Dissertation - Deutsche Digitale Bibliothek

Die Regulation der Zink-Transporter und ihr Einfluss auf die
intrazelluläre Zinkhomöostase in Leukocyten
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen
University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Silke Overbeck
aus Bocholt
Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Lothar Rink
Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Fritz Kreuzaler
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ........................................................................................................................... 1
1.1
Das Immunsystem des Menschen .............................................................................. 1
1.2
Der Zinkstoffwechsel des Menschen ......................................................................... 3
1.3
Der Einfluss von Zink auf das Immunsystem ............................................................ 4
1.4
Die Zink-Transporter.................................................................................................. 6
1.5
Zink und Apoptose ................................................................................................... 11
2
Zielsetzung ....................................................................................................................... 13
3
Material und Methoden .................................................................................................. 14
3.1
Material .................................................................................................................... 14
3.2
Methoden.................................................................................................................. 21
3.2.1
Präparation der Zink-Lösung .......................................................................... 21
3.2.2
Zellkulturen ..................................................................................................... 21
3.2.3
Isolierung von mononukleären Zellen............................................................. 23
3.2.4
Erythrocytenlyse isolierter mononukleärer Zellen .......................................... 23
3.2.5
Isolierung von primären, humanen T-Zellen................................................... 24
3.2.6
Isolierung von primären, humanen B-Zellen .................................................. 25
3.2.7
Zellzahlbestimmung ........................................................................................ 25
3.2.8
Vitalitätstest..................................................................................................... 25
3.2.9
RNA-Isolierung aus Lymphocyten ................................................................. 26
3.2.10 RNA-Isolierung aus Vollblut .......................................................................... 26
3.2.11 DNA-Isolierung aus Vollblut .......................................................................... 27
3.2.12 Bestimmung der RNA- und DNA-Konzentration........................................... 27
3.2.13 Reverse Transkription ..................................................................................... 28
3.2.14 Real-time PCR (Echtzeit-Polymerasekettenreaktion) ..................................... 29
3.2.15 SNP-PCR („single nucleotide polymorphism”) .............................................. 33
3.2.16 Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................. 34
3.2.17 Durchflusscytometrie ...................................................................................... 35
3.2.18 Messung der Reinheit von primären, isolierten Zellen ................................... 37
3.2.19 Intrazelluläre Färbung und Fluoreszenzmikroskopie ...................................... 37
3.2.20 Apoptose-Assay .............................................................................................. 40
3.2.21 Messung von intrazellulärem freien Zink mit dem Durchflusscytometer....... 41
3.2.22 Messung von intrazellulärem freien Zink mit dem Fluoreszenzplattenleser .. 43
I
Inhaltsverzeichnis
3.2.23 IL-1-Assay....................................................................................................... 43
3.2.24 ELISA („enzyme linked immunosorbent assay“) ........................................... 45
3.2.25 CTLL-2-Assay ................................................................................................ 45
3.2.26 Proteinbestimmung.......................................................................................... 48
3.2.27 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ........... 49
3.2.28 Westernblot ..................................................................................................... 50
3.2.29 Auswertung ..................................................................................................... 52
4
Ergebnisse ........................................................................................................................ 53
4.1
Expression von Zink-Exportern in mononukleären Zellen ...................................... 53
4.2
Einfluss von Zink auf die Expression von hZnTs in mononukleären Zellen........... 59
4.3
Analyse der intrazellulären Zinkhomöostase ........................................................... 73
4.4
Expression von hZnT-8 in Diabetikern .................................................................... 77
4.5
Einfluss von Zink auf die Signaltransduktion .......................................................... 83
4.6
4.5.1
IL-1 Signalweg................................................................................................ 83
4.5.2
IL-2/IL-4 Signalweg........................................................................................ 84
Einfluss von Zink auf die Apoptose......................................................................... 87
5
Diskussion ........................................................................................................................ 90
6
Zusammenfassung......................................................................................................... 101
7
Literatur ......................................................................................................................... 102
8
Abkürzungsverzeichnis................................................................................................. 116
Lebenslauf ....................................................................................................................... 119
Eigene Publikationen ...................................................................................................... 120
Danksagung..................................................................................................................... 121
II
Einleitung
1
Einleitung
1.1 Das Immunsystem des Menschen
Das Immunsystem des Menschen besteht aus einer unspezifischen, angeborenen und einer
spezifischen, erworbenen Immunantwort. Beide Systeme übernehmen bestimmte
Aufgaben
und arbeiten eng miteinander zusammen, um den
Körper
gegen
Krankheitserreger zu verteidigen. Zu Beginn einer Infektion hält das angeborene
Immunsystem die Infektion in Schach und induziert gleichzeitig eine spezifische
Immunantwort, welche bei einem zweiten Kontakt mit dem gleichen Antigen eine
schnellere, stärkere und damit effektivere Immunantwort auslöst (Sekundärantwort)
(Janeway et al., 2002).
Die
Zellen
des
Immunsystems
besitzen
ein
spezifisches
Muster
an
Differenzierungsmarkern (CD, „cluster of differentiation“), welche ihre Funktion und
ihren Entwicklungszustand kennzeichnen (Geenen et al., 2001).
Zur
angeborenen
(Komplementsystem,
Immunantwort
gehören
Akute-Phase-Proteine,
neben
löslichen
Cytokine
und
Komponenten
Chemokine)
die
Monocyten/Makrophagen, dendritische Zellen, Granulocyten, Natürliche Killer (NK)Zellen und Mastzellen. Monocyten/Makrophagen und dendritische Zellen erkennen über
unspezifische
Oberflächenrezeptoren
allgemeine
Charakteristika
auf
der
Pathogenoberfläche und nehmen das Pathogen auf. Nach der Internalisierung wird in sog.
Phagolysosomen das Pathogen lysiert und die Proteine werden in Peptidfragmente
gespalten.
Anschließend
wird
das
prozessierte
Antigen
über
den
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC, „major histocompatibility complex“)-II auf
den antigenpräsentierenden Zellen (APC, „antigen presenting cell“) den T-ZellRezeptoren (TCR, „t cell receptor“) auf T-Lymphocyten des erworbenen Immunsystems
präsentiert, die dadurch aktiviert werden (Fraser et al., 1998). Die Antigenpräsentation
kann auch über MHC-I-Moleküle erfolgen, wenn das fremde Peptid aus dem Cytosol
stammt (Stoltze et al., 2000). Während NK-Zellen Tumorzellen und virusinfizierte Zellen,
welche häufig durch eine fehlende MHC-I Expression gekennzeichnet sind, direkt
zerstören, spielen Mastzellen durch die Sezernierung von inflammatorischen Mediatoren
wie z.B. Histamin und Tumornekrosefaktor (TNF)-α bei der Abwehr von Parasiten und
bei allergischen Entzündungen eine Rolle.
1
Einleitung
Die zellulären Komponenten der erworbenen Immunantwort sind die B- (CD19+) und
T-Lymphocyten (CD3+). Diese tragen antigenspezifische Rezeptoren, die nach
Aktivierung zur Vermehrung des jeweiligen Lymphocyten und dessen Differenzierung zu
Effektorzellen führen. Während B-Lymphocyten sich zu Plasmazellen entwickeln, welche
antigenspezifische Antikörper produzieren (humorale Immunität), sind T-Lymphocyten
sowohl an zellvermittelten Reaktionen als auch an der Induktion der humoralen
Immunantwort beteiligt.
Dabei unterteilt man anhand der Corezeptor-Expression CD8+- und CD4+-T-Zellen.
Während CD8+-T-Lymphocyten nur Peptide erkennen können, die an MHC-I-Moleküle
gebunden sind, können CD4+-T-Zellen nur Peptide erkennen, die von MHC-II-Molekülen
präsentiert werden (Long, 1992). Diese Eigenschaft bezeichnet man als MHC-Restriktion
der T-Zellen (Stevanovic, 2002). CD8+-T-Lymphocyten werden auch als cytotoxische
T-Zellen bezeichnet, da sie virusinfizierte Zellen und Tumorzellen erkennen und diese
spezifisch lysieren (Kirchner et al., 1993). CD4+-T-Zellen werden auch T-Helfer(TH)Zellen genannt und aufgrund ihrer Funktion und ihres spezifischen Cytokinmusters weiter
in TH1-, TH2-, TH17- und regulatorische T-Zellen eingeteilt. TH1-Zellen fördern die zelluläre
Immunantwort und produzieren die Cytokine Interferon (IFN)-γ, Interleukin (IL)-2, IL-3
und TNF-α. Demgegenüber aktivieren TH2-Zellen B-Lymphocyten zur Induktion der
humoralen Immunantwort und sezernieren die Cytokine IL-4, IL-5 und IL-10 (Mosmann
und Coffman, 1989). Während TH17-Zellen durch die Produktion von IL-17 und IL-6 proinflammatorisch wirken, werden Autoimmunreaktionen durch regulatorische T-Zellen,
welche TGF-β (“transforming growth factor”) und IL-10 synthetisieren, unterdrückt
(Sakaguchi, 2005; Taylor et al., 2006; Weaver et al., 2006; Bi et al., 2007).
Die Steuerung des Immunsystems erfolgt mit Hilfe von Cytokinen. Dabei handelt es sich
um kurzlebige Mediatoren, welche vorwiegend von Leukocyten produziert werden und
sowohl auto-, para- als auch endokrin wirken können. Man unterscheidet die Interleukine,
Interferone,
Tumornekrosefaktoren,
koloniestimulierende
Faktoren
sowie
die
Wachstumsfaktoren. Anhand ihrer Funktion kann man sie in pro-inflammatorische
Cytokine, welche entzündungsfördernd wirken, und in anti-inflammatorische Cytokine,
welche den pro-inflammatorischen entgegenwirken, unterteilen. Zu den klassischen proinflammatorischen Cytokinen gehören IL-1, IL-6 und TNF-α, die hauptsächlich von
Monocyten/Makrophagen sezerniert werden und daher auch als Monokine bezeichnet
werden (Kirchner et al., 1993; Cavaillon, 1994). Demgegenüber zählen IL-2, IL-4, IL-10
2
Einleitung
und IFN-γ zu den Lymphokinen, da sie vornehmlich durch Lymphocyten produziert
werden (Kirchner et al., 1993).
1.2 Der Zinkstoffwechsel des Menschen
Zink ist ein essentielles Spurenelement (Raulin, 1869; Todd et al., 1934), welches zu 2-4 g
im menschlichen Körper vorkommt (Rink und Gabriel, 2001). Davon befinden sich 85 %
in der Muskulatur und im Knochen, 11 % in der Haut und der Leber und 2-3 % in anderen
Geweben wie z.B. im Gehirn, in den Nieren, im Herzen und im Blutplasma (Mills, 1989;
Jackson, 1989; Favier und Favier, 1990). Dabei liegt die physiologische für das
Immunsystem so wichtige Plasmazinkkonzentration zwischen 12 und 16 µM Zink und
entspricht so nur 0,1 % des Gesamtzinkgehaltes (Crea et al., 1990; Ibs und Rink, 2003).
Im Serum bindet Zink zu 60 % geringaffin an Albumin, zu 30 % hochaffin an α2Makroglobulin und zu 10 % an Transferrin (Scott und Bradwell, 1983).
Während sich intrazellulär 30-40 % des Zinks im Zellkern befinden, teilen sich 50 % auf
Cytoplasma, Organellen und spezialisierte Vesikel auf. Das restliche Zink ist mit der
Zellmembran assoziiert (Tapiero und Tew, 2003). In vielen Zellen findet man sog.
„Zinkosomen“, d.h. vesikuläre Strukturen, die einen hohen Zinkgehalt aufweisen und
vermutlich eine Funktion bei der Zellproliferation ausüben (Haase und Maret, 2005). Das
zelluläre Zink liegt zu 5-20 % gebunden an Metallothionein vor, das über 20 konservierte
Cysteinreste Zink bindet (Andrews, 2001). Metallothionein ist ein Metalloprotein, das
gegen Metalltoxizität und oxidativen Stress schützt. Die Expression wird über den
Transkriptionsfaktor MTF-1 („metal-response element-binding transcription factor-1“)
zinkabhängig reguliert. Dieser induziert auch die Expression von weiteren regulatorischen
Zinkhomöostasegenen, welche an der komplexen Steuerung des Zinkmetabolismus
beteiligt sind (Andrews, 2001).
Dies ist wichtig, weil Zink als Cofaktor von mehr als 300 Metalloproteinen aus allen
Enzymklassen eine wichtige Funktion bei der Regulation zellulärer Prozesse (Vallee und
Falchuk, 1993) wie Signaltransduktion (Beyersmann und Haase, 2001), Transkription
(Wu und Wu, 1987; Falchuk, 1993; Dreosti, 2001), DNA-Replikation (Wu und Wu,
1987),
enzymatische
Katalyse
(Auld,
2001),
Redoxregulation
(Maret,
2006),
Zellproliferation (Grummt et al. 1986; MacDonald, 2000; Bohnsack und Hirschi, 2004),
Zelldifferenzierung (Petrie et al., 1991) und Apoptose (Sunderman, 1995; Truong-Tran et
al., 2001b) spielt. Dabei kann Zink drei Funktionen ausüben, wobei es in vielen Enzymen
mehr als nur eine besitzt: 1) zentrales Ion für die katalytische Aktivität (Bsp.
3
Einleitung
Carboanhydrase), 2) cokatalytischer Faktor (Bsp. Phospholipase C), und 3) strukturelle
Stabilität (Bsp. Proteinkinase C, Alkoholdehydrogenase). Die häufigsten Bindungspartner
sind die Aminosäuren Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Cystein. Die
bekannteste Bindungsart ist das Zinkfinger-Motiv (Coleman, 1992; Auld, 2001; Vallee
und Falchuk, 1993). Im Allgemeinen bindet ein Zinkion an vier Aminosäuren, oft an vier
Cysteine oder an eine Kombination aus Cysteinen und Histidinen, welche in der Regel
tandemartig hintereinander liegen (Chesters, 1993).
Die empfohlene tägliche Zufuhr von Zink wurde von der Deutschen Gesellschaft für
Ernährung 2004 festgesetzt. Diese liegt für Männer bei 10 mg, für Frauen bei 7 mg, für
Kinder (1-9 Jahre) zwischen 3-7 mg, für Schwangere bei 10 mg und für stillende Frauen
bei 11 mg täglich.
Da der menschliche Körper über keinen Zinkspeicher verfügt, muss ein Gleichgewicht
zwischen Zinkaufnahme und Zinkabgabe aufrechterhalten werden, um Entgleisungen zu
vermeiden (Vallee und Falchuk, 1993). Die Zinkresorption findet vornehmlich im
Dünndarm statt und wird durch faser- und phytatreiche Nahrung, welche das Zink
chelatieren, vermindert. Demgegenüber steigern Glukose und einige Aminosäuren z.B.
Cystein und Lysin die Zinkaufnahme (Sandström et al., 1987; Lee et al., 1989; Cousins,
1985). Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich nach Exkretion mit dem Pankreassekret
über die Fäces sowie in geringen Mengen über den Urin, Schweiß, Haare und Schuppen
(Van Wouwe und Uijlenbroek, 1994). Grundsätzlich ist die Zinkverfügbarkeit nicht nur
von der Nahrungsaufnahme, sondern auch vom Alter und dem Gesundheitszustand
abhängig (Rink und Gabriel, 2000). Neben einer verminderten Zinkzufuhr, können auch
Arzneimittelinteraktionen (z.B. orale Kontrazeptiva), erhöhter Zinkbedarf (z.B. Laktation)
oder Zinkverluste bei z.B. pathologisch erhöhter Diurese, zu Zinkmangelerscheinungen
führen (Halsted und Smith, 1970; Grüngreiff, 1993). Erhöhte Zinkspiegel führen nicht zu
toxischen Erscheinungen, können aber über eine Senkung des Kupferserumspiegels
Stoffwechselstörungen und Anämien hervorrufen (Fosmire, 1990).
1.3 Der Einfluss von Zink auf das Immunsystem
Zink übt als essentielles Spurenelement eine wichtige Funktion auf das stark
proliferierende Immunsystem aus (Rink und Gabriel, 2000 und 2001; Wellinghausen et
al.,
1997a).
Die
autsosomal-rezessiv
vererbbare
Erkrankung
Acrodermatitis
enteropathica, welche auf einer Mutation im Zink-Importer-Gen SLC39A4 (Zip-4; „Zrtand Irt-like protein 4“) beruht, verdeutlicht dies am besten. Dabei handelt es sich um ein
4
Einleitung
Zinkmangel-Syndrom, bei dem zahlreiche immunologische Veränderungen und weitere
Symptome wie Anämie, Hautveränderungen, Alopezie, Diarrhoe, Hypogonadismus,
geistige
Retardierung
sowie
Wachstumsstörungen
auftreten.
Aufgrund
der
Thymusatrophie und dem damit verbundenen Immundefekt, der sich in häufig
auftretenden bakteriellen, viralen und fungalen Infektionen äußert, führt diese Erkrankung
ohne Behandlung innerhalb weniger Jahre zum Tod. Eine Therapie mit Zink in
pharmakologischen Dosen (30-150 mg/d) führt zur vollen Remission aller Symptome
(Prasad et al., 1963; Neldner und Hambidge, 1975; Neldner et al., 1978; Moynahan, 1981;
Good et al., 1982).
Ein Zinkmangel wurde auch bei anderen Krankheiten beschrieben, z.B. bei Diabetes
mellitus (Chausmer, 1998), rheumatoider Arthritis (Zoli et al., 1998), Asthma (TruongTran et al., 2001a), AIDS („acquired immune deficiency syndrome“) (Isa et al., 1992),
Sichelzellanämie (Prasad, 1995) und COPD („chronic obstructive pulmonary disease“)
(Karadag et al., 2004). Weiterhin korrelieren die bei alten Menschen auftretenden
Einschränkungen des Immunsystems mit niedrigen Serumzinkspiegeln (Rink und
Kirchner, 2000; Duchateau et al., 1981; Bodgen et al., 1990). Der pathogenetische
Zusammenhang
zwischen
der
erniedrigten
Zinkkonzentrationen
und
den
immunologischen Veränderungen der einzelnen Krankheiten ist weitgehend unbekannt.
Zink beeinflusst das Immunsystem sowohl indirekt über die Regulation von Proliferation
und Apoptose als auch indirekt über die Produktion, Reifung und Funktion von
Leukocyten. Dabei spielen der Zinkmangel und die Erhöhung des Zinkgehaltes eine
Rolle, welche das angeborene und die erworbene Immunantwort betreffen. Die
Wirkungen von Zink sind spezifisch, da weder biologisch relevante, zweiwertige
Kationen wie Calcium oder Magnesium noch strukturell verwandte Kationen wie Nickel
oder Kobalt eine solch immunregulative Funktion ausüben (Wellinghausen et al., 1996b).
Innerhalb des angeborenen Immunsystems führt eine Zinkdefizienz sowohl zu einer
verminderten Phagocytose der Makrophagen und neutrophilen Granulocyten als auch zu
einer gestörten Generierung des oxidativen Bursts (Keen und Gershwin, 1990; Allen et
al., 1983). Weiterhin ist die Anzahl der neutrophilen Granulocyten und ihre Fähigkeit zur
Chemotaxis bei niedrigen Zinkspiegeln verringert (Prasad, 2000a). Ebenso ist die Zahl
und Aktivität der NK-Zellen reduziert, welche das Zink für die Erkennung der MHC-IMoleküle durch die p58 killerhemmenden Rezeptoren benötigen, um die Killing-Aktivität
zu inhibieren (Keen und Gershwin, 1990; Ravaglia et al., 2000; Rajagopalan, 1995;
Ferencik et al., 2003). Dagegen aktivieren hohe Zinkkonzentrationen Monocyten direkt
5
Einleitung
und erhöhen die Produktion von IL-1, IL-6 und TNF-α (Driessen et al., 1994;
Wellinghausen et al., 1996a).
Im Bereich des erworbenen Immunsystems reagieren T-Zellen generell sensitiver auf eine
Zinkdefizienz als B-Zellen, da die Proliferation der T-Zellen stärker von Zink abhängig ist
(Flynn, 1984; Fraker et al., 1997). Niedrige Zinkspiegel reduzieren die Zahl der B-Zellen
und deren Vorläuferzellen (King und Fraker, 2000). Außerdem inhibiert ein Zinkmangel
die Antikörper-Produktion und das immunologische Gedächtnis, wobei gezeigt werden
konnte, dass die Antikörper-Produktion als Antwort auf T-Zell-abhängige Antigene
empfindlicher reagiert als jene auf T-Zell-unabhänige Antigene (DePasquale-Jardieu und
Fraker, 1984; Fraker et al., 1978; Moulder und Steward, 1989). Aufgrund einer
Zinkdefizienz kann es zu einer Thymusatrophie kommen, welche die Differenzierung der
T-Zellen beeinträchtigt und deren Anzahl verringert (Osati-Ashtiani et al., 1998; Fraker et
al., 1995). Dies kann dadurch erklärt werden, dass die Thymusfunktion unter anderem von
dem Hormon Thymulin abhängig ist. Dieses wird durch Thymus-Epithelzellen sekretiert
und erst nach Bindung von Zink als Cofaktor aktiv (Bach, 1981 und 1983; Saha et al.,
1995; Mocchegiani et al., 1995; Hadden, 1992). Des Weiteren ist bei niedrigen
Zinkspiegeln die Balance zwischen TH1- und TH2-Zellen aufgrund eines veränderten
Cytokinmusters gestört. Während TH1-Zellen weniger IFN-γ und IL-2 sezernieren, bleibt
die Menge der TH2-Cytokine IL-4 und IL-10 unverändert (Cakman et al., 1996; Prasad,
2000b; Bao et al., 2003). Neben den Auswirkungen einer Zinkdefizienz auf T-Zellen,
können hohe Konzentrationen ab 30 µM Zink direkt die IRAK (IL-1 Typ-I Rezeptorassoziierte Kinase) und damit die IL-1β-abhängige T-Zell-Stimulation inhibieren
(Wellinghausen et al., 1997a; Rink und Gabriel, 2001).
1.4 Die Zink-Transporter
Die intrazelluläre Zinkhomöostase wird durch zinkbindende Proteine z.B. Metallothionein
und Zinktransporter strikt reguliert (Rink und Haase, 2007). Die Zinktransporter werden
durch zwei SLC („solute linked carrier“)-Genfamilien codiert: während Mitglieder der
SLC39-Familie (Zip, „Zrt- and Irt-like proteins“) den cytoplasmatischen Zinkspiegel
durch Zinkaufnahme erhöhen, senken die Mitglieder der SLC30-Familie (ZnT, Zink
Transporter/Exporter; CDF-Familie, „cation diffusion facilitator“) die intrazelluläre
Zinkkonzentration durch den Transport von Zink aus der Zelle heraus oder in vesikuläre
Strukturen hinein. Bisher sind 15 Zips und 9 ZnTs in verschiedenen, menschlichen Zellen
6
Einleitung
beschrieben, deren Expression und Regulationen jedoch nur teilweise und in
verschiedenen Systemen analysiert wurden (Liuzzi und Cousins, 2004).
ZnT-1 wird ubiquitär exprimiert und ist der bisher einzige beschriebene Zinktransporter,
von dem bekannt ist, dass er am Zinkexport durch die Plasmamembran in vielen
verschiedenen Zellen beteiligt ist, wodurch der Zelle eine Resistenz gegenüber hohen
extrazellulären Zinkkonzentration verliehen wird (Palmiter und Findley, 1995; Liuzzi et
al., 2001; Palmiter, 2004). In Ratten wird ZnT-1 auch auf vesikulären Strukturen
exprimiert (Liuzzi und Cousins, 2004). Eine Zinksupplementierung induziert die mRNAExpression von ZnT-1 in der humanen, monocytären Zelllinie THP-1 und in der murinen
Brustepithel-Zelllinie HC-11, während eine Zinkdepletion zu einer entsprechenden
mRNA-Reduktion führt (Cousins et al., 2003a; Cousins et al., 2003b, Kelleher und
Lönnerdal, 2003). Weiterhin gibt es eine erhöhte Expression von ZnT-1 im Dünndarm, in
der Leber und in der Niere von Ratten, nachdem diesen eine zinkreiche Diät gegeben
wurde (Liuzzi et al., 2001).
ZnT-2 ist in sauren endosomalen bzw. lysosomalen Vesikeln lokalisiert, wodurch es eine
vesikuläre Zinkanreicherung ermöglicht. Diesen Zink-Exporter findet man im Darm, in
der Niere, in der Plazenta, im Hoden und in der Prostata (Palmiter et al., 1996a; Iguchi et
al., 2002). ZnT-2 wird auch im Brustepithel exprimiert und reguliert dort die
Zinkkonzentration in der Milch. Eine Missense-Mutation im ZnT-2-Gen ist verantwortlich
für eine erniedrigte Zinkkonzentration in der Milch (Chowanadisai et al., 2006).
Demgegenüber ist beschrieben, dass ZnT-2 nicht in der Leber, im Muskel, im Körperfett,
im Thymus und in der Milz exprimiert wird (Cousins et al., 2003a; Liuzzi et al., 2004).
Die Expression von ZnT-2 wird – ähnlich wie die von ZnT-1 – im Dünndarm, in der
Leber und in der Niere von Ratten induziert, nachdem sie eine hohe Zinkdosis bekommen
hatten (Liuzzi et al., 2001). Mäuse, denen eine zinkreduzierte Diät gegeben wurde, zeigten
eine Herunterregulierung von ZnT-2 mRNA im Dünndarm und Pankreas (Luzzi et al.,
2004).
ZnT-3 wird hauptsächlich in der Membran zinkreicher, synaptischer Vesikel innerhalb des
Hippokampus und im Hoden exprimiert (Wenzel et al., 1997; Palmiter et al., 1996b). In
Nervenzellen transportiert ZnT-3 das cytoplasmatische Zink in die synaptischen Vesikel
hinein, aus denen es nach Stimulation freigegeben wird (Wenzel et al., 1997). Über die
Regulation der Expression von ZnT-3 ist wenig bekannt. Im murinen Thymus scheint die
mRNA nicht auf einen Zinkmangel zu reagieren (Liuzzi und Cousins, 2004).
7
Einleitung
Es ist beschrieben, dass ZnT-4 in intrazellulären Vesikeln exprimiert wird. Neben der
Expression in der Niere und im Darm ist dieser Transporter hauptsächlich im Gehirn und
im Brustepithel zu finden, wo er die Zinkkonzentration in der Milch reguliert. Ein
vorzeitiges Stop-Codon im ZnT-4-Gen führt zum Phänotyp der sog. letalen Milchmaus,
bei der die mütterliche Milch nicht genug Zink enthält – vergleichbar zur MissenseMutation im ZnT-2-Gen (Huang und Gitschier, 1997; Cousins und McMahon, 2000;
Michalczyk et al., 2002). Während die mRNA von ZnT-4 keinen Veränderungen in der
Leber, im Darm und in der Niere von Ratten nach erhöhter oraler Zinkgabe unterliegt
(Liuzzi et al., 2001), wird sie in der Brustdrüse unter Zinkmangelbedingungen induziert
(Kelleher und Lönnerdal, 2002).
ZnT-5 wird in vielen Geweben exprimiert, wobei es in den β-Zellen des Pankreas die
höchste Expression zeigt. Dort wird das Zink in die insulinhaltigen, sekretorischen
Granula transportiert (Kambe et al., 2002). Weiterhin ist ZnT-5 auch am Zinktransport in
den Golgi-Apparat und in Vesikel beteiligt (Kambe et al., 2002; Suzuki et al., 2005a). Vor
kurzem wurde gezeigt, dass eine Splicevariante mit der Plasmamembran von CHO
(„chinese hamster ovary“)-Zellen kolokalisiert, die mit einem Konstrukt aus ZnT-5 und
dem grünfluoreszierenden Protein transfiziert wurden (Jackson et al., 2007). Außerdem
spielt ZnT-5 eine fundamentale Rolle in der Reifung von Osteoblasten und in der
Aufrechterhaltung der normalen Herzfunktion (Inoue et al., 2002). Es ist beschrieben,
dass hohe Zinkkonzentrationen in einer erhöhten Expression in der humanen
Kolonadenokarzinom-Zelllinie Caco-2 resultiert, während in Plazentazellen und in der
humanen Zervixkarzinom-Zelllinie HeLa keine Veränderungen beobachtet werden
konnten (Cragg et al., 2002; Devergnas et al., 2004; Ford, 2004). Dagegen führt
Zinkmangel zu niedrigen mRNA-Spiegeln in THP-1-Zellen (Cousins et al., 2003b) und zu
erhöhter Expression in HeLa-Zellen (Devergnas et al., 2004).
ZnT-6 vermittelt ebenso wie ZnT-5 den Zinktransport vom Cytoplasma sowohl in den
trans-Golgi-Apparat als auch in das vesikuläre Kompartiment. Während die RNA in der
Leber, in der Niere, im Gehirn und im Darm detektiert werden konnte, wurde das Protein
im Gehirn und in der Lunge gefunden (Huang et al., 2002). Es ist beschrieben, dass die
Expression sowohl nach Zinksupplementierung als auch nach Zinkdepletion in THP-1Zellen reduziert war (Cousins et al., 2003b).
Die Expression von ZnT-7 ist am stärksten in der Leber und im Dünndarm und zeigt in
der Niere, in der Milz, im Herzen, im Gehirn und in der Lunge ein niedrigeres Niveau.
Zusätzlich zu ZnT-5 und ZnT-6 ist ZnT-7 am Transport vom cytoplasmatischen Zink in
8
Einleitung
den Golgi-Apparat und in vesikuläre Strukturen beteiligt (Kirschke und Huang, 2003;
Suzuki et al., 2005a). Nach einer Zinkbehandlung steigt die Expression in THP-1-Zellen
an, während ein Zinkmangel zu einer Reduktion führt (Cousins et al., 2003b). Dagegen
hat eine Zinksupplementierung in HeLa-Zellen keinen Einfluss auf die Expression,
während eine Zinkdepletion diese induziert (Devergnas et al., 2004).
Für ZnT-8 konnte bisher keine Expression in den mononukleären Zellen des peripheren
Blutes (PBMC) gezeigt werden. Es ist beschrieben, dass diese auf die Leber und den
Pankreas restringiert ist. Im Bereich des Pankreas wird ZnT-8 hauptsächlich in den
Langerhans-Inseln exprimiert, wo es den Transport von cytoplasmatischem Zink in
intrazelluläre Vesikel vermittelt, welches dort für die Reifung und Speicherung des
Insulins benötigt wird (Chimienti et al., 2004; Chimienti et al., 2005). Über eine
Regulation ist bisher nichts bekannt.
ZnT-9 wird auch als HUEL bezeichnet und zeigt eine weit verbreitete Expression (Liuzzi
und Cousins, 2004; Sim und Chow, 1999). Es gibt keine Informationen über
Regulationsmechanismen.
Zip-1 wird in vielen verschiedenen Zellen und Geweben exprimiert (Gaither and Eide,
2000 und 2001). Die subzelluläre Lokalisation von Zip-1 ist abhängig vom Zelltyp. So
konnte die Expression sowohl in der Plasmamembran als auch im vesikulären
Kompartiment und im Endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden (Milon et al.,
2001; Kambe et al., 2004). Bei hohen Zinkkonzentrationen wird die Expression in THP-1Zellen
herunter reguliert, während unter Zinkmangelbedingungen
eine leichte
Expressionssteigerung beschrieben wird (Cousins et al., 2003b; Ibs, 2006). Auch in
B-Lymphocyten wird die Expression von Zip-1 nach Induktion einer Zinkdefizienz
erhöht, während in PBMC keine Veränderung der Expression weder unter
Zinksupplementierung noch Zinkmangel zu beobachten ist (Ibs, 2006).
Zip-2 ist in der Plasmamembran zu finden, konnte aber nur in PBMC, Monocyten, im
Gewebe der Prostata und im Uterus detektiert werden (Gaither and Eide, 2000 und 2001;
Cao et al., 2001). In PBMC, Monocyten und THP-1-Zellen konnte die Expression von
Zip-2 durch einen Zinkmangel erhöht werden (Cao et al., 2001; Cousins et al., 2003b; Ibs,
2006). Ergänzend wurde eine niedrigere Expression von Zip-2 in THP-1-Zellen nach
Zinksupplementierung gefunden (Cousins et al., 2003b).
Zip-3 wird in THP-1-Zellen exprimiert. Zur Regulation gibt es widersprüchliche
Ergebnisse. So wurde unter Zinkmangelbedingungen sowohl keine Veränderung als auch
eine Herunterregulation beobachtet (Cousins et al., 2003b; Ibs, 2006). In B-Zellen steigt
9
Einleitung
die Expression unter zinkdefizienten Bedingungen (Ibs, 2006). Demgegenüber verändert
sich die Expression von Zip-3 weder in T-Lymphocyten noch in PBMC (Ibs, 2006). In der
Maus wird eine Expression im Knochenmark, in der Milz, im Dünndarm und in der Leber
beschrieben (Liuzzi und Cousins, 2004). In murinen Zellen konnte unter Zinkmangel die
Expression von Zip-3 auf der Zelloberfläche induziert werden (Wang F et al., 2004a).
Zip-4 wird im Dünndarm und in den Nieren exprimiert. Eine Mutation im dazugehörigen
Gen SLC39A4 ist verantwortlich für die durch eine Zinkdefizienz gekennzeichnete
Erbkrankheit Acrodermatitis enteropathica (Wang K et al., 2002; Kim et al., 2004). Die
Expression von Zip-4 wird im Dünndarm von Mäusen nach einer zinkarmen Kost
gesteigert und nach Zinksupplementierung erniedrigt (Dufner-Beattie et al., 2003).
Zip-5 wird in vielen Geweben exprimiert, ist aber vorrangig im Dünndarm zu finden
(Dufner-Beattie et al., 2004). Die Expression von Zip-5 in Mäusen wird nicht durch Zink
reguliert (Wang F et al., 2004b).
Zip-6 ist sowohl in der Plasmamembran als auch im Endoplasmatischen Retikulum
lokalisiert und wird im Brustgewebe, in der Prostata, in der Hirnanhangdrüse und im
Gehirn exprimiert (Taylor und Nicholson, 2003). Es ist beschrieben, dass die Expression
von Zip-6 durch LPS (Lipopolysaccharid) in dendritischen Zellen erniedrigt wird
(Kitamura et al., 2006).
Zip-7 wird ubiquitär exprimiert und ist intrazellulär im Golgi-Apparat lokalisiert. Erhöhte
Zinkbedingungen haben in der humanen Prostata-Zellline RWPE1 keinen Einfluss auf die
Expression der mRNA, erniedrigen aber die Expression des korrespondierenden Proteins
(Huang et al., 2005).
Zip-14 wird in der Plasmamembran vieler Gewebe exprimiert (Taylor et al., 2005). Die
Expression von Zip-14 wird durch IL-6 in der Leber heraufreguliert und ist so eventuell
für die Hypozinkämie während der Akuten-Phase-Antwort verantwortlich (Liuzzi et al.,
2005).
Die übrigen humanen Zink-Importer sind bisher noch nicht näher charakterisiert worden.
In der Abbildung 1.1 sind die bisher bekannten Daten bezüglich der subzellulären
Lokalisierung und der Transportrichtung der verschiedenen Zink-Transporter zusammen
gefasst.
10
Einleitung
Abb. 1.1: Subzelluläre Lokalisierung und Transportrichtung der Zink-Importer (Zip) und
Zink-Exporter (ZnT). Während Mitglieder der Zip-Familie den cytoplasmatischen Zinkspiegel
durch Zinkaufnahme aus dem Extrazellularraum oder aus intrazellulären Vesikeln erhöhen, senken
die Mitglieder der ZnT-Familie die intrazelluläre Zinkkonzentration durch den Transport von Zink
aus der Zelle heraus oder in vesikuläre Strukturen hinein (verändert nach: Rink und Haase, 2007).
1.5 Zink und Apoptose
Bei der Apoptose handelt es sich um einen streng regulierten, programmierten Zelltod, der
im Gegensatz zur Nekrose ohne eine Entzündungsreaktion stattfindet. Auf diesem Wege
wird auf natürliche Art und Weise neben der Vernichtung potenziell autoreaktiver Zellen
auch die Entartung von Zellen und somit die Entstehung von Krebs verhindert, wodurch
das zelluläre Gleichgewicht aufrechterhalten wird (Hanahan und Weinberg, 2000). Die
Apoptose kann über zwei Wege ablaufen. Der extrinsische Weg wird durch
Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche ausgelöst, während der intrinsische Weg über die
Mitochondrien vermittelt wird. Das Ergebnis beider Mechanismen ist die Aktivierung von
Caspasen, die im Cytosol präformiert vorliegen und durch die Spaltung zellulärer
Substrate zu den charakteristischen biochemischen und morphologischen Veränderungen
führen (Igney und Krammer, 2002).
Es ist bekannt, dass Zink für die Regulation der Apoptose eine entscheidende Bedeutung
zukommt (Sunderman, 1995). Allerdings ist der Mechanismus noch nicht vollständig
11
Einleitung
geklärt. Die Situation wird dadurch erschwert, dass sowohl zu niedrige als auch zu hohe
Zinkkonzentrationen zur Apoptose und auch Nekrose führen können (Martin et al., 1991;
McCabe et al., 1993; Zalewski und Forbes, 1993; Zalewski et al., 1993; Treves et al.,
1994; Matsushita et al., 1996; Kuo et al., 1997; Hamatake et al., 2000; Kown et al., 2000;
Untergasser et al., 2000; Kondoh et al., 2002 und 2005). Dies bedeutet zugleich, dass ein
gewisser Zinkspiegel notwendig ist, um die Apoptose zu inhibieren (Truong-Tran et al.,
2001b). In vitro wurde gezeigt, dass Zinkkonzentrationen im mikromolaren Bereich die
Aktivität verschiedener Caspasen inhibieren können (Perry et al., 1997; Stennicke und
Salvesen, 1997; Maret et al., 1999), und dass die durch Zinkentzug ausgelöste Apoptose
von der Caspase-3 abhängig ist (Truong-Tran et al., 2000; Chai et al., 2000). Der
schützende Effekt von Zinkionen beruht weiterhin auf einer Interaktion mit Calcium- und
Magnesium-abhängigen Endonukleasen, wodurch die für die Apoptose typische DNAFragmentierung inhibiert wird (Cohen und Duke, 1984; Beletsky et al., 1989; Giannakis et
al., 1991; Torriglia et al., 1997). Außerdem ist beschrieben, dass Zink das Verhältnis von
Bcl-2 (anti-apoptotisch) zu Bax (pro-apoptotisch) erhöht (Fukamachi et al., 1998), und
dass ein Zinkmangel die Translokation von Cytochrom C aus den Mitochondrien induziert
(Kolenko et al., 2001).
12
Zielsetzung
2
Zielsetzung
Trotz der immensen Bedeutung von Zink für das Immunsystem und der vielseitigen
Einsatzmöglichkeiten
einer
pharmakologischen
Zinksubstitution
herrscht
noch
weitgehend Unklarheit über die daran beteiligten Mechanismen.
Im Rahmen dieser Arbeit soll zunächst die Verteilung der humanen Zink-Exporter
(hZnTs) und deren Charakterisierung in mononukleären Zellen analysiert werden. Dabei
soll die Grundexpression der hZnTs in primären, aufgereinigten Zellen mit der in
Zelllinien verglichen werden. Ferner sollen die hZnTs sowohl in B-Zellen, T-Zellen,
Monocyten als auch in PBMC quantifiziert und der Einfluss einer Zinksupplementierung
und Zinkdepletion auf die Expression untersucht werden. In dem Zusammenhang soll
auch die intrazelluläre Zinkkonzentration als Antwort auf eine veränderte Expression der
hZnTs unter Zinkmangel analysiert werden, um eine Erklärung für die unterschiedlichen
Reaktionen der verschiedenen Zellpopulationen auf eine Zinkdepletion zu finden.
Weiterhin wird eine mögliche Assoziation zwischen der Expression von hZnT-8 und
Diabetes Gegenstand der Untersuchungen sein. Unter Berücksichtigung der Analyse der
Zink-Exporter und der bereits vorhandenen Analyse der Zink-Importer soll anschließend
der Einfluss von Zink auf die Apoptose und auf die durch die Interleukine IL-1, IL-2 und
IL-4 induzierte, intrazelluläre Signaltransduktion in T-Zellen analysiert werden. Da
bekannt ist, dass Zink direkt die IRAK (IL-1 Typ-I Rezeptor-assoziierte Kinase) und
damit die IL-1β-abhängige T-Zell-Stimulation inhibieren kann, soll die Aktivierung der
Zelle durch IL-1β unter Zinkmangelbedingungen analysiert werden. In Bezug auf die
durch IL-2- und IL-4-vermittelte Signaltransduktion soll eine Erklärung für den
unterschiedlichen, gegensätzlichen Einfluss von Zink auf diese beiden Signalwege
gefunden werden.
Die
mit
immunologischen
sowie
zell-,
protein-
und
molekularbiologischen
Arbeitstechniken durchgeführten Untersuchungen und daraus gewonnenen Ergebnisse
dieser Arbeit sollen dabei helfen, Aussagen über die Wirkungsweise von Zink in vitro
treffen
zu
können,
um
damit
einen
Ansatzpunkt
für
einen
Einsatz
einer
Zinksupplementierung in der Therapie in vivo zu erhalten.
13
Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1
Geräte
•
Analysenwaage, 770/GS/GJ (Kern, Balingen-Frommern)
•
Belichtungskassette-K für Röntgenfilme, 20x25cm (BioRad Laboratories,
München)
•
Blot-Transfer-Kammer, Mini-Trans (BioRad Laboratories, München)
•
CO2-Inkubator, MCO-17AIC (Sanyo, Gunma, Japan)
•
Durchflusscytometer, FACS-Calibur (Becton-Dickinson, Heidelberg)
•
Elektrophorese-Kammer für Agarosegele, Wide Mini-Sub Cell GT (Biorad,
München)
•
Elektrophorese-Kammer für Polyacrylamidgele, Mini-Protean 3 Electrophoresis
Module Assembly (Biorad, München)
•
Elektrophorese-Netzgerät, Power Pac 300 (Biorad, München)
•
ELISA-Reader, Magellan (Tecan, Crailsheim)
•
ELISA-Washer, Atlantis (Asys Hitech, Eugendorf)
•
Fluoreszenzmikroskop, Axioskop (Zeiss, Köln)
•
Folienschweißgerät, Polystar 100 GE (Rische und Herfurth, Hamburg)
•
Gefrierschrank, – 20 °C (Bosch, München)
•
Gefrierschrank, – 80 °C, MDF-U71V (Sanyo, Gunma, Japan)
•
Kamera (Nikon, Düsseldorf)
•
Kühlschrank (Bosch, München)
•
Laborwaage, 1265 MP (Sartorius, Göttingen)
•
Magnet, BD IMagnet (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
•
Magnetrührer, MR3001 (Heidolph, Schwabach)
•
Mikroskop Dialux 22EB (Leitz, Wetzlar)
•
Multipipette, Multipette plus (Eppendorf, Hamburg)
•
Multiplate Reader, Magellan (Tecan Ultra 384, Crailsheim)
•
PCR-Gerät, Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Foster City,
USA)
•
pH-Messgerät, HI 9321 (Hanna Instruments, Kehl am Rhein)
14
Material und Methoden
•
Photometer, BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg)
•
Pipetten, 0,5-10 µl, 10-100 µl und 100-1000 µl, Research (Eppendorf, Hamburg)
•
Pipettierhilfe, pipetus-akku (Hirschmann, Eberstadt)
•
Rollenschüttler, CAT RM 5 (Neolab, Heidelberg)
•
Röntgenfilm-Entwickler, Curix HT-530 AGFA (AGFA, Köln)
•
Schüttler, HS 250 basic (IKA Labortechnik, Staufen)
•
Standzentrifuge, Varifuge 3.0 RS (Heraeus Christ, Osterode)
•
Standzentrifuge, Multifuge 3 S-R (Heraeus Christ, Osterode)
•
Sterile Werkbank, KR-210 (Kojair, Vilppula, Finnland)
•
Taqman-PCR-Gerät, Sequence Detection System 7000 (Applied Biosystems,
Foster City, USA)
•
Thermomixer, comfort und compact (Eppendorf, Hamburg)
•
Tischzentrifuge, 5417 R (Eppendorf, Hamburg)
•
Tischzentrifuge, Biofuge A (Heraeus, Osterode)
•
Ultraschallgerät, Vibra Cell (Sonics & Materials, Danbury, Connecticut, USA)
•
Umkehrmikroskop (Zeiss, Köln)
•
UV-Cleaner Box, UVC/T (Lab4You, Berlin)
•
UV-Geldokumentationskammer, BioRad Gel Dok XR Systems (Biorad, München)
•
Video Graphic Printer UP-895CE (Sony, Tokyo, Japan)
•
Vortex, Reax (Heidolph, Schwabach)
•
Western Blot-Kammer, Mini-Protean 3 Electrophoresis Module Assembly
(Biorad, München)
3.1.2
Laborbedarf
•
Bakterienfilter, 0,2 µm (Pall, Dreieich)
•
Belichtungskassette (Biorad, München)
•
Bürkerkammer mit Deckgläschen (Brand, Wertheim)
•
Cellscraper, 25 cm (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Einmalküvetten (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Einmalpipetten, 5 ml, 10 ml und 25 ml (Greiner, Nürtingen)
•
Erlenmeyerkolben, 250 ml (Schott, Mainz)
•
FACS-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Gel Blotting Papier GB003 (Schleicher und Schuell, Dassel)
15
Material und Methoden
•
Fotopapier URP-110HG (Sony, Tokyo, Japan)
•
Frischhaltefolie (RUF, Bremen)
•
Glasplatten, Outer Glass PLT W/1,5 mm, M-P 3 (BioRad Laboratories, München)
•
Glasplatten, Short Plates, M-P 3 (BioRad Laboratories, München)
•
Kanülen, 0,9 x 40 mm (Terumo, Leuven, Belgien)
•
Klebefolien, Optical Adhesive Covers (Applied Biosystems, Foster City, USA)
•
Kunststoffröhrchen mit Schraubverschluss, 15 ml und 50 ml (Falcon, Heidelberg)
•
Latex Einmalhandschuhe (Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien)
•
Nitrocellulose-Membran Trans-Blot Transfer Medium, pure (Biorad, München)
•
Objektträger für Suspensionszellen, 76 x 26 mm (Engelbrecht, Edermünde)
•
Objektträger für adhärente Zellen, Culture Slide (Becton Dickinson, Heidelberg)
•
PCR-Reaktionsgefäß, 0,2 ml (Eppendorf, Hamburg)
•
Pipettenspitzen, 1-10 µl und 10-100 µl (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Pipettenspitzen, 100-1000 µl (Eppendorf, Hamburg)
•
Pipettenspitzen Combitips, 1 ml, 2,5 ml, 5 ml und 10 ml (Eppendorf, Hamburg)
•
Pipettenspitzen, gestopft, 1-10 µl, 10-100 µl und 100-1000 µl (Biozym,
Oldendorf)
•
Polystyren-Röhrchen mit Deckel, 13 ml (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Reaktionsgefäße, 1,5 ml mit Schraubverschluss (VWR, Darmstadt)
•
Reaktionsplatten, MicroAmp Optical 96-Loch (Applied Biosystems, Foster City,
USA)
•
Schlauchfolie, PE, 0,2 mm (VWR International, Darmstadt)
•
Schwammkissen, 8x11 cm (BioRad Laboratories, München)
•
S-Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Spritzen, 20 ml (Braun, Melsungen)
•
UV-Einmalküvette, UVette (Eppendorf, Hamburg)
•
X-OMAT UV Plus Film (Kodak, Stuttgart)
•
Zellkulturflaschen, T25 (Sarstedt, Nümbrecht)
•
Zellkulturflaschen, T25 (Nunc, Roshilde, Dänemark)
•
Zellkulturflaschen, T75 (Nunc, Roshilde, Dänemark)
•
Zellkulturplatten, 6-Loch (Becton Dickinson, Heidelberg)
•
Zellkulturplatten, 24-Loch (Becton Dickinson, Heidelberg)
16
Material und Methoden
3.1.3
Zellkulturmedien und Mediumzusätze
•
β-Mercaptoethanol (Merck, Darmstadt)
•
Fetales Kälberserum (PAA, Cölbe)
•
Ficoll-Trennlösung 1,077 g/ml (Biochrom, Berlin)
•
Heparin-Natrium, Liquemin N 5000 (Roche, Mannheim)
•
Kulturmedium DMEM (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Kulturmedium RPMI 1640 (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
L-Glutamin, 200 mM (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Natrium-Pyruvat, 100 mM (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Nicht-essentielle Aminosäuren, 100x (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Phosphate Buffered Saline ohne Ca2+ und Mg2+, 1x (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Phosphate Buffered Saline ohne Ca2+ und Mg2+, 10x (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Penicillin/Streptomycin, 10.000 U/ml + 10.000 µg/ml (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Proteinfreies Medium, Ultradoma P.F. (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Trypsin (Bio Whittaker, Heidelberg)
3.1.4
Immunologische Reagenzien
•
AB-Serum (PAA, Cölbe)
•
IL-1β, rekombinant, human (Strathmann, Hannover)
•
IL-2, rekombinant, human (PeproTech, Rocky Hill, USA)
•
IL-4, rekombinant, murin (PeproTech, Rocky Hill, USA)
•
Kaninchen-anti-human-ZnT-1-Antikörper (freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von Dr. Dianne Ford, Newcastle, UK)
•
Kaninchen-anti-human-ZnT-4-Antikörper (freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von Dr. M. Leigh Ackland, Victoria, Australia)
•
Kaninchen-anti-Akt-Antikörper (Cell Signaling, Beverly, USA)
•
Kaninchen-anti-Phospho-Akt-Antikörper (Ser473) (193H12) (Cell Signaling,
Beverly, USA)
•
Kaninchen-anti-Phospho-p38 MAPK-Antikörper (Thr180/Tyr182) (3D7) (Cell
Signaling, Beverly, USA)
•
Kaninchen-anti-p42/44 MAPK-Antikörper (Cell Signaling, Beverly, USA)
•
Kaninchen-anti-Phospho-p42/44 MAPK-Antikörper (Thr202/Tyr204) (Cell
Signaling, Beverly, USA)
17
Material und Methoden
•
Kaninchen-anti-Phospho-STAT6-Antikörper (Tyr641) (Cell Signaling, Beverly,
USA)
•
Kaninchen-anti-STAT6-Antikörper (Cell Signaling, Beverly, USA)
•
Maus-IgG1κ-Isotypkontrolle-FITC konjugiert (BD Biosciences Pharmingen,
Heidelberg)
•
Maus-anti-human-CD3-FITC-konjugiert (BD Biosciences Pharmingen,
Heidelberg)
•
Maus-anti-human-CD19-FITC-konjugiert (BD Biosciences Pharmingen,
Heidelberg)
•
Phytohämagglutinin (Becton Dickinson, Heidelberg)
•
Ziege-anti-Biotin-Sekundärantikörper-HRP konjugiert (Cell Signaling, Beverly,
USA)
•
Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper-HRP konjugiert (Cell Signaling,
Beverly, USA)
•
3.1.5
Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper-FITC konjugiert (Dianova, Hamburg)
Molekularbiologische und ELISA-Reagenzien
•
100 bp DNA-Leiter, O´Range Ruler (MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
•
6 x O´Range Loading Dye Solution (MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
•
Agarose (Gibco, Karlsruhe)
•
Assay-Diluent für ELISA (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
•
Capture-Antikörper für IL-2-ELISA (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
•
Detection-Antikörper für IL-2-ELISA (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
•
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 mM (Applied Biosystems, Warrington,
Großbritannien)
•
Essigsäure (Merck, Darmstadt)
•
Ethidiumbromid (Sigma, Steinheim)
•
HotStarTaq-Polymerase, 5 U/µl (Qiagen, Hilden)
•
Magnesiumchlorid, 25 mM (Qiagen, Hilden)
•
Na2EDTA (Sigma, Steinheim)
•
Oligonukleotidprimer (TIB Molbiol, Berlin)
•
PCR-Puffer, 10x (Qiagen, Hilden)
•
Rox, 100 mM (TIB Molbiol, Berlin)
18
Material und Methoden
•
Stop-Lösung für ELISA (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
•
Substratlösungen A und B für ELISA (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
•
Tris-Base, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Merck, Darmstadt)
•
Tris-HCl, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Merck, Darmstadt)
•
Waschlösung für ELISA, 20x (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg)
3.1.6
Sonstige Reagenzien
•
Acrylamid/bis-Acrylamid, 30 % (Sigma, Steinheim)
•
Actinomycin D (Sigma, Steinheim)
•
Ammoniumpersulfat (BioRad Laboratories, München)
•
Aqua ad iniectabilia (Braun, Melsungen)
•
Aqua Spüllösung (Delta Select, Pfullingen)
•
Bradford-Reagenz (Biorad, München)
•
Bromphenolblau (Riedel-de-Haën, Hannover)
•
BSA, Bovines Serumalbumin (Fluka, Buchs, Schweiz)
•
Calciumchlorid (Merck, Darmstadt)
•
DMSO, Dimethyl-Sulfoxid (Merck, Darmstadt)
•
EDTA, Ethylendiamintetraacetat (Merck, Darmstadt)
•
Ethanol, absolut (J.T. Baker, Deventer, Holland)
•
Ethanol, 70 %, vergällt (Universitätsklinikum, Aachen)
•
FluoZin-3 (Molecular Probes, Eugene, USA)
•
Glycerin (Roth, Karlsruhe)
•
Glycin (Sigma, Steinheim)
•
Glucose (Merck, Darmstadt)
•
HBSS, Hank´s Balanced Salt Solution (Sigma, Steinheim)
•
Hepes, 1 M (Bio Whittaker, Heidelberg)
•
Hepes (Merck, Darmstadt)
•
Hoechst 33258 (Sigma, Steinheim)
•
Isopropanol (Merck, Darmstadt)
•
Kaliumchlorid (Merck, Darmstadt)
•
LumiGLO Reagenz und Peroxid (Cell Signaling, Beverly, USA)
•
Magermilchpulver Sucofin (Trade Service International, Zeven)
•
Magnesiumchlorid, 25mM (Qiagen, Hilden)
19
Material und Methoden
•
Magnesiumchlorid (Merck, Darmstadt)
•
Methanol (Universitätsklinikum, Aachen)
•
Natriumchlorid (Merck, Darmstadt)
•
Natriumdihydrogenphosphat (Fluka, Buchs, Schweiz)
•
Natriumvanadat (Sigma, Steinheim)
•
Natronlauge (Merck, Darmstadt)
•
PFA, Paraformaldehyd (Sigma, Steinheim)
•
Propidiumiodid, 1 mg/ml (Sigma, Steinheim)
•
Ponceau S (Fluka, Buchs, Schweiz)
•
Protein-Leiter, biotinyliert (Cell Signaling, Beverly, USA)
•
Natriumpyrithion (Sigma, Steinheim)
•
Salzsäure, 32 % (Merck, Darmstadt)
•
Saponin (Riedel-de-Haën, Hannover)
•
SDS, Sodiumdodecylsulfat (Merck, Darmstadt)
•
TEMED, N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin (Sigma, Steinheim)
•
TPEN, N, N, N´, N´-Tetrakis-(2-Pyridyl-Methyl)-ethylendiamin (Sigma,
Steinheim)
•
Trypanblau, 0,4 % (Sigma, Steinheim)
•
Tween 20 (Merck, Darmstadt)
•
Zinksulfat (Sigma, Steinheim)
3.1.7
Kommerziell erhältliche Testkits
•
BioRad Protein Assay Farbstoff-Konzentrat (BioRad Laboratories, München)
•
Dynal B Cell Negative Isolation Kit (Invitrogen, Karlsruhe)
•
Dynal T Cell Negative Isolation Kit Ver II (Invitrogen, Karlsruhe)
•
human Annexin V/FITC-Kit (Bender MedSystems Diagnostic, Wien, Österreich)
•
Komponenten-Set zur Herstellung eines IL-2-ELISAs, murin (BD Biosciences
Pharmingen, Heidelberg)
•
QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden)
•
QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden)
•
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden)
•
Reverse Transcription System (Promega, Heidelberg)
•
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden)
20
Material und Methoden
3.2 Methoden
3.2.1
Präparation der Zink-Lösung
Das Zinksulfat wird zu einer 100 mM Stammlösung in Aqua ad iniectabilia gelöst und
mittels eines Bakterienfilters (Porengröße 0,2 µm) steril filtriert. Die Stammlösung wird
mit Aqua ad iniectabilia zu einer 10 mM Lösung und anschließend mit proteinfreiem
Medium (Ultradoma) zu einer 2 mM Lösung weiter verdünnt.
3.2.2
Zellkulturen
Die in dieser Arbeit verwendeten Zellen werden stets bei 37°C, 5 % CO2 und gesättigter
Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Suspensionszellen werden zweimal wöchentlich nach
mikroskopischer Kontrolle gezählt, auf die entsprechenden Zellkonzentrationen
eingestellt und in frisches Kulturmedium umgesetzt. Die adhärenten Zellen werden
zweimal wöchentlich 1:10 in frisches Kulturmedium umgesetzt. Die frisch isolierten,
primären Zellen werden entsprechend des jeweiligen Versuchsansatzes eingesetzt. In der
Tabelle 3.1 sind das jeweilige Kulturmedium, die Zusätze und der Zellumsatz der
einzelnen Zelllinien aufgelistet. Sofern Fetales Kälberserum (FCS) verwendet wurde,
handelt es sich immer um für 30 Minuten bei 56 °C inaktiviertes Serum.
21
Material und Methoden
Tab. 3.1: Auflistung der verwendeten Zellen.
Zelle
Kulturmedium
Zusätze
Zellumsatz
20 % FCS
Caco-21
DMEM
1 % L-Glutamin
1 % Penicillin/Streptomycin
1:10
1 % NEAA
10 % FCS
1 % L-Glutamin
CTLL-22
RPMI 1640
1 % Penicillin/Streptomycin
1x104/ml
1 % Natriumpyruvat
1,8 µl β-Mercaptoethanol
5 % FCS
EL-4 6.13
1 % L-Glutamin
RPMI 1640
1x105/ml
1 % Penicillin/Streptomycin
10 % FCS
1 % L-Glutamin
Jurkat1
RPMI 1640
1 % Penicillin/Streptomycin
2x105/ml
1 % Natriumpyruvat
1 % NEAA
K-5621, Molt-41,
Raji
1
10 % FCS
RPMI 1640
1 % L-Glutamin
2x105/ml
1 % Penicillin/Streptomycin
10 % FCS
THP-11
1 % L-Glutamin
RPMI 1640
1 % Penicillin/Streptomycin
2x105/ml
2,5 µl β-Mercaptoethanol
10 % FCS
Primäre Zellen
RPMI 1640
1 % L-Glutamin
1 % Penicillin/Streptomycin
1
von DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)
2
von ATCC („American Type Culture Collection“)
3
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Michael Martin, Gießen
22
Material und Methoden
3.2.3
Isolierung von mononukleären Zellen
PBMC (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) zeichnen sich durch eine im
Vergleich zu Granulocyten und Erythrocyten geringere Dichte aus und können daher über
eine Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Ficoll ist eine Lösung aus
einem hochmolekularen Zucker und einem Röntgenkontrastmittel mit einer Dichte von
1,077 g/ml. Während sich die Erythrocyten aufgrund einer höheren Dichte am Boden
absetzen, befinden sich die Granulocyten nach der Zentrifugation in der unteren Phase.
Thrombozyten besitzen eine noch geringere Dichte als mononukleäre Zellen und sammeln
sich in der oberen Phase an, so dass die PBMC aus der Interphase abgenommen werden
können.
Reagenzien:
•
Heparin (10.000 Einheiten/ml)
•
PBS (1x)
•
Ficoll der Dichte 1,077 g/ml
•
RPMI-Kulturmedium
mit
10
%
FCS,
1
%
L-Glutamin
und
1
%
Penicillin/Streptomycin
Durchführung:
•
Mit Heparin (50 Einheiten/ml Blut) antikoaguliertes Vollblut wird 1:1 mit PBS
(1x) vorsichtig gemischt
•
In einem 50 ml Röhrchen wird Ficoll vorgelegt und 1:1 mit dem Vollblut/PBSGemisch überschichtet
•
Es wird 20 min. bei 20 °C und 600 g zentrifugiert
•
Mit einer Pipette werden die PBMC aus der Interphase abpipettiert
•
Die isolierten PBMC werden mit PBS (1x) aufgefüllt und 10 min. bei 300 g
zentrifugiert
•
Das Pellet wird erneut in PBS (1x) resuspendiert und 10 min. bei 300 g gewaschen
•
Das Pellet wird in Kulturmedium aufgenommen und die gewünschte Zellzahl
eingestellt
3.2.4
Erythrocytenlyse isolierter mononukleärer Zellen
Bei der Isolierung von PBMC stellen Erythrocyten eine Kontamination dar, die durch eine
hypotone Lyse entfernt werden. Dabei werden die PBMC in sterilem Wasser, d.h. in einer
hypotonen Lösung, resuspendiert, bevor durch die Zugabe einer zweifach konzentrierten
23
Material und Methoden
physiologischen Lösung, z.B. in Form von PBS (2x), wieder isotone Bedingungen
hergestellt werden. Da die kernlosen Erythrocyten gegenüber einer hypotonen Lösung
weitaus empfindlicher reagieren als kernhaltige Zellen, können sie so selektiv entfernt
werden.
Reagenzien:
•
Aqua Spüllösung
•
PBS (10x und 1x)
•
RPMI-Kulturmedium
mit
10
%
FCS,
1
%
L-Glutamin
und
1
%
Penicillin/Streptomycin
Durchführung:
•
Die PBMC werden nach einer 10-minütigen Zentrifugation bei 300 g in 10 ml
Aqua Spüllösung resuspendiert und sofort wieder mit 10 ml PBS (2x) aufgefüllt
•
Es wird 10 min. bei 300 g zentrifugiert
•
Das Pellet wird in 50 ml PBS (1x) aufgenommen und die Zellsuspension wird
erneut für 10 min. bei 300 g zentrifugiert
•
Das Pellet wird in Kulturmedium aufgenommen und die gewünschte Zellzahl
eingestellt
3.2.5
Isolierung von primären, humanen T-Zellen
Mit dem Dynal T Cell Negative Isolation Kit Ver II der Firma Invitrogen können primäre,
humane T-Zellen negativ isoliert werden. Dabei wird zu den isolierten, mononukleären
Zellen ein Antikörpermix gegeben, der aus monoklonalen, murinen Antikörpern besteht,
die gegen Nicht-T-Zellen gerichtet sind. Anschließend werden die Dynabeads
hinzugegeben, die mit einem monoklonalen, humanen anti-Maus IgG Antikörper
beschichtet sind. Diese binden an die murinen Antikörper, die an den Nicht-T-Zellen
gebunden haben. Durch den Einsatz eines Magneten können diese Zellen entfernt werden,
so dass im Überstand reine, ungekoppelte T-Zellen vorliegen.
Reagenzien:
•
Puffer 1: PBS (1x), 0,1 % FCS, 2 mM Na2EDTA
•
FCS
Durchführung:
•
Nach der Isolierung der mononukleären Zellen (siehe 3.2.3) erfolgte die
Durchführung exakt nach der Anleitung der Firma Invitrogen
24
Material und Methoden
3.2.6
Isolierung von primären, humanen B-Zellen
Mit dem Dynal B Cell Negative Isolation Kit der Firma Invitrogen können primäre,
humane B-Zellen negativ isoliert werden. Dabei wird zu den isolierten, mononukleären
Zellen ein Antikörpermix gegeben, der aus monoklonalen, murinen Antikörpern besteht,
die gegen Nicht-B-Zellen gerichtet sind. Anschließend werden die Dynabeads
hinzugegeben, die mit einem monoklonalen, humanen anti-Maus IgG Antikörper
beschichtet sind. Diese binden an die murinen Antikörper, die an den Nicht-B-Zellen
gebunden haben. Durch den Einsatz eines Magneten können diese Zellen entfernt werden,
so dass im Überstand reine, ungekoppelte B-Zellen vorliegen.
Reagenzien:
•
Puffer 1: PBS (1x), 0,1 % FCS, 2 mM Na2EDTA
Durchführung:
•
Nach der Isolierung der mononukleären Zellen (siehe 3.2.3) erfolgte die
Durchführung exakt nach der Anleitung der Firma Invitrogen
3.2.7
Zellzahlbestimmung
Durchführung:
•
10 µl der Zellsuspension werden in eine Bürkerkammer pipettiert und gezählt
•
Die Zellzahl wird wie folgt berechnet:
Zellzahl/ml = Anzahl der lebenden Zellen x Kammerfaktor x 1000
Kammerfaktor = 15,63
3.2.8
Vitalitätstest
Trypanblau hat die Eigenschaft, tote Zellen anzufärben, so dass bei dieser Art der
Zellzahlbestimmung zwischen Lebendzellzahl und den toten Zellen (blau) unterschieden
werden kann.
Reagenzien:
•
Trypanblau
Durchführung:
•
10 µl Zellen werden mit 10 µl Trypanblau gemischt
•
10 µl der Zellsuspension werden in eine Bürkerkammer pipettiert und gezählt
•
Die Zellzahl wird wie folgt berechnet:
Zellzahl/ml = Anzahl der lebenden Zellen x Kammerfaktor x Verdünnung x 1000
Kammerfaktor = 15,63; Verdünnung = 2
25
Material und Methoden
3.2.9
RNA-Isolierung aus Lymphocyten
Das RNeasy Mini Kit der Firma Qiagen ermöglicht die Isolierung von RNA aus
Lymphocyten ab einer Größe von ca. 200 Nukleotiden, d.h. kleinere RNA-Fragmente, wie
z.B. 5.8S rRNA, 5S rRNA und tRNA, werden nicht isoliert. Die Zellen werden zunächst
mit hoch-denaturierendem Guanidinisothiocyanat lysiert, wodurch störende RNasen
inaktiviert werden. In Gegenwart von Ethanol bindet die intakte RNA an eine Silica-GelMembran. Für die Elution der RNA wird RNase-freies Wasser benutzt.
Reagenzien:
•
RLT-Puffer
•
β-Mercaptoethanol
•
Ethanol (70 %)
•
RW1-Puffer
•
RPE-Puffer
•
RNase-freies Wasser
Durchführung:
•
Die Durchführung erfolgte exakt nach der Anleitung der Firma Qiagen
•
Die RNA wird nach der Konzentrationsbestimmung bei – 80 °C eingefroren (siehe
3.2.12)
3.2.10 RNA-Isolierung aus Vollblut
Mit dem QIAamp RNA Blood Mini Kit der Firma Qiagen kann RNA direkt aus Vollblut
ab einer Größe von ca. 200 Nukleotiden isoliert werden, d.h. kleinere RNA-Fragmente,
wie z.B. 5.8S rRNA, 5S rRNA und tRNA, werden nicht isoliert. Zu Beginn werden die
Erythrocyten selektiv lysiert und damit die Leukocyten angereichert. Diese werden unter
hoch-denaturierendem Bedingungen lysiert, wodurch störende RNasen inaktiviert werden.
In Gegenwart von Ethanol bindet die intakte RNA an eine Silica-Gel-Membran. Für die
Elution der RNA wird RNase-freies Wasser benutzt.
Reagenzien:
•
EL-Puffer
•
RLT-Puffer
•
β-Mercaptoethanol
•
Ethanol (70 %)
•
RW1-Puffer
26
Material und Methoden
•
RPE-Puffer
•
RNase-freies Wasser
Durchführung:
•
Die Durchführung erfolgte exakt nach der Anleitung der Firma Qiagen
•
Die RNA wird nach der Konzentrationsbestimmung bei – 80 °C eingefroren (siehe
3.2.12)
3.2.11 DNA-Isolierung aus Vollblut
Das QIAamp DNA Mini Kit der Firma Qiagen ermöglicht die Isolierung genomischer
DNA aus Vollblut. Nach der Lyse der Zellen bindet die genomische DNA in Gegenwart
von Ethanol an eine Silica-Gel-Membran, von der es mit Hilfe von Wasser eluiert wird.
Reagenzien:
•
Proteinase K
•
AL-Puffer
•
Ethanol, absolut
•
AW1-Puffer
•
AW2-Puffer
•
Aqua ad iniectabilia
Durchführung:
•
Die Durchführung erfolgte exakt nach der Anleitung der Firma Qiagen
•
Die DNA wird nach der Konzentrationsbestimmung bei – 20 °C eingefroren (siehe
3.2.12)
3.2.12 Bestimmung der RNA- und DNA-Konzentration
Durch eine spektralphotometrische Messung der optischen Dichte lässt sich sowohl die
Menge als auch die Reinheit von RNA- und DNA-Lösungen quantifizieren. Während
Proteine bei einer Wellenlänge von 280 nm ein Maximum ihrer Lichtabsorption
aufweisen, befindet sich das Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren bei einer
Wellenlänge von 260 nm. Die Reinheit einer Nukleinsäurelösung lässt sich durch
Bestimmung des Extinktionsquotienten 260 nm/280 nm abschätzen. Liegt dieser unter 1.8,
befinden sich in der Lösung zu viele Proteine, liegt er dagegen über 2.0, beinhaltet die
Lösung zu viele Salze.
27
Material und Methoden
Reagenzien:
•
Aqua ad iniectabilia
Durchführung:
•
Die RNA wird 1:50 und die DNA wird 1:10 mit Aqua ad iniectabilia verdünnt
•
Der Nullabgleich erfolgt gegen Aqua ad iniectabilia
•
Die RNA-Konzentration wird wie folgt berechnet:
Konzentration (µg/ml) = Verdünnungsfaktor x 40 x Extinktion bei 260 nm
•
Die DNA-Konzentration wird wie folgt berechnet:
Konzentration (µg/ml) = Verdünnungsfaktor x 50 x Extinktion bei 260 nm
3.2.13 Reverse Transkription
Für die Reverse Transkription von mRNA in cDNA wird das Reverse Transcription
System der Firma Promega verwendet. Es werden 12-18 Nukleotide lange oligo-dTPrimer verwendet, welche komplementär zum Poly-A-Schwanz am 3`-Ende der mRNA
sind und mit diesem einen DNA/RNA-Doppelstrang bilden, der dem Enzym „Reverse
Transkriptase“ als Ausgangspunkt zur Synthese der cDNA dient.
Reagenzien:
•
Aqua ad iniectabilia
•
Magnesiumchlorid (25 mM)
•
Reverse Transkriptonspuffer (10x)
•
dNTP-Mix (10 mM)
•
RNasin Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl)
•
AMV Reverse Transkriptase (20 U/µl)
•
Oligo(dT)15-Primer (500 ng/µl)
Durchführung:
•
1 µg RNA in 9,9 µl Aqua ad iniectabilia wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß
gegeben und für 10 min. bei 70 °C inkubiert
•
Die Probe wird kurz anzentrifugiert und anschließend auf Eis gestellt
•
Die restlichen Reagenzien werden gemäß der Tabelle 3.2 hinzu gegeben
28
Material und Methoden
Tab. 3.2: Auflistung der Reagenzien.
Reagenz
Volumen
Endkonzentration
Magnesiumchlorid, 25 mM
4 µl
5 mM
Reverse Transkriptonspuffer, 10x
2 µl
1x
dNTP-Mix, 10 mM
2 µl
1 mM
RNasin Ribonuclease Inhibitor, 40 U/µl
0,5 µl
1 U/µl
AMV Reverse Transkriptase, 20 U/µl
0,6 µl
0,75 U/µl
Oligo(dT)15-Primer, 500 ng/µl
1 µl
25 ng/µl
•
Der Ansatz wird für 1 h bei 42 °C inkubiert
•
Anschließend wird für 5 min. auf 95 °C erhitzt
•
Der Ansatz wird dann für 5 min. auf Eis gestellt
•
Die cDNA wird bei –20°C eingefroren
3.2.14 Real-time PCR (Echtzeit-Polymerasekettenreaktion)
Während mit der klassischen PCR cDNA qualitativ nachgewiesen werden kann, erfolgt
mit Hilfe der real-time PCR eine Quantifizierung der zu untersuchenden,
umgeschriebenen mRNA. Diese Methode basiert auf der Detektion und Quantifizierung
eines Fluoreszenzfarbstoffes, dessen Signal direkt proportional zur Menge des
zunehmenden PCR-Produkts in der Reaktion ansteigt. Neben den Primern wird eine
20-30 Nukleotide lange Sonde verwendet, die sich während der Reaktion
exonübergreifend an die innere Region des PCR-Produktes anlagert. Diese Sonde ist am
5`-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM und am 3´-Ende mit dem Quencher
TAMRA markiert. So lange die Sonde intakt ist, emittiert der Fluoreszenzfarbstoff bei
Bestrahlung kein Licht, sondern überträgt aufgrund des Förster-Typ-Energietransfers die
für die Fluoreszenz notwendige Energie auf den Quencher. Wird die Sonde während der
Amplifikation durch die 5´-Exonuclease-Aktivität der Taq-Polymerase gespalten, wird
der Energietransfer aufgehoben und der Fluoreszenzfarbstoff emittiert Licht.
Die Fluoreszenz-Emission wird in jedem Zyklus aufgezeichnet, wodurch das Beobachten
der exponentiellen Phase der PCR-Reaktion möglich wird. Dabei wird der Parameter CT
(„cycle threshold“) als diejenige Zyklusnummer definiert, in der die Fluoreszenz-
29
Material und Methoden
Emission einen bestimmten Schwellenwert übersteigt. Für die relative Quantifizierung
wird die komparative CT-Methode angewandt, bei der der CT-Wert des zu untersuchenden
Gens auf den CT-Wert des Housekeeping-Gens PBGD (Porphobilinogendeaminase)
normalisiert wird (Livak, 1997; Livak und Schmittgen, 2001). Die Einzelergebnisse
werden durch eine Gleichung berechnet, die sich auf eine Standardkurve bezieht, die zu
Beginn der Messungen für jeden einzelnen Zinktransporter etabliert wurde. Dies
ermöglicht den Vergleich der Expression von einem Gen in einer Zelle mit dem Gen in
einer anderen Zelle. Tabelle 3.3 gibt einen Überblick über die verwendeten Primer und
Sonden.
Tab. 3.3: Auflistung der verwendeten Primer und Sonden.
Name
GenBankNummer
hZnT-1
NM_021194
hZnT-2
NM_032513
hZnT-3
NM_003459
hZnT-4
NM_013309
hZnT-5
NM_024055
5´ → 3´
Sense:
ggC CAA TAC CAg CAA CTC CAA
Antisense:
TgC AgA AAA ACT CCA CgC ATg T
Sonde:
ATT ggA CCC CgC AgA CCC AgA AAA
CCC C
Sense:
CTg CAC CTT CgT CTT CTC CAT
Antisense:
gAC AgC AgC AgA TCA CgA ACA g
Sonde:
CCT Tgg ggg TCC CTT CCA TCA ACA
Sense:
CAC CCT CCg AgA CgT TCT TC
Antisense:
ggC AAC ATg gTA AgT gAg CgT AA
Sonde:
ATC CTC ATg gAA ggT ACC CCC CgC AA
Sense:
ggC TAT CAT CAA AAT CAC CAA CCA
Antisense:
Cgg TgA TgA gCA TTA TAT CTC CAT T
Sonde:
Tgg ATT TCA TCg CTT AgA ggT TTT gTC
AgC T
Sense:
AAG GAC ATC ATG ACA GTG CTC TAA
CTC
Antisense:
CCA ACT TTA CAA CAC AAA GCC AGT
AC
Amplikon
174 bp
129 bp
151 bp
180 bp
118 bp
30
Material und Methoden
hZnT-6
NM_017964
hZnT-7
NM_133496
hZnT-8
NM_173851
hZnT-9
NM_006345
PBGD
NM_000190
Sonde:
CAA TAA TAC TCC ACC CTT GTG ATC
TGC CAC A
Sense:
ggC AAg TTg TTA Cgg gAA TTT AgA
Antisense:
TAA gCA ggA AgC CAg TAC ATA TCA A
Sonde:
AgC AgC TgA CCg AAg gTC CTg gAA gAT
Sense:
CAC ggA CAC AgT CAT TCC CTC TT
Antisense:
TCT gTC TgC Tgg gTC CTg TTg
Sonde:
Agg ACg ggC CAT CAT gAg AAT gAA
Sense:
TCC CTC TAA gCg gCT gAC AT
Antisense:
CAC AgT CgC CTg gAT CTg gTA
Sonde:
Tgg CAC CgA gCA gAg ATC CTT ggT g
Sense:
CAg AAA gAA ggA CAg ggA TCA CA
Antisense:
TTC TTg CTT AAg Tgg AgC TTT gAg T
Sonde:
TgC CTA TAC CTT CTg CTg TTT CAA ATg
ATg
Sense:
ACG ATC CCG AGA CTC TGC TTC
Antisense:
GCA CGG CTA CTGGCA CAC T
Sonde:
103 bp
184 bp
151 bp
105 bp
87 bp
CAG CCT CCT TCC AGG TGC CTC AGG
Reagenzien:
•
Aqua ad iniectabilia
•
PCR-Puffer (10x)
•
Magnesiumchlorid (25 mM)
•
dNTP-Mix (10 mM)
•
Oligonukleotidprimer (20 µM)
•
Rox (100 µM)
•
Sonde (20 µM)
•
HotStar-Taq-Polymerase (5 U/µl)
31
Material und Methoden
Durchführung:
•
In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß wird ein Mastermix gemäß der Tabelle 3.4
pipettiert, wobei sowohl für das Housekeeping-Gen PBGD als auch für die zu
untersuchenden hZnT-Transporter stets je ein separater Mastermix angesetzt wird
Tab. 3.4: Zusammensetzung des Mastermixes.
•
Reagenz
Volumen
Endkonzentration
Aqua ad iniectabilia
30 µl
PCR-Puffer, 10x
5,0 µl
1x
Magnesiumchlorid, 25 mM
5,0 µl
2,5 mM
dNTP-Mix, 10 mM
1,0 µl
0,2 mM
Sense-Primer, 20 µM
0,75 µl
0,3 µM
Antisense-Primer, 20 µM
0,75 µl
0,3 µM
Rox, 100 µM
0,5 µl
1 µM
Sonde, 20 µM
0,5 µl
0,2 µM
HotStar-Taq-Polymerase, 5 U/µl
0,5 µl
0,05 U/µl
44 µl Mastermix und 6 µl cDNA werden in die Vertiefungen der Reaktionsplatte
gegeben, wobei jede Probe als Dreifach-Bestimmung angesetzt wird
•
Die Reaktionsplatte wird mit einer Folie abgedeckt und in den Cycler gestellt
•
Die Proben werden mit den folgenden Einstellungen gemäß der Tabelle 3.5
amplifiziert und anschließend mit Hilfe der Cyclersoftware ausgewertet
Tab. 3.5: PCR-Programm.
Phase
Temperatur
Dauer
Zyklenzahl
50°C
20 sec.
1
Aktivierung der Polymerase
95°C
15 min.
1
Denaturierung
95°C
15 sec.
Primeranlagerung
60°C
1 min.
45
32
Material und Methoden
3.2.15 SNP-PCR
Mit
Hilfe
der
SNP-PCR
(„single
nucleotide
polymorphism“,
Einzelnukleotidpolymorphismus) kann eine allelische Diskriminierung durchgeführt
werden. Für die Analyse der Punktmutation werden Primer ausgewählt, die am 3´-Ende
den jeweiligen Mismatch tragen und nach der „2+4-Regel“ (2°C x (A+T) + 4°C x (C+G))
eine Annealingtemperatur zwischen 60°C und 64°C besitzen. Als interne Kontrolle dient
das
Housekeeping-Gen
HGH
(„human
growth
hormone“,
menschliches
Wachstumshormon).
In dieser Arbeit wird die SNP-PCR für die Analyse einer Punktmutation im hZnT-8-Gen
verwendet, welche im letzten Exon an der Position 973 der mRNA lokalisiert ist
(NM_173851). Die Punktmutation von Thymidin nach Cytosin resultiert in einem
Aminosäureaustausch von Tryptophan nach Arginin. Tabelle 3.6 gibt einen Überblick
über die verwendeten Primer.
Tab. 3.6: Auflistung der verwendeten Primer.
Name
Sequenz
ZnT-8_SNP_For
AGT TCC CAT AGC GAC AGG GC
ZnT-8_SNP_RevC
GAA CCA CTT GGC TGT CCC G
ZnT-8_SNP_RevT
GAA CCA CTT GGC TGT CCC A
HGH_For
TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG
HGH_Rev
TCC ACT CAC GGA TTT CTG TTG TGT TTC
Reagenzien:
•
Aqua ad iniectabilia
•
PCR-Puffer (10x)
•
dNTP-Mix (10 mM)
•
Oligonukleotidprimer (20 µM)
•
HotStar-Taq-Polymerase (5 U/µl)
Durchführung:
•
In einem 1,5 ml Reaktionsgefäß wird ein Mastermix gemäß der Tabelle 3.7
pipettiert
33
Material und Methoden
Tab. 3.7: Zusammensetzung des Mastermixes.
•
Reagenz
Volumen
Endkonzentration
Aqua ad iniectabilia
36,75 µl
PCR-Puffer, 10x
5 µl
1x
dNTP-Mix, 10 mM
2 µl
0,4 mM
ZnT-8_For, 20 µM
1 µl
0,4 µM
ZnT-8_Rev, 20 µM
1 µl
0,4 µM
HGH_For, 15 µM
0,5 µl
0,15 µM
HGH_Rev, 15 µM
0,5 µl
0,15 µM
HotStar-Taq-Polymerase, 5 U/µl
0,25 µl
0,025 U/µl
47 µl Mastermix und je 3 µl DNA (= 50 ng) werden in 0,2 ml PCR-Gefäße
gegeben, welche in den Cycler gestellt werden
•
Die Proben werden mit den folgenden Einstellungen gemäß der Tabelle 3.8
amplifiziert
Tab. 3.8: PCR-Programm.
Phase
Temperatur
Dauer
Zyklenzahl
Aktivierung der Polymerase
95°C
15 min.
1
Denaturierung
95°C
30 sec.
Primeranlagerung
64°C
30 sec.
Strangverlängerung
72°C
30 sec.
Finale Strangverlängerung
72°C
10 min.
4°C
∞
30
1
3.2.16 Agarose-Gelelektrophorese
Um die Größe der erhaltenen PCR-Produkte zu untersuchen, werden diese
elektrophoretisch aufgetrennt. Dabei kann die Agarose-Konzentration in Abhängigkeit
von
der
Größe
der
aufzutrennenden
DNA-Fragmente
variiert
werden.
Die
Wanderungsstrecke eines linearen DNA-Fragmentes verhält sich umgekehrt proportional
34
Material und Methoden
zum Logarithmus seines Molekulargewichts. Das Ethidiumbromid lagert sich an die
Nukleinsäure-Doppelstränge an, so dass die aufgetrennten DNA-Banden im UV-Licht
sichtbar gemacht und mit Hilfe von DNA-Molekulargewichtsmarkern, welche
unterschiedliche Fragmente definierter Größen enthalten, identifiziert werden können. Für
die Auftrennung wird TAE-(Tris-Acetat-EDTA)-Puffer verwendet, da dieser den Vorteil
hat, dass die DNA-Banden schärfer aufgelöst werden.
Reagenzien:
•
Agarose
•
TAE-Puffer (10x): 242 g Tris-Base, 100 ml 0,5 M Na2EDTA, 57,1 ml Essigsäure
•
Ethidiumbromid (10 mg/ml)
•
6 x O´Range Loading Dye Solution
•
100 bp DNA-Leiter, O´Range Ruler
Durchführung:
•
Der Gel-Schlitten wird in die Gießhalterung eingespannt und austariert
•
100 ml TAE-Puffer (1x) werden zusammen mit 1 bis 1,5 g Agarose aufgekocht
•
4 µl Ethidiumbromid werden hinzu gegeben
•
Die aufgekochte Gelmasse wird luftblasenfrei in den Gel-Schlitten gegossen und
benötigt ca. 30 min. zum Erstarren
•
Anschließend wird das Gel zusammen mit dem Gel-Schlitten in die
Elektrophoresekammer eingesetzt
•
Die Kammer wird mit TAE-Puffer (1x) aufgefüllt bis das Gel vollständig bedeckt
ist
•
Die Proben werden 1:6 mit Probenpuffer (6 x O´Range Loading Dye Solution)
verdünnt und 20 µl in die Taschen aufgetragen
•
Vom der 100 bp DNA-Leiter werden 15 µl aufgetragen
•
Die Elektrophorese läuft für ca. 45 min. bei 90 V
•
Die Auswertung und Dokumentation erfolgt mit Hilfe des BioRad Gel Dok XR
Systems
3.2.17 Durchflusscytometrie
Mit einem Durchflusscytometer können Zellen anhand einer Fluoreszenzmarkierung
identifiziert und so charakterisiert werden. Eine Zellsuspension wird nach der erfolgten
Markierung in einem wesentlich größeren Volumen einer Salzlösung durch eine Düse
35
Material und Methoden
gedrückt, wodurch ein feiner Flüssigkeitsstrahl entsteht, in dem vereinzelt Zellen
vorliegen. Dieser Flüssigkeitsstrahl passiert einen Laserstrahl, wobei es an den Zellen zu
einer Lichtstreuung kommt. Sobald Fluorochrome an eine Zelle gebunden sind, werden
sie in dem Augenblick zur Fluoreszenz angeregt. Photodetektoren messen dann sowohl
das emittierte Licht als auch das gestreute Licht, welches Informationen über die Größe
und die Granularität der Zellen liefert.
Die Größe einer jeden Zelle wird mit dem Forwardscatter (FSC) bestimmt. Dieser ist in
direkter Linie des ausgesandten Lichtes angeordnet und detektiert das durch die Zelle
hervorgerufene Beugungsmuster des Lichtes, welches von der Größe der Zelle abhängig
ist.
Die Granularität wird mit dem Sidescatter (SSC) gemessen. Dieser misst die Intensität des
um 90° gestreuten Lichtes, welches über Linsen gesammelt und über Spiegel an den
Detektor weiter gegeben wird. Je mehr Granula in der Zelle vorhanden sind, desto stärker
wird das Licht gestreut.
Sind Zellen fluoreszenzmarkiert, wird das von ihnen emittierte Licht über Spiegel nach
Wellenlängen getrennt und von einem Detektor die Intensität gemessen.
Bei einer Fluoreszenzmarkierung mit Antikörpern muss beachtet werden, dass auch
unmarkierte Zellen eine Autofluoreszenz besitzen und die gegen das gewünschte Antigen
spezifischen Antikörper geringfügig auch unspezifisch über Fc-Rezeptoren („fragment
crystallizable“) gebunden werden. Daher werden sog. Isotypkontrollen verwendet. Dabei
handelt es sich um einen Antikörper, der auf der einen Seite den gleichen Isotyp besitzt
wie der gegen das gewünschte Antigen spezifische Antikörper, und auf der anderen Seite
in gleicher Weise fluoreszenzmarkiert sein sollte. Da die Isotypkontrolle über eine
spezifische Bindungsstelle verfügt, die in der Probe nicht vorkommt, kann sie nur
unspezifisch über den Fc-Anteil gebunden werden. Die in einem solchen Ansatz
gemessene Fluoreszenzintensität kann dann bei der Auswertung der eigentlichen Proben
berücksichtigt werden.
Das Durchflusscytometer wurde bei folgenden Methoden angewandt:
•
Messung der Reinheit von primären, isolierten Zellen (3.2.18)
•
Intrazelluläre Färbung und Fluoreszenzmikroskopie (3.2.19)
•
Apoptose-Assay (3.2.20)
•
Messung von intrazellulärem freien Zink mit dem Durchflusscytometer (3.2.21)
•
CTLL-2-Assay (3.2.25)
36
Material und Methoden
3.2.18 Messung der Reinheit von primären, isolierten Zellen
Die Reinheit der primären, isolierten Zellen wird mit Hilfe von spezifischen Antikörpern
im Durchflusscytometer überprüft. Für die Messung der T-Zellen wird ein FITCkonjugierter Maus-anti-human-CD3-Antikörper verwendet, während für die Messung der
B-Zellen ein FITC-konjugierter Maus-anti-human-CD19-Antikörper benutzt wird.
Reagenzien:
•
PBS (1x)
•
Maus-IgG1κ-Isotypkontrolle-FITC konjugiert
•
Maus-anti-human-CD3-FITC-konjugiert
•
Maus-anti-human-CD19-FITC-konjugiert
Durchführung:
•
In FACS-Röhrchen werden je 2x105 Zellen in 100 µl PBS (1x) resuspendiert
•
Als Isotypkontrolle werden 20 µl eines 1:5 verdünnten, FITC-konjugierten MausIgG1κ-Antikörpers verwendet; für die Messung der humanen T-Zellen werden
20 µl eines FITC-konjugierten Maus-anti-human-CD3-Antikörpers zu den Zellen
gegeben; für die Messung der humanen B-Zellen werden 20 µl eines FITCkonjugierten Maus-anti-human-CD19-Antikörpers zu den Zellen gegeben
•
Es wird für 20 min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert
•
Der Ansatz wird mit 2 ml PBS (1x) gewaschen (5 min. bei 300 g)
•
Das Pellet wird in 300 µl PBS (1x) aufgenommen
•
Die Messung erfolgt am Durchflusscytometer (siehe 3.2.17)
3.2.19 Intrazelluläre Färbung und Fluoreszenzmikroskopie
Für eine intrazelluläre Färbung werden die Zellen zunächst mit AB-Serum inkubiert,
welches unspezifische Bindungsstellen blockiert. Anschließend werden die Zellen mit
Paraformaldehyd (PFA) fixiert, um die Membran zu stabilisieren und damit die
Zellmorphologie zu erhalten. Des Weiteren bleiben die Streulicht-Eigenschaften der
Zellen für die durchflusscytometrische Analyse erhalten (Halldén et al., 1989). Eine
Behandlung mit dem Detergenz Saponin permeabilisiert die Zellen, so dass die Antikörper
leichter in das Zellinnere gelangen können. Bei Saponin handelt es sich um ein
pflanzliches Glykosid, das sich aufgrund seiner Affinität zu Cholesterol in die
Plasmamembran einbaut. Daraus resultiert eine reversible Erhöhung der Durchlässigkeit
für größere Moleküle, z.B. Antikörper. Um das Cytoplasma vom Kern abgrenzen zu
37
Material und Methoden
können, wird dieser mit Hoechst 33258 gefärbt, das mit Strukturen des Zellkerns
interagiert und diesen fluoreszenzmikroskopisch durch eine blaue Färbung sichtbar macht.
Die spezifischen FITC-markierten Antikörper werden mit ultraviolettem Licht anregt,
woraufhin diese grünes Licht emittieren. Dies kann durch einen selektiven Filter
angeschaut werden.
3.2.19.1
Färbung von Suspensionszellen
Reagenzien:
•
AB-Serum (10 %): das AB-Serum wird 1:10 mit PBS (1x) verdünnt
•
PBS (1x)
•
PFA-Lösung (4 %): 500 mg PFA werden in 12,5 ml HBSS ca. 30 min. bei 56°C
gelöst
•
Saponinlösung (0,1 %): 1 g Saponin wird in 10 ml HBSS gelöst; davon werden
500 µl mit 500 µl HEPES und 49 ml HBSS gemischt (max. 14 Tage haltbar)
•
Primärantikörper: Kaninchen-anti-human-ZnT-4-Antikörper
•
Sekundärantikörper: Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper-FITC konjugiert
•
RPMI-Kulturmedium
mit
10
%
FCS,
1
%
L-Glutamin
und
1
%
Penicillin/Streptomycin
•
Hoechst 33258 (18,7 mM)
Durchführung:
•
1x106 Zellen werden 5 min. bei 300 g zentrifugiert
•
Das Pellet wird in 100 µl AB-Serum (10 %) aufgenommen
•
Der Ansatz wird für 10 min. bei 37 °C inkubiert
•
Anschließend wird mit 2 ml PBS (1x) gewaschen (5 min. bei 300 g)
•
Das Pellet wird in 500 µl PFA (4 %) aufgenommen
•
Der Ansatz wird 20 min. bei 4 °C inkubiert und zwischendurch aufgeschüttelt
•
Danach wird 2x mit je 2 ml PBS (1x) gewaschen (5 min. bei 300 g)
•
Pro Ansatz werden 100 µl Saponinlösung (0,1 %) und 5 µl des Primärantikörpers
zugegeben
•
Der Ansatz wird 20 min. bei 4 °C inkubiert
•
Es wird 2x mit je 1ml Saponinlösung (0,1 %) gewaschen
•
Pro
Ansatz
werden
100
µl Saponinlösung (0,1
%) und
1
µl
des
Sekundärantikörpers zugegeben
38
Material und Methoden
•
Der Ansatz wird 20 min. im Dunkeln bei 4 °C inkubiert
•
Anschließend wird mit 1ml Saponinlösung (0,1 %) gewaschen
•
Das Pellet wird in 500 µl Kulturmedium aufgenommen
•
Die Zellen werden mit 150 µM Hoechst 33258 für 15 min. bei 37°C und 5 % CO2
inkubiert
•
Die Ansätze werden 2x mit je 500 µl PBS (1x) gewaschen (10 min. bei 300 g)
•
Das Pellet wird in 300 µl PBS (1x) aufgenommen
•
Die Messung erfolgt am Durchflusscytometer (siehe 3.2.17)
•
Für die Fluoreszenzmikroskopie werden die Ansätze 10 min. bei 300 g
zentrifugiert; die Pellets werden in 40 µl PBS (1x) resuspendiert, auf die
Objektträger pipettiert und eingedeckelt
3.2.19.2
Färbung von adhärenten Zellen
Reagenzien:
•
AB-Serum (10 %): das AB-Serum wird 1:10 mit PBS (1x) verdünnt
•
PBS (1x)
•
PFA-Lösung (4 %): 500 mg PFA werden in 12,5 ml HBSS ca. 30 min. bei 56°C
gelöst
•
Saponinlösung (0,1 %): 1 g Saponin wird in 10 ml HBSS gelöst; davon werden
500 µl mit 500 µl HEPES und 49 ml HBSS gemischt (max. 14 Tage haltbar)
•
Primärantikörper: Kaninchen-anti-human-ZnT-4-Antikörper
•
Sekundärantikörper: Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper-FITC konjugiert
•
DMEM-Kulturmedium
mit
20
%
FCS,
1
%
L-Glutamin,
1
%
Penicillin/Streptomycin und 1 % NEAA
•
Hoechst 33258 (18,7 mM)
Durchführung:
•
Die Zellen werden auf einem Objektträger mit fixiertem Kammeraufsatz ausgesaät
•
Am Ende der Stimulation wird für die Färbung das Medium abgenommen
•
Pro Kammer werden 100 µl AB-Serum (10 %) zugegeben
•
Der Ansatz wird für 10 min. bei 37 °C inkubiert
•
Anschließend wird mit 500 µl PBS (1x) gewaschen
•
Pro Kammer werden 500 µl PFA (4 %) zugegeben
•
Der Ansatz wird 20 min. bei 4 °C inkubiert und zwischendurch aufgeschüttelt
39
Material und Methoden
•
Danach wird 2x mit je 1 ml PBS (1x) gewaschen
•
Pro Kammer werden 200 µl Saponinlösung (0,1 %) und 5 µl des Primärantikörpers
zugegeben
•
Der Ansatz wird 20 min. bei 4 °C inkubiert
•
Es wird 2x mit je 1ml Saponinlösung (0,1 %) gewaschen
•
Pro
Ansatz
werden
200
µl Saponinlösung (0,1
%) und
1
µl
des
Sekundärantikörpers zugegeben
•
Der Ansatz wird 20 min. im Dunkeln bei 4 °C inkubiert
•
Anschließend wird mit 1ml Saponinlösung (0,1 %) gewaschen
•
Der Kammeraufsatz wird entfernt und pro Ansatz werden 14 µl PBS zugegeben
•
Mit einem großen Deckglas wird der gesamte Objektträger eingedeckelt
•
Die Zellen können unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden
3.2.20 Apoptose-Assay
Die Messung der Apoptose-Rate erfolgt mit dem human Annexin-V/FITC-Kit von der
Firma Bender Med Systems. Annexin-V bindet an Phosphatidylserin. Dieses Molekül ist
unter normalen Bedingungen auf der Innenseite der Zellmembran lokalisiert. Während der
Apoptose gelangt Phosphatidylserin durch den sog. Flip-Flop-Mechanismus auf die
Außenseite der Zellmembran, wo es durch Annexin-V gebunden wird, welches wiederum
fluoreszenzmarkiert ist und die Detektion mit dem Durchflusscytometer ermöglicht. Eine
gleichzeitige Färbung mit Propidiumiodid ermöglicht die Unterscheidung zwischen
apoptotischen (Annexin-positiv und Propidiumiodid-negativ) und nekrotischen Zellen
(Annexin-positiv und Propidiumiodid-positiv).
Reagenzien:
•
RPMI-Kulturmedium
mit
10
%
FCS,
1
%
L-Glutamin
und
1
%
Penicillin/Streptomycin
•
TPEN (2 mM)
•
Actinomycin D (1 mg/ml)
•
Zink (2 mM)
•
Natriumpyrithion (50 mM)
•
PBS (1x)
•
Bindungspuffer
•
Annexin-V/FITC
40
Material und Methoden
•
Propidiumiodid (1 mg/ml)
Durchführung:
•
Die Zellen werden mit 2x105/ml ausgesäat und nach einer 40-stündigen Inkubation
bei 37°C und 5 % CO2 10 min. bei 300 g zentrifugiert:
I.
Kontrolle
II.
1 µM TPEN
•
Das Pellet wird in Kulturmedium (mit bzw. ohne 1 µM TPEN) resuspendiert
•
Die Zellzahl wird auf 1x106/ml eingestellt
•
Je 1 ml Zellen werden in die Vertiefung einer 24-Lochplatte pipettiert
•
Die Zellen werden wie folgt stimuliert:
I.
Kontrolle
II.
Kontrolle + 5 µg/ml Actinomycin D
III.
Kontrolle + 5 µM Zink + 50 µM Natriumpyrithion
IV. Kontrolle + 5 µM Zink + 50 µM Natriumpyrithion + 5 µg/ml Actinomycin D
V.
1 µM TPEN
VI. 1 µM TPEN + 5 µg/ml Actinomycin D
•
Die Ansätze werden für 6 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert
•
Die Zellen werden mit PBS (1x) gewaschen (10 min. bei 300 g)
•
Die Zellen werden mit Bindungspuffer resuspendiert
•
Die Zellzahl wird auf 2-5x105/ml eingestellt
•
Zu 195 µl der Zellsuspension werden 5 µl Annexin-V/FITC gegeben
•
Der Ansatz wird gemischt und für 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert
•
Die Zellen werden mit PBS (1x) gewaschen (10 min. bei 300 g)
•
Das Pellet wird in 300 µl PBS (1x) resuspendiert
•
Es werden pro Ansatz 3 µl Propidiumiodid hinzu gegeben
•
Die Messung erfolgt am Durchflusscytometer (siehe 3.2.17)
3.2.21 Messung von intrazellulärem freien Zink mit dem Durchflusscytometer
Mit Hilfe der zinkspezifischen Fluoreszenzsonde FluoZin-3 kann intrazelluläres freies
Zink gemessen werden (Gee et al., 2002). Während der Inkubation diffundiert FluoZin-3
durch die Zellmembran in das Zellinnere. Innerhalb der Zelle wird die Estergruppe durch
unspezifische zelluläre Esterasen abgespalten. Dabei entstehen an der Fluoreszenzsonde
freie Carboxylgruppen, woraufhin die Sonde nicht mehr die Plasmamembran passieren
41
Material und Methoden
kann. Aufgrund seiner hohen Affinität bindet FluoZin-3 spezifisch und selektiv freie
Zinkionen. Die bei der Bindung entstehende Fluoreszenz kann im Durchflusscytometer
gemessen werden.
Durch die Inkubation mit 50 µM TPEN, einem Zink-Chelator, und 100 µM Zink + 50 µM
Natriumpyrithion, einem Zink-Ionophor, erhält man diejenigen Fluoreszenzen, welche die
minimal bzw. maximal möglichen Mengen an intrazellulär freiem Zink dieser Zellen
aufzeigen (Fmin bzw. Fmax). Mit folgender Formel können unter Berücksichtigung der
Dissoziationskonstante
Kd
(hier:
15
nM)
die
gemessenen
Fluoreszenzen
in
Konzentrationen umgerechnet werden (Grynkiewicz et al., 1985):
[Zn ] = K
2+
d
 F − Fmin 


 Fmax − F 
Reagenzien:
•
RPMI-Kulturmedium ohne FCS
•
FluoZin-3 (1 mM in DMSO)
•
TPEN (2 mM)
•
Zink (10 mM)
•
Natriumpyrithion (5 mM)
Durchführung:
•
In einem 15 ml Röhrchen werden 1x106 Zellen in 1 ml Kulturmedium ohne FCS
aufgenommen
•
Es wird 1 µl FluoZin-3 (Endkonzentration: 1 µM) zugegeben
•
Das Röhrchen wird mit leicht geöffnetem Deckel für 30 min. bei 37 °C und 5 %
CO2 inkubiert
•
Die Zellen werden mit Kulturmedium ohne FCS gewaschen
•
Anschließend werden die Zellen in 1 ml Kulturmedium ohne FCS aufgenommen
und á 330 µl auf 3 FACS-Röhrchen verteilt:
I.
Kontrolle (F)
II.
50 µM TPEN (Fmin)
III.
100 µM Zink + 50 µM Natriumpyrithion (Fmax)
•
Es wird 30 min. bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert
•
Die Messung erfolgt am Durchflusscytometer (siehe 3.2.17)
42
Material und Methoden
3.2.22 Messung von intrazellulärem freien Zink mit dem Fluoreszenzplattenleser
Durch Einsatz von FluoZin-3 kann eine quantitative Analyse der intrazellulären
Zinkkonzentration im Ruhezustand und nach Stimulation mit Zink mit Hilfe des
Fluoreszenzplattenlesers durchgeführt werden. Die Wirkungsweise von FluoZin-3 und die
Berechnung des Zinkgehaltes sind unter 3.2.21 beschrieben.
Reagenzien:
•
Messpuffer:
5
mM
Glucose,
1
mM
Magnesiumchlorid,
1
mM
Natriumhydrogenphosphat, 1,3 mM Calciumchlorid, 25 mM Hepes, 120 mM
Natriumchlorid, 5,4 mM Kaliumchlorid, 20 % FCS, pH 7,35
•
FluoZin-3 (1 mM)
•
TPEN (2 mM)
•
Zink (2 mM)
•
Natriumpyrithion (5 mM)
Durchführung:
•
1x106/ml Zellen werden in Messpuffer mit 1 µl/ml FluoZin-3 30 min. bei 37°C
schüttelnd im Dunkeln inkubiert
•
Der Ansatz wird 10 min. bei 300 g zentrifugiert
•
Das Pellet wird in Messpuffer aufgenommen
•
Die Zellzahl wird auf 2x106/ml eingestellt
•
Die Zellen werden im Dreifachansatz á 100µl in die Vertiefungen einer
96-Lochplatte verteilt
•
Zum Erhalt der Minimal- und Maximalzinkwerte wird ein Teil der Zellen mit
50 µM TPEN und 100 µM Zn + 50 µM Natriumpyrithion stimuliert
•
Die Ansätze werden 15 min. bei 37°C im Dunkeln inkubiert
•
Für die Messung der Minimal- und Maximalzinkwerte wird eine Kinetik mit
5 Messungen alle 2 min. bei 37°C durchgeführt
•
Die restlichen Zellen werden mit 0 µM, 1 µM, 5 µM und 50 µM Zink stimuliert
•
Es wird eine Kinetik mit 30 Messungen alle 2 min. bei 37°C durchgeführt
3.2.23 IL-1-Assay
Bei dem IL-1-Assay wird mit der murinen T-Zelle EL-4 6.1 gearbeitet. Die IL-1-Aktivität
wird anhand der IL-2-Sekretion gemessen, welche nach Stimulierung der Zellen mit IL-1β
induziert wird.
43
Material und Methoden
Reagenzien:
•
RPMI-Kulturmedium
mit
5
%
FCS,
1
%
L-Glutamin
und
1
%
Penicillin/Streptomycin
•
TPEN (2 mM)
•
IL-1β (500 ng/ml)
Durchführung:
•
Die EL-4 6.1-Zellen werden mit 1x105/ml ausgesäat und nach einer 4-tägigen
Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 10 min. bei 300 g zentrifugiert:
•
I.
Kontrolle
II.
1 µM TPEN
III.
1 µM TPEN
Das Pellet wird in Kulturmedium (mit bzw. ohne 1 µM TPEN) resuspendiert:
I.
Kontrolle
II.
1 µM TPEN (Zugabe von Kulturmedium Zinkflux)
III.
1 µM TPEN (Zugabe von Kulturmedium mit 1 µM TPEN Zinkmangel)
•
Es wird ein Vitalitätstest durchgeführt (siehe 3.2.8)
•
Für eine intrazelluläre Zinkmessung vor Stimulation mit IL-1β werden 1x106
Zellen entnommen (siehe 3.2.21)
•
Für eine intrazelluläre Zinkmessung nach Stimulation mit IL-1β werden
2,5x105/ml für 15 min. bei 37°C und 5 % CO2 in einer Kulturflasche inkubiert;
anschließend wird mit 1 ng/ml IL-1β für 24 h bei 37°C und 5 % CO2 stimuliert;
für die Messung werden 1x106 Zellen entnommen (siehe 3.2.21):
I.
Kontrolle unstimuliert
II.
Kontrolle + IL-1β
III.
Zinkflux unstimuliert
IV. Zinkflux + IL-1β
V.
Zinkmangel unstimuliert
VI. Zinkmangel + IL-1β
•
Für die Messung der IL-2-Produktion nach Stimulation mit IL-1β werden
2,5x105/ml für 15 min. bei 37°C und 5 % CO2 in der Vertiefung einer
96-Lochplatte inkubiert; anschließend wird mit 1 ng/ml IL-1β für 24 h bei 37°C
und 5 % CO2 stimuliert; nach der Stimulation werden die Ansätze in 1,5 ml
Reaktionsgefäße überführt und 10 min. bei 300 g zentrifugiert; der Überstand wird
bis zum ELISA bei – 80°C eingefroren (siehe 3.2.24)
44
Material und Methoden
3.2.24 ELISA („enzyme linked immunosorbent assay“)
Mit einem Sandwich-ELISA können sezernierte Produkte wie z.B. das Interleukin-2
nachgewiesen werden, welches das typische T-Zell-Cytokin darstellt.
Der Sandwich-ELISA beginnt mit der Immobilisierung eines antigenspezifischen
Antikörpers („capture antibody“) in einer Mikrotiterplatte. Dieser bindet das gelöste
Antigen mit hoher Affinität, so dass alle anderen ungebundenen Komponenten
weggewaschen werden können. Im nächsten Schritt wird für die Detektion des
gebundenen Antigens neben einem zweiten und zudem biotinylierten Antikörper
(„detection antibody“), der sich durch eine andere Epitopspezifität auszeichnet, das
Enzymreagenz hinzu gegeben. Letzteres stellt ein Konjugat aus Avidin und
Meerrettichperoxidase dar. Nach der Zugabe der Substratlösung folgt die Umsetzung
eines löslichen, farblosen Chromogens zu einem löslichen, gefärbten Produkt, das dadurch
quantifizierbar ist. Die Intensität des Chromogens wird mit einem ELISA-Reader
gemessen.
Reagenzien:
•
Assay Diluent
•
Capture Antibody (monoklonaler anti-Maus IL-2 Antikörper)
•
Detection Antibody (monoklonaler, biotinylierter anti-Maus IL-2 Antikörper)
•
Enzym-Reagenz (Konjugat aus Avidin und Meerrettich-Peroxidase)
•
Standardlösung (rekombinantes Maus-IL-2)
•
Waschlösung
•
Substratlösung (Reagenz A und Reagenz B in einem 1:1-Verhältnis)
•
Stoplösung
Durchführung:
•
Die Beschichtung der Mikrotiterplatten und die Durchführung erfolgten nach der
Anleitung des Herstellers
3.2.25 CTLL-2-Assay
CTLL-2-Zellen sind murine cytotoxische T-Zellen, deren Wachstum von IL-2 bzw. IL-4
abhängig ist. Bei normaler Kultivierung werden die Zellen zwei Mal wöchentlich mit
1x104/ml umgesetzt, wobei 30 U/ml IL-2 der neuen Zellsuspension zugesetzt werden. Am
vierten Tag nach dem letzten Umsetzen ist das IL-2 soweit verbraucht, dass die Zellen
nicht mehr zum Wachstum angeregt werden. Dieser Zeitpunkt ist optimal, um die Zellen
in einem Assay zu verwenden.
45
Material und Methoden
3.2.25.1
Bestimmung des Anteils toter Zellen
Reagenzien:
•
RPMI-Kulturmedium
mit
10
%
FCS,
1
%
L-Glutamin,
1
%
Penicillin/Streptomycin, 1 % Natriumpyruvat und 1,8 µl β-Mercaptoethanol
•
PBS (1x)
•
Zink (2 mM)
•
TPEN (40 µM)
•
IL-2 (0,6 U/µl)
•
IL-4 (0,05 U/µl)
•
Propidiumiodid (1 mg/ml)
Durchführung:
•
Am vierten Tag nach dem letzten Umsetzen werden die Zellen 3x mit PBS (1x)
gewaschen, d.h. jeweils 10 min. bei 4°C und 300 g zentrifugiert
•
Das Pellet wird in Kulturmedium aufgenommen
•
Es wird ein Vitalitätstest durchgeführt
•
Die Zellzahl wird auf 5x104 lebende Zellen/ml eingestellt
•
In den Vertiefungen einer 6-Loch Platte werden 1,35 ml Kulturmedium vorgelegt,
welches das 2,2-fache der gewünschten Zink- bzw. TPEN-Endkonzentration
enthält
•
1,5 ml Zellen werden in die Vertiefungen pipettiert
•
Es wird 1 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert
•
Anschließend werden die Cytokine dazugegeben:
I.
Kontrolle
II.
30 U/ml IL-2
III.
30 U/ml IL-2 + 50 µM Zink
IV. 30 U/ml IL-2 + 1 µM TPEN
V.
2,5 U/ml IL-4
VI. 2,5 U/ml IL-4 + 50 µM Zink
VII. 2,5 U/ml IL-4 + 1 µM TPEN
•
Es wird 4 Tage bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert
•
Die Ansätze werden mit PBS (1x) gewaschen (10 min. bei 300 g)
•
Das Pellet wird in PBS (1x) aufgenommen
•
Die Zellzahl wird auf 1x105/ml eingestellt
46
Material und Methoden
•
Je 1 ml Zellen werden mit 10 µl Propidiumiodid für 10 min. bei 4°C inkubiert
•
Die Messung erfolgt am Durchflusscytometer (siehe 3.2.17)
3.2.25.2
Generierung der Zelllysate
Der Probenpuffer enthält Natriumvanadat, um zu verhindern, dass spezifische
Phosphorylierungen abgebaut werden.
Reagenzien:
•
RPMI-Kulturmedium
mit
10
%
FCS,
1
%
L-Glutamin,
1
%
Penicillin/Streptomycin, 1 % Natriumpyruvat und 1,8 µl β-Mercaptoethanol
•
PBS (1x)
•
Zink (2 mM)
•
IL-2 (1 U/µl)
•
IL-4 (10 U/µl)
•
Probenpuffer: 65 mM Tris-HCl, 25 % Glycerin, 2 % SDS, 1 mM Natriumvanadat,
pH 6,8
Durchführung:
•
Am vierten Tag nach dem letzten Umsetzen werden die Zellen 3x mit PBS (1x)
gewaschen, d.h. jeweils 10 min. bei 4°C und 300 g zentrifugiert
•
Das Pellet wird in Kulturmedium aufgenommen
•
Es wird ein Vitalitätstest durchgeführt
•
Die Zellzahl wird auf 2x106 lebende Zellen/ml eingestellt
•
Je 3 ml werden in die Vertiefung einer 6-Loch Platte gegeben
•
Die Zellen werden zunächst mit Zink für 15 min. bei 37°C und 5 % CO2
vorinkubiert und anschließend mit IL-2 bzw. IL-4 für weitere 15 min. bei 37°C
und 5 % CO2 stimuliert:
I.
Kontrolle
II.
20 µM Zink
III.
50 µM Zink
IV. 30 U/ml IL-2
V.
30 U/ml IL-2 + 20 µM Zink
VI. 30 U/ml IL-2 + 50 µM Zink
VII. 150 U/ml IL-4
VIII. 150 U/ml IL-4 + 20 µM Zink
47
Material und Methoden
IX. 150 U/ml IL-4 + 50 µM Zink
•
Die Ansätze werden 10 min. bei 300 g zentrifugiert
•
Die Pellets werden in je 300 µl Probenpuffer aufgenommen
•
Die Ansätze werden auf Eis sonifiziert (2x 10 sec. mit 1 min. Pause)
•
Anschließend werden die Proben für 5 min. bei 95°C inkubiert
•
Die Ansätze werden bei – 20°C eingefroren
3.2.26 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung nach Bradford erfolgt mit Hilfe des BioRad-Reagenz. Dabei
bindet der Säurefarbstoff Coomassie-Brilliantblau an vorhandene Proteine und zwar
primär an basische und aromatische Aminosäure-Reste. Das Absorptionsmaximum des
Farbstoffes verschiebt sich in Gegenwart von Proteinen im sauren Milieu von 465 nm zu
595 nm.
Für die Messung wird eine Standardreihe mit BSA angesetzt, deren Variationskoeffizient
kleiner als 10 % sein muss.
Reagenzien:
•
Probenpuffer: 65 mM Tris-HCl, 25 % Glycerin, 2 % SDS, 1 mM Natriumvanadat,
pH 6,8
•
BSA-Stammlösung in 1:200 verdünntem Probenpuffer (1 mg/ml)
•
Bradford-Reagenz
•
Aqua Spüllösung
Durchführung:
•
Die Standardreihe wird gemäß der Tabelle 3.9 pipettiert
Tab. 3.9: Standardreihe des Mikro-Protein-Assays.
Konzentration
Aqua
Stammlösung
Bradford-Reagenz
1 µg/ml
799 µl
1 µl
200 µl
2,5 µg/ml
797,5 µl
2,5 µl
200 µl
5 µg/ml
795 µl
5 µl
200 µl
10 µg/ml
790 µl
10 µl
200 µl
15 µg/ml
785 µl
15 µl
200 µl
25 µg/ml
775 µl
25 µl
200 µl
48
Material und Methoden
•
Die Proben werden 1:200 mit Wasser verdünnt: 795 µl Wasser + 5 µl Probe +
200 µl BioRad-Reagenz
•
Der Ansatz wird bis zur Messung für 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert
Die Messung der Standardreihe in unverdünntem Probenpuffer konnte nicht durchgeführt
werden, da die empfohlene Konzentration von < 1 % SDS überschritten wurde.
3.2.27 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Natriumdodecylsulfat (SDS, „sodium dodecyl sulfate“) ist ein anionisches Detergenz,
welches die Eigenladung von Proteinen überdeckt, so dass eine konstant negative Ladung
pro Masseneinheit entsteht. Durch diese negative Gesamtladung können die Proteine in
Abhängigkeit von dem jeweiligen Molekulargewicht aufgetrennt werden. Die Tertiär- und
Sekundärstrukturen der einzelnen Proben werden durch Erhitzen auf 95 °C und die
Disulfidbrücken im Molekül durch die Zugabe von β-Mercaptoethanol zum Probenpuffer
aufgelöst.
Bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese werden ein Sammel- und ein Trenngel mit
jeweils unterschiedlichen Puffersystemen verwendet, um so schärfere Banden zu erzielen,
welche die Identifizierung des jeweiligen Proteins vereinfachen. Dabei dient das
Sammelgel der Konzentrierung der Proteine, die dann im Trenngel umgekehrt
proportional zu ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden.
Reagenzien:
•
Aqua Spüllösung
•
APS-Lösung (10 %)
•
Trenngel-Puffer: Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8)
•
Sammelgel-Puffer: Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8)
•
Elektrophorese-Puffer (5x): 0,12 M Tris Base, 0,96 M Glycin, 30 ml 10 % SDS,
600 ml, pH 8,3
•
Acrylamid/bis-Acrylamid (30 %)
•
TEMED
•
Biotinylierter Molekulargewichtsmarker
Durchführung:
•
Die Glasplatten werden mit Ethanol und fusselfreien Tüchern gesäubert und in die
Gießhalterung eingebaut
49
Material und Methoden
•
Die Reagenzien für das 8,5 %-ige Trenngel (1,5 M Tris-HCl, 30 %-iges
Acrylamid/bis-Acrylamid, 10 %-ige APS-Lösung, TEMED und Aqua Spüllösung)
werden gemischt, luftblasenfrei zwischen die Glasplatten pipettiert und mit Aqua
Spüllösung überschichtet; die Polymerisierung dauert ca. 20 min.
•
Das Wasser wird abgenommen, die Bestandteile für das 4 %-ige Sammelgel
(0,5 M Tris-HCl, 30 %-iges Acrylamid/bis-Acrylamid, 10 %-ige APS-Lösung,
TEMED und Aqua Spüllösung) werden gemischt, luftblasenfrei auf das Trenngel
pipettiert und der Gelkamm wird eingesetzt; die Polymerisierung dauert ca.
20 min.
•
Der Gelkamm wird entfernt, die Glasplatten mit dem fertigen Gel werden in die
Montagehalterung festgeklemmt und diese in die Elektrophoresekammer gestellt
•
Der Elektrophoresepuffer wird in die Kammer gefüllt
•
Die Proben und der Molekulargewichtsmarker, welcher 1:10 mit Probenpuffer
incl. 1 % β-Mercaptoethanol und 0,5 % Bromphenolblau verdünnt wird, werden
für 5 min. bei 95°C erhitzt und anschließend in die Geltaschen pipettiert
•
Die Elektrophorese läuft auf Eis bei 150 V ca. 90 min.
3.2.28 Westernblot
Beim Westernblot werden die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine aus der
Polyacrylamidmatrix über ein senkrecht zum Gel angelegtes elektrisches Feld (Tank-BlotSystem)
auf
eine
Nitrocellulosemembran
übertragen,
wobei
das
Muster
der
elektrophoretischen Auftrennung erhalten bleibt. Bei diesem Verfahren kommt ein BlotSandwich
zum
Einsatz,
der
aus
Schwammkissen,
Whatman-Papier,
Nitocellulosemembran, Gel, Whatman-Papier und Schwammkissen besteht. Während des
Transfers wird das an die Proteine angelagerte SDS ausgewaschen, sodass die Proteine
renaturieren und teilweise ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wiederherstellen können.
Um unspezifische Bindungen der Antikörper an die Nitrocellulosemembran zu vermeiden,
werden mögliche Bindungsstellen mit Magermilchpulver blockiert. Der Nachweis der
hochaffinen
Bindung
der
Primärantikörper
erfolgt
mit
Spezies-spezifischen
Sekundärantikörpern, an die die Meerrettichperoxidase (HRP, „Horseradish Peroxidase“)
gekoppelt ist. Die Meerrettichperoxidase setzt das Substrat um, wodurch ein Intermediat
entsteht, das den Röntgenfilm durch Lichtemission lokal schwärzt.
50
Material und Methoden
Reagenzien:
•
Transferpuffer: 25 mM Tris-Base, 0,2 M Glycin, 20 % Methanol, pH 8,5
•
Ponceau S-Lösung
•
TBS-Puffer (10x): 0,2 M Tris-Base, 2,28 M NaCl, pH 7,6
•
TBS/T-Puffer (1x): TBS, 0,1 % Tween-20
•
Blocking-Puffer: 2,5 g Magermilchpulver werden in 50 ml TBS/T-Puffer gelöst
•
Primärantikörper: 10 ml TBS-T + 5 % Magermilchpulver + Primärantikörper
(1:1000)
•
Sekundärantikörper: 10 ml TBS-T + 5 % Magermilchpulver + HRP-konjugierter
Sekundärantikörper (1:2000) + HRP-konjugierter-Anti-Biotin-Antikörper (1:1000)
•
Detektionslösung: 0,5 ml LumiGLO Reagenz (20x), 0,5 ml LumiGLO Peroxid
(20x), 9,5 ml Aqua Spüllösung
Durchführung:
•
Die Nitrocellulosemembran und das Whatman-Papier werden auf Gelgröße
geschnitten
•
Die Membran, das Whatman-Papier und die Schwammkissen werden in
Transferpuffer equilibriert
•
Das Blot-Sandwich bestehend aus Schwammkissen, Whatman-Papier, Gel,
Membran, Whatman-Papier und Schwammkissen wird zusammengebaut und in
das Blot-Modul gesetzt, wobei das Gel der Kathode und die Membran der Anode
zugewandt ist
•
Die Kühleinheit wird hinzugefügt und der Transferpuffer wird eingefüllt
•
Der Blot läuft bei 150 V ca. 90 min.
•
Nach dem Blot wird die Membran für ca. 5 min. in Ponceau S-Lösung inkubiert,
mit Aqua dest. gewaschen und eingescannt
•
Die Membran wird mit Transferpuffer entfärbt
•
Anschließend wird die Membran mit ca. 25 ml Blocking-Puffer über Nacht bei
4°C inkubiert
•
Die Membran wird zusammen mit dem Primärantikörper für 3 h bei
Raumtemperatur inkubiert
•
Es wird 3x mit TBS/T gewaschen
•
Die Membran wird zusammen mit den Sekundärantikörper für 1 h bei
Raumtemperatur inkubiert
51
Material und Methoden
•
Es wird 3x mit TBS/T gewaschen
•
Die Membran wird für 1 min. in die Detektionslösung gelegt
•
Anschließend wird die Membran in eine Belichtungskassette gelegt
•
Der Röntgenfilm wird belichtet und entwickelt
3.2.29 Auswertung
Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse basieren auf der Auswertung
einer Reihe von Einzelexperimenten. Die Ergebnisse sind dabei als Mittelwerte aus
mehreren Einzelresultaten (Anzahl der Einzelexperimente n = x) dargestellt. Sind
repräsentative oder exemplarische Experimente gezeigt, so ist dies gesondert erwähnt.
Die statistische Auswertung der Experimente erfolgte mit dem Student t-test.
Signifikanzen wurde mit dem Programm SPSS für Windows berechnet und wurden wie
folgt dargestellt: *: p < 0,05; **: p < 0,01; *** p < 0,001.
52
Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1 Expression von Zink-Exportern in mononukleären Zellen
Die intrazelluläre Zinkhomöostase wird durch zinkbindende Proteine z.B. Metallothionein
und Zinktransporter strikt reguliert (Rink und Haase, 2007). Dabei sind die Zink-Exporter
(ZnTs) dafür verantwortlich, die intrazelluläre Zinkkonzentration durch den Transport von
Zink aus der Zelle heraus oder in vesikuläre Strukturen hinein zu senken. Bisher sind neun
humane Zink-Exporter (hZnTs) in verschiedenen, menschlichen Zellen beschrieben, deren
Expression und Regulationen nur teilweise und in verschiedenen Systemen analysiert
wurden (Liuzzi und Cousins, 2004). Ein globaler Überblick über die Verteilung und
Regulationsmechanismen dieser Zink-Exporter unter verschiedenen Zinkbedingungen in
den Zellen des Immunsystems fehlt bis heute und soll während dieser Arbeit beschrieben
werden.
Für die relative Quantifizierung der einzelnen Zink-Exporter wurde eine real-time PCR
etabliert, deren Auswertung auf der komparativen CT-Methode beruht, bei der der CTWert des zu untersuchenden Gens auf den CT-Wert des Housekeeping-Gens PBGD
(Porphobilinogendeaminase) normalisiert wird (Livak, 1997; Livak und Schmittgen,
2001). Die Einzelergebnisse wurden durch eine Gleichung berechnet, die sich auf eine
Standardkurve bezieht, die zu Beginn der Messungen für jeden einzelnen Zinktransporter
etabliert wurde. Dies ermöglichte den Vergleich der Expression von einem Zink-Exporter
in einer Zelle mit dem Zink-Exporter in einer anderen Zelle.
Zunächst wurde die Expression der humanen Zink-Exporter hZnT-1 bis hZnT-9 in der
T-Zelllinie Molt-4, in der B-Zelllinie Raji, in der Monocyten-Zelllinie THP-1 (Abb. 4.1A)
und in primären PBMC (Abb. 4.1B) analysiert. Die verschiedenen LeukocytenSubpopulationen unterschieden sich deutlich im Hinblick auf die Verteilung und Höhe der
Expression der einzelnen Zink-Exporter. Die Expression von hZnT-1 erreichte in PBMC
ein absolutes Maximum, welches 40x höher war im Vergleich zu Raji, 60x höher im
Vergleich zu THP-1 und sogar 390x höher im Vergleich zu Molt-4. Der Zink-Exporter
hZnT-2 konnte weder in den verschiedenen Zelllinien noch in den primären PBMC
gefunden werden. Die Expression von hZnT-3 war in THP-1 und in den PBMC auf einem
ähnlichen, niedrigen Niveau und in Molt-4 gerade noch zu detektieren, während RajiZellen keine Expression aufwiesen. Molt-4 und PBMC zeigten im Vergleich zu Raji und
THP-1 eine deutliche Expression von hZnT-4. Die Expression von hZnT-5, hZnT-6 und
hZnT-7 konnte in allen analysierten Zellen detektiert werden, wobei die höchste
53
Ergebnisse
Expression in den PBMC zu finden war, gefolgt von THP-1, dann Molt-4 und letztlich
Raji. Die Expression von hZnT-8 konnte während dieser Arbeit zum ersten Mal in PBMC
und auf einem geringeren Niveau in Molt-4 nachgewiesen werden (Abb. 4.1A, B).
Interessanterweise gab es große Schwankungen bezüglich der hZnT-8-Expression
zwischen den einzelnen Probanden mit teilweise fehlender Expression, die nur für diesen
Transporter beobachtet werden konnte (Abb. 4.2). Dabei war die Expression bzw.
fehlende Expression in den Probanden zu verschiedenen Zeitpunkten stabil (Daten nicht
gezeigt). Die Expression von hZnT-9 war in allen analysierten Zellen auf dem gleichen
niedrigen Niveau (Abb. 4.1A, B).
Aus den erhaltenen Daten kann man weiter schließen, dass hZnT-1 unter physiologischen
Bedingungen der Haupttransporter in Raji und PBMC war, während hZnT-5 in THP-1
und hZnT-6 in Molt-4 am stärksten exprimiert wurde (Abb. 4.1).
Abb. 4.1: Vergleich der Expression der humanen Zink-Exporter hZnT-1 bis hZnT-9 in
Molt-4, Raji, THP-1 und PBMC. Die T-Zelllinie Molt-4, die B-Zelllinie Raji, die MonocytenZelllinie THP-1 und PBMC wurden 40 h kultiviert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel
erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD
normalisiert. (A) Unter physiologischen Bedingungen war hZnT-1 der Haupttransporter in Raji,
hZnT-5 der Haupttransporter in THP-1 und hZnT-6 der Haupttransporter in Molt-4. (B) Unter
physiologischen Bedingungen war hZnT-1 der Haupttransporter in PBMC. Dargestellt sind die
Mittelwerte aus n = 3 ± SE.
54
Ergebnisse
Abb. 4.2: Vergleich der Expression von hZnT-8 in verschiedenen Individuen. Die PBMC
wurden 40 h kultiviert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Die Expression
von hZnT-8 unterlag großen, interindividuellen Schwankungen. Dargestellt ist die Expression in n
= 7 verschiedenen Probanden.
Um die Größe der einzelnen PCR-Produkte und die Spezifität der PCR-Reaktion zu
überprüfen, wurde im Anschluss an die TaqMan-PCR eine Gelelektrophorese
durchgeführt. Die verschiedenen Zink-Exporter mit Ausnahme von hZnT-2 konnten mit
ihrer berechneten Größe detektiert werden (Abb. 4.3A). Um die Funktionalität des
ausgewählten Primerpaares für die Amplifizierung von hZnT-2 zu bestätigen, wurde als
Positivkontrolle cDNA aus der Prostata gewählt (freundlicherweise zur Verfügung gestellt
von Dr. Marcus V. Cronauer, Düsseldorf), wo hZnT-2 exprimiert wird (Iguchi et al.,
2002). In dieser Probe konnte hZnT-2 detektiert und damit eine Fehlfunktion der PCR
ausgeschlossen werden (Abb. 4.3B).
55
Ergebnisse
Abb. 4.3: Expression der humanen Zink-Exporter hZnT-1 bis hZnT-9 in Molt-4, Raji,
THP-1 und PBMC. Die T-Zelllinie Molt-4, die B-Zelllinie Raji, die Monocyten-Zelllinie THP-1
und PBMC wurden 40 h kultiviert. Die PCR-Produkte wurden auf ein 1 %-iges TAE-Gel
aufgetragen. (A) Die Zink-Exporter hZnT-1 und hZnT-3 bis hZnT-9 konnten spezifisch mit ihrer
jeweiligen Größe detektiert werden. (B) Der Zink-Exporter hZnT-2 konnte spezifisch mit seiner
Größe in cDNA aus der Prostata, welche als Positivkontrolle diente, nachgewiesen werden.
Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus n = 3. Legende: L = 100 bp-Leiter, 1 = Raji,
2 = Molt-4, 3 = THP-1, 4 = PBMC, N = Negativkontrolle, P = Prostata-Positivkontrolle.
Um das Expressionsprofil der analysierten Zelllinien mit dem von primären, isolierten
Zellen zu vergleichen, sollte die Expression der einzelnen Zink-Exporter in primären,
aufgereinigten Zellen gemessen werden. In Bezug auf die T-Zellen, die ungefähr 60 % der
PBMC ausmachen, konnten ausreichend Zellen isoliert werden, die im Durchschnitt eine
Reinheit von 97,3 % aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Bei den B-Zellen, die ungefähr zu
20 % in den PBMC vertreten sind, konnte im Durchschnitt eine Reinheit von 95,6 %
erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Leider war die Ausbeute an B-Zellen und damit auch
an mRNA so gering, dass die mRNA von drei verschiedenen Spendern vor der Analyse
gepoolt werden musste, um eine PCR-Reaktion laufen lassen zu können. Da die zur
Quantifizierung genutzte Methode hier an ihre Grenze stieß, konnte leider keine Analyse
des Expressionsprofils in isolierten Monocyten durchgeführt werden, da diese nur
ungefähr 10 % der PBMC ausmachen.
Das Expressionsprofil von hZnT-1 bis hZnT-9 in primären, aufgereinigten T-Zellen war
ähnlich zu dem in der Zelllinie Molt-4, auch wenn die Expression für jeden einzelnen
Zink-Exporter in den primären T-Zellen höher war (Abb. 4.4A). Wie in der T-Zelllinie
auch war hZnT-2 nicht zu detektieren und es gab eine kaum messbare Expression von
hZnT-3, während hZnT-4 eine deutliche Expression zeigte. Weiterhin war hZnT-6 wieder
der Haupttransporter unter physiologischen Bedingungen. Außerdem gab es eine starke
56
Ergebnisse
Expression von hZnT-7, während die mRNA-Spiegel von hZnT-8 und hZnT-9 niedrig
waren. Im Gegensatz zur T-Zelllinie gab es in primären T-Zellen eine erhöhte Expression
von hZnT-1 und der Zink-Exporter hZnT-5 wurde im Vergleich zu den anderen
Transportern nicht so stark exprimiert.
Die Expression von hZnT-1 bis hZnT-9 war auch in primären, aufgereinigten B-Zellen im
Vergleich zur B-Zelllinie Raji höher und zeigte ähnlich hohe Werte wie in den primären
T-Zellen (Abb. 4.4B). Im Gegensatz zur B-Zelllinie war in primären B-Zellen, trotz der
deutlich
vorhandenen
Expression
von
hZnT-1,
hZnT-6
unter
physiologischen
Bedingungen der Haupttransporter. Weiterhin konnten die beiden Transporter hZnT-3 und
hZnT-8 auf einem niedrigen Niveau detektiert werden, deren Expression in der Zelllinie
völlig fehlte. Außerdem gab es eine starke Expression von hZnT-4, während im Vergleich
zu den anderen Zink-Exportern der mRNA-Spiegel von hZnT-5 eher niedrig und der von
hZnT-7 eher hoch war. Wie in der B-Zelllinie auch konnte hZnT-2 nicht detektiert werden
und hZnT-9 zeigte eine geringe Expression.
Abb. 4.4: Vergleich der Expression der humanen Zink-Exporter hZnT-1 bis hZnT-9 in
primären, humanen T- und B-Zellen. Die mRNA der primären T- und B-Zellen wurde direkt
nach der Aufreinigung isoliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. (A) Unter
physiologischen Bedingungen war hZnT-6 der Haupttransporter in primären T-Zellen. Dargestellt
sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. (B) Unter physiologischen Bedingungen war hZnT-6 der
Haupttransporter in primären B-Zellen. Dargestellt sind die Ergebnisse von n = 3 verschiedenen,
gepoolten Spendern.
57
Ergebnisse
Aufgrund der insgesamt höheren Expressionwerte der einzelnen Zink-Transporter in
primären Zellen im Vergleich zu den proliferierenden Zelllinien, wurde die Expression
von hZnT-1 bis hZnT-9 in primären T-Zellen gemessen, die mit 10 µg/ml PHA für 48 h
stimuliert wurden, um die Zelle zu aktivieren und zur Proliferation anzuregen. Beide
Expressionsprofile ähnelten sich, aber das Ausmaß der Expression war im Vergleich zur
unstimulierten Kontrolle in stimulierten T-Zellen deutlicher niedriger (Abb. 4.5).
Abb. 4.5: Vergleich der Expression der humanen Zink-Exporter hZnT-1 bis hZnT-9 in
aktivierten, primären, humanen T-Zellen. Die primären T-Zellen wurden 48 h mit 10 µg/ml
PHA stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR.
Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Aktivierte, primäre T-Zellen
zeigten im Vergleich zur Kontrolle eine erniedrigte Expression aller Zink-Exporter. Dargestellt ist
ein exemplarisches Experiment.
Mit Hilfe dieser Daten konnte zum ersten Mal ein vollständiges Expressionsprofil der
Zink-Exporter in verschiedenen Leukocyten-Subpopulationen dargestellt werden, welches
die Grundexpression der einzelnen Zink-Exporter beschreibt. Dabei fiel auf, dass die
verschiedenen Leukocyten sich sowohl in den Zink-Exportern selbst als auch in der Höhe
der Expression unterschieden, welches auch im Vergleich zwischen stets proliferierenden
Zellen und primären, ruhenden Zellen beobachtet werden konnte. Ein weiteres wichtiges
Resultat war, dass zum ersten Mal die Expression von hZnT-8 in Leukocyten
nachgewiesen werden konnte, die bisher ausgeschlossen wurde (Chimienti et al., 2004;
Chimienti et al., 2005). Ferner konnte unter physiologischen Bedingungen hZnT-1 als
Haupttransporter in Raji und PBMC, hZnT-5 als Haupttransporter in THP-1 und hZnT-6
als Haupttransporter sowohl in Molt-4 als auch in primären, aufgereinigten B- und
T-Zellen identifiziert werden.
58
Ergebnisse
4.2 Einfluss von Zink auf die Expression von hZnTs in mononukleären
Zellen
Um den Einfluss einer Zinksupplementierung und einer Zinkdefizienz auf die Expression
der
Zink-Exporter
zu
untersuchen,
wurden
die
verschiedenen
Leukocyten-
Subpopulationen mit 15 µM und 30 µM Zink bzw. mit dem Zinkchelator TPEN für
40 Stunden kultiviert. Da nur aus den Zelllinien und den PBMC genügend mRNA
gewonnen werden konnte, wurden diese für die Analyse verwendet. Während Raji und
THP-1 mit 2,5 µM TPEN inkubiert wurden, konnten PBMC und Molt-4 nur mit 1 µM
TPEN stimuliert werden, da die Zellen nach einer Inkubation mit höheren
Konzentrationen nicht mehr lebensfähig waren (Daten nicht gezeigt).
Die Expression von hZnT-1, welcher am stärksten auf die unterschiedlichen
Zinkbedingungen reagierte, stieg mit höher werdenden Zinkkonzentrationen in allen
untersuchten Zellen an (Abb. 4.6). Dies war besonders deutlich für Molt-4 und THP-1, bei
denen die Expression unter Zink signifikant auf das zwölf- bzw. 20-fache anstieg (Abb.
4.6A, B), während die mRNA-Spiegel bei Raji und PBMC zwei- bzw. dreimal so hoch
waren (Abb. 4.6C, D). Unter Zinkmangelbedingungen mit TPEN wurde die Expression
von hZnT-1 im Vergleich zur unstimulierten Probe leicht erniedrigt (Abb. 4.6), was am
deutlichsten für THP-1 zu beobachten war (Abb. 4.6B).
Um die Expression von hZnT-1 auf Proteinebene zu analysieren, wurde freundlicherweise
ein anti-hZnT-1-Antikörper von Dr. Dianne Ford (Newcastle, UK) zur Verfügung gestellt,
da es noch keine käuflichen Antikörper gegen Zink-Transporter gibt. Mit diesem
Antikörper, der aufgrund seiner Epitopspezifität für eine Analyse im Westernblot geeignet
war, konnten die Ergebnisse der mRNA-Analyse auch auf Proteinebene bestätigt werden
(Abb. 4.6).
59
Ergebnisse
Abb. 4.6: Expression von hZnT-1 in Molt-4, THP-1, Raji und PBMC. Die Zellen wurden 40 h
mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4 und
PBMC) stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqManPCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Unter dem Balkengramm
ist jeweils ein korrespondierender Westernblot für hZnT-1 abgebildet. (A) Die Expression von
hZnT-1 in Molt-4 wurde durch Zink signifikant erhöht und durch TPEN leicht erniedrigt. (B) Die
Expression von hZnT-1 in THP-1 wurde durch Zink signifikant erhöht und durch TPEN leicht
erniedrigt. (C) Die Expression von hZnT-1 in Raji wurde durch Zink erhöht. (D) Die Expression
von hZnT-1 in PBMC wurd durch Zink erhöht und durch TPEN leicht erniedrigt. Dargestellt sind
die Mittelwerte aus n = 3 ± SE für die real-time TaqMan-PCR und ein repräsentatives Experiment
aus n = 3 für den Westernblot. * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001. Legende: K = Kontrolle,
15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn, TP = TPEN.
60
Ergebnisse
Auch unter Stimulationsbedingungen konnte keine Expression von hZnT-2 weder in den
verschiedenen Zelllinien noch in PBMC detektiert werden. Während die insgesamt
niedrige Expression von hZnT-3 in Molt-4 und PBMC leicht durch Zink erhöht wurde
(Abb. 4.7A, B), reagierten die THP-1-Zellen unter Zinkmangelbedingungen mit einer
deutlichen, fast signifikanten Herunterregulation der Expresssion (n = 3, p = 0,06) (Abb.
4.7C). Dagegen war die Expression von hZnT-3 in Raji nicht nachweisbar.
Abb. 4.7: Expression von hZnT-3 in Molt-4, PBMC und THP-1. Die Zellen wurden 40 h mit
15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4 und PBMC)
stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR. Die
hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Da es keine Expression von hZnT-3
in Raji gab, sind diese Daten nicht gezeigt. (A) Die Expression von hZnT-3 in Molt-4 wurde leicht
durch Zink erhöht, aber nicht durch TPEN reguliert. (B) Die Expression von hZnT-3 in PBMC
wurde leicht durch Zink erhöht, aber nicht durch TPEN reguliert. (C) Die Expression von hZnT-3
in THP-1 wurde nicht durch Zink reguliert, aber durch TPEN erniedrigt. Dargestellt sind die
Mittelwerte aus n = 3 ± SE. Legende: K = Kontrolle, 15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn,
TP = TPEN.
61
Ergebnisse
Die Expression von hZnT-4 änderte sich weder nach Zinksupplementierung noch nach
Zinkdepletion in Molt-4 und PBMC (Abb. 4.8A, B), während in Raji- und THP-1-Zellen
leichte Veränderungen bei insgesamt niedriger Expression zu beobachten waren (Abb.
4.8C, D).
Abb. 4.8: Expression von hZnT-4 in Molt-4, PBMC, Raji und THP-1. Die Zellen wurden 40 h
mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4 und
PBMC) stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqManPCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. (A) Die Expression von
hZnT-4 in Molt-4 wurde kaum durch Zink oder TPEN reguliert. (B) Die Expression von hZnT-4
in PBMC wurde kaum durch Zink oder TPEN reguliert. (C) Die Expression von hZnT-4 in Raji
wurde leicht durch Zink erhöht und durch TPEN erniedrigt. (D) Die Expression von hZnT-4 in
THP-1 wurde leicht durch Zink erhöht und durch TPEN erniedrigt. Dargestellt sind die
Mittelwerte aus n = 3 ± SE. Legende: K = Kontrolle, 15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn,
TP = TPEN.
62
Ergebnisse
Um die Expression von hZnT-4 auf Proteinebene zu analysieren, wurde freundlicherweise
ein anti-hZnT-1-Antikörper von Dr. M. Leigh Ackland (Victoria, Australia) zur
Verfügung gestellt, da es noch keine käuflichen Antikörper gegen Zink-Transporter gibt.
Mit diesem Antikörper, der aufgrund seiner Epitopspezifität für eine Analyse im
Durchflusscytometer geeignet war, konnte hZnT-4 auch auf Proteinebene detektiert
werden (Abb. 4.9). Die Expression von hZnT-4 wurde kaum durch Zink oder TPEN in
den verschiedenen Leukocyten-Subpopulationen reguliert (Abb. 4.9).
Abb. 4.9: Expression von hZnT-4 in Molt-4, PBMC, Raji und THP-1. Die Zellen wurden 40 h
mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4 und
PBMC) stimuliert. Die Expression von hZnT-4 wurde durch die Bindung eines FITC-konjugierten
Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers an einen Kaninchen-anti-human-ZnT-4-Antikörper
nachgewiesen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Durchflusscytometer gemessen. Die Expression
von hZnT-4 in Molt-4 (A), PBMC (B), Raji (C) und THP-1 (D) wurde kaum durch Zink oder
TPEN reguliert. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus n = 3.
Da der Antikörper für eine Analyse im Fluoreszenzmikroskop geeignet war, wurde
außerdem
die
intrazelluläre
Lokalisierung
von
hZnT-4
unter
Kontroll-
und
Stimulationsbedingungen in den verschiedenen Leukocyten-Subpopulationen (Abb. 4.10)
und im Vergleich dazu in der humanen Kolonadenokarzinom-Zelllinie Caco-2 (Abb. 4.11)
untersucht. Bisher wurde die intrazelluläre Lokalisierung von ZnT-4 nur in Zellen
untersucht, die nicht zum Immunsystem gehören. So ist beschrieben, dass ZnT-4 eine
vesikuläre bzw. granuläre Lokalisierung in Caco-2-Zellen (Murgia et al., 1999), in der
murinen Brustepithel-Zelllinie HC-11 (Kelleher und Lönnerdal, 2003) und in der
humanen Brustkarzinom-Zelllinie PMC42 aufweist (Michalczyk et al., 2002).
63
Ergebnisse
Die intrazelluläre Färbung von hZnT-4 war besonders deutlich für Molt-4 und PBMC zu
erkennen und konzentrierte sich vornehmlich auf den Rand der Zelle, während sich in den
Caco-2-Zellen das gesamte Cytoplasma mit Ausnahme des Zellkerns anfärbte (Abb. 4.10
und Abb. 4.11). Dies deutete auf eine Plasmamembranlokalisierung von hZnT-4 in Zellen
des Immunsystems hin, die bisher noch nicht beschrieben ist.
Kontrolle
15µM Zn
Kontrolle
Molt-4
15µM Zn
PBMC
30µM Zn
1µM TPEN
30µM Zn
1µM TPEN
Kontrolle
15µM Zn
Kontrolle
15µM Zn
Raji
30µM Zn
THP-1
2,5µM TPEN
30µM Zn
2,5µM TPEN
Abb. 4.10: Lokalisierung von hZnT-4 in Molt-4, PBMC, Raji und THP-1. Die Zellen wurden
40 h mit 15 µM Zink, 30 µM Zink und 2,5 µM TPEN (Raji und THP-1) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4
und PBMC) stimuliert. Die Expression von hZnT-4 wurde durch die Bindung eines FITCkonjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers an einen Kaninchen-anti-human-ZnT-4Antikörper nachgewiesen. Die Fluoreszenz wurde im Mikroskop betrachtet. hZnT-4 wurde in der
Plasmamembran von Molt-4, PBMC, Raji und THP-1 exprimiert. Dargestellt ist ein
repräsentatives Experiment aus n = 3.
64
Ergebnisse
Kontrolle
15µM Zn
Caco-2
30µM Zn
2,5µM TPEN
Abb. 4.11: Lokalisierung von hZnT-4 in Caco-2. Die Zellen wurden 40 h mit 15 µM Zink,
30 µM Zink und 2,5 µM TPEN stimuliert. Die Expression von hZnT-4 wurde durch die Bindung
eines FITC-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers an einen Kaninchen-antihuman-ZnT-4-Antikörper nachgewiesen. Die Fluoreszenz wurde im Mikroskop betrachtet.
hZnT-4 wurde im Cytoplasma von Caco-2-Zellen exprimiert. Dargestellt ist ein repräsentatives
Experiment aus n = 3.
Um auszuschließen, dass es sich hierbei um angefärbte Vesikel handelt, die aufgrund
eines stark ausgeprägten Kern-Plasma-Verhältnisses, an den Rand gedrängt werden und
so eine Plasmamembranlokalisierung vortäuschen, wurden PBMC isoliert und mit dem
Mitogen PHA stimuliert, um das Kern-Plasma-Verhältnis zu verändern. In den
stimulierten PBMC wurde dann zusätzlich zur hZnT-4-Färbung der Kern mit Hoechst
33258 angefärbt, um den Kern vom Cytoplasma und der Plasmamembran abgrenzen zu
können. Die Analyse mit dem Fluoreszenzmikroskop und eine nachfolgende
Überlagerung der beiden Fluoreszenzeinzelbilder ergaben, dass hZnT-4 tatsächlich auf der
Plasmamembran exprimiert wurde (Abb. 4.12).
Abb. 4.12: Lokalisierung von hZnT-4 in stimulierten PBMC. Die Zellen wurden 40 h mit
10 µg/ml PHA stimuliert. Die Expression von hZnT-4 wurde durch die Bindung eines FITCkonjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers an einen Kaninchen-anti-human-ZnT-4Antikörper nachgewiesen. Gleichzeitig wurde der Kern mit Hoechst 33258 angefärbt. Die
Fluoreszenz wurde im Mikroskop betrachtet. hZnT-4 wurde in der Plasmamembran von
stimulierten PBMC exprimiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus n = 3.
65
Ergebnisse
Eine Analyse der mit PHA stimulierten PBMC mit dem Durchflusscytometer zeigte
außerdem, dass die Expression von hZnT-4 nach 40-stündiger Stimulation mit 10 µg/ml
PHA im Vergleich zur Kontrolle signifikant höher war (Abb. 4.13A). Auf den ersten
Blick scheint dies im Gegensatz zur niedrigen mRNA-Expression von hZnT-4 nach 48 h
in mit PHA stimulierten, primären T-Zellen zu stehen, aber die mRNA-Expression von
hZnT-4 wurde bereits nach einer einstündigen Stimulation mit 10 µg/ml PHA in primären
T-Zellen induziert und nahm anschließend wieder ab (Abb. 4.13B). Dies deutet auf eine
Beteiligung von hZnT-4 im Aktivierungsprozess der Leukocyten während einer
Immunantwort hin.
Abb. 4.13: Expression von hZnT-4 in stimulierten PBMC. (A) Die Zellen wurden 40 h mit
10 µg/ml PHA stimuliert. Die Expression von hZnT-4 wurde durch die Bindung eines FITCkonjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers an einen Kaninchen-anti-human-ZnT-4Antikörper nachgewiesen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Durchflusscytometer gemessen. Die
Protein-Expression von hZnT-4 stieg nach 40-stündiger Stimulation mit PHA im Vergleich zur
Kontrolle signifikant an. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. ** p < 0,01. (B) Die
Zellen wurden für 1 h mit 10 µg/ml PHA stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel
erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD
normalisiert. Die mRNA-Expression von hZnT-4 stieg nach einstündiger Stimulation mit PHA im
Vergleich zur Kontrolle an. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus n = 3.
66
Ergebnisse
Während die Expression von hZnT-5 in Molt-4 sowohl unter Zinkzugabe als auch
Zinkdepletion unverändert blieb (Abb. 4.14A), konnte in Raji überraschenderweise eine
erhöhte Expression unter Zinkdefizienzbedingungen gemessen werden (Abb. 4.14B).
Dagegen hatte Zink keinen Einfluss auf die Expression in Raji-Zellen (Abb. 4.14B).
Genauso überraschend war die beobachtete Erniedrigung der Expression in THP-1 und
PBMC nach Zink-Stimulation (Abb. 4.14C, D), welche in THP-1-Zellen nach 30 µM
Zink sogar signifikant war (Abb. 4.14C). Ein Zinkmangel hatte keinen Einfluss auf die
Expression in THP-1 und PBMC (Abb. 4.14C, D).
Abb. 4.14: Expression von hZnT-5 in Molt-4, Raji, THP-1 und PBMC. Die Zellen wurden
40 h mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4
und PBMC) stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. (A) Die
Expression von hZnT-5 in Molt-4 wurde nicht durch Zink oder TPEN reguliert. (B) Die
Expression von hZnT-5 in Raji wurde nicht durch Zink reguliert, aber durch TPEN erhöht. (C) Die
Expression von hZnT-5 in THP-1 wurde signifikant durch Zink erniedrigt, aber nicht durch TPEN
reguliert. (D) Die Expression von hZnT-5 in PBMC wurde leicht durch Zink erniedrigt, aber nicht
durch TPEN reguliert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. * p < 0,05. Legende:
K = Kontrolle, 15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn, TP = TPEN.
67
Ergebnisse
Die Regulation der beiden Zink-Exporter hZnT-6 und hZnT-7 war in Bezug auf alle
untersuchten Zellen gleich. Während die Expression beider Zink-Exporter unter
Zinkmangelbedingungen in Raji und THP-1 überraschenderweise signifikant anstieg, gab
es keine Veränderung nach Zinksupplementierung (Abb. 4.15A, B und Abb. 4.16A, B). In
Molt-4 und PBMC gab es weder durch Zink noch durch eine Zinkdepletion
Veränderungen in der Expression der beiden Transporter (Abb. 4.15C, D und Abb. 4.16C,
D).
Abb. 4.15: Expression von hZnT-6 in Raji, THP-1, Molt-4 und PBMC. Die Zellen wurden
40 h mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4
und PBMC) stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. (A) Die
Expression von hZnT-6 in Raji wurde nicht durch Zink reguliert, aber signifikant durch TPEN
erhöht. (B) Die Expression von hZnT-6 in THP-1 wurde nicht durch Zink reguliert, aber
signifikant durch TPEN erhöht. (C) Die Expression von hZnT-6 in Molt-4 wurde nicht durch Zink
oder TPEN reguliert. (D) Die Expression von hZnT-6 in PBMC wurde nicht durch Zink oder
TPEN reguliert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. * p < 0,05. Legende:
K = Kontrolle, 15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn, TP = TPEN.
68
Ergebnisse
Abb. 4.16: Expression von hZnT-7 in Raji, THP-1, Molt-4 und PBMC. Die Zellen wurden
40 h mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4
und PBMC) stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. (A) Die
Expression von hZnT-7 in Raji wurde nicht durch Zink reguliert, aber signifikant durch TPEN
erhöht. (B) Die Expression von hZnT-7 in THP-1 wurde nicht durch Zink reguliert, aber
signifikant durch TPEN erhöht. (C) Die Expression von hZnT-7 in Molt-4 wurde nicht durch Zink
oder TPEN reguliert. (D) Die Expression von hZnT-7 in PBMC wurde nicht durch Zink oder
TPEN reguliert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. * p < 0,05. Legende:
K = Kontrolle, 15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn, TP = TPEN.
69
Ergebnisse
PBMC von den Probanden, die für die Expression von hZnT-8 positiv waren, zeigten
keine Regulation weder nach Zinkzugabe noch nach Zinkmangel (Abb. 4.17A), während
die Expression in Molt-4 nach Zink gleich blieb und nach Zinkdepletion leicht abnahm
(Abb. 4.17B). Dagegen war die Expression von hZnT-8 weder in Raji noch in THP-1
nachweisbar.
Abb. 4.17: Expression von hZnT-8 in PBMC und Molt-4. Die Zellen wurden 40 h mit 15 µM
Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4 und PBMC)
stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR. Die
hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Da es keine Expression von hZnT-8
in Raji und THP-1 gab, sind diese Daten nicht gezeigt. (A) Die Expression von hZnT-8 in PBMC
wurde nicht durch Zink oder TPEN reguliert. (B) Die Expression von hZnT-8 in Molt-4 wurde
nicht durch Zink reguliert, aber durch TPEN erniedrigt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3
± SE. Legende: K = Kontrolle, 15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn, TP = TPEN.
70
Ergebnisse
Die Expression von hZnT-9 zeigte weder nach Zinksupplementierung noch nach
Zinkdepletion eine Veränderung in den untersuchten Zelllinien (Abb. 4.18).
Abb. 4.18: Expression von hZnT-9 in Molt-4, THP-1, PBMC und Raji. Die Zellen wurden
40 h mit 15 µM Zink, 30 µM Zink, 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4
und PBMC) stimuliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Die Expression
von hZnT-9 in Molt-4 (A), THP-1 (B), PBMC (C) und Raji (D) wurde weder durch Zink noch
durch TPEN reguliert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. Legende: K = Kontrolle,
15Zn = 15 µM Zink, 30Zn = 30 µM Zn, TP = TPEN.
71
Ergebnisse
Ein Vergleich der Expression der einzelnen Transporter nach Stimulation mit Zink zeigt,
dass hZnT-1 der Haupttransporter unter erhöhten Zinkbedingungen in allen untersuchten
Zellen war (Abb.4.6 bis Abb. 4.8, Abb. 4.14 bis Abb. 4.18). Tabelle 4.1 fasst die
Ergebnisse der mRNA-Analyse der einzelnen Transporter in den verschiedenen Zellen
zusammen.
Tab. 4.1: Zusammenfassung über die Regulation von hZnT-1 bis hZnT-9 unter Zink und
TPEN im Vergleich zur Kontrolle in THP-1, Raji, Molt-4 und PBMC.
THP-1
Raji
Molt-4
PBMC
Zink
TPEN
Zink
TPEN
Zink
TPEN
Zink
TPEN
hZnT-1
↑
↓
↑
↓
↑
↓
↑
↓
hZnT-2
-
-
-
-
-
-
-
-
hZnT-3
↔
↓
-
-
↑
↔
↑
↔
hZnT-4
↑
↓
↑
↓
↔
↔
↔
↔
hZnT-5
↓
↔
↔
↑
↔
↔
↓
↔
hZnT-6
↔
↑
↔
↑
↔
↔
↔
↔
hZnT-7
↔
↑
↔
↑
↔
↔
↔
↔
hZnT-8
-
-
-
-
↔
↓
↔
↔
hZnT-9
↔
↔
↔
↔
↔
↔
↔
↔
Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass die Zink-Exporter in den verschiedenen
Leukocyten-Subpopulationen unterschiedlich auf eine Zinksupplementierung bzw.
Zinkdefizienz hin reguliert werden, um die intrazelluläre Zinkhomöostase aufrecht zu
erhalten. Ein entscheidendes Resultat dieser Experimente war die Identifizierung eines
weiteren Zink-Exporters (hZnT-4), der auf der Plasmamembran von Zellen des
Immunsystems lokalisiert ist.
72
Ergebnisse
4.3 Analyse der intrazellulären Zinkhomöostase
Aufgrund der unerwarteten, gestiegenen Expression der Zink-Exporter hZnT-5, hZnT-6
und hZnT-7 unter Zinkmangelbedingungen in Raji und THP-1, wurde die intrazelluläre
Zinkhomöostase und deren Veränderung über die Zeit gemessen. Dazu wurden die
verschiedenen Zelllinien mit 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw. 1 µM TPEN (Molt-4)
stimuliert, um die Zellen unter Zinkmangel zu kultivieren und die Expression der
Transporter zu beeinflussen. Anschließend wurden die Zellen mit steigenden
Zinkkonzentrationen stimuliert und der Einfluss der veränderten Transporter-Expression
auf die intrazelluläre Zinkverteilung über eine Zeitspanne von 150 Minuten analysiert.
Zum Zeitpunkt Null lag die labile, intrazelluläre Zinkkonzentration in Molt-4 bei 0,14 nM
für die Kontrolle und bei 0,07 nM für die mit TPEN behandelte Probe. Nach einer
zweiminütigen Stimulation mit 1 µM Zink stieg die intrazelluläre Zinkkonzentration auf
ein Maximum von 0,34 nM für die unbehandelte und 0,38 nM für die mit TPEN
behandelte Probe. Danach begann die Zinkkonzentration wieder zu sinken (Abb. 4.19A).
Bei den Raji-Zellen war die anfängliche, labile Zinkkonzentration mit der von den Molt-4
gleich und lag bei 0,14 nM für die Kontrolle und 0,08 nM für die unter Zinkmangel
kultivierte Probe. Die Stimulation mit 1 µM Zink erreichte nach zwei Minuten ein
Maximum von 0,35 nM für die Kontrolle und 0,29 nM für die Zinkmangel-Probe.
Anschließend nahm die intrazelluläre Zinkkonzentration wieder ab (Abb. 4.19B). Die
labile Zinkkonzentration in THP-1 war schon zu Beginn der Messung im Vergleich zu
den Molt-4- und Raji-Zellen am höchsten und lag bei 0,3 nM für die unbehandelte und
0,18 nM für die mit TPEN behandelte Probe. Nach einer zweiminütigen Stimulation mit
1 µM Zink stieg die intrazelluläre Zinkkonzentration auf ein Maximum von 0,69 nM für
die Kontrolle und 0,49 nM für die TPEN-Probe. Im Anschluss sank die intrazelluläre
Zinkkonzentration wieder (Abb. 4.19C).
73
Ergebnisse
Abb. 4.19: Regulation der intrazellulären Zinkhomöostase in Molt-4, Raji und THP-1 nach
Stimulation mit 1 µM Zink. Die Zellen wurden 40 h mit 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw.
1 µM TPEN (Molt-4) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit 1 µM Zink stimuliert. Die
intrazelluläre, labile Zinkkonzentration wurde mit FluoZin-3 in einem Fluoreszenzplattenleser
über 150 min. gemessen. Nach einer initialen Zinkaufnahme nahm die intrazelluläre, labile
Zinkkonzentration in Molt-4 (A), Raji (B) und THP-1 (C) ab. Dargestellt sind die Mittelwerte aus
n = 3 ± SE.
Auch bei einer Stimulation mit 5 µM Zink war nach zwei Minuten das Maximum der
labilen, intrazellulären Zinkkonzentration erreicht und stieg in Molt-4 von 0,09 nM auf
1,47 nM für die unbehandelte und von 0,1 nM auf 1,81 nM für die unter Zinkmangel
kultivierte Probe. Anschließend sank die Zinkkonzentration wieder (Abb. 4.20A). In
Bezug auf die Raji-Zellen war die anfängliche, labile Zinkkonzentration mit der von Molt4 vergleichbar und lag bei 0,11 nM für die Kontrolle und 0,1 nM für die mit TPEN
behandelte Probe. Nach einer zweiminütigen Stimulation mit 5 µM Zink stieg die
intrazelluläre Zinkkonzentration auf ein Maximum von 1,59 nM für die Kontrolle und
2,03 nM für die mit TPEN behandelte Probe, um danach wieder abzunehmen (Abb.
4.20B). Die im Vergleich zu Molt-4 und Raji schon zu Beginn höhere, intrazelluläre
Zinkkonzentration in THP-1 von 0,26 nM für die Kontrolle und 0,19 nM für die
Zinkmangel-Probe stieg nach zweiminütiger Stimulation auf 2,99 nM bzw. 2,53 nM.
Danach nahm die Konzentration wieder ab (Abb. 4.20C).
74
Ergebnisse
Abb. 4.20: Regulation der intrazellulären Zinkhomöostase in Molt-4, Raji und THP-1 nach
Stimulation mit 5 µM Zink. Die Zellen wurden 40 h mit 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw.
1 µM TPEN (Molt-4) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit 5 µM Zink stimuliert. Die
intrazelluläre, labile Zinkkonzentration wurde mit FluoZin-3 in einem Fluoreszenzplattenleser
über 150 min. gemessen. Nach einer initialen Zinkaufnahme nahm die intrazelluläre, labile
Zinkkonzentration in Molt-4 (A), Raji (B) und THP-1 (C) ab. Dargestellt sind die Mittelwerte aus
n = 3 ± SE.
Bei einer Stimulation mit 50 µM Zink traten dann die Unterschiede zwischen den
einzelnen Zelltypen auf. Bei Molt-4 lag die labile, intrazelluläre Zinkkonzentration zu
Beginn bei 0,11 nM für die unbehandelte und 0,08 nM für die mit TPEN behandelte
Probe. Die maximale, intrazelluläre Zinkkonzentration war nach einer Stimulationsdauer
von 16 Minuten erreicht und lag bei 44,06 nM für die Kontrolle und 45,28 nM für die
TPEN-Probe. Danach begann die intrazelluläre Zinkkonzentration wieder abzunehmen
und lag nach 150 Minuten bei 25,33 nM für die Kontrolle und 36,76 nM für die mit TPEN
behandelte Probe (Abb. 4.21A). Bei Raji und THP-1 war die Situation anders. Die labile
Zinkkonzentration stieg bei Raji für die unbehandelte Probe von 0,12 nM nach
16-minütiger Stimulation mit 50 µM Zink auf 26,9 nM und für die unter Zinkmangel
kultivierte Probe von 0,08 nM auf 29,7 nM. Während die intrazelluläre Zinkkonzentration
der unbehandelten Probe nach 150 Minuten mit 26,03 nM immer noch unverändert war,
stieg die labile Zinkkonzentration in der mit TPEN behandelten Probe signifikant weiter
75
Ergebnisse
an, auf 62,65 nM (Abb. 4.21B). In den THP-1 war die Situation ähnlich. Zu Beginn lag
die intrazelluläre Zinkkonzentration für die Kontrolle bei 0,24 nM und für die mit TPEN
behandelte Probe bei 0,18 nM. Nach 16-minütiger Stimulation mit 50 µM Zink stieg die
labile Zinkkonzentration für die unbehandelte Probe auf 36,02 nM und für die TPENProbe auf 36,89 nM. Nach einer Stimulationsdauer von 150 Minuten blieb die
intrazelluläre Zinkkonzentration für die Kontrolle mit 39,08 nM etwa gleich, während die
labile Zinkkonzentration in der mit TPEN behandelten Probe signifikant auf 54,46 nM
weiter anstieg (Abb. 4.21C).
Abb. 4.21: Regulation der intrazellulären Zinkhomöostase in Molt-4, Raji und THP-1 nach
Stimulation mit 50 µM Zink. Die Zellen wurden 40 h mit 2,5 µM TPEN (THP-1 und Raji) bzw.
1 µM TPEN (Molt-4) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit 50 µM Zink stimuliert. Die
intrazelluläre, labile Zinkkonzentration wurde mit FluoZin-3 in einem Fluoreszenzplattenleser
über 150 min. gemessen. Nach einer initialen Zinkaufnahme nahm die intrazelluläre, labile
Zinkkonzentration in Molt-4 (A) ab, während sie in Raji (B) und THP-1 (C) anstieg. Dargestellt
sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. ** p < 0,01.
Diese Daten demonstrieren das unterschiedliche Verhalten von T-Zellen auf der einen
Seite und B-Zellen und Monocyten auf der anderen Seite als Antwort auf eine Stimulation
mit Zink nach vorheriger Induktion einer Zinkdefizienz, welches mit der Regulation der
Zink-Exporter in Einklang gebracht werden kann.
76
Ergebnisse
4.4 Expression von hZnT-8 in Diabetikern
Während dieser Arbeit konnte zum ersten Mal in PBMC und auf einem geringeren Niveau
in Molt-4 die Expression von hZnT-8 nachgewiesen werden (Abb. 4.1A, B). In den
PBMC gab es interessanterweise große Schwankungen bezüglich der hZnT-8-Expression
zwischen den einzelnen Probanden mit teilweise fehlender Expression, die nur für diesen
Transporter beobachtet werden konnte (Abb. 4.2). Bisher war nur beschrieben, dass es in
Leukocyten keine Expression von hZnT-8 gibt, und dass dieser Transporter in der Leber
und im Pankreas exprimiert wird, wobei dieser Zink-Exporter hauptsächlich in den
Langerhans-Inseln gefunden wurde, wo er den Transport von cytoplasmatischem Zink in
intrazelluläre Vesikel vermittelt, welches dort für die Reifung und Speicherung des
Insulins benötigt wird (Chimienti et al., 2004; Chimienti et al., 2005).
Da der Prozentsatz der hZnT-8 negativen Personen ungefähr dem prozentualen Anteil an
Diabetikern in der Bevölkerung entspricht und hZnT-8 für den Transport von Zink in
Insulin speichernde Vesikel verantwortlich ist, wurde eine mögliche Assoziation zwischen
der Expression von hZnT-8 und Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes untersucht. Für die
Analyse der Expression von hZnT-8 wurde die mRNA von insgesamt acht Typ-1Diabetikern, 13 Typ-2-Diabetikern und zehn gesunden Probanden als Kontrollgruppe
isoliert.
Im Hinblick auf die Expression von hZnT-8 auf mRNA-Ebene fällt bei Betrachtung der
Einzelergebnisse auf, dass die Probanden der Kontrollgruppe eine im Vergleich zu Typ-1und Typ-2-Diabetikern erhöhte Expression von hZnT-8 aufwiesen. Innerhalb der
gesunden Kontrollgruppe gab es zwei Probanden, die für die Expression von hZnT-8
negativ waren. Demgegenüber war die Anzahl der Patienten, die kein hZnT-8
exprimierten, bei Typ-1-Diabetikern und noch deutlicher bei Typ-2-Diabetikern erhöht
(Abb. 4.22).
77
Ergebnisse
Abb. 4.22: Expression von hZnT-8 in Typ-1- und Typ-2-Diabetikern im Vergleich zu einer
Kontrollgruppe. Die mRNA wurde direkt aus dem Vollblut isoliert. Die Quantifizierung der
mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA
von PBGD normalisiert. Die PCR-Produkte wurden auf ein 1 %-iges TAE-Gel aufgetragen. Die
Probanden der Kontrollgruppe wiesen eine im Vergleich zu Typ-1- und Typ-2-Diabetikern
erhöhte Expression von hZnT-8 auf. Dargestellt sind die Einzelergebnisse aus zehn Probanden der
Kontrollgruppe (A), acht Typ-1-Diabetikern (B) und 13 Typ-2-Diabetikern (C). Legende:
L = 100 bp-Leiter, N = Negativkontrolle.
78
Ergebnisse
Fasst man die Ergebnisse der Einzeluntersuchungen zusammen, erkennt man eine im
Vergleich zur Kontrolle signifikant reduzierte Expression von hZnT-8 in Typ-2Diabetikern. Auch in Typ-1-Diabetikern war die Expression von hZnT-8 im Vergleich zur
Kontrolle niedriger (Abb. 4.23).
Abb. 4.23: Expression von hZnT-8 in Typ-1- und Typ-2-Diabetikern. Die mRNA wurde direkt
aus dem Vollblut isoliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time
TaqMan-PCR. Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Typ-2-Diabetiker
zeigten eine im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduzierte Expression von hZnT-8. Auch bei
Typ-1-Diabetikern war die Expression von hZnT-8 reduziert. Dargestellt sind die Mittelwerte aus
n = 10 ± SE (Kontrolle), n = 8 ± SE (Typ-1-Diabetiker) und n = 13 ± SE (Typ-2-Diabetiker).
* p < 0,05.
Basierend auf einer Veröffentlichung, die eine Assoziation zwischen einer Punktmutation
im hZnT-8-Gen und dem Risiko für Typ-2-Diabetes beschreibt (Sladek et al., 2007), ist
für alle Proben eine SNP-Analyse zur allelischen Diskriminierung etabliert worden, um zu
überprüfen, ob es sich bei dem beschriebenen Basenaustausch um den gleichen Effekt
handelt, der innerhalb dieser Arbeit auf Ebene der Expression von hZnT-8 gefunden
wurde. Für die SNP-Analyse wurde die genomische DNA aus den gleichen Probanden
isoliert. Um eine Fehlfunktion der PCR ausschließen zu können, wurde im Rahmen einer
Multiplex-PCR als interne Kontrolle das Housekeeping-Gen HGH („human growth
hormone“, menschliches Wachstumshormon) verwendet. Die Punktmutation im hZnT-8Gen ist im letzten Exon an der Position 973 der mRNA lokalisiert (NM_173851) und
beinhaltet eine Basensubstitution von Thymidin (T) nach Cytosin (C), die in einem
Aminosäureaustausch von Tryptophan nach Arginin resultiert.
Die Auswertung der SNP-Analyse im Hinblick auf die Genotypen zeigt, dass (1) in der
Kontrollgruppe die Genotypen relativ ausgewogen verteilt waren, dass (2) 50 % der Typ1-Diabetiker homozygot für das C-Allel waren, und dass (3) bei Typ-2-Diabetikern der
Genotyp CC überwog (61,5 %) und es keinen Patienten mit dem Genotypen TT gab (Abb.
4.24; Tab. 4.2). Die Auswertung der Allelfrequenzen der SNP-Analyse ergab, dass das
79
Ergebnisse
C-Allel in der Kontrollgruppe zu 60 % auftrat, bei den Typ-1-Diabetikern zu 68,75 %
vorhanden war und bei den Typ-2-Diabetikern mit 80,8 % am stärksten vertreten war
(Abb. 4.24; Tab. 4.3).
Abb. 4.24: Verteilung der Genotypen in Typ-1- und Typ-2-Diabetikern im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Die genomische DNA wurde direkt aus dem Vollblut isoliert und in eine
Multiplex-PCR eingesetzt. In einer PCR wurde das C-Allel amplifiziert, während in der anderen
PCR das T-Allel amplifziert wurde. Als interne Kontrolle diente das Housekeeping-Gen HGH.
Die PCR-Produkte wurden auf ein 1,5 %-iges TAE-Gel aufgetragen. Dargestellt sind die
Einzelergebnisse aus zehn Probanden der Kontrollgruppe (A), acht Typ-1-Diabetikern (B) und
13 Typ-2-Diabetikern (C). Legende: L = 100 bp-Leiter, N = Negativkontrolle.
Tab. 4.2: Auswertung der SNP-Analyse im Hinblick auf den Genotypen.
Genotyp Kontrollgruppe Typ-1-Diabetes Typ-2-Diabetes
CC
4 (40 %)
4 (50 %)
8 (61,5 %)
TT
2 (20 %)
1 (12,5 %)
0 (0 %)
CT
4 (40 %)
3 (37,5 %)
5 (38,5 %)
gesamt
10 (100 %)
8 (100 %)
13 (100 %)
80
Ergebnisse
Tab. 4.3: Auswertung der SNP-Analyse im Hinblick auf die Allelfrequenzen.
Allel
Kontrollgruppe Typ-1-Diabetes Typ-2-Diabetes
C
12 (60 %)
11 (68,75 %)
21 (80,8 %)
T
8 (40 %)
5 (31,25 %)
5 (19,2 %)
gesamt
20 (100 %)
16 (100 %)
26 (100 %)
Eine Darstellung der vom Genotyp abhängigen Expression von hZnT-8 unter
Berücksichtigung einer vorliegenden Diabetes-Erkrankung, die aufgrund niedriger
Fallzahlen mit Vorsicht zu betrachten ist, zeigte im Fall des Genotypen CC eine im
Vergleich zur Kontrolle signifikant erniedrigte Expression von hZnT-8 in Typ-2Diabetikern (Abb.4.25).
Abb. 4.25: Vom Genotyp abhängige Expression von hZnT-8 in Typ-1- und Typ-2Diabetikern im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die mRNA wurde direkt aus dem Vollblut
isoliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR. Die
hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Die Expression wurde mit dem
Ergebnis der SNP-Analyse in Bezieung gesetzt. In Bezug auf den Genotypen CC zeigten Typ-2Diabetiker eine im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduzierte Expression von hZnT-8.
Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 4 ± SE (Kontrolle CC), n = 4 ± SE (Kontrolle CT), n = 2 ±
SE (Kontrolle TT), n = 8 ± SE (Typ-2-Diabetiker CC), n = 5 ± SE (Typ-2-Diabetiker CT), n = 0
(Typ-2-Diabetiker TT), n = 4 ± SE (Typ-1-Diabetiker CC), n = 3 ± SE (Typ-1-Diabetiker CT) und
n = 1 (Typ-1-Diabetiker TT). ** p < 0,01.
81
Ergebnisse
Die Betrachtung der vom Genotyp abhängigen Expression von hZnT-8 unabhängig von
einer vorliegenden Diabetes-Erkrankung ergab, dass es zwischen den Genotypen keinen
signifikanten Unterschied in der Expression von hZnT-8 gab (Abb. 4.26).
Abb. 4.26: Vom Genotyp abhängige Expression von hZnT-8. Die mRNA wurde direkt aus dem
Vollblut isoliert. Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel erfolgte mittels real-time TaqMan-PCR.
Die hZnT mRNA wurde auf die mRNA von PBGD normalisiert. Die Expression wurde mit dem
Ergebnis der SNP-Analyse in Bezieung gesetzt. Zwischen den Genotypen gibt es keinen
signifikanten Unterschied in der Expression von hZnT-8. Dargestellt sind die Mittelwerte aus
n = 16 ± SE (CC), n = 12 ± SE (CT) und n = 3 ± SE (TT).
Damit konnte demonstriert werden, dass zwar die Assoziation zwischen Typ-2-Diabetes
und dem beschriebenen SNP existiert, dieser aber nicht die Expressionshöhe von hZnT-8
beeinflusst, welcher den entscheidenden Faktor darstellt.
82
Ergebnisse
4.5 Einfluss von Zink auf die Signaltransduktion
Nachdem der unterschiedliche Einfluss der verschieden regulierten Zink-Exporter auf die
intrazelluläre Zinkhomöostase demonstriert werden konnte, sollte der Einfluss von Zink
auf die durch die Interleukine IL-1, IL-2 und IL-4 induzierte, intrazelluläre
Signaltransduktion in T-Zellen analysiert werden.
4.5.1
IL-1 Signalweg
Es ist bekannt, dass relativ hohe Konzentrationen ab 100 µM Zink direkt die IRAK (IL-1
Typ-I Rezeptor-assoziierte Kinase) und damit die IL-1β-abhängige T-Zell-Stimulation
inhibieren können (Wellinghausen et al., 1997a; Rink und Gabriel, 2001). Außerdem
konnte anhand einer Messung der Zellaktivierung mit dem Cytosensor gezeigt werden,
dass Zinkkonzentrationen ab 15 µM zu einer Inhibition der durch IL-1β hervorgerufenen
Aktivitätssteigerung der T-Zellen führen, wobei höhere Zinkkonzentrationen einen
stärkeren, inhibitorischen Effekt haben (Ibs, 2006). Damit konnte ein inhibitorischer
Einfluss von Zink in niedrigen und damit physiologisch relevanten Konzentrationen
demonstriert werden (Ibs, 2006).
Demgegenüber gibt es keine Informationen bezüglich der Reaktion von T-Zellen auf eine
Stimulation mit IL-1β unter Zinkmangelbedingungen, welche im Rahmen dieser Arbeit
mit Hilfe der murinen T-Zelllinie EL-4 6.1 anhand der Produktion von mIL-2 analysiert
wurde. Dafür wurden die Zellen über vier Tage unter Zinkmangelbedingungen kultiviert
(1. Inkubation) und am vierten Tag ein Mediumswechsel vorgenommen (2. Inkubation),
der in einem Ansatz einen Zinkflux in die Zelle induzierte.
Die Messung der labilen, intrazellulären Zinkkonzentration vor der Stimulation mit IL-1β
(1 ng/ml) hat ergeben, dass die Zellen, in denen der Zinkflux induziert wurde, im
Vergleich zur Kontrolle und im Vergleich zu den Zellen, die dauerhaft unter
Zinkmangelbedingungen kultiviert wurden, eine signifikant höhere Zinkkonzentration
aufwiesen (Abb. 4.27A). Außerdem wiesen die Zellen, die dauerhaft unter
Zinkmangelbedingungen
kultiviert
wurden,
eine
signifikant
höhere,
labile
Zinkkonzentration im Vergleich zur Kontrolle auf (Abb. 4.27A). Korrespondierend zu
diesem Ergebnis war im Vergleich zur Kontrolle und im Vergleich zu den Zellen, die
dauerhaft unter Zinkmangelbedingungen kultiviert wurden, die Produktion von mIL-2
nach einer 24-stündigen Inkubation mit IL-1β in den Zellen signifikant am höchsten, in
denen der Zinkflux induziert wurde (Abb. 4.27B). Weiterhin war die Produktion von
83
Ergebnisse
mIL-2 in den Zellen, die dauerhaft unter Zinkmangelbedingungen kultiviert wurden, im
Vergleich zur Kontrolle signifikant höher (Abb. 4.27B).
Abb. 4.27: Reaktion von EL-4 6.1 auf eine Stimulation mit IL-1β
β unter
Zinkmangelbedingungen. Die Zellen wurden für vier Tage mit 1 µM TPEN stimuliert
(1. Inkubation). Am vierten Tag erfolgte ein Mediumswechsel (2. Inkubation), der in einem
Ansatz einen Zinkflux induziert (TPEN / w/o). Die Messung der intrazellulären, labilen
Zinkkonzentration erfolgte mit einem Durchflusscytometer. Die Produktion von mIL-2 wurde mit
einem ELISA bestimmt. (A) Vor der Stimulation mit 1 ng/ml IL-1β war die labile
Zinkkonzentration in den Zellen, in denen der Zinkflux induziert wurde, im Vergleich zur
Kontrolle und im Vergleich zu den Zellen, die dauerhaft unter Zinkmangelbedingungen kultiviert
wurden, signifikant höher. Außerdem wiesen die Zellen, die dauerhaft unter
Zinkmangelbedingungen kultiviert wurden, eine signifikant höhere, labile Zinkkonzentration im
Vergleich zur Kontrolle auf. (B) Die Produktion von mIL-2 war nach einer 24-stündigen
Inkubation mit 1 ng/ml IL-1β in den Zellen, in denen der Zinkflux induziert wurde, im Vergleich
zur Kontrolle und im Vergleich zu den Zellen, die dauerhaft unter Zinkmangelbedingungen
kultiviert wurden, signifikant am höchsten. Weiterhin war die Produktion von mIL-2 in den
Zellen, die dauerhaft unter Zinkmangelbedingungen kultiviert wurden, im Vergleich zur Kontrolle
signifikant höher. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE für die Messung der labilen
Zinkkonzentration und n = 5 ± SE für den ELISA. * p < 0,05.
Hiermit konnte zum ersten Mal demonstriert werden, dass eine Aktivierung von T-Zellen
mit IL-1β unter Zinkmangelbedingungen zu einer Aktivitätssteigerung führt und dass
diese Aktivitätssteigerung mit der intrazellulären Zinkkonzentration korreliert.
4.5.2
IL-2/IL-4 Signalweg
Es ist beschrieben, dass Zink dazu in der Lage ist, die durch IL-4 induzierte Proliferation
von T-Zellen zu hemmen, während es keinen Einfluss auf das durch IL-2 hervorgerufene
Wachstum hat. Demgegenüber hat die Inkubation mit dem Zink-Chelator TPEN keine
Auswirkungen auf die durch IL-2 oder IL-4 induzierte Proliferation (Ibs, 2006). Basierend
auf diesen Daten soll im Rahmen dieser Arbeit der zugrunde liegende, molekulare
Mechanismus für dieses unterschiedliche Verhalten aufgeklärt werden. Die Experimente
84
Ergebnisse
werden mit der murinen T-Zelllinie CTLL-2 durchgeführt, deren Proliferation von den
Cytokinen IL-2 oder IL-4 abhängig ist.
Um zu überprüfen, ob der inhibitorische Effekt durch Zink auf die durch IL-4 induzierte
Proliferation tatsächlich auf einem Einfluss auf die Proliferation basiert und nicht durch
eine Beeinflussung der Apoptose hervorgerufen wird, wurde der Einfluss von Zink und
TPEN auf den Anteil der toten Zellen nach einer viertägigen Inkubation mit 30 U/ml IL-2
oder 2,5 U/ml IL-4 gemessen. Während auf die Stimulation mit IL-2 sowohl Zink als auch
TPEN keinen Einfluss hatten, konnte für die Stimulation mit IL-4 ein im Vergleich zur
Kontrolle um 6,1 % signifikant erhöhter Anteil an toten Zellen nach Inkubation mit Zink
nachgewiesen werden. Demgegenüber hatte TPEN keinen Einfluss auf die Stimulation
mit IL-4 (Abb. 4.28).
Abb. 4.28: Einfluss von Zink und TPEN auf den Anteil toter CTLL-2-Zellen nach
Stimulation mit IL-2 oder IL-4. Die Zellen wurden nach einer einstündigen Vorinkubation mit
50 µM Zink und 1 µM TPEN für weitere vier Tage mit 30 U/ml IL-2 oder 2,5 U/ml IL-4
stimuliert. Der Anteil der toten Zellen wurde mit einem PJ-Staining im Durchflusscytometer
gemessen. (A, B) Weder Zink noch TPEN hatten einen Einfluss auf den Anteil an toten Zellen
nach Stimulation mit IL-2. (C, D) Zink erhöhte um 6,1 % signifikant den Anteil an toten Zellen
nach Stimulation mit IL-4, während TPEN keinen Einfluss darauf hatte. Dargestellt sind die
Mittelwerte aus n = 3 ± SE (IL-2) und n = 4 ± SE (IL-4). * p < 0,05.
85
Ergebnisse
Nachdem gezeigt werden konnte, dass der inhibitorische Effekt durch Zink auf die durch
IL-4 induzierte Proliferation durch eine Beeinflussung der Apoptose hervorgerufen wird,
sollte im Anschluss daran der molekulare Mechanismus untersucht werden. Dafür wurde
der Einfluss von 20 µM und 50 µM Zink auf den Phosphorylierungsgrad einiger
Zielproteine in CTLL-2-Zellen nach Stimulation mit 30 U/ml IL-2 und 150 U/ml IL-4 im
Westernblot analysiert. Da bekannt ist, dass IL-4 STAT-6 („signal transducer and
activator of transcription-6“) aktivieren kann (Kaplan et al., 1996; Takeda et al., 1996),
wurde mit diesem Protein begonnen.
Auch wenn IL-4 im Gegensatz zu IL-2 zu einer Phosphorylierung von STAT-6 geführt
hat, so war dennoch kein Einfluss von Zink auf den Phosphorylierungsgrad erkennbar
(Abb. 4.29A). Im nächsten Schritt wurden die MAP-Kinasen p38 und p42/44 berachtet.
IL-2 hat zu einer Phosphorylierung von p42/44 geführt, aber Zink hat den Grad der
Phosphorylierung nicht beeinflusst (Abb. 4.29A). Im Hinblick auf die p38-Kinase konnte
keines der Cytokine eine Steigerung der Phosphorylierung hervorrufen (Abb. 4.29A). Der
nächste Versuch konzentrierte sich auf die anti-apoptotisch fungierende Akt-Kinsase. IL-2
hat zu einer starken Zunahme der Phosphorylierung der Akt-Kinase geführt, aber die
Inkubation mit Zink hatte keine Wirkung auf den Grad der Phosphorylierung (Abb.
4.29A). Bei IL-4 war die Situation anders. Während die Inkubation mit IL-4 allein in einer
Phosphorylierung der Akt-Kinase resultierte, konnte Zink diese inhibieren (Abb. 4.29A).
Eine densitometrische Analyse ergab, dass bereits Konzentrationen ab 20 µM Zink zu
einer signifikanten Reduktion der Phosphorylierung der Akt-Kinase um 13,2 % führten
(Abb. 4.29B, C).
86
Ergebnisse
Abb. 4.29: Einfluss von Zink auf den Phosphorylierungsgrad einiger Zielproteine in
CTLL-2-Zellen nach Stimulation mit IL-2 oder IL-4. Vier Tage nach dem letzten Umsetzen
wurde das restliche Cytokin durch mehrfaches Waschen entfernt. Die Zellen wurden nach einer
15-minütigen Vorinkubation mit 20 µM und 50 µM Zink für weitere 15 min. mit 30 U/ml IL-2
oder 150 U/ml IL-4 stimuliert. Der Phosphorylierungsgrad wurde im Westernblot bestimmt bzw.
densitometrisch analysiert. (A) Zink hatte keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von STAT-6,
p38 und p42/44 nach Stimulation mit IL-2 oder IL-4. Demgegenüber hat Zink die
Phosphorylierung der Akt-Kinase nach Stimulation mit IL-4 inhibiert. (B, C) Nach Stimulation
mit IL-4 hat Zink die Phosphorylierung der Akt-Kinase signifikant um 13,2 % inhibiert.
Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus n = 3 ± SE für die Westernblots und die
Mittelwerte aus n = 3 ± SE für die densitometrische Analyse. ** p < 0,01.
Damit konnte der molekulare Mechanismus für den Einfluss von Zink auf das
unterschiedliche Verhalten von T-Zellen bei einer Stimulation mit IL-2 bzw. IL-4
aufgeklärt werden.
4.6 Einfluss von Zink auf die Apoptose
Unter 4.1 wurde gezeigt, dass proliferierende Zelllinien und mit PHA stimulierte, primäre
Zellen im Vergleich zu ruhenden, primären Zellen eine insgesamt niedrigere Expression
der einzelnen Zink-Exporter besitzen (Abb. 4.1, Abb. 4.4, Abb. 4.5). Ferner ist
beschrieben, dass verschiedene Zelllinien, mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte
87
Ergebnisse
Zellen, mit dem Superantigen SPEA (Streptococcus pyogenes erythrogenes toxin A)
stimulierte PBMC und PBMC von Leukämie-Patienten, eine im Vergleich zu PBMC von
gesunden Probanden niedrigere Expression der Zink-Importer (hZip) aufweisen (Ibs,
2006). Damit ergibt sich für proliferierende Zellen im Vergleich zu ruhenden Zellen eine
insgesamt niedrigere Expression sowohl an Zink-Exportern als auch an Zink-Importern.
Dies lässt vermuten, dass proliferierende Zellen ihre intrazelluläre Zinkhomöostase auf
einem niedrigeren Niveau halten. Da Zelllinien sich in erster Linie von primären Zellen
darin unterscheiden, dass sie nicht in die Apoptose gehen und ständig proliferieren, und da
Zink für die Regulation der Apoptose eine entscheidende Bedeutung zukommt
(Sunderman, 1995), wurde unter Berücksichtigung der Regulation der Zink-Transporter
der Einfluss sowohl einer Zinkdefizienz als auch einer Zinkstimulation auf die Apoptose
in einer immortalen Zelllinie analysiert.
Dafür wurde die T-Zelllinie Molt-4 genutzt. Für die Untersuchung der Auswirkungen
einer Zinkdefizienz auf die Apoptose wurden die Zellen nach einer 40-stündigen
Inkubation mit 1 µM TPEN für weitere sechs Stunden mit dem Apoptose-induzierenden
Agenz Actinomycin D (5 µg/ml) stimuliert. Anschließend wurde der Anteil der Apoptose
mit dem Durchflusscytometer gemessen. Die Analyse ergab, dass es vor der Induktion der
Apoptose mit Actinomycin D keinen Unterschied in Bezug auf den Anteil an apoptischen
Zellen gab. Erst nach der Induktion der Apoptose war der Anteil der apoptotischen Zellen
in der mit TPEN vorinkubierten Probe im Vergleich zur Kontrolle signifikant höher (Abb.
4.30).
Abb. 4.30: Einfluss von TPEN auf die Apoptose in Molt-4. Die Zellen wurden nach einer
40-stündigen Inkubation mit 1 µM TPEN für weitere sechs Stunden mit 5 µg/ml Actinomycin D
stimuliert. Anschließend wurde der Anteil der Apoptose mit dem Durchflusscytometer gemessen.
Vor der Induktion der Apoptose mit Actinomycin D gab es keinen Unterschied in Bezug
auf den Anteil an apoptischen Zellen. Nach der Induktion der Apoptose mit Actinomycin D
war der Anteil der apoptotischen Zellen in der mit TPEN vorinkubierten Probe im Vergleich zur
Kontrolle signifikant höher. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE. Legende:
AcD = Actinomycin D. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01.
88
Ergebnisse
Für die Analyse der Auswirkungen einer Zinksupplementierung auf die Apoptose wurden
die Zellen nach einer 40-stündigen Kultivierung für weitere sechs Stunden mit 5 µM Zink,
dem Ionophor Natriumpyrithion (50 µM) und Actinomycin D (5 µg/ml) stimuliert.
Anschließend wurde der Anteil der Apoptose mit dem Durchflusscytometer gemessen.
Die Auswertung zeigt, dass allein die Inkubation mit Zink ohne Actinomycin D zu einer
signifikant erhöhten Apoptoserate führte, was den destruktiven Aspekt von Zink
verdeutlicht. Gleichzeitig demonstrierte Zink auch einen protektiven Effekt, da nach der
Induktion der Apoptose mit Actinomycin D die Apoptoserate in dem mit Zink
behandelten Ansatz im Vergleich zu dem mit Zink behandelten Ansatz, zu dem kein
Actinomycin D gegeben wurde, signifikant geringer anstieg (Abb. 4.31).
Abb. 4.31: Einfluss von Zink auf die Apoptose in Molt-4. Die Zellen wurden nach einer
40-stündigen Kultivierung für weitere sechs Stunden mit 5 µM Zink, 50 µM Natriumpyrithion und
5 µg/ml Actinomycin D stimuliert. Anschließend wurde der Anteil der Apoptose mit dem
Durchflusscytometer gemessen. Zink führte zu einer signifikant erhöhten Apoptoserate. Die
Apoptoserate stieg nach der Induktion der Apoptose mit Actinomycin D in dem mit Zink
behandelten Ansatz im Vergleich zu dem mit Zink behandelten Ansatz, zu dem kein Actinomycin
D gegeben wurde, signifikant geringer an. Dargestellt sind die Mittelwerte aus n = 3 ± SE.
Legende: AcD = Actinomycin D, Zn = Zink, Na-Pyr = Natriumpyrithion. * p < 0,05; ** p < 0,01;
*** p < 0,001.
Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass sich die Zelle bei niedrigen Zink-Konzentrationen
durch die Regulation der Zink-Transporter und damit der intrazellulären Zinkhomöostase
vor der Induktion der Apoptose schützen konnte. Demgegenüber induzierten hohen ZinkKonzentrationen die Apoptose direkt. Allerdings drehten sich die Verhältnisse nach
Inkubation mit dem Apoptose-inudzierenden Agenz Actinomycin D wieder um. Während
einer Apoptose-Induktion wirkte der Zinkmangel destruktiv und der Zinküberschuss
protektiv.
89
Diskussion
5
Diskussion
Aufgrund der essentiellen Rolle von Zink für das Immunsystem (Vallee und Falchuk,
1993; Wellinghausen et al., 1997a; Rink und Haase, 2007), ist es wichtig zu verstehen,
welche Moleküle für den Zinktransport in die Zelle hinein und aus der Zelle heraus von
Bedeutung sind, wie diese Moleküle unter verschiedenen Zinkkonzentrationen reguliert
werden und welche Auswirkungen sie auf die intrazelluläre Zinkhomöostase und damit
verbunden auf entscheidende Prozesse wie Signaltransduktion und Apoptose haben.
Bisher ist die Expression und Regulation der einzelnen Zinktransporter und deren Einfluss
auf die intrazelluläre Zinkhomöostase in immunologisch relevanten Zellen nur partiell und
mit verschiedenen experimentellen Systemen untersucht worden. Innerhalb dieser Arbeit
wurde zum ersten Mal ein globaler Überblick über die Verteilung und Regulation aller
beschriebenen
Zink-Exporter
in
den
verschiedenen
Leukocyten-Subpopulationen
präsentiert. Außerdem wurde der Einfluss der unterschiedlich regulierten Zink-Exporter
auf die intrazelluläre Zinkhomöostase dargestellt und der Einfluss von Zink sowohl auf
die durch die Interleukine IL-1, IL-2 und IL-4 induzierte, intrazelluläre Signaltransduktion
als auch auf die Apoptose in T-Zellen demonstriert.
Unter den neun bekannten Zink-Exportern war hZnT-1 derjenige, der am deutlichsten
durch Zink reguliert wurde. Die Expression der mRNA stieg während der
Zinksupplementierung bis auf das 20-fache an. Außerdem war hZnT-1 unter erhöhten
Zinkkonzentrationen in allen untersuchten Zelllinien der Haupttransporter. Weiterhin
konnten die Ergebnisse der mRNA-Analyse auch auf Ebene der Proteinexpression
bestätigt werden. Dieses Resultat unterstreicht die bedeutende Rolle von hZnT-1 für die
Zellen des Immunsystems und deutet auf einen wichtigen Beitrag dieses Transporters für
die Aufrechterhaltung der intrazellulären Zinkhomöostase und der damit verbundenen
Funktionen im Immunsystem hin. Dieses Ergebnis bestätigt die Beobachtungen einer
Arbeitsgruppe, welche nur die Expressionserhöhung von hZnT-1 unter Zink und die
korrespondierende Erniedrigung unter Zinkmangelbedingungen in THP-1 beschreibt
(Cousins et al., 2003a und 2003b). Ferner ist bekannt, dass die mRNA-Spiegel von ZnT-1
im Dünndarm, in der Leber und in der Niere von Ratten nach einer zinkreichen Diät
ansteigen (Liuzzi et al., 2001). Diese ausgeprägte Regulation passt zu der Tatsache, dass
ZnT-1 der bisher einzig beschriebene Zink-Exporter ist, der in der Plasmamembran vieler
verschiedener Zellen lokalisiert ist und dort die intrazelluläre Zinkkonzentration durch
einen Zinkefflux aus der Zelle heraus erniedrigt (Palmiter und Findley, 1995). Auf diese
Art und Weise verleiht dieser Transporter der Zelle eine Resistenz gegenüber hohen
90
Diskussion
Zinkkonzentrationen und schützt diese vor der Toxizität durch Zink, wie es für
transfizierte BHK-Zellen beschrieben ist (Palmiter und Findley, 1995; Palmiter, 2004).
Die Regulation des murinen ZnT-1 ähnelt derjenigen des Metallothioneingens und basiert
auf zwei metallresponsiven Elementen in der Promotorregion des ZnT-1-Gens. Diese
werden durch die Bindung des Transkriptionsfaktors MTF-1 (metal response elementbinding transcription factor-1) aktiviert, der sechs Zinkfinger besitzt (Langmade et al.,
2000).
Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass zusätzlich zur Plasmamembranlokalisierung von
ZnT-1 eine Splice-Variante von ZnT-5 mit der Plasmamembran in transfizierten CHOZellen kolokalisiert (Jackson et al., 2007). In dieser Arbeit konnte hZnT-4 als ein weiterer
Zink-Exporter identifiziert werden, der in der Plasmamembran exprimiert wird. Die
Expression von hZnT-4 konnte in PBMC und Molt-4 und zu einem geringeren Grad in
Raji und THP-1 detektiert werden. Bisher war nur eine vesikuläre bzw. granuläre
Lokalisierung von ZnT-4 für die humane Kolonadenokarzinom-Zelllinie Caco-2 (Murgia
et al., 1999), die murine Brustepithel-Zelllinie HC-11 (Kelleher und Lönnerdal, 2003) und
die humane Brustkarzinom-Zelllinie PMC42 (Michalczyk et al., 2002) beschrieben. Die
Expression von hZnT-4 in der Plasmamembran konnte auf allen Subpopulationen gezeigt
werden und war auf die Zellen des Immunsystems beschränkt, da sich die Färbung von
der der Caco-2-Zellen unterschied, die den hZnT-4-Transporter im gesamten Cytoplasma
ausgenommen vom Zellkern exprimiert haben.
Dieses
Resultat
lässt
vermuten,
dass
im
Gegensatz
zur
ubiquitären
Plasmamembranlokalisierung von ZnT-1, verschiedene Zink-Exporter spezifisch in der
Plasmamembran unterschiedlicher Zelltypen exprimiert werden. Weiterhin scheint es so,
dass es aufgrund der wichtigen Funktion von Zink für das Immunsystem und der damit
verbundenen optimalen Funktionalität jeder einzelnen Zelle notwendig ist, zwei ZinkExporter, hZnT-1 und hZnT-4, in der Plasmamembran zu haben, um eine gut balancierte,
intrazelluläre Zinkkonzentration aufrecht zu erhalten.
Außerdem konnte die Expression von hZnT-4 nach Stimulation mit dem Mitogen PHA
gesteigert werden. Dies entspricht einem veränderten physiologischen Status der Zelle,
der während einer Immunantwort beobachtet werden kann, und weist darauf hin, dass
hZnT-4
an
der
Regulation
der
intrazellulären
Zinkhomöostase
während
des
Aktivierungsprozesses von Leukocyten beteiligt ist. Dabei ist zu erwähnen, dass dies eine
sehr schnelle Reaktion der Zelle war, da die mRNA bereits nach einer einstündigen
91
Diskussion
Stimulation mit PHA ein Maximum erreichte, danach wieder abnahm und das Protein
nach einer 40-stündigen Inkubation mit PHA signifikant höher exprimiert wurde.
Unter physiologischen Bedingungen konnte hZnT-5 als Haupttransporter in THP-1
identifiziert werden. Überraschenderweise wurde die Expression von hZnT-5 in PBMC
leicht und in THP-1 signifikant nach der Zinksupplementierung herunterreguliert. Andere
Studien beschreiben eine erhöhte Expression von ZnT-5 nach Inkubation mit Zink in
Caco-2-Zellen bzw. keine Veränderung der Expression in Zellen aus der Plazenta oder in
HeLa-Zellen (Cragg et al., 2002; Devergnas et al., 2004; Ford, 2004). Ferner wird eine
Herunterregulierung der mRNA-Spiegel von ZnT-5 nach einer Zinkbehandlung mit
200 µM Zink in Caco-2-Zellen und eine Herunterregulierung des korrespondierenden
Proteins in Patienten beschrieben, die über zwei Wochen täglich 25 mg Zink
eingenommen haben (Cragg et al., 2005). Diese Daten legen den Schluss nahe, dass die
Expression und Regulation von ZnT-5 zwischen verschiedenen Zelltypen variiert und von
der Höhe des extrazellulären Zinkgehaltes abhängig ist.
Genauso
überraschend
war
die
erhöhte
Expression
von
hZnT-5
unter
Zinkmangelbedingungen in Raji und die signifikant erhöhte Expression von hZnT-6 und
hZnT-7 unter Zinkmangelbedingungen in Raji und THP-1. Eine vergleichbare Regulation
ist auch für die Expression von ZnT-5 und ZnT-7 in HeLa-Zellen nach Zinkdepletion
beschrieben (Devergnas et al., 2004). Diese ähnliche Reaktion der drei Transporter auf
einen Zinkmangel kann damit zusammenhängen, dass alle drei Zink-Exporter im
sekretorischen Apparat lokalisiert sind und dort für die Aktivierung zinkenthaltender
Enzyme benötigt werden, indem ZnT-5, ZnT-6 und ZnT-7 Homo- und Heterooligomere
bilden und so den Zinktransport in den Golgi-Apparat und in das vesikuläre
Kompartiment durchführen (Suzuki et al., 2005a und 2005b). Diese Hypothese kann
weiter durch den beobachteten Anstieg der intrazellulären, labilen Zinkkonzentration in
Raji und THP-1 gestützt werden, der nach der Stimulation mit 50 µM Zink gemessen
wurde, während dieser nach Stimulation mit 1 µM und 5 µM Zink ausblieb. Unter
Zinkmangel kultivierte Raji-Zellen zeigten die höchste Zinkaufnahme nach Stimulation,
die mit einem Zinktransport in den sekretorischen Apparat als Folge der Heraufregulation
der drei Zink-Exporter hZnT-5, hZnT-6 und hZnT-7 erklärt werden kann. Nach den RajiZellen folgten die THP-1-Zellen mit dem zweithöchsten Anstieg der labilen,
intrazellulären Zinkkonzentration. Diese zeigten unter Zinkmangelbedingungen eine
erhöhte Expression der beiden Zink-Exporter hZnT-6 und hZnT-7. Auf diese Weise
scheinen beide Zelltypen ihren cytoplasmatischen Zinkspiegel zu senken und die
92
Diskussion
Fähigkeit zur Proteinsynthese aufrecht zu erhalten, indem sie das Zink in den GolgiApparat transportieren.
Im Gegensatz dazu zeigten Molt-4-Zellen nach der initialen Zinkaufnahme einen Abfall
der intrazellulären Zinkkonzentration. Dies kann zum einen durch die Zinkexportaktivität
von hZnT-4 erklärt werden, dessen Expression zum ersten Mal auf der Plasmamembran
gezeigt werden konnte und der am stärksten in Molt-4 exprimiert wurde. Zum zweiten
erfolgte in Molt-4-Zellen keine Heraufregulation der Transporter hZnT-5, hZnT-6 und
hZnT-7 unter Zinkmangelbedingungen. Diese unterschiedliche Art der Regulation
zwischen Raji- und THP-1-Zellen auf der einen Seite und Molt-4-Zellen auf der anderen
passt auch gut zu der Tatsache, dass die Kapazität zur Proteinsynthese in B-Zellen und
Monocyten im Vergleich zu T-Zellen höher ist. Außerdem verfügen T-Zellen über einen
im Vergleich zu Monocyten niedrigeren, intrazellulären Zinkspiegel und reagieren
empfindlicher auf ansteigende Zinkkonzentrationen als Monocyten (Goode et al. 1989;
Wellinghausen et al. 1997b; Fraker und King, 2004). Durch die hohe Expression des auf
der Plasmamembran lokalisierten Zink-Exporters hZnT-4 scheinen sich die T-Zellen vor
zu hohen, intrazellulären Zinkkonzentrationen zu schützen.
Die Aktivität von hZnT-4 scheint sehr effizient zu sein, da die Molt-4-Zellen trotz ihrer
im Vergleich zu Raji- und THP-1-Zellen niedrigen Expression von hZnT-1, die einzige
Leukocyten-Subpopulation war, die ihren intrazellulären Zinkgehalt durch einen
Zinkexport aus der Zelle heraus gesenkt haben. Außerdem lassen die Daten vermuten,
dass die kombinierte Aktivität von hZnT-5, hZnT-6 und hZnT-7 effizienter ist als
diejenige von hZnT1 allein, da die Raji- und THP-1-Zellen das Zink eher in den GolgiApparat transportierten als aus der Zelle heraus.
Die Zink-Exporter hZnT-2, hZnT-3 und hZnT-9 scheinen keine bedeutende Rolle im
Immunsystem zu spielen. Eine Expression von hZnT-2 konnte in keiner der analysierten
Zelltypen gefunden werden. Die Funktionalität des ausgewählten Primerpaares konnte
durch den Nachweis der mRNA von hZnT-2 in der Prostata bestätigt werden. Dieses
Ergebnis passt zu Studien, die eine Expression von ZnT-2 in immunologischen Organen
wie dem Thymus und der Milz ausgeschlossen haben (Cousins et al., 2003a; Palmiter et
al., 1996b).
Die Expression von hZnT-3 war generell niedrig, und bestätigt damit andere
Beobachtungen, bei denen keine mRNA von hZnT-3 in einer humanen, lymphoblastoiden
Zelllinie gefunden werden konnte, die zuvor mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert
93
Diskussion
worden war (Andree et al., 2004). Somit scheint sich eine spezifische Rolle für ZnT-3 im
Gehirn und im Hoden zu bestätigen (Wenzel et al., 1997; Palmiter et al., 1996b).
Eine niedrige Expression von hZnT-9 konnte in allen analysierten Zellen gefunden
werden und bestätigen damit Daten, die qualitativ eine Expression von hZnT-9 (HUEL) in
Molt-4-Zellen, Raji-Zellen und PBMC gezeigt haben (Sim und Chow, 1999). In dieser
Arbeit konnte der quantitative Nachweis auch für THP-1-Zellen dargestellt werden.
Möglicherweise existieren neben Zink andere Faktoren, die die Expression von hZnT-2,
hZnT-3 und hZnT-9 beeinflussen. Dies konnte für den Zink-Importer Zip-14 gezeigt
werden, dessen Expression durch IL-6 in der Leber heraufreguliert wird und so eventuell
für die Hypozinkämie während der Akuten-Phase-Antwort verantwortlich ist (Liuzzi et
al., 2005).
Bisherige Veröffentlichungen belegen eine Expression von ZnT-8 in der Leber und in
dem Pankreas, vornehmlich in den Langerhans-Inseln, und schließen eine Expression in
PBMC aus (Chimienti et al., 2004 und 2005). Dies konnte in dieser Arbeit widerlegt
werden. Die Expression von hZnT-8 konnte zu einem geringen Grad in Molt-4 und auf
einem höheren Niveau in PBMC gezeigt werden. Die Expression von hZnT-8 in PBMC
schwankte bemerkenswert zwischen den einzelnen Probanden und reichte von sehr stark
bis hin zu fehlender Expression. Dies mag der Grund dafür sein, warum andere
Arbeitsgruppen bisher keine mRNA von ZnT-8 detektieren konnten (Chimienti et al.,
2004 und 2005). Sowohl eine Zinksupplementierung als auch eine Zinkdepletion haben
die Expression von hZnT-8 in PBMC nicht verändert, während in Molt-4 eine
Herunterregulation der mRNA von hZnT-8 unter Zinkmangelbedingungen gezeigt werden
konnte.
Innerhalb des Pankreas wird ZnT-8 hauptsächlich in den Langerhans-Inseln exprimiert
und vermittelt – ähnlich wie ZnT-5 – den Zinktransport vom Cytoplasma in intrazelluläre
Vesikel, wo es für die Reifung und Speicherung von Insulin benötigt wird (Kambe et al.,
2002; Chimienti et al., 2004 und 2005). Innerhalb dieser Arbeit wurde eine mögliche
Assoziation zwischen der Expression von hZnT-8 und Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes
untersucht. Beim Typ-1-Diabetes oder auch insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM,
„insulin dependent diabetes mellitus“) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung, die
bereits in der Jugend entsteht, und bei der die insulinsekretierenden β-Zellen des Pankreas
zerstört werden und so eine Insulinabhängigkeit entsteht. Neben einer genetischen
Prädisposition
spielen
Umweltfaktoren,
wie z.B.
virale
Infektionen
als
auch
psychologische und ernährungsbedingte Faktoren, bei der Entstehung von Typ-1-Diabetes
94
Diskussion
eine Rolle. Demgegenüber wird Typ-2-Diabetes oder nicht-insulinabhängiger Diabetes
mellitus (NIDDM, „non-insulin dependent diabetes mellitus“) auch als Altersdiabetes
bezeichnet und ist durch eine Insulinresistenz gekennzeichnet. Neben den genetischen
Faktoren sind eine kalorienreiche Überernährung und Bewegungsmangel die typischen
Risikofaktoren für Typ-2-Diabetes. Beim Typ-2-Diabetes sind die Ursachen für die
Zerstörung der β-Zellen des Pankreas noch unklar. Es ist aber beschrieben, dass dies
durch eine erhöhte Konzentrationen an Glukose und gesättigten Fettsäuren gemeinsam mit
der von Adipozyten herrührenden Sekretion bestimmter Faktoren und durch eine
chronische Aktivierung der angeborenen Immunantwort bedingt ist (Almawi et al., 1999;
Donath et al., 2003; Cnop et al., 2005).
Einige Studien berichten, dass Typ-1- und Typ-2-Diabetes-Erkrankungen häufiger in der
gleichen Familie auftreten. Dies lässt vermuten, dass es trotz der pathologischen
Unterschiede Gemeinsamkeiten in der genetischen Prädisposition für die jeweilige
Diabetes-Erkrankung gibt (Tuomi, 2005). Die in dieser Arbeit durchgeführte Analyse
ergab eine reduzierte Expression von hZnT-8 sowohl in Typ-1-Diabetikern als auch eine
signifikant reduzierte Expression in Typ-2-Diabetikern. Dies lässt vermuten, dass hZnT-8
einerseits eine größere Rolle beim Typ-2-Diabetes spielt und andererseits aber auch eine
Assoziation zum Typ-1-Diabetes besteht.
Weiterhin ist beschrieben, dass es eine Assoziation zwischen einer Punktmutation im
hZnT-8-Gen und dem Risiko für Typ-2-Diabetes gibt (Sladek et al., 2007). Diese
Punktmutation im hZnT-8-Gen ist im letzten Exon an der Position 973 der mRNA
lokalisiert (NM_173851) und beinhaltet eine Basensubstitution von Thymidin (T) nach
Cytosin (C), die in einem Aminosäureaustausch von Tryptophan nach Arginin resultiert.
Die in dieser Arbeit durchgeführte Analyse ergab, dass das C-Allel als Risikoallel bei
Typ-1-Diabetikern und noch deutlicher bei Typ-2-Diabetikern erhöht war. Bei der
Darstellung der vom Genotyp abhängigen Expression von hZnT-8 unter Berücksichtigung
einer vorliegenden Diabetes-Erkrankung konnte im Fall des Genotypen CC eine im
Vergleich zur Kontrolle signifikant erniedrigte Expression von hZnT-8 in Typ-2Diabetikern nachgewiesen werden. Die Betrachtung der vom Genotyp abhängigen
Expression von hZnT-8 unabhängig von einer vorliegenden Diabetes-Erkrankung ergab,
dass es zwischen den Genotypen keinen signifikanten Unterschied in der Expression von
hZnT-8 gab. Damit konnte bestätigt werden, dass zwar die Assoziation zwischen Typ-2Diabetes und dem beschriebenen Polymorphismus existiert, dieser aber nicht die
Expressionshöhe von hZnT-8 beeinflusst, welcher den entscheidenden Faktor darstellt.
95
Diskussion
Vor kurzem erschien eine Veröffentlichung, die ZnT-8 als eines der wichtigsten
Autoantigene für Typ-1-Diabetes identifiziert hat (Wenzlau et al., 2007). Während die
Autoantikörper gegen ZnT-8 bei 60 % bis 80 % der neu erkrankten Typ-1-Diabetiker
gefunden wurden, waren es bei den Typ-2-Diabetikern weniger als 3 %. Die kombinierte
Messung der Autoantikörper gegen die bekannten Autoantigene für Typ-1-Diabetes
(GAD, Glutamatdecarboxylase; IA2, Proteintyrosinphosphatase [„islet cell antigen 512”];
Insulin) und dem neuen Autoantigen ZnT-8 haben die Detektionsrate von 80 % auf 98 %
ansteigen lassen.
Aufgrund dieser Daten lässt sich feststellen, dass ZnT-8 sowohl bei Typ-1-Diabetes als
auch bei Typ-2-Diabetes von Bedeutung ist. Eventuell wirkt ZnT-8 auf eine ähnliche Art
und Weise als Autoantigen wie es bei Insulin der Fall ist. Es ist bekannt, dass die
Transkriptionsrate des Insulingens bei verschiedenen Personen genetisch bedingte
Unterschiede zeigt, die von einer polymorphen Minisatellitensequenz (VNTR, „variable
number of tandem repeats“) abhängt, die sich stromaufwärts des Insulingens befindet.
Wird das Gen im Thymus mit hoher Rate exprimiert, kann es durch die Vernichtung von
potenziell autoreaktiven T-Zellen vor der Entstehung von Typ-1-Diabetes schützen,
während eine niedrige Expressionsrate eine erhöhte Anfälligkeit für Typ-1-Diabetes zeigt
(Undlien et al., 1995; Bennett and Todd, 1996; Vafiadis et al., 1997; Janeway et al.,
2002).
Ein Vergleich des Expressionsprofils von hZnT-1 bis hZnT-9 zwischen Zelllinien und
primären Zellen verdeutlicht, dass die Expression der einzelnen Zink-Exporter in
primären Zellen deutlich höher war. Diese erhöhte Expression konnte durch eine
Aktivierung der primären T-Zellen mit PHA, welches Proliferation induziert,
herunterreguliert werden. Zusammen mit der Tatsache, dass Zelllinien und primäre Zellen
teilweise ein verändertes Expressionsprofil aufwiesen, wobei der Unterschied bei den BZellen größer war als bei den T-Zellen, lassen die Daten vermuten, dass ruhende und
proliferierende Zellen eine vom physiologischen Zustand abhängige, unterschiedliche
Expression der Zink-Exporter benötigen, um die intrazelluläre Zinkhomöostase aufrecht
zu erhalten. Zusammen mit den Daten einer vorangegangenen Dissertation, die beschreibt,
dass verschiedene Zelllinien, mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte Zellen, mit dem
Superantigen SPEA stimulierte PBMC und PBMC von Leukämie-Patienten, eine im
Vergleich zu PBMC von gesunden Probanden niedrigere Expression der Zink-Importer
(hZip) aufweisen (Ibs, 2006), lässt sich daraus schließen, dass proliferierende Zellen im
Vergleich zu ruhenden Zellen eine insgesamt niedrigere Expression sowohl der Zink96
Diskussion
Importer als auch Zink-Exporter besitzen und damit ihre intrazelluläre Zinkhomöostase
auf einem niedrigeren Niveau halten.
In diesem Zusammenhang ließ sich in dieser Arbeit auch zeigen, dass sich Zellen durch
die Regulation der Zink-Transporter und damit der intrazellulären Zinkhomöostase bei
niedrigen Zink-Konzentrationen vor der Induktion der Apoptose schützen konnten,
während hohe Zink-Konzentrationen die Apoptose direkt induzierten. Dabei drehten sich
die Verhältnisse während einer Inkubation mit dem Apoptose-inudzierenden Agenz
Actinomycin D wieder um. Während einer Apoptose-Induktion wirkte der Zinkmangel
destruktiv und der Zinküberschuss protektiv. Die Versuche sind mit einer T-Zelllinie
gemacht worden und passen zu der Tatsache, dass T-Zellen empfindlich auf ansteigende
Zinkkonzentrationen reagieren (Goode et al. 1989; Wellinghausen et al. 1997b; Fraker
und King, 2004). Ferner bestätigen diese Ergebnisse andere Veröffentlichungen, die
einerseits den protektiven und andererseits den destruktiven Effekt von Zink auf die
Apoptose beschreiben (Cohen und Duke, 1984; Beletsky et al., 1989; Giannakis et al.,
1991; Perry et al., 1997; Stennicke und Salvesen, 1997; Torriglia et al., 1997; Fukamachi
et al., 1998; Maret et al., 1999; Chai et al., 2000; Truong-Tran et al., 2000; Kolenko et al.,
2001).
Nachdem der unterschiedliche Einfluss der verschieden regulierten Zink-Exporter auf die
intrazelluläre Zinkhomöostase demonstriert werden konnte, wurde der Einfluss von Zink
auf die durch die Interleukine IL-1, IL-2 und IL-4 induzierte, intrazelluläre
Signaltransduktion in T-Zellen analysiert. Bei IL-1 handelt es sich um ein klassisches,
pro-inflammatorisches Cytokin, welches T-Zellen und Makrophagen aktiviert und Fieber
induziert (Janeway et al., 2002). Es konnte gezeigt werden, dass eine Aktivierung von
T-Zellen mit IL-1β unter Zinkmangelbedingungen zu einer Aktivitätssteigerung führt und
dass diese Aktivitätssteigerung mit der intrazellulären Zinkkonzentration korreliert. Dies
steht nicht im Gegensatz zu den Beobachtungen, dass (1) Zinkkonzentrationen ab 15 µM
zu einer Inhibition der durch IL-1β hervorgerufenen Aktivitätssteigerung der T-Zellen
führen (Ibs, 2006) und dass (2) relativ hohe Konzentrationen ab 100 µM Zink direkt die
IRAK (IL-1 Typ-I Rezeptor-assoziierte Kinase) und damit die IL-1β-abhängige T-ZellStimulation inhibieren können (Wellinghausen et al., 1997a; Rink und Gabriel, 2001), da
bei diesen Versuchsansätzen extrazellulär Zink zugegeben wurde. Bei dem hier in dieser
Arbeit durchgeführten Experiment ist allein über die Regulation der Transporter und
durch die Zugabe von frischem Kulturmedium ein Zinkflux in die Zelle und damit eine
erhöhte, intrazelluläre Zinkkonzentration erzielt worden. Diese Zinkkonzentrationen
97
Diskussion
erreichen allerdings nicht die Höhe, die durch die Zugabe von extrazellulärem Zink
erreicht werden können. Überraschend war, dass die Zellen, die dauerhaft unter
Zinkmangelbedingungen
kultiviert
wurden,
eine
signifikant
höhere,
labile
Zinkkonzentration im Vergleich zur Kontrolle aufwiesen. Dies könnte damit
zusammenhängen, dass der Zinkchelator TPEN mit der Zeit das Zink wieder frei gibt oder
dass das Zink aus anderen Quellen frei wird, z.B. aus Metallothionein, welches 5-20 %
des zellulären Zinks bindet (Andrews, 2001). Es ist bekannt, dass Zink aus
Metallothionein frei gesetzt wird, sobald die verfügbare Zinkkonzentration niedrig ist
(Maret, 2000). Ferner konnte in Mäusen gezeigt werden, dass Metallothionein nicht nur
vor einer Zinktoxizität sondern auch vor einer Zinkdefizienz schützt (Kelly et al., 1996).
Neben dem Einfluss von Zink auf den IL-1-Signalweg wurde auch der Einfluss von Zink
auf die durch die Cytokine IL-2 und IL-4 induzierte Signaltransduktion in T-Zellen
analysiert. Während IL-2 als T-Zell-Wachstumsfaktor das wichtigste Cytokin bei der
Entwicklung einer adaptiven Immunantwort ist, spielt IL-4 als typisches TH2-Cytokin eine
Rolle bei der B-Zell-Aktivierung, bei dem Isotypwechsel zu IgE und bei der Hemmung
von TH1-Zellen (Janeway et al., 2002). Die durchgeführte Untersuchung basiert auf der
Beobachtung, dass Zink dazu in der Lage ist, die durch IL-4 induzierte Proliferation von
T-Zellen zu hemmen, während es keinen Einfluss auf das durch IL-2 hervorgerufene
Wachstum hat (Ibs, 2006).
Der IL-4-Signalweg startet mit der hochaffinen Bindung von IL-4 an die IL-4Rα-Kette,
die daraufhin zusammen mit der allgemein vorkommenden γ-Kette ein Dimer ausbildet.
Diese Dimerisierung resultiert in der Phosphorylierung der Tyrosinreste in den mit dem
IL-4-Rezeptor assoziierten Januskinasen Jak-1 und Jak-3. Anschließend werden durch
diese Januskinasen Tyrosinreste in der cytoplasmatischen Domäne der IL-4Rα-Kette
phosphoryliert. Diese Phosphotyrosine dienen wiederum als Andockstellen für
Signalmoleküle, welche sogenannte Proteintyrosinbindende Domänen (PTB) oder SrcHomologie-2-Domänen (SH2) tragen. STAT-6 bindet über eine solche SH2-Domäne an
die
IL-4Rα-Kette
und
wird
durch
die
aktivierten
Januskinasen
an
einem
carboxyterminalen Tyrosinrest phosphoryliert. Nach der Phosphorylierung löst sich das
STAT-6-Molekül vom Rezeptor und bildet Homodimere aus. Das Dimer kann dann in
den Zellkern wandern und an spezifische DNA-Motive binden (Nelms et al., 1999).
Innerhalb dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass IL-4 zwar zur Aktivierung von
STAT-6 führt, aber es keine Beeinflussung durch Zink auf den Phosphorylierungsgrad
gibt.
98
Diskussion
Zwei weitere Signalwege für IL-4 werden durch die Proteine der Insulin-RezeptorSubstrat-(IRS)-Familie vermittelt, welche mit der IL-4Rα Kette interagieren können.
Diese lagern sich über eine PTB-Domäne an einen cytoplasmatischen Tyrosinrest an,
welcher innerhalb des I4R-Konsensusmotivs (Insulin-IL-4-Rezeptor) liegt. Dieses Motiv
findet man auch bei dem Insulin-Rezeptor und dem IGF-1-Rezeptor („Insulin-like growth
factor type-1“) (Nelms et al., 1998). Nach der Phosphorylierung der IRS-Proteine
fungieren diese als Andockstellen für Signalmoleküle, welche SH2-Domänen enthalten.
Auf
diese
Weise
kann
einerseits
die
regulatorische
Untereinheit
p85
der
Phosphatidlyinositol-3-Kinase (PI3-Kinase) andererseits aber auch das Adapterprotein
Grb-2 („growth factor receptor bound protein 2“) gebunden werden. Während die
PI3-Kinase zur Aktivierung der Akt-Kinase führt, induziert das Adapterprotein Grb-2 den
Ras-MAPK-(Mitogenaktivierte Proteinkinase)-Signalweg (Nelms et al., 1999).
Durch die hier durchgeführte Analyse der MAP-Kinasen p38 und p42/44 kann eine
Beeinflussung des Ras-MAPK-Signalweges durch Zink ausgeschlossen werden.
Demgegenüber konnte aber eine signifikante Inhibition der Akt-Kinase durch Zink nach
Stimulation mit IL-4 demonstriert werden. Korrespondierend konnte für die Stimulation
mit IL-4 ein im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöhter Anteil an toten Zellen nach
Inkubation mit Zink nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der
Tatsache, dass es sich bei der Akt- oder auch PKB-Kinase (Proteinkinase B) um eine antiapoptotisch wirkende Serin/Threonin-Kinase handelt, die u.a. über die Phosphorylierung
und damit Inaktivierung des pro-apoptotischen Moleküls Bad („Bcl-2 antagonist of cell
death“ [B cell leukemia 2]) der Apoptose entgegen wirkt (Kandel und Hay, 1999; Song et
al., 2005; Manning und Cantley, 2007). Damit konnte der molekulare Mechanismus für
den Einfluss von Zink auf die IL-4-Signaltransduktion in T-Zellen aufgeklärt werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der
Funktionalität von Zink und belegen die enorme Bedeutung der Zink-Transporter für
mononukleäre Zellen. Die Tatsache, dass immortale Zellen eine insgesamt niedrigere
Expression der Zink-Transporter besitzen, weist auf einen interessanten Unterschied in
Bezug auf die Regulation der intrazellulären Zinkhomöostase zwischen ruhenden Zellen
und proliferierenden Tumorzellen hin. So könnten die Expressionsprofile zur Bestimmung
des Zellstatus und zur Identifikation entarteter Zellen herangezogen werden. Ferner kann
durch die reduzierte Expression von hZnT-8 sowohl in Typ-1- als auch in Typ-2Diabetikern eine Assoziation zwischen diesem Zink-Exporter und den beiden DiabetesErkrankugen postuliert werden, deren Bedeutung zukünftig näher charakterisiert werden
99
Diskussion
sollte. Durch den direkten Einfluss von Zink auf die Apoptose und auf die durch
Interleukine ausgelöste, intrazelluläre Signaltransduktion, wird die Bedeutung von Zink
für das Immunsystem unterstrichen. Die hier gewonnenen Erkenntnisse sollten bei einer
therapeutischen Zinkadministration berücksichtigt werden.
100
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Zink ist ein essentielles Spurenelement für das Immunsystem. In dieser Arbeit gelang es,
wichtige Mechanismen zur intrazellulären Zinkhomöostase und deren Einfluss auf die
intrazelluläre Signaltransduktion in mononukleären Zellen aufzuklären.
Die Analyse des Expressionsprofils der Zink-Exporter hat zusammen mit der
Charakterisierung der Zink-Importer zu der Erkenntnis geführt, dass immortale Zellen
durch eine insgesamt niedrigere Expression der Zink-Transporter ihre intrazelluläre
Zinkhomöostase
auf
einem
niedrigeren
Niveau
halten.
Unter
physiologischen
Bedingungen konnte hZnT-1 als Haupttransporter in Raji und PBMC, hZnT-5 als
Haupttransporter in THP-1 und hZnT-6 als Haupttransporter sowohl in Molt-4 als auch in
primären, aufgereinigten B- und T-Zellen identifiziert werden. Weiterhin konnte die
Regulation der intrazellulären Zinkhomöostase nach Stimulation mit Zink während einer
Zinkdefizienz aufgeklärt werden: nach initialer Zinkaufnahme sinkt die intrazelluläre
Zinkkonzentration in Molt-4 durch den neu auf der Plasmamembran entdeckten hZnT-4,
während diese in Raji und THP-1 durch die unter Zinkmangelbedingungen induzierte,
erhöhte Expression der Zink-Exporter hZnT-5, hZnT-6 und hZnT-7 ansteigt. Daneben
veranschaulicht die Heraufregulation von hZnT-4 nach Stimulation mit PHA die wichtige
Funktion dieses Zink-Exporters für die Regulation der Zinkkonzentration in Leukocyten
während eines Aktivierungsprozesses. Ferner konnte durch die erniedrigte Expression des
Zink-Exporters hZnT-8 in Typ-2- und Typ-1-Diabetikern die enorme Bedeutung dieses
Transporters für diese beiden Erkrankungen dargestellt werden. Während hZnT-1, hZnT4, hZnT-5, hZnT-6 und hZnT-7 eine fundamentale Bedeutung im Hinblick auf die
Aufrechterhaltung der intrazellulären Zinkhomöostase und der damit verbundenen,
optimalen Funktionalität der einzelnen Leukocyten-Subpopulationen zukommt, scheinen
hZnT-9, hZnT-3 und hZnT-2 nur eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Außerdem
konnte der Einfluss von Zink auf intrazelluläre Prozesse wie die Apoptose und die durch
Interleukine induzierte Signaltransduktion näher charakterisiert werden. Einerseits konnte
erstmals gezeigt werden, dass eine Aktivierung von T-Zellen mit IL-1β unter
Zinkmangelbedingungen zu einer Aktivitätssteigerung führt, die mit der intrazellulären
Zinkkonzentration korreliert. Andererseits konnte der molekulare Mechanismus für den
Einfluss von Zink auf die IL-4-Signaltransduktion in T-Zellen aufgeklärt werden.
Die hier in vitro aufgeklärten Mechanismen zur Regulation der intrazellulären
Zinkhomöostase und Funktionsweise von Zink in Zellen des Immunsystems eröffnen
neue, therapeutische Optionen in der Zinksubstitution.
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Rheumatol. 17, 378-338.
115
Abkürzungsverzeichnis
8
Abkürzungsverzeichnis
SI-Einheiten sowie Abkürzungen laut Duden sind nicht aufgeführt
AIDS
Erworbenes Immundefektsyndrom („acquired immune deficiency
syndrome“)
APC
Antigenpräsentierende Zelle („antigen presenting cell“)
APS
Ammoniumpersulfat
ATCC
„American Type Culture Collection“
Bad
„Bcl-2 antagonist of cell death“
Bcl-2
„B cell leukemia 2”
BSA
Bovines Serumalbumin
C
Cytosin
CD
Differenzierungsmarker („cluster of differentiation“)
CDF
„cation diffusion facilitator“
CFDA-SE
Carboxy-Fluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester
CHO
„chinese hamster ovary“
COPD
Chronisch obstructive Lungenkrankheit („chronic obstructive
pulmonary disease“)
CT
„cycle threshold“
DMSO
Dimethyl-Sulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure („desoxyribonucleic acid“)
DSMZ
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
Enzymgekoppelter Immunosorbenstest („enzyme-linked
immunosorbent assay”)
Fc
„fragment crystallizable“
FCS
Fetales Kälberserum („fetal calf serum“)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FSC
Forwardscatter
GAD
Glutamatdecarboxylase
Grb-2
„growth factor receptor bound protein 2“
HBSS
Hank´s Balanced Salt Solution
HGH
menschliches Wachstumshormon („human growth hormone“)
HRP
Meerrettichperoxidase („horseradish peroxidase“)
116
Abkürzungsverzeichnis
I4R
Insulin-IL-4-Rezeptor
IA2
Proteintyrosinphosphatase IA2 („islet cell antigen 512”)
IDDM
Insulinabhängiger Diabetes mellitus („insulin dependent diabetes
mellitus“)
IFN
Interferon
IGF-1
„Insulin-like growth factor type-1“
IL
Interleukin
IRAK
IL-1 Typ-I Rezeptor-assoziierte Kinase
IRS
Insulin-Rezeptor-Substrat
JAK
Januskinase
LMP
„low melting point“-Agarose
LPS
Lipopolysaccharid
MAPK
Mitogenaktivierte Proteinkinase
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex („major histocompatibility
complex“)
MTF-1
„metal-response element-binding transcription factor-1“
NEAA
Nicht-essentielle Aminosäuren („non essential amino acids”)
NIDDM
Nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus („non-insulin dependent
diabetes mellitus“)
NK
Natürliche Killerzellen
PBGD
Porphobilinogendeaminase
PBMC
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes („peripheral blood
mononuclear cells“)
PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung („phosphate buffered saline”)
PCR
Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction”)
PFA
Paraformaldehyd
PHA
Phytohämagglutinin
PI3K
Phosphatidlyinositol-3-Kinase
PTB
Proteintyrosinbindende Domäne
RNA
Ribonukleinsäure („ribonucleic acid”)
SDS
Natriumdodecylsulfat („sodium dodecyl sulfate”)
SDS-PAGE
Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
SH2
Src-Homologie-2-Domäne
SLC
„solute linked carrier“
117
Abkürzungsverzeichnis
SNP
Einzelnukleotidpolymorphismus („single nucleotide polymorphism“)
SPEA
Streptococcus pyogenes erythrogenes toxin A
SSC
Sidescatter
STAT-6
„signal transducer and activator of transcription-6“
T
Thymidin
TAE
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TCR
T-Zell-Rezeptor („t cell receptor”)
TEMED
N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin
TGF
Transformierender Wachstumsfaktor (“transforming growth factor”)
TH
T-Helferzelle
TNF
Tumornekrosefaktor
TPEN
N, N, N´, N´-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylendiamin
Zip
Zink Importer („Zrt- and Irt-like proteins“)
ZnT
Zink Transporter/Exporter
118
Lebenslauf
Lebenslauf
Silke Overbeck
Geboren am 23.01.1979 in Bocholt
08/85 – 07/89
Grundschule in Bocholt
08/89 – 06/98
St.-Georg-Gymnasium in Bocholt
09/98 – 09/99
Kommunikationsberaterin bei Siemens in Bocholt
10/99 – 12/03
Biologie-Studium an der RWTH in Aachen
01/04 – 11/04
Diplomarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Lothar Rink am
Institut für Immunologie der RWTH Aachen
Thema: Interaktion von Superantigenen mit dem
Haupthistokompatibilitätskomplex und dem T-Zell-Rezeptor
11/04
Abschluss als Diplom-Biologin mit Auszeichnung und
Verleihung der Springorum-Denkmünze als Anerkennung im
Juni 2005
12/04 – 12/07
Dissertation in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Lothar Rink am
Institut für Immunologie der RWTH Aachen
119
Eigene Publikationen
Eigene Publikationen
Originalarbeiten
Bode, U., Lörchner, M., Pabst, R., Wonigeit, K., Overbeck, S., Rink, L., Hundrieser, J.
(2007) The superantigen-induced polarization of T cells in rat peripheral lymph nodes is
influenced by genetic polymorphisms in the IL-4 and IL-6 gene clusters. Int. Immunol.
19, 81-92.
Metz, C.H., Schröder, A.K., Overbeck, S., Kahmann, L., Plümäkers, B., Rink L. (2007)
T-helper type 1 cytokine release is enhanced by in vitro zinc supplementation due to
increased natural killer cells. Nutrition 23, 157-163.
Diedershagen, M., Overbeck, S., Arlt, S., Plümäkers, B., Lintges, M., Rink L. (2007)
Mycoplasma arthritidis-derived superantigen (MAM) displays DNase activity. FEMS
Immunol. Med. Microbiol. 49, 266-271.
Bode, U., Lörchner, M., Ahrendt, M., Blessenkohl, M., Kalies, K., Claus, A., Overbeck,
S., Rink, L., Pabst, R. (2008) Dendritic cell (DC) subsets in lymph nodes are
characterized by the specific draining area and influence the phenotype and fate of
primed T cells. Immunology 123, 480-490.
Overbeck, S., Uciechowski, P., Ackland, M.L., Ford, D., Rink, L. (2008) Intracellular
zinc homeostasis in leukocyte subsets is regulated by different expression of zinc
exporters ZnT-1 to ZnT-9. J. Leukoc. Biol. 83, 368-380.
Übersichtsartikel
Overbeck, S., Rink, L., Haase, H. (2008) Modulating the immune response by oral zinc
supplementation: A single approach for multiple diseases. Arch. Immunol. Ther. Exp. 56,
15-30.
Haase, H., Overbeck, S., Rink, L. (2008) Zinc supplementation for the treatment or
prevention of disease: Current status and future perspectives. Exp. Gerontol. 43, 394-408.
Kongressbeiträge
Overbeck, S., Diedershagen, M., Keitel, C., Plümäkers, B., Herrmann, T., Rink, L.
(2004) Binding modes of Mycoplasma arthritidis superantigen fused with green
fluorescent protein to its natural ligands. Immunobiology 209, 399.
Overbeck, S., Uciechowski, P., Ackland, M.L., Ford, D., Rink, L. (2007) Intracellular
zinc homeostasis in leukocytes is regulated by different expression of zinc exporters
ZnT-1 to ZnT-9. Kongressband. 37. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Immunologie.
120
Danksagung
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Lothar Rink, für die
interessante Themenstellung. Ich danke ihm für die exzellente Betreuung, die vielfältige
Unterstützung und die hilfreichen Diskussionen. Ferner möchte ich ihm für die
Anleitung zum wissenschaftlichen Denken und Handeln danken.
Herrn Prof. Dr. Fritz Kreuzaler danke ich für die Bereitschaft, als zweiter Gutachter zur
Verfügung zu stehen.
Allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des Instituts für Immunologie danke ich für die
freundliche Arbeitsatmosphäre und ständige Hilfsbereitschaft. Insbesondere möchte ich
mich bei meiner Kollegin und Freundin Frau Romney Haylett für die Unterstützung bei
der Durchflusscytometrie sowie für die vielen Diskussionen und aufmunternden Worte
bedanken. Herrn Dr. Peter Uciechowski und Herrn Dr. Klaus-Helge Ibs danke ich für
die Hilfe bei der Einarbeitung in die real-time PCR Technik. Bei Herrn Dr. Hajo Haase
möchte ich mich für die Unterstützung rund um das Thema Zink bedanken. Frau Birgit
Plümäkers danke ich für die hervorragende Zusammenarbeit im Laboralltag.
Bei Herrn Professor Dr. Wolfram Karges bedanke ich mich für die gute
Zusammenarbeit und die Bereitstellung der Patientenblutproben.
Meinem Freund Christoph Günster danke ich für die liebevolle Unterstützung jeglicher
Art. Er hat meine Launen geduldig ertragen und mir immer zur Seite gestanden.
Abschließend gilt mein besonderer Dank meiner Familie. Meine Eltern, Walter und
Evelyn Overbeck, haben mir ein sorgenfreies Studium und meinen Weg ermöglicht.
Zusammen mit meiner Schwester Judith haben sie mir ihr Vertrauen entgegen gebracht,
fest an mich geglaubt und mich während der gesamten Zeit unterstützt.
121