Immunmodulation durch Staphylococcus aureus

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef-Hospital – Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Ch. Rieger
_____________________________
Immunmodulation durch Staphylococcus aureus-Superantigene
bei atopischer Dermatitis
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Cordula Koerner-Rettberg
aus Bochum
2001
1
Abstract
Koerner-Rettberg
Cordula
Immunmodulation durch Staphylococcus aureus-Superantigene bei atopischer Dermatitis
Problem: Die atopische Dermatitis (AD) ist eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung
mit vielschichtiger und noch nicht vollständig geklärter Pathogenese, bei der der
chronischen S. aureus-Besiedlung und insbesondere der damit verbundenen SuperantigenProduktion eine wichtige Rolle zugeschrieben wird.
Methode: Diese Arbeit untersuchte den Einfluß der Staphylokokken-Superantigene SEB,
SEA und TSST-1 in-vitro auf Allergie-relevante Parameter der humoralen und zellulären
Immunfunktion an peripheren mononukleären Zellen von Patienten mit atopischer
Dermatitis und gesunden Personen.
Ergebnis: Die S. aureus-Superantigene führten zu einer auch bei AD-Patienten stark
ausgeprägten T-Zell-Proliferation, einer Isotypen-unspezifischen Ig-Suppression, einer
CD23-Suppression (zumindest durch hohe und mittlere Toxinkonzentrationen) und einer
gleichzeitigen sCD23-Freisetzung. Diese Effekte waren bei PMCs im TH2-Milieu
(experimentelle IL-4-Gabe oder AD-Patienten) deutlich ausgeprägter und unterstrichen
damit ihre Relevanz für Atopiker. Die Superantigene induzierten weiter eine IFNγ-Antwort,
die die beobachteten Toxineffekte zum Teil zu vermitteln scheint, und die bei AD-Patienten
abgeschwächt verlief.
Die beobachteten Effekte erwiesen sich als abhängig von der Funktionsfähigkeit der Toxine
als Superantigene.
Diskussion: Die hier dargestellten Ergebnisse bieten ein Erklärungsmuster für den Beitrag
von Superantigenen in der Pathogenese der AD, indem sie den lokalen inflammatorischen
Prozeß der Haut unterstützen und in die Funktionsfähigkeit der Immunabwehr auf
humoralem und zellulärem Niveau eingreifen.
2
Dekan:
Referent:
Korreferent:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Prof. Dr. med. Ch. Rieger
Prof. Dr. med. S. Gatermann
Tag der Mündlichen Prüfung: 06.06.2002
3
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen
6
Verzeichnis der Abbildungen
8
1.
Einleitung
11
1.1
1.1.1
1.1.1.1
1.1.1.2
1.1.1.3
1.1.2
1.1.2.1
1.1.2.2
1.1.2.3
Immunologische Grundlagen der allergischen Immunantwort
IgE-vermittelte Immunantwort
biologische Eigenschaften des IgE
Regulation der IgE-Synthese
Funktion des IgE
FcεRII / CD23 und sCD23
biologische Eigenschaften von CD23 / sCD23
Regulation der CD23-Expression und sCD23-Bildung
Funktion des CD23 und sCD23
11
11
11
12
13
15
15
16
17
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
Atopische Dermatitis
Definition und Epidemiologie
Klinik der atopischen Dermatitis
Histopathologie der Haut bei atopischer Dermatitis
Immundysfunktion bei atopischer Dermatitis
Staphylokokkus aureus und atopische Dermatitis
20
20
21
21
22
26
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
Staphylokokken-Superantigene
Entdeckung der Superantigene
Struktur der Superantigene SEB, SEA und TSST-1
Immunologische Effekte der Superantigene
30
30
31
32
1.4
Ziel der Arbeit
35
2.
Material und Methoden
37
2.1
Charakterisierung der Blutspender
37
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
Zellkulturmethoden
Materialien
Zellisolation
Zellkulturbedingungen
Stimulationen
38
38
39
39
40
2.3
2.3.1
2.3.2
Radioaktiv-Markierung der Antikörper mit
Materialien
Methodik
2.4
2.4.1
Assays
Materialien
125
J
42
42
42
44
44
4
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
2.4.6
2.4.6.1
2.4.6.2
2.4.6.3
2.4.6.4
Proliferations-Assay
Immunglobulin-Assay
CD23-Assay
sCD23-Assay
Bestimmung der IFNγ-mRNA-Expression per PCR
RNA-Präparation
cDNA-Herstellung
DNA-Amplifikation (PCR)
Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA
45
45
47
48
48
48
50
51
51
2.5
Analyse der Daten
53
3.
Ergebnisse
55
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
Effekte von SEB und SEA auf PMCs gesunder Personen
versus AD-Patienten
Proliferation
Immunglobulinsynthese
CD23-Expression
sCD23-Freisetzung
55
55
57
66
70
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
Effekte von SEB/SEA und SEB-Peptiden
Proliferation
Immunglobulinsynthese
CD23-Expression
72
72
73
77
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
Effekte von SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
Proliferation
Immunglobulinsynthese
CD23-Expression
78
78
79
83
3.4
Einfluß von SEB auf die IFNγ-mRNA-Expression
84
4.
Diskussion
86
4.1
4.2
4.3
4.4
Proliferationsdaten
Immunglobulinsynthese
CD23-Expression / sCD23-Freisetzung
IFNγ-Synthese
87
93
100
104
5.
Zusammenfassung
107
6.
Literaturverzeichnis
110
Danksagung
132
Curriculum vitae
133
5
Abkürzungen
AD
atopische Dermatitis
Ag
Antigen
Ak
Antikörper
APC
Antigen-präsentierende Zelle
AS
Aminosäure
BBS
Borat-gepufferte Salzlösung
BSA
bovines Serumalbumin
CD
cluster of differentiation
CD23
niedrig-affiner IgE-Rezeptor
cDNA
komplementäre DNA (Desoxyribonukleinsäure)
CLA
cutaneous lymphocyte-associated antigen
ConA
Concanavalin A
cpm
counts per minute
DEPC
Diethylpyrocarbonat
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
Elisa
enzyme-linked immunosorbent assay
FcεRI
hochaffiner IgE-Rezeptor
FcεRII
niedrig-affiner IgE-Rezeptor (=CD23)
FCS
foetales Kälberserum
GIT
Guanidinisothiocyanat
H135
an Position 135 mutiertes TSST-1 (Histidin ? Alanin)
IFNγ
Interferon-gamma
IgE / A / G
Immunglobulin E / A / G
IL
Interleukin
IU
internationale Einheiten
kD
Kilodalton (Einheit für Molekulargewicht)
6
Mab
monoklonaler Antikörper
MBq
Megabecquerel (Einheit für Aktivität einer radioakt. Substanz)
MHC II-Komplex
Major histocompatibility complex Typ II
mRNA
Messenger-RNA (Ribonukleinsäure)
p17
rekombinantes Wildtyp-TSST-1
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PMC
periphere mononukleäre Zellen
PBS
Phosphat-gepufferte Salzlösung
PGE2
Prostaglandin E2
PHA
Phythämagglutinin
PWM
Pokeweed-Mitogen
RIA
Radioimmunoassay
sCD23
lösliches CD23
SCID
severe combined immunodeficiency
SEA
Staphylokokken-Enterotoxin A
SEB
Staphylokokken-Enterotoxin B
Taq
Thermophilus aquaticus
TBE-Puffer
Tris-Borat-EDTA-Puffer
TCR
T-Zell-Rezeptor
TGFß
Transforming growth factor ß
TNFα
Tumornekrosefaktor α
TSST-1
Toxic Shock Syndrome Toxin 1
Y115
an Position 115 mutiertes TSST-1 (Tyrosin ? Alanin)
7
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1
Proliferation von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEA,
Konzentrationsreihe 100ng/ml – 0,1fg/ml (Einzelspender)
Abb. 2
Proliferation von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEA,
Vergleich gesunder Personen versus AD-Patienten
Abb.3 a-c
53
54
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB oder SEA ± IL-4,
Abb. 3a: IgG-, Abb. 3b: IgA-, Abb. 3c: IgE-Synthese,
Kollektiv gesunder Personen (Abb. 3c stellt Kollektiv der
AD-Patienten mit dar)
Abb. 4 a-b
55-56
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB oder SEA ± IL-4
Abb. 4a: IgG-, Abb. 4b: IgA-Synthese; IgE-Synthese siehe
Abb. 3c, Kollektiv von AD-Patienten
Abb. 5
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB oder SEA,
Konzentrationsreihe 100ng/ml – 0,1fg/ml (Einzelspender)
Abb. 6 a-c
57
58
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB ± IL-4,
± Anwesenheit von anti-IFNγ-Ak,
Abb. 6 a: IgG-, Abb. 6 b: IgA-, Abb. 6 c: IgE-Synthese,
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 7 a-c
59-60
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB oder SEA ± IL-4,
± Anwesenheit von anti-IL-12-Ak,
Abb. 7 a: IgG-, Abb. 7 b: IgA-, Abb. 7 c: IgE-Synthese,
Kollektiv gesunder Personen
8
61-62
Abb. 8
CD23-Expression nach Stimulation mit SEB oder SEA ± IL-4,
Vergleich gesunder Personen versus AD-Patienten
Abb. 9
CD23-Expression nach Stimulation mit SEB ± IL-4,
SEB-Konzentrationsreihe 100ng – 0,1fg/ml (Einzelspender)
Abb. 10 a-b
63
64
CD23-Expression nach Stimulation mit SEB ± IL-4,
± Anwesenheit von anti-IFNγ-Ak,
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 11
Abb. 10 a: Darstellung des Gesamtkollektivs
65
Abb. 10 b: Aufschlüsselung nach Einzelspendern
66
sCD23-Freisetzung nach Stimulation mit SEB oder SEA ± IL-4,
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 12
sCD23-Freisetzung nach Stimulation mit SEB oder SEA ± IL-4,
Kollektiv von AD-Patienten
Abb. 13
68
Proliferation von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA,
SEB-Peptiden oder Mitogenen (Einzelspender)
Abb. 14 a-c
67
69
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB oder SEB-Peptiden ± IL-4,
Abb. 14a: IgG-, Abb. 14b: IgG-, Abb. 14c: IgE-Synthese
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 15 a-c
70-71
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB ± IL-4,
± Anwesenheit von SEB-Peptiden,
Abb. 15a: IgG-, Abb. 15b: IgA-, Abb. 15c: IgE-Synthese
(Einzelspender)
72-73
9
Abb. 16
CD23-Expression nach Stimulation mit SEB oder
SEB-Peptiden ± IL-4,
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 17
Proliferation nach Stimulation mit SEB, SEA,
TSST-1-Wildtyp oder TSST-1-Mutanten (3 Einzelspender)
Abb. 18 a-c
74
75
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB, SEA,
TSST-1-Wildtyp oder TSST-1-Mutanten ± IL-4,
Abb. 18a: IgG-, Abb. 18b: IgA-, Abb. 18c: IgE-Synthese
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 19 a-c
76-77
Ig-Synthese nach Stimulation mit SEB, SEA,
TSST-1-Wildtyp oder TSST-1-Mutanten ± IL-4,
Abb. 19a: IgG-, Abb. 19b: IgA-, Abb. 19c: IgE-Synthese (Einzelspender
AD-Patient)
Abb. 20
78-79
CD23-Expression nach Stimulation mit SEB, SEA,
TSST-1-Wildtyp oder TSST-1-Mutanten ± IL-4,
Kollektiv gesunder Personen
Abb. 21
IFNγ-mRNA-Expression nach Stimulation mit SEB, ± IL-4
und IL-2, 21a: 48 Std., 21b: 72 Std., Nicht-Atopiker
Abb. 22
80
81
IFNγ-mRNA-Expression nach Stimulation mit SEB, ± IL-4
und IL-2, 21a: 48 Std., 21b: 72 Std., AD-Patient
10
82
1. EINLEITUNG
1.1
Immunologische Grundlagen der allergischen Immunantwort
1.1.1 IgE-vermittelte Immunantwort
Die IgE-vermittelte Immunantwort entspricht der klassischen allergischen Sofortreaktion
Typ 1 nach Coombs und Gell (27). Ihr Mechanismus besteht in der Bildung Allergenspezifischer IgE-Antikörper, Bindung des IgE über sein Fc-Stück an bestimmte
Entzündungszellen (z.B. Mastzellen) und Überbrückung von mindestens 2 IgE-Molekülen
auf der Oberfläche der Zellen durch polyvalente Allergenmoleküle mit konsekutiver
Freisetzung von präformierten und neu synthetisierten Entzündungsmediatoren wie
Histamin, Serotonin und Leukotrienen durch Degranulation (69,89). Im Rahmen einer
allergischen Reaktion tritt häufig abgesehen von der frühen Sofortreaktion eine
Spätphasereaktion wenige Stunden bis 1 Tag nach Allergenkontakt auf, die als Folge der
allergischen Entzündungskaskade und Entzündungszellinfiltration zu werten ist.
1.1.1.1 Biologische Eigenschaften des IgE
Der IgE-Antikörper wurde erstmals 1967 von den Arbeitsgruppen von Ishizaka und
Johannsson beschrieben. Er ist wie die Immunglobuline der anderen Klassen ein
Glykoprotein aus 2 schweren und 2 leichten Polypeptidketten, wobei die schweren Ketten
neben 1 variablen Region 4 statt 3 konstante Domänen aufweisen und damit länger sind als
bei den anderen Immunglobulinen. IgE hat ein Molekulargewicht von 188.000 Da. Es liegt
immer als Monomer vor, hat keine Komplement-aktivierenden Eigenschaften und ist nicht
plazentagängig. Die Synthese von IgE geschieht in zu Plasmazellen ausgereiften B-Zellen
nach Isotypenswitch.
Mit dem Fc-Teil bindet das IgE-Molekül über hochaffine IgE-Rezeptoren (FcεRI) an
Mastzellen und Basophile, wo der Rezeptor in großer Dichte exprimiert wird, aber auch an
Eosinophile, Monozyten, Langerhans-Zellen, dendritische Zellen, bronchiale Epithelzellen
11
und Thrombozyten. Durch überbrückende Bindung von polyvalenten Allergenmolekülen an
das an seinen hochaffinen Rezeptor gebundene IgE kommt es zur Aktivierung und
Mediatorfreisetzung der entspechenden Zellen, was neben den oben genannten
proinflammatorischen Mediatoren auch die Freisetzung von die weitere Immunreaktion
modulierenden Zytokinen umfaßt (siehe auch Kap. 1.2.4). Es existiert weiter ein niedrigaffiner Rezeptor für IgE (FcεRII/CD23), der u.a. eine wichtige Rolle bei der IgERegulation spielt und auf den weiter unten im Kap. 1.1.2 eingegangen wird. Es besteht ein
Gleichgewicht zwischen freiem Serum-IgE und über Fc-Rezeptoren zellgebundenem IgE,
wobei das zellgebundene überwiegt. Das freie IgE wird in vivo schnell inaktiviert, an
Mastzellen gebunden kann es jedoch über Monate aktiv sein (68).
1.1.1.2 Regulation der IgE-Synthese
Gesunde Personen (Nicht-Allergiker) bilden nur sehr geringe Mengen an IgE; der IgESerumspiegel ist bei Neugeborenen niedrig bis nicht meßbar, steigt dann bis zum frühen
Schulalter auf ein Maximum an, wonach er dann wieder auf niedrige Werte um 30ng/ml
abfällt. Bei Patienten mit allergischen Erkrankungen findet man häufig erhöhte IgE-Werte,
allerdings nicht regelmäßig: Sie treten vor allem bei polysensibilisierten Allergikern auf.
Unter den atopischen Erkrankungen zeichnet sich die atopische Dermatitis durch besonders
hohe IgE-Serumspiegel aus (Serum-IgE meist > 350ng/ml, oft weit darüber), besonders
wenn weitere Symptome anderer atopischer Erkrankungen koexistieren (176).
Es besteht eine komplexe polygene Vererbung des Atopie-Risikos, wobei Merkmale wie
hohe IgE-Spiegel und die Bildung spezifischen IgEs jeweils getrennt vererbt werden (63).
Die IgE-Synthese wird durch komplexe Mechanismen gesteuert, die sowohl eine
Interaktion von T- und B-Zellen wie auch löslichen Mediatoren umfassen. Zur Induktion
einer IgE-Synthese durch B-Zellen (Isotypenswitch) ist neben der Anwesenheit von IL-4
oder IL-13 eine direkte T-B-Zell-Interaktion notwendig, wobei neben der Bindung des
TCR mit dem B-Zell-MHC II-Antigen-Komplex („kognate“, d.h. antigenspezifische
Interaktion) zusätzlich eine Interaktion des CD40-Liganden auf T-Zellen mit CD40 der BZellen stattfindet (44,160,2,88,66). Nach dieser Phase werden weitere Signale durch T-B-
12
Zellkontakt ausgetauscht (z.B. über CD28/B7-Interaktion. Eine dem IL-4 vergleichbare
Wirkung auf Differenzierung, CD23-Expression und IgE-Isotypenswitch bei B-Zellen
kommt dem IL-13 zu und ist IL-4-unabhängig (32,132), tatsächlich werden gemeinsame
Signaltransduktionswege beschritten. Allerdings konnte dem IL-13 keine dem IL-4
vergleichbare Wirkung auf T-Zellen (Expansion des TH2-CD4 +-T-Zellpools) nachgewiesen
werden.
Die IgE-Synthese wird weiter von der Ausprägung der T-Zell-Hilfe beeinflußt: Aktivierte
CD4 + T-Zellen unterscheiden sich anhand ihres Zytokinspektrums, wobei dieses zwischen
einer TH1-Antwort mit vorwiegender Produktion von IL-2 und IFNγ und einer TH2Antwort mit Produktion von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 als jeweilige Extremformen
variiert. In diesem TH1/2-Konzept führt die TH2-Antwort neben ihrem Einfluß auf
Effektorzellen wie Mastzellen, Basophile und Eosinophile zu einer Hochregulation der IgESynthese durch direkten Einfluß auf B-Zellen, aber auch durch Hemmung einer TH1Polarisierung von TH0-Zellen. Eine TH1-Immunantwort inhibiert entsprechend die
Entwicklung von TH2-Zellen (116,138,154). Das von APCs synthetisierte IL-12 ist
wiederum ein starker Stimulator der IFNγ-Synthese von T-Zellen, Promotor einer TH1Antwort und zeigt damit einen suppressiven Effekt auf die IgE-Synthese; die Bildung von
IL-12 wird wiederum durch IFNγ unterstützt (44,165).
Auch der niedrig-affine Rezeptor für IgE CD23 und sein Spaltprodukt sCD23 haben einen
modulativen Einfluß auf die IgE-Synthese. Hierauf wird in Kap. 1.1.2 eingegangen.
1.1.1.3 Funktion des IgE
Die physiologische Funktion des IgE ist noch nicht vollständig geklärt. Es wird vermutet,
daß sie unter anderem in der Infektionsabwehr gegen bestimmte Parasiten zu sehen ist,
welche starke IgE-Induktoren sind. So findet man eine ausgeprägte Eosinophilie und hohe
IgE-Spiegel bei Wurmerkrankungen, wobei die Eosinophilen und Gewebsmastzellen die
Effektorzellen darstellen, zumal die parasitären Gewebestadien sich aufgrund ihrer Größe
nicht zur Phagozytose eignen. Die Entwicklung der Eosinophilie ist hierbei T-Zell-abhängig.
Die Abtötung der Parasiten durch Degranulation der Eosinophilen und Mastzellen erfolgt
13
aber nicht nur IgE-vermittelt über Bindung des IgE an die zahlreich auf diesen Effektorzellen
vorhandenen IgE-Rezeptoren (FcεRI und FcεRII) (47), sondern ebenfalls IgG- und
komplementvermittelt.
Die IgE-vermittelte allergische (anaphylaktische) Reaktion ist demgegenüber als
überschießende Immunantwort und damit als pathologische – krankmachende –
Immunreaktion anzusehen. Sie ist gekennzeichnet durch die Freisetzung von
Entzündungsmediatoren wie Histamin durch IgE-besetzte Mastzellen und das Überwiegen
eines TH2-Zytokinspektrums (82,154). Auf die pathophysiologische Rolle des IgE bei der
atopischen Dermatitis wird weiter unten im Kap. 1.2.4 eingegangen. Neben den
Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis - allen voran der atopischen Dermatitis –
einerseits und den Parasitosen durch Helminthen andererseits gibt es noch weitere Zustände
mit erhöhtem IgE-Spiegel, denen man jedoch ebenfalls keine physiologische Rolle
beimessen kann: So ist ein erhöhter IgE-Spiegel auch bei einigen Lymphomen zu finden.
Auch
bei
der
Transplantatabstoßungsreaktion,
einigen
Nephritiden
und
Lebererkrankungen, einigen zellulären Immundefekten und insbesondere beim Hyper-IgESyndrom bestehen abnorm hohe IgE-Spiegel. Es handelt sich bei letzterem um eine
autosomal dominant vererbte Immunschwäche, die sich neben erhöhtem IgE und IgD durch
eine eingeschränkte Neutrophilen-Chemotaxis, verminderten Anteil an T-Gedächtniszellen,
eingeschränkte humorale und zelluläre Immunantwort auf Antigene und eine Eosinophilie
auszeichnet. Klinisch kommt es u.a. zu abszedierenden Staphylokokken-Infektionen,
häufigen Atemwegsinfektionen und – bemerkenswerterweise – zu einer juckenden
Dermatitis.
14
1.1.2 Niedrig-affiner IgE-Rezeptor Fcε RII/CD23 und sein lösliches Spaltprodukt
sCD23
1.1.2.1 Biol. Eigenschaften von CD23 / sCD23
Der niedrig-affine Rezeptor für IgE (FcεRII oder CD23) wurde erstmals 1975 in seiner
Eigenschaft als IgE-bindender Rezeptor von Lawrence et al. beschrieben, als spezifischer
Oberflächenmarker auf EBV-transformierten B-Zellen 1981 von Kintner et al. und als BZell-Aktivierungsmarker 1985 von Thorley-Lawson et al.. 1987 konnte gezeigt werden,
daß der B-Zelldifferenzierungsmarker CD23 und der niedrig-affine IgE-Rezeptor identisch
sind (9,182).
CD23 ist ein Membranprotein aus 321 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von
45kDa. Es liegt in 2 Formen vor, die mit Typ A und B bezeichnet werden und sich nur
durch 5 Aminosäuren in ihrer intrazytoplasmatischen Region unterscheiden (167). CD23
hat nur einen kurzen intrazytoplasmatischen Anteil mit 23 Aminosäuren, eine einzige
transmembranäre Domäne (20 AS) und einen langen C-terminalen extrazellulären Anteil
(277 AS).
Der extrazelluläre Bereich weist eine Region mit großer Homologie zu Lektinen auf, was
die Verwandtschaft des CD23-Moleküls mit anderen Adhäsionsmolekülen zeigt. Im
Gegensatz zu den anderen Fc-Rezeptoren gehört es also nicht zu der Superfamilie der
Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren. Diese Lektin-Region ist auch die Binderegion für
IgE. Da der intrazytoplasmatische Anteil des CD23 nur sehr kurz ist, ist es wahrscheinlich,
daß die Signaltransduktion noch zusammen mit anderen Molekülen stattfindet (31,88).
Die Typ A-Isoform des CD23 ist nur auf B-Zellen zu finden und wird von ihnen konstitutiv
exprimiert. CD23 ist hier ein früher Differenzierungsmarker der B-Zellen, da er nur auf
IgM/IgD-positiven Zellen zu finden ist und beim Isotypenswitch sowie beim Wandel von BZellen zu Ig-sezernierenden Plasmazellen verloren geht (81). Typ B kann auf zahlreichen
Zelltypen exprimiert werden (B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, Eosinophile, Thrombozyten,
Langerhans-Zellen, follikuläre dendritische Zellen, natürliche Killerzellen (5,26,31), dieses
jedoch nicht konstitutiv, sondern unter bestimmten Stimulationsbedingungen (siehe nächstes
Kap.).
15
Aus CD23 entstehen durch autokatalytische Abspaltung seine löslichen Spaltprodukte
sCD23 mit unterschiedlichen Molekulargewichten von 37 bis 12kDa (68).
1.1.2.2 Regulation der CD23-Expression und sCD23-Bildung
CD23 wird zum einen durch seinen Liganden IgE hochreguliert, was für alle potentiell
CD23-exprimierenden Zelltypen gilt. Hier handelt es sich aber nicht um eine aktive
Neusynthese von CD23, sondern eher um eine Verminderung der autokatalytischen
Spaltung zu sCD23 (30,79,104).
Demgegenüber ist IL-4 ein sehr potentes Zytokin mit CD23-hochregulierender Eigenschaft
durch CD23-Neusynthese, was zunächst für B-Zellen gezeigt wurde, aber auch die
anderen CD23-exprimierenden Zelltypen betrifft (81,84,130). Parallel kommt es zu einem
IgE-Anstieg.
Eine maximale CD23-Induktion ist durch Stimulation von B-Zellen mit IL-4 und
zusätzlichem B-Zell-aktivierendem Signal möglich, z.B. durch direkten Kontakt zu
aktivierten T-Zellen, LPS, oder Stimulation via CD40 oder CD72, unter diesen
Bedingungen erreicht die CD23-Expression ihr Maximum nach 2-3 Tagen (26,80).
Leukotrien B4 kann ebenfalls die IL-4-induzierte CD23-Synthese steigern (88). Auch IL-2
kann die CD23-Expression auf B-Zellen steigern, allerdings nicht so ausgeprägt wie IL-4;
durch IL-2 wird CD23 Typ A exprimiert, während IL-4 hauptsächlich Typ B hochreguliert
(38,130,179).
Die Regulation von CD23 auf B-Zellen unterscheidet sich von der auf den anderen
potentiell CD23-exprimierenden Zelltypen: IFNγ, welches für seinen IL-4-antagonistischen
Effekt bei der IgE-Synthese bekannt ist, supprimiert auch die IL-4-induzierte CD23Expression auf B-Zellen, ebenso Prostaglandin E2 (43) und TGF-ß. Die genannte IFNγWirkung wird aber nicht bei den anderen fakultativ CD23-exprimierenden Zellen
beobachtet: bei Langerhans-Zellen, Eosinophilen und Monozyten erhöht bzw. induziert
IFNγ sogar die CD23-Expression (6,169).
Die CD23-Regulation auf T-Zellen ist nicht vollständig geklärt, sie scheint aber ebenfalls
durch IL-4 induzierbar zu sein (31,179).
16
Die Spaltung von CD23 zu sCD23 wird durch IL-2, IL-4 und IFNγ gesteigert (38,79,84),
sie wird durch Bindung von IgE an CD23 gehemmt, da hierbei die Leucin-Spaltungsregion
stabilisiert wird (104,119).
Bei atopischen Erkrankungen ist die CD23-Expression auf B-Zellen deutlich erhöht und auf
T-Zellen, Monozyten, Langerhans-Zellen und Eosinophilen nachweisbar, während man bei
frisch isolierten peripheren mononukleären Zellen von Nicht-Atopikern nur CD23-tragende
B-Zellen findet (5,6,26,31). Ebenso ist die sCD23-Produktion im Serum von Atopikern
deutlich höher als bei Nicht-Atopikern, wo wenig oder kein sCD23 nachweisbar ist
(14,16). Des weiteren läßt sich bei AD-Patienten, nicht aber bei Nicht-Atopikern, in-vitro
durch Allergen-Stimulation die CD23-Expression auf B-Zellen, Monozyten / Makrophagen
und – in weitaus geringerem Maße – auf T-Zellen steigern (184).
1.1.2.3 Funktion des CD23 und sCD23
Die Funktionen von CD23 umfassen ein breites Spektrum von Zelladhäsion,
Antigenpräsentation, Wachstum und Differenzierung von B- und T-Zellen, Bewahren vor
Apoptose, Sekretion von zytotoxischen Mediatoren und Regulation der IgE-Synthese (10).
Zuerst wird auf die Rolle von CD23 als IgE-Rezeptor eingegangen:
Bei den unterschiedlichen Zelltypen, die CD23 exprimieren, liegt es auf der Hand, daß die
Funktion von CD23 abhängig von dem Zelltyp ist, auf der es exprimiert wird (10,180):
CD23 auf Makrophagen, Eosinophilen und Thrombozyten (Typ B-Isoform) mediiert die
IgE-abhängige Zytotoxizität synergistisch mit dem Komplementsystem durch Phagozytose
von IgE-besetzten Partikeln, IL-1- und TNFα-Sekretion und Superoxid-Bildung nach
Aktivierung der Effektorzellen durch Bindung von IgE-Polymeren an CD23 (180). Die
Rolle des CD23 in der Parasitenabwehr konnte durch die Demonstration der Lysefähigkeit
von Würmern bewiesen werden. Eine Expression von CD23 auf den Effektorzellen im
Rahmen der atopischen Dermatitis unterstützt somit IgE-vermittelt die lokale
Entzündungsreaktion.
17
Die Rolle des auf B-Zellen exprimierten CD23 besteht zum einen in einer effektiveren IgEabhängigen Antigenpräsentation an T-Zellen nach Typ A-CD23-vermittelter Endozytose
von löslichen IgE-Komplexen (31).
CD23 spielt außerdem eine wichtige Rolle in der IgE-Regulation: Durch Überbrückung von
mehreren CD23-Molekülen auf B-Zellen bei der Bindung von IgE-Immunkomplexen
kommt es zu einer Herunterregulation der IgE-Synthese im Sinne eines inhibitorischen
feedback-Signals (41,109,148). Dieses gilt aber nur für B-Zellen nach IL-4-Stimulation,
was dafür spricht, daß der CD23-Isotyp B diese supprimierende Funktion hat (31). CD23
kann aber unter bestimmten Bedingungen auch eine B-Zell-Proliferation induzieren, was
wahrscheinlich von unterschiedlichen Signaltransduktionswegen der beiden Isoformen A
und B abhängt (103).
Die Rolle des CD23 in der B-Zell-Differenzierung wird durch seine Lektin-Homologie und
fehlende Verwandtschaft zu den anderen Fc-Rezeptoren suggeriert. Tatsächlich ließ sich
ein weiterer von IgE unterschiedlicher natürlicher Ligand für CD23 (und sCD23) finden:
CD21, welches auf B-Zellen, T-Zellen und follikulären dendritischen Zellen exprimiert wird.
Durch Bindung an CD21 wird die IgE-Synthese gesteigert (3,10); dieses kann durch
Verstärkung des T-B-Zell-Kontaktes bei CD23-CD21-Bindung geschehen, aber auch TZell-unabhängig durch sCD23-Bindung an CD21 auf B-Zellen. Hierdurch wird die
Transkription von ε-Keimbahn-Produkten erhöht. Dieser Mechanismus der CD23-CD21Interaktion ist besonders für Atopiker relevant, da T-Zellen von Nicht-Atopikern kein
CD23 tragen und sCD23 sich in signifikanter Menge nur im Serum von Atopikern
nachweisen läßt.
Die Rolle von sCD23 ist vielgestaltig und zum großen Teil IgE-unabhängig. Zum einen wirkt
sCD23 als Differenzierungsfaktor für verschiedene Zellvorläufer und wird hierzu von Zellen
in Thymus und Knochenmark gebildet. Der Mechanismus ist wahrscheinlich eine
Apoptose-Hemmung und CD21-mediiert (10,31). Außerdem scheint sCD23 die
Makrophagen-Migration zu hemmen (40), und IgE-unabhängig die Histaminausschüttung
aus Mastzellen zu bewirken (31).
Weiter haben die sCD23-Fragmente über 25kDa eine IgE-steigernde Wirkung
(15,16,144), wobei es für den Mechanismus mehrere Möglichkeiten gibt: evtl. über
18
Bindung von sCD23 an IgE auf IgE-tragenden B-Zellen nach Isotypenswitch, auf jeden
Fall aber durch Bindung an CD21 auf B-Zellen (10).
Bindung von IgE an CD23 bewahrt CD23 vor Spaltung zu sCD23, wodurch
wahrscheinlich der negative Feedback-Mechanismus der IgE-CD23-Interaktion zu
erklären ist.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß CD23 eine wichtige Rolle in der
pathologischen Hochregulation der IgE-Synthese bei Atopikern spielt und zusammen mit
sCD23 die chronische Entzündungsreaktion und die hohen IgE-Spiegel der atopischen
Dermatitis aufrechterhalten kann: Neben dem steigernden Effekt von (s)CD23 auf die IgESynthese unterstützen CD23 und sCD23die Effektorfunktion der Eosinophilen,
Makrophagen und Mastzellen durch proinflammatorische Mediatorfreisetzung aus den
Entzündungszellen.
19
1.2
Atopische Dermatitis
1.2.1 Definition und Epidemiologie
Der Ausdruck „Atopie“ (griechisch Atopia = Ungewöhnlichkeit, Seltsamkeit) wurde zuerst
1923 von Coca und Cooke verwendet und bezeichnet heute den Zustand oder die
Fähigkeit erhöhter Bildung allergenspezifischen IgEs zusammen mit der klinischen
Manifestation der Typ-I Überempfindlichkeitsreaktion. Zu den atopischen Erkrankungen
gehören die atopische Dermatitis, das allergische Asthma, die allergische Rhinitis und
Konjunktivitis.
Die atopische Dermatitis ist eine mit starkem Juckreiz einhergehende entzündliche
Hauterkrankung mit akut-entzündlichen, chronischen oder chronisch-rezidivierenden
Verläufen.
Nach Hanifin u. Rajka bzw. für das Kindesalter modifiziert nach Sampson (53,141) wird
die Diagnose „atopische Dermatitis“ aufgrund einiger Symptome und Befunde gestellt, die
in 4 Hauptkriterien und eine Mehrzahl von Nebenkriterien zusammengefaßt sind: Die
Hauptkriterien umfassen 1. Pruritus, 2. chronischen oder chronisch-rezidivierenden Verlauf,
3. persönliche oder Familienanamnese für Atopie-Erkrankungen und 4. eine typische
Verteilung und Morphologie des Hautekzems. Zu den Nebenkriterien werden erhöhtes
Serum-IgE, positive Hauttest-Sofortreaktion, trockene Haut, Ichtyosis vulgaris, Keratosis
palmaris, tiefe Handlinien, unspezifische Hand- und Fußekzeme, infraorbitale DennieMorgan-Lidfalte, subkapsuläre Katarakte, Neigung zu Hautinfektionen, Verschlechterung
durch emotionelle oder Umwelteinflüsse, Dermographismus und frühes Manifestationsalter
gezählt.
Die Prävalenz der atopischen Dermatitis ist im Kindes- und frühen Erwachsenenalter am
höchsten; wobei sie sich häufig schon im Säuglingsalter manifestiert. Die Angaben zur
Prävalenz im Kindesalter liegen zwischen 10 und 20% (147) und zeigen eine steigende
Tendenz, was die atopische Dermatitis als eine der häufigsten Hauterkrankungen ausweist.
Eine genetische Prädisposition ist gesichert, eine jüngere Studie weist auf Regionen auf
20
Chromosom 13q und 5q als AD-assoziierte Genloci hin (4), es wird jedoch eine
multifaktorielle Vererbung angenommen (25).
1.2.2 Klinik der atopischen Dermatitis
Die Erstmanifestation der atopischen Dermatitis liegt meist in den ersten beiden
Lebensjahren. Die typischerweise betroffenen Hautareale sind in diesem Zeitraum Gesicht,
Rumpf und Streckseiten, unter Aussparung der Windelregion, später dominieren
Extremitätenbeugen und Handrücken. Typisch ist ebenfalls ein ausgeprägter Juckreiz der
betroffenen Regionen. Akute Hautläsionen zeichnen sich durch Rötung, Schwellung, ggf.
sogar Blasenbildung aus, durch Kratzeffekte entstehen hierauf nässende Erosionen mit
Krustenbildung, die bei bakterieller Superinfektion eitrig oder honig-gelb erscheinen. Im
subakuten und chronischen Stadium ist die Haut trocken, schuppig, mit vergröbertem
Hautrelief (Lichenifikation), verdickter Haut und ggf. juckenden Papeln. Zu weiteren
Stigmata der atopischen Dermatitis siehe oben (Kap. 1.2.1). Bei der Hälfte der betroffenen
Patienten besteht die Krankheit jenseits des 2. Lebensjahres fort. Symptome anderer
atopischer Erkrankungen (allergisches Asthma und allergische Rhinokonjunktivitis)
bestehen nicht selten zusätzlich oder werden im weiteren Verlauf entwickelt.
1.2.3 Histopathologie der Haut bei atopischer Dermatitis
Das histologische Bild der atopischen Dermatitis unterscheidet sich in der akuten
Krankheitsphase von dem des subakuten und chronischen Stadiums. Die akuten
Hautläsionen zeichnen sich durch ein Epidermis-Ödem (Spongiose) mit intraepidermalen
Vesikeln aus. Die Dermis weist Entzündungszellinfiltrate bestehend aus überwiegend
Lymphozyten auf, wovon wiederum der überwiegende Teil CD4+ TH-Zellen mit nur
geringem Anteil an CD8+ T-Zellen sind (99,183). Chronische Läsionen zeigen nur noch
wenig Ödem, hier dominiert eine hyperplastische Epidermis und Hyperkeratose. Das
zelluläre Infiltrat zeigt nun vor allem Makrophagen, daneben weiterhin einen hohen Anteil an
T-Zellen. Der Gehalt an epidermalen Langerhans-Zellen wie auch an Mastzellen und
21
Eosinophilen ist vermehrt (96,139,183). Interessanterweise weisen die Antigenpräsentierenden Zellen in der Epidermis bei atopischer Dermatitis (Langerhans-Zellen und
Makrophagen) auf ihrer Oberfläche gebundenes IgE auf, was bei Nicht-Atopikern nicht
gefunden wird (5,6,13). Ferner zeigen T-Zellen, die aus betroffenen Hautarealen bei akuter
atopischer Dermatitis isoliert wurden, eine ausgeprägte IL-4-Sekretion, aber nur sehr
geringe Sekretion von IFNγ, und entsprechen somit eher dem TH2-Subtyp (51,167).
Damit ist das Konzept des vorherrschenden TH2-Zelltyps bei atopischer Dermatitis nicht
nur für periphere mononukleäre Blutzellen, sondern auch für die Haut selbst belegt,
zumindest was akute Hautläsionen angeht. Dagegen weisen T-Zellen aus Hautbiopsien aus
chronischen AD-Läsionen eher ein TH0 / TH1-Zytokinspektrum mit signifikanter Produktion
von IFNγ und IL-12 und weniger IL-4 und IL-13 auf (48,172,178).
1.2.4 Immundysfunktion bei atopischer Dermatitis
Der der atopischen Dermatitis zugrundeliegende Pathomechanismus ist noch nicht
vollständig geklärt; es liegt wahrscheinlich eine Kombination von defekter zellulärer
Immunantwort, IgE-mediierter Typ-1 allergischer Immunreaktion und äußeren Faktoren
(z.B. durch Staphylokokkenprodukte) vor. Einen ersten Anhalt für die ätiologische
Bedeutung einer zellulären Immunschwäche ergab die Beobachtung, daß einige Patienten
mit
primären
T-Zell-Immunschwächen
hohe
IgE-Spiegel
und
ekzemartige
Hautbeteiligungen aufweisen, z.B. beim Wiskott-Aldrich-Syndrom oder Hyper-IgESyndrom, und daß die Übertragung einer atopischen Veranlagung bzw. Heilung einer
bestehenden atopischen Dermatitis durch Knochenmarktransplantation möglich ist (145).
Auch die Anfälligkeit der Patienten mit atopischer Dermatitis gegenüber viralen und
bakteriellen Hautinfektionen sowie gegenüber Hautpilzen weist auf einen zugrundeliegenden
T-Zelldefekt hin (52), ebenso eine eingeschränkte Kontaktsensibilisierung gegen
Dinitrochlorbenzen (135) verminderte T-Zell-Reaktivität auf Mitogene (75,76), ein
verminderter Anteil von CD8+ T-Suppressorzellen / zytotoxischen T-Zellen am Gesamt-TZellpool peripherer mononukleärer Zellen und im Hautinfiltrat (99,183) sowie der erhöhte
Anteil aktivierter hautspezifischer (CLA+) T-Lymphozyten im peripheren Blut von AD-
22
Patienten (35). Ein weiterer Aspekt einer pathologischen T-Zellfunktion bei AD besteht in
einer Dysregulation der Apoptose von T-Zellen mit gleichzeitiger Überexpression
antiapoptotischer Zytokine (127). Es wird ebenfalls vermutet, daß auch die erhöhte IgESynthese bei atopischer Dermatitis eine T-Zell-Dysregulation widerspiegelt: Zahlreiche
Studien haben sowohl für Atopiker allgemein wie für Patienten mit atopischer Dermatitis
gezeigt, daß ihre peripheren mononukleären Zellen überwiegend ein Zytokinspektrum des
TH2-Subtyps (s.o. Kap. 1.1.1.2) sezernieren (82,120,128,175), auch konnte demonstriert
werden, daß akute Hautläsionen von AD-Patienten vorwiegend allergenspezifische CD4+T-Zellen des TH2-Typs aufweisen (51,167). Allerdings scheinen chronische ADHautläsionen ein verändertes Zytokinprofil mit Dominanz des TH1-Spektrums aufzuweisen
(48,172,178). Die Zytokine des TH2-Spektrums führen zu einer weiteren Amplifikation der
TH2-Antwort und funktionellen Antagonisierung der TH1-Antwort (51,116,131). Die TH2Dominanz führt somit zu einem relativen Mangel an IFNγ und Unterstützung der IgESynthese sowie zur Differenzierung und Reifung von Mastzellen, Eosinophilen und
Basophilen. Auch konnte mehrfach gezeigt werden, daß periphere mononukleäre Zellen
von Patienten mit atopischer Dermatitis eine verringerte Fähigkeit zur IFNγ-Sekretion
haben bei erhöhter IL-4-Sekretion (73,82,107,136,140,162). Da IFNγ ja u.a. die
zytotoxische Aktivität von Makrophagen und natürlichen Killerzellen erhöht und die
Differenzierung von zytotoxischen T-Zellen fördert, könnte durch den IFNγ-Mangel auch
der verminderte Anteil an zytotoxischen T-Zellen und die Anfälligkeit gegenüber viralen,
aber auch bakteriellen und Pilz-Hautinfektionen bei Patienten mit atopischer Dermatitis zu
erklären sein (22).
Ein weiterer Effekt dieses TH2-Zytokinspektrums ist die Expression von CD23 auf
verschiedenen Zelltypen einschließlich T-Lymphozyten, wohingegen CD23 bei NichtAtopikern nur auf B-Zellen in geringerer Menge gefunden werden kann (siehe Kap.1.1.2).
Über die Interaktion dieser CD23-positiven T-Zellen mit CD21 auf B-Zellen kommt es
wiederum zur Steigerung der IgE-Synthese (3,10).
Obige Darstellungen zeigen also nicht nur den potentiellen Anteil einer defekten zellulären
Immunantwort an der Pathogenese der atopischen Dermatitis auf, sondern stellen auch den
Zusammenhang zwischen Auffälligkeiten der zellulären Immunität und der bestehenden
23
überschießenden IgE-vermittelten Immunantwort vom Soforttyp dar. Welchen Anteil die
IgE-vermittelte Immunantwort an der Pathogenese der atopischen Dermatitis hat, ist nicht
einfach zu sagen; jedoch sprechen einige Zusammenhänge für eine bedeutende Rolle: Zum
einen läßt schon die Tatsache, daß ein hoher IgE-Spiegel geradezu ein Charakteristikum
der atopischen Dermatitis ist, eine pathogenetische Rolle des IgE vermuten. (Ein erhöhter
IgE-Spiegel tritt bei 80-85% der Patienten mit atopischer Dermatitis auf, bei der atopischen
Dermatitis finden sich die höchsten IgE-Spiegel unter den atopischen Erkrankungen (176).
Des weiteren weist ein großer Teil der Patienten einen positiven Hauttest auf bestimmte
Allergene (vor allem Nahrungsmittel- und Inhalationsallergene) auf (142). Es ist eine
klinische Beobachtung, daß bei einem Teil der Patienten Allergenkontakt die Ausprägung
der atopischen Dermatitis verschlechtert und – bei Nahrungs-mittelallergie, die besonders
im frühen Kindesalter wichtig ist – sich die Relevanz der Allergene zu einem großen Teil in
einem oralen Provokationstest reproduzieren läßt (141,142). Auch Inhalationsallergene, die
ab dem Jugendlichenalter relevanter werden, können bei einigen Patienten den klinischen
Zustand der atopischen Dermatitis verschlechtern, sowohl über Eintritt via Atemwege als
auch über Applikation auf der Haut (173). Das Auftreten positiver Hautreaktionen vom
Soforttyp oder verzögertem Soforttyp spricht für das Vorhandensein spezifischer IgEAntikörper auf Mastzellen und Basophilen in der Haut von Patienten mit atopischer
Dermatitis und konsekutiver Mediatorfreisetzung nach Allergenbindung. Jedoch spricht die
nicht immer vorhandene Übereinstimmung zwischen positivem Prick- oder RAST-Test und
einer klinischen Relevanz dieser Allergene für eine Rolle des IgE unabhängig von IgEmediierter
Mastzelldegranulation.
Diese
Rolle
kann
in
der
Aktivierung
von
allergenspezifischen T-Lymphozyten in der Haut von AD-Patienten bestehen (134). Dieses
Konzept wird unterstützt durch den Nachweis von IgE-tragenden epidermalen LangerhansZellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis, jedoch nicht bei Nicht-Atopikern (5,13).
Der hochaffine Rezeptor für IgE (FcεRI) wird auf epidermalen Langerhans-Zellen von
Nicht-Atopikern und von Patienten mit atopischer Dermatitis und einigen anderen
entzündlichen Hautkrankheiten exprimiert, bei letzteren jedoch auf deutlich erhöhtem
Niveau (91). Der niedrig-affine IgE-Rezeptor (FcεRII, CD23) ist konstitutionell nur auf BZellen zu finden und wird nur unter bestimmten Stimulationsbedingungen (z.B. IL-4) auf
24
anderen Zellen, u.a. auch auf epidermalen Langerhans-Zellen exprimiert (6). Das über diese
beiden Rezeptoren gebundene IgE kann nach Allergen-Bindung internalisiert werden und
Allergenfragmente mit den zahlreichen MHC II-Komplexen der Langerhans-Zellen als sehr
potente Antigen-präsentierende Zellen den T-Lymphozyten dargeboten werden. Diese
Bedeutung der Langerhans-Zellen wird auch durch die Arbeiten von Mudde et al. und
Taylor et al. unterstützt (118,161), durch die gezeigt wurde, daß IgE-besetzte LangerhansZellen von Patienten mit atopischer Dermatitis - nicht aber Langerhans-Zellen ohne IgE - in
vitro Allergen binden können und dann autologe antigen-spezifische T-Zellen stimulieren
können.
Der niedrig-affine Rezeptor für IgE CD23 wird auch auf isolierten peripheren
mononukleären Zellen von Patienten mit atopischer Dermatitis verstärkt exprimiert und geht
mit erhöhtem IgE-Spiegel einher (31,88,89), was ebenfalls die Rolle des IgE in der
Pathogenese der atopischer Dermatitis unterstützt. Interessant ist in diesem Zusammenhang,
daß nach erfolgreicher Hyposensibilisierung die Allergen-induzierte CD23-Expression auf
B-Zellen parallel mit IgE-Spiegel abnimmt (74).
Auch das lösliche Spaltprodukt des niedrig-affinen IgE-Rezeptors sCD23 ist im Serum von
Atopikern deutlich erhöht nachweisbar; auf seine Rolle in der IgE-Regulation und IgEunabhängigen Entzündungsreaktion wurde bereits oben (Kap. 1.1.2.) eingegangen.
Weiter gehören eine Eosinophilie sowie eine verstärkte spontane Histaminfreisetzung aus
Basophilen zu den immunologischen Auffälligkeiten bei der AD.
Bei Atopikern wird ferner eine Stoffwechselstörung der Omega-6-Fettsäuren (Omega-6Desaturasemangel) immer wieder diskutiert (112), der zum einen eine defekte
Prostaglandin E-Synthese verursachen könnte, was wiederum eine Reifungsstörung von TLymphozyten im Thymus verursachen könnte, zum anderen für die defekte
Hautlipidbarriere bei atopischer Dermatitis verantwortlich sein könnte.
Neurovegetative Fehlfunktionen wurden häufig als ätiologische Faktoren der atopischen
Dermatitis genannt, und tatsächlich ist eine veränderte Reaktivität auf ß-adrenerge und
cholinerge Reize oft messbar und klinisch sichtbar (Reaktion auf Streß, paradoxe
Schweißreaktion, weißer Dermographismus). Jedoch gibt es zur Zeit keinen Anhalt dafür,
25
daß es sich hier um mehr als Epiphänomene handelt bzw. daß diese Beobachtungen
krankheitsspezifisch wären.
Neuere Untersuchungen haben eine Korrelation zwischen dem Auftreten genetischer
Varianten und der Atopie bzw. Asthma aufgezeigt. Insbesondere konnte eine Kopplung
zwischen Asthma und Atopie einerseits und Regionen auf dem Chromosom 5 (5q31)
andererseits nachgewiesen werden; diese Region wurde neuerdings auch als
Kandidatenlocus für eine Assoziation mit der AD beschrieben (4). Interessant ist hierbei,
daß diese Region für IL-13 kodiert. Außerdem wurde auch eine Assoziation von
Mutationen im IL-4-Rezeptor mit Atopie festgestellt (32,58), was wieder die Bedeutung
dieses TH2-Zytokin-Netzwerkes bei der Entstehung von atopischen Erkrankungen
unterstreicht.
Abgesehen von oben genannten Mechanismen sprechen viele Beobachtungen auch für eine
wichtige Rolle der Staphylokokken-Besiedlung im Rahmen der atopischen Dermatitis.
Hierauf wird im folgenden Abschnitt eingegangen.
1.2.5 Staphylokokkus aureus und atopische Dermatitis
Die chronische Besiedlung von betroffener als auch gesunder Haut von Patienten mit
atopischer Dermatitis ist ein typisches Merkmal dieser Hautkrankheit: Während ein
gesundes Personenkollektiv in seiner residenten Hautflora nur in ca. 5% der Fälle eine S.
aureus-Besiedlung zeigt, kann S. aureus bei über 90% der Patienten mit atopischer
Dermatitis auf der chronisch ekzemartig veränderten Haut und zu 70% auf nicht betroffener
Haut nachgewiesen werden. Außerdem ist die Keimdichte besiedelter Hautareale bei
atopischer Dermatitis deutlich höher (28,52,101).
Die Gründe für die hohe S. aureus-Besiedlung sind noch nicht vollständig geklärt: Es wird
die gestörte Integrität der betroffenen Haut mit verändertem pH, gestörter FettsäureSchutzschicht, Veränderungen in Talg- und Schweißsekretion diskutiert (46), außerdem
wurde eine gesteigerte Adhärenz von S. aureus an Epithelzellen der Haut von AD-Patienten
beobachtet (24). Insbesondere könnte eine gestörte zelluläre Immunität, wie sie ja für die
atopische Dermatitis angenommen wird, mit T-zellulärer Dysfunktion einschließlich
26
Überwiegens einer TH2-Antwort, und mit einer pathologischen Makrophagenaktivierung
(siehe Kap. 1.2.4) eine Rolle spielen.
Das Konzept, daß diese hohe S. aureus-Besiedlung bei atopischer Dermatitis nicht nur eine
Begleiterscheinung darstellt, sondern ätiologisch eine Rolle in der Unterhaltung der
chronischen Entzündungsreaktion der Haut spielt, wurde weiter dadurch gestützt, daß
beobachtet wurde, daß eine orale oder topische antibiotische Behandlung auch bei S.
aureus-Besiedlung (nicht Infektion) eine deutliche Besserung des Hautzustands mit sich
bringen kann (100). Des weiteren wurden in den 70er und 80er Jahren wiederholt
Untersuchungen bezüglich S. aureus-spezifischer Immunreaktionen bei Patienten mit
atopischer Dermatitis durchgeführt. Es fanden sich eine abgeschwächte Typ 4-Hautreaktion
auf gereinigte S. aureus Zellwandbestandteile sowie häufig spezifisches IgE gegen S.
aureus-Zellwandbestandteile, jedoch blieb die Relevanz dieser Ergebnisse bei gleichzeitig
hohem Gesamt-IgE und folglich hoher unspezifischer IgE-Bindung sowie fehlender
Korrelation zu Sofortreaktionen in Hauttests fraglich (52,55). Es konnte aber in der Folge
mehrfach gezeigt werden, daß bakterielle Produkte bei Patienten mit atopischer Dermatitis
die Histaminausschüttung von Basophilen erhöhen (72). Kürzlich wurde gezeigt, daß diese
Zellwandbestandteile bei AD-Patienten, aber nicht bei Gesunden eine IL-5-Sekretion
induzieren (108). Weitere Erkenntnisse ergaben die Untersuchungen von Neuber
(122,124), mit denen gezeigt wurde, daß sowohl hitzeinaktivierter S. aureus als auch
einzelne S. aureus-Zellwandbestandteile (Lipoteichonsäure und Peptidoglykan) in vitro die
humorale Immunantwort und CD23-Expression von peripheren mononukleären Zellen von
Patienten mit atopischer Dermatitis modulieren und unter bestimmten Bedingungen die IgESynthese und CD23-Expression erhöhen. Auch der Einfluß des von Staphylococcus aureus
produzierten Toxins Enterotoxin B wurde in diesem Rahmen an einer kleinen Patientenzahl
von 3 Patienten untersucht, wobei ein suppressiver Effekt auf die IgA- und IgG-Synthese
sowie CD23-Expression von Patienten mit atopischer Dermatitis gesehen wurde,
wohingegen die IgE-Synthese bei AD-Patienten nur bei Kostimulation mit IL-5 zu
supprimieren war (122).
Das Interesse an von Staphylokokken sezernierten Superantigenen und deren Rolle bei der
atopischen Dermatitis wurde verstärkt durch den Nachweis, daß ein hoher Anteil von S.
27
aureus-Isolaten von der Haut von Patienten mit atopischer Dermatitis tatsächlich
Superantigene sezerniert, und zwar vermehrt im Vergleich zu Isolaten von gesunden
Personen (1,18,110,126). Strange et al. konnten zeigen, daß die Applikation von S.
aureus-Superantigenen auf gesunde Haut von Patienten mit AD sowie auf Haut gesunder
Personen ein Erythem und Hautinduration hervorruft (156). Diese Beobachtungen wurden
insbesondere relevant, da die außerordentliche immunstimulatorische Potenz von
Superantigenen bekannt war: schon in kleinsten Mengen können sie eine große Anzahl von
T-Lymphozyten und Antigen-präsentierende Zellen in vitro aktivieren bzw. in vivo nach
Aktivierung zur Deletion führen und eine Sekretion von Entzündungsmediatoren wie IL-1,
IL-2 und TNFα induzieren (21,37,90,105). Dieses wäre somit ein Mechanismus, durch
den eine Exazerbation oder Perpetuierung der Entzündungsreaktion der Haut denkbar
wäre. Zur Untersuchung der Rolle von Superantigenen bei der atopischen Dermatitis wurde
in einer ganzen Reihe jüngerer Arbeiten das Vorkommen spezifischer IgE-Antikörper
gegen Staphylokokken-Superantigene untersucht (12,17,98,102,125,126159,185): Es
konnten bei einem Großteil der AD-Patienten mit positivem Nachweis von Superantigenproduzierenden S. aureus-Stämmen Toxin-spezifische IgE-Antikörper nachgewiesen
werden, die bei gesunden Personen mit S. aureus-Kolonisation extrem selten sind, und bei
Leung (98) sowie kürzlich Wehner (171) konnte auch eine Toxin-induzierte und Toxinspezifische IgE-vermittelte Histaminsekretion und Leukotrien-Freisetzung durch Basophile
bei AD-Patienten ausgelöst werden. Diese Untersuchungen beschreiben somit die Wirkung
der Toxine als Allergene und nicht als Superantigene. Dennoch scheint auch diese ToxinWirkung von funktioneller Relevanz zu sein, da die Histaminfreisetzung die lokale
Entzündungsreaktion verstärkt und zu Juckreiz führt. Dieses wird von einigen neueren
Arbeiten unterstützt, die eine Korrelation zwischen Superantigen-spezifischen IgEAntikörpern und Schwere der atopischen Dermatitis zeigte (12,18,126). Bei Zollner und
Tada (159,185) bestand jedoch diese Korrelation nicht, jedoch korrelierte hier die
Superantigen-Produktion auf der Haut mit der Schwere der atopischen Dermatitis und mit
dem Grad der T-Zell-Aktivierung.
Eine weitere die Relevanz von S. aureus Superantigenen in der Pathogenese der AD
unterstützende Beobachtung ist die Fähigkeit der Toxine, die Expression des Haut-homing-
28
Rezeptors CLA (cutaneous lymphocyte-associated antigen) auf T-Zellen im peripheren
Blut zu erhöhen (97). Tatsächlich konnte gezeigt werden, daß sich T-Zellen aus peripherem
Blut von AD-Patienten mit Superantigen-sezernierenden Staphylokokken-Stämmen von
denen von Patienten mit Toxin-negativer S. aureus-Besiedlung und von gesunden Personen
durch eine höhere CLA-Expression unterscheiden (164,185), was zur Einwanderung
aktivierter T-Zellen in die Haut von AD-Patienten und lokaler Aktivierung anderer
ortsständiger Zelltypen sowie Entzündungsmediatorfreisetzung führen mag und so die lokale
Entzündung der Haut weiter aggraviert. Hinweise darauf, daß diese Effekte Superantigenmediiert sind, wurden in jüngeren Studien dadurch erbracht, daß CLA+ T-Lymphozyten
aus peripherem Blut von AD-Patienten ein distinktes Toxin-spezifisches Vß-Repertoire
entsprechend der auf der Haut sezernierten S. aureus-Superantigene aufwiesen (29,157)
und weiter dadurch, daß intradermale T-Zellen von AD-Patienten mit Superantigensezernierenden S. aureus-Stämmen ebenfalls eine veränderte Toxin-spezifische VßExpression zeigten (18,153).
29
1.3
Staphylokokken-Superantigene
1.3.1 Entdeckung der Superantigene
Der Begriff „Superantigen“ als Charakterisierung bakterieller Toxine mit bestimmten
immunologischen Eigenschaften wurde erst vor etwas mehr als 10 Jahren, nämlich 1989
von Kappler und Marrack geprägt, nachdem der fundamentale Unterschied dieser Stoffe
zu herkömmlichen Antigenen und zu Mitogenen verstanden war. Dennoch ist die
außerordentliche Potenz bestimmter bakterieller Toxine, allen voran der von
Staphylokokken sezernierten Enterotoxine, schon länger bekannt. StaphylokokkenEnterotoxine (A-E) waren als häufige Auslöser einer akuten Lebensmittelvergiftung mit
Symptomen wie Übelkeit, Erbrechen, Fieber, Abgeschlagenheit und Durchfall bekannt.
Das Toxic Shock Syndrome Toxin 1 war als auslösendes Agens des Toxic Shock
Syndrome bekannt. Die Primärstruktur von Enterotoxin B (SEB) wurde als erstes der
Staphylokokken-Enterotoxine 1970 durch Bergdoll (65) aufgeklärt (siehe Kap. 1.3.2).
Bereits in den 70er Jahren konnte gezeigt werden, daß diese Exotoxine starke Stimulatoren
von Lymphozyten sind (129) und etwas später, daß es sich bei den proliferierenden Zellen
um T-Zellen handelt (92). Weiter wurde deutlich, daß nur minimale, um ein vielfaches
niedrigere Toxinmengen im Vergleich zu herkömmlichen Antigenen benötigt wurden, um
eine T-Zell-Proliferation auszulösen (92). Als Mechanismus, der die systemischen
Symptome der Lebensmittelvergiftung und – beim Staphylokokken-Toxin TSST-1 – des
Toxic Shock Syndrome verursacht, wurden bald die durch die T-Zellen in hoher Menge
ausgeschütteten inflammatorisch wirksamen Zytokine wie IL-2, IFNγ und TNFα vermutet
(21,37), dennoch war der eigentliche zelluläre und molekulare Wirkmechanismus, der die
außergewöhnliche T-Zell-Stimulationsfähigkeit der Toxine erklären könnte, noch nicht
bekannt. Erst Ende der 80er Jahre führten vor allem die Arbeiten der Gruppen von
Marrack, Carlsson, Janeway und Fleischer zur Aufklärung des Mechanismus: Es wurde
gezeigt, daß die Anwesenheit von Antigen-präsentierenden Zellen und speziell das Binden
der Toxine am MHC II-Komplex nötig ist, um eine T-Zell-Proliferation durch Enterotoxine
zu erzielen, so daß es sich bei den Toxinen nicht um Mitogene handelt. Anders als bei
30
herkömmlichen Antigenen müssen die Enterotoxine jedoch nicht zuvor durch APCs
prozessiert und als Peptidfragmente mit dem MHC II-Komplexes präsentiert werden,
bevor eine Erkennung durch T-Zellen erfolgen kann. Es erfolgt vielmehr eine direkte
Bindung der intakten Toxine an den TCR der T-Zelle einerseits und den MHC II-Komplex
der APC andererseits (39,42,115,174). Bald darauf wurde gezeigt, daß die Bindungsstelle
der Enterotoxine an den MHC II-Komplex nicht im Innern des Komplexes an der Antigenspezifischen Peptidbindungsstelle liegt, sondern außen am MHC II-Komplex liegt. Auch
am TCR binden die Toxine nicht an den Antigen-spezifischen Bindungsstellen der beiden
Ketten, sondern selektiv an einer Reihe von für das Toxin spezifischen variablen Regionen
der ß-Kette (Vß) (78,174). Diese Erkenntnis erklärte zum ersten Mal, warum die Toxine
eine so außergewöhnliche stimulative Potenz besitzen: Durch herkömmliche Antigene
werden nur die für sie spezifischen T-Zellen aktiviert, was pro Antigen auf weniger als 1 in
10.000 Zellen zutrifft. Der Bindungsmechanismus der Enterotoxine kann jedoch zu einer
Stimulation aller T-Zellen mit entsprechenden Vß-Strukturen führen und somit bis zu 20%
der T-Zellen eines Individuums erreichen. Aufgrund dieser Erkenntnis wurde von Kappler
und Marrack 1989 der Begriff der „Superantigene“ für Proteine mit dem wie oben
dargestellten Wirkmechanismus geprägt. Zu dieser Gruppe zählen mittlerweile neben den S.
aureus-Enterotoxinen A-E noch weitere bakterielle Produkte wie das S. aureus-Toxic
Shock Syndrome Toxin 1 (TSST-1), S. aureus-Exfoliativ-Toxin A und B und weitere
Toxine u.a. von Streptococcus pyrogenes, Mycoplasma arthritidis, Clostridium perfringens,
Pseudomonas aeruginosa und Yersinia enterocolitica (146).
1.3.2 Struktur der Superantigene SEB, SEA und TSST-1
Die Enterotoxine sind Moleküle mittlerer Größe, leicht basisch, reich an hydrophilen
Aminosäuren und haben miteinander gemeinsam, relativ hitzeresistent sowie resistent
gegenüber proteolytischer Spaltung zu sein. SEB war das erste der Superantigene, dessen
Primärstruktur aufgeklärt wurde (65). Es umfaßt 239 Aminosäuren bei einem
Molekulargewicht von 28.366 Da. Die Aufklärung der Primärstrukturen von SEA und
TSST-1 erfolgte später (7,66): SEA besteht aus 233 Aminosäuren bei einem
31
Molekulargewicht von 27.078 Da. Es besteht eine nicht unerhebliche Homologie zwischen
den Enterotoxinen, wobei SEA, SED und SEE einerseits sowie SEB und die SECMoleküle andererseits eine Gruppe von Molekülen mit großer Homologie bilden.
Interessanterweise
weisen
die
Enterotoxine
zwei
Bereiche
besonders
großer
Übereinstimmung auf: zum einen die Aminosäuresequenz von Position 100 zu 115 und zum
anderen von Position 142 bis 160 (105), was für eine besondere Bedeutung dieser
Regionen bei der Bindung zu den beteiligten Strukturen spricht. TSST-1 ist etwas kleiner
als die Enterotoxine; es umfaßt 194 Aminosäuren bei einem Molekulargewicht von 22.049
Da. Im Gegensatz zu SEB und SEA weist TSST-1 keine Disulfid-Brücke im mittleren
Bereich des Moleküls auf, die Homologie zu SEA und SEB ist mit ca. 45% geringer
ausgeprägt.
Die Sekundärstruktur der Enterotoxine ist durch ein Überwiegen von ß-Faltblattstrukturen
gekennzeichnet, daneben existiert auch ein kleiner Teil von α-Helices und aperiodischen
Bereichen (150,151,152).
Der Hohe Anteil an ß-Faltblattstrukturen erlaubt in der Tertiärstruktur, die zylindrische oder
Faßform hat, eine große Kontaktfläche der Moleküle nach außen.
1.3.3 Immunologische Effekte von Superantigenen
Mikrobielle Superantigene sind durch ihre Fähigkeit, große Anteile des peripheren T-ZellPools zu aktivieren, gekennzeichnet (siehe oben, Kap.1.3.1). Durch ihre nicht Antigenspezifische, sondern TCR-Vß-Subtyp-spezifische Bindung wird ein immens großes T-ZellRepertoire von bis zu 10-20% der gesamten T-Zellen eines Individuums erreichbar. Diese
Fähigkeit von Superantigenen, T-Zellen zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen,
wurde in vitro früh demonstriert (56,174). Die massive T-Zell-Stimulation resultiert in-vitro
in einer massiven Freisetzung von T-zellulären Mediatoren wie IL-2, IFNγ, TNFα und -ß
(21,37). Auch in-vivo konnte die Sekretion dieser Mediatoren nach SuperantigenStimulation im Mausmodell nachgewiesen werden (57,113), außerdem führen in-vivo
applizierte hohe Dosen von IL-2 und TNFα zu Schock-ähnlichen Symptomen und damit
zu einer dem von TSST-1 und anderen Toxinen ausgelösten Toxic Shock Syndrome
32
ähnlichen Klinik, was die Relevanz der in-vitro und in-vivo beobachteten Effekte
unterstreicht.
Jedoch wurde von White et al. 1989 erstmals das in-vivo-Phänomen der Superantigeninduzierten klonalen Deletion von praktisch allen T-Zellen mit Superantigen-spezifischer VßKette beschrieben, was die Induktion von Toleranz zu diesem Toxin bezüglich
nachfolgender Stimulationen zu Folge hatte (174). Es stellte sich somit die Frage, inwieweit
sich die in-vitro beobachteten Effekte (T-Zell-Stimulation) und die in-vivo ablaufenden
Mechanismen nach Superantigen-Kontakt unterscheiden. Superantigen-Stimulation in-vivo
induziert tatsächlich unterschiedliche Zellschicksale einschließlich Proliferation / T-ZellExpansion, Anergie-Induktion und Zelldeletion. Einer initialen 2-48 Stunden dauernden
hyperakuten Phase der Immunsuppression folgt eine Phase der Hyperreaktivität mit starker
Zytokinproduktion und massiver Expansion der Vß-spezifischen T-Zell-Population, hieran
schließt sich eine Phase der Anergie an, die durch verminderte IL-2-Produktionsfähigkeit
gekennzeichnet ist. Ein Teil der Toxin-reaktiven T-Zellen verschwindet dann aus der
peripheren Zirkulation durch klonale Deletion nach Herunterregulation der TCR-Expression
und Apoptose (90,137,170). Dieses Schicksal scheint hauptsächlich CD4 + T-Zellen zu
betreffen, CD8 + können den TCR re-exprimieren. Welchen Weg die einzelne Zelle
beschreitet, hängt wahrscheinlich von Einflüssen aus dem direkten Umfeld ab (67,78,114).
McCormack konnte in-vivo bei Mäusen zeigen, daß eine chronische SuperantigenExposition zu einer fast vollständigen Deletion aller T-Zellen mit entsprechenden VßRegionen führt, und dieses auch bei sehr geringen Toxin-Konzentrationen, die keine T-ZellProliferation auslösen konnten, wohingegen ein akuter Superantigen-Kontakt die
entsprechende T-Zell-Population nur zur Hälfte reduzierte (111). Andererseits zeigten
Arbeiten
an
AD-Patientenkollektiven
mit
nachgewiesenem
chronischen
Superantigenkontakt das Vorherrschen von Superantigen-spezifischen Vß-Repertoires bei
den T-Zellen aus Hautläsionen (18,153) und im peripheren Blut (29,121,157).
Weiter
wurde
gezeigt,
daß
in-vivo-Superantigen-Stimulation
einen
starken
immunsuppressiven Effekt hat. Dieser betrifft die zelluläre und humorale Immunantwort und
ist durch Induktion verschiedener T-Suppressor-Zellpopulationen mediiert (64,131,160).
Die gesteigerte Suppressor-Zell-Aktivität kann zu einer unspezifischen Suppression der
33
Immunglobulinsynthese führen (131,160), jedoch auch durch Induktion von B-ZellProliferation und Differenzierung zu Plasmazellen die Ig-Synthese steigern, was zumindest
in-vitro abhängig vom relativen T-B-Zellverhältnis ist (117). Außerdem lösen Superantigene
bei T-Zellen eine starke zellvermittelte zytotoxische Aktivität gegen Toxin-MHC IItragende APCs aus (33). Makrophagen und andere MHC II-exprimierende Zellen werden
durch Superantigene ebenfalls aktiviert und zur Sekretion von Zytokinen (IL-1, TNFα, IL12) angeregt (37,93,97).
Beim Vergleich der Potenz der Staphylokokken-Superantigene untereinander ist SEA der
potenteste T-Zell-Aktivator unter den Enterotoxinen. TSST-1 zeigt demgegenüber eine
etwas geringere T-Zell-Stimulationsfähigkeit (166).
Abgesehen von akuten durch Superantigene vermittelten Erkrankungen wie das Toxic
Shock Syndrom und die Lebensmittelvergiftung, die relativ gut verstanden sind, ist die
Bedeutung einer chronischen Superantigen-Exposition für das menschliche Immunsystem
noch
nicht
klar.
Verschiedene
Szenarien
werden
diskutiert:
So
könnten
Autoimmunerkrankungen durch Antigen-unspezifische Stimulation vieler T Zellen
einschließlich einiger autoreaktiver T-Zellen, die der Selbstkontrolle im Thymus entkommen
waren, ausgelöst werden. Ein weiterer denkbarer Mechanismus für das Auslösen von
Autoimmunerkrankungen besteht in der polyklonalen B-Zell-Aktivierung mit Agunspezifischer Steigerung der Ig-Synthese. Im Falle, daß der Ig-suppressive Effekt in-vivo
überwiegt, würde eine geschwächte humorale Immunabwehr resultieren. Ob die Deletion
großer Mengen von T-Zell-Klonen signifikante Lücken in die Antigen-spezifische
Immunantwort reißt, ist unklar. Durch die Superantigen-induzierte zytolytische Aktivität von
T-Zellen gegenüber APCs könnte die Immunabwehr ebenfallls beeinträchtigt werden.
Durch eine überschießende Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus T-Zellen und
MHC II-tragenden Zellen kann eine pathologische Entzündungsreaktion ausgelöst werden
(56,96). Auf die potentielle Rolle der Superantigene bei der atopischen Dermatitis im
speziellen wird gesondert in Kap. 1.2.5 und Kap. 4 eingegangen.
34
1.4
Ziel der Arbeit
Der Pathomechanismus der AD ist noch nicht vollständig geklärt; neben einer
pathologischen T-Zell-Funktion und einer Dysregulation der IgE-Synthese werden auch
äußere Faktoren wie die chronische Staphylokokken-Besiedlung bei AD-Patienten als
relevante Faktoren in der Pathogenese der atopischen Dermatitis diskutiert. Verschiedene
Punkte sprechen für eine Rolle von S. aureus-sezernierten Superantigenen bei der AD: S.
aureus-Stämme von der Haut von AD-Patienten produzieren wesentlich häufiger
Superantigene als die von Nicht-Atopikern (1,110,185), ein höherer Schweregrad der AD
korreliert mit der Toxin-Produktion (18,159,185) oder dem Auftreten Toxin-spezifischer
IgE-Antikörper (12,18,126). Weiter ist die außerordentliche immunstimulatorische Potenz
der Superantigene bekannt (siehe Kap. 1.3.3).
Die Erkenntnisse über den Effekt einer chronischen Superantigen-Exposition von Patienten
mit atopischer Dermatitis sind jedoch sehr begrenzt. In-vivo-Untersuchungen mit
Superantigenen an AD-Patienten sind aus ethischen Gründen nur eingeschränkt möglich.
Daher war es Ziel dieser Arbeit, in einem in-vitro Modell den Einfluß von S. aureus
Superantigenen auf die Immunantwort von peripheren mononukleären Zellen zu
untersuchen, dies unter besonderer Berücksichtigung des Vergleichs gesunder Personen,
d.h. Nicht-Atopiker, mit AD-Patienten. Zum einen sollte die Reaktivität der PMCs von
AD-Patienten auf Superantigene untersucht werden, da es zwar Daten über eine
verminderte Proliferationsfähigkeit nach Mitogen-Stimulation gab, die Datenlage zur
Stimulationsfähigkeit durch Superantigene jedoch dürftig und zum Teil widersprüchlich war.
Insbesondere sollten aber auch wichtige Bestandteile der allergischen Immunreaktion
untersucht werden, nämlich die IgE-Synthese und die Expression des niedrig-affinen
Rezeptors für IgE, CD23 sowie die Freisetzung seines löslichen Spaltproduktes sCD23.
Gerade über den Einfluß von Superantigenen auf CD23 / sCD23 lagen noch praktisch
keine Erkenntnisse vor, zum Einfluß auf die IgE-Synthese bei AD-Patienten besteht eine
spärliche und uneinheitliche Datenlage (62,86,95,122). Sowohl CD23 als auch sCD23 sind
an der IgE-Regulation beteiligt, die bei der atopischen Dermatitis pathologisch erhöhte
35
Werte aufweist, und sind selbst pathologisch hochreguliert. Des weiteren sollte der Einfluß
der Superantigene auf die generelle humorale Immunfunktion bei AD-Patienten untersucht
werden, um IgE-spezifische Effekte von Ig-Isotypen-unspezifischen Effekten unterscheiden
zu können und beurteilen zu können, ob es eine Atopie-spezifische generelle
Beeinträchtigung der humoralen Abwehr durch Superantigene gibt. Ein suppressiver Effekt
auf die humorale Abwehr bei Nicht-Atopikern war bereits beschrieben (131,160),
allerdings konnte auch eine Ig-Synthesesteigerung durch Superantigene unter bestimmten
Bedingungen demonstriert werden (117). Von Superantigenen ist bekannt, daß sie bei
Nicht-Atopikern eine starke IFNγ-Produktion induzieren (21,37), was ein klassisches
Zytokin der TH1-Antwort ist. IFNγ spielt weiter eine wichtige Rolle in der IgE-Regulation,
beeinflußt maßgeblich das TH1/TH2-Verhältnis und kommt als Mediator der im Rahmen der
Arbeit gesehenen Superantigen-Effekte wie CD23-Suppression und Ig-Suppression in
Frage. Auf der anderen Seite ist bei AD-Patienten aber eine eingeschränkte Fähigkeit zur
IFNγ-Produktion und Überwiegen einer TH2-Zytokinantwort im peripheren Blut bekannt
(73,82,107,136,162), so daß abschließend orientierende Experimente zum Einfluß von
Zytokinen auf die Toxin-Effekte und insbesondere zur Toxin-induzierten IFNγ-Produktion
zumindest an Einzelspendern untersucht werden sollten.
Erkenntnisse über die Rolle mikrobieller Superantigene bei der atopischen Dermatitis sind
wichtig für die Eröffnung neuer Therapien dieser noch nicht zufriedenstellend behandelbaren
Erkrankung und können Einsichten in pathophysiologische Zusammenhänge bei anderen
Hauterkrankungen eröffnen, bei denen ebenfalls eine Beteiligung von Superantigenen
vermutet wird.
Beispiele für neue Therapieansätze, die aus der immunologisch-allergologischen
Grundlagenforschung hervorgegangen sind, sind Entwicklung / Einsatz von anti-IgEAntikörpern, anti-IL-5-Antikörpern, löslichem IL-4-Rezeptor und die Hemmung der SEBinduzierten IL-12-Produktion und damit der Induktion CLA+ T-zellen durch
Phosphodiesterasehemmer Typ 4 (96,143).
36
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1
Charakterisierung der Blutspender
Das Kollektiv der gesunden Blutspender (d.h. hier: Nicht-Atopiker) wurde aus freiwilligen
Studenten oder Mitarbeitern der Ruhr-Universität aus der Cafeteria der medizinischen
Fakultät rekrutiert. Voraussetzung war das anamnestische Fehlen einer atopischen Diathese
oder Erkrankung aus dem atopischen Formenkreis (atopische Dermatitis, allergische
Rhinitis und Konjunktivitis, Asthma bronchiale, Nahrungsmittelallergie). Es wurde jeweils
200ml venöses Blut unter sterilen Bedingungen gewonnen. Die Gesamtzahl der gesunden
Spender einschließlich der Vorversuche belief sich auf 45.
Patienten mit atopischer Dermatitis wurden in Zusammenarbeit mit der Dermatologischen
Klinik des St. Josef-Hospitals, Universitätsklinik, Leitung Prof. Dr. med. P. Altmeyer,
rekrutiert. Die Patienten erfüllten die Diagnosekriterien für atopische Dermatitis nach
Hanifin und Rajka (53), nämlich eine chronische oder chronisch-rezidivierende Dermatitis,
Juckreiz, beugeseitige Lichenifikationen und eine positive Atopie-Anamnese. Sie erhielten
weder eine systemische noch topische Steroidbehandlung in den letzten 2 Wochen vor
Blutabnahme. Alter und Geschlecht waren beliebig. Die gewonnene Blutmenge betrug 5060ml venöses Blut. Das Kollektiv dieser Blutspender mit atopischer Dermatitis umfaßte 16
Personen.
37
2.2
Zellkulturmethoden
2.2.1 Materialien
- Ficoll-Metrizoat-Gradient:
Ficoll (Pharmacia, Freiburg) 9%ig
108ml
Metrizoat (Molter, Heidelberg)
20ml
Aqua bidest.
25ml
Dichte auf 1,075-1,078g/cm3 eingestellt,
Gemisch wird autoklaviert.
- Kulturmedium: RPMI-1640-Medium mit folgenden Zusätzen:
2mM Glutamin,
100µg/ml Streptomycin,
100IU/ml Penicillin,
10mM HEPES,
20mM Natriumhydrogencarbonat (alles von Gibco Europe Ltd.,
Karlsruhe)
Das Kulturmedium wurde in dieser Zusammensetzung als Waschmedium benutzt;
zur Kultivierung von Zellen wurde 10% FCS hinzugegeben (siehe unten).
- Fötales Kälberserum (FCS) (Seromed, München), 30min bei 56°C hitzeinaktiviert.
- PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung):
Herstellung der 20fach konzentrierten Stammlösung: KCl
4g
NaCl
160g
KH2 PO4
4g
Na2 HPO4
23g
ad 1 l aqua deion.
(pH 7,4, Leitfähigkeit 12-16mS/cm)
Vor Gebrauch Verdünnung 1.20 (50ml ad 1 l Aqua dest), pH 7,2-7,3
38
- Kulturplatten:
6-Loch- und 96-Loch-Platten (Nunc, Dänemark)
24-Loch-Platten (Costar Corp., Cambridge, MA, USA)
- 50ml-Falcon-Tubes (Becton-Dickinson UK Lim., Oxford, UK)
- Heparin-Lösung: Heparin (Sigma, Deisenhofen) 3000U/ml in PBS
- Türk'sche Färbelösung: (Essigsäure-Gentianaviolett, Merck, Darmstadt)
- Trypan-Blau 0,4% in physiol. Kochsalzlösung (Serva, Heidelberg)
- Giemsa- und May-Grünwald-Lösung (Merck, Darmstadt)
2.2.2 Zellisolation
Aus dem heparinisierten Spenderblut wurden die peripheren mononukleären Zellen durch
Ficoll-Metrizoat-Dichtegradientenzentrifugation wie folgt gewonnen (8):
200ml Blut (gesunde Spender) bzw. 50ml Blut (Atopiker) wurde unter sterilen
Bedingungen mit 1ml (3000 IU) bzw. 0,25ml (750 IU) Heparin-Lösung versetzt. Dieses
Blut wurde in 8 bzw. 2 Portionen a 25ml aufgeteilt, und mit jeder Portion wurde ein 10mlFicoll-Metrizoat-Gradient in 50ml-Falcon-Tubes vorsichtig überschichtet. Anschließend
wurde eine Zentrifugation für 45min bei 375g (4°C) durchgeführt, wonach sich die
mononukleären Zellen als opake lymphozytenreiche Interphase abschieden. Die Interphase
wurde vorsichtig abpipettiert und mit 3 Zentrifugationsschritten (1x 10min bei 375g, 2x
10min bei 170g (4°C) in Kulturmedium ohne FCS gewaschen. Nach dem letzten
Waschvorgang wurden die pelletierten Zellen in 10ml Kulturmedium resuspendiert, und aus
einem Aliquot wurde nach Anfärben mit Türk'scher Färbelösung die Zellzahl mikroskopisch
in einer Hämatocytometer-Zählkammer nach Neubauer bestimmt. Mittels Trypan-BlauFärbung wurde die Viabilität der isolierten Zellen geprüft.
2.2.3 Zellkulturbedingungen
Die isolierten peripheren mononukleären Zellen wurden in einer wasserdampfgesättigten
Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C kultiviert (Begasungsbrutschrank, Heraeus, Hanau).
39
Als Kulturmedium wurde RPMI-1640-Medium mit 10% FCS verwandt. Die Zelldichte
wurde auf 1x106 lebende Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt. Die Kultivierung wurde je nach weiterem Experiment - in 6-Loch-Platten (CD23/sCD23-Assay und ZytokinmRNA-Messung), 24-Loch-Platten (Immunglobulin-Synthese) bzw. 96-Loch-Platten
(Proliferation) durchgeführt; die Dauer der Kultivierung variierte ebenfalls je nach weiterem
Assay: 3-4 Tage für Proliferations-Assay, 3 Tage für CD23/sCD23-Assay, 10-12 Tage
für Immunglobulinsynthese-Assay, und 2 sowie 3 Tage für mRNA-Messung. Die jeweils
optimale Kultivierungszeit wurde zuvor in Zeitkinetiken für die einzelnen Assays bestimmt.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Proben geerntet, der Zellkulturüberstand
durch Zentrifugation bei 375g 10min (4°C) von den Zellen getrennt und - sofern nicht
sofort weiterverarbeitet - bei -20°C eingefroren.
2.2.4 Stimulationen
- Rekombinantes IL-2 wurde von Genzyme, München, bezogen und in einer Konzentration
von 50 U/ml eingesetzt.
- Rekombinantes IL-4 wurde zunächst von Genzyme, München, bezogen und in einer
Konzentration von 100 U/ml eingesetzt. Später wurde rIL-4 als Geschenk von Dr. W.
Sebald, Theodor-Boveri Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg, eingesetzt,
Konzentration 1nM. Diese IL-4-Konzentrationen waren ausreichend, um regelmäßig eine
IgE-Antwort und CD23-Expression bei Nicht-Atopikern zu induzieren.
- Neutralisierende polyklonale Ziege-anti-human-IL-12-Antikörper waren ein freundliches
Geschenk von Dr. S.F. Wolf, Genetics Institute, Cambridge, MA, USA,
eingesetzte Konzentration 1µg/ml.
-
Neutralisierende
polyklonale
Ziege-anti-human-IFNγ-Antikörper
wurden
von
Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA, bezogen, eingesetzte
Konzentration 1µg/ml.
- Die Mitogene PHA, ConA und PWM wurden von Sigma Chemical Co., München,
bezogen. In den Konzentrationen (PHA 1µg/ml, ConA und PWM 2µg/ml) war bei PMCs
gesunder Spender eine optimale Proliferationsantwort zu erzielen.
40
Die Hinzugabe der Zytokine bzw. Antikörper erfolgte jeweils zu Kulturbeginn gleichzeitig
mit der Toxin- bzw. Mitogen-Stimulation.
Toxine:
- SEB und SEA wurden von Sigma Chemical Co., München, bezogen. Die gewählten
Konzentrationen gehen aus den Daten im Ergebnisteil hervor. Von Konzentrationen über
100ng/ml SEA oder SEB wurde abgesehen, da es bei höheren Konzentrationen vermehrt
zu zelltoxischen Effekten kam (durch Trypan-Blau-Färbung nach Zellernte ermittelt).
- Die SEB-Peptide waren ein Geschenk von Dr. A. Wood, Nottingham, UK. Die Peptide
wurden per Peptidsynthese hergestellt. P1 enthält die Aminosäuren 21-32 des SEBMoleküls, P2 93-107 und P3 202-217. Diese 3 Octapeptide repräsentieren antigene
Determinanten des SEB-Moleküls, da sie mit Antiserum gegen natives SEB reagieren
(177).
- Rekombinantes TSST-1 (Wildtyp, p17) sowie die durch Gen-Punktmutation in jeweils 1
Aminosäure veränderten TSST-1-Proteine H135 (Austausch von Histidin zu Alanin an
Position 135) und Y115 (Austausch von Tyrosin zu Alanin) wurden freundlicherweise von
Dr. P.F. Bonventre, Department of Molecular Genetics, Biochemistry and Microbiology,
Cincinnati, Ohio, USA, zur Verfügung gestellt. Die Reaktivität mit einem neutralisierenden
monoklonalen
anti-TSST-1-Antikörper
war
bei
allen
Molekülen
erhalten,
im
Kaninchenmodell zeigte H135 nur 5-10% der Mitogenität des TSST-1-Wildtyps und keine
Toxizität, Y115 zeigte eine halb-maximale Mitogenität (11).
41
2.3
125
Radioaktiv-Markierung der Antikörper mit J
2.3.1 Materialien
- 0,02M Na-Phosphat-Puffer: NaHPO4 x 2 H2 O
NaCl
10,68g
26,30g
ad 3l aqua dest.
- Na- 125 J zur Markierung der Antikörper (Amersham-Buchler, Braunschweig),
spezifische Aktivität 520GBq/mg Jod.
- Chloramin T (Merck, Darmstadt) 1mg/ml:
20,00mg ad 20ml aqua dest.
- Natriumdisulfit 4,7mg/ml: Na2 S2 O5 94,00mg ad 20ml aqua dest.
- Rinderserumalbumin (BSA) (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, USA) 3%ig:
600,00mg ad 20ml aqua dest.
- Dialysepuffer Borat-gepufferte Salzlösung (BBS), 20fache Stammlösung:
NaCl
180,00g
Borsäure
6,10g
ad 1l aqua dest.
(Die Stammlösung wird zum Gebrauch 1:20 mit aqua dest. verdünnt. pH 7,2-7,3)
2.3.2 Methodik
Die für die Radioimmunoassays benötigten
125 J-markierten
Antikörper wurden nach der
Chloramin T-Methode (83) wie bei Bujanowski-Weber et al. (14) beschrieben hergestellt.
Sie beruht auf der durch Chloramin T katalysierten Substitution von Wasserstoffionen
durch Jod an aromatischen Ringen des Antikörperproteins und anschließender Entfernung
des ungebundenen Jods durch Dialyse.
Es wurden 0,1mg (1mg/ml) Antikörper mit 37 MBq Na125 J markiert, indem nach Zugabe
von 0,2ml (0,2mg) Chloramin T 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Nach
42
Hinzufügen von 0,2ml (0,94mg) Na2S2O3 wurde erneut 1 Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert, dann 0,6ml 3%ige BSA-Lösung hinzugegeben. Die Proteinlösung dialysierte dann
48 Stunden gegen 2x 1 l BBS-Puffer. Die spezifische Aktivität der Antikörper betrug etwa
0,3 MBq/µg Protein. Die Antikörper wurden bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
43
2.4
Assays
2.4.1 Materialien
- 3 H-Thymidin (Amersham-Buchler, Braunschweig) 37 MBq/ml,
verdünnt 1:50 zu einer Endaktivität von 7,4 kBq/10µl
- Glasfaser-Filterpapier (Dunn Labortechnik, Asbach)
- Tween 20 (Serva, Heidelberg)
- Rinder-Serumalbumin (BSA) (Boehringer, Mannheim)
- Waschpuffer: Phosphat-gepufferte Salzlösung (siehe 2.2.1) + 0,05% Tween 20
- 96-Loch-Mikrotiterplatten mit einsetzbaren Probengefäßen (Removawell,
Dynatech, Denkendorf)
- 96-Loch-Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp, Dänemark)
- Kimbel-Tubes (Greiner, Nürtingen)
IgE-RIA:
- affinitätschromatographisch gereinigte polyklonale Ziege-antihuman-IgE-Antikörper der Firma Tago, bezogen über Medac,
Hamburg
- IgE-Standard-Immunglobulin (Behring-Werke, Marburg)
IgG/A/M-RIAs:- polyklonale Ziege-anti-human-IgG-, IgA-, IgM-Antikörper (Jackson
Immuno Research, Dianova, Hamburg)
- IgG, IgA, IgM als Standard (Behringwerke, Marburg)
IgE-Elisa:
- monoklonale anti-human-IgE-Antikörper, Klone 4.15 und 7.12,
1:1-Mischung, freundlicherweise überlassen von Dr. A. Saxon,
University of California, Los Angeles, CA, USA
- IgE-Standard (Behring-Werke, Marburg)
- Ziege-anti-human-IgE-Antikörper, Phosphatase-konjugiert
(Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, Md, USA)
44
- P-Nitrophenylphosphat 1mg/ml (Sigma Chemical Co., München)
- Substrat-Puffer (0,15M Tris, 0,005M MgCl2 )
CD23-/sCD23-Assay: - Monoklonale anti-human-CD23-Antikörper (mab 135 und
mab 176), von Dr. Guy Delespesse, University of Montreal, Quebec,
Kanada, freundlicherweise zur Verfügung gestellt
2.4.2 Proliferations-Assay
Nach 3-4 Kulturtagen in 96-Loch-Mikrotiterplatten (Probenvolumen jeweils 200µl bei
einer eingestellten Zellkonzentration mononukleärer Zellen von 106 /ml) wurde die
proliferative Aktivität der Zellen durch 3 H-Thymidin-Einbau bei der DNA-Synthese
gemessen. Hierzu wurde 7,4kBq 3 H-Thymidin gelöst in 10µl Kulturmedium zu jeder Probe
gegeben und die Kulturen für weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden
mit einem Zellharvester (Skatron, Leerbyden, Norwegen) geerntet und auf GlasfaserFilterpapier fixiert. Der Filter wurde getrocknet und die einzelnen Filterplättchen der
Proben mit 3ml Scintillationslösung versetzt in einem Flüssigkeitsscintillationsmeßgerät (ßCounter, Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometer, 3255 Packard) gemessen. Die
Kulturen wurden jeweils in Triplikaten angesetzt und hieraus ein Mittelwert gebildet; die
gemessene Aktivität wurde in counts/min angegeben.
2.4.3 Immunglobulin-Assays
Der
Immunglobulingehalt
der
Zellkulturüberstände
wurde
mittels
Festphasen-
Radioimmunoassay bestimmt (84): 96-Loch-Mikrotiterplatten mit einsetzbaren losen
Probengefäßen (Removawell, Dynatech, Denkendorf) wurden für 4-16 Stunden mit 100µl
polyklonalem anti-IgE-, anti-IgG-, anti-IgA- oder anti-IgM-Antikörper (jeweils 1µg/ml,
verdünnt in PBS + 0,05% Tween) inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit Waschpuffer
(PBS + 0,05% Tween) wurde die freie Proteinbindungskapazität mit 1% BSA in
Waschpuffer 30min abgesättigt. Anschließend wurden die Probengefäße mit 100µl
Zellkulturüberstand für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Für die IgE-Messung
45
wurde der Kulturüberstand unverdünnt eingesetzt; während für die Bestimmung der
anderen Immunglobuline der Überstand 1:20 (und wenn nötig auch 1:40) verdünnt wurde.
Parallel zu diesen Proben wurden Standardkurven der entsprechenden Immunglobuline
mitangefertigt, indem IgE in 12 1:2-Verdünnungsschritten von 200ng/ml abwärts bis
0,2ng/ml und IgA/IgG von 300ng/ml abwärts bis 0,3ng/ml einschließlich PBS+TweenLeerproben pipettiert wurden. Nach weiteren 3 Waschschritten wurden je 100µl
125 J-
markierte anti-IgE-, anti-IgA-, anti-IgG oder anti-IgM-Antikörper (je 12,5ng mit einer
Aktivität von 3,7kBq bzw. 100.000cpm) aufgegeben und für 4 Stunden bei 37°C
inkubiert. Es folgten Waschschritte mit Waschpuffer, woraufhin die Probengefäße
getrocknet wurden. Die gebundene Radioaktivität konnte nun nach Herausnahme der
einzelnen Probengefäße aus der 96-Loch-Platte mittels Gamma-Counter (PackardCanberra Cobra, Packard-Canberra, Frankfurt) bestimmt werden. Die Nachweisgrenze
lag bei 0,8ng/ml für IgA/G und 0,4ng/ml für IgE. Alle Bestimmungen wurden in Triplikaten
durchgeführt. Die Spezifität der Assays wurde durch Zugabe von Immunglobulinen anderer
Isotypen nachgewiesen.
Da im Verlauf der Durchführung der Experimente der anti-human-IgE-Antikörper von
Tago / Medac nicht mehr erhältlich war, wurde auf ein ELISA-sandwich-Verfahren zur
IgE-Bestimmung übergewechselt:
96-Loch-Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp) wurden mit einer 1:1-Mischung der 2
monoklonalen anti-human-IgE-Antikörper mab 4.15 und mab 7.12 in einer Konzentration
von je 1µg/ml in 0,1M Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) über Nacht bei Raumtemperatur
vorinkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS + 0,05% Tween 20 wurden die freien
Proteinbindungsstellen mit PBS + Tween +0,5% BSA abgesättigt. Anschließend wurden je
100µl unverdünnter Zellkulturüberstand pro Loch aufgegeben und ebenfalls über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert. Parallel zu den Kulturüberständen wurde eine IgE-StandardVerdünnungsreihe aufgebracht, ebenfalls 100µl/Loch, ab einer Konzentration von 100ng/ml
absteigend in 12 1:2-Verdünnungsschritten in PBS+Tween 0,05%. Eine Leerprobe mit
PBS+Tween wurde außerdem mitgeführt. Nach erneuten Waschschritten wurde mit dem
Phosphatase-konjugierten anti-human-IgE-Detektionsantikörper (verdünnt 1:3000 in
46
PBS+0,05% Tween 20) 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach weiteren Waschschritten (3x
mit PBS-Tween, 3x mit Aqua dest.) wurde das Enzymsubstrat P-Nitrophenylphosphat
1mg/ml in 100µl Substratpuffer aufgegeben und nach 40min die Photoabsorbtion bei einer
Wellenlänge von 450nm gemessen (SLT-Labinstruments, Crailsheim). Die Nachweisgrenze
lag bei 0,2ng/ml. Alle Bestimmungen wurden als Dreifachbestimmungen durchgeführt.
2.4.4 CD23-Assay
Der monoklonale Antikörper mab 135 wurde wie auch der mab 176 (siehe unten) von Dr.
Guy Delespesse (University of Montreal, Quebec, Kanada) zur Verfügung gestellt. Beide
sind spezifisch für unterschiedliche Epitope des niedrig-affinen IgE-Rezeptors CD23 (133)
und seinen proteolytischen Spaltprodukten (45- und 25kD), den IgE-bindenden Faktoren
(sCD23).
Die Quantifizierung der CD23-Expression auf der Zelloberfläche der peripheren
mononukleären Zellen wurde wie bei Bujanowski-Weber 1989 (14) beschrieben
durchgeführt: Am Tag 3 der Zellkultur wurden die Zellen vom Kulturüberstand durch
Zentrifugation getrennt und die pelletierten Zellen in 500µl Kulturmedium mit 10% FCS
wiederaufgenommen. Ein kleines Aliquot wurde zur Zellzahlbestimmung (Türk'sche
Lösung) und Bestimmung der toten Zellen (Trypan-Blau-Färbung) abgenommen. Weitere
3x je 100µl der Zellsuspension wurden für 1 Stunde mit 100µl einer in PBS 1:200
verdünnten Lösung des radioaktiv markierten mab 135 inkubiert (50ng/200µl, 14,8kBq auf
1x106 Zellen). Die zellgebundenen Antikörper wurden von den freien Antikörpern mittels
Zentrifugation durch ein 500µl-FCS-Kissen abgetrennt, welches zuvor in schmale KimbelRöhrchen eingebracht worden war (Zentrifugation bei 500g, 10min, 4°C). Die Zellpellets
wurden weitere 3x mit PBS-Tween gewaschen und die zellgebundene Radioaktivität in
einem Gamma-Counter (Packard-Canberra Cobra, Packard-Canberra, Frankfurt)
gemessen. Die Ergebnisse wurden als prozentualer Anteil der Antikörper-Bindung an der
insgesamt eingesetzten Radioaktivität bestimmt und auf eine Zellzahl von 1x106 Zellen
berechnet.
47
Die Spezifität des Testsystems für CD23 wurde zuvor in mehreren Untersuchungen
sichergestellt (14).
2.4.5 sCD23-Assay
Die Bestimmung des sCD23-Gehaltes der Zellkulturüberstände wurde wie bei
Bujanowski-Weber
et
al.
1988
(14)
beschrieben
mit
einem
Festphasen-
Radioimmunoassay durchgeführt: 96-Loch-Platten mit einsetzbaren Probengefäßen
(Removawell, Dynatech, Denkendorf) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit je
100µl einer 1:1000-Verdünnung Mab 176 (1µg/ml) in 0,1mM Bicarbonatpuffer inkubiert.
Nach
3maligem
Waschen
mit
PBS+0,05%
Tween
wurden
die
freien
Proteinbindungskapazitäten der Plastikoberfläche mit PBS + 1% BSA abgesättigt (1
Stunde bei 37°C). Hiernach wurde eine Inkubation mit je 100µl der Zellkulturüberstände
für 16 Stunden bei Raumtemperatur angeschlossen, 3x mit Waschpuffer gewaschen und für
4 Stunden mit 100µl
125 J-markiertem
Mab 135 (12,5ng/100µl, 3,7kBq, 100.000cpm) bei
37°C inkubiert. Nach weiteren 3 Waschschritten zum Entfernen der ungebundenen
Radioaktivität wurde die in den Probengefäßen gebundene Radioaktivität einzeln im
Gamma-Counter gemessen. Die Ergebnisse wurden in Prozent der Bindung im Verhältnis
zur gesamten eingesetzten Radioaktivität angegeben.
2.4.6 Bestimmung der IFNγ-mRNA-Expression per PCR
2.4.6.1 RNA-Präparation
Materialien: Wenn nicht gesondert vermerkt, wurden die Chemikalien von Riedel de
Haen, Seelze, bezogen.
- Guanidinisothiocyanat (GIT)-Stammlösung:
Guanidinisothiocyanat (Sigma)
250g
aqua deion., steril
293ml
48
0,75M Natriumcitrat pH 7
17,6ml
N-Laurylsarkosin (Sigma)
26,4ml
Je 50ml dieser Lösung wurde vor der Verwendung 0,36ml ß-Mercaptoethanol
zugesetzt.
- Natriumacetat 2M, pH 4
- Phenol, H2O-gesättigt
- Chloroform / Isoamylalkohol (49:1)
- Isopropanol
- Ethanol (75% v/v) (alles Merck, Darmstadt)
- Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser: 0,1%w/v DEPC in aqua deion., autoklaviert
Vorgehen:
Die RNA-Präparation wurde nach Chomczynski und Sacchi 1987 (23) wie folgt
vorgenommen:
Am Ende der Kulturzeit (48 und72 Stunden) wurden die Zellen (ursprünglich eingebrachte
Zellzahl 5x106) mit 800µl stark denaturierender GIT-Lösung (s.o.) aufgenommen. Eine
saure Phenolextraktion zur Entfernung der Proteine und DNA wurde angeschlossen:
Zellhomogenat in 800µl GIT-Lösung
+100µl 2M Natriumacetat-Lösung, pH 4, schütteln,
+800µl wassergesättigtes Phenol, schütteln,
+200µl Chloroform / Isoamylalkohol (49:1), intensiv schütteln,
10 min auf Eis stehen lassen
zentrifugieren 20 min bei 13.000g, 4°C,
abnehmen der RNA-haltigen wässrigen Phase, ggf. auf 700µl mit GIT auffüllen
+700µl (1 Volumenanteil) Isopropanol, schütteln
1 Stunde bei –20°C stehen lassen
zentrifugieren 20 min bei 13.000g 4°C, Überstand dekantieren
Pellet 30 min trocknen lassen
in 300µl GIT-Lösung resuspendieren, 20 min stehen lassen
+300µl Isopropanol, schütteln
49
1 Stunde bei –20°C stehen lassen
zentrifugieren 10 min bei 13.000g, 4°C, Überstand dekantieren
Pellet 30 min trocknen lassen, in 1ml Ethanol 75%ig resuspendieren,
zentrifugieren 10 min 13.000g, 4°C, Überstand dekantieren, an Luft trocknen
RNA-Suspensionen mit DEPC-Wasser auf ein Volumen von 10µl auffüllen
Zur Kontrolle des Vorliegens vergleichbarer RNA-Mengen wurden 2µl-Aliquots in 500µl
DEPC-Wasser gelöst und der RNA-Gehalt photometrisch bei 260nm bestimmt.
2.4.6.2 cDNA-Herstellung
Die reverse Transkription von zellulärer RNA in DNA erfolgte in folgenden Ansätzen:
10x-PCR-Puffer (500mM KCl + 100mM Tris-HCl pH 8,3 2µl
25mM MgCL2
4µl
(5mM)
H2O
1µl
10mM dGTP
2µl
(1mM)
10mM dATP
2µl
(1mM)
10mM dCTP
2µl
(1mM)
10mM dTTP (Boehringer, Mannheim)
2µl
(1mM)
Reverse Transkriptase 50U/µl (Gibco BRL)
1µl
(2,5U/µl)
RNAse-Inhibitor 20U/µl (Pharmacia)
1µl
(1U/µl)
50µM oligo-dT10-16 (Sigma)
1µl
(2,5µM)
RNA-Lösung in H2O
2µl
----20µl
Die Ansätze wurden mit je 100µl Mineralöl überschichtet, um Verdunstung zu verhindern.
Nach 10 min bei Raumtemperatur vollzog sich die reverse Transkription bei 1stündiger
Inkubation im Heizblock bei 42°C. Nach Erhitzen für 10 min auf 65°C waren die Proben
bereit zur PCR.
50
2.4.6.3 DNA-Amplifikation (PCR)
Die DNA-Amplifikationsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
10x-PCR-Puffer (s.o.)
5µl
10mM dGTP
2µl
0,2mM
10mM dATP
2µl
0,2mM
10mM dCTP
2µl
0,2mM
10mM dTTP
2µl
0,2mM
1U/µl Taq-Polymerase (Gibco-BRL)
2µl
2U
15µM 5’-Primer
0,5µl
75pM
15µM 3’-Primer
0,5µl
75pM
DNA-Lösung:
5µl
Mit H2O ad 100µl
(d.h. +79µl H2O)
Die Proben wurden erneut mit Mineralöl überschichtet und die DNA-Amplifikation in
einem DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus) mit 30 Zyklen nach folgendem
Temperaturregime ausgeführt (für die Zytokinprodukte wie IFNγ lag die Zyklenzahl im
linearen Bereich der PCR-Reaktion):
1 Startzyklus: 5 min 94°C, 1 min 60°C, 2 min 72°C
29 Zyklen:
1 min 94°C, 2 min 60°C, 3 min 72°C
zuletzt
5 min 60°C
2.4.6.4 Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA
Materialien:
Proben-Puffer (Stammlösung, 5x konzentriert):
Ficoll 400 (Sigma)
20% (w/v)
Bromphenolblau (Merck)
0,25% (w/v)
Xylencyanol (Aldrich)
0,25% (w/v)
EDTA
0,02M
51
Agarose-Gel 2%ig:
TBE 5x
30ml
Agarose (Serva, Heidelberg)
6g (2%)
Ethidiumbromid (Sigma, Deisenhofen) 150µl (0,5µg/ml)
ad 300ml aqua deion.
Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer (Stammlösung, 5x konzentriert):
Tris
54g
Borsäure
27,5g
EDTA 0,5M
20ml
ad 1l aqua deion.
Vorgehen:
Je 20µl der Proben mit der DNA-Lösung wurden mit 5µl Probenpuffer versetzt, hiervon je
20µl im vorbereiteten 2%igen Agarose-Gel bei 100V und 50mA elektrophoretisch
aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde 0,5x TBE verwandt. Durch Ethidiumbromid wurden die
DNA-Banden sichtbar gemacht und anschließend photographiert.
ß-Actin wurde jeweils als Kontrolle mitgeführt. Als Marker-DNA zur Längenbestimmung
der Amplifikationsprodukte diente die 123 bp ladder, Bethesda Research Laboratories,
Detroit, USA. Weiter wurde die Spezifität der Amplifikationsprodukte durch ihre bekannte
Größe in Relation zueinander sichergestellt (IFNγ 501bp, ß-Actin 661bp).
52
2.5
Analyse der Daten
Alle Assay-Bestimmungen erfolgten in Triplikaten, aus denen der Mittelwert gebildet
wurde.
Die auf Spenderkollektiven beruhenden Daten sind bei ausreichend großer Fallzahl
wiederum als Mittelwerte mit ihrem Standardfehler angegeben. Bei geringem
Stichprobenumfang (n</=4) erfolgte die Darstellung jedoch aufgeschlüsselt nach
Einzelspendern. Der Umfang der Kollektive variierte zwischen n=3 und n=19 und ist
jeweils in der Legende einer Abbildung vermerkt.
Bei der Signifikanzanalyse der Ergebnisse wurde das Signifikanzniveau (Bereich für die
Größe des α-Fehlers) mit α=5% gewählt, d.h. ab p<0,05 wurde die Alternativhypothese
angenommen und von einer Signifikanz des beobachteten Effektes ausgegangen. Höhere
Signifikanzniveaus wurden ebenfalls, wenn erreicht, entsprechend gekennzeichnet (p<0,01
und p<0,001).
Aufgrund des Versuchsaufbaus und der Fragestellung handelte es sich bei der Mehrzahl der
auf Signifikanz zu prüfenden Daten um verbundene (paarige) Stichproben (z.B. ToxinEffekt gegenüber unstimulierten Kontrollen). Hier erfolgte die Signifikanzberechnung für
Stichproben mit einem Umfang von mindestens n=10 zunächst mit dem Student’s t-Test für
paarige Stichproben aufgrund seiner guten Trennschärfe. Voraussetzung für die
Anwendbarkeit dieses parametrischen Lagetests ist das Vorliegen einer normalverteilten
Grundgesamtheit. Dieses ist jedoch für die vorliegenden Meßwerte nicht bekannt; die
Beurteilung der einzelnen Stichproben ergibt lediglich eine annähernd symmetrische
Verteilung. Da der t-Test bezüglich des Vorliegens seiner Voraussetzungen sehr robust ist,
kann er jedoch auch bei Stichproben mit symmetrischer Verteilung und einander ähnlicher
Verteilungsform angewendet werden, sofern der Stichprobenumfang genügend groß ist (n
mindestens 10). Für die Signifikanzanalyse an den anderen Stichproben wurde primär der
Wilcoxon Rangsummentest für 2 verbundene Stichproben herangezogen. Seine
53
Voraussetzungen sind lediglich die Stetigkeit der Variablen und die symmetrische Verteilung
der Stichproben, was hier erfüllt ist.
Um eine einheitliche Bewertung der Daten zu ermöglichen, wurde der gegenüber dem
Student’s t-test konservativere Wilcoxon-Test schließlich bei allen Signifikanzanalysen für
verbundene (paarige) Stichproben angewendet. Alle im Ergebnisteil ausgewiesenen
Signifikanzen für verbundene Stichproben beruhen somit auf dem Wilcoxon-Test. Die
Ergebnisse der Signifikanzanalyse beider Tests unterschieden sich jedoch im wesentlichen
nur anhand des erreichten Signifikanzniveaus, welches im t-Test teilweise höher ausfiel.
Bei Stichproben mit einem Umfang n < 5 wurde aufgrund der geringen Fallzahl auf eine
statistische Analyse verzichtet und die Daten aufgeschlüsselt nach Einzelspendern
dargestellt.
Ein Teil der Daten verlangte eine statistische Analyse im 2-Stichprobentest für
unverbundene, d.h. unpaarige Stichproben, namentlich der Vergleich der Spenderkollektive
der AD-Patienten gegenüber den Nicht-Atopikern. Hier lagen meist unterschiedliche
Stichprobenumfänge vor. Für die Signifikanzanalyse bei dieser Fragestellung wurde der UTest nach Mann-Whitney angewendet, dessen theoretische Voraussetzungen lediglich die
Stetigkeit der Variablen ist, was natürlich hier erfüllt ist. Ein gleicher Stichprobenumfang,
ähnliche Standardabweichungen, symmetrische oder Normalverteilung sind nicht
vorausgesetzt.
54
3. ERGEBNISSE
3.1
Effekte von SEB und SEA auf PMCs gesunder Personen
versus AD-Patienten
3.1.1 Proliferation
Superantigene zeigen eine außerordentliche Potenz bezüglich der Stimulation von T-Zellen
und Induktion einer Proliferationsantwort, was ein Effekt des für sie spezifischen
Aktivierungsmechanismus von T-Zellen und MHC II-positiven Zellen ist. In den ersten
Experimenten ist der Zeitpunkt maximaler Proliferationsantwort von mononukleären Zellen
auf Superantigene und Mitogene durch serielle Proliferationstests untersucht worden. Es
stellte sich heraus, daß die Proliferationsantwort in den ersten Tagen ansteigt, nach 72-96
Stunden ihr Maximum erreicht und danach wieder abfällt. Daher wurde in den folgenden
Proliferationsuntersuchungen die Kulturdauer auf 72-96 Stunden festgelegt.
Wegen der außerordentlichen Stimulationspotenz, die allen Superantigenen eigen ist, wurde
anhand von Konzentrationsreihen untersucht, bis zu welcher minimalen EnterotoxinKonzentration ein Effekt in diesem Testsystem zu beobachten ist. Es zeigte sich eine
ausgeprägte proliferative Antwort bis in sehr niedrige Dosisbereiche (pg bis fg) hinein, der
Proliferationseffekt von SEB und SEA war im unteren Dosisbereich deutlich dosisabhängig.
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse eines beispielhaften Spenders. Die Toxine SEB und SEA
unterschieden sich nicht in ihrer Potenz. Bei Toxin-Dosen oberhalb 100ng/ml (Daten nicht
abgebildet) war ebenfalls eine Proliferationsantwort zu verzeichnen, jedoch zeigte sich in
der Trypan-Blau-Färbung eine Abnahme der Zell-Viabilität, was dafür spricht, daß im
Dosisbereich jenseits 100ng/ml SEB bzw. SEA zelltoxische Effekte zunehmend eine Rolle
spielen könnten. Daher wurden in folgenden Versuchen keine Konzentrationen über
100ng/ml verwandt.
55
SEB und SEA - Proliferation
Konzentrationsreihe
5000
4500
3H-Thymidin [cpm]
4000
SEB
SEA
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Abb. 1
0,1
fg/m
l
1fg
/ml
10f
g/m
l
100
fg/m
l
1pg
/ml
10p
g/m
l
100
pg/
ml
1ng
/ml
10n
g/m
l
100
ng/
ml
Ko
ntr.
0
Proliferation von PMCs eines beispielhaften Nicht-Atopikers, SEA- und SEB-Konzentrationen wie
angegeben.
Die nächsten Untersuchungen dieser Arbeit dienten dem Vergleich der Stimulierbarkeit
peripherer mononukleärer Zellen von gesunden Personen versus Patienten mit atopischer
Dermatitis durch die 2 Staphylokokken-Superantigene SEB und SEA. Die SEB-induzierte
Proliferation von PMCs wurde anhand ihres 3H-Thymidin-Einbaus bei 19 gesunden
Blutspendern und 6 AD-Patienten gemessen (Abbildung 2). Als Toxinkonzentration wurde
100ng/ml gewählt, da diese sicher im wirksamen Bereich bei noch unbeeinträchtigter
Zellviabilität liegt. Beim Vergleich von gesunden Personen mit AD-Patienten fand sich in
beiden Kollektiven nach einer Stimulation mit 100ng/ml SEB eine ca. 20fach gesteigerte
Proliferation ohne signifikanten Unterschied zwischen den beiden Spendergruppen. Die
proliferative Antwort auf 100ng/ml SEA wurde an 9 gesunden und 6 AD-Blutspendern
getestet. Auch hier fand sich ein eindrucksvoller und signifikanter Anstieg der Proliferation
nach SEA-Stimulation bei beiden Spendergruppen, ebenfalls ohne signifikanten
Unterschied zwischen den beiden Spendergruppen. Diesbezüglich ist auch interessant zu
56
bemerken, daß sich ebenfalls kein Unterschied in der „basalen“ Proliferation unstimulierter
peripherer mononukleärer Zellen beider Spendergruppen fand.
SEB, SEA - Proliferation
25000
gesunde Personen versus AD-Patienten
3H-Thymidin-Einbau [cpm]
20000
**
*
*
***
15000
gesunde Personen
AD-Patienten
10000
5000
0
unstim.
Abb. 2
SEB
unstim.
SEA
Proliferation von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides 100ng/ml), Vergleich AD-
Patienten mit Nicht-Atopikern, Mittelwerte ± Standardfehler aus 19 (SEB) bzw. 9 (SEA) Experimenten gesunder
Personen und aus 6 AD-Patienten. * p<0,05, ** p<0,01
Auffällig war außerdem die recht hohe interindividuelle Differenz in der Stärke der
proliferativen Antwort nach Superantigen-Stimulation, was sich in einer großen
Standardabweichung niederschlug. Bei einzelner Betrachtung der Spender war jedoch
festzustellen, daß zwar das Niveau des Proliferationsanstieges stark variierte, jedoch
ausnahmslos jeder Spender eine deutliche Proliferationsantwort auf die Superantigene
zeigte.
3.1.2 Immunglobulinsynthese
Parallel zur Proliferation wurde der Effekt der Superantigene SEB und SEA auf die in vitroImmunglobulin-Synthese (IgE, -A, -G) peripherer mononukleärer Zellen untersucht, dieses
ebenfalls vergleichend zwischen gesunden Spendern und AD-Patienten. Zeitkinetiken in
57
Vorversuchen ergaben ein Ansteigen der Immunglobulin-synthese bis Tag 10-14 der
Inkubationszeit, jedoch nahm am Tag 14 die Zellviabilität bereits ab, so daß die
Inkubationsdauer auf 10-12 Tage begrenzt wurde.
Abb. 3
3a: IgG-Synthese, 3b: IgA-Synthese (oben), und 3c: IgE-Synthese (auf der folgenden Seite), nach
SEB, SEA - IgG-Synthese
gesunde Personen
700
##
600
IgG [ng/ml]
500
400
300
200
**
**
**
SEB
SEA
**
100
0
unstim.
IL-4
IL-4 + SEB
IL-4 + SEA
SEB, SEA - IgA-Synthese
3000
gesunde Personen
2500
IgA [ng/ml]
2000
1500
1000
**
**
SEB
SEA
**
**
IL-4 + SEB
IL-4 + SEA
500
0
unstim.
IL-4
Stimulation mit SEB bzw. SEA (beides 100ng/ml), IL-4 100 U/ml, Mittelwerte ± Standardfehler aus 10
unabhängigen Experimenten gesunder Personen (Abb.3c zeigt zusätzlich AD-Pat.). * p<0,05, ** p<0,01 bezogen
auf Kontrolle ohne Toxin, # p<0,05, ## p<0,01 bezogen auf Kontrolle ohne IL-4
58
SEB, SEA - IgE-Synthese
gesunde Personen versus AD-Patienten
14
+#
12
IgE [ng/ml]
10
gesunde Personen
8
AD-Patienten
++
6
##
4
*
*
*
*
**
2
**
0
unstim.
Abb. 3c
SEB
SEA
IL-4
IL-4 + SEB
IL-4 + SEA
IgE-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides 100ng/ml), IL-4 100 U/ml,
Vergleich Nicht-Atopiker und AD-Patienten, Mittelwerte ± Standardfehler aus unabhängigen Experimenten bei 10
gesunden Personen und 6 AD-Patienten. * p<0,05, ** p<0,01 bezogen auf Kontrolle ohne Toxin, # p<0,05, ##
p<0,01 bezogen auf Kontrolle ohne IL-4, + p<0,05, ++ p<0,01 bezogen auf gesunde Personen
Bei der Untersuchung von 10 gesunden Personen (Abb. 3a-c) konnten sowohl SEB als
auch SEA in gleicher Weise die spontane IgG- und IgA-Synthese, d.h. die IgG- und IgASynthese von unstimulierten peripheren mononukleären Zellen, signifikant supprimieren. Bei
der spontanen IgE-Synthese der 10 gesunden Spender konnte kein Effekt durch die beiden
Superantigene festgestellt werden, jedoch lag die basale IgE-Synthese bereits –wie bei
Nicht-Atopikern zu erwarten- auf sehr niedrigem Niveau. Stimulation der mononukleären
Zellen gesunder Spender mit IL-4 führte zu einem signifikanten Anstieg der IgE- und IgGSynthese, nicht aber der IgA-Synthese. Eine Stimulation der Zellen mit SEB und SEA in
Anwesenheit von IL-4 resultierte in einer deutlichen, signifikanten Suppression aller 3
Immunglobulinklassen. Interessant hierbei war, daß im Gegensatz zur spontanen IgESynthese ein deutlicher signifikanter suppressiver Effekt der Toxine auf die IL-4-induzierte
IgE-Synthese zu verzeichnen war. Beim Vergleich von gesunden Personen versus ADPatienten (Abb. 3c und 4a-b) fiel auf, daß die basale IgE- und IgG-Synthese bei ADPatienten gegenüber der Gruppe gesunder Personen signifikant erhöht war. AD-Patienten
zeigten einen Anstieg der Immunglobulinsynthese nach IL-4-Stimulation der mononukleären
59
Zellen, jedoch war dieser für IgE und IgA, aber (bei bereits relativ hoher spontaner
Immunglobulin-Synthese) nicht für IgG signifikant.
SEB, SEA - IgG-Synthese
4500
AD-Patienten
+
+
4000
3500
IgG [ng/ml]
3000
++
++
2500
2000
1500
1000
*
**
**
500
*
0
unstim.
SEB
unstim.
SEA
IL-4
IL-4 +
SEB
IL-4
IL-4 +
SEA
SEB, SEA - IgA-Synthese
4500
AD-Patienten
##
4000
#
3500
IgA [ng/ml]
3000
2500
2000
1500
**
**
1000
*
*
500
0
unstim.
Abb. 4
SEB
unstim.
SEA
IL-4
IL-4 + SEB
IL-4
IL-4 + SEA
4a: IgG-Synthese und 4b: IgA-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides
100ng/ml), Mittelwerte ± Standardfehler aus 9 (SEB) bzw. 6 (SEA) unabhängigen Experimenten bei AD-Patienten
(IgE-Synthese siehe Abb. 3c auf vorangehender Seite). * p<0,05, ** p<0,01 bezogen auf Kontrolle ohne Toxin, #
p<0,05, ## p<0,01 bezogen auf Kontroole ohne IL-4, + p<0,05, ++ p<0,01 bezogen auf Nicht-Atopiker
60
Stimulation mit SEB oder SEA führte in der Gruppe der Atopiker zu einer deutlichen und
signifikanten Suppression der Immunglobulin-Synthese bis auf niedrige Niveaus
vergleichbar mit denen gesunder Personen nach Toxin-Stimulation. Der supprimierende
Effekt von SEB und SEA betraf also alle Immunglobulinklassen und wurde besonders bei
IL-4-kokultivierten PMCs und bei AD-Patienten deutlich. Ein Unterschied zwischen SEB
und SEA bezüglich ihres Effektes konnte nicht festgestellt werden.
Um festzustellen, ob der beobachtete suppressive Effekt dosisabhängig bezüglich der
eingesetzten Superantigen-Dosis ist, wurden die Toxine über einen ausgedehnten
Dosisbereich bis hinunter zu 0,1fg/ml auf ihre Fähigkeit zur Ig-Synthese-Modulation
getestet. Abb. 5 zeigt beispielhaft einen Einzelspender.
SEB - Immunglobulin-Synthese
600
Konzentrationsreihe
500
IgG
IgA
IgG / IgA [ng/ml]
400
300
200
100
Abb. 5
0,1
fg/
ml
1fg
/m
l
10f
g/m
l
10
0fg
/m
l
1pg
/ml
10p
g/m
l
100
pg/
ml
1ng
/ml
10n
g/m
l
100
ng/
ml
uns
tim
.
0
IgG- und IgA-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB in den angegebenen Konzentrationen bei
einem repräsentativen Nicht-Atopiker. IgE-Synthese nicht dargestellt, da nicht meßbar niedrig.
Analog zu den Proliferationsergebnissen wurde der Effekt der Superantigene, die IgSynthese zu supprimieren, bis in einen Konzentrationsbereich von 100fg/ml SEB
61
beobachtet. Abb. 5 zeigt die IgG- und IgA-Synthese eines Einzelspenders (NichtAtopiker), die IgE-Synthese ist hier nicht dargestellt, da sie nicht meßbar niedrig war.
Da der suppressive Effekt der Superantigene auf die Ig-Synthese bei IL-4vorstimulierten Zellen und bei Zellen von Atopikern - mit in der Regel erhöhtem Anteil einer
TH2-Fraktion – besonders ausgeprägt war, und da neben der IgE-Synthese auch die
CD23-Expression als weiterer Bestandteil einer durch ein TH2-Zytokinspektrum
induzierbaren allergischen Immunantwort betroffen war (auf die CD23-Expression wird
später eingegangen), sollte im Folgenden untersucht werden, ob der Toxin-Effekt der IgEund CD23-Suppression zum Teil durch Zytokine des TH1-Spektrums vermittelt ist. Dazu
wurden periphere mononukleäre Zellen mit SEB und SEA unter Hinzugabe von
neutralisierenden anti-human-IFNγ- und anti-human-IL-12-Antikörpern stimuliert (beide
1µg/ml). Abb. 6a-c (für anti-IFNγ-Aks) und 7a-c (für anti-IL-12-Aks) zeigen die
Ergebnisse.
SEB +/- anti-IFN-gamma
IgG-Synthese
800
700
ohne anti-IFN-gamma
mit anti-IFN-gamma
IgG [ng/ml]
600
500
*
400
*
*
*
*
300
*
*
*
200
100
Abb. 6
SE
B1
ng/
ml
IL-4
+
IL-4
+
SE
B1
00n
g/m
l
IL4
SE
B1
ng/
ml
SE
B1
00n
g/m
l
un
stim
.
0
6a: IgG-Synthese von PMCs ± IL-4 (1nM), nach Stimulation mit SEB in 2 Konzentrationen (100 und
1ng/ml), ± Anwesenheit von neutralisierenden anti-IFNγ-Aks (1µg/ml), Mittelwerte ± Standardfehler aus 5
unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern, * p<0,05 bezogen auf Kontrollen ohne Toxin.
62
SEB +/- anti-IFN-gamma
7000
IgA-Synthese
6000
IgA [ng/ml]
5000
ohne anti-IFN-gamma
mit anti-IFN-gamma
4000
*
3000
2000
* *
*
*
*
*
*
1000
SE
B1
ng/
ml
IL-4
+
IL-4
+
SE
B1
00n
g/m
l
IL4
SE
B1
ng/
ml
SE
B1
00n
g/m
l
uns
tim
.
0
SEB +/- anti-IFN-gamma
IgE-Synthese
10
ohne anti-IFN-gamma
mit anti-IFN-gamma
9
#
8
IgE [ng/ml]
7
6
5
*
4
*
*
*
*
*
3
2
1
Abb. 6
SE
B1
ng/
ml
IL-4
+
IL-4
+
SE
B1
00n
g/m
l
IL4
SE
B1
ng/
ml
SE
B1
00n
g/m
l
uns
tim
.
0
6b: IgA-Synthese, 6c: IgE-Synthese von PMCs ± IL-4 (1nM), nach Stimulation mit SEB in 2
Konzentrationen (100 und 1ng/ml), ± Anwesenheit von neutralisierenden anti-IFNγ-Aks (1µg/ml), Mittelwerte ±
Standardfehler aus 5 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern, * p<0,05, ** p<0,01 bezogen auf
Kontrolle ohne Toxin, # p<0,05 bezogen auf Kontrolle ohne IL-4
63
Weder die Anwesenheit von anti-IFNγ-Antikörpern noch von anti-IL-12-Antikörpern
konnte den suppressiven Effekt von SEB und SEA aufheben. Bei der spontanen IgESynthese kam es jedoch durch Zugabe von neutralisierenden anti-IFNγ-Antikörpern zu
einer diskreten Abschwächung des supprimierenden Toxin-Effektes, der nun bezogen auf
die Kontrolle ohne Toxin nicht mehr als signifikant nachweisbar war. Jedoch war kein
statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Toxin-stimulierten Proben mit / ohne antiIFNγ festzustellen. Auch bei einer niedrigeren SEB-Konzentration von 1ng/ml war die
Toxin-vermittelte Ig-Suppression nicht durch anti-IFNγ-Aks aufzuheben. Dieses galt für
alle 3 Immunglobulinklassen.
Wegen der geringeren Fallzahl (n=3) der Experimente mit neutralisierenden anti-IL-12-Aks
erfolgt die Darstellung dieser Ergebnisse aufgeschlüsselt nach den 3 Einzelspendern (Abb.
7a-c). Die Kokultivierung mit anti-IL-12-Aks (blaue Säulen) zeigte in allen 3 Ig-Klassen
keinen Effekt auf die Toxin-induzierte Ig-Suppression.
SEB, SEA +/- anti-IL-12
IgG-Synthese
1000
900
800
Spender 1
IgG [ng/ml]
700
Spender 2
Spender 3
600
500
400
300
200
100
Abb. 7
IL4+
ILSE
4+
A+
SE
A
an
ti-IL
-12
IL4+
IL4+
IL4+
SE
SE
B
B
+
an
ti-IL
12
IL4
an
ti-IL
-12
SE
A
an
ti-IL
-12
+
SE
A
SE
+a
B
ntiIL12
SE
B
un
stim
.+
un
stim
an
.
ti-I
L-1
2
0
7a: IgG-Synthese von PMCs ± IL-4 (1nM), nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides 100ng/ml), ±
Anwesenheit von neutralisierenden anti-IL-12-Aks (1µg/ml), Darstellung der Ergebnisse aus 3 unabhängigen
Experimenten bei Nicht-Atopikern. Blaue Säulen = Kokultivierung mit anti-IL-12-Aks.
64
SEB, SEA +/- anti-IL-12
IgA-Synthese
7000
6000
Spender 1
5000
IgA [ng/ml]
Spender 2
4000
Spender 3
3000
2000
1000
IL4+
SE
+a
A
ntiIL12
IL4+
SE
A
IL4+
SE
B
IL4+
SE
B
+a
ntiIL1
2
IL
-4
an
ti-I
L12
SE
A
IL4
+
SE
+a
A
ntiIL12
SE
B
an
ti-I
L-1
2
+
SE
B
un
stim
.+
un
stim
.
an
ti-IL
-12
0
SEB, SEA +/- anti-IL-12
IgE-Synthese
3
2,5
Spender 1
IgE [ng/ml]
2
Spender 2
Spender 3
1,5
1
0,5
Abb. 7
IL4+
SE
A
+
an
ti-IL
-12
IL4+
SE
A
IL4+
SE
B
+a
ntiIL1
2
an
ti-IL
-12
an
ti-IL
-12
+
IL4+
IL4+
SE
B
IL4
SE
A
SE
A
+
an
ti-IL
-12
SE
B
SE
B
un
sti
m
.+
un
stim
.
an
ti-I
L-1
2
0
7b: IgA-Synthese und 7c: IgE-Synthese von PMCs ± IL-4 (1nM), nach Stimulation mit SEB oder SEA
(beides 100ng/ml), ± Anwesenheit von neutralisierenden anti-IL-12-Aks (1µg/ml), Darstellung der Ergebnisse aus
3 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern. Blaue Säulen = Kokultivierung mit anti-IL-12-Aks.
65
3.1.3 CD23-Expression
Der Effekt von SEB und SEA auf die IgE-Synthese wurde oben dargestellt. Um einen
weiteren Einblick in die Beeinflussung der Atopie-assoziierten Immunantwort durch
Superantigene zu bekommen, wurde auch die CD23-Expression und die Freisetzung seiner
löslichen Spaltprodukte (sCD23) unter SEB- und SEA-Stimulation untersucht. Auf die
sCD23-Freisetzung wird im nächsten Kapitel eingegangen.
Abb. 8 zeigt den Effekt von SEB und SEA auf die CD23-Expression peripherer
mononukleärer Zellen von 10 gesunden Personen und 6 AD-Patienten. Die schon sehr
niedrige Basalexpression von CD23 bei gesunden Spendern konnte durch SEB und SEA in
der hier gewählten Konzentration von 100ng/ml weder weiter supprimiert noch gesteigert
werden. Die beiden Toxine zeigten hier keinerlei Effekt. In der Gruppe der Patienten mit
atopischer Dermatitis lag die basale CD23-Expression der nicht stimulierten Zellen etwas
höher als bei der anderen Spendergruppe. Hier konnte durch Stimulation mit SEB und
SEA ein mäßiger, aber signifikanter Suppressionseffekt beobachtet werden.
SEB, SEA - CD23-Expression
gesunde Personen versus AD-Patienten
10
#
#
9
8
*
%-Bindung
7
gesunde Personen
6
AD-Patienten
**
*
5
4
*
3
2
+
*
*
1
0
unstim.
Abb. 8
SEB
SEA
IL-4
IL-4 + SEB
IL-4 + SEA
CD23-Expression auf PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides 100ng/ml), ± IL-4 (100
U/ml), Vergleich AD-Patienten versus Nicht-Atopiker, Mittelwerte ± Standardfehler aus 10 (Nicht-Atopiker) und
6 (AD-Patienten) unabhängigen Experimenten, * p<0,05, ** p<0,01 bezogen auf Kontrollen ohne Toxin, # p<0,05
bezogen auf Kontrollen ohne IL-4, + p<0,05 bezogen auf Nicht-Atopiker.
66
Die Stimulation mit IL-4 führte erwartungsgemäß zu einem deutlichen und signifikanten
Anstieg der CD23-Expression auf peripheren mononukleären Zellen in beiden Kollektiven.
IL-4-ausgesetzte PMCs mit hoher CD23-Expression reagierten auf SEB- und SEAStimulation mit einem ausgeprägten und signifikanten Rückgang der CD23-Expression.
Dieser Effekt trat bei beiden Spendergruppen auf. Insgesamt hatte die Stimulation mit
beiden Superantigenen also einen deutlich supprimierenden Effekt auf eine hochregulierte
CD23-Expression (sei es bei AD-Patienten oder bei IL-4-Kostimulation), wohingegen ein
Effekt bei niedriger Basalexpression ausblieb.
Auch hier wurde die Konzentrationsabhängigkeit des beobachteten suppressiven Effektes
auf die CD23-Synthese durch Stimulation mit absteigenden SEB-Konzentrationen bis
0,1fg/ml untersucht; Abb. 9 zeigt einen Nicht-Atopiker. Bei hohen SEB-Konzentrationen
sah man auch hier analog zu obigen Daten eine Suppression der CD23-Expression, ab
100pg/ml SEB bei der spontanen CD23-Expression und ab 100fg/ml bei der IL-4induzierten CD23-Expression war dieser suppressive Effekt aufgehoben. Die niedrigste
verwendete SEB-Konzentration (0,1fg/ml) führte bei der IL-4-induzierten CD23Expression zu einer leichten Steigerung der CD23-Expression.
SEB - CD23-Expression
10
Konzentrationsreihe
9
8
%-Bindung
7
6
5
4
3
2
1
Abb. 9
SE
B0
,1fg
/ml
IL-4
+
SE
B1
00f
g/m
l
IL-4
+
SE
B1
00p
g/m
l
IL-4
+
IL4
SE
B1
00n
g/m
l
IL-4
+
SE
B0
,1fg
/ml
SE
B1
00f
g/m
l
SE
B1
00p
g/m
l
SE
B1
00n
g/m
l
uns
tim
.
0
CD23-Expression auf PMCs nach Stimulation mit SEB in den angegebenen Konzentrationen, ± IL-4
(100 U/ml), Nicht-Atopiker.
67
Da von der CD23-Expression auf mononukleären Zellen bekannt ist, daß IFNγ die CD23Expression herunterreguliert, wurde auch hier an einer kleinen Probandenzahl (4 gesunde
Spender) untersucht, ob Anwesenheit von neutralisierenden anti-human-IFNγ-Aks den
supprimierenden Effekt der Enterotoxine auf die CD23-Expression abschwächen kann.
Abb. 10 zeigt die Ergebnisse, die wegen der begrenzten Fallzahl (n=4) keiner kollektiven
statistischen
Signifikanzauswertung
zugänglich
sind
und
daher
zusätzlich
nach
Einzelspendern aufgeschlüsselt dargestellt sind: Ohne IL-4-Stimulation war die basale
CD23-Expression dieser Nicht-Atopiker-Gruppe wieder niedrig, hier führte die Stimulation
mit SEB bei allen 4 Spendern zu einer Suppression der CD23-Expression. Unter
Anwesenheit von anti-IFNγ bei SEB-Stimulation kam es bei allen 4 Spendern zu einem
Anstieg der CD23-Expression im Vergleich zur Toxin-Stimulation ohne anti-IFNγ-Aks,
und in Anwesenheit von anti-IFNγ-Aks konnte SEB nur bei 1 von 4 Spendern eine
diskrete CD23-Suppression induzieren.
SEB +/- anti-IFN-gamma
CD23-Expression
16
14
12
%-Bindung
ohne anti-IFN-gamma
10
mit anti-IFN-gamma
8
6
4
2
SE
B1
ng/
ml
IL-4
+
IL-4
+
SE
B1
00n
g/m
l
IL4
SE
B1
ng/
ml
SE
B1
00n
g/m
l
uns
tim
.
0
Abb. 10a CD23-Expression auf PMCs nach Stimulation mit SEB in 2 Konzentrationen (100 und 1ng/ml), ± IL-4
(1nM), ± neutralisierende anti-IFNγ-Aks (1µg/ml), 10a: Mittelwerte ± Standardfehler aus 4 unabhängigen
Experimenten bei Nicht-Atopikern
68
IL-4-Stimulation induzierte bei diesen Nicht-Atopikern – analog zu Abb. 8 – eine deutliche
Heraufregulation der CD23-Expression auf PMCs, hier zeigte eine SEB-Stimulation - wie
erwartet und ebenfalls analog zu Abb. 8 – einen deutlichen suppressiven Effekt auf die
CD23-Expression bei allen 4 Spendern. Unter Anwesenheit von neutralisierenden antiIFNγ-Aks war nur noch bei 3 von 4 Spendern eine Suppression durch SEB zu
verzeichnen, bei 2 von 4 Spendern wurde die Toxin-induzierte Suppression der IL-4induzierten
CD23-Expression
abgeschwächt.
Somit
führte
eine
Zugabe
von
neutralisierenden anti-IFNγ-Ak zu einer diskreten Reduktion der SEB-induzierten CD23Suppression.
SEB +/- anti-IFN-gamma
18
CD23-Expression
16
14
Spender 1
Spender 2
Spender 3
Spender 4
%-Bindung
12
10
8
6
4
2
IL4+
SE
an
B
ti-IF
1
Ng
am
m
a
1+
IL4+
SE
B
IL4+
SE
B
an
10
ti-IF
0
Ng
am
ma
IL4+
SE
B
10
0+
an
ti-IF
IL4
Ng
am
ma
IL4+
+a
SE
ntiB1
IFN
ga
mm
a
SE
B1
SE
B
an
10
ti-IF
0
Ng
am
ma
10
0+
SE
B
un
stim
.+
un
an
stim
ti-IF
.
Ng
am
m
a
0
Abb. 10b CD23-Expression auf PMCs nach Stimulation mit SEB in 2 Konzentrationen (100 und 1ng/ml), ± IL-4
(1nM), ± neutralisierende anti-IFNγ-Aks (1µg/ml), 10b: Darstellung der Ergebnisse nach 4 unabhängigen
Einzelspendern (Nicht-Atopiker) aufgeschlüsselt. Blaue Säulen = Kokultivierung mit anti-IFNγ−Ακσ.
69
3.1.4 sCD23-Freisetzung
Abb. 11 und 12 stellen den Einfluß der Toxine auf die sCD23-Freisetzung von gesunden
Personen und Patienten mit atopischer Dermatitis dar. Periphere mononukleäre Zellen
beider Spendergruppen wiesen eine niedrige basale Freisetzung von Spaltprodukten des
niedrig-affinen IgE-Rezeptors (sCD23) auf. Bei der Gruppe der gesunden Spender blieb
die Toxin-Stimulation gänzlich ohne Effekt. Stimulation mit SEB führte bei der Gruppe der
AD-Patienten zu einem deutlichen Anstieg der sCD23-Freisetzung. Der Anstieg nach
SEA-Stimulation erscheint ebenso markant, jedoch konnte anhand der vorliegenden Daten
bei niedrigerer Fallzahl und größerer Streuung in der statistischen Analyse die
Nullhypothese auf dem üblichen Signifikanzniveau von p=0,05 nicht verworfen werden.
SEB, SEA - sCD23-Freisetzung
gesunde Personen
**
0,6
*
0,5
%-Bindung
0,4
0,3
0,2
0,1
Abb. 11
IL4
SE
A
IL-4
+
IL-4
+
SE
B
IL4
SE
A
uns
tim
.
SE
B
uns
tim
.
0
sCD23-Freisetzung nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides 100ng/ml), ± IL-4 (100 U/ml),
Mittelwert ± Standardfehler aus 11 (SEB) und 6 (SEA) unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern, *
p<0,05, ** p<0,01
70
Nach Stimulation der peripheren mononukleären Zellen mit IL-4 kam es bei beiden
Spendergruppen zu einem Anstieg der sCD23-Freisetzung. Diese bereits erhöhte sCD23Freisetzung unter IL-4-Stimulation konnte durch SEB und SEA weiter signifikant gesteigert
werden, sowohl bei Nicht-Atopikern als auch bei Patienten mit AD. Damit zeigte sich die
sCD23-Freisetzung nach Enterotoxin-Stimulation reziprok zur CD23-Expression: Bei IL4-vorstimulierten PMCs und bei PMCs von AD-Patienten kommt es zu einer
Herunterregulation der CD23-Expression bei gleichzeitig erhöhter Freisetzung seines
löslichen Spaltproduktes.
SEB, SEA - sCD23-Freisetzung
AD-Patienten
*
0,45
0,4
0,35
%-Bindung
0,3
**
0,25
0,2
0,15
*
0,1
0,05
Abb. 12
IL-4
SE
A
IL-4
+
IL-4
+
SE
B
IL-4
SE
A
uns
tim
.
SE
B
uns
tim
.
0
sCD23-Freisetzung nach Stimulation mit SEB oder SEA (beides 100ng/ml), ± IL-4 (100 U/ml),
Mittelwert ± Standardfehler aus 6 (SEB) und 5 (SEA) unabhängigen Experimenten bei AD-Patienten,
* p<0,05, ** p<0,01
71
3.2
Vergleich der Effekte von SEB / SEA mit denen von SEBPeptiden
3.2.1 Proliferation
Es ist bekannt, daß die starke stimulative Potenz von mikrobiellen Superantigenen wie SEB
und SEA durch Bindung an den TCR der T-Zellen einerseits und den MHC II-Komplex
auf Antigen-präsentierenden Zellen andererseits vermittelt wird. Hierzu ist die
dreidimensionale Struktur des Superantigen-Moleküls nötig. Kurze SEB-Peptide mit einer
Länge von 8 Aminosäuren können diese für Superantigene spezifische Zell-Zell-Interaktion
nicht leisten.
Um die Abhängigkeit der Toxin-induzierten Immunglobulin- und CD23-Suppression von
ihrer Wirkung als Superantigene zu prüfen, wurden nun 3 antigenetisch wirksame SEBPeptide vom C-terminalen Ende, Molekülmitte und N-terminalen Ende im Vergleich zu
SEB eingesetzt.
SEB, SEA und SEB-Peptide
Proliferation
3H-Thymidin-Einbau [cpm]
25000
20000
ohne IL-4
mit IL-4
15000
10000
5000
Abb. 13
P3
100
ng/
ml
P3
1ng
/ml
P3
0,0
1ng
/ml
P2
100
ng/
ml
P2
1ng
/ml
P2
0,0
1ng
/ml
P1
100
ng/
ml
P1
1ng
/ml
P1
0,0
1ng
/ml
SE
A1
00n
g/m
l
SE
A1
n
SE
g
/
m
A0
l
,01
ng/
ml
SE
B1
00n
g/m
l
SE
B1
ng/
SE
ml
B0
,01
ng/
ml
uns
tim
.
0
Proliferation von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, SEB-Peptiden oder den Mitogenen PHA,
ConA, PWM in den angegebenen Konzentrationen, ± IL-4 (1nM), repräsentativer Einzelspender (NichtAtopiker)
72
Abb. 13 stellt zunächst den Vergleich zwischen intaktem SEB und SEA und den SEBPeptiden auf die Proliferation von peripheren mononukleären Zellen an einem
repräsentativen gesunden Spender dar. Erwartungsgemäß kam es hier durch Stimulation
mit den SEB-Peptiden auch bei hoher Konzentration nicht zu einer proliferativen Antwort,
wohl aber durch Mitogene und - wie bereits zuvor getestet - durch Stimulation mit SEB
und SEA.
3.2.2 Immunglobulinsynthese
Abb. 14a-c zeigen den Effekt der SEB-Peptide auf die Immunglobulin-Synthese der
mononukleären Zellen von 4 Nicht-Atopikern. Im Gegensatz zu den intakten
Toxinmolekülen hatten die Peptide keinen Effekt auf die Immunglobulinsynthese aller IgKlassen bei nicht IL-4-behandelten Zellen. Auch unter IL-4-Stimulation zeigten die Peptide
nicht den für SEB und SEA typischen suppressiven Effekt auf die Immunglobulin-Synthese.
Das hier als Positiv-Kontrolle mitgeführte SEB induzierte dagegen wieder eine deutliche
Suppression der Ig-Synthese aller 3 Immunglobulinklassen. Für diesen Effekt wird somit
das intakte Molekül benötigt.
600
SEB, SEB-Peptide
IgG-Synthese
500
IgG [ng/ml]
400
300
200
100
P3
IL-4
+
P2
IL-4
+
P1
IL-4
+
SE
B
IL-4
+
IL4
P3
P2
P1
SE
B
uns
tim
.
0
Abb. 14a-c 14a: IgG-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEB-Peptiden (je 100ng/ml), ± IL-4
(1nM), Mittelwerte ± Standardfehler aus 4 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern.
73
SEB, SEB-Peptide
4500
IgA-Synthese
4000
3500
IgA [ng/ml]
3000
2500
2000
1500
1000
500
P3
IL-4
+
P2
IL-4
+
P1
IL-4
+
IL4+
SE
B
IL-4
P3
P2
P1
uns
tim
.
SE
B
0
SEB, SEB-Peptide
14
IgE-Synthese
12
IgE [ng/ml]
10
8
6
4
2
P3
IL-4
+
P2
IL-4
+
P1
IL-4
+
SE
B
IL-4
+
IL4
P3
P2
P1
SE
B
uns
tim
.
0
Abb. 14a-c 14b: IgA-Synthese, 14c: IgE-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEB-Peptiden (je
100ng/ml), ± IL-4 (1nM), Mittelwerte ± Standardfehler aus 4 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern, *
p<0,05, ** p<0,01
74
Bei 2 Spendern führten jeweils einzelne SEB-Peptide bei IL-4-stimulierten mononukleären
Zellen zu einem weiteren Anstieg der IgE- oder IgA-Synthese, jedoch sind diese
Einzelbeobachtungen für die zu klärende Fragestellung von untergeordneter Relevanz, sie
begründen jedoch die große Standardabweichung bei den Daten zur Peptid-Stimulation
unter IL-4-Einfluß. Die Daten von einem dieser Spender sind in Abb. 15 exemplarisch
dargestellt.
Es wurde ebenfalls eine Kostimulation mit SEB-Peptiden und intaktem SEB-Molekül
durchgeführt (Abb.15a-c). Hier konnte keines der drei SEB-Peptide die Wirkung des
intakten SEB-Moleküls blocken: Sobald mit SEB kostimuliert wurde, unabhängig von der
eingesetzten Konzentration, kam es zur Suppression der Ig-Synthese, was für alle IgIsotypen galt.
SEB und SEB-Peptide
IgG-Synthese
250
200
ohne IL-4
100
50
SE
B1
00
ng
/m
l+
SE
P1
B
1
ng
SE
/
m
B0
l
+
,01
ng P1
/m
l+
P1
SE
B
10
0n
g/m
l+
SE
P2
B
SE 1ng
/m
B
l+
0,0
1n
P
g/m 2
l+
P2
SE
B
10
0n
g/
SE ml +
P3
B
1
SE
ng
/m
B
l+
0,0
P
1n
g/m 3
l+
P3
P3
10
0n
g/m
P3 l
1n
P3 g/m
l
0,0
1n
g/m
l
P2
10
0n
g/m
P2 l
1n
g/m
P2
l
0,0
1n
g/m
l
P1
10
0n
g/m
l
P1
1n
P1 g/m
l
0,0
1n
g/m
l
SE
B1
00
ng
/
SE ml
B
1
SE ng/m
B
0,0 l
1n
g/m
l
0
un
stim
.
IgG [ng/ml]
mit IL-4
150
Abb. 15a-c 15a: IgG-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB und / oder SEB-Peptiden, Konzentrationen
der Peptide bei SEB-Kostimulation immer 100ng/ml, ± IL-4 (1nM), Einzelspender (Nicht-Atopiker)
75
Abb. 15a-c
10
0n
g/
SE ml +
P
B
SE 1ng 1
/m
B
l+
0,0
P
1n
g/m 1
l+
P1
SE
B
10
0n
g
SE /ml +
B
1n P2
SE
g
B
0,0 /ml
+
1n
g/m P2
l+
P2
SE
B
10
0n
g/
SE ml +
P
B
SE 1ng 3
/
B
0,0 ml +
P
1n
g/m 3
l+
P3
SE
B
P3
10
0n
g/m
P3 l
1
P3 ng/
0,0 ml
1n
g/m
l
P2
10
0n
g/m
P2 l
1n
P2
g
0,0 /ml
1n
g/m
l
P1
10
0n
g/m
P1 l
P1 1ng/
0,0 ml
1n
g/m
l
10
0n
g
SE /ml
B
SE 1ng
B0
/m
,01 l
ng
/m
l
SE
B
un
stim
.
IgE [ng/ml]
SE
B1
00
ng
/m
SE l+P
B
1
1n
SE
g
B
0,0 /ml
+
1n
g/m P1
l+
P1
SE
B
10
0n
g
SE /ml +
B
P
1n 2
SE
B0 g/m
l
,01
ng + P2
/m
l+
P2
SE
B
10
0n
g
SE /ml +
B
P
1n 3
SE
g
B
0,0 /ml
+
1n
g/m P3
l+
P3
P3
10
0n
g/m
P3 l
1
P3 ng/m
0,0
l
1n
g/m
l
P2
10
0n
g/m
P2 l
1n
P2
g/
0,0 ml
1n
g/m
l
P1
10
0n
g/m
P1 l
1n
P1
g
0,0 /ml
1n
g/m
l
10
0n
g
SE /ml
B
1n
SE
B0 g/m
l
,01
ng
/m
l
SE
B
un
stim
.
IgA [ng/ml]
SEB und SEB-Peptide
900
IgA-Synthese
800
700
ohne IL-4
600
mit IL-4
500
400
300
200
100
0
SEB und SEB-Peptide
14
IgE-Synthese
12
10
ohne IL4
mit IL-4
8
6
4
2
0
15b: IgA-Synthese, 15c: IgE-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB und / oder SEB-
Peptiden, Konzentrationen der Peptide bei SEB-Kostimulation immer 100ng/ml, ± IL-4 (1nM), Einzelspender
(Nicht-Atopiker)
76
3.2.3 CD23-Expression
Es wurde ebenfalls der Effekt von SEB-Peptiden im Vergleich zu SEB auf die CD23Expression von mononukleären Zellen untersucht. Abb. 16 stellt die Ergebnisse von 3
gesunden Spendern dar. Hier zeigte sich - analog zu den oben dargestellten Ergebnissen
der Proliferation und der Immunglobulin-Synthese, daß die SEB-Peptide nicht den
supprimierenden Effekt der intakten Superantigene auf die IL-4-induzierte CD23Expression ausüben, wohingegen SEB als Positiv-Kontrolle wiederum bei IL-4-stimulierten
PMCs zur CD23-Suppression bei allen 3 Spendern führte.
SEB, SEB-Peptide
25
CD23-Expression
%-Bindung
20
15
Spender 1
Spender 2
Spender 3
10
5
Abb. 16
P3
+
IL4
IL-4
+
P2
P1
+
IL4
SE
B
IL4+
IL4
P3
P2
P1
SE
B
un
stim
.
0
CD23-Expression von PMCs nach Stimulation mit SEB oder SEB-Peptiden (jeweils 100ng/ml) ± IL-4
(1nM), Darstellung der Ergebnisse aus 3 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern.
77
3.3
Vergleich der Effekte von SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1Mutanten
3.3.1 Proliferation
Die vorangegangenen Untersuchungen zeigten, daß nur das komplette EnterotoxinMolekül, nicht aber seine Peptidfragmente eine starke proliferative Potenz sowie einen
Immunglobulin- und CD23-modulierenden Effekt haben. Mit Hilfe von durch
Punktmutation nur geringfügig in ihrer Primärstruktur veränderten rekombinanten TSST-1Molekülen stand ein weiteres und aussagekräftigeres Instrument zur Verfügung, um die
Abhängigkeit der beobachteten Toxin-Effekte auf CD23 / sCD23 und Ig-Synthese von der
Funktionsfähigkeit der Toxine als Superantigene klären zu können. Weiter konnte so näher
untersucht werden, welche Teile der Superantigen-Moleküle für diese Effekte unentbehrlich
sind. Dazu wurden SEB, SEA, rekombinantes Wild-Typ-TSST-1 (p17) als weiteres
Staphylokokken-Superantigen und zwei rekombinante TSST-1-Moleküle mit jeweils einer
Punktmutation an Aminosäuren-Stelle 115 (Tyrosin-Austausch zu Alanin) bzw. 135
(Histidin-Austausch zu Alanin) zunächst bezüglich ihrer mitogenen Eigenschaft verglichen.
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-Mutanten
Proliferation
30000
3H-Thymidin-Einbau [cpm]
25000
20000
15000
10000
5000
0
unstim.
Abb. 17
SEB
SEA
P17
Y115
H135
Proliferation von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, rTSST-1-Wildtyp p17 oder den
rekombinanten TSST-1-Mutanten Y115 und H135 (alle 100ng/ml), 3 unabhängige Einzelspender (2 NichtAtopiker (dunkle Balken), 1 AD-Patient (helle Balken)).
78
Abb. 17 stellt diese Ergebnisse dar: SEB, SEA und der TSST-1-Wildtyp riefen wie
erwartet eine ausgeprägte proliferative Antwort hervor. Auch das an Stelle 115 veränderte
TSST-1-Molekül zeigte bei allen Spendern eine gute mitogene Potenz. Lediglich bei
Stimulation mit H135-TSST-1 blieb bei allen Spendern eine proliferative Antwort aus.
3.3.2 Immunglobulinsynthese
Bei der Immunglobulin-Synthese ergab sich ein vergleichbares Ergebnis (Abb. 18 für
Nicht-Atopiker und Abb. 19 für AD-Patienten):
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
800
IgG-Synthese
700
IgG [ng/ml]
600
Spender 1
Spender 2
Spender 3
Spender 4
500
400
300
200
100
H1
35
IL4+
Y1
15
IL4+
P1
7
IL4+
SE
A
IL-4
+
SE
B
IL-4
+
IL
-4
H1
35
Y1
15
P1
7
SE
A
SE
B
un
sti
m
.
0
Abb. 18a-c 18a: IgG-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, rTSST-1-Wildtyp p17 und den
rekombinanten TSST-1-Mutanten Y115 und H135 (jeweils 100ng/ml), ± IL-4 (1nM), Darstellung der Ergebnisse
aus 4 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern.
79
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
1600
IgA-Synthese
1400
IgA [ng/ml]
1200
Spender 1
Spender 2
Spender 3
Spender 4
1000
800
600
400
200
H1
35
+
IL4
IL4
IL4+
Y1
15
P1
7
+
SE
A
IL4+
IL4+
SE
B
IL
-4
H1
35
Y1
15
P1
7
SE
A
SE
B
un
stim
.
0
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
IgE-Synthese
3,5
3
Spender 1
Spender 2
Spender 3
Spender 4
IgE [ng/ml]
2,5
2
1,5
1
0,5
H1
35
IL-4
+
Y1
15
IL4+
P1
7
IL-4
+
SE
A
IL4+
IL4+
SE
B
IL4
H1
35
Y1
15
P1
7
SE
A
SE
B
un
stim
.
0
Abb. 18a-c 18b: IgA-Synthese, 18c: IgE-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, rTSST-1-Wildtyp
p17 und den rekombinanten TSST-1-Mutanten Y115 und H135 (jeweils 100ng/ml), ± IL-4 (1nM), Darstellung
der Ergebnisse aus 4 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern.
Bei nicht IL-4-stimulierten Zellen führten SEB, SEA, TSST-1-Wildtyp p17 und auch Y115
zu einer Suppression der IgG- und der IgA-Synthese – die für Y115 jedoch bereits
abgeschwächt ausfiel. H135 induzierte lediglich bei 2 der 4 Spender eine Suppression der
80
IgG-Synthese und zeigte keinen Effekt mehr bei der IgA-Synthese. Die IgE-Synthese mit
sehr niedrigen Basalwerten wurde von keinem der Moleküle beeinflußt.
Bei IL-4-vorstimulierten mononukleären Zellen kam es durch alle 3 unveränderten
Superantigene wiederum zu einer deutlichen Supprimierung der Immunglobulin-Synthese
aller 3 Ig-Klassen. Y115 konnte die IgE- ,IgA- und IgG-Synthese ebenfalls supprimieren,
jedoch zeigte es hier wiederum weniger Wirksamkeit als das Wildtyp-TSST-1. Durch
Stimulation mit H135 blieb der Toxin-typische Suppressionseffekt analog zu den
Proliferationsergebnissen und denen der spontanen Ig-Synthese aus.
Der untersuchte Atopiker verhielt sich bezüglich der Effekte der TSST-Mutanten
wie die Gruppe der Nicht-Atopiker: Auch hier fiel eine gänzlich aufgehobene Wirkung des
H135 bezüglich einer Ig-Suppression auf, wohingegen Y115 bei PMCs ohne IL-4 noch
eine Wirkung zeigte, bei IL-4-Kostimulation jedoch die IgG- und IgA-Synthese nicht mehr
senken konnte und eine verminderte Wirksamkeit bei der IgE-Synthese zeigte.
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
IgG-Synthese - Atopiker
1400
1200
IgG [ng/ml]
1000
800
600
400
200
H1
35
IL4+
Y1
15
IL4+
P1
7
IL4+
SE
A
IL-4
+
SE
B
IL-4
+
IL4
H1
35
Y1
15
P17
SE
A
SE
B
uns
tim
.
0
Abb. 19a-c 19a: IgG-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, rTSST-1-Wildtyp p17 und den
rekombinanten TSST-1-Mutanten Y115 und H135 (jeweils 100ng/ml), ± IL-4 (1nM), AD-Patient
81
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
7000
IgA-Synthese - Atopiker
6000
IgA [ng/ml]
5000
4000
3000
2000
1000
25
H1
35
IL-4
+
Y1
15
IL-4
+
P1
7
IL-4
+
SE
A
IL-4
+
IL-4
+
SE
B
IL-4
H1
35
Y1
15
P1
7
SE
A
SE
B
uns
tim
.
0
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
IgE-Synthese - Atopiker
IgE [ng/ml]
20
15
10
5
H1
35
IL4+
Y1
15
IL-4
+
P1
7
IL-4
+
SE
A
IL-4
+
SE
B
IL-4
+
IL4
H1
35
Y1
15
P1
7
SE
A
SE
B
un
stim
.
0
Abb. 19a-c 19b: IgA-Synthese, 19c: IgE-Synthese von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, rTSST-1-Wildtyp
p17 und den rekombinanten TSST-1-Mutanten Y115 und H135 (jeweils 100ng/ml), ± IL-4 (1nM), AD-Patient
82
3.3.3 CD23-Expression
Abb. 20 zeigt den Einfluß der Toxine SEB, SEA, TSST-1-Wildtyp p17 und der TSST-1Mutanten Y115 und H135 auf die CD23-Expression an 4 Nicht-Atopikern.
Bei wiederum sehr niedriger spontaner CD23-Expression (Nicht-Atopiker) führten die
genannten Proteine sämtlich zu keinerlei Effekt. Die durch IL-4 induzierte hochregulierte
CD23-Expression konnte durch SEB, SEA und das Wildtyp-TSST-1 supprimiert werden,
wohingegen Y115 und H135 praktisch keine Effekte mehr zeigten und sich damit analog zu
den Ig-Synthese-Daten verhielten. Lediglich auffallend war, daß Y115 bei nahezu
uneingeschränkt erhaltener proliferativer Potenz nur noch eingeschränkte Fähigkeit zur
Suppression der Ig-Synthese und CD23-Expression zeigte, letzteres besonders deutlich bei
Kostimulation mit IL-4.
SEB, SEA, TSST-1 und TSST-1-Mutanten
14
CD23-Expression
12
%-Bindung
10
Spender 1
Spender 2
Spender 3
Spender 4
8
6
4
2
Abb. 20
H1
35
IL4+
Y1
15
IL4+
P1
7
+
IL4
SE
A
IL-4
+
SE
B
IL-4
+
IL
-4
H1
35
Y1
15
P1
7
SE
A
SE
B
un
stim
.
0
CD23-Expression von PMCs nach Stimulation mit SEB, SEA, rTSST-1-Wildtyp p17 und den
rekombinanten TSST-1-Mutanten Y115 und H135 (jeweils 100ng/ml), ± IL-4 (1nM), Darstellung der Ergebnisse
aus 4 unabhängigen Experimenten bei Nicht-Atopikern
83
3.4
Einfluß von SEB auf die Zytokin-mRNA-Expression
Von Superantigenen ist bekannt, daß sie in-vitro bei PMCs von Nicht-Atopikern potente
Induktoren einer IFNγ-Produktion sind. Da IFNγ zum einen eine zentrale Rolle in der
Regulation der T-Helfer-Antwort spielt, indem es eine Zytokinantwort vom TH1-Typ
unterstützt, es weiter die Ig- (allen voran die IgE-)Synthese sowie die CD23-Expression
moduliert, und zum dritten von Atopikern nur in verringerter Menge synthetisiert wird,
wurde nun an Einzelspendern (2 Nicht-Atopiker, 1 AD-Patient) die Induktion einer IFNγAntwort durch Superantigene auf mRNA-Level untersucht. PMCs wurden jeweils 48 und
72 Stunden mit den Superantigenen (SEB) inkubiert und dann zur RNA-Extraktion
geerntet. Abb. 21 zeigt die IFNγ-mRNA-Produktion nach Stimulation mit SEB in 2
Konzentrationen (100 und 1ng/ml) am Beispiel eines Nicht-Atopikers. Sowohl mit als auch
ohne IL-4- und IL-2-Kostimulation induziert SEB eine IFNγ-Antwort. Das IFNγ-Signal
ist bei niedriger SEB-Dosis bei IL-4-kostimulierten PMCs etwas schwächer, ansonsten ist
ein starkes IFNγ-Signal nach Superantigen-Stimulation sowohl nach 48 wie nach 72
Stunden Kulturdauer sichtbar, eine Spontanproduktion von IFNγ-mRNA ist dagegen nicht
sichtbar.
Abb. 21
IFNγ-mRNA-Expression von PMCs eines Nicht-Atopikers nach Stimulation mit SEB, 21a: nach 48
Std., 21b: nach 72 Std., Stimulationen von links nach rechts: Spalte 1 und 2: unstimuliert, 3: IL-2 (50U/ml), IL-4
(1nM), 4: SEB 1ng/ml, 5: SEB 100ng/ml, 6: SEB 1ng/ml, IL-2, IL-4, 7: SEB 100ng/ml, IL-2, IL-4, 8: ß-ActinKontrolle, Pfeil markiert IFNγ-Transkriptionsprodukt
84
Abb. 22 zeigt das Ergebnis des untersuchten AD-Patienten, wo bei vergleichbarem ßActin-Signal nur ein ganz schwaches Signal für IFNγ-mRNA bei Stimulation mit 100ng/ml
SEB auftritt. SEB induziert somit auch beim AD-Patienten IFNγ, allerdings nur bei hoher
Superantigen-Konzentration und in abgeschwächtem Maße im Vergleich zu NichtAtopikern.
Abb. 22
IFNγ-mRNA-Expression von PMCs eines AD-Patienten nach Stimulation mit SEB, 22a: nach 48 Std.,
22b: nach 72 Std., Stimulationen von links nach rechts: Spalte 1: ß-Actin-Kontrolle, 2 und 3: unstimuliert, 4: IL-2
(50U/ml), IL-4 (1nM), 5: SEB 100ng/ml, 6: SEB 1ng/ml, 7: SEB 100ng/ml, IL-2, IL-4, 8: SEB 1ng/ml, IL-2, IL-4,
Pfeil markiert IFNγ-Transkriptionsprodukt
85
4. DISKUSSION
Der Pathomechanismus der atopischen Dermatitis ist immer noch nicht vollständig
verstanden; es wird allgemein angenommen, daß Störungen der T-Zell-Effektor-Funktion
eine wesentliche Rolle spielen (siehe Einleitung). Ein Charakteristikum der AD ist die
häufige Besiedlung der Haut mit S. aureus-Stämmen, die häufiger als bei S. aureustragenden Nicht-Atopikern Superantigene exprimieren (siehe Einleitung, 1,18,98,110,185).
Eine Korrelation zwischen Toxinnachweis bei S. aureus-Besiedlung von AD-Patienten mit
dem Schweregrad ihrer Erkrankung (159,185), ein bei AD-Patienten Toxin-spezifisch
verändertes TCR-Vß-Spektrum (18,29,121,153,157), der häufige Nachweis von Toxinspezifischem IgE (12,17,98,102,125,126,159,185) und die bekannte außerordentliche
immunstimulatorische Potenz der Superantigene sind weitere Argumente für eine Rolle der
Toxine in der Pathogenese der AD. Interessanterweise wird auch bei anderen
Hauterkrankungen, die wie die AD ein T-zelluläres Hautinfiltrat und Erytheme aufweisen,
ein Zusammenhang mit Staphylokokken-Superantigenen diskutiert.
Zum Zeitpunkt der Durchführung der Experimente waren nur wenig Untersuchungen zur
Superantigenwirkung auf PMCs von AD-Patienten durchgeführt, und insbesondere
bezüglich des Einflusses der Superantigene auf Atopie-spezifische Immunparameter (IgE,
CD23/sCD23) existierten äußerst wenig (bzw. bei sCD23 keine) Erkenntnisse, und diese
auf Basis geringer Fallzahl (n=3), sowohl was Nicht-Atopiker als auch Atopiker betrifft
(122). Dieses veranlaßte die Untersuchungen dieser Arbeit über den Einfluß von S. aureusSuperantigenen auf folgende Parameter an peripheren mononukleären Zellen: Proliferation,
Ig-Synthese (auch Zytokin-induziert), CD23-Expression, sCD23-Freisetzung, IFNγProduktion, jeweils im Vergleich von AD-Patienten versus Nicht-Atopiker.
86
4.1
Proliferation
Die Proliferationsdaten dieser Arbeit reflektieren eindrucksvoll die außerordentliche Potenz
der Superantigene zur Stimulation und Aktivierung von Lymphozyten, indem in den
durchgeführten
Konzentrationsreihen
eine
Proliferationsantwort
bis
in
Konzentrationsbereiche von fg/ml SEB bzw. SEA erzielt wurde. Hierbei konnte kein
signifikanter Unterschied zwischen SEB und SEA bezüglich ihrer Fähigkeit zur
Lymphozytenaktivierung gesehen werden, was sicherlich bei der begrenzten Zahl der
Versuche mit kleinsten Toxin-Konzentrationen auch statistisch nicht zu erwarten ist. In der
Literatur ist SEA als das Toxin mit der größten T-Zell-stimulativen Potenz unter den
Staphylokokken-Enterotoxinen beschrieben (166). Die Fähigkeit zur in-vitro-Stimulation
von T-Zellen in großem Umfang durch Superantigene ist hinlänglich etabliert (56,92,105),
jedoch lagen nur sehr begrenzte und zum Teil widersprüchliche Untersuchungen zur
Fähigkeit von PMCs atopischer Patienten, auf Enterotoxin-Stimulation mit einer
Proliferationsantwort zu reagieren, vor. Diesem Vergleich – Patienten mit AD versus
gesunde
Personen,
d.h.
Nicht-Atopiker
–
dienten
die
hier
durchgeführten
Proliferationsuntersuchungen. Es konnte hier kein signifikanter Unterschied zwischen PMCs
gesunder Spender und denen von Atopikern festgestellt werden, wobei bei beiden
Gruppen eine sehr große interindividuelle Streubreite auffiel. Diese großen interindividuellen
Unterschiede könnten einen unterschiedlichen Präaktivierungsgrad der PMCs wiedergeben.
Allerdings wäre hier zu erwarten, daß sich die Kollektive der gesunden Personen einerseits
und der AD-Patienten andererseits besser abgrenzen ließen. Bereits seit längerem ist eine
reduzierte Fähigkeit zur Proliferation nach Stimulation mit herkömmlichen Mitogenen (PHA,
ConA) bei Lymphozyten von Patienten mit atopischer Dermatitis bekannt (36). Die
Arbeitsgruppe von Kapp et al. stellte eine unterschiedliche Reaktivität der Lymphozyten
gesunder und atopischer Personen fest und führte dieses auf eine unterschiedliche in-vivoPräaktivierung zurück (75,76): In diesen Arbeiten wiesen isolierte PMCs von ADPatienten nach in-vitro-Stimulation mit Mitogenen und Antigenen eine gegenüber gesunden
Personen reduzierte Proliferationsantwort auf und produzierten signifikant weniger IL-1 und
87
IL-2, was als Erschöpfungszustand nach übermäßiger Stimulation des lokalen
Immunsystems der Haut gedeutet wurde. Ein unterschiedlicher Präaktivierungszustand
erscheint auch anhand der hier beobachteten deutlich höheren Spontanproduktion von
Immunglobulinen der Klassen IgE und IgG bei AD-Patienten plausibel. Da Superantigene
T-Zellen Vß-spezifisch aktivieren (78), könnte die in dieser vorliegenden Arbeit
beobachtete interindividuelle Variabilität jedoch vielmehr an der individuellen Verteilung der
Vß-T-Zell-Subsets liegen. Das Vß-Spektrum könnte insbesondere bei AD-Patienten mit
chronischer Staphylokokken-Besiedlung und konsekutiv langfristigem Kontakt zu
Staphylokokken-Superantigenen (1,110,185) durch selektive Toxin-spezifische Expansion
oder Deletion von T-Zell-Subsets mit entsprechenden Vß-Regionen verändert sein und so
eine individuell unterschiedliche Proliferationsantwort bedingen. Da jedes Toxin an ein für
es spezifisches Set unterschiedlicher Vß-Ketten bindet, und bei AD-Patienten S. aureusStämme mit Produktion unterschiedlicher Toxine isoliert wurden (18,98,185), würde somit
nicht nur ein Unterschied zwischen den beiden Kollektiven gesunder und atopischer
Personen zu erklären sein, sondern ebenso die hier beobachtete große interindividuelle
Variabilität innerhalb der Kollektive. Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß
Unterschiede in der Expression der Vß-Ketten der T-Zellen aus peripherem Blut und aus
Hautbiopsien zwischen AD-Patienten und gesunden Personen nachgewiesen wurden
(18,29,121,153,157). Nachdem die oben zitierten Arbeiten lediglich die Reaktivität auf
Mitogene oder herkömmliche Antigene untersucht hatten, sind mittlererweile weitere
Untersuchungen zum Einfluß von Superantigenen auf die Proliferation von PMCs atopischer
Patienten unternommen worden. So zeigten König et al. (86) eine verminderte
Proliferationsantwort auf SEB und SEA (Konzentrationsbereich 1µg/ml, 100ng/ml und
10ng/ml) bei erwachsenen AD-Patienten im Vergleich zu Gesunden, Campbell et al. (19)
eine gesteigerte Proliferation nach SEB-Stimulation (1µg/ml) bei Kindern mit AD im
Vergleich zu Gesunden. Hofer et al. (62) schließlich fanden einen dosisabhängigen Effekt
mit einer gesteigerten Proliferationsantwort bei PMCs von AD-Patienten im Vergleich zu
Gesunden nach Stimulation mit TSST-1 im oberen des von ihm gewählten
Toxindosisbereichs (1ng/ml), wohingegen dieser Unterschied zwischen den Kollektiven in
niedrigeren Dosen (1pg/ml und 0,01pg/ml) verschwand – bei weiterhin bestehender
88
Proliferationsantwort im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollen. Interessanterweise
verlief bei Hofer die in beiden Kollektiven Toxindosis-abhängige Proliferationsantwort
parallel mit der Produktion von IFNγ und einer Dosis-abhängigen Beeinflussung der IgESynthese,
worauf
in
Abschnitt
4.2
und
4.4
weiter
eingegangen
wird.
Durchflußzytometrische Untersuchungen zeigten eine überwiegende Expansion des T-ZellPools in hohen, d.h. ng/ml-TSST-Konzentrationen, wohingegen in niedrigeren TSSTKonzentrationsbereichen sowohl B-Zellen als auch T-Zellen (diese jedoch weniger
ausgeprägt) proliferierten. Die Unterschiede zwischen den Ergebnissen der verschiedenen
Arbeitsgruppen einschließlich meiner Arbeit sind unter der Prämisse von Hofer, daß der
verwendete Konzentrationsbereich für den Ausfall des Ergebnisses von Bedeutung ist,
schwierig zu interpretieren; neben der unterschiedlichen Toxinkonzentration kann auch eine
eingeschränkte Vergleichbarkeit der Patientenkollektive (Kinder versus Erwachsene, ggf.
unterschiedliche Schwere oder Chronizität der AD) und die unterschiedliche intrinsische
Aktivität des verwendeten Toxins (schwächer superantigenetisch wirksames TSST-1
versus potentes SEB und SEA) eine Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse sein. Die
Abhängigkeit der Proliferationsergebnisse vom Patientenkollektiv wird durch eine neuere
Arbeit von Yoshino et al. unterstützt (181), in der gezeigt wurde, daß SEB bei Patienten
mit milder AD eine im Vergleich zu Nicht-Atopikern gesteigerte Proliferationsantwort
induziert, wohingegen sich bei Patienten mit schwerer AD und während Exazerbationen
eine abgeschwächte Proliferation nach SEB-Stimulation erzielen läßt. Der eingeschränkten
Proliferationsfähigkeit von PMCs von AD-Patienten mit schwerer AD schien eine
gesteigerte Apoptose von T-Zellen zugrunde zu liegen. Der vorliegenden Arbeit liegt ein
bezüglich des klinischen Schweregrades gemischtes Patientenkollektiv zugrunde, so daß die
große Variabilität in der Proliferationsantwort dieses Kollektivs und der nicht vorhanden
Unterschied zum Kollektiv der Nicht-Atopiker durchaus hiermit zu erklären ist.
Es wurden weiter Proliferationstests nach Stimulation mit am C-terminalen Ende durch
Punktmutation veränderten TSST-1-Molekülen und mit 3 verschiedenen SEB-Peptiden
durchgeführt, um die beobachteten Effekte bei der CD23-Expression und der Ig-Synthese
mit der Wirkung der Toxine als Superantigene zu korrelieren. Bonventre et al. hatten im
Maus- und Kaninchenmodell gezeigt, daß ein Aminosäure-Austausch an Position 135
89
(Histidin zu Alanin) die Potenz von TSST-1 zur T-Zell-Stimulation fast vollständig zum
Erliegen brachte; ein Austausch von Tyrosin zu Alanin an Position 115 resultierte in diesem
System in einer halb-maximalen mitogenen Aktivität. Diese Effekte verhielten sich parallel
zur Fähigkeit, einen toxischen Schock zu induzieren (11). Damit wurde demonstriert, daß
die Superantigen-immanente Fähigkeit zur T-Zell-Stimulation und die Auslösung eines
Schocks (wie beim TSS) zusammenhängende Phenomene sind, und daß hierfür das Cterminale Ende des TSST-1-Moleküls wichtig ist. Die vorliegenden Ergebnisse aus dem
humanen System bestätigten diese Beobachtungen. Auch hier konnte mit H135 keine
Proliferationsantwort erzielt werden bei ebenfalls aufgehobener Fähigkeit zur Ig- und
CD23-Suppression, Y115 konnte eine dem rekombinanten TSST-Wildtyp p17 noch
vergleichbare Proliferation induzieren, zeigte jedoch eine bereits deutlich abgeschwächte
Fähigkeit zur Suppression der Ig-Synthese und CD23-Expression (siehe folgende Kapitel).
Diese Versuche lassen somit den Schluß zu, daß die in dieser Arbeit beobachteten Effekte
der CD23-Suppression und sCD23-Freisetzung bei AD-Patienten und IL-4-stimulierten
Zellen, welche bisher nicht im Zusammenhang mit Superantigenen beschrieben waren,
ebenfalls einen Superantigen-immanenten Effekt darstellen.
Weiterhin wurde die Proliferationsantwort von PMCs nach Stimulation mit 3 SEBOctapeptiden und deren Fähigkeit zur Blockierung der SEB-Effekte bei Kostimulation mit
SEB untersucht. Die 3 Octapeptide P1 (Aminosäuren 21-32), P2 (AS 93-107) und P3
(AS 202-217) wurden als Antigen-Determinanten des nativen SEB-Moleküls durch ihre
Reaktivität mit SEB-Antiseren identifiziert (177). P2 ist außerdem ein Peptid, was die
Region der SEB-Disulfid-Brücke enthält, die wichtig für die Mitogenität von SEB ist (49).
In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch keines der 3 Peptide bei Kostimulation mit
intaktem SEB-Molekül die Proliferationsantwort des Toxins blockieren. Dieses scheint kein
Effekt zu geringer Konzentration zu sein, da die SEB-Peptide im molaren Verhältnis um ein
Vielfaches überwogen und SEB bis hinunter in eine Konzentration von 10pg/ml getestet
wurde. Auch Wood et al. (177) konnten mit den Peptiden keinen inhibitorischen Effekt auf
die T-Zell-Proliferation durch SEB erzielen. Demgegenüber haben mehrere andere
Arbeitsgruppen, die wie Wood den Ansatz zur Identifizierung funktionell relevanter SEBEpitope mittels der Methode der synthetischen Peptide verfolgten, mit ähnlichen, aber nicht
90
völlig identischen SEB-Peptiden andere Ergebnisse erzielt: So konnten Komisar et al. (85)
mit 5 Peptiden die Bindung von SEB an seine Liganden (MHC II / TCR) blockieren, von
denen eines die Aminosäuren 90-114 an der Disulfid-Brücke umfaßte (Cystein 93 –
Cystein 113). Auch Jett et al. (71) konnte mit 4 Peptiden, davon eines AS 93-112, die
SEB- induzierte Proliferation unterdrücken. Die Tatsache, daß das hier und bei Wood
verwendete Peptid P2 (AS 93-107) diese Eigenschaft nicht besaß, scheint an der zu
geringen C-terminalen Ausdehnung zu liegen, was in einer fehlenden / zu geringen
Verdrängung von SEB von seinen Bindungsplätzen resultiert. Durch Funktionsanalysen
nach Punktmutationen beim TSST-1 (siehe obige TSST-1-Daten und (11,34)) wurde ja
gezeigt, daß bereits minimale Veränderungen des Moleküls zum Funktionsverlust des
Superantigens führen können. Kappler (77) und Swanninatha (158) konnten für SEB drei
N-terminal lokalisierte Epitope mit Relevanz für die MHC II- bzw. TCR-Interaktion finden
(AS 9-23, 41-53 und 60-61), Soos (155) noch zusätzlich ein C-terminales Epitop (AS
179-212). Die Peptide allein induzierten wie zu erwarten keinerlei Proliferationsantwort.
Bei den anderen untersuchten Parametern (CD23-Expression, Ig-Klassen-Synthese) gab
es parallel zu der fehlenden Proliferationsantwort durch die drei Antigen-wirksamen, aber
nicht Superantigen-wirksamen Peptide ebenfalls keinen Anhalt für einen Effekt.
Zusammenfassend zeigen die dargestellten Ergebnisse der Superantigen-induzierten
Proliferation bei Atopikern und gesunden Personen die außerordentliche Potenz dieser
Toxine zur T-Zell-Aktivierung auf, was eine bedeutsame Rolle im Pathomechanismus der
atopischen Dermatitis spielen kann: Die Ag-unabhängige Aktivierung großer Mengen von
T-Zellen kann insbesondere unter dem Blickwinkel, daß bei der AD ein T-Zell-dominiertes
Hautinfiltrat vorliegt (183), zur massiven Freisetzung von Entzündungsmediatoren und
konsekutiver Verstärkung der lokalen entzündlichen Hautreaktion führen. Dieses Szenario
erscheint um so relevanter, da nachgewiesen wurde, daß Superantigen-Stimulation auf
CD4 + als auch CD8+ T-Zellen den hautspezifischen homing receptor CLA (cutaneous
lymphocyte-associated antigen) induziert (97), was den Einstrom von T-Zellen in die Haut
von AD-Patienten mit Toxin-sezernierenden S. aureus-Stämmen erleichtert.
Ein Problem liegt jedoch in der Übertragung der in-vitro erzielten Ergebnisse auf die
tatsächlichen in-vivo-Verhältnisse des lokalen Immunsystems der Haut. Z. B. stellt sich
91
anhand der oben diskutierten unterschiedlichen Daten zur Reaktivität von PMCs atopischer
Spender auf die Toxine und der Dosisabhängigkeit der Toxin-Effekte als wahrscheinlichste
Erklärung dieser Unterschiede die Frage, in welchen Konzentrationen die Superantigene
auf der Haut von AD-Patienten wirksam sind. Hohe lokale Toxinkonzentrationen haben
wahrscheinlich eine völlig andere immunmodulatorische Wirkung als sehr niedrige
Toxinkonzentrationen (auf die konzentrationsabhängige Beeinflussung der entsprechenden
Immunparameter wie IgE-Synthese, CD23-Expression und IFNγ-Produktion wird in den
nächsten Abschnitten eingegangen). Ein weiteres Problem der in-vitro- Untersuchungen ist,
daß die in-vivo beobachteten immunologischen Effekte der Superantigene nicht komplett
in-vitro zu reproduzieren sind. So kommt es in-vivo nach einer Phase der Proliferation von
T-Zellen zu einer Induktion von Anergie und / oder sogar Zelldeletion durch Superantigene
(67,78,90,114,137,170). Die Auswirkungen hiervon auf das Immunsystem sind bisher nur
spekulativ (siehe Kap. 1.3.3). Um Einblicke in den tatsächlichen lokalen Funktionszustand
des Hautimmunsystems zu bekommen, sind zusätzlich andere Studienentwürfe nötig, z.B.
in-situ- bzw. ex-vivo-Testungen an Hautbiopsien.
92
4.2
Ig-Synthese
Da die atopische Dermatitis typischerweise mit einem erhöhten IgE-Spiegel einhergeht
(53,176), IgE eine entscheidende Rolle bei der Typ-1 allergischen Reaktion spielt,
Patienten mit AD mehrheitlich eine Kolonisation mit Superantigen-produzierenden S.
aureus-Stämmen aufweisen (1,110,185), Superantigene als potente Immunstimulatoren
bekannt sind und experimentell AD-ähnliche Hautläsionen auslösen können (156), war es
Zweck dieser Untersuchungen, den Einfluß der Superantigene auf die IgE-Synthese von
AD-Patienten zu untersuchen. Es lagen bereits Erkenntnisse über die Fähigkeit von
Superantigenen, die humorale Immunabwehr zu supprimieren, vor (131,160), jedoch war
die Datenlage bzgl. des Einflusses der Superantigene auf die IgE-Synthese von Atopikern
zum Zeitpunkt der Untersuchungen noch äußerst dürftig. (Neuber zeigte 1992 an 3 ADPatienten einen suppressiven Effekt von in sehr hoher Dosis eingesetztem SEB auf die IgESynthese. (122)) Um zu unterscheiden, ob beobachtete Effekte Isotyp-spezifisch sind,
wurde in dieser Arbeit auch parallel der Einfluß der Toxine auf die IgA- und IgG-Synthese
untersucht. Das Modell der IgE-Induktion durch IL-4 wurde zusätzlich gewählt, um die
basal sehr niedrige IgE-Produktion gesunder Personen zu erhöhen, um Suppressionseffekte
beurteilen zu können, und um experimentell ein TH2-Milieu zu schaffen, was im peripheren
Blut von Atopikern vorherrscht (82,120,128,175).
Die dargestellten Untersuchungen zeigten eine deutliche Suppression der IgE-Synthese
durch die Superantigene bei AD-Patienten sowohl mit als auch ohne IL-4 und bei IL-4kostimulierten PMCs von gesunden Personen. Diese Ergebnisse würden zunächst keinen
Zusammenhang zwischen der Induktion hoher IgE-Spiegel und der Exposition zu
Superantigenen bei AD erkennen lassen. Mittlerweile haben sich mehrere Arbeitsgruppen
dieser Frage experimentell gewidmet. So konnte jeweils einmal für Enterotoxin und einmal
für TSST-1 entsprechend den vorliegenden Daten eine Suppression der IgE-Synthese
durch Superantigene bei AD-Patienten in-vitro gezeigt werden (86,95). Um sich den invivo-Bedingungen anzunähern, wählten Herz et al. ein SCID-Mausmodell mit humanen
PMCs von AD-Patienten und konnten in diesem in-vivo-Modell ebenfalls eine Suppression
93
der IgE-Synthese durch SEB-Stimulation feststellen (60). Demgegenüber zeigten Hofer et
al. (die TSST-1 in ihren Studien verwendeten) erstmalig, daß TSST-1 die IgE-Synthese
von AD-Patienten unter bestimmten Bedingungen (nämlich sehr niedrigen ToxinKonzentrationen) erhöhen kann (61,62): Hofer demonstrierte einen biphasischen Effekt von
TSST-1 auf die IgE-Synthese von AD-Patienten, die bei Toxin-Konzentrationen um
1ng/ml noch supprimiert wurde, bei niedrigeren Konzentrationen anstieg und bei 0,01pg/ml
TSST-1 deutlich gesteigert war. Bei Nicht-Atopikern konnte keinerlei IgE-Steigerung
durch niedrige TSST-1-Konzentrationen erreicht werden. Auch Neuber fand später im
Gegensatz zu seinen ersten Untersuchungen eine erhöhte IgE-Synthese nach SEBStimulation, dies allerdings bei einer erstaunlich hohen SEB-Konzentration von 1µg/ml SEB
(123). In anderen Arbeiten wurde bisher keine Superantigen-induzierte IgE-Steigerung
gezeigt, was wahrscheinlich an nicht ausreichend niedrigen Konzentrationen lag (bei (86)
minimal 0,1pg/ml des gegenüber TSST-1 potenteren SEB u. SEA, bei (95) minimal 1pg/ml
TSST-1, in der vorliegenden Arbeit minimal 0,1fg/ml SEB/SEA, allerdings nur bei NichtAtopikern). Interessanterweise korrelierte bei Hofer die Toxin-induzierte IgE-Suppression
mit einer starken Proliferationsantwort (siehe Kap. 4.1) und einer gesteigerten IFNγProduktion, und anti-IFNγ-Aks (1,5µg/ml) konnten den suppressiven Effekt wieder
aufheben. Die IgE-Steigerung durch niedrigste TSST-1-Konzentrationen ging mit einer
Steigerung der Synthese anderer Ig-Klassen (IgG,A,M) einher und entsprach einer
polyklonalen B-Zell-Aktivierung. Die Beobachtungen von sowohl IgE-Suppression wie
auch –Steigerung in den verschiedenen Arbeitsgruppen und meiner Arbeit erscheinen somit
abhängig von der eingesetzten Toxinkonzentration.
Im Gegensatz zu Hofer konnte in der vorliegenden Arbeit durch Hinzugabe von
neutralisierendem IFNγ-Ak (1µg/ml) der suppressive Effekt von SEB auf die IgE-Synthese
nicht aufgehoben, allenfalls minimal abgeschwächt werden. Ein Erklärungsansatz für die
Unfähigkeit von anti-IFNγ, den Suppressionseffekt zu antagonisieren, wäre, daß die
Superantigen-induzierte Immunglobulin-Suppression nicht oder nicht nur durch IFNγ
vermittelt ist, sondern durch inhibitorische T-B-Zell-Signale oder andere lösliche
Mediatoren vermittelt wird. Im Hinblick auf Hofers Ergebnisse wäre jedoch auch denkbar,
daß trotz der recht hoch gewählten anti-IFNγ-Konzentration nicht genügend Antikörper
94
zur Neutralisierung des durch SEB-Stimulation gebildeten IFNγ vorlag. Dieses wäre mit
Hofers Ergebnissen vereinbar, da in der vorliegenden Arbeit zwar eine vergleichbare
Menge an anti-IFNγ-Aks eingesetzt wurde, aber recht hohe Toxin-Konzentrationen des im
Vergleich zu TSST-1 wirksameren SEB gewählt wurden (100 und 1ng/ml), was zu starker
IFNγ-Bildung führt, außerdem die Neutralisationsversuche bei Nicht-Atopikern
durchgeführt wurden, die auf (hohe) SEB-Gaben mit starker IFNγ-Produktion reagieren
können, und hier ebenfalls durchweg die IgG- und IgA-Synthese supprimiert war, wobei
bekannt ist, daß zur Suppression von IgG wesentlich mehr IFNγ benötigt wird als zur
Suppression von IgE (106). IFNγ-Messungen im Zellüberstand sind zur Klärung dieses
Sachverhaltes in dieser Arbeit nicht durchgeführt worden – auf die IFNγ-mRNABestimmung wird unten unter 4.4 eingegangen. Lester et al. wiesen in diesem
Zusammenhang auf einen weiteren Kandidaten für die Mediation des suppressiven Effektes
der Superantigene auf die Ig-Synthese hin (95): im Gegensatz zu Hofer konnte bei Lester
durch anti-IFNγ-Zugabe bei AD-Patienten der TSST-1-induzierte suppressive Effekt auf
die IgE-Synthese nicht beeinflußt werden, wohl aber durch anti-IFNα-Zugabe, was
wiederum bei Nicht-Atopikern nur marginalen Effekt hatte. Dieses deutet auf zwei
unterschiedliche Mechanismen der IgE-Modulation durch Superantigene bei Gesunden und
Atopikern hin. Außerdem unterstützt es das Konzept einer verminderten TH1-T-ZellFunktion und / oder defekter IFNγ-Synthese (73,82,107,136,162) sowie einer verstärkten
Makrophagen-Aktivität bei AD.
IL-12 ist ein potenter Induktor für IFNγ (44,107,165) und kommt damit ebenfalls als
Auslöser der Superantigen-induzierten IgE-Suppression (und IgG / A-Suppression) in
Betracht, in dem es von APCs nach Superantigen-Bindung via MHC II-Komplex
ausgeschüttet würde. Daher wurden hier ebenfalls Versuche zur Ig-Synthese unter
Anwesenheit eines neutralisierenden anti-IL-12-Aks durchgeführt. Auch hier konnte die
nach SEB / SEA-Stimulation gesehene Ig-Suppression aller Ig-Klassen nicht durch anti-IL12 (1µg/ml) gehemmt werden. Aus diesem negativen Ergebnis kann jedoch nicht abgeleitet
werden, daß IL-12 nicht durch Superantigene induziert wird, denn die wahrscheinlich sehr
hohe IFNγ-Produktion nach Toxin-Stimulation mag durch die Zugabe von anti-IL-12 nicht
ausreichend hemmbar sein. Die Ig-Synthese kann hier nur ein indirektes Maß für eine IL-
95
12-Produktion sein, da sie unmittelbarer von TH-Zytokinen wie IFNγ und nur mittelbar
durch IL-12 beeinflußt wird. Ein positives Ergebnis hätte dagegen – wie schon oben bei
den anti-IFNγ-Versuchen - mehr Aussagekraft gehabt. Die Methode der Kokultur mit
neutralisierenden IL-12-Aks führte bei Leung et al. in einem experimentellen Ansatz mit
anderer Zielgröße zu dem Nachweis von Superantigen-induzierter IL-12-Aktivität (97).
Dort wurde untersucht, ob die Expression des durch Superantigene auf T-Zellen induzierten
homing receptors CLA durch Hinzugabe von anti-IL-12 (1µg/ml) zu blocken sei, was
gelang und auf eine Induktion von IL-12 durch Superantigene hinweist (mehr zum Einfluß
der Superantigene auf die Zytokin-Produktion unter Kap. 4.4).
In der vorliegenden Arbeit ging die Superantigen-vermittelte IgE-Suppression einher mit
einer Suppression der anderen Ig-Klassen, was somit auf eine nicht-Isotyp-spezifische
Modulation der IgE-Synthese, sondern auf eine generelle Suppression der humoralen
Immunantwort durch Superantigene hindeutet. Der Mechanismus besteht wahrscheinlich in
der Induktion von Suppressor-Zell-Populationen (131,160), die wiederum über lösliche
Mediatoren (z.B. IFNγ, TGFß) oder zelluläre Interaktionen die humorale Antwort
supprimieren. Hofer et al. (62) stellten analog zu den hier präsentierten Ergebnissen eine
alle Ig-Klassen betreffende Suppression der Ig-Synthese fest, die wohlbemerkt in sehr
niedrigen Toxinkonzentrationen unter 1pg/ml in eine Steigerung der Ig-Synthese überging.
Lester dagegen vermutete eine isotypenspezifische Herunterregulation der IgE-Synthese
durch Superantigene, da er keinen Einfluß von TSST-1 auf die IgG-Synthese feststellte
(95). Allerdings sind Ergebnisse zur IgG-Synthese nur mit 1 TSST-1-Konzentration
(1pg/ml) aufgeführt, so daß hier der fehlende suppressive Effekt auf die IgG-Synthese in
einer zu niedrigen Toxin-Konzentration begründet sein könnte. Auch Neuber (122) fand
bei 3 AD-Patienten eine die IgE, IgA- und IgG-Synthese betreffende Suppression durch
SEB, später (119) bei gleich hoch gewählter SEB-Konzentration (1µg/dl) jedoch eine
signifikante Steigerung der IgE-Synthese, die im Gegensatz zu den Ergebnissen von Hofer,
König und dieser Arbeit steht.
Die Ergebnisse der Versuche mit rekombinanten TSST-1-Mutanten und SEBOctapeptiden verhielten sich analog zu den Proliferationsergebnissen: Es wurde keinerlei
Effekt durch das mutierte TSST-1-Molekül H135 erzielt, Y115 zeigte eine abgeschwächte
96
und nicht konstante immunsuppressive Eigenschaft. Die SEB-Peptide führten durchweg zu
keiner Ig-Suppression. Allerdings fiel auf, daß einzelne SEB-Peptide – obschon insgesamt
ohne homogenen Effekt - bei einzelnen Spendern eine IgE-Synthesesteigerung bewirken
konnten. Dieser Beobachtung ist jedoch bei der vereinzelten Beobachtung zunächst keine
Bedeutung beizumessen, zumal die Peptide mit ihrer geringen Molekülgröße und Komplexität nicht als Allergene in Betracht kommen. Die Untersuchungen mit den
rekombinanten TSST-1-Molekülen und den Peptiden legen nahe, daß die in dieser Arbeit
beschriebenen Toxin-Effekte auf die Ig-Synthese Superantigen-immanent sind.
Wenn man nach den hier diskutierten Ergebnissen der verschiedenen Arbeiten zum Einfluß
von Superantigenen auf die humorale Immunantwort bei AD nun von einer
konzentrationsabhängigen biphasischen Beeinflussung der Ig-Synthese ausgeht (und
konsekutiv nicht nur der Ig-Synthese, sondern auch der T-Zell-Proliferation und
Zytokininduktion), stellt sich die Frage, welche Verhältnisse tatsächlich in vivo und lokal auf
der Haut von AD-Patienten vorliegen: Wenn hohe Toxin-Konzentrationen lokal wirksam
sind, wäre eine Immunmodulation wie in dieser vorliegenden Arbeit und bei (86,95,122)
beschrieben möglich. Bei sehr geringen wirksamen Toxinkonzentrationen wäre eine
polyklonale B-Zell-Stimulation mit Steigerung der Ig- einschließlich IgE-Synthese
anzunehmen. In diesem Zusammenhang sind folgende Beobachtungen interessant: Zollner et
al. (185) stellten zwar eine positive Korrelation zwischen Kolonisation von AD-Patienten
mit Superantigen-produzierenden S. aureus-Stämmen einerseits und der Schwere der AD
andererseits fest, jedoch korrelierte die IgE-Synthese negativ mit der Präsenz von
Superantigen-produzierenden Stämmen. Die Beobachtung einer im Vergleich zu anderen
AD-Patienten supprimierten IgE-Synthese bei chronischem Toxin-Kontakt könnte auf hohe
wirksame Toxinkonzentrationen im lokalen Hautmilieu hindeuten. Die konsekutiv hohe
IFNγ-Produktion könnte die lokale Entzündungsreaktion der Haut verstärken. Dieses
Szenario wird unterstützt durch die Arbeit von Herz et al. (60), die eine Assoziation
zwischen verminderter IgE-Produktion und verstärkten Entzündungsreaktion der Haut nach
SEB-Behandlung in mit PMCs von AD-Patienten rekonstituierten SCID-Mäusen
feststellten. Eine lokale IFNγ-Produktion widerspricht nicht unbedingt den derzeitigen
Erkenntnissen über die TH-Antwort bei AD, da im Gegensatz zu dem gültigen Konzept
97
einer TH2-dominierten Zytokinantwort von peripheren Lymphozyten in der AD
(82,120,128,175) und von aus akuten AD-Läsionen gewonnenen T-Zellen 2 Arbeiten eine
TH1-dominierte Zytokinantwort mit IFNγ-Produktion für chronische AD-Hautläsionen
nachweisen konnten (48,172).
Eine weitere Eigenschaft von S. aureus-Superantigenen besteht in der Induktion
toxinspezifischer IgE-Antikörper, die häufig bei AD-Patienten mit Toxin-bildenden S.
aureus-Stämmen,
sehr
selten
jedoch
bei
Nicht-Atopikern
mit
gleicher
Staphylokokkenbesiedlung gefunden werden (12,18,98,102,125,159,185). Die Rolle
dieses spezifischen IgE ist noch unklar, jedoch ist vorstellbar, daß es durch Toxin-Bindung
an auf Mastzellen oder Basophilen gebundenem spezifischem IgE zur Histaminfreisetzung
und folglich Unterstützung der Entzündungsreaktion der Haut kommt. In mehreren Studien
wurde eine positive Korrelation zwischen Schwere der AD und der Präsenz Superantigenspezifischer IgE-Antikörper nachgewiesen (12,18,126). Unter welchen in-vivoBedingungen (hohe versus niedrige lokale Toxin-Konzentrationen) es zu dieser Induktion
spezifischen IgEs kommt, ist jedoch nicht bekannt.
Es stellt sich außerdem die Frage, ob für die Rolle der S. aureus-Toxine in der Pathogenese
der AD eher diese Wirkung der Toxine als Allergene mit der Induktion spezifischen IgEs im
Vordergrund steht oder ihre Wirkung als Superantigene. Die in dieser Arbeit untersuchten
Toxin-Effekte auf die Ig-Synthese (und auch CD23 / sCD23-Expression und Proliferation)
erwiesen sich als abhängig von der Funktion der Toxine als Superantigene. Die Relevanz
dieser Effekte für die AD wird durch zahlreiche neuere Arbeiten unterstützt, die bei ADPatienten mit chronischem Superantigenkontakt sowohl im peripheren Blut (29,121,157)
als auch bemerkenswerterweise im T-zellulären Hautinfiltrat von AD-Läsionen (18) sowie
nach experimentellem Superantigen-Hautkontakt (153) ein verändertes Toxin-spezifisches
Vß-Spektrum fanden, was somit den Eingriff dieser Toxine in ihrer Eigenschaft als
Superantigene auch lokal in der Haut der AD-Patienten belegt.
Zusammenfassend ist bezüglich der Beeinflussung der humoralen Immunantwort von ADPatienten durch Superantigene zu sagen, daß es als klassische Superantigen-Wirkung invitro zu einer markanten Isotypen-unspezifischen Ig-Suppression kommt, was die Daten
dieser Arbeit eindrucksvoll zeigen. Jedoch ist bei geringsten Toxin-Konzentrationen jenseits
98
des pg-Bereichs eine polyklonale Stimulation der Ig-Synthese möglich; dieser Effekt scheint
AD-spezifisch. Welche Situation lokal in der Haut von AD-Patienten vorliegt, ist bisher nur
spekulativ. Es sprechen jedoch zahlreiche Beobachtungen dafür, daß das IgE-Molekül
nicht der wichtigste Baustein im Pathomechanismus der AD ist, sondern (T-)zelluläre
Mechanismen es sind. Die hier beobachtete generelle humorale Suppression durch
Superantigene könnte zusätzlich die Abwehr gegen die Staphylokokkenbesiedlung relevant
schwächen und repräsentiert einen großen Eingriff in eine intakte Immunabwehr. Die
ausgeprägte humorale Immunsuppression durch Superantigene betraf gesunde Spender als
auch AD-Patienten, sie erscheint jedoch besonders für AD-Patienten relevant, da sie viel
häufiger Superantigen-produzierende S. aureus aufweisen, die Haut bereits vorgeschädigt
ist, und die hier beobachtete humorale Immunsuppression markanter bei AD-Patienten und
IL-4-kostimulierten PMCs, d.h. vor dem Hintergrund eines experimentellen TH2-Milieus
auftrat.
99
4.3
CD23-Expression / sCD23-Freisetzung
Der niedrig-affine IgE-Rezeptor FcεRII oder CD23 spielt in der IgE-Regulation und in
IgE-mediierten Immunfunktionen (siehe Kap. 1.1.1.2 und 1.1.2.3) eine wichtige Rolle. Da
sich atopische Erkrankungen und allen voran die atopische Dermatitis durch einen hohen
IgE-Spiegel auszeichnen und außerdem die CD23-Expression und sCD23-Freisetzung bei
AD-Patienten gesteigert ist (14,15,16,31), liegt eine Rolle von CD23 und seinem löslichen
Spaltprodukt sCD23 im Pathomechanismus der atopischen Erkrankungen nahe. Über den
Einfluß von S. aureus-Superantigenen auf die CD23-Expression und sCD23-Freisetzung
lagen sowohl generell als auch AD-Patienten betreffend äußerst wenig Erkenntnisse vor;
lediglich bei Neuber et al. (122) war der Einfluß von SEB in sehr hoher Konzentration auf
die CD23-Expression an 3 AD-Patienten untersucht worden, ohne sich der sCD23Freisetzung zu widmen. Daher wurde hier der Einfluß von Superantigenen (SEB, SEA und
TSST-1) auf die spontane und IL-4-induzierte CD23-Expression und sCD23-Freisetzung
von Nicht-Atopikern und AD-Patienten untersucht.
Der Ansatz der Kostimulation mit IL-4 bei Nicht-Atopikern wurde gewählt, da IL-4 die
basal bei Nicht-Atopikern sehr niedrige CD23-Expression erhöht und die gesteigerte
CD23-Expression bei Atopikern zum großen Teil auf einer IL-4-induzierten Typ BIsoform beruht. In der vorliegenden Arbeit zeigten Superantigene keinen bzw. sehr geringen
Einfluß auf die spontane CD23-Expression oder sCD23-Freisetzung von Nicht-Atopikern,
wohingegen die Toxine bei (spontan höherer) CD23-Expression der Atopiker und bei IL4-induzierter CD23-Expression der Gesunden einen deutlichen suppressiven Effekt
ausübten. Parallen hierzu verhielt sich das sCD23, welches mit oder ohne Anwesenheit von
IL-4 bei Atopikern durch die Toxine gesteigert wurde, bei Nicht-Atopikern nur in
Anwesenheit von IL-4 (und damit hochregulierter CD23-Expression) vermehrt freigesetzt
wurde. Diese Effekte traten nicht bei Stimulation mit der H135-TSST-Mutante und den
SEB-Octapeptiden auf, was darauf hinweist, daß diese Effekte abhängig von der Wirkung
der Toxine als Superantigene sind.
100
Die Suppression der IL-4-induzierten CD23-Expression konnte abgesehen von oben
genannter Arbeit von Neuber et al. (122) in 2 weiteren Arbeiten bestätigt werden (86, 34),
von denen erstere an 4 AD-Patienten durchgeführt wurde. Hier wurde jedoch die sCD23Freisetzung nicht untersucht. Bei Drynda et al. (34) wurde parallel zur CD23-Suppression
eine sCD23-Suppression statt Steigerung gesehen, was im Gegensatz zu den hier
präsentierten Ergebnissen steht. Atopiker wurden hier nicht untersucht.
Die in der vorliegenden Arbeit gesehene Kombination von durch Superantigene
entgegengesetzt beeinflußtem CD23 und sCD23 lassen vermuten, daß die Suppression der
CD23-Synthese durch „Shedding“ des CD23-Moleküls auf der Zelloberfläche mit
konsekutiver Freisetzung von sCD23 zustandekommt. Zelltoxische Effekte konnten durch
Trypan-Blau-Färbung bei Beendigung der Kulturzeit ausgeschlossen werden. Der
Mechanismus der sCD23-Freisetzung ist zum Teil geklärt; sie erfolgt durch einen
autokatalytischen Prozeß mit Beteiligung einer Metalloprotease an einer LeucinSpaltungsregion (104,109). Durch Bindung des natürlichen CD23-Liganden IgE wird diese
Region stabilisiert und das CD23-Molekül vor Abspaltung geschützt (119). IgE, CD23 und
sCD23 bilden einen komplexen Regelkreis, der hier kurz skizziert wird: Eine vermehrte
CD23-Expression führt zu einem negativen feedback in der IgE-Synthese (41,109,148), an
CD23 gebundenes IgE verhindert die sCD23-Freisetzung (119), sCD23 wiederum hat
zumindest als größeres Spaltprodukt IgE-steigernde Eigenschaften (15,16,30,144), und
CD23 sowie sCD23 bewirken über Bindung an CD21 eine Steigerung der IgE-Synthese
(3,10). Eine Herunterregulation der IL-4-induzierten CD23-Expression und Freisetzung
von sCD23 durch Superantigene könnte somit zu einer Störung in diesem Regelkreis, und
das freigesetzte sCD23 zu einer nachhaltigen Steigerung der IgE-Synthese führen,
insbesondere in einem IL-4-geprägten Milieu, in dem dieser Effekt ja beobachtet wurde.
Weitere
Einflüsse,
z.B.
auf
die
Zelldifferenzierung,
Apoptose-Induktion
und
Makrophagenmigration wären möglich. Der Mechanismus, durch den die Superantigene ein
„Shedding“ von CD23 zu sCD23 vermitteln würden, bleibt spekulativ. Es wäre jedoch
vorstellbar, daß die ausgeprägte Superantigen-induzierte IgE-Suppression, die bei den hier
eingesetzten Toxin-Konzentrationen auftrat, durch einen verminderten IgE-Schutz des
CD23 die Spaltung von CD23 erleichtert. Ein weiterer Mechanismus – zumindest was die
101
verminderte CD23-Expression betrifft – liegt in der durch Superantigene in diesen
Konzentrationen induzierten IFNγ-Produktion, wofür es durch die CD23-Experimente mit
neutralisierenden anti-IFNγ-Aks Anhaltspunkte gibt. Die IFNγ-Produktion nach
Superantigen-Stimulation konnte auch bei AD-Patienten in dieser Arbeit per PCR und
mittlerweile in anderen Arbeiten nachgewiesen werden (62,86, siehe unten Kap. 4.4).
IFNγ supprimiert das auf B-Zellen exprimierte CD23. Ein weiterer Faktor bei der
Superantigen-vermittelten Suppression der IL-4-induzierten CD23-Expression kann in der
Toxin-induzierten Sekretion des löslichen IL-4-Rezeptors (sIL-4R) bestehen, da dieser
durch SEB verstärkt sezerniert wird, und seine exogene Zugabe wiederum zur Suppression
der IL-4-induzierten CD23-Expression führt (86).
Auch
Veränderungen
im
relativen
Verhältnis
der
Zellpopulationen
nach
Superantigenstimulation sind als Ursache für die reduzierte CD23-Expression denkbar:
Durch Superantigene werden (außer in sehr niedrigen Konzentrationen) vorwiegend TZellen zur Proliferation angeregt, so daß eine Expansion dieses Zelltyps, der eine geringere
Dichte von CD23-Molekülen pro Zelle im Vergleich zu B-Zellen im IL-4-Milieu aufweist,
zu einer Verringerung der auf 1x106 Zellen bezogenen CD23-Expression führen würde.
Diese Erklärung ist jedoch für den deutlichen Effekt der Superantigene nicht ausreichend,
da der Anteil der B-Zellen innerhalb der PMCs vor Superantigenstimulation bereits nur um
10% liegt. Eine Zelltyp-spezifische Analyse der CD23-Verteilung nach Toxin-Stimulation
mittels FACS-Analyse könnte dieses klären und wäre ein nächster Schritt.
Es wäre ebenfalls von Interesse, den Einfluß der Superantigene auf die CD23-Expression
auf Langerhans-Zellen zu untersuchen, was jedoch den Rahmen dieser Arbeit gesprengt
hätte. Langerhans-Zellen von AD-Patienten zeichnen sich - im Gegensatz zu denen von
Nicht-Atopikern – durch eine signifikante CD23-Expression aus und übernehmen eine
wichtige Funktion als professionelle APCs (5,6). Außerdem wäre es in Anbetracht der
Ergebnisse von Hofer et al. (62) lohnend, die CD23-Expression und sCD23-Freisetzung
bei noch geringeren Toxin-Konzentrationen zu untersuchen, da analog zu den IgEErgebnissen eine Induktion der CD23-Expression durch niedrigste Toxin-Konzentrationen
möglich wäre. In der vorliegenden Arbeit wurde die CD23-Expression unter SEBStimulation bis minimal 0,1fg/ml untersucht; hier sieht man in der niedrigsten SEB-
102
Konzentration analog zu Hofer bereits eine mäßige Steigerung der CD23-Expression über
den Basalwert ohne Toxin hinaus. Dieses könnte durch die Toxin-vermittelte polyklonale
B-Zell-Aktivierung und die in niedrigsten Toxin-Konzentrationen nicht mehr auftretende
IFNγ-Induktion ausgelöst sein. In der Arbeit von König et al. wurde bis zur niedrigsten der
gewählten Toxin-Konzentration von 0,1pg/ml SEB bzw. SEA eine Suppression der CD23Expression gesehen (86), was mit Hofers Ergebnissen durchaus vereinbar ist, da Hofer erst
ab Konzentrationen von 0,01pg/ml des zudem noch schwächer wirksamen TSST-1 eine
Steigerung der IgE-Synthese gesehen hat. Eine Prüfung dieser Ergebnisse an einer größeren
Personenzahl und insbesondere an Atopikern wäre daher von Interesse.
Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Ergebnisse zur Superantigenwirkung auf
CD23- / sCD23 eine reziproke Beeinflussung der beiden Parameter. Dieses kann den
komplexen IgE-CD23-Regelkreis weiter stören und zur IgE-Steigerung führen. Dem
verstärkt freigesetzten sCD23 kommt wiederum eine starke proinflammatorische
Eigenschaft zu, die auch IgE-unabhängige Mechanismen umfaßt (siehe Kap. 1.1.2.3) und
so die lokale Entzündungsreaktion der Haut bei AD weiter unterstützen kann. Da CD23
und sCD23 noch zahlreiche weitere Funktionen außerhalb der IgE-Antwort inne haben
(Beeinflussung des Überlebens/Apoptose von T-Zellen und B-Zellen in Keimzentren, ZellHoming und -Differenzierung), stellt der Superantigen-Effekt einen potentiell großen Eingriff
ins Immunsystem dar.
103
4.4
IFNγ-Synthese
Es ist ein etabliertes Konzept, daß bei PMCs von Patienten mit atopischer Dermatitis eine
T-Helfer-Antwort vom TH2-Typ mit entsprechender Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6, IL10 und IL-13 überwiegt, und nur wenig IL-2, IFNγ und IL-12 sezerniert wird
(82,120,128,175).Weiter wurde PMCs von Atopikern eine reduzierte Fähigkeit zur IFNγProduktion zugeschrieben (73,107). Auch akute AD-Hautläsionen weisen vorwiegend
CD4 + T-Zellen des TH2-Typs auf (51,167). Auf der anderen Seite konnte Grewe in einem
in-situ-Modell für chronische AD-Hautläsionen bei AD-Patienten eine gesteigerte
Expression von IL-2, IFNγ und IL-12 p35 mRNA – also Zytokinen der TH1-Antwort –
bei verminderter IL-4 mRNA-Expression nachweisen (48). 2 weitere Arbeiten wiesen
ebenfalls in chronischen Hautläsionen bei AD die Dominanz einer TH0- bzw. TH1Zytokinantwort nach (59,172). Von den S. aureus Superantigenen ist bekannt, daß sie
einen großen Anteil von T-Zellen stimulieren können (56,92,105) und bei PMCs gesunder
Personen zu einer starken Induktion von IL-2 und IFNγ führen (21). Daher stellte sich die
Frage, welche Zytokinantwort durch Superantigene bei AD-Patienten ausgelöst wird und
insbesondere, ob sie auch bei AD-Patienten zu einer signifikanten IFNγ-Produktion führen
können. Auf die Versuche mit neutralisierenden anti-IFNγ- und anti-IL-12-Aks wurde
bereits oben im Kapitel über die Ig-Synthese und CD23-Expression eingegangen. Hier
fand sich bereits bei der CD23-Expression und IgE-Synthese ein leichter Anhalt für eine
Rolle von IFNγ bei den Superantigen-induzierten Suppressionseffekten. Es wurde nun
außerdem auf der mRNA-Ebene die IFNγ-Produktion nach SEB-Stimulation bei einzelnen
Spendern (1 AD-Patient und 2 Nicht-Atopiker) untersucht. Hier zeigte sich bei den
gesunden Spendern eine deutliche IFNγ-mRNA-Expression nach Superantigen-Stimulation
(SEB), während die PMCs des AD-Patienten nur ein schwaches IFNγ-mRNA-Signal bei
der höchsten SEB-Konzentration und kein Signal bei der niedrigeren SEB-Konzentration
aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen, daß PMCs von Nicht-Atopikern als auch von ADPatienten mit einer IFNγ-Produktion auf Superantigene reagieren, und sie deuten auf eine
verminderte IFNγ-Bildung von AD-Patienten nach Superantigen-Stimulation hin. Allerdings
104
muß bei der zweiten Aussage eingeräumt werden, daß die hier verwendete PCR-Methode
noch keine quantitative Aussage über die PCR-Produkte zuließ. Quantitative PCRMethoden mit Quantifizierung der PCR-Produkte über Ionenaustauschchromatographie
oder „real-time“-PCR standen noch nicht zur Verfügung und würden bezüglich des
Vergleichs von AD-Patienten mit Nicht-Atopikern eine bessere Aussagekraft liefern.
Es wurden mittlerweile weiterführende Untersuchungen zur Superantigen-induzierten
Zytokinproduktion bei AD unternommen. So konnte sowohl auf mRNA-Ebene als auch
auf Protein-Ebene bestätigt werden, daß PMCs von AD-Patienten nach SuperantigenStimulation mit einer geringeren IFNγ-Produktion reagieren als Nicht-Atopiker
(19,62,86,95,123). Bei AD-Patienten induzieren Superantigene außerdem die Produktion
von typischen TH2-Zytokinen wie IL-4 und IL-5 sowie GM-SCF (86, 123); selbiges
konnte für PMCs von Patienten mit allergischer Rhinitis nach Superantigen-Stimulation
gezeigt werden (149). Die genannten Arbeiten wurden sämtlich in-vitro an aus peripherem
Blut isolierten Lymphozyten durchgeführt. Diese Ergebnisse weisen somit darauf hin, daß
das von Superantigenen induzierte Zytokinspektrum abhängig von der vorherrschenden TH
(1 versus 2)-Population der Person ist: Die bei AD-Patienten zumindest im peripheren Blut
vorherrschende TH2-Antwort würde so durch Superantigene weiter verstärkt, obschon
auch – aber in geringerem Maße – IFNγ induziert wird. Da Superantigene sehr potente TZell-Stimulatoren sind, würde so die Atopie-assoziierte Dysbalance in der TH-ZytokinAntwort verstärkt und zu einer massiven Freisetzung dieses Zytokinspektrums führen, was
wiederum die lokale Entzündungsreaktion der Haut über Induktion einer Eosinophilen- und
Mastzellen-Antwort aggravieren würde. Auch experimentell konnte die Zytokinantwort auf
SEB durch exogene IL-4-Stimulation von PMCs gesunder Personen von einer TH1- zu
einer TH2-Antwort (IL-4, IL-5, IL-10, weniger IFNγ) verändert werden (20). Neben
einer reduzierten IFNγ-Bildung bei AD-Patienten konnte Matsui kürzlich auch eine
reduzierte IL-12-Produktion bei AD-Patienten zeigen (107), was auf eine gestörte IL-12IFNγ-Regulationsschleife hindeutet. In diesem Zusammenhang sind die interessanten
Ergebnisse von Lauw et al. (93) über eine durch SEB induzierbare IL-12- (und IL-18)Synthese und von Leung et al. (97) über eine durch TSST-1 induzierbare und IL-12abhängige Expression des Haut-selektiven homing-Rezeptors CLA nur mit Vorsicht auf
105
AD-Patienten zu übertragen, da nicht klar ist, inwieweit eine IL-12-Antwort, die dort bei
Nicht-Atopikern nachgewiesen wurde, bei AD-Patienten stattfindet, wenn man für sie von
einer reduzierten IL-12-Produktion ausgeht. Dennoch besteht in der CLA-Induktion durch
Superantigene ein weiterer Baustein, der im Pathomechanismus der AD wichtig sein kann,
da so ein vermehrtes Einströmen von aktivierten T-Zellen in die Haut erleichtert würde. Sie
zeigt weiter, daß den APCs neben den T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der AD
zukommen könnte, da sie als einzige bioaktives (p70) IL-12 bilden und auf SuperantigenStimulation auch IL-1 und TNFα bilden, was wiederum zur Expression des CLARezeptors E-Selektin auf Endothelzellen führt (50).
Ein Problem besteht in der Bewertung der in dieser Arbeit erhobenen und der oben
referierten Daten über Superantigen-induzierte Zytokinspektren, da sie in-vitro an
peripheren mononukleären Zellen von AD-Patienten und nicht in-situ bzw. an Zellen aus
dem lokalen Hautmilieu gewonnen worden sind. Die Arbeiten von Grewe und Werfel
(48,172) wiesen in-situ bei chronischen AD-Hautläsionen eine TH1-dominierte
Immunantwort mit IFNγ-Bildung nach, so daß das relevante lokale Hautmilieu
insbesondere bei Anwesenheit von IFNγ-induzierenden Superantigenen durchaus TH1geprägt sein könnte. Das Vorliegen einer chronischen S. auerus-Besiedlung mit
Superantigenproduktion wurde in diesen Studien jedoch nicht untersucht. Weitere in-situ
bzw. ex-vivo-Untersuchungen mit Berücksichtigung des lokalen Superantigenkontaktes
sind somit nötig, um eine zutreffende Beurteilung der lokalen Verhältnisse zu erlauben.
Dennoch stellt das hier gewählte in-vitro-Modell weiterhin eine adäquate – und oft aus
ethischen
Gründen
die
einzig
gangbare
–
Möglichkeit zur Gewinnung von
Grundlagenkenntnissen über die immunologischen Effekte bestimmter hochwirksamer
Toxine auf das menschliche Immunsystem und auf mit ihnen assoziierte Krankheitsbilder
dar.
106
5. ZUSAMMENFASSUNG
Die atopische Dermatitis ist eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung aus dem
atopischen Formenkreis mit vielschichtiger und noch nicht vollständig geklärter
Pathogenese. Die ausgeprägte chronische Hautbesiedlung mit S. aureus und der hierunter
hohe Anteil von Superantigen-produzierenden Stämmen ist ein charakteristisches Merkmal
dieses Krankheitsbildes. Aufgrund dieser und weiterer Zusammenhänge, die eine Rolle von
Superantigenen bei der AD suggerieren, und in Anbetracht der bekannten
immunmodulatorischen Potenz von Superantigenen wurde in dieser Arbeit der Einfluß der
Staphylokokken-Superantigene SEB, SEA und TSST-1 auf die in vitro-Immunantwort von
peripheren mononukleären Zellen von Patienten mit AD und gesunden Probanden
untersucht.
Stimulation von PMCs mit SEB oder SEA führte bis in niedrigste Konzentrationsbereiche
sowohl bei gesunden Probanden wie auch bei AD-Patienten zu einer markanten
dosisabhängigen Proliferationsantwort, wobei sich – bei großer interindividueller Variabilität
- kein Unterschied in der Reaktivität von PMCs von Atopikern gegenüber gesunden
Probanden feststellen ließ.
SEB und SEA supprimierten die spontane Immunglobulinproduktion in beiden
Spenderkollektiven Isotypen-unspezifisch, wobei der suppressive Effekt am deutlichsten
bei einer durch IL-4 hochregulierten Ig-Synthese und bei der Ig-Synthese von ADPatienten auftrat. Diese Daten ergaben keinen Anhalt für eine Rolle der Superantigene bei
der Steigerung der IgE-Synthese, wie sie bei AD-Patienten vorliegt. Diese Effekte der Ig
(einschließlich IgE)-Suppression durch Superantigene bei Nicht-Atopikern und ADPatienten scheinen zunächst im Gegensatz zu Daten über die Fähigkeit von Superantigenen
zur Steigerung der IgE-Antwort (61,62) zu stehen. Jedoch ist die hier demonstrierte IgESuppression mit der zitierten IgE-Steigerung durchaus vereinbar, da letztere lediglich bei
geringsten Konzentrationen des immunologisch weniger potenten TSST-1, und spezifisch
für Atopiker gesehen wurde. Die im Rahmen der Arbeit durchgeführte SEBKonzentrationsreihe für die CD23-Expression, die eine CD23-Steigerung bei niedrigster
107
SEB-Konzentration (0,1fg/ml) zeigte, gibt hier einen Hinweis auf das oben beschriebene
Phänomen, daß die IgE-Antwort und CD23-Expression abhängig von der Toxin-Dosis
differentiell beeinflußt werden könnte. In höheren Toxin-Dosen kam es in dieser Arbeit
regelmäßig zu einer Superantigen-induzierten Suppression der IL-4-induzierten CD23Expression sowie der CD23-Expression von AD-Patienten. Dabei verhielt sich die
sCD23-Freisetzung nach Superantigen-Stimulation genau reziprok zur CD23-Expression,
was in dieser Arbeit erstmalig gezeigt wurde. Die potentiellen den CD23-/sCD23-Effekten
zugrundeliegenden Mechanismen werden diskutiert; ein „shedding“ von CD23 von der
Zelloberfläche zu sCD23 erscheint wahrscheinlich. Dem sCD23 kommt neben seiner Rolle
in der IgE-Regulation eine starke proinflaamatorische Rolle zu, so daß seine vermehrte
Freisetzung die Entzündungsprozesse der Haut aggravieren könnte.
Durch Experimente zum einen mit antigenwirksamen SEB-Peptiden und zum anderen mit
einem durch Punktmutation geringfügig veränderten rTSST-1-Molekül, von denen jeweils
bekannt war, daß sie keine Superantigen-Wirkung besitzen, wurde demonstriert, daß die
beobachteten die Ig-Synthese und CD23/sCD23 betreffenden Toxin-Effekte abhängig von
ihrer Wirkung als Superantigene sind.
Anhand einer begrenzten Versuchszahl wurde zuletzt auf mRNA-Ebene exemplarisch
gezeigt, daß Superantigene eine IFNγ-Produktion auslösen, allerdings zeigte sich diese bei
AD-Patienten wesentlich schwächer ausgeprägt. Da IFNγ als Mediator der hier
beobachteten Effekte in Betracht kommt, wurden Neutralisationsexperimente mit
neutralisienden anti-IFNγ− und anti-IL-12-Aks durchgeführt. Ihre Hinzugabe konnte den
Superantigen-vermittelten suppressiven Effekt bei der Ig-Synthese nicht blockieren. Jedoch
kam es durch anti-IFNγ bei der CD23-Expression (und andeutungsweise bei der IgESynthese) zu einer diskreten Reduktion des suppressiven Effektes von Superantigenen.
Die dargestellten Daten zeigen, daß von Staphylokokken sezernierte Superantigene in-vitro
eine starke immunmodulatorische Potenz vor allem im Kollektiv der AD-Patienten haben.
Sie führen zu einer starken T-Zell-Proliferation, Ig-Suppression, CD23-Suppression
(zumindest in hohen und mittleren Dosen) und gleichzeitigen sCD23-Freisetzung. Diese
Effekte sind bei PMCs im TH2-Milieu deutlich ausgeprägter und unterstreichen damit ihre
Relevanz für Atopiker. Superantigene induzieren weiter eine IFNγ-Antwort, die die
108
beobachteten Superantigen-Effekte wahrscheinlich zum Teil vermittelt, und die bei ADPatienten abgeschwächt verläuft.
Die hier dargestellten Ergebnisse bieten ein Erklärungsmuster für den Mechanismus der
Superantigene, den inflammatorischen Prozeß der atopischen Dermatitis zu unterstützen und
signifikant in die Funktionsfähigkeit einer intakten Immunabwehr auf humoralem wie
zellulärem Level einzugreifen. Vor dem Hintergrund mittlerweile mehrfach belegter
Superantigen-spezifischer Veränderungen im Vß-Spektrum im peripheren Blut und in der
Haut von AD-Patienten erscheinen diese Beobachtungen von besonderer Relevanz.
Die Ergebnisse tragen zur Einordnung der uneinheitlichen und bisher teils spärlichen in-vitro
Datenlage bezüglich der Effekte von Superantigenen auf die hier untersuchten
immunologischen Parameter bei AD-Patienten bei. Obwohl die Übertragbarkeit auf invivo-Verhältnisse bzw. die lokalen Verhältnisse der Haut nur eingeschränkt möglich ist und
weiterer in-situ-Untersuchungen bedarf, stellen diese in-vitro-Untersuchungen ein
adäquates Modell zur Erlangung von Einblicken in Grundlagen der Superantigen-induzierten
Immunmodulation bei AD dar.
109
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Danksagung
Zuerst gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. med. Ch. Rieger für die Betreuung dieser
Arbeit sowie für seine stets gewährte Unterstützung.
In seiner Klinik habe ich unter seiner Leitung klinisches Arbeiten mit wissenschaftlichkritischem Ansatz schätzen gelernt, was meinen Zugang zu pädiatrischen Krankheitsbildern
und den Umgang mit Patienten nachhaltig geprägt hat. Dafür sei ihm hier ebenfalls gedankt.
Herrn Prof. Dr. med. W. König, damals AG Infektabwehrmechanismen des Instituts für
medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Ruhr-Universität Bochum, danke ich für
die thematische Anregung zu meinen experimentellen Arbeiten auf dem Gebiet der
bakteriellen Exotoxine, die mich auf mein Dissertationsthema hinführten.
Desweiteren möchte ich mich bei Frau Dr. Ute Stephan, Herrn Dr. Jürgen
Bujanowski-Weber und Herrn Dr. Andreas Fischer für die Einführung in spezielle
Experimentiertechniken, viele anregende Gespräche sowie eine freundschaftliche
Arbeitsatmosphäre bedanken.
Meiner Schwester Claudia sei gedankt für ihre ständige Bereitschaft zur fachlichen
Diskussion und ihr kritisches Interesse.
Ganz besonders bedanke ich mich bei meinem Mann für die Durchsicht des Manuskripts
und seine uneingeschränkte Unterstützung, die vor allem die letzte Phase dieser Arbeit
wesentlich erleichtert hat.
132
Curriculum vitae
Angaben zur Person
Name:
Cordula Koerner-Rettberg, geb. Koerner
Wohnort:
Paulinenstr. 11, 44799 Bochum
Geburtstag und –ort: 08.01.1970, Bochum
Eltern:
Klaus Koerner, Dipl.-Ingenieur für Chemie
Elke Koerner, Chemotechnikerin
Familienstand:
verheiratet, 1 Kind
Schulbildung
1976-1980
Grundschule, Bochum
1980-1989
Albert-Einstein-Gymnasium, Bochum
11.05.1989
Abitur, Note 1,0
Berufsausbildung
10.1989-09.1991
Vorklinisches Studium
02.09.1991
Ärztliche Vorprüfung, Note 1,66
10.1991-09.1992
Erster klinischer Studienabschnitt, Ruhr-Universität Bochum
27.08.1992
Erster Teil der Ärztlichen Prüfung, Note 2,0
03.1992-09.1993
Beginn experimenteller Arbeiten über die Wirkung bakterieller
Exotoxine auf die menschliche Immunabwehr in der AG
Infektabwehrmechanismen, Prof. Dr. med. W. König, des Institutes
für medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Ruhr-Universität
Bochum
10.1993-03.1996
Zweiter klinischer Studienabschnitt, Ruhr-Universität Bochum
und University of London, UK
09.1993-08.1994
1jähriger klinischer Studienaufenthalt an der United Medical and
Dental School of Guy’s and St.Thomas’ Hospitals, London, mit
133
einem Stipendium des DAAD
26.03.1996
Zweiter Teil der Ärztlichen Prüfung, Note 2,0
04.1996-03.1997
Praktisches Jahr:
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital,
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum (Wahlfach Kinderheilkunde), Augusta-Krankenanstalten Bochum (Innere Medizin),
Baragwanath Hospital, Johannesburg, Südafrika (Chirurgie)
25.04.1997
Dritter Teil der Ärztlichen Prüfung, Note 1, Gesamtnote 1,66
Beruflicher Werdegang
07.1997-12.1998
Ärztin im Praktikum, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im
St. Josef-Hospital, Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
06.01.1999
Approbation als Ärztin
seit 01.1999
Assistenzärztin, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im
St. Josef-Hospital, Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
134