um IL-2-Rezeptor-positive Lymphozyten handelt. Ein großer Anteil dieser Lymphozyten, Lymphozytenpopulation aber auch CD16+- und bestanden aus CD56+-NK-Zellen CD4+-Tkonnten nachgewiesen werden. Dagegen war lediglich ein geringer Anteil positiv für CD8. Zudem lag der Anteil NKp30 und Granzym B positiver Zellen bei über 90 %, was für eine hohe zytotoxische Aktivität der Killerzellen 79 spricht. Der Vergleich der Immunphänotypisierung beider APC-Kulturen gesunder Spender zeigte ein ähnliches Expressionsmuster für Antigene von DC wie auch von Makrophagen. Allerdings waren Todesrezeptoren wie FAS, TNFTNFR1 und auch zu einem geringen Anteil TRAIL-RI stärker auf der antiapoptotischen APC-Kultur exprimiert. Für das Differenzierungsantigen CCR7 waren keine relevanten Unterschiede detektierbar. Hinsichtlich des Reifungsgrades war die Ratio aus HLA-DR/HLA-I in den apoptotischen APC niedriger. Konträr hierzu wies CD86 als relevantes Kontaktantigen für NK-Zellangriffe apoptotischen eine Population stärkere auf Expressionsdichte (Costa et al. in 2002). der pro- Somit ist wahrscheinlich, dass der höhere Reifegrad der APC ursächlich für das Ausbleiben der Zell-induzierten Apoptose war. Entsprechend belegten frühere Arbeiten, dass die Reifung von DC zu einer Abnahme der Sensitivität für Zell-induzierte Apoptose führt. Das konnte für die Granzym B-induzierte Apoptose durch zytotoxische Lymphozyten (Medema et al. 2001), als auch für die Todesrezeptor-assoziierte Apoptose belegt werden (Leverkus et al. 2000, Willems et al. 2000). 4.4.5 APC-Apoptose durch autologe, IL-2-aktivierte Lymphozyten von Patienten Die Apoptose unreifer APC durch IL-2-aktivierte Lymphozyten wurde zusätzlich zu gesunden Kontrollen auch an Patienten untersucht. Hierzu wurden die autologen, IL-2-aktivierten Lymphozytenpopulationen zweier Patienten isoliert und mit den jeweiligen unreifen APC-Populationen koinkubiert. Dabei kam es in beiden Ansätzen zu einem deutlichen Anstieg der Caspaseaktivität, wobei die Lymphozyten-induzierte Apoptose des Patienten mit Makrophagenaktivierungssyndrom (MAS) - verglichen mit dem Patient mit Prostatakarzinom - überwog. Die Immunphänotypisierung der Lymphozyten-Populationen beider Patienten ergab, dass in dem Patient mit MAS mehr zytotoxische (CD8+) 80 Lymphozyten erfasst wurden, was die höhere Sensitivität für die durch Lymphozyten induzierte Apoptose erklären könnte. Zudem waren die APC des zweiten Patienten mit Prostatakarzinom weitgehend differenziert, was eine durch Lymphozyten induzierte Apoptose erschwert (Medema et al. 2001). 4.5 P2RX7-Genotyp und -Funktion in APC Der P2X7-Rezeptor ist ein ATP-sensitiver Kationenkanal, der auf Zellen des Immunsystems, somit auch auf APC - wie DC und Makrophagen detektiert wurde (Coutinho-Silva et al. 1999, Grahames et al. 1999, Ferrari et al. 2000, Humphreys et al. 2000). Der P2X7-Rezeptor ist systemrelevant, da er immunologisch bedeutende Prozesse wie die Initiierung des Zelltodes, die Interleukinfreisetzung oder eine suffizente TZellaktivierung durch die immunologische Synapse von APC und Lymphozyten initiieren kann (Di Virgilio et al. 1990, Zanovello et al. 1990, Ferrari et al. 1997, Junger 2011). Demzufolge sind Polymorphismen, die die funktionellen Eigenschaften des P2RX7 beeinflussen, entscheidend für eine adäquate Immunantwort. 4.5.1 Bedeutung der P2RX7 Polymorphismen Eine mögliche genetische Assoziation des P2X7-Rezeptors mit der Akkumulation unreifer APC des hier erfassten Patientenkollektivs sollte in folgender Genotypisierung analysiert werden. Die Genotypisierung für die Patienten zeigte - verglichen mit der gesunden Kontrolle - einen höheren Anteil der funktionellen Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) SNP489 und SNP1513. Bei den in dieser Arbeit analysierten Patienten handelte es sich maßgeblich um immunologische Erkrankungen. SNP1513 wurde bisher mit leukämischer, autoimmunologischer und infektiöser Genese im Rahmen der Tuberkulose in Zusammenhang gebracht (Wiley et al. 2002, Shemon et al. 2006, Sharma et al. 2010, Al- 81 Shukaili et al. 2011). Dagegen ist der SNP489, der mit weiteren „„gain-of-function““ SNPs im Haplotyp mit SNP460 vererbt wird, mit psychiatrischen Erkrankungen wie z.B. uni- und bipolaren Störungen assoziiert (Hejjas et al. 2009, McQuillin et al. 2009, Stokes et al. 2010). Da SNP1513 und SNP489 häufig miteinander assoziiert sind, wurden die Besonderheiten dieses Haplotyps in den unreifen APC untersucht (Denlinger et al. 2006, Stokes et al. 2010). Dabei war von besonderem Interesse, inwiefern die Präsenz des „„loss-of-function““ SNP1513 oder des „„gain-of-function““ SNP489 die P2RX7-Funktion beinflusst (Gu et al. 2001, Cabrini et al. 2005, Roger et al. 2010). 4.5.2 ATP-induzierte Caspaseaktivität Die Untersuchung der ATP-Stimulation der isolierten APC-Kulturen zeigte, dass für ATP keine Caspase-assoziierte Apoptose dokumentiert werden konnte. So führte ATP tendenziell zu einer schwachen Reduktion der spontanen Caspaseaktivität, also zu einer Anti-Apoptose. Auch die Stimulation mit Cyclosporin A (CsA) führte zu einem vergleichbaren Effekt. Dieser anti-apoptotische Effekt von CsA und ATP war in der induzierten Apoptose durch den potenten Apoptoseinduktor Staurosporin (STS) noch deutlicher. Andere Arbeitsgruppen konnte bereits darstellen, dass der ATP-induzierte Zelltod - abhängig vom Zelltyp - über apoptotisch und nicht-apototische als auch über Caspase-abhängige oder Caspase-unabhängige Mechanismen initiiert werden kann (Zanovello et al. 1990, Hogquist et al. 1991, Ferrari et al. 1999, Grahames et al. 1999, Wang et al. 2004, Auger et al. 2005, Kong et al. 2005, Sylte et al. 2005, Delarasse et al. 2009, Nishida et al. 2012). Auch von einer Form der Pseudo-Apoptose wurde im Rahmen des ATP-induziertem Zelltod berichtet (Mackenzie et al. 2005). Kongruent mit weiteren Studien konnte für Cyclosporin A auch in dieser Arbeit ein anti-apoptotischer Effekt auf den induzierten Zelltod belegt werden (Walter et al. 1998, Pritchard et al. 2000) 82 Der Apoptoseinduktor STS wurde primär als Positivkontrolle eingesetzt und führte in allen getesteten APC zu einer Caspase-Stimulation. Dabei wurde nicht nur die Effektorcaspase-3/7 untersucht, sondern auch die Initiatorcaspasen, welche der Initiation von Caspase-3/7 vorausgehen (Degterev et al. 2003). Die hier detektierten Initiatorcaspasen decken zum einen die Apoptose-Kaskade über den mitochondrialen (Caspase-9, Caspase-3/7), zum anderen den alternativen Weg über Caspase-8 ab. Außerdem ist Staurosporin in der Lage, in einigen Zellen Caspase-9 und folglich Caspase-3/7 zu aktivieren und kann somit über eine nicht Todesrezeptor-abhängige Apoptose Caspase-8 induzieren (Ferrari et al. 1998, Tafani et al. 2001, Nicolier et al. 2009). Des Weiteren zeigte sich in der P2RX7-Genotypenanalyse, dass die Staurosporin-induzierte Apoptose in SNP489/1513 mutierten APC geringer war (Abb. 24). Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Regulierung der Caspasen - beziehungsweise der Apoptose - durch einen dysfunktionalen P2RX7 beeinflusst werden kann. Diese These wurde bereits in verschiedenen Untersuchungen belegt. So konnte gezeigt werden, dass Polymorphismus die ATP-induzierte SNP1513 Apoptose reduziert wird durch und den das P2RX7- Überleben leukämischer Zellen begünstigt (Gu et al. 2001, Wiley et al. 2002). Außerdem konnten weitere Untersuchungen einen Zusammenhang zwischen Caspase-8 und P2RX7 dokumentieren, da P2RX7 defiziente Mäuse mit einer Reduzierung der Gentranskripte für Caspase-8 einhergehen (Csolle et al. 2013). Demzufolge könnte eine Beeinträchtigung der Caspase-8 durch den Polymorphismus zu einer reduzierten STSinduzierten Freisetzung der Initiatorcaspase-8 (Abb. 24) geführt haben, die die Aktivierung der nachfolgenden Effektorcaspase-3/7 ebenfalls abschwächen würde. Die Bedeutung der Caspase-8 im Rahmen der P2X7Funktion wurde auch in einer weiteren Arbeit belegt, jedoch führte die Blockade des Rezeptors durch oATP (periodate-oxidized ATP) in der Studie von Sylte et al. zu keiner Änderung der STS-induzierten Chromatinkondensation (Sylte et al. 2005). 83 4.5.2.1 Effekt der SNPs auf die Aktivität der Pore des P2RX7 Zusätzlich zur Caspaseinduktion wurde auch die Beeinflussung der beiden Polymorphismen von P2RX7 auf die elektrophysiologische Aktivität in unreifen APC analysiert. Dabei konnte für den „„gain-of-function““ SNP489 eine höhere mittlere und maximale ATP-induzierte Signalstärke nachgewiesen werden, wohingegen die APC mit dem „„loss-of-function““ SNP1513 - verglichen mit dem P2RX7-Wildtyp - ein schwächeres Signal induzierten. Die SNP489/1513 unreifen zeigten APC dabei mit deutlich dem Polymorphismus schwächere für ATP-induzierte Signalstärken. Übereinstimmend mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte für den alleinigen eine Polymorphismus des „„gain-of-function““ SNP489 Verstärkung des elektrophysiologischen Signals und des Calcium-Influx nachgewiesen werden (Cabrini al. 2005, Bradley et al. 2011), wobei eine weitere Arbeitsgruppe für den heterozygoten Polymorphismus SNP489 (C/T) keinen „„gain-of-function““ dokumentierte (Denlinger et al. 2006). An anderer Stelle wurde der SNP1513 als „„loss-of-function““ Polymorphismus mit einer reduzierten ATP-induzierten IL-1β-Sekretion, Apoptose, Ethidium-Aufnahme sowie einem herabgesetzten Barium-und Calcium-Influx beschrieben (Gu et al. 2001, Sluyter et al. 2004, Cabrini et al. 2005). Jedoch konnte dort in Bezug auf die Elektrophysiologie keine Abschwächung nachgewiesen werden (Boldt et al. 2003). Durch die Präsenz beider Einzelnukleotidpolymorphismen SNP489/1513 des P2RX7 kam es bei ATP-Stimulation – verglichen mit dem Wildtyp - zu einer geringeren Aktivität der Pore. Analog zeigte die Gruppe um Denlinger, dass der „„gain-of-function““-Effekt des SNP489 bei gleichzeitiger Mutation für SNP1513 nicht messbar ist und der SNP1513 den positiven Effekt von SNP489 relativiert (Denlinger et al. 2006). Interessanterweise führte die gleichzeitige Stimulation von ATP und Cyclosporin A (CsA) zu einer Verbesserung der reduzierten IonenflussAktivität in SNP489/1513 mutierten APC. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass CsA eine Dysfunktion des P2X7-Rezeptors positiv beeinflussen 84 kann (Gan et al. 2005). Allerdings ist noch nicht klar, über welchen Mechanismus CsA diese Wirkung entfaltet. Möglicherweise spielt das intrazelluläre Calcium eine Rolle und führt, wie in den P2X-Rezeptor exprimierenden LLC-PK1 Zellen, zu einem verstärkten Signal (Filipovic et al. 1998, Gordjani et al. 2000). Aber auch eine größere Sensitivität des P2X-Rezeptors gegenüber dem Agonisten ist zu diskutieren. Weitere Studien sind zur Aufklärung der molekularen Mechanismen erforderlich. Abb. 29: Hypothese zum Mechanismus der Persistenz unreifer antigenpräsentierender Zellen: Aufgrund einer reduzierten Aktivität des P2X7-Rezeptors (P2RX7) durch „„loss-offunction““ Polymorphismen kommt es zur reduzierten proinflammatorischen Immunreaktion. Eine solche Immunreaktion tritt beispielweise bei einer abgeschwächten IL-1β-Induktion und bei vermehrter Interleukin-10-Sekretion auf (Sluyter et al. 2004, Denlinger et al. 2005). Die abgeschwächte proinflammatorische Immunreaktion resultiert in einer insuffiziente Aktivierung der T-Zellen und eine fehlenden Differenzierung der APC in vivo (links), was wiederum zu einer TH2 oder einer suppressiven Immunantwort führt (Efron u. Moldawer 2003). In vitro (rechts) kommt es durch IL-10 zur Reduktion der Expression von CD86 auf den APC. Damit assoziiert ist ein Reduktion der Sensitivität von APC gegenüber der NK-92-vermittelten Apoptose (Costa et al. 2002). Ferner kann IL10 zu einer Rückdifferenzierung der APC mit erhöhter CD14-Expression führen, was die Akkumulation unreifer APC-Populationen zusätzlich verstärkt (Fortsch et al. 2000). ATP (Adenosintriphosphat), iAPC (unreife antigenpräsentierende Zelle), mAPC (reife antigenpräsentierende Zelle). IL-1β (Interleukin-1-β), IL-10 (Interleukin-10), l-o-f („loss-offunction“), wt (Wildtyp), NK-Zelle (natürliche Killerzelle). Universitätsklinikum Ulm 2013. 85 5. Zusammenfassung Unreife dendritische Zellen (iDC) und aktivierte Makrophagen (MΦ) gehören zur Gruppe der antigenpräsentierenden Zellen (APC) und können aufgrund zytokinstimulierter Inflammation zur Manifestation von Makrophagenaktivierungssyndromen (MAS) und Hämophagozytose (HLH) beitragen. Die Erkrankungen sind mit der Häufigkeit von bestimmten Polymorphismen des P2X7-Rezeptors (purinerger 2X7-Rezeptor) assoziiert, welcher nach Stimulation durch Adenosintriphosphat (ATP) die Apoptose oder die Freisetzung von Mikropartikeln auslöst. Unter Verwendung von kultivierten iDC und MΦ von unterschiedlichen inflammatorischen Erkrankungen mit HLH und MAS wurde der Phänotyp dieser Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie, die ATP-induzierte Aktivierung mittels der Apoptose-assoziierten Caspasen-3/7, -8, -9 und die Targetfunktion für natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sowie funktionale Polymorphismen des P2X7-Rezeptors geprüft. Die durch ATP und NKZellen vermittelte Apoptose wurde mit Hilfe Chemilumineszenz-basierter Enzymaktivitätsmessungen quantifiziert und die P2RX7-Polymorphismen mittels Pyrosequenzierung nachgewiesen. Morphologische Interaktionen zwischen Interleukin-2 aktivierten natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und kultivierten APC wurden fluoreszenzmikroskopisch auch unter Anwendung konfokaler und Transelektronenmikroskopie untersucht. Die Häufigkeit von iDC und MΦ war mit einer verminderten NK-Zellzahl im Blut assoziiert. Für den Kontakt der NK-Zellen mit den kultivierten APC zeigten sich unterschiedliche morphologische Eigenschaften der immunologischen Synapse. Bestimmte Isolate der kultivierten APC waren für IL-2 aktivierte NK-Zelllyse sensibel, jedoch war die NK-vermittelte Apoptose gegen APC negativ, wenn die NK-Zellen durch die kultivierten APC phagozytiert wurden. Die verminderte NK-Zellsensibilität war mit einer höheren Interleukin-10 (IL-10) Sekretion der APC und einer verminderten Expression des Korezeptors CD86 (cluster of differentiation) assoziiert. Eine Genotypisierung für den „gain-of-function“ SNP489 (single nucleotide polymorphism) und den „loss-of-function“ SNP1513 des P2X7- 86 Rezeptors zeigte untersuchten Mutationen eine Patienten. Häufung Die der Polymorphismen funktionale Relevanz in der den hier wichtigsten des P2X7-Rezeptors an Position 489 und 1513 wurde mit Hilfe von Patchclampingverfahren geprüft. Mutierte Zellen zeigten eine schwächere Ionenkanalfunktion im Patchclamping-Experiment und eine schwächere Caspaseaktivität durch Staurosporin. Dabei konnte die Ionenkanalaktivität der SNP489/1513 mutierten Patienten durch die Kostimulation mit Cyclosporin (CsA) zum Teil restituiert werden. Zusammenfassend könnte durch eine starke P2X7-Aktivität eines nicht funktionell mutierten P2X7-Rezeptors und NK-Zellen die Apoptose von APC induziert - und damit eine Kontrolle des inflammatorischen Aktivierungssystems erreicht werden. Die vorliegenden Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass in kultivierten APC von inflammatorischen Erkrankungen wie HLH und MAS bei einem schwachen P2X7-Rezeptor - und/oder dem Vorhandensein von SNP489 und SNP1513 - die elektrophysiologische Funktion des P2X7-Rezeptors sowie die induzierte Apoptose von APC beeinträchtigt werden könnten. Zusammen mit einer herabgesetzten NK-Zell-vermittelten APC-Apoptose durch die Sekretion von Interleukin-10 und durch die niedrige CD86Expression, würden diese Effekte eine Kontrolle der APC und folglich auch eine kontrollierte Immunantwort erschweren. 87 6. 1. Literaturverzeichnis Adrain C, Murphy B M, Martin S J: Molecular ordering of the caspase activation cascade initiated by the cytotoxic T lymphocyte/natural killer (CTL/NK) protease granzyme B. J Biol Chem 280: 4663-4673 (2005) 2. Alimonti J B, Shi L, Baijal P K, Greenberg A H: Granzyme B induces BID-mediated cytochrome c release and mitochondrial permeability transition. J Biol Chem 276: 6974-6982 (2001) 3. Allavena P, Piemonti L, Longoni D, Bernasconi S, Stoppacciaro A, Ruco L, Mantovani A: IL-10 prevents the differentiation of monocytes to dendritic cells but promotes their maturation to macrophages. Eur J Immunol 28: 359-369 (1998) 4. 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Die Rohdaten der Tabelle 17 führt die Caspase-3/7-Aktivität der APC nach Stimulation mit ATP, Ciclosporin (CsA) und STS auf, dargestellt in den Abbildungen 27-28. In den Tabellen sind die Diagnosen der Patienten (#= Patientennummer; n.u. bzw. n = nicht untersucht) und der P2RX7 Genotyp aufgetragen. Die SNPs des P2RX7 wurden als “1” für Wildtyp, als “2” für heterozygote, und “3” für homozygot bezeichnet. Die Reihenfolge der SNPs war: SNP489, SNP 946, SNP1405, SNP1513, SNP1729. Tab. 7: Prozent (%) positive Zellen der gegateten antigenpräsentierenden Zellen für die Antigene CD14, CD11c, HLA-DR und CD80. Diagnose P2RX7 Genotyp CD14 (%) CD11c (%) HLA-DR (%) CD80 (%) 7242 Hämophagozytose 12n1n1 n.u. n.u. 2,90 n.u. 10719 Blutspender 2n1n1 91,98 41,80 95,54 12,30 10837 Blutspender 21211 40,80 20,40 92,50 5,30 10838 Blutspender 22111 39,43 22,27 84,15 30,61 10927 Blutspender n.u. 82,23 83,50 80,26 9,95 11081 Endometriumkarzinom 21111 40,62 42,92 92,27 28,60 11082 Hämophagozytose 2n121 82,87 n.u. 66,80 0,20 11091 Colonkarzinom nn111 18,18 85,35 94,61 28,59 11093 Colonkarzinom 12111 65,48 74,23 93,48 3,24 11095 Hämophagozytose 21212 94,83 44,73 9,58 1,42 11096 Oligoastrozytom 21211 71,96 98,12 98,77 0,00 11137 Prostatakarzinom 11121 94,77 n.u. 98,11 1,36 11151 Sepsis 21211 47,67 95,72 97,22 0,00 11215 Sepsis 21111 12,79 n.u. 11,87 n.u. 11263 Hämophagozytose 31121 74,41 n.u. 89,79 n.u. 11291 Fibromyalgie 21211 97,30 n.u. n.u. n.u. # X Tab. 8: Prozent (%) positive Zellen der gegateten antigenpräsentierenden Zellen für die Antigene CD86, CCR7, CD1a, und das zytoplasmatische CD178. Diagnose P2RX7 Genotyp CD86 (%) CCR7 (%) CD1a (%) CD178 zyto. (%) 10719 Blutspender 2n1n1 59,05 0,10 1,43 n.u. 10837 Blutspender 21211 52,80 n.u. n.u. 85,80 10838 Blutspender 22111 39,53 2,52 2,76 85,85 10927 Blutspender Nnnnn 19,55 4,90 1,34 n.u. 11081 Endometriumkarzinom 21111 48,40 6,51 n.u. n.u. 11082 Hämophagozytose 2n121 0,40 4,91 4,52 1,22 11091 Colonkarzinom nn111 18,30 1,35 6,56 32,49 11093 Colonkarzinom 12111 12,29 n.u. 3,41 n.u. 11095 Hämophagozytose 21212 3,16 0,29 2,25 0,68 11096 Oligoastrozytom 21211 2,32 0,69 n.u. 85,89 11137 Prostatakarzinom 11121 60,53 2,74 n.u. 89,42 11151 Sepsis 21211 50,40 0,09 n.u. 93,22 11215 Sepsis 21111 n.u. 2,69 n.u. n.u. 11263 Hämophagozytose 31121 n.u. 89,79 n.u. n.u. # Tab. 9: Prozent (%) positive Zellen der NK- Zellpopulationen für die Antigene CD57, CD56, CD3 und CD16. NK-Zellen > 5 % CD16/56 positiver Zellen (#11081, #11093, #11137, #11291, #11096) als Kontrolle im Vergleich zu den Kulturen mit verminderten NK-Zellen ≤ 5 % CD16/56 positiver Zellen (#11082, #11088, #11091, #11095, #11236, #10981, #11177, #11176). . Diagnose P2RX7 Genotyp CD57/CD56 (%) CD3/CD56 (%) CD16/CD56 (%) 10981 Hämophagozytose nnnnn 1,30 2,05 2,55 11081 Endometriumkarzinom 21111 5,00 3,56 5,55 11082 Hämophagozytose 2n121 1,87 2,27 3,50 11088 Hämophagozytose 2n121 n.u. 0,92 1,37 11091 Adenokarzinom nn111 2,26 1,06 2,17 11093 Colonkarzinom 12111 9,19 2,66 14,57 11095 Hämophagozytose 21212 2,46 2,14 4,14 11096 Oligoastrozytom 21211 5,60 1,37 11,01 11137 Prostatakarzinom 11121 18,21 5,68 13,78 11176 Fibromyalgie 2n221 4,72 3,27 3,49 11177 Hämophagozytose nnnnn 4,62 11,68 3,44 11236 Hämophagozytose nnnnn 9,61 5,53 5,98 11291 Fibromyalgie 21211 13,68 22,08 9,24 # XI Tab. 10: Caspase-3/7-Aktivität der Kontrolle als Summe aus APC + NK-92 sowie die Koinkubation von antigenpräsentierenden Zellen (APC) mit NK-92 in RLU (Relative Light Units). # Diagnose Kontrolle APC + NK-92 Koinkubation APC und NK-92 10838 Blutspender 1042675 769702 1364959 1114343 10837 Blutspender 1125005 1014285 1258791 1234677 11093 Neoplasie 676958 562189 393940 535913 11096 Neoplasie 875428 686054 692892 631484 11081 Neoplasie 1484770 1756146 1799813 2342428 11137 Neoplasie 31463 29936 50059 65122 11095 Hämophagozytose 910832 891254 700162 644021 10991 Hämophagozytose 560320 383529 376953 488568 10082 Hämophagozytose 518277 434544 536383 477329 11216 Sepsis 436279 532366 454420 396768 11151 Sepsis 167285 154423 173306 184404 11176 Fibromyalgie 182543 169418 212397 240903 Tab. 11: Interleukin-10 (IL-10)-Konzentration in Pikogramm pro Milliliter (pg/ml), Anteil der CD86 positiven APC in Prozent (%) sowie die Apoptose als Caspase-3/7-Aktivierung der Koinkubation von antigenpräsentierenden Zellen mit NK-92 als Stimulationsindicex (SI). # Diagnose P2RX7Genotyp CD 86 in % IL-10 pg/ml SI SI 10927 Blutspender n.u. 19,6 5,3 0,47 0,84 10991 Hämophagozytose n.u. n.u. 4,2 0,67 1,27 11081 Endometriumkarcinom 21111 48,4 3,8 1,21 1,33 11093 Colonkarzinom 12111 12,3 3,8 0,58 0,95 11095 Hämophagozytose 21212 3,2 4,8 0,77 0,72 11096 Oligoastroztom 21211 n.u. 3,8 0,98 0,97 11137 Prostatakarzinom 11121 60,5 0,75 1,59 2,18 11151 Sepsis 21211 50,1 1,4 1,04 1,19 11176 Fibromyalgie 2n221 n.u. n.u. 1,16 1,42 XII Tab. 12: Caspase-3/7-Aktivität der Adenosintriphosphat (ATP)- und Staurosporin (STS)stimulierten antigenpräsentierenden Zellen in RLU (Relative Light Units). # Diagnose P2XR7Genotyp 7242 Hämophagozytose 2n1n1 16008 14218 10205 7761 32621 34236 7986 Blutspender 21111 59988 45942 78485 50410 n.u. n.u. 8582 Hämophagozytose 21211 7456 9226 12474 7019 n.u. n.u. 10927 Blutspender n.u. 11231 11255 7884 5652 27538 26926 11082 Hämophagozytose 2n121 13429 15779 14422 12762 26744 27636 11091 Adenokarzinom nn111 8038 7551 4593 6051 9937 9720 11093 Colonkarzinom 12111 8747 7722 8554 8068 10765 9134 11095 Hämophagozytose 21212 38471 48547 50307 53684 82189 70150 11096 Oligoastrozytom 21211 17410 19180 19735 18579 37636 38511 11116 Erdheim-Chester n.u. 6033 6211 4623 4435 8434 9207 11137 Prostatakarzinom 11121 3150 3181 2627 2415 12953 10921 11151 Sepsis 21211 14832 13812 8619 8139 20991 19729 11176 Fibromyalgie 2n221 30090 28807 15110 15858 37432 35400 11190 Hämophagozytose 11111 3216 3197 2902 2896 7736 5000 11215 Sepsis 21111 19543 13020 12209 11886 n.u. n.u. 11217 Sepsis 11111 5387 5453 2868 4043 n.u. n.u. 11233 Hämophagozytose 21211 17514 19114 17078 17058 22146 23310 11235 Hämophagozytose n.u. 3264 3662 3781 3251 n.u. n.u. 11263 Hämophagozytose 31121 2895 3605 3396 5034 4833 5629 11291 Fibromyalgie 21211 5047 3451 3203 3800 5084 6306 12288 LCH n.u. 59830 73562 54839 60860 100242 199711 Kontrolle ATP STS XIII Tab. 13: Caspase-8-Aktivität der Adenosintriphosphat (ATP)- und Staurosporin (STS)stimulierten antigenpräsentierenden Zellen in RLU (Relative Light Units). # Diagnose P2RX7 Genotyp 7242 Hämophagozytose 2n1n1 5991 5395 7833 7953 9689 10673 7986 Blutspender 21111 41008 n.u. 46021 n.u. 11874 11054 10719 Blutspender 2n1n1 3577 2981 n.u. n.u. 4035 4229 10837 Blutspender 21211 32982 21918 24984 37243 n.u. n.u. 10927 Blutspender nnnnn 4100 4338 2479 4303 5431 4708 11082 Hämophagozytose 2n121 10400 8607 7163 6688 8006 8131 11091 Adenokarzinom nn111 7998 n.u. 8779 n.u. n.u. n.u. 11093 Colonkarzinom 12111 4654 4689 4620 4666 4854 5244 11095 Hämophagozytose 21212 8550 7784 7880 7309 12595 10850 11096 Oligoastrozytom 21211 11832 11965 12073 10571 8386 9382 11116 Erdheim-Chester nnnnn 3582 3587 5801 5965 4237 8218 11151 Sepsis 21211 13931 7069 6842 6811 8557 8469 11137 Prostatakarzinom 11121 2500 2649 2602 2598 n.u. n.u. 11176 Fibromyalgie 2n221 14087 15184 10649 10720 12083 12666 11190 Hämophagozytose 11111 3176 3431 4133 4100 3289 3222 11215 Sepsis 21111 8956 6977 9451 7391 16399 16487 11216 Sepsis 11111 4318 4132 n.u. n.u. 11329 11011 11233 Hämophagozytose 21211 4205 3878 4898 4948 n.u. n.u. 11235 Hämophagozytose Nnnnn 1504 1456 1628 1493 1524 1397 11263 Hämophagozytose 31121 2632 2592 n.u. n.u. 3728 3011 11291 Fibromyalgie 21211 2831 2617 2932 2695 2903 2031 Kontrolle ATP STS Tab. 14: Caspase-9-Aktivität der Adenosintriphosphat (ATP)- und Staurosporin (STS)stimulierten antigenpräsentierenden Zellen in RLU (Relative Light Units). # Diagnose P2RX7 Genotyp 8582 Hämophagozytose 21211 56893 56515 65600 61394 123392 124569 10719 Blutspender 2n1n1 56706 55255 63296 64252 76930 74812 10927 Blutspender nnnnn 68024 59606 67774 60108 93974 97233 11215 Sepsis 21111 59926 56895 62150 66576 143861 150422 11216 Sepsis 11111 51303 53098 55966 55317 157581 157210 Kontrolle ATP STS 11217 Sepsis 11111 47515 52606 58875 55448 84247 83518 7242 Hämophagozytose 2n1n1 57142 63006 60914 63718 83747 84043 XIV Tab. 15: Caspase-3/7-Aktivität der Ciclosporin- (CsA) und Adenosintriphosphat- (ATP) stimulierten antigenpräsentierenden Zellen in RLU (Relative Light Units). # Diagnose P2RX7 Genotyp CsA (RLU) CsA+ATP (RLU) 7986 Blutspender 21111 48031 49066 30697 27761 11081 Endometriumkarzinom 21111 55658 54602 44404 55938 11082 Hämophagozytose 2n121 11772 14127 11852 11394 11093 Colonkarzinom 12111 7052 6749 7309 8165 11095 Hämophagozytose 21212 40075 34294 45834 51247 11096 Oligoastrozytom 21211 18884 17125 18036 20504 10991 Hämophagozytose n.u. 20622 18821 19104 18871 Tab. 16: Caspase-3/7-Aktivität der Staurosporin (STS)-, ATP (Adenosintriphosphat)- und Ciclosporin (CsA)-stimulierten antigenpräsentierenden Zellen in RLU (Relative Light Units). P2RX7 # STS+ATP (RLU) STS+CsA (RLU) STS+ATP+CsA (RLU) Diagnose Genotyp Blutspender 21111 327794 358726 n.u. n.u. n.u. n.u. 11081 Endometriumkarzinom 21111 191153 n.u. 357422 n.u. 179171 n.u. 11082 Hämophagozytose 2n121 15171 20571 16361 18930 11600 15348 11093 Colonkarzinom 12111 12136 7490 7474 7425 6990 6159 11095 Hämophagozytose 21212 80523 76521 52401 64041 60941 57090 11096 Oligoastrozytom 21211 27322 30825 29501 24653 19922 23893 10991 Hämophagozytose n.u. 38891 n.u. 29509 n.u. 22235 n.u. 7986 XV Tab. 17: Elektrophysiologie der Adenosintriphosphat (ATP)- und Ciclosporin (CsA)stimulierten antigenpräsentierenden Zellen (als Maximum in Nanoampere (nA) und als Mittelwert in Picoampere/Picofarad (pA/pF). Maximum (nA) Mittelwert (pA/pF) # Diagnose P2X7 Genotyp ATP ATP + CsA ATP ATP + CsA 7539 n.u. 21211 9,03 8,06 n.u. n.u. 7963 Blutspender 31131 6,09 5,97 40,43 80,44 7986 Blutspender 11111 6,36 6,33 115,02 111,49 8129 n.u. 21121 0,26 0,26 57,3 128,14 8815 n.u. n.u. n.u. n.u. 43,02 n.u. 9077 n.u. 3n121 2,26 2,89 16,39 52,08 9108 n.u. 21121 0,04 0,14 9,93 n.u. 11039 n.u. 1n111 8,76 9,29 66,88 91,26 11053 n.u. 3n121 5,01 5,44 21,56 45,97 11081 Endometrium-CA 21111 5,57 5,92 153,22 227,24 11215 Sepsis 21111 n.u. n.u. 111,87 128,9 11217 Sepsis 11111 7,37 6,7 80,01 113,26 11263 Hämophagozytose 31121 4,48 6,68 18,6 62,9 XVI Danksagung Ich möchte mich ganz herzlich bei meiner Professorin Dr. Marion Schneider bedanken, die mich jederzeit großartig unterstützt und begleitet hat. Es hat mir große Freude gemacht mit ihr wissenschaftlich zu arbeiten! Vielen Dank auch an Harald und Myriam für den Support und die tolle Atmosphäre im Labor. Ein ganz großes Dankeschön an meine Familie, die über all die Jahre hinter mir gestanden ist und mich tatkräftig unterstützt hat. XVII Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt. XVIII Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
