Auswirkung einer temporären In-vivo

Tierärztliche Hochschule Hannover
Auswirkung einer temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter
Rinderembryonen im bovinen Eileiter auf das mRNA-Expressionsmuster
entwicklungsrelevanter Gene
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder
eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. )
Vorgelegt von
Karsten Müller
aus Vechta
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung:
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Tag der mündlichen Prüfung:
Prof. Dr. med. vet. C. Wrenzycki
Klinik für Rinder,
Reproduktionsmedizinische Einheit der
Kliniken
Prof. Dr. Wrenzycki
Prof. Dr. Niemann
09.11.2011
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ......................................................................................................... 1
2
Schrifttum ......................................................................................................... 5
2.1
Physiologische und anatomische Grundlagen der Fortpflanzung des
Rindes .............................................................................................................. 5
2.1.1
Zyklus des Rindes ................................................................................... 5
2.1.2
Eileiter und Uterus des Rindes ................................................................ 6
2.1.3
Präimplantatorische Embryonalentwicklung ............................................ 8
2.2
Generierung von Embryonalstadien beim Rind .............................................. 10
2.2.1
In-vitro-Produktion von Rinderembryonen ............................................. 10
2.2.2
Gewinnung uteriner Embryonalstadien .................................................. 15
2.2.3
In-vivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen....................................... 16
2.3
Unterschiede in der Qualität und in der Genexpression bei
Rinderembryonen aus verschiedenen Herkünften ......................................... 24
2.4
Epigenetische Genregulation in frühen Embryonalstadien ............................. 28
2.4.1
DNA-Methylierung ................................................................................. 28
2.4.2
Histonmethylierung und Histonmethyltransferasen ............................... 38
2.5
2.5.1
Energiemetabolismus im präimplantatorischen Embryo ................................. 44
Solute Carrier 2A (SLC2A) / Glukosetransporter (GLUT) ...................... 45
3
Material und Methoden .................................................................................. 52
3.1
Gewinnung von Embryonalstadien (Morulae, Blastozysten) aus der
temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Zygoten im Eileiter vom
Rind................................................................................................................ 52
3.1.1
Verwendete Tiere und deren vorherige und anschließende Nutzung .... 52
3.1.2
Vorbereitung und Synchronisation der Empfängertiere ......................... 52
3.1.3
Generierung der In-vitro-Zygoten für den tubalen Transfer ................... 53
i
Inhaltsverzeichnis
3.1.4
Medien und Instrumente für den transvaginal-endoskopischen
Embryonentransfer in den Eileiter des Rindes....................................... 55
3.1.5
Transvaginaler
Zugang
zur
Bauchhöhle
und
endoskopisch
geleiteter Embryonentransfer in den Eileiter des Rindes ....................... 59
3.1.6
Medien und Instrumente für die kombinierte Eileiter-/Uterusspülung ... 64
3.1.7
Kombinierte Eileiter- und Uterusspülung zur Rückgewinnung der
Embryonen ............................................................................................ 65
3.2
Gewinnung in vivo produzierter Embryonalstadien (Morulae,
Blastozysten) aus dem Uterus des Rindes .................................................... 66
3.2.1
Vorbereitung der Tiere ........................................................................... 66
3.2.2
Spülung der Uterushörner ..................................................................... 67
3.3
In-vitro-Produktion von Rinderembryonen ...................................................... 67
3.4
Morphologische Beurteilung der gewonnenen Embryonalstadien .................. 68
3.5
RT-qPCR zur quantitativen Analyse der Genexpression ............................... 70
3.5.1
Isolierung der Messenger RNA .............................................................. 70
3.5.2
Reverse Transkription (RT, cDNA Synthese) ........................................ 71
3.5.3
Farbstoff und PCR-Zyklus ..................................................................... 72
3.5.4
Detektion, Quantifizierung und Auswertung........................................... 75
3.6
Statistische Analyse ........................................................................................ 76
3.7
Allgemeiner Versuchsaufbau .......................................................................... 76
4
Ergebnisse ..................................................................................................... 78
4.1
Erstellung der In-vitro-Embryonen .................................................................. 78
4.2
Gewinnung der in vivo produzierten Embryonen ............................................ 78
4.3
Erstellung und Rückgewinnung der Embryonen aus der temporären
Eileiterkultur ................................................................................................... 78
4.4
Vergleichende Darstellung der mRNA-Expression aus den Embryonen
der drei Versuchsgruppen .............................................................................. 81
ii
Inhaltsverzeichnis
4.4.1
DNMT1 .................................................................................................. 82
4.4.2
DNMT3a ................................................................................................ 82
4.4.3
SUV39H1............................................................................................... 84
4.4.4
SLC2A3 (GLUT3) .................................................................................. 84
4.4.5
SLC2A8 (GLUT8) .................................................................................. 86
5
Diskussion...................................................................................................... 87
5.1
Transvaginale Endoskopie und Eileiterkultur .................................................. 90
5.2
Genexpressionsmuster ................................................................................... 93
5.2.1
DNMT1 und DNMT3a ............................................................................ 94
5.2.2
SUV39H1............................................................................................... 97
5.2.3
SLC2A3 und SLC2A8 ............................................................................ 98
5.3
Schlussbetrachtung ...................................................................................... 100
6
Zusammenfassung....................................................................................... 102
7
Summary...................................................................................................... 105
8
Anhang: Verzeichnisse ................................................................................ 107
8.1
Verzeichnis der Tabellen .............................................................................. 107
8.2
Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 107
8.3
Zusammensetzung der Medien .................................................................... 109
8.4
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................. 114
9
Literaturverzeichnis ...................................................................................... 119
10
Danksagung ................................................................................................. 150
iii
1
Einleitung
Die In-vitro-Produktion (IVP) hat sich einen festen Platz in der Biotechnologie beim
Rind gesichert. Sowohl die Gewinnung von Oozyten aus Schlachthofovarien als auch
Eizellgewinnung vom lebenden Tier durch ultraschallgeleitete, transvaginale Follikelpunktion (Ovum pick up, OPU) ermöglichen den Zugriff auf eine große Anzahl von
weiblichen Keimzellen für die IVP.
Seit der Geburt des ersten Kalbes nach Transfer in vivo gereifter und in vitro
fertilisierter Oozyten im Jahre 1981 (BRACKETT et al.1982) wurden die Methoden
der IVP ständig verbessert. Durch Verwendung spezieller Kulturmedien gelang es
1988 erstmalig befruchtete Rinderoozyten in vitro zu präimplantatorischen Embryonen weiterzuentwickeln und Trächtigkeiten zu etablieren (GOTO et al. 1988; LU et
al. 1988). BERG und BREM beschrieben 1991 ein praktisch nutzbares Verfahren zur
In-vitro-Reifung (IVM), -Fertilisation (IVF) und -Kultivierung (IVC) von Rinderembryonen, was bis in die heutige Zeit ständig optimiert wurde. Die Effizienz der IVM und
IVF erreicht heute 70 bis 90 % (WRENZYCKI 2007), das Entwicklungsstadium der
Morula oder Blastozyste erreichen 25-40 % der in vitro fertilisierten und -kultivierten
Embryonen (HAGEMANN et al. 1998, RIZOS 2003). Die Trächtigkeitsraten, die nach
Transfer in vitro produzierter Embryonen erzielt werden, liegen heute etwa bei 50 %.
Die Trächtigkeitsraten bei Rindern nach Transfer in vivo gewonnener Embryonen
liegen höher (55-65%). Auch das Abortrisiko fällt bei transferierten In-vivoEmbryonen geringer aus. Nach Transfer von IVP-Embryonen oder Embryonen erstellt durch somatischen Kerntransfer wurden multiple Abnormalitäten bei den geborenen Kälbern beobachtet. Diese sind unter dem Begriff „Large Offspring Syndrome“
(LOS) zusammengefasst (SINCLAIR et al. 2000; LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI
et al. 2004).
Die qualitativen Unterschiede der Embryonen, die sich im Tier entwickeln zu denen,
die sich in vitro entwickeln, sind nach wie vor sehr deutlich. Signifikante Unterschiede
bestehen vor allem in Morphologie, Metabolismus, Zellzahl, Entwicklungsgeschwindigkeit, Kryokonservierbarkeit und Genexpression der Embryonen (GREVE et al.
1
1995; VAN SOOM et al. 1997; GUTIERREZ-ADAN et al. 2004; FARIN et al. 2006;
KHURANA et al. 2000a/b; LOPES et al. 2007; WRENZYCKI et al. 2005).
Diese Unterschiede verdeutlichen die Notwendigkeit einer intensiven Forschung zur
Steigerung der Effizienz der IVP und zur Verbesserung der Qualität der daraus entstehenden Embryonen. Bis heute können In-vitro-Kultursysteme die dynamisch
wechselnde Sekretion des Eileiter- und Uterusepithels nicht vollständig ersetzen. Seit
Beginn der Entwicklung der In-vitro-Produktion von Rinderembryonen wurden Teilschritte deshalb einzeln oder in Kombination im Tier vollzogen, um die künstliche
Kulturperiode zu verkürzen. Die Zwischenkultur kann in Eileitern der gleichen (homologen) bzw. einer heterologen Spezies stattfinden. Arbeiten von GALLI et al. (2003)
belegen die erfolgreiche Produktion qualitativ hochwertiger, in vitro produzierter Rinderembryonen, die temporär im ligierten Schafeileiter zwischenkultiviert wurden. Außer im ovinen Ovidukt wurden in vitro gereifte und -fertilisierte bovine Embryonen
auch im Eileiter des Kaninchens erfolgreich zwischenkultiviert (BOLAND et al. 1984;
ELLINGTON et al. 1990a/b; BESENFELDER et al. 1993).
Eine Zwischenkultur von Embryonen im Rindereileiter erforderte einen operativen
Zugang zur Bauchhöhle der Empfängertiere. Diese Verfahren belasten die Tiere
stark und sind zudem zeitaufwändig und kostenintensiv. Überdies sind sie nicht oder
nur eingeschränkt wiederholbar, da die Tiere für die Rückgewinnung früher Embryonalstadien geschlachtet werden mussten. Eine neuentwickelte, minimal-invasive Methode stellt die transvaginale Endoskopie dar. Diese ermöglicht den Zugang zu den
Eileitern über das Scheidendach des Rindes. Der Eingriff ist wiederholbar und birgt
keinerlei nachteilige Effekte für die Tiere (BESENFELDER u. BREM et al. 1998).
Da bislang die Ergebnisse zur Qualität der Embryonen meist auf vergleichenden
Studien aus reinen In-vitro-Kulturen bzw. der Embryogewinnung aus dem Tier (Invivo-Entwicklung) basieren, ist es sinnvoll, in vitro produzierte Embryonen unter angepassten, optimalen Bedingungen mit Hilfe der transvaginalen Endoskopie in den
Eileiter zyklussynchronisierter Rinder zu übertragen, um hohe Produktionsraten (Invitro-Produktion) mit optimierten Entwicklungsbedingungen (Eileitermilieu) zu kombinieren.
2
Versuche, in denen die Überlebensrate nach Kryokonservierung von Blastozysten
aus IVP und In-vivo-Produktion und temporärer In-vivo-Kultur verglichen wurden,
konnten bereits zeigen, dass sich die Qualität der im Eileiter zwischenkultivierten
Embryonen deutlich verbessert hat (RIZOS et al. 2002b).
Auf Ebene der mRNA-Expression wurden vergleichende Studien zwischen in vivo
und in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen durchgeführt. Diese
zeigten auf, dass die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene bei Embryonen im Morula- und Blastozystenstadium aus in vitro Produktion sowie nach somatischem Kerntransfer im Vergleich zu der in vivo generierter Stadien nach Uterusspülung häufig verändert ist (LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2005b). Das Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene in vivo produzierter Embryonen dient
für solche Analysen als „goldener Standard“. Blastozysten aus einer In-vivo-Kultur
boviner in vitro produzierter Zygoten im ligierten Schafeileiter wiesen ebenfalls ein
verändertes mRNA-Expressionsmuster im Vergleich zu vollständig in vivo erzeugten
Blastozysten auf. Jedoch waren die Unterschiede deutlich geringer als zwischen IVPund in vivo produzierten Embryonen (LAZZARI et al. 2002).
Bei der Entstehung des LOS und anderen Störungen während der Embryonalentwicklung
werden
anhaltende
Abweichungen
vom
normalen
mRNA-
Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene, bedingt durch Änderungen epigenetischer Modifikationen während des frühembryonalen Wachstums vermutet (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Epigenetische Mechanismen, wie DNA-Methylierung
und Histonmodifikationen, sind für die Regulation der embryonalen Gentranskription
von herausragender Bedeutung (WRENZYCKI et al. 2005a). Für die DNAMethyltransferasen
1
und
3a
(DNMT1,
DNMT3a)
sowie
für
die
Histonmethyltransferase SUV39H1 konnten unterschiedliche Transkriptmengen bei
Embryonen aus In-vivo- und In-vitro-Produktion festgestellt werden (WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003).
Für die korrekte Entwicklung der Embryonen ist ein ungestörter Energiemetabolismus eine Voraussetzung. Dabei spielt das Energiesubstrat Glukose eine besondere
Rolle. Die Aufnahme und Verfügbarkeit von Glukose ist für den Embryo essentiell.
3
Der Glukosemetabolismus ist an die Expression spezieller Transmembranproteine,
den Glukosetransportern (Solute Carrier 2A) gebunden. Es konnte bereits aufgezeigt
werden, dass eine In-vitro-Kultur boviner Embryonen die mRNA-Menge von SLC2A3
und SLC2A8 in Blastozysten im Vergleich zu den Embryonen, die komplett im Tier
erzeugt wurden, verändert (KNIJN et al. 2005).
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden bovine Embryonen in vitro produziert.
Ein Teil der erstellten Zygoten wurde in vitro bis zum Stadium der Morula/Blastozyste
kultiviert und zur mRNA-Analyse eingefroren, während die anderen Zygoten zyklussynchronen Färsen für eine temporäre Eileiterkultur in den nicht ligierten Eileiter mittels transvaginaler Endoskopie übertragen wurden. Nach 6-8 tägiger Kultur erfolgte
eine Rückspülung der Stadien. Diese Morulae und Blastozysten wurden ebenfalls zur
mRNA-Analyse eingefroren. Desweiteren wurden In-vivo-Embryonen nach Synchronisation, Superovulation und künstlicher Besamung der Spendertiere mittels Uterusspülung an Tag 7 und Tag 8 gewonnen und eingefroren. Im anschließenden zweiten
Teil der Arbeit erfolgte die vergleichende Darstellung der mRNA-Expressionsmuster
der entwicklungsrelevanten Gene DNMT1, DNMT3a, SUV39H1, GLUT3 und GLUT8
in den Embryonen der drei verschiedenen Herkünfte mittels RT-qPCR.
4
2
Schrifttum
2.1
Physiologische und anatomische Grundlagen der Fortpflanzung des Rindes
2.1.1 Zyklus des Rindes
Als Sexualzyklus werden alle morphologischen, hormonellen und biochemische Veränderungen bezeichnet, die periodisch beim weiblichen Tier auftreten. Diese Veränderungen bewirken die Bereitstellung einer oder mehrerer Eizellen, die Paarungswilligkeit wird gewährleistet und die Gebärmutterschleimhaut wird auf die Aufnahme des
Embryos vorbereitet (SCHNORR 2001, S. 25).
Rinder gehören zu den asaisonal polyöstrischen Tieren. Die Brunst tritt im Abstand
von 21 Tagen über den gesamten Jahreszeitraum auf. Eine Zykluslänge beträgt also
21 (17-24) Tage. Im Proöstrus bewirkt Prostaglandin F2α am Ovar die Auflösung des
Gelbkörpers. Mit der Luteolyse startet im Follikel die vermehrte Bildung von Östrogenen.
Dadurch
beginnen
sich
die
Brunstsymptome,
u.a.
die
vermehrte
Ödematisierung der Vulva und das Bespringen anderer Kühe, auszubilden. Durch
das Absinken des Progesteronspiegels wird wieder vermehrt GnRH im Hypothalamus freigesetzt. Dies führt zu einer gesteigerten Ausschüttung von FSH, wodurch
das Wachstum des dominanten Follikels stimuliert wird. Auch LH wird vermehrt ausgeschüttet. Der Östrus bzw. der Tag der Brunst ist Tag 0 im Zyklus. Rein äußerlich
ist der Östrus durch Aufspringen, Unruhe, Brüllen, Abgang von Brunstschleim und
positiven Duldungsreflex gekennzeichnet. Hierfür ist die hohe Konzentration von Östrogenen verantwortlich. Durch die weiter steigende GnRH-Ausschüttung erreichen
FSH und LH ihre höchsten Werte. Die Brunst hat eine relativ kurze Dauer von durchschnittlich 18 Stunden. Die Ovulation findet 6-12 Stunden nach Brunstende im
Metöstrus statt. In dieser Phase findet die Umwandlung des Corpus haemorrhagicum
in das Corpus luteum statt. Zirka 4 Tage nach der Ovulation beginnt die
Progesteronkonzentration im Blut auf messbare Werte anzusteigen. Damit wird der
5
Diöstrus eingeleitet (RÜSSE und SINOWATZ 1998, S. 93-116). Bei ausbleibender
Trächtigkeit kündigt sich im darauffolgenden Proöstrus der neue Zyklus durch das
Einsetzen der typischen Verhaltensweisen wieder an.
2.1.2 Eileiter und Uterus des Rindes
Der Eileiter des Rindes (Abb. 1), auch Tuba uterina, Ovidukt oder Salpinx genannt,
ist ein häutig-muskulöser Schlauch, der dem Auffangen und Weitertransport der
ovulierten Eizelle und der Kapazitation der Spermien dient. Er verläuft stark gewunden und hat beim Rind eine Länge von etwa 25cm (SALOMON 2004, S. 379-389).
Der Ursprung des Ovidukts ist unmittelbar am Ovar. Der Eileiter steht aber nicht in
kontinuierlichem Zusammenhang mit dem Eierstock. Kaudal mündet er am
uterotubalen Übergang in die Gebärmutter. Die Tubae uterinae sind paarig angelegt.
Sie beginnen mit dem Eileitertrichter, Infundibulum tubae uterinae, mit dem sie die
ovulierte Eizelle aufnehmen. Der Trichterrand ist mit feinen Fortsätzen, den Eileiterfransen (Fimbriae tubae), besetzt. Die Eileiterfransen können teilweise mit dem Ovar
verwachsen sein. Der Fimbrientrichter ist beim Rind so groß, dass er das Ovar vollständig umfassen kann (LEISER 1999, S. 424-433). In der Mitte des Trichters befindet sich die Bauchhöhlenöffnung des Eileiters, das Ostium abdominale tubae
uterinae. Auf die Bauchhöhlenöffnung folgt ein relativ großkalibriger, gewunden verlaufender Abschnitt, die Ampulla tubae uterinae. Hier findet für gewöhnlich die Befruchtung statt. Die Ampulle geht in einen sehr stark gewundenen, engen Abschnitt,
dem Isthmus tubae uterinae über. Mit der Uterusöffung, Ostium uterinae tubae, mündet er schließlich im gleichseitigen Uterushorn. Der Eileiter hängt an einem eigenen
Gekröse, der Mesosalpinx, welches parallel zum Eierstocksgekröse verläuft. Zwischen den Gekrösen beider Organe ist ein von kranioventral her zugänglicher Raum,
die Eierstockstasche (Bursa ovarica) ausgebildet. Die Blutversorgung des Ovidukts
erfolgt über die Arteria und Vena ovarica (SALOMON 2004, S.379-389).
Die Wand des Eileiters setzt sich von innen nach außen aus der Tunica mucosa,
Tunica muscularis, Tela subserosa und Tunica serosa zusammen. Die Schleimhaut
6
des Eileiters zeigt dichte, verzweigte Längsfalten, die zum Isthmus hin abnehmen.
Das Epithel ist einschichtig, iso- bis hochprismatisch und setzt sich aus sekretorischen Zellen (Drüsenzellen) und Zilien tragenden Zellen (Flimmerzellen) zusammen.
Die Mukosa unterliegt zyklusabhängigen Umbauvorgängen, um optimale Stoffwechselbedingungen für die Eizelle bzw. die frühembryonalen Entwicklungsstadien zu
schaffen. Die Drüsenzellen geben schwach sauren Schleim, Elektrolyte, Enzyme,
Albumine, Zucker und Aminosäuren zur Versorgung des frühen Embryos bzw. zur
Enddifferenzierung/Endreifung der Gameten in das Eileiterlumen ab. Die Flimmerzellen sind mit Kinozilien besetzt, welche einen aktiven Flüssigkeitsstrom in Richtung
Uteruslumen unterstützen. Die Tunica muscularis der einzelnen Eileiterabschnitte ist
unterschiedlich stark entwickelt. Im Eileitertrichter und in der Ampulla sind die glatten
Muskelschichten sehr dünn, lediglich im Bereich des Isthmus sind sie verstärkt und
durch einen vorherrschend spiraligen Verlauf gekennzeichnet (LIEBICH 1999, S.
295-299).
Die Gebärmutter des Rindes ist ein Hohlorgan, das der Aufnahme des Embryos und
dessen Entwicklung bis zur Geburt dient (SALOMON 2004, S. 379-389), desweiteren
fördert sie den Transport der Spermien in Richtung Eileiter und deren Kapazitation.
Um diesen Aufgaben gerecht zu werden, unterliegt die Gebärmutter strukturellen
Umbauvorgängen, die unter dem Begriff des uterinen Zyklus zusammengefasst werden und eine optimale Implantation und Plazentation des Keimes ermöglichen (LIEBICH 1999, S.295-299). Die Gebärmutter des Rindes (Abb. 1) ist ein Uterus bicornis.
Sie wird in die Abschnitte Gebärmutterhals (Cervix uteri), Gebärmutterkörper (Corpus
uteri) und in die paarigen Uterushörner (Cornua uteri) eingeteilt. Die Hörner sind widderartig aufgerollt und ca. 35-45cm lang, sie münden in den etwa 3cm langen Korpus. Die Cervix uteri liegt zwischen Gebärmutterkörper und Scheide und dient dem
Verschluss des Uterus. Sie ist beim Rind 15-20cm lang und ragt zapfenartig (Portio
vaginalis) in die Scheide vor. Der Canalis cervicales liegt zwischen äußeren und inneren Muttermund und ist außer in der Brunst und zur Geburt durch Längs- und kräftige Ringfalten verschlossen (SALOMON 2004, S. 379-389).
7
Histologisch gliedert sich die Wand des Uterus in das Endometrium, das die
lumenseitige Schleimhautauskleidung bildet, das Myometrium, welches aus einer
zirkulären und longitudinalen Muskelschicht besteht und das Perimetrium, ein außen
anliegendes, einschichtiges Epithel. Das Endometrium setzt sich aus dem Oberflächenepithel und der Lamina propria mucosae zusammen. Grundsätzlich ist das
Oberflächenepithel einschichtig und hochprismatisch, es kann jedoch beim Rind stellenweise auch mehrreihig sein. Die Endometriumszellen tragen Kinozilien (Flimmerzelle) oder Mikrovilli (sezernierende Zelle). Beim Rind besitzt die Schleimhaut große,
knollige drüsenfreie Bezirke, die Karunkel (Carunculae), diese vergrößern sich in der
Trächtigkeit und dienen der Verbindung zwischen maternaler Schleimhaut und fetaler
Fruchthülle (LIEBICH 1999, S. 295-299).
Abbildung 1: Ovar, Eileiter und Uterus des Rindes, Seitenansicht (Nickel, Schummer,
Seiferle 1999)
2.1.3 Präimplantatorische Embryonalentwicklung
Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Befruchtung der gereiften Oozyte durch
ein kapazitiertes Spermium und somit mit der Vereinigung des väterlichen und mütterlichen Erbgutes bei der Verschmelzung der Vorkerne der beiden Gameten. Der
8
Ort der Befruchtung ist die Eileiterampulle (Abb. 2). Durch die Verschmelzung der
hapoliden Vorkerne der Keimzellen entsteht eine diploide Zygote, die sich in der Prophase der ersten mitotischen Teilung befindet. Die präimplantatorische Embryonalentwicklung gliedert sich in die ersten Teilungen bis hin zur Morula, die
Kompaktierung der Morula, die Differenzierung der Blastomeren in Zellen des
Trophektoderms und der inneren Zellmasse, die Blastulation mit Kavitation und
Blastozoelexpansion und schließlich dem Schlupf der expandierten Blastozyste aus
der Zona pellucida (SCHNORR 2001, S. 33-74).
Nach der Befruchtung der Eizelle finden die ersten Teilungen während der Wanderung des frühen Embryos im Eileiter tierartspezifisch statt, so dass beim Rind nach 2
bis 2½ Tagen (p.i.) 2-Zeller, nach 2½ Tagen (p.i.) 4-Zeller sowie nach 4 Tagen (p.i.)
8-Zell-Stadien entstanden sind. Als 16-Zellstadium erreicht der Embryo über das
Ostium uterinae tubae die Uterushornspitze (SCHNORR, 2001, S. 33-74). Nach 5-6
Tagen (p.i.) entwickelt sich im Uterus das Morulastadium. Sechs bis 8 Tage nach der
Befruchtung entwickelt sich beim Rind das Blastozystenstadium. In diesem Stadium
differenziert sich der Embryo in zwei Zelllinien, die Embryoblastzellen (inner cell
mass, ICM) und die Trophoblastzellen (Trophektoderm). Aus den Zellen der inneren
Zellmasse
entwickelt
sich
später
der
Rinderfetus,
aus
den
Zellen
des
Trophektoderms gehen Chorion und Ammnion (Fruchthüllen) hervor. Am Tag 9 (p.i.)
schlüpft die expandierte Blastozyste aus der Zona pellucida, darauf folgt eine Phase
des Längenwachstums (Elongation) des Embryos. An Tag 18 - 19 beginnt die Implantation. An Tag 22 füllt die elongierte Blastozyste den Uterus ganz aus. Die Erkennung und Aufrechterhaltung der Gravidität von Seiten des Muttertieres erfolgt
spätestens an Tag 17/18 (RÜSSE und SINOWATZ 1998, S. 93-116).
9
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung
beim Säugetier (Schnorr 2001)
2.2
Generierung von Embryonalstadien beim Rind
2.2.1 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen
Die In-vitro-Produktion boviner Embryonen basiert nach der Gewinnung der Eizellen
im Wesentlichen auf drei Schritten: der In-vitro-Reifung (IVM), In-vitro-Fertilisation
(IVF) und In-vitro-Kultur (IVC) der befruchteten Eizelle (NIEMANN u. MEINECKE
1993).
Die für die In-vitro-Produktion benötigten Eizellen können durch ultraschallgeleitete
Follikelpunktion (Ovum pick-up, OPU), erstmalig beschrieben durch PIETERSE et al.
(1988), durch Laparoskopie (RATH, 1993) oder aus Ovarien von Schlachttieren gewonnen werden. Die am häufigsten angewandten Techniken zur Oozytengewinnung
aus Schlachthofovarien sind die Aspirations- und die Slicingmethode (ECKERT u.
NIEMANN 1995). Aus den gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) werden solche für die IVP ausgewählt, die von mindestens 3-6 Zelllagen Kumulus umschlossen sind und ein homogenes Ooplasma aufweisen (NIEMANN u. MEINECKE
10
1993). Die unreifen Eizellen müssen vor ihrer Befruchtung in Medien, denen entsprechende Reifungshormone zugesetzt werden, in vitro gereift werden. Die Reifung der
Oozyten (Maturation) ist die Voraussetzung für eine erfolgreiche Fertilisation und
gliedert sich in die Kernreifung (nukleäre Maturation) und in die Reifungsvorgänge im
Ooplasma (zytoplasmatische Reifung). Die Eizellen setzen in den Reifungsmedien
die Meiose fort, die zuvor arretiert war (SIRARD u. COENEN 2006). Je nach Morphologie der KOK und der Kulturbedingungen können Maturationsraten (Kernreifung)
von 85-95% erreicht werden (ADONA et al. 2008). Die Angaben zur optimalen Reifungszeit variieren zwischen 14 und 26 Stunden. Einerseits sollen die Oozyten solange reifen, bis möglichst viele Eizellen die Metaphase II erreicht haben, andererseits soll das Auftreten von Degenerationserscheinungen durch eine Überreifung,
welche die Weiterentwicklungsfähigkeit der Eizellen negativ beeinflusst, so gering
wie möglich gehalten werden. Die IVM wird in komplexen Medien durchgeführt, die
Puffer, Aminosäuren, organische Verbindungen, Serum oder Serumersatzstoffe
(BSA, PVA), Hormone und Wachstumsfaktoren sowie Antibiotika enthalten
(SAGIRKAYA et al. 2007). Trotzdem weisen in vitro gereifte Oozyten häufig eine
verminderte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu in vivo gereiften Eizellen auf
(MOOR et al. 1998; WATSON et al. 2000; LIM et al. 2008). Zur Kontrolle der In-vitroReifung kann ein Teil der maturierten Eizellen enzymatisch entkumuliert und lichtmikroskopisch auf den Reifungsstatus und die Qualität beurteilt werden. Das Vorhandensein eines Polkörpers sowie Farbe und Homogenität des Ooplasmas werden als
Parameter zur Beurteilung verwendet (HASHIMOTO et al. 1998).
Bei der In-vitro-Fertilisation erfolgt die Befruchtung gereifter Eizellen unter definierten
Bedingungen außerhalb des weiblichen Genitaltraktes (HEYNER und TUCKER,
2000; PARRISH et al., 1988). Rinderspermien haben im Gegensatz zu Eizellen ihre
Reifeteilungen zum Zeitpunkt der Befruchtung bereits beendet. Es müssen jedoch
noch zwei wesentliche Vorgänge (Kapazitation und Akrosomreaktion) durchlaufen
werden, bis sie ihre endgültige Befruchtungsfähigkeit erlangen. Zur Befruchtung der
in vitro gereiften Eizellen wird meistens tiefgefrorenes und aufgetautes Bullensperma
verwendet. Die Spermien werden vor ihrer Verwendung einer Selektionsprozedur
unterzogen (PARRISH et al., 1995). Um Spermien zu erhalten, die eine ausreichen-
11
de
Motilität
besitzen
und
kapazitiert
sind,
wird
häufig
eine
Dichtegradientenzentrifugation mit dem aufgetauten Bullensperma durchgeführt.
Früher wurde für diesen Vorgang häufig Isopercoll genutzt. Dieses ist jedoch aufgrund fehlender klinischer Prüfung weder für den human- noch den veterinärmedizinischen Bereich zugelassen. Stattdessen werden heute zugelassene, kommerziell
erhältliche Silikate verwandt (Spermfilter®, Cryo Bio System; Pure Sperm® und Bovi
Pure®, Nidacon).
Durch Inkubation in speziellen Medien (HHE = Heparin, Hypotaurin, Epinephrin, wobei Heparin die Akrosomenreaktion auslöst) werden die Spermien kapazitiert (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Die Kapazitation ist die Voraussetzung für den Ablauf
der Akrosomreaktion und damit für die Verschmelzung von Spermium und Eizelle
(ESTEVES et al. 2000). Die maturierten Oozyten und motile, kapazitierte Spermien
werden in speziellen Fertilisationsmedien unter definierten Bedingungen für 6-24h
koinkubiert (HEYNER und TUCKER, 2000). Ein häufig eingesetztes Medium für die
In-vitro-Fertilisation ist das TALP- (Tyrode‟s Albumin Lactate Pyruvate) Medium
(BAVISTER und YANAGIMACHI 1977; SAEKI et al. 1995), welches in Verbindung
mit Kapazitierungs- bzw. Motilitätsfaktoren wie Heparin (PARRISH et al. 1988),
Penicillamin (ANDREWS und BAVISTER, 1989), Hypotaurin und Epinephrin
(LEIBFRIED und BAVISTER, 1982) eingesetzt wird.
Nach etwa 18-20h Kokultur von Eizellen und Spermien werden die Kumuluszellen
von den Oozyten entfernt (Hyaluronidase-Behandlung, Vortexen oder Pipettieren).
Nach diesem Vorgang werden sie bis zum Morulae- bzw. Blastozystenstadium kultiviert, wobei unterschiedliche Kulturmedien und -techniken zum Einsatz kommen. Die
Kulturmedien waren meist sehr komplex zusammengesetzt und unterschieden sich
im
Wesentlichen
im
Gehalt
an
Energiesubstraten,
Aminosäuren
und
Nukleinsäurevorstufen. Das am häufigsten verwendete Medium war lange Zeit das
Tissue Culture Medium-199 (TCM-199, FUNAHASHI et al. 1991; PEUCKMANN
2000). Serum (undefiniert), Serumbestandteile (semidefiniert, z.B. Bovines Serumalbumin / BSA) oder Serumersatzstoffe (definiert, z.B. Polyvinylalkohol/ PVA) werden
dem Kulturmedium zugesetzt, um den Embryonen wichtige Substrate für ihre Ent-
12
wicklung zur Verfügung zu stellen, sowie das Handling zu verbessern (z.B. kein Aufschwemmen der Embryonen). Trotz erfolgreicher Embryonenproduktion und Etablierung von Trächtigkeiten nach dem Transfer von Embryonen aus diesen IVCSystemen wurden weitere Kultursysteme entwickelt, um die Entwicklungsraten zu
erhöhen (FARIN et al. 2001) und die Vergleichbarkeit der Systeme untereinander zu
verbessern. Es erfolgte die Entwicklung definierter und standardisierbarer Kultursysteme. Hierzu zählt z.B. das Chatot-Ziomek-Bavister-Medium (CZBM, CHATOT et al.
1989). KAJIHARA et al. (1999) verwendeten erfolgreich das Charles Rosenkrans 1
Medium (CR1 Medium). Das Medium „Synthetic Oviductal Fluid “ (SOF) gewann für
die IVC zunehmend an Bedeutung (TERVIT et al. 1972; MATSUYAMA et al. 1993;
HOLM et al. 1999), heute ist es das Standardmedium in der IVC. Beim SOFProtokoll ist der wesentliche Unterschied die auf 5 % reduzierte Sauerstoffkonzentration in der Gasatmosphäre. Im SOF-Medium wurde auch zum Beispiel bovines Serumalbumin (BSA) durch Makromoleküle wie das PVP (Polyvinylpyrrolidon) oder
PVA (Polyvinylalkohol) ersetzt und somit ein definiertes Medium geschaffen
(KESKINTEPE u. BRACKETT 1996). Unter Verwendung dieser Kulturmedien (TCM199, SOF, HECM) können Entwicklungsraten bis zur Blastozyste von über 40 % erzielt werden (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; KRISHER et al. 1999). In definierten Medien sind die Entwicklungsraten meistens niedriger als in semi-definierten
(BSA) oder undefinierten (Serum) Kulturmedien (ECKERT u. NIEMANN 1995;
KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; WRENZYCKI et al. 1999, 2001).
Da komplexe Zusätze wie Serum oder Serumproteine (z.B. BSA) potentiell kontaminiert sein können oder wachstumsinhibierende Faktoren beinhalten können, wurden
Studien über die Entwicklungsfähigkeit von bovinen Embryonen in proteinfreien Medien getätigt. HECM (hamster embryo culture medium), mKSOM und andere Basismedien wurden mit
verschiedenen Aminosäuren, Glucose, Pyruvat, Lactat und
Phosphat versetzt und der osmotische Druck in den Medien wurde verändert
(BAVISTER 1995). Der osmotische Druck hatte keinen signifikanten Einfluss auf die
Entwicklungsfähigkeit der Embryonen. Die Entwicklungsfähigkeit unter Zusatz von
Aminosäuren hängt jedoch von der Zusammensetzung des Basismediums ab. Es
konnte gezeigt werden, dass sich Embryonen in Medien mit Glukosesupplementation
13
schneller entwickelten als Embryonen in Medien, denen Puruvat und/oder Phosphat
zugesetzt waren (WIRTU et al. 2003).
Studien über den Einfluss verschiedener Proteinzusätze oder Makromolekülsupplementationen in Reifungsmedien auf die Menge an Transkripten von Genen (cell
survival genes) in in vitro erzeugten Blastozysten zeigten, dass diese Zusätze einen
signifikanten Effekt auf die untersuchte Transkriptmenge in den Blastozysten hatten.
Genutzt wurden folgende Reifungsmedien: TCM199+ 10% FBS, TCM199 + 6% fettfreies BSA und TCM199 + 4% PVP. So erhöhten sich zum Beispiel die
Transkriptmengen für die Growth Factor kodierenden Gene (IGF1R, IGF2, IGF2R) in
Embryonen, die in TCM199+fafBSA kultiviert wurden (WARZYCH et al. 2007). In einer Studie überprüften WRENZYCKI et al. (2000) den Einfluss von SOF-Medium und
TCM-199 sowie verschiedener Proteinquellen auf die relative Häufigkeit von 10 entwicklungsspezifischen Gentranskripten. Das Kulturmedium hatte einen starken Effekt
auf die Transkriptionsaktivität der Embryonen, der Effekt der Proteinquelle war geringer. WRENZYCKI et al. (2000) stellten fest, dass die Entwicklung in SOF-Medium
der In-vivo-Entwicklung ähnlicher war als die Entwicklung in TCM-199. Unterschiede
in der Expression entwicklungsrelevanter Gene zwischen IVP- und In-vivoEmbryonen bestanden allerdings trotz der Verwendung von SOF-Medium.
Glukoseaufnahme und Entwicklungsfähigkeit von Rinderblastozyten scheinen positiv
zu korrelieren (DORLAND et al. 1992). In dem definierten Kulturmedium SOF wirken
sich
geringe
Glukosekonzentrationen
von
1,5mM
positiv
auf
die
Blastozystenentwicklung aus (BRACKETT et al. 1997; IWATA et al. 1998). Eine Kultur von Zygoten ohne Glukose für 24h und das anschließende Wachstum in einem
Medium mit 1,5mM bzw. 3,0mM Glukose erhöhte die Blastozystenrate (FURNUS et
al.1997), während hohe Konzentrationen von 4,5mM bzw. 5mM die Entwicklung
hemmten (FURNUS et al. 1997; IWATA et al. 1998).
14
2.2.2 Gewinnung uteriner Embryonalstadien
Die Gewinnung uteriner Embryonalstadien wird beim Rind im Rahmen des Embryotransfers seit den 1970er Jahren routinemäßig durchgeführt. Damals erfolgte die
Gewinnung blutig, durch einen Einschnitt
ins
Scheidendach (TESTART u. GO-
DARD-SIOUR , 1975). Durch den so entstandenen Zugang wurde eine an einen Ballonkatheter befestigste Spülkanüle in die Bauchhöhle vorgeschoben und ins Gebärmutterhorn inseriert. Den Katheter fixierte der Operateur, indem der Ballon aufgeblasen wurde. Im Anschluss folgte die Spülung des Uterushorns.
Heutzutage wird eine unblutige, transzervikale Spülmethode angewandt (BAKER u.
JILLELLA 1978; BOUTERS et al. 1978; HAHN 1978; GÖRLACH 1997). Die Spülung
erfolgt am stehenden, meist superovuliertem Tier. Ein flexibler Ballonkatheter wird
mit Hilfe eines Mandrin versteift und unter rektaler Kontrolle durch die Vagina, Zervix
und das Corpus uteri in eines der beiden Gebärmutterhörner eingeführt. Wenn die
Spitze des Ballonkatheters die große Kurvatur des entsprechenden Hornes erreicht
hat, wird der Mandrin ca. 10cm zurückgezogen. Die flexible Katheterspitze wird vorsichtig weiter nach kranial vorgeschoben. Sobald der Katheter im vorderen Drittel
des Uterushorns positioniert ist, wird er durch Aufblasen des Ballons dort fixiert
(NIEMANN u. MEINECKE 1993a). Die Spülung des abgedichteten Uterushorns kann
nun ohne Flüssigkeitsverluste erfolgen. Als Spülmedium wird in den meisten Fällen
37°C warme, phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit einem Zusatz von 1-2 % hitzeinaktiviertem Serum verwendet. Die Spülung erfolgt in Etappen und die rückgewonnene Flüssigkeit wird in einem Glasgefäß aufgefangen. Nach der Spülung des
ersten Uterushornes wird die Spülung des zweiten Hornes auf die gleiche Weise
vorbereitet und vorgenommen.
Eine andere Möglichkeit uterine Embryonalstadien unblutig zu gewinnen ist, einen
Ballonkatheter direkt hinter der Zervix zu fixieren. Es wird so die gesamte Gebärmutter gespült, ohne den Katheter umlegen zu müssen. Der aufgeblasene Ballon kann
allerdings eines der Uterushörner verlegen und somit eine vollständige Spülung verhindern (SEIDEL u. SEIDEL 1991).
15
Durchschnittlich werden pro Spenderkuh fünf bis acht transfertaugliche Embryonen
durch transzervikale Uterusspülung gewonnen, die ca. 60-80 % Gewinnungsrate
(Anzahl gewonnener Embryonen im Verhältnis zu der Anzahl an Gelbkörpern) ausmachen. Die Nachkommenrate der durch Spülung gewonnenen und anschließend
transferierten Embryonen liegt zwischen 50-60 % (GELDERMANN 2005, S. 351359). Eines der größten Probleme bei der In-vivo-Gewinnung liegt in der hohen Variabilität der Ovarreaktionen (ADAMS 1994). Neben der Auswirkungen wiederholter
Superovulationsbehandlungen haben auch der Ernährungsstatus, das Alter, die
Rasse, und die reproduktive Vergangenheit des Spendertieres Einfluss auf die Embryonenausbeute bei der unblutigen Uterusspülung (MAPLETOFT et al. 2002;
MAPLETOFT et al. 2006).
2.2.3 In-vivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen
Gerade um neue Wege zum Verständnis der embryo-maternalen Kommunikation
aufzeigen zu können, ist es unumgänglich, In-vitro-Methoden mit den physiologischen Abläufen im Eileiter zu kombinieren. Im Gegensatz zur vollständigen Embryonalentwicklung im Tier bietet die In-vitro-Produktion von Embryonen einen guten Einblick für wissenschaftliche Fragestellungen, da eine große Anzahl weiblicher Keimzellen genutzt werden kann. Dennoch liegen IVP-Embryonen durch ihre geringere
Qualität hinter den Embryonen zurück, deren Entwicklung vollständig im Tier abläuft.
In vivo gewonnene Embryonen besitzen gute qualitative Eigenschaften, dennoch ist
deren Gewinnung erheblich eingeschränkt. So reagieren nur 1/3 aller synchronisierten und superovulierten Tiere adäquat auf die Hormonstimulation. Unterschiede zwischen in vitro produzierten Embryonen und in vivo gewonnenen Embryonen (Tabelle
1) sind also nach wie vor deutlich (FARIN und FARIN, 1995; THOMPSON 1997;
HOLM et al., 2002).
Da sich diese markanten Unterschiede meist auf Vergleichsstudien von Embryonen
aus reiner In-vitro-Produktion mit denen, die sich vollständig im Tier entwickelt haben, beziehen, wurden in vitro produzierte Embryonen in Eileiter von Zwischenempfängern übertragen und dort kultiviert, um das Entwicklungspotential des Ovidukts zu
16
nutzen und die Zeitspanne in einer künstlichen Umgebung und damit den möglichen
negativen Einfluss der In-vitro-Kultur auf die Embryonalentwicklung so gering wie
möglich zu halten.
Tabelle 1: Unterschiede zwischen in vitro und in vivo erzeugten Embryonen
In vivo
produzierte Embryonen
In vitro
produzierte Embryonen
Farbe
hell
dunkel
(insbesondere nach Kultur
in serumhaltigen Medien)
Perivitelliner Raum
groß
Kompaktierung
stark ausgeprägt
Gesamtzellzahl
140–160
Morphologie
klein
schwach ausgeprägt
höher, ähnlich, geringer
(expand. Blastozyste)
ICM-Zellen (Blastozyste)
40
weniger
Gefriertauglichkeit
gut
geringer
Temperaturempfindlichkeit
gering
hoch
Trächtigkeitsraten
55-65%
Metabolismus
ATP-, O2-, Glukoseund Pyruvataufnahme
ungestört
40-60%
höhere fetale Verluste im letzten Drittel der
Trächtigkeit nach Transfer von
IVP-Embryonen
niedrigere Aufnahmen in IVP-
Chromosomale
Abberationen
(Tag-5-Embryonen)
31 %
42 %
Expressionsmuster
ungestört
erhöht, ähnlich, erniedrigt
Embryonen
entwicklungsrel.
Gentranskripte
17
Als Zwischenempfänger sind sowohl heterologe als auch homologe Spezies verwendet worden. Im Jahr 1955 wurde in einer Studie erstmalig aufgezeigt, dass sich befruchtete Schafeizellen in den Eileitern von pseudograviden Kaninchen normal entwickeln können (AVERILL et al. 1955). Seit dieser Zeit gab es Reihe von Veröffentlichungen über die Entwicklungsfähigkeit verschiedener fertilisierter Säugtiereizellen
zu präimplantatorischen Embryonen im Ovidukt des Kaninchens (BOLAND 1984).
Der Zugang zu den Eileitern der Tiere erfolgte chirurgisch durch einen Einschnitt in
der Linea alba (SIRARD u. LAMBERT 1986) oder laparoskopisch (BESENFELDER
et al. 1998). Über den Eileitertrichter wurden die Embryonen in die Eileiterampulle
transferiert. Die In-vivo-Kultur im Kaninchen fand im ligierten Ovidukt statt, um Embryoverluste via Uterus und Cervix zu vermeiden. In einer Arbeit im Jahr 1986 wurde
aufgezeigt, dass die In-vivo-Kultur im Kanincheneileiter bovinen Embryonen bessere
physiologische Konditionen bietet als die reine In-vitro-Kultur der Embryonen
(SIRARD u. LAMBERT 1986). Es konnten Trächtigkeiten mit Geburten gesunder
Kälber nach Embryotransfer der im Kanincheneileiter zwischenkultivierten Embryonen erzeugt werden.
Eine weitere Möglichkeit, eine temporäre In-vivo-Kultur bei einer heterologen Spezies
durchzuführen, bietet der Eileiter des Schafes. LU et al. konnten in ihrer 1988 veröffentlichen Arbeit Entwicklungsraten (zur Morula/Blastozyste) von 60 % für Embryonen, die in vitro gereift, in vitro fertilisiert und anschließend im Schafeileiter zwischenkultiviert wurden, aufzeigen. In einer weiteren Studie wurden 668 befruchtete
bovinen Eizellen in ligierte Schafeileiter transferiert. Der Zeitpunkt des Transfers der
befruchteten Oozyten war auf den Ovulationszeitpunkt der Tiere terminiert. Nach 6tägiger Eileiterkultur konnten 63% der übertragenen Stadien wiedergefunden werden, 46% erreichten das Morula bzw. Blastozystenstadium (LU et al. 1988). Die
Verwendung von IVF-generierten Embryonen, die im ligierten Schafeileiter zwischenkultiviert wurden, ist mittlerweile als Standardmethode etabliert und sowohl in
wissenschaftlichen (LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2003b) als auch in umfangreichen praktischen Bereichen (GALLI et al. 2003) angewendet worden. Der hohe Aufwand dieser Produktionsmethode wird in Kauf genommen, da die Embryonen
aus der Zwischenkultur im Schafovidukt ein höheres Entwicklungspotential besitzen.
18
Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass in vitro produzierte Zygoten nach einer Invivo-Kultur im Schafeileiter eine deutlich verbesserte Qualität aufwiesen. Qualitätsmerkmale waren Kryotoleranz und Genexpressionsmuster der Embryonen. Die Ergebnisse für die Eileiterkultur-Blastozysten waren vergleichbar mit denen von
Blastozysten aus reiner In-vivo-Kultur. Blastozysten aus der IVP wiesen eine niedrige
Kryotoleranz im Gegensatz zu denen aus den anderen Gruppen auf (ENRIGHT et al.
2000; RIZOS et al. 2002a; LONERGAN et al. 2003a). Desweiteren wurde auf Genexpressionsebene (Tabelle 2) festgestellt, dass Blastozysten aus der temporären Invivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen, die aus dem Tier gewonnen wurden, eine niedrigere Expression zum Beispiel für Gene wie BAX (Apoptose) oder SOX
(Stress) zeigten als Blastozysten aus einer reinen In-vitro-Kultur (LAZZARI et al.
2002; RIZOS et al. 2002b; LONERGAN et al. 2003b; GUTIERREZ-ADAN et al.
2004).
19
Tabelle 2: MessengerRNA-Expressionsmuster in Blastozysten unterschiedlicher Herkunft und in Relation zu anderen Qualitätsparametern (Wrenzycki 2007, modifiziert)
Transkripthäufigkeit
Qualitätsmarker/Herkunft
Referenzen
(Anstieg↑ oder Abfall↓)
SLC2A1↑, G6PD↑
Respiration
LOPES et al. 2007
GAPDH↓, Tubulin↓, DNMT↓, GATA6↓,
Qualität der sNT-Blastozysten
IFITM3↓
SMITH et al. 2007
LAZZARI
et
al.
Geburtsgewicht (indirekt)
SLC2A3↑
Kryokonservierung
Survivin↑, FAS↑, Kaspase-3↑, HSP↑
PARK et al. 2006
COX2↑, CDX2↑, ALOX15↑, BMP15↑ ,
EL-SAYED et al.
PLAU↑, PLAC8↑
2006
Trächtigkeitsrate nach Transfer
Spenderzelleffizienz (lebende Nach-
2002
HDAC1↓↑, HDAC2↑, DNMT3a↓, Oct4↓
kommen)
In
vivo-
vs.
IVP-
vs.
sNT-
Blastozysten
In vivo- vs.
in vitro-kultivierte Blastozysten
SOF supplementiert mit Hyaluronan
Verwendung gesexten Spermas
in der IVF
Sauerstoffbedingungen
während
der Post-Kompaktierungskultur
In vivo- vs. IVP- vs. in vivo-kultivierte
Blastozysten
et
al.
2007
ACOX1↓, CD81↓, DNAJC10↑, HRH1↑,
TFAP2A↓
SMITH et al. 2005
SCL2A3↓, SLC2A4↓, SLC2A8↓
KNIJN et al. 2005
PALASZ
BAX↓, SOX↓, IGF2↑, Ecad↓
MORTON
HARVEY
EEF1G↓
20
et
al.
et
al.
2007
FOXO3a↓, REA↓, HMG2↓, GNBL2↓,
,SOX↓↑, Sur↓↑
al.
2007
Myotrophin↓, APC1↓
Na/K↓,
et
2008
SLC2A3↓, G6PD↓ , Xist
SLC2A1↓↑,
Kultur im isolierten Mäuseeileiter
BEYHAN
Cx43↓↑,
CORCORAN et al.
2007
Oct4↑
RIZOS et al. 2007
Aufgrund der Notwendigkeit, präimplantative Entwicklungsstudien auch beim Rind
durchführen zu können, wurden bei dieser Spezies bislang die verschiedensten operativen Eingriffe beschrieben, um IVP-Rinderembryonen in den Eileiter der homologen Spezies transferieren zu können. Die Operationen fanden teils sogar in Vollnarkose statt. Es wurde durch einen ventralen Schnitt die Bauchhöhle eröffnet und ein
Katheter in der Eileiterampulle verankert. Das andere Ende des Schlauches wurde
via Uterus und Vagina nach außen gelegt und am Schwanz fixiert. Zygoten und
Embryonen im 2-Zell-Stadium wurden über den Katheter in das Ovidukt übertragen.
Nach fünftägiger Kultur erfolgte die Rückgewinnung der Stadien durch eine nichtchirurgische Spülung bzw. nach Schlachtung der Tiere mit anschließender Spülung der
entnommenen Reproduktionsorgane. Die Wiederfindung- und Entwicklungsraten bei
dieser Methode waren allerdings sehr gering. Lediglich ein Embryo hatte sich bis
zum Morulastadium weiterentwickelt. Jedoch glich diese Morula in Färbung, Größe
und Kompaktierung den In-vivo-Morulae (SCHMIDT et al. 1997).
FAYRER-HOSKEN et al. transferierten im Jahr 1989 in vitro gereifte und befruchtete
Rinderembryonen laparoskopisch in die Eileiter von fünf Färsen. Die Tiere waren
zyklussynchron zu den zu übertragenden Stadien. Der endoskopische Zugang zur
Bauchhöhle erfolgte über die rechte Flanke der Rinder. Ein Teflonschlauch mit angeschlossenem Tomcat-Katheter wurde in die Bauchhöhle vorgeschoben. Der Katheter
war mit 2-5 Embyonen im Zweizellstadium beladen und wurde unter endoskopischer
Kontrolle 2,5-5cm in die Eileiterampulle eingeführt, dort erfolgte das Absetzen der
Embryonen. Eines der Empfängertiere brachte ein gesundes Kalb auf die Welt
(FAYRER-HOSKEN et al. 1989).
Im Jahr 1993 wurde erstmalig beim Kaninchen ein Routineeingriff für den Transfer
von Embryonen in den Eileiter unter laparoskopischen Bedingungen beschrieben
(BESENFELDER u. BREM 1993). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde dieser Zugang
ebenfalls beim Rind dargestellt, um einen tubalen Anschluss der Embryonalentwicklung sowohl für wissenschaftliche als auch praktische Ansätze zu schaffen (BESENFELDER u. BREM 1998). Bei dieser Methode wurde der Zugang zu den inneren Geschlechtsorganen mittels transvaginaler Endoskopie geschaffen. Ein Universalschaft
21
mit eingelegtem, stumpfen Obturator wurde vaginal eingeführt, bis vor die Cervix geschoben und dorsal in der Fornix vaginae fixiert. Im Anschluss erfolgte die Durchstoßung des Vaginaldachs mittels eines perforierenden Trokars. Ein Arbeitsschaft mit
eingelegtem Endoskop wurde anschließend in den Universalschaft eingeführt. Im
Arbeitskanal befindet sich ein Schlauch mit angeschlossener Embryotransferkapillare
aus Glas. Diese hirtenstabartig gebogene, mit IVP-Embryonen befüllte Kapillare wurde dann unter endoskopischer Kontrolle in den Eileitertrichter eingefädelt und bis in
die Ampulle vorgeschoben. In der Eileiterampulle sind die Embryonen abgesetzt
worden (BESENFELDER u. BREM 1998; HAVLICEK et al. 2005a/b; BESENFELDER
et al. 2009). Die Rückgewinnung der Embryonen erfolgte entweder durch eine unblutige Uterusspülung (wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben) oder durch eine kombinierte,
endoskopische Eileiter-/Uterusspülung. Die Wiederfindungsrate wird durch die
Rückgewinnungsmethode stark beeinflusst. Eine endoskopische, kombinierte Spülung von Uterus und Eileiter führte zu einer Steigerung der Wiederfindungsrate um
das doppelte (HAVLICEK et al. 2005a/b; BESENFELDER et al. 2010).
Es wurden in diesen Studien sowohl verschiedene Embryonalstadien (auch Gameten) übertragen als auch verschiedene Einbettungsmedien verwendet, um die
Wiederfindungs- und Entwicklungsraten zu steigern (WETSCHER et al. 2005a/b).
Die Einbettungsmedien (Alginat, Hyaluronsäure) sollten einen zu schnellen Abtransport bzw. Rückfluss der in den Eileiter übertragenen Stadien verhindern.
Wie erfolgreich gezeigt werden konnte, ermöglicht dieser minimal-invasive, endoskopische Zugang durch das Scheidendach zum Rinderovidukt den frühzeitigen Transfer von Embryonen in den Eileiter, um sowohl Trächtigkeiten zu erzeugen als auch
den Rindereileiter zur In-vivo-Kultur von Embryonen zu nutzen. Mit dieser Methode
konnte ebenfalls erstmals gezeigt werden, dass durch Spülung der bovinen Eileiter
nach Superovulation und künstlicher Besamung (KB) frühe Embryonalstadien (Zygoten bis 16 Zeller) beim Rind mit anderen Methoden als durch Schlachtung oder chirurgische Maßnahmen gewonnen werden können (BESENFELDER et al. 2001;
HAVLICEK et al. 2009; BESENFELDER et al. 2010).
22
Studien von RIZOS et al. befassten sich mit einer Organkultur boviner, in vitro erzeugter Zygoten im isolierten Eileiter von Mäusen (isolated mouse oviduct, IMO). Bei
diesen Untersuchungen sollte besonders die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen
im IMO und die Qualität der daraus entstandenen Blastozysten untersucht werden.
Wie bereits oben beschrieben, kann das Entwicklungspotential des Eileiters (sowohl
im Trans-Spezies-Transfer als auch beim Transfer bei der homologen Spezies) dazu
beitragen, qualitativ hochwertige Blastozysten zu erzeugen. Trotzdem gibt es einige
Nachteile, lebende Tiere als Zwischenempfänger zu nutzen. Zu erwähnen wären die
Tieranschaffungs- und Tierhaltungskosten, Tierschutzaspekte und der hohe technische und personelle Aufwand für die Transfers.
In vitro produzierte, bovine Zygoten wurden in die Ampullen von vorher frisch entnommenen Mäuseeileitern transferiert und diese dann in zwei verschiedenen Medien
(SOF, KSOM) kultiviert. Gleichzeitig fand eine IVC einer Kontrollgruppe in den beiden Medien statt. Die Kultur der Zygoten im IMO brachte im Vergleich zur Kontrollgruppe keine höheren Entwicklungsraten hervor. Qualitativ unterschieden sich die
gewonnenen Blastozysten jedoch. Es konnte mittels RT-qPCR aufgezeigt werden,
dass Genexpressionsmuster qualitätsassozierter Transkripte aus Embryonen dieser
Organkultur denen ähneln die rein in vivo generiert bzw. im Schafeileiter zwischenkultiviert wurden. Die Blastozysten aus der In-vitro-Kultur-Vergleichsgruppe wiesen
hingegen ein verändertes Expressionsmuster auf (RIZOS et al. 2007).
Da in verschiedenen Tiermodellen eine bessere Embyronenqualität nach In-vivoKultur im Eileiter nachgewiesen werden konnte, vergleichbare Studien für den humanmedizinischen Bereich allerdings nicht existieren, entwickelten Wissenschaftler
2009 erstmals ein In-vivo-Kultursystem für den Menschen. Für dieses In-UteriCulture-System (IUCS) wurde eine perforierte Siliconröhre mit Zygoten/Embryonen,
erstellt durch ICSI (intracytoplasmic sperm injection), beladen und via Scheide in den
Uterus von Frauen eingeführt, für einige Tage kultiviert. Die daraus gewonnenen
Embryonen wurden dann mit Embryonen aus einer In-vitro-Produktion verglichen.
Die Mikroperforation der Siliconröhre erlaubt eine Kommunikation zwischen Embryonen und Endometrium bzw. zwischen Embryonen und den Uterussekreten. Es konn-
23
ten Embryonen guter Qualität gewonnen werden. Ein signifikanter Unterschied stellte
sich in der Anzahl der euploiden Embryonen dar, die Anzahl war im Vergleich zur Invitro-Kontrollgruppe bei der IUCS-Gruppe erhöht. Diese Ergebnisse werfen erneut
die Frage auf, in wie weit die In-vitro-Kulturbedingungen einen negativen Einfluss auf
epigenetische Modifikationen und Genexpression haben (BLOCKEEL et al. 2009).
2.3
Unterschiede in der Qualität und in der Genexpression bei Rinderembryonen aus verschiedenen Herkünften
Die Entwicklung boviner IVP-Embryonen wird stark durch die Bedingungen während
der Oozytenreifung, Fertilisation und Embryonenkultur beeinflusst. Es konnte gezeigt
werden, dass die Oozytenqualität den Hauptfaktor für die Entwicklung der
ungereiften Eizelle zur Blastozyste darstellt (RIZOS et al. 2002b). Dagegen wird die
Qualität der resultierenden Embryonen, gemessen an der Kryotoleranz und der relativen Menge spezifischer Gentranskripte, hauptsächlich durch die Kulturbedingungen
nach der Fertilisation bestimmt (RIZOS et al. 2002b, 2003, Tabelle 1). Obwohl die
Medien zur In-vitro-Kultur immer weiter verbessert wurden, zeigen in vitro produzierte
Embryonen nach wie vor Abweichungen im Vergleich zu in vivo gewonnenen Embryonen. Das zeigt sich sowohl auf morphologischer und biochemischer, aber auch
auf molekularer Ebene. IVP-Embryonen zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber
der Kryokonservierung (POLLARD u. LEIBO 1994) und besitzen ein dunkleres und
erhöhtes Zytoplasmavolumen, sowie einen erhöhten Lipidgehalt (CROSIER et al.
2000). Zudem können bei einem Vergleich mit präimplantatorischen In-vivoEmbryonen
Unterschiede
im
Energiemetabolismus
nachgewiesen
werden
(KHURANA u. NIEMANN 2000b). Ebenso wird über ein erhöhtes Auftreten von
chromosomalen Aberrationen berichtet (VIUFF et al. 1999). Darüber hinaus gibt es
Abweichungen im mRNA-Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; RIZOS et al. 2002a, 2003; WRENZYCKI et al. 2005b).
Wie bereits vorher erwähnt, beschrieben LONERGAN et al. 2001 den positiven Einfluss der In-vivo-Kultur im ligierten Schafeileiter auf die Blastozystenqualität von
Embryonen aus In-vitro-Reifung und In-vitro-Fertilisation. Sie konnten zeigen, dass
24
die Embryonen aus dem Schafeileiter eine signifikant höhere Kryotoleranz, gemessen an der Überlebens- und Schlupfrate nach dem Auftauen, als die Embryonen aus
der In-vitro-Kultur besaßen (LONERGAN et al. 2001).
Unterschiede zeigten sich aber auch bei den aus IVP-Embryonen resultierenden
Kälbern im Vergleich zu Kälbern aus in vivo gewonnenen Embryonen. Diese Auffälligkeiten werden unter dem Begriff „Phänomen der übergroßen Kälber“ („large
offspring syndrome“, LOS) zusammengefasst (WALKER et al. 1996; YOUNG et al.
1998; FARIN et al. 2006). Neben der charakteristischen Übergröße und den vergrößerten Organen treten Abweichungen in Form von erhöhten pränatalen Verlusten,
Schwergeburten, verlängerten Trächtigkeiten, Atemproblemen, Saugschwierigkeiten,
Eihautwassersucht sowie plötzlichem perinatalen Tod auf. Die Kälber weisen außerdem häufiger einen veränderten Energiestoffwechsel auf (LAZZARI et al. 2002;
WRENZYCKI et al. 2004, 2005a).
All die oben aufgeführten Qualitätskriterien lassen allerdings keine wirklich objektive
Beurteilung der Embryonenqualität zu. Somit könnte mit Hilfe des Expressionsmusters entwicklungsrelevanter Gene die Qualität von Embryonen aus IVP objektiver und
besser evaluiert werden. Unterschiede in den mRNA-Expressionsmustern diverser
Gene zwischen IVP und in vivo erzeugten Embryonen sind in zahlreichen Studien
bereits aufgeführt worden, wobei das Expressionsmuster der in vivo erzeugten Embryonen als physiologischer Standard gilt (NIEMANN et al. 2002; LONERGAN et al.
2003a/b; GUTIERREZ-ADAN et al. 2004; WRENZYCKI et al. 2005a; CORCORAN et
al. 2006; TVEDEN-NYBORG et al. 2007). Änderungen in diesem physiologischen
Genexpressionsmuster können als ein Versuch des Embryos angesehen werden,
suboptimale Kulturbedingungen zu kompensieren (LAZZARI et al. 2002).
Untersuchungen auf der Transkriptionsebene präimplantatorischer Säugetierembryonen können ebenfalls wertvolle Hinweise auf den physiologischen Status und damit die Überlebensfähigkeit und Entwicklungskompetenz der untersuchten Embryonen liefern. Weiterhin ist es auf diese Weise möglich, einen wissenschaftlichen Einblick in die Regulation der Expression zahlreicher Gene während der frühen Embryonalentwicklung zu erhalten. Zu diesem Zwecke wurden Gendatenbanken erschaf-
25
fen. Die Genexpressionen von 60 Genen in bovinen IVP-Blastozysten, Blastozysten
aus sNT (somatic nuclear transfer) und in vivo gewonnenen Blastozysten wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich sowohl Blastozysten aus der IVP wie
auch Blastozysten aus sNT im Expressionsmuster verschiedenen Genen zu denen
reiner in vivo Blastozysten unterschieden (LONG et al. 2007, MC HUGHES et al.
2009). KUES et al. analysierten 2008 erstmals beim Rind das gesamteTranskriptom
in der frühen Entwicklungsphase von der Oozyte bis zur Blastozyste mit Hilfe des
Affymetrix GeneChip Bovine Genomic Array. Dieser Chip analysiert etwa 23.000
Transkripte. Diese Studie zeigt erstmals eine zusammenfassende Analyse des Genexpressionsprofils
und
der
transkriptionellen
Dynamik
in
der
In-vivo-
Präimplantationsphase und kann damit als eine Basis zur Verbesserung assistierter
Reproduktionstechniken dienen (KUES et al. 2008).
Während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung geschehen eine Reihe von
Änderungen in der Genexpression, zum Beispiel im Verlauf der ersten Teilungen, der
Aktivierung des embryonalen Genoms, der Kompaktierung zur Morula und
Blastozystenbildung mit Ausbildung der inneren Zellmasse (ICM) und des
Trophektoderms (TE; KIDDER 1992). Sowohl mütterliche mRNA und Proteine, welche während der Oogenese synthetisiert und akkumuliert wurden und zur frühen
Entwicklung beitragen (TELFORD et al. 1990), als auch väterliche mRNA, welche
während der Befruchtung in die Eizelle gelangen, spielen dabei eine wichtige Rolle
(OSTERMEIER et al. 2004). Der präimplantatorische Rinderembryo ist zunächst unter der Kontrolle maternaler genomischer Informationen. Anschließend ist die Entwicklung von neuen Genprodukten abhängig, die vom embryonalen Genom nach
dessen Aktivierung produziert werden (WRENZYCKI et al. 2007, Abb. 3). In der Phase des Übergangs von der maternalen auf die embryonale Expression (MET, siehe
Abb. 3) ist der Embryo besonders anfällig gegenüber externen Faktoren (DEAN et al.
2001). Die Hauptaktivierung (major activation) des bovinen embryonalen Genoms
erfolgt im 8- bis 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990), wohingegen die minor
activation („kleine“ Aktivierung) schon in der Zygote beobachtet werden kann
(MEMILI u. FIRST 2000). Die meisten Gene werden zeit- und stadienabhängig, dem
26
allgemeinen maternalen und/oder embryonalen Expressionsmuster folgend, transkribiert (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000).
Abbildung 3: Transkriptionsverläufe während der frühen Embryonalentwicklung beim
Rind (Wrenzycki et al. 2007)
Die In-vitro-Umgebung hat einen großen Einfluss auf die mRNA-Expressionsmuster
in präimplantatorischen Rinderembryonen. Inadäquate Kulturbedingungen beeinflussen nachteilig die Embryonenqualität (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; LAZZARI et
al. 2002; LONERGAN et al. 2003; WRENZYCKI et al. 2005; CORCORAN et al.
2007; TVEDEN-NYBORG et al. 2008) und sind korreliert mit signifikanter Hoch- oder
Herunterregulierung, De-novo-Induktion oder Stilllegung von Genen, die für die ungestörte Embryonal-, Fetal- und Neonatalentwicklung verantwortlich sein können
(siehe Tabelle 2). Auffällige Abweichungen können zu abnormalen Entwicklungen,
die wie bereits weiter oben beschrieben, unter dem Begriff des LOS zusammengefasst werden und zum embryonalen oder fetalen Tod führen (WRENZYCKI et al.
2005a, FARIN et al. 2006).
27
2.4
Epigenetische Genregulation in frühen Embryonalstadien
Entwicklungsprozesse in Organismen gehen immer mit einer zeitlichen und räumlichen Genexpression einher. Die Genetik fasst alle Funktionen der DNA zusammen,
die eine direkte Folge ihrer Struktur bzw. Sequenz sind. Unter anderem gehören dazu die Organisation der DNA zu Genen oder Veränderungen der DNA aufgrund von
Modifikationen wie z.B. Mutationen, also Veränderungen in der Basenabfolge. Die
Epigenetik umfasst hingegen die vererbbaren, reversiblen chromosomalen Modifikationen, die den regulatorischen Zustand der Gene und die Genexpression aufrechthalten oder unterdrücken, wobei die Nukleotidabfolge der Gene unverändert bleibt
(LI 1993; SHI et al. 2003). Die epigenetischen Modifikationen bleiben über die Zellteilung hinweg erhalten und werden an die nächste Generation weitergegeben.
Genexpressionsmuster werden von genetischen und epigenetischen Mechanismen
beeinflusst. Für die korrekte Entwicklung eines Organismus ist die epigenetische
Kontrolle der Genexpression von ausschlaggebender Bedeutung, da viele Gene nur
zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung in einem spezifischen Zelltyp aktiviert
sein dürfen. Bei der präimplantatorischen Entwicklung von Embryonen sind epigenetische
Mechanismen
wie
DNA-Methylierung/Demethylierung
und
Histon-
Modifikationen in die Regulation geprägter (imprinted) und nicht geprägter (nonimprinted) Gene, in die X-Chromosom-Inaktivierung und in die Aufrechterhaltung der
Telomerlänge involviert (WRENZYCKI et al. 2005a).
2.4.1 DNA-Methylierung
Die DNA-Methylierung beschreibt den Transfer einer Methylgruppe (CH₃-Gruppe) auf
die Nukleinbasen Cytosin der DNA durch spezielle Enzyme. Die DNA-Methylierung
ist die am besten untersuchte DNA-Modifikation. Sie wird vererbt und kommt sowohl
bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten vor (JOHNSON et al. 2002). Die DNAMethylierung ist meist mit einer Transkriptionshemmung assoziiert und spielt bei vielen
regulatorischen
Prozessen
wie
der
X-Chromosom-Inaktivierung,
beim
genomischen Imprinting, der Regulation der Entwicklung, der Mutagenese, der DNAReparatur und der Chromatin-Organisation eine große Rolle (KLIMASAUSKAS et al.
28
1994; JAENISCH u. BIRD 2003). In Säugetierzellen findet die DNA-Methylierung
ausschließlich an Position 5` des Cytosins eines CpG-Dinukleotids statt, wobei etwa
70% aller CpGs methyliert sind.
DNA-Methylierungen sind bei Wirbeltieren hauptsächlich in CpG-Inseln anzutreffen
(OKANO et al. 1998). Diese Inseln sind Regionen der DNA, die reich an den aufeinander folgenden Basen Cytosin und Guanin sind. In den CpG-Islands liegt das
Dinukleotid Cytosin-Guanin (5-CpG-3) im Vergleich zum restlichen Genom mit 10bis 20-mal erhöhter Frequenz vor. Im Allgemeinen ist die Sequenzfolge Cytosin –
Phosphat – Guanin im Genom im Vergleich zur statistischen Wahrscheinlichkeit ihres
Auftretens
unterrepräsentiert.
Die
DNA-Methylierung
wird
durch
DNA-
Methyltransferasen (DNMTs) durchgeführt (Abb. 4). Diese Enzyme (siehe Kapitel
2.4.1.1) katalysieren den Transfer einer Methylgruppe vom S-Adenosyl-L-Methionin
an das Kohlenstoffatom C-5 der Base Cytosin (ROBERTSON et al. 1999).
Abbildung 4: DNA-Methyltransferasen katalysieren den Transfer einer Methylgruppe
auf das C-Atom im Cytosinring (HAAF 2006)
Epigenetische Fehler, welche die Chromatinstruktur oder die DNA-Methylierung verändern, können beim Menschen zu Erbkrankheiten und Tumorerkrankungen führen
(TILGHMAN 1999; FALLS et al. 1999). Das Auftreten einer abweichenden Expression von „imprinted“ Genen steht im Zusammenhang mit dem Beckwith-WiedemannSyndrom (BWS), Angelman Syndrom (AS), Retinoblastomen (RB), Rett-Syndrom,
ATR-X-Syndrom (Alpha Thalassemia/Mental Retardation-Syndrome, X-linked), ICFSyndrom (Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies) und verschiedenen
Krebsformen
(DEAN
et
al.
2005).
Ein
erhöhtes
Risiko
für
Imprintingstörungen und Imprintingkrankheiten, wie die zum Teil oben aufgeführten
29
Syndrome
wurde
bei
Kindern
nach
In-vitro-Fertilisierung
(IVF)
und
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) beobachtet (COX et al. 2002;
DEBAUN et al. 2003; LAWRENCE et al. 2010). Außerdem werden Gene, die dem
Imprinting unterliegen, als mögliche ursächliche Kandidaten für die Entstehung des
LOS bei Tieren angesehen (WRENZYCKI et al. 2006).
Geschlechtsspezifische Methylierungen (siehe Abb. 5) im Genom von Oozyte und
Spermium werden nach der Befruchtung durch Demethylierung entfernt. Geprägte
Gene sind von dieser Demethylierung ausgenommen und bleiben methyliert. Das
paternale Genom wird (siehe Abb. 5) innerhalb weniger Stunden nach der Befruchtung aktiv demethyliert (Maus, Schwein, Rind, Mensch), Ausnahmen davon zeigen
nur das Kaninchen und das Schaf (SHI et al. 2004, YOUNG u. BEAUJEAN 2004)
Beim maternalen Genom findet eine passive Demethylierung während der ersten
Teilungen statt (MAYER et al. 2000; DEAN et al. 2001; HAAF 2006; LEPIKHOV et al.
2008). Die Demethylierung erfolgt aktiv, d.h. in Abwesenheit von DNA-Replikation
und unterliegt speziesspezifischen Variationen.
Bislang war zwar bekannt, dass 5„-Methylcytosine in der väterlichen und mütterlichen
DNA der Zygote demethyliert werden, doch die molekularen Mechanismen, die den
Vorgang vermitteln, waren bis dato unerforscht. Eine Forschergruppe hat nun erstmals nachgewiesen, dass die Abnahme von 5„-Methylcytosin (5-mC) in väterlichen
Vorkernen von Maus-, Kaninchen- und Rinder-Zygoten mit der Zunahme an 5Hydroxymethylcytosin (5-hmC) korreliert und die Oxidase Tet3 durch Knock-outExperimente als Katalysator der Modifikation identifiziert. Zugleich entdeckten die
Forscher durch Ausschalten des entsprechenden Gens, dass ein Schutzprotein die
Konversion von 5-mc in 5-hmc in weiblichen Vorkernen verhindert. Die neuen Erkenntnisse unterstreichen, dass 5-hmc und Tet3 eine wichtige Rolle bei der
Reprogrammierung in frühen Embryonen spielen (WOSSIDLO et al. 2011; IQBAL et
al. 2010).
Später findet eine De-novo-Methylierung der DNA statt. Dieser Vorgang beginnt beim
Rind zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium (BOURC´HIS et al. 2001a; DEAN et al.
2001; SHI et al. 2003) und bei der Maus sowie beim Menschen ab der Morula (DEAN
30
et al. 2001). Dabei kommt es bei der Maus zu einer deutlich asymmetrischen
Methylierung, wobei die DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse (ICM)
hypermethyliert wird, wohingegen die DNA der Zellen des Trophektoderms (TE) eine
Hypomethylierung aufweist (DEAN et al. 2001; SANTOS et al. 2002). Diese Asymmetrie ist beim Rind schwächer ausgeprägt (Abb. 5) und beim Menschen liegt eine
stärkere Methylierung der DNA der Zellen des Trophektoderms gegenüber der DNA
der Blastomeren der inneren Zellmasse vor (FULKA et al. 2004). Auch beim Schaf
kann eine asymmetrische Verteilung der Methylierung in voll expandierten
Blastozysten beobachtet werden. Im Gegensatz zur Maus beruht diese Asymmetrie
jedoch nicht auf einer verstärkten Remethylierung in den Kernen der ICM, sondern
auf einer selektiven Demethylierung der DNA im TE (YOUNG u. BEAUJEAN 2004).
Die korrekte Reprogrammierung der Methylierung der beiden elterlichen Genome in
der frühen Embryonalentwicklung hat große Bedeutung für die ungestörte weitere
Entwicklung (LEPIKHOV et al. 2008). Veränderungen im Methylierungsmuster der
DNA wurden beim Rind sowie bei der Maus nach Kerntransfer nachgewiesen
(HUMPHERYS et al. 2001; ENRIGHT et al. 2005). Bei Kerntransferembryonen
kommt es zu einer inkompletten, sowie auch variablen Demethylierung des diploiden
Spendergenoms (DEAN et al. 2001; LIU et al. 2008).
31
Abbildung 5: Elternspezifische Methylierungsreprogrammierung im frühen Säugetier
embryo (HAAF 2003, modifiziert)
2.4.1.1 DNA-Methyltransferasen
Methyltransferasen übertragen Methylgruppen auf bestimmte Basen der DNA. DNAMethyltransferasen bestehen aus zwei funktionellen Domänen, einer N-terminalen
Domäne mit regulatorischen Funktionen, und einer C-terminalen katalytischen Domäne (BESTOR 2000; ROBERTSON 2002). Fünf DNA-Methyltransferasen sind im
Säugetiergenom identifiziert worden: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b und
DNMT3L (siehe Abb. 6). Je nach Funktion werden die DNA-Methyltransferasen in
zwei Klassen eingeteilt. Als Erhaltungsmethyltransferase (maintenance methyltransferase) wird die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) bezeichnet. Sie ist für die Aufrechthaltung eines bereits existierenden DNA-Methylierungsmusters nach der DNAReplikation zuständig (BESTOR u. VERDINE 1994). Die genaue Funktion der
DNMT2-Familie ist nicht geklärt. Die DNMT2 wurde sowohl in Organismen, die
Methylierung aufweisen, gefunden als auch bei solchen ohne feststellbare DNAMethylierung. Homozygote Mäuse-DNMT2-Null-Mutanten sind lebensfähig und zeigen normale Methylierungslevel an endogenen Sequenzen (OKANO et al. 1998). Im
Jahre 2006 konnte gezeigt werden, dass die DNMT2 trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit
zu
den
5-Methylcytosin-Methyltransferasen
nicht
wie
angenommen
Nukleotidbasen in der DNA methyliert, sondern Transfer-RNA methyliert (tRNAASP;
GOLL et al. 2006). Um diese unterschiedliche biologische Funktion aufzuzeigen,
wurde ihr der Name TRDMT1 (tRNA aspertartic acid methyltransferase 1) gegeben.
Eine zweite Gruppe von Methyltransferasen sind die sogenannten De-novoMethyltransferasen. Sie sind u.a. für die DNA-Methylierungsmuster während der
Embryonalentwicklung verantwortlich und übertragen Methylgruppen auf völlig
unmethylierte DNA-Stränge. Zu den De-novo-Methyltransferasen zählen die
DNMT3a und DNMT3b (OKANO et al. 1999; MARGOT et al. 2003).
Neben der DNMT3a und DNMT3b gehört auch DNMT3L zu dieser Enzymfamilie. Die
DNMT3L, die alleine keine Methylierungsaktivität aufweist, ist zusammen mit
DNMT3a und DNMT3b für die Etablierung des genomischen Imprintings bei der
32
Maus essentiell und während der Oogenese für die De-novo-Methylierung verantwortlich (BOURC‟HIS et al. 2001a/b; HATA et al. 2002). DNMT3a und 3L sind für die
Ausbildung der geprägten Regionen in Oozyten verantwortlich (HATA et al. 2002).
Der genaue Mechanismus dieses Prozesses ist noch ungeklärt, es scheint aber,
dass die DNMT3L eine Art Aktivator-Protein für die Methylierung einzelner Gene ist
(DEAN et al. 2005). Die DNMT3L kann die katalytische Aktivität der DNMT3a und 3b
scheinbar bis um das 15fache verstärken (GOWHER et al. 2005).
Die DNA-Methylierung spielt somit eine sehr wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung der Säugetiere (JAENISCH u. BIRD 2003). Mutationen des DNMT3a-Gens auf
dem paternalen oder/und maternalen Allel führen zu Störungen der Reproduktion,
der Embryonalentwicklung sowie beim Imprinting (KANEDA et al. 2004), Mutationen
im DNMT1-Gen sind bei Mäusen letal (CAO u. JACOBSEN 2002).
In vergleichenden DNA-Studien zu DNMT´s (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b und
DNMT3L) in Maus, Rind und Mensch konnte gezeigt werden, dass generell eine
große strukturelle und funktionelle Übereinstimmung dieser Enzyme zwischen den
Spezies besteht. Es gibt allerdings eine höhere Übereinstimmung in der Struktur
zwischen Rinder- und Menschen-DNMT´s als zwischen Maus- und MenschenDNMT´s. Ebenfalls konnte in dieser Studie aufgezeigt werden, dass die mRNAExpressionsmuster der Enzyme während der frühen Embryonalentwicklung in den
drei Spezies übereinstimmen. Diese Erkenntnisse sind sehr wichtig für das Verständnis, welche Rolle die korrekte DNA-Methylierung als epigenetischer Prozess für
die normale Entwicklung des Embryos hat (RODRIQUEZ-OSORIO et al. 2010).
33
Abbildung 6: Die drei DNA-Methyltransferasenfamilien der Säuger (SIMON et al. 2005,
modifiziert)
2.4.1.1.1 DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1)
Die DNA-Methyltransferase 1 ist in erster Linie für die Aufrechterhaltung der
Methylierung und die Methylierung hemimethylierter CpG-Dinukleotide zuständig
(OKANO et al. 1999).
Das
DNMT1-Protein
(Abb.
7)
verfügt
im
C-Terminus
über
eine
DNA-
Doppelbindungsstelle, durch welche sich die Präferenz für die hemimethylierte DNA
erklären ließe. Die methylierte DNA wird hingegen durch die N-terminale Domäne
gebunden (BACOLLA et al. 1999, 2001). Die katalytische C-Domäne muss von der
N-terminalen Domäne aktiviert werden (MARGOT et al. 2003). Das Enzym besteht
aus 1620 Aminosäuren. Die ersten 1100 Aminosäuren machen die N-terminale, regulatorische Domäne und die restlichen Aminosäuren die C-terminale, katalytische
Domäne aus.
Die DNMT1 ist die hauptsächlich vorkommende DNA-Methyltransferase im Säugetier
und weist verschiedene Isoformen auf. Homologe der DNMT1 sind in fast allen
Eukaryonten mit 5-Methylcytosin-Domänen in der DNA zu finden, jedoch nicht in
DNA ohne solche Domänen (BESTOR 2000).
34
Abbildung 7: Struktur des DNMT1-Proteins der Maus (CIRIO et al. 2007, modifiziert)
Es wurden geschlechtsspezifische Isoformen von DNMT1 identifiziert, welche sich in
der Anzahl an Aminosäuren unterscheiden (BESTOR et al. 1988; Abb. 8). Die Oozyten-Isoform von DNMT1 beinhaltet ein spezifisches 5´Exon (DNMT 1o), welches verursacht, dass die Translation erst am ATG-Codon 4 beginnt. Daraus resultiert ein um
118 Aminosäuren kürzeres Protein. Während die somatische Form der DNMT1
(DNMT1s) vorrangig im Zellkern lokalisiert ist, befindet sich die DNMT1o nur zu Beginn des Oozyten-Wachstums und während des 8-Zell-Stadiums im Nukleus
(BESTOR 2000). Vor der Ovulation und in präimplantatorischen Mäuseembryonen ist
die DNMT1o im Zytoplasma zu finden und erst nach der Implantation im Zellkern lokalisiert, wo sie dann von der längeren somatischen Form ersetzt wird (CARLSON et
al. 1992). Ein spermienspezifischer Promotor (DNMT1p) ist in der dritten Isoform von
DNMT1 zu finden, dieser Promotor ist nur in pachytänen Spermatozyten zu finden.
Für
das
Rind
existiert
bisher
kein
Nachweis
von
somatischen
und
oozytenspezifischen DNMT1-Transkripten. Stattdessen deuten neueste Untersuchungen darauf hin, dass keine oozytenspezifische Form der DNMT1 beim Rind
existiert (RUSSELL u. BETTS 2008). So konnten RUSSELL und BETTS (2008) zwar
eine neue Variante der DNMT1 nachweisen (DNMT1b), die jedoch wie die bisher
bekannte DNMT1 ubiquitär in allen Geweben exprimiert wird. Diese neue DNMT1bVariante ist nur in geringen Mengen in ungereiften Oozyten, in etwas höheren Mengen in fetaler Leber und fetalen Gonaden und in den höchsten Mengen in fetalen
Muskelpräparaten nachzuweisen (RUSSELL u. BETTS 2008). Dagegen konnte kein
Hinweis auf einen alternativen Promotor oder ein alternatives Exon gefunden werden, wie es bei der Maus für die DNMT1o existiert (RUSSELL u. BETTS 2008).
35
Abbildung 8: Geschlechtsspezifische Exons und mRNAs der DNMT1 (BESTOR 2000)
In Abhängigkeit von der Herkunft und dem Entwicklungsstadium konnten bei Rindern
für die DNMT1 in verschiedenen Versuchen unterschiedliche mRNA-Gehalte festgestellt werden. WRENZYCKI u. NIEMANN (2003) beschrieben die DNMT1mRNAExpression in maturierten Eizellen sowie in Embryonen verschiedener Herkunft (parthenogenetisch, IVP, SCNT). Dabei war in identisch erstellten Embryonen
im 8- Zellstadium ein signifikanter Abfall des mRNA-Gehaltes im Vergleich zu Zygoten der gleichen Herkunft nachweisbar. Im Blastozystenstadium konnte jedoch ein
signifikanter Anstieg der Transkriptmenge bei den Embryonen aus SCNT und IVP im
Vergleich zu in vivo gewonnenen Embryonen beobachtet werden. Bei einem Vergleich früher präimplantatorischer boviner Embryonen aus IVP und In-vivoGewinnung konnte ein signifikanter Unterschied der DNMT1 mRNA-Expression bei
Embryonen verschiedener Herkunft festgestellt werden. So ist die relative
Transkriptmenge in in vivo gewonnenen Morulae- und Blastozystenstadien geringer
als in Embryonen aus In-vitro-Kultur (HÖFFMANN et al. 2006).
36
2.4.1.1.2 DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a)
DNMT3a/b sind De novo-DNMTs (OKANO et al. 1999) und erreichen ihre höchste
Expression in der frühen Embryogenese (BIRD 2002; WADE 2001). Die DNAMethyltransferasen 3a und 3b bestehen aus einer großen N-terminalen Domäne und
einer kleineren, katalytischen C-terminalen Domäne. Bei Untersuchungen an Hefen
konnten keine intramolekularen Interaktionen zwischen den zwei Domänen, wie sie
für DNMT1 beschrieben worden sind, festgestellt werden (MARGOT et al. 2003).
DNMT3a und DNMT3b sind essentiell für die De novo-Methylierung von embryonalen Stammzellen (OKANO et al. 1999). Untersuchungen an Mäusen konnten zeigen,
dass sie ebenfalls eine große Rolle bei der De novo-Methylierung während der frühembryonalen Entwicklung spielen. Sie sind desweiteren an der Ausbildung des
maternalen und paternalen Imprinting beteiligt. Mutationen des DNMT3a-Gens sowohl auf dem paternalen als auch auf dem maternalen Allel führen zu Störungen der
Reproduktion, der Embryonalentwicklung und des Imprinting (KANEDA et al. 2004).
DNMT3b spielt eine bedeutende Rolle während der frühen Embryonalentwicklung
und methyliert ein breites Spektrum an DNA-Sequenzen, wohingegen DNMT3a eine
Reihe an Genen oder Sequenzen zu methylieren scheint, die während der späteren
Embryonalentwicklung und/oder nach der Geburt von Bedeutung sind (OKANO et al.
1999).
Auch in der Spermatogenese spielt DNMT3a eine bedeutende Rolle. So war es nicht
möglich, eine Trächtigkeit bei Wildtypmäusen zu etablieren, die mit DNMT3a mutanten Böcken gekreuzt wurden (KANEDA et al. 2004). Störungen der DNMT3aExpression sind letal für Mäuse, und auch von der DNMT3a/DNMT3b homozygoten
Knockoutmaus wurde berichtet, dass sie unfähig ist, neuintegrierte retrovirale DNA
zu methylieren. Bei heterozygoten Knockoutmäusen bleibt diese Fähigkeit jedoch
erhalten (OKANO et al. 1999). In Vergleichsstudien zwischen bovinen in vitro und in
vivo generierten sowie geklonten Embryonen konnte ein signifikanter Anstieg der
DNMT3a-Expression in den geklonten Embryonen im Vergleich zu in vivo generierten, parthenogenetischen und IVP-Blastozysten nachgewiesen werden. HÖFFMANN
konnte 2006 durch vergleichende Untersuchungen mittels semi-quantitativer RTPCR Unterschiede in der relativen Transkriptmenge für DNMT3a zwischen in vivo
37
und in vitro erzeugten Embryonen feststellen. Die relative Transkriptmenge von
DNMT3a unterschied sich signifikant zwischen Morulae und Blastozysten aus den
beiden Herkünften. Bei den Blastozysten war der Gehalt an DNMT3a in den in vivo
gewonnenen Embryonen niedriger als bei ihren in vitro Gegenspielern, und umgekehrt bei den Morulae (HÖFFMANN 2006; DRALLMEYER 2008).
2.4.2 Histonmethylierung und Histonmethyltransferasen
Die Histonmethylierung ist ebenfalls ein wichtiger Mechanismus der epigenetischen
Kontrolle der Genexpression. Die DNA des Zellkerns bildet in eukaryontischen Zellen
mit Proteinen einen Komplex, der als Chromatin bezeichnet wird. Die sich wiederholende Grundeinheit des Chromatins wird Nukleosom genannt. Nukleosome bestehen
aus einem Oktamer-Komplex der Histone H2A, H2B, H3 und H4, um den jeweils 146
Basenpaare DNA gewunden sind (GELDERMANN 2005a, S.63-88). Die Histone bestehen
aus
zentralen,
globulären
Domänen
und
flexiblen
Armen,
die
posttranslationell modifiziert werden können (siehe Abb. 9).
Aufgrund dieser Modifizierungen spielen die Histone eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression. Die Histone sind in die Modulation der Transkription
während der Entwicklung, in die X-Chromosom-Inaktivierung bei weiblichen Säugetieren und in die Genom-Stabilität sowie in die meiotische Chromosomendynamik
involviert (GOLL u. BESTOR 2002). Die N-terminalen, flexiblen Arme der Histone
sind einer Vielzahl von Modifikationen, wie Acetylierung (Lysin), Phosphorylierung
(Serin/Threonin), Methylierung (Lysin, Arginin), Ubiquitinylierung (Lysin) und ADPRibosylierung unterworfen (Berger, 2002). Die Acetylierung ist dabei am besten erforscht und wird als eine epigenetische Markierung für den Status der
transkriptionellen Aktivität gesehen (TURNER, 2000). Die Möglichkeit durch Kombination verschiedener Modifikationsstufen der N-Termini Markierungen für „Feinabstimmungen” der transkriptionellen Aktivität bzw. des Chromatinzustandes verfügbar
zu haben, führte zur „Histon-Code”-Hypothese (STRAHL und ALLIS, 2000). Mit der
Entdeckung der H3-K9-Methyltransferaseaktivität von SUV39H1 (REA et al. 2000)
wurde diese Hypothese auch mit der Kontrolle heterochromatischer Regionen in
38
Verbindung gebracht (JENUWEIN und ALLIS, 2001). Aufgrund dieser Modifizierungen der Aminosäuren spielen die Histone eine wichtige Rolle bei der Regulation der
Genexpression.
Abbildung 9:
Histonaufbau und Histonmodifizierung (SPOTSWOOD u. TURNER
2002, modifiziert)
1964 wurde die Histonmethylierung von MURRAY nachgewiesen. Es war aber noch
lange unklar, welche genaue Funktion diese Modifikation hat (MURRAY 1964). Erst
über 30 Jahre später konnte ein Zusammenhang zwischen der Transkription und der
Histonmethylierung aufgezeigt werden (CHEN et al. 1999). Heute sind zwei Varianten der Histonmethylierung bekannt: die Methylierung an den Aminosäuren Arginin
und/oder Lysin. Histonmethyltransferasen (HMTs) katalysieren diese Prozesse. Sie
übertragen eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin auf die beiden oben genannten Aminosäuren in der N-terminalen Region der Histone. Die Methylierung von
Argininen ist weniger gut untersucht. Sie erfolgt an den Aminogruppen des
Guanidinorestes durch
Protein-Arginin-Methyltransferasen
(PRMTs; GARY u.
CLARKE 1998). Histon-Arginin-Methylierung ist in die Genaktivierung involviert und
methyliert als Coaktivator Promotoren. Die Methylierung erfolgt durch HistonMethyltransferasen der CARM1/PRMT1-Familien. Diese zielen überwiegend auf
39
Histon 3 (H3) und Histon 4 (H4) ab (CHEN et al. 1999). Die Histonmethylierung von
Lysin spielt eine Rolle bei der Genstilllegung von heterochromatischen Genen. Eine
Methylierung von Lysinresten durch Histon-Lysin-Methyltransferasen findet am
Histon H3 an den Positionen K4, K9, K27, K36 und K79 und am Histon H4 an K20
statt (Abb. 9; STRAHL et al. 1999; FENG et al. 2002; SIMS et al. 2003). Sie wird von
Histon-Methyltransferasen
der
Familie
der
SET-Domäne
tragenden
Lysin-
Methyltransferasen bewältigt. Die Domäne dieser Methyltransferasenfamilie wurde
nach den drei Proteinen SU(VAR)3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax bezeichnet, an
denen sie vorhanden ist (JENUWEIN et al. 1998). Als erste lysinspezifische
Histonmethyltransferasen wurden Proteine der SU(VAR)3-9-Familie von Drosophila,
Maus und Mensch entdeckt. Ein Durchbruch bei der Analyse der Funktion von
SU(VAR)3-9 war die Entdeckung der für Lysin 9 von Histon H3 (H3-K9) spezifischen
Methyltransferaseaktivität der SET-Domäne der menschlichen und maushomologen
SUV39H1 und Suv39h1 (REA et al., 2000). Neben SUV39H1 und SUV39H2 sind bei
der Maus ESET (YANG et al. 2002a) und G9A zu nennen (TACHIBANA et al. 2002).
Methylierte Histone können je nach Position der methylierten Lysinreste aktivierende
oder reprimierende Wirkung auf die Genexpression haben (HAKE et al. 2004).
Methylierungen an Lysin K4 und K9 haben gegensätzliche Effekte; eine K4Methylierung wird mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziiert und die K9Methylierung mit inaktivem Chromatin (LACHNER u. JENUWEIN 2002). Eine H3K9-Methylierung tritt auch bei fakultativem Heterochromatin des inaktiven XChromosoms weiblicher Säugetiere auf und wird hier auch während der Mitose aufrechterhalten (PETERS et al. 2002). Histonmethylierung in Kombination mit der
DNA-Methylierung stabilisieren möglicherweise die stillgelegten Chromatindomänen.
Die Kombination schützt möglicherweise die Genexpressions-Programme und bewahrt die genomische Integrität (FUKS et al. 2003). Embryonen, erzeugt durch somatischen Kerntransfer weisen häufig eine H3-K9-Hypermethylierung bei gleichzeitiger
DNA-Hypermethylierung
auf,
was
ein
genomweites
Scheitern
der
Reprogrammierung nahe legt. Diese Erkenntnisse weisen auf ein epigenetisches
Zusammenspiel zwischen Histonmethylierung und DNA-Methylierung bei der Ent-
40
wicklung von Embryonen hin (LEPIKHOV et al. 2008). Desweiteren wird die Beziehung zwischen epigenetischen Merkmalen und dem Entwicklungspotential geklonter
Embryonen aufgezeigt (SANTOS et al. 2003).
2.4.2.1 Histonmethyltransferase SUV39H1
Methylierungen finden grundsätzlich nur an den Aminosäuren Arginin und/oder Lysin
der Histontails statt (Abb. 9). Proteine der SU(VAR)3-9-Familie (Abb. 10) gehören zu
den lysinspezifischen Histonmethyltransferasen, sie methylieren Histon H3 und besitzen eine katalytische Einheit, die SET-Domäne (REA et al. 2000). An die SETDomäne des Proteins
grenzen zwei cysteinreiche Regionen, die preSET- und
postSET Domäne. Es wird vermutet, dass außer der katalytischen Set-Domäne auch
diese flankierende Regionen für die enzymatische Aktivität des Enzyms essentiell
sind (REA et al. 2000; ZHANG u. REINBERG 2001).
Die Histon Methyltransferase (HMT) SUV39H1 ist für die Methylierung des Lysin 9
im Histone H3 verantwortlich ist. SUV39H1 ist ein SET-Domänen-Protein, welches
sehr spezifisch die Aminosäure Lysin mit bis zu drei Methylresten (Mono-, Di- oder
Tri-Methylierung) ausstatten kann. Es wird vermutet, dass
Di- und Tri-
Methylierungen generell zu einer höheren Stabilität der Histon-Lysin-Methylierung
beitragen (LACHNER et al. 2003). Die Tri-Methylierung von H3-K4 wurde in komplett
aktivierten Promotern gefunden, während die Di-Methylierung nur mit basaler Transkription assoziiert ist (SANTOS-ROSA et al. 2002). Im Gegensatz dazu induziert die
H3-K9-Methylierung generell ein transkriptionell inaktives Chromatin (LACHNER u.
JENUWEIN 2002).
Abbildung 10: Proteinstruktur von SU(VAR)3-9
41
Ein Fehlen der Histonmethyltransferase SUV39H1 verringert den Gehalt von
methyliertem H3-K9 um die Hälfte (TACHIBANA et al. 2002). SUV39H1 ist für die
Methylierung von Heterochromatin-Kompartimenten des Nukleus von Bedeutung
(PETERS
et
al.
2001,
Histonmethyltransferase
Abb.
(REA
11).
Die
Identifizierung
et
al.,
2000)
war
von
ein
SUV39H1
Meilenstein
als
der
Chromatinforschung. Die SET-Domäne als katalytisches Motiv der HistonMethyltransferasen definierte eine neue Klasse von Protein-Methyltransferasen und
erweiterte das Verständnis vom Aufbau des Chromatins grundlegend. BANNISTER
et al. konnten 2001 bei der Hefe Schizosaccharomyces pombe aufzeigen, dass
SUV39H1 in Kooperation mit Heterochromatin-Protein1 an der Gen-Stilllegung beteiligt ist. Heterochromatin-Protein 1 (HP1) ist ein Adaptorprotein, das verschiedene
Heterochromatin-Komponenten am Chromatin zu großen makromolekularen Komplexen verbindet. Die drei Isoformen von HP1 (HP1α, β, γ) sind strukturelle Komponenten des Heterochromatins und binden methylierte Histone und die für die
Methylierung verantwortlichen HMTs. HP1 bindet mit hoher Affinität an Histon H3,
wenn dieses an Lysin 9 methyliert ist (LACHNER et al. 2001). Die Chromo-Domäne
von HP1 wurde dabei als Methyl-Lysin-Bindungsdomäne identifiziert. Die Stilllegung
der Transkription wird durch zwei Schritte erreicht: SUV39H1 platziert einen Marker
(Methyl) an Histon H3 und dieser wird dann von HP1 durch die Chromo-Domäne erkannt. Dieses Modell könnte auch die stabile Vererbbarkeit des heterochromatischen
Zustandes erklären (LACHNER et al. 2001).
Die Interaktion zwischen HP1, HMTs und methylierten Lysinresten der Histone ist
von entscheidender Bedeutung für die Bildung und den Erhalt des Heterochromatins
(LACHNER et al. 2001). Am besten untersucht ist die Bindung HP1-SUV39H1-H3K9(methyl)3.
42
Abbildung 11: Schematischer Ablauf der Heterochromatisierung (THIEL et al. 2004)
Störungen der zwei murinen Suv39h-HMTasen führten zu einer Abschaltung der H3K9-Methylierung des konstitutiven Heterochromatins, nicht jedoch bei dem inaktivierten X-Chromosom (Xi). HP1 bindet jedoch nicht an Xi. Diese Beobachtungen veranlassten PETERS et al. (2002) zu der Vermutung, dass es noch einen Suv39h-HP1
unabhängigen Regulationsmechanismus für die Methylierung von H3-K9 bei fakultativem Heterochromatin geben muss.
In
einer
2005
durchgeführten
Expressionsanalyse
bei
Genen,
die
an
Histonmodifikationen beteiligt sind, ergaben sich deutliche Unterschiede zwischen
Rinderembryonen verschiedener Herkunft. Die Aufdeckung dieser Unterschiede im
mRNA-Expressionsprofil zwischen in vivo und in vitro produzierten oder geklonten
Embryonen ist ebenfalls ein wesentlicher Schlüssel in der Optimierung der In-vitroProduktions-Systeme und trägt zur Minimierung des Auftretens von Entwicklungsstörungen bei (NOWAK-IMIALEK et al. 2005). Auch HÖFFMANN zeigte in ihrer Arbeit
2005
auf,
dass
sich
die
relativen
Transkriptmengen
der
H3-K9
Histon-
Methyltransferase in Embryonen aus In-vivo-Herkunft und aus IVP unterschieden.
Die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen überstieg dabei immer die
der In-vivo-Embryonen.
43
2.5
Energiemetabolismus im präimplantatorischen Embryo
Die Entwicklung eines Säugetierembryos lässt sich grob in zwei Phasen unterteilen,
eine Prä- und eine Postimplantationsphase. Bis zum Zeitpunkt der Implantation wird
der Embryo über die Histiotrophe, also über die Ovidukt- und Uterusflüssigkeit, ernährt. Nach der Implantation kommt es zum Anschluss an den maternalen Blutkreislauf und hierüber zur weiteren Ernährung.
Die Präimplantationsentwicklung umfasst die Zeitspanne von der Befruchtung der
Eizelle bis zur Einnistung der geschlüpften Blastozyste in die Gebärmutterschleimhaut. Diese kurze Phase stellt grundlegend die Weichen in der Embryonalentwicklung, wie z.B. die Aktivierung des embryonalen Genoms. Die Aktivierung des embryonalen Genoms geht bei präimplantatorischen Embryonen einher mit einer Veränderung des embryonalen Metabolismus. Studien beim Rind zeigten, dass mit der
Kompaktierung zur Morula eine Umstellung des Energiemetabolismus von einer
Pyruvat/Laktatverwertung zur Metabolisierung von Glukose erfolgt (WALES 1986;
JAVED u. WRIGHT, 1991; KHURANA u. NIEMANN 2000). Zygoten benötigen für die
erste Reifeteilung hauptsächlich Pyruvat, während die zweite Teilung gleichermaßen
von Pyruvat und Laktat unterstützt wird (LEESE, 1995). Frühe Teilungsstadien können zwar auch schon geringe Mengen Glukose über den Pentosephosphatweg
metabolisieren, doch erst mit der Aktivierung des embryonalen Genoms steigt die
Aktivität des Embden-Meyerhof-Parnas-Weges (EMP = Glykolyse) an (JAVED u.
WRIGHT, 1991; RIEGER et al., 1992a; RIEGER et al., 1992b). Eine mögliche Ursache dafür ist, dass der Embryo in diesen frühen Stadien nicht zum Glukosetransport
befähigt sein könnte (PANTALEON et al. 1997). Die Umstellung des embryonalen
Stoffwechsels von der Pyruvat/Lakatverwertung zum Glukosemetabolismus ist an die
Aktivierung eines Schlüsselenzyms der Glykolyse, der Phosphofruktokinase (PFK),
gebunden. Die PFK fungiert bei der Umstellung des Metabolismus als „Schrittmacher“. Ein programmgemäßes Durchlaufen zahlreicher weiterer zell- und molekularbiologischer Prozesse bestimmt die Entwicklungsfähigkeit des Embryos. Dabei spielt
das Energiesubstrat Glukose eine wesentliche Rolle. Ihre Aufnahme und Verfügbarkeit ist für die Blastozystenbildung, einem sehr energieaufwendigen Prozess, essentiell (BARBEHENN et al., 1974; BARBEHENN et al., 1978).
44
Die Glukoseaufnahme ist an die Expression von speziellen Transmembranproteinen,
den Glukosetransportern gebunden. Spezifische Glukosetransporterisoformen regulieren die Glukoseaufnahme der Zelle. Insulin kontrolliert die Transkription, Translation und Translokation der Glukosetransporterproteine (TAHA u. KLIP, 1999) und
nimmt Einfluss auf die Entwicklung von Präimplantationsembryonen.
2.5.1 Solute Carrier 2A (SLC2A) / Glukosetransporter (GLUT)
Glukosetransporter sind transmembranäre Transportproteine, die den Transport von
Glukose und anderen Hexosemolekülen durch die Zellmembran katalysieren. Sie
werden heute als Solute Carrier Familie (SLC) – SLC2A bezeichnet. Früher wurden
sie auch als GLUT bezeichnet. Im Jahre 1977 konnte das Protein, welches den
Transport der hydrophilen Glukose durch die Plasmamembran in die Zelle ermöglicht, isoliert werden (KASAHARA u. HINKLE 1977). Die entsprechende DNA des
Proteins konnte 1985 kloniert werden und erlaubte Aussagen über die Struktur des
Glukosetransporters (MUEKLER et al., 1985). Glukosetransporter sind Proteine, die
aus ca. 500 Aminosäuren und 12 membrandurchspannenden Helices bestehen.
Durch die Helices können sie einen Kanal in der Membran bilden (HENDERSON,
1993). Zwischen den Helices 6 und 7 liegt eine größere intrazytoplasmatische Domäne. Wichtig für die Substratbindung ist die extrazytoplasmatische N-glykosylierte
Domäne (ASANO et al., 1993, Abb. 12).
Abbildung 12: Allgemeiner Aufbau eines Glukosetransporters (Glut1; Lehninger Biochemie 2001)
45
Die Familie der „klassischen“ GLUTs wird bei Säugetieren nach der Reihenfolge ihrer
Klonierung nummeriert und umfasst insgesamt 13 Transporter, die die Glukose aktiv
oder passiv durch Membranen befördern können, sich jedoch in ihrer Regulation,
Kinetik
und
ihrem
Expressionsmuster
unterscheiden.
Durch
Aminosäuresequenzvergleich der Glukosetransporter können diese in drei Subfamilien aufgeteilt werden. Die erste Subfamilie (Klasse I) umfasst die GLUT-Transporter
1-4, die zweite (Klasse II) beinhaltet die Transporter GLUT5, GLUT7, GLUT9 und
GLUT11, wobei GLUT5 ein Fruktosetransporter ist. Eine dritte Familie (Klasse III)
beinhaltet die Transporter GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12 und den Myo-InositolTransporter HMIT1 (JOOST und THORENS, 2001). Manche Typen (z.B. GLUT2)
können konstitutiv in die Zellmembran eingelagert werden, während andere Typen
(z.B. GLUT4) für diese Einlagerung die Stimulation der Zelle durch Insulin benötigen.
Den einzelnen Glukosetransporterisoformen sind die konservierten Regionen der
Primärstruktur und die zwölf transmembranen Helices dieser Membranproteine gemeinsam. Sowohl das C- als auch N-terminale Ende dieser Proteine befindet sich im
Cytoplasma. Sequenzhomologien des C- und N- terminalen Endes weisen auf eine
Dimerisierung von zwei Proteinen hin, die ursprünglich je sechs transmembranäre
Helices umfassten.
Bei Säugern unterscheidet man nach der Art des Glukosetransportes: den aktiven
Transport durch Sodium dependent Glucose Transporters (SGLT) oder den passiven
Glukosetransport
mittels
Glukosetransporterisoformen
(GLUT).
Der
aktive
Glukosetransport erfolgt durch energieabhängige Natrium-Cotransporter im Dünndarm und in den proximalen tubulären Epithelzellen der Niere (SACKTOR, 1989;
WRIGHT et al., 1994). Es sind zurzeit 2 Isoformen (SGLT1 und SGLT2) bekannt.
Die erleichterte Diffusion von Glukose durch die Plasmamembran wird durch die
energieunabhängigen Glukosetransporterproteine (GLUT) vermittelt. Neben Glukose
werden auch Fruktose und Galaktose als Substrate transportiert. Die Substratspezifität und Transportgeschwindigkeit sind von der GLUT-Isoform abhängig. Die
Glukosetransporterproteinfamilie umfasst wie oben bereits erwähnt 13 verschiedene
Transporter GLUT1-12 und den H+-myo-Inositol Cotransporter HMIT1 (DOEGE et
46
al., 2001; PHAY et al., 2000b; ULDRY und THORENS, 2004). Funktionell lassen sich
die passiven Glukosetransporter noch in jene Transporter, welche insulinabhängig
Glukose transportieren (GLUT2, GLUT4, GLUT8) und jene, die insulinunabhängig
sind unterscheiden. In Embryonalstadien des Rindes werden zwei Insulin-sensitive
Glukosetransporter exprimiert. Im Gegensatz zu dem ausschließlich in Blastozysten
transkribierten GLUT4 (SLC2A4) wird GLUT8-RNA(SLC2A8) in allen untersuchten
Embryonalstadien gefunden (AUGUSTIN et. al 2001). .
Die zell- und gewebsspezifische Verteilung der GLUT-Isoformen ist gut untersucht.
Durch knock-out-Modelle konnte gezeigt werden, dass diesen Molekülen eine wichtige Funktion in der Glukoseaufnahme, der Speicherung von Glukose und als
Glukosesensor zukommt. Die Expression von Glukosetransporterisoformen für
Präimplantationsembryonen der Maus ist gut charakterisiert. Präimplantatorische
Embryonen der Maus exprimieren die Glukosetransporter 1-3 und 8 (AGHAYAN et
al., 1992; CARAYANNOPOULOS et al., 2000; HOGAN et al., 1991; SCHULTZ et al.,
1992). Die Lokalisation von Glukosetransportern in Präimplantationsembryonen der
Maus ermöglichte zudem Aussagen zur Bedeutung einzelner Isoformen für die
Glukoseaufnahme und mögliche Mechanismen der Glukosebereitstellung für den
Embryo
(CARAYANNOPOULOS
et
al.,
2000;
PANTALEON
et
al.,
1997;
PANTALEON und KAYE, 1998). Die Untersuchungen der Arbeitsgruppe um KAYE
zeigten, dass der GLUT3 (SLC2A3) die entscheidende Rolle bei der Aufnahme externer Glukose spielt (PANTALEON et al., 1997). Sowohl der SLC2A1 Transporter
als auch der SLC2A3 Transporter werden von der bovinen Oozyte und allen frühembryonalen bovinen Stadien exprimiert. Hierbei stellen SLC2A1 und SLC2A3 die
Hauptisoformen der Glukosetransporter in der frühen embryonalen Entwicklung dar
(AUGUSTIN et al. 2001).
Eine veränderte Expression von Glukosetransporterisoformen während der Entwicklung von Präimplantationsembryonen (Maus und Rind) wurde bei einem Vergleich
von In-vivo- mit In-vitro-Embryonen (MORITA et al., 1994; NAVARRETE SANTOS et
al., 2000a, KNIJN et al. 2002), bei einer Verwendung verschiedener Kulturmedien
(WRENZYCKI et al., 1999) oder beim Vorliegen von Hyperglykämie (MOLEY et al.,
47
1998b) gefunden. Eine Forschungsgruppe um AUGUSTIN konnte durch Ihre Untersuchungen
aufzeigen,
dass
Glukosetransporter
entwicklungsspezifisch
in
präimplantatorischen Embryonen des Rindes exprimiert werden. Dabei liegen die
Glukosetransporter 1, 3, 8 und SGLT-I als maternale Transkripte vor und sind in allen
Embryonalstadien nachweisbar. Die GLUT (SLC2A) sind spezifisch in den verschiedenen embryonalen Zellen lokalisiert und werden in Blastozysten durch Insulin spezifisch in ihrer Transkription verändert (AUGUSTIN et. al 2001).
2.5.1.1 Solute Carrier 2A3/Glukosetransporter 3 (SLC2A3, GLUT3)
1988
wurde
erstmals
die
humane
cDNA
der
dritten
Isoform
der
Glukosetransporterfamilie kloniert (KAYANO et al.1988). Anschließend konnte auch
in anderen Spezies die entsprechenden cDNA dieser Isoform kloniert werden (Kaninchen: ASANO et al. 1988; Hund: BORSON et al. 1996; Ratte: NAGAMATSU et al.
1993; Maus: NAGAMATSU et al. 1992; Schaf: BENNETT et al. 1995). Für GLUT3 ist
ein niedriger Km-Wert (1•8mM) und eine hohe Glukoseaffinität charakteristisch
(GOULD et al., 1992; SIMPSON et al 2008). Der GLUT3 (SLC2A3) wird vor allem in
neuronalem Gewebe, in der Plazenta und in geringen Mengen in Muskel-, Fett- und
Nierengewebe exprimiert. Beim Glukosetransport über die Blut-Hirn-Schranke sind
vor allem GLUT1 (SLC2A1) und GLUT3 (SLC2A3) beteiligt. GLUT3 ist der spezifische Transporter im Gehirn bei Maus und Ratte, während das Protein im humanen
Organismus auch in den langsamen Muskelfasern nachgewiesen werden kann. Im
Gegensatz zu dieser spezifischen Proteinlokalisation von GLUT3 (SLC2A3) kann die
mRNA beim Menschen ubiquitär, bei der Maus aber nur im Gehirn nachgewiesen
werden (KAYANO et al. 1988). In Gehirnen von Ratten wird der GLUT3 durch Stressoren wie z.B. Hypoxie über einen durch HIF1 (Hypoxie inducible factor) vermittelten
Signalweg (ROYER et al. 2000) oder Hypoglykämie (LEE et al. 2000) in seiner Expression beeinflusst. Die Rolle des GLUT3 im fetomaternalen Glukosetransport wurde unter Hyperglykämie an Plazenten von Schafen (DAS et al. 2000) und bei diabetischen Müttern untersucht (SCIULLO et al. 1997). Beide Studien zeigten eine
Herabregulation dieses Transporters auf. Maligne Entartung testikulärer Keimzellen
48
(YOUNES et al. 1997) und auch das Ehrlich-Karzinom (AU et al. 1997) sind hingegen mit einer erhöhten Expression von GLUT3 verbunden. Die Expression des
GLUT3 (SLC2A3) steht unter dem Einfluss von Insulin und wird über den
Signaltransduktionsweg der MAP-Kinase reguliert (TAHA et al. 1995; TAHA et al.
1997). Die Transkription des GLUT3-Gens unterliegt u.a. den Transkriptionsfaktoren
sp1 und sp3 (RAJAKUMAR et al. 1998), Proteine der Zinkfinger-Familie. Obwohl der
GLUT3 in vielen Spezies beschrieben wurde, sind, im Vergleich zu den
Glukosetransportern 1, 2 oder 4, bisher relativ wenige Studien über die spezifische
Regulation und Funktion dieser Isoform vorgenommen worden.
In präimplantatorischen Embryonen der Maus beginnt die Expression der GLUT3RNA und GLUT3-Proteins ab dem 4-/6-Zellstadium (PANTALEON et al. 1997). Die
Untersuchungen dieser Arbeitsgruppe zeigten, dass der GLUT3 (SLC2A3) die entscheidende Rolle bei der Aufnahme externer Glukose spielt (PANTALEON et al.
1997).
Der
GLUT3
(SLC2A3)
ist
in
den
apikalen
Membranen
der
Trophektodermzellen lokalisiert und für die Aufnahme der maternalen Glukose verantwortlich (PANTALEON und KAYE 1998). Die offenbar entscheidende Funktion
des GLUT3 für die Versorgung des Embryos mit Glukose bestätigt die Beobachtung
einer um zirka 50% verringerten Blastozystenrate nach Kultur von 2-Zell-Embryonen
unter
Repression
der
GLUT3-Translation
durch
Antisense-Oligonukleotide
(PANTALEON et al. 1997). In Studien an Mäusen fand man heraus, dass SLC2A3
essentiell für die Entwicklung von frühen postimplantatorischen Embryonen ist und
das eine Inaktivierung des Slc2a3-Gens bei Mäusen zur Apoptose führt (SCHMIDT
et al. 2009). Bei Rindern ist SLC2A3 maternaler Herkunft und konnte dementsprechend von der Eizelle bis zur Tag 12-Blastozyste dargestellt werden (AUGUSTIN et
al. 2001). Die Expression von SLC2A3 scheint ein sehr sensitiver Marker für eine
suboptimale embryonale Umgebung zu sein. Die relative Transkriptmenge ist bei der
In-vitro-Kultur im Brutschrank und bei der In-vivo-Kultur im Schafeileiter, die ansonsten besser geeignet zu sein scheint, im Gegensatz zu in vivo gewonnenen Embryonen signifikant erhöht (LAZZARI et al. 2002).
49
2.5.1.2 Solute Carrier 2A8/Glukosetransporter 8 (SLC2A8, GLUT8, GLUTX1)
Die cDNA eines neuen Glukosetransporters wurde aus den Hoden der Ratte isoliert,
in denen auch die höchsten Expressionsraten von mRNA dieses Transporters nachgewiesen wurden. Schwächere Expressionsraten waren noch im Gehirn und der Nebenniere nachweisbar (IBBERSON et al. 2000). Auf der Basis homologer Bereiche
der
Glukosetransportersequenzen
1-5
führte
dann
das
„Screenen“
von
Nukleotidsequenzdatenbanken zur Klonierung des GlutX1 (IBBERSON et al. 2000)
bzw. GLUT8 (CARAYANNOPOULOS et al. 2000; DOEGE et al. 2000b). Die cDNA
kodiert für ein Protein aus 478 Aminosäuren, die eine Sequenzähnlichkeit zwischen
29 bis 32 % zu den verschiedenen GLUT1-5 aufweist. Als Unterschied zu den bisher
beschriebenen passiven Glukosetransportern, besitzt der GLUT8 eine lange extrazelluläre Schleife zwischen den Transmembransegmenten 9 und 10. In dieser
Schleife befindet sich auch die einzige Glykosylierungssequenz, die bei den anderen
Glukosetransportern zwischen den Transmembransegmenten 1 und 2 in der extrazellulären Schleife 1 lokalisiert ist. Dieses Motiv scheint für die intrazelluläre Lokalisation
des
Transporters
verantwortlich
zu
sein.
Die
Funktionalität
des
Glukosetransporters liegt nach einer Translokation des Proteins in die Plasmamembran vor, wobei die Translokation nach einem Aminosäureaustausch (IBBERSON et
al. 2000) oder als Insulin-sensitiv nachgewiesen wurde (CARAYANNOPOULOS et
al. 2000). 2002 konnte nachgewiesen werden, dass hohe GLUT8-Konzentration in
den Köpfen von Maus- und Menschspermatozoen zu finden sind (SCHÜRMANN et
al. 2002). Dieses Ergebnis lässt auf eine GLUT8-Funktion bei der GlukoseVersorgung der Spermazellen schließen. IBBERSON et al. demonstrierten, dass
GLUT8 in speziellen Gehirnregionen und Neuronen vorhanden ist, wo es eine Rolle
im Glukosemetabolismus spielt (IBBERSON et al. 2002). Weiterhin ist bekannt, dass
während der Blastozystenentwicklung der Embryo sehr schnell von Pyruvat als primäre Energiequelle zu Glukose umsteigt (Rind: JAVED u. WRIGHT 1991;
KHURANA u. NIEMANN 2000). Um den Glukosetransport in dieser kritischen Phase
zu maximieren, wird die GLUT8-Expression stark erhöht (CARAYANNOPOULOS et
al. 2000). Da die GLUT8-Expression in adulten Geweben wie z.B. Gehirn, Muskel
und Fett, geringer ist als in Blastozysten, wird vermutet, dass die GLUT8-Funktion
50
nur während der Embryonalentwicklung ausgeübt wird, damit der Embryo zusätzlich
mit Glukose versorgt werden kann (Abb. 13). GLUT8 (SLC2A8) wäre somit vor allem
ein embryonaler Transporter. Der in den Publikationen von DOEGE et al. sowie
CARAYANNOPOULOS et al. im gleichen Jahr (2000) beschriebene GLUT8 wird
auch in Präimplantationsembryonen des Rindes exprimiert. Nach einer Stunde
insulinsupplementierter Kultur von Rinderblastozysten wurden für die Gene GLUT3
und GLUT8 signifikante Unterschiede in den relativen Transkriptmengen gefunden.
Signifikante Unterschiede über den gesamten Untersuchungszeitraum waren nicht
nachzuweisen (AUGUSTIN et al. 2001). GLUT8 ist ein Glukosetransporter, der für
eine insulinstimulierte Glukoseaufnahme in der Blastozyste verantwortlich ist. Eine
verminderte Expression kann mit vermehrter Apoptose in Zusammenhang gebracht
werden (CARAYANNOPOULOS et al. 2000).
Abbildung
13:
Schematische Darstellung des Glukosetransportes
Blastozysten der Maus (Pantaleon u. Kaye 1998)
51
in
3
Material und Methoden
Die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Chemikalien sowie die genutzten Geräte sind – sofern nicht im Text angegeben – im Anhang aufgeführt.
3.1
Gewinnung von Embryonalstadien (Morulae, Blastozysten) aus der temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Zygoten im Eileiter vom Rind
3.1.1 Verwendete Tiere und deren vorherige und anschließende Nutzung
Für die endoskopischen Versuche wurden Färsen der Rassen Holstein-Friesian und
Deutsche Schwarzbunte im Alter von 13 bis 25 Monaten für die Versuche verwendet. Die Tiere stammten aus der Herde des Instituts für Nutztiergenetik (FLI) Mariensee. Die Färsen wurden von Oktober bis April im Stall gehalten, sie erhielten neben freiem Zugang zu Wasser, Grassilage und ein Mineralergänzungsfutter; in den
Sommermonaten hatten sie Zugang zu Weide- und Auslaufflächen. Insgesamt wurden 47 Tiere in die Versuche eingebunden, davon wurden 25 Rinder für die Vorversuche, um die Technik der transvaginalen Endoskopie zu erlernen genutzt und 22 für
die Hauptversuche. Einige von ihnen wurden zu einem früheren Zeitpunkt bereits für
andere Versuche (OPU und transvaginal-endoskopische Eileiterspülung) herangezogen. Nach der Beendigung dieser Arbeit sind die Tiere belegt oder für weitere Versuchszwecke genutzt worden. Insgesamt haben 22 der Färsen, die in die Eileiterkulturversuche eingebunden waren, abgekalbt, 19 waren nach den Versuchen für diese
Arbeit regulär tragend, 3 sind in andere Versuche eingebunden und 3 sind geschlachtet worden.
3.1.2 Vorbereitung und Synchronisation der Empfängertiere
Färsen der oben genannten Rassen im Alter zwischen 13 und 25 Monaten (410 bis
460 kg Körpergewicht) wurden als Zwischenempfänger vorbereitet. Die Empfängertiere sind eingangs auf Allgemein- und Geschlechtsgesundheit untersucht worden.
52
Es erfolgte eine Aussonderung der Tiere mit Anomalitäten im Bereich der Geschlechtsorgane. Die Färsen wurden nach dem Ovsynch-Protokoll vorbereitet . Die
Synchronisation startete mit der Verabreichung von 0,02 mg GnRH intramuskulär
(Receptal®, Intervet, Oberschleissheim, Deutschland). Nach sieben Tagen erfolgte
die Verabreichung von 500 μg Cloprostenol (Estrumate®, Mallinckrodt Veterinary,
Burgwedel, Deutschland). Eine GnRH-Injektion (0,02 mg) 48 Stunden später beendete die Synchronisationsbehandlung. Die Ovulation sollte in den darauffolgenden 26
bis 40 Stunden stattfinden. Der Synchronisationserfolg (definiert als Brunst nach
Synchronisation), die Ovulationsseite und das Erscheinungsbild des Corpus
hämorrhagicum wurden während/kurz vor der transvaginalen Endoskopie bestimmt.
3.1.3 Generierung der In-vitro-Zygoten für den tubalen Transfer
Die Embryonen für die temporäre Kultur im homologen, nicht ligierten bovinen Eileiter wurden bis zum Zygotenstadium in vitro generiert. Hierzu sind Ovarien von einem
nahegelegenen Schlachthof gesammelt und in einem Thermogefäß mit physiologischer Kochsalzlösung bei ca. 25°C ins Labor transportiert worden. Die Gewinnung
der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) aus den Ovarien erfolgte mit Hilfe der
Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995). Dazu wurden die Ovarien mit einer
Arterienklemme in einer Petrischale fixiert. Die Schale war mit 25 °C warmer, modifizierter phosphatgepufferter Salzlösung [PBS+ Heparin (2 I.E./500mL) + 0,1% BSA]
gefüllt. Jedes Ovar wurde von beiden Seiten in Längsrichtung mit einem Mehrfachmesser, bestehend aus 6-8 parallel angeordneten Rasierklingen eingeschnitten und
anschließend mit PBS gespült. Die Flüssigkeit aus der Petrischale wurde zum Abtrennen der größeren Gewebepartikel durch ein Teesieb in ein Becherglas mit einem
Volumen von 600 ml gegossen. Anschließend erfolgte nach Sedimentation das Heraussuchen der KOK unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Je
nach Beschaffenheit des Cumulus oophorus und des Ooplasmas wurden die KOK in
Anlehnung an die unten verwendeten Beurteilungskriterien in fünf Qualitätsklassen
(Tabelle 3, BUNGARTZ et al. 1995) eingeteilt. Nur KOK der Kategorien 1 und 2 wurden für die IVP verwendet. Nach dreimaligem Waschen der KOK in TCM + BSA (0,1
53
%) wurden sie für 24 Stunden in mit Silikonöl überschichteten 100 μl großen Tropfen
TCM + BSA (0,1 %) + eCG (10 I.E.) + hCG (5 I.E.; Suigonan®, Intervet) in einem
Inkubator bei 39°C und 5 % CO₂ und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre gereift.
Zur In-vitro-Fertilisation der gereiften Oozyten wurde Tiefgefriersperma des IVFgetesteten Bullen Zauberer (414382, Nordrind 2002) eingesetzt. Um vitale von toten
Spermien zu trennen, erfolgte eine modifizierte Percoll-Gradientenzentrifugation
(PARRISH et al. 1995; SOMFAI et al. 2002). Nach Auftauen der Spermienportion im
Wasserbad bei 30°C für 30 Sekunden wurde der Percollgradient von 90% mit dem
aufgetauten Sperma überschichtet. Nach 16-minütiger Zentrifugation bei 380 x g
konnte der Überstand verworfen, das Spermienpellet mit Fert-TALP resuspendiert
und erneut zentrifugiert (3 Minuten bei 380 x g) werden. Nach diesem Schritt erfolgten wiederum ein Absaugen des Überstandes und eine weitere Resuspendierung
und Zentrifugation (3 Minuten bei 380g) der Spermien in HHE [Heparin (Serva),
Hypotaurin (Sigma), Epinephrine(Sigma)] + Fert-TALP. Die Befruchtung fand während einer Kokultur der gereiften Oozyten und der motilen Spermien in einer Endkonzentration von
Spermien/ml bei 39°C und 5% CO₂ in 100l Fert-TALP+HHE-
Drops statt. Nach 19-stündiger Inkubation wurde der Kumulus von den befruchteten
Eizellen durch Schütteln (Vortexing) in 37°C warmem TCM-air mechanisch entfernt
und unter dem Mikroskop nach Polkörpern gesucht. Zygoten guter Qualität (Ausbildung der Polkörper, homogenes Zytoplasma) wurden in 80µl TCM-air-Drops bis zum
Eileitertransfer gesammelt.
54
Tabelle 3: Klassifizierungsschema für unreife Oozyten (BUNGARTZ et al. 1995)
Kategorie 1
Homogenes dunkles Ooplasma, kompakt
angeordneter, durchgehend
drei-vierlagiger Cumulus oophorus
Homogenes dunkles Ooplasma, mindestens
eine durchgehende Lage von
Kumuluszellen
Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 und 2 oder davon
abweichend (heterogenes dunkles oder helles Zytoplasma oder homogenes
helles Zytoplasma), anhaftende Kumuluszellen
Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorie 1, 2 oder 3, keine
anhaftenden Kumuluszellen
Beschaffenheit des Ooplasmas wie Kategorie1 bis 3, deutliche
Auflockerung (Expandierung) der anhaftenden Kumuluszellen
Kategorie 2
Kategorie 3
Kategorie 4
Kategorie 5
3.1.4 Medien und Instrumente für den transvaginal-endoskopischen Embryonentransfer in den Eileiter des Rindes
Die in vitro generierten Zygoten wurden bei einer Temperatur von ca. 37°C in TCMair-Drops gesammelt und zusammen mit 100-150µl TCM-air-Lösung in eine Transferkapillare überführt. Für den transvaginal-endoskopischen Embryonentransfer in
den bovinen Eileiter wurden folgende Instrumente (Abb. 14-16) verwendet:
 Universalschaft mit Hahn zur Insufflation (STORZ 66016 EA, Ø
12,5mm, Länge 49,5cm)
 Stumpfer Obturator (STORZ 66016 EB, Ø 12,5 mm, Länge 49,5 cm)
 Obturator mit Dreikantspitze (STORZ 66016 ED, Ø 12,5 mm, Länge
49,5 cm)
 Innenschaft mit Arbeitskanal für Transferkatheter (STORZ 66016 B)
 Transferkapillare (Glas) für Embryonen (Modell Mariensee) mit aufgesetztem ca. 70 cm langen Kunststoffschlauch (Original-Perfusor, B.
Braun, Melsungen 8722960) und 1ml Einwegspritze
55
 HOPKINS Geradeausblick-Optik 0° (Ø 5,5 mm) mit eingebauter Fiberglas-Lichtleitung (STORZ 61015 A)
 KARL STORZ Endovision TELECAM DX, Farbsystem PAL (STORZ
69232001), bestehend aus:

400A Netzkabel

TELECAM C-Mount Kamerakopf (STORZ 20212034)

TELECAM DX Kamera-Kontrolleinheit (CCU; STORZ 20232020)

C-Mount Objektiv, einlegbar 30mm (STORZ 20200042)

BNC-Verbindungskabel (STORZ 536 MK)

S-VHS (Y/C)-Verbindungskabel (STORZ 547 S)

2 Verbindungskabel zur Ansteuerung von DVD/Video- Printern
oder -Recordern (STORZ 20221070)
 Kaltlicht-Fontäne HALOGEN 250twin (STORZ 20113301) bestehend
aus:

400A Netzkabel

Fiberglas-Lichtkabel (STORZ 69495 NA, Ø 3,5 mm)
 36 cm Farbmonitor (Panasonic WV-CM 1480)
 DVD-Recorder (Panasonic DMR-E 100)
Am Ende jeder Endoskopiesitzung wurden die Instrumente nach gründlicher Reinigung mit Wasser für mindestens 60 Minuten in eine 4%ige Desinfektionslösung
(Korsolex® plus, Bode Chemie, Hamburg) gelegt und anschließend mit H₂O bidest.
gespült.
56
Universalschaft
Stumpfer Obturator
Spitzer Obturator
Innenschaft
Endoskop
Abbildung 14: Übersicht der Instrumente
Universalschaft
Stumpfer Obturator
Spitzer Obturator
Innenschaft
Abbildung 15: Detailaufnahmen der Instrumente
Abbildung 5: Detailaufnahmen der Instumente
Abbildung 16: Bildgebende Geräte (Endoskopie-/Lichteinheit, Monitor, DVD-Recorder)
57
3.1.4.1 Herstellung der Embryotransferkapillare
Die Herstellung der Embryotransferkapillare erfolgte nach dem Vorbild für die Transferkapillare der Forschungsgruppe um Professor Urban Besenfelder aus Wien (Abb.
17).
Eine 50µl Kapillarpipette (BLAUBRAND® intraMARK, Brand, Wertheim) wurde mit
Hilfe eines Bunsenbrenners hirtenstabartig an der Vorderseite gebogen. Die scharfen
Ränder der Kapillarspitzen sind ebenfalls per Bunsenbrenner geglättet worden. Die
gebogene Spitze sollte das Inserieren in den Eileitertrichter erleichtern. Die ersten
Versuche wurden mit einer wie oben beschriebenen Kapillare durchgeführt, da diese
allerdings bei zu vielen Transfers (n=4) abbrach, wurde sie modifiziert.
Die Embryotransferkapillare Modell „Mariensee“ (Abb. 18) wird ebenfalls aus einer
50µl-Glaskapillarpipette hergestellt. Die Spitze, welche in den Eileiter eingefädelt
werden sollte, wurde mit einem Bunsenbrenner in einen ca. 90° Winkel gebogen.
Diese hakenartige Form erleichterte die Manipulation am Eileitertrichtereingang. Am
anderen Ende erfolgte eine Kürzung der Länge der Kapillare mit Hilfe eines Glasschneiders um etwa 3cm. Dadurch konnten die Hebelkräfte, die während des Inserierens in den Trichter entstehen, deutlich geringer gehalten werden. Die scharfen Kanten wurden per Bunsenbrenner geglättet, um eine Traumatisierung des Gewebes zu
vermeiden. Durch diese Modifikationen konnte die Häufigkeit des Abbrechens der
Transferkapillare auf null reduziert werden.
Abbildung 17: Transferkapillare Modell Besenfelder
58
Abbildung 18: Transferkapillare Modell Mariensee (modifiziert)
3.1.5 Transvaginaler Zugang zur Bauchhöhle und endoskopisch geleiteter
Embryonentransfer in den Eileiter des Rindes
Der transvaginal-endoskopische Embryotransfer in den bovinen, nicht ligierten Eileiter erfolgte jeweils 40-48 Stunden nach der letzten GnRH-Behandlung. Die Färsen
waren somit zyklussynchron zu dem Stadium der zu übertragenden Zygoten. Alle
Embryonen wurden unilateral auf die Seite transferiert, an der die Ovulationsstelle
am Ovar aufzufinden war.
Die Tiere wurden für den endoskopischen Eingriff für 12 Stunden nüchtern gehalten
und zum geplanten Transfertermin in einen Zwangsstand verbracht. Dort erhielten
sie zur Relaxierung des Enddarms und zur lokalen Schmerzausschaltung eine
Epiduralanästhesie mit 2,5-4 ml Procainhydrochlorid (Procasel 2 %®, Selectavet)
zwischen Kreuzbein und dem ersten Schwanzwirbel. Nach dem Einsetzen der Wirkung der epiduralen Anästhesie ist der Schwanz des Tieres zur Seite gebunden und
die Anogenitalregion trocken gereinigt worden. Anschließend wurde die Vulva mit
einem Schleimhaut- und Wundantiseptikum (Octenisept ®, Schülke & Mayr GmbH,
Norderstedt) desinfiziert.
Die im Folgenden beschriebenen transrektalen Manipulationen wurden mit der rechten Hand ausgeführt. Die Führung des Endoskops erfolgte zeitgleich mit der linken
Hand. Zusätzlich war die Anwesenheit einer Hilfsperson zum Anreichen der Instrumente, zum späteren Befüllen der Transferkapillare und zum Absetzen der Embryonen in den Eileiter notwendig.
59
Nach der manuellen Entleerung des Enddarms und Vorbereitung der Instrumente
(Abb. 19) führte der Assistent den Universalschaft mit dem stumpfen Obturator in die
Vagina des Tieres ein. Der Operateur schob das Instrument unter rektaler Kontrolle
bis zur Fornix vaginae vor und fixierte dieses ca. 3cm kaudal der Zervix im dorsalen
Scheidendach (Abb. 19). An dieser Stelle ist die Schleimhaut nur 3-4 mm dick und
lässt sich problemlos durchstoßen. Der Assistent tauschte dann den stumpfen gegen
einen traumatischen Obturator aus. Es folgte eine rektale Kontrolle der Umgebung
vor der Trokarspitze. Es sollte so ausgeschlossen werden, dass sich wichtige Organe (Arteria iliaca, Pansen, Blase, Niere, Rektum) im Bereich der Manipulation befinden. Die Spitze des Trokars wurde anschließend leicht nach kranioventral und rechts
geneigt und das Rektum mit der rektal eingeführten Hand leicht nach links gezogen.
Die Durchstoßung des Scheidendachs musste schnell und ruckartig erfolgen, da sich
bei einem langsamen Vorschieben des Trokars das Bauchfell großflächig von der
Bauchwand ablösen würde. Nach dem Entfernen des traumatischen Obturators aus
dem Universalschaft konnte ein deutliches Einströmen von Luft in die Bauchhöhle
vernommen werden. Dies stellte den Beweis für den korrekten Sitz des Universalschaftes in der Bauchhöhle dar. Das durch den Lufteinstrom erzeugte künstliche
Pneumoperitoneum schaffte zusätzlich einen größeren Arbeitsfreiraum für die endoskopischen Manipulationen.
Abbildung 19: Schematische Darstellung der transvaginalen Endoskopie
60
Der Assistent führte nun den Arbeitskanal mit Endoskop, Lichtquelle und aufgesetzten Kamerakopf in den Universalschaft ein. Die Ovarien wurden endoskopisch begutachtet und festgestellt, auf welcher Seite die Ovulation, ersichtlich durch das Corpus hämorrhagicum, stattgefunden hat (Abb. 20). Außerdem erfolgte eine Inaugenscheinnahme der Bauchhöhle, um eventuelle Verklebungen oder andere Anomalien
auszuschließen.
Abbildung 20: Endoskopische Übersicht Eileiter rechts Ovar
61
Arbeitskanal und Endoskop wurden wieder entfernt. Der Assistent und eine weitere
Hilfsperson befüllten nun die Embryotransferkapillare (Transferpettor Caps®, 100 200 μl, No. 701910, Brandt, Wertheim). Ein steriler Plastikschlauch (OriginalPerfusor, B. Braun, Melsungen 8722960) wurde in den Arbeitskanal des Endoskopes
eingelegt. Am vorderen Ende des Schlauches wurde die Transferkapillare, am hinteren eine 1ml Spritze befestigt (Abb. 21 und 22). Die Embryonen wurden mit Hilfe einer Mundpipette aufgenommen und über das vordere, gebogene Ende in die Transferkapillare überführt (Abb. 22 und 23). Eine dritte Person bedient die an die Kapillare
über den Schlauch angeschlossene Spritze und positionierte so die Zygoten zwischen zwei Luftblasen (Abb. 23).
Abbildung 21: Endoskop im Arbeitsschaft mit angeschlossener Transferkapillare und
1ml Einmalspritze
Abbildung 22: Befüllen der Transferkapillare
62
Abbildung 23: Zygoten positioniert zwischen zwei Luftblasen in der Transferkapillare
Anschließend wurde der Arbeitsschaft mit Endoskop und eingelegter, befüllter Transferkapillare wieder in den Universalschaft eingeführt. Auf das Okular des Endoskops
wurde die Kamera aufgesetzt und eine Lichtquelle mittels Lichtkabel angeschlossen.
Dies ermöglichte die Darstellung des endoskopischen Bildes auf dem Monitor bei
gleichzeitiger Aufnahme auf DVD. Der Operateur nahm das Ovar mit der Ovulationsstelle transrektal mit der Hand auf und führte es vor das Endoskop. Anschließend
wurde der Eierstock um ca. 180° über kranial zur Medianen gedreht, um einen Blick
auf den Eileiter zu erhalten. Der Übergang von Infundibulum zur Eileiterampulle wurde aufgesucht und so vor das Endoskop positioniert, dass die Öffnung des Trichters
gut mit der Transferkapillare erreichbar war (Abb. 20).
Danach erfolgte die Insertion der Kapillare mit den Embryonen in den Trichter. War
dies gelungen, konnte sie weiter in die Ampulle eingefädelt und dann ca. 3-5 cm tief
in den Eileiter vorgeschoben werden (Abb. 24). Dort wurden zwischen 20 und 50 Zygoten mit möglichst wenig (max. 150µl) TCM-air-Lösung abgesetzt.
Nach erfolgtem Transfer sind die Instrumente aus dem Arbeitsschaft entfernt worden.
Die zuvor eingeströmte Luft wurde vorsichtig per Vakuumleitung über den noch inserierten Universalschaft abgesaugt. Abschließend konnte dann auch der Schaft herausgezogen werden.
63
Die transferierten Stadien wurden nach 7 bis 8 Tagen mittels kombinierter EileiterUterusspülung zurückgewonnen.
Abbildung 24: Eileitertransfer von IVP-Zygoten
3.1.6 Medien und Instrumente für die kombinierte Eileiter-/Uterusspülung
Für die Eileiter- und Uterusspülung ist 37°C warme PBS-Lösung (Phosphate
Buffered Saline) mit einem Zusatz von 1 % NBCS (New Born Calf Serum) verwendet
worden. Die PBS-Lösung wurde jeweils kurz vor der geplanten Spülung angesetzt
und bis zu ihrem Gebrauch kühl gelagert. Die Zugabe des in Aliquots à 10 ml eingefrorenen NBCS erfolgte erst unmittelbar vor der Spülung.
Zur kombinierten Uterus-/Eileiterspülung wurde ein Uterusspülkatheter (Minitüb
19005/0016), welcher an eine Spülsystem-Pumpe (Fa. VETEC, Rostock) angeschlossen wurde (Abb. 25 und 26), verwendet. Die Spülung des Eileiters erfolgte
transvaginal-endoskopisch mit einer Spülkanüle (Modell Mariensee, Abb. 27), einem
daran angeschlossenen Kunststoffschlauch (Original-Perfusor, B. Braun, Melsungen
8722960) und einer 20ml Einwegspritze. Das genutzte Endoskopiesystem wurde bereits oben beschrieben.
64
Abbildung 25: Uterusspülkatheter mit geblocktem Ballon
Abbildung 26: Spülsystempumpe
Abbildung 27: Spülkanüle Modell "Mariensee"
3.1.7 Kombinierte Eileiter- und Uterusspülung zur Rückgewinnung der Embryonen
Nach 7-8-tägiger Kultur im bovinen Eileiter erfolgte die Rückgewinnung der transferierten Embryonen mittels kombinierter Eileiter-/Uterusspülung.
Die Färsen wurden genüchtert und in einen Zwangsstand verbracht. Es erfolgte eine
Epiduralanästhesie mit 2,5-4ml Procainhydrochlorid (Procasel 2 %®, Selectavet). Vor
65
Beginn der endoskopischen Eileiterspülung wurde in das Uterushorn (die Seite des
zu spülenden Eileiters) ein Uterusspülkatheter (Minitüb 19005/0016) eingelegt und
durch Aufblasen des Ballons in der Hornspitze fixiert (Abb. 25).
Der Zugang zur Bauchhöhle und die Endoskopietechnik erfolgten wie bereits in Kapitel 3.1.5 beschrieben. Die Eileiterspülkanüle wurde in das Infundibulum eingefädelt
und mindestens 3cm in das Ovidukt vorgeschoben. Für die Spülung sind 20ml körperwarme PBS-Lösung langsam, aber mit stetem Druck, in den Eileiter infundiert
worden. Der Eileiter blähte sich während der erfolgreichen Spülung sichtbar auf. Die
Spülflüssigkeit gelangte über die uterotubale Verbindung in die Spitze des Gebärmutterhorns. Direkt im Anschluss an die Eileiterspülung wurde das Uterushorn mittels
einer an den Spülkatheter angeschlossene Spülsystem-Pumpe (Fa. VETEC, Rostock, Abb. 26) mit 500ml PBS-Lösung (ca. 37° C) gespült. Die gewonnene Spülflüssigkeit ist durch einen Filter mit 50 μm großen Poren (Jürgens, Hannover) abgegossen und die im Filter sitzenden Embryonen anschließend in eine Petrischale überführt worden. Die Klassifizierung der gespülten Embryonen erfolgte unter einem Stereomikroskop (Nikon, Düsseldorf) bei 45facher Vergrößerung nach den Kriterien der
IETS (ROBERTSON u. NELSON 1998).
Alle gewonnenen Morulae und Blastozysten guter Qualität wurden einzeln in
silikonisierten 0,6ml Cups mit PBS + 0,1% PVA (Polyvinylalkohol, Sigma) bei -80°C
eingefroren.
3.2
Gewinnung
in
vivo
produzierter
Embryonalstadien
(Morulae,
Blastozysten) aus dem Uterus des Rindes
3.2.1 Vorbereitung der Tiere
Für die Gewinnung in vivo gereifter Embryonen wurden als Spendertiere Kühe und
Färsen der Rassen Holstein-Friesian und Deutsche Schwarzbunte aus der Herde
des Instituts für Nutztiergenetik (FLI) Mariensee verwendet.
66
Die Tiere sind von Oktober bis April im Stall und von April bis September auf der
Weide gehalten worden. Als Futter erhielten die Tiere Heu, Grassilage, Maissilage
und Mineralfutter, laktierende Tiere erhielten zusätzlich Kraftfutter. Wasser ad libitum
stand stets zur Verfügung.
Zwischen dem 10. und 12. Tag nach der letzten sichtbaren Brunst erfolgte bei den
Spendertieren eine intramuskuläre Injektion von 2500-3000 I.E. eCG (equine Chorion
Gonadotropin). Achtundvierzig Stunden danach erhielten sie eine weitere intramuskuläre Injektion von 2,5 ml PGF2α (Prostaglandin F2α) zur Luteolyse. Während der
superovulatorischen Brunst, nach weiteren 48 Stunden, wurden die Spendertiere
zweimal im Abstand von 12 Stunden mit Sperma des IVF-getesteten Bullen Zauberer
(414382, Nordrind 2002) künstlich besamt. Am Tag 7-8 nach der ersten Besamung
erfolgte die unblutige Spülung der uterinen Embryonalstadien.
3.2.2 Spülung der Uterushörner
Unter rektaler Kontrolle wurde ein vaginal eingeführter Uterusspülkatheter bis in die
Gebärmutterhornspitze vorgeschoben. Mittels eines aufblasbaren Ballons, der sich
an der Katheterspitze befindet, fixierte der Operateur den Spülkatheter in der Hornspitze. Danach konnte über eine Spülsystem-Pumpe die körperwarme PBS-Lösung
(+ NBCS) in die Uterushörner gepumpt und wieder abgesaugt werden. Im Anschluss
wurden die Embryonen, wie in Kapitel 3.1.7 bereits beschrieben, durch ein Sieb filtriert, unter einem Stereomikroskop herausgesucht, nach den Kriterien der IETS
(ROBERTSON u. NELSON 1998) klassifiziert und einzeln eingefroren.
3.3
In-vitro-Produktion von Rinderembryonen
Die In-vitro-Produktion von Rinderembryonen besteht aus den drei Schritten der
In-vitro-Reifung (IVM), In-vitro-Fertilisisation (IVF) und In-vitro-Kultivierung (IVC).
Die Eizellen wurden wie bereits in Kapitel 3.1.3 gewonnen, klassifiziert und maturiert.
Es erfolgte im Anschluss eine IVF.
67
Neunzehn Stunden nach der In-vitro-Fertilisation wurde der Kumulus der KOK durch
Schütteln (Vortexing) in körperwarmer TCM-air-Lösung mechanisch entfernt. Nach
dreimaligem Waschen der Embryonen in SOF (Synthetic Oviduct Fluid) erfolgte in
30µl-Tropfen SOF unter einer Silikonölüberschichtung die In-vitro-Kultur. Die Kultur
fand in einer sauerstoffreduzierten, feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre von 5% O₂ ,
5% CO₂ und 90% N₂ bei 39°C in modularen Inkubationskammern (ICN Biomedicals,
OH) statt. Die Embryonen wurden bis zum benötigten Entwicklungsstadium kultiviert,
gesammelt und in PBS mit 0,1% PVA (Polyvinyl-Alkohol) gewaschen. Anschließend
wurden sie einzeln eingefroren und bis zur weiteren Aufbereitung bei -80°C gelagert.
3.4
Morphologische Beurteilung der gewonnenen Embryonalstadien
Die Einteilung der gewonnenen Embryonen aus der In-vitro-/In-vivo-Produktion und
der temporären Eileiterkultur erfolgte anhand ihres Alters, der Morphologie und des
Entwicklungsstadiums (IETS-Standard). Die Definitionen der einzelnen Stadien sind
wie folgt:
Kompaktierte Morulae: Embryonen mit mehr als 16 Blastomeren, Zusammenschluss
der einzelnen Blastomeren zu einem kompakten Verband und vergrößertem
perivitellinen Raum. Gewonnen nach 5-6-tägiger IVC bzw. In-vivo-Spülung an Tag 67 oder 7-tägiger temporärer Eileiterkultur.
Blastozyste: Die Embryonen weisen deutliche Differenzierung zwischen äußerer
Trophoblastenschicht und dunklerer, kompakter, innerer Zellmasse auf. Deutliche
Blastozoelbildung, glatte Abgrenzung zum nur noch schmalen perivitellinen Raum.
Gewonnen nach 6-7-tägiger IVC bzw. In-vivo-Spülung an Tag 7-8 oder 7-8-tägiger
temporärer Eileiterkultur.
Expandierte Blastozyste: Embryonen mit deutlicher Blastozoelbildung und bei denen
die Zona pellucida dünner ist. Deutliche Unterscheidung in ICM (Inner Cell Mass)
und Trophoblasten, starke Ausdehnung des gesamten Embryos. Fast der gesamte
perivitelline Raum ist verschwunden. Gewonnen nach 7-8-tägiger IVC bzw. In-vivoSpülung an Tag 8 oder 8-tägiger temporärer Eileiterkultur.
68
Eine Beurteilung der Morulae und Blastozysten erfolgte anhand der Vorgaben der
IETS (ROBERTSON u. NELSON 1998). Nur exzellente und gute Embryonen (Klasse
I) wurden für die Genexpressionsanalye berücksichtigt. Demnach sind Embryonen
der Klasse I symmetrische und runde Embryonen mit in Größe, Farbe und Dichte
einheitlichen Blastomeren (Zellen). Diese Embryonen stimmen mit dem erwarteten
Entwicklungsstadium überein. Mindestens 85 % des zellulären Materials sollte intakt
und lebensfähig sein. Diese Einteilung sollte auf dem prozentualen Anteil der Embryonenzellen, gemessen an dem ausgeschleusten Material im perivitellinen Spalt,
bestimmt werden (Abb. 28).
Abbildung 28: Morphologie der Embryonen der drei Versuchsgruppen
69
3.5
Die
RT-qPCR zur quantitativen Analyse der Genexpression
Anwendung
der
Reversen
Transkription
(RT)
mit
folgender
Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Nachweis einer spezifischen mRNA ist heute
ein Routinewerkzeug in der Molekularbiologie. Die mRNA-Quantifizierung aus den
für diese Arbeit gewonnenen Embryonen erfolgte mittels RTq-PCR. Diese Technologie kombiniert die DNA-Vervielfältigung (PCR) mit der Detektion des Produktes in
einem Reaktionsgefäß vom Ansatz bis zur Auswertung nach vorheriger Umschreibung der RNA in cDNA. Durch das Wegfallen der Auswertung mittels AgaroseGelelektrophorese bietet diese Methode zusätzlich eine große Zeitersparnis.
In dieser Arbeit wurde mittels relativer mRNA-Quantifizierung die Genexpression der
Zielgene DNMT1, DNMT3a, SUV39H1, SLC2A3 (GLUT3) und SLC2A8 (GLUT8) auf
einen externen Standard (Kaninchen-Globin-mRNA) bezogen. Es erfolgten 15-18
Wiederholungen pro Gentranskript.
3.5.1 Isolierung der Messenger RNA
Die Isolierung der mRNA erfolgte aus einzeln eingefrorenen Embryonen der drei
Versuchsgruppen mittels Dynabeads® mRNA DIRECT Kits (Dynal, Oslo, Norwegen).
Embryonen des jeweils gleichen Entwicklungsstadiums der verschiedenen Herkünfte
wurden immer parallel aufbereitet.
Die tiefgefrorenen Embryonen wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit 40 μl
Lysispuffer lysiert. Zu Beginn dieses Schrittes wurde 2 µl (1 pg) Kaninchen-GlobinmRNA (MWG Biotech) als externer Standard hinzupipettiert. Jeder Probe wurden
dann 4 µl Dynabeads oligo (dT)25 hinzugefügt. Die Dynabeads wurden zuvor zweimal mit 40 μl Lysispuffer gewaschen und auf Eis gelagert. Die Bindung der magnetischen Dynabeads an die Poly-(A)-Sequenzen am 3‟-Ende der mRNA der Embryonen
erfolgte bei Raumtemperatur durch 10 minütiges leichtes Schütteln in einem Thermomixer.
Die Trennung der Beads vom Lysispuffer erfolgte in einem Dynal MPC-E-1 Magnetständer. Die Dynabeads mit der RNA wurden mit Hilfe des Magneten an der Rück-
70
wand der Eppendorfcups fixiert und der Puffer konnte abpipettiert werden. Anschließend wurde in gleicher Weise einmal mit Waschpuffer A und zweimal mit Waschpuffer B gewaschen.
Nach den Waschschritten wurden 11,0 μl steriles Wasser (Millipore®) zu den
Dynabeads gegeben. Die Trennung der RNA von den Beads erfolgte dann bei 65°C
für 2,5 min im Biometra PCR-Thermocycler. Im Anschluss an diesen Prozess kamen
die Proben sofort in einen auf Eis gelagerten Magnetständer. Der Überstand mit der
RNA wurde abpipettiert und unverzüglich für die Reverse Transkription (RT) verwendet.
3.5.2 Reverse Transkription (RT, cDNA Synthese)
Die Reverse Transkription erfolgte in einem Reaktionsvolumen von 20 μl. Die
Poly(A)⁺ RNA aus den Embryonen wurde in komplementäre DNA (cDNA) durch das
Enzym Reverse Transkriptase umgeschrieben. Negativkontrollen sollten Kontaminationen
ausschließen.
Diese
enthielten
anstelle
der
Proben-mRNA
Wasser
(Millipore®).
Die Präparation des Mastermixes (Tabelle 4) erfolgte für alle zu untersuchenden
Proben gemeinsam. Damit werden Pipettierfehler vermieden und die Genauigkeit
des Reaktionsansatzes erhöht. Nach Zugabe von jeweils 11 µl Wasser für die Negativkontrolle und 11 µl RNA aus der vorangegangenen RNA-Isolierung zu den mit
Mastermix befüllten 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäße (No. 710920, Biozym Diagnostic
GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland) erfolgte die Reverse Transkription in einem
Thermocycler (PTC-200, MJ Research, Watertown, MA).
Bei folgendem Temperaturprogramm wurde die Reverse Transkription durchgeführt:
10 Minuten bei 25°C
60 Minuten bei 42°C
(Reverse Transkription der mRNA in cDNA)
05 Minuten bei 99°C
(Denaturierung der Enzyme)
unendlich bei 4°C
(Endtemperatur)
71
Die cDNA wurde bei -20°C bis zur quantitativen Auswertung gelagert.
Tabelle 4: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches (Mastermix) für die RT
Komponenten
Einfache Menge Endkonzentration
10x PCR Puffer
2 μl
1x
MgCl₂ (50 mM)
2 μl
5 mM
dNTPs (10 mM)
2 μl
1 mM
Hexamer Primer (50 μM)
1 μl
2,5 μM
RNase-Inhibitor (20 Units/μl)
1 μl
20 Units
Reverse Transcriptase (50 Units/µl) 1 µl
50 Units
3.5.3 Farbstoff und PCR-Zyklus
Für die Detektion und Quantifizierung der PCR-Produkte wurde der DNA-Farbstoff
SYBR Green® verwendet. SYBR Green ist ein Cyanin-Farbstoff, der zum Nachweis
von doppelsträngiger DNA genutzt wird. Durch Bindung an die DNA entstehen DNAFluoreszenzfarbstoff-Komplexe, die blaues Licht bei einer Wellenlänge λmax = 494 nm
absorbieren und grünes Licht bei λmax = 521 nm emittieren. Durch die geringe Spezifität des Farbstoffes kann zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden. Es kann im Anschluss an die PCR allerdings eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden. Diese bestimmt die Fragmentlängen und ist somit spezifisch
für die einzelnen PCR-Produkte. Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird. Bei einer für
das Fragment spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der Doppelstrang und
SYBR Green® wird freigesetzt. Doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-
72
Produkten hat einen höheren Schmelzpunkt als z.B. unspezifisch entstehende
Primerdimere, somit ist eine Unterscheidung der Produkte möglich.
Das Prinzip der Polymerase Kettenreaktion (PCR) beruht auf der Amplifizierung einer
DNA-Vorlage (Template) mit Hilfe der hitzestabilen Taq-Polymerase, wobei ein Zyklus von drei Reaktionsschritten bis zu 40mal durchlaufen wird.
Die Initialisierung des PCR-Zyklus startet mit der thermischen Denaturierung des
Doppelstrangs bei 95°C. Danach erfolgt die Primer-Hybridisierung an die
einzelsträngige DNA. Die Annealingtemperatur ist je nach Primer unterschiedlich. Die
für die vorliegende Arbeit verwendeten Primerpaare und die dazugehörige
Annealingtemperatur sind in Tabelle 6 aufgeführt.
In der nun folgenden Elongationsphase, also die Amplifikation des zwischen den
Primern liegenden Sequenzabschnittes,
füllt die DNA-Polymerase die fehlenden
Stränge mit freien Nukleotiden auf. Dieser Schritt erfolgt bei 72°C.
Die RTq-PCR für diese Arbeit wurden mit dem Gerät 7500 Fast Real-Time PCR System von Applied Biosystems durchgeführt. Der verwendete PCR-Ansatz Power
SYBR Green PCR Master Mix (2x; P/N: 4367659, Applied Biosystems) enthält eine
Hot Start Taq-Polymerase, dNTP´s, SYBR Green und Rox Farbstoff. Die Real-Time
PCR wurde in einem Endvolumen von 20µl in 0,2ml 96-well Platten durchgeführt
(Tabelle 5).
Tabelle 5: Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes
Template
2 µl cDNA (entspricht 0,1 Embryoäquivalent)
Upper Primer (5µM)
0,8 µl
Lower Primer (5µM)
0,8 µl
Power SYBR Green MasterMix (2x)
0,8 µl
Steriles Wasser
6,4 µl
73
Verwendetes PCR-Programm:
95 °C 10 min.
Aktivierung der Taq-Polymerase
95 °C 15 sek.
Denaturierung
60°C 60 sek.
Elongation und Fluoreszenzmessung
Zyklenzahl:
40
Tabelle 6: Verwendete Primerpaare und die dazugehörige Annealingtemperatur
Gene
Primersequenzen 5´-3´
Position in der mRNA Sequenz
Anzahl
Zyklen
Anlagerungstemperatur
der Primer
°C
DNMT1
5´primer: (3997-4015)
GGAGCCGTTGCATGTGTTC
3´primer: (4070-4090)
CGAGCTCAACCTGGTGATGTT
40
60
94
0,1
BC114063
DNMT3a
5´primer: (2162-2185)
ACTATACCGACGTCTCCAACAT
GA
3´primer: (2201-2218)
ACCGGCCCAGCAGTCTCT
40
60
57
0,1
XM_001252215
SUV39H1
5´primer: (1057-1074)
GCCCCGCATTGCTTTCTT
3´primer: (1142-1161)
ATGCGTGTGCTCTCCATGTC
40
60
105
0,1
NM_001046264
SLC2A8
5´primer: (1441-1461)
GCATCTTCGGTGTCCTTTTCA
3´primer: (1501-1521)
CAAAATGGGCTGTGATTTGCT
40
60
80
0,1
AY208940
SLC2A3
5´primer: (127-149)
GTTGCTACCATAGGCTCTTTCCA
3´primer: (173-192)
GATCGCCTCAGGAGCATTGA
40
60
65
0,1
AY033938
Globin
5´primer: (241-260)
GCA GCC ACG GTG GCG AGT
AT
3´primer: (555-657)
GTG GGA CAG GAG CTT GAA
AT
40
60
256
100fg
X04751
74
Größe des
Amplifikats
bp
Embryonen
Äquivalent
Datenbank Nr.
der
mRNA Sequenz
3.5.4 Detektion, Quantifizierung und Auswertung
Die Effizienz ist abhängig vom Primerpaar und der amplifizierten Sequenz und muss
für jedes Primerpaar mit Hilfe einer Standardkurve bestimmt werden. Die Effizienzen
der hier verwendeten Primerpaare lagen in dem Bereich von 86-94% (Faktor 1,71,9). Ideal wäre eine Verdoppelung der Transkripte nach jedem Zyklus (Faktor 2).
Für die Standardkurve wurde mRNA aus einem Pool von 60 Blastozysten präpariert
und in cDNA umgeschrieben. Die cDNA wurde verdünnt auf eine relative Konzentration von 0,25 Blastozystenäquivalent/µl, aliquotiert und bei -20°C gelagert. Pro PCRVersuchstag wurde daraus eine Verdünnungsreihe mit dem Faktor 5 und 4 Verdünnungsstufen erstellt (0,5 Bla, 0,1 Bla, 0,02 Bla, 0,004 Bla). Die Auswertung der PCRLäufe wurden mit der 7500 Fast System SDS Software V1.4.0 durchgeführt und die
Ct–Werte (Threshold cycle) der Embryonen (Morulae und Blastozysten) der verschiedenen Herkünfte unter der Verwendung der Verdünnungsreihe in relative Units
umgerechnet. So konnten sie nach der Normalisierung mit den Werten für den externen Standard (Kaninchen Globin mRNA) zueinander ins Verhältnis gesetzt werden.
Die Daten (relativen Units) für die untersuchten Gene und die jeweils dazugehörigen
Globin-Werte wurden dafür in eine Exceltabelle überführt. Für die Normalisierung
der Daten wurden die relativen Units für das jeweilige Gen dividiert durch die relative
Unit des dazugehörigen Globin Wertes. Zusätzlich wurde die Schmelzkurve bestimmt. Während der Optimierung der Primer wurden die PCR-Fragmente zusätzlich
noch in einem 4%igen Agarosegel (Abb. 29) elektophoretisch aufgetrennt, um die
Fragmentgrößen zu kontrollieren.
DNMT1
DNMT3a
GLUT3
GLUT8
SUV39H1
Globin
Abbildung 29: DNA Größenmarker 20bp DNA Ladder (Fermentas)
75
3.6
Statistische Analyse
Die statistische Auswertung der durchgeführten Versuche erfolgte mit Hilfe der
SigmaStat 2.0 Computersoftware (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Zunächst wurden alle Daten eines Gens auf eine Normalverteilung mittels des KolmogorovSmirnov Tests getestet und anschließend wurde eine Varianzanalyse mit dem
Levene Median Test durchgeführt.
Im Anschluss daran wurde eine Two way ANOVA für jedes Gen (DNMT1, DNMT3a,
SLC2A3, SLC2A8, SUV39H1) mit den zwei Faktoren Herkunft (In-vivo-, In-vitro-,
temporäre In-vivo-Kultur) und Entwicklungsstadium (Morulae, Blastozysten) und ihren Interaktionen gefolgt von einem Tukey-Test durchgeführt. Die relative
Transkriptmenge wurde als x ±SEM dargestellt und Unterschiede P≤ 0,05 als statistisch signifikant aufgeführt.
3.7
Allgemeiner Versuchsaufbau
In der vorliegenden Arbeit verteilen sich die die experimentellen Untersuchungen auf
zwei übergeordnete Gebiete:
•
Produktion von bovinen Morulae und Blastozysten aus verschiedenen Herkünften;
1. „Reine“ IVP-Embryonen
2. Embryonen aus der In-vivo-Produktion
3. Embryonen (nach IVM/IVF) aus einer temporären Kultur im homologen Eileiter des Rindes
•
Expressionsanalysen der beim Rind entwicklungsrelevanten Transkripte des
DNMT1-, DNMT3a-, SUV39H1-, SLC2A3- und SLC2A8-Gens bei den Embryonen der verschiedenen Herkünfte (Abb. 30). Fünfzehn bis 18 Wiederholungen pro Gentranskript.
76
Abbildung 30: Schematischer Überblick über die Versuchsanordnung
77
4
Ergebnisse
4.1
Erstellung der In-vitro-Embryonen
Die für die Versuche verwendeten In-vitro-Embryonen wurden im Labor des Instituts
für Nutztiergenetik (FLI) in Mariensee routinemäßig zwei- bis dreimal pro Woche erstellt. Hierbei lag die durchschnittliche Teilungsrate an Tag 3 bei 78,6%±9,2%. Die
Entwicklungsrate bis zur Blastozyste betrug im Durchschnitt 31,1%±4,3%.
4.2
Gewinnung der in vivo produzierten Embryonen
Uterine Embryonalstadien vom 16-Zeller bis zur expandierten Blastozyste wurden
routinemäßig im Versuchsstall des Instituts unblutig per Uterusspülung gewonnen.
4.3
Erstellung und Rückgewinnung der Embryonen aus der temporären Eileiterkultur
Die Gewinnung der Embryonen aus der temporären In-vivo-Kultur erfolgte mittels
transvaginal-endoskopisch geleiteten Transfer von in vitro erzeugten Zygoten in den
Eileiter zyklussynchroner Rinder. Nach 7-8 tägiger Kultur im Eileiter wurden die Embryonen mittels einer kombinierten Eileiter-/Uterusspülung zurückgewonnen.
Bei den 22 transvaginal-endoskopisch durchgeführten Embryotransfers in die Eileiter
von zyklussynchronen Rindern sind 640 in vitro erzeugte Zygoten übertragen worden.
Nach
der
In-vivo-Kultur
konnten
381
Stadien
mittels
kombinierter
Eileiter-/Uterusspülung zurückgewonnen werden. Diese verteilten sich wie folgt:
78
Tabelle 7: Verteilung der Embryonalstadien nach Eileiterkultur
Stadium:
Anzahl / %
Blastozysten
39 / 10,3
Morulae
35 / 9,2
degenerierte 16-Zeller
36 / 9,4
degenerierte 8-Zeller
44 / 11,6
degenerierte 4-Zeller
55 / 14,4
degenerierte 2-Zeller
42 / 11,0
degeneriert (Stadium nicht er-
130 / 34,1
kennbar) UFO o. leere Zona
Gesamtstadien:
381 / 100
Insgesamt lag die Wiederfindungsrate (Anzahl der übertragenen Zygoten zu den
wiedergefundenen Stadien) bei 59,9% (Tabelle 7). Die einzelnen Wiederfindungsraten schwankten zwischen 0 und 100% (Abb. 31). Eine zusammenfassende Darstellung aller erspülten Stadien ist in Abbildung 32 zu sehen.
Wiederfindungsraten bei 22 Spülungen
Wiederfindungsraten
7
6
4
3
2
0% bis ≤20%
>20% bis ≤40%
>40% bis ≤60%
>60% bis ≤80%
Abbildung 31: Verteilung der Wiederfindungsraten
79
>80% bis ≤100%
Die Teilungsrate lag bei 80,6% (307/381) und die Entwicklungsrate zu Morulae und
Blastozysten bei 19,4% (74/381). In den 22 transvaginal-endoskopisch geleiteten
Embryonentransfers wurden im Schnitt 29,1 IVF-Zygoten übertragen, davon konnten
durchschnittlich 17,3 Stadien zurückgewonnen werden, von denen sich 3,4 bis zur
Morula oder Blastozyste entwickelt hatten. Von den 35 gewonnenen Morulae sind 29
Morulae guter Qualität (siehe Kapitel 3.4) eingefroren worden, von den 39 gewonnenen Blastozysten sind 31 Blastozysten guter Qualität (siehe Kapitel 3.4) für die
mRNA-Expressionsmusteranalyse eingefroren worden.
50
45
40
35
Blastozysten
30
Morulae
25
16-Zeller
20
8-Zeller
4-Zeller
15
2-Zeller
10
Deg.
5
0
Abbildung 32: Verteilung der erspülten Stadien auf die einzelnen Transfers
Komplikationen, die bei den Transfers auftraten, waren zum Teil auf Seite der Synchronisation zu finden (Ausbleiben der Ovulation), aber auch Verwachsungen im Bereich der Ovarien traten auf, wodurch der Manipulationsspielraum sehr klein wurde,
80
so dass ein erfolgreiches, tiefes Inserieren der Transferkapillare in den Eileiter nicht
möglich war. Einige Färsen besaßen im Ampullenbereich sehr stark gewundene Eileiter, so dass die Embryotransferkapillare ebenfalls nicht weit genug in den Eileiter
inseriert werden konnte und so die Zygoten durch Rückfluss in die Bauchhöhle verloren gingen. In diesen Fällen kam es gelegentlich (n=4) zu einem Abbrechen der gläsernen Kapillare und zum Verlust aller zu übertragenen Embryonen. Durch die Modifikationen an der Embryotransferkapillare konnte ein Abbrechen verhindert werden.
In seltenen Fällen war keine ausreichende Wirkung der Epiduralanästhesie vorhanden (n=2), wodurch die Manipulation stark erschwert wurde.
4.4
Vergleichende Darstellung der mRNA-Expression aus den Embryonen der
drei Versuchsgruppen
Bei den gewonnenen Embryonen (Morulae/Blastozysten) aus den drei verschiedenen Herkünften ist die relative Menge entwicklungsrelevanter Gentranskripte analysiert worden. Hierzu wurden zwei DNA-Methyltransferasen DNMT1 und DNMT3a,
eine Histon-Methyltransferase SUV39H1 und zwei Glukosetransporter SLC2A3
(GLUT3) und SLC2A8 (GLUT8) ausgewählt. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss der Herkunft (In-vivo-/Eileiterkultur/In-vitro-) der Embryonen auf die relative Häufigkeit der mRNA-Expression von DNMT1, DNMT3a, SUV39H1, SLC2A3 und
SLC2A8. In vivo kultivierte und in vivo gewonnene Embryonen wiesen ein ähnliches
Transkriptionsmuster für die untersuchten Gene auf und unterschieden sich signifikant von den in vitro produzierter Embryonen.
Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Qualität der generierten Embryonen maßgeblich durch die Kulturbedingungen beeinflusst wird.
Die im Folgenden als Morulae bezeichneten Stadien sind kompaktierte Morulae
(MO), die als Blastozysten bezeichneten Stadien sind expandierte Blastozysten
(BLA).
81
4.4.1 DNMT1
Für die relative Transkriptmenge an DNMT1 konnte ein signifikanter Unterschied (P≤
0,05) zwischen in vivo und in vitro erzeugten Morulae und in vivo und in vitro produzierten Blastozysten nachgewiesen werden. Ebenfalls fielen signifikante Unterschiede (P≤ 0,05) im Expressionsmuster von DNMT1 zwischen den Morulae aus der temporären Eileiterkultur und in vitro erzeugten Morulae und Eileiterkulturblastozysten
und in vitro erzeugten Blastozysten auf. Im Vergleich der relativen Transkriptmengen
von DNMT1 in den jeweiligen Stadien (Morulae/Blastozysten) aus der temporären
Eileiterkultur und In-vivo-Produktion zeigten sich keine signifikanten Unterschiede
(Abb. 33).
Relative Transkriptmenge DNMT1
1,6
b
b
1,4
1,2
1
in vivo
0,8
a
0,6
0,4
temporär
in vitro
a
a
a
0,2
0
MO
BLA
Abbildung
33:
Relative
Transkriptmenge
von
DNMT1
(MO=Morulae,
BLA=Blastozysten) in in vivo, in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der
temporären Eileiterkultur (a:b p≤ 0,05; ± SEM)
4.4.2 DNMT3a
Bei der relativen Transkriptmenge für DNMT3a fielen signifikante Unterschiede (P≤
0,05) im Expressionsmuster der in vivo und in vitro gewonnenen Morulae und bei
82
den Blastozysten der zwei Gruppen (in vivo/in vitro; Abb. 34) auf. Ebenfalls signifikant waren die Unterschiede bei der m-RNA der Morulae (temporär/in vitro; 0,21 ±
0,03 vs. 0,10 ± 0,02) und Blastozysten (temporär/in vitro; aus der temporären Eileiter
im Vergleich zu den in vitro generierten. Im Vergleich der relativen Transkriptmengen
von DNMT3a in den jeweiligen Stadien (Morulae/Blastozysten) aus der temporären
Eileiterkultur und In-vivo-Produktion zeigten sich keine signifikanten Unterschiede.
Relative Transkriptmenge DNMT3a
1,2
b
1
0,8
a
0,6
in vivo
temporär
a
in vitro
0,4
a
a
0,2
b
0
MO
BLA
Abbildung 34: Relative Transkriptmenge von DNMT3a in in vivo, in vitro generierten
Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur (a:b p≤ 0,05; ± SEM)
83
4.4.3 SUV39H1
Die relativen Transkriptgehalte von SUV39H1 unterschieden in den Stadien der drei
verschiedenen Herkünfte (Abb. 35) signifikant (P≤ 0,05) voneinander. So zeigten sich
sowohl signifikante Unterschiede zwischen den Morulae in vivo und in vitro als auch
bei
den
Blastozysten
dieser
beiden
Herkünfte.
Die
Unterschiede
der
Transkriptmenge zwischen Morulae aus temporärer Eileiterkultur zu in vitro generierten unterschieden sich signifikant, ebenso verhielt es sich bei den Blastozysten dieser Herkünfte. Die relative Menge der Gentranskripte von SUV39H1 in den Morulae
und Blastozysten aus temporärer Eileiterkultur und in vivo war nicht signifikant unterschiedlich.
1,6
b
Relative Transkriptmenge SUV39H1
1,4
1,2
1
in vivo
b
0,8
temporär
in vitro
0,6
a
0,4
a
a
a
0,2
0
MO
BLA
Abbildung 35: Relative Transkriptmenge von SUV39H1 in in vivo, in vitro generierten
Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur (a:b p≤ 0,05; ± SEM )
4.4.4 SLC2A3 (GLUT3)
Auch für die relative Menge der Gentranskripte von SLC2A3 (Abb. 36) konnten signifikante Unterschiede in in vivo und in vitro Morulae und in vivo und in vitro
Blastozysten festgestellt werden. Ebenso signifikant unterschieden sich die Morulae
und Blastozysten aus der temporären Eileiterkultur und in vitro generierte Stadien
84
voneinander. Morulae und Blastozysten aus temporärer Eileiterkultur und in vivo unterschieden sich nicht signifikant in der Menge der exprimierten Transkripte für
SCL2A3.
1
b
Relative Transkriptmenge SLC2A3
0,9
0,8
0,7
0,6
in vivo
0,5
temporär
0,4
b
in vitro
a
0,3
0,2
a
a
a
0,1
0
MO
BLA
Abbildung 36: Relative Transkriptmenge von SLC2A3 (GLUT3) in in vivo, in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur (a:b p≤ 0,05; ±
SEM)
85
4.4.5 SLC2A8 (GLUT8)
Abbildung 37 zeigt die relative Transkriptmenge von SCL2A8. Für dieses Gen konnten signifikante Unterschiede bei in vivo und in vitro generierten Morulae und
Blastozysten aufgezeigt werden. Morulae und Blastozysten aus der IVP unterschieden sich in ihrer SLC2A8-Expression signifikant zu denen aus In-vivo-Produktion
bzw. Eileiterkultur.
1,8
b
Relative Transkriptmenge SLC2A8
1,6
1,4
b
1,2
in vivo
1
temporär
0,8
0,6
a
a
a
in vitro
a
0,4
0,2
0
MO
BLA
Abbildung 37: Relative Transkriptmenge von SLC2A8 (GLUT8) in in vivo, in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur (a:b p≤ 0,05; ±
SEM)
86
5
Diskussion
In vitro produzierte Embryonen unterscheiden sich immer noch deutlich von in vivo
gewonnenen Embryonen (FARIN u. FARIN, 1995; THOMPSON 1997; HOLM et al.
2002). Außer morphologischen und biochemischen Unterschieden (GREVE et al.
1995; KHURANA u. NIEMANN 2000b) fallen auch Unterschiede auf molekularer
Ebene auf (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; LONERGAN et al. 2001; NIEMANN et
al. 2002; WRENZYCKI et al. 2005b). Somit kann mit Hilfe des Expressionsmusters
entwicklungsrelevanter Gene die Qualität von Embryonen aus IVP und nach sNT
objektiver und besser evaluiert werden. Genexpressionsmuster der in vivo gewonnenen Embryonen dienen hierbei als „physiologischer Standard“ (WRENZYCKI 2007).
Assistierte Reproduktionstechniken, wie z.B. die IVM von Oozyten, Superovulation,
IVF/ICSI und die IVC greifen in äußerst sensitive Phasen der Entwicklung ein. In diesen Phasen wird das Genom reprogrammiert und ist besonders anfällig für epigenetische Störungen. Die Störung dieses zeitlich und räumlich hochkoordinierten Prozesses stellte eine wichtige Ursache für den hohen Verlust von Embryonen bzw.
Trächtigkeiten und abnormaler Phänotypen nach Übertragung von IVP-Embryonen
dar. Die Nutzung assistierter Reproduktionstechniken scheinen die Schwere und
Häufigkeit von Reprogrammierungsstörungen zu verstärken (HAAF 2006).
Die In-vivo-Embryonen für diese Arbeit wurden nach Superovulation gewonnen. Ein
möglicher nachteiliger Einfluss durch die vorangegangene Superovulation des Spendertieres ist vorstellbar. So wurde für Maus und Hamster nachgewiesen, dass durch
Superovulation erzeugte Embryonen eine gestörte Entwicklung aufweisen können
(ERTZEID u. STORENG 2001). Für das Rind wurde festgestellt, dass Embryonen
gewonnen nach Superovulation eine abweichende Genexpression im Vergleich zu
Embryonen haben, die ohne hormonelle Stimulation des Spendertieres gewonnen
wurden. Diese Studie wirft die Frage auf, ob In-vivo-Embryonen, gewonnen nach
Superovulation, der Standard für vergleichende Genexpressionsstudien sein sollten
(MUNDIM et al. 2009).
87
Gegenüber der Embryogewinnung aus Superovulation ermöglicht die In-vitroTechnik die Produktion einer noch höhreren Anzahl von Embryonen. Andererseits
weist die IVP Grenzen auf, die durch deutliche qualitative Mängel der Embryonen
gekennzeichnet sind und sich auf den Embryo, den Fetus, die Plazenta und das geborene Kalb (LOS) auswirken. In erster Linie wird nach Embryotransfer von In-vitroEmbryonen und stärker noch bei Embryonen aus somatischen Klonen vermehrt ein
Syndrom fetaler Anomalien beobachtet, das häufig mit einem embryonalen und fetalen Überwuchs einhergeht. Daher wird es als Large Offspring Syndrome (LOS;
WALKER et al. 1996; YOUNG et al. 1998; FARIN et al. 2006) bezeichnet. Die genaue Pathogenese dieses Syndroms ist noch weitestgehend unklar. Offensichtlich
spielen in dessen Ätiologie Störungen der epigenetischen Reprogrammierung des
Genoms während der frühembryonalen Phase eine erhebliche Rolle. Die Skelettmuskulatur ist abnormal entwickelt, Plazenta und Plazentagefäße sind verändert,
Störungen im Metabolismus und Störungen in physiologischen und genetischen Mechanismen (Polyploidie, Methylierung der DNA, Untergang von Zellen des Embryos,
Embryotod, Funktionsstörungen zu späterem Zeitpunkt mit Abort bzw. Todesfolge
etc.) treten vermehrt auf. Derzeitige Erklärungsmodelle gehen daher von einer Störung der frühembryonalen Demethylierungs- bzw. Methylierungsvorgänge als einer
wichtigen Ursache des LOS aus (KANG et al. 2001; WILMUT et al. 2002;
HIENDLEDER et al. 2006; FARIN et al. 2006).
Im Unterschied zur Blastozystenrate, die durch die Sperma- und Eizellqualität festgelegt ist, wird die Beeinflussung der Blastozystenqualität vornehmlich durch die Kultur
gesehen (RIZOS et al. 2002). Aus diesem Grund wurde die In-vivo-Kultur von
IVM/IVF Embryonen schon zu Beginn der IVP-Entwicklung erfolgreich eingesetzt,
indem chirurgischer Zugang zu Rinder-, Schaf- und Kanincheneileiter geschaffen
wurde. Auf diese Weise wurden bislang über 25.000 transfertaugliche Embryonen
guter Qualität gewonnen (HAVLICEK et al. 2010).
Neueste Arbeiten konzentrieren sich auf eine optimierte Embryonenproduktion, die
eine maximale Entwicklungsdauer im Rind (In-vivo-Kultur) mit den Vorteilen der In
vitro-Produktion kombiniert (HAVLICEK et al. 2010).
88
Bislang sind vergleichende Studien zur mRNA-Expression nur zwischen in vivo und
in vitro produzierten Embryonen (nach IVP und/oder sNT), bzw. zwischen in vitro
produzierten Embryonen und Embryonen aus Eileiterkulturen im heterologen Eileiter
(Kaninchen, Schaf) oder nach Organkultur (isolierter Mäuseeileiter) durchgeführt
worden (Tabelle 2). Auch wenn eine Eileiterkultur im heterologen Ovidukt Embryonen
guter Qualität hervorbrachte, sind sie den komplett in vivo generierten Embryonen
bezüglich ihrer Genexpression nicht gleich zu setzen, da nur die physiologische Umgebung des präimplantatorischen Embryos optimale Voraussetzungen für seine weitere Entwicklung bietet (BAVISTER 1995; LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al.
2003c; WRENZYCKI et al. 2005b). HAVLICEK et al. zeigten 2010 bereits mit ihrer
Studie auf, dass Blastozysten aus der In-vivo-Kultur im homologen, nicht ligiertem
Eileiter des Rindes bezüglich der Kryokonservierbarkeit ein ähnliches Verhalten zeigten wie Blastozysten aus der reinen In-vivo-Produktion. Je länger die In-vivo-Kultur
nach IVF erfolgte, desto bessere Qualität erlangten die getesteten Embryonen
(HAVLICEK et al. 2010).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, Embryonen aus einer Eileiterkultur im
homologen, nicht ligierten Eileiter mit Embryonen aus der IVP und in vivo gewonnenen Embryonen bezüglich ihrer Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene zu
vergleichen, um so weitere Qualitätsunterschiede aufzuführen. Die DNA- und HistonMethyltransferasen
wurden
ausgewählt,
da
sie
bei
der
epigenetischen
Reprogrammierung des Genoms während der frühen Embryonalentwicklung eine
bedeutende Rolle spielen (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003). Die Glukosetransporter
sind essentiell für den Stoffwechsel des präimplantatorischen Embryos und somit
auch Markergene für dessen korrekte Entwicklung.
2011 konnte in einer Studie vom KUZMAMY et al. aufgezeigt werden, dass die Kulturbedingungen (IVP, Eileiterkultur, In-Vivo-Produktion) keinen signifikanten Einfluss
auf das Expressionsmuster von ausgewählten Genen vor dem Einfrieren der Embryonen hatten. Es wurden entwicklungsrelevante Gene, unter anderem auch
DNMT1A und SLC2A3, ausgewählt und mittels RT-qPCR analysiert. Die Embryonen
für die Genanalyse wurden in Pools, vor und nach Kryokonservierung, untersucht.
89
Nach dem Auftauen konnten signifikant höhrere Transkriptlevel für die Gene (OCC,
DSC2, BAX) in Blastozysten aus der IVP und In-vivo-Produktion nachgewiesen werden. SLC2A3 war in der In-vitro-Gruppe ebenfalls signifikant erhöht (KUZMANY et al.
2011).
5.1
Transvaginale Endoskopie und Eileiterkultur
Die transvaginale Endoskopie mit dem daraus resultierenden Zugang zum Eileiter
stellt eine Technik dar, um sowohl frühe tubale Embryonalstadien gewinnen zu können (HAVLICEK et al. 1999; BESENFELDER et al. 2001) als auch Rinderembryonen
aus der IVP in vivo, im homologen Eileiter kultivieren zu können. Damit besteht eine
Alternative zu den bisherigen Methoden der In-vivo-Kultur im heterologen System (z.
B. ligierter Schaf- und Kanincheneileiter) und zur Organkultur im isolierten Mäuseeileiter (RIZOS et al. 2007), welche ebenso wie die In-vitro-Kultur nachteilige Einflüsse
auf die Embryonen haben können (LAZZARI et al. 2002; HAVLICEK 2005a;
WETSCHER 2005a). Der 1998 von BESENFELDER und BREM entwickelte transvaginal-endoskopische Zugang zum Eileiter des Rindes stellt einen minimal-invasiven
Eingriff dar, welcher wiederholt und ohne größere nachteilige Effekte auf die spätere
Nutzung der Tiere angewendet werden kann. Vorteil dieser Methode ist die minimale
Manipulation der Reproduktionsorgane, da diese nicht wie bei konventionell chirurgischen Eingriffen an die Körperoberfläche vorverlagert werden müssen, sondern
durch den endoskopischen Einsatz in situ bleiben (BESENFELDER u. BREM 1998).
Die transvaginale Endoskopie ist ein äußerst schonendes Verfahren, denn im Vergleich zu laparoskopischen oder chirurgischen Zugängen zur Bauchhöhle wird lediglich das dorsale Scheidendach durchstoßen, welches an der entsprechenden Stelle
nur wenige Millimeter dick und äußerst regenerationsfähig ist. Bei späteren Schlachtungen der mit dieser Technik endoskopierten Tiere konnte die Zugangsstelle im
Fornix vaginae nur in wenigen Fällen als kleine Einziehung im Schleimhautrelief dargestellt werden (MÖSSLACHER et al. 2001). Auch ist durch die mittige Eintrittsstelle
des Endoskops im Reproduktionstrakt eine gleichermaßen gute Erreichbarkeit des
rechten und linken Ovars gegeben, um je nach Ovulationsseite Zugang zum jeweili-
90
gen Eileiter zu erlangen (BESENFELDER u. BREM 1998). Auch die Dauer des Eingriffs ist bei diesem endoskopischen Verfahren wesentlich kürzer, welches ebenfalls
zu einer erheblichen Reduktion der Belastung für die Tiere beiträgt (HAVLICEK
2002).
Als kritischer Punkt der transvaginalen Endoskopie bleibt die Eröffnung der Bauchhöhle durch einen scharfen Trokar zu nennen. Es ist hierbei durch rektale manuelle
Kontrolle vor der Trokarierung des Fornix vaginae sicherzustellen, dass sich keine
Organe wie zum Beispiel Pansen, Arteriae iliacae, Blase oder Nieren vor der
Trokarspitze befinden. Ferner kann ein Ablösen des Bauchfells durch ruckartiges
Durchstoßen des Scheidendaches vermieden werden.
Die transvaginale Endoskopie beim Rind stellt also eine Methode dar, mit deren Hilfe
die einzelnen Schritte der frühen präimplantatorischen Embryonalentwicklung und
die Effekte des Eileitermilieus auf die Embryonen untersucht werden können, zum
Beispiel bei der Erspülung früher Embryonalstadien aus dem Eileiter oder nach
Verwendung der transvaginalen Endoskopie zur temporären In-vivo-Kultur in vitro
produzierter Embryonen (HAVLICEK et al. 2005a, 2005b; WETSCHER et al. 2005a,
2005b).
In der vorliegenden Arbeit konnten bei 16 Tieren erfolgreich Zygoten in den Eileiter
abgesetzt werden, bei 4 Transfers brach die gläserne Transferkapillare ab und es
kam somit zum Verlust aller Embryonen in die Bauchhöhle, bei zwei Tieren gab es
eine ungenügende Wirkung der Epiduralanästhesie, so dass ein Transfer der Zygoten aufgrund des Abwehrverhaltens der Tiere nicht möglich war.
Die Wiederfindungsrate (Anzahl der übertragenen Zygoten zu den wiedergefundenen
Stadien) lag bei 59,5%. Die einzelnen Wiederfindungsraten schwankten zwischen 0100%. Mögliche Gründe für die zum Teil sehr unterschiedlichen Wiederfindungsraten
dieser Arbeit im Vergleich zu den Ergebnissen der Wiener Arbeitsgruppe um Prof. U.
Besenfelder (BESENFELDER et al. 2005) sind multifaktoriell. Zum einen wurden in
der Studie von Prof. Besenfelder verschiedene Versuchsgruppen [Zygoten in
Hyaluronsäure, Zygoten mit und ohne Cumulus, GIFT, (Gamete Intra-Fallopian
91
Transfer), Zygoten in Alginat, Progressive Stadien (4- bis 8-Zellstadium)] übertragen
und für jede Gruppe andere Wiederfindungsraten ermittelt. Diese Gewinnungsraten
sind jedoch sehr deutlich von den in den verschiedenen Gruppen durchgeführten
Transferaktionen abhängig. So konnte für die Embryonen der Gruppe „Zygoten in
Alginat gebettet“ die höchste Findungsrate von 70,5% und die niedrigste für die Embryonen der Gruppe „Hyaluronsäure“ (12,9%) ermittelt werden. Der wichtigste Grund
der Alginateinbettung in diesem Versuch lag darin, den Verlust der Embryonen nach
Transfer in einen aktiven und dynamischen Eileiter zu verhindern, was auch gelang.
Die deutlich erhöhte Konzentration an Hyaluronsäure (6 mg/ml) verhinderte jedoch
die
koordinierte
und
frequente
Bewegung
des
Zilienbesatzes
auf
den
Eilieiterepithelzellen (HUANG et al., 1997), was ein wichtiger Grund für die verminderte Findungsrate in der „Hyaluronsäuregruppe“ im Versuch sein könnte. Die
Wiederfindungsrate bei der Studie BESENFELDER et al. 2005 war im Schnitt 50,5%,
was dem Ergebnis dieser Arbeit (59,5%) ähnelt. Die Ergebnisse dieses „offenen“
Systems der In-vivo-Kultur lassen sich mit den in der Literatur dokumentierten Arbeiten am ligierten Schafeileiter vergleichen, wo Wiedergewinnungsraten zwischen 64%
und 74% erreicht wurden (SREENAN und SCANLON 1968; BOLAND 1984;
ENRIGHT et al. 2000; RIZOS et al. 2002).
Die Blastozystenrate lag bei der Studie der Wiener Arbeitsgruppe im Schnitt bei
24,4%, in dieser Arbeit bei 19,4%. Auch hier sind die Gründe zum Teil in den verschiedenen Versuchsgruppen der von BESENFELDER et a. 2005 durchgeführten
Studie zu finden. Die Supplemente, die zu den übertragenen Embryonalstadien oder
Gameten zugesetzt wurden, beeinflussen deren Entwicklung. Die höchsten Entwicklungsraten mit 41,9% (Tag 7) und 43,3% (Tag 8) nach In-vivo-Kultur wurde bei BESENFELDER in der Gruppe erreicht, in der fortgeschrittene Stadien übertragen wurden. Ein weiterer Grund für die höheren Entwicklungsraten bei der Forschungsgruppe um Prof. Besenfelder lag wahrscheinlich darin, dass im Anschluss an die Spülung
nach der In-vivo-Kultur noch eine 24h In-vitro-Kultur der gewonnenen Stadien erfolgte.
92
5.2
Genexpressionsmuster
Die Charakterisierung embryonaler Genexpressionsmuster ermöglicht eine genauere
Beurteilung der Qualität von Embryonen als die Betrachtung morphologischer Parameter. Weiterhin erlaubt sie Einblicke in die molekularen Mechanismen der Embryonalentwicklung und in die Auswirkungen einzelner Veränderungen der Umgebung
auf Wachstum und Entwicklung der Embryonen (LEIBFRIED-RUTLEDGE 1999;
SHEHU et al. 1996). Genexpressionsanalysen bei Rinderembryonen haben in den
letzten Jahren stetig zugenommen. Durch die Technik der RT-PCR wurde es möglich, die Expression verschiedener Gene in einzelnen präimplantatorischen Embryonen qualitativ und quantitativ nachzuweisen (NIEMANN und WRENZYCKI, 2000;
WRENZYCKI et al. 2001a, 2001b). Die RT-qPCR ist die bevorzugte Methode für die
Ermittlung quantitativer mRNA-Expression in kleinen Probenmengen, wie Oozyten
oder präimplantatorischen Embryonen, insbesondere bei Genen mit geringer Expression (GÁL et al. 2006). Viele Arbeiten über Genexpressionsmuster in
präimplantatorischen Rinderembryonen führten zu der Erkenntnis, dass eine Vielzahl
von Transkripten in IVP-Embryonen ein anderes/abweichendes Expressionsmuster
im Vergleich zu In-vivo-Embryonen aufweisen (HO et al., 1994; STOJANOV und
O'NEILL, 1999; NIEMANN und WRENZYCKI, 2000; HYTTEL et al., 2000;
WRENZYCKI et al., 1999, 2000, 2001a, 2001b, 2002). Derartigen Unterschieden in
der Genexpression wird eine wichtige Rolle bei verschiedenen Problemen, die im
Zusammenhang mit der IVP auftreten, zugeschrieben (MENEZO et al., 2000; NIEMANN und WRENZYCKI 2000). Ebenso wird ein Zusammenhang zum LOS vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen zum besseren Verständnis der grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen bei der Kontrolle der embryonalen
Genexpression beitragen, indem die Expressionensmuster entwicklungsrelevanter
Gene in in vitro produzierten und Embryonen aus einer temporären Eileiterkultur im
Vergleich zu den Expressionsmustern in vivo gewonnener Embryonen verglichen
werden.
Die Aufdeckung dieser Unterschiede ist der Schlüssel zur Optimierung von Biotechnologien im veterinär- und humanmedizinischen Sektor. Daraus resultierend können
möglicherweise verbesserte Kultursysteme entwickelt werden, Technologien zur In-
93
vitro-Erstellung von Embryonen verfeinert werden und vielleicht auch die Eileiterkultur zur Gewinnung qualitativ hochwertiger Embryonen standardisiert werden. Zusätzlich liefern die Studien weitere Hinweise auf die Entstehung von Entwicklungsstörungen wie zum Beispiel des LOS.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA-Expression von fünf Genen
(DNMT1, DNMT3a, SUV39H1, SLC2A3 und SLC2A8) in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen, sowie in Embryonen aus einer temporären Eileiterkultur im homologen Eileiter des Rindes vergleichend untersucht. Für alle
untersuchten Gene konnte eine signifikante Abhängigkeit von Transkriptmenge und
Herkunft der Embryonen festgestellt werden, wobei die Expressionsmuster der in
vivo gewonnenen Embryonen als physiologischer Standard dienten. Die für diese
Studie ausgewählten Gene haben sich in ihrem Gehalt bereits von unterschiedlichen
Einflussfaktoren verändert gezeigt (WRENZYCKI et al. 2007; Tabelle 2). Allerdings
muss bei der Interpretation von Daten aus der RT-qPCR immer beachtet werden,
dass eine Relevanz für die Protein- bzw. Funktionsebene angenommen wird, aber
meist nicht nachgewiesen ist.
5.2.1 DNMT1 und DNMT3a
Die
DNA- und
Histon-Methylierungen
spielen
während
der epigenetischen
Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle
(WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Für die DNMT1 zeigte sich in dieser Arbeit ein signifikanter Unterschied in Morulae
und Blastozysten der drei Herkünfte. In diesen embryonalen Stadien war die relative
Transkriptmenge für DNMT1 in in vivo gewonnenen und in den Embryonen aus der
temporären Eileiterkultur niedriger als die in den in vitro produzierten Stadien. Die
Embryonen aus der temporären Kultur im Eileiter ähnelten im Expressionsmuster
den In-vivo-Embryonen. HÖFFMANN zeigte 2006 auf, dass die DNMT1 eine hohe
Aktivität für die Aufrechterhaltung der Methylierung vor der Aktivierung des embryonalen Genoms hat, und das ein signifikanter Abfall, sowohl bei in vivo gewonnenen
94
als auch bei in vitro generierten Embryonen, nach der Aktivierung des Genoms stattfindet. Hierbei blieb jedoch die relative Transkriptmenge der in vitro produzierten
Embryonen, wie auch in dieser Arbeit, signifikant über dem Niveau der In-vivoEmbryonen. Ähnliche Ergebnisse konnten in den bislang veröffentlichten Studien
über die DNMT1-Expression beim Rind (WRENZYCKI et al. 2001b; WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003) erzielt werden. Unterschiedliche Studien zu Einflussfaktoren auf
den Gehalt an mRNA für DNMT1 in Eizellen und Embryonen des Rindes sind in Tabelle 8 aufgelistet.
Tabelle 8: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT1 in frühen Embryonalstadien des Rindes
Referenz
Untersuchte
Versuchsbedingungen
Stadien
Ergebnis
HÖFFMANN
et al. (2006)(
Morulae und
Blastozysten
IVP im Vergleich zur In-vivoProduktion
↑
WRENZYCKI
et al. (2001a)(WRENZYCKI
Blastozysten
IVP im Vergleich zur In-vivoProduktion
↑
WRENZYCKI
u. NIEMANN
(2003)(WRENZYCKI
Blastozysten
Artifizielle Produktion im Vergleich
zur In-vivo-Produktion
↑
KUZMANY
et al. (2011)
Blastozysten
IVP im Vergleich zur In-vivoProduktion und Eileiterkultur
→
e
→ = kein Einfluss erkennbar, ↑ = mRNA-Gehalt erhöht, ↓ = mRNA-Gehalt herabgesetzt
Für die DNMT3a zeigten sich in dieser Arbeit ebenfalls signifikante Unterschiede
zwischen den Morulae und den Blastozysten der drei Herkünfte. Im Morulastadium
war die relative Transkriptmenge der in vivo gewonnenen Embryonen und Eileiterkulturembryonen höher als die in den in vitro produzierten. Die Embryonen aus der
temporären Kultur im Eileiter ähnelten im Expressionsmuster abermals den In-vivoEmbryonen. Im Blastozystenstadium verhielt es sich genau umgekehrt. Die relative
Transkriptmenge der in vivo gewonnenen Embryonen und Eileiterkulturembryonen
war deutlich niedriger als die der in vitro erzeugten Blastozysten. In Tabelle 9 sind
Untersuchungen aufgelistet, die sich mit den Einflussfaktoren auf die mRNA-Gehalte
95
von DNMT3a in Oozyten und Embryonen des Rindes beschäftigten. WRENZYCKI
und NIEMANN (2003) konnten in ihren Untersuchungen keinen Unterschied in der
relativen Transkriptmenge von DNMT3a in Abhängigkeit zur Produktionsart (in vivo
oder in vitro) der Embryonen nachweisen. Allerdings konnte in darauf folgenden Arbeiten festgestellt werden, dass sich je nach Stadium (10-16 Zeller, Morula,
Blastozyste) doch Signifikanzen in Bezug auf die Expression von DNMT3aTranskripten (HÖFFMANN et al. 2006) sowie auch auf Proteinebene nachweisen
ließen (DRALLMEYER 2008, et al. 2009). Diese Ergebnisse könnten durch die Tatsache bedingt sein, dass in den späteren Arbeiten andere Kultursysteme zur IVP der
Embryonen verwendet worden sind. Signifikante Unterschiede im Proteingehalt und
der Proteinlokalisierung der DNMT3a in den Blastomeren weisen auf einen Einfluss
der In-vitro-Kultur auf die De novo- Methylierung vor, während und nach der Aktivierung des embryonalen Genoms hin (DRALLMEYER 2008). Die Ergebnisse dieser
Arbeit zeigen ebenfalls auf, dass die Herkunft der Embryonen einen Einfluss auf die
Genexpression von DNMT3a hat.
Tabelle 9: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT3a in frühen Embryonalstadien des Rindes
Referenz
BEYHAN et
al (2007)(BEYHAN et
al. 2007)
DE A.
CAMARGO
et al.
Untersuchte
Stadien
Morulae und
Blastozysten
Versuchsbedingungen
SCNT im Vergleich zur
IVP
Ergebnis
↓
Blastozysten
IVP und SCNT im Vergleich zur
In-vivo-Produktion
↓
Blastozysten
Parthenogenese im Vergleich zu
Blastozysten aus befruchteten
Oozyten
↓
10-16-Zellstadien
und
Morulae
IVP im Vergleich zu Embryonen
aus In-vivo-Produktion
↓
(2005)(DEWRENZYCKI
e
GOMEZ et
al. (2009)(GOMEZ et
al. 2009)
HÖFFMANN
et al. (2006)(
96
SAGIRKAYA
et al. (2007)(SAGIR
Blastozysten
WRENZYCKI
u. NIEMANN
(2003)(WRENZYCKI u.
NI
Blastozysten
Zusatz von Serum fetaler
Kälber
in der IVM im Vergleich
zu synthetischem
Serumzusatz
SCNT im Vergleich zu in
vivo
bzw. in vitro generierten
Embryonen
↑
↓
→ = kein Einfluss erkennbar, ↑ = mRNA-Gehalt erhöht, ↓ = mRNA-Gehalt herabgesetzt
5.2.2 SUV39H1
Die Methylierung von H3-K9 ist eine weitere wichtige epigenetische Modifikation.
Sowohl SUV39H1 als auch G9A können an dieser Stelle die Methylgruppen übertragen, was mit einer Repression der Genaktivität verbunden ist (TACHIBANA et al.
2002). Die H3-K9-Methylierung durch SUV39H1 kann durch HP1 erkannt werden
und stellt somit eine Grundlage für den Aufbau heterochromatischer Strukturen dar
(LACHNER et al. 2001; CHEUTIN et al. 2003). Histon-Methylierungen spielen während der epigenetischen Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung
eine bedeutende Rolle (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Die relative Transkriptmenge von SUV39H1 in den untersuchten Stadien unterschied
sich in dieser Arbeit signifikant in den Embryonen der drei verschiedenen Herkünfte
(In-vivo-/ In-vitro-/ temporäre In-vivo-Kultur). Hierbei lag die Transkriptmenge der in
vitro generierten Embryonen immer über der der In-vivo-Embryonen und der Embryonen aus der temporären Eileiterkultur. Auch bei diesem Gen ähnelten die Expressionsmuster der Embryonen aus der temporären Eileiterkultur denen der In-vivoEmbryonen.
NOWAK-IMIALEK et al. (2008) zeigten in Ihrer Arbeit auf, dass expandierte
Blastozysten, die im SOF-System kultiviert worden waren, Blastozysten nach parthenogenetischer Aktivierung sowie solche nach Kerntransfer (männliche Spenderzellen) einen signifikant höheren relativen SUV39H1-Transkriptgehalt zeigten als in vivo
gewonnene
Embryonen.
Die
signifikanten
Unterschiede
in
der
relativen
Transkriptmenge zwischen den Herkünften lassen darauf schließen, dass die H3-K9-
97
Methylierung stark von der In-vitro-Kultur bzw. durch weitere assistierte Reproduktionstechniken beeinflusst wird. In einer weiteren Studie wurde die relativen
Transkriptmenge von SUV39H1 in Embryonen zweier verschiedener Herkünfte (in
vivo/ in vitro) untersucht. Auch hier unterschieden sich die Transkriptgehalte signifikant. Die Transkriptmenge für SUV39H1 der in vitro generierten Embryonen lag auch
dort immer über der der In-vivo-Embryonen (HÖFFMANN 2006).
5.2.3 SLC2A3 und SLC2A8
Präimplantationsembryonen nutzen während der Teilung überwiegend Laktat und
Pyruvat und mit Beginn der Blastozystenentwicklung Glukose zur Energiebereitstellung. Die Energieversorgung von Embryonen vor der Kompaktierung ist also hauptsächlich von der ATP-Synthese abhängig. Mit fortschreitender Weiterentwicklung,
verstärkter Proteinsynthese und Bildung des Blastozoel steigt der Verbrauch an ATP.
Der Embryo verwendet nun vermehrt auch Glukose und Aminosäuren zur Energieversorgung (PARTRIDGE und LEESE 1996). Vom 8-16 Zellstadium steigt der
Glukoseverbrauch des Embryos stetig an (KHURANA und NIEMANN 2000b). Neben
dem Citratzyklus nutzen Blastozysten auch die Glykolyse zur Energiegewinnung.
Obwohl die anaerobe Glykolyse unter dem Aspekt der ATP-Gewinnung weniger
günstig ist, stellt sie vermutlich eine Anpassung an die niedrigen Sauerstoffkonzentrationen im Uteruslumen dar. Untersuchungen in der Maus, der Ratte, dem Kaninchen und dem Rind zeigten eine Expression eines breiten Spektrums von
Glukosetransportern in Präimplantationsembryonen. Das Expressionsmuster weist
jedoch zell- und stadienspezifische Unterschiede in der Verteilung der Isoformen und
Unterschiede zwischen den Spezies auf (FISCHER und NAVARRETE-SANTOS
2003). Viele Versuchsergebnisse deuten auf eine Funktion der Glukosetransporter
bei
der
Entwicklung
der
Präimplantationsembryonen
hin,
die
über
die
Glukoseaufnahme hinausgeht. Bei Antisense-Experimenten mit SCL2a1, SCL2a3
und SCL2a8 reduzierte sich nicht nur die Glukoseaufnahme der Embryonen, sondern
es kam im Maus- und Rattenmodell auch zu einer Entwicklungsblockierung im
Morulastadium, zu einem Anstieg der Apoptoserate oder zu erniedrigten Graviditäts-
98
raten nach Embryotransfer (BRISON et a. 1993; PINTO et al. 2002). AUGUSTIN et
al.
(2001)
zeigten
auf,
dass
Glukosetransporter
während
der
Präimplantationsentwicklung beim Rind stadienspezifisch exprimiert werden. Dabei
liegen die Solute Carrierer 1, 3, 8 und SGLT-I als maternale Transkripte vor und sind
in allen untersuchten Embryonalstadien nachweisbar. Die SLC2A3 und SLC2A1mRNA Expression ist bei bovinen Embryonen nachgewiesen worden (WRENZYCKI
et al. 1999; AUGUSTIN et al. 2001). SLC2A3-mRNA wurde in Blastozysten aus Invitro Kultur-Systemen (SOF-Serum, SOF-BSA) und aus Eileiterkulturen im ligierten
Schafeileitern stärker exprimiert als bei in vivo gewonnenen Blastozysten (LAZZARI
et a. 2002). MessengerRNA von SLC2A3 kann in Blastozysten an Tag 7 ihrer Entwicklung nur im Trophektoderm detektiert werden (WRENZYCKI et al. 2003).
SLC2A3, dessen Hauptaufgabe der Transport von Glukose an neuronalem Gewebe
ist, hat sich in der Vergangenheit als sensitiver Marker für suboptimale Kulturbedingungen bei der IVP herausgestellt (LAZZARI et al. 2002). Dadurch dass die Expression nur bei in vitro produzierten Embryonen signifikant erhöht war, kann davon ausgegangen werden, dass diese qualitativ nicht denen, die in vivo generiert wurden,
entsprechen. (LAZZARI et al. 2002). In Embryonalstadien des Rindes werden zwei
Insulin-sensitive Glukosetransporter exprimiert. Im Gegensatz zu dem ausschließlich
in Blastozysten transkribierten SLC2A4, wird die SLC2A8-RNA in allen untersuchten
Embryonalstadien gefunden (AUGUSTIN 2001). In einer Studie von KUZMANY et al.
(2011) gab es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von SCL2A3 in
Blastozysten aus verschiedenen Herkünften.
Die relative Transkriptmenge von SLC2A3 und SCL2A8 in den untersuchten Stadien
in dieser Arbeit (Morulae/Blastozysten) unterschied sich signifikant in den Embryonen der drei verschiedenen Herkünfte (In-vivo-/ In-vitro-/ temporäre In-vivo-Kultur).
Hierbei lag die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen immer über der
der In-vivo-Embryonen und der Embryonen aus der Eileiterkultur.
In Anlehnung an die Ergebnisse der vorher genannten Arbeiten bedeutet dies für die
vorliegende Arbeit, dass die Embryonen, die nach einer temporären Eileiterkultur un-
99
tersucht wurden, in ihren mRNA-Gehalten aller untersuchter Gene eher denen in vivo
erstellter Embryonen ähneln, also qualitativ hochwertiger erscheinen.
5.3
Schlussbetrachtung
Um neue Wege zum Verständnis der embryo-maternalen Kommunikation aufzeigen
zu können, ist es unumgänglich, die In-vitro-Methoden mit den physiologischen Abläufen bereits im Eileiter zu kombinieren. Neueste Arbeiten konzentrieren sich auf
eine optimierte Embryogewinnung, die eine maximale Entwicklungsdauer im Rind
(In-vivo-Kultur) mit den Vorteilen der In-vitro-Produktion kombinieren (HAVLICEK et
al. 2010)
Die derzeitig gebräuchlichen In-vitro-Systeme beim Rind könnten dauerhafte Änderungen in den Genexpressionsmustern während der embryonalen und fetalen Entwicklung bedingen (WRENZYCKI et al. 2004), was zu einer verringerten Qualität der
Embryonen führen und sogar die Überlebensfähigkeit der Nachkommen nach einem
Transfer beeinflussen kann (WRENZYCKI et al. 2007).
Es ist möglich, dass epigenetische Modulationen in der IVP während der
präimplantatorischen Embryonalentwicklung kausale Mechanismen sind, die am
Auftreten des LOS beim Rind beteiligt sind (WILMUT et al. 2002; HIENDLEDER et
al. 2006; FARIN et al. 2006). Daher ist die Analyse der mRNA-Gehalte von Genen,
die für die embryonale Entwicklung wichtig sind, ein nützliches Werkzeug, um die
„Normalität“ der Embryonen zu messen (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Die genaue Analyse dieser entwicklungsrelevanten Gene könnte dazu beitragen, dass fundierte Klassifikationskriterien für die Selektion bezüglich einer guten Entwicklungskompetenz gefunden werden (COTICCHIO et al. 2004; PATEL et al. 2007).
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben verdeutlicht, dass alle untersuchten mRNAExpressionsprofile der Embryonen der temporären Eileiterkultur denen des „goldenen Standards“, also denen der In-vivo-Embryonen, gleichen.
100
Die Aufdeckung von Unterschieden im mRNA-Expressionsprofil zwischen in vivo und
in vitro produzierten oder geklonten Embryonen ist ein wesentlicher Schlüssel für
Optimierung der In-vitro-Systeme und zur Minimierung des Auftretens von Entwicklungsstörungen.
Ein kritischer Punkt der IVP scheint die Supplementierung der Kulturmedien zu sein.
Bovines Serumalbumin und Serum werden am häufigsten als Medienzusätze verwendet, sind aber umstritten, da sie neben Hormonen und Wachstumsfaktoren eine
Reihe weiterer unbekannter Komponenten enthalten können. Dies macht den Vergleich von Experimenten untereinander schwierig. Es ist also von großem Interesse,
klar definierte Medien zu entwickeln, die auf synthetischen Makromolekülen basieren
(WARZYCH et al. 2007).
NIEMANN et al. (2002) hat zusammenfassend beschrieben, dass all die auftretenden
Abnormalitäten und Aberrationen nichts anderes sind als eine Stressantwort des
Embryos auf ungenügende Kulturbedingungen.
Die fünf ausgewählten Gentranskripte wurden beim Rind erstmals vergleichend zwischen den Embryonen der drei Herkünfte untersucht. Die signifikanten Unterschiede
in der relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vivo und
in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur
lassen darauf schließen, dass sowohl der Erhalt als auch die De-novo-DNAMethylierung von der In-vitro-Kultur beeinflusst werden. Die ebenfalls signifikanten
Unterschiede in der relativen Transkriptmenge für die Histonmethyltransferase zeigen, dass auch die H3-K9-Methylierung stark von den In-vitro-Kulturbedingungen
abhängig ist. Auch die Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der
Glukosetransporter, deren Produkte am embryonalen Metabolismus beteiligt sind
(SLC2A3 und SLC2A8), werden durch die In-vitro-Kultur beeinflusst.
Die In-vitro-Techniken haben sich zum Teil als eigenständige Verfahren entwickelt
und müssten daher mehr an den physiologischen Abläufen, zum Beispiel an denen
im Eileiter und Uterus, bemessen werden. Insgesamt erscheint eine embryonale
Entwicklung im Eileiter von Vorteil zu sein.
101
6
Zusammenfassung
Karsten Müller
Auswirkung einer temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Rinderembryonen im bovinen Eileiter auf das mRNA-Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene
Im ersten Teil des Versuches wurden durch transvaginale Endoskopie in vitro erstellte Embryonen (Zygoten Stadium) in den Eileiter des Rindes zur 7-8 tägigen In-vivoKultur transferiert. Es sollte eine minimal-invasive, reproduzierbare Methode im Vergleich zu den bislang bestehenden Möglichkeiten von chirurgischen Eingriffen oder
Organkulturen im unligierten, homologen Eileiter des Rindes etabliert werden. Im
zweiten Teil der Arbeit erfolgte der Vergleich der Expressionsmuster fünf entwicklungsrelevanter Gene in den Embryonen der verschiedenen Herkünfte. Zwei DNAMethyltransferasen (DNMT1 und DNMT3a), die Histon-Methyltransferase SUV39H1,
sowie die Glukosetransporter SLC2A3 und SLC2A8 wurden ausgewählt und analysiert. Die Einflüsse der In-vitro-Produktion auf die präimplantatorische embryonale
Genexpression sollten dargestellt werden, wobei die Expressionsmuster der In-vivoEmbryonen als physiologischer Standard dienten. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
1. Im Vorversuch wurden 25 Färsen endoskopiert und somit die Technik der transvaginalen Endoskopie erlernt. In dieser Zeit wurde auch die Transferkapillare
entwickelt und modifiziert.
2. Im Hauptversuch wurde der endoskopische Eileitertransfer bei 22 zyklussynchronen Rindern im Alter zwischen 13 - 25 Monaten durchgeführt. 640 in vitro
erzeugte Zygoten sind in die Ovidukte der Empfängertiere übertragen worden.
Insgesamt lag die Wiederfindungsrate bei 59,5%. Die einzelnen Wiederfindungsraten schwankten zwischen 0 und100%. Die durchschnittliche Entwicklungsrate
zur Blastozyste/Morula lag bei 19,4%. In den 22 transvaginal-endoskopisch geleitetem Embryonentransfers wurden im Schnitt 29,1 IVF-Zygoten übertragen,
102
davon konnten durchschnittlich 17,3 Stadien zurückgewonnen werden von denen sich 3,4 bis zur Morula oder Blastozyste entwickelt hatten.
3. Zeitgleich wurden routinemäßig In-vitro-Embryonen (Morulae/Blastozysten) produziert und uterine Embryonalstadien in vivo durch Uterusspülungen gewonnen.
4. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss der Herkunft der Embryonen
auf die relative Transkripthäufigkeit der zu untersuchenden Gene. Für die relative Transkriptmenge des DNMT1-Gen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen In-vivo- und In-vitro-Embryonen nachgewiesen werden. Ebenfalls fielen
signifikante Unterschiede im Expressionsmuster von DNMT1 zwischen den
Embryonen aus der temporären Eileiterkultur und den in vitro erzeugten Gegenstücken auf.
In den In-vivo- und Eileiterkulturembryonen war die relative
Transkriptmenge für dieses Gen niedriger als in den in vitro produzierten. Zwischen in vivo gewonnenen Embryonen und In-vivo-Kulturembryonen fielen keine
signifikanten Unterschiede auf.
5. Bei der relativen Transkriptmenge der DNMT3a-mRNA fielen signifikante Unterschiede im Expressionsmuster zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen auf. Ebenso signifikant waren die Unterschiede bei der m-RNA Expression der Morulae/Blastozysten aus der temporären Eileiterkultur im Vergleich zu
den in vitro generierten. Bei den Blastozysten war der Gehalt in den in vivo gewonnenen und Eileiterkultur Embryonen niedriger als bei den In-vitroBlastozysten, bei Morulae verhielt es sich genau anders herum. Zwischen in vivo gewonnenen Embryonen und In-vivo-Kulturembryonen fielen keine signifikanten Unterschiede auf.
6. Die relativen Transkriptgehalte von SUV39H1 unterschieden in den Stadien der
drei Herkünfte signifikant voneinander. So zeigten sich sowohl signifikante Unterschiede zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen, als auch zwischen Embryonen aus temporärer Eileiterkultur und in vitro generierten Embryo-
103
nen. Die relativen Mengen der Gentranskripte von SUV39H1 in den Morulae und
Blastozysten aus temporärer Eileiterkultur und in vivo waren ähnlich. Die
Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen lag deutlich über denen der
In-vivo- und Eileiterkulturembryonen.
7. Für die relative Menge der Gentranskripte von SLC2A3 und SLC2A8 konnten
signifikante Unterschiede in in vivo und in vitro erzeugten Embryonen festgestellt
werden. Ebenso signifikant unterschieden sich die Embryonen der temporären
Eileiterkultur von den in vitro generierten Stadien. Morulae und Blastozysten aus
temporärer Eileiterkultur und in vivo unterschieden sich nicht signifikant in der
Menge der exprimierten Transkripte. Auch bei diesen Genen lag die
Transkriptmenge deutlich höher bei In-vitro-Embryonen im Vergleich zu den
Embryonen der anderen beiden Herkünfte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mit Hilfe der transvaginalen Endoskopie
eine Eileiterkultur beim Rind minimal-invasiv möglich ist und somit ein alternatives
Verfahren zu bestehenden Techniken darstellt. Die signifikanten Unterschiede in der
relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vitro generierten
Embryonen und den Embryonen der anderen beiden Herkünfte lassen darauf schließen, dass sowohl die Erhalt- als auch die De-novo-DNA-Methylierung von der Invitro- Kultur beeinflusst werden. Die signifikanten Unterschiede in der Expression der
Histon-Methyltransferase zeigen, dass auch die H3-K9-Methylierung von der Kulturumgebung beeinflusst wird. Ebenso scheint die In-vitro-Kultur Embryonen im Metabolismus zu beeinflussen, denn auch bei den Transkriptmengen für die
Glucosetransporter SLC2A3 und SLC2A8 gab es signifikante Unterschiede in den
Expressionsmustern der verschiedenen Herkünfte. Alle untersuchten Gentranskripte
zeigten ähnliche Expressionsmuster bei Embryonen aus Eileiterkultur und in vivo
gewonnenen Embryonen.
104
7
Summary
Karsten Müller
Effect of a temporary in vivo culture in the bovine oviduct of in vitro produced
bovine embryos on the mRNA expression of developmentally important gene
transcripts
The present study was designed to adopt a minimally invasive method to culture in
vitro produced bovine embryos in bovine fallopian tubes. Bovine in vitro produced
embryos (zygote stage) were transferred into the bovine oviduct via transvaginal endoscopy for a culture period of 7-8 days. In the following these embryos were retrieved by flushing and the mRNA expression of five developmentally important gene
transcripts DNMT1, DNMT3A, SLC2A3, SLC2A8 and SUV39H1 was analysed by
RTqPCR. Additionally, embryos that were completely in vitro generated and in vivo
derived embryos were analysed by RT-qPCR. The following results could be obtained:
1. In preliminary tests, 25 Holstein Frisian heifers were endoscoped to adopt the
technique. During these tests the capillary used for transfer was designed and modified.
2. In the main experiments 640 zygotes were transferred into the fallopian tubes of
22 synchronised heifers aged 13-25 months. Recovery rates lay at 59.9% altogether,
individually ranging from 0 to 100%. The average developmental rate of transferred
zygotes to the morula/blastocyst stage was 19.4%. On average 29.1 in vitro produced zygotes were transferred during each transfer session (n=22) of which 17.3%
embryos of differing stages could be recovered. Of these 3.4 had developed to the
stage of a morula/blastocyst.
3. Embryos were also generated in vitro (SOF) and in vivo.
105
4. The following results could be obtained after the analysis of the expression of developmentally important gene transcripts
- The expression of DNMT1, SLC2A3, SLC2A8 and SUV39H1 transcripts was significantly upregulated in those embryos (morulae/blastocysts) derived from the IVPsystem compared to those generated in vivo. No differences could be seen for those
embryos derived from the temporary in vivo culture compared to those generated
completely in vivo.
- The relative abundance of DNMT3A was significantly upregulated in blastocysts
derived from the IVP-system in comparison to those temporarily cultured in vivo and
completely generated in vivo. No statistical differences could be between the embryos of the latter two groups. On the other hand, morulae derived from the IVPsystem showed a significantly lower expression of DNMT3A-mRNA compared to the
embryos of both other groups, whereas no differences could be seen in embryos
from the temporary in vivo culture and those derived in vivo.
The results of this study show that an oviduct culture of bovine embryos using a
transvaginal endoscopy approach.
The results of the mRNA analysis additionally show that the expression of developmentally important gene transcripts is not altered by the temporary in vivo culture as
it is when comparing in vivo generated embryos to those derived from in vitro culture
systems. Therefore, temporary culture in vivo seems to be an optimized system in
comparison to conventional IVP.
106
8
8.1
Anhang: Verzeichnisse
Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1: Unterschiede zwischen in vitro und in vivo erzeugten Rinderembryonen 17
Tabelle 2: mRNA Expressionsmuster in Blastozysten unterschiedlicher
Herkunft und in Relation zu anderen Qualitätsparametern .......................... 20
Tabelle 3: Klassifizierungsschema für unreife Oozyten ............................................ 55
Tabelle 4: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches (Mastermix) für die RT ..... 72
Tabelle 5: Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes .......................................... 73
Tabelle 6: Verwendete Primerpaare und die dazugehörige Annealingtemperatur.... 74
Tabelle 7: Verteilung der Embryonalstadien nach Eileiterkultur................................ 79
Tabelle 8: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT1 in frühen
embryonalstadien des Rindes ........................................................................ 95
Tabelle 9:Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT3a in frühen
embryonalstadien des Rindes ........................................................................ 96
8.2
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Ovar, Eileiter und Uterus des Rindes, Seitenansicht (Nickel,
Schummer, Seiferle 1999) ............................................................................... 8
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung
beim Säugetier (Schnorr 2001) ...................................................................... 10
Abbildung 3:
Transkriptionsverläufe während der frühen
Embryonalentwicklung beim Rind (Wrenzycki et al. 2007)........................... .27
Abbildung 4:
DNA-Methyltransferasen katalysieren den Transfer einer
Methylgruppe auf das C-Atom im Cytosinring (HAAF 2006) ......................... .29
Abbildung 5: Elternspezifische Methylierungsreprogrammierung
im frühen Säugetier embryo(HAAF2003,modifziert)……………………….…31
Abbildung 6 :
Die drei Methyltransferasenfamielien beim Säugetier………………33
Abbildung 7:
Struktur des DNMT1-Proteins der Maus (CIRIO et al. 2007).......... 34
Abbildung 8: Geschlechtsspezifische Exons und mRNAs der DNMT1 (BRESTOR
2000) .............................................................................................................. 35
107
Abbildung 9:
Histonaufbau und Histonmodifizierung (SPOTSWOOD u. TURNER
2002, modifiziert) ........................................................................................... 38
Abbildung 10:
Proteinstruktur von SU(VAR)3-9 .................................................... 41
Abbildung 11: ... Schematischer Ablauf der Heterochromatisierung (THIEL et al. 2004)
....................................................................................................................... 42
Abbildung 12:
Allgemeiner Aufbau eines Glukosetransporters (Glut1; Lehninger
Biochemie 2001) ............................................................................................ 45
Abbildung 13: Schematische Darstellung des Glukosetransportes in Blastozysten der
Maus (Pantaleon u. Kaye 1998) ..................................................................... 51
Abbildung 14: Übersicht der Instrumente ................................................................. 57
Abbildung 15: Detailaufnahmen der Instrumente ...................................................... 57
Abbildung 16: Bildgebende Geräte ........................................................................... 57
Abbildung 17: Transferkapillare Modell Besenfelder ................................................ 58
Abbildung 18: Transferkapillare Modell Mariensee (modifiziert) ............................... 59
Abbildung 19: Schematische Darstellung der transvaginalen Endoskopie ............... 60
Abbildung 20: Endoskopische Übersicht Ovar/Eileiter .............................................. 62
Abbildung 21: Endoskop im Arbeitsschaft mit angeschlossener Kapillare ................ 62
Abbildung 22: Befüllen der Transferkapillare………………………………………….62
Abbildung 23: Zygoten positioniert in der Transferkapillare…………………………63
Abbildung 24: Eileitertransfer von IVP-Zygoten ........................................................ 64
Abbildung 25: Uterusspülkatheter mit geblocktem Ballon ......................................... 65
Abbildung 26: Spülsystempumpe ............................................................................. 65
Abbildung 27: Spülkanüle Modell "Mariensee" ......................................................... 65
Abbildung 28: Morphologie der Embryonen der drei Versuchsgruppen ................... 69
Abbildung 29: DNA Größenmarker 20bp DNA Ladder (Fermentas) ......................... 75
Abbildung 30: Schematischer Überblick über die Versuchsanordnung .................... 77
Abbildung 31: Verteilung der Wiederfindungsraten .................................................. 79
Abbildung 32: Verteilung der erspülten Stadien auf die einzelnen Transfers ........... 80
Abbildung 33: Relative Transkriptmenge von DNMT1 .............................................. 82
Abbildung 34: Relative Transkriptmenge von DNMT3a ............................................ 83
Abbildung 35: Relative Transkriptmenge von SUV39H1 .......................................... 84
108
Abbildung 36: Relative Transkriptmenge von SLC2A3 (GLUT3) .............................. 85
Abbildung 37: Relative Transkriptmenge von SLC2A8 (GLUT8) .............................. 86
8.3
Zusammensetzung der Medien
0,9% NaCl-Lösung
NaCl
Aqua bidest
Penicillin
Streptomycin
Sigma S 55886 1,08 M
Barnstead E-pure
Appli Chem GmbH
Appli Chem GmbH
9,0g
1L
0,06g
0,1g
PBS-Stocklösung
Na-Pyruvat
Streptomycin
D-Glucose
CaCl₂xH2O
Penicillin G
Aqua bidest
Sigma P3662
Appli Chem GmbH
Appli Chem GmbH
Sigma C 7902; 0,178 M
Appli Chem GmbH
Barnstead E-pure
3,6g
5,0g
100,0g
13,3g
6,0g
1L
PBS-Gebrauchslösung (Dulbecco´s phosphate buffered saline)
Aqua bidest
Barnstead E-pure
1L
Stocklösung
10,0ml
PBS-Pulver
Sigma D-5773
9,65g
PBS für das slicen
PBS-Gebrauchslösung
BSA(V)
Sigma
Heparin
Serva; 177IE/mg
500ml
0,5g
0,0056g
PBS für die Eileiter- und Uterusspülung
PBS-Gebrauchslösung
Fetales Kälberserum
500ml
5ml
Reifungsmedien:
TCM/BSA (FAF) pH 7,4
TCM 199
Sigma M 2520
1,51g
Gentamycinsulfat Sigma G 3632
0,005g
Na-Pyruvat:
Sigma P3662
0,0022g
NaHCO2
Riedel-deHaan 31437
0,035g
Ad. H2O Ampuwa® Fresenius
100ml
BSA(FAF)
Sigma A 7030
0,1g
109
TCM-air pH 7,2
TCM 199
Sigma M 2520
Gentamycinsulfat Sigma G 3632
Na-Pyruvat:
Sigma P3662
NaHCO2
Riedel-deHaan 31437
Ad. H2O Ampuwa®
Fresenius
BSA(FAF)
Sigma A 7030
1,51g
0,005g
0,0022g
0,035g
100ml
0,1g
SUIGONAN (Intervet GmbH)
eCG:
hCG:
0,9% NaCl:
Aliquotieren in 25µl
400IU
200IU
1,0ml
Reifungstropfen
TCM/BSA(FAF)
Suigonan
Cysteamin
100µl Tropfen mit Siliconöl überschichten
965µl
25µl
10µl
Fertilisierungsmedien
Fert.-Talp Stocklösung
NaCl
KCl
NaHCO2
NaHPO2xH2O
CaCl2x2H2O
MgCl₂
Phenolrot
Penicillamin
Na-Lactat 60%
Ampuwa®
114mM
3,2mM
25,0mM
0,3mM
2,0mM
0,5mM
0,01µg/ml
20,0mM
10,0mM
Fresenius
0,6658g
0,0239g
0,2100g
0,0041g
0,0294g
0,0048g
0,0010g
0,0003g
0,1860g
100ml
Gentamycin-Stocklösung
Gentamycin
Ampuwa®
25mg
0,5ml
110
HHE-Stocklösung
a) 250 mM Epinephrin-Ansatz:
Na-Lactat (60%):
165 mg
Na-Metabisulfit:
50 mg
Ampuwa®:
50 mL
→ 40 mL + 1,83 mg Epinephrin (SIGMA E 4250; MG 183,2), pH 4,0
b) 1 mM Hypotaurin-Ansatz:
Hypotaurin SIGMA H 1384; MG 109,1
Ampuwa®
1,09 mg
10 mL
c) 50 IE/mL Heparin-Ansatz:
Heparin
Serva; 177 IE/mg
Ampuwa®
2,82 mg
10 mL
Epinephrin-Ansatz:
Hypotaurin-Ansatz:
Ampuwa®:
→ 80 mL + 40 mL Heparin
4 mL
10 mL
26 mL
Isopercoll-Stocklösung:
a) Lösung A:
NaHCO3:
EBBS
SIGMA E 7510
0,21 g
10 mL
b) Isopercoll:
Percoll
SIGMA P 1644
Lösung A
10 mL
938 mL
Na-Pyruvat-Lösung:
Na-Pyruvat SIGMA 3662; 0,073M
Fert.-Talp Stock
0,002 g
1 mL
Fert.-Talp Gebrauchslösung (Spermienzentrifugation u. Wasch-Tropfen):
BSA/V
SIGMA
0,060 g
Na-Pyruvat-Lösung
140 mL
Fert.-Talp Stock
10 mL
Fertilisierungstropfen:
HHE-Stocklösung
Fert.-Talp Gebrauchslsg.
100 mL Tropfen mit Silikonöl überschichtet
111
120 mL
2 mL
Kulturmedium:
SOFaa(m) Stocklösungen:
a) Stock A:
NaCl
SIGMA S 5886; 1,08 M
KCl
SIGMA P 5405; 0,072 M
KH3PO2
SIGMA P 5655; 0,012 M
MgSO4
SIGMA M 2643
H2O
SIGMA W 1503
Na-Lactat
SIGMA L 4263; 0,042 M
6,290 g
0,534 g
0,162 g
0,182 g
98,40 mL
600 mL
b) Stock B:
NaHCO2
Phenolrot
H2O
2,100 g
0,010 g
100 mL
SIGMA S 4019; 0,25 M
SIGMA P 5530
SIGMA W 1503
c) Stock C:
Na-Pyruvat SIGMA 3662; 0,073 M
H2O
SIGMA W 1503
0,080 g
10 mL
d) Stock D:
CaCl2 x 2H2O SIGMA C 7902; 0,178 M
H2O
SIGMA W 1503
0,262 g
10 mL
e) Glutamin-Stocklösung:
Glutamin
SIGMA G 6392
H2O
SIGMA W 1503
0,292 g
10 mL
112
SOFaa(m)-Kulturmedium:
Myo-Inositol SIGMA I 7508
Gentamycin SIGMA G 3632
H2O
SIGMA W 1503
Glutamine-Stock
Stock A
Stock B
Stock C
Stock D
BME 50x
SIGMA B 6766
MEM 100x SIGMA M 7145
0,05 g
0,005 g
78 mL
100 mL
10,0 mL
10,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
3,0 mL
1,0 mL
Kultur-Tropfen:
SOFaa(m)-Kulturmedium
BSA (FAF)
30 mL Tropfen mit Silikonöl überschichten
10 mL
0,04 g
Lösungen für die RT-PCR
Reverse Transkiption (RT) und Polymerase Kettenreaktion (PCR)
10 x RT-Puffer minus Mg
50nM MgCl2
dNTPs
Random Hexamers (50µM)
RNAse-Inhibitor (20U/µl)
MuLV (Murine Leukemia Virus)Reverse Transkriptase
Kaninchenglobin mRNA
Taq DNA Polymerase
Gen-spezifische Primerpaare
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
Amersham, Bioscienes Europe, Freiburg
Applied Biosystems, CA, USA
Applied Biosystems, CA, USA
Applied Biosystems, CA, USA
BRL, Gaithersburg, MD
Invitrogen, Karlsruhe
MWG-Biotech, Ebersberg
Lysis-Puffer
10nM EDTA, pH 8,0
10nM Tris-HCl, pH 8,0
400µg/ml Proteinase K
1% (w/v) SD
1x TE Puffer
1 nM EDTA nM Tris-HCl pH 8,0
113
8.4
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
Ag
Antigen
Ak
Antikörper
ANOVA
Analysis of Variance
AOS
Abnormal Offspring Syndrome
ART
Assistierte Reproduktionstechniken
AS
Angelman Syndrom
ATP
Adenosintriphosphat
Bax
Bos taurus apoptosis regulator box-a
BLIF
bovine leukemia inhibitory factor
BSA
Bovines Serumalbumin
BWS
Beckwith-Wiedemann Syndrom
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
CG-Dinukleotid
Cytosin-Guanin-Dinukleotid
CO₂
Kohlenstoffdioxid
CpG-Island
Cytosin-Guanin-reiche Region des Genoms
Cx31
Connexin 31
Cx43
Connexin 43
D
dies = Tag
DAB
Diaminobenzidine
deg.
degeneriert
DMR
differentiell methylierte Regionen
DNA
Desoxyribonucleotide Acid = Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
114
DNMT
DNA-Methyltransferase
DNMT1o
Oozytenspezifische DNA-Methyltransferase 1
DNMT1s
Somatische DNA-Methyltransferase 1
DOAD
Developmental Origins of Adult Disease
DOHaD
Developmental Origins of Health and Disease
DVD
Digital video disc
eCG
equines Choriongonadotropin
et al.
et alii
Fa.
Firma
Fab
Antigenbindendes Antikörperfragment
Fas
Rezeptor der Tumornekrosefaktor(TNF)-Familie
FLI
Friedrich-Loeffler-Institut
FOAD
Fetal origins of adult disease
FSH
Follikel-stimulierendes Hormon
GLUT
Glukosetransporter
GnRH
Gonadotropes Releasing Hormon
GR-Promoter
Glukokortikoid-Rezeptor Promoter
GV-Oozyte
Oozyte im Germinalvesikel-Stadium
H19
Histon 19
hCG
humanes Choriongonadotropin
HCl
Salzsäure
HECM
Hamster Embryo Culture Medium
HHE
Heparin-Hypotaurin-Epinephrin-Medium
HRP
Horseradish Peroxidase = Meerrettichperoxidase
HSP
Heat Shock Protein
ICM
Inner cell mass = innere Zellmasse
ICR
Imprinting Control Region
115
I.E./U.
International Einheiten
IETS
International Embryo Transfer Society
Igf2
Insulin-like growth factor 2
IgG
Immunglobulin G
i.m.
intramuskulär
i.v.
intravenös
IVC
In vitro culture = In-vitro-Kultur
IVF
In vitro fertilisation = In-vitro-Befruchtung
IVM
In vitro maturation = In-vitro-Reifung
IVP
In vitro production = In-vitro-Produktion
KB
künstliche Besamung
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplex
LH
Luteinisierungshormon
LOS
Large Offspring Syndrome
MII
Metaphase II
MET
Maternal-Embryonic Transition
mod.
modifiziert
mRNA
messenger ribonucleic acid
N₂
lat. Nitrogenium = Stickstoff
NaCl
Natriumcloride = Kochsalz
NBCS
New born calf serum
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NGS
Normal goat serum
O₂
lat. Oxygenium = Sauerstoff
Oct4
Octamer-4
OPU
Ovum pick up
P
Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit)
116
PBS
sung
Phosphate buffered saline = Phosphat gepufferte Salzlö-
PFA
Paraformaldehyd
PGF2a
Prostaglandin-F 2a
prim.
primär
PVA
Polyvinylalkohol
PVP
Polyvinylpyrrolidon
RB
Retinoblastom
RNA
Ribonucleotide Acid
RNase
Ribonuklease
RT
Raumtemperatur
S.
Seite
SCNT
Somatic Cell Nuclear Transfer
sek.
sekundär
silikon.
silikonisiert
SO
Superovulation
sog.
sogenannt
SOX
Sarcosine oxidase
SOF
Synthetic Oviductal Fluid = Synthetische Eileiterflüssigkeit
Tab.
Tabelle
TCM
Tissue Culture Medium
TE
Trophektoderm
u.
und
u. a.
unter anderem
UFO
unfertilized oocyte
UV-Licht
ultraviolettes Licht
vs.
versus
z.B.
zum Beispiel
117
ZP
Zytoplasma
z.T.
zum Teil
118
9
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10 Danksagung
Zuerst möchte ich mich herzlich bei Frau Prof. Dr. Christine Wrenzycki für die Überlassung des Themas und die gute Betreuung während der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit bedanken. Danke für die Motivation und Unterstützung, die konstruktive Kritik und die schnellen Korrekturen bis zur letzten Sekunde.
Weiterhin gilt mein Dank dem Leiter des Institutes für Nutztiergenetik des FLI Mariensee, Herrn Prof. Dr. H. Niemann, der mit der Bereitstellung des Arbeitsplatzes
und der Tiere große Teile zum Gelingen der Arbeit beigetragen hat.
Für die finanzielle Unterstützung danke ich der „Gesellschaft der Freunde der FAL“.
Prof. U. Besenfelder, Dr. H. Havlicek und Dr. K. Brüning danke ich für das kompetente Anlernen der Technik der transvaginalen Endoskopie und für die technischen
Tipps und Ratschläge zum Erstellen der Transferkapillare.
Nahezu unersetzlich war die Hilfe von meiner Mitdoktorandin Dr. S. Drallmeyer, die
mir während der Endoskopiesitzungen assistierte und ständig mit Geduld und gutem
Rat zur Seite stand.
Auch bei Klaus-Gerd Hadeler bedanke ich mich herzlich. Vor allem für die Unterstützung und technische Hilfe bei den Embryonenspülungen, sowie bei Grit Möller, Rolf
Poppenga und Hans-Georg Sander für die angenehme Zeit in den Stallungen und
die Hilfe mit dem „lieben Vieh“.
Ein ganz besonderer Dank geht an Karin Korsarwe für die hervorragende Einführung
in die IVP und die Hilfe beim Erstellen der Medien und an Doris Herrmann für die Hilfe bei der Durchführung der RT-qPCR, ohne Euch wäre ich so viele Male fast verzweifelt.
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Ich danke natürlich auch allen weiteren fleißigen Mitarbeitern des FLI Mariensee zum
Beispiel für den Ovarientransport, die Hilfe im Stall, Labor oder mit den technischen
Geräten.
Hanna Stinshoff danke ich für die viele Hilfe, das immer offene Ohr, mentaler Unterstützung und für Ihre fachliche Kompetenz!!! Ohne Dich hätte ich es nicht geschafft…
Meinen Mitdoktoranden danke ich für die Kritik, die aufmunternden Worte und das
nette Miteinander während meiner Zeit am FLI.
Auch bei meinen jetzigen Kollegen der Tierklinik am Kaiserberg, möchte ich mich
bedanken. Sie haben mir, soweit es möglich war, in der Endphase den Rücken freigehalten und mich motiviert.
Meiner Familie, meinen Freunden und ganz besonders meiner Freundin Meike danke ich dafür, dass sie mir bis zum Ende Kraft gegeben haben durchzuhalten. Ich
danke für Eure Unterstützung und für die Geduld. Ohne Euch wäre die Durchführung
und Fertigstellung dieser Arbeit niemals möglich gewesen.
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