[18F]FLT-PET zur Evaluation der Proliferation und des

Aus der
Klinik für Nuklearmedizin
des Universitätsklinikums Ulm
Leiter: Prof. Dr. med Sven Reske
_____________________________________________________________________
[18F]FLT-PET zur Evaluation der Proliferation
und des Therapieansprechens maligner Lymphome
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der Universität Ulm
von
Durda Kratochwil, geb. Tepsic
Geboren in Karlovac
2010
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Buck
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. Stephan Stilgenbauer
Tag der Promotion:
20.05.2011
Inhaltsverzeichnis
______________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
0. Abkürzungen.....................................................................................................................III
1. Einleitung...........................................................................................................................1
1.1. Maligne Lymphome.........................................................................................................1
1.1.1. Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese............................................................ 1
1.1.2. Klassifikation und Prognose................................................................................... 2
1.1.3. Staging ................................................................................................................... 4
1.2. Funktionelle Bildgebung mit FDG-PET........................................................................ 5
1.3. Möglichkeiten zur Beurteilung der Proliferationsrate maligner Tumore........................ 8
1.4. Ziele................................................................................................................................. 9
2. Material und Methoden................................................................................................. 11
2.1. Klinische Studie............................................................................................................ 11
2.1.1. Patientenkollektiv................................................................................................. 11
2.1.2. Radiochemische Synthese von FLT..................................................................... 11
2.1.3. Durchführung der FLT-PET bzw. FLT-PET/CT................................................. 12
2.1.4. Auswertung der FLT-PET bzw. FLT-PET/CT.....................................................13
2.1.5. Histopathologie- HE-Färbung.............................................................................. 14
2.1.6. Immunhistochemie- Ki-67Färbung...................................................................... 14
2.1.7. Routinestaging...................................................................................................... 14
2.1.8. Datenanalyse.........................................................................................................15
2.2. Tierexperimentelle Studie............................................................................................. 16
2.2.1. Induktion von Lymphom-Xenotransplantaten in immundefizienten
Mäuse.................................................................................................................... 16
2.2.2. Therapie-Schema.................................................................................................. 16
2.2.3. Bestimmung der Proliferationsaktivität im Lymphom-Xenotransplantat............ 16
2.2.4. Radiosynthese von [18F]FLT................................................................................ 17
I
Inhaltsverzeichnis
______________________________________________________________________
2.2.5. Durchführung der FLT-PET................................................................................. 17
2.2.6. Bestimmung der [18F]FLT-Biodistribution im Gamma-Counter......................... 18
2.2.7. Semiquantitative Bestimmung der [18F]FLT- Aufnahme in der PET.................. 19
2.2.8. Datenanalyse.........................................................................................................19
3. Ergebnisse....................................................................................................................... 20
3.1. Klinische Studie............................................................................................................. 20
3.1.1. Patientenkollektiv / Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse............ 20
3.1.2. Ergebnisse der Bildgebung von Lymphompatienten mit FLT-PET.................... 23
3.1.3. Grading maligner Lymphome: Vergleich von FDG-PET vs. FLT-PET.............. 27
3.1.4. Korrelation zwischen der Proliferationsfraktion und der [18F]FLT-Aufnahme.... 30
3.2. Tierexperimentelle Studie.............................................................................................. 33
3.2.1. Auswirkung der Steroidtherapie auf Proliferationsrate und Tumorgröße............ 33
3.2.2. Auswirkung der Steroidtherapie auf die [18F]FLT Aufnahme des Lymphoms...35
3.2.3. Bildgebung mit FLT-PET....................................................................................36
4. Diskussion....................................................................................................................... 38
4.1. Vergleich von FLT und FDG zum Staging maligner Lymphome................................ 38
4.2. Bestimmung der Proliferationsaktivität maligner Lymphome......................................41
4.3. Grading maligner Lymphome.....................................……………………………... 43
4.4. FLT-PET zur Evaluation des Therapieansprechens maligner Lymphome....................44
5. Zusammenfassung...........................................................................................................48
6. Literaturverzeichnis....................................................................................................... 50
7. Danksagung..................................................................................................................... 63
8. Lebenslauf........................................................................................................................64
II
0. Abkürzungen
______________________________________________________________________
0. Abkürzungen
Abb.
= Abbildungen
al.
= andere (lat. altera)
aqua dest.
= destilliertes Wasser
bzw.
= beziehungsweise
C
= Kohlenstoff
ca.
= circa
CLL
= chronisch lympathische Leukämie
cm
= Zentimeter
CT
= Computertomographie
DMSO
= Dimethylsulfoxid
DNA
= Desoxyribonukleinsäure
EKG
= Elektrokardiogramm
F
= Fluor
FDG
= [18F]-Fluor-Desoxyglucose
FLT
= [18F]-Fluor-Desoxythymidin
HCL
= Salzsäure
HIV
= human immunodeficiency virus
HPLC
= High-Pressure-Liquid-Chromatographie
HWZ
= Halbwertszeit
i.v.
= intravenös
keV
= Kiloelektronenvolt
kg
= Kilogramm
m
= männlich
M
= Mol
MALT
= mucosa associated lymphatic tissue
MBq
= Mega Becquerel
mg
= Miligramm
Min.
= Minuten
III
0. Abkürzungen
______________________________________________________________________
MIP
= Maximale Intensitäts- Projektion
Ml
= Mililiter
mm
= Millimeter
MRT
= Magnetresonanztomographie
N
= Stickstoff
neg.
= negativ
NHL
= Non-Hodgkin Lymphom
NK
= natürliche Killerzellen
O
= Sauerstoff
PBS
= Phosphatpuffer (phosphat buffered saline)
PET
= Positronen-Emissions-Tomographie
Pt
= Patient
r
= Korrelationskoeffizient
REAL
= Revised European American Lymphoma-Classification
ROI
= region of interest
s.c.
= subcutan
SUV
= standardized uptake value
Tab.
= Tabelle
TBR
= Tumor to background ratio
TK1
= Thymidinkinase 1
WHO
= World Health Organization
IV
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1. Maligne Lymphome
1.1.1. Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese
Es werden zwei Formen der malignen Lymphome unterschieden, Hodgkin-Lymphom und
Non-Hodgkin-Lymphom (NHL). Die Inzidenz des Morbus Hodgkin zeigt weltweit eine
geringe Variationsbreite (Parkin et al. 2005). Das Verhältnis zwischen Männern und
Frauen ist ca. 3:2. Jedes Jahr erkranken in Deutschland 3 von 100.000 Einwohnern an
Morbus Hodgkin. Der Anteil der Hodgkin-Lymphome an allen Krebserkrankungen beträgt
etwa 0,5%. Die Altersverteilung verläuft zweigipflig mit einem ersten Gipfel im 3.
Jahrzehnt und dem zweiten Gipfel in der 7. Dekade. Das mittlere Erkrankungsalter beträgt
ca.
35
Jahre
(Arbeitsgemeinschaft
Bevölkerungsbezogener
Krebsregister,
2006;
Dachdokumentation Krebs, Robert Koch-Institut). Die Ätiologie dieser Erkrankung ist
nicht vollkommen geklärt. Eine Assoziation zu Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus
wird beschrieben (Jarrett et al. 2003). In den westlichen Ländern konnte das Epstein-BarrVirus in 26-50% der Fälle im Tumor nachgewiesen werden (Armstrong et al. 1998). Das
Risiko, nach einer erfolgten Mononukleose an einem Hodgkin-Lymphom zu erkranken,
wird als 3fach erhöht beschrieben (Young et al. 2003). Ebenfalls ein erhöhtes
Erkrankungsrisiko besteht bei angeborenen und erworbenen Immundefekterkrankungen
wie z.B. HIV und nach allogener Knochenmarkstransplantation (Swerdlow et al. 2003).
An NHL erkranken in Deutschland pro Jahr 5 bis 10 pro 100.000 Einwohner. Die Inzidenz
dieser Lymphomgruppe hat sich in den letzten 25 Jahren bei Männern verdoppelt, bei
Frauen ist sie um 70% gestiegen
(Arbeitsgemeinschaft Bevölkerungsbezogener
Krebsregister, 2006; Dachdokumentation Krebs, Robert Koch-Institut). 80% aller NHL
sind B-Zell-Lymphome. Bei den NHL spielen Immundefekte (Knowles et al. 2003),
Infektionen (Matsuo et al. 2004) und durch Translokation entstandene Hybrid-Gene
(Kerbauy et al. 2004) eine Rolle in der Pathogenese der Lymphomentstehung.
1
1. Einleitung
1.1.2. Klassifikation und Prognose
Lymphome sind Neoplasien des lympathischen Systems. Gewöhnlich werden maligne
Tumore nach ihrer zellulären Herkunft klassifiziert. Lange Zeit war es nicht möglich,
dieses Prinzip erfolgreich auf die malignen Lymphome anzuwenden. Dies änderte sich erst
mit der Klärung der zellulären Zusammensetzung des lympathischen Gewebes und der
Entwicklung von Methoden, mit denen die verschiedenen Zellarten des lympathischen
Systems zuverlässig voneinander unterschieden werden konnten (Coupland et al. 2000).
Inzwischen wurde gezeigt, dass die zelluläre Herkunft die morphologischen und klinischen
Merkmale der meisten Lympomkrankheiten ganz wesentlich bestimmt und somit eine
Grundlage für die Klassifizierung der Lymphome darstellt (Coupland et al. 2000).
Jahrzehntelang standen sich in der Fachliteratur unterschiedliche Einteilungen der
malignen Lymphome gegenüber. Die Kiel- Klassifikation wurde im deutschsprachigen
Raum und die Working Formation-Klassifikation vor allem in den USA verwendet.
Anfang der 90er Jahre einigten sich die Pathologen der beiden Kontinente auf eine neue
gemeinsame Klassifikation, die
Revised-European-American-Lymphoma (R.E.A.L.)
Klassifikation. Im Mittelpunkt dieser neuen Einteilung stand die Definition distinkter
Lymphomkrankheiten, die sich mit guter Reproduzierbarkeit diagnostizieren lassen. Neben
den bisher beachteten Kriterien, wie den klinischen und morphologischen Merkmalen,
kamen jetzt die immunphänotypischen und molekulargenetischen Merkmale neu hinzu.
Prinzipiell wird in der WHO-Klassifikation jede Entität definiert durch die Kombination
morphologischer, immunphänotypischer, genetischer und klinischer Befunde (Harris et al.
1999). Modifikationen in der Terminologie sind adaptiert an die REAL-Klassifikation
(siehe Tabelle 1).
Die wichtigen Prognosefaktoren beider Lymphomarten sind die Histologie, das Staging,
das Lebensalter der Patienten, die B-Symptomatik, wozu Gewichtsabnahme über 10 %
innerhalb eines halben Jahres, Nachtschweiß und Fieber über 38°C gehören, und der
Allgemeinzustand des Patienten. Der Morbus Hodgkin hat eine günstige Prognose, er
gehört zu den am besten therapierbaren Malignomen mit einer 10-Jahres-Überlebensrate
von über 80% für Stadium II und über 60% für Stadium III. Im Stadium IV beträgt die 10-
2
1. Einleitung
Jahres-Überlebensrate über 40% (Josting et al. 2002). Bei den NHL beträgt die mittlere
Überlebenszeit bei den indolenten Lymphomen 10-20 Jahre und bei den aggressiven 3-4
Jahre (Dreyling 2010, Murawski et al. 2010).
Tabelle 1: WHO-Klassifikation der Lymphome (WHO = World Health Organization, MALT = mucosa
associated lymphatic tissue )
B-Zell-Ursprung
Chronische lymphozytische Leukämie/
lymphozytisches Lymphom
Lymphoplasmozytisches
Lymphom/Immunozytom/M. Waldenström
Haarzell-Leukämie
T-Zell-Ursprung
Leukämie großer granulärer Lymphozyten,
vom T- und NK- Zell Typ
Mycosis fungoides/Sézary Syndrom
"smoldering" und chronische adulte T-Zell
Leukämie/Lymphom (HTLV+)
Splenisches Marginalzonenlymphom
Marginalzonen-Lymphom
Extranodales (MALT-B-Zell) Lymphom
Nodales (monozytoid)
Follikelzentrums-Lymphom/follikulär, Grad I
Follikelzentrumslymphom/follikulär, Grad II
Prolymphozytenleukämie
Prolymphozytenleukämie
Plasmozytom/Multiples Myelom
Peripheres T-Zell Lymphom, nicht spezifiziert
Mantelzell-Lymphom
Angioimmunoblastisches Lymphom
Follikelzentrums-Lymphom/follikulär, Grad III Angiozentrisches Lymphom
Diffuses großzelliges B-Zell Lymphom
Intestinales T-Zell Lymphom
Primäres mediastinales (thymisches) BAnaplastisches großzelliges Lymphom (Tgroßzelliges Lymphom
und Null Zell-Typ)
Hochmalignes B-Zell Lymphom, Burkitt-ähnlich
Vorläuferzell B-lymphoblastisches
Vorläuferzell T-lymphoblastisches
Lymphom/Leukämie
Lymphom/Leukämie
Burkitt-Lymphom/akute B-Zell Leukämie
Adultes T-Zell Lymphom/Leukämie
Plasmazell-Leukämie
Morbus Hodgkin
Klassisches Hodgkin-Lymphom
-Noduläre Sklerose
-Lymphozytenreich
-Gemischte Zellulärität
-Lymphozytenarm
Noduläres Lymphozytenprädominantes Hodgkin-Lmphom
3
1. Einleitung
1.1.3. Staging
Die Diagnose eines malignen Lymphoms wird durch die Lymphknotenhistologie gesichert.
Zur Erfassung der Ausdehnung der Krankheit wird das klinische Staging durchgeführt.
Dazu gehört die Anamnese mit der Frage nach der B-Symptomatik (Fieber über 38°C,
Nachtschweiß und Gewichtsabnahme von mehr als 10% des ursprünglichen Gewichtes
innerhalb von 6 Monaten), die Laborbefunde, Röntgen des Thorax, Sonografie und CT des
Thorax und des Abdomens sowie die Knochenmarkbiopsie mit Zytologie. Gegebenfalls
wird bei der weiteren Fragestellung, insbesondere nach Befall von ZNS, auch eine MRT
durchgeführt. Ein sorgfältiges Staging ist entscheidend für die Prognose und Behandlung
der Lymphome. Das bisher bedeutendste Verfahren zum Staging der Patienten ist die CT.
Aussagen der CT über die Lymphadenopathien basieren auf der Lymphknotengröße. Dabei
gelten Lymphknoten als pathologisch deren Durchmesser signifikant vergrößert ist. Es
kann im CT jedoch nicht unterschieden werden zwischen reaktiv oder entzündlich
vergrößerten Lymphknoten und solchen, die maligne verändert sind. Auch ist das
Erkennen von kleinsten Tumorabsiedlungen in normal großen Lymphknoten nicht möglich
(Vinnicombe et al. 2003). Die gleichen Kriterien der Durchmesserbestimmung des
Lymphknotens gelten auch bei der MRT. Somit ergibt sich hier die gleiche Problematik
wie beim CT. Hierbei könnte jedoch die Verwendung von superparamagnetischem
Eisenoxid als Kontrastmittel zur Darstellung der Lymphknoten hilfreich sein. Das
Eisenoxid wird von den retikuloendothelialen Zellen aufgenommen, wodurch es zu einer
Signalminderung in T2-gewichteten Sequenzen kommt. In den Lymphknoten, die mit
Tumorzellen durchsetzt sind, fehlen retikuloendotheliale Zellen, und es kommt nicht zu der
Signalminderung. Damit können teilweise auch nichtvergrößerte Lymphknoten, die
tumorös infiltriert sind, im MRT erkannt werden. Weiterhin können jedoch
Mikrometastasen oder nur teilweise befallene Lymphknoten nicht eindeutig identifiziert
werden (Mack et al. 2002).
Die Stadieneinteilung bei den malignen Lymphomen erfolgt nach der Ann-ArborKlassifikation (siehe Tabelle 2).
4
1. Einleitung
Tabelle 2: Stadieneinteilung der maligne Lymphome nach der Ann-Arbor-Klassifikation. Es werden vier
klinische Stadien unterschieden.
I Befall einer einzigen Lymphknoten-Station oder Vorliegen eines einzelnen
extranodal lokalisierten Herdes (IE)
II Befall von zwei oder mehr Lymphknotenregionen auf einer Seite des
Zwerchfells oder Vorliegen lokalisierter extranodaler Herde und Befall einer oder
mehrerer Lymphknotenregionen auf einer Seite des Zwerchfells (IIE)
III Befall von Lymphknotenregionen auf beiden Seiten des Zwerchfells oder Vorliegen
lokalisierter extranodaler Herde und Befall einer oder mehrerer Lymphknotenregionen (IIIE) , sodass Herde auf beiden Seiten des Zwerchfells resultieren
IV disseminierter Befall eines oder mehrerer extralympathischer Organe mit oder
ohne Lymphknotenbefall
Zusätze: A: keine Begleitsymptome; B: mit Begleitsymptomen
E: extranodaler Befall (umschriebener Organbefall durch direktes Einwachsen
aus den beteiligten Lymphknoten oder im engen anatomischen Bezug)
S: Milzbefall
1.2. Funktionelle Bildgebung mit FDG-PET
Die Behandlungsgrundlagen der malignen Lymphome basieren auf der Histologie und dem
Tumorstaging. In den letzten zwei Jahrzehnten war die CT das wichtigste Verfahren zum
Tumorstaging und der Kontrolle des Therapieansprechens (Schreyer et al. 2005). Es ist
allerdings nicht möglich, nicht vergrößerte, aber bereits befallene Lymphknoten sicher zu
erkennen. Viele Behandlungsmethoden der malignen Lymphome sind zytostatisch und
führen nicht sofort zu einer Minderung der Größe des Tumors. Veränderungen der
Tumorgröße können erst nach Wochen oder Monaten nach der Therapie auftreten,
wodurch Entscheidungen über Therapiemodifikationen bei Nichtansprechen nicht schnell
genug getroffen werden können (Padhani et al. 2000).
5
1. Einleitung
In verschiedenen Studien wurde die FDG-PET als ein sensitives Verfahren zur
Aufdeckung nodaler, extranodaler und Knochenmarksbeteiligung in Vergleich zu den
konventionellen Stagingmethoden - wie der CT, dem Ultraschall oder der MRT - evaluiert
(Moog et al. 1997, Otero et al. 2009, von Falck et al. 2009, Kand et al. 2010). Die
Positronen-Emissions-Tomographie ist ein nuklearmedizinisches Schnittbildverfahren,
welches es ermöglicht, nicht-invasiv die Verteilung einer radioaktiv markierten Substanz
in vivo zu bestimmen. Die FDG-PET ist eine diagnostische Methode, mit der vitale
Tumore detektiert und gleichzeitig von den stoffwechselinaktiven diffenenziert werden
können. Das biochemische Konzept besteht darin, dass Desoxy-Glucose analog zu Glucose
durch Transporterproteine der Zellmembran ins Zellinnere transportiert wird, dieses nach
Phosphorylierung nicht mehr verlassen, dort aber auch nicht weiter katabolisiert werden
kann (siehe Abbildung 1).
FDG
FLT
Nukleosidtransporter
Glucosetransporter
(Glut-1)
FDG
Hexokinase II
FLT
Glucose-
Thymidin-
Thymidinkinase I
6-Phosphatase
dephosphorylase
FDG-6-PO4
FLT-PO4
DNA-Synthese
Glycolyse
Abbildung 1: „Trapping“-Mechanismus von FDG und FLT: FDG wird über den Glukosetransporter Glut-1
in die Zelle aufgenommen und dort, hauptsächlich durch die Hexokinase II, phosporyliert. Nachgeschaltet
finden kaum metabolischen Abbauprozesse statt, dadurch kumuliert das FDG-6-PO4 in der Zelle. FLT wird
in die Zelle über einen Nukleosidtransporter aufgenommen und durch die Thymidinkinase I phosporyliert. In
dieser Form wird es weder in quantitativ bedeutendem Ausmaß in die DNA eingebaut, noch dephosporyliert.
Es kommt ebenfalls zu einer intrazellulären Akkumulation. (FDG = Fluorodeoxyglucose; FLT =
Flurodeoxythymidin; DNA = Desoxyribonukleinsäure )
6
1. Einleitung
Viele Tumorentitäten weisen eine erhöhte intrazelluläre Aufnahme des Glukoseanalogons
FDG auf, zumeist bedingt durch eine erhöhte Expression des Glukosetransporters Glut-1 in
der Zellmembran und eine höhere Rate der intrazellulären Phosporylierung über den
Hexokinase-Signalweg. Das intrazelluläre Trapping der FDG-6-P beruht dabei auf der
gesteigerten Phosporylierung durch Hexokinasen. Somit wird FDG analog des
hochregulierten Glukosestoffwechsel in malignen Zellen vermehrt aufgenommen und kann
dazu benutzt werden metabolisch aktive Tumorherde darzustellen (Poeppel et al. 2009).
Zudem ist eine, nach der Chemotherapie persistierende, FDG-Anreicherung in
Lymphomen prognostischer Hinweis auf ein frühes Rezidiv und dabei der konventionellen
CT überlegen (Romer et al. 1998, Jerusalem et al. 2003). In weiteren Studien wurde
darüber berichtet, dass FDG-PET für die Kontrolle des Therapieansprechens verschiedener
Tumore verwendet werden kann, wie z.B. des Ösophaguskarzinom (Flamen et al. 2002),
des malignen Glioms (Spence et al. 2002) und des malignen Lymphoms (Spaepen et al.
2001, Matthies et al. 2001, van der Hiel et al. 2001).
FDG ist nicht tumorspezifisch (Wang et al. 2009, McDermott et al. 2010). Es kann sich
ebenfalls in entzündlichen Läsionen mit erhöhtem Glukoseverbrauch, z.B. Abszessen,
Pneumonien (Strauss et al. 1996), Tuberkuloseherden (Shreve et al. 1999), Sinusitiden
(Yasuda et al. 1998) oder Sarkoidoseherden (Yamada et al. 1998) anreichern und so zu
falsch positiven Ergebnissen bezüglich der Tumordiagnostik führen. Die FDG-Aufnahme
weist in Organen mit physiologisch hohem Glukosemetabolismus, z.B. im Gehirn und
Myokard, eine hohe Hintergrundaktivität auf. Weiterhin findet sich eine erhöhte
Konzentration im Urogenitaltrakt, da (entgegen der Glukose) eine FDG-Ausscheidung
über die Niere erfolgt. In der Skelettmuskulatur kann es ebenfalls zu einer Anreicherung
kommen, falls es nach der FDG-Gabe zu verstärkter Muskelaktivität oder einem erhöhten
Insulinspiegel kommt (Costelloe et al. 2009).
Vor dem Hintergrund dieser Limitationen ist es sinnvoll, neue Radiopharmaka zu etabliert
die nicht die Glucoseaufnahme des Tumors beurteilen sondern, wie beispielsweise die
Nukleoside, der DNA-Synthese dienen und somit unmittelbarer die Proliferationsaktivität
repräsentieren.
7
1. Einleitung
1.3. Möglichkeiten zur Beurteilung der Proliferationsrate maligner Tumore
Die quantitative Alteration der DNA-Synthese reflektiert einen radiogenen oder
chemotherapeutisch induzierten Zellschaden fakultativ besser als eine Veränderung der
Glukoseutilisation. Daher könnten nichtinvasive Messungen der Proliferationsrate
maligner Tumore hilfreich sein bei der Wahl der optimalen Therapie. Es wurden bereits
Radiopharmaka
als
potentiell
spezifische
Proliferationsmarker
zur
selektiven
Visualisierung maligner Tumore evaluiert, wie z.B. [11C] Thymidin. Es stellt ein
Pyrimidinbasenderivat dar, das für die in vivo DNA-Synthese gebraucht wird (Martiat et
al. 1988, van Eijkeren et al. 1996, Wells et al. 2002). Es wird in die DNA eingebaut und
dazu benutzt, die DNA-Syntheserate zu bestimmen (Vander Borght et al. 1991, Mankoff et
al. 1999). Weiterhin wurde gezeigt, dass die [11C] Thymidin Retention nach erfolgreicher
Therapie schneller abnimmt als die Retention von FDG (Shields et al. 1998). [11C]
Thymidin ist aufgrund des schnellen Abbaus (Shields et al. 1992, Shields et al. 1998) und
der kurzen Halbwertszeit des [11C] (20 min) für den Routinegebrauch in der Klinik
ungeeignet.
Das Thymidin-Analogon [18F] FLT ist in vivo stabil (Shields et al. 1998, Grierson et al.
2000) und ist beteiligt am Nukleosidstoffwechsel maligner Tumore. FLT wurde initial als
Chemotherapeutikum für die Behandlung von Leukämien verwendet (Blau et al. 1989),
wobei entdeckt wurde, dass dieser Antimetabolit eine anti-HIV Wirkung besitzt,
vergleichbar des Wirkmechanismus von Azidothymidin (Kong et al. 1992). In weiteren
klinischen Studien wurde jedoch eine höhere Toxizität des FLT, in pharmakologisch
wirksamen Dosierungen, beobachtet (Flexner et al. 1994). Die erfolgreiche Kopplung von
F-18 an FLT (Wilson et al. 1991) war ein Versuch, das [18F] FLT als ein Radiopharmakon
für das Monitoring von HIV-Infektionen zu benutzen. Dieser Ansatz wurde im Tiermodel
zwar nie getestet, somit wurde aber die Basis für die Darstellung der tumoralen
Proliferation mit Hilfe von FLT geschaffen.
Es konnte nachgewiesen werden, dass [18F] FLT in proliferierendem Gewebe akkumuliert
(Shields et al. 1998). FLT wird von den Zellen aufgenommen (siehe Abbildung 1) und
durch die Thymidinkinase 1 (TK1) phosporyliert, wodurch es zum intrazellulären Trapping
von FLT kommt (Kong et al. 1992, Barthel et al. 2005). Das Verbleiben des FLT innerhalb
8
1. Einleitung
der Zelle zeigt dabei die intrazelluläre TK-1-Aktivität. Die Thymidinkinase 1 ist ein
Enzym, welches im engen Zusammenhang mit der zellulären Proliferation steht. Studien
haben gezeigt, dass die TK-Aktivität um das 10-fache ansteigt, wenn die Zelle in die DNASynthesephase eintritt (Sherley et al. 1988). Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass
hohe TK-1-Aktivität mit dem Wachstum der Tumorzellen korreliert (Sakamoto et al. 1993,
Romain et al. 1997). Schließlich wurde die signifikante Korrelation der Tumorproliferation
und der FLT-Aufnahme im Maus-Modell für das Lymphom (Wagner et al. 2003) und am
Menschen für das Bronchialkarzinom (Buck et al. 2002) gezeigt.
1.4. Ziele
Die
Positronen-Emissions-Tomographie
stellt
die
derzeit
beste
Methode
dar,
Stoffwechselvorgänge in vivo mit hoher Ortsauflösung bildlich darzustellen und zu
quantifizieren.
Das
bisher
am
häufigsten
verwendete
Radiopharmakon
[18F]Fluorodesoxyglukose (FDG) hat eine hohe Sensitivität beim Nachweis maligner
Tumore und ist den konventionellen Methoden, wie z.B. dem CT oder MRT, überlegen
(Otero et al. 2009, von Falck et al. 2009). FDG reichert sich jedoch ebenfalls in
entzündlichen Läsionen an, wodurch die Spezifität limitiert wird. Neben dem
hochregulierten Glucosestoffwechsel ist die alterierte Zellzyklusregulation ein weiteres
Selektionskriterium maligner Tumore. Daher sollte durch radioaktive Markierung von
Nukleosiden, da diese die elementaren Bausteine in der DNA-Synthese sind, eine
selektivere Anreicherung im Tumor erreicht werden und diese mit der PET abgebildet
werden können. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, die proliferationsabhängige
Anreicherung von FLT in malignen Lymphomen nachzuweisen und zu zeigen, dass
dadurch die FLT-PET eine sinnvolle Ergänzung des Stagings maligner Lymphome
darstellt.
In einer prospektiven, klinischen Studie an Patienten mit histologisch gesichertem
Lymphom soll überprüft werden, ob die mittels PET in vivo quantifizierbare, tumorale
FLT-Aufnahme mit der Proliferationsaktivität im Tumor korreliert; diese wird ex vivo mit
9
1. Einleitung
der immunhistologischen Färbung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 als
Referenzmethode quantifiziert.
In einem weiteren Teil des Forschungsobjektes soll in einer tierexperimentellen
Versuchsserie das [18F] FLT zur Kontrolle des Therapieansprechens maligner Lymphome
nach einer antiproliferativen Therapie mit Prednisolon in einem Maus-XenotransplantatModell evaluiert werden. Es soll überprüft werden, ob die tumorale FLT-Aufnahme nach
der Therapie zeitnah signifikant sinkt und ob die mittels PET quantifizierte FLTAnreicherung mit der Proliferationsrate im Tumor korreliert.
10
2. Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1. Klinische Studie
2.1.1. Patientenkollektiv
In diese prospektive Studie wurden 28 Patienten eingeschlossen ( 19 Männer, 9 Frauen;
siehe Tabelle 3). Patienten mit histologisch gesicherten malignen Lymphomen, die an dem
Universitätsklinikum Ulm zum Staging oder Restaging aufgenommen wurden, nahmen an
der Studie teil. Patienten mit Lymphom-Manifestation im Knochen, mit Zweitneoplasien
und Patienten, die in den letzten 4 Monaten eine Radio- oder Chemotherapie hatten,
wurden in die Studie nicht aufgenommen. Alle Patienten gaben eine schriftliche
Einverständniserklärung über die Teilnahme an der Studie ab. Die Studie wurde von der
Ethikkommission der Universität Ulm genehmigt.
2.1.2 Radiochemische Synthese von FLT
Die Herstellung von [18F]FLT erfolgte aus benzoylgeschütztem Anhydrothymidin nach der
von Machulla beschriebenen Methode (Machulla et al. 2000). Die Radiosynthese wurde
ferngesteuert und vollautomatisch in einem PET-Synthesegerät (Nuclear Interface;
Münster) durchgeführt (Präcursor, Ansatzkit und Verbrauchsmaterial Merck, Darmstadt).
[18F]Fluorid wurde mittels der
18
O(p,n)18F Kernreaktion durch Beschuß von Isotopen
angereichertem [18O]Wasser mit einem 18 MeV-Strahl im Zyklotron Cyclone 18/9 (IBA,
Louvain, Belgien) erzeugt. Nach der Wiedergewinnung des [18O]Wasser mittels einer
QMA Kassette (Milford, USA) wurde das [18F]Fluorid mit 360 µl K2CO3 Lösung (3,3 mg
K2CO3) ausgewaschen.
20 mg Kryptofix 2.2.2. wurden danach zu 0,7 ml Acetonitril beigefügt, und das Gemisch
des [18F]Fluorids sowie des Kaliumkarbonats wurden bis zur Trockenheit eingedampft.
Der Eindampfungsvorgang wurde mit 1 ml Acetonitril wiederholt, um letzte Spuren von
Restfeuchtigkeit zu entfernen. Danach wurde eine Lösung von 10 mg des 5’-benzoyl-3’,2Anhydrothymidin in 1 ml DMSO zu dem trockenem Kryptat dazugefügt, und die
11
2. Material und Methoden
entstandene Lösung wurde 10 min lang bei 160 °C inkubiert. Durch Hydrolyse mit 1%iger
350 µl 1 M NaOH und Erhitzen bis 55°C für 10 min wurde die DMT-Schutzgruppe
entfernt. Danach wurde das Hydrolysat über eine Alox N Patrone transferiert um freies
[18F]Fluorid zu eliminieren. Anschließend wurde das [18F]FLT mittels präparativer
Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt. Für die Trennung des [18F]FLT wurde
eine
18
C-Säule (Phenomenex, Luna 5u, 250 x 10 mm) verwendet, die mit isotonischer
Natrium-Chlorid-Lösung und Ethanol (90/10, V/v) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5
ml/min ausgewaschen wurde. Die Verbleibzeit von FLT belief sich auf 10 min. Das FLT
wurde somit von
18
F-Verunreinigungen getrennt. Abschließend wurde das gewonnene
Produkt durch einen 0,2 µm Sterifix Filter (Braun, Melsungen) in eine sterile
Injektionslösung überführt.
2.1.3. Durchführung der FLT-PET bzw. der FLT-PET/CT
Die PET-Untersuchungen wurden an hochauflösenden, dedizierten Vollring-Tomographen
(ECAT Exact oder ECAT HR+; Siemens/CTI, Knoxville, USA), welche bei einem axialen
Gesichtsfeld von 15,5 cm 47 (ECAT Exact) oder 63 (ECAT HR+) Schnittbilder pro
Bettposition generieren, durchgeführt. Vierminütige Transmissionsscans mit einer
Germanium 68/Gallium 68-Stabquelle wurden vor der Tracerapplikation durchgeführt. Die
Schwächungskorrektur ist für die Quantifizierung der Tracer-Aufnahme per SUV
Voraussetzung. Die Patienten blieben 6 Sunden vor der PET-Untersuchung nüchtern.
Statische Emissionsscanner wurden 60 min nach der i.v. Injektion von 265-370 MBq
[18F]FLT (Mittelwert 334 MBq) bzw. 345-550 MBq
18
F-FDG (Mittelwert 391 MBq)
gestartet. Fünf Bettpositionen decken bei jedem Patienten ein Messfeld von 77,5 cm ab.
Die Emissionsscans umfassten jeweils Hals, Thorax, Abdomen, Becken und proximalen
Femur der Patienten; die Akquisitionszeit betrug 8 min pro Bettposition. Die Schnittbilder
wurden
im
Anschluss
mit
Hilfe
des
in
Abteilung
etablierten,
iterativen
Rekonstruktionsalgorithmus rekonstruiert (Schmidlin et al. 1997).
Die PET/CT erfolgte am General Electric Discovery LS Hybrid-Scanner. Die applizierte
Menge [18F]FLT betrug ebenfalls 265-370 MBq und wurde wiederum ca. 60 min vor dem
Start der Untersuchung verabreicht. Die PET/CT-Untersuchung begann mit der
12
2. Material und Methoden
Akquisition der CT in der so genannten Scout Definition des kombinierten Scanbereichs.
Die Patientenliege wurde nach Akquisition der CT-Daten automatisch in die erste PETBettposition gebracht. Der weitere Verlauf der Untersuchung entspricht dem der oben
genannten PET. Die CT-Transmissionsbilder wurden für die Schwächungs- und
Streustrahlenkorrektur der PET-Emissionsdaten verwendet, dadurch sind im PET/CT keine
separaten Transmissionsmessungen notwendig. Die Schnittbildrekonstruktion erfolgte mit
dem vom Hersteller mitgelieferten OSEM-Algorithmus. Zur Auswertung der PET/CT
wurde eine Fusions-Software verwendet. Diese ermöglicht die Auswertung von PET und
CT-Bildern separat für beide Datensätze oder im Fusionsmodus (GE Entegra bzw.
Xeleris).
2.1.4. Auswertung der FLT-PET bzw. FLT-PET/CT
Die Auswertung erfolgte verblindet ohne Kenntnis der Ergebnisse der Voruntersuchungen
(CT) oder des histologischen Befundes. Kriterien für einen positiven Befund im Sinne
eines Tumornachweises war eine eindeutige fokale FLT- Anreicherung in einem Gewebe
mit normalerweise niedrigem, homogenem Speichermuster. Diese Kriterien basieren auf
den Vorschlägen der Autoren, die erstmals mit [11C]-Thymidin und PET gearbeitet hatten
(Shields
et
al.
1998).
Zur
visuell-quantitativen
Auswertung
wurden
fokale
Mehranreicherungen in Organen mit üblicherweise fehlender oder homogener FLTSpeicherung als pathologisch gewertet.
Ergänzend zur visuell-qualitativen Befundung erfolgte eine semi-quantitative Bestimmung
der tumoralen Tracer-Aufnahme durch die Berechnung des jeweiligen standardized uptake
values (SUV). Der SUV ist ein dimensionsloser Parameter, der die relative Aufnahme des
Radiopharmazeutikum in einem Organ bzw. Gewebe beschreibt. Dieser relative Parameter
bezieht die in einem Gewebevolumen durch regions of interest (ROI) erhaltenen mittleren
Aktivitätswerte auf die injizierte Aktivitätsmenge und auf das Körpergewicht des Patienten
(SUV = Aktivitätskonzentration im Gewebe [Bq/g] x Körpergewicht [g] / applizierte
Aktivität [Bq]).
13
2. Material und Methoden
2.1.5. Histopathologie – HE-Färbung
Der histologische Befund wurde in der Abteilung Pathologie der Universität Ulm bei 17
Patienten anhand der Doppelfärbung der Tumorschnitte mit Hämalaun und Eosin erstellt.
Die Schnitte wurden entparaffiniert, mit Aqua dest. gewässert und in Hämalaun für 3-8
min gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte gespült und gebläut. Als nächstes folgte die
Färbung mit 0,1%iger Eosinlösung für 5-15 min. Abschließend wurden die Schnitte in 96100%iges Ethanol und danach in Xylol gelegt.
Als Färbeergebnis sind die Zellkerne, basophiles Zytoplasma und Kalk blau, azidophiles
Zytoplasma, Bindegewebe und Fibrin rot. Anhand dieser Schnitte wurden die Präparate
mit der besten Darstellung des Tumors für die Ki-67 Färbung ausgesucht.
2.1.6. Immunhistochemie - Ki-67-Färbung
Die immunhistochemischen Färbungen der klinischen Studie wurden im Rahmen der
klinischen Routine von der Abteilung Pathologie angefertigt. Die verwendeten Materialien
und technisches Vorgehen entsprechen der von uns unter 2.2.3 beschriebenen Methodik.
Die histologischen Präparate wurden unter einem Mikroskop evaluiert und bei jedem
Objekt 3 repräsentative Bereiche ausgewählt. Unter dem Mikroskop wurden dann in jedem
Bereich 200 Zellen ausgezählt, pro Objektträger 600 Zellen. Die Proliferationsaktivität des
Tumors wurde anhand des Prozentsatzes der MIB-1 gefärbten Kerne zu allen Kernen des
ausgesuchten Bereiches berechnet.
2.1.7. Routinestaging
Das Routinestaging beinhaltete die klinische Untersuchung, die laborchemische
Untersuchung, die Oberbauchsonographie, Röntgen-Thorax, CT des Thorax und des
Abdomens sowie die Knochenmarksbiopsie. Bei insgesamt 21 Patienten wurde eine FDGPET durchgeführt. Die FDG-Aufnahme in das Lymphomgewebe war der für das FLTPET beschriebenen Methode entsprechend. Um die Biodistribution von FLT mit der von
FDG zu vergleichen wurde zusätzlich die FDG-Aufnahme in normalen Organen berechnet.
14
2. Material und Methoden
2.1.8. Datenanalyse
Nach dem Beenden der klinischen Studie wurden die Ergebnisse der Histopathologie, des
Routinestaging und die FLT-Befunde miteinander korreliert. Mit Hilfe der linearen
Regressionsanalyse wurde der Anteil der Ki-67 positiven Zellen und der SUV von FLT
miteinander korreliert und der Korrelationskoeffizient r bestimmt. Die FLT-Aufnahme in
indolenten und aggressiven Lymphomen wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests
verglichen. Unterschiede wurden als signifikant betrachtet
p<0,05.
15
für das Signifikanzniveau
2. Material und Methoden
2.2. Tierexperimentelle Studie
2.2.1. Induktion von Lymphom-Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen
Für diese Studie wurden 12 immundefiziente CB-17 SCID-Mäuse verwendet. Die 6-8
Wochen alten Mäuse wurden vom zentralen Tierforschungszentrum der Universität Ulm
bereitgestellt. Die Tierversuche waren durch die zuständige Behörde genehmigt.
Die humane, follikuläre, CD-20 positive B-Zell-Lymphom Linie DoHH2 wurde für die
Induktion des Lymphom-Xenotransplantats verwendet. Von dieser Zelllinie ist bekannt,
dass Thymidinkinase 1, einem Schlüsselenzym des Salvage Signalwegs der DNA-Synthese
und somit erforderlich für das intrazelluläre Trapping von [18F]FLT, überexprimiert wird.
Zehn Millionen (10 x 106) DoHH2 Zellen wurden in 200 µl 0,9% NaCl suspendiert und
s.c. in die rechte Schulter jeder immundefizienten Maus injiziert. Nach 3-5 Wochen
erreichten die Tumore einen Durchmesser von 0,9 bis 2,8 cm, welcher mit einer
Schublehre gemessen wurde. Die Kinetik von [18F]FLT in DoHH2-Zellen wurde bereits
früher von einer Arbeitsgruppe unserer Abteilung beschrieben (Wagner et al. 2003).
2.2.2. Therapie-Schema
Die 12 Versuchstiere wurden mit einer i.v.-Einzeldosis von Prednisolon (Solu-Decortin,
Merck, Darmstadt) mit einer Dosierung von 1,5 mg pro kg Körpergewicht behandelt. Das
Therapieansprechen wurde 8 Tage nach der Einleitung der Therapie histologisch evaluiert.
Die Versuchstiere der Kontrollgruppe (n=10) wurden mit einer i.v. Injektion
physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) behandelt.
2.2.3. Bestimmung der Proliferationsaktivität im Lymphom-Xenotransplantat
Die formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitte
(5 µm) des zu
untersuchenden Tumorgewebes wurden entwachst, rehydriert und in einem 0,01 M
Citratpuffer in die Mikrowelle für 20 Minuten gelegt, um die Antigene zu demaskieren.
Als primärer Antikörper wurden 100 µl der monoklonalen Ki-67 spezifischen
16
2. Material und Methoden
Antikörperlösung MIB-1 (DAKO, Hamburg, Verdünnung 1:100 mit PBS) in einer
Verdünnung von 1:100 verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde ein Träger des
Peroxidase-Komplexes verwendet (EnVision, DAKO, Hamburg), welcher, zusammen mit
3-Amino-9-Äthylcarbazol (AEC, Sigma-Aldrich, Deisenhofen) als Chromogen diente und
die rötliche Färbung der Kerne bewirkte. In jedem Tumor Xenotransplantat wurde die
Proliferationsaktivität als Prozentanteil der MIB-1 gefärbten Zellkerne an der Gesamtzahl
der Zellkerne in vier repräsentativen Schnitten berechnet. Für die Bestimmung der
Immunreaktivität wurden 600 Zellen pro Schnitt und 2400 Zellen pro Tumor untersucht.
2.2.4. Radiosynthese von [18F]FLT
FLT wurde nach der von Machulla beschriebenen Methode (Machulla et al. 2000)
produziert. Die Herstellungmethode wurde im Rahmen der klinischen Studie schon
beschrieben (Abschnitt 2.1.2)
2.2.5. Durchführung der FLT-PET
Die FLT-PET wurde bei den behandelten Mäusen (n=12) und Kontrollmäusen (n=10)
direkt vor und 8 Tage nach der Applikation von 1,5 mg/kg KG Prednisolon (SoluDecortin, Merck, Darmstadt) durchgeführt.
Zur Anästhesie wurde 100 mg Ketamin (Ketanest, Parke-Davis, Karlsruhe) und 16 mg
Xylazin/kg (Rompun, Bayer Animal Health, Leverkusen) i.p. appliziert. 10-15 MBq
[18F]FLT wurde in die Schwanzvene der Versuchstiere injiziert. Nach einer Inkubationszeit
von 60 Minuten wurde die FLT-PET mittels einem hochauflösenden Vollring-Scanner
(ECAT HR+; Siemens/CTI, Knoxville, USA) durchgeführt, welcher 63 Schnitte pro
Bettposition produziert. Das axiale Gesichtsfeld betrug 15,5 cm, somit wurden die Mäuse
in einer Bettposition gemessen (Abbildung 2).
17
2. Material und Methoden
Abbildung 2:
Narkotisierte Mäuse im FLT-PET mit dem Siemens ECAT HR+
(FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie)
2.2.6. Bestimmung der [18F]FLT-Biodistribution im Gamma-Counter
Bei Kontrollmäusen und behandelten Mäusen wurde [18F]FLT in die Schwanzvene injiziert
(100 µl) mit einer Aktivitätsdosis von 5-10 MBq pro Maus. Nach der zweiten FLT-PET
wurden die Mäuse getötet und seziert. Gewebeproben von dem Lymphom, Blut, Herz,
Lunge, Leber, Milz, Niere, Interstitium, Magen, Knochen, Gehirn, Muskel und
Wirbelkörper wurden gewogen und mit einem Cobra II Auto-Gamma-Counter (Packard
Instrument) wurde die Radioaktivität in den Proben bestimmt. Die Daten wurden Zerfallkorrigiert und als mittlerer Prozentsatz (%ID) des Gewebes (g) angegeben (%ID/g).
18
2. Material und Methoden
2.2.7. Semiquantitative Bestimmung der [18F]FLT- Aufnahme in der PET
Die Identifikation des Tumorgewebes erfolgte im Frontalbild der MIP, einem
Projektionsverfahren zur Darstellung des Gesamtvolumens.
Für alle Tumor-Xenotransplantate wurde das Tumor-Hintergrund-Verhältnis (Tumor to
background-Ratio = TBR) berechnet. Für diese Berechnung wurde die Region of Interest
(ROI) in dem Tumorbereich und eine entsprechende ROI in die Muskulatur des rechten
Oberschenkels gelegt. Die Traceraufnahme in dem Oberschenkelbereich wurde als
Hintergrundanreicherung definiert. Tumor-Hintergrund Werte wurden für den mittleren
Messwert innerhalb der ROI berechnet.
2.2.8. Datenanalyse
Nach dem Beenden des tierexperimentellen Teils der Studie erfolgte der Vergleich der
Ergebnisse der Histopathologie und der FLT-Daten. GraphPad Prism Software
(Version 4,03, GraphPad, San Diego, CA) wurde für die statistische Analyse verwendet.
Es wurde jeweils Mittelwert, Median, Standardabweichung, tumorale [18F]FLT-Aufnahme
und
Proliferationsaktivität
der
mit
Prednisolon
behandelten
Gruppe
und
der
Kontrollgruppe berechnet.
Zur Bewertung der statistischen Signifikanz etwaiger Therapie-induzierten Unterschiede
zwischen den beiden Gruppen wurde der nicht-parametrische, in die Software implantierte
Mann-Whitney-U Test verwendet. Ein p-Wert kleiner als 0,05 wurde als signifikant
ertrachtet.
19
3. Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1.
Klinische Studie
3.1.1. Patientenkollektiv / Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse
Der histologische Befund ergab bei 12 Patienten die Diagnose eines indolenten Lymphoms,
wobei 6 Patienten ein follikuläres Lymphom Grad I, 1 Patient ein follikuläres Lymphom Grad
II, 1 Patient ein multiples Myelom (extraossär), 1 Patient ein Immunozytom, 1 Patient ein
nichtspezifibares follikuläres Lymphom und 2 Patienten einen Morbus Hodgkin (gemischter
Typ) aufwiesen. Bei 16 Patienten ergab sich die Diagnose eines aggressives Lymphoms,
hierbei hatten 11 Patienten ein diffus großzelliges B-NHL, 4 Patienten ein anaplastisch
großzelliges B-HNL und 1 Patient ein T-Zell reiches B-NHL. Das klinische Stadium der
Patienten wurde nach visueller Befundung der bildgebenden und klinischen Untersuchungen
festgelegt und die Zahl der jeweils mit FLT-PET oder im Routinestaging diagnostizierten
Lymphommanifestationen bestimmt (vgl. Tabelle 3, Spalte 2). Das Routinestaging beinhaltet
in unserer Klinik bei klinischer Indikation und technischer Verfügbarkeit auch eine
Diagnostik mittels FDG-PET; In unserem Patientenkollektiv war dies bei 19 von 28 Patienten
der Fall. Bei diesen Patienten wurde die Anreicherung der Radiopharmaka [18F]FLT und
[18F]FDG im intraindividuellen Vergleich semiquantitativ, d.h. mittels Angabe des
jeweiligen SUV, ermittelt; diese Ergebnisse wurden tabellarisch zusammengefasst (Tabelle
4).
20
3. Ergebnisse
Tabelle 3 : Vergleich von FLT-PET und Routinestaging bezüglich der Anzahl detektierter Läsionen
Übersicht über die Anzahl der jeweils mit FLT-PET und im Routinestaging entdeckten Läsionen in
Abhängigkeit zur jeweiligen histopathologischen Klassifizierung als indolentes oder aggressives NHL oder
eines Morbus Hodgkin. 28 konsekutiv eingeschlossenen Patienten mit gesichertem Lymphombefall erhielten
2004 an der Universitätsklinik Ulm sowohl eine Stadienbestimmung per FLT-PET als auch mit den
konventionellen Bildgebungsverfahren Sonographie und Computertomographie. (FLT = Fluordesoxythymidin,
PET = Positronenemissionstomographie, NHL = Non-Hodgkin-Lymphom)
PatNr.
Histologie
Alter
Klinisches
Stadium
Läsionen
im FLT-PET
Läsionen
Routinestaging
2
5
6
7
9
15
17
21
25
28
indolentes Lymphom
follikuläres Lymphom Grad I
Multiples Myelom (extraossär)
Immunozytom IgM (extraossär)
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad II
follikuläres Lymphom, nicht spezifiziert
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad I
60
67
44
57
70
38
53
48
37
53
IV A
IA
IV A
IV B
IV A
IV B
III A
II A E
III B
II A
79
3
8
53
5
51
14
3
29
3
79
3
3
57
5
52
14
2
15
3
4
27
Morbus Hodgkin, gemischte Zellularität
Morbus Hodgkin, gemischte Zellularität
20
19
IA
II A E
3
4
2
6
70
44
64
49
43
39
53
61
56
47
IV
IV
IV B
III B rel.
IV B rel.
IV B
III A
III E
IV B
IAE
33
1
6
3
5
2
2
33
11
1
13
1
6
2
5
2
2
25
3
1
42
39
66
38
58
38
II A E
IV A
II E B
III B
VI B
IA
4
3
59
17
6
7
-5
54
10
6
3
1
3
8
10
11
12
13
14
16
18
19
20
22
23
24
26
aggressive Lymphome
diffuses großzelliges B-NHL
anaplastisches großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL, mediastinal
diffuses großzelliges B-NHL
anaplastisches großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL,
zentroblastisch
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
anaplastisches großzelliges B-NHL
T-Zell reiches B-NHL
anaplastisches großzelliges B-NHL
21
3. Ergebnisse
Tabelle 4 : SUVs in Abhängigkeit von Lymphomhistologie und Proliferationsrate
Übersicht über die mittleren und maximalen SUVs der FLT- (FLT-SUV) und FDG-Untersuchung (FDG-SUV)
und der jeweils histologisch bestimmten Proliferationsrate (Ki-67 Index aus der exemplarisch biopsierten
Läsion) bei den 28 konsekutiv eingeschlossenen Patienten, die 2004 mit gesichertem Lymphombefall zur
Stadienbestimmung per FLT-PET und FDG-PET in der nuklearmedizinischen Abteilung der Universitätsklinik
Ulm vorgestellt wurden. (PET = Positronen-Emissions-Tomographie, n/a = nicht analysiert, FLT =
Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, SUV = standardized uptake value, NHL = Non-HodgkinLymphom)
Pat-
Histologie
Nr.
2
5
6
7
9
15
17
21
25
28
4
27
1
3
8
10
11
12
13
14
16
18
19
20
22
23
24
26
indolentes Lymphom
follikuläres Lymphom Grad I
Multiples Myelom (extraossär)
Immunozytom IgM (extraossär)
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad II
follikuläres Lymphom, nicht
spezifiziert
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad I
follikuläres Lymphom Grad I
Morbus Hodgkin, gemischte
Zellularität
Morbus Hodgkin, gemischte
Zellularität
aggressive Lymphome
diffuses großzelliges B-NHL
anaplastisches großzelliges BNHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL,
mediastinal
diffuses großzelliges B-NHL
anaplastisches großzelliges BNHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL,
zentroblastisch
diffuses großzelliges B-NHL
diffuses großzelliges B-NHL
anaplastisches großzelliges BNHL
T-Zell reiches B-NHL
anaplastisches großzelliges BNHL
mittlerer mittlerer Max.
FLTFDG- FLT-SUV
SUV
SUV
Max.
FDGSUV
Ki- 67 Index
2,0
1,3
2,1
4,5
2,9
6,3
2,1
1,4
3,9
n/a
3,6
1,8
3,7
8,1
4,6
10,2
2,8
1,8
6,1
n/a
4
n/a
n/a
n/a
50
2,6
1,5
2,7
2,8
1,9
4,5
3,2
3,1
n/a
n/a
4,2
2,7
4,2
5,1
3,2
6,5
5,1
3,9
n/a
n/a
n/a
1
5
n/a
20
1,4
1,4
2,2
2,6
2
2,0
3,6
3,2
5,2
5
5,5
3,1
10,3
4,7
80
4,1
4,8
6,6
3,6
5,6
5,3
10,5
5,5
80
80
4,7
n/a
6,6
n/a
85
3,2
3,1
5,6
4,0
n/a
9,2
5,3
5,8
5,7
4,4
n/a
n/a
n/a
2,0
5,2
12,3
8,7
10,4
9,7
5,9
n/a
n/a
n/a
3,2
7,8
n/a
80
95
48
n/a
8,5
8,5
4,8
15,9
13,2
8,5
17,0
5,2
8,7
21,2
22,5
13,8
n/a
n/a
100
5,8
6,4
6,2
n/a
9,5
10,9
8,3
n/a
90
n/a
8,3
n/a
14,3
n/a
90
22
3. Ergebnisse
3.1.2. Ergebnisse der Bildgebung von Lymphompatienten mit FLT-PET
FLT-PET erzeugt Bilder mit hohen Kontrasten – zum einen zwischen Lymphomen, zum
anderen aber auch zwischen physiologisch-hochproliferativem Gewebe und dem jeweiligen
Bindegewebshintergrund.
Der durchschnittliche SUV(max) der FLT-Aufnahme in den Lymphomen betrug 6,9 (Median
5,6, Standardabweichung 3,8, Streubreite 1,8 - 17,0) und der durchschnittliche SUV(max) der
FDG-Aufnahme 8,4 (Median 6,3, Standardabweichung 5,9, Streubreite 1,8 - 22,5).
Der durchschnittliche SUV(max) des FLT-Uptake in der Subgruppe der biopsierten und
histologisch klassifizierten Läsionen betrug 4,5 (Median 4,7, Standardabweichung 2,7,
Streubreite 1,3 – 9,2) und im Vergleich dazu der durchschnittliche SUV(max) des FDGUptake 5,0 (Median 5,1, Standardabweichung 3,3, Streubreite 1,5 – 16,2).
Die FLT-Anreicherung war im Vergleich zur FDG-Speicherung somit jeweils geringer; der
Unterschied ist statistisch signifikant (p<0,05).
Außer der Traceranreicherung in den malignen Lymphomen wurde eine hohe physiologische
FLT-Aufnahme im Knochenmark beobachtet (mittlerer SUV-Wert 6,9, Medianwert 6,9,
Streubreite 3,4 - 12). Die FLT-Aufnahme im Knochenmark war somit signifikant höher im
Vergleich zur Aufnahme im Lymphom (p<0,05). Der durchschnittliche SUV der FLTAufnahme in der Leber war 4,6 (Median 4,3, Streubreite 4,1-6,6), in der Milz 2,9 (Median
1,9, Streubreite 0,8-6,2), im Magen-Darm-Tarkt 1,9 (Median 1,8, Streubreite 0,9-3,4) und in
der Lunge 0,5 (Median 0,4, Streubreite 0,5-0,9). Im Gehirn wurde nur eine angedeutete FLTAufnahme beobachtet – durchschnittlicher SUV(max) 0,2 (Median 0,18, Streubreite 0,1-0,8).
In der Abbildung 3 wird die Biodistribution von FLT im Vergleich zur jeweiligen Verteilung
des FDG bei den Patienten gezeigt, die jeweils eine PET mit beiden Tracern bekommen
haben. Die malignen Lymphomen zeigten jeweils eine intensive Aufnahme beider
Radiopharma, die FLT-Speicherung war jedoch geringfügig, aber statistisch signifikant,
geringer als von FDG. Eine signifikant höhere physiologische Hintergrundanreicherung von
FLT als von FDG wurde im Knochenmark, in der Milz und in der Leber beobachtet (jeweils
23
3. Ergebnisse
p<0,05). Im Gegensatz zur physiologisch intensiven cerebralen Glukoseutilisation, d.h. hoher
FDG-Anreicherung, zeigt das Gehirn lediglich eine flaue FLT-Aufnahme.
FLT
FDG
durchschnittlicher SUV
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Lymphom
Knochen
Leber
Milz
Magen-
Lunge
Gehirn
Darmtrakt
Abbildung 3: Biodistribution von [18F]FLT
Durchschnittliche Aufnahme (SUV) von FLT im malignen Lymphom und Normalorganen im Vergleich zur
Aufnahme des Glucoseanalogons FDG.
(FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, SUV = standardized uptake value)
Die im Routinestaging beschreibenen Lymphommanifestationen waren bei allen untersuchten
Patienten auch in der PET FLT-positiv. An 12 Patienten konnten per FLT-PET ergänzend 75
weitere Läsionen identifiziert werden, an 4 Patienten wurden per FLT-PET insgesamt 9
Läsionen weniger detektiert als mit den konventionellen Verfahren.
Bei einem Patienten war z.B. nur im FLT-PET bereits initial eine cerebrale Mehrspeicherung
Darstellbar (Abbildung 4). Da diese im Verlauf mit FDG-PET/CT und MRT validiert wurde,
ist diese Manifestation als „richtig-positiv“ in der FLT-PET und „falsch-negativ“ in den
bildgebenden Standartverfahren zu werten.
24
3. Ergebnisse
a
c
b
d
e
d
Abbildung 4: Nur mit FLT-PET bereits initial dargestellte periventrikuläre Lymphommanifestation;
validierbar nach 3 Wochen mit MRT und FDG-PET
a) MIP: FLT-PET, Patient 22 mit einem diffus großzelligem B-Zell NHL, klinisches Stadium II E B und
einer durchschnittlichen FLT-SUV von 4,8. Im Hautniveau links parieto-occipital, im paramandibulären
Weichteilgewebe links bis prämental sowie links retromandibulär und fokal sublingual ist eine
intensive, ausgedehnte FLT-Mehranreicherung zu sehen. Weitere, gering intensive fokale
Mehranreicherung findet sich links cervical, entlang der Gefäßnervenscheide, von der Schädelbasis bis
in Höhe der Clavicula reichend.
b) FLT-PET transversaler Schnitt, cerebrale Manifestation des Lymphoms. Es ist eine mäßig intensive
fokale FLT-Speicherung periventrikulär bds. und im Gyrus cinguli erkennbar.
c) CT-Schädel, transversaler Schnitt
d) FDG-PET-CT Fusionsbild
e) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 100 % Ki-67 positiver Kerne.
(FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, PET = Positronenemissionstomographie, SUV =
standardized uptake value, MIP = maximale Intensitäts Projektion, CT = Computertomographie, NHL = NonHodgkin Lymphom, MRT = Magnetresonanztomographie)
Unter den, diskrepant zur morphologischen Bildgebung, FLT-negativen Befunden befanden
sich 3 ossäre Läsionen die aufgrund des physiologisch hohen Hintergrunds nicht abgrenzbar
waren und im Gesamtkontext als „falsch-negativ“ zu werten sind (Abbildung 5).
25
3. Ergebnisse
a
b
Abbildung 5: Im FLT-PET “falsch-negative” ossäre Lymphommanifestation
a) FLT-PET, Patient 4 mit Morbus Hodgkin, Mischtyp, klinisches Stadium I A, durchschnittliche FLTSUV 1,4. Es sind vergrößerte mediastinale Lymphknoten erkennbar (Pfeil).
b) Korrespondierende cerebrale und transaxiale Schichten der FDG-PET von demselben Patienten,
durchschnittliche FDG-SUV 3,1. Außer den auch im FLT-PET gesehenen Lymphknoten mediastinal
wurde hier zusätzlich eine ossäre Manifestation (roter Pfeil) des Tumors festgestellt, welche in der FLTPET aufgrund der hohen Anreicherung im proliferierendem Knochenmark nicht zur Darstellung
kommt.
(FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, PET = Positronenemissionstomographie, SUV =
standardized uptake value )
Die Gesamtzahl der an 28 Patienten detektierten Läsionen betrug 448 mit der FLT-PET, 376
mit den Routineverfahren (vgl. Tabelle 3, Spalten 5,6). Die scheinbar höhere
Nachweisbarkeitsrate der FLT-PET ist statistisch jedoch nicht signifikant (p=0,21; MannWhitney-U-Test). Letztendlich wurden sowohl mit den Standartverfahren, als auch mit der
FLT-PET bei allen Patienten jeweils das gleiche klinische Stadium diagnostiziert (vgl.
Tabelle 3).
26
b
3. Ergebnisse
3.1.3. Grading maligner Lymphome: Vergleich von FDG-PET vs. FLT-PET
Ohne Berücksichtigung der Histologie betrug der Mittelwert der SUV(mean) der FLTAufnahme in der gesamten Subgruppe der biopsierten Läsionen 4,2 (Median 4,3,
Standardabweichung 2,2, Streubreite 1,3 – 9,2). Bei den 12 Patienten mit indolenten
Lymphomen
betrug
der
durchschnittliche
SUV(mean)
dabei
2,3
(Median
2,1,
Standardabweichung 0,9, Streubreite 1,3 - 4,5), der durchschnittliche SUV(max) 3,9 (Median
3,7, Standardabweichung 1,6, Streubreite 1,8 - 8,1). Bei den 16 Patienten mit aggressiven
Lymphomen war die durchschnittliche FLT-Aufnahme SUV(mean) 5,6 (Median 5,4,
Standardabweichung 1,7, Streubreite 3,2 – 9,2), durchschnittliche SUV(max) belief sich bei
diesen Patienten auf 9,1 (Median 9,1, Standardabweichung 3,4, Streubreite 5,2 – 17,0). Der
durchschnittliche FLT-SUV(mean) bei Patienten mit einem Morbus Hodgkin war 1,7; FLTSUV(max) 2,7.
Im Vergleich zu den indolenten Lymphomen wiesen die aggressiven Lymphome somit eine
signifikant höhere FLT-Aufnahme auf (p<0,0001).
Die durchschnittliche FDG-Aufnahme SUV(mean) in den biopsierten Läsionen betrug ohne
Berücksichtigung der Histologie 5,5 (Median 4,2, Standardabweichung 3,8, Streubreite 1,4 –
15,9). Bei 10 Patienten mit indolentem Lymphom war die durchschnittliche FDG-Aufnahme
SUV(mean) 3,5 (Median 3,4, Standardabweichung 1,6, Streubreite 1,4 – 6,3), der
durchschnittliche SUV(max) 5,3 (Median 5,2, Standardabweichung 2,6, Streubreite 1,8 –
10,2). Bei 12 Patienten mit aggressiven Lymphom war die durchschnittliche FDG-Aufnahme
7,1 (Median 6,4, Standardabweichung 4,3, Streubreite 3,1 – 15,9), der durchschnittliche FDGSUV(max) betrug 11,0 (Median 9,4, Standardabweichung 6,6, Streubreite 3,2 – 22,5). Der
durchschnittliche FDG-SUV(mean) bei Patienten mit einem Hodgkin-Lymphom war 2,5;
FDG-SUV(max) 4,1.
Die durchschnittliche FDG-Aufnahme der aggressiven Lymphome war somit nicht signifikant
höher im Vergleich zu den indolenten Lymphomen (p = 0,16).
Bei Verwendung der receiver operating characteristic (ROC) Analyse, unterscheidet der
durchschnittliche FLT-SUV zwischen aggressiven und indolenten Lymphomen mit einem
Bereich unter der Kurve (area under the curve =AUC) von 0,98 (maximaler FLT-SUV 0,97).
27
3. Ergebnisse
Im Vergleich dazu unterscheidet die durchschnittliche FDG-SUV zwischen diesen beiden
Lymphomformen nur mit einer AUC von 0,78 (maximaler FDG-SUV 0,79).
Die Abbildung-6 illustriert den funktionsbildgebenden Unterschied von einem indolenten (ac) und einem aggresiven Lymphom (d-f) an jeweils einem inguinal lokalisiertem
Lymphombulk.
Abbildung 6: Geringer FLT-Uptake in indolentem, intensiver FLT-Uptake im aggresiven Lymphom
A) FLT-PET, Patient 2 mit einem follikulären Lymphom Grad I. Im proliferierenden Knochenmark ist ein
physiologisch intensiver FLT-Uptake zu sehen.
In der Leber findet sich ein niedriger FLT-Uptake, bedingt durch die FLT- Glukoronisation. Weiterhin
ist eine niedrige FLT-Aufnahme ebenso in der vergrößerten Milz und in den paraaortalen, iliakalen und
inguinalen Lymphknoten zu sehen (Pfeil).
B) PET- transaxialer Schnitt in Höhe der Inguinalregion. Es ist ein geringer FLT-Uptake im Lymphom
links inguinal zu sehen (Pfeil).
C) Ki-67 Immnhistochemische Färbung des aus dem linken Inguinallympknoten entnommenen Gewebes
mit einer niedrigen Proliferationsfraktion von 4%.
D) FLT-PET, Patient 14 mit einem diffus großzelligem NHL, klinisches Stadium III E, und einem
mittleren FLT-SUV von 5,8. Im proliferierenden Knochenmark ist ein physiologisch intensiver FLTUptake zu sehen. In den cervicalen, axillären, mediastinalen, paraaortalen, iliacalen und inguinalen
Lymphknoten ist eine intensive FLT-Aufnahme erkennbar (Pfeil).
E) PET- transaxialer Schnitt in Höhe der Inguinalregion. Es zeigt sich eine intensive FLT-Aufnahme im
Lymphom links (Pfeil).
F) Ki-67 Immnhistochemische Färbung des aus dem li. Inguinallympknoten entnommenen Gewebes mit
einer hohen Proliferationsfraktion von 95%.
(FLT = Fluordesoxythymidin, PET =
Positronenemissionstomographie, NHL = Non-Hodgkin Lymphom, SUV = standardized uptake value)
28
3. Ergebnisse
Mit Ausnahme von Patient-7 mit einem niedrig-gradigem follikulärem Lymphom und einem
FLT-SUV von 4,5, haben unsere Ergebnisse bei FLT-SUV=3,0 eine Grenze ergeben, die
zwischen indolenten und aggressiven Lymphomen trennt (Abbildung 7a). Die FDG-SUVs
von indolenten und aggressiven Lymphomen überlappen zu einem großen Teil, ein trennender
„cut-off“-Wert war nicht zu definieren (Abblidung 7b).
mittlerer FDG-SUV
Abbildung 7a:
FLT-Anreicherung (mittlerer FLT-SUV) in biopsierten Läsionen der indolenten und aggressiven Lymphome.
Mit Ausnahme von Patienten 7 unterscheidet ein Trennwert von SUV=3,0 zuverlässig indolente von aggressiven
Lymphomen. (FLT = Fluordesoxythymidin, SUV = standardized uptake value)
indolent
aggressiv
Abbildung 7b:
Durchschnittliche FDG-SUV Werte der biopsierten Läsionen der 7 Patienten mit indolentem und der 10
Patienten mit einem aggressiven Lymphom. Es wurde eine Überlappung der FDG-SUV Werte (von 1,4 – 5,8)
der aggressiven und indolenten Lymphome festgestellt.
(FDG = Fluordesoxyglucose, SUV = standardized uptake value)
29
3. Ergebnisse
Der oben genannte statistische Ausreiser (Pat.-7) wurde jedoch nach erneuter Biopsie 4
Wochen später reklassifiziert – von niedrig-gradigem follikulärem Lymphom in ein
anaplastisches großzelliges B-NHL (Abbildung 8).
b
a
c
Abbildung 8: Transformation indolent – aggressiv; Prädiktion durch vorrausgehendem ungewöhnlich
hohem FLT-Uptake
Patient 7 mit der initialen Diagnose eines follikulären Lymphoms Grad I, nach vier Wochen Reklassifizierung
und Diagnose anaplastisches großzelliges B-NHL
a) FLT-PET im Coronalschnitt, multiple intensive Mehranreicherungen cervical bds. (rechts intensiver),
infraclaviculär bds. bis axillär bds. reichend. Paraaortale, inguinale und iliacale Lymphome bds.
Mediastinale Mehranreicherung.
b) Übersichtsaufnahme (MIP): Lymphombefall des Muskels
c) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 88% Ki-67 positiven Zellkerne.
(FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie value, NHL = Non-Hodgkin Lymphom,
MIP = maximale Intensitäts Projektion)
3.1.4 Korrelation zwischen der Proliferationsfraktion und der [18F] FLT-Aufnahme
Bei insgesamt 18 Patienten, bei welchen genügend Lymphknotengewebe zur Verfügung
stand, wurden die Proben immunhistochemisch gefärbt. Bei den restlichen 10 Patienten waren
die Gewebeproben zu klein für die immunhistologische Auswertung, jedoch ausreichend für
die Histopathologie. Alle Gewebeproben der malignen Lymphome enthielten Ki-67 positive
Zellen.
30
3. Ergebnisse
In der MIB –1 Immunhistochemie war die durchschnittliche Proliferationsfraktion der
Lymphomproben 54 % (Median 50%, Standardabweichung 38,6%, Streubreite 1 – 100%).
Bei den 7 biopsierten indolenten Lymphomen betrug die durchschnittliche Proliferationsrate
12,7% (Standardabweichung 17,5%, Streubreite 1 – 50%). Bei den 10 aggressiven
Lymphomen
belief
sich
die
durchschnittliche
Proliferationsrate
auf
82,8%
(Standardabweichung 14,1%, Streubreite 48 – 100%). Die lineare Regressionsanalyse zeigte
bei allen malignen Lymphomen eine signifikante Korrelation zwischen [18F] FLT-SUV und
dem Ki-67-Index (p<0,001; r=0,86; Abbildung 9). Die Abbildungen 10 illustriert mit einem
Bildbeispiel die geringe FLT-Aufnahme in einem indolenten Lymphom mit niedriger, die
Abbildung 11 die intensive FLT-Anreicherung bei einem aggressiven Lymphom mit hoher
mittlerer FLT-SUV
Proliferationsrate.
Fraktion der Ki-67 positiven Zellen (%)
Abbildung 9:
Lineare Regressionsanalyse des mittleren tumoralen [18F]FLT-SUV und der Proliferationsfraktion (Prozentsatz
der Ki-67 positiven Zellen): signifikante Korrelation für p<0,0001.
(FLT = Fluordesoxythymidin, SUV = standardized uptake value)
31
3. Ergebnisse
b
a
d
e
c
Abbildung 10: Niedriger FLT-SUV bei einem Lymphom Grad I.
a) MIP: FLT-PET, Patient 21 mit follikulärem NHL Grad I, klinisches Stadium II A E, und einem
niedrigem mittleren FLT-SUV von 2,7.
b) PET- transversaler Schnitt in Höhe der HWS mit geringer FLT-Speicherung in einem medial des M.
Sternocleidomastoideus re. gelegenem LK (Pfeil).
c) CT-transversaler Schnitt, geringgradige Vergrößerung des LK medial des M. Sternocleidomastiodeus.
d) Übersicht (1:10) des entnommenen LK-Gewebes (Ki-67 Immunhistochemie).
e) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 5% Ki-67 Antigen positiver
braungefärbter Zellkerne (1:200).
(FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie, SUV = standardized uptake
value, MIP = maximale Intensitäts Projektion, LK = Lymphknoten, CT = Computertomographie,
M = Muskulus, HWS = Halswirbelsäule, NHL = Non-Hodgkin Lymphom)
a
b
d
c
e
Abbildung 11: Hoher FLT-SUV bei anaplastischem NHL
a) MIP: FLT-PET, Patient 26 mit anaplastisch großzelligem B-NHL und einem hohen FLT-SUV von 8,3
im biopsierten Lymphom axillär rechts (Pfeil).
b) PET- transversaler Schnitt in Höhe der LWS mit intensiver FLT-Anreicherung in axillär gelegenen LK
rechts (Pfeil).
c) CT- transversaler Schnitt, deutliche Vergrößerung der LK axillär rechts.
d) Übersicht des entnommenen LK-Gewebes.
e) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 90% Ki-67 positiven Zellkerne
(FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie, SUV = standardized uptake value,
LWS = Lendenwirbelsäule, MIP = maximale Intensitäts Projektion, LK = Lymphknoten, CT=
Computertomographie, NHL = Non-Hodgkin Lymphom)
32
3. Ergebnisse
3.2. Tierexperimentielle Studie
3.2.1. Auswirkung der Steroidtherapie auf Proliferationsrate und Tumorgröße
Die Referenzmethode für die Bestimmung der Proliferationsfraktion im Tumor ist die
Immunhistochemie; In unserem Design wurde eine Färbung des Proliferationsmarkers Ki-67
durchgeführt.
In den Tumorproben der unbehandelten Versuchstiere (n=6) waren 83,6% der Tumorzellen
Ki-67 positiv, was einer hohen Proliferationsaktivität entspricht (Standabweichung 2,8,
Median 82,5%, Streubreite 80,0% - 89,5%, Abbildungen 12a, 13a). Nach Therapie mit einer
Einzeldosis Prednisolon (1,5 mg/kg i.v.) war die durchschnittliche Proliferationsfraktion in
den Versuchstieren (n=12) 53,8% (Median 58,6%, Standardabweichung 4,9%, Streubreite 39
– 69,9%; Abbildungen 12b, 13b). Der Rückgang der Proliferationsfraktion war statistisch
signifikant (p=0,001).
Vor Beginn der Therapie wurde die Größe jedes Tumors mit Hilfe einer Schublehre bestimmt.
Vor Therapie war der durchschnittliche Durchmesser der Lymphome 2,3 cm (Median 2,2 cm,
Standardabweichung 0,4 cm, Streubreite 1,6 – 2,7cm). Acht Tage nach dieser Therapie hat
sich der Tumordurchmesser signifikant vergrößert (2,8 cm, Medianwert 2,9 cm,
Standardabweichung 0,5 cm, Streubreite 1,6 – 3,4 cm; p<0,0001; Mann-Whitney-Test).
33
3. Ergebnisse
a
b
1
2
5
6
1
2
5
6
7
9
10
11
3
3
4
4
8
12
Abbildung 12: Immunhistologische Färbungen des Tumorgewebes
a) Kontrollgruppe, Versuchstiere 1-6. Durchschnittlicher Prozentsatz der Ki-67 positiven Zellen 83,6 %.
b) Nach achttägiger Behandlung mit Prednisolon, Versuchstiere 1-12. Durchschnittlicher Prozentsatz der
Ki-67 positiven Zellen 53,8%.
34
3. Ergebnisse
3.2.2. Auswirkung der Therapie auf die [18F]-FLT-Aufnahme des Lymphoms
[18F]-FLT wurde einer Kontrollgruppe (n=10) und der Gruppe der mit Prednisolon
behandelten Mäuse (n=12) intravenös verabreicht und die Aufnahme von [18F]-FLT in die
Lymphome und andere Organe wurde mittels eines Cobra II Auto Gamma-Counter (Packard
Instrument) gemessen. Die durchschnittliche tumorale FLT-Aufnahme in der unbehandelten
Gruppe betrug 5,4% ID/g (Median 5,3%, Standardabweichung 2,4%, Streubreite 1,6 – 9,3).
Acht Tage nach der Verabreichung von Prednisolon wurde eine signifikant niedrigere
(p=0,0003)
FLT-Aufnahme
in
den
Lymphom-Xenotransplantaten
beobachtet
(durchschnittlicher Wert 1,3% ID/g, Median 0,9%, Standardabweichung 1,4%, Streubreite 0,1
– 2,2%; Abbildung 13).
Aus den Gamma-Counter-Daten wurde ergänzend ein Tumor/Muskel-Verhältnis berechnet,
was
am
ehesten
ein
realistisches
invitro-Surrogat
für
das
Kontrastverhältnis
Tumor/Hintergrund der PET-Bildgebung darstellt. Auch dieser relative AnreicherungsQuotinent zeigte bei den mit Steroid behandelten Tieren (durchschnittlicher Wert 1,1,
Standardabweichung 0,7) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (durchschnittlicher Wert 4,2,
Standardabweichung 2,6) einen signifikanten Rückgang.
35
3. Ergebnisse
a
b
Abbildung 13:
a)
Durchschnittliche Proliferationsfraktion (Prozent Ki-67 positiver Zellkerne/Gesamtzahl der Kerne) der
Kontrollgruppe ohne Therapie (n=10) und der Therapiegruppe 8 Tage nach der Behandlung mit
Prednisolon (n=12). Die Proliferationsfraktion nimmt signifikant ab (p=0,0001).
b) Durchschnittliche FLT-Aufnahme im Lymphom der Kontrollgruppe (n=10) und der therapierten
Gruppe (n=12), p<0,0003. (FLT = Fluordesoxythymidin)
3.2.3. Bildgebung mit FLT-PET
Die FLT-PET wurde bei den 12 Versuchstieren vor und 8 Tage nach der Steroidtherapie
durchgeführt. In der Abbildung 14 sind transaxialen Schnittbilder in Höhe der
Tumorlokalisation im intraindividuellen Verglich vor und nach Steriodtherapie abgebildet, in
36
3. Ergebnisse
denen jeweils eine Regions of interest (ROI) für die Berechnung der Tumor/HintergrundRatio (TBR) definiert wurden. Die durchschnittliche TBR vor der Therapie betrug 3,1
(Standardabweichung 0,8, Streubreite 1,9 – 4,9), 8 Tage nach der Therapie mit Prednisolon
verringerte sich die TBR auf einen durchschnittlichen Wert von 1,6 (Standardabweichung 0,6,
Streubreite 1,1 – 2,0; p=0,0014).
VT
TBR:4.9
TBR: 3.5
TBR:4.6
TBR:1.7
TBR:2.0
TBR:2.6
NT
TBR:2.0
TBR:1.8
VT
TBR: 2.2
TBR: 1.9
TBR:
2.12,1
TBR:
TBR:1.3
TBR:1.2
TBR:1.1
NT
Abbildung 14:
Transaxiale Schichten der jeweils gleichen Versuchstiere vor Therapie (VT) und nach Therapie (NT). Es ist eine
deutliche Mehranreicherung vor der Therapie erkennbar (roter Pfeil).
(TBR = tumor/background-ratio)
37
4. Diskussion
4. Diskussion
4.1. Vergleich von FLT und FDG zum Staging maligner Lymphome
Zur Zeit ist die morphologische Bildgebung (Sonographie, CT, MRT) das verbreiteste
Verfahren für das Routinestaging maligner Lymphome (Cheson et al. 2007). Dabei werden
allerdings nur morphologische Veränderungen, d.h. Größe und Struktur einer
Raumforderung, beurteilt. Da auch gutartige Erkrankungen zu vergrößerten Lymphknoten
führen können ist die Spezifität der Methode bei lediglich diskreten Veränderungen
limitiert. Die Methode ist „blind“ für Lymphknotenmetastasen die noch kleiner als deren
physiologischer Durchmesser, d.h. in manchen Lokalisationen 1-1,5 cm, sind. Die
Bestimmung
der
Proliferationsrate
eines
Gewebes
stellt
ein
zusätzliches,
größenunabhängiges Dignitätskriterium dar. Wir haben untersucht, ob sich durch die
Aufnahme dieses zusätzlichen Beurteilungskriterium - in Form der funkionellen
Bildgebung mit FLT-PET - das Staging eines Lymphompatienten relevant verbessern lässt.
In verschiedenen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die funktionelle Bildgebung
mit der FDG-PET für die Beurteilung der Tumorausbreitung einen Benefit erbringt und die
Methode gilt heute bereits als etabliertes Verfahren für das Staging und Restaging maligner
Lymphome (Jerusalem et al. 2003, Naumann et al. 2001). Der Nachteil des GlukoseAnalogons FDG ist, dass es nicht tumorspezifisch ist. Es reichert sich auch in
entzündlichen Läsionen wie z.B. Abszessen und Pneumonien an (Strauss et al. 1996).
Weiterhin kann es sich in Tuberkuloseherden (Shreve et al. 1999), Sinusitiden (Yasuda et
al. 1998) und Nekrosen (Belakhlef et al. 2008) anreichern und so zu falsch positiven
Ergebnissen führen. Die diagnostische Genauigkeit des FDG-PET ist damit herabgesetzt
(Shreve et al. 1999). FLT dagegen reichert sich kaum in entzündlichen Läsionen an (Van
Waarde et al. 2004) und könnte daher potentiell tumorspezifischer sein. Der diagnostische
Stellenwert von FLT wurde bereits für diverse Tumorentitäten evaluiert, z.B. beim
Bronchialkarzinom, HNO-Tumore, Magentumore (Buck et al. 2005, Herrmann et al.
2007). Bei diesen Autoren wurde die FLT-PET jeweils als sehr spezifische
Untersuchungsmethode bestätigt, allerdings war die Sensitivät zum Teil limitiert.
38
4. Diskussion
In der vorliegenden Studie wurde bei 21 Patienten die Positronen Emissions Tomographie
jeweils mit FLT und FDG als Marker für proliferative Aktivität bzw. Glucosestoffwechsel
durchgeführt. Beide Radiotracer zeigten eine gesteigerte Aufnahme in Lymphomen. In den
per Biopsie definitiv als Lymphommanifestationen bestätigen Raumforderungen war die,
semiquantitativ bestimmte, Akkumulation nicht signifikant verschieden – der mittlere
SUV(max) für FLT lag bei 6,9 und für FDG bei 8,4. Signifikante Unterschiede der beiden
Tracer zeigten sich bezüglich der physiologischen Biodistribution. Die FLT-Aufnahme im
Knochenmark war signifikant höher als jene von FDG und lag im Gegensatz zu diesem
sogar noch über der Aufnahme des Lymphoms. Auf der anderen Seite zeigt FDG eine
intensive Speicherung cerebral, wohingegen FLT im Gehirn nur gering aufgenommen
wird.
Die genannten Unterschiede bzgl. Tumoranreicherung und physiologischer Biodistribution
führten dazu, dass mit FLT-PET im Vergleich zur FDG-PET bei 12 Patienten insgesamt 75
zusätzliche Läsionen entdeckt wurden. Die Gesamtzahl der mit FLT diagnostizierten
Läsionen belief sich bei den 28 untersuchten Patienten auf 448. In unserer Studie konnte
somit gezeigt werden, dass sich die FLT-PET zum Staging maligner Lymphome insgesamt
gut eignet. Da bei allen Patienten das gleiche klinische Stadium wie im Routinestaging
festgestellt wurde, lässt sich daraus allerdings kein genereller Bedarf an dieser ergänzenden
Untersuchungsmethode ableiten. Sie kann im Einzelfall zur Beantwortung einer
spezifischen Fragestellung aber durchaus weiterführende Erkenntnisse liefern, z.B. wenn
ein cerebraler Lymphombefall verdächtigt wird.
Im Gehirn wurde eine sehr geringe Aufnahme von FLT beobachtet, wogegen FDG im
Gehirn intensiv gespeichert wurde. In der Arbeit von van Waarde et al. wurde im
Tiermodell mit Ratten mit Gliomzellen für FLT nur eine Anreicherung im Tumor
beschrieben, während beim FDG eine Anreicherung sowohl im Tumor als auch in
entzündlichen Läsionen gemessen wurde (van Waarde et al. 2004). Im gleichen Tiermodell
verglich der Autor noch weitere vier PET-Tracer (zwei Sigma-Rezeptor Liganden, [11C]Cholin und [11C]-Methionin) mit FDG und FLT (van Waarde et al. 2004). Hierbei war
39
4. Diskussion
[18F]FLT tumorselektiver im Vergleich zu den restlichen Tracern. Die Aufnahme von FDG
im Gehirn war in dieser Arbeit ebenfalls signifikant höher als die FLT-Aufnahme. In einer
weiteren Studie wurde bei 25 Patienten mit Gliomen des Gehirns die Aufnahme von FLT
und FDG verglichen. [18F]FLT PET wurde als sensitiver im Vergleich zu [18F]FDG PET
zur Darstellung in Regression befindlicher hochgradiger Gliome dargestellt. Außerdem
korrelierte der [18F]FLT-SUV besser mit dem Ki-67 Index (Chen et al. 2005).
Für den Lymphombefall anderer Organe könnte FLT aufgrund einer dort hohen
Hintergrundaktivität weniger geeignet sein. FLT wird in der Leber glukoronidiert (Shields
et al. 1998), wodurch es dort zu einer erhöhten FLT-Aufnahme kommt. Buck et al hatten in
Ihrer Arbeit bezgl. des Einsatzes von FLT zum Staging von Bronchialkarzinomen im Vgl.
zu FDG von einer limitierten Detektion von Lebermetastasen berichtet. In unserem
Patientenkollektiv befanden sich allerdings keine Patienten mit fraglichem hepatischen
Lymphombefall.
Im
Knochenmark wurde die FLT-Aufna hme von uns mit
durchschnittlichem FLT-SUV von 6,9 (Median 6,9; Streubreite 3,4 – 12) bestimmt. Dies
geht einher mit den Beobachtungen anderer Autoren und ist wahrscheinlich bedingt durch
die erhöhte DNA – Synthese (Shields et al. 1998, Wagner e t al. 2003). Daher wurden bei
zwei Patienten Knochenläsionen, die im konventionellem Staging festgestellt wurden, mit
der FLT-PET nicht erkannt.
Aufgrund unserer Ergebnisse können wir empfehlen eine FLT-PET einzusetzen, wenn ein
cerebraler Lymphombefall verdächtigt wird, da dieses Organ eine hohe physiologische
FDG-Aufnahme bei geringerer FLT-Anreicherung zeigt. Für den, epidemiologisch
häufigeren Fall, eines ossären Befalls scheint die aktuelle Referenzdiagnostik mit FDGPET überlegen, da die physiologische FLT-Anreicherungen im Knochenmark in unserer
Untersuchung nicht nur über jener von FDG lag, sondern sogar noch über die Aufnahme
im Lymphomgewebe hinausging.
40
4. Diskussion
4.2. Bestimmung der Proliferationsaktivität maligner Lymphome
In der Studie von Shields wurde gezeigt, dass die Darstellung der Proliferationsaktivität
der therapiebedingten Veränderungen im Tumorgewebe besser aufzeigt als die Darstellung
des Glukosemetabolismus. Das zunächst verwendete radioaktiv markierte 2-[11C]Thymidin hat eine kurze Halbwertszeit von 20 Minuten und ist deswegen für den Einsatz
in der Klinik ungeeignet. Verschiedene, in vivo resistente Thymidinanaloga wurden als
weitere Proliferationsmarker vorgeschlagen, wobei FLT bis jetzt der vielversprechendste
ist. Es wurde gezeigt, das mit diesem Tracer PET-Tomogramme von proliferierendem
Gewebe und von Tumoren von hohem Kontrast entstehen (Shields et al. 1998, Vesselle et
al. 2002).
In einer der ersten in vitro Studien wurde die proliferationsabhängige FLT-Aufnahme in
die PANC-1 Lymphomzelllinie nachgewiesen (Seitz et al. 2002) sowie etwas später in
einem Lymphom Xenotransplantat Modell (Wagner et al. 2003). In dem klinischen
Abschnitt dieser Arbeit konnte mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse eine signifikante
Korrelation ( r=0,86, p< 0,0001) zwischen der FLT-Aufnahme im Lymphom und der
Proliferationsfraktion der biopsierten Läsionen gezeigt werden. Eine ähnliche Korrelation
des FLT-Uptakes und der Proliferationsfraktion wurde bereits für Lungentumore
beschrieben (Buck et al. 2002, Vesselle et al. 2002).
In unserer Patientenstudie ermittelten wir in der Regressionsanalyse zwischen tumoralem
[18F] FLT-SUV und dem Ki-67-Index eine signifikante Korrelation (p<0,001; r=0,86). Wir
haben damit gezeigt, dass FLT auch für die Tumorentität des Lymphoms einen guten
Proliferationsmarker darstellt. Unsere Ergebnisse liegen in etwa in dem Bereich, den die
o.g. Autoren in ihren Zell- u. Tiermodellen oder bei Ihren Forschungen mit anderen
Tumorentitäten beobachtet hatten.
Neben
FLT
wurden
auch
andere
Nukleosid-Analoga
für
die
nicht-invasive
Proliferationsmessung vorgeschlagen. Entgegen dem FLT werden [3H]-Thymidin, FMAU
(Fluor-Methyl-Arabinofuranosyl-Uracil) und Br-BFU(Brom-Fluor-Desoxyuridin) zu 78 –
79 % in die DNA eingebaut (Bading et al. 2004, Lu et al. 2002, Toyohara et al. 2002). FLT
41
4. Diskussion
wird nur zu einem sehr geringen Prozentsatz (0,2 – 2 % , Lu et al. 2002, Wagner et al.
2003) in die DNA aufgenommen. Somit ist FLT kein direkter Marker der Proliferation,
sondern die [18F]-FLT Aufnahme in die Zelle ist lediglich ein Maß für die Aktivität der
Thymidinkinase 1 (Rasey et al. 2002, Nishii et al. 2008). Da TK1 ein S-Phase spezifisches
Enzym ist, kann die TK1 allerdings als ein Schlüsselenzym der Proliferation betrachtet
werden (Rasey et al. 2002, Vesselle et al. 2002). Wie bereits genannt, konnte durch uns
eine
signifikante
Korrelation
[18F]-FLT-SUV
zwischen
und
dem
Ki-67-Index
nachgewiesen werden (p<0,0001; r=0,86). Damit wurde gezeigt, dass über die FLTAnreicherung - obwohl dies (wie soeben ausgeführt) lediglich einen indirekten Marker der
DNA-Syntheserate darstellt - für den klinischen Einsatz hinreichend genau die
Proliferationskinetik maligner Lymphome abgeschätzt werden kann.
In einer der ersten in vivo Studien zu FMAU wurde eine erhöhte Aufnahme in das Herz
beobachtet, bedingt durch die hohe Affinität zur mitochondrialen TK2 (Sun et al. 2005).
Außerdem wird FMAU unter den bisher evaluierten Nukleosidanaloga von den Tumoren
quantitativ am geringsten angereichert, trotzdem könnte es im Einzelfall gegenüber FLT
Vorteile haben, z.B. bei der Darstellung des Beckens aufgrund der geringen Anreicherung
im Urin (Bading et al. 2004, Schwartz et al. 2003). FLT dient nur der TK1 als Substrat und
wird von der mitochondrialen TK2 nicht verwertet, im Gegensatz zu anderen Nukleosiden
wie 3[H]Thymidin und 3[H]Arabinothymidin (Toyohara et al. 2002). Nicht alle Tumore
zeigen eine hohe TK-1 Aktivität (Schwartz et al. 2003). Manche Tumore weisen eine
erhöhte de-novo Synthese durch Thymidylat Synthase auf, ohne Steigerung des Salvage
Pathway und der TK1 Aktivität (Sakamoto et al. 1993, Seitz et al. 2002, Toyohara et al.
2002, Schwartz et al. 2003). Obwohl nicht alle Tumore eine starke TK1-Aktivität
aufweisen, konnte bei allen Zelllinien, deren Proliferation TK1-abhängig ist, wie maligne
Erkrankungen des hämatopoetischen und lympathischen Systems sowie kleinzellige
Bronhialkarzinome, eine Zunahme der FLT-Aufnahme nachgewiesen werden (Schwartz et
al. 2003). Letztendlich konnte in unserer Studie gezeigt werden, dass auch maligne
Lmyphome zu den Tumorentitäten gehören, die suffizient und nicht-invasiv mit 18F-FLTPET bzgl. ihrer Proliferationskinetik evaluiert werden können.
42
4. Diskussion
4.3. Grading maligner Lymphome
Sowohl in indolenten als auch in aggressiven Lymphomen war eine fokale FLTAnreicherung darstellbar. Zusätzlich wurden im FLT-PET bei 12 Patienten weitere
Läsionen diagnostiziert (Tabelle 3). Bei 4 Patienten konnten im PET weniger Läsionen als
im Routinestaging nachgewiesen werden. Bei allen Patienten wurde das gleich klinische
Stadium nach Ann Arbor Klassifikation (Tabelle 2) wie im Routinestging festgestellt. Die
aggressiven Lymphome wiesen im Vergleich zu den indolenten Lymphomen jedoch im
Mittel eine höhere FLT-Aufnahme auf. In unserem Kollektiv ergibt sich ein Grenzwert von
FLT-SUV = 3,0 zur Unterscheidung zwischen indolenten und aggressiven Lymphomen
(Abbildung 7a). Für FDG konnte ein solcher Grenzwert nicht bestimmt werde, d.h. die
durchschnittliche FDG-Aufnahme aggressiver Lymphome war in unserer Evaluation nicht
höher, verglichen mit den indolenten Lymphomen. Andere Autoren hatten in der
Vergangenheit berichtet, dass eine Unterscheidung zwischen indolenten und aggressiven
Lymphomen tendenziell auch mit Hilfe der FDG-PET (Rodriguez et al. 1995, Lapela et al.
1995) möglich sei. Es wurde kürzlich über eine hohe Wahrscheinlichkeit von aggressiven
Lymphomen bei Patienten mit einem FDG-SUV > 13 berichtet (Schoder et al. 2005). Ein
FDG-SUV < 6 wurde als Indiz für ein indolentes Lymphom beschrieben. In der von
Schoder
durchgeführten
Studie
fielen
jedoch
45%
der
Patienten
in
den
Überlappungsbereich zwischen aggressiv und indolent. Die Festsetzung eines Grenzwertes
zwischen den beiden Lymphomgruppen bei FDG-SUV = 10 würde zu einer
Fehlklassifikation von 29 % der agressiven und 19 % der indolenten Lymphome führen.
Somit gehen die Ergebnisse dieser Autoren doch mit unseren Beobachtungen, d.h. einem
weiten Überlappungsbereich zwischen indolenten und aggressiven Lymphomen in der
FDG-PET,
konform.
Das
sich
in
unserer
Erhebung
auch
kein
angedeuteter
Gruppenunterschied gezeigt hat, führen wir in erster Linie auf unsere vergleichsweise
geringere Fallzahl zurück.
Im klinischen Alltag basiert die Unterscheidung zwischen indolenten und aggressiven
Lymphomen auf der prozentualen Bestimmung der Blasten aus biopsierten Läsionen,
entweder durch Nativ-Mikroskopie oder durch Immunhistologie der proliferierenden
43
4. Diskussion
Zellen. Eine Biopsie ist erforderlich, wobei diese vor allem bei den Patienten mit
aggressiven Lymphomen repräsentativ ist. Bei Patienten mit einem indolenten Lymphom
kann die Heterogenität der Lymphomproliferation häufig nur durch mehrere Biopsien
verschiedener
Lymphommanifestationen
bestimmt
werden.
Hierdurch
kann
die
Transformation in ein aggressives Lymphom bei manchen Patienten übersehen werden.
Für Patienten mit einem indolentem Lymphom wäre es möglich, mit der FLT-PET eine
Transformation der Erkrankung zu einem aggressiven Phänotyp frühzeitig durch erhöhte
FLT-Aufnahme zu erkennen und die relevante Lokalisation einer einzelnen gezielten
Biopsie zuzuführen. Dadurch könnte die Erkrankung frühzeitiger neu klassifiziert werden
und es könnten unnötige Biopsien bei multimorbiden Patienten mit hohem präoperativem
Risiko oder bei Patienten mit Lymphommanifestationen an schlecht zugänglichen
Lokalisationen vermieden werden. In unserer Arbeit wurde eine ähnliche Überlappung von
FDG-SUV der indolenten und aggressiven Lymphome, wie in der von Schoder
publizierten Studie, beobachtet. Daraus lässt sich schließen, dass das Grading maligner
Lymphome mit FDG-PET nicht zuverlässig ist. Im Gegensatz dazu weisen unsere Daten
darauf hin, dass mit der FLT-PET ein klinisch ausreichend genaues Grading maligner
Lymphome auch nicht-invasiv möglich sein könnte. Dies muss jedoch noch in einer Studie
mit größeren Fallzahlen verifiziert werden.
4.4. FLT-PET zur Evaluation des Therapieansprechens maligner Lymphome
Bisherige Limitationen der Responsebeurteilung per morphologischer Bildgebung sind die
langsamen Größenveränderungen z.B. bei der Resorption von Nekrosen, die ein sinnvolles
Restaging erst Wochen oder Monate nach der Therapie möglich machen. Schwierigkeiten
bereiten auch neue, eher zytostatisch als zytotoxisch wirkende Therapien die nicht
unmittelbar eine Veränderung der Tumorgröße bewirken. Für diese Situationen ist es
erstrebenswert, funktionelle Kriterien zu etablieren, die geeignet sind einen langfristigen
Benefit zuverlässig vorhersagen zu können (Padhani et al. 2000). Ein frühe Stratifizierung
in Responder und Non-Responder könnte einen früheren Wechsel auf eine evtl.
wirksamere Zweitlinientherapie ermöglichen und für den Patienten uneffiziente aber
zumeist mit Toxizität verbundene und teure Therapien vermeiden helfen.
44
4. Diskussion
Es konnte bereits gezeigt werden, dass PET mit dem Tracer FDG eine sensitive Methode
zur Bestimmung des zytostatischen oder zytotoxischen Effekts schon in der Frühphase
einer Therapie darstellt (Mikhaeel et al. 2000, Kostakoglu et al. 2003, Romer et al. 1998).
Auch für die Tumorentität der malignen Lymphome wurde bereits ein relevanter
Stellenwert der FDG-PET für die Kontrolle des Therapieansprechens gezeigt (Jerusalem et
al. 2003, Spaepen et al. 2001). Wie schon erwähnt, hat FDG jedoch einige Nachteile, wie
z.B. die nichtspezifische Anreicherung in entzündlichen Läsionen. Im Vergleich zu FDG
haben FLT und andere Thymidinanaloga den Vorteil, spezifischer
den Tumor
darzustellen. Weiterhin ist damit eine Bestimmung der aktuellen Proliferaionsaktivität
möglich. Das lässt erhoffen, dass FLT für die Darstellung des Therapieansprechens und der
damit verbundenen sinkenden Proliferatiosfraktion besser geeignet ist als FDG.
Prednisolon wird bei Menschen zur Induktionstherapie bei malignen Lymphomen benützt.
Steroiden wird ein antiproliferativer und proapoptotischer Effekt auf Lymphomzellen
zugeschrieben (Rose et al. 2002). In einer unlängst erschienen Studie von Leyton wird eine
rasche Reduzierung der tumoralen FLT-Aufnahme 24 Stunden nach Behandlung von RIF1 Sarkommäusen mit Cisplatin berichtet (Leyton et al. 2005). In einer anderen Studie
konnte für das adenosquamöse Ösophaguskarzinom eine schnelle Abnahme des [18F]-FLT
–Uptakes ebenfalls 24 Stunden nach Cisplatin gezeigt werden (Dittmann et al. 2002). Eine
Reduktion der tumoralen [18F]-FLT-Aufnahme nach Radiotherapie und androgener
Ablationstherapie wurde in einem Tiermodell des Prostatakarzinoms demonstriert (Oyama
et al. 2004). In einer Maus-Studie wurde in murinsquamösen Tumoren 24 Stunden nach
Bestrahlung eine signifikante Abnahme des FLT-Uptakes (p=0,020) nachgewiesen; Im
Vergleich dazu hatte sich die FDG-Aufnahme im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht
wesentlich geändert (Yang et al. 2006). Waldherr und Mitarbeiter konnten unter
Verwendung eines epidermoiden Karzinom-Xenotransplantat-Modells demonstrieren, dass
die [18F]-FLT-Aufnahme auch nach zytostatischer Therapie mit Kinaseinhibitoren
signifikant sinkt (Waldherr et al. 2005).
Es ist unwahrscheinlich, dass bei allen Tumoren [18F]FLT-PET zur Beurteilung des
Therapieansprechens eingesetzt werden kann. Bei Tumoren mit niedriger TK-1 Expression
oder
niedriger
Proliferationsfraktion
sollte
45
[18F]-FLT-PET
aufgrund
seiner
4. Diskussion
Anreicherungsphysiologie bereits in der initialen Darstellung und somit auch für die
Bewertung des Therapieansprechens limitiert sein. Weiterhin kann die therapieinduzierte
Aktivierung des Thymidylat Salvage Pathways den [18F]-FLT-Uptake maligner Zellen
erhöhen. In der von Dittmann et al. veröffentlichten Studie kam es 24 Stunden nach der
Therapie ösophagealer Zellen mit MTX und 5-FU zu einer sieben- bis zehnfachen
Zunahme des [18F]-FLT-Uptakes (Dittmann et al. 2002) und wurde mit einer
therapiebedingten Aktivierung des Thymidin- Salvage-Pathways erklärt. Barthel wies
einen Abfall der [18F]-FLT-Aufnahme 48 h nach 5-FU Behandlung von FibrosarcomMäuselinie nach (Barthel et al. 2003), er erklärt die Abnahme des [18F]-FLT-Uptakes mit
Änderungen der katalytischen Aktivität, jedoch nicht durch Änderungen der TK1, da es 48
Stunden nach Therapie zu einem Anstieg der TK1-Levels kam.
Bei einer früheren tierexperimentellen Studie unserer Abteilung wurde bereits die humane
Lymphomzelllinie DoHH2 verwendet, welche eine hohe TK1-Aktivität und eine hohe
Proliferationsaktivität aufweist (Wagner et al. 2003). Somit war bereits ein prinzipiell gut
zur
Bildgebung
mit
18F-FLT
geeignetes
in-vivo
Lymphom-Modell
für
den
tierexperimentellen Teil dieser Arbeit etabliert. Im genannten Lymphom-XenotransplantatMausmodell wurde in unserer aktuellen Arbeit das Therapieansprechen bei malignen
Lymphomen mit FLT-PET gemessen. Bei 12 Versuchstieren wurde jeweils vor und acht
Tage nach Therapie mit Prednisolon (1,5 mg/kg i.v.) eine FLT-PET durchgeführt. Obwohl
es nach der Therapie nicht zu einer Verkleinerung der Tumorgröße kam, konnte
immunhistologisch eine Verminderung der Proliferationsfraktion um 29% nachgewiesen
werden. Bildgebend wurde eine Reduktion der Traceraufnahme mittels Reduktion der
tumor-to-background-Ratio (TBR) in der behandelten Gruppe per FLT-PET festgestellt
(Abbildung 14) und konnte nach Sektion der Versuchstiere im Gammacounter im Sinne
einer signifikanten Reduktion der tumoralen Aktivitätskonzentration (1,3 im Vergleich zu
5,4%ID/g) validiert werden.
46
4. Diskussion
Die in unserer tierexperimentellen Studie erzielten Ergebnisse unterstützen die Hypothese,
dass antiproliferative Effekte der Tumortherapie frühzeitig mit [18F]FLT und PET erkannt
werden können, bevor sich die Tumorgröße ändert. Allerdings ist es möglich, dass sich
Tumorgewebe unter Therapie in einen „Winterschlaf ähnlichen“ Zustand versetzen kann
und bereits kurze Zeit nach der Behandlung wieder an Wachstum zunimmt. Dieser Effekt
wird als „stunning“ bezeichnet und wurde eingehend z.B. beim Schilddrüsenkarzinom
unter grenzwertig wirksamen Aktivitäten I-131 beobachtet. Was wir in unserem
Mausmodel als (per FLT-PET bestätigten) Therapieresponse interpretiert hatten, könnte
auch schlicht ein solcher „stunning“-Effekt gewesen sein. Somit steht es noch aus
endgültig zu zeigen, dass sich eine Abnahme des FLT-Uptake unter Therapie auch in einer
verbesserten Prognose für den Patienten niederschlägt.
Mit dem PET-Tracer FDG wurde beobachtet, dass es in der Frühphase einer letztendlich
wirksamen Therapie zu einem „Aufblühen“ des tumoralen Stoffwechsels kommen kann.
Diese Beobachtung wurde als „flare“-Phänomen benannt und mit einer gesteigerten
Glukoseutilisation beim Versuch zytotoxische Arzneimitteleffekte zu kompensieren oder
im Rahmen des Apoptoseprogramms diskutiert; Es kann dazu führen, dass falsch-positiv
von einem Progress unter Therapie ausgegangen wird (Biersack et al. 2004). Mit dem
Tracer FLT wurde bisher noch kein solches „flare“-Phänomen beschrieben. Wir können
darauf hoffen, dass diese Limitation der Response-Beurteilung mit der Einführung der
FLT-PET
der
Vergangenheit
angehört.
Die
bisherige
Erfahrung
mit
diesem
Radiopharmakon ist allerdings noch zu gering, um endgültig ausschließen zu können, dass
es nicht auch mit
FLT zu derartigen, reaktiven und somit falsch-positiven
Mehrspeicherungen kommen kann.
47
5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
In diesem Forschungsvorhaben sollte evaluiert werden, ob sich die Positronen-EmissionsTomographie (PET) mit Fluorodesoxythymidin ([18F]FLT) zur Darstellung der
Proliferationsaktivität sowie zur Kontrolle der Therapieansprechens maligner Lymphome
eignet. In dem prospektiven, klinischen Abschnitt wurde bei einem Patientenkollektiv von
insgesamt 28 Patienten mit histologisch gesicherten Lymphomen die PET mit [18F]FLT
durchgeführt. Zusätzlich erhielten 19 Patienten eine PET mit Fluorodesoxyglukose
([18F]FDG). Bei 17 Patienten wurden Biopsien des Tumorgewebes mittels der Ki-67
Immunohistologie gefärbt. Es konnte gezeigt werden, dass FLT für die Darstellung der
Proliferationsaktivität maligner Lymphome geeignet ist. Bei allen untersuchten Patienten
zeigte sich eine erhöhte fokale FLT-Aufnahme in den Lymphommanifestationen, die im
Routinestaging ebenfalls beschrieben wurden. Es ergab sich weiterhin das gleiche
klinische Stadium bei allen Patienten wie im Routinestaging. Im Vergleich zur FDG-PET
konnte ein weiterer Vorteil des FLT gezeigt werden, nämlich die bessere Darstellbarkeit
cerebralen Lymphommanifestation. Des weiteren konnte eine Differenzierung zwischen
indolenten und aggressiven Lymphomen mittels der FLT-Aufnahme vorgenommen
werden; Bei einem „Standart Uptake Value“ (SUV) von 3,0 ergab sich der Trennwert
zwischen indolenten und aggressiven Lymphomen. Bei einem Patienten konnte frühzeitig
die maligne Transformation der Erkrankung erkannt werden. Dieser Zusammenhang kann
nicht ohne weiteres auf die Kontrolle des Therapieansprechens übertragen werden, da es
therapiebedingt zu Änderungen des Stoffwechsels kommt und somit auch zu Änderungen
der Thymidinkinase-1-Aktivität kommen kann. Deswegen beobachteten wir in einem
tierexperimenteller Abschnitt die Veränderungen der FLT-Aufnahme nach Steroidtherapie
(Prednisolon 1,5 mg/kg i.v.). Bei den 12 Versuchstieren war ein signifikanter Rückgang
des FLT-Uptakes nach Steroidtherapie erkennbar. Es konnte gezeigt werden, dass in einem
Mausmodell des malignen Lymphoms das Thymidin-Analogon FLT für die frühe
Kontrolle des Therapieansprechens nach Prednisolon geeignet ist. Schon sehr früh
während der Therapie konnten deren antiproliferative Effekte dargestellt werden, noch
bevor es zu einer tumoralen Größenreduktion, wie es im aktuellen Rotinestaging zur
48
5. Zusammenfassung
Bestätigung eines positiven Therapieeffekts erforderlich ist, kommen konnte. Insgesamt
können wir sagen, dass eine FLT-PET geeignet ist für die Darstellung der malignen
Lymphome und für die nicht-invasive Beurteilung des Tumorgradings. Aufgrund der
spezifischen Darstellung der Proliferation könnte FLT ein geeigneter Tracer in der
Diagnostik maligner Lymphome in Organen mit physiologisch hoher FluordesoxyglukoseAufnahme sein. Weiterhin kann durch die gezielte Proliferationsdarstellung früh die
Transformation zu einer aggressiveren Form erkannt werden. FLT zeigt hoffnungsvolle
Ansätze, für eine Eignung zur Therapiekontrolle – zumindest nach Glucokorticoid bei
Lymphomen. Zur Verifikation unserer initialen Ergebnisse sind weitere Studien mit
größeren Fallzahlen und bezüglich der Kontrolle des Therapieansprechens nach anderen
Therapeutika nötig.
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7. Danksagung
7. Danksagung
Ich möchte allen herzlichst danken, die am erfolgreichen Zustandekommen dieser Arbeit
beteiligt waren.
An erster Stelle bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. Reske für die freundliche Aufnahme
in seine Abteilung und die Bereitstellung eines ergiebigen Themas für meine Doktorarbeit.
Ganz besonderer Dank gilt auch Herrn PD Dr. A. Buck für seine hervorragende Betreuung
bei der Versuchsdurchführung, Ergebnisauswertung und Anfertigung dieser Arbeit.
Ebenfalls möchte ich mich beim Herrn Prof. Dr. H. Döhner und Herrn Prof. Dr. S.
Stilgenbauer bedanken, die als Kooperationspartner maßgeblich am Zustandekommen der
klinischen Studie beteiligt waren.
Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. T. Mattfeldt für die erfolgreiche Zusammenarbeit mit
der
Abteilung
Pathologie.
Für
ihre
Unterstützung
bei
der
Anfertigung
von
Immunhistologien und mikroskopischen Bilder danke ich Frau Ehmke und Herrn Kunft.
Allen Mitarbeiter der Abteilung Nuklearmedizin sage ich vielen Dank für ihre freundliche
Mitarbeit bei der Durchführung von Untersuchungen, Bedienung von Geräten oder ihrer
Tätigkeit in der Radiochemie.
Ganz besonderer Dank gilt meiner Familie, die mir das Studium ermöglicht hat und mich
in allem Lebenslagen unterstützt.
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8. Lebenslauf
8. Lebenslauf
Name:
Durda Kratochwil, geb. Tepsic
Geburtstag:
12.04.1978
Geburtsort:
Karlovac/Kroatien
Schule:
1984 bis 1991
Gesamtschule in Kroatien
1991 bis 1993
Karl-Friedrich-Reinhardt-Hauptschule in Schorndorf
1993 bis 1996
Gottlieb-Daimler-Realschule Schorndorf
1996 bis 1999
Wirtschaftsgymnasium Waiblingen; Abitur
Studium:
10/1999 bis 05/2006 Studium der Humanmedizin an der
Universität Ulm
08/2001 Ärztliche Vorprüfung
08/2002 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
03/2005 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
05/2006 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
05/2006 Approbation als Ärztin
Berufliche Tätigkeit:
07/2006 bis 06/2007 Assistenzärztin für Innere Medizin,
Solothurner Spitäler AG
08/2007 bis 11/2008 Assistenzärztin für Innere Medizin,
Kardiologie, Krankenhaus Schwetzingen, innerhalb dieser
Zeit halbjährige Rotation in die Thoraxklinik Heidelberg,
Abteilung Onkologie
seit 02/2009 Assistenzärztin für Innere Medizin, HeiligGeist-Hospital Bensheim
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