ARP2/3 complex - Uni
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Das Zytoskelett • G-Aktin/ F-Aktin • Aktin-assoziierte Zell-Matrix-Verbindungen • Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Mikrotubuli-assoziierter Transport Kinesin-Familie S. cerevisiae 6 Kinesin-Gene C.elegans 16 Kinesin-Gene H. sapiens > 40 Kinesin-Gene • Kinesin, Unc-104 (KIF1A) und Kinesin II tragen am C-Terminus eine MotorDomäne und transportieren Vesikel zum MT-Plus-Ende • Mitglieder der Unc-104 Familie haben eine monomere Struktur • KIF1B (Unc-104 Familie) transportiert Mitochondrien • Kinesine mit C-terminaler MotorDomäne (KIFC2, Ncd, KAR3) wandern zum Minus-Ende Mikrotubuli-assoziierter Transport Kinesin-Familie S. cerevisiae 6 Kinesin-Gene C.elegans 16 Kinesin-Gene H. sapiens > 40 Kinesin-Gene • Kinesin, Unc-104 (KIF1A) und Kinesin II tragen am C-Terminus eine MotorDomäne und transportieren Vesikel zum MT-Plus-Ende • Mitglieder der Unc-104 Familie haben eine monomere Struktur • KIF1B (Unc-104 Familie) transportiert Mitochondrien • Kinesine mit C-terminaler MotorDomäne (KIFC2, Ncd, KAR3) wandern zum Minus-Ende Aktin (rot) / Tubulin (grün) Tubulin Aktin F-Aktin (-)-Ende 25 nm Protofilamente 37 nm (+)-Ende G-Aktin • Aktin Monomer trägt ATP oder ADP in einer zentralen Falte • 42 kDa • α-Aktin: Muskelzellen • β-,γ-Aktin: Nichtmuskelzellen • ATPase-Aktivität im Filament überführt ATP in ADP F-Aktin (+)-Ende • Aktin-Filament (F-Aktin) besteht aus 2 parallelen Protofilamenten • Rechtsgängige Helix • Flexible Struktur • Accessorische Proteine stabilisieren die Helix (-)-Ende F-Aktin F-Aktin O OH O O HN Cytochalasin Helminthosporium dematoideum O S Latrunculin A Latrunculia magnifica Phalloidin Amanita phalloides Actin nucleation Types of nucleation Spontaneous nucleation Initiated polymerisation • Three classes of proteins – ARP2/3 complex (Actin related protein) – Formins – Spire ARP 2/3 complex Acanthamoeba castellanii First purified from Acanthamoeba castellanii Purified from yeast and vertebrates Consist of seven polypeptides • Two actin related proteins: ARP 2 ARP 3 • ARPC 1-5 (actin related protein complex-1 to 5) EM pictures of ARP2/3-Actin-complex ARP2/3-Actin-complex Arp2: red Arp3: green Volkmann et al., Science, 2001 Crystal structure of inactive ARP2/3 Apocomplex = inactive form • large separation between Arp2 and Arp3 – No actin-like heterodimer • • • • ATP binding pocket of ARP2 and ARP3 are empty ARPC1 is a seven bladed ß-propeller protein ARPC3 and ARPC5 are primarily α-helical proteins ARPC2 and ARPC4 form the core of the complex Activation of the ARP2/3 complex Activation: ATP » » Binding by ARP2 and ARP3 Binding to ARP3 closes the nucleotide binding cleft NPFs (Nucleation promoting factors) » Two classes: class I (activation of ARP2/3) class II (stabilization of ARP2/3 Actin network) » Induce the formation of Arp2 and Arp3 to a heterodimer » Induce major conformational rearrangements in Arp2/3 complex » Binding of an NPF increases its affinity for nucleotides Actin filaments Class I NPFs – nucleation promoting factors Common protein domain: WCA domain – W – WASP homology-2 domain • binds G-actin enables polymerisation onto the barbed end of a growing filament – C – central region – A – acidic region • mediates binding to ARP2/3 complex • WCA domain is sufficient for the activation of ARP2/3 in vitro Profilin • 125-139 Aminosäuren lang • In Protozoen, Schleimpilzen, Pilzen, Tieren und Pflanzen entdeckt Arp2/3-complex • Profilin rekrutiert ATP-G-Aktin an das (+)-Ende des wachsenden Filaments • Cdc42, Arp2/3, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein (WASP) und Scar/WAVE fördern die Aktin-Polymerisation • WASP und SCAR/WAVE binden den Arp2/3-Komplex und G-Aktin Profilin • 125-139 Aminosäuren lang • In Protozoen, Schleimpilzen, Pilzen, Tieren und Pflanzen entdeckt Arp2/3-complex • Profilin rekrutiert ATP-G-Aktin an das (+)-Ende des wachsenden Filaments • Cdc42, Arp2/3, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein (WASP) und Scar/WAVE fördern die Aktin-Polymerisation • WASP und SCAR/WAVE binden den Arp2/3-Komplex und G-Aktin Arp2/3 und Scar/WAVE • Profilin rekrutiert ATP-G-Aktin an das (+)-Ende des wachsenden Filaments • Cdc42, Arp2/3, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein (WASP) und Scar/WAVE fördern die Aktin-Polymerisation • WASP und SCAR/WAVE binden den Arp2/3-Komplex und G-Aktin Arp2/3 und Scar/WAVE • Profilin rekrutiert ATP-G-Aktin an das (+)-Ende des wachsenden Filaments • Cdc42, Arp2/3, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein (WASP) und Scar/WAVE fördern die Aktin-Polymerisation • WASP und SCAR/WAVE binden den Arp2/3-Komplex und G-Aktin Gelsolin • Zwei im Tandem angeordnete homologe Hälften (S1-S3 und S4-S6) • mind. 3 Ca-Bindungsregionen • Aktin-Bdg. wird durch PIP2-Bdg. aufgehoben Cofilin • Hoch konserviert, 15-18 kDa • actin-depolymerizing factor (ADF) • Bindet G- und F-Aktin • wird durch LIM-Kinase phosphoryliert (deaktiviert) regulatory proteins: > 60 classes of actin binding proteins: Arp2/3 complex capping proteins (barbed end) ADF/cofilin profilin regulatory proteins: > 60 classes of actin binding proteins: Arp2/3 complex capping proteins (barbed end) ADF/cofilin profilin Aktin-Einfluss bei Endocytosevorgängen Aktin-Vernetzung Bündel-bildende Vernetzer Gel-bildende Vernetzer Myosin-Superfamily Myosin-Superfamily Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Neutrophil and Shigella Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-GFP Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-GFP Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung 4 3 1 2 1) Actinfilamente im Zellinneren werden zerlegt (z.B. durch Gelsolin) 2) Hydrostatische Kräfte treiben die Filamente zur Front des sich bildenden Füsschens 3) Aktin bildet ein Netzwerk (z.B. mit Filamin) 4) Myosin kontrahiert das Netzwerk und zieht so den Zellkörper nach Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Aktin-assoziierte zelluläre Bewegung Dispersion: control Dispersion: + Latrunculin Aggregation: + Latrunculin Aktin-Filamente (Kontrolle) Latrunculin-behandelte Zelle Tubulin-dependent transport of SI SI-YFP Tubulin-CFP Actin-dependent transport of SI SI-YFP Actin-CFP Scale bars: 10 µm Listeria monocytogenes Listerien Listerien sind anspruchslos. Sie können sich in nährstoffarmen Substraten (Wasserpfützen, Kondenswasser) vermehren. Man trifft sie sowohl auf pflanzlichen Materialien (z. B. abgestorbene Gräser) als auch im Darmtrakt von Menschen und Tieren (1-10%). Als humanpathogen wird nur die Art Listeria monocytogenes angesehen. Die Infektion erfolgt durch Aufnahme von kontaminierter Nahrung, beim Menschen durch den Verzehr von nicht sachgerecht hergestellten Lebensmitteln (vor allem Fleisch-, Fisch- und Milchprodukte). Listerien finden sich vor allem in nicht erhitzten tierischen Lebensmitteln (z. B. Rohmilch und Rohmilchkäse). Listerien können Blutvergiftungen oder Hirnhautentzündungen auslösen, die mit Antibiotika behandelt werden können, aber dennoch in 30 % der Fälle zum Tode führen. Besonders bei Schwangeren ist eine Listeriose sehr gefährlich, da eine Infektion fatale Folgen für das ungeborene Kind haben kann. Es kann zu Frühgeburt, schweren Schädigungen oder sogar zum Absterben des Fötus kommen. Listeria monocytogenes GFP-Actin Phasencontrast GFP-VASP Phasencontrast Listeria monocytogenes L.monocytogenes and Rickettsia NPF: ActA protein • Shares similar domains with the WASP-family members • Asymmetrical distributed on the bacterial surface RickA protein • Formation of bundles of unbranched F-filaments (in vitro assays Ybranched filaments) Usher Syndrom: • Expression: Pigment Epithel, Photorezeptor Zellen derStereocilien Retina, embryon. Cochlea und vestibuläre Neuroepithelien • Symptome: Taubheit, Vestibuläre Dysfunktion, Retinitis Pigmentosa Myosin Ib • Veränderung der Morphogenese der sensorischen Zellen im Innenohr Myosin VI • Häufigkeit: 3-4/ 100.000, 3.000 bis 5.000 Fälle in Deutschland Myosin VIIa Myosin XV Man unterscheidet 3 Typen von Usher: 1) beinhaltet eine hochgradige Schwerhörigkeit bzw. Taubheit von Geburt an. Daher sind Sprachverständnis und Sprechenlernen nur schwer möglich → Defekt in Myosin VIIA 2) bedeutet eine von Geburt an konstant bleibende Innenohrschwerhörigkeit. Insbesondere durch Anpassung von Hörgeräten sind Sprachverständnis und Sprechenlernen möglich 3) umfaßt eine bei der Geburt mittelgradige, aber sich verstärkende Schwerhörigkeit • • Alle drei Typen sind mit Retinitis Pigmentosa kombiniert Bis heute gibt es keine Therapie! Usher Syndrom: • • • • Expression: Pigment Epithel, Photorezeptor Zellen der Retina, embryon. Cochlea und vestibuläre Neuroepithelien Symptome: Taubheit, Vestibuläre Dysfunktion, Retinitis Pigmentosa Veränderung der Morphogenese der sensorischen Zellen im Innenohr Häufigkeit: 3-4/ 100.000, 3.000 bis 5.000 Fälle in Deutschland Man unterscheidet 3 Typen von Usher: 1) beinhaltet eine hochgradige Schwerhörigkeit bzw. Taubheit von Geburt an. Daher sind Sprachverständnis und Sprechenlernen nur schwer möglich → Defekt in Myosin VIIA 2) bedeutet eine von Geburt an konstant bleibende Innenohrschwerhörigkeit. Insbesondere durch Anpassung von Hörgeräten sind Sprachverständnis und Sprechenlernen möglich 3) umfaßt eine bei der Geburt mittelgradige, aber sich verstärkende Schwerhörigkeit • • Alle drei Typen sind mit Retinitis Pigmentosa kombiniert Bis heute gibt es keine Therapie! Usher´s Syndrome
