In vitro-Modell der primären Immunantwort - Ruhr
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum - Universitätskinderklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger In vitro-Modell der primären Immunantwort Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Holger Bartz aus Witten 2001 Seite 2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. U. Schauer Korreferent: Tag der mündlichen Prüfung: -2 - Widmung Widmung: Diese Arbeit ist meinen Eltern gewidmet. „Gabba Gabba Hey“ Ramones -3 - Inhalt Inhalt: Seite Widmung 3 Inhaltsverzeichnis 4 Verwendete Abkürzungen 6 1. Einleitung 1.1. Dendritische Zellen 9 1.2. T-Zellen 21 1.3. Andere an der primären Immunantwort beteiligte Zellen 23 1.4. Dendritische Zellen: Rolle in Klinik und Allergie 23 1.5. Problemstellung 26 1.6. Zielsetzung 32 2. Probanden, Material und Methoden 2.1. Probanden 33 2.2. Eingesetzte Materialien 34 2.3. Magnet assoziierte Zellsortierung (MACS) 38 2.4. Anzucht dendritischer Zellen 42 2.5. Gemischte Leukozyten Reaktion (MLR) 48 2.6. Messung der Effektorzellproliferation 53 2.7. Analytische Durchflußzytometrie 53 2.8. Polymerase Ketten Reaktion (PCR) 59 2.9. Enzym Linked Immunoassay (ELISA) 62 -4 - Inhalt Seite 3. Ergebnisse 3.1. Generierung dendritischer Zellen aus CD34 positiven hämatopoetischen 63 Nabelschnurblutstammzellen mittels GM-CSF, SF und TNF-α 3.2. Merkmale dendritischer Zellen 71 3.3. Nur dendritische Zellen induzieren IL-4 und IFN-γ in Nabelschnurzellen; 83 NK-Zellen sind die ersten zytokinproduzierenden Zellen 3.4. Zytokine und Zell-Zell-Kontakte bei der Induktion von Zytokinen in naiven 96 Zellen durch dendritische Zellen 3.5. Exogene Beeinflussung des Modells 111 4. Diskussion 4. Diskussion 121 4.1. Modelletablierung 122 4.2. Kinetik der Zytokininduktion naiver Zellen 131 4.3. Interzelluläre Wechselwirkungen 139 4.4. Exogene Einflüsse auf dendritische Zellen und die konsekutive 151 Veränderung der IFN-γ/IL-4 Bildung 4.5. Perspektiven 158 Literatur 160 Abstract 187 Danksagung 188 Lebenslauf 189 -5 - Abkürzungen Verwendete Abkürzungen : A.dest. Destilliertes Wasser Abb. Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper APZ Antigenpräsentierende Zelle bp Basenpaare CBMC Cord Blood Mononuclear Cells (Mononukleäre Nabelschnurblutzellen) CD Cluster of differentation CD40L CD40 Ligand CFU-DC Colony-Forming-Unit-Dendritic-Cell (Koloniebildende Einheit des dendritischen Zelltyps) CTL Cytotoxic T-Cells (Zytotoxische T-Zellen) d Tag DNA Desoxyribonukleinsäure DZ Dendritische Zelle EDTA Ethylendiamintetraessig ELISA Enzym linked immunoassay Fc Konstantes Antikörperfragment FcεR Bindungsrezeptor für das konstante Fragment des IgE FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoresceinisothiocyanat g Gravitationskonstante G-CSF Granulocyt-Colony-Stimulating-Factor (Granulozyten -KolonieStimulierender-Faktor) GM-CSF Granulocyt-Makrophage-Colony-Stimulating-Factor (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierender Faktor) h Stunde(n) HANKS Hanks balanced salt solution, steril HBSS Hanks balanced salt solution Hepes 2-(N-Hydroxyethylpiperazil)-2´Ethansulfonsäure HLA Humanes Leukozyten Antigen -6 - Abkürzungen I.E. Internationale Einheiten ICOS Inducible co-stimulator IFN Interferon Ig Immunglobulin IgA Immunglobulin Typ A IgE Immunglobulin Typ E IgG Immunglobulin Typ G IgM Immunglobulin Typ M IL Interleukin LAL Limulus Amebocyte Lysate LPS Lipopolysaccharid LZ Langerhanszelle MACS Magnet assoziierte Zellsortierung M-CSF Makrophage-Colony-Stimulating-Factor (Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor) MFI Mittlere Fluoreszenz Intensität MHC Major Histocompatibility Complex MicroBead Paramagnetisch markierte Antikörper MLR Mixed Leukocyte Reaction (dt. gemischte Leukozyten Reaktion, GLR) NK-Zellen Natürliche Killerzellen nT naive T-Zellen PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells (Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) PE Phyoerythrin PerCP Peridininchlorophyl PMA Phorbol-12-myrisat-13-acetat Poly[(I:C)] Poly Inosin-Cytosin RNA Ribonukleinsäure RSV Respiratorischer Syntial Virus (Respiratory Syntial Virus) SF Stammzellfaktor Tab. Tabelle TZR T-Zell-Rezeptor -7 - Abkürzungen TGF-ß Transforming-Growth-Factor-ß Th-Zellen T-Helfer-Zellen TNF(-α) Tumor-Nekrose-Faktor (alpha) -8 - 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1. Dendritische Zellen 1.1.1. Historisches 1.1.1.1. Erstbeschreibung Dendritische Zellen wurden erstmals 1868 von Langerhans (1847-1888) als in der Epidermis liegender Zelltyp beschrieben1 . Heute werden diese immer noch vielbeachteten Zellen als Entwicklungsstufe oder Subpopulation der Familie der dendritischen Zellen aufgefaßt2 und ihrem Entdecker zu Ehren als Langerhanssche Zellen der Haut bezeichnet. Diese Zellen waren 1961 Ziel der Arbeit von Birbeck, der in ihnen eine Struktur entdeckte, die nach ihm Birbeck Granula benannt wurde3 und heute das spezifischste Nachweiskriterium für Langerhanszellen ist4 . Da die Langerhanszellen lange Zeit die einzige gut zugängliche Population dendritischer Zellen waren, wurden Kennzeichen und Fähigkeiten dendritischer Zellen zuerst an ihnen erkannt und beschrieben5 . Heute sind sie aufgrund ihrer Lage und den neuen Erkenntnissen um ihre Aufgaben und Funktionen wieder ein wichtiger Gegenstand der Forschung geworden. 1.1.1.2. Der Begriff „Dendritische Zelle“ Der Begriff „Dendritische Zelle“ im Sinne einer Klasse professionell antigenpräsentierender Zellen wurde erst 1973 von Steinman et al. geprägt: Er wählte diese Bezeichnung aufgrund der charakteristischen Morphologie von ihm isolierter Zellen aus peripheren Lymphorganen der Maus, die ihn an bestimmte neuronale Zellen mit dem Namen „dendritische Zelle“ erinnerte. Die Namengebung bezog sich ausschließlich auf das Erscheinungsbild der Zellen, nicht auf andere Eigenschaften6 . Denn es waren die funktionellen Eigenschaften der neuen Zellgruppe, die sich fundamental von denen anderer Zellarten unterschieden: Dendritische Zellen sind als einziger Zelltyp in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren7 . -9 - 1. Einleitung 1.1.1.3. Dendritische Zellen der Maus Bei den anfänglich von Steinman untersuchten Zellen handelte es sich um Zellen der Mauslymphorgane, insbesondere um Milzzellen6,7,8. Durch weitere Arbeiten gelang es, den Ursprung dieser Zellgruppe in den für das Oberflächenantigen CD34 positiven hämato-poetischen Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen9,10 zu entdecken und in vitro aus ihnen dendritische Zellen zu generieren11,12,13 . Viele Arbeitsgruppen haben sich daraufhin mit der näheren Beschreibung der Morphologie6 , der biochemischen Eigenschaften14 , der Oberflächenstrukturen15 und vor allem mit den überragenden funktionellen Eigenschaften der dendritischen Zellen beschäftigt16 , die ausschließlich bei ihnen zu finden sind und sie kennzeichnen: dendritische Zellen können als einziger Zelltyp in der autologen und allogenen MLR17 naive TZellen aktivieren. Eine MLR mit Memory-T-Zellen und dendritischen Zellen verläuft wesentlich stärker als mit anderen antigenpräsentierenden Zellen. Diese deutliche Überlegenheit gegenüber anderen Zellgruppen, die bis dahin als Stimulatorzellen in der MLR genutzt wurden, z.B. B-Zellen oder Monozyten/Makrophagen, zeigt, daß die dendritischen Zellen die eigentlichen professionellen antigenpräsentierenden Zellen sind. Für die antigenpräsentierende Aktivität anderer Populationen (wie B-Zellen) werden vereinzelt Kontaminationen mit dendritischen Zellen verantwortlich gemacht 18 . 1.1.1.4. Dendritische Zellen des Menschen Beim Menschen wurde später neben den Langerhanszellen eine weitere, den murinen dendritischen Zellen vergleichbare, Zellgruppe entdeckt, die über ähnliche funktionelle Eigenschaften verfügte17 . Für Arbeiten an diesen menschlichen dendritischen Zellen wurden sie zunächst mittels Direktisolation aus peripherem Blut gewonnen19 und von Monozyten abgegrenzt 20 . Neben der kennzeichnenden Funktion wurden dabei auch bestimmte charakteristische Oberflächenstrukturen dieser Zellen beschrieben21 und Funktionen mit Oberflächenmolekülen verknüpft22 . Durch die immer genauere Differenzierung der Oberflächenantigene und einiger unterschiedlicher funktioneller Eigenschaften, konnten Subtypen sowie verschiedene Entwicklungsstufen der dendritischen Zellen im humanen peripheren Blut gefunden und unterschieden werden23, 24, 25. - 10 - 1. Einleitung Der große und entscheidende Nachteil der Direktisolation war und blieb jedoch die geringe Menge an dendritischen Zellen, die so gewonnen werden kann. Daraus ergab sich die Notwendigkeit, eine Möglichkeit der ex vivo Anreicherung, wie bei Mauszellen, auch für humane Zellen zu finden26, 27 . 1.1.2. In vivo-Ursprungs- und Reifungsmodell dendritischer Zellen 1.1.2.1. Ursprungszellen Da inzwischen unterschiedliche Entwicklungspfade und verschiedenartige Typen dendritischer Zellen beschrieben wurden, ist die Einordnung, Klassifizierung und Nomenklatur der verschiedenen Populationen in einem einheitlichen Modell sehr schwierig geworden. Es muß sowohl die Existenz der verschiedenen dendritischen Zellen im Körper berücksichtigen als auch vielfältige in vitro-Ergebnisse. Insgesamt sollte dieses Modell in der Lage sein, die Abläufe während der Immunaktivierung zu erklären. Die aktuelle Klassifikation orientiert sich zum einen an den sich entwickelnden Populationen, zum anderen an den Ursprungszellen, aus denen die dendritischen Zellen generiert werden. Als Ausgangszellen zur in vitro Generierung dendritischer Zellen dienen heute entweder durch bestimmte Oberflächenmarker gekennzeichnete hämatopoetische Stammzellen28 oder isolierte Monozyten29 . Daneben existiert ein unter Kulturbedingungen erst seit neuestem gezielt simulierbarer Entwicklungspfad zu sog. lymphoiden dendritischen Zellen30 , deren Existenz im Körper durch Isolation gesichert wurde31 . 1.1.2.2. Verhalten dendritischer Zellen in vivo 1.1.2.2.1 Modellvorstellung der physiologischen Abläufe Das heutzutage gültige Modell der in vivo Entwicklung dendritischer Zellen beschreibt ihren Ursprung in den CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks, von dem aus sie sich durch das Blut in die entsprechenden nicht lymphatischen Organe ausbreiten. Hier entwickeln sie sich zur Gruppe der organständigen - 11 - 1. Einleitung dendritischen Zellen, zu denen zum Beispiel die Langerhanszellen der Haut oder die Monozyten des Blutes zählen. An diesem Punkt ihrer Entwicklung verfügen die Zellen über ausgeprägte Fähigkeiten zur Antigenaufnahme und -verarbeitung. Während dieser Prozessierung des Antigens bewegen sich die unreifen dendritischen Zellen dann zu höhergelegenen Lymphstationen (z.B. Lymphknoten). Auf dem Weg dorthin unterliegen sie dem Einfluß unspezifischer Entzündungsreize, z.B. in Form von Zytokinen (z.B. TNFα, GM-CSF) oder Bakterienprodukten (z.B. LPS), was zu einem radikalen Wandel ihrer Fähigkeiten führt. Diese Entwicklung wird als „Reifungsprozeß“ bezeichnet und umfaßt den Verlust der Phagozytoseaktivität bei gleichzeitigem Gewinn der Fähigkeit zur Antigenpräsentation. Diese Entwicklung spiegelt sich auch an einer Veränderung der Oberflächenmolekülkonstellation wider, die nun eine starke Aktivierung von Memoryund naiven T-Zellen ermöglicht. Ein möglicher erneuter, der Aktivierung folgender, Verlust dieser Moleküle wird als Zustand der „überreifen“ dendritischen Zellen bezeichnet. Das folgende Schicksal der dendritischen Zellen liegt höchstwahrscheinlich in einem apoptoseähnlichen Prozeß mit kontrolliertem, selbständigen Abbau der Zellen. 1.1.2.2.2 Das Beispiel Langerhanszellen Das Verhalten der dendritischen Zellen im Menschen konnte am Beispiel der Langerhanszellen gut untersucht werden. Über diese ist bekannt, daß sie Knochenmarkstammzellen entspringen, über den Blutweg in die Haut transportiert werden32 und sich dort zu Langerhanszellen entwickeln. Hier verharren sie, um im Bedarfsfall Antigen aufzunehmen und daran anschließend als sogenannte „veiled cells“ von der Haut in die afferenten Lymphstationen zu wandern. Die Bezeichnung „veiled cells“, also „Schleierzellen“, bezieht sich auf ihre lichtmikroskopische Darstellung, in der ihre Zellmembran „verschleiert” wirkt. Die „Schleierzellen” transportieren das Antigen in die Lymphstationen, um es hier den T-Zellen zu präsentierten. Zu diesem Zweck entwickeln sich die Zellen dort zu sogenannten interdigitierenden dendritischen Zellen33 , welche bestimmten in vitro kultivierten dendritischen Zellen gemäß ihrer Oberflächenstrukturen und Fähigkeiten entsprechen34 . Diese Vorstellungen werden unterstützt durch ex vivo-Daten, die zeigen, daß bei aus der Haut isolierten Langerhanszellen in vitro unter der Gabe von GM-CSF (also eine simulierte Entzündungsreaktion) eine verstärkte Exprimierung der Oberflächenmoleküle - 12 - 1. Einleitung MHC und CD1a erfolgt, genau wie dies bei dendritischen Zellen in Lymphknoten35, 36 der Fall ist. Weiterhin kommt es zur Ausbildung der beschriebenen funktionellen Eigenschaften im Sinne der Weiterentwicklung von Langerhanszellen zu reifen dendritischen Zellen, einhergehend mit der Abnahme der Phagozytosefähigkeit und gleichzeitiger Zunahme der Fähigkeit zur T-Zell-Aktivierung37, 38 . Dieser Prozeß konnte durch vielfache, umfangreiche experimentelle Arbeiten bestätigt werden. Exemplarisch hierfür ist der Mannose-Rezeptor, der eine wichtige Rolle bei der Phagozytose von Zuckern spielt und nach Antigenaufnahme von der Zelloberfläche verschwindet39 (s Abb. 1). Dendritischer Zellvorläufer Unreife dendritische Zelle Reife dendritische Zelle IL-10 Zytokine z.B. GM-CSF IL-3, IL-4 Pathogene (z.B. LPS) Zytokine (z.B. TNF-α, GM-CSF) T-Zellen (CD40L) Eigenschaften : Eigenschaften : Endozytose (FcR) Wenig Endozytose (wenig FcR) Starke Expression : CCR1,CCR5,CCR6 MHC II intrazellulär Starke Expression : MHC II Oberfläche CDs 54, 58, 80, 86, 40, 83 IL-12 Schwache Expression : CCR7 CDs 54, 58, 80, 86, 40, 83 IL-12 Schwache Expression : CCR1,CCR5,CCR6 Abb. 1: Reifung der dendritischen Zelle - 13 - 1. Einleitung 1.1.3. Die dendritischen Zellen in vitro 1.1.3.1. Entwicklung dendritischer Zellen aus CD34 positiven Stammzellen 1.1.3.1.1. In vitro-Entwicklung dendritischer Vorläuferzellen aus CD34 positiven Stammzellen Dendritische Zellen bilden sich innerhalb von 14 Tagen aus CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen unter dem Einsatz der Zytokine GM-CSF und TNF-α. Sich zu dendritischen Zellen, Makrophagen oder Granulozyten entwickelnde Stammzellen sind durch die zusätzliche Expression des Oberflächenantigens CD86 gekennzeichnet40 . Die dendritischen Zellen verfügen am Ende der Kulturperiode über unterschiedliche Muster von Oberflächenantigenen. Es handelt sich also nicht um eine einheitliche Population, sondern um ein heterogenes Gemisch , bestehend aus verschiedenen Arten und verschiedenen Entwicklungsstadien41,42 . Diese Methode zur Generierung dendritischer Zellen wurde auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt, mit der Besonderheit, daß als Quelle der Stammzellen Nabelschnurblut diente. Über die intrazellulären Vorgänge, die zur Ausdifferenzierung von CD34 positiven Zellen zu dendritischen Zellen führen, ist allerdings wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß die Aktivierung der Protein Kinase C hierbei eine maßgebliche Rolle spielt, da gezeigt werden konnte, daß Phorbol Ester (PMA), artifizieller Stimulus und bekannter Aktivator der Protein Kinase C zur Ausreifung der Zellen führen kann. Zusätzlich konnten die durch GM-CSF und TNF-α vorher initiierten Ausreifungsprozesse durch Blockade der Protein Kinase C gestoppt werden44 . Am Tag fünf der Kulturperiode entwickeln sich die Stammzellen zunächst zu Zellen, die entweder CD14 positiv oder CD1a positiv sind26 . Hierbei handelt es sich um richtungsweisende Vorläuferstadien für die weitere Entwicklung der Zellen. - 14 - 1. Einleitung 1.1.3.1.2. In vitro-Entwicklung dendritischer Zellen aus dendritischen Vorläuferzellen Da am Tag fünf der Kulturperiode die Zellen teilweise nur CD14 positiv sind, können sie aus dem heterogenen Zellgemisch isoliert werden und entwickeln sich dann unter dem fortbestehenden Einfluß von GM-CSF und TNF-α zu dendritischen Zellen. Durch den Einsatz des Differenzierungsfaktors M-CSF hingegen werden sie zu Makrophagen26 . Mittels TGF-β werden auch aus diesen CD14 positiven Zellen Langerhanszellen45 . Ein wichtiger Unterschied besteht in den unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften der sich entwickelnden Zellpopulationen: dendritische Zellen sind in der Lage zur Aktivierung naiver T-Zellen, aber nur beschränkt zur Phagozytose. Die Monozyten / Makrophagen verhalten sich genau entgegengesetzt: mit starker Phagozytosefähigkeit und wenig ausgeprägter Stimulationskapazität (s.Abb. 2). Tab. 1: Kennzeichen der dendritischen Zell-Subtypen Merkmal Unreif Reif Langerhanszellen Lymphoide CD1a + ++ + CD14 - - +/- MHC II + ++ + + MHCI + ++ + + B7 (CD80, CD86) + ++ + ICAM (CD54) + ++ + CD83 - + - Makropinozytose + - - CD23 + - CD123 - - - + CD11c + ++ + - CD45RA - - - + CD45RO + + + - CD4 + + + ++ Lag Antigen - - + - Langerin - - + - Birbeck Granula - - + - Mannose Rezeptor + - + Weitere Merkmale - 15 - + E-Cadherin + CD44+ Faktor XIIIa + FasLigand Nicht-spezifische CD8α+ Elastase CD25+ 1. Einleitung 1.1.3.1.3. In vitro-Entwicklung von Langerhanszellen aus dendritischen Vorläuferzellen Isoliert man am fünften Tag der Kultur die nur CD1a positiven Zellen, entwickeln sich diese unter Fortbestehen der Wachstumsbedingungen mit GM-CSF und TNF-α zu Langerhanszellen. Dieses Verfahren wurde in weiterführenden Arbeiten ebenfalls von Caux etabliert46 . Spezifischer Nachweis für Langerhanszellen sind die Birbeck Granula 3 , die durch spezielle Antikörper oder elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden können47,43 . Dadurch ist eine sichere Unterscheidung dieser Population von anderen dendritischen Zellen möglich. Die Langerhanszellen werden als erste immunregulatorische Zellen der Haut betrachtet, die eine maßgebliche Aufgabe in der Antigenpräsentation zu T-Zellen und somit eine Rolle auch in der Kontaktsensibilisierung haben. Dieser Umstand macht die dendritischen Zellen in ihrer Form als Langerhanszellen zu einem wichtigen Gegenstand auch der dermatologischen Forschung. CD1a CD1a GM-CSF + TNF-α CD34 LZ GM-CSF + TNF-α CD1a Stammzelle GM-CSF + TNF-α DZ CD14 CD14 Granulozyt M-CSF Makrophage Abb. 2: Entwicklung von DZ, LZ und Makrophagen aus CD34 positiven Stammzellen - 16 - 1. Einleitung 1.1.3.2. In-vitro-Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung dendritischer Zellen ist die Kultivierung CD14 positiver Monozyten des peripheren Blutes über einen Zeitraum von sieben Tagen mit den Zytokinen GM-CSF und IL-4. Ohne Zellteilung entwickeln sich die Monozyten zunächst zu unreifen dendritischen Zellen, die durch spezifische Oberflächenmolekülkonstellationen (s. Tab 1.) und Fähigkeiten (z.B. Stärke der Effektorzellaktivierung) gekennzeichnet sind. Unter dem Einfluß von Entzündungsmediatoren wie TNF-α, IL-1, bakteriellen Produkten wie LPS oder durch synthetische Stoffe wie Poly[(I:C)] entwickeln sich aus den unreifen, reife dendritische Zellen. Diese Entwicklung geht einher mit Veränderungen der Oberflächenantigenexpression und den Fähigkeiten der Zellen 48 (s. Abb. 3). CD14 GM-CSF + IL-4 TNF-α oder IL-1 oder LPS oder Poly[(I:C)] Monozyt Unreife DZ M-CSF CD14 Abb. 3: Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten - 17 - Reife DZ 1. Einleitung 1.1.3.3. Lymphoide dendritische Zellen Die bisher genannten dendritischen Zellen werden unter die Gruppe der myeloiden dendritischen Zellen zusammengefaßt. Daneben existiert ein weiterer Typus, die sogenannten lymphoiden dendritischen Zellen. Diese entstehen aus lymphatischen Vorläuferzellen, die interessanterweise in der Lage sind, sich sowohl zu Lymphozyten als auch zu dendritischen Zellen zu entwickeln49 . Derartige Zellinien ließen sich im murinen Thymus und im menschlichen Thymus 50, 51 (aus dem Knochenmark entstammend)50 nachweisen. Zwar stammen alle Blutzellen von CD34 positiven Stammzellen ab, doch im Gegensatz zu myeloiden Vorläuferzellen sind die ersten lymphatischen durch die hohe Expression des Antigens CD7 und die niedrige des CD4 gekennzeichnet. Diese Zellen besitzen Entwicklungsmöglichkeiten zu B-Zellen, NK-Zellen oder über eine weitere Vorläuferzelle (CD44, CD25 und c-kit-Ligand positiv) zu dendritischen Zellen oder unter dem Einfluß von IL-7 zu T-Zellen52 . Diesen lymphoiden dendritischen Zellen kommt wahrscheinlich die extrem wichtige Aufgabe der Selektion von autoagressiven T-Zellen zu (s. Abb. 4). B-Zelle CD7 Lymphatische Vorläuferzelle Dendritische Zelle CD44,CD25, c-Kit-Ligand IL-7 T-Zelle Natürliche Killerzelle Abb. 4: Entwicklung der lymphoiden dendritischen Zelle - 18 - 1. Einleitung In diesem Zusammenhang werden im Mausthymus zwei Subtypen der lymphoiden dendritischen Zellen durch die Expression des Oberflächenmoleküls CD8 unterschieden: CD8 positive lymphoide dendritische Zellen haben einen supressiven Effekt auf T-Zellen, CD8 negative nicht. Die Supression erfolgt durch den FasLiganden und der damit verbundenen Einleitung programmierter Zellabsterbevorgänge in den T-Zellen95 . Diese Eigenschaft befähigt lymphoide dendritische Zellen zur Selektion verschiedener T-Zell-Populationen. 1.1.3.4. Zuordnung der Zellinien Untersuchungen an dendritischen Zellen gestalten sich ausgesprochen schwierig, da sie nur spärlich in Geweben zu finden und schwierig zu isolieren sind. Nach Isolation wechseln die Angehörigen der dendritischen Zellfamilie ständig sowohl Morphologie als auch Oberflächenmarker und sind daher schwierig zu klassifizieren, zumal der definitive Nachweis des Zelltyps ausschließlich durch die aufwendige Untersuchung der funktionellen Eigenschaften erfolgen kann. Selbst die Frage der Zuordnung zu einer Zellinie ist ungewiß. So bleibt unklar, ob dendritische Zellen Teil des Makrophagensystems sind, oder ob sie eine eigene, unabhängige Zellinie darstellen, da eine spezielle CFU-DC in vitro gefunden wurde und nachweislich auch im Knochenmark existiert. Auch die Möglichkeit der Umwandlung auf jeder Ebene der Zellentwicklung wird diskutiert53 . Für die Zugehörigkeit zum Monozytensystem spricht, daß die Ausdifferenzierung von dendritischen Zellen aus humanen Monozyten und aus myeloiden Vorläuferzellen seit Jahren gezeigt und etabliert ist. 1.1.4. Stellung dendritischer Zellen im Immunsystem Dendritische Zellen sind unumstritten die zentrale Schaltstelle des Immunsystems und insbesondere verantwortlich für die Induktion der primären Immunantwort. Um die Initiationsmechanismen des Immunsystems weiter verstehen zu können, müssen zukünftige Untersuchungen den dendritischen Zellen einen entsprechenden Stellenwert einräumen. - 19 - 1. Einleitung Antikörper B-Zelle Antigen Zytokine (z.B. IL-4, IFN-γ) T-HelferZellen Zytotoxische TZelle Zytotoxizität TZR IL-12 (NK-ZellAktivierender-Faktor) Entzündungsmediatoren (TNF-α, ..) Zytotoxizität NK-Zellen Infiziertes Gewebe Abb. 5: Schematische Darstellung der Schaltstellenfunktion der DZ Die zentrale, vernetzende Rolle der dendritischen Zellen wird durch ihre Wirkungen auf die unterschiedlichsten Teile des Immunsystems deutlich. Sie dienen als Bindeglied zwischen unspezifischer und spezifischer Abwehr, indem sie in den peripheren Organen Antigene unspezifisch aufnehmen und diese nachfolgend den spezifischen Anteilen des Immunsystems präsentieren und dadurch aktivieren. Dabei werden sowohl der humorale Flügel des spezifischen Immunsystems u.a. in Form von B- bzw. Plasmazellen als auch der zelluläre Flügel, z.B. CTL und Th-Zellen, angeregt 61 . Sie bilden so ein vernetzendes und kontrollierendes Element hinsichtlich spezifischer (Antikörper und T-Zell-Rezeptor) und unspezifischer Abwehrmechanismen (Antigenaufnahme und -präsentation, Freisetzung von Zytokinen, Aktivierung von NKZellen) sowie humoraler (Zytokine, Antikörper) und zellulärer Immunität (Zytotoxische (CD8+) T-Zellen, NK-Zellen) (s. Abb. 5). Supplementär wurde in letzter Zeit gezeigt, daß verschiedene Untergruppen der reifen dendritischen Zellen auch zur Inaktivierung von Immunprozessen beitragen können. Es ist - 20 - 1. Einleitung Aufgabe der bereits erwähnten lymphoiden dendritischen Zellen96 , die sich gemeinsam mit T-Zellen und NK-Zellen im Thymus ausbilden und auch Thymus-Dendriten55 genannt werden, auto-agressive T-Zellen zu selektieren und so die Selbst-Toleranz56,54 zu entwickeln. Lymph-oide dendritische Zellen wirken im Gegensatz z.B. zu MilzDendriten57 also supremierend. 1.2. T-Zellen 1.2.1. T-Zell-Klassifikation T-Zellen tragen definitionsgemäß den T-Zell-Rezeptor und das damit komplexierte Molekül CD3. Daneben existieren auf T-Zellen verschiedene andere Oberflächenmoleküle, die zur Einteilung in Untergruppen genutzt werden. So kennzeichnet CD4 T-Helfer-Zellen, CD8 zytotoxische T-Zellen. Weiterhin existieren noch sog. Regulator-T-Zellen (auch als Th3-Zellen bezeichnet), die durch Produktion des Zytokins TGF- ß gekennzeichnet sind 216 . T-Helfer-Zellen werden anhand ihrer Oberflächenmoleküle und der von ihnen produzierten Zytokine in weitere Untergruppen eingeteilt. Diese Einteilung ist in Tab. 2 dargestellt. Tab. 2: Übersicht über die T-Zell-Subpopulationen nach Zytokinen Bezeichnung Vorherrschendes Zytokin T-Helfer 0 (Th0) Kein bevorzugtes Zytokin T-Helfer 1 (Th1) Interferon-gamma (IFN-γ), Interleukin-2 (IL-2) T-Helfer 2 (Th2) Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-13 (IL-13) T-Helfer 3 (Th3) Transforming-Growth-Factor-ß (TGF-ß) T-Helfer-Zellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten, tragen das Oberflächenmolekül CD45 in der Ausprägung CD45RA und werden als naive T-Zellen bezeichnet. Nach Antigenkontakt entwickeln sie die Ausprägung CD45RO und sind dann Effektor-T-Zellen, die - 21 - 1. Einleitung sich teilweise zu Memory-Zellen weiterentwickeln. Neuere Arbeiten sehen ein Erkennungszeichen für Memory-Zellen in der Ausprägung bestimmter Chemokinrezeptoren59 . Funktionelle Unterschiede zwischen naiven und Memory-Zellen bestehen darin, daß die Art der Zytokinproduktion in naiven Zellen noch nicht festgelegt ist, und sie schwieriger zu aktivieren sind. Memory-Zellen dagegen sind leicht zu aktivieren, und ihre Polarisation (Th1/Th2) ist schon vorgegeben. Naive T-Zellen werden als Th0-Zellen bezeichnet und entwickeln sich entweder zu Th1Zellen, die atopieprotektive Zytokine wie IFNγ produzieren oder zu Th2-Zellen, gekennzeichnet durch atopiefördernde Zytokine wie IL-4, IL-5 oder IL-13. Kommt es nach Aktivierung der T-Zellen zu einem Überwiegen des Th2-Zytokinmusters im Körper, führt dies durch die Wirkung von IL-5 zur Aktivierung von eosinophilen Granulozyten und durch IL-4 und IL-13 zur Produktion und Freisetzung von IgE aus B-Zellen. Zusätzlich polarisiert IL-4 weiter naive T-Helfer-Zellen in Richtung Th-2-Zytokinmuster60 . Welche Bedingungen aus naiven Zellen Th1- oder Th2-Zellen werden lassen, ist momentan eine wichtige Frage und Hintergrund dieser Arbeit. Da naive Zellen nur durch dendritische Zellen aktiviert werden können, muß die Aufklärung der Wechselwirkungen von dendritischen und naiven Zellen das nächste Ziel der Allergieforschung sein und wurde in dieser Arbeit untersucht. 1.2.2. Einfluß antigenpräsentierender Zellen T-Zellen werden durch Signale von antigenpräsentierenden Zellen aktiviert. Memory-T-Zellen können schon durch schwache Signale von nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen, wie B-Zellen oder Makrophagen, aktiviert werden. Naive T-Zellen dagegen können nur durch dendritische Zellen aktiviert werden, die über ein entsprechendes Arsenal von Molekülen verfügen. Daher sind dendritische Zellen die verantwortlichen Zellen für die Polarisierung naiver T-Zellen. Die Untersuchung der an den Wechselwirkungen beteiligten Moleküle, z.B. Oberflächenantigene (CD40, CD80, CD86) und Zytokine (IL-12, IL-4), und deren Einfluß auf die Polarisierung der T-Zellen wird zukünftig die Frage der Th-2-Bildung beantworten und war Teil dieser Arbeit. - 22 - 1. Einleitung 1.3. Andere an der primären Immunantwort beteiligte Zellen Bei der primären Initiation des Immunsystems spielen in vivo natürlich noch weitere Zellgruppen wichtige Rollen, die aber als naive Zellen alle von dendritischen Zellen aktiviert werden können. Art der Reaktion und die zeitlichen Abläufe der Aktivierung verschiedener naiver Zelltypen sind im humanen System noch unklar. Welche Zellen zu welchem Zeitpunkt welche Zytokine sezernieren und damit die Polarisation der gesamten Immunantwort beeinflussen, soll daher in dieser Arbeit aufgeklärt werden. 1.4. Dendritische Zellen: Rolle in Klinik und Allergie 1.4.1. Prävalenz Daß die Prävalenz von Allergien in der westlichen Welt seit Jahren steigt, konnte vielfach belegt werden62 . Trotz umfangreicher epidemiologischer Arbeiten konnten Ursache und Auslöser dieser Entwicklung jedoch nicht gefunden werden, wohl aber beeinflussende Faktoren. Allergieprotektiv zeigte sich in diesen Studien z.B. der Kontakt mit Lipopolysaccharid, einem Hüllenbestandteil gram-negativer Erreger213 , der in vitro IFN-γ induziert. Zeitgleich mit den epidemiologischen Studien wurden in der experimentellen Immunologie entscheidende Fortschritte in der Entwicklung eines pathophysiologischen Modells der Allergieentstehung gemacht63 . 1.4.2. Pathomechanismus der Allergie 1.4.2.1. Effektorendstrecken: Eosinophile Granulozyten und Histamin Die verschiedenen klinischen Manifestationsformen der Allergie sind bedingt durch eosinophile Granulozyten, Histamin und verschiedene andere Mediatorenstoffe64 . Die löslichen Substanzen entstammen der Granula von Mastzellen und basophilen Granulozyten und werden nach Bindung von Immunglobulinen der Klasse E (IgE) an die zellständigen Fcε-Rezeptoren ausgeschüttet. Die physiologische Aufgabe des IgE ist die Abwehr von parasitären Erregern und Würmern65 . - 23 - 1. Einleitung 1.4.2.2. IgE und eosinophile Granulozyten IgE wird von B-Zellen unter dem Einfluß von IL-4 gebildet, welches von einer speziellen Gruppe der Th-Zellen produziert wird. Diese T-Zellen bilden auch IL-5, das zum Einstrom und zur Aktivierung eosinophiler Granulozyten führt66 . Zur Einleitung dieser Abläufe sind demnach T-Zell-produzierte Zytokine verantwortlich. Eosinophile Granulozyten binden über Komplement C3b und enthalten zytotoxische Substanzen (eosinophiles kationisches Protein = ECP, major basic protein = MBP) gegen die Allergene 67 . 1.4.2.3. Die Rolle dendritischer Zellen bei der Atopieentwicklung Die Polarisierung und Zytokinbildung der T-Zellen bildet sich nach Kontakt mit dendritischen Zellen aus. Die hier stattfindenden Wechselwirkungen sind demnach der erste Schritt der Atopieentstehung. Die Rolle der dendritischen Zellen in verschiedenen Erkrankungen ist daher Ziel einiger Studien gewesen. Die allergische Kontaktdermatitis gilt als Prototyp der zellvermittelten Hypersensitivitätsreaktion, in dem dendritische Zellen eine entscheidende Rolle im Sensibilisierungsprozeß spielen. Ihre Anzahl steigt in der Region des Antigeneintritts, angelockt durch Chemokine und Zytokine. Diese dendritischen Zellen initiieren dann den weiteren Allergieprozeß58,68. Da dendritische Zellen den Fcε-Rezeptor exprimieren können, wird ihnen auch eine wichtige Funktion bei anderen Erkrankungen des atopischen Formenkreises58 , wie dem exogenen Asthma oder der Rhinokonjunktivitis69 zugeschrieben. Neben der Initiation von allergiefördernden Abläufen kann der Ausbruch einer Erkrankung auch mit der Abnahme protektiver Faktoren zusammenhängen. Viele endogene inhibitorische Mechanismen des Asthmas sind eng mit den Funktionen von dendritischen Zellen verknüpft. Das von ihnen produzierte Zytokinspektrum, z.B. IL12 oder TGF-ß, umfaßt auch Hemmstoffe der Asthmaentstehung. Veränderungen dieses Spektrums könnten der Schlüssel zur Entstehung und Etablierung des Asthmas70 sein. Die Rolle der dendritischen Zellen während der Allergieentstehung sind in Abb. 6 zusammengefaßt. - 24 - 1. Einleitung Allergen Dendritische Zelle Mastzelle MHC B7 TCR CD28 IL-4 IL-12 IL-18 Th0 IL-2 IFN-γ Th1 Th2 IL-5 IL-4 IL-13 IgE IL-2 IFN-γ B-Zelle Eosinophiler Granulozyt Abb. 6: Schematische Darstellung der pathophysiologischen Abläufe der Allergie - 25 - 1. Einleitung 1.5. Problemstellung Die Entstehung von Th2-Mustern (im Sinne von IL-4 produzierenden Zellen) ist auf die Wechselwirkungen zwischen antigenpräsentierenden und naiven Zellen eingegrenzt worden. Die zeitlichen Abläufe, welcher Art diese Wechselwirkungen sind und wie die Polarisierung durch exogene, aber physiologische Substanzen beeinflußt werden kann, muß Ziel zukünftiger Forschung sein. 1.5.1. Anforderungen Zum Erreichen dieser Ziele ist es nötig, ein Modell zu entwickeln, in dem die prägenden Einflüsse dendritischer Zellen auf naive Zellen untersucht werden können. Der erste Schritt war die dazu notwendige Generierung dendritischer Zellen. Zu diesem Zweck wurden Stammzellen aus dem Nabelschnurblut isoliert und unter definierten Bedingungen kultiviert. Anschließend mußte gezeigt werden, daß es sich bei den angezüchteten Zellen um dendritische Zellen handelt. 1.5.2. Stammzellisolation In der Hierarchie hämatopoetischer Stammzellen ist die erste Zelle pluripotent und in der Lage zur extensiven Selbsterneuerung71 . In späteren Entwicklungsschritten gehen diese Fähigkeiten zurück und die Zelle ist weiter differenziert. Daher wurde in dieser Arbeit die frühe, pluripotente, durch das Oberflächenantigen CD34 gekennzeichnete Stammzelle als Zielzelle der Isolation gewählt. Der Prozeß der Stammzellisolation ist ausgesprochen kompliziert und bedeutend. Die Zellen müssen in einer ausreichenden Reinheit von > 95 % eingesetzt werden, da die Kulturen ansonsten nach einigen Tagen untergehen. Die Ursache für dieses Phänomen ist bislang ungeklärt. Daneben darf auch die eingesetzte Konzentration der Zellen nicht zu klein sein, da die Zellen zu Beginn der Kulturphase zu Wachstum und Entwicklung eine gewisse Dichte benötigen. - 26 - 1. Einleitung 1.5.2.1. Stammzelloberflächenantigene und -quellen Es gibt verschiedene Materialien, aus denen sich Stammzellen isolieren und dendritische Zellen generieren lassen: Knochenmark73,74, Nabelschnurblut 72 und peripheres Blut 73,76 . Da der Anteil an Stammzellen in peripherem Blut sehr gering ist, sind für Isolationen große Blutmengen nötig. Zwar kann der Anteil von Stammzellen durch die Gabe von GCSF erhöht werden, trotzdem bleibt die Isolation sehr aufwendig75 . Der Stammzellanteil in Knochenmark und Nabelschnurblut ist mit ca. 1,3 % in etwa gleich groß. Da der Zugang zu Nabelschnurblut technisch wesentlich einfacher, ungefährlicher und unbelastender für den Probanden ist (Punktion der Vena umbilicalis vs. Knochenmarkspunktion), ist die Anzahl der erreichbaren Spender beim Einsatz von Nabelschnurblut wesentlich größer. Zielmolekül der Isolation ist klassischerweise CD34, ein Marker für hämatopoetische Stammzellen. Daneben wurde in jüngster Zeit die Isolation unter Verwendung des Moleküls CD133 etabliert. Hierbei handelt es sich um eine alternative Selektionsmöglichkeit, von der vermutet wird, daß sie der CD34 Sortierung überlegen sei, weil sich CD133 nur auf stark CD34 exprimierenden Zellen findet, und diese Zellen eventuell früher in der Entwicklungsreihe der hämatopoetischen Zellen stehen77 . CD 34 ist ein Oberflächenglykophosphoprotein, das auf einem frühen Entwicklungsschritt der lymphohämatopoetischen Zellreihe ausgebildet wird. Es findet sich ferner auf be-stimmten Endothelzellen und embryonalen Fibroblasten78 . Da bekannt ist, daß CD34 positive Zellen alleine in der Lage sind, die Hämatogenese nach einer Auslöschung des Knochenmarks wieder zu reaktivieren, ist das Interesse an diesen Zellen für eine klinische Nutzung im Rahmen von autologen Stammzellretransplantationen oder für Gentherapiestudien groß und wächst mit Zunahme des Einsatzes dieser therapeutischen Verfahren weiter78 . Trotz dieser Nutzungsmöglichkeiten ist wenig über die eigentliche Funktion des CD34 bekannt. Neuere Ergebnisse an Endothelzellen weisen ihm die Aufgabe eines “homing”Rezeptors, also eines Adhaesionsmoleküls für Leukozyten bei Entzündungsprozessen, zu79 . Dies könnte auch die Aufgabe des CD34 auf den Stammzellen in der Knochenmarkumgebung sein. - 27 - 1. Einleitung In jüngster Zeit wurde in der Literatur darauf aufmerksam gemacht, daß verschiedene Oberflächenantigene, die mit CD34 gleichzeitig auf den Zellen exprimiert werden, auf die spätere Differenzierungsrichtung der Zellen hinweisen (s. Tab. 3). Tab. 3: Differenzierungsweg assoziierte Marker40, 80, 81 Differenzierungsweg assoziierte Oberflächenantigene Myeloid Erythroid B-Zellen Thymus / T-Zellen Dendritische Zellen CD33 CD71 CD10 CD38 CD86 CD34 CD34 CD34 CD5 CD34 CD7 CD34 1.5.2.2. Isolationsmethoden Zur Stammzellisolation in benötigter Reinheit und Ausbeute, bei gleichzeitig günstiger Kostenlage und Lebensfähigkeit der Zellen, hat sich die magnetassoziierte Zellselektion (MACS) durchgesetzt. 1.5.3. Kulturbedingungen Die Anzucht der Zellen folgte dem Protokoll von Caux et al.. Die Zellen wurden hierbei unter dem Einsatz von GM-CSF und TNF-α 14 Tage in Kultur gehalten und anschließend geerntet. Dieses ursprüngliche Protokoll wurde durch den Einsatz des Stamzellfaktors erweitert82 . 1.5.4. Nachweis dendritischer Zellen 1.5.4.1. Nachweiskriterien Dendritische Zellen sind durch unterschiedliche Charakteristika gekennzeichnet. Hierzu zählt ihr Phänotyp mit der eindrucksvollen Morphologie und den typischen Oberflächenmolekülkonstellationen. - 28 - 1. Einleitung Das Kennzeichen der dendritischen Zellen sind aber ihre Fähigkeiten, u.a. ihre Stimulationskapazität in der MLR. Sie sind die stärksten Stimulatorzellen von Memory-TZellen und die einzige Zellpopulation, die naive T-Zellen aktivieren kann. Diese Eigenschaften machen dendritische Zellen zu einem entscheidenen Bestandteil dieser Arbeit. 1.5.4.2. Nachweis des Phänotyps Der Phänotyp dendritischer Zellen umfaßt klassischerweise ihre lichtmikroskopische Darstellung und ihre in bestimmten Konstellationen auftretenden Oberflächenmoleküle. 1.5.4.2.1. Morphologie Schon Steinman wählte bei der Erstbeschreibung der dendritischen Zellen ihre lichtmikroskopische Morphologie als Erkennungsmerkmal. Der Zellkern wird von ihm als groß, lichtbrechend, in einer verdrehten Form vorliegend und gewöhnlich zwei kleine Nukleoli enthaltend, beschrieben. Das umgebende Zytoplasma ist in unterschiedlich weiten und langen Ausläufern plaziert und es enthält viele Mitochondrien6 . Die Morphologie wird bis heute immer noch als ein maßgebliches Kriterium angesehen, auch wenn sich die verschieden gewonnenen dendritischen Zellen morphologisch unterscheiden83 . Frisch isolierte dendritische Zellen zeigen ein rundliches Erscheinungsbild, gezüchtete dagegen die klassischen Ausläufer84 . Bereits anhand dieser Merkmale lassen sich Monozyten / Makrophagen von dendritischen Zellen differenzieren19 . Die lichtmikroskopische Betrachtung ist als ein Hauptkriterium bei der Beurteilung der Entwicklung von dendritischen Zellen zu beachten85 . 1.5.4.2.2. Oberflächenantigene Es gibt für humane dendritische Zellen kein spezifisches Oberflächenmolekül. Statt dessen treten je nach Art ihrer Generierung und ihres Entwicklungsstandes wechselnd verschiedene Kombinationen von Oberflächenmolekülen auf. Im Einklang mit der gängigen Literaturmeinung sind zur Identifikation von dendritischen Zellen die Oberflächenantigene CD1a, CD14, CD80, CD83 und CD86 nachzuweisen. Dies gilt insbesondere für stammzellgenerierte dendritische Zellen86 . - 29 - 1. Einleitung Das Vorliegen des Moleküls CD1a ist allgemein als Marker für dendritische Zellen anerkannt. Bei der CD1-Proteinfamilie handelt es sich um dem MHC verwandte Moleküle, die außerhalb der MHC-Genregion lokalisiert codiert werden. Die CD1 Proteine sind nicht polymorph, umfassen aber verschiedene Isotypen (CD1a,b,c,d und e). Diese Isotypen sind auf unterschiedliche Zellarten bei verschiedenen Lebewesen lokalisiert und nehmen im Rahmen der Antigenpräsentation unterschiedliche Aufgaben wahr 87, 88 . 1.5.5. Überprüfung der Funktionalität Der entscheidende Nachweis für das Vorliegen dendritischer Zellen wird durch die Prüfung ihrer funktionellen Eigenschaften in der MLR geführt. Die angezüchteten Zellen werden gemeinsam mit Effektorzellen kultiviert und deren Aktivierung durch Messung ihrer Proliferationsrate bestimmt. Effektorzellen können bei diesem Nachweis entweder Memory-T-Zellen oder naive T-Zellen sein. 1.5.5.1. Anforderungen an die T-Zellen Für die beschriebenen Experimente ist eine Reinheit der Effektorzellen von mehr als 99 % nötig, sonst besteht die Gefahr, daß sich in der kontaminierenden Restpopulation wiederum antigenpräsentierende Zellen befinden, die dann eventuell zu einer Autostimulation führen könnten. Da die absolute Menge der kontaminierenden Zellgruppe sehr viel größer wäre als die der eingesetzten dendritischen Zellen, wäre dann der stimulierende Effekt nicht mehr eindeutig zuzuordnen gewesen. Ein grundlegender Aspekt für diese Arbeit war die Naivität der als naiv bezeichneten Zellen. Naiv sind T-Zellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten. Sie sind durch das Oberflächenantigen CD45RA gekennzeichnet. Nach Antigenkontakt verliert sich CD45RA und statt dessen wird das Molekül CD45RO exprimiert89 . Demnach müßten alle sich im peripheren Blut befindlichen Zellen mit dem Antigen CD45RA naive T-Zellen sein (ca. 5 %). Dies wird jedoch von Autoren bestritten90 , die den Verlust des CD45RO als temporäres Phänomen interpretieren, das bei Zellen nach langer Zeit ohne spezifischen Antigenkontakt auftritt. Diese Zellen wären also trotz ihrer naiven Oberflächenmarker im Sinne der Definition nicht naiv, da sie bereits Antigenkontakt hatten. - 30 - 1. Einleitung Unstrittig naiv sind dagegen die T-Zellen des Nabelschnurblutes, die zu 95 % den Oberflächenmarker CD45RA tragen. Diese Zellen waren auf Grund ihrer Herkunft sicher noch keinem Antigen ausgesetzt und wurden daher für die vorliegenden Experimente verwendet91 . 1.5.5.2. Das Clusterphänomen Bei gemeinsamer Kultivierung von Effektorzellen mit dendritischen Zellen zeigt sich ein lichtmikroskopisch deutlich imponierendes Anlagerungsphänomen. Es bilden sich wolkenartige Komplexe, im englischsprachigen Raum als „Cluster“ bezeichnet, in denen sich die Effektorzellen an die Ausläufer dendritischer Zellen schmiegen92 . Diese Anlagerung ist ein Hauptkriterium für den Nachweis für dendritische Zellen, da diese "immunologischen Synapsen" morphologisches Substrat der stattfindenden Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und Effektorzellen sind93 . Andere als antigenpräsentierend eingesetzte Zellen zeigen kein derartiges Phänomen. 1.5.5.3. Stimulation von Memory-T-Zellen Gängiges Kriterium zum Nachweis dendritischer Zellen ist der Vergleich der induzierten Proliferationsraten von Memory-T-Zellen zwischen den als dendritisch bezeichneten Zellen und anderen antigenpräsentierenden Zellen, wie z.B. Monozyten. Dendritische Zellen zeichnen sich durch eine deutliche Überlegenheit, mit einer vielfach höheren induzierten Proliferationsrate, aus. 1.5.5.4. Stimulation naiver T-Zellen Im Gegensatz zu allen anderen Zellarten sind dendritische Zellen in der Lage, eine primäre Immunantwort auszulösen, d.h. naive T-Zellen zu aktivieren. Da diese Eigenschaft spezifisch ist, gilt dieses Kriterium als definierend für dendritische Zellen und muß erfüllt sein. - 31 - 1. Einleitung 1.6. Zielsetzung Für diese Arbeit ergab sich daher folgende Zielsetzung: Entwicklung eines in vitro-Modells der Initiation der primären Immunantwort Hierzu sollten folgende Teilaspekte verwirklicht werden: I. Grundlagen des in vitro-Modells: Generierung dendritischer Zellen aus hämatopoetischen Nabelschnurblutstammzellen, mit Optimierung von Stammzellisolation und Kulturbedingungen sowie der Klassifizierung der angezüchteten Zellen als dendritische Zellen. Meßparameter des Systems sollte der Nachweis von induzierten Zytokinen in Memory- und naiven T-Zellen sein. II. Stimulation der primären Immunabläufe durch den Einsatz verschiedener Zellarten Qualität und zeitliche Abläufe der induzierten Zytokine der an der primären Immunentstehung beteiligten Zellen sollen untersucht werden. III. Einfluß der interzellulären Wechselwirkungen auf die Zytokinmuster naiver T-Zellen In dem dann etablierten Modell soll der Einfluß verschiedener Moleküle (CD40 Ligand, B7-Komplex (CD80,CD86), IL-12 und IL-4) auf die Polarisierung der sich entwickelnden Effektor-Zellen untersucht werden. IV. Rolle exogener Einflüsse während der primären Immuninduktion Exogene Faktoren sollen in das Modell eingebracht und ihre Wirkungen auf dendritische Zellen und die dadurch veränderte Zytokininduktion naiver T-Zellen geprüft werden. - 32 - 2. Patienten, Material und Methoden 2. Probanden, Material und Methoden 2.1. Probanden Die eingesetzten Nabelschnurblutproben stammten von Neugeborenen, die zwischen dem 15.11.1995 und dem 30.6.1997 im Augusta-Krankenhaus und im ElisabethHospital in Bochum geboren wurden. Ausschlußkriterien waren Frühgeburtlichkeit, Schwangerschaftskomplikationen, sowie eine bekannte Hepatitis- oder HIV-Infektion der Mutter; hierdurch sollten Unreife, Defekte und Voraktivierung bzw. Transformierung des Immunsystems ausgeschlossen werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Patienten waren drei Jungen im Alter von drei, vier und sieben Jahren. Der dreijährige Patient hatte vier Brüder, die in Jugoslawien jung an opportunistischen Infektionen gestorben waren. Die beiden anderen Patienten waren Brüder. Alle drei Patienten wurden klinisch auffällig mit einer Pneumocystis carinii Infektion in den ersten Lebensmonaten. Eine Immunglobulinanalyse ergab einen Mangel an IgA und IgG, aber das Vorhandensein von IgM. Die Lymphozyten der Patienten exprimierten nach Stimulation mit PMA und Ionomycin keinen CD40 Liganden (CD154). Zehn ml heparinisiertes, peripheres Blut wurden direkt vor der therapeutischen intravenösen Gabe von Immunglobulinen für die dargestellten Versuche entnommen. Peripheres, adultes Blut wurde in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden, erwachsenen Probanden gewonnen und in Heparin aufgenommen. - 33 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.2. Eingesetzte Materialien Material Hersteller β-Aktin-Primer R&D Systems, Wiesbaden 10 ml serologische Pipette, steril Falcon/BD, Heidelberg 15 ml konische Röhrchen (Blue Max Jr.) Falcon/BD, Heidelberg 3 Amershan Pharmacia Biotec, H-Thymidin Buckinghamshire,UK 50 ml konische Röhrchen (Blue Max) Falcon/BD, Heidelberg Acrylamid Fluka Chemie, Buchs, CH Agarose Serva Ammonium Persulfat Merck, Darmstadt Amphotericin B Biochrom KG, Berlin Anti-CD14-MicroBeads Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Anti-CD14-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-CD1a-FITC Ortho Diagnostic Systems, Raritan, USA (Ortho-(OKT 6)-mune-Reagents) Anti-CD1a-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-CD34-PE Dianova, Hamburg Anti-CD3-Körper Geschenk von Prof. C. Heusser, Basel, CH Anti-CD3-PerCP Becton Dickinson, Heidelberg Anti-CD45RA-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-CD45RO-MicroBeads Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach anti-CD80-Körper (blockierend) Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main Anti-CD80-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-CD83-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-CD86-Körper (blockierend) Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main Anti-CD86-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-HLA-PerCP Becton Dickinson, Heidelberg Anti-IFN-γ-FITC (Maus IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg Anti-IgG2a+b-MicroBeads Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach - 34 - 2. Patienten, Material und Methoden Anti-IL-12-Körper (blockierend) Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main Anti-IL-12-PE Becton Dickinson, Heidelberg Anti-IL-4-Körper (blockierend) Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main Anti-IL4-PE (Maus IgG1) Becton Dickinson, Heidelberg Auflichtmikroskop OLYMPUS, Japan (Umkehrmikroskop) CK2 Beta-Counter (Liquid Scintillation) LKB-Wallak, Freiburg Borsäure Merck, Darmstadt Brefeldin A Sigma-Aldrich, Deisenhofen Brutschrank (CO2-Inkubator) Heraeus, Düsseldorf BSA (Albumin from bovine serum) Fluka Chemie, Buchs, CH BS-Säule Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach CD34 Progenitor Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach CD40 Ligand, löslich Alexis, Grünberg Chloroform Merck, Darmstadt Coatest Endotoxin Test Diapharma, Columbux, Ohio, USA Dextranblau Fluka Chemie, Buchs, CH Durchflußzytometer FACScan Becton Dickinson, Heidelberg Durchlichtmikroskop Zeiss, Jena EDTA Biochrom KG, Berlin Ethanol absolut Merck, Darmstadt FACS-Röhrchen Falcon/BD, Heidelberg FcR-Blocking-Reagenz Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach FCS Fetales Kälberserum Biochrom KG, Berlin (verschiedene Chargen) Ficoll-Trennlösung (Dichte 1,077 g/ml) Biochrom KG, Berlin Fuchs-Rosenthal-Zählkammer BD, Heidelberg G21-Nadel BD, Heidelberg G22-Nadel BD, Heidelberg G23-Nadel BD, Heidelberg Gelkammer Biometra, Göttingen (für horizontale Gelelektrophorese) - 35 - 2. Patienten, Material und Methoden Gewebekulturplatte (MULTIWELL), Falcon/BD, Heidelberg 24 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel GIT (Guanidine-Thiocyanate) Fluka Chemie, Buchs, CH Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- Leucomax, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg Stimulierender-Faktor (GM-CSF) HANKS (steril) Biochrom KG, Berlin Hanks balanced salts (HBSS) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Heparin-Natrium 100 I.E./ml Promonta, Hamburg („Vetren 200“) HEPES-Puffer Biochrom KG, Berlin IFN-γ-ELISA R&D Systems, Wiesbaden IFN-γ-Primer R&D Systems, Wiesbaden IL-4-ELISA R&D Systems, Wiesbaden IL-4-Primer R&D Systems, Wiesbaden Ionomycin Sigma-Aldrich, Deisenhofen Isomethylalkohol Merck, Darmstadt Isopropanol Merck, Darmstadt LPS Sigma-Aldrich, Deisenhofen Lysis II-Softwarepaket Becton Dickinson, Heidelberg MACS Multistand Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach MACS-Trennsäule Typ AS + Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach MACS-Trennsäule Typ MS+ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Makrophagen-Kolonie-Stimulierender- Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main Faktor Maus IgG1 Isotypkontrolle FITC Becton Dickinson, Heidelberg Maus IgG1 Isotypkontrolle PE Becton Dickinson, Heidelberg MidiMACS (Magnet) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Mikroskop-Aufsatz Zeiss, Jena MiniMACS (Magnet) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Mitomycin C Sigma-Aldrich, Deisenhofen Monensin Sigma-Aldrich, Deisenhofen Natriumazid Merck, Darmstadt Natriumpyruvat Biochrom KG, Berlin Neuramidase Sigma-Aldrich, Deisenhofen - 36 - 2. Patienten, Material und Methoden NK-Cell-Isolation-Kit Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Paraformaldehyd, Pulver Riedel-de Haen AG, Seelze PBS, steril Biochrom KG, Berlin PC-Software „GraphPad Prism“ GraphPad Software Incorporated, San Diego, USA Penicillin / Streptomycin Biochrom KG, Berlin Phenol Merck, Darmstadt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Polystyren Reagenzglas (mit Rundboden) Falcon/BD, Heidelberg Propidiumiodid (PI) Sigma-Aldrich, Deisenhofen rekombinantes, humanes IL-12 Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main rekombinantes, humanes IL-4 Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main RNA-Isolations-Kit StrataGen, Austin, Texas, USA RPMI 1640-Flüssigmedium Biochrom KG, Berlin Saponin Riedel-de Haen AG, Seelze Schafserythrozyten BAG Biologische Analysesysteme, Lich ß-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Deisenhofen Stammzellfaktor (SF) R&D Systems, Wiesbaden Thermoblock Biometra Tris Base Sigma-Aldrich, Deisenhofen Trypan Blau Fluka Chemie, Buchs, CH Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) R&D Systems, Wiesbaden Türk´sche Lösung Fluka Chemie, Buchs, CH Zellerntegerät (cell Harvester) Titertek, Oslo, Norwegen Zellkulturplatte (MICROTEST) Falcon/BD, Heidelberg 96 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel Zentrifuge (Omnifuge 2.0RS) Heraeus, Düsseldorf - 37 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.3. Magnet assoziierte Zellsortierung (MACS) 2.3.1. Grundlagen der Magnet assoziierten Zellsortierung Mit der Magnet assoziierten Zellsortierung wurde eine Technik zur Zellisolation ve rwendet, mit der schon kleinste Zellmengen aus heterogenen Zellpopulationen isoliert werden konnten. Die Lebensfähigkeit der sortierten Zellen blieb in hohem Maße erhalten und die Reinheit der gewonnen Fraktionen war sehr hoch. Die zu selektionierenden Zellen wurden mit einem spezifischen, paramagnetischen Antikörper, einem sogenannten MACSMicroBead, markiert, und über eine sich in einem permanenten Magnetfeld befindende Separierungssäule gegeben. Die magnetisch markierten Zellen verblieben an der Säule, die Unmarkierten nicht. Nachdem die Säule aus dem Magnetfeld entfernt wurde, konnten die an ihr verbliebenen Zellen eluiert werden. 2.3.2. Super-paramagnetische Antikörper (MACSMicroBeads) Es wurden sehr kleine (Durchmesser ca. 50 nm), aus Eisenoxid und Polysacchariden bestehende, hochspezifische Antikörper verwendet (sog. MACS MicroBeads), die sich in Kultur zersetzten und weder Funktion noch Überlebensfähigkeit der Zellen beeinflußten. 2.3.3. Separierungseinheit Die Separierungseinheit bestand aus einem starken Dauermagneten an einem Ständer und einer Separierungssäule, ein ferromagnetisches Gerüst mit räumlich kleinen strukturellen Einheiten in einem Plastikgefäß. Beim Einbringen der Säule in das Magnetfeld des Dauermagneten resultierten sehr starke, räumlich kleine Magnetfelder. In unmittelbarer Nähe der so konstruierten Säule wurden 10 000mal stärkere Felder erzeugt, als dies mit üblichen geometrischen Strukturen möglich gewesen wäre. Bei Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld erfolgte durch diese Struktur eine schnelle Entmagnetisierung der Antikörper, so daß eine zügige Eluation der Zellen aus der Säule ermöglicht wurde, ohne ihnen Schaden zuzufügen (s. Abb. 7). - 38 - 2. Patienten, Material und Methoden Trennsäule Magnetfeld Magnet Ferromag. Gerüst Gefäß O O O OO O OO Zellen in Puffer Abb. 7: Schematische Darstellung der Separierungseinheit 2.3.4. Selektionsstrategien Die MACS bietet prinzipiell zwei Möglichkeiten zur Zellisolierung: entweder die posit ive oder die negative Selektion (Depletion). Bei der positiven Selektion wurden gegen bestimmte Oberflächenmoleküle der Zielzellen gerichtete Antikörper verwendet, so daß diese Zellen auf der Säule verblieben und nach Entnahme aus dem Magnetfeld eluiert und genutzt werden konnten. Bei der Depletion wurden alle Zellen außer den Zielzellen markiert und die Unmarkie rten aufgefangen, nachdem sie die Säule passiert hatten. 2.3.5. Markierungsmöglichkeiten Zellen konnten entweder direkt, d.h. mit einem hochspezifischen, paramagnetisch gekoppelter Antikörper gegen die zu erkennende Antigenstruktur der Zielzelle, oder indirekt markiert werden. - 39 - 2. Patienten, Material und Methoden Bei der indirekten Markierung wurde ein primär ungekoppelter Antikörper gegen die Zielstruktur verwandt und, in einem zweiten Inkubationsschritt, ein Zweiter, gegen die Fc-Struktur des Ersten gerichteter Antikörper eingesetzt (s. Abb. 8). Indirekte Markierung Direkte Markierung Abb. 8: Schematische Darstellung der Markierungsmöglichkeiten von Zellen durch MicroBeads. Direkte Markierung mit einem paramagnetischen Antikörper, der spezifisch gegen ein bestimmtes Oberflächenantigen ist. Indirekte Markierung mit einem MicroBead, der gegen die Fc-Struktur eines spezifischen Antikörpers gerichtet ist. 2.3.6. Inkubation Die Antikörpermengen wurden in Vorexperimenten ermittelt, in der Regel wurde das Volumenverhältnis 1 : 5 von Antikörper zu Zellen beachtet. Als Bezugskonzentration galten hierbei 1 x 107 Zellen pro 80 µl Puffer, zu denen dann 20 µl Antikörper gegeben wurden. Die Inkubationen erfolgten für 15 min bei 6° C (Kühlschranktemperatur). Die jeweils günstigsten Puffer (HBSS, PBS, bei Bedarf mit EDTA und / oder BSA) wurden in Vorexperimenten ermittelt. Zwischen den Inkubationen erfolgten entsprechende Waschschritte. - 40 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.3.7. Verwendung der Separationseinheit Die mit Antikörpern beladenen Zellen wurden in einer der Zellmenge und Separationseinheit entsprechenden Puffermenge (laut Herstellerangabe) auf die Separationssäule gegeben und entsprechend gespült, danach wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und die gebundenen Zellen nach Pufferzugabe unter Druck aus der Säule entfernt und in einem 15 ml Röhrchen mit Schraubverschluß aufgefangen. 2.3.8. Isolierte Zellarten Folgende Zellgruppen wurden mit Hilfe der MACS isoliert und verwendet: CD34 positive hämatopoetische Stammzellen (aus Nabelschnurblut) Natürliche Killerzellen (aus Nabelschnurblut) CD45 RA - positive Zellen (aus Nabelschnurblut und peripherem Blut) Naive T-Zellen (aus Nabelschnurblut) Memory-T-Zellen (aus peripherem Blut) Monozyten (aus peripherem Blut) Falls nicht gesondert angegeben, erfolgte die Isolierung streng nach Herstellerprotokoll. - 41 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.4. Anzucht dendritischer Zellen 2.4.1. Blutalter Das Alter des Blutes (Entnahmezeitpunkt bis Beginn des Experimentes) wurde erfaßt. 2.4.2. Gewinn von Nabelschnurblut Nabelschnurblut wurde nach Abnabelung der Kinder steril aus der Vena umbilicalis der Plazenta entnommen und zu 10 ml einer gerinnungs- und keimhemmenden Pufferlösung in sterile 50 ml Becher mit Schraubverschluß gegeben. Pufferlösung: 20 ml Heparin-Natrium 100 I.E./ml, 1 ml HEPES 1 M, 1 ml Penicillin 10 000 I.E. /ml / Streptomycin 10 000 I.E. /ml, 1 ml Amphotericin 250 µg/ml; ad 100 ml HBSS Die mononukleäre Zellphase wurde entsprechend peripherem Blut gewonnen und als CBMC (Cord Blood Mononuclear Cells) bezeichnet (siehe auch 2.4.3); die Zellzahl wurde in einer Neubauer-Zählkammer erfaßt. 2.4.3. Isolation von CD34 positiven Zellen (hämatopoetische Stammzellen) aus mononukleären Nabelschnurzellen Die Stammzellen wurden durch eine indirekte, positive Magnet-assoziierte-Zell-Sortierung (MACS) gewonnen, d.h. die das Oberflächenantigen tragenden Zellen wurden mittels eines unmarkierten, hochspezifischen Antikörpers gegen CD34 und einem paramagnetisch beladener Sekundärantikörper aus der Menge der CBMC isoliert . - 42 - 2. Patienten, Material und Methoden Dazu wurde zuerst das gewonnene Zellpellet mononukleärer Zellen mit 50 µl Immunglobulinen resuspendiert, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend die Zellen mit 50 µl CD34 - Antikörper gemischt und für 15 min bei 4 - 6° C inkubiert. Danach wurden die Zellen in 10 ml HANKS aufgenommen und bei 350 g gewaschen. Das entstandene Zellpellet wurde in 200 µl HANKS und 50 µl Sekundärantikörper, welche mit MACSBeads markiert und gegen den Fc-Anteil des Anti-CD34-Antikörpers gerichtet waren, aufgenommen und gemischt und nach einer Inkubation von 15 min bei 4 - 6 ° C wurden die Zellen bei 350 g erneut 10 min gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 400 µl pro 1 x 108 Zellen eisgekühltem HANKS aufgenommen und auf eine, sich in einem Magnetfeld befindende, MiniMACS-(MS-)Säule gegeben, die zuvor gekühlt und mit 500 µl eisgekühltem HANKS gespült worden war. Die mit Antikörpern markierten Zellen blieben in dem Magnetfeld an der Säule hängen. Die Säule wurde viermal mit jeweils 500 µl eiskaltem HANKS gespült, was nicht an die Säule gebundene Zellen auswusch, dann wurde sie aus dem Magnetfeld entfernt. Jetzt gab man 1000 µl eiskaltes HANKS auf die Säule und drückte dies mit einem Stempel durch. Durch den mechanischen Druck wurden die Zellen von der Säule entfernt und in ein bereitgestelltes 15 ml Gefäß gespült. Diese Zellen wurden auf eine zweite, auf gleiche Art und Weise vorbereitete, Säule gegeben. Die neue Säule wurde wie die Erste gespült, man entfernte die Zellen jedoch schließlich mit 500 µl HANKS in ein 15 ml Gefäß mit Schraubverschluß. Die Zellzahl wurde in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer ermittelt und auf eine Zellkonzentration von 1,25 x 105 / ml Kulturmedium eingestellt. Die Reinheit der Sortierung (Anteil der CD 34 positiven hämatopoetischen Stammzellen) wurde durchflußzytometrisch zu verschiedenen Zeitpunkten der Sortierung bestimmt. Die Zeitpunkte waren: 1. In den CBMC 2. Vor der Sortierung 3. Nach der ersten MACS-Säule 4. Nach der zweiten MACS-Säule - 43 - 2. Patienten, Material und Methoden Das Kulturmedium bestand aus: RPMI 1640 mit 10 % Fetalem Kälberserum verschiedener Chargen und 4 % Zusatzlösung, bestehend aus: Natriumpyruvat 100 mM, L-Glutamin 200 mM, nicht-essentiellen Aminosäuren (L-Alanin, L-Asparagin x H2 O, L-Glutamat, Glycin, L-Prolin, L-Serin), Penicillin 10 000 I.E. / ml, Streptomycin 10 000 I.E. /ml; gemischtes Verhältnis 1:1:1:0,5:0,5. dazu wurden, wie unten beschrieben, Wachstumsfaktoren hinzugefügt. Alle Arbeitsschritte und verwendeten Substanzen waren steril. 2.4.4. Wachstumsfaktoren 2.4.4.1. Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor (GM-CSF) Nach der Sortierung wurden die CD 34 positiven Zellen mit variierende Mengen des Differenzierungs- und Wachstumsfaktors GM-CSF kultiviert: Es wurden 2 ng; 0,2 ng; 0,02 ng; 0,002 ng je pro 200 µl eingesetzt. Am 14. d wurden die Zellmengen in der Neubauer-Zählkammer und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch bestimmt. 2.4.4.2. Stammzellfaktor (SF) Es wurden Kulturen mit 10 ng / ml SF und ohne SF bei konstanter Menge der übrigen Stimulanzien angezüchtet, die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch am 14. d bestimmt. - 44 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.4.4.3. Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α ) Es wurden Kulturen mit 5 ng / ml TNF-α und ohne TNF-α bei konstanter Menge der übrigen Stimulanzien angezüchtet, die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch am 14. d bestimmt. 2.4.4.4. Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor (M-CSF) Verschiedene Wachstumsfaktoren wurden getestet. Dabei wurde M-CSF unter folge nden Bedingungen eingesetzt: 5 oder 20 Internationale Einheiten (Units) / ml jeweils am 1. und / oder 10. Tag. Am 14. d wurden die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch bestimmt. 2.4.4.5. Verschiedene Chargen Fetalen Kälberserums (FCS) Es wurden Kulturen mit verschiedenen Chargen des FCS bei konstanter Menge der Stimulanzien angezüchtet und sowohl die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer als auch die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch am 14. Tag bestimmt. 2.4.4.6. Kontaminierendes Lipopolysaccharid (LPS) Der Gehalt an kontaminierendem LPS in den verschiedenen Chargen des FCS wurde durch den COATEST Endotoxin Test ermittelt, der auf der Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-Methode beruhte. LAL war ein Reagenz, das aus den gereinigten Zellen des Limulus polyphemus, einer Krabbenart, gewonnen wurde. Es enthält ein Enzymsystem, das durch Endotoxin aktiviert wurde und durch Spaltung von S-2423 den gelben Farbstoff para-nitro Anilin (pNA) freisetzte, der photometrisch bei 405 nm gemessen werden konnte, um die Menge des Endotoxins zu quantifizieren. Zur Messung wurde das Endpunktverfahren mit Mikrotiterplattenmethode gewählt. Pro Platte wurden 50 µl Probe oder Standard gegeben und 5 min bei 37° C inkubiert. Hierzu kamen 50 µl LAL-Lösung, dann erfolgte 5 min Inkubation bei 37° C. Nach Zugabe von 100 µl Substrat-Puffer Lösung erfolgte ein weiterer Inkubationsschritt für 5 - 45 - 2. Patienten, Material und Methoden min bei 37° C. Nach Zugabe von 20 % Essigsäure konnte die Probe im ELISA-Reader bei 405 nm gemessen werden. Die Werte wurden mittels einer Standardkurve ermittelt97 . 2.4.5. Zellkultur Die CD34 positiven Zellen wurden in einer Zellmenge von 2,5 x 104 Zellen in 200 µl Kulturmedium in eine F96-Mikrowell-Flachbodenplatte eingebracht und in einem mit 5 % CO2 begasten Brutschrank bei 37° C kultiviert. Anfangs wurde jedem Senkloch 0,2 ng GM-CSF, 10 ng SF und 5 ng TNF-α je pro ml als Stimulanzien zur Zellvermerung und -ausreifung zugefügt. Bei genügender Fülle wurde der Inhalt eines Senkloches auf zwei verteilt. Am 7. Tag erfolgte eine Nachstimulation der Zellen durch eine erneute Zugabe der Stimulanzien in der gleichen Menge wie bei der Erststimulation. Die Zellen wurden nach 14 d geerntet. 2.4.6. Reifung der dendritischen Zellen Teile der dendritischen Zellen wurden an Tag 14 zur weiteren Ausreifung gebracht. Dies geschah durch den Einsatz verschiedener Stimulanzien. Dies waren: 10 ng / ml; 1 ng / ml; 0,1 ng / ml GM-CSF; 50 ng / ml; 5 ng / ml; 0,5 ng / ml TNF-α; 10 ng / ml GM-CSF und 5 ng / ml TNF-α; 1 ng / ml; 10 ng / ml; 100 ng / ml löslicher CD40 Ligand mit 1 µg/ ml Verstärker; 100 µg / ml; 10 µg / ml; 1 µg / ml; 0,1 µg / ml LPS mit 10 ng / ml GM-CSF. Die Oberflächenantigene wurden durchflußzytometrisch nach 24 Stunden bestimmt. - 46 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.4.7. Visuelle Nachweise Die durchlichtmikroskopische Darstellung der angezüchteten Zellen wurde fotografisch festgehalten. Dies geschah mittels einer herkömmlichen Photokamera. Auch die zusammengelagerten Komplexe der GLR wurden auf diese Weise fotografiert. 2.4.8. Durchflußzytometrische Darstellung der Oberflächenantigene Aus jeder Zellfraktion wurden für jede Messung ca. 1 - 2 x 105 Zellen entnommen und diese Zellmenge in 100 µl HBSS mit Natriumazid aufgenommen und mit den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen des jeweiligen Antikörpers für 20 min bei 4 ° C inkubiert; anschließend der Überschuß an nicht gebundenen Antikörpern mit je 1 - 2 ml HBSS mit Natriumazid für 5 min bei 200 g ausgewaschen. Für die durchflußzytometrische Messung nahm man die gefärbten Zellpellets schließlich in je 250 µl HBSS mit Natriumazid auf. Folgende Antikörper fanden zur Messung der Stammzellreinheit (CD 34 positive Zellen) Verwendung: Anti-CD 34 - PE (QBEND 10) Dianova Folgende Antikörper fanden zur Messung der Zelldifferenzierung Verwendung: Anti-CD 14 - PE Becton-Dickinson Anti-CD 1a - FITC Ortho (OKT 6) Anti-CD 80 - PE Becton-Dickinson (PharMingen) Anti-CD 86 - PE Becton-Dickinson (PharMingen) Anti-CD 83 - PE Becton-Dickinson (PharMingen) Anti-HLA-DR- PerCP Becton-Dickinson - 47 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.5. Gemischte Leukozyten Reaktion (MLR) 2.5.1. Grundlagen der Gemischte Leukozyten Reaktion Mit der gemischten Leukozyten Reaktion wurde der Einfluß bestimmter Zellgruppen (als Stimulatorzellen) auf andere Zellgruppen (Responderzellen) überprüft. Diese Stimulatorzellen waren antigenpräsentierende Zellen und regten die Responderzellen eine rseits zur Proliferation, andererseits zur Zytokinproduktion an. 2.5.2. Probengewinn Für jedes Experiment diente das Blut zweier Probanden. Genauere Hinweise zur Art und Gewinn des Blutes siehe in den entsprechenden Abschnitten. 2.5.3. Gewinn mononukleärer Zellen Das Blut wurde im Verhältnis 1:1 mit HANKS Salzlösung verdünnt, mit Ficoll 1.077 g / ml unterschichtet und anschließend mit 550g für 20 Minuten in einem 50 ml Röhrchen zentrifugiert. Die aus mononukleären Zellen entstandene Interphase wurde abpipettiert und mit HANKS einmal bei 350g und einmal bei 300g gewaschen. Es folgte eine Zellzahlbestimmung nach Anfärbung mit Türk´scher Lösung in einer Neubauer-Zählkammer. Anschließend wurden die Zellen noch einmal mit HANKS bei 350g gewaschen und als Zellpellet belassen. Diese Zellgruppe wird im Weiteren als PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) bezeichnet. Diente Nabelschnurblut als Ausgangsmaterial, handelte es sich um CBMC (Cord Blood Mononuclear Cells). - 48 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.5.4. Zellen in der MLR 2.5.4.1. Zellgruppen der konventionellen MLR 2.5.4.1.1. Neuramidase-Behandlung von Schafserythrozyten Der Ansatz einer MLR wurde zunächst exemplarisch an einer gängigen Form der MLR getestet. Hierzu wurde die T-Zell-Isolation unter Verwendung von Schafserythrozyten durchgeführt, deren Oberflächenspannung vorher durch Neuramidase verringert wurde. Dazu wurden 20 ml Schafserythrozyten zweimal mit sterilem PBS-Puffer bei 800 g 5 min gewaschen; anschließend das Zellpellet in 20 ml PBS-Puffer aufgenommen und unter Zugabe von 0,5 Units Neuramidase 30 min in einem 37° C warmen Wasserbad inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 50 ml Medium aufgenommen. Das Medium bestand aus: RPMI 1640, 20 % Fetalem Kälberserum, 1 % Penicillin 10 000 I.E. / ml / Streptomycin 10 000 I.E. /ml 0,01 M Hepes 2.5.4.1.2. Präparation von humanen, peripheren T-Zellen und akzessorischen Zellen Die mononukleären Zellen wurden nach dem letzten Waschgang in 2 - 3 ml RPMI 1640 Medium aufgenommen. Pro 1 x 108 mononukleären Zellen gab man 1 - 2 ml vorbeha ndelte Schafserythrozyten zu und mischte diese gründlich. Die Suspension wurde vorsichtig auf 15 ml Ficoll geschichtet und 20 min bei 550 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befanden sich die T-Zellen, über ihren Rezeptor CD2 an die Schafserythrozyten gebunden, als sogenannte Rosetten am Boden des Gefäßes. Diese Zellen bezeichnete man als E+ -Zellen. In der Interphase befanden sich die sog. E- -Zellen (B-Zellen, Monozyten und einige NK-Zellen). - 49 - 2. Patienten, Material und Methoden Der Überstand wurde bis zur Interphase vorsichtig abpipettiert und verworfen. Die Interphase wurde ebenfalls abpipettiert und in ein 15 ml Gefäß mit Schraubverschluß gegeben. Zur späteren Verwendung der E- -Zellen als akzessorische Zellen wusch man die Zellen mit eiskaltem PBS 0,01 % EDTA und lagerte sie bis zur Kultivierung auf Eis. Zur Gewinnung der E+ -Zellen mußten die Schafserythrozyten lysiert werden. Hierzu gab man die Zellen 4 - 7 min in einen 1 zu 10 verdünnten NH4 Cl-Puffer und wusch sie anschließend mit RPMI 1640 zweimal bei 350 g 10 min. 2.5.4.2. Gewinnung der gezüchteten Zellen Zum Lösen der adhaerierten Zellen nach Kultur wurden die Zellkulturplatten 15 min auf Eis inkubiert, dann die Zellen unter intensivem Resuspendieren in ein 50 ml Röhrchen mit Schraubverschluß überführt. Die Zellzahl wurde nach Zentrifugation (10 min bei 350 g) in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Anschließend wurden die Zellen zur Verhinderung weiterer Proliferation mit 50 µl Mitomycin C / 1 x 107 Zellen 30 min in einem Wasserbad bei 37° C inkubiert, danach mit eiskaltem HANKS bei 350 g 10 min zweimal zentrifugiert, und die Zellzahl erneut in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril. 2.5.4.3. Gewinnung von Monozyten Das verwendete Blut wurde in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden, erwachsenen Probanden entnommen, in Heparin aufgenommen und die mononukleäre Zellphase gewonnen. Die Isolation der Monozyten erfolgte durch eine direkte, positive MAC-Sortierung mit Anti-CD33-MicroBeads, einer AS-Säule mit G23 Nadel und HANKS als Puffer. Anschließend wurden diese Zellen ebenfalls zur Verhinderung der Proliferation mit 50 µl Mitomycin C / 1 x 107 Zellen 30 min in einem Wasserbad bei 37° C inkubiert, danach mit eiskaltem HANKS bei 350 g 10 min zweimal zentrifugiert, und es erfolgte die Zellzahlbestimmung in einer Neubauer-Zählkammer. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril. - 50 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.5.4.4. Gewinnung von peripheren (Memory-) T-Zellen und naiven T-Zellen Das verwendete Blut wurde zum Gewinn der peripheren T-Zellen in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden, erwachsenen Probanden entnommen und in Heparin aufgenommen. Zum Gewinn der naiven T-Zellen wurde Nabelschnurblut verwendet. Die mononukleäre Zellphase wurde gewonnen. Die Isolation der T-Zellen erfolgte durch eine indirekte, positive MAC-Sortierung mit einem primären Anti-CD3-Körper und einem sekundären Anti-IgG2 a+b-MACSMicrobead, einer AS-Säule mit G22 Nadel und RPMI 1640 Medium mit 2 % FCS als Puffer. Die gewonnen Zellen wurden dann 10 min bei 350 g zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril. 2.5.4.5. Gewinnung von CD45 RA positiven Zellen CD45RA positive Zellen wurden aus mononukleären Nabelschnurzellen durch direkte Depletion der CD45RO Zellen gewonnen. Das Zellpellet wurde hierzu in 20 µl HANKSPuffer und 80 µl CD45RO- MicroBeads pro 1 x 107 Zellen aufgenommen. Die Sortierung erfolgte mittels einer AS-Säule mit G22 Nadel und RPMI 1640 Medium (2 % FCS). Die gewonnenen Zellen wurden dann 10 min bei 350 g zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril. 2.5.4.6. Gewinnung von NK-Zellen Zur Isolation der NK-Zellen wurde ein kommerzielles Kit verwendet, daß die Nicht-NKZellen indirekt depletierte. Die mononukleären Nabelschnurzellen wurden mit einem Gemisch von Hapten-gekoppelten Antikörpern gegen CD3 (T-Zellen), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen), CD36 (Stammzellen) und anti-IgE inkubiert, danach ein MACSMicroBeads gegen das Hapten eingesetzt. Die Isolation erfolgte über eine BSSäule mit G21 Nadel (HANKS als Puffer). Die gewonnen Zellen wurden dann 10 min bei 350 g zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril. - 51 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.5.5. Ansatz einer Mixed Leukocyte Reaction (MLR) Die Responder- und Stimulatorzellen jeweils unterschiedlicher Spender wurden in verschiedenen Mengen miteinander in einem Brutschrank mit 8 % CO2 eine Woche kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in dem beschriebenen Kulturmedium. Um die Proliferation der Stimulatorzellen zu verhindern, wurde ihre DNA-Synthesefähigkeit gehemmt; hierzu wurden diese Zellen vor Ansatz der Kultur für 30 min bei 37° C in einem Wasserbad mit 50 µl Mitomycin C pro 1 x 107 Zellen inkubiert, und anschließend zweimal bei 350 g 10 min mit dem Kulturmedium gewaschen. Zur Messung der Proliferation wurden 0; 5 x 102 ; 5 x 103 und 5 x 104 Stimulatorzellen eingesetzt. Zu diesen wurden jeweils 2,5 x 104 ; 5 x 104 oder 1 x 105 Effektorzellen gegeben. Zur Messung der intrazellulären Zytokine und Oberflächenantigene wurden zu 0; 5 x 102 ; 5 x 103 und 5 x 104 Stimulator- jeweils 1 x 105 Effektorzellen gegeben. 2.5.6. Zugabe exogener Stimulanzien in die MLR Um verschiedene Effekte und Wechselwirkungen zu prüfen, wurden teilweise zusätzlich zu den Stimulator- und Effektorzellen weitere, exogene Substanzen in die Kultur gegeben. Hierbei handelte es sich um monoklonale Antikörper (gegen CD3, CD80, CD86, IL-4, IL-12), rekombinante Zytokine (IL-4, IL-12) oder bakterielle Produkte (LPS). Die Substanzen wurden in unterschiedlichen Mengen eingesetzt (Tab. 4). Tab.4: Eingesetzte Substanzen und Mengen Substanz Eingesetzte Mengen anti-CD3 10 µg / ml 1 µg / ml 0,1 µg / ml anti-CD80 20 pg / ml 4 pg / ml 0,8 pg / ml 0,16 pg / ml anti-CD86 20 pg / ml 4 pg / ml 0,8 pg / ml 0,16 pg / ml anti-IL-4 50 pg / ml (1250 I.E.) 10 pg / ml (250 I.E.) 2 pg / ml (50 I.E.) 0,4 pg / ml (10 I.E.) anti-12 10 pg / ml 2 pg / ml 0,4 pg / ml 0,08 pg / ml rek. IL-12 500 I.E./ ml 50 I.E. / ml 5 I.E. / ml rek. IL-4 500 I.E. / ml 250 I.E. / ml 25 I.E. / ml LPS 10 µg / ml 1 µg / ml 0,1 µg / ml - 52 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.6. Messung der Effektorzellproliferation Zur Untersuchung des Proliferationsverhaltens wurden nach 48; 72; 96 h die Zellen mit 10 µCi/ml 3 H-Thymidin (37mbq, entsprechend 1 mCi/ml) für 24 h gepulst. Über ein Zellerntegerät wurden die zellulären Bestandteile gewonnen und in einem Beta-Counter analysiert und die Ergebnisse in radioaktiven Zerfällen pro Minute (counts per minute) dargestellt. 2.7. Analytische Durchflußzytometrie 2.7.1. Grundlagen der Durchflußzytometrie Das Prinzip der Durchflußzytometrie war die simultane Messung verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften einzelner Zellen oder Partikel, die hintereinander in einem Flüssigkeitsstrom angeordnet untersucht wurden. Dabei erfolgte die Analyse von Zellen über die gleichzeitige Bestimmung ihrer Fluoreszenzintensität und ihres Streulichtes. 2.7.2. Aufbau eines Durchflußzytometers Zur Analyse wurde die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 20 Millionen Zellen pro Milliliter über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die aus Quarzglas bestehende Meßküvette eingeführt. Die Zellen passierten, von einem Hüllstrom umgeben, den Analysepunkt. Der Hüllstrom diente dazu, den Probestrom im Zentrum der Meßküvette zu stabilisieren und so zu verengen, daß die Zellen hintereinander, einzeln, zum Analysepunkt gelangten (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung) (s.Abb. 9). - 53 - 2. Patienten, Material und Methoden Abb. 9 : Darstellung der Durchflußzytometrie: Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung 2.7.3. Messung der Lichtstreuung Die Lichtstreuung wurde definiert als physikalischer Prozeß, bei dem die Zelle mit dem einfallenden Lichtstrahl interagiert. Hierbei wurde nur die Richtung, nicht die Wellenlänge des Lichtes verändert. Zur Lichtstreuung trugen folgende Zelleigenschaften bei: - Zellgröße - Zellmembran - Zellkern - intrazelluläre granuläre Bestandteile - 54 - 2. Patienten, Material und Methoden Das Licht wurde nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut; der größte Anteil fiel in die Vorwärtsrichtung (d.h. entlang des einfallenden Lichtstrahls) und ist hauptsächlich ein Maß für die Zellgröße (Vorwärtsstreulicht). Das im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht hing von der Zelldichte und der Granularität, jedoch nur zum geringen Teil von der Zellgröße ab (Rechtwinkelstreulicht). 2.7.4. Messung der Fluoreszenz Mittels eines 15 MW Argon-Lasers wurden Fluoreszenzfarbstoffe zur Emission von Lichtquanten bestimmter Wellenlänge angeregt. Diese Anregung geschah durch Licht mit der Wellenlänge von 488 nm. Dabei konnten mehrere Farbstoffe mit ähnlichem Absorptionsspektrum und unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet werden. 2.7.5. Signalverarbeitung Passierte eine Zelle den Analysepunkt, wurden Signale vom Vorwärtsstreulicht, Rechtwinkelstreulicht und den Fluoreszenzen gemessen. Dies geschah durch eine Kombination von Signalmessung und -verstärkung. Dieses analoge Signal wurde dann in ein computergerechtes Digitalsignal verwandelt. 2.7.6. Datenauswertung Die Daten wurden mit der Software LYSIS II, entweder als Histogramm oder als korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot Plot) aufgetragen, ausgewertet. - 55 - 2. Patienten, Material und Methoden Im Histogramm stellte dabei die vertikale Achse die Intensität des Signals dar, die horizontale Achse die Anzahl der Zellen. In der korrelierten Zweiparameterdarstellung (Dot plot) wurde ein Signalpaar gleichzeitig abgebildet. Die beiden Intensitätsachsen wurden gegeneinander aufgetragen. In die so gebildete Matrix wurde jeweils dort ein Punkt eingezeichnet, an dem sich die Intensitätswerte der beiden Parameter einer gegebenen Zelle schneiden. Abb. 10: Dot Plot Abb. 11: Histogramm: Ein-Punkt-Darstellung. Auf der x-Achse wird die Stärke des Signals dargestellt, auf der y-Achse die Anzahl der markierten Zellen. - 56 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.7.7. Autofluoreszenz und Qualitätskontrolle Viele Zellen zeigten bei der Anregung mit 488 nm auch ohne Anfärbung eine gewisse Fluoreszenz. Dieses als Autofluoreszenz bezeichnete Signal war Fluoreszenzlicht, welches ungefärbte Zellen aufgrund seiner eigenen chemischen Zusammensetzung emittieren. Zur Qualitätssicherung wurde zu einer Probe unbehandelter Zellen noch ein unspezifischer Antikörper gleicher Klasse, Subklasse und Fluoreszenzfarbstoff wie der Meßfarbstoffantikörper gegeben, nach entsprechender Inkubation diese Kontrolle gemessen und als Negativwert festgelegt. Messungen, deren Intensität dann über den Werten der Kontrollmessung lagen, galten als positiv. 2.7.8. „LIST-MODE“ Datenaufnahme Der Durchflußzytometer war so konzipiert, daß er bis zu 5 Eigenschaften (2 Lichtstreuungen und 3 Fluoreszenzen) an einzelnen Zellen simultan messen konnte. Die Meßwerte wurden in der sogenannten Fünf-Parameter LIST-MODE Datenaufnahme aufgeno mmen. Das heißt, daß alle fünf Eigenschaften der analysierten Zelle hintereinander notiert und als Liste gespeichert wurden. 2.7.9. Färbung der Oberflächenantigene Die Differenzierung der mononukleären Zellen bzw. der angezüchteten Zellen erfolgte durchflußzytometrisch anhand der Streulichteigenschaften und mit Hilfe monoklonaler, gegen Leukozytenoberflächenantigene gerichtete Antikörper. Die Antikörper waren direkt an die Fluoreszenzfarbstoffe Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phyoerythrin (PE) oder Peridininchlorophyll (PerCP) gekoppelt. - 57 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.7.10. Färbung der intrazellulären Zytokine 2.7.10.1. Effektorzellen Die intrazellulären Nachweise der Zytokine IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ in Effektorzellen wurden in Anlehnung an die von Jung et al. entwickelte Methode ebenfalls durchflußzytometrisch mittels fluoreszenzmarkierter Zytokin-Antikörper durchgeführt94 . Hierzu wurden die Zellen mit Phorbolester und Ionomycin stimuliert und die intrazellulären Transportprozesse durch Zugabe von Monensin unterbrochen. Dies führte zu einer Akkumulation der Zytokine im Golgi-Apparat und damit zu einem durchflußzytometrisch meßbaren Signal auf Einzelzellniveau. Die Zellen wurden für diese Messung 10 min in 4 % Paraformaldehyd fixiert, und zweimal 10 min bei 300 g gewaschen. Die Zytokinfärbung (je 10 µl anti-IL-4-PE oder anti-IFN-γ-PE pro 2x105 Zellen in 100 µl Puffer) erfolgte für 10 min bei 4-6 Grad in 10 % Saponinpuffer. Die Zellen wurden dann für 5 min bei 250 g gewaschen und zur Messung in 250 µl HBSS aufgenommen. 2.7.10.2. Dendritische Zellen Zur Messung von Zytokinen in dendritischen Zellen wurde nach Zugabe entsprechender Stimulanzien für einen jeweils angegebenen Zeitraum Brefeldin A zugegeben. Dies war ein Pilzgift, das in seiner Wirkung Monensin ähnelte, aber weniger zelltoxisch war. Zur IL-12 Messung wurden dendritische Zellen 10 min in 4 % Paraformaldehyd fixiert, und zweimal 10 min bei 300 g zentrifugiert, wobei die Röhrchen mit HBSS aufgefüllt wurden, danach 45 min in 0,1 % Saponinpuffer inkubiert. Daran anschließend erfolgte die IL-12 Färbung (10 µl anti-IL-12-PE pro 2 x 105 Zellen in 100 µl Puffer bei 4 - 6° C). - 58 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.8. Polymerase Kettenreaktion (PCR) - Zytokinnachweis 2.8.1. Gewinn der Zellen Die in der MLR angesetzten Zellen wurden nach 7 d für 5 h bei 37° mit PMA 10 ng / ml und Ionomycin 1µM zur Zytokinproduktion stimuliert, anschließend geerntet, und mit HANKS gewaschen. Das Pellet wurde in 1 ml GIT mit 7,2 µl ß-Mercaptoethanol pro 5 x 106 Zellen resuspendiert und bei -70° C über Nacht eingefroren. 2.8.2. RNA - Isolierung Nachdem das gewonnene Lysat aufgetaut worden war, wurde es auf zwei Eppendorfhütchen verteilt. Danach erfolgte die Zugabe von 50 µl 2M Na-Acetat mit einem pH von 4 und 600 µl Phenol-Chloroform-Isomylalkohol-Mix. Diese Suspension wurde dann bei 1200g 20 min zentrifugiert; die so entstandene wässerige Phase gepoolt und in neue Eppendorfhütchen überführt. Nach Zugabe von 500 µl Isopropanol und mind. einstünd igem Einfrieren bei -20° C wurden die Zellen erneut zentrifugiert und der Überstand vo rsichtig abpipettiert. Das Pellet wurde noch einmal mit 100 % Ethanol gewaschen und zentrifugiert. Nachdem das Ethanol entfernt war, wurde das Pellet in 25µl A.dest. gelöst und gründlich resuspendiert. 2.8.3. Konzentrationsbestimmung der RNA Die Extinktion der RNA wurde photometrisch in einem Plattenleser bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt, die RNA Menge dann graphisch ermittelt. - 59 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.8.4. Umschreibung der RNA auf cDNA 5 µg der RNA wurden in 9 µl A.dest. aufgenommen und mit 29 µl DEPC Aqua und 3 µl oligo(dT) gemischt, und anschließend, nach 5 min Inkubation bei 65° C, zentrifugiert und 10 min bei Raumtemperatur zum Abkühlen belassen. Primersequenz IL-4: 5´-TTCCTGTCGAGCCTTTCAG-3´ Primersequenz INF-γ: 5´-ATTTGGCTCTGCATTATTTTTCTGT-3´ Primersequenz β-Aktin: 5´- CGCGTCCGCC CCGCGAGCAC AGACCTCGC-3´ Das Pellet wurde in 5,0 µl first strand buffer, 1,0 µl RNase Block Ribonuklease Inhibitor (400 U/µl), 2,0 µl 100 mM dNTPs, 1,0 µl MMLV-RT (50 U/µl) aufgenommen und gemischt; 1 h bei 37° C, dann 5 min bei 90° inkubiert, und abschließend wurde die Reaktion auf Eis gestoppt. 2.8.5. Amplifikation Zu Beginn wurden 3 µl cDNA, 10 µl zehnfacher Taq Puffer, 0,8 µl 100mM dNTPs, 4 µl Primer (jeweils für ß-Actin, IL-4, und IFN-γ) und 81,7 µl A.dest. gemischt und zentrifugiert, erst bei 91° C, dann bei 54 ° C je 5 min inkubiert, danach wieder zentrifugiert. Anschließend wurde 0,5 µl Taq DNA Polymerase in den Ansatz gegeben und dieser mit Mineralöl überschichtet. Im Folgenden wurden 30 Zyklen inkubiert. Ein Zyklus bestand aus Inkubationen von 1 min bei 91° C, 1 min bei 54° C und 2 min bei 72° C. Zum Schluß wurde der Ansatz innerhalb von 10 min von 72° C auf 4° C gekühlt. - 60 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.8.6. Darstellung der Ergebnisse Das gewonnene PCR-Produkt (20 µl) und die DNA-Längenstandards (5 µl) wurden mit 5 µl Dextranblau versetzt und in die mittels eines speziellen Kammes vorbereiteten Taschen eines 8 % Polyacrylamidgels gegeben. 50 ml Polyacrylamidgel bestanden aus: Aqua dest. 34,5 ml Acrylamid 40%ig 10,0 ml Ammonium Persulfat 10%ig 1,0 ml 10 x TBE 5,0 ml TBE (5 x): Tris Base 53,9 g Borsäure 27,51 g 0,5 M EDTA pH 8,0 20 ml ad 1 l Aqua dest. Als Laufpuffer wurde 1 x TBE verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei 180 Volt für 4 Stunden in einer LBK-Kammer. Das entstehende Bild wurde mittels einer Polaroid Kamera festgehalten. - 61 - 2. Patienten, Material und Methoden 2.9. Enzym Linked Immunoassay (ELISA) Die Messung der Zytokine IL-4 und IFN-γ erfolgte mittels der ELISA-Technik nach 1; 2; 4; 7 d. Dazu wurden die Zellen und ihr Mediumüberstand geerntet und 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und weiterverarbeitet. 50 µl dieses Überstandes wurden in jeweils ein Senkloch einer vorbehandelten Platte gegeben, in der sich bereits 50 µl biotinylierter Antikörper gegen IL-4 bzw. IFN-γ befanden. Anschließend wurde die Platte 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann dreimal gewaschen. Danach wurden 100 µl eines in Puffer gelösten Streptavidin HRP-Konzentrates in jedes Senkloch gegeben und die Platte für 30 min inkubiert, bevor sie wieder dreimal gewaschen wurde. Nun wurden 100 µl vorbereitete TMB Substrat Lösung in jedes Senkloch gegeben. Danach wurde die Platte 30 min bei Raumtemperatur unter Vermeidung von Lichteinfall entwickelt, und die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stop Lösung beendet. Die Absorption wurde dann bei 550 nm Wellenlänge in einem Plattenleser gemessen und die Zytokinmenge graphisch ermittelt. - 62 - 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Generierung dendritischer Zellen aus CD34 positiven hämatopoetischen Nabelschnurblutstammzellen mittels Granulozyten-Makrophagen-KolonieStimulierender-Faktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SF) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) Die Generierung dendritischer Zellen erfolgte aus CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen des Nabelschnurblutes durch den Einsatz von GM-CSF, SF und TNF-α. Das eingesetzte Blut darf zu diesem Zweck ein bestimmtes Alter (Zeitraum von der Blutentnahme bis zum Beginn der Isolierung) nicht überschritten haben. 3.1.1. Isolation von CD34 positiven Zellen aus Nabelschnurblut CD34 positive Zellen können mit Hilfe der Magnet assoziierten Zellsortierung (MACS) aus der Menge der mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes isoliert werden. Parameter zur Beurteilung der Sortierungsqualität waren Reinheit, Ausbeute und der Anteil intakter Zellen nach der Sortierung. Die Reinheit der Sortierung ist der Anteil Zielzellen an der Gesamtzellmenge nach der Sortierung, die Ausbeute die Anzahl der sortierten Zellen. Der Anteil untergegangener Zellen wurde mit Propidiumiodid (PI) Färbung gekennzeichnet. 3.1.1.1. Die Reinheit der Isolation ist unabhängig vom Blutalter CD34 positive Zellen lassen sich unabhängig vom Blutalter mit einer Reinheit von über 96 % aus dem mononukleären Anteil des Nabelschnurblutes unter Verwendung der MACS isolieren (s.Abb.7). Der Anteil CD34 pos. Zellen wurde durchflußzytometrisch mit einem Antikörper zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt (s. Abb. 12 und 13). - 63 - 3. Ergebnisse Abb. 12: Reinheit der CD34+ -Sortierung; die Sortierung erfolgte mittels MACS-Technologie unter CD34 positive Zellen [%] indirekter Markierung des Zielmoleküls . 100 4 h alt 3,5 h alt 1 h alt 0,5 h alt 50 0 0 1 2 3 4 Meßpunkt Meßpunkt Sortierungsschritt 1 Nach dem ersten Waschschritt 2 Vor der ersten Anreicherung 3 Nach der ersten Anreicherung 4 Nach der zweiten Anreicherung (Ende der Isolierung) Abb. 13: Anteil CD34 positiver Zellen in den Proben unterschiedlichen Blutalters zu verschiedenen Meßzeitpunkten während der Isolierung; die Messung des Anteils CD34 positiver Zellen erfolgte durchflußzytometrisch. - 64 - 3. Ergebnisse 3.1.1.2. Die Ausbeute der Isolation ist abhängig vom Blutalter, nicht von der Ausgangszellmenge Die Ausbeute der gereinigten CD34+ Stammzellen nimmt unabhängig von der Ausgangszellmenge mit der Zunahme des Blutalters ab (s. Abb. 14). Die Zellmengen wurden in einer Neubauer- bzw. einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer nach Türks bestimmt. Bei ungefähr gleicher Ausgangszellmenge und, wie gezeigt, gleichem Anteil an Stammzellen vor der Sortierung, ist die Ausbeute, also die Zellmenge nach der Sortierung im Verhältnis zum Anteil der Zielzellen an der Ausgangszellmenge, bei älterem Blut deutlich kleiner. Zellmenge 10 10 0.5 h 1h 3,5 h 4h 10 8 10 6 10 4 Vor Sortierung Nach Sortierung Abb. 14: Vergleich der Zellmenge vor und nach Anreicherung CD34 positiver Zellen in Abhängigkeit vom Blutalter; die Zellmenge wurde nach Färbung mit Türk´scher Lösung in einer Neubauer- bzw. FuchsRosenthal-Zählkammer bestimmt. - 65 - 3. Ergebnisse 3.1.1.3. Das Blutalter bestimmt den Anteil untergegangener Zellen während der Isolation Der Anteil untergegangener Zellen in den zum jeweiligen Zeitpunkt vorhandenen Zellgemischen ist abhängig vom Blutalter. Je älter das Blut, desto höher ist der Anteil an untergegangenen Zellen in der Ausgangsfraktion. Zusätzlich nimmt er im Laufe der Sortierung bei älterem Blut stärker zu. Das hat bei älterem Blut zur Folge, daß große Anteile der in Kultur gegebenen Zellen schon zu Kulturbeginn nicht mehr lebensfähig sind, beziehungsweise frühzeitig untergehen. Der Anteil untergegangener Zellen bleibt im Blut, welches innerhalb einer Stunde verarbeitet wird, über den Zeitraum der Sortierung hinweg annähernd konstant klein (s. Abb. 15). Der Anteil der untergegangenen Zellen wurde durchflußzytometrisch durch Anfärbung mit Propidiumiodid (DNA-Farbstoff) Untergegangene Zellen [% ] bestimmt. 75 4 h alt 3,5 h alt 1 h alt 0,5 h alt 50 25 0 0 1 2 3 4 5 Meßpunkt Meßpunkt Sortierungsschritt 1 Nach dem ersten Waschschritt 2 Vor der ersten Anreicherung 3 Nach der ersten Anreicherung 4 Nach der zweiten Anreicherung (Ende der Isolierung) Abb. 15 : Anteil abgestorbener Zellen an der Probenmenge zu verschiedenen Messzeitpunkten; der Anteil der abgestorbenen Zellen wurde durchflußzytometrisch durch Anfärbung mit Propidiumiodid (DNAFarbstoff) bestimmt. - 66 - 3. Ergebnisse 3.1.2. Generierung dendritischer Zellen aus CD34 positiven Stammzellen durch den Einsatz von GM-CSF, SF und TNF-α 3.1.2.1. GM-CSF in der Generierung dendritischer Zellen Die Zugabe von 10 ng/ml des Proliferations- und Differentationsfaktors GM-CSF zu Kulturbeginn und am Tag sechs der Kultur führt nach 14 Tagen Kultur zur größten Zellmenge angezüchteter Zellen (s. Abb. 16). Die Menge der übrigen Stimuli wurde hierbei konstant gehalten. Die Zellmengen wurden nach 14 Tagen in einer NeubauerZählkammer nach Türks bestimmt, die Zelldifferenzierung anhand morphologischer Kriterien im Lichtmikroskop beurteilt. Auch hier ergab sich 10 ng/ml GM-CSF als günstigste Konzentration. 6.0×10 06 Zellzahl 5.0×10 06 Zellzahl 4.0×10 06 3.0×10 06 2.0×10 06 1.0×10 06 0.0×10 -00 100 ng / ml 10 ng / ml 1 ng / ml 0,1 ng / ml Stimulus (GM-CSF) [ng/ml] Abb. 16: Zellzahl nach 14 Tagen Kultur mit Einsatz verschiedener Mengen GM-CSF bei konstanter Menge der übrigen Stimulantien; die Zellzahl wurde nach Färbung mit Türk´scher Lösung in der NeubauerZählkammer bestimmt; die Beurteilung der Zelldifferenzierung erfolgte lichtmikroskopisch. 3.1.2.2. Stammzellfaktor verdoppelt die Zellmenge dendritischer Zellen Mit Einsatz von 10 ng/ml Stammzellfaktor zu Kulturbeginn und am Kulturtag sechs läßt sich die Menge dendritischer Zellen nach 14 Tagen Kultur CD34 positiver Zellen bei konstanter Menge der übrigen Stimulantien nahezu verdoppeln (s. Abb. 17). Die Zellmenge wurde am Tag 14 der Kultur in der Neubauerzählkammer nach Anfärbung mit Türk´scher Lösung bestimmt. Die Zelldifferenzierung ergab nach morphologischen Kriterien im Lichtmikroskop keinen Unterschied. - 67 - 3. Ergebnisse Zellzahl 1.5×1007 1.0×1007 5.0×1006 0.0×10 -00 mit SF ohne SF Abb. 17: Zellzahl nach 14 Tagen Kultur mit oder ohne Einsatz von Stammzellfaktor bei konstanter Menge der übrigen Stimulantien; die Zellzahl wurde nach Färbung mit Türk´scher Lösung in der NeubauerZählkammer bestimmt; die Beurteilung der Zelldifferenzierung erfolgte lichtmikroskopisch. 3.1.3.3. TNF-α vergrößert den Anteil CD1a-positiver Zellen Der Anteil CD1a positiver Zellen ist nach 14 Tagen Anzucht CD34 positiver Zellen mit TNF-α drei- bis viermal höher als ohne (s. Abb. 18). Die zugegebene Menge der übrigen Stimulantien wurde konstant gehalten. Der Anteil CD1a+ -Zellen wurde durchflußzytometrisch mit einem entsprechenden monoklonalen Antikörper bestimmt. Die Zellmengen wurden nach 14 Tagen in einer Neubauer-Zählkammer (Färbung nach Türks) bestimmt. Sie waren in beiden Ansätzen annähernd gleich groß. CD1a positive Zellen [%] 60 SF,GM-CSF,TNF-alpha SF, GM-CSF 45 30 15 0 SF,GM-CSF,TNF-alpha SF, GM-CSF Abb. 18: Anteil CD1a positiver Zellen nach 14 Tagen Kultur CD34 positiver Zellen mit oder ohne TNF-α bei konstanten Mengen der übrigen Stimuli; die CD1a-Expression wurde durchflußzytometrisch bestimmt; die Zellmenge, in der Neubauer-Kammer ermittelt, war in beiden Ansätzen vergleichbar. - 68 - 3. Ergebnisse 3.1.3.4. Verschiedene Zytokine führen zu unterschiedlich differenzierten Zellen Der Einsatz verschiedener Zytokine führt zu unterschiedlich ausdifferenzierten Zellen am Kulturtag 14. Bei isolierter Zugabe von Stammzellfaktor entwickeln die Zellen kaum Differenzierungsmarker, reifen also nur wenig aus. Die zusätzliche Zugabe von GM-CSF zum Stammzellfaktor führt zu einer geringen Ausprägung der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14. Die Kombination von SF, GM-CSF und TNF-α führt zur deutlich höchsten Ausprägung des Oberflächenmoleküls CD1a, bei relativ geringer CD14 Ausprägung. Der Zusatz von M-CSF führt zwar unabhängig vom Zugabezeitpunkt und in einer gewissen Zugabemenge zu einer hohen CD14 Ausprägung, jedoch kommt es immer auch zu einer Ausbildung des CD1a-Moleküls. Als günstigster Cocktail zur Monozyten/Makrophagenzucht, bei gleichzeitig möglichst geringer Kontamination mit CD1a positiven Zellen, ergab sich die Zugabe von 20 Units M-CSF zu 1,25x105 Zellen pro 200 µl Kulturmedium (s. Abb. 19). % der Zellen CD1a % der Zellen CD14 Oberflächenmarker positive Zellen in % 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SF + + + + + + GM-CSF + + + + + + TNF-α M-CSF 5U/ml 1. Tag 10. Tag 20U/ml 1. Tag Abb. 19: Oberflächenmarker nach 14 Tagen Anzucht mit verschiedenen Stimuluscocktails - 69 - + + 10. Tag 3. Ergebnisse 3.1.3. Das Kulturergebnis ist abhängig vom LPS-Gehalt des FCS 3.1.3.1. Die CD1a -Expression ist abhängig von fetalem Kälberserum Das in dem Medium verwendete FCS beeinflußt die Zelldifferenzierung. Nach 14tägiger Kultur läßt sich, abhängig von der FCS-Charge, ein unterschiedlicher Anteil CD1apositiver Zellen nachweisen. Mit einem der eingesetzten FCS war keine Anzucht von CD1a positive Zellen [%] Zellen möglich (s. Abb. 20). CD1a in % 30 20 10 0 8L07 435L 417L 901B Charge fetales Kälberserum Abb. 20: Einfluß des verwendeten fetalen Kälberserums auf die CD1a Expression 3.1.3.2. Das Kultivierungsergebnis hängt vom LPS-Gehalt der FCS ab Verschiedene fetale Kälbersera haben einen unterschiedlich hohen Gehalt an LPS. Die Höhe der Verunreinigung korreliert mit der Ausprägung des Oberflächenantigens CD1a auf den dendritischen Zellen. In FCS ohne LPS war keine Anzucht von Zellen möglich. LPS [pg/ml] 3000 LPS-Gehalt 2000 1000 0 8L07 435L 417L 901B Charge fetales Kälberserum Abb. 21: LPS-Gehalt verschiedener fetaler Kälbersera - 70 - 3. Ergebnisse 3.2. Merkmale dendritischer Zellen 3.2.1. Visueller Nachweis Lichtmikroskopisch zeigten die mit GM-CSF, TNF-α und SF die typischen morphologischen Kennzeichen dendritischer Zellen. Hierzu zählen die charakteristischen Ausläufer, die Zellgröße, das dichte, granulierte Zytoplasma, und der große Zellkern. Neben diesen Zellen mit dendritenartigem Äußeren fanden sich noch Zellen mit andersartigen Morphen. a) b) Abb. 22: Morphologie der angezüchteten Zellen an Tag 14 der Kultur mit GM-CSF, TNF-α und SF; Darstellung im Lichtmikroskop a) 20fache Vergrößerung b) 40fache Vergrößerung. 3.2.2. Nur dendritische Zellen regen durch Clusterbildung naive T-Zellen zur Proliferation und Zytokinbildung an 3.2.1.1. Gewinn von T-Zellen aus peripherem Blut und Nabelschnurblut T - Lymphozyten lassen sich durch eine positive MAC-Sortierung mit einer Reinheit von über 99 % aus Blutzellgemischen isolieren. Diese Methode ist sowohl bei mononukleären Nabelschnurblutzellen, als auch bei adulten peripheren mononukleären Zellen anzuwenden. Von den gereinigten Nabelschnurblutzellen sind über 95% positiv für das Oberflächenantigen CD45RA, einem Marker für naive Zellen. Periphere T-Zellen sind zu 95 %mit dem Oberflächenantigen CD45RO gekennzeichnet (Memory-T-Zellen). - 71 - 3. Ergebnisse 3.2.1.2. Dendritischen Zellen bilden mit T-Zellen Cluster Gemeinsam eingesetzte dendritische Zellen und T-Zellen bildeten innerhalb weniger Stunden wolkenartige Komplexe (sog. Cluster). Im Laufe der Kulturperiode lagern sich immer mehr Zellen zu immer größeren Komplexen zusammen. Andere Stimulatorzellen waren nicht in der Lage, derartige Komplexe mit naiven T-Zellen zu bilden. a) b) Abb. 23: Dendritische Zellen bilden mit naiven T-Zellen wolkenartige Komplexe; a) Anlagerung von TZellen an eine dendritische Zelle nach 6h b) Bildung großer Komplexe aus mehreren dendritischen Zellen und T-Zellen Nach 24 Stunden. - 72 - 3. Ergebnisse 3.2.1.3. Nur dendritische Zellen aktivieren naive T-Zellen CD33 positiv sortierte Monozyten aus peripherem Blut regen naive T-Zellen nicht zur Proliferation an. Dendritische Zellen dagegen aktivieren, abhängig von ihrer Anzahl, aber auch schon in kleinen Mengen, naive T-Zellen. Die Aktivierung wurde durch Messung der Proliferationsrate nach zwei Tagen gemeinsamer Kultur von dendritischen Zellen bzw. Monozyten mit naiven T-Zellen bestimmt. Die Proliferationsratenbestimmung erfolgte durch Messung des Zerfalls radioaktiven 3 H-Thymidins in der DNA während der DNA-Synthesephase der Zellteilung. Die Monozyten bzw. dendritischen Zellen wurden vor Einsatz in die Kultur zur Hemmung ihrer Replikationsfähigkeit mit Mitomycin C 100000 Monzyten DC 75000 50000 25000 3 H-Thymidineinbau [cpm] behandelt (s. Abb. 24). 0 5 50 500 5000 50000 Menge APC Abb. 24: Vergleich der Proliferationsrate durch Messung des ß-Zerfalls des eingebauten 3 H-Thymidin nach zwei Tagen Kultur von 2,5 x 104 naiven T-Zellen durch Stimulation mit Monozyten oder dendritischen Zellen in verschiedenen Mengen in der MLR. - 73 - 3. Ergebnisse 3.2.1.4. Nur dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen Zytokine Dendritische Zellen sind nach einer Kulturdauer von sieben Tagen in der Lage, in naiven Zellen die Ausbildung eines Th1- und Th2-Musters zu induzieren. Monozyten dagegen sind nicht in der Lage, naive Zellen zur Ausbildung eines Th2-Musters anzuregen. Der Anteil der Th1-Zellen ist nach Kontakt mit dendritischen Zellen ebenfalls sehr viel größer. 3.2.1.4.1. Nur dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen Interferon-γ Dendritische Zellen sind CD33 positiv sortierten Zellen aus peripherem Blut deutlich in der IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen überlegen. Die Zellen waren über sieben Tage gemeinsam im Sinne einer MLR in Kultur. Die Zytokine wurden durchflußzytometrisch intrazellulär bestimmt (s.Abb. 25). Zytokinproduzierende Zellen [%] 25 DC Monos Monozyten 20 15 10 5 0 5 50 500 5000 50000 APZ-Menge APC-Menge Abb. 25: Vergleich der IFN-γ Induktion in 1 x 105 naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit Monozyten oder dendritischen Zellen in der MLR und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) - 74 - 3. Ergebnisse 3.2.1.4.2. Nur dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen IL-4 Im Gegensatz zu CD33 positiv sortierten Zellen aus peripherem Blut sind dendritische Zellen in der Lage, in naiven T-Zellen eine IL-4-Produktion zu induzieren (Th2-Muster). Die Zellen waren über sieben Tage gemeinsam im Sinne einer MLR in Kultur. Die IL-4 produzierende Zellen [%] Zytokine wurden durchflußzytometrisch intrazellulär bestimmt (s. Abb. 26). DC Monozyten Mo 5.0 2.5 0.0 1 10 100 1000 10000 100000 Menge der antigenpräsentierenden Zellen Abb. 26: Vergleich der IL-4 Induktion in 1 x 105 naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit Monozyten oder dendritischen Zellen in der MLR und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) - 75 - 3. Ergebnisse 3.2.3. Dendritische Zellen sind stärkste Proliferations- und Zytokininduktoren peripherer (Memory-) T-Zellen 3.2.3.1. Akzessorische (E- -) Zellen aktivieren Memory-T-Zellen Durch das Verfahren der Zellrosettierung gewonnene akzessorische Zellen (E-) können T-Zellen (E+-Zellen) zu Proliferation anregen. Die Zellen wurden zwei Tage gemeinsam kultiviert und die Proliferation durch den Einbau von 3 H-Thymidin gemessen. Nur hohe Zahlen akzessorischer Zellen konnten eine meßbare Proliferation induzieren (s. Abb. 27). 1 x 105 T - Zellen 4 5 x 10 T - Zellen 4 2,5 x 10 T - Zellen 4000 3000 2000 1000 3 H-Thymidineinbau [cpm] 5000 0 1 10 100 1000 10000 100000 Anzahl Stimulatorzellen Abb. 27: Messung der Proliferation von peripheren T-Zellen (E+-Zellen) durch 3 H-Thymidineinbau nach 2 Tagen Stimulation mit akzessorischen Zellen (E- -Zellen) (Mittelwert aus drei Messansätzen mit jeweils drei Messreihen) mit verschiedenen Responder- und Stimulatorzellmengen. - 76 - 3. Ergebnisse 3.2.3.2. Dendritische Zellen aktivieren Memory-T-Zellen In der MLR regen dendritische Zellen periphere (Memory-)T-Zellen zur Proliferation an. Die Zellen waren gemeinsam zwei Tage in Kultur (s. Abb. 28) und die Proliferationsrate 100000 75000 50000 25000 3 H-Thymidineinbau [Cpm] wurde über den Einbau von 3 H-Thymidin gemessen. 0 5.0 50.0 500.0 5000.0 50000.0 Menge der dendritischen Zellen Abb. 28: Messung der Proliferationsrate von peripheren (Memory-)T-Zellen durch 3 H-Thymidineinbau nach zwei Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen bei verschiedenen Responder- und Stimulatorzellmengen. Dendritische Zellen sind über mehrere Tage in der Lage, periphere (Memory-)T-Zellen zur Proliferation anzuregen. Dabei hängt die Stärke der Reaktion von der Anzahl der Stimulatorzellen ab (s. Tab. 5). Tab. 5: Messung der Proliferation * Menge der 3 dendritischen Zellen [Counts per minute] [Counts per minute] [Counts per minute] Zwei Tage Stimulation Drei Tage Stimulation Vier Tage Stimulation 0 H-Thymidineinbau 3 H-Thymidineinbau 3 H-Thymidineinbau 425 (± 25) 296 (± 24) 471 (± 13) 500 3545 (± 121) 3659 (± 354) 2005 (± 312) 5000 31723 (± 1112) 23154 (± 911) 10355 (± 501) 50000 66339 (± 2534) 56644 (± 2121) 13165(± 987) * Messung von 2,5 x 104 peripheren T-Zellen durch 3 H-Thymidineinbau nach Stimulation mit verschie- denen Mengen dendritischer Zellen (Mittelwert aus drei Meßansätzen mit jeweils drei Meßreihen) - 77 - 3. Ergebnisse 3.2.3.3. Die Proliferationsrate peripherer (Memory-) T-Zellen ist abhängig vom Anteil CD1a tragender Stimulatorzellen Die Proliferationsrate von peripheren (Memory-) T-Zellen ist abhängig von den Stimulatorzellen. Je größer der Anteil CD1a positiver Zellen in der Stimulatorzellgruppe, desto höher ist die Proliferationsrate. Demzufolge sind dendritische Zellen wesentlich stärkere Stimulatoren der Proliferation als andere akzessorische Zellen. Der Anteil CD1a positiver rossettierter Zellen betrachtet ca. 1 %. Bei den kultivierten Zellen ist die Expression von CD1a abhängig von den Kulturbedingungen. Mit TNF-α gezüchtete Zellen exprimieren deutlich höher CD1a und sind auch wesentlich stärkere Stimulatorzellen. Die Zellen waren gemeinsam 2 Tage in Kultur und die Proliferationsrate wurde durch den Einbau von 3 H-Thymidin gemessen (s. Abb. 29). E- als APC CD1a : 40,3 % CD1a : 11 % 75000 50000 25000 3 H-Thymidineinbau [Cpm] 100000 0 5 50 500 5000 50000 Menge der APC Abb. 29: Vergleich der Proliferationsraten mit unterschiedlichen Stimulatorzellen unter den sonst üblichen Bedingungen. Die E- -Zellen wurden durch Rosettierung gewonnen, die CD1a: 40,3 % positiven Zellen durch Anzucht mit GM-CSF, SF und TNF-α und die CD1a: 11 % positiven Zellen durch Kultur nur mit GM-CSF und SF. Die Messung der Proliferationsrate von 2,5 x 104 eingesetzten peripheren T-Zellen durch 3 H-Thymidineinbau nach Stimulation mit verschiedenen Mengen APC. - 78 - 3. Ergebnisse 3.2.3.4. Zytokininduktion von Memory-T-Zellen durch akzessorische (E-) Zellen Akzessorische Zellen als Stimulatorzellen der MLR induzieren in peripheren T-Zellen eine schwache Th1- und Th2-Zytokinproduktion. Die Zellen waren sieben Tage gemeinsam in Kultur; am siebten Tag wurden die intrazellulären Zytokine via Durchflußzytometer ermittelt (s. Abb. 30). Zytokinproduzierende Zellen [%] 10 IFN-Gamma IL-4 5 0 5 50 500 5000 50000 Anzahl der Stimulatorzellen Abb. 30: Durchflußzytometrische Messung der intrazellulären Zytokinproduktion in peripheren (Memory) T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit akzessorischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) - 79 - 3. Ergebnisse 3.2.3.5. Zytokininduktion durch dendritische Zellen in Memory-T-Zellen 3.2.3.5.1. Anteil der zur Zytokinproduktion angeregten T-Zellen am siebten Kulturtag mit dendritischen Zellen Dendritische Zellen können in der MLR in peripheren T-Zellen eine Zytokinproduktion induzieren. Es erfolgt dabei eine Ausbildung sowohl eines Th1- (Leitzytokine IFN-γ und IL-2) als auch eines Th2-Musters (IL-4 und IL-5). Das Th1-Muster findet sich jedoch in einem wesentlich größeren Anteil der Zellen. Die Zellen waren sieben Tage gemeinsam im Sinne einer MLR in Kultur; anschließend wurden die intrazellulären Zytokine via Durchflußzytometer ermittelt (s. Abb. 31). Zytokinproduzierende Zellen [%] 30 IFN-Gamma IL-2 IL-4 IL-5 20 10 0 5 50 500 5000 50000 Menge dendritischer Zellen Abb. 31: Durchflußzytometrische Messung der intrazellulären Zytokinproduktion in peripheren T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) - 80 - 3. Ergebnisse 3.2.3.5.2. Höhere Zahlen dendritischer Zellen vergrößern den Th2-Anteil Der Anteil sich ausbildender Th1-Zellen (Leitzytokine IL-2 und Interferon- γ) ist nicht so stark von der Menge der eingesetzten dendritischen Zellen abhängig wie der Anteil Th-2Zellen (IL-4 und IL-5). Es kommt zu einer relativ größeren Zunahme der Th2-Zellen durch Erhöhung der Stimulatorzellzahl. Der Th1-Anteil bleibt dagegen relativ konstant (s. Veränderung des prozentualen Anteils zytokinproduzierender Zellen [%] Abb. 32). 500 IFN-γ IL-2 IL-4 IL-5 400 300 200 100 0 5.0 50.0 500.0 5000.0 50000.0 Menge der dendritischen Zellen Abb. 32: Relative Veränderung des Anteils der zytokinproduzierenden Zellen an der Gesamtzellmenge (Spontanaktivität = 100 %) - 81 - 3. Ergebnisse 3.2.3.6. Dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellenstärker Zytokine als akzessorische Zellen 3.2.3.6.1. IFN-γ Dendritische Zellen sind wesentlich stärkere Interferon- γ-Induktoren in naiven Zellen als IFN-γ produzierende Zellen [%] andere Zellen. (s. Abb. 33). EDC 30 20 10 0 5 50 500 5000 50000 Menge der APC Abb. 33: Vergleich der IFN-γ Induktion in peripheren T-Zellen durch dendritische Zellen oder durch Rosettierung gewonnene akzessorische Zellen (E- -Zellen) nach sieben Tagen Stimulation und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) 3.2.3.6.2. IL-4 Dendritische Zellen wirken als wesentlich stärkere Induktoren für IL-4 in naiven Zellen Ι L-4 produzierende Zellen [%] als andere Zellen. (s. Abb. 34) EDC 7.5 5.0 2.5 0.0 5 50 500 5000 50000 Menge der APZ Abb. 34: Vergleich der IL-4 Induktion in peripheren T-Zellen durch dendritische Zellen oder durch Rosettierung gewonnene akzessorische Zellen (E- -Zellen) nach sieben Tagen Stimulation und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) - 82 - 3. Ergebnisse 3.3. Nur dendritische Zellen induzieren IL-4 und IFN-γ in Nabelschnurzellen; NK-Zellen sind die ersten zytokinproduzierenden Zellen 3.3.1. Nur dendritische Zellen induzieren in Nabelschnurblutzellen in der PCR nachweisbar IL-4 Selbst in der extrem sensitiven PCR gelang der Zytokinnachweis nur durch den Einsatz von dendritischen Zellen. Selbst die kleinste eingesetzte Menge dendritischer Zellen war in der Lage sowohl IL-4 als auch IFN-γ zu induzieren. Durch den Einsatz CD33 positiver, periphere Monozyten gelang lediglich eine schwache Induktion von IFN-γ; IL-4 war nicht zu induzieren (s. Abb. 35). bpStandard leer IFN-γ IL-4 5000 DZ IL-4 IFN-γ 500 DZ leer IL-4 50 DZ IFN-γ IL-4 5000 Mo Abb. 35: PCR-Untersuchung zum Nachweis von IFN-γ und IL-4 - 83 - IFN-γ leer bpStandard 3. Ergebnisse 3.3.2. Die Zytokinproduktion und -sekretion in mononukleären Nabelschnurblutzellen und den darin enthaltenen CD3 positiven Zellen ist am siebten Kulturtag maximal 3.3.2.1. Maximum der IFN-γ-Produktion und -sekretion in mononukleären Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag Dendritische Zellen induzieren in mononukleären Nabelschnurblutzellen IFN-γ. Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe der ELISA-Technik, ist eine deutliche Zunahme des IFN-γ im Laufe der gemeinsamen Kulturperiode zu erkennen. Der Höhepunkt dieser Produktion wird am 7. Tag nach gemeinsamer Kultur mit dendritischen Zellen erreicht (s. Abb. 36). DC + CBMC FACS DC + CBMC ELISA IFN-γ produzierende Zellen [%] 10000 7500 50 5000 25 2500 0 Zytokine im Überstand [pg/ml] 75 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 36: Dendritische Zellen induzieren die Produktion und Sekretion von IFN-γ in mononukleären Nabelschnurblutzellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kulturperiode; die intrazellulären Zytokine wurden nach entsprechend langer Stimulationszeit mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach entsprechend langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 84 - 3. Ergebnisse 3.3.2.2. Maximum der IL-4-Produktion und -Sekretion in mononukleären Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag Dendritische Zellen als Stimulatorzellen induzieren IL-4 in mononukleären Nabelschnurblutzellen. Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe der ELISA-Technik, ist eine Zunahme des IL-4 im Laufe der Kulturperiode zu erkennen. Das Maximum dieser Produktion wird am siebten Tag gemeinsamer Kultur dendritischer Zellen mit mononukleären Nabelschnurblutzellen erreicht (s. Abb. 37). DC + CBMC FACS DC + CBMC ELISA IL-4 produzierende Zellen [%] 75 50 5 25 0 Zytokine im Überstand [pg/ml] 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 37: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IL-4 in mononukleären Nabelschnurzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach entsprechend langer Stimulationszeit mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach entsprechend langer Stimulationszeit mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 85 - 3. Ergebnisse 3.3.2.3. Maximum der IFN-γ-Produktion und -Sekretion der CD3 positiven Zellen der mononukleären Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag Naive T-Zellen als Anteil mononukleärer Nabelschnurblutzellen verhalten sich hinsichtlich der IFN-γ-Produktion anders als die Gesamtmenge der mononukleären Zellen. Ihr Anteil IFN-γ-produzierender Zellen ist zu Beginn der Kulturzeit niedriger als der Anteil der Gesamtmenge, am Ende höher. Die IFN-γ-Produktion wurde durchflußzytometrisch bestimmt und das Oberflächenantigen CD3 als T-Zell-Marker dazu korreliert betrachtet, so daß diese Zellart einzeln analysiert werden konnte (s. Abb. 38). IFN-γ produzierende Zellen [%] 60 CBMC + DC CD3+ in CBMC + DC 45 30 15 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 38: Anteil der IFN-γ-produzierenden T-Zellen an den mononukleären Nabelschnurblutzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine und das Oberflächenantigen CD 3 wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt . - 86 - 3. Ergebnisse 3.3.2.4. Maximum der IL-4-Produktion und -Sekretion der CD3 positiven Zellen der mononukleären Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag Naive T-Zellen als Anteil der mononukleären Nabelschnurblutzellen verhalten sich hinsichtlich der IL-4-Produktion genauso wie die Gesamtmenge der Zellen. Die IL-4Produktion wurde durchflußzytometrisch bestimmt und das Oberflächenantigen CD3 als T-Zell-Marker dazu korreliert betrachtet (s. Abb. 39). IL-4 produzierende Zellen [%] 7.5 CBMC + DC CD3+ in CBMC + DC 5.0 2.5 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 39: Anteil der IL-4-produzierenden T-Zellen an mononukleären Nabelschnurblutzellen, die zu verschiedenen Kulturzeitpunkten zur Zytokinproduktion stimuliert wurden; die intrazellulären Zytokine und das Oberflächenantigen CD 3 wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt . - 87 - 3. Ergebnisse 3.3.3. Maximum der Zytokinproduktion und -sekretion der CD45RA positiven Zellen sind der vierte (IFN-γ) und siebte Kulturtag (IL-4) 3.3.3.1. Maximum der IFN-γ-Produktion und -Sekretion der CD45RA positiven Zellen ist der vierte Kulturtag Durch dendritische Zellen läßt sich in das Oberflächenantigen CD45RA tragenden Zellen die Produktion von IFN-γ induzieren. CD45RA tragende Zellen wurden durch eine negative MAC-Sortierung aus Nabelschnurblut isoliert. Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe der ELISA-Technik, ist während der Kulturperiode ein zeitlicher Verlauf zuerkennen. Bereits zu Kulturbeginn liegen hohe IFN-γ-Produktion und Sekretion vor (s. Abb. 40). DC + RA pos FACS DC+RA pos ELISA 1250 1000 20 750 500 10 250 0 IFN-γ im Überstand [pg/ml] IFN-γ produzierende Zellen [%] 30 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 40: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IFN-γ in CD45RA positiven Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 88 - 3. Ergebnisse 3.3.3.2. Maximum der IL-4-Produktion und -Sekretion der CD45RA positiven Zellen ist der siebte Kulturtag Durch dendritische Zellen läßt sich in das Oberflächenantigen CD45RA tragenden Zellen die Produktion von IL-4 induzieren. Die CD45RA tragenden Zellen wurden durch eine Depletion der CD45RO-Zellen aus Nabelschnurblut isoliert. Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe der ELISA-Technik, ist eine zeitabhängige Zunahme des IL-4 zu erkennen. Der Höhepunkt dieser Produktion wird am siebten Tag gemeinsamer Kultur dendritischer Zellen mit CD45RA positiven Zellen erreicht (s. Abb. 41). DC + RA pos FACS DC + RA pos ELISA 10.0 7.5 5.0 5.0 2.5 2.5 0.0 IL-4 im Überstand [pg/ml] IL-4 produzierende Zellen [%] 7.5 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 41: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion von IL-4 in CD45RA positiven Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 89 - 3. Ergebnisse 3.3.4. Die Zytokinproduktion und -sekretion in Natürlichen Killerzellen erreichen ihr Maximum am zweiten Kulturtag 3.3.4.1. Die IFN-γ-Produktion und -Sekretion in Natürlichen Killerzellen erreichen ihr Maximum am zweiten Kulturtag Durch dendritische Zellen läßt sich in Natürlichen Killerzellen die Produktion von IFN-γ induzieren. Die Natürlichen Killerzellen wurden durch eine negative MAC-Sortierung aus Nabelschnurblut isoliert. Sowohl intrazellulär durchflußzytometrisch, als auch extrazellulär mit Hilfe der ELISATechnik, ist eine zeitliche Zunahme des IFN-γ zu erkennen. Der Höhepunkt der Produktion wird am zweiten Tag nach gemeinsamer Kultur mit dendritischen Zellen erreicht (s. Abb. 42). DC + NK FACS DC + NK ELISA 2000 1500 50 1000 25 500 0 IFN-γ im Überstand [pg/ml] IFN-γ produzierende Zellen [%] 75 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 42: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IFN-γ in Natürlichen Killerzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazelluläre Zytokinkonzentration wurde mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 90 - 3. Ergebnisse 3.3.4.2. Das Maximum der IL-4-Produktion in Natürlichen Killerzellen ist der vierte Kulturtag, der Sekretionshöhepunkt der zweite Dendritische Zellen induzieren in Natürlichen Killerzellen die Produktion und Sekretion von IL-4. Intrazellulär durchflußzytometrisch und extrazellulär, mit Hilfe der ELISATechnik, ist ein zeitlicher Verlauf des IL-4 zu erkennen. Der Höhepunkt der Sekretion wird nach zwei Tagen gemeinsamer Kultur dendritischer Zellen mit NK-Zellen erreicht. Intrazellulär ist der Produktionshöhepunkt dagegen an Kulturtag vier. Die wenigen anfangs IL-4 produzierenden Zellen sezernieren also mehr IL-4 als die später mit der Produktion einsetzenden zahlreichen Zellen (s. Abb. 43). 7.5 15 5.0 10 2.5 5 0.0 IL-4 im Überstand [pg/ml] Ι L-4 produzierende Zellen [%] DC + NK FACS DC + NK ELISA 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 43: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IL-4 in Natürlichen Killerzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 91 - 3. Ergebnisse 3.3.5. Natürliche Killerzellen sind die ersten zytokinproduzierenden Zellen des Nabelschnurblutes 3.3.5.1. Natürliche Killerzellen sind die ersten IFN-γ-Produzierenden Zellen des Nabelschnurblutes Die Produktion von IFN-γ setzt zuerst in den Natürlichen Killerzellen ein. In ihnen läßt sich durchflußzytometrisch IFN-γ wesentlich früher nachweisen als in den anderen Zellgruppen. Sowohl die mononukleären Nabelschnurblutzellen, als auch die CD45RA IFN-γ produzierende Zellen [%] positiven Zellen setzen wesentlich später mit der IFN-γ-Produktion ein (s. Abb. 44). DC + NK FACS DC + RA pos FACS DC + CBMC FACS 75 50 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 44: Vergleich der intrazellulären Produktion von IFN-γ verschiedener Zellgruppen nach Stimulation mit dendritischen Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt - 92 - 3. Ergebnisse 3.3.5.2. IL-4 wird von NK-Zellen, CD45RA-positiven Zellen und der Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurblutzellen annähernd zeitgleich produziert IL-4 wird von den untersuchten Zellgruppen in annähernd gleichen zeitlichen Abläufen IL-4 produzierende Zellen [%] produziert (s. Abb. 45). DC + NK FACS DC + RA pos FACS DC + CBMC FACS 7.5 5.0 2.5 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 45: Vergleich der intrazellulären Produktion von IL-4 verschiedener Zellgruppen nach Stimulation mit dendritischen Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 93 - 3. Ergebnisse 3.3.6. Natürliche Killerzellen sind die ersten zytokinsezernierenden Zellen des Nabelschnurblutes 3.3.6.1. Natürliche Killerzellen sind die ersten IFN-γ sezernierenden Zellen des Nabelschnurblutes Die Natürlichen Killerzellen sind die Zellgruppe, die als erste in der Lage sind, IFN-γ zu sezernieren. Ihnen folgen dann die CD45RA positiven Zellen und zum Schluß die Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurblutzellen. Diese Zellen sezernieren dafür sehr große Mengen IFN-γ (s. Abb. 46). DC + NK ELISA DC + CBMC ELISA DC + RA pos ELISA IFN- γ im Überstand [pg / ml] 7500 5000 2500 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 46: Vergleich der Sekretion von IFN-γ verschiedener Zellgruppen nach Stimulation mit dendritischen Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISATechnik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 94 - 3. Ergebnisse 3.3.6.2. IL-4 wird von Nabelschnurblutzellen annähernd gleichzeitig sezerniert IL-4 wird von den untersuchten Zellgruppen in annähernd gleichen zeitlichen Abläufen produziert 4 (s. Abb. 47). Die CBMC produzieren allerdings gegen Kulturende weit größere Mengen als die anderen Zellgruppen. IL-4 im Überstand [pg / ml] DC + CBMC ELISA DC + RA pos ELISA DC + NK ELISA 75 50 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Tag Abb. 47: Vergleich der Sekretion von IL-4 verschiedener Zellgruppen nach Stimulation mit dendritischen Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISATechnik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt. - 95 - 3. Ergebnisse 3.4. Zytokine und Zell-Zell-Kontakte bei der Induktion von Zytokinen in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen 3.4.1. Die Zugabe eines Antikörpers gegen Interleukin-4 (Anti-IL-4) hemmt die Induktion von IL-4, nicht von IFN-γ 3.4.1.1. Anti-IL-4 beeinflußt die IFN-γ-Induktion in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen nicht Die Zugabe unterschiedlicher Dosen eines Antikörpers gegen Interleukin-4 beeinflußt die Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen nicht (s. Abb.48). IFN-Gamma IFN- γ produzierende Zellen [%] 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 50 10 2 0,4 ohne Anti-IL-4 [pg/ml] Abb. 48: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-4 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die Zytokine wurden intrazellulär nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 96 - 3. Ergebnisse 3.4.1.2. Anti-IL-4 hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen Die Zugabe von Anti-IL-4 am Tag des Kokulturbeginns von dendritischen Zellen und naiven T-Zellen hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen. Besonders wirkungsvoll ist die Hemmung mit 2 bis 10 pg/ml Anti-IL-4. Weniger effektiv ist die Hemmung mit größeren oder kleineren Mengen (s. Abb. 49). IL-4 produzierende Zellen [%] 4 IL-4 3 2 1 0 50 10 2 0,4 ohne Anti-IL-4 [pg/ml] Abb. 49: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-4 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 97 - 3. Ergebnisse 3.4.2. Die Zugabe eines Antikörpers gegen Interleukin 12 (Anti-IL12) hemmt die Induktion von IFN-γ und IL-4 in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen 3.4.2.1. Anti-IL-12 hemmt die Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen Die Zugabe von Anti-IL-12 am Tag des gemeinsamen Kulturbeginns hemmt die Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen nach sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen. Diese Hemmung erfolgt unabhängig von der Antikörpermenge im getesteten Bereich (s. Abb. 50). IFN-γ produzierende Zellen [%] 7.5 IFN-Gamma 5.0 2.5 0.0 10 2 0,4 0,08 ohne Anti-IL-12 [pg/ml] Abb. 50: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-12 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritische Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen für sieben Tage und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 98 - 3. Ergebnisse 3.4.2.2. Anti-IL-12 hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen Die Zugabe von Anti-IL-12 am Tag des Kulturbeginns hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen. Diese Hemmung erfolgt unabhängig von der Antikörpermenge im getesteten Bereich (s.Abb. 51). IL-4 produzierende Zellen [%] 7.5 5.0 2.5 0.0 10 2 0,4 0,08 ohne Anti-IL-12 [pg/ml] Abb. 51: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-12 auf die IL-4 Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 99 - 3. Ergebnisse 3.4.3. Antikörper gegen CD80 (Anti-CD80) hemmen die Induktion von IFN-γ, aber nicht von IL-4 in naiven T-Zellen 3.4.3.1. Die Zugabe von Anti-CD80 hemmt die Induktion von IFN-γ Die Zugabe von Anti-CD80 am Tag des gemeinsamen Kulturbeginns hemmt die Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen. Diese Hemmung erfolgt unabhängig von der Antikörpermenge (s. Abb. 52). IFN-γ produzierende Zellen [%] 7.5 IFN-Gamma 5.0 2.5 0.0 20 4 0,8 0,16 ohne Anti-CD80 [pg/ml] Abb. 52: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD80 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 100 - 3. Ergebnisse 3.4.3.2. Die Zugabe von anti-CD80 beeinflußt die Induktion von IL-4 nicht Die Zugabe von Anti-CD80 am Tag des Kulturbeginns beeinflußt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen nicht (s. Abb. 53). IL-4 produzierende Zellen [%] 7.5 IL-4 5.0 2.5 0.0 20 4 0,8 0,16 ohne Anti-CD80 [pg/ml] Abb. 53: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD80 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 101 - 3. Ergebnisse 3.4.4. Antikörper gegen CD86 (Anti-CD86) beeinflussen weder die Induktion von IFN-γ noch von IL-4 3.4.4.1. Die Zugabe von Anti-CD86 beeinflußt die Induktion von IFN-γ nicht Die Zugabe von Anti-CD86 am Tag des Kulturbeginns beeinflußt die Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen nicht (s. Abb. 54). IFN- γ produzierende Zellen [%] 7.5 IFN-Gamma 5.0 2.5 0.0 20 4 0,8 0,16 ohne Anti-CD86 [pg/ml] Abb. 54: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD86 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 102 - 3. Ergebnisse 3.4.4.2. Die Zugabe von Anti-CD86 beeinflußt die Induktion von IL-4 nicht Die Zugabe von Anti-CD86 am Tag des Kulturbeginns beeinflußt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen nicht (s. Abb. 55). IL-4 produzierende Zellen [%] 7.5 IL-4 5.0 2.5 0.0 20 4 0,8 0,16 ohne Anti-CD86 [pg/ml] Abb. 55: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD86 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 103 - 3. Ergebnisse 3.4.5. Durch die gemeinsame Zugabe von Zytokinen und AntiZytokinen gelingt eine Th1- / Th2-Polarisierung 3.4.5.1. Die Zugabe von IL-4 und anti-IL-12 hemmt die Produktion von IFN-γ Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen exogen zugeführtem IL-4 (250 I.U./ml) und anti-IL-12 (2 pg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutliche Reduktion des intrazellulär messbaren IFN-γ (s. Abb. 56). IFN-γ produzierende Zellen [%] 25 Kontrolle IL-4 + αIL-12 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abb. 56: Einfluß der optimalen Mengen Anti-IL-12 und IL-4 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 104 - 3. Ergebnisse 3.4.5.2. Die Zugabe von IL-4 und anti-IL-12 fördert die Produktion von IL-4 Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen exogen zugeführtem IL-4 (250 I.U./ml) und anti-IL-12 (2 pg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutlich gesteigerte, intrazellulär meßbare IL4 Produktion (s. Abb. 57). IL-4 produzierende Zellen [%] 30 Kontrolle IL-4 + αIL-12 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abb. 57: Einfluß der optimalen Mengen Anti-IL-12 und IL-4 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 105 - 3. Ergebnisse 3.4.5.3. Die Zugabe von IL-12 und anti-IL-4 fördert die Produktion von IFN-γ Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen exogen zugeführtem IL-12 (500 I.U./ml) und anti-IL-4 (2 µg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutliche Zunahme des intrazellulär messbaren IFN-γ-produzierende Zellen [%] IFN-γ (s. Abb. 58). Kontrolle 40 αIL-4+IL-12 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abb. 58: Einfluß der optimalen Mengen IL-12 und anti-IL-4 auf die IFN-γ-Induktion in naiven T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 106 - 3. Ergebnisse 3.4.5.4. Die Zugabe von IL-12 und anti-IL-4 hemmt die Produktion von IL-4 Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen exogen zugeführtem IL-12 (500 I.U/ml) und anti-IL-4 (2 pg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutliche Reduktion des intrazellulär messbaren IL-4 (s. Abb. 59). IL-4 produzierende Zellen [%] 15 Kontrolle αIL-4+IL-12 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abb. 59: Einfluß der optimalen Mengen Anti-IL-12 und IL-4 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 107 - 3. Ergebnisse 3.4.6. Der CD40 Ligand ist zur Induktion von IFN-γ notwendig Der Ausfall des CD40 Liganden auf peripheren T-Zellen führt zu einer Reduktion der Interferon- γ-Synthese ohne Beeinflussung der IL-4-Synthese. Die Untersuchungen wurden an CD45RA positiven T-Zellen von drei Patienten mit gesichertem CD40 Liganden-Mangel durchgeführt. Diese Patienten sind von Geburt an nicht in der Lage, den CD40 Liganden zu exprimieren, u.a. nicht auf ihren ansonsten intakten T-Zellen. Die Patienten wurden klinisch durch Auftreten des Hyper-IgMSyndroms auffällig. Die dendritischen Zellen und Kontroll-CD45RA-Zellen entstammten gesunden Menschen Zytokinproduzierende Zellen [%] (s. Abb. 60). 25 Patienten Kontrollen 20 15 10 5 0 IFN-Gamma IL-4 Zytokin Abb. 60: Vergleich der Zytokinproduktion in peripheren CD45RA positiven Zellen nach einer Woche Stimulation mit dendritischen Zellen zwischen Patienten mit CD40L-Mangel und gesunden Kontrollpersonen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 108 - 3. Ergebnisse 3.4.7. Die MHC-TCR-Interaktion beeinflußt die IL-4-Produktion 3.4.7.1. Verstärkung der MHC-TCR-Interaktion verstärkt die IL-4-Produktion Durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen CD3 in die oben beschriebene gemischte Kultur von naiven T-Zellen mit dendritischen Zellen konnte eine verstärkte Ausprägung des Th-2-Musters erzielt werden. Dieser Effekt war dosisabhängig (s. Abb. 61). IL-4 produzierende Zellen [%] 30 IL-4 20 10 0 ohne 0,1 µg/ml 1 µg/ml 10 µg/ml Anti-CD3 (OKT 3) Konzentration Abb. 61: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD3 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 109 - 3. Ergebnisse 3.4.7.2. Die MHC-TCR-Interaktion beeinflußt die IFN-γ-Produktion nicht Durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen CD3 in die oben beschriebene gemischte Kultur von naiven T-Zellen mit dendritischen Zellen beeinflußt das Th1Muster nicht (s. Abb. 62). IFN-γ produzierende Zellen [%] 30 IFN-γ 20 10 0 ohne 0,1 µg/ml 1 µg/ml 10 µg/ml Anti-CD3 (OKT 3) Konzentration Abb. 62: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD3 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 110 - 3. Ergebnisse 3.5. Exogene Beeinflussung des Modells 3.5.1. IL-12-Induktion in dendritischen Zellen 3.5.1.1. LPS ist der stärkste IL-12-Induktor dendritischer Zellen IL-12 ist in dendritischen Zellen nach 24 Stunden am stärksten durch LPS zu induzieren. Die Zellen wurden vor der LPS Gabe 2 Stunden mit GM-CSF vorbehandelt. Ohne Zugabe eines Stimulus war kein IL-12 nachweisbar. Die eingesetzten Substanzen wurden in unterschiedlichen Konzentrationen getestet (s. Tab. 8 und Abb. 63). Tab.8: Übersicht der eingesetzten Konzentrationen der verwendeten Stimuli ( fett: optimale Konzentration) Substanz eingesetzte IL-12 produzierende Konzentrationen Zellen [%] (+ SEM) ohne GM-CSF 0,5 (+/- 0,2) 10 ng / ml 3,1 (+/- 0,4) 1 ng / ml 2,5 (+/- 0,7) 0,1 ng / ml 0,8 (+/- 0,3) 50 ng / ml 2,5 (+/- 0,3) 5 ng / ml 2,6 (+/- 0,2) 0,5 ng /ml 0,6 (+/- 0,2) GM-CSF + TNF-α 10 ng / ml + 5 ng / ml 3,2 (+/- 0,2) CD40 Ligand + 1 ng / ml 0,6 (+/- 0,2) Verstärker (1µg / ml) 10 ng / ml 7,3 (+/- 0,9) 100 ng / ml 6,8 (+/- 0,7) 100 µg/ml (+10 ng/ml) 11,1 (+/- 0,6) 10 µg/ml (+10 ng/ml) 10,8 (+/- 0,5) 1 µg/ml (+10 ng/ml) 5,8 (+/- 0,5) 0,1 µg/ml (+10 ng/ml) 0,7 (+/-0,1) TNF-α LPS (+ GM-CSF) - 111 - 3. Ergebnisse IL-12 10 CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-a ohne 0 GM-CSF + LPS 5 GM-CSF IL-12 produzierende Zellen [%] 15 Abb. 63: Messung von IL-12 in dendritischen Zellen nach 24 Stunden Stimulation mit verschiedenen Stimuli (Darstellung der optimalen Wirkkonzentration); die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit den angegebenen Stimulanzien inkubiert und 18 Stunden vor intrazellulärer, durchflußzytometrischer Messung Brefeldin A zugegeben. 3.5.1.2. Die IL-12-Produktion ist 18 Stunden nach LPS-Gabe maximal Da LPS als optimaler Stimulus zur IL-12 Induktion in den dendritischen Zellen ermittelt werden konnte, wurde die Kinetik dieser Induktion untersucht. Dabei ergab sich, daß der Anteil IL-12-produzierender dendritischer Zellen 18 Stunden nach LPS-Gabe maximal ist (s. Abb. 64). IL-12 produzierende Zellen [%] 15 LPS Kein Stimulus ohne 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [h] Abb. 64: Messung von IL-12 in dendritischen Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von 10 µg / ml LPS (die Zellen wurden vorher zwei Stunden mit 10 ng/ml GM-CSF inkubiert); die Messung erfolgte durchflußzytometrisch nach Zugabe von Brefeldin A. - 112 - 3. Ergebnisse 3.5.2. Änderung der Oberflächenantigenexpression dendritischer Zellen unter dem Einfluß verschiedener Substanzen Die Einflüsse des CD40 Liganden und LPS nach Vorstimulation mit GM-CSF, sowie die alleinige Wirkung von GM-CSF, TNF-α und GM-CSF gemeinsam mit TNF-α wurden betrachtet. Messparameter waren die Ausreifungsmarker CD1a, CD14, CD83, MHC II und die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. 3.5.2.1. Das Oberflächenantigen CD1a Der Einfluss von LPS bzw. des CD40 Liganden auf dendritische Zellen für 24 Stunden führt zu einer deutlich erhöhten Expression des Oberflächenantigens CD1a. Auch GMCSF bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigen diesen Effekt, allerdings ist er hier wesentlich CD1a 40 30 20 LPS + GM-CSF CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-a 0 GM-CSF 10 ohne CD1a positive Zellen [%] schwächer ausgeprägt (s. Abb. 65). Abb. 65: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD1a; die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächemolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. - 113 - 3. Ergebnisse 3.5.2.2. Das Oberflächenantigen CD14 Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40 Liganden für 24 Stunden kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erniedrigten Expression des Oberflächenantigens CD14. Auch durch TNF-α, GM-CSF bzw. GM-CSF mit TNF-α wurde dieser Effekt erzielt, allerdings ist die Absenkung hier wesentlich schwächer ausgeprägt (s. Abb. 66). CD14 45 30 GM-CSF+ LPS CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-a 0 GM-CSF 15 ohne CD14 positive Zellen [%] 60 Abb. 66: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD14; die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächenmolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. - 114 - 3. Ergebnisse 3.5.2.3. Das Oberflächenantigen CD80 Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40L für 24 Stunden kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer leichten Verstärkung der Expression des Oberflächenantigens CD80. GM-CSF, TNF-α bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigten kaum 20 CD80 15 10 GM-CSF + LPS CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-alpha 0 GM-CSF 5 ohne CD 80 positive Zellen [%] einen Effekt (s. Abb. 67). Abb. 67: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD80; die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit dem angegebenen Stimulus inkubiert und dann das Oberflächemolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. - 115 - 3. Ergebnisse 3.5.2.4. Das Oberflächenantigen CD83 Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40 Liganden für 24 Stunden kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erhöhten Ausprägung des Oberflächenantigens CD83. Auch GM-CSF, TNF-α bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigten CD83 50 40 30 20 GM-CSF + LPS CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-alpha 0 GM-CSF 10 ohne CD83 postive Zellen [%] diesen Effekt, allerdings ist er hier wesentlich schwächer ausgeprägt (s. Abb. 68). Abb. 68: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD83; die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächemolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. - 116 - 3. Ergebnisse 3.5.2.5. Das Oberflächenantigen CD86 Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40 Liganden für 24 Stunden kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erhöhten Ausbildung des Oberflächenantigens CD86. GM-CSF bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigten keinen Effekt (s. Abb. 69). CD86 30 20 GM-CSF + LPS CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-alpha 0 GM-CSF 10 ohne CD86 positive Zellen [%] 40 Abb. 69: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD86; die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächenmolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. - 117 - 3. Ergebnisse 3.5.2.6. Das Oberflächenantigen HLA-DR (MHC II) Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS und dem CD40L für 24 Stunden kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erhöhten Ausbildung des Oberflächenantigens HLA-DR. Auch GM-CSF allein bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigt diesen Effekt, allerdings ist er hier wesentlich schwächer ausgeprägt (s. Abb. 70). HLA-DR 2000 GM-CSF + LPs CD40Ligand GM-CSF + TNF-a TNF-alpha 0 GM-CSF 1000 ohne HLA-DR [Mean] 3000 Abb. 70: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens HLA-DR . Die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden wie angegeben mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächenmolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt. - 118 - 3. Ergebnisse 3.5.3. LPS beeinflußt die Polarisation naiver T-Zellen durch Modifikation dendritischer Zellen 3.5.3.1. LPS fördert die IFN-γ-Produktion Die Zugabe von LPS in eine Kultur mit dendritischen Zellen als Stimulatorzellen und naiver T-Zellen als Effektorzellen führt zu einer deutlichen Verstärkung des Th1-Musters. Die dendritischen Zellen wurden zuvor zwei Stunden mit GM-CSF behandelt. Stärkste Effekte zeigten sich mit Konzentrationen von LPS größer als 0,1 µg pro ml. Die IFN-Gamma produzierende Zellen [%] Effekte sind nicht beliebig zu steigern, sondern ab 1 µg/ml stabil (s. Abb. 71). Kontrolle 0,1 µg LPS 1 µg LPS 10 µg LPS 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abb. 71: Einfluß verschiedener Mengen LPS auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. Die dendritischen Zellen wurden vor LPS-Gabe zwei Stunden mit GM-CSF inkubiert. - 119 - 3. Ergebnisse 3.5.3.2. LPS hemmt IL-4-Produktion Die Zugabe von LPS zu einer wie oben beschriebenen Kultur mit dendritischen Zellen als Stimulatorzellen und T-Zellen als Effektorzellen führt zu einer Abschwächung des Th2Musters. Die dendritischen Zellen wurden zuvor mit GM-CSF zwei Stunden vorstimuliert. Die Effekte wurden hier ab 1 µg/ml deutlich und erst am siebten Kulturtag eindeutig zu erkennen (s. Abb. 72). 10µg LPS IL-4 produzierende Zellen [%] 6 1µg LPS 0,1µg LPS Kontrolle 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tag Abb. 72: Einfluß verschiedener Mengen LPS auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. - 120 - 4. Diskussion 4. Diskussion In dieser Arbeit wurde ein in vitro-Modell der primären Immunantwort etabliert. Hierzu wurden verschiedene Teilkomponenten verwirklicht. Erster Schritt war die Generierung dendritischer Zellen aus Nabelschnurblutstammzellen. Die einzigartige Fähigkeit dendritischer Zellen, naive Zellen aktivieren und zur Zytokininduktion anregen zu können, machte sie zum Kernstück des Modells. Die induzierten Zytokine waren Messparameter des Modells. Durch die Modellstruktur konnten Reaktionen einzelner Effektorzellgruppen, die zeitlichen Abläufe der Immuninduktion und die interzellulären Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen untersucht werden. Weiterhin konnte der Einfluß exogener Faktoren auf die primäre Immunantwort untersucht werden. Hierdurch eröffnen sich in Zukunft mannigfaltige Möglichkeiten zur Beurteilung der immunmodulatorischen Fähigkeiten einzelner Substanzen und zur Atopieneigung einzelner Menschen. CD34 Dendritische Zelle Zytokine Phase 1: Generierung dendritischer Zellen Phase 4: Einfluß exogener Faktoren Phase 3: Zelluläre Interaktionen Phase 2: Rolle verschiedener Effektorzellen Phase 1: Etablierung der Meßsysteme Abb. 73: Übersicht über die Phasen der Modelletablierung: In Phase 1 wurde das Grundmodell mit Stammzellisolation, Anzucht und Nachweis dendritischer Zellen, MLR und Meßsystemen (FACS, ELISA, PCR für die Zytokine IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ) etabliert. In Phase 2 wurden Rollen und zeitliche Abläufe verschiedener Effektorzellgruppen, in Phase 3 die interzellulären Wechselwirkungen untersucht. In Phase 4 wurde der Einfluß exogener Faktoren auf dieses in vitro Modell der primären Immunantwort gezeigt. - 121 - 4. Diskussion 4.1. Modelletablierung Grundprinzip des vorliegenden Modells war die Aktivierung naiver Zellen durch dendritische Zellen und die Messung der durch diesen Kontakt induzierten Zytokine. Zu diesem Zweck erfolgten zunächst Stammzellisolation, Kultivierung und Nachweis dendritischer Zellen sowie die Messung der Zytokininduktion in naiven T-Zellen. Nabelschnurblut CD34 Isolation Dendritische Zelle CD1a GM-CSF, TNF-α, SF Zytokine Proliferation Medium mit FCS (LPS ?) Stammzelle Dendritische Zelle + CD3+CD45RA+ Nabelschnurblut CD45RO Depletion Abb. 74: Übersicht über die Modelletablierung: Zunächst wurde die Stammzellisolation optimiert, dann die Kultivierung. Nachdem die Qualität der Zellen gezeigt war, wurde das Meßsystem etabliert 4.1.1. Erzeugung dendritischer Zellen aus CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen Zur Etablierung des Modells wurden große Menge dendritischer Zellen nach der 1992 von Caux42 beschriebenen Methode aus CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen des Nabelschnurblutes101 in 14tägiger Kultur mit GM-CSF und TNF-α generiert. Zur Erhöhung der Zellzahl wurde, wie von Saraya et al. beschrieben100 , der Stammzellfaktor als Stimulus hinzugefügt. Entscheidend für die Anwendbarkeit dieser Methode war also der in dieser Arbeit festgestellte Zusammenhang zwischen Blutalter und Sortierungsergebnis und der - 122 - 4. Diskussion Einfluß verschiedener FCS-Chargen auf den Kultivierungserfolg, abhängig von deren LPS-Verunreinigung. 4.1.1.1. Die Stammzellisolation 4.1.1.1.1. Zellisolationsverfahren Die Stammzellisolation war der grundlegende Schritt zur Generierung dendritischer Zellen. Während der Experimente wurde beobachtet, daß zur erfolgreichen Anzucht dendritischer Zellen eine Reinheit von über 95 % CD34 positiver Stammzellen benötigt wird; diese Reinheit wurde mit Hilfe der MACS-Technik erreicht. Diese Technik bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Zellselektionsmethoden. Hervorzuheben sind vor allem die zu erreichende Reinheit102 und Ausbeute des Isolats bei günstiger Kostenlage. Zusätzlich zeichnen sich MACS sortierte Zellen durch eine hohe Lebensfähigkeit und erhaltene Funktionalität aus 104, 103 . 4.1.1.1.2. Optimierung der Isolation Zur Verbesserung der Isolationsergebnisse wurden verschiedene Parameter des eingesetzten Blutes untersucht. Das Blutalter erwies sich als besonders wichtig: zwar war die Reinheit des Isolats unabhängig vom Blutalter, doch die Ausbeute (Anzahl der gereinigten Zielzellen) nahm mit seiner Zunahme ab. Die Größe der Ausgangszellmenge spielte dabei keine Rolle. Ebenfalls vom Blutalter abhängig war der Anteil untergegangener Zellen in der Ausgangszellmenge. Dieser anfangs noch geringe Anteil bleibt innerhalb der ersten Stunde konstant und steigt danach dramatisch an. Während der Sortierung steigt er immer weiter an, je stärker, desto älter das Blut ist. Somit wirkt sich der Lagerungszeitraum gleich zweifach auf den Kultivierungserfolg aus: Seine Verkürzung bewirkt einerseits eine Erhöhung der Anzahl der isolierbaren, lebensfähigen Zellen im Ausgangszellgemisch, andererseits sind diese Zellen stabiler und überstehen die Isolation besser, so daß am Ende die Ausbeute größer wird und mehr kultivierungsfähige Zellen zur Verfügung stehen. Entscheidendes Ergebnis für weitere Arbeiten mit CD34+ - Stammzellen war die Beachtung des kurzen Lagerzeitraums des Nabelschnurblutes. - 123 - 4. Diskussion 4.1.1.2. Kultivierungskomponenten 4.1.1.2.1. Grundlagen GM-CSF, TNF-α und SF als Wachstumsfaktoren waren anderen getesteten Zytokinen in der Anzucht dendritischer Zellen überlegen105 . Daneben konnte der Einfluss verschiedener Chargen fetaler Kälberseren auf den Kultivierungserfolg gezeigt werden. CD1a CD34 6 Tage: GM-CSF, TNF-α, SF 6 Tage: GM-CSF, TNF-α, SF Medium mit FCS (LPS ?) Stammzelle Medium mit FCS (LPS ?) Dendritische Vorläuferzelle Dendritische Zelle Abb. 75: Prinzip der in dieser Arbeit etablierten in vitro-Generierung dendritischer Zellen: Nach erfolgter Stammzellisolation wurden die Zellen an Tag 0 und 6 mit GM-CSF, TNF-α und SF stimuliert. Am Ende der Kulturperiode entstanden dendritische Zellen; eine Fragestellung dieser Arbeit war der Einfluß des kontaminierenden LPS im FCS. 4.1.1.2.2. FCS und seine Bestandteile In dem eingesetzten Kulturmedium befand sich als Nährstofflieferant u.a. fetales Kälberserum (FCS). Dies wurde hinzugefügt, da Strobl et al. zeigten, daß verschiedene Serumkomponenten die in vitro Entwicklung dendritischer Zellen signifikant beeinflussen101 , und andere Arbeitsgruppen unter serumfreien Bedingungen kein105 oder nur ein deutlich geringer ausgeprägtes Wachstum85 dendritischer Zellen beobachteten. In der vorliegenden Arbeit fielen bei Einsatz verschiedener Chargen FCS deutliche Unterschiede im Wachstum und der Ausbildung dendritischer Zellen auf. Kontaminierendes LPS als ubiquitär vorkommendes Molekül kam als beeinflussender Faktor in Betracht und wurde daher weiter untersucht. - 124 - 4. Diskussion So wurde gezeigt, daß LPS als Kontamination im FCS vorliegt, und Ausreifung und Proliferation dendritischer Zellen abhängig sind vom Grad dieser Verunreinigung. Die Ausprägung des Oberflächenantigens CD1a, als Marker für dendritische Zellen, korrelierte mit dem Grad der Verunreinigung des FCS mit LPS. Lanzavecchia 83 beschreibt das bakterielle Produkt LPS als beeinflussenden Faktor der Entwicklung dendritischer Zellen, vernachlässigt es als Kontamination des FCS aber. Verschiedene LPS-Wirkungen auf dendritische Zellen sind in Tab. 6 zusammengefasst. Tab. 6: Funktion von LPS in der Entwicklung von dendritischen Zellen106 Wirkungsbereich Folge Funktion Verstärkung der aktivierenden Eigenschaften: Stärkere Aktivierung von naiven T-Zellen und Memory-T-Zellen Morphologie Stärkere Ausprägung der typ. dendritischen Morphologie Oberflächenmoleküle Verstärkte Expression von: MHC II (HLA-DR), CD58, CD80, CD86, CD1a Verminderte Expression von: CD40, CD1a (sog. „Überreife dendritische Zellen“) 4.1.1.2.3. GM-CSF In dieser Arbeit wurde als optimale Menge 10 ng/ml GM-CSF zur Generierung dendritischer Zellen ermittelt. Hierbei ergab sich bei stabiler Zellmenge die beste lichtmikroskopische Differenzierung. GM-CSF ist ein entscheidendes Molekül in der Entwicklung dendritischer Zellen. Seine Aufgaben sind in Tab.7 zusammengefaßt. Tab. 7: Physiologische Aufgaben des GM-CSF 11, 107,108,109 Wirkungsbereich: Wirkung: Zelldifferenzierung: Förderung der Entwicklung von: Makrophagen, Granulozyten, dendritischen Zellen Aktivierung von: Ausgereiften Makrophagen und Granulozyten Immunsystem allgemein: Senkung der Infektanfälligkeit schnellere Wiederentwicklung der Immunantwort bei Knochenmarktransplantierten und Chemotherapie Peripheres Blut: Erhöhung der Stammzellzahl Effekte an DZ: Unterdrückung von Apoptose Ausreifung von unreifen zu reifen DZ Entzündung: Unspezifischer Entzündungsmediator - 125 - 4. Diskussion 4.1.1.2.4.TNF-α Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche zeigten, daß der Anteil CD1a positiver Zellen bei Einsatz von 5 ng/ml TNF-α drei- bis viermal höher war als ohne, ein Effekt, den Caux zunächst nur andeutete42 später aber deutlich zeigte105, 41 . TNF-α wirkt über die in Tab. 8 zusammengefaßten Mechanismen verstärkend auf die Ausbildung dendritischer Zellen. Tab.8: Physiologische Rolle des TNF-α 110,111, 42, 10 5 Wirkungsbereich: Wirkung: Entzündungen Bindung an Oberflächenrezeptoren und Aktivierung intrazellulärer Pfade mit Folge von Start oder Aufrechterhaltung von Entzündungsreaktionen. Hämatopoetische Entwicklung Fördernd mit GM-CSF und IL-3 Unterdrückung von G-CFU Stammzellen Bevorzugte Zielzellen CD34+ und CD86+ Ausdifferenzierung von Makrophagen und DZ Hochregulation von CD86 Verstärkte Expression des GM-CSF-Rezeptors (Förderung der GM-CSF-Wirkung). Reife dendritische Zellen Senkung der Apoptoserate Ausreifung von dendritischen Zellen 4.1.1.2.5. Stammzellfaktor Durch Einsatz von 10 ng/ml Stammzellfaktor wurde die Menge der angezüchteten Zellen bei konstanten Einsatzmengen der übrigen Wachstumsfaktoren verdoppelt. Die Arbeitsgruppen von Santiago-Schwarz112 und Saraya 100 zeigten sogar eine mögliche Verdreifachung. Der Stammzellfaktor wurde mehrfach unter verschiedenen Namen beschrieben (z.B. Mast Cell Growth factor113 c-kit-Ligand, Stammzellfaktor114 , es handelt sich dabei um den Liganden für den c-kit-Rezeptor, ein proto-onkogen115 . Er hat alleine nur geringe Auswirkungen auf die Zellzahl, wirkt aber synergistisch mit Wachstumsfaktoren wie GM-CSF oder Erythropoetin stark proliferationssteigernd 115 , beeinflußt die Zelldifferenzierung selbst aber nicht 114,116,117,118, 119 . - 126 - 114, 4. Diskussion Als Alternative und Ergänzung zum Stammzellfaktor gilt in jüngster Zeit der FTL3Ligand, der eine ähnliche Funktion wie der Stammzellfaktor einnehmen kann121 . In Kombination entwickeln beide eine potenzierte Wirkung122 . 4.1.1.2.6. CD40 Ligand Der CD40 Ligand (CD154 oder TRAP, TNF related activation protein) lässt dendritische Zellen ähnlich GM-CSF und TNF-α ausreifen, wahrscheinlich durch ein Cross-linking des CD40124 . Seine Wirkungen im Zusammenhang mit dendritischen Zellen sind in Tab. 9 zusammengefasst. Die in dieser Arbeit beobachtete Ausreifung von unreifen zu reifen dendritischen Zellen konnte auch von Caux125 beobachtet werden, der allerdings Fibroblastengebundenen CD40 Liganden einsetzte. Tab. 9: CD40 Liganden-Wirkungen auf DZ 126, 127 , 123, 128, 129, 130 Zelltyp Wirkung unreife DZ Verstärkung von CD54 (ICAM-1), B7 (CD80, CD86), CD58 MHC II Matrix-Metalloproteinase NO-Synthese Senkung der Apoptoserate Reife DZ Verlust von CD1a und CD40 Alle DZ Zytokininduktion und -sekretion: IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α 4.1.1.2.7. TGF-Beta (TGF-β ) Die Wirkungen der Serumkomponente TGF-β sind vielfältig. Teilweise wirkt sie wachstumshemmend auf CD34 positive Stammzellen131 , andererseits konnte Strobl TGF-β als einen entscheidenden Faktor für die Ausbildung dendritischer Zellen im FCS ausmachen101 , insbesondere zur Differenzierung des Langerhanszell-Typs121 . Auswirkungen dieses Zytokins sollten in Zukunft weiter untersucht werden. - 127 - 4. Diskussion 4.1.2. Nachweis dendritischer Zellen Das zentrale Element des vorliegenden Modells waren dendritische Zellen, die als einzige Zellpopulation naive Zellen aktivieren können. Daher wurde zunächst anhand der in Kapitel 1.4 ausführlich dargestellten Kriterien nachgewiesen, daß es sich bei den in dieser Arbeit generierten Zellen wirklich um dendritische Zellen handelt. Die Zellen zeigten den dendritischen Phänotyp, mit typischer Zellmorphologie7,83,19,85 und geforderten Oberflächenmolekülen87 . In funktionellen Tests zeigten sich die Zellen anderen in der Aktivierung von Memory-T-Zellen deutlich überlegen132,133,57,134,7,135,9, 10,136,19,137,18,138,139,140,141 und nur sie aktivierten naive T-Zellen durch Clusterbildung120 . Diese Fähigkeiten sind spezifisch für dendritische Zellen und hinreichender Nachweis132,133, 9,10,136,19,137,18,138, 139,140,7, 144,145, 83,143,149 . Naiven Zellen konnten in nötiger Reinheit durch Einsatz der MACS-Technologie und von Nabelschnurblut isoliert werden, wie auch von Strobl et al. beschrieben101 . Im Vorfeld zu dieser Arbeit durchgeführte Versuche zeigten, daß andere Verfahren (z.B. die T-Zell-Rossetierung) nicht in der Lage waren, T-Zell-Isolate mit einer Reinheit von über 96 % zu erzeugen. CD1a 2-4 Tage + + Clusterbildung CD3+CD45RA+ oder CD3+CD45RO+ T-Zell-Proliferation Abb. 76: Das Grundprinzip dieser Arbeit war die Aktivierung naiver Zellen durch dendritische Zellen. Zuerst wurde der Nachweis erbracht, daß es sich bei den angezüchteten Zellen wirklich um dendritische Zellen handelte. Der sicherste Nachweis war die Aktivierbarkeit von naiven T-Zellen in der MLR. MLR-Prinzip: Zu Mitomycin C behandelten Stimulatorzellen (z.B. dendritische Zellen) werden bestimmte Mengen Effektorzellen (z.B. T-Zellen) gegeben und dann die induzierte Proliferationsrate als Maß der Zellaktivierung gemessen. Naive T-Zellen lassen sich nur von dendritischen Zellen aktivieren, Memory-T-Zellen stärker; dieser Funktionstest ist notwendig und hinreichend zum Nachweis dendritischer Zellen. - 128 - 4. Diskussion 4.1.3. Anpassung der Meßsysteme Nachdem dendritische Zellen in ausreichender Menge zur Verfügung standen, wurde das Meßsystem des Modells etabliert. Dazu wurden dendritische Zellen mit Memory-TZellen und naiven T-Zellen in Kontakt gebracht und die induzierten Zytokine zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Als Meßtechniken wurden FACS, ELISA und teilweise die PCR verwendet. Die Aktivierung naiver Zellen mittels dendritischer Zellen simuliert ein den Abläufen im menschlichen Neugeborenen nahestehendes Modell mit vielen Regelmöglichkeiten bei spezifischen Meßsystemen. Dendritische Zelle FACS 0.;2.;4.;7. Tag mRNA IL-4 / IFN-γ ELISA CD45RA+ CD3+ Abb. 77: Grundlegende Struktur des in dieser Arbeit generierten Modells: Die Zytokininduktion in naiven Zellen durch dendritische Zellen wurde gemessen; es erfolgte eine Messung der mRNA, der intrazellulären und der sezernierten Zytokine (IL-4 und IFN-γ) zu verschiedenen Zeitpunkten der gemeinsamen Kulturperiode. 4.1.3.1. Th1- und Th2- Induktion in Memory-T-Zellen Das beschriebene Meßsystem wurde zunächst mit Memory-T-Zellen etabliert, da deren Aktivierungsschwelle niedriger liegt, und Zytokine daher leichter induzierbar und nachweisbar146,147 sind. Dendritische Zellen regten Memory-T-Zellen zur Ausbildung von Th1- und Th2Muster an. Je kleiner das Verhältnis von Memory-T-Zellen zu dendritischen Zellen war, desto größer wurde der Anteil Th2-Zytokinmuster exprimierender Zellen, bei - 129 - 4. Diskussion Konstanz des Th1-Musters. Durch den Einsatz von Monozyten war kein Th2-Muster zu induzieren. Das Th2-Muster war also von der Stärke der Stimulation abhängiger als das Th1-Muster. 4.1.3.2. Dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen IL-4 und IFN-γ Dendritische Zellen sind nachweislich in der Lage, naive Zellen zur Ausbildung von Th2- (Il-4, IL-5) und Th1-Zytokinen (IFN-γ, IL-2) anzuregen. Das angestrebte Modell war somit vollständig etabliert, die Übertragung des Meßsystems auf naive T-Zellen gelang. Die Entwicklung von naiven T-Zellen zu Memory-T-Zellen, die einhergeht mit der endgültigen Etablierung der Th1-/Th2-Polarisation, ist eine zentrale Frage der Immunologie, da hierdurch das immunologische Gedächtnis gebildet wird. In dieser Arbeit konnte ein Modell entwickelt werden, das den ersten Schritt dieser Entwicklung, von naiven T-Zellen zu IL-4-/IFN-γ-produzierenden Effektorzellen, simuliert. Ein Ausbau des Modells, in dem die endgültige Polarisierung der T-Zellen gelingt, ist denkbar, da sich dendritische Zellen als der entscheidende Stimulus zur Polarisationsrichtung zeigten. Durch immer wiederkehrende Restimulation mit dendritischen Zellen könnte es möglich sein, naive T-Zellen schrittweise in stabile Memory-Zellen zu überführen. Die Erzeugung von IL-4 aus naiven T-Zellen bei Restimulation mit PMA/Ionomycin ohne die exogene Zufuhr von IL-4 galt als nicht möglich147 . Bisher mußten Th0-Zellen durch die Zugabe von exogenem, rekombinaten IL-4 zur IL-4-Induktion oder von IL12 zur IFN-γ-Induktion148 gelenkt werden. Da in vivo keine exogenen Zytokine nötig sind, um T-Zellen zu polarisieren, war klar, daß es für diese Zytokininduktion physiologische Mechanismen geben muß. 4.1.3.3. Kinetik der Zytokininduktion in T-Zellen Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der Zytokininduktion in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen, zeigt sich ein Maximum nach sieben Tagen. Sowohl Produktion als auch Sekretion von IFN-γ und IL-4 sind an diesem Tag deutlich höher als an den Tagen zuvor. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den bisher bekannten Literaturwerten zur Kinetik der Zytokinsynthese im Mausmodell durch exogene Stimulation überein. - 130 - 4. Diskussion 4.2. Kinetik der Zytokininduktion naiver Zellen Da dendritische Zellen sowohl Memory- als auch naive T-Zellen zur Zytokinproduktion anregen konnten, wurde nun ihr Einfluß auf Art und zeitlichen Ablauf der Zytokinproduktion anderer naiver Zellgruppen untersucht. Berücksichtigt wurden Zellarten, die als Effektorzellen der Immunabwehr des Neugeborenen wirken: Naive TZellen, NK-Zellen, CD45RA positive- Zellen und die Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurzellen. Dies geschah, um die Aufgaben einzelner Zellgruppen und deren gegenseitige Wechselwirkungen bei der primären Immunantwort zu untersuchen. Sämtliche naiven Zelltypen wurden aus Nabelschnurblut gewonnen, waren also zweifellos naiv. Dendritische Zelle FACS 0.; 2.; 4.; 7. Tag mRNA IL-4 / IFN-γ ELISA Wechselnde Effektorzellen Abb. 78: Die Grundstruktur des Modells wurde beibehalten; die Reaktionen und zeitlichen Verläufe verschiedener Effektorzellen wurden getestet. 4.2.1. Zytokininduktion in mononukleären Nabelschnurblutzellen Abhängig von ihrer Anzahl stimulieren dendritische Zellen IL-4 in mononukleären Nabelschnurblutstammzellen; IFN-γ wird zellzahlunabhängig induziert. Der Nachweis erfolgte auf allen Ebenen der Zytokinproduktion. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde die Messenger-RNA nachgewiesen, dann das jeweilige Zytokin intrazellulär durchflußzytometrisch im Golgi-Apparat und schließlich - 131 - 4. Diskussion die Zytokine durch die ELISA-Technik im Überstand, also als Sekretionsprodukt in der Zellenumgebung. Parallel dazu wurden unter denselben Bedingungen periphere, adulte Monozyten als Stimulatorzellen eingesetzt. Eine IL-4-Induktion durch Monozyten konnte nicht nachgewiesen werden; sie ist also eine spezifische Funktion der dendritischen Zellen Die bei der Stimulation mit Monozyten zu beobachtende extrem schwache IFN-γ-Induktion kann Folge der PMA / Ionomycin - Restimulation und somit artifiziell sein. Sowohl intrazellulär als auch sezerniert erkennt man eine Zunahme des IFN-γ mit einem Höhepunkt am siebten Tag nach Stimulation durch dendritische Zellen. Derselbe Verlauf findet sich für IL-4. Dies ist durch die sich selbst verstärkenden Mechanismen des IFN-γ und IL-4151 zu erklären: IFN-γ wirkt indirekt über dendritische Zellen152 , NK-Zellen153 und andere Zellgruppen innerhalb des CBMC Th1 fördernd, IL-4 fördert direkt die Th2 Etablierung. Eine Zunahme dieser Zytokine während der Kokulturperiode überrascht demnach nicht. 4.2.2. Kinetik der Zytokinproduktion von naiven T-Zellen innerhalb der Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurzellen Da man durchflußzytometrisch fünf Parameter (intra- und extrazelluläre) betrachten kann154 , ist die Population der T-Zellen innerhalb des heterogenen Zellgemisches der CBMC beurteilbar, indem man den Oberflächenmarker CD3 und die intrazellulären Zytokine gleichzeitig markiert. Im Nabelschnurblut sind ca. 95 % der T-Zellen naiv und zusätzlich durch das Oberflächenantigen CD45RA gekennzeichnet155 . Mit dieser Technik konnte gezeigt werden, daß der Anteil der IFN-γ produzierender TZellen zunächst niedriger ist als der Anteil IFN-γ produzierender Zellen der Gesamtzellmenge, gegen Ende der gemeinsamen Kulturzeit jedoch größer wird. Daraus lässt sich schließen, daß verschiedene Zellgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten für die IFN-γ-Produktion verantwortlich sind und T-Zellen diese Rolle erst gegen Ende der Kulturzeit übernehmen. Der Anteil IL-4 produzierender T-Zellen ist gleichmäßig niedriger als der IL-4produzierende Anteil der Gesamtzellmenge. Es gibt also neben den T-Zellen noch - 132 - 4. Diskussion andere Zellgruppen die IL-4 produzieren, allerdings in den gleichen zeitlichen Verläufen wie T-Zellen. Dieses Ergebnis führt zu der überraschenden Erkenntnis, daß die IFN-γ-Produktion offensichtlich komplexer geregelt ist als die von IL-4. Zum einen werden zur IFN-γInduktion in naiven T-Zellen mehrere Zellgruppen benötigt (die naiven T-Zellen sind nicht die ersten Produzenten), zum anderen sind mehr Zytokine (z.B. IL-12) beteiligt. IL-4 wird dagegen direkt erzeugt, denn es gibt keine Zellgruppe, die vor den naiven TZellen IL-4 produziert, und dieses IL-4 ist dann in der Lage, selbst IL-4 zu induzieren. Daraus ergab sich die weiterführende Fragestellung, welcher Zelltyp früh Zytokine produziert bzw. sezerniert und so die Zytokinbildung der naiven T-Zellen moduliert. Zur Beantwortung dieser Frage wurde das Modell so weiterentwickelt, daß die dendritischen Zellen mit verschiedenen naiven Zellgruppen in Kontakt gebracht wurden. 4.2.3. Verhalten der CD45RA-Zellen Zellen mit dem Oberflächenantigen CD45RA wurden aus Nabelschnurblut isoliert und beobachtet. Diese umfassen vor allem T-Zellen, B-Zellen und Natürliche Killerzellen156 . Betrachtet man ihre IL-4- bzw. IFN-γ-Produktion und -Sekretion, erkennt man eine Zunahme bis zum siebten Tag. Diese Verläufe entsprechen den schon bei T-Zellen gezeigten. Durch diese Versuchskonstellation konnte sicher gezeigt werden, daß es sich bei der Zytokinproduktion der Nabelschnur-T-Zellen auch wirklich um eine Reaktion der naiven T-Zellen handelte und nicht um eine Reaktion der verbleibenden Memory-TZellen, da sowohl CD3 pos. Zellen als auch CD45RA pos. Zellen IFN-γ bzw. IL-4 bilden. Zusätzlich wurde gezeigt, daß es sich bei den früh sezernierenden Zellen um solche handelt, die das Oberflächenantigen CD45RA tragen, aber keine naiven T-Zellen sind. Dies rückte die Natürlichen Killerzellen als frühe Lieferanten des IFN-γ in den Blickpunkt, da sie Teil der CBMC sind und CD45RA, aber kein CD3 tragen157 . - 133 - 4. Diskussion 4.2.4. Natürliche Killerzellen 4.2.4.1. Die Natürliche Killerzelle Bei den Natürlichen Killerzellen handelt es sich um eine heterogene Zellpopulation der unspezifischen Immunabwehr. Sie können unmittelbar, nicht-antigenspezifisch Zielzellen zerstören und sind durch die Oberflächenkonstellation CD16 (FcγIII) pos., CD56 pos., CD3 neg. definiert158, 159 , ein spezifischer Oberflächenmarker, wie z.B. NK1.1 für Maus-NK-Zellen, existiert bei humanen Zellen nicht160 . Für diese Arbeit war von Bedeutung, daß sie in minutenschnelle Zytokine ausschütten158 können und das Oberflächenantigen CD45RA tragen, wie auch die frühen IFN-γ produzierenden Zellen in den dargestellten Experimenten. Zytokinwirkungen auf Natürliche Killerzellen werden in der Literatur zahlreich beschrieben und sind in Tab. 10 zusammengefasst. Für diese Arbeit war insbesondere die Wirkung des IL-12 (früher: NK-Zell-aktivierender-Faktor) von Bedeutung, das ihre Killerzellaktivität, Proliferation, die Produktion bzw. Expression von IFN-γ und GMCSF162 sowohl im Knochenmark Erwachsener als auch im Nabelschnurblut163 steigert, sie aber nicht vor dem Zelltod durch Apoptose schützt. Die Reaktionen der NK-Zellen auf IL-12 ordnen sich gut in das vorgestellte Modell ein, da – wie in dieser Arbeit und in der Literatur gezeigt 164 - dendritische Zellen IL-12 zur Verfügung stellen können. IL-12 aus dendritischen Zellen wird wiederum verstärkt exprimiert durch GM-CSF und IFN-γ aus aktivierten NK-Zellen. Das Zytokinspektrum der NK-Zellen unterstützt also die nachfolgende Ausbildung eines Th1-Musters161 und zwar durch die Wirkung von IFN-γ auf naive T-Zellen165 und dendritische Zellen und die verstärkte Freisetzung von IL-12 aus den dendritischen Zellen durch GM-CSF und IFN-γ166. - 134 - 4. Diskussion Tab. 10: NK-Zell-Eigenschaften 158, 159, 143, 167 Eigenschaft Ausprägung Oberflächenantigene CD16 (FcγIII) pos CD56 pos CD3 neg. CD45RA IL-2 bewirkt Aktivierung Freisetzung löslicher TNF-α-Rezeptoren Produktion GM-CSF-mRNA Schutz vor Apoptose IL-7 bewirkt Steigerung der Proliferation und Killerzellaktivität Freisetzung löslicher TNF-α-Rezeptoren Produktion GM-CSF-mRNA Schutz vor Apoptose IL-12 bewirkt Steigerung der Proliferation und Killerzellaktivität (im KM und Nabelschnurblut) Produktion und Expression IFN-γ Aktivierende Zellen CD4-pos. T-Helferzellen via Zytokinproduktion in deren Abwesenheit nur durch dendritische Zellen 4.2.4.2. Kinetik der IFN-γ-Produktion und -Sekretion Natürlicher Killerzellen In vitro produzieren und sezernieren NK-Zellen bereits nach einem Tag Stimulation mit dendritischen Zellen in großem Umfang IFN-γ, der bis zum zweiten Tag noch weiter steigt, um dann über einen leichten Rückgang am vierten Tag, am siebten Tag fast nicht mehr vorhanden zu sein. NK-Zellen sind die ersten IFN-γ produzierenden und sezernierenden Zellen. Von ihnen stammt das frühe IFN-γ, das in den CBMC beobachtet werden konnte und nicht den TZellen entstammte. Diese Beobachtung bestätigt viele der in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse. Humane dendritische Zellen sind - u.a. durch IL-12 - in der Lage NK-Zellen zu aktivieren, die dadurch umgehend IFN-γ ausschütten und neu produzieren. Dieses IFNγ steht schnell zur Verfügung, um die spezifische Immunantwort (u.a. naive T-Zellen) zu initiieren und zu modulieren. IFN-γ und GM-CSF aus den Natürlichen Killerzellen wirken aber auch auf die dendritischen Zellen zurück, die dadurch gesteigert IL-12 und - 135 - 4. Diskussion kostimulatorische Moleküle (B-7) exprimieren. Diese Moleküle sind, wie in dieser Arbeit gezeigt, ebenfalls wichtig zur Induktion der IFN-γ-Produktion naiver T-Zellen. Die NK-Zellen wirken also direkt auf die T-Zellen (über IFN-γ) und indirekt (über die IL-12 produzierende dendritischer Zellen). Bestätigt werden die Ergebnisse durch die vorgelegten Daten hinsichtlich der Kinetik der IL-12-Produktion von dendritischen Zellen. Diese ist innerhalb weniger Stunden nach der Aktivierung maximal, steht also schnell zur Verfügung, um die NK-Zellen zu aktivieren. Das IL-12 und Oberflächenmoleküle der dendritischen Zellen und das IFN-γ aus den NK-Zellen lenken also gemeinsam naive T-Zellen in Richtung Th1 (s.Abb. 79). Kostim. Moleküle verstärkt (Il-12, B-7) Aktivierung Direkt IFN-γ Indirekt Via IL-12 (Mech. unbekannt) T-Zelle IFN-γ GM-CSF NK-Zelle Abb. 79: Netzwerk der NK-Wirkungen nach den Ergebnissen dieser Arbeit: NK-Zellen werden durch dendritische Zellen aktiviert und beginnen mit der Produktion und Sekretion von Zytokinen, die dann indirekt via dendritische Zellen oder direkt auf naive T-Zellen wirken und deren Polarisierung beeinflussen. 4.2.4.3. Kinetik der IL-4-Produktion und -Sekretion durch Natürliche Killerzellen Die Sekretion von IL-4 durch Natürliche Killerzellen ist bereits am zweiten Tag nach der Stimulation mit dendritischen Zellen maximal. Bemerkenswerterweise erfolgt die - 136 - 4. Diskussion größte durchflußzytometrisch nachgewiesene IL-4-Produktion jedoch erst am vierten Kulturtag. Beide Prozesse nehmen dann bis zum siebten Tag wieder ab. Dieses IL-4 entstammt wahrscheinlich ausschüttungsbereiten Reserven, die Kos et al. in Maus-NK-Zellen zeigten158 , und sich nach Kontakt mit dendritischen Zellen in minutenschnelle in den Extrazellularraum entleeren. Nach dem Kontakt mit dendritischen Zellen setzt die Produktion von neuem IL-4 ein, welches sich intrazellulär nach einigen Tagen zeigen lässt. 4.2.5. Natürliche Killerzellen sind die frühen IFN-γ-Produzenten Nach Etablierung des Meßsystems konnten durch den Einsatz der dendritischen Zellen die zeitlichen Abläufe der Zytokininduktion in naiven Zellen geklärt werden. Die daran beteiligten Zellen entsprechen der primären Immunantwort. Selbstverständlich ist die Situation in vivo wesentlich komplexer, doch die grundlegenden Mechanismen und vor allem die zeitlichen Abläufe der Zytokinbildung sind aus dem vorgestellten Modell übertragbar, unter der Voraussetzung, daß kein exogener Einfluß auf das Neugeborene stattfindet. Es handelt sich also um ein Modell der Immunsituation ohne Beeinflussung von außen, gleichsam steriler Bedingungen. Die durchflußzytometrische Betrachtung zeigte, daß innerhalb der CBMC naive TZellen - die einen Großteil der CBMC ausmachen - erst spät IFN-γ produzieren. Durch Untersuchung isolierter Zellarten konnte NK-Zellen als erste IFN-γ produzierende Zellen identifiziert werden, die dieses Zytokin auch sehr schnell sezernieren und dadurch die weitere Immunantwort modulieren. Diese regulatorische Rolle der NK-Zellen in der frühen Etablierungsphase des Immunsystems ist bislang erheblich unterschätzt worden. Im Mausmodell konnte ihre Fähigkeit zur schnellen Zytokinfreisetzung schon mehrfach gezeigt werden162 und auch ihre Aktivierbarkeit durch dendritische Zellen - direkt168 und indirekt durch IL-12169 war bekannt, aber ihre Stellung als immunmodulatorischer Zelltyp, also ihre Wirkung auf das spezifische Immunsystem, ist bisher wenig berücksichtigt worden. Die NK-Zellen stellen ebenfalls IL-4 zur Verfügung und tragen daher auch zur Etablierung eines Th2-Musters bei. - 137 - 4. Diskussion 4.2.6. Physiologische Betrachtung der in vitro-Ergebnisse NK-Zellen sind Teil der unspezifischen Abwehr des Körpers. Wurde bisher vor allem ihren zytotoxischen Fähigkeiten Beachtung geschenkt, muß man nun auch den Blick auf ihre Rolle als Modulator der spezifischen Immunantwort lenken. Ihre zytotoxischen Fähigkeiten liefern den antigenpräsentierenden Zellen Bruchstücke von Fremdobjekten, die dann weiterverarbeitet werden. Derartige Bruchstücke haben eine entscheidende Wirkung auf die antigenpräsentierenden Zellen, da ihre kostimulatorischen Fähigkeiten dadurch verbessert werden und sie mit der Zytokinproduktion beginnen170 . Die NK-Zellen wirken aber auch immunmodulatorisch auf das spezifische Immunsystem, da sie durch Zytokinfreisetzung - IL-4 oder IFN-γ - die Antikörperproduktion stimulieren bzw. suprimieren und damit den humorigen Zweig der spezifischen Immunantwort beeinflussen. Gleichzeitig erfolgt durch diese Zytokine auch die Polarisation der naiven T-Zellen in ein Th1- bzw. Th2-Muster, wodurch die zelluläre, spezifische Abwehr in wegweisende Bahnen gelenkt wird. Dendritische Zellen und NK-Zellen sind Vertreter des zellulären Flügels der unspezifischen Abwehr. Beide sind Teil der ersten Abwehrreihe gegen Bedrohungen, beide verarbeiten diese und steuern gemeinsam die Antwort des spezifischen Immunsystems. Die dendritischen Zellen sind dabei durch ihre kostimulatorischen Moleküle der ausschließliche Aktivator der spezifischen Immunantwort, die NK-Zellen haben durch Beeinflussung der Zytokinumgebung einen modulierenden Effekt. - 138 - 4. Diskussion 4.3. Interzelluläre Wechselwirkungen Dendritische Zellen als Stimulatorzellen sind stark genug, um in naiven Effektorzellen Zytokine zu induzieren. Nachdem die zeitlichen Zusammenhänge verschiedener Effektorzellgruppen gezeigt waren, wurden die interzellulären Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen Ziel der folgenden Untersuchungen. Bedingt durch die Modellstruktur konnten einzelne interzelluläre Wechselwirkungen durch den Einsatz spezifischer, aktivierungsneutraler, monoklonaler Antikörper gehemmt werden. Die Auswirkung auf das entstehende Zytokinmuster der naiven TZellen wurde dabei stets im Vergleich zu Ansätzen ohne diese Hemmung betrachtet. Ziele der Modulation waren die Wechselwirkungen von HLA/MHC mit TZR, B-7Komplex (CD80, CD86) mit Rezeptoren (CD28, CTLA4) sowie einigen Zytokinen (IL-12, IL-4) und Zytokinrezeptoren. IL-4 IFN-γ MHC II B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) IL-12 IL-4 TZR CD28 CTLA4 Blockierende Antikörper Abb. 80: Die interzellulären Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen wurden eingehend untersucht; die verschiedenen Interaktionen wurden durch den Einsatz akitivierungsneutraler Antikörper spezifisch geblockt und der Effekt der Blockierung auf die Zytokininduktion gemessen. - 139 - 4. Diskussion 4.3.1. Antigenabhängiges Signal und Kostimulus Die vollständige Aktivierung von T-Zellen muß über mindestens zwei Stimuli erfolgen, die durch Oberflächenantigene oder Zytokine antigenpräsentierender Zellen vermittelt werden können. Dendritische Zellen verfügen in einem hohen Maße über derartige Stimulations-moleküle, was laut Young et al. ihre gezeigte Stärke als Aktivator in der MLR bedingt22 . Die beiden nötigen Stimuli werden als antigenabhängiges Signal und Kostimulus bezeichnet. Das antigenabhängige Signal wird durch die Bindung des HLA/MHC-Moleküls der antigenpräsentierenden Zelle, in dem sich während der Antigenpräsentation das Antigen befindet, an den T-Zell-Rezeptor (TZR) vermittelt171 . Diese führt durch eine Anzahl intrazellulärer Protein-Tyrosin-Kinasen172 zu verschiedenen T-Zell-Reaktionen: Proliferation, Änderung der Oberflächenantigene, Sensibilitätsveränderung gegenüber Zytokinen, Produktion von Zytokinen oder der Ausprägung zellspezifischer Eigenschaften, z.B. Zytotoxizität173, 174 . Allerdings kann es statt dessen auch zu deaktivierenden Zellreaktionen wie Anergie oder Apoptose kommen, was zur Entstehung der T-Zell-Toleranz führt173 . Welche Zellreaktion sich entwickelt, ist abhängig vom Erhalt eines weiteren Signals neben dem antigenabhängigen, dem als Kostimulus bezeichneten. Der Kostimulus kann durch Mediatorenstoffe in Form von Zytokinen oder durch die Bindung und Vernetzung von Oberflächenantigenen vermittelt werden. Besondere Rollen nehmen die Zytokine IL-12, IL-4 und deren Rezeptoren, und der B7Komplex (CD80, CD86) und dessen Gegenstücke (CD28, CTLA 4) ein. Die kostimulierenden Wechselwirkungen dieser Moleküle wurden näher untersucht. - 140 - 4. Diskussion Tab. 11: Übersicht über die in dieser Arbeit beobachteten Interaktionen Stimulus Molekül T-Zelle Antigenpräsentierende Zellen Antigenabhängiges MHC Klasse I Signal MHC Klasse II T-Zell-Rezeptor (HLA-Komplexe) löslicher anti-CD3-Körper (artifiziell, nicht von APZ) Kostimulus B7-Komplex: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) CD28, CTLA4 IL-12 IL-12-Rezeptor IL-4 (Herkunft unbekannt) IL-4-Rezeptor CD40 CD40 Ligand Neben den genannten kostimulierenden Molekülen sind weitere beschrieben, die in Tab.12 dargestellt sind. Alle Stimulationswege können in Zukunft durch blockierende Antikörper im vorliegenden Modell einfach und effizient untersucht werden. Insbesondere OX40 und ICOS sind hochinteressante Moleküle, deren Untersuchung im vorliegenden Modell Aufschluß über ihre Rolle in der Th1-/Th2-Polarisierung im humanen System geben kann. Tab 12 : Weitere Kostimuli und ihre Wirkungen175, 176, 177 Molekül CD70 ICOS Ligand OX40 SLAM 4-1BB LFA-1 (CD11a/CD18) Beschriebene Wirkung Zellvermehrung Verstärkt IL-10 Verstärkt Th2 Verstärkt Th1 Verstärkt Th1 Adhäsion (ICAM-1) 4.3.2. Beeinflussung des antigenabhängigen Signals Durch die Zugabe eines aktivierenden monoklonalen Antikörpers gegen CD3, einer dem TZR assoziierten Struktur, wurde der antigenabhängige Stimulus gezielt verstärkt. - 141 - 4. Diskussion Diese Verstärkung beeinflußte die Entstehung des IFN-γ nicht signifikant. Dies deckt sich mit den Ergebnissen, daß die IFN-γ-Induktion auch durch Erhöhung der Zahl dendritischer Zellen kaum zu beeinflussen war. Der Anteil IL-4-produzierender Zellen wurde dagegen durch Zugabe von anti-CD3 erhöht. Dies geschah dosisabhängig, also eine stärkere Bindung und Vernetzung des TZR durch mehr Antikörper, führte zu einer Erhöhung des IL-4. Dies steht in Einklang mit Flamand et al. 178 , die für die IL-4-Induktion die Stärke der Vernetzung des TZR verantwortlich macht und mit den in dieser Arbeit vorgelegten Daten, die eine IL-4Verstärkung bei Erhöhung der Stimulatorzellmenge zeigten. 4.3.3. Aktivierungsneutralisation des IL-12 IL-12 hat verschiedene Aufgaben im menschlichen Körper. Für diese Arbeit war vor allem seine Rolle als Induktor von IFN-γ und Aktivator verschiedener Zellgruppen von Bedeutung. Weitere Aufgaben des IL-12 sind in Tab. 13 zusammengefaßt. Die durchgeführte IL-12-Blockade führte zu verminderter IFN-γ und IL-4-Produktion, wobei die Abnahme des Anteils IL-4 produzierender Zellen sehr überraschend war. Tab. 13: Übersicht IL-12-Wirkungen179, 180, 162, 163, 181, 182, 183 Bereich Wirkung Alternative Bezeichnungen Natural Killer Cell Stimulatory Factor (NKSF) Cytotoxic lymphocyte maturation factor (CLMF) Ursprung Antigenpräsentierende Zellen, v.a. dendritische Zellen Wirkung auf Zellen Aktivierung von NK-Zellen Steigerung der NK-Zell-Zytotoxizität Entwicklung von CD8+ zytotoxischen T-Zellen Aktivierung von CD4 und CD8 pos T-Lymphozyten T-Zell-Polarisierung Erzeugung eines Th1-Musters (IFN-γ) Effekte im Mausmodell Tumorreduktion Unterbindung von Infektionen - 142 - 4. Diskussion 4.3.3.1 Hemmung der IFN-γ-Induktion durch anti-IL-12 Die Hemmung der IFN-γ-Induktion durch eine IL-12 Blockade war nach den in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnissen erwartungsgemäß, da exogenes IL-12 naive T-Zellen zur IFN-γ-Produktion anregte150, 161 und dendritische Zellen nach Stimulation IL-12 produzieren. Ein auslösender Mechanismus hierfür war die CD40-CD40 Liganden Interaktion, in dem T-Zellen durch den löslichen CD40 Liganden simuliert werden. Nach dieser CD40-CD40L-Bindung produzieren dendritische Zellen IL-12, das TZellen zur IFN-γ-Produktion anregt. Im dargestellten Versuchsaufbau wird dieses freigesetzte IL-12 durch Antikörper abgefangen und die IFN-γ-Produktion vermindert. 4.3.3.2 Hemmung des IL-4 durch anti-IL-12 Die Hemmung der IL-4-Induktion durch IL-12-Blockade war sehr überraschend und neu. Gängig ist die Ansicht, daß IL-12 die IL-4-Induktion hemmt184, 150, 161 , obwohl unklar ist, ob diese Hemmung direkt oder indirekt durch eine verstärkte IFN-γInduktion erfolgt. Allerdings zeigten Openshaw150 et al., daß mit Hilfe von IL-12 naive T-Zellen zur gleichzeitigen IL-4- und IFN-γ-Produktion angeregt werden können. Es ergibt sich die Frage, ob die IL-4-Produktion eine direkte oder indirekte IL-12Wirkung ist. Der indirekte Weg könnte IL-10 vermittelt sein, das wie IFN-γ durch IL12 induziert wird. IL-10 antagonisiert seinerseits Wirkungen von IL-12 in bestimmten Bereichen, z.B. indem es die IL-4-Induktion fördert (aber nicht induziert). Vielleicht ist seine Rolle im vorliegenden System so bedeutend, daß eine Unterbrechung der Kaskade IL-12, IL-10, IL-4 zu einer Abnahme des IL-4 führt161 . Die Rolle des IL-10 sollte in Zukunft im vorliegenden Modell ebenso wie die der anderen Zytokine untersucht werden. Daneben könnten noch weitere indirekte Mechanismen existieren, die als Reaktion auf IL-12 gegenregulierend aktiviert werden und im vorliegenden System für die Induktion von IL-4 verantwortlich sind. - 143 - 4. Diskussion 4.3.4. Hemmung des IL-4 Die vielfältigen Aufgaben des IL-4 im menschlichen Körper sind in Tab. 14 dargestellt. Für diese Arbeit war seine zentrale Rolle als einziger bekannter IL-4-Induktor, als Leitzytokin der Th-2-Zellen und damit als Atopiemarker von Bedeutung. Tab. 14: Wirkungen von IL-4187, 186, 188, 189 Wirkbereich Wirkung Naive T-Zellen Fördert Th2-Muster aus Th0-Zellen (IL-4, IL-5) Unterdrückt Th1-Muster Antagonist von IFN-γ und IL-12 Verstärkt durch IL-2 Atopische Dermatitis Erniedrigung des IL-12 induzierten IFN-γ B-Zellen Start der Immunantwort (IgM-Produktion) Immunglobulinwechsel von IgM zu IgG4 und IgE Die IL-4-Ausbildung ließ sich in dem vorliegenden Modell durch die Blockierung des Zytokins IL-4 vermindern. IFN-γ wurde durch IL-4-Blockade nicht beeinflusst. Beides war erwartungsgemäß, da IL-4 selbst der Induktor von IL-4 ist und in der Regel sogar exogen eingesetzt werden muß, um eine Polarisierung Richtung Th2 zu erzielen190 . Daß es nicht zur völligen Auslöschung der IL-4-Produktion kommt, liegt im vorliegenden Modell wahrscheinlich an der starken HLA/MHC - TZR - Interaktion, die in einem Teil der naiven T-Zellen direkt IL-4 induziert. Das Phänomen der direkten IL4-Induktion in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen wurde in dieser Arbeit mehrfach unter verschiedenen Bedingungen gezeigt und ist bisher nicht beschrieben. Durchgeführte Kontrollen mit Monozyten des peripheren Blutes ließen kein IL-4 entstehen, es handelt sich also nachweislich um einen spezifischen Effekt dendritischer Zellen. Da die IL-4 Produktion sich durch Verstärkung des TZR-Stimulus vergrößern ließ, scheint die starke Expression des MHC auf den dendritischen Zellen Grundlage dieser Entdeckung zu sein. Der selbstverstärkende Mechanismus des erzeugten IL-4191 wird durch Zugabe des antiIL-4 durchbrochen, mit der Folge der IL-4 Abschwächung, aber nicht der Abschaltung. - 144 - 4. Diskussion 4.3.5. Wirkungen des B7-Komplexes 4.3.5.1. Der B7-Komplex In der vorliegenden Arbeit wurden die umfangreichen Wechselwirkungen des B7Komplexes, bestehend aus B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86), untersucht. Er kann auf vielen Zelltypen gefunden werden185 , z.B. B-Zellen, Makrophagen, unreifen und reifen dendritischen Zellen192 . Ob CD86193 oder CD80161 als stärkerer Kostimulus , oder ob beide gleichstark sind194, 174 , wird in der Literatur kontrovers betrachtet200 . Der B7-Komplex ist von großer Bedeutung, da seine Blockade zur Reduktion der Proliferationsrate von naiven und Memory-T-Zellen in der MLR mit dendritischen Zellen führt und die starke Aktivierungsfähigkeit dendritischer Zellen als Funktion der hohen Expression des B-7-Komplexes interpretiert wird195, 22, 174, 201 . Seine deutlich geringere Ausprägung auf Monozyten wird von Fagnoni et al. dafür verantwortlich gemacht 196 , daß nur dendritische Zellen naive T-Zellen überhaupt und Memory-TZellen stärker aktivieren22 . 4.3.5.2. Die Rezeptoren des B7-Komplexes Auf der T-Zelloberfläche gibt es zwei Rezeptoren für den B-7-Komplex, CD28 und CTLA-4, beides Glykoproteine 172 . Sie haben teilweise die gleiche Aminosäuresequenz und eine ähnliche Gesamtstruktur, werden aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten exprimiert und unterscheiden sich in ihren Funktionen. CD28 wird auf ruhenden und aktivierten T-Zellen exprimiert, ist aber der dominierende Rezeptor für B7 auf ruhenden Zellen. Bindet B7 an CD28 führt dies zur T-ZellAktivierung und damit zur Expression von Zytokinen, Zytokinrezeptoren, Genen für das Zellüberleben und zu einer Steigerung der Proliferationsrate197 . CTLA-4 wird nur auf aktivierten T-Zellen exprimiert, auf denen es durch eine höhere Affinität als CD28 zu dem B7-Komplex der dominierende Rezeptor wird. CTLA-4 aktiviert hemmende Signalwege und beendet die T-Zell-Aktivierung198 . - 145 - 4. Diskussion 4.3.5.3. Hemmung des B-7 Komplexes Der singuläre Block des B7-1 (CD80) führte zu einer deutlichen Abschwächung der IFN-γ-Induktion. Die selektive Hemmung des Kostimulationsweges durch das Oberflächenmolekül CD86 zeigte in den durchgeführten Experimenten keinen Einfluß auf die Zytokinbildung. Unterschiedliche Funktionen von CD80 und CD86 werden immer wieder diskutiert. In dieser Arbeit wurde eine Funktion des CD80 bei der IFN-γ-Induktion gezeigt; dies wird auch aus Teilen der Literatur unterstützt, die durch Einsatz aktivierender monoklonaler CD80-Antikörper zur Kostimulation IFN-γ erzeugen konnten199 . Einzelne Autoren widersprechen diesen Zusammenhängen und machen völlig andere Einflüsse an den T-Zellen bzw. andere Strukturen und Mechanismen der antigenpräsentierenden Zellen für die Polarisierung verantwortlich. Diesen Arbeiten ist in sofern recht zu geben, daß der B7-Komplex sicher nicht alleine die Polarisierung der Zellen bestimmt, aber sowohl die vorgelegten Daten als auch die moderne Literatur zeigen eine klare Funktion des B7 in der T-Zell-Aktivierung. 4.3.6. CD40 Ligand und CD40 Liganden-Mangel Ein wichtiger Baustein der interzellulären Wechselwirkungen ist die CD40-CD40 Liganden-Interaktion, denn dieser Kontakt reguliert andere stimulierende Moleküle und wurde deshalb untersucht. Das Grundmodell wurde zu diesem Zweck durch den Einsatz naiver Zellen von Patienten mit dem CD40 Liganden -Mangel verändert. 4.3.6.1. CD40, CD40 Ligand und Interaktionen CD40 ist ein Oberflächenmolekül der TNF-Rezeptoren-Familie und wurde zuerst auf B-Lymphozyten identifiziert und funktionell charakterisiert. Inzwischen ist CD40 auf weiteren Zellarten beschrieben, die zusammen mit den entsprechenden Wirkungen in Tab. 15 dargestellt sind. - 146 - 4. Diskussion Tab. 15: CD40: Vorkommen und Wirkungen130, 124, 202 Zellart Wirkung B-Zellen Proliferation Differenzierung Immunglobulin-Produktion Isotypwechsel Apoptoseschutz Phänotypausbildung im Keimzellzentrum Entwicklung zu Plasmazellen und Gedächtniszellen Monozyten Immunregulation Stammzellen Immunregulation Ausbildung dendritischer Zellen (Ontogenese) Dendritische Zellen Immunregulation Endothel-/ Epithelzellen Immunregulation Der CD40 Ligand wird hauptsächlich von aktivierten, CD4 positiven (auch naiven) TZellen exprimiert, dem immunologischen Gegenstück zu den antigenpräsentierenden Zellen202, 203 . Er findet sich auch auf basophilen und eosinophilen Granulozyten und aktivierten B-Zellen. Ein Problem bei Arbeiten mit dem CD40-CD40 Liganden-Komplex war bis vor kurzem die schlechte Verfügbarkeit des CD40 Liganden. Er lag nur zellgebunden vor, z.B. an Fibroblasten, oder mußte löslich in sehr hohen Mengen eingesetzt werden. Deshalb wurde er meist durch aktivierende oder deaktivierende Antikörper gegen CD40 simuliert. Die physiologischen Wirkungen der Interaktion sind in Abb. 81 dargestellt. Nun steht ein Verstärker für den löslichen CD40 Liganden zur Verfügung, der mehrere Moleküle komplexiert und so zu einer enormen Wirkungsverstärkung führt. In der vorliegenden Arbeit wurden Wirkungen des CD40-CD40 LigandenKomplexes zum einen durch den Einsatz des löslichen CD40Liganden untersucht, zum anderen durch Einsatz von Patientenzellen, die keinen CD40 Liganden exprimieren konnten. - 147 - 4. Diskussion Aktivierung der antigenpräsentierenden Zelle: Bildung regulatorischer Zytokine (IL-12) Expression kostimulierender Moleküle Bildung inflammatorischer Zytokine NO Produktion Antigenpräsentierende Zelle CD40 CD40L Aktivierung der T-Zellen: Direkte Aktivierung der T-Zellen T-Zellen entwickeln kostimulierende Eigenschaften (Helferfunktion) Polarisierung Richtung Th1 T-Zelle Abb. 81: Schematische Darstellung der funktionellen Konsequenzen der CD40 Triggerung; Die CD40CD40 Liganden Interaktion führt bei Gesunden zur verstärkten Expression stimulatorischer Moleküle; dieses Signal fehlte bei den Patientenzellen. Nachdem die Rolle einzelner stimulatorischer Moleküle untersucht worden war, wurde auf diese Weise das komplette Fehlen dieser Moleküle simuliert. Die Folgen dieser mangelnden Interaktion wurden anhand der entstehenden Zytokinmuster in den T-Zellen gemessen. 4.3.6.2. Das Hyper-IgM-Syndrom 4.3.6.2.1. Das HIGM-Syndrom (Hyper-IgM-Syndrom) und Tiermodell Das HIGM-Syndrom (Hyper-IgM-Syndrom), eine X-chromosomal vererbbare Immundefizienzerkrankung, beruht auf der genetischen Veränderung des CD40 Liganden. Die Erkrankung ist klinisch gekennzeichnet durch einen Verlust der T-Zellabhängigen Antikörperantwort mit Verlust des B-Zell-Gedächtnis ohne zirkulierende IgG-, IgA- und IgE-Antikörper, opportunistische Infektionen mit wie einer verstärkten Empfindlichkeit Pneumocystis-carinii-Pneumonien Cryptosporidium-Diarrhoen130 . - 148 - für und 4. Diskussion Morphologisch finden sich bei Patienten mit dem HIGM-Syndrom in den Lymphorganen keine Keimzentren, welche das anatomisch-morphologische Substrat des Antikörperwechsels und den Ort der somatischen Mutationen130 bilden. Im Tiermodell gelang es Xu et al.205 durch die Erzeugung von CD40- und CD40Ligand-knock-out-Mäusen einen Phänotyp zu generieren, der an einem, dem menschlichen HIGM-Syndrom vergleichbarem Symptomen leidet. Beide Krankheitsbilder haben die kritische Rolle des CD40-CD40 Liganden-Komplexes in der Entwicklung von B-Zellen gezeigt130 . Neben den pathologisch-morphologischen Substraten liegt damit auch eine tierexperimentelle Bestätigung für das pathophysiologische Entstehungsmodell des HIGM vor204 . 4.3.6.2.2. Charakteristika der Patienten und Ergebnisse Die Patienten, deren Zellen in dieser Arbeit verwendet wurden, sind zuerst durch eine Pneumocystis-carinii-Pneumonie klinisch auffällig geworden. Die Diagnose des CD40 Liganden-Mangel wurde durch die typische Klinik und den Einsatz der Durchflußzytometrie gesichert. Inzwischen werden die fehlenden Immunglobuline in dreiwöchentlichen Abständen substituiert. Das humane Krankheitsbild mit den typischen Krankheitserregern spricht für einen Defekt der CD40-CD40L-Interaktion auf Ebene der spezifischen, zellulären Immunantwort, welcher dann konsekutiv zu der B-Zell-abhängigen Symptomatik führt. Tatsächlich haben CD40 Ligand-knock-out-Mäuse Probleme beim T-Zell-Priming und sind empfänglich für Leishmania-Infektionen130 , haben also Probleme mit der Th1abhängigen Immunität. 4.3.7. Der CD40 Ligand ist zur IFN-γ-Induktion nötig Teil dieser Arbeit war die Analyse des durch allogene dendritische Zellen induzierten Zytokinmusters naiver T-Zellen von Patienten mit CD40 Liganden-Mangel im Vergleich zu der gesunder Probanden. Es zeigte sich praktisch keine Ausbildung eines - 149 - 4. Diskussion Th1-Musters in den T-Zellen der Patienten. Das Th2-Muster dagegen ließ sich bei Gesunden wie Patienten vergleichbar induzieren. Die Krankheitsbilder sind durch eine fehlende Th1-Antwort in Verbindung mit einer mangelhaften Bildung von IL-12 durch antigenpräsentierende Zellen und dem folgenden Ausfall der IL-12 aktivierten Zellgruppen, wie z.B. NK-Zellen, zu erklären. Diese These wird durch die hier vorgelegten in vitro Daten und die Abläufe im Mausmodell206,130 bestätigt. In der vorliegende Arbeit führt der lösliche CD40 Ligand zu einer weiteren Ausreifung der Zellen mit stark vermehrter Expression der kostimulatorischen Signale und zur Produktion von IL-12. Durch Blockade dieser Moleküle (CD80, CD86 und IL-12), wurde eine drastische Minderung der IFN-γ-Produktion erzielt. Dies ist die Erklärung für die fehlende Th1-Antwort der CD40 Liganden-Mangel-Patienten. Durch eine fehlende Ausreifung der dendritischen Zellen bei mangelnder Aktivierung via CD40-CD40 Ligand kommt es nicht zu einer Verstärkung des B7-Komplexes und es wird auch kein IL-12 gebildet. Die kostimulatorischen Signale zur Ausbildung eines Th1-Musters fehlen. Die hier vorgestellten Daten lassen die CD40-CD40L-Interaktion als zwingend nötig ansehen, damit dendritische Zellen genügend kostimulatorische Aktivität entwickeln können, um T-Zellen in vivo zur IFN-γ-Produktion anzuregen. Die Tatsache, daß das Th2-Muster sich nicht auffällig verändert, kann in seiner Abhängigkeit von der Vernetzung der TZR begründet liegen. Blotta et al. 207 zeigten zwar, daß in humanen T-Lymphozyten die IL-4 Synthese durch ein CD40 Liganden initiiertes Cross-Linking gestartet wird, doch wie die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, bildet sich IL-4 hauptsächlich abhängig von der Stärke der MHC-TZRWechselwirkung aus. Diese ist bei den Patienten mit dem CD40 Liganden-Mangel nicht entscheidend beeinträchtigt, daher wird auch die IL-4-Produktion nicht signifikant beeinflußt. - 150 - 4. Diskussion 4.4. Exogene Einflüsse auf dendritische Zellen und die konsekutive Veränderung der IFN-γ- / IL-4-Bildung Wie gezeigt, konnte im vorliegenden Modell die primäre Immuninduktion simuliert werden und die Wechselwirkungen zwischen naiven Zellgruppen und dendritischen Zellen wurden effizient untersucht. Das Modell simuliert allerdings eine „sterile“ Welt des Neugeborenen, das in vivo sofort Kontakt mit der Umwelt aufnimmt und dessen Immunsystem umgehend beginnt, sich auf diese Auseinandersetzung mit den vom Körper als „fremd“ eingestuften Eindringlingen einzurichten und zu adaptieren. Daher wurde weitergehend untersucht, ob von außen eingebrachte Substanzen die Polarisierungseigenschaften der dendritischen Zellen verändern können. Diese Veränderung sollte sich zum einen an den dendritischen Zellen selbst widerspiegeln, z.B. in der Form veränderter Expression von Oberflächenmolekülen oder Zytokinen und die Zytokinproduktion der naiven TZellen beeinflussen. Zu diesem Zweck wurde zunächst geprüft, ob die Zytokininduktion der naiven TZellen in diesem Modell durch Veränderung der Zytokinumgebung bei gleichzeitigem Kontakt mit dendritischen Zellen beeinflußbar war. Ziel war hierbei, die maximale Polarisierbarkeit und Elastizität der naiven T-Zellen bei zusätzlicher exogener Stimulation zu prüfen. Derartige artifizielle Stimulationen verwenden in der Regel antiCD3 als antigenunabhängiges Signal und anti-CD28 als Kostimulus. Diese Aktivierungskomponenten wurden im vorliegenden Modell von den dendritischen Zellen zur Verfügung gestellt. In artifiziellen Modellen ist die IFN-γ-Produktion durch die Zugabe von IL-12 und antiIL-4 induzierbar, die des IL-4 durch anti-IL-12 und IL-4208 . Vorliegend wurden dann physiologische Substanzen gesucht, die dendritische Zellen zur Induktion von IL-12 und zur vermehrten Ausprägung von kostimulierenden Oberflächenmolekülen (u.a.dem B7-Komplex) anregten, also Moleküle, deren bedeutende Rolle in der Polarisierung der naiven T-Zellen in dieser Arbeit schon gezeigt wurde. Die gesuchten Stoffe mußten also in der Lage sein, die dendritischen Zellen zur Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen vorzubereiten. Dieses Konzept wurde anschließend in der MLR geprüft, indem entsprechend vorbehandelte dendritische - 151 - 4. Diskussion Zellen mit naiven T-Zellen eingesetzt und die induzierten Zytokine gemessen wurden. LPS wurde als maturierend wirkende und IFN-γ erzeugende Substanz identifiziert. FACS IL-12 CDs 80,83,86 CD1a, CD14 GM-CSF+LPS CD40 Ligand TNF-α GM-CSF+ TNF-α Abb. 82: Der Einfluß exogener Stimuli auf dendritische Zellen selbst wurde untersucht, mit dem Ziel, die dendritischen Zellen so zu verändern, daß sie in der MLR verstärkt IFN-γ induzieren. Zu diesem Zweck wurden die dendritischen Zellen 18 h mit verschiedenen Stimuli inkubiert und dann ihre Oberflächenantigene und IL-12 gemessen. FACS 0.; 2.; 4 .;7. Tag IL-4 / IFN-γ C GM-CSF LPS 18 h CD45RA+ CD3+ Abb. 83: LPS wurde als die dendritischen Zellen stark veränderndes Molekül ausgemacht, und daher die mit LPS vorbehandelten dendritischen Zellen als Stimulatorzellen in das Modell eingebracht; die induzierten Zytokine der naiven T-Zellen wurden gemessen. - 152 - 4. Diskussion 4.4.1 Artifizielle Musterbeeinflussung Um die Wirkung der Zytokinumgebung auf die Polarisierung der naiven T-Zellen zu untersuchen, wurden naive T-Zellen mit dendritischen Zellen in Kontakt und rekombinate Zytokine und Antikörper eingebracht. Durch den gemeinsamen Einsatz von Antikörpern gegen IL-4 und der Zugabe von rekombinatem IL-12, konnte erwartungsgemäß eine massive Induktion von IFN-γ erzielt werden. Weiterhin war es möglich, durch Zugabe des IL-4-induzierenden IL-4 und durch Hemmung seines Gegenspielers IL-12 mittels blockierender, monoklonaler Antikörper die IL-4-Induktion zu verstärken. Hierbei handelt es sich um eine Weiterentwicklung von Standardverfahren zur Erzeugung von IFN-γ und IL-4, in denen üblicherweise anti-CD3 statt dendritischer Zellen verwendet wird, um T-Zellen zu aktivieren, und Zytokine und Antikörper, um sie zu polarisieren208 . Das Grundmodell dieser Arbeit läßt eine Veränderung der Polarisierung zu, die Stimulation durch dendritische Zellen ist mittels zusätzlicher Zytokine beeinflußbar. Nächstes Ziel war daher die Suche nach physiologischen Einflüssen zur Verstärkung des B7-Komplexes und Induktion von IL-12 und die Folgen für die Polarisierung der naiven T-Zellen. 4.4.2. IL-12-Induktion in dendritischen Zellen Um die Einflüsse und Wirkmechanismen der exogenen Faktoren beschreiben zu können, wurden zunächst Untersuchungen an den dendritischen Zellen selbst vorgenommen. Mit dem so ermittelten optimalen Stimulus behandelte dendritische Zellen wurden dann in die MLR eingebracht. Es konnte systematisch gezeigt werden, daß verschiedene Stoffe in der Lage sind, dendritische Zellen zur Produktion von IL-12 anzuregen, welches spontan nicht nachweisbar war. Die von Mosca209 gezeigte Methode zur IL-12 Induktion in monozytengenerierten dendritischen Zellen durch LPS diente als Grundlage der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente, in denen IL-12 intrazellulär in dendritischen Zellen gemessen wurde. - 153 - 4. Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurden das bakterielle Produkt LPS, endogene Substanzen wie GM-CSF, TNF-α oder der lösliche CD40 Ligand verwendet. Die Stimulanzien wurden teilweise nach Vorinkubation mit GM-CSF eingesetzt. Da GM-CSF im menschlichen Körper210 physiologischer Weise vorkommt, wurde in dieser Arbeit vorausgesetzt, daß das Modell durch die Zugabe nicht signifikant beeinflußt wird. GM-CSF nimmt wahrscheinlich in vivo und in vitro eine vorbereitende Rolle ein, indem es Zellen für exogene Einflüsse empfänglicher macht. Die zur Kontrolle untersuchten GM-CSF-Effekte (auch in Kombination mit TNF-α) auf die IL-12-Induktion zeigten, daß es allein kaum Wirkung entfaltet und nur in wenigen dendritischen Zellen IL-12 induziert. Deutliche Induktionseffekte sind demnach auf die jeweilige Hauptsubstanz zurückzuführen, nicht auf GM-CSF. Als günstigster Stimulus zur Induktion von IL-12 ergab sich die Kombination von LPS mit GM-CSF. Maximum der Induktion ist 18 Stunden nach Zugabe. Auch der lösliche CD40 Ligand erwies sich als starker IL-12-Induktor, teilweise dem LPS noch überlegen. Da neben IL-12 auch die stimulatorischen Oberflächenmoleküle verantwortlich für die T-Zell-Differenzierung sind, wurden die Auswirkungen des CD40 Liganden und von LPS auf die Oberflächenantigene der dendritischen Zellen ebenfalls näher untersucht. 4.4.3. Ausreifung dendritischer Zellen Dendritische Zellen maturieren unter dem Einfluß von löslichem CD40 Liganden und LPS, sie werden von unreifen zu reifen dendritischen Zellen. Vorversuche dieser Arbeit zeigten, daß Ausreifungsschritte mit LPS nur möglich waren, wenn die Zellen vor LPSGabe mit GM-CSF inkubiert wurden. Die zur Kontrolle untersuchte weitere Ausreifung durch GM-CSF allein ist nur minimal. In dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal, die Ausreifung dendritischer Zellen unter dem Einfluß des löslichen CD40 Liganden zu beobachten. McLellan et al. zeigten Gleiches im Mausmodell durch den Einsatz aktivierender Antikörper gegen CD40128 . - 154 - 4. Diskussion Als Maß für die Ausreifung dienten die Oberflächenantigene CD1a, HLA-DR (MHC II), CD83 und der B7-Komplex (CD80, CD86)211 . MHC und CD1a sind repräsentativ für den Hauptstimulus, der gerade bei den dendritischen Zellen besonders stark ist. Beim MHC galt die Besonderheit, daß nach Ende der Kulturzeit, im Stadium der unreifen dendritischen Zellen, bereits alle Zellen das Molekül an ihrer Oberfläche trugen. Daher wurde die Zunahme des MHC durch die mittlere Fluoreszenzintensität bestimmt. Diese gibt an, wie viele Antikörper pro Zelle binden und entspricht damit der Expressionsmenge des Antigen. CD83 gilt als spezifischer Marker für reife dendritische Zellen. Er diskriminiert sie streng von unreifen dendritischen Zellen, seine Funktion war lange unbekannt212 ; inzwischen wird ihm die eines Adhäsionsmoleküls98 zugeschrieben. Der Arbeitsgruppe um Schuler und Steinkasser gelang die Klonierung des Moleküls 99 und zeigte interessante Aspekte seines intrazellulären Verhaltens während der Ausreifung der dendritischen Zellen215 . Die kostimulatorischen Moleküle des B7-Komplexes nehmen als Maß für die Ausreifung ebenfalls zu. Sowohl beim Einsatz von LPS als auch durch den CD40 Liganden konnte ein Anstieg dieser Oberflächenantigene beobachtet werden. Es kam zusätzlich zur erwartungsgemäßen Abnahme des CD14, der für einen monozyten-ähnlichen, unreiferen Typ von dendritischen Zellen kennzeichnend ist. Die geforderten Ausreifungsmoleküle konnten also gezeigt werden. Neben den untersuchten existieren noch weitere Moleküle, deren erhöhte Expression auf dendritischen Zellen mit einem Reifungsschritt verbunden werden. Beispiele hierfür sind CD54 (ICAM-1) oder CD58 (LFA-3), die von Caux123 beschrieben wurden130 . Diese Moleküle werden aber zum einen relativ labil exprimiert (CD54) und sind zum anderen nicht so spezifisch für die Maturation wie die in dieser Arbeit erfaßten. Da die dendritischen Zellen unter Einfluß von CD40 Ligand und LPS ausreifen, wurde überprüft, ob sie ausgereift eine verstärkte Produktion von IFN-γ induzieren und sich ihre Wirkung auf die IL-4-Produktion verändert. - 155 - 4. Diskussion 4.4.4. LPS-bedingte Veränderung der T-Zell-Polarisation Zur Untersuchung des LPS-Einflusses auf die Polarisierung naiver T-Zellen wurden dendritische Zellen mit GM-CSF und LPS vorinkubiert, wodurch sie wie beschrieben ausreiften und IL-12 produzierten. Zum Zeitpunkt der maximalen IL-12-Expression (18 Stunden) wurden sie mit naiven T-Zellen in Kontakt gebracht. 4.4.4.1. IFN-γ wird verstärkt Die mit LPS vorbehandelten dendritischen Zellen führten zu einer deutlich verstärkten Ausprägung von IFN-γ in den stimulierten naiven T-Zellen. Dies entsprach den anderen in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnissen, die IL-12 und B7 als Richtung IFN-γ polarisierende Kostimulatoren zeigten, und deren verstärkte Expression bzw. Produktion in dendritischen Zellen durch LPS erfolgte. Wie schon postuliert, führt diese zu vermehrtem IFN-γ. Diese in vitro-Konstellation läßt sich mit der Besiedlung des Neugeborenen mit gramnegativen Erregern, der Quelle von LPS, vergleichen. War das vorliegende Modell bisher das eines steril aufwachsenden Kindes, wird durch die Zugabe von LPS der Kontakt mit gram-negativen Erregern simuliert. Da LPS im vorliegenden Modell die IFN-γ-Produktion unterstützt, spricht dies für eine allergieprotektive Wirkung dieses Erregerkontaktes. Umfangreiche epidemiologische Daten, die von Mutius et al. 213 gewinnen konnten, bestätigen dies und weisen LPS eine Senkung des Atopierisikos zu. Das vorliegende Modell liefert damit die in vitro-Erklärung für das in diesen Studien beschriebene Phänomen, der Senkung des Atopierisikos durch frühen Erregerkontakt. Nach den in dieser Arbeit vorgelegten Daten verändern sich die dendritischen Zellen durch das LPS und regen die naiven T-Zellen zu vermehrter IFN-γ-Produktion an, dem zentralen atopieprotektiven Zytokin während der Immunetablierung. - 156 - 4. Diskussion 4.4.4.2. IL-4-Hemmung durch LPS IL-4 wurde durch LPS mittels verstärkter Kostimulation durch B7 und IL-12 in seiner Entstehung gehemmt, wobei diese Abschwächung gut mit der Zunahme des IFN-γ korreliert. Wie gezeigt, führt die singuläre Blockade des IL-12 dagegen zur IL-4-Verminderung. Dies unterstreicht die Vermutung, daß die IL-4 fördernde Wirkung des IL-12 auf indirekte Mechanismen zurückzuführen ist, da sonst die Zugabe von rekombinatem oder aus den dendritischen Zellen stammendem IL-12 zu einer Verstärkung des IL-4 hätte führen müssen, dies aber nicht tat. Überträgt man diese in vitro-Ergebnisse auf die epidemiologische Studie, scheint LPS nicht nur atopieprotektiv durch IFN-γ-Induktion zu wirken, sondern auch durch Minderung des atopieförderden IL-4. - 157 - 4. Diskussion 4.5. Perspektiven In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell geschaffen, das eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Untersuchung der primären Immunantwort eröffnet. Weitere Arbeiten an und in diesem Modell können damit wichtige Erkenntnisse über die physiologischen und pathophysiologischen Abläufe des Immunsystems liefern. Auch eine Überprüfung dieser in vitro-Ergebnisse in klinischen Zusammenhängen kann erfolgen. Daneben können einzelne Komponenten des Modells noch optimiert werden: Generierung dendritischer Zellen: Die Zellzahl kann durch den zusätzlichen Einsatz des FTL3-Liganden erhöht werden, da dieser synergistisch mit dem Stammzellfaktor wirkt. Da sich, wie gezeigt, LPS im Kulturmedium befand (FCS), wäre eine Umstellung der Kulturbedingungen auf serumfreie Medien nötig. Dies wäre auch für eine eventuelle klinische Nutzung der Zellen Voraussetzung (z.B. zur Retransfusion der gezüchteten Zellen). Möglich wäre dies durch den Einsatz von serumfreien Medium unter Zugabe von TGF-ß. Effektorzellen: Die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Effektorzellgruppen unter dem Einfluß dendritischer Zellen könnten als Ergänzung zu den in dieser Arbeit vorgelegten Daten in gemeinsamer Kultur mehrerer Zellgruppen nachgestellt werden. Wechselwirkungen: Die Einflüsse interzellulärer Wechselwirkungen der in dieser Arbeit diskutierten, aber nicht untersuchten Moleküle (z.B. IL-10, OX-40, ICOS) auf die IL-4 / IFN-γ-Induktion können mittels monoklonaler Antikörper oder durch den Einsatz rekombinanter Zytokine untersucht werden. Exogene Einflüsse: Neben den gezeigten Einflüssen des LPS auf dendritische Zellen und deren veränderten Polarisierungseigenschaften können weitere Pathogene und deren Bedeutung für die Th1-/ Th2-Etablierung untersucht werden. Interessantes Untersuchungsobjekt wäre z.B. der RSV, von dem Schwarze et al. 214 zeigen konnten, daß er im Tiermodell die Th2- - 158 - 4. Diskussion Polarsierung fördert. Eine Überprüfung dieser Ergebnisse könnte die Stellung des vorgestellten Modells als Bindeglied zwischen Tiermodell und klinischen Studien belegen. Durch die gezielte Anzuchtmöglichkeit dendritischer Zellen und den Erhalt hoher Zellzahlen ist die molekularbiologische Untersuchung intrazellulärer Wirkungen bestimmter Substanzen auf dendritische Zellen möglich. Beispielhaft wären hier die intrazellulärer Aktivierungswege durch LPS zu nennen. Übertragung des Modells in den klinischen Bereich : In Anlehnung an bestehende Tests der klinischen Routine (T-Zell-Transformationstest), könnten diagnostische Untersuchungen entwickelt werden, in der dendritische und TZellen eines Spenders geprüft werden. Gemeinsam eingebrachte Zellen können hinsichtlich der Immunkompetenz und der Atopieneigung untersucht werden. Auch die inidivduelle Reaktion des Spenders auf definierte exogene Substanzen kann durch das Einbringen dieser Substanzen in das autologe System geprüft werden. Unter klinischen Gesichtspunkten könnte geprüft werden, ob dendritische Zellen von Atopikern andere polarisierende Fähigkeiten haben als die von Gesunden. Auch ihre Reaktionen auf exogene Stimulanzien könnten überprüft werden, da diese bei Zellen von Atopikern anders ausfallen könnten als bei Zellen von gesunden Probanden. - 159 - Literatur Literaturverzeichnis: 1) Langerhans, P. Über die Nerven der menschlichen Haut. Virchows Arch. 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Funktionelle Tests zeigten sie als stärkste Stimulatorzellen in der MLR mit Memory-T-Zellen (MT) und einzige Aktivatoren naiver T-Zellen (nT). Die Modelletablierung war mit dem Nachweis der induzierten Effektorzellzytokine IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ in der MLR mit nT abgeschlossen. In diesem Modell wurden Art und zeitliche Abläufe der Immuninduktion des Neugeborenen durch den Einsatz verschiedener isolierter naiver Zellgruppen als Effektorzellen untersucht. Die Zellpopulationen waren CBMC, CD45RA+-Zellen, nT, MT, Natürliche Killer Zellen (NKZ). NKZ konnten als erste IFN-γ-produzierende Zellen ermittelt werden; die IL-4-Produktion verlief bei allen isolierten Zellgruppen annähernd zeitgleich. Die interzellulären Wechselwirkungen zwischen nT und DZ wurden untersucht. Mittels neutralisierender Antikörper wurden die kostimulatorischen Signale CD80, CD86, IL-12 und IL-4 isoliert blockiert und die so induzierten Zytokine bestimmt. Bei Verlust des CD40 Liganden, wie bei Patienten mit Hyper-IgM-Syndrom, konnte kein Th1-Muster induziert werden; das Th-2 Muster blieb unbeeinträchtigt. Abschließend wurde der Einfluß exogen eingebrachter, physiologischer Stimuli auf die Zytokininduktion ermittelt. LPS wurde als Substanz, die bei der Immunprägung des Neugeborenen eine Rolle spielen könnte, identifiziert, da LPS die IL-12-Bildung und Ausreifung der DZ anregt und diese so zur verstärkten IFN-γ-Bildung führen. Dieses Modell bietet vielfache Möglichkeiten für zukünftige Untersuchungen. - 187 - Danksagung Danksagungen: Ich danke meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. U. Schauer für die Überlassung des Themas, für die ständige Unterstützung, für seine Lehrbereitschaft und wichtige Gespräche, alles weit über das normale Maß hinaus. Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Rieger für die Bereitsstellung der Möglichkeiten. Ich danke Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel für die ständige inhaltliche und moralische Unterstützung und für ihre Bereitschaft, ihr Wissen mit mir zu teilen. Insbesondere danke ich ihnen für ihre Hilfsbereitschaft bei Problemen aller Art. Ich danke Frau Dr. Nora Hauk für die Hilfe der Endotoxinbestimmung. Ich danke Herrn Karsten Stempel, M.A., für die Durchsicht der Arbeit. Ich danke Frau Melanie Janßen für die Durchsicht der Arbeit, für ihre Toleranz und die im rechten Moment vermittelte Motivation. Ich danke meinem Vater, Rudolf Bartz, für vieles, insbesondere aber dafür, im rechten Moment Internetleitungen herstellen zu können. Ich danke meiner Mutter, Ingrid Bartz, geb. Kröpcke für alles. - 188 - Lebenslauf Curriculum vitae: Holger Bartz, geboren am 9.1.1972 in Witten, Sohn von Rudolf und Ingrid Bartz, geb. Kröpcke, evangelischen Bekenntnisses, 1991 Abitur, Albert-Martmöller-Gymnasium, Witten 1991-1992 Zivildienst , Gemeinschaftskrankenhaus Herdecke 1994 Ärztliche Vorprüfung, Ruhr-Universität Bochum 1995 1. Ärztliches Staatsexamen, Ruhr-Universität Bochum 1998 2. Ärztliches Staatsexamen, Ruhr-Universität Bochum Mai 1999 3. Ärztliches Staatsexamen, Ruhr-Universität Bochum Juni 1999- Arzt im Praktikum, Dezember 2000 Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - UniversitätskinderklinikSt. Josef-Hospital Bochum, bei Prof. Dr. med. C. Rieger Seit Februar 2001 Assistenzarzt, Zentrum für Med. Mikrobiologie und Hygiene, Inst. für Med. Mikrobiologie, Marburg, bei Prof. Dr. med. K. Heeg - 189 -
