Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von in
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des St. Josef-Hospitals - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von in-vitro angezüchteten antigen-präsentierenden Zellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Friederike Büning-Pfaue aus Moers 2001 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Priv. Doz. Dr. med. U. Schauer Koreferent: Tag der mündlichen Prüfung: Für meine Eltern In der Wissenschaft gleichen wir alle nur den Kindern, die am Rande des Wissens hier und da einen Kiesel aufheben, während sich der weite Ozean des Unbekannten vor unseren Augen erstreckt. (Isaac Newton) Inhaltsverzeichnis I ______________________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................V TABELLENVERZEICHNIS......................................................................................VII ABKÜRZUNGEN: .................................................................................................... VIII 1 EINLEITUNG .......................................................................................................... 1 1.1 AUFBAU DES IMMUNSYSTEMS .............................................................................. 1 1.1.1 Spezifische und unspezifische Abwehrmechanismen .................................. 1 1.1.2 Das Th1/ Th2-Paradigma.............................................................................. 2 1.2 DIE IMMUNMODULIERENDE WIRKUNG VON VIREN .............................................. 3 1.3 ANTIGEN- PRÄSENTIERENDE ZELLEN (APC) ALS MEDIATOREN DER IMMUNANTWORT .................................................................................................. 4 1.4 IMMUNBIOLOGIE DER DENDRITISCHEN ZELLEN (DC) ........................................... 5 1.4.1 Geschichtlicher Hintergrund ......................................................................... 5 1.4.2 Stadien der DC-Reifung ............................................................................... 5 1.4.3 Morphologie und Phänotyp von DC ............................................................. 8 1.4.4 Funktionelle Eigenschaften von DC ............................................................. 8 1.5 GEWINNUNG VON DC........................................................................................... 9 1.6 UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE DER HETEROGENEN DC ........................................ 9 2 FRAGESTELLUNG.............................................................................................. 10 3 MATERIAL UND METHODEN ......................................................................... 11 3.1 ISOLIERUNG VON MONONUKLEÄREN ZELLEN AUS NABELSCHNURBLUT ............. 11 3.2 AUFBEREITUNG VON MONONUKLEÄREN ZELLEN ............................................... 12 3.2.1 Isolierung von Stammzellen ....................................................................... 12 3.2.2 Isolierung von CD45 RA naiven T-Zellen ................................................. 13 3.3 KULTIVIERUNG DER STAMMZELLEN UND ANZUCHT VON DC............................. 14 Inhaltsverzeichnis II ______________________________________________________________________ 3.3.1 Anzucht von gemischten, dendritischen Populationen............................... 14 3.3.2 Anzucht von Subpopulationen.................................................................... 14 3.4 SORTIERUNG DER SUBPOPULATIONEN IM AUTOMACS ........................................ 15 3.5 FUNKTIONSMESSUNGEN IM DURCHFLUSSZYTOMETER (FACSCAN) ................... 16 3.5.1 Stimulation und Fixierung der Zellen zur Messung von intrazellulären Zytokinen und intrazellulrärem RSV.......................................................... 16 3.5.2 3.5.2.1 Färbung der Oberflächen-Antigene ..................................................... 17 3.5.2.2 Färbung von intrazellulären Zytokinen................................................ 18 3.5.2.3 Infektion – Bestimmung von intrazellulärem RSV ............................. 18 3.5.2.4 Apoptose – Bestimmung von Annexin V............................................ 19 3.5.2.5 Phagozytose – Bestimmung von inkorporiertem Dextran FITC ......... 19 3.5.2.6 Burst – Peroxidaseaktivität in den Lysosomen.................................... 20 3.5.3 4 Färbung ....................................................................................................... 17 Durchflusszytometrische Messung............................................................. 21 3.5.3.1 Arbeitsprinzip eines Durchflusszytometer........................................... 21 3.5.3.2 Durchführung der Messungen.............................................................. 22 3.6 PROLIFERATION DER ANGEZÜCHTETEN ZELLEN ................................................. 23 3.7 ELISA-NACHWEIS DER ZYTOKINPRODUKTION IM ÜBERSTAND ......................... 23 3.8 BESTIMMUNG VON VIRALEM EINFLUSS AUF DIE ANGEZÜCHTETEN ZELLEN ........ 24 3.9 HERSTELLERNACHWEIS ...................................................................................... 26 ERGEBNISSE ........................................................................................................ 32 4.1. EXPRESSION VON CD14 UND CD1 A NACH DER 14TÄGIGER KULTIVIERUNG VON STAMMZELLEN ..................................................................................................... 32 4.1.1 Anzucht von drei Populationen .................................................................. 32 4.1.2 Sortierung der polarisierten Populationen.................................................. 33 4.2 PHÄNOTYP DER GEPRÜFTEN POPULATIONEN ...................................................... 35 4.2.1 Morphologie im Lichtmikroskop................................................................ 35 4.2.2. Expression von spezifischen dendritischen Oberflächenantigenen............ 36 4.3 UNTERSCHIEDLICHER REIFUNGSGRAD DER POLA RISIERTEN ZELLEN GEGENÜBER DER HETEROGENEN POPULATION ......................................................................... 38 4.3.1 Zellteilungsrate der Subpopulationen......................................................... 38 4.3.2 Phagozytoseverhalten der angezüchteten Zellen........................................ 39 4.4 VERGLEICH DER POLARISIERTEN POPULATIONEN UNTEREINANDER ................... 40 4.4.1 Bildung von Wasserstoffperoxid ................................................................ 40 Inhaltsverzeichnis III ______________________________________________________________________ 4.4.2 4.5 Spontane Zytokinproduktion der Subpopulationen.................................... 41 UNTERSCHIEDE DER SUBPOPULATIONEN IN DER KOKULTUR MIT NAIVEN TZELLEN ............................................................................................................... 43 4.5.1 Clusterbildung mit naiven T-Zellen............................................................ 43 4.5.2 Aktivierung von naiven T-Zellen durch die angezüchteten Populationen . 44 4.5.3 Zytokinproduktion in der Kokultur ............................................................ 45 4.5.3.1 Untersuchungsergebnisse der intrazellulären Zytokinmessung........... 45 4.5.3.2 Untersuchungsergebnisse der Zytokinproduktion aus dem ELISA-Test 46 4.6 DER EINFLUSS VON VIRALEN STIMULI AUF DIE SUBPOPULATIONEN ................... 47 4.6.1 Infizierbarkeit der Subpopulationen ........................................................... 48 4.6.2 Expression spezifischer Oberflächenantigene ............................................ 48 4.6.2.1 Expression der Oberflächenantigene auf den CD14+ Zellen unter dem Einfluss von Poly- I-C und RSV.............................................................. 49 4.6.2.2 Expression der Oberflächenantigene auf den heterogenen Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV ...................................................... 50 4.6.2.3 Expression der Oberflächenantigene auf den CD1a+ Zellen unter dem Einfluss von Poly- I-C und RSV.............................................................. 52 4.6.3 Spontane Zytokinfreisetzung der Subpopulationen unter viralem Einfluss53 4.6.4 Zellteilungsrate der Subpopulationen unter viralem Einfluss .................... 56 4.6.5 Induktion der T-Zellaktivierung durch die geprüften Populationen unter viralem Einfluss .......................................................................................... 57 5 6 DISKUSSION ......................................................................................................... 59 5.1 HETEROGENE ZELLEN ALS VORSTUFEN DER „UNREIFEN DC“............................ 59 5.2 INDUKTION DER ZELLREIFUNG DURCH DIE ZYTOKINE IL-4 UND M-CSF ........... 61 5.3 DIE POLARISIERTEN POPULATIONEN ALS ZWEI UNTERSCHIEDLICHE ZELLTYPEN 63 5.4 DER EINFLUSS VON VIRALEN STIMULI AUF DIE SUBPOPULATIONEN ................... 67 5.5 METHODENDISKUSSION ...................................................................................... 69 ZUSAMMENFASSUNG: ...................................................................................... 71 LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................... 73 DANKSAGUNG ........................................................................................................... 81 Inhaltsverzeichnis IV ______________________________________________________________________ LEBENSLAUF.............................................................................................................. 82 Abbildungsverzeichnis V ______________________________________________________________________ Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Modell-Schema der Th-1/Th2-2-Differenzierung durch den Einfluss von Zytokinen................................................................................................... 3 Abbildung 2: Stadien der DC-Reifung im Knochenmark, im Blut, im peripheren Gewebe und im sekundären Lymphorgan................................................. 7 Abbildung 3: Expression der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14 nach der 14tägigen Kultivierung mit: a) M-CSF, b) TNF-α + GM-CSF und c) TNF-α + GM-CSF + IL-4 ....................................................................... 33 Abbildung 4: Expression der Oberflächenantigene CD1a und CD14 auf den geprüften Populationen nach der Sortierung im Automacs (nur Kultur a und c).... 34 Abbildung 5: Expression der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14 auf den polarisierten Zellen nach der Sortierung im Automacs ........................... 35 Abbildung 6: Morphologie der geprüften Zellen im Lichtmikroskop nach der 14tägigen Kultivierung mit a) M-CSF, b) TNF-α + GM-CSF und c) TNF-α + GMCSF + IL-4............................................................................................... 36 Abbildung 7: Vergleich der Expression von Oberflächenmolekülen auf den gezüchteten Zellen....................................................................................................... 37 Abbildung 8: Proliferationsfähigkeit der drei angezüchteten Populationen.................. 39 Abbildung 9: Phagozytoseverhalten der angezüchteten Zellpopulationen.................... 40 Abbildung 10: Phagosomale Wasserstoffperoxidbildung der geprüften Zellen an Tag 14 in vitro ohne Stimulus (Kontrolle) und unter maximaler Stimulation mit PMA ........................................................................................................ 41 Abbildung 11:Lichtmikroskopische Darstellung der Clusterbildung in der MLR......... 44 Abbildung 12: Induktion der T- Zellproliferation durch die geprüften Zellen................. 45 Abbildung 13: Spontane Induktion der Zytokinproduktion von IL-4 und IFN-γ in der MLR ........................................................................................................ 46 Abbildung 14: Nachweis der IL-4 Produktion in der MLR der geprüften Zellen........... 47 Abbildung 15: Vergleich zur Infizierbarkeit der geprüften Populationen ...................... 48 Abbildung 16: Expression der Oberflächenantigene auf den mit M-CSF gezüchteten CD14+ Zellen unter den viralen Einflüssen von Poly-I-C und RSV ...... 50 Abbildungsverzeichnis VI ______________________________________________________________________ Abbildung 17: Expression der Oberflächenantigene auf den mit GM-CSF + TNF-α gezüchteten heterogenen Zellen unter den viralen Einflüssen von Poly-IC und RSV .............................................................................................. 51 Abbildung 18: Expression der Oberflächenantigene auf den CD1a+ Zellen unter den viralen Einflüssen von Poly-I-C und RSV .............................................. 53 Abbildung 19: Proliferationsverhalten der geprüften Populationen unter dem viralen Einfluss von Poly- I-C und RSV.............................................................. 57 Abbildung 20: Induktion der T-Zellenproliferation durch die geprüften Zellen unter viralem Einfluss....................................................................................... 58 Abbildung 21: Aufgaben der unterschiedlichen APC im Immunsystem........................ 66 Tabellenverzeichnis VII ______________________________________________________________________ Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Spontane Sekretion von Th-1 fördernden Zytokinen. ................................ 42 Tabelle 2: Spontane Sekretion von Th-2 fördernden Zytokinen. ................................ 42 Tabelle 3: Spontane Sekretion von regulatorisch wirksamen Zytokinen. ................... 43 Tabelle 4: Spontane Zytokinfreisetzung der CD14+ Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV. ...................................................................................... 54 Tabelle 5: Spontane Zytokinfreisetzung der heterogenen Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV. ............................................................................... 55 Tabelle 6: Spontane Zytokinfreisetzung der CD1a+ Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV. ...................................................................................... 56 Abkürzungen VIII ______________________________________________________________________ Abkürzungen: Ag Antigen Ak Antikörper APCs Antigen-presenting cells = Antigen-präsentierende Zellen CD Cluster of differentiation CLA Cutaneouse lymphocyte-associated antigen CPM Counts per minute DC Dendritic cells = dendritische Zellen DHR Dihydrorhodamin DMF Dimethylformamid DNS Desoxyribonukleinsäure ELISA Enzyme-linked immunosorbent-assay FACS Fluorescence-activated cell sorter FCS Fetal calf serum = fetales Kälberserum FITC Fluorescein-isothiocyanat FMLP Formyl-L-methionyl-L-phenylalanine FSC Forward light scatter = Vorwärtsstreulicht GM-CSF Granulocyten/ Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor HEPES Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure Hep-2 human epithelial cells HLA Human leucocyte antigen = humanes Leukozyten Antigen = MHC Ig Immunglobulin IGIF Interferon-gamma-induzierender Faktor IFN Interferon IL Interleukin M-CSF Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor MFI Mittlere Fluoreszenzintensität MHC Major histocompatibility complex = HLA MLR Mixed lymphocyte reaction = gemischte Lymphozyten Reaktion Abkürzungen IX ______________________________________________________________________ MOI Multiplicity of infection NK Natürliche Killerzellen PBS Phosphate buffered sline PE Phycoerythrin PGE2 Prostaglandin E2 PI Propium Iodid PMA Phorbol-12-myristat-13-Acetat Poly-I-C Polyinosinic Polycytidylie Acid RNA Ribonukleinsäure RSV Respiratorisches Sycytial Virus SF Stammzellfaktor SSC Sideward scatter = Rechtwinkelstreulicht TGF-β Transforming growth factor-β Th-Zellen T-Helferzellen TNF Tumor Nekrose Faktor 1 Einleitung 1 ______________________________________________________________________ 1 Einleitung 1.1 Aufbau des Immunsystems 1.1.1 Spezifische und unspezifische Abwehrmechanismen Mit der Ausbildung des Immunsystems ist innerhalb der Evulotion von über 400 Millionen Jahren ein hochdifferenzierter und anpassungsfähiger Abwehrapparat für den Menschen entstanden. Diese Abwehr schützt vor dem Eindringen bzw. vor der pathogenen Wirkung von Mikroorganismen, Fremd- und Schadstoffen, Toxinen und malignen Zellen. Eine wesentliche Aufgabe des Immunsystems ist es, zwischen „gefährlichen“ und „ungefährlichen“ Molekülen zu unterscheiden. Dabei hat das System die Fähigkeit erhalten, destruktive Antworten gegenüber körpereigenen Substanzen oder irreparable Zerstörungen umliegender Gewebe zu vermeiden. Die Zerstörung von malignen Zellen oder fremdem Zellmaterial entspricht demgegenüber der Zielsetzung zum Lebenserhalt [1]. Traditionell Komponente wird das Immunsystem unterteilt. Die in eine angeborene und entwicklungsgeschichtlich eine älteren erworbene angeborenen Abwehrmaßnahmen werden als unspezifisch bezeichnet, da sie zunächst unabhängig vom jeweils eindringenden Erreger aktiv werden. Neben dem Säuremantel der Haut sowie der intakten Epidermis zählen hierzu das Komplementsystem, antimikrobielle Enzymsysteme und unspezifische Mediatoren. Auf dem zellulären Sektor sind die Granulozyten, die natürlichen Killerzellen (NK) und das Monozyten- Makrophagensystem zu nennen. Das erworbene Immunsystem kann demgegenüber hochspezifisch mit einer humoral orientierten Abwehr auf das jeweilige Antigen (Ag) reagieren und klonal expandieren. Es setzt sich aus T- und B-Lymphozyten zusammen [1]. Die Population der T-Lymphozyten exprimiert auf der Zelloberfläche neben dem CD3-Ag-Rezeptor-Komplex auch CD4 bzw. CD8. Diese Moleküle ermöglichen eine Einteilung der Zellen in zwei funktionelle Untergruppen: Die CD8+ Zellen agieren als zytotoxische T-Zellen und zerstören histoinkompatible, virusinfizierte oder anderweitig veränderte Zielzellen durch direkten Kontakt oder mit Hilfe von Zytokinen. Die CD4+ 1 Einleitung 2 ______________________________________________________________________ Zellen sind dagegen proinflammatorische Zellen. Sie werden auch wegen ihrer wichtigen Funktion bei der B-Zellstimulation T-Helferzellen (Th) genannt [1]. 1.1.2 Das Th1/ Th2-Paradigma Zur Abwehr gegen eingedrungene Erreger und gegen ihre Vermehrung hält das Immunsystem verschiedene Strategien bereit. Dafür differenzieren sich je nach Zytokinmilieu aus den ursprünglich nicht determinierten T-Helfer-0-Zellen (Th0) die Th1- bzw. Th2-Zellen, die das Immunsystem in unterschiedlicher Weise beeinflussen. Bei einer Th1-Reaktion sezernieren die Zellen das Interferon-γ (IFN-γ), den Tumor Nekrose Faktor α (TNF-α) und das Interleukin-2 (IL-2), die die zelluläre Immunabwehr zur Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen unterstützen. Die Th2-Zellen sezernieren dagegen die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13. Diese induzieren mit Hilfe von B-Lymphozyten, Plasmazellen und Antikörpern (Ak) eine humorale Immunität zur Verteidigung gegen extrazelluläre Pathogene. Außerdem differenzieren unter IL-5 die eosinophilen Zellen und unter IL-10 die Basophilen und die Makrophagen aus. [2]. Unter den Th1-Zytokinen kommt dem IFN-γ eine besondere Bedeutung zu. Dieses Zytokin besitzt einen direkten antiviralen Effekt und wirkt indirekt durch die Aktivierung von NK-Zellen, Makrophagen und zytotoxischen CD8+ T-Zellen auf das eingedrungene Pathogen [3, 4]. Aus der Gruppe der Th2-Zytokine spielt das IL-4 eine entscheidende Rolle [5]: Es bewirkt die Suppression der zellulären Immunantwort und eine Inhibierung der Synthese und der Effekte von IFN-γ. Außerdem induziert es eine Umschaltung der Immunglobulinsynthese der B-Zellen von IgM nach IgE, das wiederum eine Schlüsselrolle bei der Induktion von allergischen Symptomen spielt [6]: Es bindet an hochaffine IgE-Rezeptoren auf den Mastzellen, den basophilen Zellen und den aktivierten eosinophilen Zellen, die dann Entzündungsreaktionen auslösen können. 1 Einleitung 3 ______________________________________________________________________ Th-0 IL-4 IL-11 TGF-beta IL-12 IL-18 Th-1 IL-4, IL-10 Inhibitorische Wirkung Th-2 IFN-gamma Th-1-Zytokine IL-2 IFN-gamma TNF-beta Abbildung 1: 1.2 Viren Th-2-Zytokine Th-1 und Th-2 Zytokine IL-3 IL-6 GM-CSF IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 Modell-Schema der Th-1/Th2-2-Differenzierung durch den Einfluss von Zytokinen Die Immunmodulierende Wirkung von Viren sind unterschiedlicher eigenständige Weise infektiöse beeinflussen. Einheiten, Dabei zeigen die das Immunsystem das Influenzavirus und in das Respiratorische Sycytial Virus (RSV) gegensätzliche Effekte, die im Folgenden kurz dargestellt werden sollen. Bei einer Infektion mit dem Influenzavirus wird in der Zelle eine erhöhte Produktion des Enzyms MxA induziert. Dieses Protein hemmt die Messenger-Ribonukleinsäure (mRNS) bei der Synthese des Virus. Eine Vermehrung des Virus wird dadurch verhindert [7, 8]. Weiterhin induziert es die Reifung und die Polarisierung der Th-1Antwort [9]. Das RSV ist ein negatives Einzelstrang-RNA-(ssRNA)-Virus, das zur Familie der Paramyxoviren gehört. Es verursacht bei Säuglingen und Kleinkindern eine schwere Infektion der unteren Atemwege [10, 11]. Es hinterlässt eine unzureichende Immunität und begünstigt dadurch trotz hoher Ak-Konzentrationen von der Mutter häufige Reinfektionen [12-14]. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass insbesondere Infektionen mit RSV über die Erkrankung einer schweren Bronchiolitis in frühester 1 Einleitung 4 ______________________________________________________________________ Kindheit die Entstehung von Asthma bronchiale begünstigt [15-19]. Labordiagnostisch werden im Vergleich zu anderen Viruserkrankungen bei einer RSV-Infektion nur geringe IFN-γ Konzentrationen nachgewiesen [20]. Stattdessen treten erhöhte IgESpiegel vor allem bei Kindern mit atopischer genetischer Prädisposition auf [21]. Für das Immunsystem des Neugeborenen bedeutet dieses ein Th1/Th2-Ungleichgewicht, das schon früh zu allergiefördernden Th2-polarisierten Gedächnis-T-Zellen führt. Damit spielt das RSV eine wichtige Rolle bei der Modulation der Th2-Antwort. Eine vorausgegangene Influenzainfektion soll allerdings vor einer Asthmainduktion durch RSV schützen, indem es die G-Protein-induzierte Eosinophilie reduziert [22]. 1.3 Antigen-präsentierende Zellen (APCs) als Mediatoren der Immunantwort Als Verbindung zwischen der unspezifischen und der spezifischen Immunabwehr dienen die antigen-präsentierenden Zellen (APCs) [23]. Zu ihnen zählen die Makrophagen und die dendritischen Zellen (DC). Beide entstehen aus den gleichen Vorläuferzellen im Knochenmark [2]. Bei Virusinfektionen spielen vor allem die DC als professionelle APCs neben den BZellen und den Makrophagen die Hauptrolle. Sie beeinflussen durch die AgPräsentation, den Zellkontakt und die dadurch verursachte Zytokinproduktion die immunologische Kompetenz der Th-Zellen. 1 Einleitung 5 ______________________________________________________________________ 1.4 Immunbiologie der dendritischen Zellen (DC) 1.4.1 Geschichtlicher Hintergrund Die DC wurden erstmals 1868 in der Epidermis identifiziert. Diese Zellen wurden nach ihrem Entdecker „Langerhans Zellen“ genannt [24]. Erst 1973 entdeckte man ähnliche Zellen auch in anderen Organsystemen [25]. Die DC machen weniger als 0,5% der mononukleären Zellen im Blut aus, sind aber im Interstitium nahezu aller Organe anzutreffen [1]. Ihre Zellzahl ist entsprechend gering. Eine direkte Gewinnung von DC ist deshalb sehr mühsam, was eine Untersuchung dieser Zellen in der Vergangenheit schwierig gemacht hat. 1.4.2 Stadien der DC-Reifung Die Entwicklung von DC findet in vier Schritten, an vier verschiedenen Orten statt (Abb. 2): Zunächst werden im Knochenmark CD34+ Stammzellen („Knochenmark-Vorläufer“) produziert. Diese Zellen können sich unter einem bestimmten Zytokinmilieu zu sogenannten „DC-Vorläufern“ entwickeln. Sie zirkulieren im Blut oder in den Lymphgefäßen. Durch das Eindringen von pathogenem Ag wird MIP-3α in dem betroffenen Gewebe gebildet, das ein Ligand für den auf DC-Vorläufern exprimierten CCR6 ist und somit diese Zellen anlockt [26]. Sie wandern ins Gewebe ein und entwickeln sich dort zu „unreifen DC“ [26]. Diese Zellen haben die Fähigkeit, Ag aufzunehmen. Dafür gibt es unterschiedliche Mechanismen: a) Makropinozytose, b) rezeptorvermittelte Endozytose (Mannose Rezeptor) [27], c)Fcγ Rezeptor Typ I und II [28] und Phagozytose [29]. Anschließend wandern die mit Ag-beladenen „unreifen DC“ in die sekundären Lymphorgane ein und treten in den T-Zell-Regionen in Kontakt mit den Th-Zellen. 1 Einleitung 6 ______________________________________________________________________ Während der Migration und Interaktion mit den T-Zellen reifen die DC aus („reife DC“) und unterliegen dabei phänotypischen und funktionellen Änderungen: Sie verlieren die Fähigkeit, Ag aufzunehmen [30-32]. Das bisher intrazellulär liegende MHC-Molekül Klasse II, über das die Erkennung durch den spezifischen T-Zellrezeptor verläuft, wird an der Zelloberfläche exprimiert [30-32]. Durch die Interaktion der Oberflächenantigene CD40L-CD40 treten DC mit den T-Zellen in Kontakt [33]. Dadurch wird die Kapazität der DC, die T-Zellen zu stimulieren, erhöht. Außerdem wird die Ausreifung der DC induziert [34]; es findet eine erhöhte Expression der akzessorischen Moleküle CD80 und CD86 statt [35]. Darüber hinaus wird der spezifische dendritische Marker CD83 hochreguliert, der als der wichtigste Indikator für die Identifikation von reifen DC gilt [36, 37]. Die aktivierten T-Zellen stimulieren ferner die Zytokinproduktion von DC (IL-1, IL-6, IL-12) [24]. 1 Einleitung 7 ______________________________________________________________________ Knochenmark-Vorläufer Blut DC-Vorläufer Zytokine Viren Peripheres Gewebe Ag-Aufnahme intrazelluläres HLA CD40 CD80 CD86 CD83 CD54 Unreife DC Bakterienspaltprodukte (LPS) Zytokine (TNF, GM-CSF) T-Zellen (CD40L) virale dsRNA T T T Reife DC Aktivierte T-Zellen Sekundäres Lymphorgan T T Lymphozytenaktivierung T T T Abbildung 2: Ag-Aufanhme oberflächliches HLA CD40 CD80 CD86 CD83 CD54 Stadien der DC-Reifung im Knochenmark, im Blut, im peripheren Gewebe und im sekundären Lymphorgan. Während ihrer Migration unterliegen sie phänotypischen und funktionellen Modifikationen. Je nach Reifestufe ändert sich die Expression der Oberflächenantigene. Funktionell unterscheiden sich unreife und reife DC in ihrer Fähigkeit, Ag aufzunehmen bzw. es zu präsentieren und die T-Zellen zu aktivieren. 1 Einleitung 8 ______________________________________________________________________ 1.4.3 Morphologie und Phänotyp von DC Die DC fallen durch ihre ungewöhnliche, sternförmige Form auf. Dieses Bild entseht aufgrund der vielen vom Zellkörper ausgehenden langen zytoplasmatischen Zellausläufern (teilweise > 10 µm) [38]. Sie tragen spezifische Oberflächenantigene, anhand derer man sie auch identifizieren kann: Neben den dendritischen Markern CD54 und CD83 [36, 37] exprimieren reife DC in hohen Konzentrationen das MHC Klasse II Molekül, das den Th-Zellen die daran gebundenen exogen aufgenommenen Ag präsentiert [39]. Außerdem tragen sie das CD40 und die Co-Stimulationsantigene CD80 und CD86, durch die sie in Kontakt mit den T-Zellen treten [24]. Sie sind negativ für den Rezeptor des Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (M-CSF) CD115 [40]. Im Vergleich zu den Makrophagen sind die DC nicht-adhärente Zellen [38]. 1.4.4 Funktionelle Eigenschaften von DC Sowohl „unreife“ als auch „reife DC“ bilden stabile Zellpopulationen, die sich nicht mehr teilen [38]. Sie unterliegen während ihres Entwicklungsprozesses funktionellen Änderungen (1.4.2): Dabei sind es ihre wichtigsten Aufgaben, je nach Reifestadium exogen eingedrungenes Ag aufzunehmen bzw. es zu präsentieren, um eine effektive Immunantwort auszulösen. Als einzigartig gilt die Fähigkeit von DC, naive T-Zellen, das heißt Lymphozyten, die noch nicht auf ihr Ag getroffen sind, zu aktivieren [41]. Während der Zell-Interaktion, werden sogenannte „Cluster“ gebildet, wobei die Zellen aneinander haften [38]. Durch die CD40L-CD40 Bindung mit den T-Zellen setzen die DC verschiedene Zytokine (IL-1, IL-6, IL-12) frei [24]. Das IL-12 spielt dabei in der Differenzierung der T-Zellantwort eine zentrale Rolle. Es induziert die Produktion von IFN-γ und damit auch die Förderung der Th-1 Zellen [42]. Im Vergleich zu den Makrophagen produzieren die DC keine Sauerstoffradikale [38]. 1 Einleitung 9 ______________________________________________________________________ 1.5 Gewinnung von DC Die direkte Gewinnung von DC aus peripherem Gewebe ist aufgrund der geringen Zellzahl sehr unbefriedigend. Es wurden deshalb andere in-vitro Methoden, wie die Anzüchtung von DC aus Stammzellen [43] oder peripheren Blutmonozyten [38], herangezogen. Stammzellen können entweder aus dem Knochenmark oder aus Nabelschnurblut von Neugeborenen isoliert werden [44]. Die Gewinnung und Kultivierung von Stammzellen aus Nabelschnurblut ist eine selten angewandte und schwierige, aber etablierte Methode nach Caux [44]: AC 133+ Zellen werden hierzu isoliert und 14 Tage mit Stammzellfaktor (SF), mit Granulozyten/ Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) und mit TNF-α inkubiert. Die kultivierte DC-Population setzt sich sowohl aus CD1a bzw. CD14 einfach positiven als auch aus CD1a/ CD14 doppelt positiven bzw. doppelt negativen Zellen zusammen [45]. Diese Zellpopulation wird deshalb im folgenden als „heterogen“ bezeichnet [46]. 1.6 Untersuchungsergebnisse der heterogenen DC Über die angezüchteten, heterogenen DC war bisher nur wenig bekannt. Eine genaue Einordnung dieser Zellen in eine der DC-Entwicklungsstufen war deshalb nicht möglich. Zunächst wurden sie den „unreifen DC“ zugeordnet. Voruntersuchungen ergaben allerdings, dass sie phänotypisch neben dem CD1a auch teilweise das Oberflächenantigen CD14 exprimieren. Spezifische dendritische Marker sind dagegen nur in sehr geringen Mengen nachweisbar. Sie sind positiv für den M-CSF Rezeptor CD115. Überdies setzt sich die heterogene Population aus adhärenten und nichtadhärenten Zellen zusammen. Eine eingehende funktionelle Beschreibung dieser Zellen fehlt derzeit noch. Dennoch weisen die bisherigen Erkenntnisse über diese Population auf Unterschiede zu den in der Literatur beschriebenen „unreifen DC“ auf. 2 Fragestellung 10 ______________________________________________________________________ 2 Fragestellung Die bislang erzielten Ergebnisse standen im Widerspruch zu den Befunden von „unreifen DC“, die in der Literatur beschrieben wurden. Die angezüchtete Zellpopulation war heterogen und exprimierte sowohl das CD1a, als auch den Makrophagenmarker CD14. Daneben ergaben sich weitere phänotypische Unterschiede. Eine gründliche Untersuchung dieser Zellen war daher erforderlich. Die Frage nach dem Entwicklungslevel und, ob noch weitere Reifungsprozesse zur Prägung von „unreifen DC“ notwendig sind, waren bislang offen geblieben. Genauere Erkenntnisse darüber zu gewinnen, war Ziel dieser Untersuchung und wurde unter folgenden Fragestellungen bearbeitet: 1. Welche Reifungsfaktoren werden benötigt, um aus den heterogenen DC stabile und homogene Zellpopulationen anzuzüchten? 2. Welche phänotypischen und funktionellen Unterschiede weisen die homogenen Zellpopulationen auf? 3. Welche Immunkompetenz zeigen die geprüften Zellpopulationen gegenüber RSV? 3 Material und Methoden 11 ______________________________________________________________________ 3 Material und Methoden 3.1 Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut Reagenzien: Citrat-Phosphat-Dextrose Lösung Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure Puffer (HEPES Puffer) (1 M) Penicillin/Streptomycin (10000 U / 10000 µg/ml) Amphotericin B (250 µg/ml) Hanks Salzlösung Ficoll Lösung (Dichte 1,077) Türksche Lösung Sonstiges: Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss; 50,0 ml Die Reagenzröhrchen wurden mit je 7,0 ml eines Lagerungspuffers vorbereitet. Diese Lösung wurde aus folgenden Reagenzien angesetzt: 50,0 ml Citrat-Phosphat-Dextrose Lösung, 1,0 ml HEPES Puffer, 1,0 ml Penicillin/ Streptomycin 1,0 ml Amphotericin B. Nach der Abnabelung wurde das Nabelschnurblut des Neugeborenen aus der Vena umbilicalis der Plazenta entnommen und in die vorbereiteten Reagenzröhrchen gegeben. Im Labor – spätestens 24 Stunden post partum – wurde das Nabelschnurblut in 7,0 ml Portionen aufgeteilt. Hanks Salzlösung wurde im Verhältnis 5:1 dazugegeben und mit 15,0 ml Ficoll Lösung unterschichtet. Anschließend wurde diese Mischung 20 Minuten bei 400×g zentrifugiert. Dabei lagerten sich Erythrozyten und polymorphkernige Leukozyten am Gefäßboden ab und sammelten sich mononukleäre Zellen an der Phasengrenze an. Letztgenannte Zellen wurden vorsichtig abpipettiert und anschließend zweimal gewaschen: 10 Minuten bei 300×g und 15 Minuten bei 200×g. Eine Probe wurde entnommen, um die genaue Zellzahl nach der Anfärbung mit Türkscher Lösung 3 Material und Methoden 12 ______________________________________________________________________ in einer Neubauer Zählkammer zu ermitteln. Anschließend wurden die Zellen nochmals 10 Minuten bei 300×g zentrifugiert. 3.2 Aufbereitung von mononukleären Zellen 3.2.1 Isolierung von Stammzellen Reagenzien: AC 133+ Kit (AC 133+ Antikörper (Ak), Blocking Reagenz) Hanks Salzlösung Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% fetales Kälberserum (FCS), 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) Türksche Lösung sonstiges: Mini MACS Sortiersäulen für Stammzellen Magnetblock Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss; 15,0 ml Für die Anzucht von dendritischen Zellen wurden zunächst AC133+ Stammzellen aus den mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes isoliert. Hierzu wurden 1x107 Zellen in 250 µl Hanks Salzlösung aufgenommen und mit je 100 µl AC 133+ Ak, bzw. Blocking Reagenz für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der überschüssige, nicht gebundene Ak mit 5,0 ml Hanks Salzlösung ausgewaschen (10 Minuten, 300×g). Die Zellen wurden über zwei magnetisierte Sortiersäulen gegeben und zwei- bis viermal mit je 500 µl Hanks Salzlösung nachgespült. Anschließend wurden die Säulen aus dem Magnetblock genommen und die mit Ak-markierten Stammzellen mittels manuellem Überdruck mit 1,0 ml Kulturmedium aus der Säule eluiert. Die Stammzellzahl des Eluats wurde nach der Anfärbung mit Türkscher Lösung in einer Fuchs-RosenthalZählkammer ermittelt. 3 Material und Methoden 13 ______________________________________________________________________ 3.2.2 Isolierung von CD45 RA naiven T-Zellen Reagenzien: CD45 RA Antikörper Hanks Salzlösung Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS + 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) Türksche Lösung sonstiges: Midi MACS Sortiersäulen für CD45 RA Zellen Magnetblock Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss; 15,0 ml Für die gemischte Lymphozyten-Reaktion (MLR) wurden naive CD45 RA T-Zellen aus den mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes isoliert. Dazu wurden 1x107 Zellen in 80 µl Hanks Salzlösung aufgenommen und mit 20 µl CD45 RA Antikörper bei 4°C 15 Minuten inkubiert. Der nichtgebundene Ak wurde anschließend ausgewaschen (10 Minuten, 300×g). und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde mit 1,0 ml Hanks resuspendiert und auf die vorgespülte magnetisierte Sortiersäule gegeben. Die Säulen wurden dreimal mit je 3,0ml Hanks Salzlösung nachgespült. Anschließend wurde die Säule aus dem Magnetblock herausgelöst und die Zellen durch Überdruck mit 3,0 ml Kulturmedium aus der Säule eluiert und in einem Reagenzröhrchen aufgefangen. Die Zellzahl wurde in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Für die gemischte dendritischen Lymphozytenreaktion Subpopulationen im wurden Verhältnis 5:1 die isolierten zusammengegeben, unterschiedliche Interaktionen zu bestimmen. Folgende Kontrollen wurden in der MLR durchgeführt: • Messung der intrazellulären Zytokinproduktion (3.5.2.2) • Proliferation (3.6) • Messung der Zytokinprodukte im Überstand mittels Enzyme-linked immunosorbent-assay (ELISA) (3.7) T-Zellen um mit deren 3 Material und Methoden 14 ______________________________________________________________________ 3.3 Kultivierung der Stammzellen und Anzucht von DC 3.3.1 Anzucht von gemischten, dendritischen Populationen Reagenzien: Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS, 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) Stimuli: SF (100 ng/ml) GM-CSF (100 ng/ml) TNF-α (2,5 ng/ml) sonstiges: Multiwell-Platte mit Flachboden, 24 wells Die Stammzellen wurden in einer Konzentration von 1,0 - 1,5 x 105 Zellen/ml in Kulturmedium aufgenommen und in einer Multiwell-Platte ausgeplattet. Dann wurden die entsprechenden Stimuli zur Ausdifferenzierung von dendritischen Zellen hinzugegeben. 7 Tage lang wurden die Zellen im Brutschrank (37°C, 8% CO2 ) kultiviert. Optimale Bedingungen wurden durch die Teilung der Zellen an Tag 3, bzw. nach Bedarf zu späteren Zeitpunkten und durch die Zugabe von frischem Kulturmedium geschaffen. An Tag 7 wurden die Zellen mit GM-CSF und TNF-α restimuliert und weitere 7 Tage bis zum Ausreifen der dendritschen Zellen bei 37°C und 8% CO2 kultiviert. 3.3.2 Anzucht von Subpopulationen Reagenzien: Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS, 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) Stimuli: SF (100 ng/ml) IL-4 (50 U/ml) GM-CSF (100 ng/ml) TNF-α (2,5 ng/ml) M-CSF (25 U/ml) sonstiges: Multiwell-Platte mit Flachboden, 24 wells 3 Material und Methoden 15 ______________________________________________________________________ Die Zellansätze vom siebten Tag (3.3.1) wurden je nach gewünschter Subpopulation restimuliert: • Für die Anzucht von heterogenen Zellen: Restimulation wie in Abschnitt 3.3.1 beschrieben. • Für die Anzucht von einfach positiven CD1a+ Zellen (CD1a+, CD14-): GMCSF, TNF- α und IL-4. • Für die Anzucht von einfach positiven CD14+ Zellen (CD1a-, CD14+): M-CSF. Die restimulierten Ansätze wurden weitere sieben Tage im Brutschrank (37°C, 8% CO2 ) bebrütet. 3.4 Sortierung der Subpopulationen im Automacs Geräte: Automacs Reagenzien: CD1a+ Micro Beads CD14 Micro Beads Blocking Reagenz Hanks Salzlösung Türksche Lösung Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS, 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) sonstiges: Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss; 50,0 ml Die Zellen wurden am 14. Tag auf Eis in Reagenzröhrchen geerntet und gezählt. Anschließend wurden sie gewaschen (10 Minuten, 300×g). Je nach Restimulation wurden die Zellen mit dem entsprechenden Ak (pro 1,0 x 107 Zellen: 20 µl Micro Beads + 20 µl Blocking Reagenz + 60 µl Hanks Salzlösung) bei 4°C 15 Minuten inkubiert. Der überschüssige Ak wurde anschließend ausgewaschen (10 Minuten, 300×g). Das Zellpellet wurde mit 4,0 ml Hanks Salzlösung resuspendiert. Die Kulturen wurden dann über das Automacs nach Angaben des Herstellers (einfach positive Selektion) sortiert. Die positive Zellsuspension wurde anschließend mit 3,0 ml Kulturmedium verdünnt und die Zellzahl ermittelt (Neubauer Zählkammer). Die Zellen wurden erneut zentrifugiert (10 Minuten, 300×g), der Überstand verworfen und das 3 Material und Methoden 16 ______________________________________________________________________ Zellpellet in entsprechender Konzentration je nach gewünschter Weiterverwertung in Kulturmedium aufgenommen. 3.5 Funktionsmessungen im Durchflusszytometer (FACScan) Für die funktionelle Beschreibung der drei verschiedenen Subpopulationen wurden deren Oberflächenantigene, deren intrazelluläre Zytokine (MLR) und deren Infektions-, Apoptose- und Phagozytoseverhalten im Durchflusszytometer erfasst, um die Populationen untereinander zu vergleichen. 3.5.1 Stimulation und Fixierung der Zellen zur Messung von intrazellulären Zytokinen und intrazellulrärem RSV Reagenzien: Brefeldin A (10 µg/ml) PMA (10 ng/ml) Ionomycin (1,0 µM) Monensin (2,5 µM) Paraformaldehyd (4%) Saponin (1%) Hanks Salzlösung sonstiges: Polystyrol Reagenzgläser mit Rundboden; 5,0 ml Für die Messung der intrazellulären Zytokine (MLR – 3.2.2) und der Infektion mit RSV (3.8 Ansatz c und d) wurden die Zellen zunächst stimuliert und anschließend deren Zellwände fixiert und permeabilisiert. Am 14. Tag (18 Stunden vor der durchflusszytometrischen Messung) wurde der Hälfte der Ansätze Brefeldin A zugegeben. Die andere Hälfte der Zellen wurde fünf Stunden vor der Messung mit PMA, Ionomycin und Monensin stimuliert: Die Zellen wurden in Polystyrol Reagenzgläser geerntet und gewaschen (10 Minuten; 300×g). 3 Material und Methoden 17 ______________________________________________________________________ Zur Fixierung wurden die Zellen mit 1,0 ml Paraformaldehyd resuspendiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden sie mit Hanks Salzlösung zweimal zentrifugiert: je 10 Minuten bei 300×g. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet zur Permeabilisierung in 200 µl Saponin resuspendiert. 3.5.2 Färbung 3.5.2.1 Färbung der Oberflächen-Antigene Reagenzien: Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS, 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) Puffer (Hanks Salzlösung + 0,1% Acid) Antikörper: CD14 Tricolor CD1a Phycoerythrin (PE) CD40 Fluorescein-isothiocyanat (FITC) CD80 FITC CD83 FITC CD86 FITC humanes Leukozyten Antigen A,B,C (HLA-A,B,C) FITC HLA-DR FITC Cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA) FITC Die Subpopulationen wurden in Polystyrol Reagenzgläser geerntet und gewaschen (10 Minuten, 300×g). Der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in einer Konzentration von ca. 1,0 x 105 Zellen/100 µl in Pufferlösung aufgenommen. Pro Subpopulation wurden 8 Reagenzgläser mit je 100 µl Zellsuspension angesetzt. In den Ansätzen 1 bis 7 wurde jeweils der zu bestimmende Oberflächen-Ak dem Herstellerhinweis entsprechend dazugegeben (CD40, 80, 83, 86 HLA-ABC, HLA-DR und CLA). Dabei wurden nur in Probe 1 die Subpopulationsmarker CD1a und CD14 mitgefärbt (rotfluoreszierender Farbstoff PE, bzw. Tricolor). Die Zellsuspension in Probe 8 galt als Kontrollansatz und wurde nicht angefärbt. Alle Proben wurden 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde der nicht gebundene Ak mit je 1000 µl 3 Material und Methoden 18 ______________________________________________________________________ Puffer ausgewaschen (10 Minuten, 300×g). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 250 µl Puffer aufgenommen. 3.5.2.2 Färbung von intrazellulären Zytokinen Reagenzien: Saponin (1%) Hanks Salzlösung Antikörper: IL-4 PE INF-γ FITC IgG1 PE IgG1 FITC Zur Färbung der intrazellulären Zytokine wurden zwei Polystyrol Reagenzgläser mit je 100 µl der vorbereiteten Zellsuspension (3.5.1) angesetzt: Zum Vergleich wurden nur dem ersten Ansatz die Zytokin-Ak (je 10 µl IL- 4 PE und INF-γ FITC) zugesetzt; im zweiten Ansatz erfolgte eine Kontrollfärbung mit IgG1 -Ak (je 10 µl IgG1 PE und IgG1 FITC). Nach der Inkubation im Kühlschrank (15 Minuten) folgte das Auswaschen des nicht gebundenen Ak (2,0 ml Saponin, 10 Minuten, 300×g). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 250 µl Hanks Salzlösung aufgenommen. 3.5.2.3 Infektion – Bestimmung von intrazellulärem RSV Reagenzien: Saponin (1%) Hanks Salzlösung Antikörper: Respiratorisches Sycytial Virus (RSV)-Ak Strept-Avidin Tri-color Zur Färbung des intrazellulären RSV wurden zwei Reagenzgläser - wie in Abschnitt 3.5.2.2 beschrieben - mit vorbehandelten Zellen (3.5.1) angesetzt: Reagenzglas 1 diente als Versuchsansatz, Reagenzglas 2 als Kontrolleansatz. Dabei wurde nur der Versuchsansatz in Röhrchen 1 mit 10 µl Biotin-konjugierter RSVAk im Kühlschrank inkubiert (15 Minuten). Der überschüssige Ak wurde mit 1,0 ml 3 Material und Methoden 19 ______________________________________________________________________ Saponin ausgewaschen (10 Minuten, 300×g) und der Überstand verworfen. Da Biotin selbst keine Fluoreszenz besitzt, wurden die Zellen mit Strept-Avidin Tri-color nachgefärbt (je 0,5 µl) und 15 Minuten inkubiert. Auch der Kontrolle in Röhrchen 2 wurde dieser Ak zugesetzt, um die unspezifischen Bindungsstellen zu markieren. Anschließend wurde erneut der ungebundene Ak ausgewaschen (10 Minuten, 300×g). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 250 µl Hanks Salzlösung aufgenommen. 3.5.2.4 Apoptose – Bestimmung von Annexin V Reagenzien: Annexin V Kit (Binding Puffer, Propium Iodid (PI), Annexin V FITC) Hanks Salzlösung Die Apoptose ist ein genetisch regulierter Vorgang, bei dem es zu einer Art Selbstmord der Zelle kommt. Bei diesem Prozess verliert die Zellmembran ihren gerichteten Aufbau. Intrazellulärgelegene Bestandteile werden so nach der Anfärbung mit Annexin V, das in hohem Maße an den Zellmembranbaustein Phosphatidylserin bindet, messbar. Dazu wurden die Zellen in Polystyrol Reagenzgläser geerntet und mit kalter Hanks Salzlösung in einer vorgekühlten Zentrifuge gewaschen (4°C, 10 Minuten, 300×g). Das Zellpellet wurde mit 490 µl Binding Puffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit Annexin V FITC und PI (je 5 µl) gefärbt und auf Eis für 10 Minuten inkubiert (verdunkelt). Annexin V markiert dabei die apoptotischen, PI die nekrotischen Zellen. 3.5.2.5 Phagozytose – Bestimmung von inkorporiertem Dextran FITC Reagenzien: Puffer (Phosphate Buffered Sline (PBS) + 0,01% Natriumazid, 1% FCS) Medium (RPMI 1640 + 1% HEPES Puffer) Antikörper: Dextran FITC PBS 3 Material und Methoden 20 ______________________________________________________________________ Die Phagozytosefähigkeit der Zellen wurde anhand des aufgenommenen Dextran FITC gemessen. Dazu wurden je 200 µl Zellsuspension (1 x 107 Zellen/ml) in sechs Polypropylen Reagenzgläser (für jeweils 3 Messzeitpunkte bei 37°C, bzw. bei 0°C) gegeben und zwei Minuten bei entsprechender Temperatur vorinkubiert. Anschließend wurden die Ansätze mit Dextran FITC Ak (20 µl) gefärbt und im Wasserbad bzw. auf Eis inkubiert. Die Reaktion wurde jeweils mit 4,0 ml Puffer nach 0; 15 und 30 Minuten gestoppt. Anschließend wurden die Ansätze gewaschen (4 x 1,0 ml Puffer, 4°C, 5 Minuten, 200×g). Der Überstand wurde verworfen. Zum Schluss wurden die Zellen in Polystyrol Reagenzgläser überführt und in 250 µl PBS aufgenommen. 3.5.2.6 Burst – Peroxidaseaktivität in den Lysosomen Reagenzien: Burstpuffer (Hanks Salzlösung + Hepes Puffer (0,01M)) Dimethylformamid (DMF) Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) (1 µM) PMA (100 ng/ml) LDS-751 (8 µg/ml) PI (40 µg/ml) Der Test weist intrazelluläres Wasserstoffperoxid durch Oxidation des nichtfluoreszenten Indikators DHR 123 zum grünfluoreszenten Rhodamin 123 in einer methyloperoxidase-katalysierten Reaktion nach. Dabei wurden die Zellen mit maximalem Anreiz durch PMA im Vergleich zu einem Kontrollansatz stimuliert. Zunächst wurden zwei Polystyrol Reagenzgläser mit je 250 µl Burstpuffer für 10 Minuten bei 37°C vorinkubiert. Es folgte die Zugabe von je 10 µl Zellsuspension (1,0x105 Zellen/ml) und 10 µl DHR als Substrat. In dem Ansatz zur maximalen Stimulation wurde außerdem 10 µl PMA hinzugefügt. Nach 20 Minuten wurde die DNS der lebenden Zellen mit 10 µl LDS-751 angefärbt. Dieser rotfluoreszente Farbstoff 3 Material und Methoden 21 ______________________________________________________________________ erlaubt die sichere Abgrenzung der Leukozyten von Zelltrümmern. Am Ende der Inkubationszeit wurden die toten Zellen mit 10 µl PI gegengefärbt und die Röhrchen auf Eis überführt. 3.5.3 Durchflusszytometrische Messung 3.5.3.1 Arbeitsprinzip eines Durchflusszytometer Das grundlegende Prinzip der analytischen Durchflusszytometrie ist die simultane Messung von verschiedenen physikalischen und chemischen Zelleigenschaften in Form von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen an einzelnen Zellen in einer Suspension. Es können bis zu fünf Parameter gleichzeitig bestimmt werden: Vorwärtsstreulicht (FSC) als Maß für die Zellgröße, Rechtwinkelstreulicht (SSC) als Maß für die Granularität und drei verschiedene Fluoreszenzfärbungen. Die dabei eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe müssen so gewählt werden, dass deren Emissionsspektrum den Photodetektionsbereichen des Durchflusszytometer entsprechen. Bei einem Gerät mit einem 488 nm, 15 mW Argon-Ionen Laser und drei Photodetektoren, die Licht der Wellenlänge 530 nm, 585 nm und >650 nm aufnehmen können, sind folgende Farbstoffe geeignet: • FITC [530 nm (Fl-1)] • PE [585 nm (Fl-2)] • Tri-color [>650 nm (Fl-3)] Die Zellen werden im List-Modus aufgenommen und die erhaltenen Daten mittels der FACscan-Research-Software analysiert. Dabei wird die Immunfluoreszenz logarithmisch und die Messdaten des Streulichts gewöhnlich linear verstärkt. Zunächst wird eine Kontroll-Probe gemessen und deren (Fluoreszenz-)Intensität als Nullwert festgelegt, auf den alle weiteren Messdaten der Ansätze bezogen werden. Die Auswertung der Messergebnisse ist in Ein- und Zweiparameter-Darstellung möglich: Bei einem Histogramm handelt es sich um eine Einparameter-Darstellung. 3 Material und Methoden 22 ______________________________________________________________________ Hiermit lassen bestimmen. sich Bei Fluoreszenzintensitäten vergleichend der von die Fluoreszenzintensitätsmaxima Zweiparameter-Darstellung zwei gemessenen (Dot-Plot) Zelleigenschaften einer werden Probe die gegeneinander aufgetragen. 3.5.3.2 Durchführung der Messungen Geräte: Durchflusszytometer (FACScan) Die Probenröhrchen wurden zunächst in das Gerät eingesetzt: Per Überdruck gelangten die Zellen von einem Hüllstrom umgeben in die Messküvette und dann zum Analysepunkt. Der Hüllstrom diente dazu, den Probenstrom im Zentrum der Messküvette zu stabilisieren und so zu verengen, dass die Zellen hintereinander, einzeln zum Analysenpunkt gelangten. Mit Hilfe der Streulichteigenschaften wurde zunächst die gewünschte Zellpopulation festgelegt. Anschließend wurden die Fluoreszenzdaten der Ansätze bestimmt, die vorab mit Oberflächen-, Zytokin-, Infektions-, Apoptose- oder Phagozytose-Ak behandelt waren. Die erhobenen Daten wurden über das Scan-Research Softwarepaket ausgewertet. 3 Material und Methoden 23 ______________________________________________________________________ 3.6 Proliferation der angezüchteten Zellen Geräte: Zellerntegerät Beta-Counter Reagenzien: Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS, 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) 3 H-Thymidin Mitomycin C (25 µg/ml) Bei dieser Messung wurde sowohl das Proliferationsverhalten der angezüchteten Zellen selbst, als auch das der T-Zellen in der MLR geprüft. Die Zellen der heterogenen Population wurde in der gemischten Lymphozytenreaktion mit Mitomycin C vorbehandelt, um die Eigenproliferation zu hemmen. Für die Untersuchung wurden die Zellen nach 72 Stunden Kultur zunächst mit 2 µCi/ml 3 H-Thymidin für 24 Stunden gepulst. Über ein Zellerntegerät wurden die zellulären Bestandteile gewonnen. Die Radioaktivität wurde in einem β-Zähler analysiert. Sie korrelierte mit dem Ausmaß an Desoxyribonukleinsäure-(DNS)-Replikation und Proliferation. Die Ergebnisse wurden in radioaktiven Zerfällen pro Minute (CPM) dargestellt. 3.7 ELISA-Nachweis der Zytokinproduktion im Überstand Reagenzien: Quantikine human IL-18 Colorimetrie Sandwich Enzyme-linkedimmunosorbent-assay (ELISA) Quantikine human IL-12 Colorimetrie Sandwich ELISA Quantikine human IL-12 p40 Colorimetrie Sandwich ELISA Quantikine human PGE2 Colorimetrie Sandwich ELISA Quantikine human IL-10 Colorimetrie Sandwich ELISA Quantikine human IL-11 Colorimetrie Sandwich ELISA Quantikine human TGF-β1 Colorimetrie Sandwich ELISA Quantikine human IL-4 Colorimetrie Sandwich ELISA 3 Material und Methoden 24 ______________________________________________________________________ Quantikine human IFN-γ Colorimetrie Sandwich ELISA Der Nachweis für die Zytokinproduktion im Überstand wurde mit der sogenannten „Sandwich-ELISA“ Technik durchgeführt. Dazu wurden zunächst die angezüchteten und stimulierten Zellen geerntet und abzentrifugiert (10 Minuten; 300×g). Danach wurden die spezifischen Ak für die jeweiligen Zytokine als „Fänger-Ak“ auf die vom Hersteller mitgelieferten Mikroplatten gegeben und gebunden. Anschließend wurde der Überstand der Probe und der der dazugehörenden Kontrolle hinzupipettiert. Die immobilisierten Ak koppelten spezifisch an die in dem Ansatz enthaltenen Zytokine. Danach wurde der ungebundene Ak ausgewaschen und ein zweiter enzym-gekoppelter Ak hinzugefügt, der an einem anderen Epitop der Zytokine als der erste reagierte. Nach der anschließenden Inkubationszeit wurde ein mit einem Farbstoff markierter Ak dazugegeben und das entstandene farbige Produkt bestimmt, das direkt proportional der Zytokinkonzentration in der Probe war. 3.8 Bestimmung von viralem Einfluss auf die angezüchteten Zellen Reagenzien: GM-CSF (100 ng/ml) TNF-α (2,5 ng/ml) Polyinosinic Polycytidylie Acid (Poly-I-C) (10 ng/ml) Infektionsmedium (1:1) RSV (Multiplicity of infection (MOI) 1) Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% FCS, 4% nährstoffreiche und keimhemmende Lösung) Sonstiges: Multiwellplatte mit Flachboden, 24 wells und 96 wells Die Expression von Oberflächenantigenen (3.5.2.1), das Proliferationsverhalten (3.6) und die Zytokinproduktion (3.7) der dendritischen Subpopulationen wurden zusätzlich unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV untersucht. RSV wurde dafür zunächst von den Mitarbeitern der Universitätsklinik Bergmannsheil in Bochum auf der Wirtszellinie Hep-2 angezüchtet und kultiviert. 3 Material und Methoden 25 ______________________________________________________________________ Für die Versuchsreihe wurden dann die angezüchteten Subpopulationen am 14. Tag sortiert (3.4) und in einer Multiwellplatte ausgeplattet. Anschließend wurde jede Subpopulation zweifach im Vergleich zu zwei Kontrollansätzen stimuliert: • kein Stimulus (Kontrolle für den Ansatz mit Poly-I-C) • Poly-I-C • Infektionsmedium (Kontrolle für den Ansatz mit RSV) • RSV Das Infektionsmedium und das RSV wurden nach zwei Stunden vorsichtig abpipettiert (Mangelmedium) und die Ansätze entsprechend mit Kulturmedium aufgefüllt. Anschließend wurden die Zellen für weitere 24 Stunden im Brutschrank (37°C, 8% CO2 ) inkubiert. 3 Material und Methoden 26 ______________________________________________________________________ 3.9 Herstellernachweis AC133 Kit Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 508-01 Amphotericin B Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. A 2612 Annexin V Kit Beckman Coulter Company; France (Marseille); Best.-Nr. 2375 Automacs Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach) Beta-Counter LKB Wallac; Germany Blocking Reagent (human IgG) Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 599-01 Brefeldin A Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. B 7651 CD14 Micro Beads Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 502-01 CD14 FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 347493 CD14 Tri-color Ak Caltag; CA; Best.-Nr. MHCD 1406 CD1a Micro Beads Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 510-01 CD1a PE Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 34225X CD40 FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 33074X CD45 RA Ak Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 459-01 CD80 FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 33514X 3 Material und Methoden 27 ______________________________________________________________________ CD83 FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 2410 CD86 FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 32294X Citrat-Phosphat-Dextrose-Lösung Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. 6-7165 CLA FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35824X Cryo Tubes, 1,0 ml Nalge Nunc International; Denmark; Best.-Nr. 343958 Dextran FITC Ak Molecular Probes; Netherlands; Best.-Nr. D 1845 DHR (Dihydrorhodamin 123) Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. D 632 Dimethyl-Sulfoxid-Lösung Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. D-5879 DMF (Dimethylformamid) Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. D 8654 Durchflusszytometer (FACScan) Becton Dickinson; Germany (Heidelberg) FCS Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. S 0115 Ficoll-Lösung (Dichte 1,077) Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. L 6115 GM-CSF Sandoz/ Essex Pharma; Germany; Leucomax 300 Hanks-Salzlösung Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. L 2045 HEPES Puffer 1M Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. L 1613 HLA-ABC FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 32294X 3 Material und Methoden 28 ______________________________________________________________________ HLA-DR Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 347363 IgG1 FITC Kontroll-Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 20604A IgG1 PE Kontroll-Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 20605A IL-4 (rekombiniert) TEBU; Germany; Best.-Nr. 200-04 IL-4 PE Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 554516 Infektionsmedium (Dulbecco`s Mem 25MM Hepes) Life Technologies; Scotland; Best.-Nr. 22320-022 INF-γ FITC Ak Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 18904A Ionomycin Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. I 0634 LDS-751 Exciton Dayton; USA (Ohio); Best.-Nr. 07510 M-CSF TEBU; Germany; Best.-Nr. 300-25 MidiMACS Sortiersäulen für RA+-Zellen Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 424-01 MiniMACS Sortiersäulen für Stammzellen Miltenyi Biotec; Germany (Bergisch-Gladbach); Best.-Nr. 422-01 Mitomycin C Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. M 0503 Monensin Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. M 5273 Multiwell-Platte mit Flachboden, 24 wells Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35 3047 Multiwell-Platte mit Flachboden, 96 wells Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35 3072 3 Material und Methoden 29 ______________________________________________________________________ nährstoffreiche und keimhemmende Lösung 1,0 % L-Glutamin 200mM; Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. K0282 1,0 % Natriumpyruvat 100mM; Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. L0473 1,0 % nicht essentielle Aminosäuren; Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. K 0293 1,0 % Penicillin/ Streptomycin 10000U/ 10000µg/ml; Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. A 2213 Natriumazid Merk; Germany (Darmstadt); Best.-Nr. 6688 Paraformaldehyd Riedel-de-Haen; Germany (Seelze); Best.-Nr. 16005 PBS-Dulbecco Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. L 1825 Penicillin/ Streptomycin (10000U/ 10000 µg/ml) Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. A 2213 Propium Iodid Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. P 4170 PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. P-8143 Polyinosinic Polycytidylie Acid Sigma; Germany (Deisenhofen); Best.-Nr. P-0913 Polypropylen Reagenzgläser mit Rundboden, 5,0 ml Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 2053 Polystyrol Reagenzgläser mit Rundboden, 5,0 ml Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35 2052 Quantikine human IFN-γ Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. DIF50 Quantikine human Il-4 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. HS400 Quantikine human Il-10 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. HS100B 3 Material und Methoden 30 ______________________________________________________________________ Quantikine human Il-11 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. D1100 Quantikine human Il-12 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. D1200 Quantikine human Il-12 p40 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. DP400 Quantikine human Il-18 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. D1800 Quantikine human PGE2 Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. DEO100 Quantikine human TGF-β Colorimetrie Sandwich ELISA R & D Systems; Germany (Wiesbaden-Nordenstadt); Best.-Nr. DB100 Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss, 15,0 ml Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35 2096 Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss, 50,0 ml Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35 2070 RPMI 1640 Medium Biochrom KG; Germany (Berlin); Best.-Nr. F 1415 Respiratorisches Sycytial Virus (RSV) Universitätsklinik Bergmannsheil, Bochum RSV Ak Biodesign; Germany; Best.-Nr. B 65820 G Saponin Riedel-de-Haen; Germany (Seelze); Best.-Nr. 16109 Serum-freies-Medium (X-Vivo 15) Bio Whittaker; USA (Maryland); Best.-Nr. 04-418Q Stammzellfaktor TEBU; Germany; Best.-Nr. Strept-Avidin Tri-color AK Caltag; CA (Burlingame); Best.-Nr. SA1006 Thymidin (3 H) Amersham; Germany; Best.-Nr. TRK 418 3 Material und Methoden 31 ______________________________________________________________________ TNF-α Genzyme; Germany; Best.-Nr. TNF-H Türksche Lösung Fluca; Germany (Steinheim); Best.-Nr. 93770 Zellerntegerät Tibertek; Germany Zellsieb, 40 µm Falcon/ Becton Dickinson; Germany (Heidelberg); Best.-Nr. 35 2340 4 Ergebnisse 32 ______________________________________________________________________ 4 Ergebnisse 4.1. Expression von CD14 und CD1a nach der 14tägiger Kultivierung von Stammzellen 4.1.1 Anzucht von drei Populationen Aus Nabelschnurblut von Neugeborenen wurden AC133+ Stammzellen isoliert und für sieben Tage mit SF, GM-CSF und TNF-α bebrütet. Anschließend wurden daraus drei Kulturen angesetzt, die für weitere sieben Tage unterschiedlich restimuliert wurden: a) M-CSF, b) TNF-α + GM-CSF oder c) IL-4 + TNF-α + GM-CSF. Am 14. Tag wurden dann die Oberflächenantigene CD1a und CD14 auf den unterschiedlich angezüchteten Zellen im Durchflusszytometer bestimmt. Dabei können drei Populationen identifiziert werden. Im Dot Plot ergeben sich typische Verteilungsmuster hinsichtlich der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14. Bei der Anzucht mit M-CSF entwickeln sich hauptsächlich CD14+ Zellen. Unter TNF-α + GMCSF + IL-4 können vermehrt CD1a+ Zellen nachgewiesen werden. Die heterogene Population zeichnet sich durch ihren gleichzeitigen Gehalt von einfach positiven CD14, bzw. CD1a wie auch von doppelt positiven bzw. doppelt negativen CD14/ CD1a Zellen aus (Abb. 3a-c). CD14 4 Ergebnisse 33 ______________________________________________________________________ a) b) c) CD1a Abbildung 3: Expression der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14 nach der 14tägigen Kultivierung mit: a) M-CSF, b) TNF-α + GM-CSF und c) TNF-α + GM-CSF + IL4. Die Zellen wurden mit CD1a PE und CD14 FITC angefärbt und im Durchflusszytometer gemessen. Die Abbildungen zeigen die Ergebnisse als Dot Plot Darstellungen vor der Sortierung. Unter der Kultivierung mit M-CSF entwickeln sich vorwiegend CD14+Zellen. Die mit TNF-α + GM-CSF + IL-4 bebrüteten Ansätze exprimieren zu einem großen Anteil das CD1a, während die mit TNF-α + GM-CSF gezüchteten Kulturen sowohl das CD14 als auch das CD1a tragen. 4.1.2 Sortierung der polarisierten Populationen Die polarisierten Zellkulturen (einfach positive CD14+ bzw. CD1a+ Populationen) wurden außerdem am 14. Tag mit spezifischen Ak (CD14 Micro Beads bzw. CD1a Micro Beads) markiert und durch eine einfach positive Selektion im Automacs hinsichtlich ihrer Oberflächenantigene CD14 bzw. CD1a getrennt. CD14 4 Ergebnisse 34 ______________________________________________________________________ a) b) c) CD1a Abbildung 4: Expression der Oberflächenantigene CD1a und CD14 auf den geprüften Populationen nach der Sortierung im Automacs (nur Kultur a und c). Die Zellen wurden wie in Abbildung 3 angezüchtet, mit CD1a PE und CD14 FITC gefärbt und im Durchflusszytometer gemessen. Die Abbildungen a) und c) zeigen einen deutlichen Anstieg von einfach positiven CD14 bzw. CD1a Zellen. In den Verteilungsmustern der Kulturen a) und c) werden dabei die Anteile der einfach positiven CD14 bzw. CD1a Zellen verstärkt (Abb. 4 a-c). Die Abbildung 5 stellt die prozentualen CD14 bzw. CD1a Anteile auf den polarisierten Populationen nach Durchflusszytometer der Sortierung dar. Diese im Automacs Ergebnisse und der unterstreichen unterschiedliche Verteilungsmuster der Oberflächenantigene auf den Zellen. Messung nochmals im das 4 Ergebnisse 35 ______________________________________________________________________ 100 Prozent 75 50 CD1a+ CD14+ CD1a+, CD14+ CD1a-, CD14- 25 0 CD14+ Zellen CD1a+ Zellen Polarisierte Populationen nach der Sortierung Abbildung 5: Expression der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14 auf den polarisierten Zellen nach der Sortierung im Automacs. Die Zellen wurden mit M-CSF bzw. TNF-α + GM-CSF + IL-4 angezüchtet, mit CD1a PE und CD14 FITC gefärbt und im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden insgesamt drei unabhängige Messungen durchgeführt und die Ergebnisse in Prozent ausgewertet. Negativ wirkt sich allerdings die Sortierung auf die Apoptoserate aus. Davon sind überwiegend die CD14+ Zellen betroffen. Nach 18 Stunden sind etwa 20% der Zellen apoptotisch. Die CD1a+ Zellen erreichen dieses Maximum schon nach 12 Stunden mit ca. 10% (keine Abbildung). 4.2 Phänotyp der geprüften Populationen 4.2.1 Morphologie im Lichtmikroskop Auch das morphologische Erscheinungsbild der drei Subpopulationen unterscheidet sich nach der 14tägigen Kultivierung erheblich. Im Lichtmikroskop lassen sich lange Zellausläufer bei den CD14+ Zellen erkennen. Die CD1a+ Zellen sind dem gegenüber unscharf begrenzt. Im angelsächsischen Schrifttum werden diese Zellen deshalb auch als „veiled“ (=schleiernd) bezeichnet. Die heterogene Population zeigt Zellen von sehr unterschiedlicher Form und Größe (Abb. 6 a-c). 4 Ergebnisse 36 ______________________________________________________________________ a) Abbildung 6: b) c) Morphologie der geprüften Zellen im Lichtmikroskop (40000x) nach der 14tägigen Kultivierung mit a) M-CSF, b) TNF-α + GM-CSF und c) TNF-α + GM-CSF + IL4. Unter M-CSF entwickeln sich große Zellen mit langen Zellausläufern. Die mit TNF-α + GM-CSF + IL-4 gezüchtete Population setzt sich aus kleinen, unscharf begrenzten Zellen (= veiled cells) zusammen, während die heterogene Kultur aus verschieden großen und unterschiedlich geformten Zellen besteht. 4.2.2. Expression von spezifischen dendritischen Oberflächenantigenen Zur genaueren Charakterisierung wurden weitere Oberflächenantigene an Tag 14 auf den angezüchteten Zellen bestimmt. Die Moleküle wurden dazu mit einem spezifisch bindenden, fluoreszierenden Ak markiert und im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden Ag gemessen, von denen bekannt war, dass sie in hohen Konzentrationen auf DC exprimiert werden. Hierzu gehörten die Oberflächenantigene CD40, CD80, CD86, CLA und MHC Klasse I und II. Außerdem wurde auch der spezifische dendritische Marker CD83 erfasst (Abb. 7 a/ b). 4 Ergebnisse 37 ______________________________________________________________________ 750 MFI 500 250 0 CD14 heterogen CD1a Kontrolle CD40 CD80 CD86 CD83 CLA Oberflächenantigene a) 4000 MFI 3000 2000 CD14 heterogen CD1a 1000 0 b) Abbildung 7: Kontrolle HLA-ABC HLA-DR Oberflächenantigene Vergleich der Expression von Oberflächenmolekülen auf den gezüchteten Zellen. Abbildung a) zeigt die Stimulations- und dendritischen Marker. Abbildung b) stellt die MHC Moleküle Klasse I und II dar. Die Ag wurden mit einem FITCmarkierten Ak im Durchflusszytometer gemessen und die Ergebnisse als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ausgewertet. Das CD40 und die Co-Stimulationsmoleküle CD80 und CD86 werden am stärksten auf den CD1a+ Zellen nachgewiesen. Für das Molekül CD86 wird dabei der höchste Wert festgestellt. Die CD14+ Zellen exprimieren diese Ag vergleichsweise wenig. Die heterogene Population stellt eine Zwischengruppe dar. Der dendritische Marker CD83 und das CLA werden hauptsächlich auf den CD1a+ Zellen gefunden. Die MHC-Ag (HLA-ABC und HLA-DR) werden am höchsten auf den CD1a+ Zellen exprimiert, wobei sich für das HLA-DR mehr als dreimal so hohe Werte ergeben wie für das HLA-ABC. Die CD14+ Zellen tragen diese Ag vergleichsweise wenig. Es gibt 4 Ergebnisse 38 ______________________________________________________________________ keine Unterschiede in der Höhe der Expression zwischen dem HLA-ABC und dem HLA-DR. Die heterogene Population stellt wiederum eine Zwischengruppe dar. 4.3 Unterschiedlicher Reifungsgrad der polarisierten Zellen gegenüber der heterogenen Population 4.3.1 Zellteilungsrate der Subpopulationen Zur Prüfung des Proliferationsverhalten wurden die Zellen an Tag 14 geerntet, sortiert und 72 Stunden in Kultur gegeben. Anschließend wurden sie für 24 Stunden mit [3 H]Thymidin gepulst und die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) mit einem β-Zähler gemessen. Dieser Wert wurde als Maß für die Zellteilungsrate verwendet. Die beiden polarisierten Kulturen proliferieren im Vergleich zu der heterogenen Population nur noch stark vermindert. Es findet nur noch ein geringer [3 H] Thymidin Einbau in die DNS statt. Die heterogenen Zellen zeigen dagegen eine intensive Zellteilung (Abb. 8). 4 Ergebnisse 39 ______________________________________________________________________ CPM 7500 5000 2500 0 CD14 heterogen CD1a CD14 heterogen CD1a Subpopulationen Abbildung 8: Proliferationsfähigkeit der drei angezüchteten Populationen. Zunächst wurde [ 3 H] Thymidin in die Ansätze hinzugegeben. Nach 24 Stunden wurden dann mit einem β-Zähler die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) gemessen und als Maß für die Zellteilungsrate verwendet. Während die polarisierten Zellen stabile Populationen darstellen, zeigen die heterogenen Zellen eine intensive Zellteilung. 4.3.2 Phagozytoseverhalten der angezüchteten Zellen Ferner wurde die Phagozytosefähigkeit der Subpopulationen an Tag 14 bestimmt. Dabei wurde das über einen Mannose-Rezeptor aufgenommene Dextran FITC durchflusszytometrisch gemessen. Am meisten inkorporieren die Zellen der heterogenen Population das Dextran FITC. Bei ihnen ist auch ein deutlicher Anstieg der Phagozytoserate über die Messzeit zu beobachten. Die polarisierten Populationen (CD1a+ bzw. CD14+ Zellen) nehmen demgegenüber sehr viel weniger Dextran FITC auf, wobei die CD14+ Zellen immer noch mehr als doppelt so viel aufnehmen wie die CD1a+ Zellen (Abb. 9). 4 Ergebnisse 40 ______________________________________________________________________ 750 MFI 500 250 0 CD14 heterogen CD1a 0 Min 15 Min 30 Min Zeit Abbildung 9: Phagozytoseverhalten der angezüchteten Zellpopulationen. Es wurde das inkorporierte Dextran FITC zu den Messzeitpunkten 0, 15 und 30 Minuten im Durchflusszytometer erfasst. 4.4 Vergleich der polarisierten Populationen untereinander Bei der funktionellen Analyse zeigen die Subpopulationen unterschiedliche Eigenschaften. Dabei stehen die CD1a+ und die CD14+ Zellen im Kontrast zueinander, während die heterogene Population eine Zwischengruppe darstellt. 4.4.1 Bildung von Wasserstoffperoxid Die drei geprüften Populationen wurden weiterhin auf ihre WasserstoffperoxidProduktion untersucht. In der Anwesenheit von Sauerstoffradikalen wird der nicht fluoreszente Indikator DHR 123 zum dem grünfluoreszenten Rhodamin 123 oxidiert. Die Zellen wurden zuvor mit PMA stimuliert und mit der Kontrolle (Ansatz ohne Stimulus) verglichen (3.5.2.6). Dabei zeigen die CD1a+ Zellen keine H2 O2 Freisetzung. Auch nach der maximalen Stimulation mit PMA wird keine Veränderung gegenüber der Kontrolle nachgewiesen. 4 Ergebnisse 41 ______________________________________________________________________ Die CD14+ Zellen zeigen schon in der Kontrolle eine verhältnismäßig hohe phagosomale Wasserstoffperoxidbildung. Unter dem Einfluss von PMA steigert sich allerdings die Bildung von Sauerstoffradikalen nochmals erheblich. Die heterogene Population verhält sich ähnlich wie die CD14+ Zellen. Jedoch liegt bei dieser Zellgruppe der Ausgangswert der Kontrollprobe sehr viel niedriger und die Wasserstoffperoxidbildung unter maximaler Stimulation mit PMA ist auch geringer (Abb. 10). Prozent 75 50 25 0 CD14 heterogen CD1a Kontrolle PMA Stimulation Abbildung 10: Phagosomale Wasserstoffperoxidbildung der geprüften Zellen an Tag 14 in vitro ohne Stimulus (Kontrolle) und unter maximaler Stimulation mit PMA. Dabei oxidiert H2 O2 den nicht fluoreszierenden Indikator DHR 123 zum dem grünfluoreszierenden Rhodamin 123 und kann damit durchflusszytometrisch erfasst werden. 4.4.2 Spontane Zytokinproduktion der Subpopulationen Die spontane Zytokinproduktion der Subpopulationen wurde mittels ELISA-Test an Tag 14 nachgewiesen. Folgende Zytokine wurden im Überstand gemessen: IL-18, IL-12 und IL-12 p40, die eine Th1- Antwort fördern und Prostaglandin E2 (PGE2) und IL-11, die eine Th2-Antwort induzieren. Das IL-10 und der Transforming growth factor-β (TGF-β) sind regulatorisch wirksame Zytokine. Das IL-18 ist das am meisten produzierte Zytokin der Th1-Antwort fördernden Faktoren. Es wird vor allem von den CD14+ Zellen produziert. Für das Zytokin IL-12 4 Ergebnisse 42 ______________________________________________________________________ kann unter den Subpopulationen nur die Untereinheit IL-12p40 nachgewiesen werden. Dieses wird hauptsächlich von der heterogenen Population produziert. Die CD1a+ und die CD14+ Zellen sezernieren es nur in geringen Mengen (Tab. 1). Tabelle 1: Spontane Sekretion von Th-1 fördernden Zytokinen. Zytokin* CD14 heterogen CD1a IL-18 271,7 (±183,3) 144,3 (±133,4) 69,7 (±26,5) IL-12 0 (±0) 0 (±0) 0 (±0) 5,6 (±9,8) 65,0 (±69,3) 8,3 (±14,4) IL-12 p40 * [pg/ml] Die Zytokine wurden jeweils im Überstand der angezüchteten Zellkulturen mittels ELISA nachgewiesen. Unter den Th2-fördernden Zytokinen wird das PGE2 von allen drei Populationen in verhältnismäßig großen Mengen freigesetzt. Das IL-11 dagegen wird gar nicht produziert (Tab. 2). Tabelle 2: Spontane Sekretion von Th-2 fördernden Zytokinen. Zytokin* CD14 heterogen CD1a PGE2 89,0 (±78,8) 40,3 (±9,3) 286,7 (±297,7) IL-11 0,0 (±0) 0,0 (±0) 0,0 (±0) * [pg/ml] Die Zytokine wurden im Überstand der Zellkulturen mittels ELISA nachgewiesen. Die regulatorisch wirksamen Zytokine werden überwiegend von der heterogenen Population freigesetzt. Dies gilt vor allem für das TGF-β. Aber auch die polarisierten Zellen produzieren dieses Zytokin, obgleich auch nur um die Hälfte weniger als die heterogenen Zellen (Tab. 3). 4 Ergebnisse 43 ______________________________________________________________________ Tabelle 3: Spontane Sekretion von regulatorisch wirksamen Zytokinen. Zytokin* CD14 heterogen CD1a IL-10 0,4 (±0,7) 2,5 (±3,1) 0 (±0) TGF-β 43,0 (±74,5) 101,0 (±53,8) 44,7 (±77,4) * [pg/ml] Die Zytokine wurden im Überstand der Zellkulturen mittels ELISA nachgewiesen. 4.5 Unterschiede der Subpopulationen in der Kokultur mit naiven T-Zellen Als weiteres Merkmal von DC gilt die sehr effektive Interaktion zwischen T-Zellen und DC. Letztgenannte sind als einzige Zellen in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren und dadurch eine primäre T-Zellantwort auszulösen [24]. Dazu wurden die angezüchteten Zellen mit naiven T-Zellen zusammengegeben (3.2.2). 4.5.1 Clusterbildung mit naiven T-Zellen Im Lichtmikroskop wurde die Clusterbildung der Zellen innerhalb von 24 Stunden beobachtet. Schon nach wenigen Stunden haften die CD1a+ Zellen mit den naiven T-Zellen zusammen. In ähnlicher Form präsentiert sich die heterogene Population. Keine Clusterbildung findet bei den CD14+ Zellen mit den naiven T-Zellen statt (Abb. 11a-c). 4 Ergebnisse 44 ______________________________________________________________________ a) b) Abbildung 11: c) Lichtmikroskopische Darstellung der Clusterbildung in der gezüchteten Zellen wurden dazu mit naiven T-Zellen zusammengebracht. Innerhalb von 24 Stunden haften die CD1a+Zellen mit den T-Zellen zusammen (b/c). Bei den dagegen keine Clusterbildung beobachtet werden (a). MLR (40.000x). Die im Verhältnis 1:5 heterogenen- und die CD14+ Zellen kann 4.5.2 Aktivierung von naiven T-Zellen durch die angezüchteten Populationen Die T-Zellaktivierung durch die geprüften Populationen wurde anhand des Proliferationsverhalten geprüft. Dabei wurden in unterschiedlichen Konzentrationen die Induktorzellen zu 5x105 /ml T-Zellen hinzugegeben und 72 Stunden kultiviert. Danach wurden die Ansätze mit radioaktivem [3 H] Thymidin gepulst, das bei der Zellteilung als Substrat in die DNS der T-Zellen eingebaut wird. Nach 24 Stunden wurden die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) gemessen und als Maß für die TZellaktivierung verwendet. Die heterogene Population wurde dabei vorab mit Mitomycin C behandelt. Dieses Reagenz hemmt die Eigenproliferation dieser Zellen und beugt somit einer Verfälschung der Ergebnisse in der MLR vor. Die CD1a+ und die heterogene Population zeigen eine sehr hohe Kapazität, naive TZellen zu stimulieren. Eine besonders starke Proliferation wird bei einer Konzentration von 5x104 /ml Zellen beobachtet. Die CD14+ Zellen induzieren dagegen nur eine sehr geringe Proliferation der T-Zellen (Abb. 12). 4 Ergebnisse 45 ______________________________________________________________________ CPM 20000 10000 CD14 heterogen CD1a 0 5x10 2 5x10 3 5x10 4 Konzentration von stimulierenden Zellen Abbildung 12: Induktion der T-Zellproliferation durch die geprüften Zellen. In der MLR wurden dazu in unterschiedlichen Konzentrationen die jeweiligen Populationen als Induktoren zu 5x105 /ml T-Zellen hinzugegeben und 72 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Ansätze mit radioaktivem [ 3 H] Thymidin inkubiert, das bei der Zellteilung als Substrat in die DNS der T-Zellen eingebaut wird. Nach 24 Stunden wurden dann die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) mit einem βZähler gemessen und als Maß für die Zellteilungsrate verwendet. Die heterogenen– und die CD1a+ Zellen induzieren mit zunehmender Zellzahl eine erhöhte Proliferation der T-Zellen. Die CD14+ Population dagegen stimulieren nur in geringem Maße T-Zellen zur Zellteilung. 4.5.3 Zytokinproduktion in der Kokultur 4.5.3.1 Untersuchungsergebnisse der intrazellulären Zytokinmessung Die Zellen wurde dafür zunächst mit den naiven T-Zellen im Verhältnis 1:5 kultiviert. Nach drei Tagen wurden die Ansätze mit PMA, Ionomycin und Monensin (5 Stunden vor der Messung) bzw.mit Befeldin A (18 Stunden vor der Messung) inkubiert. Anschließend wurden die intrazellulär gebildeten Zytokine mit spezifischen Ak für IL-4 und IFN-γ angefärbt und im Durchflusszytometer simultan gemessen. Unter PMA induzieren alle drei Subpopulationen eine vermehrte INF-γ Produktion der T-Zellen, während das IL-4 nur in geringen Mengen freigesetzt wird. Dies gilt vor allem für die beiden polarisierten Populationen (Abb. 13a). 4 Ergebnisse 46 ______________________________________________________________________ Ein umgekehrtes Bild zeigt sich nach der Zugabe von Brefeldin A. Alle Subpopulationen steigern die IL-4 Produktion der T-Zellen. Am meisten induzieren es die CD14+ Zellen und die heterogene Population. Die INF-γ Produktion dagegen ist in der MLR aller Subpopulationen gleich gering und liegt bei etwa 5% (Abb. 13b). 40 Prozent 30 20 CD14 heterogen CD1a 10 0 IL-4 INF-gamma Zytokine a) 40 Prozent 30 20 CD14 heterogen CD1a 10 0 b) Abbildung 13: IL-4 INF-gamma Zytokine Spontane Induktion der Zytokinproduktion von IL-4 und IFN-γ in der MLR. Es wurde die Methode der intrazellulären Zytokinmessung angewandt. In Abbildung a) wurden die angezüchteten Zellen zuvor mit PMA, Ionomycin und Monensin stimuliert. Abbildung b) zeigt die Zytokinproduktion nach der Zugabe von Brefeldin A. 4.5.3.2 Untersuchungsergebnisse der Zytokinproduktion aus dem ELISA-Test 4 Ergebnisse 47 ______________________________________________________________________ Zur Kontrolle wurde die IL-4 Produktion auch mittels ELISA-Test überprüft. Dabei wurde die gleiche Methode, wie bei der Messung der spontanen Zytokinproduktion der Populationen (4.4.2), angewendet. Die T-Zellproduktion von IL-4 wird vor allem von den heterogenen Zellen induziert. In den Kokulturen der polarisierten Zellen wird das Zytokin vergleichsweise wenig produziert (Abb. 14). 50 pg/ml 40 30 20 CD14 heterogen CD1a 10 0 CD14 heterogen CD1a Subpopulationen Abbildung 14: 4.6 Nachweis der IL-4 Produktion in der MLR der geprüften Zellen. Das Zytokin wurde im Überstand von jeweils 3 Ansätzen pro Population mittels ELISA nachgewiesen. Eine besonders hohe IL-4 Produktion durch die T-Zellen induziert die heterogene Population, während die polarisierten Zellen nur eine geringe Zytokinsekretion induzieren. Der Einfluss von viralen Stimuli auf die Subpopulationen Zur weiteren Charakterisierung wurde auch der Einfluss von Poly-I-C und RSV auf die angezüchteten Zellen bestimmt und miteinander verglichen. Als Kontrolle für Poly-I-C diente der Ansatz ohne zusätzlichen Stimulus und für RSV das Infektionsmedium. 4 Ergebnisse 48 ______________________________________________________________________ 4.6.1 Infizierbarkeit der Subpopulationen Zur Bestimmung der Infizierbarkeit wurden die Ansätze vorab mit RSV inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert. Das intrazelluläre RSV wurde anschließend mit einem spezifischen, fluoreszierenden Ak markiert und im Durchflusszytometer gemessen. Als Kontrolle dienten die Ansätze mit dem Infektionsmedium. Wie die Abbildung 15 zeigt werden die CD14+ Zellen am stärksten infiziert. Bei den CD1a+ Zellen dagegen findet sich nur in geringen Mengen intrazelluläres RSV. Im Vergleich der beiden Populationen weisen die CD14+ Zellen einen doppelt so hohen RSV Gehalt auf wie die CD1a+ Zellen. Prozent 30 20 10 0 Abbildung 15: CD14 heterogen CD1a RSV Inf.med. Vergleich zur Infizierbarkeit der geprüften Populationen. Die Kulturen wurden dazu 24 Stunden mit RSV bzw. Infektionsmedium als Kontrollansatz inkubiert. Anschließend wurde das intrazelluläre RSV durchflusszytometrisch gemessen. 4.6.2 Expression spezifischer Oberflächenantigene Bei dieser Versuchsreihe wurde die Expression der Stimulationsmoleküle CD40, CD80 und CD86, die des dendritischen Markers CD83 sowie die der MHC-Antigene Klasse I und II in MFI an Tag 14 gemessen. Dafür wurden die Moleküle mit spezifischen FITCmarkierten Ak gefärbt und im Durchflusszytometer erfasst. 4 Ergebnisse 49 ______________________________________________________________________ 4.6.2.1 Expression der Oberflächenantigene auf den CD14+ Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV Die Expression der Oberflächenantigene CD40 und CD80 zeigt unter den viralen Stimuli keine Änderung. Auch der dendritische Marker CD83 wird dadurch kaum beeinflusst. Das CD86 wird dagegen schon in beiden Kontrollansätzen (ohne Stimulus und mit Infektionsmedium) mit höheren Werten als die übrigen Ag erfasst. Unter den viralen Stimuli ist vor allem die erhöhte Expression des Moleküls unter Poly-I-C bedeutsam (Abb. 16a). Das Oberflächenantigen HLA-ABC wird sowohl unter Poly-I-C als auch unter RSV um etwa die Hälfte höher exprimiert als in den Kontrollen. Das HLA-DR wird dagegen nur von Poly-I-C beeinflusst und zeigt dafür höhere Werte (Abb. 16b). 4 Ergebnisse 50 ______________________________________________________________________ 750 MFI 500 ohne Stimulus Poly-I-C Infektionsmedium RSV 250 0 Kontrolle CD40 CD80 CD86 CD83 Oberflächenantigene a) 750 MFI 500 ohne Stimulus Poly-I-C Infektionsmedium RSV 250 0 Kontrolle HLA-ABC HLA-DR Oberflächenantigene b) Abbildung 16: Expression der Oberflächenantigene auf den mit M-CSF gezüchteten CD14+ Zellen unter den viralen Einflüssen von Poly-I-C und RSV. Die Ansätze ohne Stimulus bzw. mit Infektionsmedium wurden als Kontrollen mitgeführt. Abbildung a) zeigt die Stimulations- und dendritischen Marker. Abbildung b) stellt die MHC Moleküle Klasse I und II dar. Die Ag wurden mit einem FITCmarkierten Ak im Durchflusszytometer gemessen und die Ergebnisse als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ausgewertet. 4.6.2.2 Expression der Oberflächenantigene auf den heterogenen Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV Die Expression der Oberflächenantigene CD40, CD80 und CD83 zeigt unter den viralen Stimuli nur geringfügige Änderungen. Das CD86 wird dagegen sowohl von Poly-I-C als auch von RSV deutlich beeinflusst und mit höheren Werten als in den jeweiligen Kontrollen erfasst (Abb 17a). 4 Ergebnisse 51 ______________________________________________________________________ Für die MHC-Moleküle ergeben sich ähnliche Tendenzen wie bei den CD14+ Zellen. Allerdings wird das HLA-DR sehr viel höher auf den heterogenen Zellen als auf den CD14+ Zellen exprimiert (Abb. 17b). 750 MFI 500 ohne Stimulus Poly-I-C Infektionsmedium RSV 250 0 Kontrolle CD40 CD80 CD86 CD83 Oberflächenantigene a) 3000 MFI 2000 ohne Stimulus Poly-I-C Infektionsmedium RSV 1000 0 b) Abbildung 17: Kontrolle HLA-ABC HLA-DR Oberflächenantigene Expression der Oberflächenantigene auf den mit GM-CSF + TNF-α gezüchteten heterogenen Zellen unter den viralen Einflüssen von Poly-I-C und RSV. Die Ansätze ohne Stimulus bzw. mit Infektionsmedium wurden als Kontrollen mitgeführt. Abbildung a) zeigt die Stimulations- und dendritischen Marker. Abbildung b) stellt die MHC Moleküle Klasse I und II dar. Die Ag wurden mit einem FITC-markierten Ak im Durchflusszytometer gemessen und die Ergebnisse als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ausgewertet. 4 Ergebnisse 52 ______________________________________________________________________ 4.6.2.3 Expression der Oberflächenantigene auf den CD1a+ Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV Für die Ansätze der CD1a+ Zellen konnte wegen der zu geringen Zellzahl keine RSVKontrolle mit Infektionsmedium durchgeführt werden. Für diese Population diente der Ansatz ohne Stimulus auch als Kontrolle für das RSV. Auf den Zellen werden im Vergleich zu den anderen Subpopulationen die gemessenen Ag sowohl in der Kontrolle als auch unter den Stimuli mit den höchsten Werten erfasst. Die Expression der Moleküle CD40, CD80 und CD86 ändert sich nur unter der Stimulation durch RSV. Es werden dafür kleinere Werte gemessen. Der dendritische Marker CD83 wird durch die viralen Stimuli kaum beeinflusst (Abb. 18a). Sowohl das HLA-ABC als auch das HLA-DR werden durch Poly-I-C vermehrt nachgewiesen. Unter RSV dagegen werden diese Moleküle vermindert exprimiert (Abb. 18b). 4 Ergebnisse 53 ______________________________________________________________________ 750 MFI 500 250 0 ohne Stimulus Poly-I-C RSV Kontrolle CD40 CD80 CD86 CD83 Oberflächenantigene a) 5000 MFI 4000 3000 2000 ohne Stimulus Poly-I-C RSV 1000 0 b) Abbildung 18: Kontrolle HLA-ABC HLA-DR Oberflächenantigene Expression der Oberflächenantigene auf den CD1a+ Zellen unter den vi ralen Einflüssen von Poly-I-C und RSV. Die Ansätze ohne Stimulus wurden als Kontrollen mitgeführt. Abbildung a) zeigt die Stimulations- und dendritischen Marker. Abbildung b) stellt die MHC Moleküle Klasse I und II dar. Die Ag wurden mit einem FITC-markierten Ak im Durchflusszytometer gemessen und die Ergebnisse als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ausgewertet. 4.6.3 Spontane Zytokinfreisetzung der Subpopulationen unter viralem Einfluss Unter den viralen Einflüssen von Poly-I-C und RSV wurden die gleichen Zytokine mit derselben Methode wie in 4.4.2 gemessen. Bei allen drei Subpopulationen steigert sich besonders die Produktion von PGE2 und IL-11 unter der Wirkung von RSV. Es werden insgesamt dafür sehr hohe Werte erreicht. Alle anderen Zytokine werden in geringeren Mengen sezerniert. 4 Ergebnisse 54 ______________________________________________________________________ Das Poly-I-C nimmt bei den CD14+ Zellen vor allem Einfluss auf die Zytokine IL-12, IL-12 p40 und IL-10. Sie werden vermehrt produziert. Das RSV induziert dagegen die Sekretion von PGE2, IL-11 und IL-18 (Tab. 4). Tabelle 4: Spontane Zytokinfreisetzung der CD14+ Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV. Zytokin * Ohne Stimulus Poly-I-C Inf.med. RSV IL-18 271,7 (±183,3) 263,3 (±146,0) 150,7 (±94,2) 340,0 (±134,5) IL-12 0,0 (±0,0) 0,7 (±1,2) 0,0 (±0,0) 0,1 (±0,1) IL-12 p40 5,7 (±9,8) 20,7 (±35,8) 3,7 (±6,4) 3,3 (±5,8) PGE2 89,0 (±78,2) 293,3 (±209,8) 69,3 (±69,8) 2220,0 (±1577,7) IL-11 0,0 (±0,0) 0,0 (±0,0) 0,0 (±0,0) 1233,3 (±76,4) IL-10 0,4 (±0,7) 41,3 (±20,4) 0,9 (±0,7) 9,5 (±3,1) TGF-β 43,0 (±74,5) 46,7 (±81,0) 0,0 (±0,0) 147,3 (±30,3) * [pg/ml] Die Ansätze ohne Stimulus bzw. mit Infektionsmedium wurden als Kontrollen zu den viralen Stimuli mitgeführt. Die Zytokine wurden jeweils im Überstand von drei mit M-CSF gezüchteten Zellkulturen mittels ELISA nachgewiesen. Die heterogene Population zeigt ähnliche Tendenzen wie die CD14+ Zellen. Unterschiede ergeben sich nur bei den Zytokinen IL-10 und IL-12 unter dem Einfluss von RSV: Das IL-10 wird vermindert im Gegensatz zur Kontrolle mit Infektionsmedium produziert und das IL-12 wird unter RSV genausoviel produziert wie unter Poly-I-C (Tab. 5). 4 Ergebnisse 55 ______________________________________________________________________ Tabelle 5: Spontane Zytokinfreisetzung der heterogenen Zellen unter dem Einfluss von PolyI-C und RSV. Zytokin* Ohne Stimulus Poly-I-C Inf.med. RSV IL-18 144,3 (±113,4) 148,3 (±127,3) 82,3 (±46,7) 230,0 (±55,7) IL-12 0,0 (±0,0) 1,6 (±1,7) 0,1 (±0,2) 1,4 (±1,8) IL-12 p40 65,0 (±69,3) 490,3 (±553,0) 19,3 (±13,6) 34,0 (±39,8) PGE2 40,3 (±9,6) 143,0 (±136,0) 32,0 (±4,6) 1573,3 (±996,1) IL-11 0,0 (±0,0) 0,0 (±0,0) 0,0 (±0,0) 1533,3 (±152,8) IL-10 2,5 (±3,1) 35,7 (±39,1) 27,9 (±45,2) 16,0 (±15,4) TGF-β 101,0 (±53,8) 72,0 (±37,3) 14,0 (±24,2) 184,0 (±67,0) * [pg/ml] Die Ansätze ohne Stimulus bzw. mit Infektionsmedium wurden als Kontrollen zu den viralen Stimuli mitgeführt. Der Nachweis der Zytokinproduktion erfolgte im Überstand durch den ELISA. Auch die CD1a+ Zellen verhalten sich ähnlich wie die CD14+ Zellen. Das IL-12 wird allerdings wie bei der heterogenen Population von RSV und Poly-I-C gleichermaßen beeinflusst. Das IL-10 wird unter RSV vermehrt produziert als unter Poly-I-C. Im Gegensatz zu den beiden anderen Subpopulationen wird es insgesamt jedoch um ein vielfaches weniger sezerniert (Tab. 6). 4 Ergebnisse 56 ______________________________________________________________________ Tabelle 6: Zytokin Spontane Zytokinfreisetzung der CD1a+ Zellen unter dem Einfluss von Poly-I-C und RSV. Ohne Stimulus Poly-I-C Inf.med. RSV IL-18 69,7 (±26,5) 90,0 (±62,5) 41,7 (±21,5) 216,7 (±60,1) IL-12 0,0 (±0,0) 1,2 (±2,0) 0,1 (±0,1) 1,2 (±2,0) IL-12 p40 8,3 (±14,4) 21,0 (±16,5) 4,0 (±6,9) 4,3 (±7,5) PGE2 286,7 (±297,7) 351,7 (±339,0) 230,0 (±268,9) 2673,3 (±1728,0) IL-11 0,0 (±0,0) 0,0 (±0,0) 0,0 (±0,0) 1216,7 (±57,7) IL-10 0,0 (±0,0) 0,4 (±0,3) 0,6 (±0,5) 2,6 (±2,4) TGF-β 44,7 (±77,4) 42,0 (±72,7) 0,0 (±0,0) 152,7 (±32,8) * [pg/ml] Die Ansätze ohne Stimulus bzw. mit Infektionsmedium wurden als Kontrollen zu den viralen Stimuli mitgeführt. Der Nachweis der Zytokinproduktion erfolgte im Überstand durch den ELISA. 4.6.4 Zellteilungsrate der Subpopulationen unter viralem Einfluss Zur Prüfung des Proliferationsverhalten wurde die Zellen nach der viralen Stimulation für 24 Stunden mit [3 H]-Thymidin gepulst. Anschließend wurden die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) mit einem β-Zähler gemessen und dieser Wert als Maß für die Zellteilungsrate verwendet. Auch unter der Stimulation der Zellen mit Poly-I-C bzw. RSV zeigen die beiden polarisierten Kulturen nur eine geringe Proliferation. Die CD14+ Zellen proliferieren sogar unter viralem Einfluss geringfügig weniger im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen. Die heterogene Population proliferiert dagegen sehr stark. Jedoch ist auch bei dieser Zellgruppe ähnlich wie bei den CD14+ Zellen vergleichsweise eine Abnahme der Proliferationsrate sowohl unter Poly-I-C als auch unter RSV zu beobachten (Abb. 19). 4 Ergebnisse 57 ______________________________________________________________________ 7500 CPM 5000 2500 0 CD14 heterogen CD1a ohne Stim. Poly-I-C Inf.med. RSV Stimuli Abbildung 19: Proliferationsverhalten der geprüften Populationen unter dem viralen Einfluss von Poly-I-C und RSV. Der Ansatz ohne Stimulus bzw. der mit Infektionsmedium diente jeweils als Kontrolle. Über einen β-Zähler wurden nach der Inkubation der angezüchteten Populationen mit [3 H]-Thymidin die radioaktiven Zerfälle gemessen. Die Zellen mit einer großen Mitoserate wie die heterogene Population zeigen dabei einen hohen radioaktiven Zerfall pro Minute (CPM), der allerdings unter den Stimuli abnimmt. Die polarisierten Zellen dagegen bleiben auch unter der viralen Stimulation stabil und teilen sich nur in sehr geringem Maße. 4.6.5 Induktion der T-Zellaktivierung durch die geprüften Populationen unter viralem Einfluss Die T-Zellaktivierung wurde anhand des Proliferationsverhalten geprüft. Dafür wurden die geprüften Populationen als Induktorzellen zu naiven T-Zellen im Verhältnis 1:5 hinzugegeben und 72 Stunden kultiviert. Danach wurden die Ansätze mit radioaktiven [3 H] Thymidin gepulst, das bei der Zellteilung als Substrat in die DNS der T-Zellen eingebaut wird. Nach 24 Stunden wurden die radioaktiven Zerfälle pro Minute (CPM) gemessen und als Maß für die T-Zellaktivierung verwendet. Die heterogene Population wurde dabei vorab mit Mitomycin C behandelt. Dieses Reagenz hemmt die Eigenproliferation dieser Zellen und beugt somit einer Verfälschung der Ergebnisse in der MLR vor. In der MLR induzieren alle drei Subpopulationen eine erhöhte Proliferationsrate der TZellen unter viralem Einfluss. Eine besondere Steigerung zeigt sich bei den CD14+ Zellen mit RSV. Die CD1a+ Zellen dagegen stimulieren die T-Zellen unter RSV nur geringfügig mehr als in der Kontrolle mit Infektionsmedium (Abb. 20). 4 Ergebnisse 58 ______________________________________________________________________ 40000 CPM 30000 20000 CD14 heterogen CD1a 10000 0 ohne Stim. Poly-I-C Inf.med. RSV Stimuli Abbildung 20: Induktion der T-Zellenproliferation durch die geprüften Zellen unter viralem Einfluss. Der Ansatz ohne Stimulus bzw. der mit Infektionsmedium diente jeweils als Kontrolle. Über einen β-Zähler wurde das in die DNS der T-Zellen eingebaute radioaktive [3 H]-Thymidin gemessen. Die CD1a+ und die heterogenen Zellen zeigen dabei eine erhöhte Kapazität T-Zellen zu stimulieren. Insbesondere unter Poly-I-C steigerte sich nochmals die Induktionskraft beider Populationen, während RSV überwiegend Einfluss auf die heterogenen Zellen nimmt. Die CD14+ Zellen induzieren die T-Zellstimulation vergleichsweise wenig, obgleich sich unter den Stimuli eine Steigerung zeigt. 5 Diskussion 59 ______________________________________________________________________ 5 Diskussion Durch die unterschiedliche Kultivierung von AC133+ Stammzellen können drei verschiedene Zellpopulationen angezüchtet werden. Unter dem Einfluss der Wachstumsfaktoren GM-CSF + TNF-α. entwickeln sich heterogene Zellen. Diese Mischpopulation setzt sich aus CD1a bzw. CD14 einfach positiven und CD1a/CD14 doppelt positiven bzw. doppelt negativen Zellen zusammen. Durch die Zugabe von Reifungsfaktoren werden die Zellen polarisiert. Unter M-CSF entwickeln sich dann vorwiegend CD14+ Zellen, während das IL-4 die verstärkte Expression von CD1a induziert. Die durch die vorliegenden Untersuchungen gewonnenen Erkenntnisse weisen im Vergleich der drei angezüchteten Populationen untereinander einerseits auf Unterschiede im Entwicklungsniveau der Zellen und andererseits auf phänotypisch und funktionell ungleiche Zelltypen hin. 5.1 Heterogene Zellen als Vorstufen der „unreifen DC“ Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich die heterogene Population im Vergleich zu den polarisierten Zellen in einem Vorläuferstadium befindet. Dieses lässt sich besonders gut am Proliferationsverhalten und an phänotypischen Eigenschaften der Zellen belegen: Die heterogene Population zeigt eine intensive Zellteilung, die sechs- bis achtfach höher ist als die der polarisierten Zellen. In diesem Zusammenhang wird auch der Begriff „instabil“ gebraucht, während die polarisierten Zellen „stabile“ Populationen darstellen. Verantwortlich für die hohe Proliferation der heterogenen Zellen ist vermutlich der Anteil der CD1a/ CD14 doppelt negativen Zellen. Voruntersuchungen hatten ergeben, dass sich vorwiegend diese Zellen teilen, während die Mitoserate der anderen Fraktionen stagniert. 5 Diskussion 60 ______________________________________________________________________ Bezüglich der Oberflächenantigene CD1a und CD14 sind die polarisierten Zellen einfach positiv und werden nach den vorgelegten Befunden als homogen angesehen. Bei der heterogenen Population werden dagegen neben der doppelt negativen, undifferenzierten Fraktion nur CD14- bzw. CD1a-tragende und eine Mischform mit beiden Markern gefunden. Normalerweise kommen CD1a und CD14 getrennt auf unterschiedlichen Zelltypen vor, wobei erstgenanntes typisch für DC ist [47], während das CD14 vorwiegend auf Makrophagen gefunden wird [48]. Die gleichzeitige Expression dieser Oberflächenmarker lässt daher vermuten, dass ein endgültiger Zelltyp bei der heterogenen Population noch nicht festgelegt ist. Diese „Zwitterstellung“ zwischen DC und Makrophagen spiegelt sich auch in weiteren phänotypischen und funktionellen Eigenschaften wieder: Morphologisch zeigt sich ein sehr uneinheitliches Bild aus unterschiedlich großen und verschieden geformten Zellen. Dendritencharakter zeigt die heterogene Population bei der Expression der Oberflächenmoleküle und der T-Zellstimulation. Neben dem CD1a und dem CD14 lassen sich auch andere Ag nachweisen, die in hohen Konzentrationen spezifisch für DC sind [49]. Auf den heterogenen Zellen sind diese Moleküle zwar nachweisbar, aber sie werden weniger stark als auf DC exprimiert. Eine Ausdifferenzierung dieser Zellen hat also noch nicht stattgefunden. Lediglich die phänotypische Veranlagung, zu DC ausreifen zu können, ist gegeben. In Kokultur induzieren die heterogene- und die CD1a+ Population eine gleich hohe T-Zellproliferationsrate. Dieses Ergebnis ändert sich auch nicht nach der Vorbehandlung der heterogenen Zellen mit Mitomycin C, das die hohe Eigenproliferation dieser Population hemmt. Für Vorläuferzellen ist eine derartig starke T-Zellaktivierung allerdings untypisch. Andere Studien belegen, dass die Fähigkeit, eine kompetente und effektive Immunantwort auszulösen, mit dem Reifegrad der Zellen korreliert [24]. Eine endgültige Erklärung für dieses Ergebnis bleibt also weiterhin offen. Makrophagencharakter wiederum zeigen die geprüften Zellen hinsichtlich der Wasserstoffperoxydbildung. Unter der Stimulation mit PMA werden erhöhte H2 02 Mengen gebildet. Im Vergleich zu den Makrophagen ist die Produktion allerdings schwächer, was auf das Vorhandensein von CD1a+ Zellen innerhalb dieser Population zurückzuführen ist. Eine Ursache für die hohe Phagozytosefähigkeit liegt vermutlich in der Addition von Dendriten- und Makrophageneigenschaften begründet, die in der heterogenen Population vereint sind. So ist bekannt, dass sowohl unreife DC als auch Makrophagen ein hohes Phagozytosepotential besitzen. Bei der Zytokinmesung 5 Diskussion 61 ______________________________________________________________________ werden sowohl Th1- als auch Th2-fördernde Zytokine erfasst. Auffällig ist insbesondere die hohe Produktion der Zytokinuntereinheit IL-12p40 im Vergleich zu der der polarisierten Zellen. Diese Untereinheit lagert sich einer zweiten Kette (IL-12p35) über eine kovalente Bindung zu dem biologisch aktiven Heterodimer IL-12 an [50]. In hohen Mengen können sich die IL-12p40 Untereinheiten aber auch zu Homodimeren verbinden und wirken dann antagonistisch auf die IL-12 Sekretion und dessen Effekte [51, 52]. Eine spontane Sekretion von IL-12p40 ist üblicherweise nur in geringen Mengen nachweisbar, da erst beim Kontakt mit T-Zellen über die Bindung mit CD40L eine verstärkte Produktion induziert wird [53]. Die Bildung von IL-12p40 Homodimeren ist auch in dieser Studie in Hinblick auf die IFN-γ-Produktion vorstellbar. Eine Messung des aktiven Zytokins IL-12 wurde zwar nicht durchgeführt, aber eine möglicherweise dadurch induzierte IFN-γ-Produktion ist untersucht worden. Diese fiel allerdings negativ aus, was auf die antagonistischen Effekte der IL-12p40 Homodimere zurückgeführt werden kann. Insgesamt lassen die vorgestellten Ergebnisse darauf schließen, dass es sich bei der heterogenen Population um eine Vorstufe der „unreifen DC“ handelt. Eine endgültige Differenzierung der Zellen hat noch nicht stattgefunden. Phänotypisch und funktionell weisen sie Eigenschaften sowohl von DC als auch von Makrophagen auf. Als adäquate Bezeichnung für diese Zellpopulation wird „prä-dendritische Zelle“ vorgeschlagen. 5.2 Induktion der Zellreifung durch die Zytokine IL-4 und M-CSF Eine Modifikation der Methode nach Caux zur Anzucht von DC aus Stammzellen induziert die weitere Ausreifung der Zellpopulationen. Die Ansätze werden dazu entweder mit M-CSF oder mit GM-CSF + TNF-α + IL-4 restimuliert (3.3.2). Es entwickeln sich daraus zwei unterschiedliche, reine und stabile Zellpopulationen. Die mit GM-CSF + TNF-α + IL-4 bebrüteten Zellen exprimieren vorzugsweise CD1a an ihrer Oberfläche. Pathophysiologisch wirkt dabei IL-4 zusammen mit GM-CSF als Ausreifungsfaktor für DC [38]. Es hemmt die Makrophagenentwicklung [54-56] und stabilisiert über einen noch unbekannten Mechanismus die Expression von CD1a [38]. 5 Diskussion 62 ______________________________________________________________________ Für die in vitro-Anzucht von DC aus Monozyten ist die Zugabe von IL-4 üblich [38, 46, 57]. Die physiologische Herkunft des exogen dazu gelangten Zytokins blieb aber bisher ungeklärt. Nähere Erkenntnisse dafür liefern jedoch die Ergebnisse der Zytokinproduktion in der MLR der heterogenen Zellen. Bei diesen als Vorläuferzellen u.a. von DC identifizierten Zellen (5.1) lässt sich sowohl im Überstand mittels ELISA als auch durch die intrazelluläre Zytokinmessung unter dem Einfluss von Brefeldin A das IL-4 in großen Mengen nachweisen. Es ist also denkbar, dass die heterogenen Zellen in der MLR nicht nur die T-Zellproliferation, sondern auch die Sekretion ihrer eigenen Ausreifungsfaktoren zu DC induzieren. Die Kultivierung der Ansätze mit M-CSF führt dagegen zur Entwicklung von CD14+ Zellen. Dabei reguliert das hinzugefügte Zytokin das Überleben, die Entwicklung und die Differenzierung von Makrophagen [58]. In vivo wird das M-CSF von den aktivierten Zellen selbst produziert [59]. Es bindet und wirkt über seinen Rezeptor CD115. Dieser befindet sich vor allem auf Makrophagen und ist ein sicheres Zeichen für das Nicht-Vorhandensein einer DC [40]. Die Expression des Rezeptors wird durch das Zytokin IL-6 reguliert, welches nach dem Kontakt mit aktivierten Monozyten von Fibroblasten im Gewebe freigesetzt wird. Das IL-6 induziert dabei die Expression von CD115 an der Zelloberfläche, wodurch eine Signalübertragung von sezerniertem MCSF stattfinden kann [59]. Die mit der Zugabe von M-CSF an Tag 7 induzierte Reifung von CD14+ Zellen belegt, dass eine endgültige Ausdifferenzierung noch nicht stattgefunden hat. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass auch die heterogenen Zellen das Oberflächenmolekül CD115 tragen und dadurch unter der Kultivierung mit M-CSF verstärkt das CD14 exprimieren. Die heterogenen Zellen scheinen nach den oben genannten Befunden oligopotent zu sein. Für eine endgültige Ausreifung stehen sowohl das IL-4 als auch das M-CSF zur Verfügung. Beide Zytokine werden von diesen Zellen selbst produziert. Eine Ausdifferenzierung und Polarisierung der Zellen in Richtung DC oder Makrophage ist also möglich. Wann welche Zelllinie induziert wird, hängt wahrscheinlich von endogenen und exogenen Einflüssen ab. 5 Diskussion 63 ______________________________________________________________________ 5.3 Die polarisierten Populationen als zwei unterschiedliche Zelltypen Im Vergleich der polarisierten Zellen untereinander zeigen sich Eigenschaften von zwei unterschiedlichen Zelltypen. Die CD1a+ Zellen weisen Merkmale von DC mit Langerhanscharakter auf, während die CD14+ Zellen Makrophageneigenschaften erkennen lassen. Langerhanszellen gehören zum dendritischen System. Sie befinden sich in der Epidermis der Haut und zählen zu den unreifen DC. Neben ihnen gibt es je nach Lokalisation noch weitere Subklassen der unreifen DC [24]. Einen Nachweis für Langerhanszellen zu erbringen, Eigenschaften aufweisen. ist schwierig, Erst da die sie nur wenige Zusammenführung spezifische sämtlicher Untersuchungsergebnisse lassen es zu, auf diesen Zelltyp schließen zu können. Die CD1a+ Zellen zeigen phänotypische und funktionelle Merkmale, die Langerhanszellen sehr nahe stehen. Morphologisch erscheinen sie im Lichtmikroskop unscharf begrenzt, weshalb sie im angelsächsischen Schrifttum auch als „veiled cells“(=schleiernde Zellen) bezeichnet werden [24]. Dieses Erscheinungsbild hängt mit den nicht klar lichtbrechenden Strukturen der Zelloberfläche zusammen. Erst im Elektronenmikroskop lassen sich die langen Zellausläufer (>10 µm) nachweisen [38]. Phänotypisch exprimieren sie neben dem CD1a auch andere dendritische Oberflächenantigene wie CD40, CD80, CD86, CD83, CLA und HLA Klasse I und II in hohen Konzentrationen. Das Molekül CD83 gilt dabei nicht nur als typischer dendritischer Marker, sondern auch als Reifemarker für DC [37]. Unter den geprüften Populationen wird dieses Ag zwar auf den CD1a+ Zellen mit den höchsten Konzentrationen gemessen, zeigt aber im Vergleich zu Werten in der Literatur insgesamt nur eine geringe Expression [24]. Die Klassifizierung dieser Zellen als „unreife DC“ erscheint daher als zutreffend. Im Vergleich zu den CD14+ Zellen werden vor allem die akzessorischen Moleküle mit höheren Werten erfasst. Wie andere Studien belegen, sind diese Ag für die T-Zellinteraktion wichtig [26]. Eine höhere Expression der akzessorischen Moleküle lässt deshalb auch auf eine bessere und effektivere TZellstimulation schließen [60]. Diese kann auch bei den CD1a+ Zellen beobachtet werden, die gegenüber der CD14+ Population eine vielfach höhere T-Zellaktivierung induziert. Zu beachten bleibt allerdings, dass es innerhalb der DC-Subklassen 5 Diskussion 64 ______________________________________________________________________ Unterschiede bezüglich der T-Zellstimulierung gibt: Die Langerhanszellen gelten im Gegensatz zu dermalen DC nur als schwache Induktoren [61]. Außerdem soll die exogene Zugabe von dem Zytokin IL-4 die Proliferationsfähigkeit einschränken [46]. In dieser Studie ist allerdings nur die T-Zellaktivierung der CD1a+ Zellen im Gegensatz zu der der heterogenen bzw. der der CD14+ Population geprüft worden. Ein Vergleich zu dermalen DC fehlt. Es bleibt daher nur festzuhalten, dass die CD1a+ Zellen im Gegensatz zu Makrophagen potente T-Zellstimulatoren sind. Diese Aussage wird auch im Lichtmikroskop der Kokulturen bestätigt: Die CD1a+ Zellen zeigen eine starke Clusterbildung, während die CD14+ Population keinen Kontakt mit den naiven TZellen aufnimmt. Funktionell verfügen die „unreifen DC“ über eine große Kapazität Ag aufzunehmen [24]. In dieser Studie weisen die CD1a+ Zellen gegenüber den CD14+ Zellen jedoch eine stark verminderte Phagozytosefähigkeit auf. Dennoch Untersuchungsergebnis zu der DC-Subklasse Langerhanszellen: Messungen Substrat Dextran-FITC wird benutzte passt Das endozytotisch dieses für diese über einen Mannoserezeptor aufgenommen, der bei Langerhanszellen nur schwach exprimiert wird [61, 62]. Mommaas et al. konnten zeigen, dass kein spezifischer Mannoserezeptor-Ak an die Langerhanszellen bindet, die Phagozytose von mannosyliertem und nichtmannosyliertem Ag gleich hoch ist und dass keine verstärkte Ag-Präsentation von mannosylierten Peptiden stattfindet. Weiterhin haben sie nachgewiesen, dass die Zellen nur ein schwach ausgeprägtes endosomales/lysosomales System besitzen [61]. Die geringe Aufnahme von Dextran-FITC durch die CD1a+ Zellen ist somit wahrscheinlich auf das Fehlen eines Mannoserezeptors zurückzuführen. Hinsichtlich der Zytokinproduktion werden spontan das IL-18, das IL-12p40 und das PGE2 nachgewiesen. Es werden also sowohl Th-1 als auch Th-2 fördernde Zytokine gemessen. Ein immunmodulierender Effekt ist daher den Zellen nicht eindeutig zuzuordnen. Die Zellen der CD14+ Population zeigen Makrophagencharakter. Sie stellen morphologisch spindelförmige Zellen mit langen Zellausläufern dar. Phänotypisch können neben dem Makrophagenmarker CD14 auch dendritische Oberflächenantigene nachgewiesen werden, allerdings in geringeren Konzentrationen. Dieses Ergebnis zusammen mit der niedrigen T-Zellaktivierung bestätigen die Vermutung von Santin 5 Diskussion 65 ______________________________________________________________________ und Mitarbeitern: Danach wirken sich die zum Teil bedeutsamen Unterschiede der AgPräsentation auf die funktionellen Eigenschaften der Zellen aus [60]. Funktionell zeigen die CD14+ Zellen eine hohe Phagozytoserate. Sie nehmen im Vergleich zu den CD1a+ Zellen doppelt soviel Dextran-FITC auf. Es ist offensichtlich, dass hierfür ein anderer und effektiverer Transportmechanismus als der von Langerhanszellen verantwortlich sein muss. Vermutlich handelt es sich um eine rezeptorvermittelte Ag-Aufnahme wie sie auch bei Makrophagen beobachtet wird [63]. Die hohe Phagozytosefähigkeit der CD14+ Zellen korreliert auch mit einer erhöhten Wasserstoffperoxydbildung. Durch die Stimulation der Zellen mit PMA wird ein deutliches fluoreszierendes Signal sichtbar, das auf eine vermehrte Oxidation von DHR 123 durch Sauerstoffradikale schließen lässt. Diese Funktion der Zellen ermöglicht eine direkte Vernichtung von phagozytiertem Material. Eine Präsentation des aufgenommenen Ag und die dadurch ausgelöste T-Zellaktivierung ist demnach nicht mehr notwendig. Die in dieser Arbeit gemessene geringe T-Zellstimulation durch die CD14+ Zellen zusammen Wasserstoffperoxydbildung mit der unterstützen hohen diese Phagozytoserate Annahme. und der Hinsichtlich der Zytokinfreisetzung fällt vor allem die hohe IL-18 Produktion der CD14+ Zellen auf. Es ist bekannt, dass dieses Zytokin vorwiegend von Monozyten und Makrophagen produziert wird [64]. Es zeigt bezüglich der Entwicklung einer Th1-Antwort Parallelen zum IL-12. Beide Zytokine induzieren eine IFN-γ Produktion [65, 66]. Das IL-18 wird deshalb auch als IFN-γ induzierender Faktor (IGIF) bezeichnet [66]. In der Primärstruktur zeigen das IL-12 und das IL-18 allerdings keine Übereinstimmung. Ein separater Wirkungsort und –weg ist deshalb als wahrscheinlich anzunehmen [64]. Die Produktion von IL-18 durch die CD14+ Zellen ist ein weiteres Indiz dafür, dass die angezüchtete Population den Makrophagen sehr ähnlich ist. Eine Induktion von IFN-γ in der Kokultur kann aber nicht nachgewiesen werden. Diese vorgestellten Ergebnisse lassen auf zwei unterschiedliche APCs in unserem Abwehrapparat schließen: Die Makrophagen können dabei als Effektorzellen gelten, während die DC mehr regulatorische Aufgaben zwischen dem unspezifischen und dem spezifischen Immunsystem wahrnehmen. Erstgenannte Zellen phagozytieren eingedrungenes Ag und zerstören es sofort. Anschließend unterliegen sie dem programmierten Zelltod. Die apoptotisch gewordenen Zellen mit dem darin zerstörten Ag werden von den DC aufgenommen, fragmentiert und über die Oberflächenmoleküle 5 Diskussion 66 ______________________________________________________________________ MHC Klasse I und II präsentiert [67, 68]. Dadurch werden T-Zellen angelockt und von den DC stimuliert. Durch die aktivierten T-Zellen kann dann eine spezifische Immunantwort ausgelöst werden (Abb. 21). Eingedrungenes Antigen Phagozytose Makrophage programmierter Zelltod Apoptotischer Makrophage T T Phagozytose T Aktivierte T-Zellen T T T T T Unreife DC Reife DC T T Ag-Präsentation Abbildung 21: Aufgaben der unterschiedlichen APC im Immunsystem. Die Makrophagen fungieren als Effektorzellen. Dabei phagozytieren sie eingedrungenes Ag und zerstören es direkt. Die DC üben dagegen regulatorische Aufgaben aus, indem sie die apoptotischen, mit Ag-beladenen Zellen aufnehmen, den T-Zellen präsentieren und sie dadurch aktivieren. 5 Diskussion 67 ______________________________________________________________________ 5.4 Der Einfluss von viralen Stimuli auf die Subpopulationen Viren können das Immunsystem in unterschiedlicher Weise beeinflussen (1.2). Deshalb ist auch die immunmodulierende Wirkung von RSV und Poly-I-C auf die angezüchteten Zellen untersucht worden. Die eingesetzte Substanz Poly-I-C ist dabei ein synthetisch hergestelltes Molekül, das eine Doppelstrang-Ribonukleinsäure (dsRNA) imitiert. Es zeigt funktionelle Verwandtschaft mit dem Influenzavirus und induziert eine Th1Antwort [9]. RSV hingegen spielt eine wichtige Rolle bei der Modulation einer Th2Antwort. Hinsichtlich der Infizierbarkeit inkorporieren die CD14+ Zellen die höchste Menge RSV. Im Kontrast dazu stehen insbesondere die CD1a+ Zellen, die nur eine verminderte Virusaufnahme zeigen. Das Oberflächenmolekül CD14 scheint dabei eine entscheidende Rolle zu spielen. Diese Annahme bestätigt auch die Theorie von KurtJones und Mitarbeitern: Sie haben gezeigt, dass der Makrophagenmarker CD14 als Angriffsmolekül für das RSV-Fusionsprotein (F-Protein) dient [69]. Das Virus kann folglich nur an Zellen, die das Oberflächenantigen exprimieren, binden und in diese eindringen. Unter den gemessenen Oberflächen-Ag werden insbesondere für das CD86 und die MHC-Moleküle Veränderungen unter dem Einfluss der viralen Stimuli erreicht. Dabei wird der Co-Stimulationsfaktor CD86 sehr unterschiedlich je nach Subpopulation und Stimulus beeinflusst. Das HLA-DR wird dagegen unter Poly-I-C höher exprimiert, während es unter RSV herunter reguliert wird bzw. sich nicht verändert. Es wird vorwiegend auf den CD1a+ Zellen gefunden. Die erhöhte Expression des Ag unter Poly-I-C deutet dabei auf eine Zellausreifung hin, da das HLA-DR neben dem CD83 als wichtiger Reifemarker von DC gilt [31]. Außerdem ist die Beeinflussung und die Ausdifferenzierung der Zellen durch Poly-I-C bekannt [9]. Das Oberflächenmolekül HLA-ABC regelt dagegen die Überwachung und Verarbeitung von viralem Ag in der infizierten Zelle und ist somit nicht wesentlich vom dem Reifungsprozess betroffen [9]. Wie an den Befunden der vorgelegten Untersuchung gezeigt wird, wird es auf den heterogenen und den CD14+ Zellen unter beiden viralen Stimuli gleichermaßen vermehrt exprimiert, während die CD1a+ Zellen davon unbeeinflusst bleiben. Vermutlich ist dieses Phänomen auf die bessere Infizierbarkeit der heterogenen und der CD14+ Zellen im Vergleich zur CD1a+ Population zurückzuführen. Die Verteilung der 5 Diskussion 68 ______________________________________________________________________ beiden MHC-Moleküle auf den Subpopulationen lässt auch auf die unterschiedliche AgPräsentation und der damit verbundenen T-Zellaktivierung schließen. Über das MHCMolekül Klasse I werden vorwiegend zytotoxische CD8+ T-Zellen stimuliert, während das MHC-Ag Klasse II die CD4+ Th-Zellen aktiviert [70, 71]. Die infizierten Zellen exprimieren die Virusproteine im Zytosol, die zum endoplasmatischen Retikulum zur Prozessierung transportiert werden. Dort werden sie auf die HLA-ABC Proteine geladen und an der Zelloberfläche präsentiert. Dieser Mechanismus ist vor allem für die CD14+ Zellen denkbar, deren hohe Infizierbarkeit nachgewiesen wurde. Nach der AgPräsentation werden diese Zellen apoptotisch und werden von den DC über die Phagozytose aufgenommen. Die Virusproteine befinden sich somit in Vesikeln, wo sie zu Peptidfragmenten abgebaut werden und an die MHC Klasse II Proteine binden (Abb. 21). Unabhängig von der Art der Viruspräsentation findet die vermehrte T-Zellaktivierung unter den viralen Stimuli statt. Sowohl die mit Poly-I-C als auch die mit RSV behandelten Zellen induzieren eine erhöhte Zellteilung. Dieser Befund deutet auf eine aktive Induktion einer Immunantwort durch die geprüften Zellen hin. Eine ausgeprägte Abwehr speziell gegen RSV belegen auch die Ergebnisse zur Zytokinproduktion durch die angezüchteten Zellen. Es werden insbesondere hohe Werte für das PGE2 und das IL-11 unter RSV bei allen geprüften Subpopulationen gemessen. Die Menge der freigesetzten Zytokine ist dabei unabhängig von der Infizierbarkeit der Zellen. Es scheint also, dass auch schon kleinste Mengen des Virus eine intensive Reaktion bezüglich der Zytokinproduktion auslösen. Sowohl das PGE2 als auch das IL-11 spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion der Th2-Immunantwort [72] [73]. Das IL-11 gehört zu der Familie der Typ IL-6 Zytokine. Die in dieser Gruppe zusammengefassten Zytokine bewirken ähnliche Funktionen und nutzen gp130 in ihrem Rezeptorkomplex [74, 75]. Unter dem Einfluss von respiratorisch-pathogenen Viren, wie RSV, wird eine vermehrte IL-11 Sekretion beobachtet. Diese geht von den Fibroblasten der Lunge und von den Alveolarepithelzellen Typ II aus. Außerdem können auch im Nasensekret bei einer Infektion erhöhte Werte für IL-11 festgestellt werden. Es besteht eine Korrelation zwischen der Konzentration des Zytokins und der klinischen Symptomatik. Der genaue Wirkungsmechanismus dafür ist noch nicht geklärt. Trotzdem erscheint eine Mitwirkung von IL-11 bei der Pathogenese von virusinduzierten Atemwegserkrankungen wie Asthma bronchiale als wahrscheinlich [76]. Das PGE2 inhibiert die Produktion von IL-12 und induziert dadurch eine Th2- 5 Diskussion 69 ______________________________________________________________________ Immunantwort. Außerdem trägt es als Co-Faktor zu IL-1β und TNF-α zur Ausreifung von DC bei [77]. Durch die erhöhte Produktion von IL-11 und PGE2 wird somit die Annahme bekräftigt, dass das RSV einen immunmodulierenden Effekt besitzt und die Auslösung einer Th2-Antwort begünstigt. 5.5 Methodendiskussion Die Zytokinmessungen wurden sowohl mittels ELISA als auch mittels Durchflusszytometer durchgeführt. Im folgenden soll auf die Besonderheiten dieser beiden Methoden, sowie auf deren Vor- und Nachteile eingegangen werden. Im ELISA-Test werden die Zytokine im Überstand gemessen. Dabei besteht die Gefahr, dass die Probe nicht vollständig frei von anderen Zellpopulationen ist. Fälschlicherweise können daher auch Zytokine, die nicht von der untersuchten Population produziert wurden, nachgewiesen werden und zu überhöhten Messwerten führen. Andererseits ist es aber auch denkbar, dass die freigesetzten Zytokine durch ihre Liganden neutralisiert werden, wodurch sich die Messwerte verringern. Demgegenüber ist bei der Durchflusszytometrie eine Einzelzelluntersuchung möglich. Sie beruht auf der gleichzeitigen Analyse von Lichtstreuung und Fluoreszenzsignalen. Mit dieser Methodik können die Zytokinprodukte sehr genau einer Zellpopulation (T- Lymphozyten) zugeordnet werden. Bei beiden Messmethoden werden die produzierten Zytokine mit Ak markiert, welche bei der Durchflusszytometrie an einen fluoreszierenden Farbstoff und beim ELISA an ein Enzym gekoppelt sind. Über die Stärke des fluoreszierenden Farbstoffs bzw. über die Stärke der Enzymaktivität können Rückschlüsse auf die Menge der produzierten Zytokine gemacht werden. Die ELISA-Messergebnisse ermöglichen dabei eine genaue Quantifizierung der Zytokine in pg/ml. Bei der durchflusszytometrischen Analyse wird hingegen nur der Prozentsatz der Zellen bestimmt, der sich anfärben lässt, so dass lediglich eine semiquantitative Aussage erreicht wird. 5 Diskussion 70 ______________________________________________________________________ Darüber hinaus ist die Behandlung der Zellen vor der intrazellulären Zytokinmessung im Durchflusszytometer kritisch zu beurteilen: Die Ansätze können dann entweder mit einer Kombination aus PMA, Ionomycin und Monensin oder mit Brefeldin A aufbereitet werden. Beide Methoden zielen auf die intrazelluläre Anhäufung der Zytokine ab. Die Ergebnisse der Ansätze mit PMA, Ionomycin und Monensin entsprechen jedoch nicht einem physiologischen Zellmodell. So werden die T-Zellen dann zusätzlich stimuliert. Das PMA und das Ionomycin aktivieren dabei die Proteinkinase C durch irreversible Bindung; das Monensin ist ein Protein-TransportHemmer, der eine intrazelluläre Akkumulation der neu produzierten Zytokine im GolgiApparat bewirkt [78, 79]. Die Vorbereitung der Zellen mit dem Pilzmetaboliten Brefeldin A ist ein unter physiologischen Gesichtspunkten besseres in vitro-Modell zur Messung der intrazellulären Zytokine. Es blockiert ohne vorherige Stimulation den Proteintransport zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und akkumulieren die gebildeten Zytokine intrazellulär [80]. dem Golgi-Apparat. Dadurch 6 Zusammenfassung 71 ______________________________________________________________________ 6 Zusammenfassung: Dendritische Zellen (DC) erscheinen als die effektivsten antigen-präsentierenden Zellen (APCs) innerhalb des Immunsystems. In-vitro können sie aus Stammzellen unter den Wachstumsfaktoren GM-CSF + TNF-α angezüchtet werden, sind jedoch dann als heterogen bezüglich ihrer Oberflächenantigene CD1a und CD14 anzusehen. Ihr Phänotyp zeigt darüber hinaus noch weitere für DC untypische Merkmale. Das Entwicklungsniveau dieser Zellen, sowie die Effekte von Reifungsfaktoren und die immunmodulierende Wirkung von Respiratorischem Sycytial Virus (RSV) sollten deshalb in dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurden Stammzellen mit dem Oberflächenmarker AC133+ aus Nabelschnurblut von Neugeborenen isoliert und zunächst mit SF + GM-CSF + TNF-α inkubiert. Am 7. Tag wurden die Zellen geteilt und unterschiedlich mit den Zytokinen a) M-CSF, b) GMCSF + TNF-α oder c) GM-CSF + TNF-α + IL-4 restimuliert. Die Ansätze wurden anschließend für weitere 7 Tage kultiviert. Mittels Durchflusszytometer, ELISA und Proliferationsassay wurden die phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der Populationen bestimmt. Weiterhin wurden Untersuchungen in Kokultur mit naiven TZellen durchgeführt und der Effekt von RSV überprüft. Die heterogene Population zeigt dabei neben der gleichzeitigen Expression von CD1a und CD14 phänotypische und funktionelle Merkmale sowohl von DC, als auch von Makrophagen. Sie erscheint außerdem als instabile Population mit einer intensiven Zellteilungsrate. Durch die Modifikation der Kultivierungsmethode können jedoch homogene und stabile Zellpopulationen angezüchtet werden. Die Restimulation der Ansätze mit GM-CSF + TNF-α + IL-4 induziert dabei die Ausreifung von CD1a+ Zellen. Im Lichtmikroskop erscheinen diese Zellen unscharf begrenzt („veiled cells“). Sie exprimieren die Oberflächen-Ag CD40, CD80, CD86, CD83, CLA und die MHC-Moleküle Klasse I und II in hohen Konzentrationen. Funktionell zeigen sie eine starke Clusterbildung in der Kokultur und wirken als effektive Induktoren für die T-Zellstimulation. Die 6 Zusammenfassung 72 ______________________________________________________________________ Kultivierung der Zellen unter M-CSF induziert dagegen die Ausreifung von CD14+ Zellen. Diese zeigen eine große Phagozytoseaktivität und sind durch eine hohe Wasserstoffperoxydbildung charakterisiert. Eine T-Zellaktivierung ist demgegenüber nur in geringem Ausmaß nachweisbar. Auch die gemessenen Oberflächenmoleküle werden nur schwach exprimiert. Das RSV nimmt hinsichtlich der Infizierbarkeit, der Oberflächenantigene und der TZellstimulation überwiegend Einfluss auf die CD14 exprimierenden Zellen. Bezogen auf die spontane Zytokinproduktion wird bei allen Subpopulationen eine verstärkte Freisetzung von PGE2 und IL-11 unter dem Viruseinfluss nachgewiesen. Insgesamt weisen die Ergebnisse einerseits auf Unterschiede im Entwicklungsniveau der Zellen und andererseits auf phänotypisch und funktionell ungleiche Zelltypen hin. Dabei erweist sich die heterogene Population als unreife Zellpopulation. Die gleichzeitige Expression von CD1a und CD14 lässt eine Ausdifferenzierung in Richtung DC oder Makrophage noch offen. Diese kann jedoch durch die Zugabe von Reifungsfaktoren induziert werden: Unter IL-4 entwickeln sich DC, die regulatorische Aufgaben innerhalb des Immunsystems wahrnehmen; M-CSF induziert demgegenüber die Ausreifung von direkten Effektorzellen in Form von Makrophagen. Der Einfluss von RSV wird überwiegend durch das Oberflächenantigen CD14 bestimmt, das dem Virus als Bindungsstelle dient. Die Zytokinproduktion zeigt einen immunmodulierenden Effekt in Richtung einer Th2-Antwort. Literaturverzeichnis 73 ______________________________________________________________________ Literaturverzeichnis 1. Burmester GR, A P. Taschenatlas der Immunologie. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, 1998. 2. Mygind N, Dahl R, Pedersen S, K T-P. Essential Allergy. Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1998. 3. Boehm, U, Klamp T, Groot M, Howard JC. Cellular responses to interferongamma. Annu Rev Immunol 1997, 15, 749-95. 4. Billiau, A. Interferon-gamma: biology and role in pathogenesis. Adv Immunol 1996, 62, 61-130. 5. Choi, P, Reiser H. IL-4: role in disease and regulation of production. Clin Exp Immunol 1998, 113, 317-9. 6. Ryan, JJ. Interleukin-4 and its receptor: essential mediators of the allergic response. J Allergy Clin Immunol 1997, 99, 1-5. 7. Pavlovic, J, Arzet HA, Hefti HP, Frese M, Rost D, Ernst B, Kolb E, Staeheli P, Haller O. 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Seine vielfältigen praktischen und theoretischen Anregungen haben der vorliegenden Arbeit entscheidende Akzente verliehen. Weiterhin möchte ich mich bei Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel bedanken. Sie führten mich mit viel Geduld an die mir nicht vertrauten Labortechniken heran. Das immer freundliche Arbeitsklima und ihre uneigennützige Hilfsbereitschaft zu jedem Zeitpunkt erleichterten die Durchführung der Arbeit. Ein besonderer Dank gilt meinem Freund Claus Reinsberger, der mich jeder Zeit mit viel Geduld unterstützte und mich immer wieder ermutigte, die Arbeit weiterzuführen. Mein ganz persönlicher Dank aber gilt meinen Eltern, Barbara und Hans Büning-Pfaue, die mir meinen Werdegang überhaupt erst ermöglicht haben. Ihre Unterstützung in allen Belangen, gerade auch in schwierigen Phasen, gab mir den Rückhalt, meine Ziele zu erreichen. Danksagung 82 ______________________________________________________________________ Lebenslauf NACHNAME: Büning-Pfaue VORNAME: Friederike GEBURTSDATUM: 12.10.1975 GEBURTSORT: Moers BISHERIGER AUSBILDUNGSWEG August 1982 – Juli 1986 Gemeinschaftsgrundschule am Kreuzberg Bonn August 1986 – Juli 1992 Carl-von-Ossietzky-Gymnasium Bonn Juli 1992 – Dezember 1992 Mount Waverley Secondary College Melbourne (Australien) Schüleraustausch Januar 1993 – Mai 1995 Ernst-Moritz-Arndt-Gymnasium Bonn Abitur Mai 1995 Seit WS 1995/1996 August 1997 August 1998 Ruhr-Universität Bochum Medizinstudium Physikum 1. Staatsexamen September 1998September 1999 National University of Ireland, Galway Auslandsstudienjahr Seit WS 1999/2000 Ruhr-Universität Bochum Wiederaufnahme des Medizinstudiums
