In vitro-Modell der primären Immunantwort - Ruhr

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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef-Hospital Bochum - Universitätskinderklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger
In vitro-Modell der primären Immunantwort
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Holger Bartz
aus Witten
2001
Seite 2
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: PD Dr. med. U. Schauer
Korreferent:
Tag der mündlichen Prüfung:
-2 -
Widmung
Widmung:
Diese Arbeit ist meinen Eltern gewidmet.
„Gabba Gabba Hey“
Ramones
-3 -
Inhalt
Inhalt:
Seite
Widmung
3
Inhaltsverzeichnis
4
Verwendete Abkürzungen
6
1. Einleitung
1.1. Dendritische Zellen
9
1.2. T-Zellen
21
1.3. Andere an der primären Immunantwort beteiligte Zellen
23
1.4. Dendritische Zellen: Rolle in Klinik und Allergie
23
1.5. Problemstellung
26
1.6. Zielsetzung
32
2. Probanden, Material und Methoden
2.1. Probanden
33
2.2. Eingesetzte Materialien
34
2.3. Magnet assoziierte Zellsortierung (MACS)
38
2.4. Anzucht dendritischer Zellen
42
2.5. Gemischte Leukozyten Reaktion (MLR)
48
2.6. Messung der Effektorzellproliferation
53
2.7. Analytische Durchflußzytometrie
53
2.8. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
59
2.9. Enzym Linked Immunoassay (ELISA)
62
-4 -
Inhalt
Seite
3. Ergebnisse
3.1. Generierung dendritischer Zellen aus CD34 positiven hämatopoetischen
63
Nabelschnurblutstammzellen mittels GM-CSF, SF und TNF-α
3.2. Merkmale dendritischer Zellen
71
3.3. Nur dendritische Zellen induzieren IL-4 und IFN-γ in Nabelschnurzellen;
83
NK-Zellen sind die ersten zytokinproduzierenden Zellen
3.4. Zytokine und Zell-Zell-Kontakte bei der Induktion von Zytokinen in naiven
96
Zellen durch dendritische Zellen
3.5. Exogene Beeinflussung des Modells
111
4. Diskussion
4.
Diskussion
121
4.1. Modelletablierung
122
4.2. Kinetik der Zytokininduktion naiver Zellen
131
4.3. Interzelluläre Wechselwirkungen
139
4.4. Exogene Einflüsse auf dendritische Zellen und die konsekutive
151
Veränderung der IFN-γ/IL-4 Bildung
4.5. Perspektiven
158
Literatur
160
Abstract
187
Danksagung
188
Lebenslauf
189
-5 -
Abkürzungen
Verwendete Abkürzungen :
A.dest.
Destilliertes Wasser
Abb.
Abbildung
Ag
Antigen
Ak
Antikörper
APZ
Antigenpräsentierende Zelle
bp
Basenpaare
CBMC
Cord Blood Mononuclear Cells (Mononukleäre
Nabelschnurblutzellen)
CD
Cluster of differentation
CD40L
CD40 Ligand
CFU-DC
Colony-Forming-Unit-Dendritic-Cell
(Koloniebildende Einheit des dendritischen Zelltyps)
CTL
Cytotoxic T-Cells (Zytotoxische T-Zellen)
d
Tag
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DZ
Dendritische Zelle
EDTA
Ethylendiamintetraessig
ELISA
Enzym linked immunoassay
Fc
Konstantes Antikörperfragment
FcεR
Bindungsrezeptor für das konstante Fragment des IgE
FCS
Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
g
Gravitationskonstante
G-CSF
Granulocyt-Colony-Stimulating-Factor (Granulozyten -KolonieStimulierender-Faktor)
GM-CSF
Granulocyt-Makrophage-Colony-Stimulating-Factor
(Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierender Faktor)
h
Stunde(n)
HANKS
Hanks balanced salt solution, steril
HBSS
Hanks balanced salt solution
Hepes
2-(N-Hydroxyethylpiperazil)-2´Ethansulfonsäure
HLA
Humanes Leukozyten Antigen
-6 -
Abkürzungen
I.E.
Internationale Einheiten
ICOS
Inducible co-stimulator
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IgA
Immunglobulin Typ A
IgE
Immunglobulin Typ E
IgG
Immunglobulin Typ G
IgM
Immunglobulin Typ M
IL
Interleukin
LAL
Limulus Amebocyte Lysate
LPS
Lipopolysaccharid
LZ
Langerhanszelle
MACS
Magnet assoziierte Zellsortierung
M-CSF
Makrophage-Colony-Stimulating-Factor
(Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor)
MFI
Mittlere Fluoreszenz Intensität
MHC
Major Histocompatibility Complex
MicroBead
Paramagnetisch markierte Antikörper
MLR
Mixed Leukocyte Reaction (dt. gemischte Leukozyten Reaktion,
GLR)
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
nT
naive T-Zellen
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells (Mononukleäre Zellen des
peripheren Blutes)
PCR
Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion)
PE
Phyoerythrin
PerCP
Peridininchlorophyl
PMA
Phorbol-12-myrisat-13-acetat
Poly[(I:C)]
Poly Inosin-Cytosin
RNA
Ribonukleinsäure
RSV
Respiratorischer Syntial Virus (Respiratory Syntial Virus)
SF
Stammzellfaktor
Tab.
Tabelle
TZR
T-Zell-Rezeptor
-7 -
Abkürzungen
TGF-ß
Transforming-Growth-Factor-ß
Th-Zellen
T-Helfer-Zellen
TNF(-α)
Tumor-Nekrose-Faktor (alpha)
-8 -
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1. Dendritische Zellen
1.1.1. Historisches
1.1.1.1. Erstbeschreibung
Dendritische Zellen wurden erstmals 1868 von Langerhans (1847-1888) als in der Epidermis liegender Zelltyp beschrieben1 . Heute werden diese immer noch vielbeachteten Zellen
als Entwicklungsstufe oder Subpopulation der Familie der dendritischen Zellen aufgefaßt2
und ihrem Entdecker zu Ehren als Langerhanssche Zellen der Haut bezeichnet.
Diese Zellen waren 1961 Ziel der Arbeit von Birbeck, der in ihnen eine Struktur
entdeckte, die nach ihm Birbeck Granula benannt wurde3 und heute das spezifischste
Nachweiskriterium für Langerhanszellen ist4 .
Da die Langerhanszellen lange Zeit die einzige gut zugängliche Population dendritischer
Zellen waren, wurden Kennzeichen und Fähigkeiten dendritischer Zellen zuerst an ihnen
erkannt und beschrieben5 . Heute sind sie aufgrund ihrer Lage und den neuen
Erkenntnissen um ihre Aufgaben und Funktionen wieder ein wichtiger Gegenstand der
Forschung geworden.
1.1.1.2. Der Begriff „Dendritische Zelle“
Der Begriff „Dendritische Zelle“ im Sinne einer Klasse professionell antigenpräsentierender Zellen wurde erst 1973 von Steinman et al. geprägt: Er wählte diese Bezeichnung
aufgrund der charakteristischen Morphologie von ihm isolierter Zellen aus peripheren
Lymphorganen der Maus, die ihn
an bestimmte neuronale Zellen mit dem Namen
„dendritische Zelle“ erinnerte. Die Namengebung bezog sich ausschließlich auf das
Erscheinungsbild der Zellen, nicht auf andere Eigenschaften6 .
Denn es waren die funktionellen Eigenschaften der neuen Zellgruppe, die sich fundamental von denen anderer Zellarten unterschieden: Dendritische Zellen sind als einziger
Zelltyp in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren7 .
-9 -
1. Einleitung
1.1.1.3. Dendritische Zellen der Maus
Bei den anfänglich von Steinman untersuchten Zellen handelte es sich um Zellen der
Mauslymphorgane, insbesondere um Milzzellen6,7,8. Durch weitere Arbeiten gelang es,
den Ursprung dieser Zellgruppe in den für das Oberflächenantigen CD34 positiven
hämato-poetischen Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen9,10 zu entdecken und in
vitro aus ihnen dendritische Zellen zu generieren11,12,13 .
Viele Arbeitsgruppen haben sich daraufhin mit der näheren Beschreibung der
Morphologie6 , der biochemischen Eigenschaften14 , der Oberflächenstrukturen15 und vor
allem mit den
überragenden funktionellen Eigenschaften der dendritischen Zellen
beschäftigt16 , die ausschließlich bei ihnen zu finden sind und sie kennzeichnen: dendritische Zellen können als einziger Zelltyp in der autologen und allogenen MLR17 naive TZellen aktivieren. Eine MLR mit Memory-T-Zellen und dendritischen Zellen verläuft
wesentlich stärker als mit anderen antigenpräsentierenden Zellen.
Diese deutliche Überlegenheit gegenüber anderen Zellgruppen, die bis dahin als Stimulatorzellen in der MLR genutzt wurden,
z.B. B-Zellen oder Monozyten/Makrophagen,
zeigt, daß die dendritischen Zellen die eigentlichen professionellen antigenpräsentierenden
Zellen sind. Für die antigenpräsentierende Aktivität anderer Populationen (wie B-Zellen)
werden vereinzelt Kontaminationen mit dendritischen Zellen verantwortlich gemacht 18 .
1.1.1.4. Dendritische Zellen des Menschen
Beim Menschen wurde später neben den Langerhanszellen eine weitere, den murinen dendritischen Zellen vergleichbare, Zellgruppe entdeckt, die über ähnliche funktionelle Eigenschaften verfügte17 . Für Arbeiten an diesen menschlichen dendritischen Zellen wurden
sie zunächst mittels Direktisolation aus peripherem Blut gewonnen19 und von Monozyten
abgegrenzt 20 . Neben der kennzeichnenden Funktion wurden dabei auch bestimmte
charakteristische Oberflächenstrukturen dieser Zellen beschrieben21 und Funktionen mit
Oberflächenmolekülen verknüpft22 .
Durch die immer genauere Differenzierung der Oberflächenantigene und einiger unterschiedlicher funktioneller Eigenschaften, konnten Subtypen sowie verschiedene Entwicklungsstufen der dendritischen Zellen im humanen peripheren Blut gefunden und unterschieden werden23, 24, 25.
- 10 -
1. Einleitung
Der große und entscheidende Nachteil der Direktisolation war und blieb jedoch die
geringe Menge an dendritischen Zellen, die so gewonnen werden kann. Daraus ergab sich
die Notwendigkeit, eine Möglichkeit der ex vivo Anreicherung, wie bei Mauszellen, auch
für humane Zellen zu finden26, 27 .
1.1.2. In vivo-Ursprungs- und Reifungsmodell dendritischer Zellen
1.1.2.1. Ursprungszellen
Da inzwischen unterschiedliche Entwicklungspfade und verschiedenartige Typen dendritischer Zellen beschrieben wurden, ist die Einordnung, Klassifizierung und Nomenklatur der verschiedenen Populationen in einem einheitlichen Modell sehr schwierig geworden. Es muß sowohl die Existenz der verschiedenen dendritischen Zellen im Körper
berücksichtigen als auch vielfältige in vitro-Ergebnisse. Insgesamt sollte dieses Modell in
der Lage sein, die Abläufe während der Immunaktivierung zu erklären.
Die aktuelle Klassifikation orientiert sich zum einen an den sich entwickelnden
Populationen, zum anderen an den Ursprungszellen, aus denen die dendritischen Zellen
generiert werden.
Als Ausgangszellen zur in vitro Generierung dendritischer Zellen dienen heute entweder
durch bestimmte Oberflächenmarker gekennzeichnete hämatopoetische Stammzellen28
oder isolierte Monozyten29 .
Daneben existiert ein unter Kulturbedingungen erst seit neuestem gezielt simulierbarer
Entwicklungspfad zu sog. lymphoiden dendritischen Zellen30 , deren Existenz im Körper
durch Isolation gesichert wurde31 .
1.1.2.2. Verhalten dendritischer Zellen in vivo
1.1.2.2.1 Modellvorstellung der physiologischen Abläufe
Das heutzutage gültige Modell der in vivo Entwicklung dendritischer Zellen beschreibt
ihren
Ursprung
in
den
CD34
positiven
hämatopoetischen
Stammzellen
des
Knochenmarks, von dem aus sie sich durch das Blut in die entsprechenden nicht
lymphatischen Organe ausbreiten. Hier entwickeln sie sich zur Gruppe der organständigen
- 11 -
1. Einleitung
dendritischen Zellen, zu denen zum Beispiel die Langerhanszellen der Haut oder die
Monozyten des Blutes zählen. An diesem Punkt ihrer Entwicklung verfügen die Zellen
über ausgeprägte Fähigkeiten zur Antigenaufnahme und -verarbeitung. Während dieser
Prozessierung des Antigens bewegen sich die unreifen dendritischen Zellen dann zu
höhergelegenen Lymphstationen (z.B. Lymphknoten). Auf dem Weg dorthin unterliegen
sie dem Einfluß unspezifischer Entzündungsreize, z.B. in Form von Zytokinen (z.B. TNFα, GM-CSF) oder Bakterienprodukten (z.B. LPS), was zu einem radikalen Wandel ihrer
Fähigkeiten führt. Diese Entwicklung wird als „Reifungsprozeß“ bezeichnet und umfaßt
den Verlust der Phagozytoseaktivität bei gleichzeitigem Gewinn der Fähigkeit zur
Antigenpräsentation. Diese Entwicklung spiegelt sich auch an einer Veränderung der
Oberflächenmolekülkonstellation wider, die nun eine starke Aktivierung von Memoryund naiven T-Zellen ermöglicht.
Ein möglicher erneuter, der Aktivierung folgender, Verlust dieser Moleküle wird als
Zustand der „überreifen“ dendritischen Zellen bezeichnet. Das folgende Schicksal der
dendritischen Zellen liegt höchstwahrscheinlich in einem apoptoseähnlichen Prozeß mit
kontrolliertem, selbständigen Abbau der Zellen.
1.1.2.2.2 Das Beispiel Langerhanszellen
Das Verhalten der dendritischen Zellen im Menschen konnte am Beispiel der Langerhanszellen gut untersucht werden. Über diese ist bekannt, daß sie Knochenmarkstammzellen entspringen, über den Blutweg in die Haut transportiert werden32 und sich
dort zu Langerhanszellen entwickeln. Hier verharren sie, um im Bedarfsfall Antigen
aufzunehmen und daran anschließend als sogenannte „veiled cells“ von der Haut in die
afferenten Lymphstationen zu wandern. Die Bezeichnung „veiled cells“, also
„Schleierzellen“, bezieht sich auf ihre lichtmikroskopische
Darstellung, in der ihre
Zellmembran „verschleiert” wirkt. Die „Schleierzellen” transportieren das Antigen in die
Lymphstationen, um es hier den T-Zellen zu präsentierten. Zu diesem Zweck entwickeln
sich die Zellen dort zu sogenannten interdigitierenden dendritischen Zellen33 , welche
bestimmten in vitro kultivierten dendritischen Zellen gemäß ihrer Oberflächenstrukturen
und Fähigkeiten entsprechen34 .
Diese Vorstellungen werden unterstützt durch ex vivo-Daten, die zeigen, daß bei aus der
Haut isolierten Langerhanszellen in vitro unter der Gabe von GM-CSF (also eine
simulierte Entzündungsreaktion) eine verstärkte Exprimierung der Oberflächenmoleküle
- 12 -
1. Einleitung
MHC und CD1a erfolgt, genau wie dies bei dendritischen Zellen in Lymphknoten35, 36 der
Fall ist. Weiterhin kommt es zur Ausbildung der beschriebenen funktionellen
Eigenschaften im Sinne der Weiterentwicklung von Langerhanszellen zu reifen dendritischen Zellen, einhergehend mit der Abnahme der Phagozytosefähigkeit und gleichzeitiger Zunahme der Fähigkeit zur T-Zell-Aktivierung37, 38 . Dieser Prozeß konnte durch
vielfache, umfangreiche experimentelle Arbeiten bestätigt werden. Exemplarisch hierfür
ist der Mannose-Rezeptor, der eine wichtige Rolle bei der Phagozytose von Zuckern spielt
und nach Antigenaufnahme von der Zelloberfläche verschwindet39 (s Abb. 1).
Dendritischer
Zellvorläufer
Unreife
dendritische Zelle
Reife
dendritische Zelle
IL-10
Zytokine
z.B.
GM-CSF
IL-3, IL-4
Pathogene (z.B. LPS)
Zytokine (z.B. TNF-α,
GM-CSF)
T-Zellen (CD40L)
Eigenschaften :
Eigenschaften :
Endozytose (FcR)
Wenig Endozytose
(wenig FcR)
Starke Expression :
CCR1,CCR5,CCR6
MHC II intrazellulär
Starke Expression :
MHC II Oberfläche
CDs 54, 58, 80, 86, 40, 83
IL-12
Schwache Expression :
CCR7
CDs 54, 58, 80, 86, 40, 83
IL-12
Schwache Expression :
CCR1,CCR5,CCR6
Abb. 1: Reifung der dendritischen Zelle
- 13 -
1. Einleitung
1.1.3. Die dendritischen Zellen in vitro
1.1.3.1. Entwicklung dendritischer Zellen aus CD34 positiven Stammzellen
1.1.3.1.1. In vitro-Entwicklung dendritischer Vorläuferzellen aus CD34 positiven
Stammzellen
Dendritische Zellen bilden sich innerhalb von 14 Tagen aus CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen unter dem Einsatz der Zytokine GM-CSF und TNF-α. Sich zu
dendritischen Zellen, Makrophagen oder Granulozyten entwickelnde Stammzellen sind
durch die zusätzliche Expression des Oberflächenantigens CD86 gekennzeichnet40 .
Die dendritischen Zellen verfügen am Ende der Kulturperiode über unterschiedliche
Muster von Oberflächenantigenen. Es handelt sich also nicht um eine einheitliche
Population, sondern um ein heterogenes Gemisch , bestehend aus verschiedenen Arten
und verschiedenen Entwicklungsstadien41,42 . Diese Methode zur Generierung dendritischer Zellen wurde auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt, mit der Besonderheit, daß
als Quelle der Stammzellen Nabelschnurblut diente.
Über die intrazellulären Vorgänge, die zur Ausdifferenzierung von CD34 positiven Zellen
zu dendritischen Zellen führen, ist allerdings wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß die
Aktivierung der Protein Kinase C hierbei eine maßgebliche Rolle spielt, da gezeigt werden
konnte, daß Phorbol Ester (PMA), artifizieller Stimulus und bekannter Aktivator der
Protein Kinase C zur Ausreifung der Zellen führen kann. Zusätzlich konnten die durch
GM-CSF und TNF-α vorher initiierten Ausreifungsprozesse durch Blockade der Protein
Kinase C gestoppt werden44 .
Am Tag fünf der Kulturperiode entwickeln sich die Stammzellen zunächst zu Zellen, die
entweder CD14 positiv oder CD1a positiv sind26 . Hierbei handelt es sich um
richtungsweisende Vorläuferstadien für die weitere Entwicklung der Zellen.
- 14 -
1. Einleitung
1.1.3.1.2. In vitro-Entwicklung dendritischer Zellen aus dendritischen Vorläuferzellen
Da am Tag fünf der Kulturperiode die Zellen teilweise nur CD14 positiv sind, können sie
aus dem heterogenen Zellgemisch isoliert werden und entwickeln sich dann unter dem
fortbestehenden Einfluß von GM-CSF und TNF-α zu dendritischen Zellen. Durch den
Einsatz des Differenzierungsfaktors M-CSF hingegen werden sie zu Makrophagen26 .
Mittels TGF-β werden auch aus diesen CD14 positiven Zellen Langerhanszellen45 .
Ein wichtiger Unterschied besteht in den unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften
der sich entwickelnden
Zellpopulationen: dendritische Zellen sind in der Lage zur
Aktivierung naiver T-Zellen, aber nur beschränkt zur Phagozytose. Die Monozyten /
Makrophagen verhalten sich genau entgegengesetzt: mit starker Phagozytosefähigkeit und
wenig ausgeprägter Stimulationskapazität (s.Abb. 2).
Tab. 1: Kennzeichen der dendritischen Zell-Subtypen
Merkmal
Unreif
Reif
Langerhanszellen
Lymphoide
CD1a
+
++
+
CD14
-
-
+/-
MHC II
+
++
+
+
MHCI
+
++
+
+
B7 (CD80, CD86)
+
++
+
ICAM (CD54)
+
++
+
CD83
-
+
-
Makropinozytose
+
-
-
CD23
+
-
CD123
-
-
-
+
CD11c
+
++
+
-
CD45RA
-
-
-
+
CD45RO
+
+
+
-
CD4
+
+
+
++
Lag Antigen
-
-
+
-
Langerin
-
-
+
-
Birbeck Granula
-
-
+
-
Mannose Rezeptor
+
-
+
Weitere Merkmale
- 15 -
+
E-Cadherin +
CD44+
Faktor XIIIa +
FasLigand
Nicht-spezifische
CD8α+
Elastase
CD25+
1. Einleitung
1.1.3.1.3. In vitro-Entwicklung von Langerhanszellen aus dendritischen Vorläuferzellen
Isoliert man am fünften Tag der Kultur die nur CD1a positiven Zellen, entwickeln sich
diese unter Fortbestehen der Wachstumsbedingungen mit GM-CSF und TNF-α zu
Langerhanszellen. Dieses Verfahren wurde in weiterführenden Arbeiten ebenfalls von
Caux etabliert46 .
Spezifischer Nachweis für Langerhanszellen sind die Birbeck Granula 3 , die durch spezielle Antikörper oder elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden können47,43 .
Dadurch ist eine sichere Unterscheidung dieser Population von anderen dendritischen
Zellen möglich.
Die Langerhanszellen werden als erste immunregulatorische Zellen der Haut betrachtet,
die eine maßgebliche Aufgabe in der Antigenpräsentation zu T-Zellen und somit eine
Rolle auch in der Kontaktsensibilisierung haben. Dieser Umstand macht die dendritischen
Zellen in ihrer Form als Langerhanszellen zu einem wichtigen Gegenstand auch der
dermatologischen Forschung.
CD1a
CD1a
GM-CSF +
TNF-α
CD34
LZ
GM-CSF +
TNF-α
CD1a
Stammzelle
GM-CSF +
TNF-α
DZ
CD14
CD14
Granulozyt
M-CSF
Makrophage
Abb. 2: Entwicklung von DZ, LZ und Makrophagen aus CD34 positiven Stammzellen
- 16 -
1. Einleitung
1.1.3.2. In-vitro-Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten
Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung dendritischer Zellen ist die Kultivierung CD14
positiver Monozyten des peripheren Blutes über einen Zeitraum von sieben Tagen mit den
Zytokinen GM-CSF und IL-4.
Ohne Zellteilung entwickeln sich die Monozyten zunächst zu unreifen dendritischen
Zellen, die durch spezifische Oberflächenmolekülkonstellationen (s. Tab 1.) und Fähigkeiten (z.B. Stärke der Effektorzellaktivierung) gekennzeichnet sind.
Unter dem Einfluß von Entzündungsmediatoren wie TNF-α, IL-1, bakteriellen Produkten
wie LPS oder durch synthetische Stoffe wie Poly[(I:C)] entwickeln sich aus den unreifen,
reife dendritische Zellen. Diese Entwicklung geht einher mit Veränderungen der
Oberflächenantigenexpression und den Fähigkeiten der Zellen 48 (s. Abb. 3).
CD14
GM-CSF +
IL-4
TNF-α oder
IL-1 oder
LPS oder
Poly[(I:C)]
Monozyt
Unreife
DZ
M-CSF
CD14
Abb. 3: Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten
- 17 -
Reife
DZ
1. Einleitung
1.1.3.3. Lymphoide dendritische Zellen
Die bisher genannten dendritischen Zellen werden unter die Gruppe der myeloiden dendritischen Zellen zusammengefaßt. Daneben existiert ein weiterer Typus, die sogenannten
lymphoiden dendritischen Zellen. Diese entstehen aus lymphatischen Vorläuferzellen, die
interessanterweise in der Lage sind, sich sowohl zu Lymphozyten als auch zu dendritischen Zellen zu entwickeln49 . Derartige Zellinien ließen sich im murinen Thymus und
im menschlichen Thymus 50, 51 (aus dem Knochenmark entstammend)50 nachweisen.
Zwar stammen alle Blutzellen von CD34 positiven Stammzellen ab, doch im Gegensatz zu
myeloiden Vorläuferzellen sind die ersten lymphatischen durch die hohe Expression des
Antigens CD7 und die niedrige des CD4 gekennzeichnet. Diese Zellen besitzen
Entwicklungsmöglichkeiten zu B-Zellen, NK-Zellen oder über eine weitere Vorläuferzelle
(CD44, CD25 und c-kit-Ligand positiv) zu dendritischen Zellen oder unter dem Einfluß
von IL-7 zu T-Zellen52 . Diesen lymphoiden dendritischen Zellen kommt wahrscheinlich
die extrem wichtige Aufgabe der Selektion von autoagressiven T-Zellen zu (s. Abb. 4).
B-Zelle
CD7
Lymphatische
Vorläuferzelle
Dendritische
Zelle
CD44,CD25,
c-Kit-Ligand
IL-7
T-Zelle
Natürliche
Killerzelle
Abb. 4: Entwicklung der lymphoiden dendritischen Zelle
- 18 -
1. Einleitung
In diesem Zusammenhang werden im Mausthymus zwei Subtypen der lymphoiden dendritischen Zellen durch die Expression des Oberflächenmoleküls CD8 unterschieden: CD8
positive lymphoide dendritische Zellen haben einen supressiven Effekt auf T-Zellen, CD8
negative nicht. Die Supression erfolgt durch den FasLiganden und der damit verbundenen
Einleitung programmierter Zellabsterbevorgänge in den T-Zellen95 . Diese Eigenschaft
befähigt lymphoide dendritische Zellen zur Selektion verschiedener T-Zell-Populationen.
1.1.3.4. Zuordnung der Zellinien
Untersuchungen an dendritischen Zellen gestalten sich ausgesprochen schwierig, da sie
nur spärlich in Geweben zu finden und schwierig zu isolieren sind. Nach Isolation
wechseln die Angehörigen der dendritischen Zellfamilie ständig sowohl Morphologie als
auch Oberflächenmarker und sind daher schwierig zu klassifizieren, zumal der definitive
Nachweis des Zelltyps ausschließlich durch die aufwendige Untersuchung der
funktionellen Eigenschaften erfolgen kann.
Selbst die Frage der Zuordnung zu einer Zellinie ist ungewiß. So bleibt unklar, ob
dendritische Zellen Teil des Makrophagensystems sind, oder ob sie eine eigene,
unabhängige Zellinie darstellen, da eine spezielle CFU-DC in vitro gefunden wurde und
nachweislich auch im Knochenmark existiert. Auch die Möglichkeit der Umwandlung auf
jeder Ebene der Zellentwicklung wird diskutiert53 .
Für die Zugehörigkeit zum Monozytensystem spricht, daß die Ausdifferenzierung von
dendritischen Zellen aus humanen Monozyten und aus myeloiden Vorläuferzellen seit
Jahren gezeigt und etabliert ist.
1.1.4. Stellung dendritischer Zellen im Immunsystem
Dendritische Zellen sind unumstritten die zentrale Schaltstelle des Immunsystems und
insbesondere verantwortlich für die Induktion der primären Immunantwort. Um die Initiationsmechanismen des Immunsystems weiter verstehen zu können, müssen zukünftige
Untersuchungen den dendritischen Zellen einen entsprechenden Stellenwert einräumen.
- 19 -
1. Einleitung
Antikörper
B-Zelle
Antigen
Zytokine
(z.B. IL-4, IFN-γ)
T-HelferZellen
Zytotoxische TZelle
Zytotoxizität
TZR
IL-12 (NK-ZellAktivierender-Faktor)
Entzündungsmediatoren
(TNF-α, ..)
Zytotoxizität
NK-Zellen
Infiziertes Gewebe
Abb. 5: Schematische Darstellung der Schaltstellenfunktion der DZ
Die zentrale, vernetzende Rolle der dendritischen Zellen wird durch ihre Wirkungen auf
die unterschiedlichsten Teile des Immunsystems deutlich. Sie dienen als Bindeglied
zwischen unspezifischer und spezifischer Abwehr, indem sie in den peripheren Organen
Antigene unspezifisch aufnehmen und diese nachfolgend den spezifischen Anteilen des
Immunsystems präsentieren und dadurch aktivieren.
Dabei werden sowohl der humorale Flügel des spezifischen Immunsystems u.a. in Form
von B- bzw. Plasmazellen als auch der zelluläre Flügel, z.B. CTL und Th-Zellen,
angeregt 61 . Sie bilden so ein vernetzendes und kontrollierendes Element hinsichtlich
spezifischer (Antikörper und T-Zell-Rezeptor) und unspezifischer Abwehrmechanismen
(Antigenaufnahme und -präsentation, Freisetzung von Zytokinen, Aktivierung von NKZellen) sowie humoraler (Zytokine, Antikörper) und zellulärer Immunität (Zytotoxische
(CD8+) T-Zellen, NK-Zellen) (s. Abb. 5).
Supplementär wurde in letzter Zeit gezeigt, daß verschiedene Untergruppen der reifen
dendritischen Zellen auch zur Inaktivierung von Immunprozessen beitragen können. Es ist
- 20 -
1. Einleitung
Aufgabe der bereits erwähnten lymphoiden dendritischen Zellen96 , die sich gemeinsam
mit T-Zellen und NK-Zellen im Thymus ausbilden und auch Thymus-Dendriten55 genannt
werden, auto-agressive T-Zellen zu selektieren und so die Selbst-Toleranz56,54 zu
entwickeln. Lymph-oide dendritische Zellen wirken im Gegensatz z.B. zu MilzDendriten57 also supremierend.
1.2. T-Zellen
1.2.1. T-Zell-Klassifikation
T-Zellen tragen definitionsgemäß den T-Zell-Rezeptor und das damit komplexierte Molekül CD3. Daneben existieren auf T-Zellen verschiedene andere Oberflächenmoleküle, die
zur Einteilung in Untergruppen genutzt werden. So kennzeichnet CD4 T-Helfer-Zellen,
CD8 zytotoxische T-Zellen. Weiterhin existieren noch sog. Regulator-T-Zellen (auch als
Th3-Zellen bezeichnet), die durch Produktion des Zytokins TGF- ß gekennzeichnet
sind 216 .
T-Helfer-Zellen werden anhand ihrer Oberflächenmoleküle und der von ihnen produzierten Zytokine in weitere Untergruppen eingeteilt. Diese Einteilung ist in Tab. 2
dargestellt.
Tab. 2: Übersicht über die T-Zell-Subpopulationen nach Zytokinen
Bezeichnung
Vorherrschendes Zytokin
T-Helfer 0 (Th0)
Kein bevorzugtes Zytokin
T-Helfer 1 (Th1)
Interferon-gamma (IFN-γ), Interleukin-2 (IL-2)
T-Helfer 2 (Th2)
Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5),
Interleukin-13 (IL-13)
T-Helfer 3 (Th3)
Transforming-Growth-Factor-ß (TGF-ß)
T-Helfer-Zellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten, tragen das Oberflächenmolekül
CD45 in der Ausprägung CD45RA und werden als naive T-Zellen bezeichnet. Nach Antigenkontakt entwickeln sie die Ausprägung CD45RO und sind dann Effektor-T-Zellen, die
- 21 -
1. Einleitung
sich teilweise zu Memory-Zellen weiterentwickeln. Neuere Arbeiten sehen ein Erkennungszeichen für Memory-Zellen in der Ausprägung bestimmter Chemokinrezeptoren59 .
Funktionelle Unterschiede zwischen naiven und Memory-Zellen bestehen darin, daß die
Art der Zytokinproduktion in naiven Zellen noch nicht festgelegt ist, und sie schwieriger
zu aktivieren sind. Memory-Zellen dagegen sind leicht zu aktivieren, und ihre Polarisation
(Th1/Th2) ist schon vorgegeben.
Naive T-Zellen werden als Th0-Zellen bezeichnet und entwickeln sich entweder zu Th1Zellen, die atopieprotektive Zytokine wie IFNγ produzieren oder zu Th2-Zellen, gekennzeichnet durch atopiefördernde Zytokine wie IL-4, IL-5 oder IL-13. Kommt es nach Aktivierung der T-Zellen zu einem Überwiegen des Th2-Zytokinmusters im Körper, führt dies
durch die Wirkung von IL-5 zur Aktivierung von eosinophilen Granulozyten und durch
IL-4 und IL-13 zur Produktion und Freisetzung von IgE aus B-Zellen. Zusätzlich
polarisiert IL-4 weiter naive T-Helfer-Zellen in Richtung Th-2-Zytokinmuster60 .
Welche Bedingungen aus naiven Zellen Th1- oder Th2-Zellen werden lassen, ist momentan eine wichtige Frage und Hintergrund dieser Arbeit.
Da naive Zellen nur durch
dendritische Zellen aktiviert werden können, muß die Aufklärung der Wechselwirkungen
von dendritischen und naiven Zellen das nächste Ziel der Allergieforschung sein und
wurde in dieser Arbeit untersucht.
1.2.2. Einfluß antigenpräsentierender Zellen
T-Zellen werden durch Signale von antigenpräsentierenden Zellen aktiviert.
Memory-T-Zellen können schon durch schwache Signale von nicht-professionellen
antigenpräsentierenden Zellen, wie B-Zellen oder Makrophagen, aktiviert werden.
Naive T-Zellen dagegen können nur durch dendritische Zellen aktiviert werden, die über
ein entsprechendes Arsenal von Molekülen verfügen. Daher sind dendritische Zellen die
verantwortlichen Zellen für die Polarisierung naiver T-Zellen. Die Untersuchung der an
den Wechselwirkungen beteiligten Moleküle, z.B. Oberflächenantigene (CD40, CD80,
CD86) und Zytokine (IL-12, IL-4), und deren Einfluß auf die Polarisierung der T-Zellen
wird zukünftig die Frage der Th-2-Bildung beantworten und war Teil dieser Arbeit.
- 22 -
1. Einleitung
1.3. Andere an der primären Immunantwort beteiligte
Zellen
Bei der primären Initiation des Immunsystems spielen in vivo natürlich noch weitere Zellgruppen wichtige Rollen, die aber als naive Zellen alle von dendritischen Zellen aktiviert
werden können. Art der Reaktion und die zeitlichen Abläufe der Aktivierung
verschiedener naiver Zelltypen sind im humanen System noch unklar. Welche Zellen zu
welchem Zeitpunkt welche Zytokine sezernieren und damit die Polarisation der gesamten
Immunantwort beeinflussen, soll daher in dieser Arbeit aufgeklärt werden.
1.4. Dendritische Zellen: Rolle in Klinik und Allergie
1.4.1. Prävalenz
Daß die Prävalenz von Allergien in der westlichen Welt seit Jahren steigt, konnte vielfach
belegt werden62 . Trotz umfangreicher epidemiologischer Arbeiten konnten Ursache und
Auslöser dieser Entwicklung jedoch nicht gefunden werden, wohl aber beeinflussende
Faktoren. Allergieprotektiv zeigte sich in diesen Studien z.B. der Kontakt mit Lipopolysaccharid, einem Hüllenbestandteil gram-negativer Erreger213 , der in vitro IFN-γ induziert.
Zeitgleich mit den epidemiologischen Studien wurden in der experimentellen
Immunologie entscheidende Fortschritte in der Entwicklung eines pathophysiologischen
Modells der Allergieentstehung gemacht63 .
1.4.2. Pathomechanismus der Allergie
1.4.2.1. Effektorendstrecken: Eosinophile Granulozyten und Histamin
Die verschiedenen klinischen Manifestationsformen der Allergie sind bedingt durch
eosinophile Granulozyten, Histamin und verschiedene andere Mediatorenstoffe64 . Die löslichen Substanzen entstammen der Granula von Mastzellen und basophilen Granulozyten
und werden nach Bindung von Immunglobulinen der Klasse E (IgE) an die zellständigen
Fcε-Rezeptoren ausgeschüttet. Die physiologische Aufgabe des IgE ist die Abwehr von
parasitären Erregern und Würmern65 .
- 23 -
1. Einleitung
1.4.2.2. IgE und eosinophile Granulozyten
IgE wird von B-Zellen unter dem Einfluß von IL-4 gebildet, welches von einer speziellen
Gruppe der Th-Zellen produziert wird. Diese T-Zellen bilden auch IL-5, das zum Einstrom und zur Aktivierung eosinophiler Granulozyten führt66 . Zur Einleitung dieser
Abläufe sind demnach T-Zell-produzierte Zytokine verantwortlich.
Eosinophile Granulozyten binden über Komplement C3b und enthalten zytotoxische Substanzen (eosinophiles kationisches Protein = ECP, major basic protein = MBP) gegen die
Allergene 67 .
1.4.2.3. Die Rolle dendritischer Zellen bei der Atopieentwicklung
Die Polarisierung und Zytokinbildung der T-Zellen bildet sich nach Kontakt mit
dendritischen Zellen aus. Die hier stattfindenden Wechselwirkungen sind demnach der
erste Schritt der Atopieentstehung. Die Rolle der dendritischen Zellen in verschiedenen
Erkrankungen ist daher Ziel einiger Studien gewesen.
Die allergische Kontaktdermatitis gilt als Prototyp der zellvermittelten Hypersensitivitätsreaktion, in dem dendritische Zellen eine entscheidende Rolle im Sensibilisierungsprozeß
spielen. Ihre Anzahl steigt in der Region des Antigeneintritts, angelockt durch Chemokine
und Zytokine. Diese dendritischen Zellen initiieren dann den weiteren Allergieprozeß58,68.
Da dendritische Zellen den Fcε-Rezeptor exprimieren können, wird ihnen auch eine
wichtige Funktion bei anderen Erkrankungen des atopischen Formenkreises58 , wie dem
exogenen Asthma oder der Rhinokonjunktivitis69 zugeschrieben.
Neben der Initiation von allergiefördernden Abläufen kann der Ausbruch einer Erkrankung auch mit der Abnahme protektiver Faktoren zusammenhängen.
Viele endogene inhibitorische Mechanismen des Asthmas sind eng mit den Funktionen
von dendritischen Zellen verknüpft. Das von ihnen produzierte Zytokinspektrum, z.B. IL12 oder TGF-ß, umfaßt auch Hemmstoffe der Asthmaentstehung. Veränderungen dieses
Spektrums könnten der Schlüssel zur Entstehung und Etablierung des Asthmas70 sein.
Die Rolle der dendritischen Zellen während der Allergieentstehung sind in Abb. 6
zusammengefaßt.
- 24 -
1. Einleitung
Allergen
Dendritische
Zelle
Mastzelle
MHC B7
TCR
CD28
IL-4
IL-12
IL-18
Th0
IL-2
IFN-γ
Th1
Th2
IL-5
IL-4
IL-13
IgE
IL-2
IFN-γ
B-Zelle
Eosinophiler Granulozyt
Abb. 6: Schematische Darstellung der pathophysiologischen Abläufe der Allergie
- 25 -
1. Einleitung
1.5. Problemstellung
Die Entstehung von Th2-Mustern (im Sinne von IL-4 produzierenden Zellen) ist auf die
Wechselwirkungen zwischen antigenpräsentierenden und naiven Zellen eingegrenzt
worden. Die zeitlichen Abläufe, welcher Art diese Wechselwirkungen sind und wie die
Polarisierung durch exogene, aber physiologische Substanzen beeinflußt werden kann,
muß Ziel zukünftiger Forschung sein.
1.5.1. Anforderungen
Zum Erreichen dieser Ziele ist es nötig, ein Modell zu entwickeln, in dem die prägenden
Einflüsse dendritischer Zellen auf naive Zellen untersucht werden können. Der erste
Schritt war die dazu notwendige Generierung dendritischer Zellen. Zu diesem Zweck
wurden Stammzellen aus dem Nabelschnurblut isoliert und unter definierten Bedingungen
kultiviert. Anschließend mußte gezeigt werden, daß es sich bei den angezüchteten Zellen
um dendritische Zellen handelt.
1.5.2. Stammzellisolation
In der Hierarchie hämatopoetischer Stammzellen ist die erste Zelle pluripotent und in der
Lage zur extensiven Selbsterneuerung71 . In späteren Entwicklungsschritten gehen diese
Fähigkeiten zurück und die Zelle ist weiter differenziert. Daher wurde in dieser Arbeit die
frühe, pluripotente, durch das Oberflächenantigen CD34 gekennzeichnete Stammzelle als
Zielzelle der Isolation gewählt.
Der Prozeß der Stammzellisolation ist ausgesprochen kompliziert und bedeutend. Die
Zellen müssen in einer ausreichenden Reinheit von > 95 % eingesetzt werden, da die
Kulturen ansonsten nach einigen Tagen untergehen. Die Ursache für dieses Phänomen ist
bislang ungeklärt. Daneben darf auch die eingesetzte Konzentration der Zellen nicht zu
klein sein, da die Zellen zu Beginn der Kulturphase zu Wachstum und Entwicklung eine
gewisse Dichte benötigen.
- 26 -
1. Einleitung
1.5.2.1. Stammzelloberflächenantigene und -quellen
Es gibt verschiedene Materialien, aus denen sich Stammzellen isolieren und dendritische
Zellen generieren lassen: Knochenmark73,74, Nabelschnurblut 72 und peripheres Blut 73,76 .
Da der Anteil an Stammzellen in peripherem Blut sehr gering ist, sind für Isolationen
große Blutmengen nötig. Zwar kann der Anteil von Stammzellen durch die Gabe von GCSF erhöht werden, trotzdem bleibt die Isolation sehr aufwendig75 .
Der Stammzellanteil in Knochenmark und Nabelschnurblut ist mit ca. 1,3 % in etwa
gleich groß. Da der Zugang zu Nabelschnurblut technisch wesentlich einfacher, ungefährlicher und unbelastender für den Probanden ist (Punktion der Vena umbilicalis vs.
Knochenmarkspunktion), ist die Anzahl der erreichbaren Spender beim Einsatz von
Nabelschnurblut wesentlich größer.
Zielmolekül der Isolation ist klassischerweise CD34, ein Marker für hämatopoetische
Stammzellen. Daneben wurde in jüngster Zeit die Isolation unter Verwendung des
Moleküls CD133 etabliert. Hierbei handelt es sich um eine alternative Selektionsmöglichkeit, von der vermutet wird, daß sie der CD34 Sortierung überlegen sei, weil sich CD133
nur auf stark CD34 exprimierenden Zellen findet, und diese Zellen eventuell früher in der
Entwicklungsreihe der hämatopoetischen Zellen stehen77 .
CD 34 ist ein Oberflächenglykophosphoprotein, das auf einem frühen Entwicklungsschritt der lymphohämatopoetischen Zellreihe ausgebildet wird. Es findet sich ferner auf
be-stimmten Endothelzellen und embryonalen Fibroblasten78 .
Da bekannt ist, daß CD34 positive Zellen alleine in der Lage sind, die Hämatogenese
nach einer Auslöschung des Knochenmarks wieder zu reaktivieren, ist das Interesse an
diesen
Zellen
für
eine
klinische
Nutzung
im
Rahmen
von
autologen
Stammzellretransplantationen oder für Gentherapiestudien groß und wächst mit Zunahme
des Einsatzes dieser therapeutischen Verfahren weiter78 .
Trotz dieser Nutzungsmöglichkeiten ist wenig über die eigentliche Funktion des CD34
bekannt. Neuere Ergebnisse an Endothelzellen weisen ihm die Aufgabe eines “homing”Rezeptors, also eines Adhaesionsmoleküls für Leukozyten bei Entzündungsprozessen,
zu79 . Dies könnte auch die Aufgabe des CD34 auf den Stammzellen in der
Knochenmarkumgebung sein.
- 27 -
1. Einleitung
In jüngster Zeit wurde in der Literatur darauf aufmerksam gemacht, daß verschiedene
Oberflächenantigene, die mit CD34 gleichzeitig auf den Zellen exprimiert werden, auf die
spätere Differenzierungsrichtung der Zellen hinweisen (s. Tab. 3).
Tab. 3: Differenzierungsweg assoziierte Marker40, 80, 81
Differenzierungsweg assoziierte Oberflächenantigene
Myeloid
Erythroid
B-Zellen
Thymus / T-Zellen
Dendritische Zellen
CD33
CD71
CD10
CD38
CD86
CD34
CD34
CD34
CD5
CD34
CD7
CD34
1.5.2.2. Isolationsmethoden
Zur Stammzellisolation in benötigter Reinheit und Ausbeute, bei gleichzeitig günstiger
Kostenlage und Lebensfähigkeit der Zellen, hat sich die magnetassoziierte Zellselektion
(MACS) durchgesetzt.
1.5.3. Kulturbedingungen
Die Anzucht der Zellen folgte dem Protokoll von Caux et al.. Die Zellen wurden hierbei
unter dem Einsatz von GM-CSF und TNF-α 14 Tage in Kultur gehalten und anschließend
geerntet. Dieses ursprüngliche Protokoll wurde durch den Einsatz des Stamzellfaktors erweitert82 .
1.5.4. Nachweis dendritischer Zellen
1.5.4.1. Nachweiskriterien
Dendritische Zellen sind durch unterschiedliche Charakteristika gekennzeichnet. Hierzu
zählt ihr Phänotyp mit der eindrucksvollen Morphologie und den typischen Oberflächenmolekülkonstellationen.
- 28 -
1. Einleitung
Das Kennzeichen der dendritischen Zellen sind aber ihre Fähigkeiten, u.a. ihre
Stimulationskapazität in der MLR. Sie sind die stärksten Stimulatorzellen von Memory-TZellen und die einzige Zellpopulation, die naive T-Zellen aktivieren kann. Diese Eigenschaften machen dendritische Zellen zu einem entscheidenen Bestandteil dieser Arbeit.
1.5.4.2. Nachweis des Phänotyps
Der Phänotyp dendritischer Zellen umfaßt klassischerweise ihre lichtmikroskopische
Darstellung und ihre in bestimmten Konstellationen auftretenden Oberflächenmoleküle.
1.5.4.2.1. Morphologie
Schon Steinman wählte bei der Erstbeschreibung der dendritischen Zellen ihre
lichtmikroskopische Morphologie als Erkennungsmerkmal. Der Zellkern wird von ihm
als groß, lichtbrechend, in einer verdrehten Form vorliegend und gewöhnlich zwei kleine
Nukleoli enthaltend, beschrieben. Das umgebende Zytoplasma ist in unterschiedlich
weiten und langen Ausläufern plaziert und es enthält viele Mitochondrien6 .
Die Morphologie wird bis heute immer noch als ein maßgebliches Kriterium angesehen,
auch wenn sich die verschieden gewonnenen dendritischen Zellen morphologisch
unterscheiden83 . Frisch isolierte dendritische Zellen zeigen ein rundliches Erscheinungsbild, gezüchtete dagegen die klassischen Ausläufer84 .
Bereits anhand dieser Merkmale lassen sich Monozyten / Makrophagen von dendritischen
Zellen differenzieren19 . Die lichtmikroskopische Betrachtung ist als ein Hauptkriterium
bei der Beurteilung der Entwicklung von dendritischen Zellen zu beachten85 .
1.5.4.2.2. Oberflächenantigene
Es gibt für humane dendritische Zellen kein spezifisches Oberflächenmolekül. Statt
dessen treten je nach Art ihrer Generierung und ihres Entwicklungsstandes wechselnd
verschiedene Kombinationen von Oberflächenmolekülen auf.
Im Einklang mit der gängigen Literaturmeinung sind zur Identifikation von dendritischen
Zellen die Oberflächenantigene CD1a, CD14, CD80, CD83 und CD86 nachzuweisen.
Dies gilt insbesondere für stammzellgenerierte dendritische Zellen86 .
- 29 -
1. Einleitung
Das Vorliegen des Moleküls CD1a ist allgemein als Marker für dendritische Zellen
anerkannt. Bei der CD1-Proteinfamilie handelt es sich um dem MHC verwandte Moleküle, die außerhalb der MHC-Genregion lokalisiert codiert werden. Die CD1 Proteine
sind nicht polymorph, umfassen aber verschiedene Isotypen (CD1a,b,c,d und e). Diese
Isotypen sind auf unterschiedliche Zellarten bei verschiedenen Lebewesen lokalisiert und
nehmen im Rahmen der Antigenpräsentation unterschiedliche Aufgaben wahr 87, 88 .
1.5.5. Überprüfung der Funktionalität
Der entscheidende Nachweis für das Vorliegen dendritischer Zellen wird durch die Prüfung ihrer funktionellen Eigenschaften in der MLR geführt. Die angezüchteten Zellen
werden gemeinsam mit Effektorzellen kultiviert und deren Aktivierung durch Messung
ihrer Proliferationsrate bestimmt. Effektorzellen können bei diesem Nachweis entweder
Memory-T-Zellen oder naive T-Zellen sein.
1.5.5.1. Anforderungen an die T-Zellen
Für die beschriebenen Experimente ist eine Reinheit der Effektorzellen von mehr als 99
% nötig, sonst besteht die Gefahr, daß sich in der kontaminierenden Restpopulation wiederum
antigenpräsentierende
Zellen
befinden,
die
dann
eventuell
zu
einer
Autostimulation führen könnten. Da die absolute Menge der kontaminierenden
Zellgruppe sehr viel größer wäre als die der eingesetzten dendritischen Zellen, wäre dann
der stimulierende Effekt nicht mehr eindeutig zuzuordnen gewesen.
Ein grundlegender Aspekt für diese Arbeit war die Naivität der als naiv bezeichneten
Zellen. Naiv sind T-Zellen, die noch keinen Antigenkontakt hatten. Sie sind durch das
Oberflächenantigen CD45RA gekennzeichnet. Nach Antigenkontakt verliert sich
CD45RA und statt dessen wird das Molekül CD45RO exprimiert89 .
Demnach müßten alle sich im peripheren Blut befindlichen Zellen mit dem Antigen
CD45RA naive T-Zellen sein (ca. 5 %). Dies wird jedoch von Autoren bestritten90 , die
den Verlust des CD45RO als temporäres Phänomen interpretieren, das bei Zellen nach
langer Zeit ohne spezifischen Antigenkontakt auftritt. Diese Zellen wären also trotz ihrer
naiven Oberflächenmarker im Sinne der Definition nicht naiv, da sie bereits
Antigenkontakt hatten.
- 30 -
1. Einleitung
Unstrittig naiv sind dagegen die T-Zellen des Nabelschnurblutes, die zu 95 % den Oberflächenmarker CD45RA tragen. Diese Zellen waren auf Grund ihrer Herkunft sicher noch
keinem Antigen ausgesetzt und wurden daher für die vorliegenden Experimente
verwendet91 .
1.5.5.2. Das Clusterphänomen
Bei gemeinsamer Kultivierung von Effektorzellen mit dendritischen Zellen zeigt sich ein
lichtmikroskopisch deutlich imponierendes Anlagerungsphänomen. Es bilden sich
wolkenartige Komplexe, im englischsprachigen Raum als „Cluster“ bezeichnet, in denen
sich die Effektorzellen an die Ausläufer dendritischer Zellen schmiegen92 .
Diese Anlagerung ist ein Hauptkriterium für den Nachweis für dendritische Zellen, da
diese "immunologischen Synapsen" morphologisches Substrat der stattfindenden
Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und Effektorzellen sind93 .
Andere als antigenpräsentierend eingesetzte Zellen zeigen kein derartiges Phänomen.
1.5.5.3. Stimulation von Memory-T-Zellen
Gängiges Kriterium zum Nachweis dendritischer Zellen ist der Vergleich der induzierten
Proliferationsraten von Memory-T-Zellen zwischen den als dendritisch bezeichneten
Zellen und anderen antigenpräsentierenden Zellen, wie z.B. Monozyten. Dendritische
Zellen zeichnen sich durch eine deutliche Überlegenheit, mit einer vielfach höheren induzierten Proliferationsrate, aus.
1.5.5.4. Stimulation naiver T-Zellen
Im Gegensatz zu allen anderen Zellarten sind dendritische Zellen in der Lage, eine primäre
Immunantwort auszulösen, d.h. naive T-Zellen zu aktivieren. Da diese Eigenschaft spezifisch ist, gilt dieses Kriterium als definierend für dendritische Zellen und muß erfüllt sein.
- 31 -
1. Einleitung
1.6. Zielsetzung
Für diese Arbeit ergab sich daher folgende Zielsetzung:
Entwicklung eines in vitro-Modells der Initiation der primären Immunantwort
Hierzu sollten folgende Teilaspekte verwirklicht werden:
I. Grundlagen des in vitro-Modells:
Generierung dendritischer Zellen aus hämatopoetischen Nabelschnurblutstammzellen, mit
Optimierung von Stammzellisolation und Kulturbedingungen sowie der Klassifizierung
der angezüchteten Zellen als dendritische Zellen. Meßparameter des Systems sollte der
Nachweis von induzierten Zytokinen in Memory- und naiven T-Zellen sein.
II. Stimulation der primären Immunabläufe durch den Einsatz verschiedener Zellarten
Qualität und zeitliche Abläufe der induzierten Zytokine der an der primären Immunentstehung beteiligten Zellen sollen untersucht werden.
III. Einfluß der interzellulären Wechselwirkungen auf die Zytokinmuster naiver T-Zellen
In dem dann etablierten Modell soll der Einfluß verschiedener Moleküle (CD40 Ligand,
B7-Komplex (CD80,CD86), IL-12 und IL-4) auf die Polarisierung der sich entwickelnden
Effektor-Zellen untersucht werden.
IV. Rolle exogener Einflüsse während der primären Immuninduktion
Exogene Faktoren sollen in das Modell eingebracht und ihre Wirkungen auf dendritische
Zellen und die dadurch veränderte Zytokininduktion naiver T-Zellen geprüft werden.
- 32 -
2. Patienten, Material und Methoden
2. Probanden, Material und Methoden
2.1. Probanden
Die eingesetzten Nabelschnurblutproben stammten von Neugeborenen, die zwischen
dem 15.11.1995 und dem 30.6.1997 im Augusta-Krankenhaus und im ElisabethHospital in Bochum geboren wurden. Ausschlußkriterien waren Frühgeburtlichkeit,
Schwangerschaftskomplikationen, sowie eine bekannte Hepatitis- oder HIV-Infektion
der Mutter; hierdurch sollten Unreife, Defekte und Voraktivierung bzw. Transformierung des Immunsystems ausgeschlossen werden.
Die in dieser Arbeit untersuchten Patienten waren drei Jungen im Alter von drei, vier
und sieben Jahren. Der dreijährige Patient hatte vier Brüder, die in Jugoslawien jung an
opportunistischen Infektionen gestorben waren. Die beiden anderen Patienten waren
Brüder. Alle drei Patienten wurden klinisch auffällig mit einer Pneumocystis carinii Infektion in den ersten Lebensmonaten. Eine Immunglobulinanalyse ergab einen Mangel
an IgA und IgG, aber das Vorhandensein von IgM. Die Lymphozyten der Patienten exprimierten nach Stimulation mit PMA und Ionomycin keinen CD40 Liganden (CD154).
Zehn ml heparinisiertes, peripheres Blut wurden direkt vor der therapeutischen intravenösen Gabe von Immunglobulinen für die dargestellten Versuche entnommen.
Peripheres, adultes Blut wurde in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden, erwachsenen Probanden gewonnen und in Heparin aufgenommen.
- 33 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.2. Eingesetzte Materialien
Material
Hersteller
β-Aktin-Primer
R&D Systems, Wiesbaden
10 ml serologische Pipette, steril
Falcon/BD, Heidelberg
15 ml konische Röhrchen (Blue Max Jr.)
Falcon/BD, Heidelberg
3
Amershan Pharmacia Biotec,
H-Thymidin
Buckinghamshire,UK
50 ml konische Röhrchen (Blue Max)
Falcon/BD, Heidelberg
Acrylamid
Fluka Chemie, Buchs, CH
Agarose
Serva
Ammonium Persulfat
Merck, Darmstadt
Amphotericin B
Biochrom KG, Berlin
Anti-CD14-MicroBeads
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Anti-CD14-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-CD1a-FITC
Ortho Diagnostic Systems, Raritan, USA
(Ortho-(OKT 6)-mune-Reagents)
Anti-CD1a-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-CD34-PE
Dianova, Hamburg
Anti-CD3-Körper
Geschenk von Prof. C. Heusser, Basel, CH
Anti-CD3-PerCP
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-CD45RA-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-CD45RO-MicroBeads
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
anti-CD80-Körper (blockierend)
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
Anti-CD80-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-CD83-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-CD86-Körper (blockierend)
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
Anti-CD86-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-HLA-PerCP
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-IFN-γ-FITC (Maus IgG1)
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-IgG2a+b-MicroBeads
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
- 34 -
2. Patienten, Material und Methoden
Anti-IL-12-Körper (blockierend)
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
Anti-IL-12-PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Anti-IL-4-Körper (blockierend)
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
Anti-IL4-PE (Maus IgG1)
Becton Dickinson, Heidelberg
Auflichtmikroskop
OLYMPUS, Japan
(Umkehrmikroskop) CK2
Beta-Counter (Liquid Scintillation)
LKB-Wallak, Freiburg
Borsäure
Merck, Darmstadt
Brefeldin A
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Brutschrank (CO2-Inkubator)
Heraeus, Düsseldorf
BSA (Albumin from bovine serum)
Fluka Chemie, Buchs, CH
BS-Säule
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
CD34 Progenitor Cell Isolation Kit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
CD40 Ligand, löslich
Alexis, Grünberg
Chloroform
Merck, Darmstadt
Coatest Endotoxin Test
Diapharma, Columbux, Ohio, USA
Dextranblau
Fluka Chemie, Buchs, CH
Durchflußzytometer FACScan
Becton Dickinson, Heidelberg
Durchlichtmikroskop
Zeiss, Jena
EDTA
Biochrom KG, Berlin
Ethanol absolut
Merck, Darmstadt
FACS-Röhrchen
Falcon/BD, Heidelberg
FcR-Blocking-Reagenz
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
FCS Fetales Kälberserum
Biochrom KG, Berlin
(verschiedene Chargen)
Ficoll-Trennlösung (Dichte 1,077 g/ml)
Biochrom KG, Berlin
Fuchs-Rosenthal-Zählkammer
BD, Heidelberg
G21-Nadel
BD, Heidelberg
G22-Nadel
BD, Heidelberg
G23-Nadel
BD, Heidelberg
Gelkammer
Biometra, Göttingen
(für horizontale Gelelektrophorese)
- 35 -
2. Patienten, Material und Methoden
Gewebekulturplatte (MULTIWELL),
Falcon/BD, Heidelberg
24 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel
GIT (Guanidine-Thiocyanate)
Fluka Chemie, Buchs, CH
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-
Leucomax, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg
Stimulierender-Faktor (GM-CSF)
HANKS (steril)
Biochrom KG, Berlin
Hanks balanced salts (HBSS)
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Heparin-Natrium 100 I.E./ml
Promonta, Hamburg
(„Vetren 200“)
HEPES-Puffer
Biochrom KG, Berlin
IFN-γ-ELISA
R&D Systems, Wiesbaden
IFN-γ-Primer
R&D Systems, Wiesbaden
IL-4-ELISA
R&D Systems, Wiesbaden
IL-4-Primer
R&D Systems, Wiesbaden
Ionomycin
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Isomethylalkohol
Merck, Darmstadt
Isopropanol
Merck, Darmstadt
LPS
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Lysis II-Softwarepaket
Becton Dickinson, Heidelberg
MACS Multistand
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
MACS-Trennsäule Typ AS +
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
MACS-Trennsäule Typ MS+
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
Faktor
Maus IgG1 Isotypkontrolle FITC
Becton Dickinson, Heidelberg
Maus IgG1 Isotypkontrolle PE
Becton Dickinson, Heidelberg
MidiMACS (Magnet)
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Mikroskop-Aufsatz
Zeiss, Jena
MiniMACS (Magnet)
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Mitomycin C
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Monensin
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Natriumazid
Merck, Darmstadt
Natriumpyruvat
Biochrom KG, Berlin
Neuramidase
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
- 36 -
2. Patienten, Material und Methoden
NK-Cell-Isolation-Kit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Paraformaldehyd, Pulver
Riedel-de Haen AG, Seelze
PBS, steril
Biochrom KG, Berlin
PC-Software „GraphPad Prism“
GraphPad Software Incorporated, San Diego,
USA
Penicillin / Streptomycin
Biochrom KG, Berlin
Phenol
Merck, Darmstadt
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Polystyren Reagenzglas (mit Rundboden)
Falcon/BD, Heidelberg
Propidiumiodid (PI)
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
rekombinantes, humanes IL-12
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
rekombinantes, humanes IL-4
Tebu / Peprotech, Frankfurt am Main
RNA-Isolations-Kit
StrataGen, Austin, Texas, USA
RPMI 1640-Flüssigmedium
Biochrom KG, Berlin
Saponin
Riedel-de Haen AG, Seelze
Schafserythrozyten
BAG Biologische Analysesysteme, Lich
ß-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Stammzellfaktor (SF)
R&D Systems, Wiesbaden
Thermoblock
Biometra
Tris Base
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Trypan Blau
Fluka Chemie, Buchs, CH
Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)
R&D Systems, Wiesbaden
Türk´sche Lösung
Fluka Chemie, Buchs, CH
Zellerntegerät (cell Harvester)
Titertek, Oslo, Norwegen
Zellkulturplatte (MICROTEST)
Falcon/BD, Heidelberg
96 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel
Zentrifuge (Omnifuge 2.0RS)
Heraeus, Düsseldorf
- 37 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.3. Magnet assoziierte Zellsortierung (MACS)
2.3.1. Grundlagen der Magnet assoziierten Zellsortierung
Mit der Magnet assoziierten Zellsortierung wurde eine Technik zur Zellisolation ve rwendet, mit der schon kleinste Zellmengen aus heterogenen Zellpopulationen isoliert
werden konnten. Die Lebensfähigkeit der sortierten Zellen blieb in hohem Maße erhalten
und die Reinheit der gewonnen Fraktionen war sehr hoch.
Die zu selektionierenden Zellen wurden mit einem spezifischen, paramagnetischen Antikörper, einem sogenannten MACSMicroBead, markiert, und über eine sich in einem
permanenten Magnetfeld befindende Separierungssäule gegeben. Die magnetisch markierten Zellen verblieben an der Säule, die Unmarkierten nicht. Nachdem die Säule aus
dem Magnetfeld entfernt wurde, konnten die an ihr verbliebenen Zellen eluiert werden.
2.3.2. Super-paramagnetische Antikörper (MACSMicroBeads)
Es wurden sehr kleine (Durchmesser ca. 50 nm), aus Eisenoxid und Polysacchariden bestehende, hochspezifische Antikörper verwendet (sog. MACS MicroBeads), die sich in
Kultur zersetzten und weder Funktion noch Überlebensfähigkeit der Zellen beeinflußten.
2.3.3. Separierungseinheit
Die Separierungseinheit bestand aus einem starken Dauermagneten an einem Ständer
und einer Separierungssäule, ein ferromagnetisches Gerüst mit räumlich kleinen strukturellen Einheiten in einem Plastikgefäß.
Beim Einbringen der Säule in das Magnetfeld des Dauermagneten resultierten sehr starke, räumlich kleine Magnetfelder. In unmittelbarer Nähe der so konstruierten Säule wurden 10 000mal stärkere Felder erzeugt, als dies mit üblichen geometrischen Strukturen
möglich gewesen wäre. Bei Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld erfolgte durch diese Struktur eine schnelle Entmagnetisierung der Antikörper, so daß eine zügige Eluation
der Zellen aus der Säule ermöglicht wurde, ohne ihnen Schaden zuzufügen (s. Abb. 7).
- 38 -
2. Patienten, Material und Methoden
Trennsäule
Magnetfeld
Magnet
Ferromag. Gerüst
Gefäß
O
O
O OO
O OO
Zellen in Puffer
Abb. 7: Schematische Darstellung der Separierungseinheit
2.3.4. Selektionsstrategien
Die MACS bietet prinzipiell zwei Möglichkeiten zur Zellisolierung: entweder die posit ive oder die negative Selektion (Depletion).
Bei der positiven Selektion wurden gegen bestimmte Oberflächenmoleküle der Zielzellen gerichtete Antikörper verwendet, so daß diese Zellen auf der Säule verblieben und
nach Entnahme aus dem Magnetfeld eluiert und genutzt werden konnten.
Bei der Depletion wurden alle Zellen außer den Zielzellen markiert und die Unmarkie rten aufgefangen, nachdem sie die Säule passiert hatten.
2.3.5. Markierungsmöglichkeiten
Zellen konnten entweder direkt, d.h. mit einem hochspezifischen, paramagnetisch gekoppelter Antikörper gegen die zu erkennende Antigenstruktur der Zielzelle, oder indirekt markiert werden.
- 39 -
2. Patienten, Material und Methoden
Bei der indirekten Markierung wurde ein primär ungekoppelter Antikörper gegen die
Zielstruktur verwandt und, in einem zweiten Inkubationsschritt, ein Zweiter, gegen die
Fc-Struktur des Ersten gerichteter Antikörper eingesetzt (s. Abb. 8).
Indirekte Markierung
Direkte
Markierung
Abb. 8: Schematische Darstellung der Markierungsmöglichkeiten von Zellen durch MicroBeads. Direkte
Markierung mit einem paramagnetischen Antikörper, der spezifisch gegen ein bestimmtes Oberflächenantigen ist. Indirekte Markierung mit einem MicroBead, der gegen die Fc-Struktur eines spezifischen Antikörpers gerichtet ist.
2.3.6. Inkubation
Die Antikörpermengen wurden in Vorexperimenten ermittelt, in der Regel wurde das
Volumenverhältnis 1 : 5 von Antikörper zu Zellen beachtet. Als Bezugskonzentration
galten hierbei 1 x 107 Zellen pro 80 µl Puffer, zu denen dann 20 µl Antikörper gegeben
wurden. Die Inkubationen erfolgten für 15 min bei 6° C (Kühlschranktemperatur). Die
jeweils günstigsten Puffer (HBSS, PBS, bei Bedarf mit EDTA und / oder BSA) wurden
in Vorexperimenten ermittelt. Zwischen den Inkubationen erfolgten entsprechende
Waschschritte.
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2. Patienten, Material und Methoden
2.3.7. Verwendung der Separationseinheit
Die mit Antikörpern beladenen Zellen wurden in einer der Zellmenge und Separationseinheit entsprechenden Puffermenge (laut Herstellerangabe) auf die Separationssäule
gegeben und entsprechend gespült, danach wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt
und die gebundenen Zellen nach Pufferzugabe unter Druck aus der Säule entfernt und in
einem 15 ml Röhrchen mit Schraubverschluß aufgefangen.
2.3.8. Isolierte Zellarten
Folgende Zellgruppen wurden mit Hilfe der MACS isoliert und verwendet:
CD34 positive hämatopoetische Stammzellen (aus Nabelschnurblut)
Natürliche Killerzellen (aus Nabelschnurblut)
CD45 RA - positive Zellen (aus Nabelschnurblut und peripherem Blut)
Naive T-Zellen (aus Nabelschnurblut)
Memory-T-Zellen (aus peripherem Blut)
Monozyten (aus peripherem Blut)
Falls nicht gesondert angegeben, erfolgte die Isolierung streng nach Herstellerprotokoll.
- 41 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.4. Anzucht dendritischer Zellen
2.4.1. Blutalter
Das Alter des Blutes (Entnahmezeitpunkt bis Beginn des Experimentes) wurde erfaßt.
2.4.2. Gewinn von Nabelschnurblut
Nabelschnurblut wurde nach Abnabelung der Kinder steril aus der Vena umbilicalis der
Plazenta entnommen und zu 10 ml einer gerinnungs- und keimhemmenden Pufferlösung
in sterile 50 ml Becher mit Schraubverschluß gegeben.
Pufferlösung:
20 ml Heparin-Natrium 100 I.E./ml,
1 ml HEPES 1 M,
1 ml Penicillin 10 000 I.E. /ml / Streptomycin 10 000 I.E. /ml,
1 ml Amphotericin 250 µg/ml;
ad 100 ml HBSS
Die mononukleäre Zellphase wurde entsprechend peripherem Blut gewonnen und als
CBMC (Cord Blood Mononuclear Cells) bezeichnet (siehe auch 2.4.3); die Zellzahl
wurde in einer Neubauer-Zählkammer erfaßt.
2.4.3. Isolation von CD34 positiven Zellen (hämatopoetische
Stammzellen) aus mononukleären Nabelschnurzellen
Die Stammzellen wurden durch eine indirekte, positive Magnet-assoziierte-Zell-Sortierung (MACS) gewonnen, d.h. die das Oberflächenantigen tragenden Zellen wurden mittels eines unmarkierten, hochspezifischen Antikörpers gegen CD34 und einem paramagnetisch beladener Sekundärantikörper aus der Menge der CBMC isoliert .
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2. Patienten, Material und Methoden
Dazu wurde zuerst das gewonnene Zellpellet mononukleärer Zellen mit 50 µl Immunglobulinen resuspendiert, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend die
Zellen mit 50 µl CD34 - Antikörper gemischt und für 15 min bei 4 - 6° C inkubiert.
Danach wurden die Zellen in 10 ml HANKS aufgenommen und bei 350 g gewaschen.
Das entstandene Zellpellet wurde in 200 µl HANKS und 50 µl Sekundärantikörper, welche mit MACSBeads markiert und gegen den Fc-Anteil des Anti-CD34-Antikörpers gerichtet waren, aufgenommen und gemischt und nach einer Inkubation von 15 min bei
4 - 6 ° C wurden die Zellen bei 350 g erneut 10 min gewaschen.
Anschließend wurden die Zellen in 400 µl pro 1 x 108 Zellen eisgekühltem HANKS aufgenommen und auf eine, sich in einem Magnetfeld befindende, MiniMACS-(MS-)Säule
gegeben, die zuvor gekühlt und mit 500 µl eisgekühltem HANKS gespült worden war.
Die mit Antikörpern markierten Zellen blieben in dem Magnetfeld an der Säule hängen.
Die Säule wurde viermal mit jeweils 500 µl eiskaltem HANKS gespült, was nicht an die
Säule gebundene Zellen auswusch, dann wurde sie aus dem Magnetfeld entfernt. Jetzt
gab man 1000 µl eiskaltes HANKS auf die Säule und drückte dies mit einem Stempel
durch. Durch den mechanischen Druck wurden die Zellen von der Säule entfernt und in
ein bereitgestelltes 15 ml Gefäß gespült.
Diese Zellen wurden auf eine zweite, auf gleiche Art und Weise vorbereitete, Säule gegeben. Die neue Säule wurde wie die Erste gespült, man entfernte die Zellen jedoch
schließlich mit 500 µl HANKS in ein 15 ml Gefäß mit Schraubverschluß.
Die Zellzahl wurde in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer ermittelt und auf eine Zellkonzentration von 1,25 x 105 / ml Kulturmedium eingestellt.
Die Reinheit der Sortierung (Anteil der CD 34 positiven hämatopoetischen Stammzellen) wurde durchflußzytometrisch zu verschiedenen Zeitpunkten der Sortierung bestimmt. Die Zeitpunkte waren:
1. In den CBMC
2. Vor der Sortierung
3. Nach der ersten MACS-Säule
4. Nach der zweiten MACS-Säule
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2. Patienten, Material und Methoden
Das Kulturmedium bestand aus:
RPMI 1640 mit
10 % Fetalem Kälberserum verschiedener Chargen und
4 % Zusatzlösung, bestehend aus:
Natriumpyruvat 100 mM, L-Glutamin 200 mM,
nicht-essentiellen Aminosäuren
(L-Alanin, L-Asparagin x H2 O, L-Glutamat, Glycin, L-Prolin, L-Serin),
Penicillin 10 000 I.E. / ml, Streptomycin 10 000 I.E. /ml;
gemischtes Verhältnis 1:1:1:0,5:0,5.
dazu wurden, wie unten beschrieben, Wachstumsfaktoren hinzugefügt.
Alle Arbeitsschritte und verwendeten Substanzen waren steril.
2.4.4. Wachstumsfaktoren
2.4.4.1. Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor (GM-CSF)
Nach der Sortierung wurden die CD 34 positiven Zellen mit variierende Mengen des
Differenzierungs- und Wachstumsfaktors GM-CSF kultiviert: Es wurden 2 ng; 0,2 ng;
0,02 ng; 0,002 ng je pro 200 µl eingesetzt. Am 14. d wurden die Zellmengen in der Neubauer-Zählkammer und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch bestimmt.
2.4.4.2. Stammzellfaktor (SF)
Es wurden Kulturen mit 10 ng / ml SF und ohne SF bei konstanter Menge der übrigen
Stimulanzien angezüchtet, die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch am 14. d bestimmt.
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2. Patienten, Material und Methoden
2.4.4.3. Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α )
Es wurden Kulturen mit 5 ng / ml TNF-α und ohne TNF-α bei konstanter Menge der übrigen Stimulanzien angezüchtet, die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer und die
Oberflächenantigene durchflußzytometrisch am 14. d bestimmt.
2.4.4.4. Makrophagen-Kolonie-Stimulierender-Faktor (M-CSF)
Verschiedene Wachstumsfaktoren wurden getestet. Dabei wurde M-CSF unter folge nden Bedingungen eingesetzt: 5 oder 20 Internationale Einheiten (Units) / ml jeweils am
1. und / oder 10. Tag. Am 14. d wurden die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer
und die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch bestimmt.
2.4.4.5. Verschiedene Chargen Fetalen Kälberserums (FCS)
Es wurden Kulturen mit verschiedenen Chargen des FCS bei konstanter Menge der Stimulanzien angezüchtet und sowohl die Zellmenge in der Neubauer-Zählkammer als
auch die Oberflächenantigene durchflußzytometrisch am 14. Tag bestimmt.
2.4.4.6. Kontaminierendes Lipopolysaccharid (LPS)
Der Gehalt an kontaminierendem LPS in den verschiedenen Chargen des FCS wurde
durch den COATEST Endotoxin Test ermittelt, der auf der Limulus Amebocyte Lysate
(LAL)-Methode beruhte. LAL war ein Reagenz, das aus den gereinigten Zellen des Limulus polyphemus, einer Krabbenart, gewonnen wurde. Es enthält ein Enzymsystem,
das durch Endotoxin aktiviert wurde und durch Spaltung von S-2423 den gelben Farbstoff para-nitro Anilin (pNA) freisetzte, der photometrisch bei 405 nm gemessen werden
konnte, um die Menge des Endotoxins zu quantifizieren. Zur Messung wurde das Endpunktverfahren mit Mikrotiterplattenmethode gewählt.
Pro Platte wurden 50 µl Probe oder Standard gegeben und 5 min bei 37° C inkubiert.
Hierzu kamen 50 µl LAL-Lösung, dann erfolgte 5 min Inkubation bei 37° C. Nach Zugabe von 100 µl Substrat-Puffer Lösung erfolgte ein weiterer Inkubationsschritt für 5
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2. Patienten, Material und Methoden
min bei 37° C. Nach Zugabe von 20 % Essigsäure konnte die Probe im ELISA-Reader
bei 405 nm gemessen werden. Die Werte wurden mittels einer Standardkurve ermittelt97 .
2.4.5. Zellkultur
Die CD34 positiven Zellen wurden in einer Zellmenge von 2,5 x 104 Zellen in 200 µl
Kulturmedium in eine F96-Mikrowell-Flachbodenplatte eingebracht und in einem mit
5 % CO2 begasten Brutschrank bei 37° C kultiviert. Anfangs wurde jedem Senkloch
0,2 ng GM-CSF, 10 ng SF und 5 ng TNF-α je pro ml als Stimulanzien zur Zellvermerung und -ausreifung zugefügt.
Bei genügender Fülle wurde der Inhalt eines Senkloches auf zwei verteilt. Am 7. Tag erfolgte eine Nachstimulation der Zellen durch eine erneute Zugabe der Stimulanzien in
der gleichen Menge wie bei der Erststimulation. Die Zellen wurden nach 14 d geerntet.
2.4.6. Reifung der dendritischen Zellen
Teile der dendritischen Zellen wurden an Tag 14 zur weiteren Ausreifung gebracht. Dies
geschah durch den Einsatz verschiedener Stimulanzien.
Dies waren:
10 ng / ml; 1 ng / ml; 0,1 ng / ml GM-CSF;
50 ng / ml; 5 ng / ml; 0,5 ng / ml TNF-α;
10 ng / ml GM-CSF und 5 ng / ml TNF-α;
1 ng / ml; 10 ng / ml; 100 ng / ml löslicher CD40 Ligand mit 1 µg/ ml Verstärker;
100 µg / ml; 10 µg / ml; 1 µg / ml; 0,1 µg / ml LPS mit 10 ng / ml GM-CSF.
Die Oberflächenantigene wurden durchflußzytometrisch nach 24 Stunden bestimmt.
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2. Patienten, Material und Methoden
2.4.7. Visuelle Nachweise
Die durchlichtmikroskopische Darstellung der angezüchteten Zellen wurde fotografisch
festgehalten. Dies geschah mittels einer herkömmlichen Photokamera. Auch die zusammengelagerten Komplexe der GLR wurden auf diese Weise fotografiert.
2.4.8. Durchflußzytometrische Darstellung der Oberflächenantigene
Aus jeder Zellfraktion wurden für jede Messung ca. 1 - 2 x 105 Zellen entnommen und
diese Zellmenge in 100 µl HBSS mit Natriumazid aufgenommen und mit den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen des jeweiligen Antikörpers für 20 min bei 4 ° C inkubiert; anschließend der Überschuß an nicht gebundenen Antikörpern mit je 1 - 2 ml
HBSS mit Natriumazid für 5 min bei 200 g ausgewaschen. Für die durchflußzytometrische Messung nahm man die gefärbten Zellpellets schließlich in je 250 µl HBSS mit
Natriumazid auf.
Folgende Antikörper fanden zur Messung der Stammzellreinheit (CD 34 positive Zellen)
Verwendung:
Anti-CD 34 - PE (QBEND 10) Dianova
Folgende Antikörper fanden zur Messung der Zelldifferenzierung Verwendung:
Anti-CD 14 - PE Becton-Dickinson
Anti-CD 1a - FITC Ortho (OKT 6)
Anti-CD 80 - PE Becton-Dickinson (PharMingen)
Anti-CD 86 - PE Becton-Dickinson (PharMingen)
Anti-CD 83 - PE Becton-Dickinson (PharMingen)
Anti-HLA-DR- PerCP Becton-Dickinson
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2. Patienten, Material und Methoden
2.5. Gemischte Leukozyten Reaktion (MLR)
2.5.1. Grundlagen der Gemischte Leukozyten Reaktion
Mit der gemischten Leukozyten Reaktion wurde der Einfluß bestimmter Zellgruppen
(als Stimulatorzellen) auf andere Zellgruppen (Responderzellen) überprüft. Diese Stimulatorzellen waren antigenpräsentierende Zellen und regten die Responderzellen eine rseits zur Proliferation, andererseits zur Zytokinproduktion an.
2.5.2. Probengewinn
Für jedes Experiment diente das Blut zweier Probanden. Genauere Hinweise zur Art und
Gewinn des Blutes siehe in den entsprechenden Abschnitten.
2.5.3. Gewinn mononukleärer Zellen
Das Blut wurde im Verhältnis 1:1 mit HANKS Salzlösung verdünnt, mit Ficoll 1.077
g / ml unterschichtet und anschließend mit 550g für 20 Minuten in einem 50 ml Röhrchen zentrifugiert. Die aus mononukleären Zellen entstandene Interphase wurde abpipettiert und mit HANKS einmal bei 350g und einmal bei 300g gewaschen. Es folgte eine
Zellzahlbestimmung nach Anfärbung mit Türk´scher Lösung in einer Neubauer-Zählkammer.
Anschließend wurden die Zellen noch einmal mit HANKS bei 350g gewaschen und als
Zellpellet belassen. Diese Zellgruppe wird im Weiteren als PBMC (Peripheral Blood
Mononuclear Cells) bezeichnet. Diente Nabelschnurblut als Ausgangsmaterial, handelte
es sich um CBMC (Cord Blood Mononuclear Cells).
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2. Patienten, Material und Methoden
2.5.4. Zellen in der MLR
2.5.4.1. Zellgruppen der konventionellen MLR
2.5.4.1.1. Neuramidase-Behandlung von Schafserythrozyten
Der Ansatz einer MLR wurde zunächst exemplarisch an einer gängigen Form der MLR
getestet. Hierzu wurde die T-Zell-Isolation unter Verwendung von Schafserythrozyten
durchgeführt, deren Oberflächenspannung vorher durch Neuramidase verringert wurde.
Dazu wurden 20 ml Schafserythrozyten zweimal mit sterilem PBS-Puffer bei 800 g 5
min gewaschen; anschließend das Zellpellet in 20 ml PBS-Puffer aufgenommen und
unter Zugabe von 0,5 Units Neuramidase 30 min in einem 37° C warmen Wasserbad inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 50 ml Medium aufgenommen.
Das Medium bestand aus:
RPMI 1640,
20 % Fetalem Kälberserum,
1 % Penicillin 10 000 I.E. / ml / Streptomycin 10 000 I.E. /ml
0,01 M Hepes
2.5.4.1.2. Präparation von humanen, peripheren T-Zellen und akzessorischen Zellen
Die mononukleären Zellen wurden nach dem letzten Waschgang in 2 - 3 ml RPMI 1640
Medium aufgenommen. Pro 1 x 108 mononukleären Zellen gab man 1 - 2 ml vorbeha ndelte Schafserythrozyten zu und mischte diese gründlich. Die Suspension wurde vorsichtig auf 15 ml Ficoll geschichtet und 20 min bei 550 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befanden sich die T-Zellen, über ihren Rezeptor CD2 an die Schafserythrozyten
gebunden, als sogenannte Rosetten am Boden des Gefäßes. Diese Zellen bezeichnete
man als E+ -Zellen. In der Interphase befanden sich die sog. E- -Zellen (B-Zellen, Monozyten und einige NK-Zellen).
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2. Patienten, Material und Methoden
Der Überstand wurde bis zur Interphase vorsichtig abpipettiert und verworfen.
Die Interphase wurde ebenfalls abpipettiert und in ein 15 ml Gefäß mit Schraubverschluß gegeben. Zur späteren Verwendung der E- -Zellen als akzessorische Zellen
wusch man die Zellen mit eiskaltem PBS 0,01 % EDTA und lagerte sie bis zur Kultivierung auf Eis.
Zur Gewinnung der E+ -Zellen mußten die Schafserythrozyten lysiert werden. Hierzu
gab man die Zellen 4 - 7 min in einen 1 zu 10 verdünnten NH4 Cl-Puffer und wusch sie
anschließend mit RPMI 1640 zweimal bei 350 g 10 min.
2.5.4.2. Gewinnung der gezüchteten Zellen
Zum Lösen der adhaerierten Zellen nach Kultur wurden die Zellkulturplatten 15 min auf
Eis inkubiert, dann die Zellen unter intensivem Resuspendieren in ein 50 ml Röhrchen
mit Schraubverschluß überführt. Die Zellzahl wurde nach Zentrifugation (10 min bei
350 g) in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Anschließend wurden die Zellen zur
Verhinderung weiterer Proliferation mit 50 µl Mitomycin C / 1 x 107 Zellen 30 min in
einem Wasserbad bei 37° C inkubiert, danach mit eiskaltem HANKS bei 350 g 10 min
zweimal zentrifugiert, und die Zellzahl erneut in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.
Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril.
2.5.4.3. Gewinnung von Monozyten
Das verwendete Blut wurde in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden, erwachsenen Probanden entnommen, in Heparin aufgenommen und die mononukleäre Zellphase gewonnen.
Die Isolation der Monozyten erfolgte durch eine direkte, positive MAC-Sortierung mit
Anti-CD33-MicroBeads, einer AS-Säule mit G23 Nadel und HANKS als Puffer.
Anschließend wurden diese Zellen ebenfalls zur Verhinderung der Proliferation mit 50
µl Mitomycin C / 1 x 107 Zellen 30 min in einem Wasserbad bei 37° C inkubiert, danach mit eiskaltem HANKS bei 350 g 10 min zweimal zentrifugiert, und es erfolgte die
Zellzahlbestimmung in einer Neubauer-Zählkammer. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril.
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2. Patienten, Material und Methoden
2.5.4.4. Gewinnung von peripheren (Memory-) T-Zellen und naiven T-Zellen
Das verwendete Blut wurde zum Gewinn der peripheren T-Zellen in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden, erwachsenen Probanden entnommen und
in Heparin aufgenommen. Zum Gewinn der naiven T-Zellen wurde Nabelschnurblut
verwendet.
Die mononukleäre Zellphase wurde gewonnen. Die Isolation der T-Zellen erfolgte durch
eine indirekte, positive MAC-Sortierung mit einem primären Anti-CD3-Körper und einem sekundären Anti-IgG2 a+b-MACSMicrobead, einer AS-Säule mit G22 Nadel und
RPMI 1640 Medium mit 2 % FCS als Puffer.
Die gewonnen Zellen wurden dann 10 min bei 350 g zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril.
2.5.4.5. Gewinnung von CD45 RA positiven Zellen
CD45RA positive Zellen wurden aus mononukleären Nabelschnurzellen durch direkte Depletion der CD45RO Zellen gewonnen. Das Zellpellet wurde hierzu in 20 µl HANKSPuffer und 80 µl CD45RO- MicroBeads pro 1 x 107 Zellen aufgenommen. Die Sortierung
erfolgte mittels einer AS-Säule mit G22 Nadel und RPMI 1640 Medium (2 % FCS).
Die gewonnenen Zellen wurden dann 10 min bei 350 g zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Arbeitsschritte und Substanzen waren steril.
2.5.4.6. Gewinnung von NK-Zellen
Zur Isolation der NK-Zellen wurde ein kommerzielles Kit verwendet, daß die Nicht-NKZellen indirekt depletierte. Die mononukleären Nabelschnurzellen wurden mit einem
Gemisch von Hapten-gekoppelten Antikörpern gegen CD3 (T-Zellen), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen), CD36 (Stammzellen) und anti-IgE inkubiert, danach ein
MACSMicroBeads gegen das Hapten eingesetzt. Die Isolation erfolgte über eine BSSäule mit G21 Nadel (HANKS als Puffer). Die gewonnen Zellen wurden dann 10 min
bei 350 g zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Arbeitsschritte
und Substanzen waren steril.
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2. Patienten, Material und Methoden
2.5.5. Ansatz einer Mixed Leukocyte Reaction (MLR)
Die Responder- und Stimulatorzellen jeweils unterschiedlicher Spender wurden in verschiedenen Mengen miteinander in einem Brutschrank mit 8 % CO2 eine Woche kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in dem beschriebenen Kulturmedium.
Um die Proliferation der Stimulatorzellen zu verhindern, wurde ihre DNA-Synthesefähigkeit gehemmt; hierzu wurden diese Zellen vor Ansatz der Kultur für 30 min bei 37°
C in einem Wasserbad mit 50 µl Mitomycin C pro 1 x 107 Zellen inkubiert, und anschließend zweimal bei 350 g 10 min mit dem Kulturmedium gewaschen. Zur Messung
der Proliferation wurden 0; 5 x 102 ; 5 x 103 und 5 x 104 Stimulatorzellen eingesetzt. Zu
diesen wurden jeweils 2,5 x 104 ; 5 x 104 oder 1 x 105 Effektorzellen gegeben.
Zur Messung der intrazellulären Zytokine und Oberflächenantigene wurden zu 0; 5 x
102 ; 5 x 103 und 5 x 104 Stimulator- jeweils 1 x 105 Effektorzellen gegeben.
2.5.6. Zugabe exogener Stimulanzien in die MLR
Um verschiedene Effekte und Wechselwirkungen zu prüfen, wurden teilweise zusätzlich
zu den Stimulator- und Effektorzellen weitere, exogene Substanzen in die Kultur gegeben. Hierbei handelte es sich um monoklonale Antikörper (gegen CD3, CD80, CD86,
IL-4, IL-12), rekombinante Zytokine (IL-4, IL-12) oder bakterielle Produkte (LPS). Die
Substanzen wurden in unterschiedlichen Mengen eingesetzt (Tab. 4).
Tab.4: Eingesetzte Substanzen und Mengen
Substanz
Eingesetzte Mengen
anti-CD3
10 µg / ml
1 µg / ml
0,1 µg / ml
anti-CD80
20 pg / ml
4 pg / ml
0,8 pg / ml
0,16 pg / ml
anti-CD86
20 pg / ml
4 pg / ml
0,8 pg / ml
0,16 pg / ml
anti-IL-4
50 pg / ml (1250 I.E.)
10 pg / ml (250 I.E.)
2 pg / ml (50 I.E.)
0,4 pg / ml (10 I.E.)
anti-12
10 pg / ml
2 pg / ml
0,4 pg / ml
0,08 pg / ml
rek. IL-12
500 I.E./ ml
50 I.E. / ml
5 I.E. / ml
rek. IL-4
500 I.E. / ml
250 I.E. / ml
25 I.E. / ml
LPS
10 µg / ml
1 µg / ml
0,1 µg / ml
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2. Patienten, Material und Methoden
2.6. Messung der Effektorzellproliferation
Zur Untersuchung des Proliferationsverhaltens wurden nach 48; 72; 96 h die Zellen mit
10 µCi/ml 3 H-Thymidin (37mbq, entsprechend 1 mCi/ml) für 24 h gepulst. Über ein
Zellerntegerät wurden die zellulären Bestandteile gewonnen und in einem Beta-Counter
analysiert und die Ergebnisse in radioaktiven Zerfällen pro Minute (counts per minute)
dargestellt.
2.7. Analytische Durchflußzytometrie
2.7.1. Grundlagen der Durchflußzytometrie
Das Prinzip der Durchflußzytometrie war die simultane Messung verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften einzelner Zellen oder Partikel, die hintereinander in einem Flüssigkeitsstrom angeordnet untersucht wurden.
Dabei erfolgte die Analyse von Zellen über die gleichzeitige Bestimmung ihrer Fluoreszenzintensität und ihres Streulichtes.
2.7.2. Aufbau eines Durchflußzytometers
Zur Analyse wurde die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension in einer
Konzentration von etwa 0,5 bis 20 Millionen Zellen pro Milliliter über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die aus Quarzglas bestehende Meßküvette eingeführt. Die Zellen
passierten, von einem Hüllstrom umgeben, den Analysepunkt. Der Hüllstrom diente dazu, den Probestrom im Zentrum der Meßküvette zu stabilisieren und so zu verengen, daß
die Zellen hintereinander, einzeln, zum Analysepunkt gelangten (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung) (s.Abb. 9).
- 53 -
2. Patienten, Material und Methoden
Abb. 9 : Darstellung der Durchflußzytometrie: Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung
2.7.3. Messung der Lichtstreuung
Die Lichtstreuung wurde definiert als physikalischer Prozeß, bei dem die Zelle mit dem
einfallenden Lichtstrahl interagiert. Hierbei wurde nur die Richtung, nicht die Wellenlänge des Lichtes verändert.
Zur Lichtstreuung trugen folgende Zelleigenschaften bei:
- Zellgröße
- Zellmembran
- Zellkern
- intrazelluläre granuläre Bestandteile
- 54 -
2. Patienten, Material und Methoden
Das Licht wurde nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut; der größte Anteil fiel in
die Vorwärtsrichtung (d.h. entlang des einfallenden Lichtstrahls) und ist hauptsächlich
ein Maß für die Zellgröße (Vorwärtsstreulicht).
Das im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht hing von der Zelldichte und der Granularität, jedoch nur zum geringen Teil von der Zellgröße ab (Rechtwinkelstreulicht).
2.7.4. Messung der Fluoreszenz
Mittels eines 15 MW Argon-Lasers wurden Fluoreszenzfarbstoffe zur Emission von
Lichtquanten bestimmter Wellenlänge angeregt. Diese Anregung geschah durch Licht
mit der Wellenlänge von 488 nm. Dabei konnten mehrere Farbstoffe mit ähnlichem Absorptionsspektrum und unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet werden.
2.7.5. Signalverarbeitung
Passierte eine Zelle den Analysepunkt, wurden Signale vom Vorwärtsstreulicht, Rechtwinkelstreulicht und den Fluoreszenzen gemessen. Dies geschah durch eine Kombination von Signalmessung und -verstärkung. Dieses analoge Signal wurde dann in ein
computergerechtes Digitalsignal verwandelt.
2.7.6. Datenauswertung
Die Daten wurden mit der Software LYSIS II, entweder als Histogramm oder als korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot Plot) aufgetragen, ausgewertet.
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2. Patienten, Material und Methoden
Im Histogramm stellte dabei die vertikale Achse die Intensität des Signals dar, die horizontale Achse die Anzahl der Zellen. In der korrelierten Zweiparameterdarstellung (Dot
plot) wurde ein Signalpaar gleichzeitig abgebildet. Die beiden Intensitätsachsen wurden
gegeneinander aufgetragen. In die so gebildete Matrix wurde jeweils dort ein Punkt eingezeichnet, an dem sich die Intensitätswerte der beiden Parameter einer gegebenen Zelle
schneiden.
Abb. 10: Dot Plot
Abb. 11: Histogramm: Ein-Punkt-Darstellung. Auf der x-Achse wird die Stärke des Signals dargestellt,
auf der y-Achse die Anzahl der markierten Zellen.
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2. Patienten, Material und Methoden
2.7.7. Autofluoreszenz und Qualitätskontrolle
Viele Zellen zeigten bei der Anregung mit 488 nm auch ohne Anfärbung eine gewisse
Fluoreszenz. Dieses als Autofluoreszenz bezeichnete Signal war Fluoreszenzlicht, welches ungefärbte Zellen aufgrund seiner eigenen chemischen Zusammensetzung emittieren.
Zur Qualitätssicherung wurde zu einer Probe unbehandelter Zellen noch ein unspezifischer Antikörper gleicher Klasse, Subklasse und Fluoreszenzfarbstoff wie der Meßfarbstoffantikörper gegeben, nach entsprechender Inkubation diese Kontrolle gemessen und
als Negativwert festgelegt. Messungen, deren Intensität dann über den Werten der Kontrollmessung lagen, galten als positiv.
2.7.8. „LIST-MODE“ Datenaufnahme
Der Durchflußzytometer war so konzipiert, daß er bis zu 5 Eigenschaften (2 Lichtstreuungen und 3 Fluoreszenzen) an einzelnen Zellen simultan messen konnte. Die Meßwerte
wurden in der sogenannten Fünf-Parameter LIST-MODE Datenaufnahme aufgeno mmen. Das heißt, daß alle fünf Eigenschaften der analysierten Zelle hintereinander notiert
und als Liste gespeichert wurden.
2.7.9. Färbung der Oberflächenantigene
Die Differenzierung der mononukleären Zellen bzw. der angezüchteten Zellen erfolgte
durchflußzytometrisch anhand der Streulichteigenschaften und mit Hilfe monoklonaler,
gegen Leukozytenoberflächenantigene gerichtete Antikörper. Die Antikörper waren direkt an die Fluoreszenzfarbstoffe Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phyoerythrin (PE)
oder Peridininchlorophyll (PerCP) gekoppelt.
- 57 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.7.10. Färbung der intrazellulären Zytokine
2.7.10.1. Effektorzellen
Die intrazellulären Nachweise der Zytokine IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ in Effektorzellen
wurden in Anlehnung an die von Jung et al. entwickelte Methode ebenfalls durchflußzytometrisch mittels fluoreszenzmarkierter Zytokin-Antikörper durchgeführt94 .
Hierzu wurden die Zellen mit Phorbolester und Ionomycin stimuliert und die intrazellulären Transportprozesse durch Zugabe von Monensin unterbrochen. Dies führte zu einer
Akkumulation der Zytokine im Golgi-Apparat und damit zu einem durchflußzytometrisch meßbaren Signal auf Einzelzellniveau. Die Zellen wurden für diese Messung 10 min in 4 % Paraformaldehyd fixiert, und zweimal 10 min bei 300 g gewaschen.
Die Zytokinfärbung (je 10 µl anti-IL-4-PE oder anti-IFN-γ-PE pro 2x105 Zellen in 100
µl Puffer) erfolgte für 10 min bei 4-6 Grad in 10 % Saponinpuffer. Die Zellen wurden
dann für 5 min bei 250 g gewaschen und zur Messung in 250 µl HBSS aufgenommen.
2.7.10.2. Dendritische Zellen
Zur Messung von Zytokinen in dendritischen Zellen wurde nach Zugabe entsprechender
Stimulanzien für einen jeweils angegebenen Zeitraum Brefeldin A zugegeben. Dies war
ein Pilzgift, das in seiner Wirkung Monensin ähnelte, aber weniger zelltoxisch war.
Zur IL-12 Messung wurden dendritische Zellen 10 min in 4 % Paraformaldehyd fixiert,
und zweimal 10 min bei 300 g zentrifugiert, wobei die Röhrchen mit HBSS aufgefüllt
wurden, danach 45 min in 0,1 % Saponinpuffer inkubiert. Daran anschließend erfolgte
die IL-12 Färbung (10 µl anti-IL-12-PE pro 2 x 105 Zellen in 100 µl Puffer bei 4 - 6° C).
- 58 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.8. Polymerase Kettenreaktion (PCR) - Zytokinnachweis
2.8.1. Gewinn der Zellen
Die in der MLR angesetzten Zellen wurden nach 7 d für 5 h bei 37° mit PMA 10 ng / ml
und Ionomycin 1µM zur Zytokinproduktion stimuliert, anschließend geerntet, und mit
HANKS gewaschen. Das Pellet wurde in 1 ml GIT mit 7,2 µl ß-Mercaptoethanol pro
5 x 106 Zellen resuspendiert und bei -70° C über Nacht eingefroren.
2.8.2. RNA - Isolierung
Nachdem das gewonnene Lysat aufgetaut worden war, wurde es auf zwei Eppendorfhütchen verteilt. Danach erfolgte die Zugabe von 50 µl 2M Na-Acetat mit einem pH von 4
und 600 µl Phenol-Chloroform-Isomylalkohol-Mix. Diese Suspension wurde dann bei
1200g 20 min zentrifugiert; die so entstandene wässerige Phase gepoolt und in neue Eppendorfhütchen überführt. Nach Zugabe von 500 µl Isopropanol und mind. einstünd igem Einfrieren bei -20° C wurden die Zellen erneut zentrifugiert und der Überstand vo rsichtig abpipettiert. Das Pellet wurde noch einmal mit 100 % Ethanol gewaschen und
zentrifugiert. Nachdem das Ethanol entfernt war, wurde das Pellet in 25µl A.dest. gelöst
und gründlich resuspendiert.
2.8.3. Konzentrationsbestimmung der RNA
Die Extinktion der RNA wurde photometrisch in einem Plattenleser bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt, die RNA Menge dann graphisch ermittelt.
- 59 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.8.4. Umschreibung der RNA auf cDNA
5 µg der RNA wurden in 9 µl A.dest. aufgenommen und mit 29 µl DEPC Aqua und 3 µl
oligo(dT) gemischt, und anschließend, nach 5 min Inkubation bei 65° C, zentrifugiert
und 10 min bei Raumtemperatur zum Abkühlen belassen.
Primersequenz IL-4:
5´-TTCCTGTCGAGCCTTTCAG-3´
Primersequenz INF-γ:
5´-ATTTGGCTCTGCATTATTTTTCTGT-3´
Primersequenz β-Aktin:
5´- CGCGTCCGCC CCGCGAGCAC AGACCTCGC-3´
Das Pellet wurde in 5,0 µl first strand buffer, 1,0 µl RNase Block Ribonuklease Inhibitor
(400 U/µl), 2,0 µl 100 mM dNTPs, 1,0 µl MMLV-RT (50 U/µl) aufgenommen und gemischt; 1 h bei 37° C, dann 5 min bei 90° inkubiert, und abschließend wurde die Reaktion auf Eis gestoppt.
2.8.5. Amplifikation
Zu Beginn wurden 3 µl cDNA, 10 µl zehnfacher Taq Puffer, 0,8 µl 100mM dNTPs, 4 µl
Primer (jeweils für ß-Actin, IL-4, und IFN-γ) und 81,7 µl A.dest. gemischt und zentrifugiert, erst bei 91° C, dann bei 54 ° C je 5 min inkubiert, danach wieder zentrifugiert.
Anschließend wurde 0,5 µl Taq DNA Polymerase in den Ansatz gegeben und dieser mit
Mineralöl überschichtet. Im Folgenden wurden 30 Zyklen inkubiert. Ein Zyklus bestand
aus Inkubationen von 1 min bei 91° C, 1 min bei 54° C und 2 min bei 72° C. Zum
Schluß wurde der Ansatz innerhalb von 10 min von 72° C auf 4° C gekühlt.
- 60 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.8.6. Darstellung der Ergebnisse
Das gewonnene PCR-Produkt (20 µl) und die DNA-Längenstandards (5 µl) wurden mit
5 µl Dextranblau versetzt und in die mittels eines speziellen Kammes vorbereiteten Taschen eines 8 % Polyacrylamidgels gegeben.
50 ml Polyacrylamidgel bestanden aus:
Aqua dest.
34,5 ml
Acrylamid 40%ig
10,0 ml
Ammonium Persulfat 10%ig
1,0 ml
10 x TBE
5,0 ml
TBE (5 x):
Tris Base
53,9 g
Borsäure
27,51 g
0,5 M EDTA pH 8,0
20 ml
ad 1 l Aqua dest.
Als Laufpuffer wurde 1 x TBE verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei 180 Volt für
4 Stunden in einer LBK-Kammer. Das entstehende Bild wurde mittels einer Polaroid
Kamera festgehalten.
- 61 -
2. Patienten, Material und Methoden
2.9. Enzym Linked Immunoassay (ELISA)
Die Messung der Zytokine IL-4 und IFN-γ erfolgte mittels der ELISA-Technik nach 1;
2; 4; 7 d. Dazu wurden die Zellen und ihr Mediumüberstand geerntet und 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und weiterverarbeitet. 50 µl dieses Überstandes
wurden in jeweils ein Senkloch einer vorbehandelten Platte gegeben, in der sich bereits
50 µl biotinylierter Antikörper gegen IL-4 bzw. IFN-γ befanden. Anschließend wurde
die Platte 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann dreimal gewaschen. Danach wurden
100 µl eines in Puffer gelösten Streptavidin HRP-Konzentrates in jedes Senkloch gegeben und die Platte für 30 min inkubiert, bevor sie wieder dreimal gewaschen wurde.
Nun wurden 100 µl vorbereitete TMB Substrat Lösung in jedes Senkloch gegeben. Danach wurde die Platte 30 min bei Raumtemperatur unter Vermeidung von Lichteinfall
entwickelt, und die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stop Lösung beendet. Die Absorption wurde dann bei 550 nm Wellenlänge in einem Plattenleser gemessen und die
Zytokinmenge graphisch ermittelt.
- 62 -
3. Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1. Generierung dendritischer Zellen aus CD34 positiven hämatopoetischen Nabelschnurblutstammzellen
mittels Granulozyten-Makrophagen-KolonieStimulierender-Faktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SF)
und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α)
Die Generierung dendritischer Zellen erfolgte aus CD34 positiven hämatopoetischen
Stammzellen des Nabelschnurblutes durch den Einsatz von GM-CSF, SF und TNF-α. Das
eingesetzte Blut darf zu diesem Zweck ein bestimmtes Alter (Zeitraum von der
Blutentnahme bis zum Beginn der Isolierung) nicht überschritten haben.
3.1.1. Isolation von CD34 positiven Zellen aus Nabelschnurblut
CD34 positive Zellen können mit Hilfe der Magnet assoziierten Zellsortierung (MACS)
aus der Menge der mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes isoliert werden.
Parameter zur Beurteilung der Sortierungsqualität waren Reinheit, Ausbeute und der
Anteil intakter Zellen nach der Sortierung. Die Reinheit der Sortierung ist der Anteil
Zielzellen an der Gesamtzellmenge nach der Sortierung, die Ausbeute die Anzahl der
sortierten Zellen. Der Anteil untergegangener Zellen wurde mit Propidiumiodid (PI)
Färbung gekennzeichnet.
3.1.1.1. Die Reinheit der Isolation ist unabhängig vom Blutalter
CD34 positive Zellen lassen sich unabhängig vom Blutalter mit einer Reinheit von über
96 % aus dem mononukleären Anteil des Nabelschnurblutes unter Verwendung der
MACS isolieren (s.Abb.7). Der Anteil CD34 pos. Zellen wurde durchflußzytometrisch
mit einem Antikörper zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt (s. Abb. 12 und 13).
- 63 -
3. Ergebnisse
Abb. 12: Reinheit der CD34+ -Sortierung; die Sortierung erfolgte mittels MACS-Technologie unter
CD34 positive Zellen [%]
indirekter Markierung des Zielmoleküls .
100
4 h alt
3,5 h alt
1 h alt
0,5 h alt
50
0
0
1
2
3
4
Meßpunkt
Meßpunkt
Sortierungsschritt
1
Nach dem ersten Waschschritt
2
Vor der ersten Anreicherung
3
Nach der ersten Anreicherung
4
Nach der zweiten Anreicherung (Ende der Isolierung)
Abb. 13: Anteil CD34 positiver Zellen in den Proben unterschiedlichen Blutalters zu verschiedenen
Meßzeitpunkten während der Isolierung; die Messung des Anteils CD34 positiver Zellen erfolgte
durchflußzytometrisch.
- 64 -
3. Ergebnisse
3.1.1.2. Die Ausbeute der Isolation ist abhängig vom Blutalter, nicht von der
Ausgangszellmenge
Die Ausbeute der gereinigten CD34+ Stammzellen nimmt unabhängig von der
Ausgangszellmenge mit der Zunahme des Blutalters ab (s. Abb. 14). Die Zellmengen
wurden in einer Neubauer- bzw. einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer nach Türks
bestimmt. Bei ungefähr gleicher Ausgangszellmenge und, wie gezeigt, gleichem Anteil an
Stammzellen vor der Sortierung, ist die Ausbeute, also die Zellmenge nach der Sortierung
im Verhältnis zum Anteil der Zielzellen an der Ausgangszellmenge, bei älterem Blut
deutlich kleiner.
Zellmenge
10 10
0.5 h
1h
3,5 h
4h
10 8
10 6
10 4
Vor Sortierung
Nach Sortierung
Abb. 14: Vergleich der Zellmenge vor und nach Anreicherung CD34 positiver Zellen in Abhängigkeit vom
Blutalter; die Zellmenge wurde nach Färbung mit Türk´scher Lösung in einer Neubauer- bzw. FuchsRosenthal-Zählkammer bestimmt.
- 65 -
3. Ergebnisse
3.1.1.3. Das Blutalter bestimmt den Anteil untergegangener Zellen während
der Isolation
Der Anteil untergegangener Zellen in den zum jeweiligen Zeitpunkt vorhandenen
Zellgemischen ist abhängig vom Blutalter. Je älter das Blut, desto höher ist der Anteil an
untergegangenen Zellen in der Ausgangsfraktion. Zusätzlich nimmt er im Laufe der
Sortierung bei älterem Blut stärker zu. Das hat bei älterem Blut zur Folge, daß große
Anteile der in Kultur gegebenen Zellen schon zu Kulturbeginn nicht mehr lebensfähig
sind, beziehungsweise frühzeitig untergehen. Der Anteil untergegangener Zellen bleibt im
Blut, welches innerhalb einer Stunde verarbeitet wird, über den Zeitraum der Sortierung
hinweg annähernd konstant klein (s. Abb. 15). Der Anteil der untergegangenen Zellen
wurde durchflußzytometrisch durch Anfärbung mit Propidiumiodid (DNA-Farbstoff)
Untergegangene Zellen [% ]
bestimmt.
75
4 h alt
3,5 h alt
1 h alt
0,5 h alt
50
25
0
0
1
2
3
4
5
Meßpunkt
Meßpunkt
Sortierungsschritt
1
Nach dem ersten Waschschritt
2
Vor der ersten Anreicherung
3
Nach der ersten Anreicherung
4
Nach der zweiten Anreicherung (Ende der Isolierung)
Abb. 15 : Anteil abgestorbener Zellen an der Probenmenge zu verschiedenen Messzeitpunkten; der Anteil
der abgestorbenen Zellen wurde durchflußzytometrisch durch Anfärbung mit Propidiumiodid (DNAFarbstoff) bestimmt.
- 66 -
3. Ergebnisse
3.1.2. Generierung dendritischer Zellen aus CD34 positiven
Stammzellen durch den Einsatz von GM-CSF, SF und TNF-α
3.1.2.1. GM-CSF in der Generierung dendritischer Zellen
Die Zugabe von 10 ng/ml des Proliferations- und Differentationsfaktors GM-CSF zu
Kulturbeginn und am Tag sechs der Kultur führt nach 14 Tagen Kultur zur größten
Zellmenge angezüchteter Zellen (s. Abb. 16). Die Menge der übrigen Stimuli wurde
hierbei konstant gehalten. Die Zellmengen wurden nach 14 Tagen in einer NeubauerZählkammer nach Türks bestimmt, die Zelldifferenzierung anhand morphologischer
Kriterien im Lichtmikroskop beurteilt. Auch hier ergab sich 10 ng/ml GM-CSF als
günstigste Konzentration.
6.0×10 06
Zellzahl
5.0×10 06
Zellzahl
4.0×10 06
3.0×10 06
2.0×10 06
1.0×10 06
0.0×10 -00
100 ng / ml
10 ng / ml
1 ng / ml
0,1 ng / ml
Stimulus (GM-CSF) [ng/ml]
Abb. 16: Zellzahl nach 14 Tagen Kultur mit Einsatz verschiedener Mengen GM-CSF bei konstanter Menge
der übrigen Stimulantien; die Zellzahl wurde nach Färbung mit Türk´scher Lösung in der NeubauerZählkammer bestimmt; die Beurteilung der Zelldifferenzierung erfolgte lichtmikroskopisch.
3.1.2.2. Stammzellfaktor verdoppelt die Zellmenge dendritischer Zellen
Mit Einsatz von 10 ng/ml Stammzellfaktor zu Kulturbeginn und am Kulturtag sechs läßt
sich die Menge dendritischer Zellen nach 14 Tagen Kultur CD34 positiver Zellen bei
konstanter Menge der übrigen Stimulantien nahezu verdoppeln (s. Abb. 17). Die
Zellmenge wurde am Tag 14 der Kultur in der Neubauerzählkammer nach Anfärbung mit
Türk´scher Lösung bestimmt. Die Zelldifferenzierung ergab nach morphologischen
Kriterien im Lichtmikroskop keinen Unterschied.
- 67 -
3. Ergebnisse
Zellzahl
1.5×1007
1.0×1007
5.0×1006
0.0×10 -00
mit SF
ohne SF
Abb. 17: Zellzahl nach 14 Tagen Kultur mit oder ohne Einsatz von Stammzellfaktor bei konstanter Menge
der übrigen Stimulantien; die Zellzahl wurde nach Färbung mit Türk´scher Lösung in der NeubauerZählkammer bestimmt; die Beurteilung der Zelldifferenzierung erfolgte lichtmikroskopisch.
3.1.3.3. TNF-α vergrößert den Anteil CD1a-positiver Zellen
Der Anteil CD1a positiver Zellen ist nach 14 Tagen Anzucht CD34 positiver Zellen mit
TNF-α drei- bis viermal höher als ohne (s. Abb. 18). Die zugegebene Menge der übrigen
Stimulantien
wurde
konstant
gehalten.
Der
Anteil
CD1a+
-Zellen
wurde
durchflußzytometrisch mit einem entsprechenden monoklonalen Antikörper bestimmt.
Die Zellmengen wurden nach 14 Tagen in einer Neubauer-Zählkammer (Färbung nach
Türks) bestimmt. Sie waren in beiden Ansätzen annähernd gleich groß.
CD1a positive Zellen [%]
60
SF,GM-CSF,TNF-alpha
SF, GM-CSF
45
30
15
0
SF,GM-CSF,TNF-alpha
SF, GM-CSF
Abb. 18: Anteil CD1a positiver Zellen nach 14 Tagen Kultur CD34 positiver Zellen mit oder ohne TNF-α
bei konstanten Mengen der übrigen Stimuli; die CD1a-Expression wurde durchflußzytometrisch bestimmt;
die Zellmenge, in der Neubauer-Kammer ermittelt, war in beiden Ansätzen vergleichbar.
- 68 -
3. Ergebnisse
3.1.3.4. Verschiedene Zytokine führen zu unterschiedlich differenzierten
Zellen
Der Einsatz verschiedener Zytokine führt zu unterschiedlich ausdifferenzierten Zellen am
Kulturtag 14.
Bei
isolierter
Zugabe
von
Stammzellfaktor
entwickeln
die
Zellen
kaum
Differenzierungsmarker, reifen also nur wenig aus.
Die zusätzliche Zugabe von GM-CSF zum Stammzellfaktor führt zu einer geringen
Ausprägung der Oberflächenmoleküle CD1a und CD14.
Die Kombination von SF, GM-CSF und TNF-α führt zur deutlich höchsten Ausprägung
des Oberflächenmoleküls CD1a, bei relativ geringer CD14 Ausprägung.
Der Zusatz von M-CSF führt zwar unabhängig vom Zugabezeitpunkt und in einer
gewissen Zugabemenge zu einer hohen CD14 Ausprägung, jedoch kommt es immer auch
zu
einer
Ausbildung
des
CD1a-Moleküls.
Als
günstigster
Cocktail
zur
Monozyten/Makrophagenzucht, bei gleichzeitig möglichst geringer Kontamination mit
CD1a positiven Zellen, ergab sich die Zugabe von 20 Units M-CSF zu 1,25x105 Zellen
pro 200 µl Kulturmedium (s. Abb. 19).
% der Zellen CD1a
% der Zellen CD14
Oberflächenmarker positive Zellen in %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
SF
+
+
+
+
+
+
GM-CSF
+
+
+
+
+
+
TNF-α
M-CSF
5U/ml
1. Tag
10. Tag
20U/ml
1. Tag
Abb. 19: Oberflächenmarker nach 14 Tagen Anzucht mit verschiedenen Stimuluscocktails
- 69 -
+
+
10. Tag
3. Ergebnisse
3.1.3. Das Kulturergebnis ist abhängig vom LPS-Gehalt des FCS
3.1.3.1. Die CD1a -Expression ist abhängig von fetalem Kälberserum
Das in dem Medium verwendete FCS beeinflußt die Zelldifferenzierung. Nach 14tägiger
Kultur läßt sich, abhängig von der FCS-Charge, ein unterschiedlicher Anteil CD1apositiver Zellen nachweisen. Mit einem der eingesetzten FCS war keine Anzucht von
CD1a positive Zellen [%]
Zellen möglich (s. Abb. 20).
CD1a in %
30
20
10
0
8L07
435L
417L
901B
Charge fetales Kälberserum
Abb. 20: Einfluß des verwendeten fetalen Kälberserums auf die CD1a Expression
3.1.3.2. Das Kultivierungsergebnis hängt vom LPS-Gehalt der FCS ab
Verschiedene fetale Kälbersera haben einen unterschiedlich hohen Gehalt an LPS. Die
Höhe der Verunreinigung korreliert mit der Ausprägung des Oberflächenantigens CD1a
auf den dendritischen Zellen. In FCS ohne LPS war keine Anzucht von Zellen möglich.
LPS [pg/ml]
3000
LPS-Gehalt
2000
1000
0
8L07
435L
417L
901B
Charge fetales Kälberserum
Abb. 21: LPS-Gehalt verschiedener fetaler Kälbersera
- 70 -
3. Ergebnisse
3.2. Merkmale dendritischer Zellen
3.2.1. Visueller Nachweis
Lichtmikroskopisch zeigten die mit GM-CSF, TNF-α und SF die typischen
morphologischen Kennzeichen dendritischer Zellen. Hierzu zählen die charakteristischen
Ausläufer, die Zellgröße, das dichte, granulierte Zytoplasma, und der große Zellkern.
Neben diesen Zellen mit dendritenartigem Äußeren fanden sich noch Zellen mit
andersartigen Morphen.
a)
b)
Abb. 22: Morphologie der angezüchteten Zellen an Tag 14 der Kultur mit GM-CSF, TNF-α und SF;
Darstellung im Lichtmikroskop a) 20fache Vergrößerung b) 40fache Vergrößerung.
3.2.2. Nur dendritische Zellen regen durch Clusterbildung naive
T-Zellen zur Proliferation und Zytokinbildung an
3.2.1.1. Gewinn von T-Zellen aus peripherem Blut und Nabelschnurblut
T - Lymphozyten lassen sich durch eine positive MAC-Sortierung mit einer Reinheit von
über 99 % aus Blutzellgemischen isolieren. Diese Methode ist sowohl bei mononukleären
Nabelschnurblutzellen, als auch bei adulten peripheren mononukleären Zellen
anzuwenden. Von den gereinigten Nabelschnurblutzellen sind über 95% positiv für das
Oberflächenantigen CD45RA, einem Marker für naive Zellen. Periphere T-Zellen sind zu
95 %mit dem Oberflächenantigen CD45RO gekennzeichnet (Memory-T-Zellen).
- 71 -
3. Ergebnisse
3.2.1.2. Dendritischen Zellen bilden mit T-Zellen Cluster
Gemeinsam eingesetzte dendritische Zellen und T-Zellen bildeten innerhalb weniger
Stunden wolkenartige Komplexe (sog. Cluster). Im Laufe der Kulturperiode lagern sich
immer mehr Zellen zu immer größeren Komplexen zusammen. Andere Stimulatorzellen
waren nicht in der Lage, derartige Komplexe mit naiven T-Zellen zu bilden.
a)
b)
Abb. 23: Dendritische Zellen bilden mit naiven T-Zellen wolkenartige Komplexe; a) Anlagerung von TZellen an eine dendritische Zelle nach 6h b) Bildung großer Komplexe aus mehreren dendritischen Zellen
und T-Zellen Nach 24 Stunden.
- 72 -
3. Ergebnisse
3.2.1.3. Nur dendritische Zellen aktivieren naive T-Zellen
CD33 positiv sortierte Monozyten aus peripherem Blut regen naive T-Zellen nicht zur
Proliferation an. Dendritische Zellen dagegen aktivieren, abhängig von ihrer Anzahl, aber
auch schon in kleinen Mengen, naive T-Zellen. Die Aktivierung wurde durch Messung
der Proliferationsrate nach zwei Tagen gemeinsamer Kultur von dendritischen Zellen
bzw. Monozyten mit naiven T-Zellen bestimmt. Die Proliferationsratenbestimmung
erfolgte durch Messung des Zerfalls radioaktiven 3 H-Thymidins in der DNA während der
DNA-Synthesephase der Zellteilung. Die Monozyten bzw. dendritischen Zellen wurden
vor Einsatz in die Kultur zur Hemmung ihrer Replikationsfähigkeit mit Mitomycin C
100000
Monzyten
DC
75000
50000
25000
3
H-Thymidineinbau [cpm]
behandelt (s. Abb. 24).
0
5
50
500
5000
50000
Menge APC
Abb. 24: Vergleich der Proliferationsrate durch Messung des ß-Zerfalls des eingebauten 3 H-Thymidin nach
zwei Tagen Kultur von 2,5 x 104 naiven T-Zellen durch Stimulation mit Monozyten oder dendritischen
Zellen in verschiedenen Mengen in der MLR.
- 73 -
3. Ergebnisse
3.2.1.4. Nur dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen Zytokine
Dendritische Zellen sind nach einer Kulturdauer von sieben Tagen in der Lage, in naiven
Zellen die Ausbildung eines Th1- und Th2-Musters zu induzieren. Monozyten dagegen
sind nicht in der Lage, naive Zellen zur Ausbildung eines Th2-Musters anzuregen. Der
Anteil der Th1-Zellen ist nach Kontakt mit dendritischen Zellen ebenfalls sehr viel
größer.
3.2.1.4.1. Nur dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen Interferon-γ
Dendritische Zellen sind CD33 positiv sortierten Zellen aus peripherem Blut deutlich in
der IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen überlegen. Die Zellen waren über sieben Tage
gemeinsam im Sinne einer MLR in Kultur. Die Zytokine wurden durchflußzytometrisch
intrazellulär bestimmt (s.Abb. 25).
Zytokinproduzierende
Zellen [%]
25
DC
Monos
Monozyten
20
15
10
5
0
5
50
500
5000
50000
APZ-Menge
APC-Menge
Abb. 25: Vergleich der IFN-γ Induktion in 1 x 105 naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit
Monozyten oder dendritischen Zellen in der MLR und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und
Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
- 74 -
3. Ergebnisse
3.2.1.4.2. Nur dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen IL-4
Im Gegensatz zu CD33 positiv sortierten Zellen aus peripherem Blut sind dendritische
Zellen in der Lage, in naiven T-Zellen eine IL-4-Produktion zu induzieren (Th2-Muster).
Die Zellen waren über sieben Tage gemeinsam im Sinne einer MLR in Kultur. Die
IL-4 produzierende Zellen [%]
Zytokine wurden durchflußzytometrisch intrazellulär bestimmt (s. Abb. 26).
DC
Monozyten
Mo
5.0
2.5
0.0
1
10
100
1000
10000
100000
Menge der antigenpräsentierenden Zellen
Abb. 26: Vergleich der IL-4 Induktion in 1 x 105 naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit
Monozyten oder dendritischen Zellen in der MLR und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und
Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
- 75 -
3. Ergebnisse
3.2.3. Dendritische Zellen sind stärkste Proliferations- und
Zytokininduktoren peripherer (Memory-) T-Zellen
3.2.3.1. Akzessorische (E- -) Zellen aktivieren Memory-T-Zellen
Durch das Verfahren der Zellrosettierung gewonnene akzessorische Zellen (E-) können
T-Zellen (E+-Zellen) zu Proliferation anregen. Die Zellen wurden zwei Tage gemeinsam
kultiviert und die Proliferation durch den Einbau von 3 H-Thymidin gemessen. Nur hohe
Zahlen akzessorischer Zellen konnten eine meßbare Proliferation induzieren (s. Abb. 27).
1 x 105 T - Zellen
4
5 x 10 T - Zellen
4
2,5 x 10 T - Zellen
4000
3000
2000
1000
3
H-Thymidineinbau [cpm]
5000
0
1
10
100
1000
10000
100000
Anzahl Stimulatorzellen
Abb. 27: Messung der Proliferation von peripheren T-Zellen (E+-Zellen) durch 3 H-Thymidineinbau nach 2
Tagen Stimulation mit akzessorischen Zellen (E- -Zellen) (Mittelwert aus drei Messansätzen mit jeweils
drei Messreihen) mit verschiedenen Responder- und Stimulatorzellmengen.
- 76 -
3. Ergebnisse
3.2.3.2. Dendritische Zellen aktivieren Memory-T-Zellen
In der MLR regen dendritische Zellen periphere (Memory-)T-Zellen zur Proliferation an.
Die Zellen waren gemeinsam zwei Tage in Kultur (s. Abb. 28) und die Proliferationsrate
100000
75000
50000
25000
3
H-Thymidineinbau [Cpm]
wurde über den Einbau von 3 H-Thymidin gemessen.
0
5.0
50.0
500.0
5000.0
50000.0
Menge der dendritischen Zellen
Abb. 28: Messung der Proliferationsrate von peripheren (Memory-)T-Zellen durch 3 H-Thymidineinbau
nach zwei Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen bei verschiedenen Responder- und Stimulatorzellmengen.
Dendritische Zellen sind über mehrere Tage in der Lage, periphere (Memory-)T-Zellen
zur Proliferation anzuregen. Dabei hängt die Stärke der Reaktion von der Anzahl der
Stimulatorzellen ab (s. Tab. 5).
Tab. 5: Messung der Proliferation *
Menge der
3
dendritischen Zellen
[Counts per minute]
[Counts per minute]
[Counts per minute]
Zwei Tage Stimulation
Drei Tage Stimulation
Vier Tage Stimulation
0
H-Thymidineinbau
3
H-Thymidineinbau
3
H-Thymidineinbau
425 (± 25)
296 (± 24)
471 (± 13)
500
3545 (± 121)
3659 (± 354)
2005 (± 312)
5000
31723 (± 1112)
23154 (± 911)
10355 (± 501)
50000
66339 (± 2534)
56644 (± 2121)
13165(± 987)
*
Messung von 2,5 x 104 peripheren T-Zellen durch 3 H-Thymidineinbau nach Stimulation mit verschie-
denen Mengen dendritischer Zellen (Mittelwert aus drei Meßansätzen mit jeweils drei Meßreihen)
- 77 -
3. Ergebnisse
3.2.3.3. Die Proliferationsrate peripherer (Memory-) T-Zellen ist abhängig
vom Anteil CD1a tragender Stimulatorzellen
Die Proliferationsrate von peripheren (Memory-) T-Zellen ist abhängig von den
Stimulatorzellen. Je größer der Anteil CD1a positiver Zellen in der Stimulatorzellgruppe,
desto höher ist die Proliferationsrate. Demzufolge sind dendritische Zellen wesentlich
stärkere Stimulatoren der Proliferation als andere akzessorische Zellen. Der Anteil CD1a
positiver rossettierter Zellen betrachtet ca. 1 %. Bei den kultivierten Zellen ist die
Expression von CD1a abhängig von den Kulturbedingungen. Mit TNF-α gezüchtete
Zellen exprimieren deutlich höher CD1a und sind auch wesentlich stärkere
Stimulatorzellen. Die Zellen waren gemeinsam 2 Tage in Kultur und die
Proliferationsrate wurde durch den Einbau von 3 H-Thymidin gemessen (s. Abb. 29).
E- als APC
CD1a : 40,3 %
CD1a : 11 %
75000
50000
25000
3
H-Thymidineinbau [Cpm]
100000
0
5
50
500
5000
50000
Menge der APC
Abb. 29: Vergleich der Proliferationsraten mit unterschiedlichen Stimulatorzellen unter den sonst üblichen
Bedingungen. Die E- -Zellen wurden durch Rosettierung gewonnen, die CD1a: 40,3 % positiven Zellen
durch Anzucht mit GM-CSF, SF und TNF-α und die CD1a: 11 % positiven Zellen durch Kultur nur mit
GM-CSF und SF. Die Messung der Proliferationsrate von 2,5 x 104 eingesetzten peripheren T-Zellen durch
3
H-Thymidineinbau nach Stimulation mit verschiedenen Mengen APC.
- 78 -
3. Ergebnisse
3.2.3.4. Zytokininduktion von Memory-T-Zellen durch akzessorische (E-) Zellen
Akzessorische Zellen als Stimulatorzellen der MLR induzieren in peripheren T-Zellen
eine schwache Th1- und Th2-Zytokinproduktion. Die Zellen waren sieben Tage
gemeinsam in Kultur; am siebten Tag wurden die intrazellulären Zytokine via
Durchflußzytometer ermittelt (s. Abb. 30).
Zytokinproduzierende
Zellen [%]
10
IFN-Gamma
IL-4
5
0
5
50
500
5000
50000
Anzahl der Stimulatorzellen
Abb. 30: Durchflußzytometrische Messung der intrazellulären Zytokinproduktion in peripheren (Memory)
T-Zellen nach sieben Tagen Stimulation mit akzessorischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA
(10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
- 79 -
3. Ergebnisse
3.2.3.5. Zytokininduktion durch dendritische Zellen in Memory-T-Zellen
3.2.3.5.1. Anteil der zur Zytokinproduktion angeregten T-Zellen am siebten
Kulturtag mit dendritischen Zellen
Dendritische Zellen können in der MLR in peripheren T-Zellen eine Zytokinproduktion
induzieren. Es erfolgt dabei eine Ausbildung sowohl eines Th1- (Leitzytokine IFN-γ und
IL-2) als auch eines Th2-Musters (IL-4 und IL-5). Das Th1-Muster findet sich jedoch in
einem wesentlich größeren Anteil der Zellen.
Die Zellen waren sieben Tage gemeinsam im Sinne einer MLR in Kultur; anschließend
wurden die intrazellulären Zytokine via Durchflußzytometer ermittelt (s. Abb. 31).
Zytokinproduzierende
Zellen [%]
30
IFN-Gamma
IL-2
IL-4
IL-5
20
10
0
5
50
500
5000
50000
Menge dendritischer Zellen
Abb. 31: Durchflußzytometrische Messung der intrazellulären Zytokinproduktion in peripheren T-Zellen
nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml)
und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
- 80 -
3. Ergebnisse
3.2.3.5.2. Höhere Zahlen dendritischer Zellen vergrößern den Th2-Anteil
Der Anteil sich ausbildender Th1-Zellen (Leitzytokine IL-2 und Interferon- γ) ist nicht so
stark von der Menge der eingesetzten dendritischen Zellen abhängig wie der Anteil Th-2Zellen (IL-4 und IL-5). Es kommt zu einer relativ größeren Zunahme der Th2-Zellen
durch Erhöhung der Stimulatorzellzahl. Der Th1-Anteil bleibt dagegen relativ konstant (s.
Veränderung des prozentualen
Anteils zytokinproduzierender
Zellen [%]
Abb. 32).
500
IFN-γ
IL-2
IL-4
IL-5
400
300
200
100
0
5.0
50.0
500.0
5000.0
50000.0
Menge der dendritischen Zellen
Abb. 32: Relative Veränderung des Anteils der zytokinproduzierenden Zellen an der Gesamtzellmenge
(Spontanaktivität = 100 %)
- 81 -
3. Ergebnisse
3.2.3.6. Dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellenstärker Zytokine
als akzessorische Zellen
3.2.3.6.1. IFN-γ
Dendritische Zellen sind wesentlich stärkere Interferon- γ-Induktoren in naiven Zellen als
IFN-γ produzierende Zellen
[%]
andere Zellen. (s. Abb. 33).
EDC
30
20
10
0
5
50
500
5000
50000
Menge der APC
Abb. 33: Vergleich der IFN-γ Induktion in peripheren T-Zellen durch dendritische Zellen oder durch
Rosettierung gewonnene akzessorische Zellen (E- -Zellen) nach sieben Tagen Stimulation und 5 Stunden
Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
3.2.3.6.2. IL-4
Dendritische Zellen wirken als wesentlich stärkere Induktoren für IL-4 in naiven Zellen
Ι L-4 produzierende Zellen
[%]
als andere Zellen. (s. Abb. 34)
EDC
7.5
5.0
2.5
0.0
5
50
500
5000
50000
Menge der APZ
Abb. 34: Vergleich der IL-4 Induktion in peripheren T-Zellen durch dendritische Zellen oder durch
Rosettierung gewonnene akzessorische Zellen (E- -Zellen) nach sieben Tagen Stimulation und 5 Stunden
Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
- 82 -
3. Ergebnisse
3.3. Nur dendritische Zellen induzieren IL-4 und IFN-γ in
Nabelschnurzellen;
NK-Zellen
sind
die
ersten
zytokinproduzierenden Zellen
3.3.1. Nur dendritische Zellen induzieren in Nabelschnurblutzellen in der PCR nachweisbar IL-4
Selbst in der extrem sensitiven PCR gelang der Zytokinnachweis nur durch den Einsatz
von dendritischen Zellen. Selbst die kleinste eingesetzte Menge dendritischer Zellen war
in der Lage sowohl IL-4 als auch IFN-γ zu induzieren. Durch den Einsatz CD33 positiver,
periphere Monozyten gelang lediglich eine schwache Induktion von IFN-γ; IL-4 war nicht
zu induzieren (s. Abb. 35).
bpStandard
leer
IFN-γ
IL-4
5000 DZ
IL-4
IFN-γ
500 DZ
leer
IL-4
50 DZ
IFN-γ
IL-4
5000 Mo
Abb. 35: PCR-Untersuchung zum Nachweis von IFN-γ und IL-4
- 83 -
IFN-γ
leer
bpStandard
3. Ergebnisse
3.3.2. Die Zytokinproduktion und -sekretion in mononukleären
Nabelschnurblutzellen und den darin enthaltenen CD3 positiven
Zellen ist am siebten Kulturtag maximal
3.3.2.1. Maximum der IFN-γ-Produktion und -sekretion in mononukleären
Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag
Dendritische Zellen induzieren in mononukleären Nabelschnurblutzellen IFN-γ. Sowohl
intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe der
ELISA-Technik, ist eine deutliche Zunahme des IFN-γ im Laufe der gemeinsamen
Kulturperiode zu erkennen. Der Höhepunkt dieser Produktion wird am 7. Tag nach
gemeinsamer Kultur mit dendritischen Zellen erreicht (s. Abb. 36).
DC + CBMC FACS
DC + CBMC ELISA
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
10000
7500
50
5000
25
2500
0
Zytokine im Überstand
[pg/ml]
75
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 36: Dendritische Zellen induzieren die Produktion und Sekretion von IFN-γ in mononukleären
Nabelschnurblutzellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kulturperiode; die intrazellulären Zytokine
wurden nach entsprechend langer Stimulationszeit mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation
mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch
bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach
entsprechend langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml)
und Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 84 -
3. Ergebnisse
3.3.2.2. Maximum der IL-4-Produktion und -Sekretion in mononukleären
Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag
Dendritische Zellen als Stimulatorzellen induzieren IL-4 in mononukleären Nabelschnurblutzellen. Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe der ELISA-Technik, ist eine Zunahme des IL-4 im Laufe der Kulturperiode zu erkennen.
Das Maximum dieser Produktion wird am siebten Tag gemeinsamer Kultur dendritischer
Zellen mit mononukleären Nabelschnurblutzellen erreicht (s. Abb. 37).
DC + CBMC FACS
DC + CBMC ELISA
IL-4 produzierende
Zellen [%]
75
50
5
25
0
Zytokine im Überstand
[pg/ml]
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 37: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IL-4 in mononukleären
Nabelschnurzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach
entsprechend langer Stimulationszeit mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10
ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die
extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach entsprechend
langer Stimulationszeit mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und
Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 85 -
3. Ergebnisse
3.3.2.3. Maximum der IFN-γ-Produktion und -Sekretion der CD3 positiven
Zellen der mononukleären Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag
Naive T-Zellen als Anteil mononukleärer Nabelschnurblutzellen verhalten sich
hinsichtlich der IFN-γ-Produktion anders als die Gesamtmenge der mononukleären
Zellen. Ihr Anteil IFN-γ-produzierender Zellen ist zu Beginn der Kulturzeit niedriger als
der Anteil der Gesamtmenge, am Ende höher.
Die
IFN-γ-Produktion
wurde
durchflußzytometrisch
bestimmt
und
das
Oberflächenantigen CD3 als T-Zell-Marker dazu korreliert betrachtet, so daß diese Zellart
einzeln analysiert werden konnte (s. Abb. 38).
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
60
CBMC + DC
CD3+ in CBMC + DC
45
30
15
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 38: Anteil der IFN-γ-produzierenden T-Zellen an den mononukleären Nabelschnurblutzellen zu
verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine und das Oberflächenantigen CD 3 wurden
nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10
ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt .
- 86 -
3. Ergebnisse
3.3.2.4. Maximum der IL-4-Produktion und -Sekretion der CD3 positiven
Zellen der mononukleären Nabelschnurblutzellen ist der siebte Kulturtag
Naive T-Zellen als Anteil der mononukleären Nabelschnurblutzellen verhalten sich
hinsichtlich der IL-4-Produktion genauso wie die Gesamtmenge der Zellen. Die IL-4Produktion wurde durchflußzytometrisch bestimmt und das Oberflächenantigen CD3 als
T-Zell-Marker dazu korreliert betrachtet (s. Abb. 39).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
7.5
CBMC + DC
CD3+ in CBMC + DC
5.0
2.5
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 39: Anteil der IL-4-produzierenden T-Zellen an mononukleären Nabelschnurblutzellen, die zu
verschiedenen Kulturzeitpunkten zur Zytokinproduktion stimuliert wurden; die intrazellulären Zytokine und
das Oberflächenantigen CD 3 wurden nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5
Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
durchflußzytometrisch bestimmt .
- 87 -
3. Ergebnisse
3.3.3. Maximum der Zytokinproduktion und -sekretion der
CD45RA positiven Zellen sind der vierte (IFN-γ) und siebte
Kulturtag (IL-4)
3.3.3.1. Maximum der IFN-γ-Produktion und -Sekretion der CD45RA
positiven Zellen ist der vierte Kulturtag
Durch dendritische Zellen läßt sich in das Oberflächenantigen CD45RA tragenden Zellen
die Produktion von IFN-γ induzieren. CD45RA tragende Zellen wurden durch eine
negative MAC-Sortierung aus Nabelschnurblut isoliert.
Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe
der ELISA-Technik, ist während der Kulturperiode ein zeitlicher Verlauf zuerkennen.
Bereits zu Kulturbeginn liegen hohe IFN-γ-Produktion und Sekretion vor (s. Abb. 40).
DC + RA pos FACS
DC+RA pos ELISA
1250
1000
20
750
500
10
250
0
IFN-γ im Überstand
[pg/ml]
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
30
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 40: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IFN-γ in CD45RA positiven
Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer
Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1
µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine
wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 88 -
3. Ergebnisse
3.3.3.2. Maximum der IL-4-Produktion und -Sekretion der CD45RA positiven
Zellen ist der siebte Kulturtag
Durch dendritische Zellen läßt sich in das Oberflächenantigen CD45RA tragenden Zellen
die Produktion von IL-4 induzieren. Die CD45RA tragenden Zellen wurden durch eine
Depletion der CD45RO-Zellen aus Nabelschnurblut isoliert.
Sowohl intrazellulär, mit Hilfe der Durchflußzytometrie, als auch extrazellulär, mit Hilfe
der ELISA-Technik, ist eine zeitabhängige Zunahme des IL-4 zu erkennen.
Der Höhepunkt dieser Produktion wird am siebten Tag gemeinsamer Kultur dendritischer
Zellen mit CD45RA positiven Zellen erreicht (s. Abb. 41).
DC + RA pos FACS
DC + RA pos ELISA
10.0
7.5
5.0
5.0
2.5
2.5
0.0
IL-4 im Überstand
[pg/ml]
IL-4 produzierende
Zellen [%]
7.5
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 41: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion von IL-4 in CD45RA positiven Zellen zu
verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden langer Stimulation
mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die extrazellulären Zytokine wurden mit
Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen
und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 89 -
3. Ergebnisse
3.3.4. Die Zytokinproduktion und -sekretion in Natürlichen
Killerzellen erreichen ihr Maximum am zweiten Kulturtag
3.3.4.1. Die IFN-γ-Produktion und -Sekretion in Natürlichen Killerzellen
erreichen ihr Maximum am zweiten Kulturtag
Durch dendritische Zellen läßt sich in Natürlichen Killerzellen die Produktion von IFN-γ
induzieren. Die Natürlichen Killerzellen wurden durch eine negative MAC-Sortierung aus
Nabelschnurblut isoliert.
Sowohl intrazellulär durchflußzytometrisch, als auch extrazellulär mit Hilfe der ELISATechnik, ist eine zeitliche Zunahme des IFN-γ zu erkennen.
Der Höhepunkt der Produktion wird am zweiten Tag nach gemeinsamer Kultur mit
dendritischen Zellen erreicht (s. Abb. 42).
DC + NK FACS
DC + NK ELISA
2000
1500
50
1000
25
500
0
IFN-γ im Überstand
[pg/ml]
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
75
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 42: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IFN-γ in Natürlichen
Killerzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden
langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und
Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die
extrazelluläre Zytokinkonzentration wurde mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach
verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml)
und Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 90 -
3. Ergebnisse
3.3.4.2. Das Maximum der IL-4-Produktion in Natürlichen Killerzellen ist der
vierte Kulturtag, der Sekretionshöhepunkt der zweite
Dendritische Zellen induzieren in Natürlichen Killerzellen die Produktion und Sekretion
von IL-4. Intrazellulär durchflußzytometrisch und extrazellulär, mit Hilfe der ELISATechnik, ist ein zeitlicher Verlauf des IL-4 zu erkennen.
Der Höhepunkt der Sekretion wird nach zwei Tagen gemeinsamer Kultur dendritischer
Zellen mit NK-Zellen erreicht. Intrazellulär ist der Produktionshöhepunkt dagegen an
Kulturtag vier. Die wenigen anfangs IL-4 produzierenden Zellen sezernieren also mehr
IL-4 als die später mit der Produktion einsetzenden zahlreichen Zellen (s. Abb. 43).
7.5
15
5.0
10
2.5
5
0.0
IL-4 im Überstand
[pg/ml]
Ι L-4 produzierende
Zellen [%]
DC + NK FACS
DC + NK ELISA
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 43: Durch dendritische Zellen induzierte Produktion und Sekretion von IL-4 in Natürlichen
Killerzellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach verschieden
langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und
Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt; die
extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISA-Technik im Kulturüberstand nach verschieden langer
Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1
µM) ermittelt.
- 91 -
3. Ergebnisse
3.3.5. Natürliche Killerzellen sind die ersten
zytokinproduzierenden Zellen des Nabelschnurblutes
3.3.5.1. Natürliche Killerzellen sind die ersten IFN-γ-Produzierenden Zellen
des Nabelschnurblutes
Die Produktion von IFN-γ setzt zuerst in den Natürlichen Killerzellen ein. In ihnen läßt
sich durchflußzytometrisch IFN-γ wesentlich früher nachweisen als in den anderen
Zellgruppen. Sowohl die mononukleären Nabelschnurblutzellen, als auch die CD45RA
IFN-γ produzierende Zellen
[%]
positiven Zellen setzen wesentlich später mit der IFN-γ-Produktion ein (s. Abb. 44).
DC + NK FACS
DC + RA pos FACS
DC + CBMC FACS
75
50
25
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 44: Vergleich der intrazellulären Produktion von IFN-γ verschiedener Zellgruppen nach Stimulation
mit dendritischen Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach
verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml)
und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt
- 92 -
3. Ergebnisse
3.3.5.2. IL-4 wird von NK-Zellen, CD45RA-positiven Zellen und der
Gesamtmenge
der
mononukleären
Nabelschnurblutzellen
annähernd
zeitgleich produziert
IL-4 wird von den untersuchten Zellgruppen in annähernd gleichen zeitlichen Abläufen
IL-4 produzierende Zellen
[%]
produziert (s. Abb. 45).
DC + NK FACS
DC + RA pos FACS
DC + CBMC FACS
7.5
5.0
2.5
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 45: Vergleich der intrazellulären Produktion von IL-4 verschiedener Zellgruppen nach Stimulation
mit dendritischen Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die intrazellulären Zytokine wurden nach
verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml)
und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 93 -
3. Ergebnisse
3.3.6. Natürliche Killerzellen sind die ersten zytokinsezernierenden Zellen des Nabelschnurblutes
3.3.6.1. Natürliche Killerzellen sind die ersten IFN-γ sezernierenden Zellen
des Nabelschnurblutes
Die Natürlichen Killerzellen sind die Zellgruppe, die als erste in der Lage sind, IFN-γ zu
sezernieren. Ihnen folgen dann die CD45RA positiven Zellen und zum Schluß die
Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurblutzellen. Diese Zellen sezernieren dafür
sehr große Mengen IFN-γ (s. Abb. 46).
DC + NK ELISA
DC + CBMC ELISA
DC + RA pos ELISA
IFN- γ im Überstand [pg /
ml]
7500
5000
2500
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 46: Vergleich der Sekretion von IFN-γ verschiedener Zellgruppen nach Stimulation mit dendritischen
Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISATechnik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden
Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 94 -
3. Ergebnisse
3.3.6.2. IL-4 wird von Nabelschnurblutzellen annähernd gleichzeitig
sezerniert
IL-4 wird von den untersuchten Zellgruppen in annähernd gleichen zeitlichen Abläufen
produziert 4 (s. Abb. 47). Die CBMC produzieren allerdings gegen Kulturende weit
größere Mengen als die anderen Zellgruppen.
IL-4 im Überstand [pg / ml]
DC + CBMC ELISA
DC + RA pos ELISA
DC + NK ELISA
75
50
25
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag
Abb. 47: Vergleich der Sekretion von IL-4 verschiedener Zellgruppen nach Stimulation mit dendritischen
Zellen zu verschiedenen Kulturzeitpunkten; die extrazellulären Zytokine wurden mit Hilfe der ELISATechnik im Kulturüberstand nach verschieden langer Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden
Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) ermittelt.
- 95 -
3. Ergebnisse
3.4. Zytokine und Zell-Zell-Kontakte bei der Induktion
von Zytokinen in naiven T-Zellen durch dendritische
Zellen
3.4.1. Die Zugabe eines Antikörpers gegen Interleukin-4
(Anti-IL-4) hemmt die Induktion von IL-4, nicht von IFN-γ
3.4.1.1. Anti-IL-4 beeinflußt die IFN-γ-Induktion in naiven T-Zellen durch
dendritische Zellen nicht
Die Zugabe unterschiedlicher Dosen eines Antikörpers gegen Interleukin-4 beeinflußt die
Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen nicht (s. Abb.48).
IFN-Gamma
IFN- γ produzierende
Zellen [%]
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
50
10
2
0,4
ohne
Anti-IL-4 [pg/ml]
Abb. 48: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-4 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die Zytokine wurden intrazellulär nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 96 -
3. Ergebnisse
3.4.1.2. Anti-IL-4 hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch
dendritische Zellen
Die Zugabe von Anti-IL-4 am Tag des Kokulturbeginns von dendritischen Zellen und
naiven T-Zellen hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen nach sieben Tagen
Stimulation mit dendritischen Zellen. Besonders wirkungsvoll ist die Hemmung mit 2 bis
10 pg/ml Anti-IL-4. Weniger effektiv ist die Hemmung mit größeren oder kleineren
Mengen (s. Abb. 49).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
4
IL-4
3
2
1
0
50
10
2
0,4
ohne
Anti-IL-4 [pg/ml]
Abb. 49: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-4 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 97 -
3. Ergebnisse
3.4.2. Die Zugabe eines Antikörpers gegen Interleukin 12 (Anti-IL12) hemmt die Induktion von IFN-γ und IL-4 in naiven T-Zellen
durch dendritische Zellen
3.4.2.1. Anti-IL-12 hemmt die Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch
dendritische Zellen
Die Zugabe von Anti-IL-12 am Tag des gemeinsamen Kulturbeginns hemmt die
Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen nach sieben Tage Stimulation mit dendritischen
Zellen. Diese Hemmung erfolgt unabhängig von der Antikörpermenge im getesteten
Bereich (s. Abb. 50).
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
7.5
IFN-Gamma
5.0
2.5
0.0
10
2
0,4
0,08
ohne
Anti-IL-12 [pg/ml]
Abb. 50: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-12 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritische Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen für sieben Tage und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1
µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 98 -
3. Ergebnisse
3.4.2.2. Anti-IL-12 hemmt die Induktion von IL-4 in naiven T-Zellen durch
dendritische Zellen
Die Zugabe von Anti-IL-12 am Tag des Kulturbeginns hemmt die Induktion von IL-4 in
naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen. Diese
Hemmung erfolgt unabhängig von der Antikörpermenge im getesteten Bereich
(s.Abb. 51).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
7.5
5.0
2.5
0.0
10
2
0,4
0,08
ohne
Anti-IL-12 [pg/ml]
Abb. 51: Einfluß verschiedener Mengen Anti-IL-12 auf die IL-4 Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 99 -
3. Ergebnisse
3.4.3. Antikörper gegen CD80 (Anti-CD80) hemmen die Induktion
von IFN-γ, aber nicht von IL-4 in naiven T-Zellen
3.4.3.1. Die Zugabe von Anti-CD80 hemmt die Induktion von IFN-γ
Die Zugabe von Anti-CD80 am Tag des gemeinsamen Kulturbeginns hemmt die
Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen
Zellen. Diese Hemmung erfolgt unabhängig von der Antikörpermenge (s. Abb. 52).
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
7.5
IFN-Gamma
5.0
2.5
0.0
20
4
0,8
0,16
ohne
Anti-CD80 [pg/ml]
Abb. 52: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD80 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 100 -
3. Ergebnisse
3.4.3.2. Die Zugabe von anti-CD80 beeinflußt die Induktion von IL-4 nicht
Die Zugabe von Anti-CD80 am Tag des Kulturbeginns beeinflußt die Induktion von IL-4
in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen nicht
(s. Abb. 53).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
7.5
IL-4
5.0
2.5
0.0
20
4
0,8
0,16
ohne
Anti-CD80 [pg/ml]
Abb. 53: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD80 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 101 -
3. Ergebnisse
3.4.4. Antikörper gegen CD86 (Anti-CD86) beeinflussen weder die
Induktion von IFN-γ noch von IL-4
3.4.4.1. Die Zugabe von Anti-CD86 beeinflußt die Induktion von IFN-γ nicht
Die Zugabe von Anti-CD86 am Tag des Kulturbeginns beeinflußt die Induktion von
IFN-γ in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen nicht
(s. Abb. 54).
IFN- γ produzierende
Zellen [%]
7.5
IFN-Gamma
5.0
2.5
0.0
20
4
0,8
0,16
ohne
Anti-CD86 [pg/ml]
Abb. 54: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD86 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 102 -
3. Ergebnisse
3.4.4.2. Die Zugabe von Anti-CD86 beeinflußt die Induktion von IL-4 nicht
Die Zugabe von Anti-CD86 am Tag des Kulturbeginns beeinflußt die Induktion von IL-4
in naiven T-Zellen durch sieben Tage Stimulation mit dendritischen Zellen nicht
(s. Abb. 55).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
7.5
IL-4
5.0
2.5
0.0
20
4
0,8
0,16
ohne
Anti-CD86 [pg/ml]
Abb. 55: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD86 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 103 -
3. Ergebnisse
3.4.5. Durch die gemeinsame Zugabe von Zytokinen und AntiZytokinen gelingt eine Th1- / Th2-Polarisierung
3.4.5.1. Die Zugabe von IL-4 und anti-IL-12 hemmt die Produktion von IFN-γ
Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen
exogen zugeführtem IL-4 (250 I.U./ml) und anti-IL-12 (2 pg/ml)
(optimale
Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutliche Reduktion des intrazellulär
messbaren IFN-γ (s. Abb. 56).
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
25
Kontrolle
IL-4 + αIL-12
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag
Abb. 56: Einfluß der optimalen Mengen Anti-IL-12 und IL-4 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach
sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation
mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 104 -
3. Ergebnisse
3.4.5.2. Die Zugabe von IL-4 und anti-IL-12 fördert die Produktion von IL-4
Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen
exogen zugeführtem IL-4 (250 I.U./ml) und anti-IL-12 (2 pg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutlich gesteigerte, intrazellulär meßbare IL4 Produktion (s. Abb. 57).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
30
Kontrolle
IL-4 + αIL-12
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag
Abb. 57: Einfluß der optimalen Mengen Anti-IL-12 und IL-4 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach
sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation
mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 105 -
3. Ergebnisse
3.4.5.3. Die Zugabe von IL-12 und anti-IL-4 fördert die Produktion von IFN-γ
Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen
exogen zugeführtem IL-12 (500 I.U./ml) und anti-IL-4 (2 µg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutliche Zunahme des intrazellulär messbaren
IFN-γ-produzierende Zellen [%]
IFN-γ (s. Abb. 58).
Kontrolle
40
αIL-4+IL-12
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag
Abb. 58: Einfluß der optimalen Mengen IL-12 und anti-IL-4 auf die IFN-γ-Induktion in naiven T-Zellen
nach sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach
Stimulation mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1
µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 106 -
3. Ergebnisse
3.4.5.4. Die Zugabe von IL-12 und anti-IL-4 hemmt die Produktion von IL-4
Stimuliert man T-Zellen mit dendritischen Zellen, findet sich bei bestimmten Mengen
exogen zugeführtem IL-12 (500 I.U/ml) und anti-IL-4 (2 pg/ml) (optimale Konzentrationen des getesteten Bereiches) eine deutliche Reduktion des intrazellulär messbaren
IL-4 (s. Abb. 59).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
15
Kontrolle
αIL-4+IL-12
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag
Abb. 59: Einfluß der optimalen Mengen Anti-IL-12 und IL-4 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach
sieben Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation
mit dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 107 -
3. Ergebnisse
3.4.6. Der CD40 Ligand ist zur Induktion von IFN-γ notwendig
Der Ausfall des CD40 Liganden auf peripheren T-Zellen führt zu einer Reduktion der
Interferon- γ-Synthese ohne Beeinflussung der IL-4-Synthese.
Die Untersuchungen wurden an CD45RA positiven T-Zellen von drei Patienten mit
gesichertem CD40 Liganden-Mangel durchgeführt. Diese Patienten sind von Geburt an
nicht in der Lage, den CD40 Liganden zu exprimieren, u.a. nicht auf ihren ansonsten
intakten T-Zellen. Die Patienten wurden klinisch durch Auftreten des Hyper-IgMSyndroms auffällig.
Die dendritischen Zellen und Kontroll-CD45RA-Zellen entstammten gesunden Menschen
Zytokinproduzierende
Zellen [%]
(s. Abb. 60).
25
Patienten
Kontrollen
20
15
10
5
0
IFN-Gamma
IL-4
Zytokin
Abb. 60: Vergleich der Zytokinproduktion in peripheren CD45RA positiven Zellen nach einer Woche
Stimulation
mit
dendritischen
Zellen
zwischen
Patienten
mit
CD40L-Mangel
und
gesunden
Kontrollpersonen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit dendritischen Zellen und 5
Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter Zugabe von Monensin (2,5 µM)
durchflußzytometrisch bestimmt.
- 108 -
3. Ergebnisse
3.4.7. Die MHC-TCR-Interaktion beeinflußt die IL-4-Produktion
3.4.7.1. Verstärkung der MHC-TCR-Interaktion verstärkt die IL-4-Produktion
Durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen CD3 in die oben beschriebene
gemischte Kultur von naiven T-Zellen mit dendritischen Zellen konnte eine verstärkte
Ausprägung des Th-2-Musters erzielt werden. Dieser Effekt war dosisabhängig
(s. Abb. 61).
IL-4 produzierende
Zellen [%]
30
IL-4
20
10
0
ohne
0,1 µg/ml
1 µg/ml
10 µg/ml
Anti-CD3 (OKT 3) Konzentration
Abb. 61: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD3 auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 109 -
3. Ergebnisse
3.4.7.2. Die MHC-TCR-Interaktion beeinflußt die IFN-γ-Produktion nicht
Durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen CD3 in die oben beschriebene
gemischte Kultur von naiven T-Zellen mit dendritischen Zellen beeinflußt das Th1Muster nicht (s. Abb. 62).
IFN-γ produzierende
Zellen [%]
30
IFN-γ
20
10
0
ohne
0,1 µg/ml
1 µg/ml
10 µg/ml
Anti-CD3 (OKT 3) Konzentration
Abb. 62: Einfluß verschiedener Mengen Anti-CD3 auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben
Tagen Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 110 -
3. Ergebnisse
3.5. Exogene Beeinflussung des Modells
3.5.1. IL-12-Induktion in dendritischen Zellen
3.5.1.1. LPS ist der stärkste IL-12-Induktor dendritischer Zellen
IL-12 ist in dendritischen Zellen nach 24 Stunden am stärksten durch LPS zu induzieren.
Die Zellen wurden vor der LPS Gabe 2 Stunden mit GM-CSF vorbehandelt. Ohne
Zugabe eines Stimulus war kein IL-12 nachweisbar. Die eingesetzten Substanzen wurden
in unterschiedlichen Konzentrationen getestet (s. Tab. 8 und Abb. 63).
Tab.8: Übersicht der eingesetzten Konzentrationen der verwendeten Stimuli ( fett: optimale Konzentration)
Substanz
eingesetzte
IL-12 produzierende
Konzentrationen
Zellen [%] (+ SEM)
ohne
GM-CSF
0,5 (+/- 0,2)
10 ng / ml
3,1 (+/- 0,4)
1 ng / ml
2,5 (+/- 0,7)
0,1 ng / ml
0,8 (+/- 0,3)
50 ng / ml
2,5 (+/- 0,3)
5 ng / ml
2,6 (+/- 0,2)
0,5 ng /ml
0,6 (+/- 0,2)
GM-CSF + TNF-α
10 ng / ml + 5 ng / ml
3,2 (+/- 0,2)
CD40 Ligand +
1 ng / ml
0,6 (+/- 0,2)
Verstärker (1µg / ml)
10 ng / ml
7,3 (+/- 0,9)
100 ng / ml
6,8 (+/- 0,7)
100 µg/ml (+10 ng/ml)
11,1 (+/- 0,6)
10 µg/ml (+10 ng/ml)
10,8 (+/- 0,5)
1 µg/ml (+10 ng/ml)
5,8 (+/- 0,5)
0,1 µg/ml (+10 ng/ml)
0,7 (+/-0,1)
TNF-α
LPS (+ GM-CSF)
- 111 -
3. Ergebnisse
IL-12
10
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-a
ohne
0
GM-CSF + LPS
5
GM-CSF
IL-12 produzierende
Zellen [%]
15
Abb. 63: Messung von IL-12 in dendritischen Zellen nach 24 Stunden Stimulation mit verschiedenen
Stimuli (Darstellung der optimalen Wirkkonzentration); die dendritischen Zellen wurden 24 Stunden mit
den angegebenen Stimulanzien inkubiert und 18 Stunden vor intrazellulärer, durchflußzytometrischer
Messung Brefeldin A zugegeben.
3.5.1.2. Die IL-12-Produktion ist 18 Stunden nach LPS-Gabe maximal
Da LPS als optimaler Stimulus zur IL-12 Induktion in den dendritischen Zellen ermittelt
werden konnte, wurde die Kinetik dieser Induktion untersucht. Dabei ergab sich, daß der
Anteil IL-12-produzierender dendritischer Zellen 18 Stunden nach LPS-Gabe maximal ist
(s. Abb. 64).
IL-12 produzierende
Zellen [%]
15
LPS
Kein Stimulus
ohne
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
Zeit [h]
Abb. 64: Messung von IL-12 in dendritischen Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von 10 µg
/ ml LPS (die Zellen wurden vorher zwei Stunden mit 10 ng/ml GM-CSF inkubiert); die Messung erfolgte
durchflußzytometrisch nach Zugabe von Brefeldin A.
- 112 -
3. Ergebnisse
3.5.2. Änderung der Oberflächenantigenexpression dendritischer
Zellen unter dem Einfluß verschiedener Substanzen
Die Einflüsse des CD40 Liganden und LPS nach Vorstimulation mit GM-CSF, sowie die
alleinige Wirkung von GM-CSF, TNF-α und GM-CSF gemeinsam mit TNF-α wurden
betrachtet. Messparameter waren die Ausreifungsmarker CD1a, CD14, CD83, MHC II
und die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86.
3.5.2.1. Das Oberflächenantigen CD1a
Der Einfluss von LPS bzw. des CD40 Liganden auf dendritische Zellen für 24 Stunden
führt zu einer deutlich erhöhten Expression des Oberflächenantigens CD1a. Auch GMCSF bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigen diesen Effekt, allerdings ist er hier wesentlich
CD1a
40
30
20
LPS + GM-CSF
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-a
0
GM-CSF
10
ohne
CD1a positive Zellen [%]
schwächer ausgeprägt (s. Abb. 65).
Abb. 65: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD1a; die dendritischen Zellen
wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächemolekül
durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt.
- 113 -
3. Ergebnisse
3.5.2.2. Das Oberflächenantigen CD14
Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40 Liganden für 24 Stunden
kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erniedrigten Expression des
Oberflächenantigens CD14. Auch durch TNF-α, GM-CSF bzw. GM-CSF mit TNF-α
wurde dieser Effekt erzielt, allerdings ist die Absenkung hier wesentlich schwächer
ausgeprägt (s. Abb. 66).
CD14
45
30
GM-CSF+ LPS
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-a
0
GM-CSF
15
ohne
CD14 positive Zellen [%]
60
Abb. 66: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD14; die dendritischen Zellen
wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächenmolekül
durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt.
- 114 -
3. Ergebnisse
3.5.2.3. Das Oberflächenantigen CD80
Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40L für 24 Stunden kommt es bei
bestimmten Konzentrationen zu einer leichten Verstärkung der Expression
des
Oberflächenantigens CD80. GM-CSF, TNF-α bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigten kaum
20
CD80
15
10
GM-CSF + LPS
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-alpha
0
GM-CSF
5
ohne
CD 80 positive Zellen [%]
einen Effekt (s. Abb. 67).
Abb. 67: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD80; die dendritischen Zellen
wurden 24 Stunden mit dem angegebenen Stimulus inkubiert und dann das Oberflächemolekül
durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt.
- 115 -
3. Ergebnisse
3.5.2.4. Das Oberflächenantigen CD83
Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40 Liganden für 24 Stunden
kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erhöhten Ausprägung des
Oberflächenantigens CD83. Auch GM-CSF, TNF-α bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigten
CD83
50
40
30
20
GM-CSF + LPS
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-alpha
0
GM-CSF
10
ohne
CD83 postive Zellen [%]
diesen Effekt, allerdings ist er hier wesentlich schwächer ausgeprägt (s. Abb. 68).
Abb. 68: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD83; die dendritischen Zellen
wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächemolekül
durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt.
- 116 -
3. Ergebnisse
3.5.2.5. Das Oberflächenantigen CD86
Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS bzw. des CD40 Liganden für 24 Stunden
kommt es bei bestimmten Konzentrationen zu einer deutlich erhöhten Ausbildung des
Oberflächenantigens CD86. GM-CSF bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigten keinen Effekt (s.
Abb. 69).
CD86
30
20
GM-CSF + LPS
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-alpha
0
GM-CSF
10
ohne
CD86 positive Zellen [%]
40
Abb. 69: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens CD86; die dendritischen Zellen
wurden 24 Stunden mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das Oberflächenmolekül
durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt.
- 117 -
3. Ergebnisse
3.5.2.6. Das Oberflächenantigen HLA-DR (MHC II)
Unter dem Einfluß von GM-CSF mit LPS und dem CD40L für 24 Stunden kommt es bei
bestimmten
Konzentrationen
zu
einer
deutlich
erhöhten
Ausbildung
des
Oberflächenantigens HLA-DR. Auch GM-CSF allein bzw. GM-CSF mit TNF-α zeigt
diesen Effekt, allerdings ist er hier wesentlich schwächer ausgeprägt (s. Abb. 70).
HLA-DR
2000
GM-CSF + LPs
CD40Ligand
GM-CSF + TNF-a
TNF-alpha
0
GM-CSF
1000
ohne
HLA-DR [Mean]
3000
Abb. 70: Durchflußzytometrische Messung des Oberflächenantigens HLA-DR . Die dendritischen Zellen
wurden 24 Stunden wie angegeben mit dem entsprechenden Stimulus inkubiert und dann das
Oberflächenmolekül durchflußzytometrisch mittels eines monoklonalen Antikörpers bestimmt.
- 118 -
3. Ergebnisse
3.5.3. LPS beeinflußt die Polarisation naiver T-Zellen durch
Modifikation dendritischer Zellen
3.5.3.1. LPS fördert die IFN-γ-Produktion
Die Zugabe von LPS in eine Kultur mit dendritischen Zellen als Stimulatorzellen und
naiver T-Zellen als Effektorzellen führt zu einer deutlichen Verstärkung des Th1-Musters.
Die dendritischen Zellen wurden zuvor zwei Stunden mit GM-CSF behandelt.
Stärkste Effekte zeigten sich mit Konzentrationen von LPS größer als 0,1 µg pro ml. Die
IFN-Gamma produzierende Zellen [%]
Effekte sind nicht beliebig zu steigern, sondern ab 1 µg/ml stabil (s. Abb. 71).
Kontrolle
0,1 µg LPS
1 µg LPS
10 µg LPS
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag
Abb. 71: Einfluß verschiedener Mengen LPS auf die IFN-γ-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen
Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt. Die dendritischen Zellen wurden vor
LPS-Gabe zwei Stunden mit GM-CSF inkubiert.
- 119 -
3. Ergebnisse
3.5.3.2. LPS hemmt IL-4-Produktion
Die Zugabe von LPS zu einer wie oben beschriebenen Kultur mit dendritischen Zellen als
Stimulatorzellen und T-Zellen als Effektorzellen führt zu einer Abschwächung des Th2Musters. Die dendritischen Zellen wurden zuvor mit GM-CSF zwei Stunden
vorstimuliert. Die Effekte wurden hier ab 1 µg/ml deutlich und erst am siebten Kulturtag
eindeutig zu erkennen (s. Abb. 72).
10µg LPS
IL-4 produzierende Zellen [%]
6
1µg LPS
0,1µg LPS
Kontrolle
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag
Abb. 72: Einfluß verschiedener Mengen LPS auf die IL-4-Induktion naiver T-Zellen nach sieben Tagen
Stimulation mit dendritischen Zellen; die intrazellulären Zytokine wurden nach Stimulation mit
dendritischen Zellen und 5 Stunden Restimulation mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µM) unter
Zugabe von Monensin (2,5 µM) durchflußzytometrisch bestimmt.
- 120 -
4. Diskussion
4. Diskussion
In dieser Arbeit wurde ein in vitro-Modell der primären Immunantwort etabliert.
Hierzu wurden verschiedene Teilkomponenten verwirklicht. Erster Schritt war die
Generierung dendritischer Zellen aus Nabelschnurblutstammzellen. Die einzigartige
Fähigkeit dendritischer Zellen, naive Zellen aktivieren und zur Zytokininduktion
anregen zu können, machte sie zum Kernstück des Modells. Die induzierten Zytokine
waren Messparameter des Modells.
Durch die Modellstruktur konnten Reaktionen einzelner Effektorzellgruppen, die
zeitlichen Abläufe der Immuninduktion und die interzellulären Wechselwirkungen
zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen untersucht werden. Weiterhin
konnte der Einfluß exogener Faktoren auf die primäre Immunantwort untersucht
werden. Hierdurch eröffnen sich in Zukunft mannigfaltige Möglichkeiten zur
Beurteilung der immunmodulatorischen Fähigkeiten einzelner Substanzen und zur
Atopieneigung einzelner Menschen.
CD34
Dendritische
Zelle
Zytokine
Phase 1:
Generierung
dendritischer
Zellen
Phase 4:
Einfluß
exogener
Faktoren
Phase 3:
Zelluläre
Interaktionen
Phase 2:
Rolle
verschiedener
Effektorzellen
Phase 1:
Etablierung der
Meßsysteme
Abb. 73: Übersicht über die Phasen der Modelletablierung:
In Phase 1 wurde das Grundmodell mit Stammzellisolation, Anzucht und Nachweis dendritischer Zellen,
MLR und Meßsystemen (FACS, ELISA, PCR für die Zytokine IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ) etabliert. In
Phase 2 wurden Rollen und zeitliche Abläufe verschiedener Effektorzellgruppen, in Phase 3 die
interzellulären Wechselwirkungen untersucht. In Phase 4 wurde der Einfluß exogener Faktoren auf dieses
in vitro Modell der primären Immunantwort gezeigt.
- 121 -
4. Diskussion
4.1. Modelletablierung
Grundprinzip des vorliegenden Modells war die Aktivierung naiver Zellen durch
dendritische Zellen und die Messung der durch diesen Kontakt induzierten Zytokine.
Zu diesem Zweck erfolgten zunächst Stammzellisolation, Kultivierung und Nachweis
dendritischer Zellen sowie die Messung der Zytokininduktion in naiven T-Zellen.
Nabelschnurblut
CD34
Isolation
Dendritische
Zelle
CD1a
GM-CSF, TNF-α, SF
Zytokine
Proliferation
Medium mit FCS (LPS ?)
Stammzelle
Dendritische Zelle
+
CD3+CD45RA+
Nabelschnurblut
CD45RO
Depletion
Abb. 74: Übersicht über die Modelletablierung: Zunächst wurde die Stammzellisolation optimiert, dann
die Kultivierung. Nachdem die Qualität der Zellen gezeigt war, wurde das Meßsystem etabliert
4.1.1. Erzeugung dendritischer Zellen aus CD34 positiven
hämatopoetischen Stammzellen
Zur Etablierung des Modells wurden große Menge dendritischer Zellen nach der 1992
von
Caux42 beschriebenen
Methode
aus
CD34
positiven
hämatopoetischen
Stammzellen des Nabelschnurblutes101 in 14tägiger Kultur mit GM-CSF und TNF-α
generiert. Zur Erhöhung der Zellzahl wurde, wie von Saraya et al. beschrieben100 , der
Stammzellfaktor als Stimulus hinzugefügt.
Entscheidend für die Anwendbarkeit dieser Methode war also der in dieser Arbeit
festgestellte Zusammenhang zwischen Blutalter und Sortierungsergebnis und der
- 122 -
4. Diskussion
Einfluß verschiedener FCS-Chargen auf den Kultivierungserfolg, abhängig von deren
LPS-Verunreinigung.
4.1.1.1. Die Stammzellisolation
4.1.1.1.1. Zellisolationsverfahren
Die Stammzellisolation war der grundlegende Schritt zur Generierung dendritischer
Zellen. Während der Experimente wurde beobachtet, daß zur erfolgreichen Anzucht
dendritischer Zellen eine Reinheit von über 95 % CD34 positiver Stammzellen benötigt
wird; diese Reinheit wurde mit Hilfe der MACS-Technik erreicht. Diese Technik bietet
eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Zellselektionsmethoden. Hervorzuheben
sind vor allem die zu erreichende Reinheit102 und Ausbeute des Isolats bei günstiger
Kostenlage. Zusätzlich zeichnen sich MACS sortierte Zellen durch eine hohe
Lebensfähigkeit und erhaltene Funktionalität aus 104, 103 .
4.1.1.1.2. Optimierung der Isolation
Zur Verbesserung der Isolationsergebnisse wurden verschiedene Parameter des
eingesetzten Blutes untersucht. Das Blutalter erwies sich als besonders wichtig: zwar
war die Reinheit des Isolats unabhängig vom Blutalter, doch die Ausbeute (Anzahl der
gereinigten Zielzellen) nahm mit seiner Zunahme ab. Die Größe der Ausgangszellmenge spielte dabei keine Rolle.
Ebenfalls vom Blutalter abhängig war der Anteil untergegangener Zellen in der
Ausgangszellmenge. Dieser anfangs noch geringe Anteil bleibt innerhalb der ersten
Stunde konstant und steigt danach dramatisch an. Während der Sortierung steigt er
immer weiter an, je stärker, desto älter das Blut ist.
Somit wirkt sich der Lagerungszeitraum gleich zweifach auf den Kultivierungserfolg
aus: Seine Verkürzung bewirkt einerseits eine Erhöhung der Anzahl der isolierbaren,
lebensfähigen Zellen im Ausgangszellgemisch, andererseits sind diese Zellen stabiler
und überstehen die Isolation besser, so daß am Ende die Ausbeute größer wird und
mehr kultivierungsfähige Zellen zur Verfügung stehen.
Entscheidendes Ergebnis für weitere Arbeiten mit CD34+ - Stammzellen war die Beachtung des kurzen Lagerzeitraums des Nabelschnurblutes.
- 123 -
4. Diskussion
4.1.1.2. Kultivierungskomponenten
4.1.1.2.1. Grundlagen
GM-CSF, TNF-α und SF als Wachstumsfaktoren waren anderen getesteten Zytokinen
in der Anzucht dendritischer Zellen überlegen105 . Daneben konnte der Einfluss
verschiedener Chargen fetaler Kälberseren auf den Kultivierungserfolg gezeigt werden.
CD1a
CD34
6 Tage:
GM-CSF, TNF-α, SF
6 Tage:
GM-CSF, TNF-α, SF
Medium mit FCS (LPS ?)
Stammzelle
Medium mit FCS (LPS ?)
Dendritische
Vorläuferzelle
Dendritische Zelle
Abb. 75: Prinzip der in dieser Arbeit etablierten in vitro-Generierung dendritischer Zellen: Nach
erfolgter Stammzellisolation wurden die Zellen an Tag 0 und 6 mit GM-CSF, TNF-α und SF stimuliert.
Am Ende der Kulturperiode entstanden dendritische Zellen; eine Fragestellung dieser Arbeit war der
Einfluß des kontaminierenden LPS im FCS.
4.1.1.2.2. FCS und seine Bestandteile
In dem eingesetzten Kulturmedium befand sich als Nährstofflieferant u.a. fetales
Kälberserum (FCS). Dies wurde hinzugefügt, da Strobl et al. zeigten, daß verschiedene
Serumkomponenten die in vitro Entwicklung dendritischer Zellen signifikant
beeinflussen101 , und andere Arbeitsgruppen unter serumfreien Bedingungen kein105
oder nur ein deutlich geringer ausgeprägtes Wachstum85 dendritischer Zellen
beobachteten.
In der vorliegenden Arbeit fielen bei Einsatz verschiedener Chargen FCS deutliche
Unterschiede
im
Wachstum
und
der
Ausbildung
dendritischer
Zellen
auf.
Kontaminierendes LPS als ubiquitär vorkommendes Molekül kam als beeinflussender
Faktor in Betracht und wurde daher weiter untersucht.
- 124 -
4. Diskussion
So wurde gezeigt, daß LPS als Kontamination im FCS vorliegt, und Ausreifung und
Proliferation dendritischer Zellen abhängig sind vom Grad dieser Verunreinigung. Die
Ausprägung des Oberflächenantigens CD1a, als Marker für dendritische Zellen,
korrelierte mit dem Grad der Verunreinigung des FCS mit LPS. Lanzavecchia 83
beschreibt das bakterielle Produkt LPS als beeinflussenden Faktor der Entwicklung
dendritischer Zellen, vernachlässigt es als Kontamination des FCS aber. Verschiedene
LPS-Wirkungen auf dendritische Zellen sind in Tab. 6 zusammengefasst.
Tab. 6: Funktion von LPS in der Entwicklung von dendritischen Zellen106
Wirkungsbereich
Folge
Funktion
Verstärkung der aktivierenden Eigenschaften:
Stärkere Aktivierung von naiven T-Zellen und Memory-T-Zellen
Morphologie
Stärkere Ausprägung der typ. dendritischen Morphologie
Oberflächenmoleküle
Verstärkte Expression von:
MHC II (HLA-DR), CD58, CD80, CD86, CD1a
Verminderte Expression von:
CD40, CD1a (sog. „Überreife dendritische Zellen“)
4.1.1.2.3. GM-CSF
In dieser Arbeit wurde als optimale Menge 10 ng/ml GM-CSF zur Generierung
dendritischer Zellen ermittelt. Hierbei ergab sich bei stabiler Zellmenge die beste
lichtmikroskopische Differenzierung. GM-CSF ist ein entscheidendes Molekül in der
Entwicklung dendritischer Zellen. Seine Aufgaben sind in Tab.7 zusammengefaßt.
Tab. 7: Physiologische Aufgaben des GM-CSF 11, 107,108,109
Wirkungsbereich:
Wirkung:
Zelldifferenzierung:
Förderung der Entwicklung von:
Makrophagen, Granulozyten, dendritischen Zellen
Aktivierung von:
Ausgereiften Makrophagen und Granulozyten
Immunsystem allgemein:
Senkung der Infektanfälligkeit
schnellere Wiederentwicklung der Immunantwort bei
Knochenmarktransplantierten und Chemotherapie
Peripheres Blut:
Erhöhung der Stammzellzahl
Effekte an DZ:
Unterdrückung von Apoptose
Ausreifung von unreifen zu reifen DZ
Entzündung:
Unspezifischer Entzündungsmediator
- 125 -
4. Diskussion
4.1.1.2.4.TNF-α
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche zeigten, daß der Anteil CD1a
positiver Zellen bei Einsatz von 5 ng/ml TNF-α drei- bis viermal höher war als ohne,
ein Effekt, den Caux zunächst nur andeutete42 später aber deutlich zeigte105, 41 .
TNF-α wirkt über die in Tab. 8 zusammengefaßten Mechanismen verstärkend auf die
Ausbildung dendritischer Zellen.
Tab.8: Physiologische Rolle des TNF-α 110,111, 42, 10 5
Wirkungsbereich:
Wirkung:
Entzündungen
Bindung an Oberflächenrezeptoren und Aktivierung intrazellulärer Pfade
mit Folge von Start oder Aufrechterhaltung von Entzündungsreaktionen.
Hämatopoetische Entwicklung
Fördernd mit GM-CSF und IL-3
Unterdrückung von G-CFU
Stammzellen
Bevorzugte Zielzellen CD34+ und CD86+
Ausdifferenzierung von Makrophagen und DZ
Hochregulation von CD86
Verstärkte Expression des GM-CSF-Rezeptors
(Förderung der GM-CSF-Wirkung).
Reife dendritische Zellen
Senkung der Apoptoserate
Ausreifung von dendritischen Zellen
4.1.1.2.5. Stammzellfaktor
Durch Einsatz von 10 ng/ml Stammzellfaktor wurde die Menge der angezüchteten
Zellen bei konstanten Einsatzmengen der übrigen Wachstumsfaktoren verdoppelt. Die
Arbeitsgruppen von Santiago-Schwarz112 und Saraya 100 zeigten sogar eine mögliche
Verdreifachung.
Der Stammzellfaktor wurde mehrfach unter verschiedenen Namen beschrieben (z.B.
Mast Cell Growth factor113 c-kit-Ligand, Stammzellfaktor114 , es handelt sich dabei um
den Liganden für den c-kit-Rezeptor, ein proto-onkogen115 .
Er hat alleine nur geringe Auswirkungen auf die Zellzahl, wirkt aber synergistisch mit
Wachstumsfaktoren wie GM-CSF oder Erythropoetin stark proliferationssteigernd
115
, beeinflußt die Zelldifferenzierung selbst aber nicht 114,116,117,118, 119 .
- 126 -
114,
4. Diskussion
Als Alternative und Ergänzung zum Stammzellfaktor gilt in jüngster Zeit der FTL3Ligand, der eine ähnliche Funktion wie der Stammzellfaktor einnehmen kann121 . In
Kombination entwickeln beide eine potenzierte Wirkung122 .
4.1.1.2.6. CD40 Ligand
Der CD40 Ligand (CD154 oder TRAP, TNF related activation protein) lässt
dendritische Zellen ähnlich GM-CSF und TNF-α ausreifen, wahrscheinlich durch ein
Cross-linking des CD40124 . Seine Wirkungen im Zusammenhang mit dendritischen
Zellen sind in Tab. 9 zusammengefasst. Die in dieser Arbeit beobachtete Ausreifung
von unreifen zu reifen dendritischen Zellen konnte auch von Caux125 beobachtet
werden, der allerdings Fibroblastengebundenen CD40 Liganden einsetzte.
Tab. 9: CD40 Liganden-Wirkungen auf DZ 126, 127 , 123, 128, 129, 130
Zelltyp
Wirkung
unreife DZ
Verstärkung von
CD54 (ICAM-1), B7 (CD80, CD86), CD58
MHC II
Matrix-Metalloproteinase
NO-Synthese
Senkung der Apoptoserate
Reife DZ
Verlust von CD1a und CD40
Alle DZ
Zytokininduktion und -sekretion:
IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α
4.1.1.2.7. TGF-Beta (TGF-β )
Die Wirkungen der Serumkomponente TGF-β sind vielfältig. Teilweise wirkt sie
wachstumshemmend auf CD34 positive Stammzellen131 , andererseits konnte Strobl
TGF-β als einen entscheidenden Faktor für die Ausbildung dendritischer Zellen im
FCS ausmachen101 , insbesondere zur Differenzierung des Langerhanszell-Typs121 .
Auswirkungen dieses Zytokins sollten in Zukunft weiter untersucht werden.
- 127 -
4. Diskussion
4.1.2. Nachweis dendritischer Zellen
Das zentrale Element des vorliegenden Modells waren dendritische Zellen, die als
einzige Zellpopulation naive Zellen aktivieren können. Daher wurde zunächst anhand
der in Kapitel 1.4 ausführlich dargestellten Kriterien nachgewiesen, daß es sich bei den
in dieser Arbeit generierten Zellen wirklich um dendritische Zellen handelt.
Die Zellen zeigten den dendritischen Phänotyp, mit typischer Zellmorphologie7,83,19,85
und geforderten Oberflächenmolekülen87 . In funktionellen Tests zeigten sich die Zellen
anderen in der Aktivierung von Memory-T-Zellen deutlich überlegen132,133,57,134,7,135,9,
10,136,19,137,18,138,139,140,141
und nur sie aktivierten naive T-Zellen durch Clusterbildung120 .
Diese Fähigkeiten sind spezifisch für dendritische Zellen und hinreichender
Nachweis132,133, 9,10,136,19,137,18,138, 139,140,7, 144,145, 83,143,149 .
Naiven Zellen konnten in nötiger Reinheit durch Einsatz der MACS-Technologie und
von Nabelschnurblut isoliert werden, wie auch von Strobl et al. beschrieben101 . Im
Vorfeld zu dieser Arbeit durchgeführte Versuche zeigten, daß andere Verfahren (z.B.
die T-Zell-Rossetierung) nicht in der Lage waren, T-Zell-Isolate mit einer Reinheit von
über 96 % zu erzeugen.
CD1a
2-4 Tage
+
+
Clusterbildung
CD3+CD45RA+
oder
CD3+CD45RO+
T-Zell-Proliferation
Abb. 76: Das Grundprinzip dieser Arbeit war die Aktivierung naiver Zellen durch dendritische Zellen.
Zuerst wurde der Nachweis erbracht, daß es sich bei den angezüchteten Zellen wirklich um dendritische
Zellen handelte. Der sicherste Nachweis war die Aktivierbarkeit von naiven T-Zellen in der MLR.
MLR-Prinzip: Zu Mitomycin C behandelten Stimulatorzellen (z.B. dendritische Zellen) werden
bestimmte Mengen Effektorzellen (z.B. T-Zellen) gegeben und dann die induzierte Proliferationsrate als
Maß der Zellaktivierung gemessen. Naive T-Zellen lassen sich nur von dendritischen Zellen aktivieren,
Memory-T-Zellen stärker; dieser Funktionstest ist notwendig und hinreichend zum Nachweis
dendritischer Zellen.
- 128 -
4. Diskussion
4.1.3. Anpassung der Meßsysteme
Nachdem dendritische Zellen in ausreichender Menge zur Verfügung standen, wurde
das Meßsystem des Modells etabliert. Dazu wurden dendritische Zellen mit Memory-TZellen und naiven T-Zellen in Kontakt gebracht und die induzierten Zytokine zu
verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Als Meßtechniken wurden FACS, ELISA und
teilweise die PCR verwendet.
Die Aktivierung naiver Zellen mittels dendritischer Zellen simuliert ein den Abläufen
im menschlichen Neugeborenen nahestehendes Modell mit vielen Regelmöglichkeiten
bei spezifischen Meßsystemen.
Dendritische
Zelle
FACS
0.;2.;4.;7. Tag
mRNA
IL-4 / IFN-γ
ELISA
CD45RA+
CD3+
Abb. 77: Grundlegende Struktur des in dieser Arbeit generierten Modells: Die Zytokininduktion in
naiven Zellen durch dendritische Zellen wurde gemessen; es erfolgte eine Messung der mRNA, der
intrazellulären und der sezernierten Zytokine (IL-4 und IFN-γ) zu verschiedenen Zeitpunkten der
gemeinsamen Kulturperiode.
4.1.3.1. Th1- und Th2- Induktion in Memory-T-Zellen
Das beschriebene Meßsystem wurde zunächst mit Memory-T-Zellen etabliert, da deren
Aktivierungsschwelle niedriger liegt, und Zytokine daher leichter induzierbar und
nachweisbar146,147 sind.
Dendritische Zellen regten Memory-T-Zellen zur Ausbildung von Th1- und Th2Muster an. Je kleiner das Verhältnis von Memory-T-Zellen zu dendritischen Zellen
war, desto größer wurde der Anteil Th2-Zytokinmuster exprimierender Zellen, bei
- 129 -
4. Diskussion
Konstanz des Th1-Musters. Durch den Einsatz von Monozyten war kein Th2-Muster zu
induzieren. Das Th2-Muster war also von der Stärke der Stimulation abhängiger als das
Th1-Muster.
4.1.3.2. Dendritische Zellen induzieren in naiven T-Zellen IL-4 und IFN-γ
Dendritische Zellen sind nachweislich in der Lage, naive Zellen zur Ausbildung von
Th2- (Il-4, IL-5) und Th1-Zytokinen (IFN-γ, IL-2) anzuregen. Das angestrebte Modell
war somit vollständig etabliert, die Übertragung des Meßsystems auf naive T-Zellen
gelang.
Die Entwicklung von naiven T-Zellen zu Memory-T-Zellen, die einhergeht mit der
endgültigen Etablierung der Th1-/Th2-Polarisation, ist eine zentrale Frage der Immunologie, da hierdurch das immunologische Gedächtnis gebildet wird. In dieser Arbeit
konnte ein Modell entwickelt werden, das den ersten Schritt dieser Entwicklung, von
naiven T-Zellen zu IL-4-/IFN-γ-produzierenden Effektorzellen, simuliert. Ein Ausbau
des Modells, in dem die endgültige Polarisierung der T-Zellen gelingt, ist denkbar, da
sich dendritische Zellen als der entscheidende Stimulus zur Polarisationsrichtung
zeigten. Durch immer wiederkehrende Restimulation mit dendritischen Zellen könnte
es möglich sein, naive T-Zellen schrittweise in stabile Memory-Zellen zu überführen.
Die Erzeugung von IL-4 aus naiven T-Zellen bei Restimulation mit PMA/Ionomycin
ohne die exogene Zufuhr von IL-4 galt als nicht möglich147 . Bisher mußten Th0-Zellen
durch die Zugabe von exogenem, rekombinaten IL-4 zur IL-4-Induktion oder von IL12 zur IFN-γ-Induktion148 gelenkt werden. Da in vivo keine exogenen Zytokine nötig
sind, um T-Zellen zu polarisieren, war klar, daß es für diese Zytokininduktion
physiologische Mechanismen geben muß.
4.1.3.3. Kinetik der Zytokininduktion in T-Zellen
Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der Zytokininduktion in naiven T-Zellen durch
dendritische Zellen, zeigt sich ein Maximum nach sieben Tagen. Sowohl Produktion als
auch Sekretion von IFN-γ und IL-4 sind an diesem Tag deutlich höher als an den Tagen
zuvor. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den bisher bekannten Literaturwerten zur
Kinetik der Zytokinsynthese im Mausmodell durch exogene Stimulation überein.
- 130 -
4. Diskussion
4.2. Kinetik der Zytokininduktion naiver Zellen
Da dendritische Zellen sowohl Memory- als auch naive T-Zellen zur Zytokinproduktion anregen konnten, wurde nun ihr Einfluß auf Art und zeitlichen Ablauf der
Zytokinproduktion anderer naiver Zellgruppen untersucht. Berücksichtigt wurden Zellarten, die als Effektorzellen der Immunabwehr des Neugeborenen wirken: Naive TZellen, NK-Zellen, CD45RA positive- Zellen und die Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurzellen. Dies geschah, um die Aufgaben einzelner Zellgruppen und deren
gegenseitige Wechselwirkungen bei der primären Immunantwort zu untersuchen.
Sämtliche naiven Zelltypen wurden aus Nabelschnurblut gewonnen, waren also
zweifellos naiv.
Dendritische
Zelle
FACS
0.; 2.; 4.; 7. Tag
mRNA
IL-4 / IFN-γ
ELISA
Wechselnde
Effektorzellen
Abb. 78: Die Grundstruktur des Modells wurde beibehalten; die Reaktionen und zeitlichen Verläufe
verschiedener Effektorzellen wurden getestet.
4.2.1. Zytokininduktion in mononukleären Nabelschnurblutzellen
Abhängig von ihrer Anzahl stimulieren dendritische Zellen IL-4 in mononukleären
Nabelschnurblutstammzellen; IFN-γ wird zellzahlunabhängig induziert. Der Nachweis
erfolgte
auf
allen
Ebenen
der
Zytokinproduktion.
Mit
Hilfe
der
Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde die Messenger-RNA nachgewiesen, dann das
jeweilige Zytokin intrazellulär durchflußzytometrisch im Golgi-Apparat und schließlich
- 131 -
4. Diskussion
die Zytokine durch die ELISA-Technik im Überstand, also als Sekretionsprodukt in der
Zellenumgebung.
Parallel dazu wurden unter denselben Bedingungen periphere, adulte Monozyten als
Stimulatorzellen eingesetzt. Eine IL-4-Induktion durch Monozyten konnte nicht
nachgewiesen werden; sie ist also eine spezifische Funktion der dendritischen Zellen
Die bei der Stimulation mit Monozyten zu beobachtende extrem schwache IFN-γ-Induktion kann Folge der PMA / Ionomycin - Restimulation und somit artifiziell sein.
Sowohl intrazellulär als auch sezerniert erkennt man eine Zunahme des IFN-γ mit
einem Höhepunkt am siebten Tag nach Stimulation durch dendritische Zellen. Derselbe
Verlauf findet sich für IL-4. Dies ist durch die sich selbst verstärkenden Mechanismen
des IFN-γ und IL-4151 zu erklären: IFN-γ wirkt indirekt über dendritische Zellen152 ,
NK-Zellen153 und andere Zellgruppen innerhalb des CBMC Th1 fördernd, IL-4 fördert
direkt
die
Th2
Etablierung.
Eine
Zunahme
dieser
Zytokine
während
der
Kokulturperiode überrascht demnach nicht.
4.2.2. Kinetik der Zytokinproduktion von naiven T-Zellen innerhalb der Gesamtmenge der mononukleären Nabelschnurzellen
Da man durchflußzytometrisch fünf Parameter (intra- und extrazelluläre) betrachten
kann154 , ist die Population der T-Zellen innerhalb des heterogenen Zellgemisches der
CBMC beurteilbar, indem man den Oberflächenmarker CD3 und die intrazellulären
Zytokine gleichzeitig markiert. Im Nabelschnurblut sind ca. 95 % der T-Zellen naiv
und zusätzlich durch das Oberflächenantigen CD45RA gekennzeichnet155 .
Mit dieser Technik konnte gezeigt werden, daß der Anteil der IFN-γ produzierender TZellen zunächst niedriger ist als der Anteil IFN-γ produzierender Zellen der
Gesamtzellmenge, gegen Ende der gemeinsamen Kulturzeit jedoch größer wird.
Daraus lässt sich schließen, daß verschiedene Zellgruppen zu unterschiedlichen
Zeitpunkten für die IFN-γ-Produktion verantwortlich sind und T-Zellen diese Rolle
erst gegen Ende der Kulturzeit übernehmen.
Der Anteil IL-4 produzierender T-Zellen ist gleichmäßig niedriger als der IL-4produzierende Anteil der Gesamtzellmenge. Es gibt also neben den T-Zellen noch
- 132 -
4. Diskussion
andere Zellgruppen die IL-4 produzieren, allerdings in den gleichen zeitlichen Verläufen wie T-Zellen.
Dieses Ergebnis führt zu der überraschenden Erkenntnis, daß die IFN-γ-Produktion
offensichtlich komplexer geregelt ist als die von IL-4. Zum einen werden zur IFN-γInduktion in naiven T-Zellen mehrere Zellgruppen benötigt (die naiven T-Zellen sind
nicht die ersten Produzenten), zum anderen sind mehr Zytokine (z.B. IL-12) beteiligt.
IL-4 wird dagegen direkt erzeugt, denn es gibt keine Zellgruppe, die vor den naiven TZellen IL-4 produziert, und dieses IL-4 ist dann in der Lage, selbst IL-4 zu induzieren.
Daraus ergab sich die weiterführende Fragestellung, welcher Zelltyp früh Zytokine
produziert bzw. sezerniert und so die Zytokinbildung der naiven T-Zellen moduliert.
Zur Beantwortung dieser Frage wurde das Modell so weiterentwickelt, daß die dendritischen Zellen mit verschiedenen naiven Zellgruppen in Kontakt gebracht wurden.
4.2.3. Verhalten der CD45RA-Zellen
Zellen mit dem Oberflächenantigen CD45RA wurden aus Nabelschnurblut isoliert und
beobachtet.
Diese
umfassen
vor
allem
T-Zellen,
B-Zellen
und
Natürliche
Killerzellen156 . Betrachtet man ihre IL-4- bzw. IFN-γ-Produktion und -Sekretion,
erkennt man eine Zunahme bis zum siebten Tag. Diese Verläufe entsprechen den schon
bei T-Zellen gezeigten.
Durch diese Versuchskonstellation konnte sicher gezeigt werden, daß es sich bei der
Zytokinproduktion der Nabelschnur-T-Zellen auch wirklich um eine Reaktion der
naiven T-Zellen handelte und nicht um eine Reaktion der verbleibenden Memory-TZellen, da sowohl CD3 pos. Zellen als auch CD45RA pos. Zellen IFN-γ bzw. IL-4
bilden.
Zusätzlich wurde gezeigt, daß es sich bei den früh sezernierenden Zellen um solche
handelt, die das Oberflächenantigen CD45RA tragen, aber keine naiven T-Zellen sind.
Dies rückte die Natürlichen Killerzellen als frühe Lieferanten des IFN-γ in den
Blickpunkt, da sie Teil der CBMC sind und CD45RA, aber kein CD3 tragen157 .
- 133 -
4. Diskussion
4.2.4. Natürliche Killerzellen
4.2.4.1. Die Natürliche Killerzelle
Bei den Natürlichen Killerzellen handelt es sich um eine heterogene Zellpopulation der
unspezifischen Immunabwehr. Sie können unmittelbar, nicht-antigenspezifisch
Zielzellen zerstören und sind durch die Oberflächenkonstellation CD16 (FcγIII) pos.,
CD56 pos., CD3 neg. definiert158,
159
, ein spezifischer Oberflächenmarker, wie z.B.
NK1.1 für Maus-NK-Zellen, existiert bei humanen Zellen nicht160 . Für diese Arbeit war
von Bedeutung, daß sie in minutenschnelle Zytokine ausschütten158 können und das
Oberflächenantigen CD45RA tragen, wie auch die frühen IFN-γ produzierenden Zellen
in den dargestellten Experimenten.
Zytokinwirkungen auf Natürliche Killerzellen werden in der Literatur zahlreich
beschrieben und sind in Tab. 10 zusammengefasst. Für diese Arbeit war insbesondere
die Wirkung des IL-12 (früher: NK-Zell-aktivierender-Faktor) von Bedeutung, das ihre
Killerzellaktivität, Proliferation, die Produktion bzw. Expression von IFN-γ und GMCSF162 sowohl im Knochenmark Erwachsener als auch im Nabelschnurblut163 steigert,
sie aber nicht vor dem Zelltod durch Apoptose schützt.
Die Reaktionen der NK-Zellen auf IL-12 ordnen sich gut in das vorgestellte Modell
ein, da – wie in dieser Arbeit und in der Literatur gezeigt 164 - dendritische Zellen IL-12
zur Verfügung stellen können. IL-12 aus dendritischen Zellen wird wiederum verstärkt
exprimiert durch GM-CSF und IFN-γ aus aktivierten NK-Zellen.
Das Zytokinspektrum der NK-Zellen unterstützt also die nachfolgende Ausbildung
eines Th1-Musters161 und zwar durch die Wirkung von IFN-γ auf naive T-Zellen165 und
dendritische Zellen und die verstärkte Freisetzung von IL-12 aus den dendritischen
Zellen durch GM-CSF und IFN-γ166.
- 134 -
4. Diskussion
Tab. 10: NK-Zell-Eigenschaften
158, 159, 143, 167
Eigenschaft
Ausprägung
Oberflächenantigene
CD16 (FcγIII) pos
CD56 pos
CD3 neg.
CD45RA
IL-2 bewirkt
Aktivierung
Freisetzung löslicher TNF-α-Rezeptoren
Produktion GM-CSF-mRNA
Schutz vor Apoptose
IL-7 bewirkt
Steigerung der Proliferation und Killerzellaktivität
Freisetzung löslicher TNF-α-Rezeptoren
Produktion GM-CSF-mRNA
Schutz vor Apoptose
IL-12 bewirkt
Steigerung der Proliferation und Killerzellaktivität
(im KM und Nabelschnurblut)
Produktion und Expression IFN-γ
Aktivierende Zellen
CD4-pos. T-Helferzellen via Zytokinproduktion
in deren Abwesenheit nur durch dendritische Zellen
4.2.4.2. Kinetik der IFN-γ-Produktion und -Sekretion Natürlicher Killerzellen
In vitro produzieren und sezernieren NK-Zellen bereits nach einem Tag Stimulation mit
dendritischen Zellen in großem Umfang IFN-γ, der bis zum zweiten Tag noch weiter
steigt, um dann über einen leichten Rückgang am vierten Tag, am siebten Tag fast nicht
mehr vorhanden zu sein.
NK-Zellen sind die ersten IFN-γ produzierenden und sezernierenden Zellen. Von ihnen
stammt das frühe IFN-γ, das in den CBMC beobachtet werden konnte und nicht den TZellen entstammte.
Diese Beobachtung bestätigt viele der in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse.
Humane dendritische Zellen sind - u.a. durch IL-12 - in der Lage NK-Zellen zu
aktivieren, die dadurch umgehend IFN-γ ausschütten und neu produzieren. Dieses IFNγ steht schnell zur Verfügung, um die spezifische Immunantwort (u.a. naive T-Zellen)
zu initiieren und zu modulieren. IFN-γ und GM-CSF aus den Natürlichen Killerzellen
wirken aber auch auf die dendritischen Zellen zurück, die dadurch gesteigert IL-12 und
- 135 -
4. Diskussion
kostimulatorische Moleküle (B-7) exprimieren. Diese Moleküle sind, wie in dieser
Arbeit gezeigt, ebenfalls wichtig zur Induktion der IFN-γ-Produktion naiver T-Zellen.
Die NK-Zellen wirken also direkt auf die T-Zellen (über IFN-γ) und indirekt (über die
IL-12 produzierende dendritischer Zellen).
Bestätigt werden die Ergebnisse durch die vorgelegten Daten hinsichtlich der Kinetik
der IL-12-Produktion von dendritischen Zellen. Diese ist innerhalb weniger Stunden
nach der Aktivierung maximal, steht also schnell zur Verfügung, um die NK-Zellen zu
aktivieren. Das IL-12 und Oberflächenmoleküle der dendritischen Zellen und das IFN-γ
aus den NK-Zellen lenken also gemeinsam naive T-Zellen in Richtung Th1 (s.Abb. 79).
Kostim. Moleküle
verstärkt (Il-12, B-7)
Aktivierung
Direkt
IFN-γ
Indirekt
Via IL-12
(Mech. unbekannt)
T-Zelle
IFN-γ
GM-CSF
NK-Zelle
Abb. 79: Netzwerk der NK-Wirkungen nach den Ergebnissen dieser Arbeit: NK-Zellen werden durch
dendritische Zellen aktiviert und beginnen mit der Produktion und Sekretion von Zytokinen, die dann
indirekt via dendritische Zellen oder direkt auf naive T-Zellen wirken und deren Polarisierung
beeinflussen.
4.2.4.3. Kinetik der IL-4-Produktion und -Sekretion durch Natürliche
Killerzellen
Die Sekretion von IL-4 durch Natürliche Killerzellen ist bereits am zweiten Tag nach
der Stimulation mit dendritischen Zellen maximal. Bemerkenswerterweise erfolgt die
- 136 -
4. Diskussion
größte durchflußzytometrisch nachgewiesene IL-4-Produktion jedoch erst am vierten
Kulturtag. Beide Prozesse nehmen dann bis zum siebten Tag wieder ab.
Dieses IL-4 entstammt wahrscheinlich ausschüttungsbereiten Reserven, die Kos et al.
in Maus-NK-Zellen zeigten158 , und sich nach Kontakt mit dendritischen Zellen in
minutenschnelle in den Extrazellularraum entleeren.
Nach dem Kontakt mit dendritischen Zellen setzt die Produktion von neuem IL-4 ein,
welches sich intrazellulär nach einigen Tagen zeigen lässt.
4.2.5. Natürliche Killerzellen sind die frühen IFN-γ-Produzenten
Nach Etablierung des Meßsystems konnten durch den Einsatz der dendritischen Zellen
die zeitlichen Abläufe der Zytokininduktion in naiven Zellen geklärt werden. Die daran
beteiligten Zellen entsprechen der primären Immunantwort. Selbstverständlich ist die
Situation in vivo wesentlich komplexer, doch die grundlegenden Mechanismen und vor
allem die zeitlichen Abläufe der Zytokinbildung sind aus dem vorgestellten Modell
übertragbar, unter der Voraussetzung, daß kein exogener Einfluß auf das Neugeborene
stattfindet. Es handelt sich also um ein Modell der Immunsituation ohne Beeinflussung
von außen, gleichsam steriler Bedingungen.
Die durchflußzytometrische Betrachtung zeigte, daß innerhalb der CBMC naive TZellen - die einen Großteil der CBMC ausmachen - erst spät IFN-γ produzieren. Durch
Untersuchung isolierter Zellarten konnte NK-Zellen als erste IFN-γ produzierende
Zellen identifiziert werden, die dieses Zytokin auch sehr schnell sezernieren und
dadurch die weitere Immunantwort modulieren.
Diese regulatorische Rolle der NK-Zellen in der frühen Etablierungsphase des Immunsystems ist bislang erheblich unterschätzt worden. Im Mausmodell konnte ihre
Fähigkeit zur schnellen Zytokinfreisetzung schon mehrfach gezeigt werden162 und auch
ihre Aktivierbarkeit durch dendritische Zellen - direkt168 und indirekt durch IL-12169 war bekannt, aber ihre Stellung als immunmodulatorischer Zelltyp, also ihre Wirkung
auf das spezifische Immunsystem, ist bisher wenig berücksichtigt worden.
Die NK-Zellen stellen ebenfalls IL-4 zur Verfügung und tragen daher auch zur
Etablierung eines Th2-Musters bei.
- 137 -
4. Diskussion
4.2.6. Physiologische Betrachtung der in vitro-Ergebnisse
NK-Zellen sind Teil der unspezifischen Abwehr des Körpers. Wurde bisher vor allem
ihren zytotoxischen Fähigkeiten Beachtung geschenkt, muß man nun auch den Blick
auf ihre Rolle als Modulator der spezifischen Immunantwort lenken.
Ihre zytotoxischen Fähigkeiten liefern den antigenpräsentierenden Zellen Bruchstücke
von Fremdobjekten, die dann weiterverarbeitet werden. Derartige Bruchstücke haben
eine entscheidende Wirkung auf die antigenpräsentierenden Zellen, da ihre
kostimulatorischen Fähigkeiten dadurch verbessert werden und sie mit der
Zytokinproduktion beginnen170 .
Die NK-Zellen wirken aber auch immunmodulatorisch auf das spezifische
Immunsystem, da sie durch Zytokinfreisetzung - IL-4 oder IFN-γ - die Antikörperproduktion stimulieren bzw. suprimieren und damit den humorigen Zweig der
spezifischen Immunantwort beeinflussen. Gleichzeitig erfolgt durch diese Zytokine
auch die Polarisation der naiven T-Zellen in ein Th1- bzw. Th2-Muster, wodurch die
zelluläre, spezifische Abwehr in wegweisende Bahnen gelenkt wird.
Dendritische Zellen und NK-Zellen sind Vertreter des zellulären Flügels der
unspezifischen Abwehr. Beide sind Teil der ersten Abwehrreihe gegen Bedrohungen,
beide verarbeiten diese und steuern gemeinsam die Antwort des spezifischen
Immunsystems. Die dendritischen Zellen sind dabei durch ihre kostimulatorischen
Moleküle der ausschließliche Aktivator der spezifischen Immunantwort, die NK-Zellen
haben durch Beeinflussung der Zytokinumgebung einen modulierenden Effekt.
- 138 -
4. Diskussion
4.3. Interzelluläre Wechselwirkungen
Dendritische Zellen als Stimulatorzellen sind stark genug, um in naiven Effektorzellen
Zytokine zu induzieren. Nachdem die zeitlichen Zusammenhänge verschiedener
Effektorzellgruppen gezeigt waren, wurden die interzellulären Wechselwirkungen
zwischen
dendritischen
Zellen
und
naiven
T-Zellen
Ziel
der
folgenden
Untersuchungen.
Bedingt durch die Modellstruktur konnten einzelne interzelluläre Wechselwirkungen
durch den Einsatz spezifischer, aktivierungsneutraler, monoklonaler Antikörper
gehemmt werden. Die Auswirkung auf das entstehende Zytokinmuster der naiven TZellen wurde dabei stets im Vergleich zu Ansätzen ohne diese Hemmung betrachtet.
Ziele der Modulation waren die Wechselwirkungen von HLA/MHC mit TZR, B-7Komplex (CD80, CD86) mit Rezeptoren (CD28, CTLA4) sowie einigen Zytokinen
(IL-12, IL-4) und Zytokinrezeptoren.
IL-4
IFN-γ
MHC II
B7-1 (CD80)
B7-2 (CD86)
IL-12
IL-4
TZR
CD28
CTLA4
Blockierende
Antikörper
Abb. 80: Die interzellulären Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen
wurden eingehend untersucht; die verschiedenen Interaktionen wurden durch den Einsatz akitivierungsneutraler Antikörper spezifisch geblockt und der Effekt der Blockierung auf die Zytokininduktion
gemessen.
- 139 -
4. Diskussion
4.3.1. Antigenabhängiges Signal und Kostimulus
Die vollständige Aktivierung von T-Zellen muß über mindestens zwei Stimuli erfolgen,
die durch Oberflächenantigene oder Zytokine antigenpräsentierender Zellen vermittelt
werden können. Dendritische Zellen verfügen in einem hohen Maße über derartige
Stimulations-moleküle, was laut Young et al. ihre gezeigte Stärke als Aktivator in der
MLR bedingt22 . Die beiden nötigen Stimuli werden als antigenabhängiges Signal und
Kostimulus bezeichnet.
Das antigenabhängige Signal wird durch die Bindung des HLA/MHC-Moleküls der
antigenpräsentierenden Zelle, in dem sich während der Antigenpräsentation das
Antigen befindet, an den T-Zell-Rezeptor (TZR) vermittelt171 .
Diese führt durch eine Anzahl intrazellulärer Protein-Tyrosin-Kinasen172
zu
verschiedenen T-Zell-Reaktionen: Proliferation, Änderung der Oberflächenantigene,
Sensibilitätsveränderung gegenüber Zytokinen, Produktion von Zytokinen oder der
Ausprägung zellspezifischer Eigenschaften, z.B. Zytotoxizität173, 174 .
Allerdings kann es statt dessen auch zu deaktivierenden Zellreaktionen wie Anergie
oder Apoptose kommen, was zur Entstehung der T-Zell-Toleranz führt173 .
Welche Zellreaktion sich entwickelt, ist abhängig vom Erhalt eines weiteren Signals
neben dem antigenabhängigen, dem als Kostimulus bezeichneten.
Der Kostimulus kann durch Mediatorenstoffe in Form von Zytokinen oder durch die
Bindung und Vernetzung von Oberflächenantigenen vermittelt werden.
Besondere Rollen nehmen die Zytokine IL-12, IL-4 und deren Rezeptoren, und der B7Komplex (CD80, CD86) und dessen Gegenstücke (CD28, CTLA 4) ein. Die
kostimulierenden Wechselwirkungen dieser Moleküle wurden näher untersucht.
- 140 -
4. Diskussion
Tab. 11: Übersicht über die in dieser Arbeit beobachteten Interaktionen
Stimulus
Molekül
T-Zelle
Antigenpräsentierende Zellen
Antigenabhängiges
MHC Klasse I
Signal
MHC Klasse II
T-Zell-Rezeptor
(HLA-Komplexe)
löslicher anti-CD3-Körper
(artifiziell, nicht von APZ)
Kostimulus
B7-Komplex:
B7.1 (CD80), B7.2 (CD86)
CD28, CTLA4
IL-12
IL-12-Rezeptor
IL-4 (Herkunft unbekannt)
IL-4-Rezeptor
CD40
CD40 Ligand
Neben den genannten kostimulierenden Molekülen sind weitere beschrieben, die in
Tab.12 dargestellt sind. Alle Stimulationswege können in Zukunft durch blockierende
Antikörper im vorliegenden Modell einfach und effizient untersucht werden.
Insbesondere OX40 und ICOS sind hochinteressante Moleküle, deren Untersuchung im
vorliegenden Modell Aufschluß über ihre Rolle in der Th1-/Th2-Polarisierung im
humanen System geben kann.
Tab 12 : Weitere Kostimuli und ihre Wirkungen175, 176, 177
Molekül
CD70
ICOS Ligand
OX40
SLAM
4-1BB
LFA-1 (CD11a/CD18)
Beschriebene Wirkung
Zellvermehrung
Verstärkt IL-10
Verstärkt Th2
Verstärkt Th1
Verstärkt Th1
Adhäsion (ICAM-1)
4.3.2. Beeinflussung des antigenabhängigen Signals
Durch die Zugabe eines aktivierenden monoklonalen Antikörpers gegen CD3, einer
dem TZR assoziierten Struktur, wurde der antigenabhängige Stimulus gezielt verstärkt.
- 141 -
4. Diskussion
Diese Verstärkung beeinflußte die Entstehung des IFN-γ nicht signifikant. Dies deckt
sich mit den Ergebnissen, daß die IFN-γ-Induktion auch durch Erhöhung der Zahl
dendritischer Zellen kaum zu beeinflussen war.
Der Anteil IL-4-produzierender Zellen wurde dagegen durch Zugabe von anti-CD3
erhöht. Dies geschah dosisabhängig, also eine stärkere Bindung und Vernetzung des
TZR durch mehr Antikörper, führte zu einer Erhöhung des IL-4. Dies steht in Einklang
mit Flamand et al. 178 , die für die IL-4-Induktion die Stärke der Vernetzung des TZR
verantwortlich macht und mit den in dieser Arbeit vorgelegten Daten, die eine IL-4Verstärkung bei Erhöhung der Stimulatorzellmenge zeigten.
4.3.3. Aktivierungsneutralisation des IL-12
IL-12 hat verschiedene Aufgaben im menschlichen Körper. Für diese Arbeit war vor
allem seine Rolle als Induktor von IFN-γ und Aktivator verschiedener Zellgruppen von
Bedeutung. Weitere Aufgaben des IL-12 sind in Tab. 13 zusammengefaßt.
Die durchgeführte IL-12-Blockade führte zu verminderter IFN-γ und IL-4-Produktion,
wobei die Abnahme des Anteils IL-4 produzierender Zellen sehr überraschend war.
Tab. 13: Übersicht IL-12-Wirkungen179, 180, 162, 163, 181, 182, 183
Bereich
Wirkung
Alternative Bezeichnungen
Natural Killer Cell Stimulatory Factor (NKSF)
Cytotoxic lymphocyte maturation factor (CLMF)
Ursprung
Antigenpräsentierende Zellen, v.a. dendritische
Zellen
Wirkung auf Zellen
Aktivierung von NK-Zellen
Steigerung der NK-Zell-Zytotoxizität
Entwicklung von CD8+ zytotoxischen T-Zellen
Aktivierung von CD4 und CD8 pos T-Lymphozyten
T-Zell-Polarisierung
Erzeugung eines Th1-Musters (IFN-γ)
Effekte im Mausmodell
Tumorreduktion
Unterbindung von Infektionen
- 142 -
4. Diskussion
4.3.3.1 Hemmung der IFN-γ-Induktion durch anti-IL-12
Die Hemmung der IFN-γ-Induktion durch eine IL-12 Blockade war nach den in dieser
Arbeit vorgelegten Ergebnissen erwartungsgemäß, da exogenes IL-12 naive T-Zellen
zur IFN-γ-Produktion anregte150,
161
und dendritische Zellen nach Stimulation IL-12
produzieren. Ein auslösender Mechanismus hierfür war die CD40-CD40 Liganden
Interaktion, in dem T-Zellen durch den löslichen CD40 Liganden simuliert werden.
Nach dieser CD40-CD40L-Bindung produzieren dendritische Zellen IL-12, das TZellen zur IFN-γ-Produktion anregt. Im dargestellten Versuchsaufbau wird dieses
freigesetzte IL-12 durch Antikörper abgefangen und die IFN-γ-Produktion vermindert.
4.3.3.2 Hemmung des IL-4 durch anti-IL-12
Die Hemmung der IL-4-Induktion durch IL-12-Blockade war sehr überraschend und
neu. Gängig ist die Ansicht, daß IL-12 die IL-4-Induktion hemmt184,
150, 161
, obwohl
unklar ist, ob diese Hemmung direkt oder indirekt durch eine verstärkte IFN-γInduktion erfolgt.
Allerdings zeigten Openshaw150 et al., daß mit Hilfe von IL-12 naive T-Zellen zur
gleichzeitigen IL-4- und IFN-γ-Produktion angeregt werden können.
Es ergibt sich die Frage, ob die IL-4-Produktion eine direkte oder indirekte IL-12Wirkung ist. Der indirekte Weg könnte IL-10 vermittelt sein, das wie IFN-γ durch IL12 induziert wird. IL-10 antagonisiert seinerseits Wirkungen von IL-12 in bestimmten
Bereichen, z.B. indem es die IL-4-Induktion fördert (aber nicht induziert). Vielleicht ist
seine Rolle im vorliegenden System so bedeutend, daß eine Unterbrechung der
Kaskade IL-12, IL-10, IL-4 zu einer Abnahme des IL-4 führt161 . Die Rolle des IL-10
sollte in Zukunft im vorliegenden Modell ebenso wie die der anderen Zytokine
untersucht werden.
Daneben könnten noch weitere indirekte Mechanismen existieren, die als Reaktion auf
IL-12 gegenregulierend aktiviert werden und im vorliegenden System für die Induktion
von IL-4 verantwortlich sind.
- 143 -
4. Diskussion
4.3.4. Hemmung des IL-4
Die vielfältigen Aufgaben des IL-4 im menschlichen Körper sind in Tab. 14 dargestellt.
Für diese Arbeit war seine zentrale Rolle als einziger bekannter IL-4-Induktor, als
Leitzytokin der Th-2-Zellen und damit als Atopiemarker von Bedeutung.
Tab. 14: Wirkungen von IL-4187, 186, 188, 189
Wirkbereich
Wirkung
Naive T-Zellen
Fördert Th2-Muster aus Th0-Zellen (IL-4, IL-5)
Unterdrückt Th1-Muster
Antagonist von IFN-γ und IL-12
Verstärkt durch IL-2
Atopische Dermatitis
Erniedrigung des IL-12 induzierten IFN-γ
B-Zellen
Start der Immunantwort (IgM-Produktion)
Immunglobulinwechsel von IgM zu IgG4 und IgE
Die IL-4-Ausbildung ließ sich in dem vorliegenden Modell durch die Blockierung des
Zytokins IL-4 vermindern. IFN-γ wurde durch IL-4-Blockade nicht beeinflusst.
Beides war erwartungsgemäß, da IL-4 selbst der Induktor von IL-4 ist und in der Regel
sogar exogen eingesetzt werden muß, um eine Polarisierung Richtung Th2 zu erzielen190 .
Daß es nicht zur völligen Auslöschung der IL-4-Produktion kommt, liegt im
vorliegenden Modell wahrscheinlich an der starken HLA/MHC - TZR - Interaktion, die
in einem Teil der naiven T-Zellen direkt IL-4 induziert. Das Phänomen der direkten IL4-Induktion in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen wurde in dieser Arbeit
mehrfach unter verschiedenen Bedingungen gezeigt und ist bisher nicht beschrieben.
Durchgeführte Kontrollen mit Monozyten des peripheren Blutes ließen kein IL-4
entstehen, es handelt sich also nachweislich um einen spezifischen Effekt dendritischer
Zellen. Da die IL-4 Produktion sich durch Verstärkung des TZR-Stimulus vergrößern
ließ, scheint die starke Expression des MHC auf den dendritischen Zellen Grundlage
dieser Entdeckung zu sein.
Der selbstverstärkende Mechanismus des erzeugten IL-4191 wird durch Zugabe des antiIL-4 durchbrochen, mit der Folge der IL-4 Abschwächung, aber nicht der Abschaltung.
- 144 -
4. Diskussion
4.3.5. Wirkungen des B7-Komplexes
4.3.5.1. Der B7-Komplex
In der vorliegenden Arbeit wurden die umfangreichen Wechselwirkungen des B7Komplexes, bestehend aus B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86), untersucht. Er kann auf
vielen Zelltypen gefunden werden185 , z.B. B-Zellen, Makrophagen, unreifen und reifen
dendritischen Zellen192 . Ob CD86193 oder CD80161 als stärkerer Kostimulus , oder ob
beide gleichstark sind194, 174 , wird in der Literatur kontrovers betrachtet200 .
Der B7-Komplex ist von großer Bedeutung, da seine Blockade zur Reduktion der
Proliferationsrate von naiven und Memory-T-Zellen in der MLR mit dendritischen
Zellen führt und die starke Aktivierungsfähigkeit dendritischer Zellen als Funktion der
hohen Expression des B-7-Komplexes interpretiert wird195,
22, 174, 201
. Seine deutlich
geringere Ausprägung auf Monozyten wird von Fagnoni et al. dafür verantwortlich
gemacht 196 , daß nur dendritische Zellen naive T-Zellen überhaupt und Memory-TZellen stärker aktivieren22 .
4.3.5.2. Die Rezeptoren des B7-Komplexes
Auf der T-Zelloberfläche gibt es zwei Rezeptoren für den B-7-Komplex, CD28 und
CTLA-4, beides Glykoproteine 172 . Sie haben teilweise die gleiche Aminosäuresequenz
und eine ähnliche Gesamtstruktur, werden aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten
exprimiert und unterscheiden sich in ihren Funktionen.
CD28 wird auf ruhenden und aktivierten T-Zellen exprimiert, ist aber der dominierende
Rezeptor für B7 auf ruhenden Zellen. Bindet B7 an CD28 führt dies zur T-ZellAktivierung und damit zur Expression von Zytokinen, Zytokinrezeptoren, Genen für
das Zellüberleben und zu einer Steigerung der Proliferationsrate197 .
CTLA-4 wird nur auf aktivierten T-Zellen exprimiert, auf denen es durch eine höhere
Affinität als CD28 zu dem B7-Komplex der dominierende Rezeptor wird. CTLA-4
aktiviert hemmende Signalwege und beendet die T-Zell-Aktivierung198 .
- 145 -
4. Diskussion
4.3.5.3. Hemmung des B-7 Komplexes
Der singuläre Block des B7-1 (CD80) führte zu einer deutlichen Abschwächung der
IFN-γ-Induktion. Die selektive Hemmung des Kostimulationsweges durch das
Oberflächenmolekül CD86 zeigte in den durchgeführten Experimenten keinen Einfluß
auf die Zytokinbildung.
Unterschiedliche Funktionen von CD80 und CD86 werden immer wieder diskutiert. In
dieser Arbeit wurde eine Funktion des CD80 bei der IFN-γ-Induktion gezeigt; dies wird
auch aus Teilen der Literatur unterstützt, die durch Einsatz aktivierender monoklonaler
CD80-Antikörper zur Kostimulation IFN-γ erzeugen konnten199 .
Einzelne Autoren widersprechen diesen Zusammenhängen und machen völlig andere
Einflüsse an den T-Zellen bzw. andere Strukturen und Mechanismen der
antigenpräsentierenden Zellen für die Polarisierung verantwortlich. Diesen Arbeiten ist
in sofern recht zu geben, daß der B7-Komplex sicher nicht alleine die Polarisierung der
Zellen bestimmt, aber sowohl die vorgelegten Daten als auch die moderne Literatur
zeigen eine klare Funktion des B7 in der T-Zell-Aktivierung.
4.3.6. CD40 Ligand und CD40 Liganden-Mangel
Ein wichtiger Baustein der interzellulären Wechselwirkungen ist die CD40-CD40
Liganden-Interaktion, denn dieser Kontakt reguliert andere stimulierende Moleküle und
wurde deshalb untersucht. Das Grundmodell wurde zu diesem Zweck durch den Einsatz
naiver Zellen von Patienten mit dem CD40 Liganden -Mangel verändert.
4.3.6.1. CD40, CD40 Ligand und Interaktionen
CD40 ist ein Oberflächenmolekül der TNF-Rezeptoren-Familie und wurde zuerst auf
B-Lymphozyten identifiziert und funktionell charakterisiert. Inzwischen ist CD40 auf
weiteren Zellarten beschrieben, die zusammen mit den entsprechenden Wirkungen in
Tab. 15 dargestellt sind.
- 146 -
4. Diskussion
Tab. 15: CD40: Vorkommen und Wirkungen130, 124, 202
Zellart
Wirkung
B-Zellen
Proliferation
Differenzierung Immunglobulin-Produktion
Isotypwechsel
Apoptoseschutz
Phänotypausbildung im Keimzellzentrum
Entwicklung zu Plasmazellen und Gedächtniszellen
Monozyten
Immunregulation
Stammzellen
Immunregulation
Ausbildung dendritischer Zellen (Ontogenese)
Dendritische Zellen
Immunregulation
Endothel-/ Epithelzellen
Immunregulation
Der CD40 Ligand wird hauptsächlich von aktivierten, CD4 positiven (auch naiven) TZellen exprimiert, dem immunologischen Gegenstück zu den antigenpräsentierenden
Zellen202,
203
. Er findet sich auch auf basophilen und eosinophilen Granulozyten und
aktivierten B-Zellen.
Ein Problem bei Arbeiten mit dem CD40-CD40 Liganden-Komplex war bis vor
kurzem die schlechte Verfügbarkeit des CD40 Liganden. Er lag nur zellgebunden vor,
z.B. an Fibroblasten, oder mußte löslich in sehr hohen Mengen eingesetzt werden.
Deshalb wurde er meist durch aktivierende oder deaktivierende Antikörper gegen
CD40 simuliert. Die physiologischen Wirkungen der Interaktion sind in Abb. 81
dargestellt. Nun steht ein Verstärker für den löslichen CD40 Liganden zur Verfügung,
der mehrere Moleküle komplexiert und so zu einer enormen Wirkungsverstärkung
führt. In der vorliegenden Arbeit wurden Wirkungen des CD40-CD40 LigandenKomplexes zum einen durch den Einsatz des löslichen CD40Liganden untersucht, zum
anderen durch Einsatz von Patientenzellen, die keinen CD40 Liganden exprimieren
konnten.
- 147 -
4. Diskussion
Aktivierung der antigenpräsentierenden Zelle:
Bildung regulatorischer Zytokine (IL-12)
Expression kostimulierender Moleküle
Bildung inflammatorischer Zytokine
NO Produktion
Antigenpräsentierende
Zelle
CD40
CD40L
Aktivierung der T-Zellen:
Direkte Aktivierung der T-Zellen
T-Zellen entwickeln kostimulierende
Eigenschaften (Helferfunktion)
Polarisierung Richtung Th1
T-Zelle
Abb. 81: Schematische Darstellung der funktionellen Konsequenzen der CD40 Triggerung; Die CD40CD40 Liganden Interaktion führt bei Gesunden zur verstärkten Expression stimulatorischer Moleküle;
dieses Signal fehlte bei den Patientenzellen. Nachdem die Rolle einzelner stimulatorischer Moleküle
untersucht worden war, wurde auf diese Weise das komplette Fehlen dieser Moleküle simuliert. Die
Folgen dieser mangelnden Interaktion wurden anhand der entstehenden Zytokinmuster in den T-Zellen
gemessen.
4.3.6.2. Das Hyper-IgM-Syndrom
4.3.6.2.1. Das HIGM-Syndrom (Hyper-IgM-Syndrom) und Tiermodell
Das
HIGM-Syndrom
(Hyper-IgM-Syndrom),
eine
X-chromosomal
vererbbare
Immundefizienzerkrankung, beruht auf der genetischen Veränderung des CD40
Liganden. Die Erkrankung ist klinisch gekennzeichnet durch einen Verlust der T-Zellabhängigen Antikörperantwort mit Verlust des B-Zell-Gedächtnis ohne zirkulierende
IgG-, IgA- und IgE-Antikörper,
opportunistische
Infektionen
mit
wie
einer
verstärkten
Empfindlichkeit
Pneumocystis-carinii-Pneumonien
Cryptosporidium-Diarrhoen130 .
- 148 -
für
und
4. Diskussion
Morphologisch finden sich bei Patienten mit dem HIGM-Syndrom in den
Lymphorganen keine Keimzentren, welche das anatomisch-morphologische Substrat
des Antikörperwechsels und den Ort der somatischen Mutationen130 bilden.
Im Tiermodell gelang es Xu et al.205 durch die Erzeugung von CD40- und CD40Ligand-knock-out-Mäusen einen Phänotyp zu generieren, der an einem, dem menschlichen HIGM-Syndrom vergleichbarem Symptomen leidet. Beide Krankheitsbilder
haben die kritische Rolle des CD40-CD40 Liganden-Komplexes in der Entwicklung
von B-Zellen gezeigt130 . Neben den pathologisch-morphologischen Substraten liegt
damit auch eine tierexperimentelle Bestätigung für das pathophysiologische
Entstehungsmodell des HIGM vor204 .
4.3.6.2.2. Charakteristika der Patienten und Ergebnisse
Die Patienten, deren Zellen in dieser Arbeit verwendet wurden, sind zuerst durch eine
Pneumocystis-carinii-Pneumonie klinisch auffällig geworden. Die Diagnose des CD40
Liganden-Mangel wurde durch die typische Klinik und den Einsatz der Durchflußzytometrie gesichert. Inzwischen werden die fehlenden Immunglobuline in dreiwöchentlichen Abständen substituiert.
Das humane Krankheitsbild mit den typischen Krankheitserregern spricht für einen
Defekt der CD40-CD40L-Interaktion auf Ebene der spezifischen, zellulären
Immunantwort, welcher dann konsekutiv zu der B-Zell-abhängigen Symptomatik führt.
Tatsächlich haben CD40 Ligand-knock-out-Mäuse Probleme beim T-Zell-Priming und
sind empfänglich für Leishmania-Infektionen130 , haben also Probleme mit der Th1abhängigen Immunität.
4.3.7. Der CD40 Ligand ist zur IFN-γ-Induktion nötig
Teil dieser Arbeit war die Analyse des durch allogene dendritische Zellen induzierten
Zytokinmusters naiver T-Zellen von Patienten mit CD40 Liganden-Mangel im
Vergleich zu der gesunder Probanden. Es zeigte sich praktisch keine Ausbildung eines
- 149 -
4. Diskussion
Th1-Musters in den T-Zellen der Patienten. Das Th2-Muster dagegen ließ sich bei
Gesunden wie Patienten vergleichbar induzieren.
Die Krankheitsbilder sind durch eine fehlende Th1-Antwort in Verbindung mit einer
mangelhaften Bildung von IL-12 durch antigenpräsentierende Zellen und dem
folgenden Ausfall der IL-12 aktivierten Zellgruppen, wie z.B. NK-Zellen, zu erklären.
Diese These wird durch die hier vorgelegten in vitro Daten und die Abläufe im
Mausmodell206,130 bestätigt.
In der vorliegende Arbeit führt der lösliche CD40 Ligand zu einer weiteren Ausreifung
der Zellen mit stark vermehrter Expression der kostimulatorischen Signale und zur
Produktion von IL-12. Durch Blockade dieser Moleküle (CD80, CD86 und IL-12),
wurde eine drastische Minderung der IFN-γ-Produktion erzielt. Dies ist die Erklärung
für die fehlende Th1-Antwort der CD40 Liganden-Mangel-Patienten.
Durch eine fehlende Ausreifung der dendritischen Zellen bei mangelnder Aktivierung
via CD40-CD40 Ligand kommt es nicht zu einer Verstärkung des B7-Komplexes und
es wird auch kein IL-12 gebildet. Die kostimulatorischen Signale zur Ausbildung eines
Th1-Musters fehlen. Die hier vorgestellten Daten lassen die CD40-CD40L-Interaktion
als zwingend nötig ansehen, damit dendritische Zellen genügend kostimulatorische
Aktivität entwickeln können, um T-Zellen in vivo zur IFN-γ-Produktion anzuregen.
Die Tatsache, daß das Th2-Muster sich nicht auffällig verändert, kann in seiner
Abhängigkeit von der Vernetzung der TZR begründet liegen. Blotta et al. 207 zeigten
zwar, daß in humanen T-Lymphozyten die IL-4 Synthese durch ein CD40 Liganden
initiiertes Cross-Linking gestartet wird, doch wie die oben dargestellten Ergebnisse
zeigen, bildet sich IL-4 hauptsächlich abhängig von der Stärke der MHC-TZRWechselwirkung aus. Diese ist bei den Patienten mit dem CD40 Liganden-Mangel
nicht entscheidend beeinträchtigt, daher wird auch die IL-4-Produktion nicht
signifikant beeinflußt.
- 150 -
4. Diskussion
4.4. Exogene Einflüsse auf dendritische Zellen und die
konsekutive Veränderung der IFN-γ- / IL-4-Bildung
Wie gezeigt, konnte im vorliegenden Modell die primäre Immuninduktion simuliert
werden und die Wechselwirkungen zwischen naiven Zellgruppen und dendritischen
Zellen wurden effizient untersucht.
Das Modell simuliert allerdings eine „sterile“ Welt des Neugeborenen, das in vivo
sofort Kontakt mit der Umwelt aufnimmt und dessen Immunsystem umgehend
beginnt, sich auf diese Auseinandersetzung mit den vom Körper als „fremd“
eingestuften Eindringlingen einzurichten und zu adaptieren. Daher wurde weitergehend
untersucht, ob von außen eingebrachte Substanzen die Polarisierungseigenschaften der
dendritischen Zellen verändern können. Diese Veränderung sollte sich zum einen an
den dendritischen Zellen selbst widerspiegeln, z.B. in der Form veränderter Expression
von Oberflächenmolekülen oder Zytokinen und die Zytokinproduktion der naiven TZellen beeinflussen.
Zu diesem Zweck wurde zunächst geprüft, ob die Zytokininduktion der naiven TZellen in diesem Modell durch Veränderung der Zytokinumgebung bei gleichzeitigem
Kontakt mit dendritischen Zellen beeinflußbar war. Ziel war hierbei, die maximale
Polarisierbarkeit und Elastizität der naiven T-Zellen bei zusätzlicher exogener
Stimulation zu prüfen. Derartige artifizielle Stimulationen verwenden in der Regel antiCD3 als antigenunabhängiges Signal und anti-CD28 als Kostimulus. Diese
Aktivierungskomponenten wurden im vorliegenden Modell von den dendritischen
Zellen zur Verfügung gestellt.
In artifiziellen Modellen ist die IFN-γ-Produktion durch die Zugabe von IL-12 und antiIL-4 induzierbar, die des IL-4 durch anti-IL-12 und IL-4208 .
Vorliegend wurden dann physiologische Substanzen gesucht, die dendritische Zellen
zur Induktion von IL-12 und zur vermehrten Ausprägung von kostimulierenden
Oberflächenmolekülen (u.a.dem B7-Komplex) anregten, also Moleküle, deren
bedeutende Rolle in der Polarisierung der naiven T-Zellen in dieser Arbeit schon
gezeigt wurde.
Die gesuchten Stoffe mußten also in der Lage sein, die dendritischen Zellen zur
Induktion von IFN-γ in naiven T-Zellen vorzubereiten. Dieses Konzept wurde
anschließend in der MLR geprüft, indem entsprechend vorbehandelte dendritische
- 151 -
4. Diskussion
Zellen mit naiven T-Zellen eingesetzt und die induzierten Zytokine gemessen wurden.
LPS wurde als maturierend wirkende und IFN-γ erzeugende Substanz identifiziert.
FACS
IL-12
CDs 80,83,86
CD1a, CD14
GM-CSF+LPS
CD40 Ligand
TNF-α
GM-CSF+ TNF-α
Abb. 82: Der Einfluß exogener Stimuli auf dendritische Zellen selbst wurde untersucht, mit dem Ziel,
die dendritischen Zellen so zu verändern, daß sie in der MLR verstärkt IFN-γ induzieren. Zu diesem
Zweck wurden die dendritischen Zellen 18 h mit verschiedenen Stimuli inkubiert und dann ihre
Oberflächenantigene und IL-12 gemessen.
FACS
0.; 2.; 4 .;7. Tag
IL-4 / IFN-γ
C
GM-CSF
LPS
18 h
CD45RA+
CD3+
Abb. 83: LPS wurde als die dendritischen Zellen stark veränderndes Molekül ausgemacht, und daher die
mit LPS vorbehandelten dendritischen Zellen als Stimulatorzellen in das Modell eingebracht; die
induzierten Zytokine der naiven T-Zellen wurden gemessen.
- 152 -
4. Diskussion
4.4.1 Artifizielle Musterbeeinflussung
Um die Wirkung der Zytokinumgebung auf die Polarisierung der naiven T-Zellen zu
untersuchen, wurden naive T-Zellen mit dendritischen Zellen in Kontakt und
rekombinate Zytokine und Antikörper eingebracht.
Durch den gemeinsamen Einsatz von Antikörpern gegen IL-4 und der Zugabe von
rekombinatem IL-12, konnte erwartungsgemäß eine massive Induktion von IFN-γ
erzielt werden. Weiterhin war es möglich, durch Zugabe des IL-4-induzierenden IL-4
und durch Hemmung seines Gegenspielers IL-12 mittels blockierender, monoklonaler
Antikörper die IL-4-Induktion zu verstärken.
Hierbei handelt es sich um eine Weiterentwicklung von Standardverfahren zur
Erzeugung von IFN-γ und IL-4, in denen üblicherweise anti-CD3 statt dendritischer
Zellen verwendet wird, um T-Zellen zu aktivieren, und Zytokine und Antikörper, um
sie zu polarisieren208 .
Das Grundmodell dieser Arbeit läßt eine Veränderung der Polarisierung zu, die
Stimulation durch dendritische Zellen ist mittels zusätzlicher Zytokine beeinflußbar.
Nächstes Ziel war daher die Suche nach physiologischen Einflüssen zur Verstärkung
des B7-Komplexes und Induktion von IL-12 und die Folgen für die Polarisierung der
naiven T-Zellen.
4.4.2. IL-12-Induktion in dendritischen Zellen
Um die Einflüsse und Wirkmechanismen der exogenen Faktoren beschreiben zu
können, wurden zunächst Untersuchungen an den dendritischen Zellen selbst
vorgenommen. Mit dem so ermittelten optimalen Stimulus behandelte dendritische
Zellen wurden dann in die MLR eingebracht.
Es konnte systematisch gezeigt werden, daß verschiedene Stoffe in der Lage sind,
dendritische Zellen zur Produktion von IL-12 anzuregen, welches spontan nicht
nachweisbar war. Die von Mosca209 gezeigte Methode zur IL-12 Induktion in
monozytengenerierten dendritischen Zellen durch LPS diente als Grundlage der in
dieser Arbeit durchgeführten Experimente, in denen IL-12 intrazellulär in dendritischen
Zellen gemessen wurde.
- 153 -
4. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden das bakterielle Produkt LPS, endogene Substanzen
wie GM-CSF, TNF-α oder der lösliche CD40 Ligand verwendet.
Die Stimulanzien wurden teilweise nach Vorinkubation mit GM-CSF eingesetzt. Da
GM-CSF im menschlichen Körper210 physiologischer Weise vorkommt, wurde in
dieser Arbeit vorausgesetzt, daß das Modell durch die Zugabe nicht signifikant
beeinflußt wird. GM-CSF nimmt wahrscheinlich in vivo und in vitro eine vorbereitende
Rolle ein, indem es Zellen für exogene Einflüsse empfänglicher macht.
Die zur Kontrolle untersuchten GM-CSF-Effekte (auch in Kombination mit TNF-α)
auf die IL-12-Induktion zeigten, daß es allein kaum Wirkung entfaltet und nur in
wenigen dendritischen Zellen IL-12 induziert. Deutliche Induktionseffekte sind
demnach auf die jeweilige Hauptsubstanz zurückzuführen, nicht auf GM-CSF.
Als günstigster Stimulus zur Induktion von IL-12 ergab sich die Kombination von LPS
mit GM-CSF. Maximum der Induktion ist 18 Stunden nach Zugabe. Auch der lösliche
CD40 Ligand erwies sich als starker IL-12-Induktor, teilweise dem LPS noch
überlegen.
Da neben IL-12 auch die stimulatorischen Oberflächenmoleküle verantwortlich für die
T-Zell-Differenzierung sind, wurden die Auswirkungen des CD40 Liganden und von
LPS auf die Oberflächenantigene der dendritischen Zellen ebenfalls näher untersucht.
4.4.3. Ausreifung dendritischer Zellen
Dendritische Zellen maturieren unter dem Einfluß von löslichem CD40 Liganden und
LPS, sie werden von unreifen zu reifen dendritischen Zellen. Vorversuche dieser Arbeit
zeigten, daß Ausreifungsschritte mit LPS nur möglich waren, wenn die Zellen vor LPSGabe mit GM-CSF inkubiert wurden. Die zur Kontrolle untersuchte weitere Ausreifung
durch GM-CSF allein ist nur minimal.
In dieser Arbeit gelang es zum ersten Mal, die Ausreifung dendritischer Zellen unter
dem Einfluß des löslichen CD40 Liganden zu beobachten. McLellan et al. zeigten
Gleiches im Mausmodell durch den Einsatz aktivierender Antikörper gegen CD40128 .
- 154 -
4. Diskussion
Als Maß für die Ausreifung dienten die Oberflächenantigene CD1a, HLA-DR
(MHC II), CD83 und der B7-Komplex (CD80, CD86)211 .
MHC und CD1a sind repräsentativ für den Hauptstimulus, der gerade bei den
dendritischen Zellen besonders stark ist. Beim MHC galt die Besonderheit, daß nach
Ende der Kulturzeit, im Stadium der unreifen dendritischen Zellen, bereits alle Zellen
das Molekül an ihrer Oberfläche trugen. Daher wurde die Zunahme des MHC durch die
mittlere Fluoreszenzintensität bestimmt. Diese gibt an, wie viele Antikörper pro Zelle
binden und entspricht damit der Expressionsmenge des Antigen.
CD83 gilt als spezifischer Marker für reife dendritische Zellen. Er diskriminiert sie
streng von unreifen dendritischen Zellen, seine Funktion war lange unbekannt212 ;
inzwischen wird ihm die eines Adhäsionsmoleküls98 zugeschrieben. Der Arbeitsgruppe
um Schuler und Steinkasser gelang die Klonierung des Moleküls 99 und zeigte
interessante Aspekte seines intrazellulären Verhaltens während der Ausreifung der
dendritischen Zellen215 .
Die kostimulatorischen Moleküle des B7-Komplexes nehmen als Maß für die
Ausreifung ebenfalls zu. Sowohl beim Einsatz von LPS als auch durch den CD40
Liganden konnte ein Anstieg dieser Oberflächenantigene beobachtet werden.
Es kam zusätzlich zur erwartungsgemäßen Abnahme des CD14, der für einen
monozyten-ähnlichen, unreiferen Typ von dendritischen Zellen kennzeichnend ist.
Die geforderten Ausreifungsmoleküle konnten also gezeigt werden. Neben den
untersuchten existieren noch weitere Moleküle, deren erhöhte Expression auf
dendritischen Zellen mit einem Reifungsschritt verbunden werden. Beispiele hierfür
sind CD54 (ICAM-1) oder CD58 (LFA-3), die von Caux123 beschrieben wurden130 .
Diese Moleküle werden aber zum einen relativ labil exprimiert (CD54) und sind zum
anderen nicht so spezifisch für die Maturation wie die in dieser Arbeit erfaßten.
Da die dendritischen Zellen unter Einfluß von CD40 Ligand und LPS ausreifen, wurde
überprüft, ob sie ausgereift eine verstärkte Produktion von IFN-γ induzieren und sich
ihre Wirkung auf die IL-4-Produktion verändert.
- 155 -
4. Diskussion
4.4.4. LPS-bedingte Veränderung der T-Zell-Polarisation
Zur Untersuchung des LPS-Einflusses auf die Polarisierung naiver T-Zellen wurden
dendritische Zellen mit GM-CSF und LPS vorinkubiert, wodurch sie wie beschrieben
ausreiften und IL-12 produzierten. Zum Zeitpunkt der maximalen IL-12-Expression (18
Stunden) wurden sie mit naiven T-Zellen in Kontakt gebracht.
4.4.4.1. IFN-γ wird verstärkt
Die mit LPS vorbehandelten dendritischen Zellen führten zu einer deutlich verstärkten
Ausprägung von IFN-γ in den stimulierten naiven T-Zellen. Dies entsprach den anderen
in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnissen, die IL-12 und B7 als Richtung IFN-γ
polarisierende Kostimulatoren zeigten, und deren verstärkte Expression bzw.
Produktion in dendritischen Zellen durch LPS erfolgte. Wie schon postuliert, führt
diese zu vermehrtem IFN-γ.
Diese in vitro-Konstellation läßt sich mit der Besiedlung des Neugeborenen mit gramnegativen Erregern, der Quelle von LPS, vergleichen. War das vorliegende Modell
bisher das eines steril aufwachsenden Kindes, wird durch die Zugabe von LPS der
Kontakt mit gram-negativen Erregern simuliert. Da LPS im vorliegenden Modell die
IFN-γ-Produktion unterstützt, spricht dies für eine allergieprotektive Wirkung dieses
Erregerkontaktes. Umfangreiche epidemiologische Daten, die von Mutius et al. 213
gewinnen konnten, bestätigen dies und weisen LPS eine Senkung des Atopierisikos zu.
Das vorliegende Modell liefert damit die in vitro-Erklärung für das in diesen Studien
beschriebene Phänomen, der Senkung des Atopierisikos durch frühen Erregerkontakt.
Nach den in dieser Arbeit vorgelegten Daten verändern sich die dendritischen Zellen
durch das LPS und regen die naiven T-Zellen zu vermehrter IFN-γ-Produktion an, dem
zentralen atopieprotektiven Zytokin während der Immunetablierung.
- 156 -
4. Diskussion
4.4.4.2. IL-4-Hemmung durch LPS
IL-4 wurde durch LPS mittels verstärkter Kostimulation durch B7 und IL-12 in seiner
Entstehung gehemmt, wobei diese Abschwächung gut mit der Zunahme des IFN-γ
korreliert.
Wie gezeigt, führt die singuläre Blockade des IL-12 dagegen zur IL-4-Verminderung.
Dies unterstreicht die Vermutung, daß die IL-4 fördernde Wirkung des IL-12 auf
indirekte Mechanismen zurückzuführen ist, da sonst die Zugabe von rekombinatem oder
aus den dendritischen Zellen stammendem IL-12 zu einer Verstärkung des IL-4 hätte
führen müssen, dies aber nicht tat.
Überträgt man diese in vitro-Ergebnisse auf die epidemiologische Studie, scheint LPS
nicht nur atopieprotektiv durch IFN-γ-Induktion zu wirken, sondern auch durch
Minderung des atopieförderden IL-4.
- 157 -
4. Diskussion
4.5. Perspektiven
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell geschaffen, das eine Vielzahl von
Möglichkeiten zur Untersuchung der primären Immunantwort eröffnet. Weitere
Arbeiten an und in diesem Modell können damit wichtige Erkenntnisse über die
physiologischen und pathophysiologischen Abläufe des Immunsystems liefern. Auch
eine Überprüfung dieser in vitro-Ergebnisse in klinischen Zusammenhängen kann
erfolgen. Daneben können einzelne Komponenten des Modells noch optimiert werden:
Generierung dendritischer Zellen:
Die Zellzahl kann durch den zusätzlichen Einsatz des FTL3-Liganden erhöht werden,
da dieser synergistisch mit dem Stammzellfaktor wirkt.
Da sich, wie gezeigt, LPS im Kulturmedium befand (FCS), wäre eine Umstellung der
Kulturbedingungen auf serumfreie Medien nötig. Dies wäre auch für eine eventuelle
klinische Nutzung der Zellen Voraussetzung (z.B. zur Retransfusion der gezüchteten
Zellen). Möglich wäre dies durch den Einsatz von serumfreien Medium unter Zugabe
von TGF-ß.
Effektorzellen:
Die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Effektorzellgruppen unter dem Einfluß
dendritischer Zellen könnten als Ergänzung zu den in dieser Arbeit vorgelegten Daten
in gemeinsamer Kultur mehrerer Zellgruppen nachgestellt werden.
Wechselwirkungen:
Die Einflüsse interzellulärer Wechselwirkungen der in dieser Arbeit diskutierten, aber
nicht untersuchten Moleküle (z.B. IL-10, OX-40, ICOS) auf die IL-4 / IFN-γ-Induktion
können mittels monoklonaler Antikörper oder durch den Einsatz rekombinanter
Zytokine untersucht werden.
Exogene Einflüsse:
Neben den gezeigten Einflüssen des LPS auf dendritische Zellen und deren veränderten
Polarisierungseigenschaften können weitere Pathogene und deren Bedeutung für die
Th1-/ Th2-Etablierung untersucht werden. Interessantes Untersuchungsobjekt wäre z.B.
der RSV, von dem Schwarze et al. 214 zeigen konnten, daß er im Tiermodell die Th2-
- 158 -
4. Diskussion
Polarsierung fördert. Eine Überprüfung dieser Ergebnisse könnte die Stellung des
vorgestellten Modells als Bindeglied zwischen Tiermodell und klinischen Studien
belegen.
Durch die gezielte Anzuchtmöglichkeit dendritischer Zellen und den
Erhalt hoher
Zellzahlen ist die molekularbiologische Untersuchung intrazellulärer Wirkungen bestimmter Substanzen auf dendritische Zellen möglich. Beispielhaft wären hier die intrazellulärer Aktivierungswege durch LPS zu nennen.
Übertragung des Modells in den klinischen Bereich :
In Anlehnung an bestehende Tests der klinischen Routine (T-Zell-Transformationstest),
könnten diagnostische Untersuchungen entwickelt werden, in der dendritische und TZellen eines Spenders geprüft werden. Gemeinsam eingebrachte Zellen können
hinsichtlich der Immunkompetenz und der Atopieneigung untersucht werden.
Auch die inidivduelle Reaktion des Spenders auf definierte exogene Substanzen kann
durch das Einbringen dieser Substanzen in das autologe System geprüft werden.
Unter klinischen Gesichtspunkten könnte geprüft werden, ob dendritische Zellen von
Atopikern andere polarisierende Fähigkeiten haben als die von Gesunden. Auch ihre
Reaktionen auf exogene Stimulanzien könnten überprüft werden, da diese bei Zellen
von Atopikern anders ausfallen könnten als bei Zellen von gesunden Probanden.
- 159 -
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Abstract
Abstract
Bartz
Holger
In vitro-Modell der primären Immunantwort
In dieser Arbeit wurde ein Modell der primären Immuninduktion etabliert. Kernstück des
Modells waren dendritische Zellen (DZ), die in 14tägiger Kultur aus CD34+-Stammzellen
des Nabelschnurblutes mit GM-CSF, TNF-α und SF generiert wurden. Die Kultur- und
Isolationsbedingungen wurden etabliert und das Blutalter als entscheidender Parameter des
Kulturerfolges ermittelt.
Die Zellen wurden auf Grund ihres Phänotyps und ihrer funktionellen Eigenschaften als
DZ klassifiziert. Der Phänotyp umfaßte Morphologie und Oberflächenantigene (CD1a,
CD80, CD83, CD86, HLA-DR). Funktionelle Tests zeigten sie als stärkste Stimulatorzellen in der MLR mit Memory-T-Zellen (MT) und einzige Aktivatoren naiver T-Zellen
(nT). Die Modelletablierung war mit dem Nachweis der induzierten Effektorzellzytokine
IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-γ in der MLR mit nT abgeschlossen.
In diesem Modell wurden Art und zeitliche Abläufe der Immuninduktion des Neugeborenen durch den Einsatz verschiedener isolierter naiver Zellgruppen als Effektorzellen
untersucht. Die Zellpopulationen waren CBMC, CD45RA+-Zellen, nT, MT, Natürliche
Killer Zellen (NKZ). NKZ konnten als erste IFN-γ-produzierende Zellen ermittelt werden;
die IL-4-Produktion verlief bei allen isolierten Zellgruppen annähernd zeitgleich.
Die interzellulären Wechselwirkungen zwischen nT und DZ wurden untersucht. Mittels
neutralisierender Antikörper wurden die kostimulatorischen Signale CD80, CD86, IL-12
und IL-4 isoliert blockiert und die so induzierten Zytokine bestimmt. Bei Verlust des CD40
Liganden, wie bei Patienten mit Hyper-IgM-Syndrom, konnte kein Th1-Muster induziert
werden; das Th-2 Muster blieb unbeeinträchtigt.
Abschließend wurde der Einfluß exogen eingebrachter, physiologischer Stimuli auf die Zytokininduktion ermittelt. LPS wurde als Substanz, die bei der Immunprägung des Neugeborenen eine Rolle spielen könnte, identifiziert, da LPS die IL-12-Bildung und Ausreifung
der DZ anregt und diese so zur verstärkten IFN-γ-Bildung führen.
Dieses Modell bietet vielfache Möglichkeiten für zukünftige Untersuchungen.
- 187 -
Danksagung
Danksagungen:
Ich danke meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. U. Schauer für die Überlassung des
Themas, für die ständige Unterstützung, für seine Lehrbereitschaft und wichtige
Gespräche, alles weit über das normale Maß hinaus.
Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Rieger für die Bereitsstellung der Möglichkeiten.
Ich danke Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel für die ständige
inhaltliche und moralische Unterstützung und für ihre Bereitschaft, ihr Wissen mit mir
zu teilen. Insbesondere danke ich ihnen für ihre Hilfsbereitschaft bei Problemen aller
Art.
Ich danke Frau Dr. Nora Hauk für die Hilfe der Endotoxinbestimmung.
Ich danke Herrn Karsten Stempel, M.A., für die Durchsicht der Arbeit.
Ich danke Frau Melanie Janßen für die Durchsicht der Arbeit, für ihre Toleranz und die
im rechten Moment vermittelte Motivation.
Ich danke meinem Vater, Rudolf Bartz, für vieles, insbesondere aber dafür, im rechten
Moment Internetleitungen herstellen zu können.
Ich danke meiner Mutter, Ingrid Bartz, geb. Kröpcke für alles.
- 188 -
Lebenslauf
Curriculum vitae:
Holger Bartz, geboren am 9.1.1972 in Witten,
Sohn von Rudolf und Ingrid Bartz, geb. Kröpcke,
evangelischen Bekenntnisses,
1991
Abitur,
Albert-Martmöller-Gymnasium, Witten
1991-1992
Zivildienst ,
Gemeinschaftskrankenhaus Herdecke
1994
Ärztliche Vorprüfung,
Ruhr-Universität Bochum
1995
1. Ärztliches Staatsexamen,
Ruhr-Universität Bochum
1998
2. Ärztliches Staatsexamen,
Ruhr-Universität Bochum
Mai 1999
3. Ärztliches Staatsexamen,
Ruhr-Universität Bochum
Juni 1999-
Arzt im Praktikum,
Dezember 2000
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin - UniversitätskinderklinikSt. Josef-Hospital Bochum, bei Prof. Dr. med. C. Rieger
Seit Februar 2001
Assistenzarzt,
Zentrum für Med. Mikrobiologie und Hygiene,
Inst. für Med. Mikrobiologie, Marburg, bei Prof. Dr. med. K. Heeg
- 189 -
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