Aktivierung primärer diabetogener T
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Universitätsklinikum Ulm Klinik für Innere Medizin I Schwerpunkt Endokrinologie, Diabetes und Stoffwechsel Sektionsleiter Endokrinologie: Prof. Dr. med. B. Böhm Aktivierung primärer diabetogener T-Zellen mittels in vitro prozessiertem Proinsulin Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Ruth Brücken Bonn Januar 2011 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1.Berichtserstatter: PD Dr.Timo Burster 2.Berichtserstatter: Prof.Dr. Uwe Knippschild Tag der Promotion: 04.07.2013 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung S.1 1.1. Diabetes mellitus S.1 1.2. Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM) S.2 1.2.1. Klinisches Bild S.2 1.2.2. Ätiologie S.2 1.2.3. Genetische Faktoren S.4 1.3. Das Immunsystem S.4 1.3.1. Autoimmunität S.5 1.3.2. T-Zellen S.6 1.3.3. Regulatorische T-Zellen S.6 1.3.4. Zellen des angeborenen Immunsystems S.7 1.4. Pathogenese des T1DM S.9 1.5. Major Histocompatibility Complex S.10 1.5.1. MHC-Klasse I Moleküle S.11 1.5.2. MHC-Klasse II Moleküle S.11 1.5.3. MHC-Klasse III Moleküle S.12 1.5.4. T1DM-assozierte HLA-Moleküle S.12 1.5.5. T-Zell-Interaktion mit dem MHC Klasse II-Rezeptor-Peptid-Komplex S.14 1.5.6. MHC-Klasse II Antigenprozessierung S.14 1.6. Proinsulin S.16 1.6.1. Proinsulinpeptid P17 S.17 1.6.2. Proinsulin-Prozessierung durch Cathepsine S.17 1.7. Fragestellung S.20 2. Material und Methoden S.21 2.1. Material S.21 2.1.1. Materialien für die in vitro Prozessierung von Proinsulin S.21 2.1.2. Materialien für Peptidsequenzierung und Analyse S.21 2.1.3. Materialien für Peptidsynthese S.21 2.1.4. Materialien für Peptidbindungs-Assay S.21 2.1.5. Materialien für T-Zell Assay S.21 2.1.6. Materialien für ELISA S.22 2.1.7. Verwendete Geräte S.24 I 2.2. Methoden S.26 2.2.1. In vitro Prozessierung der Proinsulinpeptide S.26 2.2.2. Peptidsequenzierung und Analyse S.26 2.2.3. Peptidsynthese S.27 2.2.4. Peptidbindungs-Assay S.27 2.2.5. Zellkultur: Durchführung eines T-Zell Assays S.27 2.2.6. Cytokindetektion mittels ELISA S.28 2.2.7. Statistisches Verfahren S.29 3. Ergebnisse S.30 3.1. Verdau von Proinsulin mit lysosomalen Cathepsinen S.30 3.2. Peptidbindungs-Assay S.32 3.3. T-Zell Assay und Cytokindetektion mittels ELISA S.33 3.3.1. TNF-α S.33 3.3.2. IFN-γ S.36 3.3.3. IL-17 S.38 3.3.4. IL-6 S.39 3.3.5. TGF-β S.41 4. Diskussion S.43 4.1. Verdau von Proinsulin mit lysosomalen Cathepsinen S.44 4.2. Peptidbindungs-Assay S.46 4.3. T-Zell Assay und Cytokindetektion mittels ELISA S.47 4.4. Schlussfolgerung S.49 4.5. Perspektive S.50 5. Zusammenfassung S.52 6. Literaturverzeichnis S.53 7. Bilderverzeichnis S.63 8. Danksagung 9. Lebenslauf S.64 S.65 II Abkürzungsverzeichnis AEP Asparagin Endoprotease APC Antigenpräsentierende Zellen APL engl. altered peptide ligands (Veränderte Peptidliganden) B-Zelle Bursa Fabricii Zelle BSA Bovines Serumalbumin Cat Cathepsin CD engl. cluster of differentiation CLIP engl. class II associated invariant chain peptide (Klasse II-assoziertes-Invariante-Ketten-Peptid) CTL Cytotoxische T-Lymphozyten DMSO Dimethylsulfoxid DTT Dithiothreitol EAD engl. experimental autoimmune Diabetes ELISA engl. enzyme linked immunosorbent assay (Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest) ER FACS endoplasmatisches Retikulum engl. fluorescence activated cell sorting (Fluss-Sortierer von Fluoreszenz markierten Zellen) FCS Fötales bovines Serum Fmoc Fluorenyloxymethylchlorid FoxP3 Forkhead Box P3 GAD Glutamat Decarboxylase GADA Anti-Glutamatdecarboxylase-Antikörper HA-AMCA Hämagglutinin-Peptide markiert mit methylcoumarin-3-Acetatsäure HbA1c glykosyliertes Hämoglobin A1 HLA Humane Leukozyten Antigene HOBt Hydrobenzotriazole HPLC engl. high performance liquid chromatography (Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie) HPSEC engl. high performance size exclusion chromatography (Hochleistungsausschluss-Chromatographie) III 7-amino-4- HRP engl. horseradish peroxidase (Meerettichperoxidase) IA-2 Inselzell-Antigen 2 ICA Zytoplasmatische Inselzell-Antikörper ICOS engl. inducible costimulator IFN-γ Interferon γ IL Interleukin kDa Kilodalton LADA engl. latent autoimmune Diabetes with onset in adultes LC engl. liquid chromatography (Flüssigkeitschromatographie) M Mol m Milli (10-3) µ Mikro (10-6) MHC engl. major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Min Minute MODY engl. maturity-onset Diabetes of the young MS/MS Tandem-Massenspektrometrie NK-Zelle Natürliche Killerzelle NMM N-Methyl-Maleimide NOD engl. Non-Obese Diabetic P Piko (10-12) PBMC engl. peripheral blood mononuclear cells (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) PBS engl. phosphate buffer saline (Isotonischer Phosphatpuffer) PD-1 engl. programmed cell death -1 RT Raumtemperatur T1DM Typ 1 Diabetes mellitus TCR T-Zellrezeptor TGF-β engl. transforming growth factor β (Transformierender Wachstumsfaktor β) TH T-Helferzelle TNF-α Tumornekrosefaktor α Treg-Zelle Regulatorische T-Zelle T-Zelle Thymus-abhängige Zelle IV U/min Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett V 1. Einleitung 1.1. Diabetes mellitus Diabetes mellitus ist eine chronische Stoffwechselerkrankung, welche durch absoluten bzw. relativen Mangel an Insulin definiert ist. Nach längerer Krankheitsdauer kann es zu Folgeschäden wie Mikro- und Makroangiopathien an multiplen Organsystemen v.a. an Niere, Nerven, Blutgefäßen und Augen kommen. Diabetes mellitus kann nach seiner Ätiologie in drei unterschiedliche Gruppen unterteilt werden. I. Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM): Die Zerstörung der Insulin produzierenden β-Zellen des Pankreas führt zu einem absolutem Insulinmangel. a) Immunologisch bedingt: Autoimmuninsulitis der Langerhans-Inselzellen durch Infiltration mit autoreaktiven T-Lymphozyten. Weitere Befunde sind der Nachweis von Autoantikörpern. Dazu gehören zytoplasmatische Inselzell-Antikörper (ICA) gegen Ganglioside, Anti-Glutamatdecarboxylase-Antikörper (GADA) gegen die Glutamatdecarboxylase, Anti-IA-2-Antikörper gegen die Tyrosinphosphatase 2 und Insulin-Auto-Antikörper gegen Insulin bzw. Proinsulin. Unter immunsuppressiver Behandlung beobachtet man eine Remission der Insulitis. Als Sonderform ist der verzögert auftretende, autoimmunbedingte Diabetes beim Erwachsenen (LADA-latent autoimmune diabetes with onset in adultes) bekannt. Dieser manifestiert sich erst im Erwachsenenalter (25.-40. Lebendsjahr) mit einer schleichenden Entwicklung des Insulinmangels. Außerdem können GADA nachgewiesen werden (Turner R et al. 1997). b) Idiopthisch bedingt: Untergang der Insulin produzierenden β-Zellen des Pankreas ohne bekannten Auslöser für die Entstehung des Diabetes. II. Typ 2 Diabetes (T2DM): Dieser äußert sich in einer vorwiegenden Insulinresistenz mit relativem Insulinmangel bis hin zu einem sekretorischen Defekt mit Insulinresistenz und totalem Insulinmangel. Meist tritt diese Erkrankung im Zusammenhang mit dem Metabolischen Syndrom auf. III. Andere Diabetesformen: Neben den zwei Hauptgruppen T1DM und T2DM gibt es weitere seltenere Ursachen für einen Diabetes mellitus wie z.B. einen genetischen Defekt in der ß-Zellfunktion. Diese Störung liegt vor bei Erwachsenen-Diabetes der bei Jugendlichen auftritt (MODY-maturity-onset Diabetes of the young). MODY manifestiert sich meist vor dem 25. Lebensjahr. Es treten keine Antikörper oder genetischen Defekte 1 der Insulinwirkung auf. Mutationen von Genen des Glukosestoffwechsels werden autosomal-dominant vererbt (Fehmann HC et al., 2004). Außerdem kann ein Diabetes mellitus bei Erkrankungen des exokrinen Pankreas und anderen Endokrinopathien auftreten oder medikamentös induziert sein (Herold G, 2010). 1.2. Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM) 1.2.1. Klinisches Bild Der T1DM ist eine chronische und irreversible Autoimmunerkrankung, welche auf einer selektiven Zerstörung der ß-Zellen beruht. Sie manifestiert sich meist im 12.-24. Lebensjahr und stellt mit ca. 10% die kleinere Gruppe der Diabetes mellitus Patienten. Erst nach Verlust von ca. 80% der ß-Zellen kommt es zur klinischen Manifestation infolge von Hyperglykämie, Ketoazidose und Glukosurie mit osmotischer Diurese. Dies äußert sich in unspezifischen Allgemeinsymptomen wie Müdigkeit, Leistungsminderung und Gewichtsverlust sowie durch Polydipsie und Polyurie. Klinisch entwickelt sich der T1DM meist rasch, innerhalb von Tagen bis Wochen, allerdings geht eine lange prädiabetische Phase ohne Krankheitssymptome voraus. In dieser Phase zeigt sich meist schon eine Sekretionsstörung, dennoch sind Nüchternblutzuckerwerte, Blutzuckertagesprofil und HbA1-Werte bis zur Manifestation im Normalbereich. Histologisch findet man eine sogenannte Autoimmuninsulitis, bestehend aus zellulären Infiltrationen der ß-Zell-Inseln, beteiligt sind v.a. mononukleäre Zellen, insbesondere T-Lymphozyten (Herold G, 2010). 1.2.2. Ätiologie Bei der Entstehung von T1DM wird von einer multifaktoriellen Genese ausgegangen, wobei genetische und umweltbedingte Faktoren eine Rolle spielen. Möglicherweise besitzt T1DM eine sehr heterogene Ätiologie, bei der verschiedene Umweltfaktoren über unterschiedliche Mechanismen zur Zerstörung der ß-Zellen beitragen. Darüber hinaus interagieren die umweltbedingten Einflüsse mit den genetischen Anlagen. Diese vielschichtigen Ursachen erschweren es, die zur Erkrankung führenden Faktoren zu identifizieren. Auffällig ist die Häufung der Erkrankung in Familien. Das Lebenszeitrisiko bei Verwandten ersten Grades für T1DM beträgt 5-6%, verglichen mit ca. 0,4% in der allgemeinen kaukasischen Bevölkerung (Risch N, 1987). Darüber hinaus ist die Konkordanzrate von eineiigen Zwillingen (30-40%) sehr viel höher als von zweieiigen 2 Zwillingen (6%) (Olmos P et al., 1988; Redondo MJ et al., 2001). Diese jedoch relativ niedrige Konkordanzrate von Genotyp-identischen Zwillingen lässt darauf schließen, dass erstens, die prädisponierenden Gene eine niedrige Penetranz besitzen, zweitens, dass wichtige nichtgenetische, umweltbedingte Faktoren ebenfalls einen großen Einfluss bei der Entstehung besitzen. Dazu gehören virale Infektionen, die Ernährung im frühen Kindesalter, Impfungen, klimatische Einflüsse, Toxine (z.B. Nitrosamine) und Stress (Knip M, 1999; Ellis TM, 1996; Dahlquist GG, 1997; Dahlquist GG et al., 2000). Bisher wurde angenommen, dass diese Umwelteinflüsse die Entstehung der Erkrankung in genetisch prädisponierten Personen triggern. Neuere Beobachtungen lassen allerdings auf ein sehr viel komplexeres Modell schließen. Es wird vermutet, dass die Umwelteinflüsse, denen man im Laufe des Lebens ausgesetzt ist, das genetisch zur Dysregulation prädisponierte Immunsystem beeinflussen. Gestützt wird dies durch Untersuchungen hinsichtlich der perinatalen Infektionsrate (d.h. in dem Zeitraum zwischen der 24. Schwangerschaftswoche und dem 7. Tag nach der Geburt) und der Erkrankungshäufigkeit in den ersten Lebensjahren in Bezug auf die Entwicklung eines T1DM. Kinder, die gehäuft an Infektionen innerhalb der ersten Lebensjahre litten, besaßen ein geringeres Risiko, einen T1DM zu entwickeln. Dagegen scheinen perinatale Infektionen das Erkrankungsrisiko zu steigern (Wasmuth HE et al., 2000; McKinney PA, 1999). Durch verbesserte Lebensbedingungen, Hygienemaßnahmen und Impfungen wird unser Immunsystem immer weniger mit Pathogenen konfrontiert, was ebenfalls ein Grund für die zunehmende Inzidenz von T1DM in den letzten Jahrzehnten darstellen könnte (Dunne DW et al., 2005). Schlussfolgernd ist festzuhalten, dass Umwelteinflüsse die Entwicklung des Immunsystems beeinflussen und somit die Entstehung der Erkrankung fördern, aber auch dämpfen können (Kelly et al., 2002). Infektionen mit dem Coxsackievirus B4 und dem Rubella Virus stehen im Verdacht, das Risiko für einen T1DM zu steigern. Tatsächlich wurden in T1DM-Patienten im Vergleich zu Gesunden gehäuft zirkulierende T-Zellen, spezifisch für diese zwei Virusarten, gefunden (Ou D, 2000; Varela-Calvino R, 2002). Es konnte nachgewiesen werden, dass das Rubella-Virus und das Coxsackie B4-Virus, wie auch das Mumps- und Cytomegalievirus, spezifische Rezeptoren besitzen, mit denen sie an der Oberfläche der humanen ß-Zellen binden und die Zelle infizieren (Jenson et al., 1980). Außerdem konnte gezeigt werden, dass bei Patienten mit frisch manifestiertem T1DM das durch Viren induzierbare IFN-α in den ß-Zellen vorhanden ist, was ein Hinweis für einen viralen Infekt in der Vorgeschichte darstellen könnte (Foulis et al., 1987). Das Cytokin IFN-γ, welches 3 als Antwort auf Infektionen zur Stimulation von Immunzellen produziert wird, kann zu einem Verlust der Immuntoleranz gegen Inselzellen und somit zu Autoimmunreaktionen führen (Sarvetnick et al., 1990). 1.2.3. Genetische Faktoren Wie auch bei vielen anderen Autoimmunerkrankungen ist die Suszeptibilität von T1DM mit bestimmten humanen Leukozyten Antigen-(HLA)-Haplotypen assoziiert. Diese Gene befinden sich auf dem Chromosom 6p21 (Singal DP, 1973; Nerup J, 1974; Cudworth AG, 1974). Bei kaukasischen T1DM-Patienten findet man zu 90% bis 95% HLA-DR3 bzw. HLA-DR4 oder beide Allele, im Vergleich zu 40% der Gesamtpopulation. Heterozygot für DR3/DR4 sind 40% bis 50%, in der Gesamtbevölkerung weisen nur 5 % diese HLAVariante auf (Concannon et al., 2005; Thomson et al., 2007). Sind beide Elternteile an T1DM erkrankt, beträgt das Risiko der Kinder, einen T1DM zu entwickeln 20 %. Ist nur der Vater erkrankt liegt das Risiko bei 5 %, bei Erkrankung der Mutter bei 2,5 % (Howson JMM et al., 2007). 1.3. Das Immunsystem Das Immunsystem erkennt und bekämpft fremde Antigene und ist in der Lage zwischen Selbst (körpereigen) und Fremd zu unterscheiden. Dazu ist ein geregeltes Zusammenspiel vieler verschiedener Strukturen und Zellen notwendig. Man unterscheidet die angeborene unspezifische von der erworbenen adaptiven Immunität. Die angeborene unspezifische Immunabwehr reagiert sehr schnell auf das Eindringen eines Pathogens. Als erste Hürde fungiert eine Vielzahl an physikalischen, chemischen und zellulären Barrieren. Die zellulären Komponenten stellen Makrophagen, Granulozyten und Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) dar, unterstützt durch Chemokine und Cytokine sowie durch das Komplementsystem. Die erworbene, adaptive Immunabwehr benötigt eine Aktivierung durch die unspezifische Immunabwehr und reagiert dadurch langsamer. Allerdings läuft die Immunantwort zielgerichteter ab, da sie sich spezifisch gegen einen bestimmten Erreger bzw. Antigen richtet. Es wird zwischen der humoralen und der zellulären Immunantwort unterschieden. Die humorale Immunantwort besteht aus Antikörpern, welche von B-Lymphozyten (Plasmazellen) produziert werden, zur zellulären Immunantwort zählt man die T4 Lymphozyten (siehe 1.2.2), welche u.a. für die Kommunikation zwischen den Zellen des Immunsystems sorgen, aber auch für die Zerstörung von infizierten Zellen zuständig sind. Dendritische Zellen (DC) übernehmen eine Schlüsselrolle in der Immunabwehr. Sie bilden eine „Brücke“ zwischen der angeborenen und adaptiven Immunität, da sie Antigene aufnehmen und verarbeiten und diese dann in Form von MHC-Peptid-Komplexen zusammen mit costimulierenden Molekülen an ihrer Oberfläche exprimieren. Über diesen Mechanismus stimulieren sie vor allem T-Lymphozyten (Lucas M et al., 2007). Eine einzelne dendritische Zelle ist in der Lage 100 bis 3000 Antigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren. Sie präsentiert 10 bis 100-fach mehr MHC-Peptid-Komplexe auf ihrer Oberfläche im Vergleich zu anderen antigenpräsentierenden Zellen wie z.B. Monozyten und ist somit deutlich effizienter (Banchereau J et al., 1998). Mehrere verschieden Immunzellen, sowohl Zellen des angeborenen, als auch die des erworbenen Immunsystems, sind an der Pathogenese des T1DM beteiligt. CD4+ und CD8+ T-Zellen, sowie Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle bei der Zerstörung der βZellen im Pankreas. Allerdings findet man ebenso B-Zellen, NK-Zellen und dentritische Zellen im pankreatischen Infiltrat und in den pankreasnahen Lymphknoten. Diese Zellen können sowohl zum β-Zelluntergang beitragen wie auch eine β-Zell protektive Funktion aufweisen. Dies lässt darauf schließen, dass ein ausgeprägter „crosstalk“ zwischen den Immunzellen, welche für die Pathogenese der Erkrankung und aber auch für die Immunregulation verantwortlich sind, stattfindet (siehe Abb.1, S.10). 1.3.1. Autoimmunität Autoimmunität, d.h. eine überschießende Immunreaktion gegen körpereigenes Gewebe, wird durch autoaggressive Immunzellen verursacht. Eine Autoimmunreaktion zeichnet sich durch das Auftreten autoreaktiver B-Zellen und T-Zellen aus. Autoreaktive Zellen lassen sich auch beim Gesunden nachweisen. Allerdings werden sie dort nicht durch andere Zellen aktiviert und sie reagieren sehr unspezifisch, z.B. entstehen Autoantikörper mit geringer Avidität. Für eine ausreichende Toleranz des Immunsystems gegenüber körpereigenem Gewebe ist ein ausgewogenes Verhältnis von proinflammatorischen und regulierenden Mechanismen unerlässlich. Eine mögliche Erklärung für die Entstehung von Autoimmunität könnte ein Ungleichgewicht von regulatorischen Mechanismen der TZellen sein. Weitere mögliche Erklärungen wären eine Resistenz der CD4+ Effektorzellen gegenüber der Kontrolle von regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) oder die Hemmung regulatorischer T-Zell-Funktion durch bestimmte Cytokine (Bettini M et al., 2009). 5 1.3.2. T-Zellen CD4+ Effektorzellen unterteilt man in T-Helferzellen Typ 1 (TH1), die vor allem das proinflammatorische Cytokin IFN-γ sezernieren (Mosmann TR et al., 1986), THelferzellen Typ 2 (TH2), welche sich durch die Produktion der Cytokine IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 auszeichnen (Trinchieri G et al., 1996; Lafaille JJ, 1998) und T-Helferzelle Typ 17, welche die Cytokine IL-17 und IL-22 produzieren (Langrish et al., 2005; Bettelli E et al., 2007). Allerdings wurde in neuesten Forschungsergebnissen festgestellt, dass es eine große Flexibilität in der Cytokinproduktion der CD4+ T-Zellen gibt; sie sind in der Lage, ihr Cytokinprofil zu ändern (O`Shea JJ, Paul WE, 2010). CD8+ T-Zellen, auch cytotoxische T-Zellen (CTL) genannt, induzieren in den Zielzellen Apoptose bzw. sezernieren Perforine und Granzyme. Diesen Vorgang nennt man auch MHC-Klasse I gesteuerte Cytotoxizität. Zusätzlich wird auch das proinflammatorische Cytokin IFN-γ durch CD8+ T-Zellen produziert. 1.3.3. Regulatorische T-Zellen Regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) fungieren als Kontrollzellen, die die Aktivität des Immunsystems steuern und die Selbsttoleranz regulieren. Als zentrale Selbsttoleranz bezeichnet man die negative Selektion der T-Lymphozyten im Thymus. Treg-Zellen sind für die periphere Selbsttoleranz verantwortlich. Es sind mehrere Arten bekannt, welche auf Grund ihrer Oberflächenmoleküle und Cytokinprofile in verschiedene Subpopulationen unterteilt werden: CD4+CD25+-Treg-Zellen, FoxP3+-Zellen, TH3 und NK-T-Zellen (Niemeyer M, 2005). Sie produzieren die immunsuppressiven Cytokine TGF-ß und IL-10, welche zur Limitierung der Immunantwort gegenüber Fremdantigenen führen und eventuell vor Autoimmunität schützen, indem sie die Proliferation und Aktivierung autoreaktiver T-Effektorzellen unterdrücken (Tang Q & Bluestone JA, 2008). Mit einem Tetracyclin on/off Mausmodell wurde gezeigt, dass eine Gabe von TGF-ß1 die Konzentration von CD4+CD25+-Treg-Zellen erhöht und so vor der Entstehung eines experimental autoimmune diabetes (EAD) in diesem Mausmodell schützt (Peng Y et al., 2004). Eine weitere Studie mit NOD-Mäusen ergab ebenfalls, dass Treg-Zellen eine wichtige Funktion bei der Prävention von EAD erfüllen. NOD-Mäuse ohne Treg-Zellen (CD28-Defiziens) entwickelten sehr schnell einen EAD (Salomon B et al., 2000). Eine Steigerung der Anzahl von Treg-Zellen durch IL-2 Injektionen führte dagegen zu einem protektiven Effekt (Tang Q & Bluestone JA, 2008). Treg-Zellen benötigen für ihr Überleben und Funktion IL-2, allerdings produzieren sie es nicht selbst. Diese 6 Beobachtung führte zu der Erkenntnis, dass Treg-Zellen von der IL-2-Produktion und weiteren Stimulation durch CD4+ Effektorzellen abhängig sind. Grinberg-Beyer et al. zeigten anhand von Mausmodellen mit EAD, dass diabetogene T-Zellen die Proliferation von Treg-Zellen mittels TNF-α induzierten (Grinberg-BleyerY et al., 2010). Treg-Zellen differenzieren im Thymus. Aber auch in der Peripherie kann diese Differenzierung durch die Gabe von TGF-ß induziert werden. Luo et al. demonstrierte, dass die Stimmulation von DC mit TGF-ß1 zu einer Differenzierung naiver CD4+ CD25+-T-Zellen zu „Inselzellprotektiven“ CD4+CD25+-FoxP3+-Treg-Zellen führte (Luo X et al., 2007). Die Aktivierung der Treg-Zellen erfolgt durch Antigenpräsentation über DC und könnte möglicherweise auch durch spezifische Antigene oder altered peptid ligand (APL) von statten gehen. Diese Tatsache ist von therapeutischem Nutzen, da man durch gezielte Stimulation und Aktivierung von Treg-Zellen autoaggressive T-Zellen hemmen kann. 1.3.4. Zellen des angeborenen Immunsystems: Professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC), Makrophagen und NK-Zellen Die Zellen des angeborenen Immunsystems spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese des T1DM. Sie produzieren proinflammatorische sowie suppressive Cytokine und bestimmen dadurch das Cytokinmilieu, durch welches autoreaktive inselzell-spezifische T-Zellen aktiviert oder gehemmt werden. Zu den professionell antigenpräsentierenden Zellen zählen B-Zellen, zwei Typen von myeloiden dendritische Zellen (mDC1 und mDC2), plasmozytische dendritische Zellen (pDC), Makrophagen, die Mikroglia des ZNS und Thymusepithelzellen. DC sind wesentlich an der Differenzierung naiver T-Zellen in CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen und an der Selbsttoleranz durch Treg-Zell-Funktion beteiligt (Windhagen A et al., 1995). DC in den Inselregionen des Pankreas weisen eine zentrale Position in der Präsentation Insulin-abhängiger Antigene und der daraus resultierenden Immunreaktion auf. Insulin bzw. Proinsulin aus den ß-Zellen werden von DC aufgenommen, prozessiert und den T-Zellen in den pankreatischen Lymphknoten präsentiert (Mohan JF et al., 2010; Pugliese A et al., 2001). Zusätzlich präsentieren DC die Autoantigene GAD65 und IA-2 (Allen JS et al., 2009; Reijonen H et al., 2000). In einigen Versuchen wurde gezeigt, dass mDC aus NOD-Mäusen durch eine gesteigerte Produktion von IL-12 und costimulatorischer Moleküle, u.a. von B7-Molekülen vermehrt T-Zellen aktivieren (Poligone B et al., 2002; Steptoe RJ et al., 2002). Den pDC wird eine verminderte Fähigkeit zur Aufnahme, Prozessierung und Präsentation gelöster Antigene zugeschrieben 7 (Lande R et al., 2010). Allerdings wurde bei Menschen sowie in Mausmodellen beobachtet, dass pDC durch das von ihnen produzierte Typ 1 IFN in einigen Situationen T1DM induzieren, aber auch hemmen können (Li Q et al., 2008). DC spielen andererseits eine protektive Rolle in der Pathogenese des T1DM, indem sie die Expansion von antigenspezifischen Treg-Zellen induzieren, welche eine Schlüsselfunktion bei der Hemmung einer β-Zell-Schädigung übernehmen (Ueno H et al., 2007). Durch die Injektion von Granulozyten-Kolonien-stimulierender Faktor (G-CSF) wurde die Anzahl der pDC und mDC in der Milz in NOD-Mäusen gesteigert, welche daraufhin keinen EAD entwickelten. Dieser Effekt beruhte auf der Aktivierung von CD4+ CD25+ Treg-Zellen durch DC. Diese Treg-Zellen unterdrücken pathogene autoaggressive T-Zellen u.a. durch die Produktion von TGF-β (Kared H et al., 2005). Neben bereits erwähnten Immunzellen befinden sich auch Makrophagen in den Inselzellinfiltraten im Pankreas. Sie können dort bereits vor der Anwesenheit von T-Zellen detektiert werden. Die Aktivität der Makrophagen wird u.a. durch TNF-α und IL-1β gesteuert (Arnush M et al., 1998; Dahlen E et al., 1998). Die Makrophagen selbst produzieren das Cytokin IL-12 und begünstigen die Differenzierung diabetogener CD8+ T-Zellen (Jun HS et al., 1999). NK-Zellen wurden im Pankreas von T1DM-Patienten und in mehreren Mausmodellen entdeckt. Sie schädigen sowohl durch ihre cytotoxische Aktivität als auch durch die Sezernierung von IFN-γ die β-Zellen des Pankreas. Im Pankreas von NOD-Mäusen findet man einen aktiveren NK-Zell-Phänotyp als im Vergleich zu Isolaten aus der Milz oder pankreatischen Lymphknoten. Sie zeigen eine stärkere Expression spezifischer Oberflächenrezeptoren z.B. von NKG2D (natural killer group 2 member D) oder NKp46 (natural killer protein 46), die mit Rezeptoren auf β-Zellen interagieren. Des Weiteren zeichnen sie sich durch eine gesteigerte Produktion von IFN-γ aus (Poirot L et al., 2004; Brauner H et al., 2010). Ihre pathogene Rolle wird bei der Entwicklung eines Diabetes deutlich, in denen NK-Zellen nach Infektion mit Coxsackievirus B4 mittels Antikörpern gegen bestimmte Rezeptoren in ihrer Funktion gehemmt wurden. Dies verhinderte das Entstehen eines EAD im Mausmodell (Flodstrom M et al., 2002). 8 1.4.Pathogenese des T1DM Zu Beginn der Erkrankung steht eine klinisch unauffällige prädiabetische Phase von sehr variabler Länge, in welcher bereits ß-Zell-spezifische sowie unspezifische Veränderungen in der humoralen und zellulären Immunreaktion nachgewiesen werden können (Durinovic-Belló I, 1998; Christie M et al., 1997). Während der Entwicklung eines T1DM findet eine komplexe Interaktion zwischen den ß-Zellen des Pankreas, dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem statt. Die Zellen des angeborenen Immunsystems wie NK-Zellen, DC und Makrophagen sind in der Lage, aggressive autoreaktive T-Zellen zu aktivieren. Sie können über die Produktion bestimmter Cytokine und durch ihr cytotoxisches Potential direkt die ß-Zellen schädigen (Lehuen A et al., 2010). Die Autoimmuninsulitis in den Langerhans-Inselzellen beruht auf der Einwanderung von autoreaktiven TH1 und CTL in den Pankreas (siehe Abb.1). CTL zerstören die Insulin-produzierenden ß- Zellen durch induzierte Apoptose, ausgelöst durch die Sekretion von Perforinen und Granzymen, TH1 dagegen durch sezernierte proinflammatorische Cytokine wie z.B. TNF-α. Die Aktivierung der T-Zellen erfolgt über die Bindung des TCR an den MHC II-Peptid-Komplex auf APC oder des TCR an den MHC I-Peptid-Komplex der ß-Zellen. Des Weitern erfolgt eine Costimulation über weitere Rezeptoren (z.B. CD28, inducible costimulator (ICOS), CTLA-4 und programmed cell death 1 (PD-1)) durch Liganden der B7-Familie auf APC oder auf den ß-Zellen (Boehm & Bluestone, 2004). Immunzellen wie zum Beispiel DC, Makrophagen und NK-Zellen können ebenfalls direkt durch Apoptose mittels Sezernierung von Cytokinen wie IL-1ß, IL-12, IFN-γ und TNF-α die ß-Zellen schädigen. Außerdem locken die ß-Zellen durch die Produktion von Chemokinen (CXC-Chemokin-Ligand 10 (CXCL-10), CC-Chemokin-Ligand 2 (CCL2), CC-Chemokin-Ligand 20 (CCL20)) Makrophagen und Lymphozyten zu den Inselzellen und verstärken so die Immunantwort (siehe Abb.1, S.10). 9 2010 Abb.1: Übersicht über die Interaktion zwischen Immunzellen und der β-Zelle. Immunzellen der angeborenen bzw. der adaptierten Immunabwehr führen über verschiedene RezeptorLiganden-Interaktionen und durch die Ausschüttung von Cytokinen zu einer Zerstörung der β-Zellen. Verwendete Abkürzungen: CXCL=CXC-chemokine-ligand, CCL=CC-chemokine-ligand, CD=cluster of differentiation, DC=dendritic cell, IDO=Indoleamine 2,3-dioxygenase, IFN=Interferon, IL=Interleukin, NK cell=natural killer cell, NKG2D=natural killer group 2 member D, NKp46=natural killer protein46, MHC=major histocompatibility complex, PD1=programmed cell death 1, PDL1=programmed cell death ligand1, RAE1=retinoic acid early transcript 1, TCR=T cell receptor, TLR=toll like receptor, WE14=chromogranin-aderived peptid 1.5. Major Histocompatibility Complex (MHC) Die adaptive Immunabwehr benötigt zur Aktivierung Kontakt mit dem Antigen. Den T-Zellen werden Peptidfragmente des Antigens auf membrangebundenen Glykoproteinen präsentiert. Diese spezifischen Moleküle werden durch Gene kodiert, welche im Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) lokalisiert sind. Beim Menschen werden sie als Humane Leukozyten Antigene (HLA) bezeichnet. Der MHC besteht aus 3,5 Megabasen, 10 lokalisiert auf Chromosom 6 und enthält mehr als 200 Gene, welche in 3 Untergruppen gegliedert sind: Klasse I, Klasse II und Klasse III. Diese sind polygen und polymorph, d.h., dass jede der Hauptklassen in mehrere Genloci und Allele unterteilt ist. 1.5.1. MHC Klasse I Moleküle MHC Klasse I Moleküle werden in die Genloci A, B und C (HLA-A, HLA-B und HLA-C) untergliedert und auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen exprimiert. Ihre Aufgabe besteht darin, Peptide aus ca. 9 bis 11 Aminosäuren von vorwiegend cytosolischen Proteinen, z.B. von Viren sowie zelleigenen Proteinen, zu binden und diese dem TCR der CD8+ T-Zellen zu präsentieren. MHC Klasse I Moleküle bestehen aus einer polymorphen α-Peptid-Kette, welche mit einer nicht-polymorphen ß-2-Mikroglobulin-Komponente assoziiert ist. Die α-Kette, die sich aus drei verschiedenen Untereinheiten (α1-, α2-, α3Domäne) zusammensetzt, ist für die Bindung der Peptide verantwortlich (siehe Abb.2). Robbins Basic Pathology 8th Eddition Abb.2: Aufbau des MHC Klasse I-Moleküls. Verwendete Abkürzung: β2m= β2 microglobulin 1.5.2. MHC Klasse II Moleküle Der Klasse II-Loci (HLA-D-Loci) ist unterteilt in die Abschnitte HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR, welche die Gene für mindestens eine α- und eine ß-Kette enthalten. Die α- und die ß-Kette (α1-, ß1-Domäne) bilden zusammen die Bindungsgrube des heterodimeren Klasse II-Moleküls. Dort binden längere Peptide, welche u.a. von extrazellulären phagozytierten Antigenen stammen. Die gebundenen Peptide werden von CD4+ T-Zellen durch den TCR erkannt, dies führt zur Aktivierung der entsprechenden T-Zellen. Die Expression dieser Moleküle ist auf professionelle APC, humane CD4+ T-Zellen und 11 Thymusepithelzellen beschränkt. Einige Zellen exprimieren fakultativ diesen Rezeptor auf ihrer Oberfläche, dazu gehören Endothelzellen. Die Expression des MHC-Moleküls wird durch Cytokinstimulation, z.B. mittels IFN-γ ausgelöst (Lian et al., 1996) (siehe Abb.3). Robbins Basic Pathology 8th Eddition Abb.3: Aufbau des MHC Klasse II-Moleküls 1.5.3. MHC Klasse III Moleküle Die Gene der Klasse III des MHC sind nicht für die Peptidpräsentation verantwortlich, sondern kodieren für eine Reihe anderer Moleküle mit unterschiedlichen Funktionen, wie z.B. für Komplementkomponenten (C2, C4, Bf), für den Tumor Nekrose Faktor (TNF) und für das Hitzeschockprotein 70 (Hsp70). 1.5.4. T1DM-assozierte HLA-Moleküle Die meisten HLA-Gene sind sehr polymorph. Die Klasse I und Klasse II Moleküle zeichnen sich auf Grund ihrer vielen Allele durch eine große Variabilität in ihrer dreidimensionalen Struktur aus, besonders in der Antigen-bindenden Region. Die Struktur dieser Region bestimmt, ob und wie das Molekül mit Peptidfragmenten des Antigens und dem TCR interagiert. Die Kombination von Allelen, welche zusammen auf einem Chromosom vererbt werden, wird als Haplotyp bezeichnet. Die HLA-Klasse II Gene DRB1 und DQB1 scheinen die Hauptdeterminanten für eine erhöhte Suszeptibilität für T1DM zu sein (Herr M et al., 2000). Zusätzlich spielen auch noch einige andere Genloci, wie das Klasse I HLA-B Gen und das Klasse II HLA-DPB1 Gen eine Rolle (Nejentsev S et al., 1997; Noble JA et al., 2000). Die Suszeptibilität für T1DM ist assoziiert mit DQB1-Allel: HLA-DQB1*0201 (HLA-DQ2) sowie HLA-DQB1*0302 (HLA-DQ8). Außerdem stehen auch die Allele HLA-DRB1*0301 (HLA-DR3) und HLA-DRB1*0401 (HLA-DR4) im Zusammenhang 12 mit einem erhöhten Risiko für die Erkrankung und werden gehäuft in der Kombination HLA-DR3/4 und HLA-DQ2/8 vorgefunden (Kelly MA et al., 2003). Mehr als 90% der Patienten mit T1DM tragen entweder einen oder beide dieser Haplotypen. Der heterozygote Genotyp HLA-DR3/4 und HLA-DQ2/8 birgt das höchste Risiko für die Erkrankung. Dagegen scheint der Haplotyp DQA1*0102 und DQB1*0602 (HLA-DQ2/HLA-DQ6) einen stark protektiven Charakter bei der Entstehung von T1DM aufzuweisen (Kockum I et al., 1999; Donner H et al., 2000; Undlien DE et al., 1997). Diese Allelkonstellation findet man in ca. 20% der gesunden kaukasischen Population, bei Patienten mit Diabetes tritt es jedoch nur sehr selten auf (Redondo MJ et al., 2000). Die Stabilität der Moleküle könnte eine mögliche Erklärung für die protektive Wirkung einiger HLA-Moleküle sein. HLA-DQ Moleküle besitzen eine höhere Stabilität auf der Zellmembran im Vergleich zu den Molekülen, die zu einer erhöhten Suszeptibilität führen. Der Zusammenhang zwischen den HLA-DR und HLA-DQ Molekülen und dem Risiko T1DM zu entwickeln ist wahrscheinlich zurückzuführen auf ihre zentrale Rolle in der Antigenpräsentation und der Aktivierung von T-Helfer-Zellen. Diese Funktion wird hauptsächlich von ihrer dreidimensionalen Struktur der Antigen-bindenden Region bestimmt, welche von der α1 und ß1-Domäne der Peptidkette gebildet wird. Durch Röntgenkristallographie und Computermodelle der HLA-Moleküle wurde festgestellt, dass alle diejenigen Moleküle, welche mit einem erhöhten Risiko für T1DM assoziiert sind, einen ähnlichen geometrischen Bau ihrer Antigen-bindenden Region aufweisen. Dagegen zeigen die protektiven HLA-Moleküle eine ganz andere Bindungsstruktur (Cucca F et al., 2001; Lee KH et al., 2001). Die strukturellen Unterschiede der protektiven und prädisponierenden Moleküle führen zu funktionellen Unterschieden bei der Selektivität und Bindungsaffinität der Peptidfragmente des Antigens, der Interaktion mit dem TCR und der Stabilität auf der Oberfläche der exprimierenden Zelle. Eine mögliche Vorgehensweise, wie HLA-Moleküle die Entstehung von T1DM beeinflussen, könnte mit der Molekülstabilität und der Deletion autoreaktiver T-Zellen im Thymus zusammen hängen. Protektive HLA-Moleküle bilden möglicherweise stabilere Komplexe mit den Selbst-Antigenen im Thymus und führen so zu einer besseren Peptidpräsentation und einer effizienteren Aussortierung der potentiell autoreaktiven T-Zellen. Prädisponierende HLA-Moleküle führen durch einen weniger stabilen Komplex zu einer verminderten Deletion und folglich zu einer erhöhten Freisetzung autoreaktiver T-Zellen in die Peripherie (Starr TK et al., 2003; Jiang H. & Chess L., 2004). 13 Ein anderer möglicher Mechanismus stellt die Antigenbindung in der Peripherie dar. Im Gegensatz zu protektiven HLA-Molekülen könnten prädisponierende HLA-Moleküle Antigene bereits in der Peripherie gut binden und somit eine Immunantwort auslösen. Eine Alternative wäre, dass protektive HLA-Moleküle Antigene mit einer höheren Affinität binden und so kompetitiv zu den nicht-protektiven HLA-Molekülen agieren. 1.5.5. T-Zell-Interaktion mit dem MHC Klasse II-Rezeptor-Peptid-Komplex Die Aktivierung einer bestimmten T-Zelle ist abhängig von der Struktur des HLA-Moleküls und des präsentierten Peptids. Der TCR bindet an mehreren Stellen am HLA-Molekül, die in allen DR und DQ Heterodimeren konserviert sind. Zusätzlich interagiert der TCR aber auch mit polymorphen Resten, welche bei jedem MHC-Molekül verschieden sind. Folglich bestimmt die spezielle Abfolge der Aminosäuren an den nichtidentischen Bindungsstellen, welche T-Zell-Population durch das präsentierte Peptid angesprochen wird. 1.5.6. MHC Klasse II Antigenprozessierung Exogene Antigene und Autoantigene werden u. a. durch rezeptorvermittelte Endozytose von APC aufgenommen und in einem Endosom/Lysosom durch Proteasen (Cathepsine), die durch das saure Milieu aktiviert werden, verdaut. Cathepsine zerlegen Antigene in Peptide mit einer Länge von ca.13-30 Aminosäuren. Cathepsine werden auf Grund ihrer unterschiedlichen Aminosäuren im aktiven Zentrum in drei verschiedene Gruppen eingeteilt: Aspartatproteasen (CatD, E), Cysteinproteasen (CatB, C, F, H, L, S, X und AEP) und Serinproteasen (CatA, G). Außerdem kann man sie in Endo- und Exoproteasen untergliedern. Zu den Endoproteasen gehören CatG, S, D, E, F und AEP, zu den Exoproteasen werden CatX, C und A gezählt. CatH und CatB besitzen sowohl Endo- wie auch Exoproteaseaktivität. Jede dieser Proteasen besitzt ein spezifisches „Schneidemuster“. (Chapman, 2006; Rudensky & Beers, 2006; Vasilijeva et al., 2007; Zaidi & Kalbacher, 2008) Die MHC Moleküle werden im rauen Endoplasmatischen Retikulum translatiert und im Anschluss daran mit der so genannten Invarianten Kette beladen. Diese dient als Schutz vor vorzeitigem Binden von zelleigenen Peptiden, unterstützt die korrekte Faltung der MHC Moleküle und dirigiert den Transport zum endocytischen Kompartiment. Dort wird die Invariante Kette durch Cathepsine, bis auf ein kurzes Peptidfragment mit dem Namen Klasse II-assoziertes-Invariante-Ketten-Peptid (CLIP - Class II associated invariant chain 14 peptid) abgebaut. Das HLA-DM-Protein ermöglicht den Austausch von CLIP mit den degradierten Antigenen (Chapman HA, 2006; Zavasnik-Bergant T & Turk B, 2006; Rudensky A & Beers C, 2006; van Endert P & Villadangos JA, 2007). Nach der Beladung wird der MHC Klasse II-Peptid-Komplex an die Oberfläche der APC transportiert und steht dort zur Präsentation des Peptids bereit (Busch R et al., 2005) (siehe Abb.4). Bei der Antigenpräsentation muss sichergestellt werden, dass sich das zu präsentierende Peptid nicht auf dem Weg zur Oberfläche oder während des Aufenthaltes auf der Zellmembran löst und durch ein anderes Peptid ersetzt wird. Dies wird über die Stabilität des Komplexes geregelt: Ohne die Peptidbindung zerfällt der Komplex und wird durch Endozytose wieder in die Zelle aufgenommen. Nature Reviews Immunology, 2009 Abb.4: MHC Klasse II Prozessierungsweg Das Antigen wird mittels Endozytose internalisiert und durch Cathepsine in einem sauren Vesikel verdaut. Diese Vesikel verschmelzen mit Vesikeln, welche MHC Klasse II Moleküle enthalten, die im rauen Endoplasmatischen Retikulim (ER) translatiert wurden. Die Invariante Kette wird von Proteasen bis auf CLIP abgebaut. Mit Hilfe von HLA-DM wird CLIP gegen ein antigenes Peptid ausgetauscht. Nach Beladung wird das MHC Klasse II Molekül auf der Oberfläche der Zelle präsentiert. Verwendete Abkürzungen: CLIP=class II associated invariant chain peptide, MHC=major histocompatibility complex, PAMP=pathogen-associated molecular pattern, TAP=transporter associated with antigen processing, TLR=toll like receptor 15 1.6.Proinsulin Als die drei wichtigsten pankreatischen Autoantigene, die zur Aktivierung von autoreaktive T-Zellen führen können, gelten Proinsulin, die Glutamat Decarboxylase 65 (GAD65) und die Inselspezifische Tyrosinphosphatase (IA-2) (Baekkeskov et al., 1990). Proinsulin/Insulin wurde von mehreren Publikationen als ein Schlüssel-Autoantigen bei der Entwicklung von EAD und T1DM beschrieben (Jasinski JM & Eisenbarth GS, 2005; Nakayama M et al., 2005; You S & Chatenoud, 2006). Nakayama et al. führte Experimenten mit einem Maus-Modell mit modifiziertem Insulin durch, bei welchem der Tyrosinrest an Position B16 innerhalb des B9-B23 Epitops der ß-Kette durch Alanin ausgetauscht wurde. Mäuse, die dieses veränderte Insulin exprimierten, entwickelten kein EAD. Außerdem spielt Insulin eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der CD8+ T-Zellen: Insulin-Peptid B9-B23 mit der ausgetauschten Aminosäure an Position 16 konnte nicht von MHC Klasse I Molekülen gebunden werden und wurde somit auch nicht präsentiert. Untersuchungen ergaben, dass Proinsulin und nicht Insulin das vorherrschende Autoantigen in T1DM darstellt. Zum einen ist es das einzige ß-Zell-spezifische Protein der pankreatischen Autoantigene, zum anderen findet man gehäuft spezifische autoreaktive CD4+ T-Zellen gegen Proinsulin in T1DM-Patienten ( Ziegler R et al., 1991; Schloot et al., 1997; Schenker M et al., 1999; Bonifacio E et al., 1999; Durinovic-Belló L et al., 2002; Kent CS et al,. 2005). Experimente von French et al. mit NOD-Mäusen ergaben, dass die transgene Expression von Proinsulin in MHC Klasse II tragenden Zellen, einschließlich Zellen des Thymus, die Entstehung einer Insulitis verhindert und somit vor EAD schützt. Dies lässt darauf schließen, dass das Fehlen der zentralen Toleranz gegenüber Proinsulin im Thymus wesentlich zur Pathogenese der Erkrankung beiträgt (French MB et al., 1997). Das von den ß-Zellen des Pankreas produzierte Insulin durchläuft mehrere Prozessierungsschritte. Als Vorläufermolekül entsteht Präproinsulin im Endoplasmatischen Retikulum. Es besteht aus einem Signalpeptid, der ß-Kette, dem C-Peptid und der α-Kette. Das bisher lineare Molekül wird durch die Ausbildung von drei Disulfidbrücken gefaltet und so in eine stabile Konformation gebracht. Nach Abspaltung der Signalsequenz entsteht Proinsulin aus 84 Aminosäuren. Das reife Insulin bleibt nach dem Entfernen des C-Peptids durch spezifische Peptidasen zurück. Das Insulinmolekül setzt sich folglich aus der α-Kette mit 21 Aminosäuren und der ß-Kette mit 30 Aminosäuren zusammen, welche durch zwei intermolekulare Disulfidbrücken kovalent verbunden sind. Eine dritte intramolekulare Disulfidbrücke befindet sich innerhalb der α-Kette (Oyer PE et al., 1971). 16 Proinsulin 73-90 (P17), ein bekanntes T-Zell-Epitop, beinhaltet das C-Ende des C-Peptids und die enzymatische Schnittstelle der Insulin-α-Kette. Während der Reifung des Insulins wird diese Stelle proteolytisch gespalten und somit das bekannte T-Zell-Epitop zerstört (Congia U et al., 1998). 1.6.1. Proinsulinpeptid P17 Das Peptid P17 entspricht dem Proinsulin 73-90 bzw. C18-A1. Messungen der Bindungsaffinität ergaben, dass dieses Peptid mit der höchsten Affinität an DRB1*0401 Moleküle bindet (Geluk AM et al., 1998). Eine große Anzahl von in vitro generierten T-Zell-Hybridoma, die ursprünglich aus HLA-DRB1*0401 transgenen Mäusen stammen, welche mit humanem Proinsulin immunisiert wurden, erkannten P17. Folglich wurde in diesem Mausmodell das Epitop C18-A1 generiert und über DRB1*0401 Moleküle T-Zellen präsentiert. Außerdem wurde festgestellt, dass auch humane T-Zellen das Peptid P17 erkennen (Endl J et al., 2006). Ob dieses Epitop auch beim Menschen während der Antigenprozessierung entsteht, könnte durch die Analyse von eluierten Peptiden von MHC II auf APC von T1DM-Patienten geprüft werden. Kürzlich zeigte eine Studie, dass eine B-Zelllinie, homozygot für DR4, welche mit Proinsulin inkubiert wurde, das Peptid PIns75-92 präsentierte. Darüber hinaus produzierten T-Zellen von nicht erkrankten Individuen nach Kontakt mit diesem Peptid das antiinflammatorische Cytokin IL-10 (Arif S et al., 2004). 1.6.2. Proinsulin-Prozessierung durch Cathepsine Insulin kann auf Grund seiner Disulfidbrücken nicht direkt an MHC Klasse II Moleküle binden, sondern muss zur Generierung von T-Zell-Epitopen zuvor in APC internalisiert und prozessiert werden. Es bestehen verschiedene Möglichkeiten für die Beladung des MHC Klasse II Moleküls mit Peptiden. Erstens, das internalisierte Antigen wird durch Cathepsine in kleine Fragmente zerlegt und erst danach auf den MHC Klasse II geladen. Ein zweiter Mechanismus ist die sogenannte MHC Klasse II gesteuerte Antigenprozessierung. Vorverdaute größere Intermediate des Antigens werden auf den MHC Klasse II geladen und im Anschluss daran weiter durch Exoproteasen vom Nterminalen bzw. vom C-terminalen Ende aus gekürzt. Während diesem Antigentrimming wird der Kern des Antigens allerdings durch die Bindungstasche des MHC Klasse II Moleküls vor weiterem Abbau durch Proteasen geschützt (Delovich TL et al., 1988). Es sind bereits mehrere T-Zell-Epitope des (Pro-)Insulins bekannt. Naquet et al. zeigte, dass 17 das Peptid A1-A14/B1-B16 eine stärkere Immunreaktion auslöst als Insulin. Das Peptid A1-A14/B1-B16 wird als das kleinst mögliche T-Zell-Epitop bezeichnet, welches noch in der Lage ist, Insulin-reaktive humane T-Zellen zu aktivieren. Es besitzt als wichtiges Erkennungsmerkmal Glutaminsäure an Position A4 (Naquet et al., 1988). Ein weiteres T-Zell-Epitop ist das Peptid C19-A4, welches von einer Proinsulin-gepulsten B-Zelllinie (DR4 homozygot) eliminiert wurde. Dieses MHC II Peptid stimuliert T-Zellen von T1DM-Patienten (HLA-DRB1*0401/0401) durch die Sekretion von IFN-γ (Arif S et al., 2004). Bemerkenswert ist, dass das T-Zell-Epitop innerhalb der Proinsulinsequenz lokalisiert ist, wie auch die bereits beschriebenen T-Zell Epitope C18-A1 (P17) und A5-A21 ( Durinovic-Belló I et al., 2002; Durinovic-Belló I et al., 2006; Endl J et al., 2006; Di Lorenzo TP et al., 2007). Dies lässt darauf schließen, dass Proinsulin ein Hauptantigen bei T1DM darstellt. Einen weiteren Einblick in die Rolle der Cathepsine bei der Entstehung von Autoimmunität gaben Experimente mit Cathepsin-knockout-Mäusen. Mäuse ohne ein funktionierendes CatL Gen (CatL -/-) erwiesen sich als völlig resistent gegen die Entwicklung eines EAD, CatS -/- und CatB-/- Mäuse entwickelten nur eine milde Form von EAD. Dies lässt vermuten, dass Cathepsine wesentlich an der Pathogenese von Autoimmunkrankeiten wie zum Beispiel T1DM beteiligt sind (Maehr R et al., 2005; Hsing LC et al., 2010). Untersuchungen von Lang et al. zeigten, dass Proinsulin zuvor einem intrazellulären Verdau unterzogen werden muss, um als T-Zell Epitop zu agieren. Sie inkubierten Intermediate von Schweine-(Pro)Insulin mit einer fixierten B-Zelllinie. Diese B-Zelllinie war nicht mehr fähig, internalisierte Antigene zu prozessieren. Der Kontakt mit den Insulinintermediaten führte nicht zu einer Aktivierung von T-Zellen. Ähnliche Ergebnisse ergab der Gebrauch von A1-A4/B1-B16 als Antigen. Zu einer T-Zell Aktivierung kam es nur, wenn diese Intermediate intrazellulär prozessiert und im Anschluss daran auf das MHC Klasse II Molekül geladen wurden, nicht aber bei extrazellulärer Degradierung des oben genannten Peptids und der Inkubation mit fixierten B-Zelllinien. Humane DC aus dem peripheren Blut (primäre DC) beinhalten in ihrem lysosomalen Kompartiment CatA, CatB, CatE, CatG, CatH, CatS, CatD und CatX. Von CatE wird vermutet, dass es zur Freilegung der Schnittstellen des Proinsulins für CatD beiträgt und CatD für die weitere Verdauung zuständig ist, sodass entsprechende T-Zell-Epitope entstehen. Bestärkt wird dies durch das Auffinden von CatE in Endosomen bzw. CatD in Lysosomen von APC (Nishioku T et al., 2002). Der Einsatz eines Serinproteaseinhibitors 18 (Aprotinin) hatte keine Auswirkungen auf die Prozessierung von Proinsulin in BZelllinien. Dies erklären die Daten, dass B-Zelllinien keine Serinproteasen wie CatG beherbergen. Allerdings wurde CatG in primären APC gefunden. CatG ist direkt an der Prozessierung von Antigenen beteiligt (Burster T et al., 2004). In vitro Verdau der Insulinβ-Kette mit CatG ergab sieben verschiedene Schnittstellen: 6LC7, 17 LV18, 24 FF25 und 25 11 LV12, 15 LY16, 16 YL17, FY26 (Blow AM et al., 1977). Eine weitere Lokalisation von CatG, neben dem lysosomalen Kompartiment von mDC, ist die Oberfläche von primären humanen B-Zellen. Dies könnte ein Hinweis sein, dass die Prozessierung von Proinsulin bereits vor der Internalisierung des Antigens in APC beginnt. Es sind weitere Untersuchungen nötig, um genauere Kenntnisse über die Degradation von Insulin und Proinsulin mittels Cathepsinen von primären humanen APC zu erlangen. Besonders wichtig wäre zu klären, welche Intermediate zu einer Aktivierung von autoaggressiven TZellen führen. 19 1.7. Fragestellung T1DM entsteht auf Grund der selektiven Zerstörung der Insulin-produzierenden ß-Zellen des Pankreas durch Cytokine und autoreaktive T-Zellen. Dabei scheint Proinsulin eines der Hauptziele der autoreaktiven T-Zellen des T1DM zu sein. Folglich spielt die Prozessierung und die Präsentation von Proinsulin eine entscheidene Rolle in der Pathogenese der Erkrankung. Um neue antigenspezifische Therapiemöglichkeiten zu entwickeln, wie zum Beispiel auf Autoantigenen basierende Immunmodulatoren oder Protease-Inhibitoren, sind genauerer Erkenntnisse über die Prozessierung und die Identifikation der T-Zell-Epitope des Proinsulin unerlässlich. a) Wie wird Proinsulin durch lysosomale Proteasen von primären mDC prozessiert? Im Experiment soll gezeigt werden, welche Cathepsine in der Prozessierung von Proinsulin in APC beteiligt sind und welche Proinsulinfragmente dabei generiert werden. Dazu wurde Poinsulin mit aufgereinigten Cathepsinen gespalten und das proteolytische Verdaumuster durch LC-MS-MS identifiziert. Nachdem die spezifischen Schnittstellen der verwendeten Cathepsine bekannt waren, wurde Proinsulin mit Cathepsinen aus mDC1 inkubiert. Das entstandene Degradationsmuster wurde ebenfalls auf die gleiche Weise analysiert. b) Welche Peptidfragmente von Proinsulin führen zu einer Aktivierung der T-Zellen in PBMC von T1DM-Patienten? Da DC eine entscheidende Rolle in der Aktivierung von T-Zellen spielen, wurden die Proinsulinfragmente, die nach Degradation mit lysosomalen Cathepsinen aus mDC1 enstanden, identifiziert und neu synthetisiert. Die so entstandenen Proinsulinfragmente wurden hinsichtlich ihrer T-Zell Reaktivität untersucht. Dies geschah mittels eines T-Zell Assays, bei welchem die synthetisierten Peptide mit PBMC von T1DM Patienten bzw. gesunden Kontrollprobanden inkubiert wurden. Um feststellen zu können, ob ein bestimmtes Peptid eine T-Zellaktivierung auslöst wurde die Sekretion von verschiedenen Cytokinen durch ELISA analysiert. 20 2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Materialien für die in vitro Prozessierung von Proinsulin Lysosomale Proteasen aus mDC1 (Hergestellt von Dr. T. Burster) Proinsulin (E. Lilly, USA) Cathepsine D, S (R&D Systems, Wiesbaden, Germany) Cathepsin G: (Sigma, Aldrich) Verdau-Puffer: 0.1M NaCitrat pH 0.5, 2.5M DTT 2.1.2. Materialien für Peptidsequenzierung und Analyse Lösungsmittel A: 0,025% TFA in Wasser Lösungsmittel B: 0,024% TFA, 80% ACN in Wasser 10mM DTT ( Dithiotreitol) (Sigma. Aldrich) N2 Trockengas 2.1.3. Materialien für Peptidsynthese HOBT (Merck, Darmstadt, Germany) NMM (Merck, Darmstadt, Germany) 2.1.4. Materialien für Peptidbindungs-Assay HLA-DRB1*0401 Moleküle; isoliert aus einer HLA-DRB1*0401 exprimierenden BZelllinie (Dr. H. Kalbacher) Allel-spezifische, Peptid markiert mit 7-amino-4-methylcoumarin-3-Acetatsäure (AMCAHA) (Dr. H. Kalbacher) Peptide: DCins1 bis DCins16, Peptid 17 (Dr. H. Kalbacher) 2.1.5. Materialien für T-Zell Assay PBMC von T1DM Patienten, Probanden rekrutiert im Uniklinikum Ulm, Klinik für Innere Medizin I; in 10% DMSO (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) in Fetal Bovine Serum (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), in N2-Tank gelagert 21 Medium für T-Zell Assay: 10% FCS (Fetal Bovine Serum) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1% Penicillin/Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 0,2% Normocyn (Amaxa Biosystems, Köln, Deutschland) in RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Zellkulturplatte: Franklin Lakes, NJ, Tissue Culture Plate, 48 Vertiefungen, Polystyrol (BD, USA) Peptide: DCins1 bis DCins16, Peptid 17 (Dr. H. Kalbacher) Tabelle 1: HLA-Genotypen der untersuchten T1DM-Patienten und gesunden Kontrollen Verwendete Abkürzungen: HLA= Humanes Leukozyten Antigen, T1DM= Typ 1 Diabetes mellitus Donor HLA-Typ 913A T1DM DRB1*0401, DRB1*0401 912A T1DM DRB1*0401, DRB1*1302 868A T1DM DRB1*0401, DRB1*1201 BOB 136 T1DM DRB1*0401, DRB1*0101 BOB 196 T1DM DRB1*0401, DRB1*1302 947A Kontrolle DRB1*0401, DRB1*0701 948A Kontrolle DRB1*0401, DRB1*1101 BOB 509 Kontrolle DRB1*0401, DRB1*0404 93A Kontrolle DRB1*0401, DRB1*0701 867A Kontrolle DRB1*0401, DRB1*1501 2.1.6. Materialien für ELISA ELISA Mikotiterplatte: Bio-One, ELISA-Platte, Half-Area, 96 well, F-Form (Greiner Frickenhausen, Deutschland) Antikörper („coating“): Maus Anti-human IL-6, IL-17, IFN-γ, TGF-β1, TNF- α (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 22 Detektion-Antikörper: biotinylierter Ziegen Anti-human IL-6, IL-17, IFN-γ, TGF-β1, TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) Standard-Antikörper: rekombinantes humanes IL-6, IL-17, IFN-γ, TGF-β1, TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) Tabelle2: Liste der beim ELISA verwendeten Lösungskonzentrationen in Abhängigkeit vom Cytokin Verwendete Abkürungen: ELISA= enzyme linked immunosorbent assay, HRP= horseradish peroxidase, IFN= Interferon, IL= Interleukin, PBS= phosphate buffer saline, TGF= tumor growth factor, TNF= tumor nekrose factor Cytokin Coating- Detektions- Standart Antikörper Antikörper Konzentration HRP Konzentration Konzentration [pg/ml] [µg/ml] Streptavidin- ReagenzVerdünnungs- Verdünnung mittel in [ng/ml] PBS IL-6 2 200 1000-30 1/200 A IL-17 4 200 1000-30 1/200 B TNF-α 4 250 1000-30 1/200 B TGF-ß1 2 300 1000-30 1/200 C IFN-γ 4 175 1000-30 1/200 B Streptavidin- HRP: PBS: R&D Systems, Minneapolis, MN, USA 137mM NaCl, 2,7mM KCl, 8,1mM Na2HPO4, 1,5mM KH2PO4, pH 7,2, 0,2 µm filtriert (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Blockierungspuffer: 1% BSA (Albumin bovine Fraktion V (SERON, Minooka, IL, USA) in PBS mit 0,05% NaN3 Reagenzverdünnungsmittel A: Reagent Diluent 0,1% BSA, 0,05% Tween20 in Tris- gepufferter Salzlösung aus 20mM Trizma-Base, 150mM NaCl), pH 7,2-7,4, 0,2µm filtriert Reagenzverdünnungsmittel B: 1% BSA in PBS Reagenzverdünnungsmittel C: 0,05% Tween20 in PBS; 1,4% entlipidiziertes bovines Serum Substratlösung: 1:1 Mischung der Farbreagenzien A (H2O2) und B (Tetramethylbenzidin) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) Stopplösung: 2 N H2SO4 23 Waschpuffer: 0,05% Tween20 in PBS, pH 7,2-7,4 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) TGF-β1-Aktivierungslösung: 1N HCl (Riedel de Haën, Seelze, Deutschland) TGF-β1-Neutralisierungslösung: 1,2 N NaOH, 0,5M HEPES (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) Überstände der T-Zell Assay, 5 Tage in Kultur 2.1.7. Verwendete Geräte Brutschrank: BBD 6220 (Heraeus, Hanau, Deutschland) Sterilbank: Lamin Air HA2448 (Heraeus, Hanau, Deutschland) ELISA-Lesegerät: EL808 (BioTek, Winooski, Vermont, USA) Gefrierschrank: (Liebherr, Bulle, Schweiz) Kühlschrank: (Bosch, Gerlingen, Deutschland) Pipet-Boy: Pipet boy acu (INTEGRA Biosciences, Fernwald, Deutschland) Pipetten, Einkanal: VWR 3X (VWR, Darmstadt, Deutschland) Pipetten, Einkanal: Eppendorf Reference (Eppendorf, Hamburg, Research (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Pipette, Mehrkanal: Eppendorf Deutschland) Pipetten, serologisch: Costar Stripette (Corning Inc., Corning, NY, USA) Stickstofftank: Chronos 400 (Messer, Sulzbach, Deutschland) Zentrifuge: Multifuge 3S-R (Heraeus, Hanau, Deutschland) Wasserbad: 3043 (Köttermann, Hänigsen, Deutschland) Multiple peptid synthesizer: Syro II (MultiSynTech, Witten, Germany) Reversed-phase HPLC, C18 Trennsäule 125x8mm (Grom, Herrrenberg, Germany) Massenspektrometrie: MALDI-TOF (Reflex IV, Bruker Daltonics, Bremen, Germany) HPSEC (high performance size exclusion chromatography) LC/ESI-MS/MS Agilent CapPump: 1100 (Agilent, Waldbronn, Germany) 24 Trennsäule: 150x0,5mm Zorbax SB-C18, 5µm (Agilent, Waldbronn, Germany) Ionen-Fallen Massenspektrometer: (Bruker-Daltonics, Bremen, Germany) BioTools 2.2 SequenceEditor 2.2: (Bruker-Daltonics, Bremen, Germany) 25 Kapillaren 2.2. Methoden 2.2.1. In vitro Prozessierung der Proinsulinpeptide Im ersten Schritt wurde Proinsulin (0,2 µg/µl Proinsulin, 0,1 M Natriumcitrat pH 5.0, 2,5 mM DTT, mit einem Endvolumen von 50 µl) mit gereinigten Cathepsinen (CatD, G, S), welche Endoproteaseaktivität besitzen, mit einer Konzentration von 1-2 µg/ml für 2h bei 37°C inkubiert. Die lysosomalen Proteasen wurden durch differentielle Zentrifugation aus mDC1 isoliert. Die in vitro Prozessierung von Proinsulin erfolgte durch die Inkubation von Substrat und lysosomalen Proteasen aus mDC1 (2,6 µg der Gesamtproteine) bei 37°C für 4h. 2.2.2. Peptidsequenzierung und Analyse Im zweiten Schritt wurden die resultierenden Verdauprodukte unter Gebrauch von one-line capillary LC/ESI-MS/MS aufgetrennt und analysiert (durchgeführt durch Dr. A. Beck, Panatecs, Tübingen). Durch Umkehrphase-Flüssigchromatographie (HPLC-High Performance Liquid Chromatography) wurden die entstandenen Peptidgemische aufkonzentriert, gereinigt und in die einzelnen Verdauprodukte aufgetrennt. Zur LC-Separation verwendete man eine Agilent CapPump 1100, verbunden mit einer 150 x 80,5 mm Zorbax SB-18C 5 µm kapillaren Trennsäule. Die Verdauprodukte wurden zusammen mit einem Eluat (mobile Phase, Laufmittel) durch die Trennsäule, welche die stationäre Phase enthält, gepumpt. Die Flussrate betrug 15 µl/min. Folgende Gradienten wurden zur Separation genutzt: 0-5 min 5% System B, 5-45 min 5-80% System B, 45-50 min 80-95% System B. Lösungsmittel A bestand aus 0,025% TFA in Wasser (v/v); Lösungsmittel B aus 0,024% TFA, 80% ACN in Wasser (v/v). Danach wurden die Proben mit Dithiotreitiol (DTT) mit einer Endkonzentration von 10 mM für 30 min bei 56°C inkubiert. Je nach Stärke der Wechselwirkung zwischen dem Peptidgemisch und der stationären Phase erschienen die Bestandteile der zu untersuchenden Substanz zu verschiedenen Zeiten, den Retentionszeiten, am Ende der Trennsäule und wurden dort mit einem UV-Detektor bei 214 nm nachgewiesen. Nun konnten die aufgetrennten Peptidfragmente chromatography mittels Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS - liquid tandem mass spectrometry) analysiert werden. Es wurde ein HCT+ Ionenfallen Massenspektrometer im positiven Ionen Mode mit Standard ESI interface verwendet. Das MS (300-2000 m/z) und MS/MS (200-3000 m/z, 1V Fragmentationsamplitude) Spektrum betrug eine Scan-Geschwindigkeit von 26000 26 m/z/sec). Die Spannung des Elektronensprays betrug 3850 V, die Flussrate des Trockengases N2 6 l/min bei 325°C und der Verneblerdruck 15 psi. Die Analyse der MS/MS-Daten erfolgte automatisch mittels BioTools 2.2 und SequenceEditor 2.2. Zur Bestätigung wurden die entstandenen Fragmente mit MS-Produkt-Komponenten, welche von einem ProteinProspector (http//prospector.ucsf.edu/) generiert wurden, verglichen. Außerdem erfolgte eine Analyse der größeren Proteinfragmente durch MALDI-TOF. 2.2.3. Peptidsynthese Die Synthese der Peptide geschah durch die solid phase Fmoc Strategie (durchgeführt durch Dr. H. Kalbacher, Tübingen). Zur Blockierung der Amino- und Carboxygruppen kamen Fmoc-Schutzgruppen (Fluorenyloxymethylchlorid) zum Einsatz. Für die Aktivierung der Carboxygruppe verwendete man HOBt (Hydrobenzotriazole) und NMM (N-Methyl-Maleimide). Die Peptide wurden durch reversed-phase HPLC mit einer C18 Trennsäule (125 x 8mm) gereinigt und aufgetrennt. Die Analyse erfolgte durch Massenspektrometrie (MALDI-TOF). 2.2.4. Peptidbindungs-Assay Gelöste HLA-DRB1* 0401 Moleküle wurden mit Allel-spezifischem Peptid, welches N-terminal mit 7-amino-4-methylcoumarin-3-Acetatsäure-Hämaglutinin (AMCA-HA) markiert wurde, bei pH 7,0 inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von P17 bzw. DCins Peptide (0,1 µg/µl, 3 µM) als Kompetitoren um die Bindungsstelle. Analysiert wurden die Proben durch Hochleistungsgrößenausschluss-Chromatographie (HPSEC). (Durchgeführt durch Dr. T. Burster, Labor Dr. H. Kalbacher, Tübingen; gemeinsame Auswertung in Ulm.) 2.2.5. Zellkultur: Durchführung eines T-Zell Assays PBMCs von Typ 1 Diabetes mellitus Patienten und gesunden Kontrollprobanden, welche in FCS/DMSO im Stickstofftank (-196°C) gelagert sind, wurden entnommen und in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut. Die nachfolgenden Arbeitsschritte wurden alle unter einer Sterilbank durchgeführt. Die aufgetauten PBMC wurden in 10 ml Medium überführt, 5 Minuten bei 1700 U/min. zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das so gewonnene Pellet konnte nun in 10 ml Medium resuspendiert werden. Anschließend erfolgte eine weiter Zentrifugation und Verwerfung des Überstandes um das DMSO auszuwaschen. Das Pellet wurde in 17 ml 27 Medium erneut resuspendiert. Im weiteren Vorgang wurde jeweils in Doppelbestimmung 3 µM Peptide (DCins 1-16, Peptid 17) mit einer Endkonzentration von 10 µg/ml in jede Kavität der Zellkulturplatte vorgelegt. In jeden Ansatz wurden 400 µl Medium, in welchem die PBMC gelöst vorlagen, zupipettiert. Die Zellkultur wurde im Brutschrank (bei 37 C°, 6% CO2, 94% relative Luftfeuchtigkeit) inkubiert. Nach fünf Tagen wurde der Überstand für weitere Experimente entnommen. 2.2.6. Cytokindetektion mittels ELISA Verwendet wurde für den enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA - Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) der Duo Set ELISA Development System Kit von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Der erste Schritt bestand darin, die ELISA-Mikrotiterplatte (96-Well) mit dem jeweils für das zu detektierende Cytokin spezifischen Coating-Antikörper mittels einer Mehrkanalpipette zu beschichten. Dazu verwendete man je 100 µl Antikörperlösung ([4 µg/ml] in PBS bei IL-6, IL-17, TNF-α und IFN-γ; [2 µg/ml] in PBS bei TGF-β1). Es folgte eine Inkubation über Nacht im Kühlschrank bei +4°C. Am nächsten Tag wurde die gecoatete Mikrotiterplatte am Waschbecken invertiert um die Antikörperlösung zu verwerfen. Daraufhin schlossen sich drei Waschgänge mit Waschpuffer (0,05% Tween20 in PBS) an. Mit einer Multikanalpipette wurde in jede Vertiefung 200 µl des Waschpuffers gegeben und die Platte am Waschbecken invertiert. Die Zugaben von 200 µl Blockierungspuffer (1% BSA in PBS) pro Vertiefung für 60 Minuten bei RT verhinderte eine spätere unspezifische falschpositive Cytokinbindung an der Wand der Platte. Im Anschluss erfolgten erneut drei Waschschritte. Zur Cytokindetektion wurden nun die Überstände des T-Zell Assays in Vierfachbestimmung pipettiert (25 µl für IL-6, 70 µl für IL-17, 25 µl für TNF-α, 80 µl für IFN-γ). Das das Cytokin TGF-β1 in einer latenten Form vorliegt, war zur Detektion dieses Cytokins eine Aktivierung nötig. TGF-β1 ist im inaktiven Zustand an das Latenz-assozierte Peptid (LAP) gebunden. Zur Dissoziation wurden 6 µl 1M HCl zu 50 µl Überstand des T-Zell Assays zugegeben, für 10 Minuten bei RT inkubiert und im Anschluss mit einer Lösung aus 1,2 M NaOH, 0,5 M HEPES neutralsiert. Von der Cytokinlösung, die nun in einer immunreaktiven Form vorliegendes TGF-β1 enthielt, wurden 30 µl pro Vertiefung in Vierfachbestimmung pipettiert. Im nächsten Schritt erfolgte das Aufbringen einer definierten Konzentration jeden Cytokins als Standard, um die Cytokin-Konzentration quantitativ zu bestimmen. Dazu gab 28 man den Standard mit [1000 pg/ml] in 100 µl des jeweiligen Reagenzverdünnungsmittels (siehe Tabelle 1). Um eine Konzentrationskurve zu ermitteln benötigte man eine zweifache serielle Verdünnung des Standards durch Titration. Dies erfolgte furch eine Entnahme von 50 µl aus der Vertiefung mit [1000 pg/ml] und einer Vermischung mit 50 µl vorgelegtem Reagenzverdünnungsmittel in den nächsten beiden benachbarten Vertiefungen. Dort lag nun eine Konzentration von 500 pg/ml vor. Dieser Vorgang wurde insgesamt sechs Mal durchgeführt bis zu einer Konzentration von 31 pg/ml in den letzten beiden benachbarten Vertiefungen. Nach der Inkubation der Überstände und des Standards bei RT für 90 Minuten, gefolgt von drei Waschschritten, konnte 100 µl einer Lösung mit Biotingekoppelten Detektionsantikörpern in jede der Vertiefungen gegeben werden. Dies wurde erneut für 90 Minuten bei RT inkubiert. Nach drei Waschschritten wurden 100 µl der Streptavidin-HRP-Lösung (Verdünnung 1/200) in Reagenzverdünnungsmittel zupipettiert. Auf Grund der Photosensitivität der HRP erfolgte die Inkubation über 20 Minuten bei RT in Dunkelheit. Streptavidin bindet sich an das Biotin des Detektionsanitkörpers. Nach drei Waschschritten folgte eine Zugabe von 100 µl der Substratlösung in jede Vertiefung und eine 20 minütige Inkubation bei RT, ebenfalls in Dunkelheit. Aus den zwei gemischten Substraten der Substratlösung entstand durch die katalytische Aktivität der HRP ein farbiges Reaktionsprodukt. Das Zupipettieren von 50 µl H2SO4 beendete die Reaktion. Zum Abschluss konnte die optische Dichte im ELISA-Lesegerät bei 450nm bestimmt werden. 2.2.7. Statistisches Verfahren Die statistische Analyse der gesammelten Daten wurde mit Hilfe des Programmes one-way ANOVA und der Software GraphPad Prism 3 durchgeführt. Ein Wert von p<0,05 wurde als signifikant, ein Wert von p<0,01 als hochsignifikant betrachtet. 29 3. Ergebnisse 3.1. Verdau von Proinsulin mit lysosomalen Cathepsinen Da myoloide dentritische Zellen Typ 1 (mDC1) besonders für die Aktivierung von TZellen verantwortlich sind, wurde Proinsulin mittels lysosomalen Cathepsinen von mDC1 degradiert und die resultierenden Bruchstücke über die Flüssigkeits-ChromatographieTandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert (durchgeführt von Dr. A. Beck, Tübingen; Proinsulin-Verdau durchgeführt von Dr. T. Burster, Ulm; Gemeinsame Auswertung in Ulm). Die entstandenen Fragmente wurden neu synthetisiert (durchgeführt durch Dr. H. Kalbacher, Tübingen) und in einem funktionellen T-Zell Assay auf ihre TZell-Reaktivität getestet. Zuvor wurden einzelne gereinigte Cathepsine (CatD, G und S) mit Proinsulin inkubiert und das proteolytische Verdaumuster durch LC-MS-MS analysiert. Die Analysen der Schnittstellen, dargestellt in einer „Cathepsin-Schnittstellen-Karte“ (siehe Abb.5-7, S.31) zeigten, dass intaktes Proinsulin von allen verwendeten Cathepsinen geschnitten wurde. Jedes einzelne Cathepsin besitzt ein spezifisches Verdaumuster. CatD, eine Aspartatprotease, bevorzugt als Schnittstellen des Proinsulinproteins hydrophobe Aminosäuren wie F, L und Y. CatS schneidet hauptsächlich nach den hydrophoben Aminosäuren V und L in P2-Position. CatG hingegen, verdaut Proinsulin nach aromatischen und positiv geladenen Aminosäuren wie F, Y, R und L und besitzt bei neutralem pH seine höchste proteolytische Aktivität. Nach der Identifizierung der spezifischen Verdaustellen der einzelnen Cathepsine, wurde Proinsulin mit der lysosmalen Fraktion aus mDC1 inkubiert (siehe Abb.8). Der Verdau wurde ebenfalls analysiert und mit den bereits bekannten Schnittstellen der einzelnen Cathepsine verglichen. Auffallend war, dass mehr übereinstimmende Schnittstellen mit CatG resultierten als mit CatD und CatS. Außerdem wurde Proinsulin gehäuft in der Mitte von bereits beschriebenen T-Zell Epitopen gespalten (Endl J et al., 2006). Die Prozessierungsprodukte DCins1 bis DCins16 von Proinsulin, sowie P17, sind in Tabelle 3 auf Seite 32 zusammengefasst. 30 FVNQHL CGSH LVEALY LVCGERGFFY TPKT RREAED LQVGQVE LGG GPGAGSLQP L ALEGSLQKR G IVEQCCTSIC S LYQLENYCN Abb.5: lysosomaler Verdau von Proinsulin mit Cathepsin D FVNQHL CGSH LVEALY LVCGERGFFY TPKT RREAED LQVGQVELGG GPGAGSLQPL ALEGSLQKR G IVEQCCTSIC S LYQLENYCN Abb.6: lysosomaler Verdau von Proinsulin mit Cathepsin S FVNQHL CGSH LVEALY LVCGERGFFY TPKT RREAED LQVGQVELGG GPGAGSLQPL ALEGSLQKR G IVEQCCTSIC S LYQLENYCN Abb.7: lysosomaler Verdau von Proinsulin mit Cathepsin G Abb.5-7: Proinsulinprozessierung mit selektiven lysosomalen Cathepsinen (CatD, CatS oder CatG). Proinsulin wurde in vitro für 2 h mit CatD, CatS oder CatG inkubiert und die entstandenen Fragmente mittels high performance liquid chromatography (HPLC) und Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS-MS) analysiert. Die Pfeile markieren die spezifischen Schnittstellen der Cathepsine, die Balken stellen die identifizierten Peptide dar. P10 mDC P17 Y LVCGERG FFY TPKT RR AGSLQPL ALEGSLQKR G P21 QCCTSIC SLYQLENYCN FVNQHL CGSHLVEALY LVCGERGFFY TPKT RREAED LQVGQVELGG GPGAGSLQPL ALEGSLQKR G IVEQCCTSIC SLYQLENYCN Abb.8: Proinsulin wurde mit lysosomalen Cathepsinen von myeloide dendritische Zellen Typ 1 (mDC1) prozessiert. Die Analyse der resultierenden Peptidfragmente erfolgte mittels high performance liquid chromatography (HPLC) und Tandem-Massenspektometrie (LC-MS-MS). P10, P17 und P21 zeigen bereits bekanntes T-Zell-Epitope. Die Pfeilspitzen markieren die Schnittstellen der Cathepsine, die Balken stellen die identifizierten Peptide dar. 31 Tabelle 3: Aminosäuresequenz der resultierenden Peptide (DCins Peptide) nach Proinsulinverdau mit lysosomalen Cathepsinen aus myeloide dendritische Zellen Typ 1 DCins-Peptid (Proinsulinabschnitt) Aminosäuresequenz DCins1 (A14-A21) YQLENYCN DCins2 (C25-A6) ALEGSLQKRGIVEQC DCins3 (B1-B13) FVNQHLCGSHLVE DCins4 (B1-B14) FVNQHLCGSHLVEA DCins5 (C25-A8) ALEGSLQKRGIVEQCCT DCins6 (C25-A7) ALEGSLQKRGIVEQCC DCins7 (C13-C24) GGGPGAGSLQPL DCins8 (B1-B12) FVNQHLCGSHLV DCins9 (C11-C24) ELGGGPGAGSLQPL DCins10 (B1-B15) FVNQHLCGSHLVEAL DCins11 (B28-C13) PKTRREAEDLQVGQVELGGG DCins12 (C3-C24) EDLQVGQVELGGGPGAGSLQPL DCins13 (C4-C24) DLQVGQVELGGGPGAGSLQPL DCins14 (A8-A21) TSICSLYQLENYCN DCins15 (A9-A21) SICSLYQLENYCN DCins16 (B1-B19) FVNQHLCGSHLVEALYLVC 3.2. Peptidbindungs-Assay Die Bindung der in Tabelle 3 gezeigten Peptide an HLA-DRB1*0401 Moleküle ist eine wichtige Voraussetzung für die Aktivierung von spezifischen T-Zellen mit dem entsprechenden TCR. Aus diesem Grund wurde die Bindungsfähigkeit der DCins Peptide an das HLA Klasse II Moleküls DRB1*0401 untersucht. Zuerst wurden Fluoreszensmarkierte Hämagglutinin Peptide (AMCA-HA) auf HLA-DRB1*0401 geladen. Im Anschluss daran gab man die zu untersuchenden Peptide DCins1 bis DCins16, sowie P17 hinzu. Durch die Gelfiltration (HPSEC - high performance size exclusion chromatography) konnte das Bindungsverhalten der einzelnen Peptide analysiert werden (Experiment durchgeführt durch Dr. T. Burster in Tübingen, Labor Dr. H. Kalbacher; Gemeinsame Auswertung in Ulm). In Abbildung 9 (siehe S.33) ist die Verdrängung der AMCA-HAPeptide von der Bindungsstelle des HLA-DRB1*0401 Moleküls durch DCins Peptide reziprok dargestellt. Die Peptide DCins8, 14 und 15 banden nicht an HLA-DRB1*0401. 32 Eine mäßige Bindungsaffinität zeigten DCins1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, und 16. Peptid DCins12 zeigt eine vergleichbare Bindungskapazität wie P17. Abb.9: Hämagglutinin-Peptid gekoppelt mit 7-amino-4-methylcoumarin-3 Acetatsäure (HA-AMCA) wurde auf HLA-DRB1*0401 Moleküle geladen und mit DCins Peptiden und Peptid P17 in äqimolarer Konzentration kompetitiert. Die kompetetiven Bindungsverhältnisse wurden mittels HPSEC analysiert. Gezeigt ist die Summe zweier unabhängiger Experimente. 3.3. T-Zell Assay und Cytokindetektion mittels ELISA PBMC von T1DM-Patienten (n=5) und gesunden Kontrollen (n=5) wurden mit 16 verschiedenen Peptide von Proinsulin (DCins1 bis DCins16, Tabelle 3, S.32) und P17, welches bereits als ein T-Zell-Epitop für autoreaktive T-Zellen bekannt ist und hier als Positivkontrolle diente, für fünf Tage kultiviert. Die dazu verwendeten PBMC stammen von T1DM-Patienten (HLA- DRB1*0401/x) bzw. von gesunden Probanden (HLA- DRB1*0401/x). Die Cytokinproduktion wurde mit Hilfe von ELISA-Messungen detektiert. 3.3.1. TNF-α PBMC der T1DM-Patienten zeigten eine erhöhte TNF-α-Produktion mit P17. Bei Donor 868A, PBMC von einem T1DM-Patient, gab es nur ein schwaches Signal bei der Stimulierung mit den DCins Peptiden (siehe Abb.10, S.35). Es konnte lediglich eine geringe Konzentration an TNF-α detektiert werden. Für Donor BOB136 lagen die Werte 33 unter der Nachweisgrenze (Daten nicht gezeigt). Keinen signifikanten Unterschied zwischen den DCins Peptiden in der TNF-α-Freisetzung lies sich bei Donor BOB196 erkennen. Im Vergleich mit DCins10 ergaben die Donoren 868A, 912A und 913A signifikante Ergebnisse (p<0,05): Bei Donor 868A kam es zu einer signifikanten Senkung der Produktion von TNF-α mit DCins15 und DCins16, bei Donor 912A mit DCins 2, 3, 4, 5, 14 und 15. Donor 913 dagegen zeigte eine signifikant erhöhte TNF-α Expression mit DCins 7 und DCins15. Die ELISA-Ergebnisse der gesunden Kontrollprobanden 867A, 93A, 947A und BOB509 ließen folgendes feststellen: Für Donor 867A ließ sich nur eine geringe Konzentration von TNF-α detektieren. Allerdings ergab die Stimulation der PBMC mit DCins8 eine signifikant erhöhte TNF-α Produktion, für Donor 947A eine signifikant reduzierte. Die PBMC des Donors 948A zeigten keinen Unterschied zwischen den eingesetzten Peptiden hinsichtlich der Konzentration von TNF-α. Die TNF-α Expression als Reaktion auf DCins15 bei Donor 93A und DCins1, 2, 3, 4, 6, 7 und 8 bei Donor BOB509 war signifikant im Vergleich zu DCins10. Es ist festzustellen, dass Extremwerte, die eine Erhöhung der TNF-α Produktion darstellen bei einigen Donoren gemessen wurden: DCins1, 5 und 15 bei Donor 93A und DCins 10, 12 und 13 bei Donor 947A. Anzumerken wäre, dass die T1DM-Patienten 912A und BOB196 den gleichen MHC Klasse II Haplotyp (HLA-DRB1*0401/1302) aufweisen. Allerdings Cytokinprofile im ELISA. 34 zeigten beide unterschiedliche 1000 100 10 1 TNF-α in pg/ml 1000 100 10 1 TNF-α in pg/ml Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TNF-α in pg/ml 10000 1000 100 10 1 TNF-α in pg/ml 100 * TNF-α in pg/ml 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 TNF-α in pg/ml 10 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TNF-α in pg/ml * Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TNF-α in pg/ml 100 * 1000 100 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TNF-α in pg/ml A) TNF-α Donor 867A (DRB1*0401/1501) TNF-α Donor 93A (DRB1*0401/0701) 1000 * 100 10 1 TNF-α Donor 948A (DRB1*0401/1101) TNF-α Donor BOB509 (DRB1*0401/0404) 100 * * * * TNF-α Donor BOB196 (DRB1*0401/1302) TNF-α Donor 913A (DRB1*0401/0401) 10 35 * * * * * * * * * * * * 10 1 TNF-α Donor 947A (DRB1*0401/0701) 1000 * 10 1 B) TNF-α Donor 912A (DRB1*0401/1302) 1000 * * 10 1 TNF-α Donor 868A (DRB1*0401/1201) 100 * * 1 Abb.10: Detektion von TNF-α in Zellkulturüberständen mittels TNF-α spezifischen ELISA. PBMC wurden mit Peptiden (DCins 1-16, P17) für 5 Tage inkubiert. Die Sekretion von TNF-α wurde mit Hilfe von TNF-α spezifischen ELISA ermittelt (vierfach-Bestimmung). A) T1DM; B) Kontrolle; * signifikant (p<0,05), im Vergleich zu DCins10. Verwendete Abkürzung: TNF-α=Tumornekrosefaktor-α 3.3.2. IFN-γ Bei der Analyse der IFN-γ Konzentrationen konnten nur geringe Signale detektiert werden. Für Donor BOB136 (T1DM) lagen die Werte unter der Nachweisgrenze (Daten nicht gezeigt). Die T1DM-Patienten Donor 868A, Donor 913A und Donor BOB196 zeigten eine signifikante bzw. hoch signifikante Steigerung der IFN-γ-Produktion bei mehreren DCins-Peptiden in Vergleich zu DCins10 (siehe Abb.11, S.37). Eine hochsignifikante Erhöhung der IFN-γ Sekretion lag für Donor 868A (DCins1 bis DCins6), bei Donor BOB196 (DCins4 sowie DCins12) und bei Donor 913A (DCins6, 7, 8 und 12) vor. Eine Reduzierung der IFN-γ Sekretion ergab der Einsatz der Proinsulinfragmente DCins9, DCins10 und DCins16. Donor 912A zeigte eine signifikante Erniedrigung der IFN-γ Sekretion bei Kontakt mit DCins14 bzw. eine hochsignifikante Senkung mit DCins16. Die detektierten IFN-γ Konzentrationen mit P17 lagen bei Donor 868A und Donor BOB196 jeweils unter der Nachweisgrenze. Donor 913A und 912A zeigten einen moderaten Anstieg mit P17. Donor 912A und Donor BOB196, T1DM-Patienten mit identischem HLA-DR-Genotyp zeigten ein unterschiedliches Cytokinprofil, wie bereits für TNF-α gezeigt wurde. Das Cytokinprofil der Kontrollprobanden zeigte ebenfalls eine geringe Konzentrationen von IFN-γ. Die Werte für Donor 947A ergaben ein sehr schwaches Signal bzw. lagen unter der Nachweisgrenze. Eine hochsignifikante Steigerung der IFN-γ Sekretion erhielt man bei Stimulation der PBMC des Donors 93A mit DCins15, sowie bei Donor 867A und Donor 947A mit DCins4. P17 induzierte eine nur moderat erhöhte Produktion von IFN-γ bei den Kontrollen. Nicht signifikante Änderungen der IFN-γ Sekretion wiesen Donor 948A und Donor BOB506 auf. 36 1000 100 10 1 100 IFN-γ in pg/ml 100 ** ** 100 10 1000 * ** ** ** ** * * 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 IFN-γ in pg/ml IFN-γ in pg/ml 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IFN-γ in pg/ml 10 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 1000 IFN-γ in pg/ml Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IFN-γ in pg/ml 100 ** * IFN-γ in pg/ml Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IFN-γ in pg/ml 1000 ** 1 100 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 p17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IFN-γ in pg/ml A) IFN-γ Donor 867A (DRB1*0401/1501) IFN-γ Donor 93A (DRB1*0401/0701) 1000 100 ** IFN-γ Donor 948A (DRB1*0401/1101) IFN-γ Donor BOB196 (DRB1*0401/1302) 10 * IFN-γ Donor 913A (DRB1*0401/0401) 37 ** 10 1 IFN-γ Donor BOB509 (DRB1*0401/0404) 1000 100 10 1 IFN-γ Donor 947A (DRB1*0401/0701) * 10 1 B) IFN-γ Donor 912A (DRB1*0401/1302) 100 ** 1 IFN-γ Donor 868A (DRB1*0401/1201) 1000 ** ** ** ** ** ** 10 1 Abb.11: Detektion von IFN-γ in Zellkulturüberständen mittels IFN-γ spezifischen ELISA. PBMC wurden mit Peptiden (DCins 1-16, P17) für 5 Tage inkubiert. Die Sekretion von IFN-γ wurde mit Hilfe von IFN-γ spezifischen ELISA ermittelt (vierfach-Bestimmung). A) T1DM; B) Kontrolle; * signifikant (p<0,05); ** hochsignifikant (p<0,01), im Vergleich zu DCins 10. Verwendete Abkürzung: IFN-γ =Interferon-γ 3.3.3. IL-17 Ebenso wie IFN-γ ergaben die Messungen von IL-17 schwache Signale, es wurden nur geringe Konzentrationen des Cytokins nachgewiesen. Allerdings ließ sich bei den T1DMDonoren insgesamt höhere Werte feststellen im Vergleich zu den Kontrollen (siehe Abb.12, S.38-39). Für Donor 868A (T1DM), BOB136 (T1DM) und 93A (Kontrolle) lag die Konzentration von IL-17 unter der Nachweisgrenze. Eine hochsignifikante Erhöhung des IL-17 Niveaus zeigte sich bei Donor 913A, wenn PBMC mit DCins2 und DCins15 stimuliert wurden. Es ergab sich eine hochsignifikante Senkung von IL-17 bei Donor 912A unter Verwendung von DCins14 und DCins16, sowie eine signifikante Senkung von IL-17 bei DCins2. Die Sekretion von IL-17 mit P17 war bei Donor 913A, 912A und BOB196 nur moderat erhöht. Auch hier war keine einheitliche Cytokinproduktion bei den Donoren 912A und BOB196 zu beobachten. Bei den Kontrollen, dazu zählen Donor 867A, Donor 947A, Donor 948A und BOB509 ließen sich ebenfalls eine IL-17 Produktion nachweisen. Bei Donor 948A fiel auf, dass im Vergleich zu den anderen DCins Peptiden, DCins 4 die Sekretion von IL-17 stark induzierte. Donor BOB509 wies eine signifikante Erhöhung der IL-17 Sekretion bei Stimulation der PBMC mit DCins1 und DCins14 auf. Die Auswertungen der Cytokinproduktion von Donor 867 sowie Donor 947 zeigten keine signifikanten Unterschiede. A) IL-17 Donor 948A (DRB1*0401/1101) IL-17 in pg/ml 100 10 ** 100 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 1 1000 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 IL-17 in pg/ml IL-17 Donor 867A (DRB1*0401/1501) * 10 1 100 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 * IL-17 in pg/ml 100 IL-17 Donor 947A (DRB1*0401/0701) Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-17 in pg/ml IL-17 Donor BOB509 (DRB1*0401/0404) 38 B) IL-17 Donor 912A (DRB1*0401/1302) 100 10 1 1000 100 ** ** 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-17 in pg/ml 1000 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-17 in pg/ml IL-17 Donor BOB196 (DRB1*0401/1302) 1000 100 ** ** 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-17 in pg/ml IL-17 Donor 913A (DRB1*0401/0401) Abb.12: Detektion von IL-17 in Zellkulturüberständen mittels IL-17 spezifischen ELISA. PBMC wurden mit Peptiden (DCins 1-16, P17) für 5 Tage inkubiert. Die Sekretion von IL-17 wurde mit Hilfe von IL-17 spezifischen ELISA ermittelt (vierfach-Bestimmung). A) T1DM; B) Kontrolle; * signifikant (p<0,05); ** hochsignifikant (p<0,01), im Vergleich zu DCins 10. Verwendete Abkürzung: IL-17=Interleukin-17 3.3.4. IL-6 Im Allgemeinen konnten bei allen Donoren, außer Donor 868A (Daten nicht gezeigt) IL-6 Konzentrationen im ELISA gemessen werden (siehe Abb.13, S.40). Die Ergebnisse der T1DM Patienten ergaben im Vergleich zu den nicht erkrankten Kontrollen höhere IL-6 Werte. Die Messwerte der T1DM-Proben, Donor 912A, BOB136, 913A und BOB196 zeigten eine relativ hohe Produktion von IL-6 bei Stimulation mit P17. Bezogen auf DCins10 zeigten Donor 196A mit DCins12 und Donor 913A mit DCins15 eine hochsignifikante Steigerung der IL-6 Sekretion. Für Donor BOB136 und 912A war die IL-6 Produktion bei Stimulation mit den meisten verwendeten DCins Peptiden hochsignifikant reduziert. Auch hier war das Cytokinprofil zwischen den Donoren 912A und BOB196, die den gleichen MHC Klasse II Haplotyp besitzen, unterschiedlich. Die Ergebnisse der IL-6 Produktion der gesunden Kontrollen zeigten die Tendenz, dass DCins16 bei einigen Donoren eine erhöhte IL-6 Produktion der PBMC zur Folge hatte. Eine gesteigerte IL-6 Sekretion wies Donor 947A für die Mehrzahl der verwendeten Peptide auf. Auch bei Donor 867A und Donor 93A ließ sich eine hochsignifikante IL-6 Konzentrationssteigerung für DCins16 bzw. DCins15 beobachten. Donor 948A und Donor BOB509 zeigten keine signifikanten Unterschiede. 39 100 10 1000 100 1000 100 IL-6 in pg/ml ** ** ** ** ** ** ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** * 10 ** ** ** ** * 10 1 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 IL-6 in pg/ml IL-6 in pg/ml 10 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-6 in pg/ml 100 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 1000 IL-6 in pg/ml Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-6 in pg/ml 100 ** IL-6 in pg/ml Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-6 in pg/ml 1000 1 1000 1 1 10000 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 IL-6 in pg/ml A) IL-6 Donor 867A (DRB1*0401/1501) IL-6 Donor 93A (DRB1*0401/0701) 1000 ** 100 10 1 IL-6 Donor 948A (DRB1*0401/1101) IL-6 Donor BOB509 (DRB1*0401/0404) 1000 100 10 D 1 IL-6 Donor 947A (DRB1*0401/0701) ** 10 1 B) IL-6 Donor BOB136 (DRB1*0401/0101) IL-6 Donor BOB196 (DRB1*0401/1302) 1000 * 100 10 1 IL-6 Donor 912A (DRB1*0401/1302) IL-6 Donor 913A (DRB1*0401/0401) 10000 ** 40 * 100 1 Abb.13: Detektion von IL-6 in Zellkulturüberständen mittels IL-6 spezifischen ELISA. PBMC wurden mit Peptiden (DCins 1-16, P17) für 5 Tage inkubiert. Die Sekretion von IL-6 wurde mit Hilfe von IL-6 spezifischen ELISA ermittelt (vierfach-Bestimmung). A) T1DM; B) Kontrolle; * signifikant (p<0,05); ** hochsignifikant (p<0,01), im Vergleich zu DCins 10. Verwendete Abkürzung: IL-6=Interleukin-6 3.3.5. TGF-ß1 Die Analysen der Messergebnisse der TGF-ß1-Konzentration ergaben insgesamt hohe Werte. Die Donoren BOB196 und 868A zeigten eine relativ homogene Verteilung der Sekretion von TGF-ß1 als Folge der Stimulation der PBMC mit DCins1 bis DCins16 und P17 (siehe Abb.14, S.41-42). Bei DCins9 bis DCins14 zeigten Donor 912A und Donor 913A eine stark verringerte TGF-ß1-Freisetzung. Allerdings ergaben sich insgesamt keine signifikanten Unterschiede. Bei den Donoren 912A und BOB196, ließ sich kein einheitliches Sekretionsmuster von TGF-ß1 erkennen. Die gesunden Kontrollen zeigten einen moderaten Anstieg der TGF-ß1 Konzentration bei den meisten getesteten Proinsulinfragmenten. Jedoch kam es bezüglich des Peptids DCins10 zu keinen signifikanten Unterschieden. A) 1000 100 10 1 1000 100 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TGF-ß1 in pg/ml 10000 TGF-ß1 Donor 93A (DRB1*0401/0701) Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 TGF-ß1 in pg/ml TGF-ß1 Donor 867A (DRB1*0401/1501) TGF-ß1 Donor BOB509 (DRB1*0401/0404) 100 10 1 10000 1000 100 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TGF-ß1 in pg/ml 1000 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TGF-ß1 in pg/ml TGF-ß1 Donor 948A (DRB1*0401/1101) 1000 100 10 1 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TGF-ß1 in pg/ml TGF-ß1 Donor 947A (DRB1*0401/0701) 41 Dcins1 Dcins2 Dcins3 Dcins4 Dcins5 Dcins6 Dcins7 Dcins8 Dcins9 Dcins10 Dcins11 Dcins12 Dcins13 Dcins14 Dcins15 Dcins16 p17 TGF-ß1 in pg/ml 1000 100 10 1 TGF-ß1 in pg/ml 100 10 1 TNF-ß1 in pg/ml 1000 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TGF-ß1 in pg/ml 10000 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 Dcins 1 Dcins 2 Dcins 3 Dcins 4 Dcins 5 Dcins 6 Dcins 7 Dcins 8 Dcins 9 Dcins 10 Dcins 11 Dcins 12 Dcins 13 Dcins 14 Dcins 15 Dcins 16 P17 TGF-ß1 in pg/ml B) TGF-ß1 Donor BOB136 (DRB1*0401/0101) TGF-ß1 Donor BOB196 (DRB1*0401/1302) 10000 1000 100 10 1 TGF-ß1 Donor 912A (DRB1*0401/1302) TGF-ß1 Donor 913A (DRB1*0401/0401) 100 10 1 TGF-ß1 Donor 868A (DRB1*0401/1201) 1000 100 10 1 Abb.14: Detektion von TGF-β1 in Zellkulturüberständen mittels TGF-β1 spezifischen ELISA. PBMC wurden mit Peptiden (DCins 1-16, P17) für 5 Tage inkubiert. Die Sekretion von TGF-β1 wurde mit Hilfe von TGF-β1 spezifischen ELISA ermittelt (vierfach-Bestimmung). A) T1DM; B) Kontrolle; * signifikant (p<0,05); ** hochsignifikant (p<0,01), im Vergleich zu DCins 10. Verwendete Abkürzung: TGF-β1=Tumor growth factor-β1 42 4. Diskussion T1DM ist eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, bei der es durch autoreaktive T-Zellen zur Zerstörung der Insulin produzierenden β-Zellen im Pankreas kommt. Es sind bereits einige körpereigene Peptide bekannt, welche von den T-Zellen nach Präsentation auf MHC Klasse II Molekülen als Antigen erkannt werden und eine Immunantwort induzieren. Dazu zählt auch Proinsulin, welches eine wichtige Rolle in der Pathogenese des T1DM spielt. Für die Entwicklung neuer antigenspezifischer Therapieansätze ist die Identifikation von autoantigenen T-Zell-Epitopen unerlässlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Verdau von Proinsulin durch lysosomale Proteasen aus mDC1 untersucht. Dazu wurden im ersten Schritt einzelne gereinigte Cathepsine verwendet und deren Schnittmuster durch Massenspektrometrie analysiert. Alle verwendeten Cathepsine waren in der Lage Proinsulin zu verdauen. Im zweiten Schritt untersuchte man die in vitro Prozessierung von Proinsulin durch ein Gemisch von lysosomalen Cathepsinen aus mDC1. Dieser Verdau wurde ebenfalls durch Massenspektrometrie analysiert und mit dem Schnittmuster der einzelnen Cathepsine verglichen. Auffallend war, dass die spezifischen Schnittstellen von CatG dem Verdaumuster des Proinsulins mit lysosomalen Cathepsinen sehr ähnlich waren. Dies lässt darauf schließen, dass CatG vermutlich eine Schlüsselfunktion in der Proinsulinprozessierung in mDC1 und somit in der Generierung von immundominaten T-Zell-Epitopen besitzt. Des Weiteren wurden die durch den Proinsulin-Verdau entstandenen Proinsulinbruchstücke neu synthetisiert und hinsichtlich ihrer T-Zell-Reaktivität getestet. Dazu wurden PBMC von T1DM Patienten sowie von gesunden Kontrollprobanden mit dem MHC-II-Genotyp HLA-DRB1*0401 mit 16 verschiedenen Proinsulinfragmenten (DCins1-16) sowie mit einem bereits bekannten immundominaten T-Zell-Epitop (P17), welches als Positivkontrolle diente, inkubiert. Die Zellüberstände wurden im Anschluss an den T-Zell Assay mittels cytokinspezifischem ELISA auf die proinflammatorischen Cytokine TNF-α, IFN-γ, IL-6 und IL-17 sowie das antiinflammatorische Cytokin TGF-β getestet. Eine Aktivierung der T-Zellen lies sich anhand einer signifikant erhöhten Cytokinproduktion feststellen. Jedoch zeigten alle untersuchten Donoren unterschiedliche Cytokinprofile, da jeweils verschiedene DCins Peptide zur T-Zell-Aktivierung führten. 43 4.1. Verdau von Proinsulin mit lysosomalen Cathepsinen DC beherbergen in ihrem Antigen-prozessierenden Kompartiment eine Reihe verschiedener Cathepsine, sowohl Endoproteasen als auch Exoproteasen, welche unterschiedliche Schnittspezifität aufweisen. Der Vergleich der Schnittstellen einzelner isolierter Cathepsine (CatS, CatD und CatG) mit dem Schnittmuster, welches durch ein Gemisch lysosomaler Cathepsine aus mDC1 entstand, zeigte, dass CatG eine dominierende Rolle bei der Prozessierung von Proinsulin einnahm. Es ergaben sich viele übereinstimmende Schnittstellen mit dem isoliertem CatG. Dies wurde durch die Untersuchung bestärkt, dass die Aktivität von CatG in PBMC von T1DM Patienten höher war als bei gesunden Kontrollen (nicht publizierte Daten von N. Schäfer). Die hohe CatG-Aktivität könnte für eine verstärkte Degradierung von Proinsulin, und von weiteren Autoantigenen zuständig sein, somit auch zu einer intensivierten Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen führen. Die Hemmung von CatG durch spezifische Inhibitoren könnte ein möglicher neuer therapeutischer Ansatz in der Behandlung und Prävention von T1DM darstellen. Der in vitro Verdau von Proinsulin durch lysosomale Cathepsine von mDC1 ergab mehrere verschiedene Peptidfragmente unterschiedlicher Länge (siehe Tabelle 3, S.32). Im Vergleich dazu zeigten die Untersuchungen von eluierten Peptiden von einer HLA-DRB1*0401/0401 exprimierender B-Zelllinie, welche zuvor mit Proinsulin stimuliert wurde, dass die Fragmente B27-C15, C3-C26 und C25-A12 resultierten (Arif S et al., 2004). Diese Fragmente, die nach Verdau auf dem MHC II Molekül präsentiert wurden, wiesen Ähnlichkeit mit DCins5 (C25-A8), DCins11 (B28-C13) und DCins12 (C3-C24) auf. Weitere Peptide, welche als T1DM T-Zell-Epitope innerhalb der Proinsulinsequenz beschrieben wurden, sind die Aminosäurenabfolgen A5-A21 (Endl J et al., 2006) sowie C19-A3 (Durinovic-Bello I et al., 2006). Es ist jedoch nicht sicher, ob diese Epitope auch durch die Antigenprozessierungsmaschinerie von mDC1, welche Peptide für MHC Klasse II Moleküle generieren, hergestellt werden. C18-A1 (P17) welches der Proinsulinsequenz C19-A3 sehr ähnlich ist und in dieser Arbeit als Positivkontrolle diente, ist ebenfalls als ein T-Zell-Epitop beschrieben, da autoreaktive C18-A1-spezifische T-Zellen in T1DM Patienten gefunden wurden (Durinovic-Bello I et al., 2002). Das Peptid C19-A3 stimuliert T-Zellen von T1DM-Patienten und regt dabei die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen wie z.B. von IFN-γ an. Auch DCins15 (A9-A21) weist zu dem T-Zell-Epitop A6-A21 aus PBMC nur geringe Unterschiede auf. Es besitzt einige Aminosäuren weniger 44 am N-Terminus. Bei dem Verdau von Proinsulin mit isoliertem CatG erschien unter anderem das Fragment C33-A13, welches dem Epitop A1-A13 (Mannering SI et al., 2005) von einem HLA-DRB1*0401 exprimierenden T-Zell-Klon ähnelt. Diese Region scheint ebenfalls eine Bindungsregion für Autoantikörper darzustellen; Individuen mit gesteigertem Risiko für die Entwicklung eines T1DM besaßen hoch affine Autoantikörper für die α-Kette von Proinsulin. Auffallend war, dass der genannte T-Zell Klon, welcher aus pankreatischen Lymphknoten isoliert wurde, nur auf Proinsulin und nicht auf Insulin reagierte (Mannering SI et al., 2009). Ein fast identisches Epitop der α-Kette (A1-A15) wurde bereits von Zhang L. publiziert (Zhang L. et al. 2008). C33-A13 besitzt eine zusätzliche Aminosäure am N-terminalen Ende, die im Vergleich mit A1-A13 fehlt. Allerdings entstand dieses Fragment nicht nach der Proinsulinprozessierung mit dem lysosomalen Cathepsingemisch aus mDC1. Ebenso wurden bereits humane CD4+ T-Zell Klone, welche durch die Proinsulinfragmente B9-B23 (Alleva DG et al., 2001) und B11B27 (Schloot NC et al., 1998) aktiviert werden, beschrieben. Zusammenfassend kann man festhalten, dass in meinen Untersuchungen die Prozessierung von Proinsulin mittels lysosomalen Cathepsinen aus mDC1 einige Fragmente hervorbrachte, welche bereits bekannten Epitopen ähneln. Es ergaben sich aber auch einige Verdauprodukte, die nur wenig Ähnlichkeit mit den bereits beschriebenen Epitopen besaßen. Eine mögliche Erklärung für die unterschiedlichen Epitope gibt der Ablauf der Degradation von Proinsulin, welcher auf unterschiedliche Weise erfolgen kann. In den durchgeführten Experimenten wurde Proinsulin in vitro durch ein Gemisch aus lysosomalen Cathepsinen verdaut, welche so auch in mDC1 vorkommen. Allerdings können bei diesem Versuch weitere Vorgänge innerhalb der Antigenprozessierungsmaschinerie von mDC1 nicht miteinbezogen werden. Es sind zwei Möglichkeiten zur Beladung des MHC Klasse II Moleküls mit einem Peptid zu diskutieren. Ein Mechanismus ist die Internalisierung des Antigens und die Zerlegung innerhalb des lysosomalen Kompartiments durch verschiedene Cathepsine in kleine Bruchstücke. Diese werden im Anschluss direkt auf das MHC Klasse II Molekül geladen und zur Oberfläche der Zelle transportiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass das internalisierte Antigen zunächst in größere Fragmente (Intermediate) zerlegt wird, welche auf MHC Klasse II Moleküle binden können. Durch Exoproteasen, zum Beispiel CatA, B, C, H und X, wird das bereits gebundene Intermediat am N- sowie am C-terminalen Ende gekürzt. Allerdings bleibt die Bindungsregion von einem proteolytischen Verdau 45 unberührt, da sie durch die Bindungstasche des MHC Klasse II Moleküls geschützt ist. Vergleicht man die generierten Peptide des in vitro Verdau mit denen, welche von MHC Klasse II Molekülen einer B-Zelllinie eluiert wurden, fällt auf, dass sich die Längen der Peptide unterscheiden. C25-A12 stammt von MHC Klasse II Molekülen einer B-Zelllinie und gleicht, bis auf das C-terminale Ende, dem Peptdid DCins15 (C25-A8). Das C-terminale Ende könnte im lysosomalen Kompartiment durch CatS eingekürzt worden sein (siehe Abb. 6, S.31). Diese Schnittstelle für CatS wird durch die Bindungsgrube, wenn das entsprechende Intermediat an MHC Klasse II Moleküle gebunden ist, vor Verdau geschützt und das Peptid kann somit auf der Oberfläche der B-Zellen erscheinen. Dies erklärt auch, warum beim Proinsulinverdau Schnittstellen resultieren, die sich mitten in bereits beschriebenen T-Zell-Epitopen befinden. Darüber hinaus unterscheidet sich aber auch das Expressionsmuster der Cathepsine von B-Zelllinien und mDC1, weil beide Zellarten unterschiedliche Cathepsine besitzen. B-Zelllinien beherbergen kein CatG, welches in mDC1 eine dominierende Rolle in der Antigenprozessierung einnimmt, dafür aber reichlich AEP (Burster T et al., 2004; Watts C et al., 2005). Zur genaueren Analyse der generierten T-Zell-Epitope in mDC1 wäre es sinnvoll, die Peptide auf MHC Klasse II Molekülen zu eluieren und mittels Massenspektrometrie zu sequenzieren. Allerdings ist dies auf Grund der zu geringen Zellzahl von primären Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen aus dem peripheren Blut, nicht möglich. 4.2. Peptidbindungs-Assay Erst die Präsentation eines Antigens und die Erkennung des damit beladenen MHC Klasse II Moleküls über den TCR sowie zusätzliche costimulatorische Moleküle führen zur Aktivierung der T-Zelle. Folglich ist das Binden der prozessierten Proinsulinfragmente eine grundlegende Voraussetzung für eine T-Zell Antwort. Die Ergebnisse des Peptidbindungs-Assays ergaben, dass P17, bereits bekannt als HLA-DRB1*0401 T-Zell-Epitop, mit einer hohen Kapazität an das MHC Klasse II Molekül DRB*0401 bindet, ebenso wie DCins12. Einige verwendete Peptide, DCins8, 14 und 15, zeigten keine Bindung. Allerdings ließen sich aus dem Bindungsverhalten keine Rückschlüsse auf die Stärke der Aktivierung der T-Zellen schließen. Auch die Stimulation der PBMC mit DCins8, 14 und 15 führte bei den meisten Donoren zu einer proinflammatorischen Cytokinsekretion. PBMC enthalten neben CD4+ T-Zellen auch CD8+ T-Zellen, welche 46 ebenfalls Cytokine nach Aktivierung sezernieren. Jedoch werden CD8+ T-Zellen durch die Antigenpräsentation über MHC Klasse I Moleküle aktiviert. Es ist nicht auszuschließen, dass die verwendeten DCins Peptide (z.B. DCins1, welches nur aus acht Aminosäuren besteht) auch an diese Moleküle binden und somit beide T-Zell Typen zur Cytokinproduktion stimulieren. 4.3. T-Zell Assay und Cytokindetektion mittels ELISA Die generierten DCins Peptide wurden hinsichtlich ihrer T-Zell Reaktivität in einem funktionellen T-Zell Assay mit primären PBMC von T1DM und gesunden Kontrollen getestet. Zu erwarten wäre, dass die nicht erkrankten Kontrollen ein anderes Cytokinprofil als die T1DM Patienten aufweisen. Einige T1DM Patienten zeigten im Vergleich zu DCins10 eine erhöhte Cytokinsekretion (IFN-γ; Donor BOB196, 868A, 913A). DCins10 entspricht der Proinsulinsequenz B1-B15. Es ist bekannt, dass dieses Peptid auch an HLA-DQB1*0602 bindet. Dieser HLA-Genotyp wird mit einer protektiven Funktion in der Pathogenese des T1DM in Verbindung gebracht (Ettinger RA et al., 1998). Bei den oben genannten Donoren induzierte dieses Peptid nur eine sehr geringe Sekretion des proinflammatorischen Cytokins IFN-γ. P17 wurde in den Experimenten als Positivkontrolle verwendet, da es bereits als ein T1DM spezifisches immundominantes T-Zell-Epitop bekannt ist. Es zeigte sich aber, dass nicht alle PBMC von T1DM-Patienten mit einer Aktivierung von T-Zellen auf dieses Peptid reagierten (Durinovic-Belló I et al., 2006). Letztendlich ergaben die Untersuchungen hinsichtlich eines neuen immundominaten T-Zell-Epitops in der Proinsulinsequenz keine einheitlichen Ergebnisse. In der Tat beschreiben auch einige Publikationen, die in vitro Untersuchungen von Probanden mit β-Zell Autoimmunität durchführten, kein bzw. eine sehr geringes Ansprechen der T-Zellen auf Proinsulin (Semena G et al., 1999; Ellis T et al., 1999; Durinovic-Belló I et al., 2002). Zusätzlich scheint die Aktivierung der T-Zellen auch von der eingesetzten Proinsulin-Konzentration abhängig zu sein (Durinovic-Belló I et al., 2006). Eine hohe Konzentration an Proinsulin könnte deshalb nötig sein, da der TCR von Proinsulin-reaktiven T-Zellen eher eine schwache Bindungsaffinität besitzt. Diese hat zur Folge, dass die Proinsulin-reaktiven T-Zellen der negativen Selektion im Thymus entgehen können. Auf Grund dieser schwachen Bindung benötigt der TCR aber eine höhere 47 Konzentration des Proinsulins in der Peripherie um aktiviert zu werden. Ein Hauptproblem bei der Analyse von Proinsulin-reaktiven T-Zellen stellt deren sehr niedrige Konzentration im peripheren Blut dar. Um eine höhere Anzahl spezifischer Proinsulin-reaktiver T-Zellen zu erhalten, müsste man sie direkt aus Inselzellinfiltraten im Pankreas isolieren, was aber bei lebenden Probanden nicht möglich ist. Auch in diesen Experimenten lagen die Messwerte für die Cytokinsekretion bei einigen Proben unter der Nachweisgrenze, da in den verwendeten PBMC vermutlich eine zu geringe Anzahl von Proinsulin-reaktiven T-Zellen vorhanden waren. Eine weitere Ursache für die geringe Cytokinsekretion stellte die eingeschränkte Vitalität der Zellen dar, da es sich nicht um frisch isolierte PBMC handelte, sondern um zuvor in FCS/DMSO gefrorene Zellen. Zum Einsatz kamen PBMC, welche neben T-Zellen eine Vielzahl an anderen, zum Teil ebenfalls Cytokin-sezernierenden Zellen wie zum Beispiel CD8+ T-Zellen beinhaltete. Folglich lies sich die Cytokinsekeretion nicht nur den Proinsulin-reaktiven CD4+ T-Zellen zuschreiben. Zusätzlich wurden die Überstände des T-Zell Assays mittels FACS untersucht. Dabei wurden Oberflächenmarker spezifisch für CD4+- und CD45RA- T-Zellen (CD4+CD45RAmemory T-cells), sowie intrazelluläre Marker zur Cytokindetektion verwendet (Daten nicht gezeigt). Allerdings ergaben diese Messungen keine verwertbaren Ergebnisse. Eine Möglichkeit, um die Sensitivität des T-Zell Assays zu erhöhen, stellt die selektive Anreicherung Proinsulin-reaktiver T-Zellen dar. Dies zeigte sich in Studien, welche die Reaktion von unselektierten PBMC mit angereicherten T-Zellen eines spezifischen Klons verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass nur die selektierten T-Zellen mit einer nachweisbar gesteigerten Aktivität gegen Proinsulin reagierten (Durinovic-Belló I et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden PBMC mit unterschiedlichen Haplotypen verwendet (HLA-DRB1*0401/x), daraus ergab sich eine große Varianz an T-Zellen. Eine HLA-Homogenität war auf Grund des begrenzten Pools an vorhandenen Donoren nicht möglich. Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Donoren bezüglich der T-Zell-Aktivierung. Bei jedem Probanden führten andere DCins Peptide zu einer Aktivierung von Proinsulin-reaktiven T-Zellen und somit auch zu einer individuellen Cytokinsekretion. Diese Tatsache lässt darauf schließen, dass die untersuchten T1DM-Patienten unterschiedliche autoagressive T-Zellen besitzen. Schon in NOD Mäusen wurde die weite Streuung der immundominaten Epitope beschrieben. Auch war die Dominanz eines einzigen Eptitops in diesen Mausmodellen auf die Anfangsphase der Erkrankung begrenzt. Im weiteren Verlauf änderten sich die Peptidsequenzen, welche zu einer Immunantwort führten und nahmen an Anzahl zu (Semena G et al., 1999; Ellis T 48 et al., 1999; Durinovic-Belló I et al., 2002). Ähnliche Ergebnisse ergab eine Longitudinalstudie über fünf Jahre mit drei verschiedenen Probandentypen: einem Hochrisiko-prädiabetischem Probanden, einem gesunden Kontrollprobanden mit dem gleichen HLA-Genotyp und zwei ebenfalls Hochrisiko-Individuen, welche bereits prophylaktisch mit Insulin behandelt wurden. Der Proband, welcher sich bereits in der prädiabetischen Phase befand, zeigte zu Beginn eine Reaktion auf zwei Proinsulin Epitope, welchen im Verlauf weitere folgten. Die Kontrolle wies nur eine eingeschränkte Reaktion gegenüber Proinsulin bei den verschiedenen Messungen auf, welche sich auf einige wenige Epitope beschränkten. Ein Proband der Hochrisikogruppe entwickelte während der Studie einen manifesten T1DM. Initial fand man bei ihm eine T-Zell-Antwort gegen ein einziges Epitop. Mit Fortschreiten der Erkrankung nahm auch die Anzahl der reaktiven Epitope zu. Der zweite Proband dieser Gruppe zeigte am Anfang eine Reaktion gegen ein Proinsulin Epitop, dieses konnte aber nach der ersten prophylaktischen Insulingabe nicht mehr bestätigt werden (Durinovic-Belló I et al., 2001). Es ist nicht auszuschließen, dass die Änderungen der Epitope auch durch die Insulintherapie verursacht oder mit beeinflusst wurden, da bekannt ist, dass Insulin auch als Immunmodulator wirkt (Daniel D et al., 1996; Atkinson MA et al., 1990; Füchtenbusch M et al., 1996). Um vergleichende Ergebnisse zu erzielen ist es folglich wichtig, alle Probanden zu einem gleichen Zeitpunkt der Erkrankung zu untersuchen. Allerdings ist das auf Grund der sehr unterschiedlichen Dauer der prädiabetischen Phase und der individuellen Entwicklung des T1DM sehr schwierig. Die PBMC der in dieser Arbeit untersuchten T1DM-Patienten wurden alle kurz nach der Diagnose der Erkrankung gewonnen. Über den Beginn der prädiabetischen Phase lassen sich aber schwer Rückschlüsse ziehen. 4.4. Schlussfolgerung Es lässt sich festhalten, dass die Prozessierung und Präsentierung von Proinsulin in APC erst ansatzweise verstanden ist und weitere Untersuchungen nötig sind. Viele DCins Peptide aktivierten T-Zellen, und führten zu einer signifikant erhöhten Cytokinsekretion, allerdings lies sich kein dominierendes Proinsulin Epitop feststellen. Die Aktivierung von T-Zellen durch DCins Peptide unterliegt einer weiten Streuung und ist von der HLA-Identität des T1DM-Patienten abhängig. Zudem weisen die immundominaten Epitope dynamische Veränderungen auf. Sie wechseln vermutlich mit dem Fortschreiten 49 der Erkrankung. Um detaillierte Einblicke in den Ablauf der Prozessierung von Antigenen im Rahmen des T1DM zu erhalten, ist es wichtig, Probanden mit demselben HLAPhänotyp auszuwählen und die zu untersuchenden autoaggressiven T-Zellen zu selektieren. 4.5. Perspektive Für die Therapie des T1DM als Autoimmunerkrankung steht zurzeit nur die Insulinsubstitution zur Verfügung, welche den Insulinmangel behebt und die Symptome reduziert. Wünschenswert wären Therapiemaßnahmen, welche spezifisch an der Ursache der Erkrankung ansetzten. T1DM resultiert aus einer Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas durch autoaggressive T-Zellen. Antigenspezifische Therapien, welche in die Immunantwort eingreifen, bieten vielversprechende Ansätze, die gezielt zu einer Suppression der schädigenden autoaggressiven T-Zellen führen, nicht aber zu einer generellen Immunsuppression. Zur Entwicklung solcher zielgerichteten Therapien ist die Identifizierung der spezifischen Antigene in der Pathogenese der Erkrankung unerlässlich, wie zum Beispiel die genaue Untersuchung der Proinsulin-T-Zell-Epitope. Eine mögliche Strategie stellt eine Immunisierung mittels eines Proinsulin Peptids dar, bei der kurze Peptidsequenzen, die als T-Zell-Epitop identifiziert wurden, T1DM-Patienten verabreicht werden. Diese antigenspezifische Modulation der Immunantwort soll zur immunologische Toleranz der autoagressiven T-Zellen führen und somit zu einer Erhaltung der β-Zellen des Pankreas. Als mögliche Risiken dieser Peptidimmuntherapie können eine allergische Hypersensitivität gegen die verabreichten Peptide oder eine Verstärkung der proinflammatorischen Immunantwort gegen die β-Zellen auftreten (Thrower SL et al., 2008). Ein weiterer Ansatz für eine antigenspezifische Therapie stellt die Verwendung von altered peptid ligands (APL) dar. APL sind Peptide, welche sich analog zu autoimmundominaten T-Zell-Epitopen darstellen. Sie binden anstatt des prozessierten Antigens an MHC Klasse II. Dadurch sind sie in der Lage die T-Zell Antwort zu modulieren indem sie zum Beispiel autoaggressive T-Zellen hemmen oder die Sekretion von antiinflammatorische Cytokinen induzieren (van Aalst D et al., 2010). Neben den antigenbasierenden spezifischen Immunmodulatoren könnte auch die Hemmung der Prozessierung der Antigene ein möglicher Therapieansatz sein. Es zeigte sich, das CatG eine dominierende Rolle in der Degradation von Proinsulin spielt. Folglich könnte durch den Einsatz spezifischer CatG Inhibitoren die Generierung der antigenen Peptide reduziert 50 werden. Außerdem ist Vitamin D in der Lage, die Aktivität von CatG zu senken und die Sekretion proinflammatorischer Cytokine zu mindern (F. Zou, nicht publizierte Daten). Diese immunmodulierenden Ansätze beziehen sich auf den Schutz der β-Zelle vor Schädigung durch autoaggressive T-Zellen. Allerdings sind in den meisten Fällen zum Zeitpunkt der Diagnose der Erkrankung über 80% der insulinproduzierenden β-Zellen bereits zerstört und der Patient auf eine lebenslange Insulinsubstitution angewiesen. Um der Zerstörung der β-Zelle mit Hilfe einer antigenspezifischen Immuntherapie zuvor zu kommen ist eine frühe Diagnose, bereits vor den ersten Symptomen der Erkrankung, von großer Wichtigkeit. 51 5. Zusammenfassung Proinsulin ist eines der wichtigsten Autoantigene des Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM). Durch die Prozessierung von Proinsulin entstehen Proinsulin-spezifische T-Zell Epitope, welche autoreaktive T-Zellen aktivieren, die unter anderem für die Entstehung eines T1DM verantwortlich sind. Um neue antigenspezifische Therapieansätze zu entwickeln, ist die detaillierte Kenntnis über die Entstehung Proinsulin-spezifischer T-Zell-Epitope unerlässlich. Professionelle Antigen-präsentierende Zellen, vor allem myeloide dendritische Zellen (mDC1), übernehmen eine wichtige Funktion in der Prozessierung von Proinsulin und in der Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden lysosomale Proteasen (Cathepsine) aus mDC1 mit Proinsulin inkubiert und die entstandenen Bruchstücke analysiert. Die Untersuchung des Verdaumusters ergab, dass der Anteil der Cathepsin G spezifischen Schnittstellen am häufigsten war. Folglich scheint Cathepsin G eine wichtige Rolle in der Generierung von Proinsulin-spezifischer T-ZellEpitope zu spielen. Die durch den Verdau entstandenen Proinsulinfragmente wurden neu synthetisiert und hinsichtlich ihrer T-Zell Reaktivität in einem T-Zell Assay untersucht. Dazu wurden diese Peptide mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von T1DM Patienten mit gesunden Kontrollen verglichen. Die Auswertung des Cytokinprofils ergab erhöhte Werte Tumornekrosefaktor-α für (TNF-α). Interferon-γ Dies lässt (IFN-γ), darauf Interleukin-6 schließen, dass (IL-6) und bestimmte Proinsulinfragmente eine T-Zell-Aktivierung induzieren, allerdings konnte bei den verschiedenen T1DM Patienten kein bestimmtes T-Zell aktivierendes Proinsulinfragment festgestellt werden, welches für T1DM ein gemeinsames neues T-Zell Epitope repräsentieren würde. Die hier dargestellten Ergebnisse dienen als Basis für weitere Untersuchungen zur Entwicklung neuer zielgerichteter Therapieansätze, z. B. durch den Einsatz von Cathepsin G Inhibitoren, die die Reduzierung von autoreaktiven T Zellen des T1DM bewirken könnten. 52 6. Literaturverzeichnis 1. Allen JS, Pang K, Skowera A, Ellis R, Rackham C, Lozanoska-Ochser B, Tree T, Leslie RD, Tremble JM, Dayan CM, Peakman M (2009): Plasmacytoid dendriti cells are proportionally expanded at diagnosis of type 1 diabetes and enhance islet autoantigen presentation to T cells through immune complex capture. Diabetes, 58: 138-145 2. 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Bilderverzeichnis Abbildung 1: Lehuen A, Diana J, Zaccone P, Cooke A (2010): Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nature Reviews Immunology, 10: S.501-513, S.503 Abbildung 2: Kumar V, Abbas A, Fausto N, Mitchell R (2007): Robbins Basic pathology, 8th Edition, Saunders Elsevier, Philadelphia, S.112 Abbildung 3: Kumar V, Abbas A, Fausto N, Mitchell R (2007): Robbins Basic pathology, 8th Edition, Saunders Elsevier, Philadelphia, S.112 Abbildung 4: Villadangos JA, Bird PI, Trapani JA (2009): Endolysosomal proteases and their inhibitors in immunity. Nature Reviews Immunology, 9: S.871-882 Eigene Publikation: Zou F, Schäfer N, Palesch D, Brücken R, Beck A, Sienczyk M, Oleksyszyn, Kalbacher H, Sun, ZL, Boehm BO, Burster T (2010): Regulation of Cathepsin G reduced the activation of Proinsulin-reactive T-cell activity in Type 1 Diabetes mellitus. (zur Publikation eingereicht) 63 8. Danksagung Mein Dank gilt Prof. Böhm für die Überlassung des Themas und für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Danken möchte ich auch den Mitarbeitern im Labor der Sektion Endokrinologie: Nadja Schäfer, Fang Zou, Dr. Silke Rosinger, Dr. Michael Reich, Rosina Sing, Christa Ruckgaber und Angelika Kurhaus. Vielen Dank für die freundliche Unterstützung und die angenehme Atmosphäre im Labor. Ebenso danke ich David Palesch für seine große Hilfe, praktischen Tipps und Ratschlägen bei den Durchführungen der Experimente und für die unterhaltsame Zeit im Labor. Mein besonderer Dank gilt PD Dr. Timo Burster für die hervorragende Betreuung meiner Dissertation. Er stand mir zu jeder Zeit mit Rat und Tat bei Seite. Vielen Dank, Timo, für deine große Hilfe und Unterstützung, deine Zeit und Geduld und das Ermöglichen der guten Koordinierung von Studium und Doktorarbeit. Ich hätte mir keinen besseren Betreuer wünschen können! 64 9. Lebenslauf Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt. 65
