EGFR-Amplifikation und Expression in Lungenkarzinomen: Eine

Aus dem Pathologischen Institut der Albert-Ludwigs-Universität,
Freiburg im Breisgau
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. M. Werner
EGFR-Amplifikation und Expression in Lungenkarzinomen:
Eine Gewebe-Mikroarray-Untersuchung an 1022 Tumoren
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Albert Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2006
von
Claus Zimmer
geboren in Bonn
2
Dekan
1. Gutachter
2. Gutachter
Prof. Dr. med. Christoph Peters
Prof. Dr. med. Ursus-Nikolaus Riede
Prof. Dr. med. Uwe Martens
Jahr der Promotion 2008
3
DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei all den Personen bedanken, ohne
deren Unterstützung diese Doktorarbeit nicht zustande gekommen wäre.
Ein besonderes Dankeschön gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. med. U.-N. Riede, der
die Arbeit koordiniert und die Arrays gereviewt hat.
Sowie Prof. Dr. med. G. Sauter, welcher wertvolle Beiträge und Ideen zur
vorligenden Dissertation beigesteuert hat.
Ebenso möchte ich mich bei Dr. R. Simon für die stets freundliche und geduldige
Anleitung und Hilfe während der ganzen Zeit meiner Dissertation bedanken.
Dank auch an Dr. D. Matern für die Hilfe beim Reviewen der Arrays und für die
moralische Unterstützung.
Prof. Dr. med. Hasse und seinen Mitarbeitern in der Lungenchirurgie Freiburg
gebührt großer Dank dafür, dass mir die umfassend ausgearbeiteten Patientendaten
zur Verfügung gestellt wurden.
Wertvolle Hilfe erhielt ich auch seitens des Laborteams in der Pathologie des
Kantonspitals Basel. Ein besonderes Dankeschön gilt Frau M. Mirlacher für die
gewandte Einführung in die TMA Technik, für die zahlreichen Tricks und die Hilfe bei
der Arbeit. Ebenso möchte ich mich bei allen weiteren Mitarbeitern des Labor Sauter
für die gute Zusammenarbeit bedanken.
4
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Einleitung
5
2. Material und Methode
10
2.1. Patientengut
10
2.2. Katamnese
10
2.3. Histologische Tumor-Graduierung
10
2.4. Tumorarray-Herstellung
14
2.5. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
16
2.6. EGFR-Immunhistochemie
17
2.7. Statistik
18
3. Resultate
19
3.1. Patientenalter und Pathologisch-anatomische Befunde
19
3.2. Klinische Daten
21
3.3. Therapie
21
3.4. Pathologisch-anatomische Befunde und Prognose
21
3.5. EGFR- FISH
27
3.6. EGFR- Immunhistochemie
30
3.7. Zusammenhang EGFR Expression und Gen Amplifikation
32
4. Diskussion
34
5. Zusammenfassung
44
6. Anhang
45
6.1. Literaturverzeichnis
45
6.2. Lebenslauf
53
5
1.
EINLEITUNG
Im letzten Jahrhundert hat sich das Lungenkarzinom an die erste Stelle der Ursachen
tumorbedingter Todesfälle bei Männern in der westlichen Welt geschoben. Etwa ein
Viertel aller krebstoten Männer sterben an einem Lungenkarzinom (Bray et al., 2004).
Allgemein gesehen sind mehr Männer als Frauen betroffen. Es zeigt sich aber, dass
der Anteil der Frauen unter den Erkrankten schon seit längerer Zeit überproportional
ansteigt.
Die Lungentumore sind eine heterogene Gruppe verschiedener Tumore, deren
Zusammenfassung sich zunächst einmal dadurch begründet, dass der Ort ihrer
Primärlokalisation die Lunge ist. Die Tumore werden durch ihren feingeweblichen
Aufbau, der Histologie, voneinander unterschieden. Auch die Inzidenz ist von diesen
histologischen Unterschieden innerhalb der Gruppe der Bronchialtumore abhängig.
Es erkranken, entgegen der höheren Inzidenz bei Männern für Lungenkarzinome
allgemein, signifikant mehr Frauen als Männer an einem Adenokarzinom der Lunge
(Radzikowska
et
al.,
2002).
Beachtenswert
sind
ebenso
die
erheblichen
geographischen Unterschiede (Moller et al., 1990). So besteht eine sehr hohe
Inzidenz in Schottland, Wales, England, Holland und Finnland, wohingegen in
Brasilien, El Salvador und Guatemala nur sehr wenige Lungenkarzinome beobachtet
werden (Werbeg et al., 1987). Das Lungenkarzinom ist vorwiegend eine Erkrankung
älterer Menschen. 60 Prozent der Patienten, die ein Lungenkarzinom entwickeln sind
älter als 60 Jahre, hingegen nur 5 Prozent jünger als 40 Jahre (Neumann, 1982) In
letzter Zeit wurde jedoch eine ansteigende Inzidenz bei jüngeren Patienten
beobachtet (Negri et al., 1995; Brennan and Bray, 2002].
Äthiologisch ist das Zigaretten-Rauchen der unumstritten dominierende Faktor. Es
besteht eine nahezu lineare Korrelation zwischen pack years (Anzahl gerauchte
Zigaretten pro Tag / 20 mal Jahre) und dem Lungenkarzinom-Risiko (Williams and
Sandler, 2001; Nyberg et al., 1998). Allerdings variiert die Korrelation zwischen den
einzelnen histologisch unterscheidbaren Lungenkarzinomtypen. Beispielsweise ist
der Zusammenhang zur Tabakexposition beim großzellig- undifferenzierten Karzinom
weitaus eindeutiger als bei dem Adenocarzinom der Lunge (Barbone et al., 1997;
Lubin et al., 1984). Andere Faktoren sind relativ unbedeutet, so zum Beispiel Asbest,
6
Staubexposition, Arsen, Chrom und ionisierende Strahlen. Hingegen erhöht sich das
Risiko ein Lungenkarzinom zu entwickeln deutlich, wenn Asbest und Rauchen
zusammenwirken (Hillerdal et al., 1983).
Die Nomenklatur der histologisch unterscheidbaren Lungenkarzinomtypen ist derzeit
im Wandel. Die histologische Differenzierung erfolgt nach der WHO-Klassifikation für
Lungentumore, die in den letzten Jahren mehrfach überarbeitet wurde (Travis et al.,
1999;
Travis
et
al.,
Plattenepithelkarzinome,
2004).
Die
Adenokarzinome,
wichtigsten
Tumortypen
großzellig-
umfassen
undifferenzierte
und
kleinzellige Karzinome. Allerdings sind Mischformen dieser klassischen Typen sehr
häufig, (Muller 1980; Haratake et al., 1986). Diese Tatsache wird bisher bei keiner
der gängigen Klassifikationen ausreichend berücksichtigt.
Klinisch-therapeutisch werden kleinzellige von nicht- kleinzelligen Lungenkarzinomen
unterschieden. Zwischen diesen beiden Gruppen bestehen erhebliche Unterschiede
bezüglich der Prognose, wie auch der Therapie. Kleinzellige Lungenkarzinome
haben zum Zeitpunkt der Diagnose meist schon metastasiert und sind dann nicht
mehr kurativ chirurgisch behandelbar. In diesem Fall besteht die Therapie
vorwiegend aus einer Radio- und/ oder Chemotherapie.
Insgesamt stehen verschiedene Therapieoptionen zur Verfügung. Neben der
chirurgischen Resektion, wird die adjuvante Chemotherapie, Radiotherapie oder
Chemotherapie plus Radiotherapie eingesetzt. Jede dieser Therapien stellt für den
Patienten eine hohe Belastung dar. Dennoch besteht für das Bronchialkarzinom wie
vor eine hohe Mortalität. Für eine patientengerechte Therapieindikationsstellung sind
ein
genaues
Verständnis
der
Tumorbiologie
und
die
Etablierung
weitere
Prognosemarker wünschenswert.
Die Karzinogenese beruht auf der Alteration multipler Gene (Fearon and Vogelstein,
1990; Renen, 1993). Dabei handelt es sich vor allem um Onkogene und
Tumorsuppressorgene. Die Potenz maligner Entartung einer Zelle wird bei
Onkogenen durch vermehrte Aktivierung, bei Tumorsuppressorgenen hingegen
durch Inaktivierung bestimmt. Von Interesse sind in der Tumorentstehung vor allem
Gene mit einer Funktion für die DNS-Reparatur oder der Zellzykluskontrolle.
Inaktivierungen solcher Gene verhindern den reibungslosen Ablauf von DNS-
7
Reparaturmechanismen mit dem Risiko weiterer DNS-Alterationen und/oder steigern
die Zellvermehrung. Für die Entstehung von Lungenkarzinomen sind mehrere
Onkogene und Tumorsuppressorgen- Läsionen beschrieben (Wynder, 1972).
Der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR = HER-1) ist ein 170 kDa großes
Glykoprotein,
das
zu
einer
Gruppe
von
4
strukturell
eng
verwandten
Wachstumsfaktor-Rezeptoren gehört, die als EGFR- oder ErbB- Familie bezeichnet
werden. EGFR ist ein Zelloberflächen-Rezeptor für verschiedene physiologische
Wachstumsfaktoren, darunter Epidermal Growth Factor und Transforming Growth
Factor alpha (TGF alpha) (Prigent and Lemoine, 1992). Die EGFR- vermittelte
Signaltransduktion beginnt mit der Bindung eines Wachstumsfaktors an die
extrazelluläre Domäne des EGF- Rezeptors. Dies löst eine Rezeptor- Dimerisierung
und
über
eine
Autophosphorylierung
von
Tyrosinresten
der
intrazellulären
Tyrosinkinase eine Aktivierung derselben aus. Dadurch werden intrazelluläre
Signalkaskaden induziert, die über eine Stimulierung der Mitose im Zellkern das
Zellwachstum fördern (Daub et al., 1996). Mutationen in dem für EGFR codierenden
Gen können die Aktivität der EGFR- Tyrosinkinase erhöhen und damit die EGFRvermittelte Signaltransduktion verstärken. Als Ursachen kommen dabei neben einer
Überexpression von Wachstumsfaktoren vor allem die Überexpression des EGRRezeptors in Betracht. Die Überaktivität des EGF- Rezeptors verstärkt die
Generierung von Wachstumssignalen und fördert bei Tumorerkrankungen die
Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierung, während die Apoptose reduziert
wird. Dadurch verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen Proliferation und
Apoptose in Richtung eines unkontrollierten Zellwachstums (Salomon et al., 1995).
Wachstumsfaktorrezeptoren haben an Bedeutung gewonnen seitdem gezeigt
worden ist, dass sie - wie im Beispiel von HER-2 - als Therapieziele für
Krebsbehandlungen
genutzt
werden
können.
Trastuzumap
(Herceptin),
ein
humanisierter monoklonaler Antikörper gegen HER-2 wurde, insbesondere in
Kombination mit anderen Chemotherapien, erfolgreich für die Behandlung HER-2
positiver Mammakarzinome eingesetzt (Pegram et al., 1998; Dieras et al., 2001). In
den letzten Jahren wurden mehrere Therapeutika entwickelt, die spezifisch mit EGFR
interagieren. Dazu gehören Anti- EGFR- Antikörper, wie beispielsweise der chimäre
Antikörper IMC-C225 (Fan and Mendelsohn, 1998) und der kürzlich produzierte,
vollständig humanisierte ABX-EGF (Yang et al., 2001) kleine Moleküle wie
8
Quinazolon- Derivate, ZD1839 (Gefitinib), CP-358, 774, Pyrazolo- oder PyroloPyriminidasen (CGP59326, PKI166, PD1, PD158780) (Moyer at al., 1997;
Woodburn, 1999) oder Thyrosinkinase-inhibierende EGF- Konjugate (Uckun et al
1998). Mit der Verfügbarkeit einer solchen Vielzahl von Anti- EGFR- Medikamenten
wurden verschiedene Phase I und Phase II-Studien gestartet (Crombet et al., 2001,
Modjtahedi et al., 1996; Perez-Soler at al 1994) und mit ZD 1839 (=Gefitinib) bereits
der
erste
oral
zu
chemotherapeutisch
applizierende
EGFR-
vorbehandelten
Blocker
Patienten
zur
mit
Behandlung
nicht-
von
kleinzelligem
Bronchialkarzinom in den USA zugelassen.
In zahlreichen Studien, viele davon bereits vor einigen Jahren durchgeführt, konnte
nachgewiesen werden, dass EGFR in einer großen Anzahl verschiedener
Tumortypen überexprimiert wird. Zu den Tumoren bei denen eine EGFRÜberexpression
nachgewiesen
werden
konnte
gehören,
neben
dem
Bronchialkarzinom (Sobol et al., 1987; Gorgoulis et al., 1992; D`Amico et al., 2000;
Cox et al., 2001), vorwiegend Plattenepithelkarzinome, beispielsweise der Haut (Jost
et al., 2000; Krahn et al., 2001) oder des Oesophagus (Ihara et al., 1993) sowie
Tumore des Kopf-Halsbereich (Azemar et al., 2000; Gale et al., 2000) und
Hirntumore wie das Glioblastom (Rainov et al., 1997; Heimberger et al., 2005) und
das Astrozytom (McLendon et al., 2000; Huang et al., 2000).
Dabei zeigt sich, dass EGFR bei den verschiedenen Tumoren in unterschiedlichem
Ausmaß exprimiert wird. Bei Glioblastom findet sich in etwa 50% der Fälle eine
Überexpression (Heimberger et al., 2005). Die Häufigkeit der EGFR- Expression bei
Bronchialkarzinomen ist deutlich geringer, wobei, trotz der Vielzahl der bisher
durchgeführten
Studien,
die
publizierten
Studien
in
ihrer
Gesamtheit
nur
ungenügende Aufschlüsse über das tatsächliche Ausmaß der EGFR- Expression bei
Bronchialkarzinomen geben. Die Angaben variieren zwischen den einzelnen Studien
deutlich.
Um die Häufigkeit der EGFR- Expression in Bronchialkarzinomen möglichst präzise
angeben zu können ist ein Studiendesign mit einem umfassenden Kollektiv mit
großer Fallzahl erforderlich. Die Studie sollte der genauen Differenzierung der
komplexen Histologie der Bronchialkarzinome Rechnung tragen, um aufzuzeigen,
welche subtypischen Merkmale diejenigen Tumore tragen, die EGFR exprimieren
und
diese
selektieren.
Das
könnte
Hinweise
liefern,
was
die
wenigen
9
Bronchialkarzinome, die EGFR exprimieren im Einzelnen auszeichnet. In letzter
Konsequenz wäre damit ein zielgerichteter Einsatz der neuentwickelten Anti- EGFRAntikörper bei Bronchialkarzinomen denkbar.
Von großer Bedeutung hierfür wäre eine standardisierte Untersuchung einer großen
Anzahl Tumore unter Verwendung eines einzigen Protokolls und des gleichen
Antikörpers, sodass die gewonnenen Daten statistisch auswertbar sind. Die kürzlich
im Institutes für Pathologie in Basel und im National Human Genome Research
Institutes
in
Bethesda,
USA
(Olli
Kallioniemi,
Juha
Kononen)
entwickelte
Gewebearray-Technik macht es möglich, eine derartige Studie mit verhältnismäßig
geringem Aufwand durchzuführen (Mousses et al., 2002). Bei diesen Verfahren
werden aus den ursprünglichen in Paraffin eingebetteten Tumorblöcken sehr kleine
(Durchmesser
0.6
mm)
Gewebezylinder
entnommen
und
in
einen
leeren
"Empfänger"- Paraffinblock eingebracht. Ein einziger Paraffinblock bietet dabei Platz
für bis zu 1000 solcher Gewebezylinder. Schnitte von diesem Array-Block erlauben
die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl verschiedener Tumore auf DNSund RNS-Veränderungen wie auch auf Proteinveränderungen. Dies ermöglicht
Studien an einem gut charakterisierten Tumorkollektiv mit bis zu 1000 verschiedenen
Patienten auf jeweils einem einzelnen Gewebeschnitt. Die Beschränkung der
Untersuchung auf ein 0,6 mm großes Tumorfragment stellt sicher, dass der Vergleich
verschiedener molekularer Veränderungen auf die gleiche Zellpopulation eines
potentiell heterogenen Tumors beschränkt ist.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren:
1. Die Herstellung eines Gewebe-Mikroarrays mit Proben von 1022 verschiedenen
Lungentumoren
eines
klinisch
und
katanamnestisch
gut
definierten
Patientenkollektives.
2. Die Entwicklung eines präzisierten Graduierungssystems nach nachträglicher
Revision aller Präparate von zwei Fachpathologen.
3. Die Untersuchung der Häufigkeit von EGFR Gen- Amplifikationen und GenÜberexpression beim Lungenkarzinom sowie deren Beziehung zu Prognose und
dem histologischem Phänotyp.
10
2.
MATERIAL UND METHODEN
2.1. Patientengut.
Das Patientengut umfasste 1022 Patienten, die zwischen 1983 und 1993 von der
Arbeitsgruppe um Prof. Dr. med. Hasse in der Abteilung für Lungenchirurgie des
Universitätskrankenhauses Freiburg an einem primären Lungenkarzinom operiert
wurden und von denen sich katanamnestisch ausreichende klinische Verlaufsdaten
evaluieren ließen. Das Patientenkollektiv umfasste 822 Männer und 200 Frauen. Das
Durchschnittsalter der Patienten lag bei 60,9 Jahren (Range 29 - 86 Jahre).
2.2. Katamnese.
Von allen Patienten wurden retrospektiv Daten über die durchgeführten Therapien
und den klinischen Verlauf erhoben. Diese Daten wurden von der Medizinischen
Klinik des Universitätskrankenhauses Freiburg zur Verfügung gestellt. Letztlich
bezieht sich die vorliegende Arbeit jedoch nur auf die Überlebenszeit (Rohüberleben,
unabhängig von der Todesursache), also auf die Anzahl vollendeter Lebensmonate,
nach dem lungenchirurgischen Eingriff. Zusätzlich vorhandene Risikofaktoren wurden
nicht berücksichtigt. Die Angaben beziehen sich dabei auf das Datum der letzten
klinischen Kontrolle beziehungsweise auf das Todesdatum. Die Daten der Patienten,
die nachweislich aus anderen Gründen als ihrem Tumorleiden verstarben, wurden
nicht in das Studienkollektiv aufgenommen.
Die durch Biopsien, operative und klinische Exploration gewonnenen Daten zum
Tumorstaging,
also
der
anatomische
Lage,
Ausdehnung
und
eventuellen
Metastasierung des Tumors, wurden in der Arbeit berücksichtigt.
2.3.
Histologische Tumor-Graduierung.
Ein Problem bei der histologischen Beurteilung von Bronchialkarzinomen ist, dass die
histologische Tumortypisierung und Graduierung zwischen den untersuchenden
11
Pathologen variieren (Stanley and Matthews, 1981; Field et al., 2004). Diese
Tatsache machte es erforderlich die histologischen Schnitte aller Tumoren erneut
durchzusehen um eine einheitliche Typisierung und Graduierung des sehr
heterogenen Kollektivs zu erlangen.
Hierbei wurde versucht die Tatsache mit einzubeziehen, dass ein einziger
Bronchialtumor zumeist aus mehreren verschiedenen histologischen Typen besteht
(Muller, 1980; Haratake et al., 1986). Dies wird auch in der neuen Auflage der in der
WHO- Kriterien von 2004 nur teilweise berücksichtigt. In der Klassifikation nach WHO
hat bei der Einordnung pluriformer Strukturen zunächst das Vorhandensein
kleinzelliger Areale Vorrang. Danach werden spindel- oder riesenzellige sowie
sarkomatöse Areale mit heterogenen Elementen berücksichtigt. Die Klassifikation
erfolgt dabei nach der höchstdifferenzierten Komponente.
Es erschien folgerichtig der Frage nachzugehen, inwieweit dieses Nebeneinander
von Tumortypen verschiedener Malignität die klinische Prognose beeinflusst.
In Anlehnung an den Gleason- Score für Prostatakarzinome (Gleason, 1966) wurde
ein, nach mikroskopischen Kriterien bewertetes histologisches Grading zur
Beurteilung der Tumore erstellt. Für jeden der 1022 Tumore des Kollektives wurden
bis zu drei histologische Subtypen definiert und deren Differenzierungsgrad
bestimmt. Der Differenzierungsgrad wurde dabei entsprechend der Kriterien WHO
(Travis et al., 2004) in einem Schema von 1 (= hochdifferenziert) bis 4 (=
entdifferenziert) beurteilt. Dabei wurde jeder Tumor im Folgenden der Entität
zugeordnet, die bei Durchsicht aller zu Verfügung stehender Präparate anteilsmäßig
überwiegte. Bei prägnantem, aber im Präparat flächenmäßig geringerem Anteil einer
zweiten oder dritten histologischen Differenzierung, wurde diese zusätzlich
gekennzeichnet und der überwiegenden Entität subtypisch zugeordnet. Die
jeweiligen bis zu drei verschiedenen Differenzierungsgrade wurden miteinander
addiert, so dass eine Score mit einem Wert von 3 bis zu 12 Punkten pro Tumor
resultierte. Bestand ein Tumor nur aus zwei unterschiedlichen Anteilen, so ging der
überwiegende Anteil zweifach, der unterwiegende einfach in die Wertung ein. Bei
nur einem Grad wurde der Wert entsprechend verdreifacht. Zusätzlich wurde das
Ausmaß einer prätherapeutischen Tumornekrose beurteilt und bei ansonsten
hochdifferenzierten Tumoren mit dem Differenzierungsgrad 3, (entsprechend
niedrigdifferenziert) in die Wertung miteinbezogen.
12
Tabelle 1:Grading- System für Bronchialkarzinome
Generelles Scoring- System:
Bei einer einheitlichen Differenzierung
Bei 2 untersch. Differenzierungen
Bei 3 untersch. Differenzierungen
Nekrose = prätherapeutische Tumornekrose Areale
Score 1 x 1 x 1
Score 1 x 1 x 2
Score 1 x 2 x 3
Carcinoma in situ (Csu) zB. SQC-csu
G3
G0
Adenosquamöses BC (ASC) = ADC mit > 5% SQC (SQC-Grading anwenden)
NB: nicht- verhornende-Plattenepithelmetaplasie („Morula“)
G1
Großzelliges BC (LCC) = Grosse Zellkerne und Nucleoli, reichlich Cytoplasma, deutliche
Zellgrenzen, keine PE-Differenzierung (keine Verhornung, keine Interzellularbrücken), keine AdenoDifferenzierung (keine Drüsen).
Subtypen:
1.) LCCrbd
2.) LCCbas
3.) LCCclc
4.) LCClel
(mit rhabdoidem Phänotyp)
(basaloides BC)
(klarzelliges BC)
(lymphoepitheliom-ähnliches BC)
NB:
- LCC + adenoider Restdifferenzierung
- LCC + squamoider Restdifferenzierung
G4
G4
G4
G4
2(x1 = 4) + (x2= 3) = 11
2(x1 = 4) + (x2 =3) = 11
Grading: alle LCC
G4
Plattenepithel-BC (SQC).=.BC mit Verhornung und /oder Interzellularbrücken
Subtypen:
1.) SQCgtc
2.) SQCclc
3.) SQCscc
4.) SQCbac
(papillär)
(klarzellig)
(kleinzellig)
(basaloid)
)
G1 = BC mit großflächig-parakeratotischer-“lineargeschichteter“ Verhornung.
(einzelne Schleimvakuolen können vorkommen).
NB: erst bei dominanter Einzelzellverschleimung und/oder Drüsen = ADC.
G2 = BC mit herdförmig-„kugeliger“ Verhornung (Hornkugel-Bildung),
Basalschicht-Stratifizierung, Interzellularbrücken.
G2-SQC mit Nekrose
>30% = 2(x1 = 2) + (x2 = 3) = 7
G2-SQC mit Sklerose
>60% = 2(x1 = 2) + (x2 = 3) = 7
G3 = BC mit mikrofokaler „Morula“ und /oder Interzellularbrücken.
PE-typ-Stratifizierung. Zytodyskohäsivitätsneigung, inflammatorische
Stromareaktion oder Nekrose >30%
G4
G4
G4
G4
13
Adeno-BC (ADC) = Drüsenbildung (tubulär, azinär) oder schleimbildendes solides BC
Subtypen:
1.) ADCpap =
2.) ADCcyc
3.) ADCmuc
4.) ADCbac
5.) ADCclc
6.) ADCsrc
papilläres ADC:
Alveolardestrukt, Papillen mit fibrovaskulärem Core
tubulär- solides Wachstum
Nekrosen > 30%
(muzinöses Zyst-ADC)
(muzinöses ADC)
(bronchioalveoläres ADC)
(klarzelliges ADC)
(siegelringzelliges ADC)
G2
G3
G3
G2
G2
G2
G2-G4
G4
G1 = Bildung isolierter Drüsen, keine soliden Anteile, kein szirrhöses Stroma
G2 = BC mit soliden Anteilen und Drüsenbildung
BC mit cribriform /papillärem pattern
G2-ADC mit Nekrose
>30% = 2(x1 = 2) + (x2 = 3) = 7
G2-ADC mit Sklerose
>60% = 2(x1 = 2) + (x2 = 3) = 7
G3 = prädominant solides BC mit Einzelzellverschleimung oder Nekrose > 30%
Neuroendokrines BC (NEC) = Zytoplasmaarme BC-Zelle in Rosetten- Rippen- Anordnung,
heterochromatöse-Kerne ohne Nukleolen, mit „nuclear molding“.
Formen:
1.) NECtcd
2.) NECacd
3.) NECscc
(typisches Carcinoid)
(atypisches Carcinoid)
(small cell-NEC)
G1
G2/G3
G4
Subtypen:
1.) NEClcc
(large cell-NEC)
2.) NECscc-lcc (kombiniert sc/lc-NEC)
G4
G4
Salivary- gland-Type Carinoma (SGC).
Formen:
SGCmce
SGCacy
(Mucoepidermoid- Carcinom)
(adenoid- cystisches Carcinom)
14
Tumorstadium und weitere Daten wie das pN Stadium wurden aus den
Pathologieberichten entnommen.
Um eine höhere Validität zu erzielen wurden die, in dieser Arbeit erstellten Daten
bezüglich EGFR- Amplifikation und – Überexpression, jedoch mit der Klassifizierung
der Tumore nach dem gängigen WHO-Schema korreliert.
2.4.
Tumorarray-Herstellung.
Das Tumorarray-Verfahren erlaubt das Einbringen von bis zu 1000 Gewebezylindern
(Durchmesser 0.6mm) von histologisch definierten Regionen verschiedener Tumoren
in einen einzigen Paraffinblock. Aufgrund der Größe des zu untersuchenden
Kollektives, wurden zwei Arrayer mit jeweils über 500 Gewebezylindern hergestellt.
Die Funktionsweise des "Arrayers" ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1. Tumor-Array-Herstellung. Das Instrument besteht aus einem dünnen, an
der Spitze geschärften Hohlzylinder (innerer Durchmesser ca. 600μm), welcher in einem X-YAchsen-Präzisionsgerät gehalten wird. Ein genau in den Hohlzylinder passender Stahlstift
ermöglicht das Ausstoßen von Gewebestücken in mit einem analogen Instrument (äußerer
Durchmesser ca. 600μm) vorgefertigte Löcher im Empfängerblock (Tumor-Array). Ein
verstellbarer "Eindring-Stopper" sichert eine konstante Länge von Zylindern und vorgefertigten
Löchern im Empfängerblock. Bis zu 1000 Gewebezylinder können in einen 20 x 40 mm
messenden Empfänger-Paraffinblock eingebracht werden.
15
Abbildung 3 zeigt den Prototyp des mittlerweile kommerziell erhältlichen ArrayStanzgerätes. Kernstück der Konstruktion sind zwei an der Spitze geschärfte
Hohlzylinder. Die kleinere "Nadel" hat einen äußeren Durchmesser von 0.6 mm.
Diese Nadel wird ausschließlich zum Stanzen von Löchern in die Empfängerblöcke
verwendet. Die dickere Nadel (innerer Durchmesser 0.6 mm) wird für das
Ausstanzen von Tumorgewebestücken aus Spenderblöcken und das Einbringen
dieser Zylinder in die im Empfängerblock vorgestanzten Löcher verwendet. Der
innere Durchmesser dieser zweiten Nadel entspricht dem äußeren Durchmesser der
dünneren Nadel. Abbildung 4 zeigt diesen Teil des ”Gewebearrayers” im Detail.
Abbildung 2. Gewebe-ArrayStanzgerät.
Abbildung 3. Gewebe-ArrayStanzgerät:
Detailaufnahme
der 2 Nadeln. Erklärungen
siehe Text
16
Abbildung 4. Schnitt eines
Gewebe-Arrayers,
HE-
Färbung,
5fache
Vergrößerung.
Der
Durchmesser jedes einzelnen
Gewebespots ist 0,6 mm.:
2.5.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).
Für die FISH- Untersuchung wurde ein Tumorarray-Schnitt ausgewählt. Dieser 5μmSchnitt wurde mit dem VYSIS (VYSIS Inc, Downers Grove,IL) "Formalin pretreatment
kit" gemäss den Empfehlungen des Herstellers vorbehandelt. Für die Hybridisierung
wurde eine kommerziell erworbene Kombinationsprobe für Zentromer 7 (Spectrum
green) und EGFR (Spectrum orange) der Firma Vysis verwendet. Die Hybridisierung
sowie die nachfolgenden Waschprozeduren erfolgten gemäss Vysis- Protokoll, mit
den von der Firma zur Verfügung gestellten Reagenzien. Das Präparat wurde
danach mit 0,2 mM 4‘5-Diamino-2-Phenyl-Indol (DAPI) gegengefärbt. Die Evaluation
der
Hybridisierungsergebnisse
Tumorgewebeprobe
wurde
für
erfolgte
die
semi-quantitativ.
vorherrschende
Für
Tumorzellpopulation
jede
die
durchschnittliche Zahl von Zentromer 7 und EGFR Signalen geschätzt. Eine
Amplifikation wurde dann angenommen, wenn mindestens 5% der Zellen in einem
Präparat
entweder
mehr
als
dreimal
mehr
Gensignale
als
Signale
des
entsprechenden Zentromers, oder eindeutige Konglomerate ("Clusters") von
mindestens fünf Gensignalen aufwiesen.
17
Abbildung 5.
FISH-
Amplifikation:mit
Clusterbildung
mehr
Signale
[grün]).
(dh.
Gensigale
des
deutlich
[rot]
als
Zentromers
Erklärungen
siehe
Text.
2.6.
EGFR Immunhistochemie.
Für die immunhistochemische Untersuchung des Arrays wurde der Antikörper "EGFRezeptor", der Firma Zymed (San Francisco, USA) verwendet. Dabei wurden die
einzelnen Arrayer-Schnitte zunächst deparaffiniert und für 15 Minuten bei 37° mit
Pronase Typ XIV vorbehandelt. Dieser wurde in einem Verhältnis von 1:100
verdünnt, um so eine optimale Anfärbung zu erzielen. Für die Negativkontrollen
wurde der Antikörper weggelassen. Als positive Kontrollen wurden Gewebe mit
bekannter
EGFR-Expression
(Plazenta)
verwendet.
Als
Chromogen
wurde
Diaminobenzidin (Vecta Stain Elite ABC, Vector) eingesetzt. Gewertet wurden
ausschließlich membranöse EGFR- Anfärbungen. Für jeden Tumor wurde die Zahl
der positiven Tumorzellen und die Intensität der Färbung (semiquantitativ
entsprechend einem Score von 0 – 3+ ) geschätzt. Danach wurden die Tumoren in
Kategorien eingeteilt als: negativ (keine Färbung), schwach positiv (EGFR Positivität
erkennbar, aber ungenügend um die Kriterien für starke Positivität zu erreichen).
oder stark positiv (>50% 2+ oder >30% 3+)
18
2.7. Statistik.
Zur
Evaluation
der
Beziehung
zwischen
Stadium,
Malignitätsgrad,
EGFR-
Amplifikation und EGFR- Expression wurden Mehrfeldertests (mehrere Gruppen)
oder der Chi- Quadrat- Test (je zwei Gruppen) verwendet. Die Darstellung der
kumulierten Überlebenskurven erfolgte nach der Methode von Kaplan-Meier (Kaplan
and Meier, 1958). Für die Berechnung der tumorspezifischen Überlebenszeiten
wurden Patienten, welche nicht am Tumor verstarben, ebenso wie derzeit noch
lebende Patienten zum Zeitpunkt der letzten klinischen Kontrolle oder am
Todesdatum als ausgeschieden aus der Verlaufsbeobachtung (Follow-up) gewertet
(censored). Patienten mit unklarer Todesursache wurden für die Berechnung der
tumorspezifischen Überlebenszeit nicht berücksichtigt. Der Einfluss von Grading,
Stadium, EGFR- Amplifikation und EGFR- Expression auf das Patientenüberleben
wurde mittels Log- rank- Tests untersucht. Alle Untersuchungen wurden an
Macintosh Computern unter Verwendung der Software-Pakete Statview 4.0 (Abacus
Concepts Inc.) oder JMP (SAS Institute Inc.) durchgeführt.
19
3. RESULTATE
3.1. Patientendaten und Pathologisch-anatomische Befunde.
Das durchschnittliche Patientenalter beträgt 69.0 Jahre (29 – 86 Jahre). Die mittlere
Nachbeobachtungszeit beträgt 37 Monate (0 - 174 Monate). Ein pT- und pN- Stadium
ist in sämtlichen Operationspräparaten bestimmbar. Das Tumorstadium ist pT1 in
170 Patienten (16,6%), davon 31 (18.2%) hoch maligne, pT2 in 565 (55,3%), davon
140 (24.8%) hoch maligne, pT3 in 190 (18.6%), davon 53 (27.9%) hoch maligne, und
pT4 in 97 (9,5%), davon 27 (27.8%) hoch maligne.
Das pN- Stadium dieser Patienten ist pN0 in 517 (50,6%), pN1 in 176 (17,2%), pN2
in 291 (28,5%), pN3 in 38 Patienten (3,7%). Nodal positiv (pN1-3) waren 43 von 170
pT1 (25.3%), 272 von 565 pT2 (48.1%), 112 von 190 pT3 (58,9%) und 78 von 97
pT4 Tumoren (80.4%) (p= <0.0001).
Tabelle 2:Tumorstadien und Graduierung der Lungentumore
Stadium
T1
T2
T3
T4
gesamt
Gesamt
170
565
190
97
1022
Anzahl hoch
maligne (G4)
(p=0,0001)
Anzahl pN+
(P=>0,0001)
31
18,2
140
24,8 %
53
27,9 %
27
27,8%
251
24,5 %
43
25,3 %
272
48,1 %
112
58,9 %
78
80,4 %
506
49,4 %
Der histologische Tumortyp ist ein Plattenepithelkarzinom (SQC) in 449 (43.9%),
Adenokarzinom (ADC) in 309 (30.2%), Grosszelliges Karzinom (LCC) in 190
(18.6%), Adenosquamöses Karzinom (ASC) in 11 (1.0%), sowie Tumore vom
Salivary Gland Type (SGC) in 6 (0.6%) Fällen. Das Kleinzelliges Karzinom (NEC) ist
mit 57 (5.6%) Tumoren in der Studie deutlich unterrepräsentiert.
Von den 1022 Tumoren sind mit 415 die meisten dem Differenzierungsgrad G3
zugeordnet (40,6%), dem Differenzierungsgrad 2 sind 341 (33,4%) und dem
Differenzierungsgrad 4 251 (24,5%) der Tumore zugeordnet. Gut differenzierte
Tumore (G1) sind mit 15 (1,5%) im Studienkollektiv deutlich unterrepräsentiert. Die
Verteilung Differenzierungsgrade bezogen auf den Tumortypen ist in Tabelle 3
dargestellt. Hier zeigt sich, dass alle Großzelligen Karzinome und 93% der
20
Kleinzelligen
Karzinome
als
entdifferenziert
beurteilt
sind,
wohingegen
Adenokarzinome, Plattenepithelkarzinome und Adenosquamöse Karzinome zumeist
den mittleren Differenzierungsgraden zugeteilt sind. Tumore vom Salivary Gland
Type sind ausschließlich mäßig oder gut differenziert.
Abbildung 6: Verteilung der Tumorentitäten
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
SG C
ASC
NEC
LCC
ADC
SQC
Tabelle 3: Klassifizierung und Differenzierungsgrad der Lungentumore
Differenzierungsgrad
G1
G2
G3
G4
gesamt
Gesamt
15
1,5%
341
33,4%
415
40,6%
251
24.5%
SGC
1
16,7%
5
83,3%
-
-
-
-
6
0,6%
ASC
-
-
8
72,7%
3
27,3%
-
-
11
1,0%
NEC
-
-
2
3,5%
2
3,5%
53
93,0%
57
5,6%
LCC
-
-
-
%
-
-
190
100%
190
18,6%
ADC
8
2,6%
188
60,8%
108
35,0%
5
1,6%
309
30,2%
SQC
6
1,3%
138
30,7%
302
67,3%
3
0,7%
449
43,9%
1022
21
3.2. Klinische Daten.
Da bei der Auswertung nur die Rohüberlebensdaten verwendet wurden, konnte für
jeden
Patienten
eine
Überlebenszeit
berechnet
werden.
Die
mittlere
Beobachtungszeit des Überlebens beträgt 37 Monate (1- 174 Monate). Bei 400
(39.1%) der 1022 Patienten trat innerhalb des Beobachtungszeitraumes ein Rezidiv
nach einer mittleren Zeit von 62,5 Monaten (43- 142 Monaten) auf. Ort des Rezidivs
ist in 176 Fällen (44.0%) Fernmetastasen, in 158 Fällen (39.5%) lokoregionale und
bei 66 Patienten (16.5%) lokoregionale und Fernmetastasen. Daten über eine
einheitliche Raucheranamnese sind leider retrospektiv nicht mehr zu erheben.
3.3
Therapie.
Das Bronchialkarzinom von 63 (10.3%) der 1022 beobachteten Patienten ist bereits
vor dem operativen Eingriff therapeutisch behandelt worden. Dabei erfolgte eine
neoadjuvante
Chemotherapie
bei
14
(1,4%)
Patienten,
eine
neoadjuvante
Radiotherapie bei 10 (0.9%). Bei 7 (0.7%) Patienten wurden beide Therapien
kombiniert. Zudem wurden 32 (3.1%) Patienten voroperiert. Bei 941 (92.1%) erfolgte
eine vollständige Tumorextirpation, 25 (2,5%) Patienten wurden R1- und 55 (5.4%)
Patienten R2- reserziert. 314 (30.7%) Patienten haben eine postoperative lokale
Radiotherapie erhalten, davon 9 (0.9% aller Patienten) als Afterloading- Therapie.
Eine systemische adjuvante Chemotherapie ist bei 36 (3.5%) Patienten erfolgt. 24
(2.4%)
Patienten
erhielten
sowohl
eine
adjuvante
Radio-
als
auch
eine
Chemotherapie.
3.4.
Pathologisch-anatomische Befunde und Prognose.
Die Beziehungen der makroskopischen und histologischen Zusammenhänge mit der
Patientenprognose sind in den Abbildungen (7-12) zusammengefasst. Wie erwartet
ist dabei das pT- und das pN- Stadium eng (und unabhängig) mit dem
Krankheitsverlauf assoziiert (p< 0.0001 in beiden Fällen). Die prognostische
22
Signifikanz des pT- Stadiums ist bereits 1983 in einer Studie von Giedl et al
dargestellt worden. Die Prognose ist insbesondere bei den Patienten mit pT1- und
pT2- Tumoren deutlich günstiger als bei Tumoren fortgeschrittener Stadien (siehe
Abbildung 7). Während dem die Unterschiede zwischen den Stadien pT1 und pT2
bzw. pT2 und pT3 signifikant sind, sind die Verlaufsunterschiede zwischen Patienten
mit pT3- und pT4- Tumoren weniger stark unterschiedlich. Wie bereits mehrfach in
der Literatur beschrieben (Rea et al., 2004, Ueda et al. 2003), ist auch der
Nodalstatus eng mit der Prognose der Patienten vergesellschaftet (Abbildung 8).
Insbesondere die Prognose der Patienten mit einem pN0 Stadium ist vergleichsweise
günstig (60% der Patienten überlebten länger als 100 Monate). Bereits ein
Tumorstadium pN1 ist mit einer deutlich ungünstigeren Prognose vergesellschaftet.
Tumorerkrankungen mit einem Stadium pN2 verlaufen noch etwas ungünstiger wobei
dann allerdings keine Unterschiede mehr zwischen pN2 und pN3 Patienten
feststellbar sind. Wie nicht anders zu erwarten ist insbesondere das pN- Stadium
prognoserelevant.
Da das Staging von dem pT- und pN-Stadium abhängig ist zeigt sich
erwartungsgemäß eine Korrelation mit der Patienten-Prognose und dem Staging
(p<0.0001) (siehe Abbildung 9). Dieser Zusammenhang entspricht den Resultaten
einer Studie bei nicht- kleinzelligen Lungenkarziomen von Jassem et al. (Jassem et
al., 2000).
Auch der histologische Differenzierungsgrad hat einen Einfluss auf die Prognose. Vor
allem die gut und mäßig differenzierten Tumore haben ein signifikant längeres
Überleben. Zwischen den undifferenzierten Tumoren mit dem Differenzierungsgrad
G3 und G4 treten keine Unterschiede bezüglich der Prognose auf, daher wurden
diese in der Abbildung 10 zusammengefasst. Insgesamt ist der Differenzierungsgrad
jedoch im Gegensatz zum Tumorstadium weniger eng mit der Prognose assoziiert.
Abbildung 10 zeigt den Zusammenhang bezogen auf das etablierte WHO- Grading
der
Tumorpatienten.
Die
Überlebensunterschiede
zwischen
Tumoren
unterschiedlicher Differenzierungsgrade ist signifikant (p= 0.0117).
Abbildung 11 zeigt die Beziehung zwischen dem für diese Untersuchung
entwickelten Gradierungssystem und dem Überleben. Da die Tumore der Kategorien
3,4 und 5 insgesamt zu selten in dem Kollektiv vertreten sind (total 24 Fälle, 2,3%
aller Patienten), konnten diese bei der Auswertung nicht berücksichtigt werden. Die
Abbildung zeigt wenig dramatische Prognoseunterschiede zwischen den übrigen
23
Gruppen. Die prognostische Relevanz (p= 0.027) ist dabei geringer, als bei dem
etablierten WHO- Graduierungssystem. Die potentielle Relevanz der histologischen
Scores wird insbesondere bei Zusammenfassung der Scores 3-5 (Gruppe A), 6
(Gruppe B), 7-9 (Gruppe C) und 10-12 (Gruppe D) deutlich (Abbildung 12). Trotzdem
muss
festgestellt
werden,
dass
auch
dieses
neue
Gradingsystem
keine
prognostische Relevanz besitzt, die derjenigen des pTNM Systems nahe kommt.
Abbildung 7. Prognose nach pT für alle Tumore (p<0,0001).
24
Abbildung 8. Prognose nach pN für alle Tumore (p<0,001).
Abbildung 9. Prognose nach Staging für alle Tumore (p<0.0001).
25
Abbildung 10.Prognose nach WHO -Grad (1-3) für alle Tumore(p=0,117).
Abbildung 11.Prognose nach Malignitäts-Score (6-12) für alle Tumore
(p=0,254).
26
Abbildung 12.Prognose nach Malignitäts-Score zusammengefasst (Gruppen AD) für alle Tumore (p=0,1090)
27
3.5.
EGFR- FISH
Die FISH- Untersuchung mit einer Kombinationsprobe für EGFR und Centromer 7
ergibt in 765 von 1022 Tumoren ein auswertbares Resultat (74,9%). Die Beziehung
zwischen EGFR- Genkopienveränderungen und den klinischen und histologischen
Parametern ist in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4. EGFR Amplifikation
analysierbar
alle
Tumore absolut
in %
gesamt
Stadium
pN
Grad
Histol.
Geschl,
*Normal
pT1
pT2
pT3
pT4
PN0
pN1
pN2
pN3
1
2
3
4
ADC
LCC
NEC
SQC
Rest
m
w
1022
170
565
190
97
517
176
291
38
15
342
414
251
309
190
57
449
17
822
200
765
125
415
149
76
388
127
216
34
11
247
317
190
220
146
40
352
7
622
143
Normal *
absolut
74.9
73.5
73.5
78.4
78.4
75.0
72.2
74.2
89.5
73.3
72.2
76.6
75.7
71,2
77.7
70.2
78.4
41,2
75.7
71.5
529
88
290
98
53
271
89
143
26
8
168
221
132
154
94
35
241
5
433
96
in %
Zugewinn*
absolut
69.2
70.4
69.9
65.8
69.7
69.8
70.1
66.2
76.5
72.7
68.0
69.7
69.5
70,0
64.4
87.5
68.5
71.4
69.6
67.1
193
36
101
38
18
98
33
55
7
3
67
76
47
60
41
5
85
2
150
43
in %
Amplifiziert*
absolut
25.2
28.8
24.3
25.5
23.7
25.3
26.0
25.5
20.6
27.3
27.1
24.0
24.7
27,3
28.1
12.5
24.1
28.6
24.1
30.1
43
1
24
13
5
19
5
18
1
0
12
20
11
6
11
0
26
0
39
4
in %
5.6
0.8
5.8
8.7
6.6
4.9
3.9
8.3
2.9
0.0
4.9
6.3
5.8
2,7
7.5
0.0
7,4
0.0
6.3
2.8
= selbe Anzahl von Centromer 7und EGFR- Gensignal
*Zugewinn = > 5%der Zellen im Präparat 2-3 mal mehr EGFR- Gensignal als Anzahl Centromer 7
*Amplifiziert= > 5%der Zellen im Präparat > 3 mal mehr EGFR- Gensignal als Anzahl Centromer 7 oder Clusters > 5 Gensignale
5,6% der Tumoren zeigen eine EGFR- Amplifikation. Zusätzliche 25,2% der Tumoren
zeigen eine geringgradige EGFR- Vermehrung (im Vergleich der Centromer 7Anzahl).
Die
Gründe
Hybridisierungsprobleme
für
nicht
(schwache
informative
Hybridisierung,
Untersuchungen
waren
Hintergrundanfärbung,
Gewebeschädigung), aber auch mit der Array-Technologie im Zusammenhang
stehende technische Schwierigkeiten. Dazu gehört das Fehlen von Gewebestücken
an einzelnen Arraypositionen und nicht repräsentative Biopsien ohne oder mit zu
wenigen Tumorzellen (< 50) im Stanzzylinder. Die meisten Gewebestücke enthalten
28
aber zwischen 600 und 1300 Tumorzell-Anschnitte. EGFR- Genveränderungen sind
bei Männern und Frauen gleich häufig (p=0,1205) und nicht mit dem Tumorstadium
(p=0,1728), dem Nodalstatus (p=0,5228) oder dem Differenzierungsgrad (p=0,9354)
korreliert. Die Beziehung zwischen EGFR- Genveränderungen und dem klinischen
Verlauf ist in Abbildung 13 dargestellt. Dabei zeigt sich eine Tendenz zu
ungünstigerer Prognose bei EGFR- amplifizierten Tumoren als bei Tumoren mit
normaler EGFR/Centromer 7-Ratio bzw. einem EGFR Zugewinn. Dieser Unterschied
erweist sich jedoch nicht als statistisch signifikant (p=0,0629). Die Korrelation
gewinnt an Deutlichkeit, wenn man die amplifizierten den nicht- amplifizierten
Tumoren der einzelnen Tumor- Subtypen des Bronchialkarzinoms gegenüberstellt.
Während die EGFR- Amplifikation in keinem Zusammenhang mit dem Überleben bei
Plattenepithelkarzinomen zu stehen scheint, ist ein signifikanter Zusammenhang
bezüglich der Prognose bei großzellig- undifferentierten Karzinomen (Abbildung 14,
p=0,04) und vor allem Adenokarzinomen (Abbildung 15, p=0,0015) darstellbar.
Abbildung 13. Prognose nach EGFR- Amplifikation für alle mittels FISH
analysierbare Tumore (p=0,0629).
29
Abbildung 14. Prognose nach EGFR- Amplifikation für LCC (p=0,0440).
Abbildung 15. Prognose nach EGFR- Amplifikation für ADC (p=0,0015).
30
3.6 EGFR Immunhistochemie
Von den 1022 Tumoren der Studie sind 910 (89,0%) auswertbar. 191 (21,0%) der
auswertbaren Tumoren sind immunhistochemisch EGFR- negativ und 189 (20,8%)
mäßig EGFR- positiv. Eine starke EGFR Expression ist bei 530 (58,2%) Tumoren
nachweisbar. Die Beziehung zwischen EGFR Expression und histologischen bzw.
klinischen Parametern ist in Tabelle 5 dargestellt. Es finden sich keine Unterschiede
in der EGFR Expression zwischen männlichen und weiblichen Patienten (p=0,5162).
Der Vergleich der EGFR Expression zwischen Patienten unterschiedlicher pTStadien ergibt ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (p=0,0833). Die EGFR
Expression ist nicht mit dem Nodalstatus korreliert (p=0,9644). Dies wiederspricht
einer neueren Studie von Suzuki et al. in der eine signifikante Korrelation der EGFRÜberexpression mit dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen bei nichtkleinzelligen Lungentumoren dargestellt werden konnte (Suzuki et al., 2005).
Tabelle 5. EGFR Expression
analysierbar
absolut in %
negativ
absolut in %
schwach
absolut in %
stark
absolut in %
1022
910 89.0
191 21.0
189 20.8
530 58.2
pT1
170
153 90.0
36 23.5
36 23.5
81 52.9
pT2
565
503 89.0
114 22.7
105 20.9
284 56.5
pT3
190
170 89.5
22 12.9
33 19.4
115 67.6
pT4
97
84 86.6
19 22.6
15 17.9
50 59.5
PN0
517
469 90.7
100 21.3
100 21.3
269 57.4
pN1
176
146 83.0
27 18.5
32 21.9
87 59.6
pN2
291
262 90.0
58 22.1
50 19.1
154 58.8
pN3
38
33 86.8
6 18.2
7 21.2
20 60.6
1
15
11 73.3
2 18.2
5 45.5
4 36.4
2
342
300 87.7
55 18.3
67 22.3
178 59.3
3
414
369 89.1
48 13.0
77 20.9
244 66.1
4
251
230 91.6
86 37.4
40 17.4
104 45.2
ADC
309
276 89,3
74 26,8
70 25,4
132 47,8
LCC
190
173 91.0
40 23.1
35 20.2
98 56.6
Histologie NEC
57
52 91.2
45 86.5
SQC
449
402 89.5
Rest
17
7 41,2
1 14.3
m
822
742 90.3
w
200
168 84.0
alle
Tumoren
gesamt
Stadium
pN
Grad
Geschl.
31
7.7
5
9.6
79 19.7
0
2
3.8
292 72.6
0.0
6 85.7
151 20.4
158 21.3
433 58.4
40 23.8
31 18.5
97 57.7
31
Die separate Untersuchung von Tumoren unterschiedlicher histologischer Subtypen
ergab eine besonders häufige EGFR Expression für Plattenepithelkarzinome. So ließ
sich bei 292 von 402 (72,6%), also rund drei Vierteln aller Tumore dieses Subtyps,
immunhistochemisch
deutlich
vermehrte
EGF-
Rezeptorzahlen
nachweisen
(Abbildung 16).
Bei Adenokarzinomen und undifferenziert- großzelligen Karzinomen ist das
Verhältnis zwischen nicht, oder nur wenig und stark EGFR exprimierenden Tumoren
nahezu ausgeglichen. 132 von 276 (47,8%) der Adenokarzinome und 98 von 173
(56,6%) undifferentiert- großzelligen Karzinomen sind positiv. Besonders selten ist
die EGFR Expression bei Tumoren mit neuroendokriner Differenzierung (3,8%).
Statistisch signifikant ist auch die Beziehung zwischen EGFR Expression und dem
Differenzierungsgrad (p=<0,0001). Hier gilt interessanterweise, dass besonders hoch
(G1) und besonders wenig differenzierte Tumoren (G4) weniger EGFR positiv sind,
als die intermediär differenzierten Tumoren (G 2-3).
Die
Beziehung
zwischen
der
immunhistochemisch
nachweisbaren
EGFR-
Expression und dem Patientenüberleben ist in Abbildung 17 dargestellt. Die
Darstellung zeigt eindeutig, dass eine EGFR- Expression beim Bronchialkarzinom
keine Prognoserelevanz besitzt.
Abbildung 16. EGFR- Expression nach Tumor- Subgruppen
450
400
350
300
292
250
132
200
150
50
0
negativ
98
100
144
2
50
75
NEC
LCC
ADC
positiv
110
SQC
32
Abbildung 17. Prognose nach EGFR- Expression (p=0,5630).
3.7 Zusammenhang EGFR Expression und Gen Amplifikation
735 der 1022 (71,9%) Tumoren sind sowohl immunhistochemisch, als auch mittels
FISH auswertbar. Es besteht eine enge Assoziation zwischen Expression und
Amplifikation (p=<0.0001, Tabelle 6). Bemerkenswerterweise findet sich bei allen
EGFR- amplifizierten Tumoren eine starke EGFR- Expression. (Abbildung 18).
Tabelle 6. Beziehung EGFR Expression und EGFR Amplifikation
EGFRExpression
Gesamt
in %
Normal*
in %
Zugewinn*
in %
Amplifiziert
*
in %
negativ
135
18,3
112
83,0
23
17,0
0
0,0
schwach
149
20,3
114
76,5
35
23,5
0
0,0
stark
451
61,4
274
60,8
134
29,7
43
9,5
Gesamt
735
100,0
500
68,0
192
26,1
43
5,9
*Normal
= selbe Anzahl von Centromer 7und EGFR- Gensignal
*Zugewinn = > 5%der Zellen im Präparat 2-3 mal mehr EGFR- Gensignal als Anzahl Centromer 7
*Amplifiziert= > 5%der Zellen im Präparat > 3 mal mehr EGFR- Gensignal als Anzahl Centromer 7 oder Clusters > 5 Gensignale
33
Abbildung 18. Beziehung EGFR Expression und EGFR Amplifikation
45,0%
40,0%
35,0%
9,5%
30,0%
25,0%
Amplifikation
Zugewinn
20,0%
15,0%
10,0%
29,7%
23,5%
17,0%
5,0%
0,0%
negativ
schwach
stark
34
4.
DISKUSSION
Die Hauptarbeit der vorliegenden Dissertation war die Zusammenstellung eines
Lungenkarzinomkollektivs
Operationspräparate
von
wurden
mehr
als
herausgesucht
1'000
und
Patienten.
die
Sämtliche
HE-Schnitte
erneut
durchgesehen und nach einheitlichen Kriterien nachbeurteilt. Die histologischen
Daten wurden mit einer Liste mit Verlaufsdaten kombiniert, die in der Lungenchirurgie
Freiburg erstellen wurde. Danach wurden jeweils die Gewebeblöcke mit den
optimalen Schnitten herausgesucht und die repräsentativen Tumorareale markiert.
Diese Arbeit umfasste ca. 6 Monate. Die Herstellung der Gewebearrays konnte dann
in nur wenigen Tagen realisiert werden. Die immunhistochemische Untersuchung
erforderte zwei Arbeitstage, die Auswertung der gefärbten Schnitte lediglich etwa
eine Stunde. Die FISH- Untersuchung konnte ebenfalls in nur zwei Arbeitstagen
erfolgen, die Auswertung war in circa einer Woche zu realisieren. Fast man nun die
Gesamtarbeitszeit dieser Studie zusammen, dann muss festgehalten werden, dass
eine Untersuchung, die die Färbung traditioneller Großschnitte eingeschlossen hätte,
insgesamt wohl nicht wesentlich länger gedauert hätte (ca. 2x länger). Der Vorteil
des jetzt gewählten Verfahren ist aber, dass ein Gewebearrayblock zur Verfügung
steht, von dem weitere 200 Schnitte hergestellt werden können. Das heißt, dass es in
der Zukunft möglich sein wird, die Bedeutung eines potentiellen Therapiezieles (oder
auch Prognosemarkers) beim Bronchialkarzinom innerhalb von wenigen Tagen an
einem Kollektiv von ca. 1'000 Patienten zu untersuchen. Dies unterstreicht die
enorme Potenz der Gewebearraytechnik. Die Gewebetechnik ist heute eine etablierte
Methode für Untersuchungen zur molekularen Epidemiologie bzw. zur Klärung der
prognostischen Relevanz von molekularen Veränderungen (Bubendorf et al., 2001).
Mehrere Studien haben gezeigt, dass an Gewebearrays erzielte Ergebnisse trotz der
geringen Größe der einzelnen untersuchten Gewebefragmente repräsentative
Ergebnisse ergeben. Beispielsweise hatte eine Untersuchung an einem Array aus
2197 Gewebeproben mit der Literatur vergleichbare Häufigkeiten der Amplifikation
von HER-2, EGFR, MYC, CCND1 und MDM2 beim Mammakarzinom ergeben (AlKuraya et al., 2004). Bei einer dieser Untersuchungen waren systematisch
Gewebefragmente aus verschiedenen Stellen der Tumorperipherie und dem
Tumorzentrum entnommen worden. Diese Studie hatte keine Unterschiede in den
Ergebnissen zwischen den verschiedenen Entnahmeorten ergeben was dafür
35
spricht, dass die in Einzelfällen sicher relevante Tumorheterogenität für die
Ergebnisse von Tumorarrayuntersuchungen kein kompromittierender Faktor ist
(Sauter and Mirlacher, 2002). Nachdem die erste Serie von Gewebearraystudien
insbesondere dafür konzipiert worden war die Technik zu validieren, wurden in den
letzten Jahren verschiedene Studien abgeschlossen, welche mittels Tumorarrays
neue, biologisch relevante Daten generierten. So wurde beispielsweise auch unter
Verwendung der für diese Studie gefertigten Gewebearrayers die Frequenz der
Expression von Ep-CAM bei Kolon- Lungen- Prostata- und Magenkarzinomen
untersucht (Went et al., 2006). Für EGFR war bereits vorgängig eine Untersuchung
an einem Multitumorarray mit dem gleichen Antikörper und dem gleichen
Färbeprotokoll erfolgt. In dieser Voruntersuchung war eine EGFR- Expression in nur
37% der Bronchialkarzinome gefunden worden (unveröffentlichte Daten von Prof. G.
Sauter). Möglicherweise ist die in dieser Untersuchung deutlich höhere Zahl der
EGFR- Positivität durch Unterschiede in der Gewebebehandlung bedingt (alle Fälle
des Bronchialkarzinomarrays wurden in Freiburg histologisch untersucht, der
Multitumorarray jedoch in Basel). Außerdem ist es möglich, dass die Verwendung
von ganz frischen Gewebeschnitten eine höhere Sensitivität bedingt hat als die
Verwendung
von
etwas
Multitumorarrayuntersuchung.
immunhistochemischen
älterer
Diese
Schnitten
Diskrepanz
Untersuchung
auf:
für
die
zeigt
die
Trotz
vorangegangene
Sensibilität
vermeintlich
einer
identischer
Untersuchungsbedingungen, können kleinste Abweichungen bereits zu deutlich
divergierenden Ergebnissen führen.
Mit Gewebearrays ist es möglich, innerhalb kurzer Zeit die Epidemiologie der
Expression eines interessierenden Gens zu untersuchen. Dabei besteht die Stärke
der Technik vor allem darin, die klinische Relevanz von relativ seltenen molekularen
Veränderungen
zu
überprüfen,
möglicherweise
geringen
bei
Bedeutung
denen
der
Aufwand
und
dem
Risiko
angesichts
eines
der
negativen
Studienergebnisses mit traditionellen Methoden der molekularen Pathologie
(klassische Schnittpräparate) ansonsten zu groß wäre.
Die Verteilung der verschiedenen Lungenkarzinome im Studienkollektiv entspricht
nicht den in der Literatur angegebenen Häufigkeiten (Riede et al. 2004), da das
kleinzellige Karzinom deutlich unterrepräsentiert ist. Entgegen der beschriebenen
Prävalenz von 15-20% aller Lungentumore sind im Gewebearrayer nur 5,6%
36
kleinzellige Tumore enthalten. Dies ist darin begründet, dass ausschließlich
Operationspräparate von Primärkarzinomen in das Studienkollektiv aufgenommen
wurden, für das histologisch gesicherte kleinzellige Karzinom jedoch keine
therapeutische Operationsindikation besteht. Umgekehrt gibt der dann jedoch relativ
hohe Anteil dieses Bronchialkarzinoms einen Hinweis darauf, wie häufig sich erst
postoperativ die Entität eines Lungentumors diagnostizieren lässt. Des weiteren
kommen großzellige Karzinome deutlich häufiger vor als in der Literatur beschrieben
(18,6% versus 5-10%). Die statistische Verschiebung aufgrund der etwa 10%
„fehlender“ Kleinzeller erklärt das nicht ausreichend. Neben einer tatsächlichen
Zunahme von großzelligen Karzinomen wäre auch eine technisch bedingte
Erklärungen denkbar, wie beispielsweise eine längere Konservierbarkeit oder
bessere Verwendbarkeit des Gewebes für die 0,6 mm durchmessenden Zylinder des
Arrayers. In Tabelle 7 und 8 wird die Verteilung der Bronchialkarzinomtypen dieser
Studie mit einem Kollektiv von 1535 Gewebsproben einer ebenfalls unter Leitung von
Prof. Riede erstellte Dissertation verglichen (Michel, 1991). Die Untersuchung enthält
neben Operationspräparaten zum größeren Teil Biopsiematerial, auch in dieser
Studie wurden alle Gewebe gereviewt. Da dies in beiden Studien vom selben
Untersucher erfolgte sind die Ergebnisse untereinander vergleichbar. Der Zeitraum
1984-88 ist in beiden Kollektiven abgebildet, die Prävalenzen unterscheiden sich
aber auch in diesen Jahren deutlich. Bemerkenswert ist, dass das Kollektiv der
vorliegenden Dissertation in den selben Jahren signifikant mehr Adenokarzinome
enthält, als die Vergleichsarbeit. Dies setzt sich auch in den Jahren 1989-93 fort.
Hingegen ist die Anzahl der Großzeller in beiden Kollektiven vergleichbar aber im
Vergleich
zur
Literatur
erhöht
abgebildet.
Letzteres
wäre
mit
der
Untersucherabhängigkeit der histologischen Klassifikation zu erklären (Haratake et
al., 1986; Field et al., 2004).
37
Tabelle 7: Verteilung der Lungentumore, 1535 Fälle (Dissertation Michel, 1991)
ADC
LCC
NEC
SQC
Rest
gesamt
1984
48
20,7%
31
13,4%
52
22,4%
94
40,5%
7
3,0%
232
100%
1985
47
18,1%
45
17,3%
64
24,6%
99
38,1%
5
1,9%
260
100%
1986
60
20,1%
57
19,1%
53
17,8%
116
38,9%
12
4,0%
298
100%
1987
76
22,7%
56
16,7%
64
19,1%
132
39,4%
7
2,1%
335
100%
1988
100
24,4%
75
18,3%
81-
19,8%
142
34,6%
12
2,9%
410
100%
Alle
331
21,6% 264 17,2%
314
20,5%
583
38,0%
43
2,8% 1535 100%
Tabelle 8: Verteilung der Lungentumore, 1022 Fälle (Studienkollektiv)
ADC
LCC
NEC
SQC
Rest
gesamt
1983
10
20,4%
7
14,3%
4
8,2%
27
55,1%
1
2,0%
49
100%
1984
12
38,7%
4
12,9%
2
6,5%
12
38,7%
1
3,2%
31
100%
1985
30
34,5%
11
12,6%
4
4,6%
41
47,1%
1
1,2%
87
100%
1986
26
39,9%
19
20,4%
7
7,5%
38
40,8%
3
3,2%
93
100%
1987
32
26,9%
22
18,5%
8
6,7%
55
46,2%
2
1,7%
119
100%
1988
31
29,8%
25
24,0%
4
3,9%
43
41,3%
1
1,0%
104
100%
1989
27
25,5%
22
20,8%
5
4,7%
49
46,2%
3
2,8%
106
100%
1990
37
30,6%
26
21,5%
6
5,0%
50
41,3%
2
1,6%
121
100%
1991
39
37,9%
23
22,3%
4
3,9%
37
35,9%
0
0,0%
103
100%
1992
29
25,4%
19
16,7%
11
9,7%
53
46,5%
2
1,7%
114
100%
1993
36
37,9%
12
12,6%
2
2,1%
44
46,3%
1
1,1%
95
100%
Alle
309
30,2% 190 18,6%
57
5,6%
449
43,9%
17
1,7% 1022 100%
Es zeigt sich, dass das die Verteilung der Tumorsubtypen in einem Kollektiv von
Bronchialkarzinomen großen Schwankungen unterlegen ist. Dies erklärt sich aus der
Definition des Kollektivs selber (beispielsweise nur Operationspräparate) aber auch
aus technischen Gründen wie möglicher Probleme bei der Konservierung oder
Färbung bestimmter Subtypen. Des weiteren ist die histologische Klassifikation
untersucherabhängig. Aufgrund der Polymorphie des Bronchialkarzinoms erscheint
selbst ein umfassendes Kollektiv von mehr als 1000 Fällen noch starken statistischen
Schwankungen unterworfen zu sein und somit sind noch größere Fallzahlen letztlich
erforderlich.
38
Mindestens 12 vorangegangene Studien haben die EGFR- Expression beim
Bronchialkarzinom untersucht. 10 dieser Untersuchungen beziehen sich auf nichtkleinzellige- Tumore, eine ausschließlich auf Plattenepithel- und eine auf
bronchioalveoläre Adenokarzinome. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 6
zusammengefasst.
Tabelle 9 Literaturbefunde: EGFR- Überexpression bei Lungentumoren
EGFRÜberexpression
32.0%
13.0%
42.8%
33.7%
48.5%
78.0%
62.0%
80.6%
59.5%
34.0%
89.0%
90.0%
Anzahl
Patienten
96
298
290
83
97
60
183
36
111
181
18
15
Tumortyp
NSCLC
NSCLC
NSCLC
NSCLC
NSCLC
NSCLC
NSCLC
NSCLC
NSCLC, nur pT1
NSCLC
SQC
ADC
Literatur
Rusch, V. et al.,1997
Reissmann, P et al., 1999
Ohsaki, Y et al.,2000
Brabender,J et al., 2001
Toyoshima, E et al., 2001
Mukohara, T. et al., 2003
Hirsch FR et al.,2003
Kanematsu, T. et al., 2003
Onn, A. et al., 2004
Suzuki, S. et al.,2005
Gorgoulis, V. et al., 1993
Erman, M. et al., 2005
Die Häufigkeit der EGFR- Positivität variiert zumindest zwischen einzelnen der
vorangegangenen Studien dramatisch. Die Häufigkeit einer EGFR- Expression bei
nicht- kleinzelligen Tumoren wird zwischen 13,0 und 80,6 % angegeben (in einer
Studie von Erman, M. et al. sogar 90,0 %, wobei sich diese nur auf ein kleines
Kollektiv von ausschließlich bronchioalveoläre Adenokarzinome bezieht).
Die Inkonstanz der Resultate macht die Schwäche immunhistochemischer
Untersuchungen
deutlich.
Offenbar
kann
die
Verwendung
unterschiedlicher
Antikörper, unterschiedlich fixierten Geweben, verschiedener Färbeprotokolle oder
unterschiedlicher Auswertungskriterien zu deutlich unterschiedlichen Beurteilungen
führen. Dieses Problem wird insbesondere dann bedeutsam, wenn aufgrund von
Literaturdaten entschieden werden soll, ob bei einem bestimmten Tumortyp ein
neues Medikament erprobt werden soll. Dies ist angesichts der hohen Kosten
klinischer Studien von großer Bedeutung. Darüber hinaus ist es sinnlos ein potentiell
wirksames Experiment am einem Tumortyp zu erproben, an dem sich seine
Wirksamkeit nicht beweisen lässt.
39
Die Ergebnisse dieser Untersuchung machen deutlich, dass eine EGFR- Expression
beim Bronchialkarzinom zwar nicht prognoserelevant, aber so häufig ist, dass gegen
das EGFR gerichtete Therapien auch bei diesem Tumortyp vielversprechend sein
dürften.
Aufgrund der hohen, in besonderem Maße vom jeweiligen Untersucher abhängigen,
Variabilität in der Diagnostik histologischer Präparate war eine erneute komplette
Durchsicht der Schnitte aller Tumoren erforderlich. So konnte eine einheitliche
Typisierung und Graduierung des sehr heterogenen Kollektivs erzielt werden.
Eine bekannte Problematik der histologischen Klassifikation von Bronchialtumoren
stellt hierbei deren morphologische Heterogenität dar. Etwa 50% der Lungentumoren
zeigen unterschiedliche Strukturen (Muller, 1980). In den WHO- Kriterien wird dies
berücksichtigt indem Lungentumore nach der am besten differenzierten Komponente
klassifiziert und der am schlechtesten differenzierten Komponente graduiert werden.
Der prognostische Wert des Gradings bezüglich des Patientenüberlebens ist jedoch
gering. Die histologische Klassifizierung hat nur bezüglich der groben Unterteilung in
kleinzellige und nicht-kleinzellige Tumore klinische Relevanz.
In Anbetracht dieser Tatsache wurde in dieser Arbeit versucht ein neues
Graduierungssystem zu etablieren, dass dem Nebeneinander verschiedener
histologischer Typen von unterschiedlicher Malignität innerhalb eines Tumors in
besonderem Maße Rechnung trägt. Es wurde ein Scoringsystem entwickelt, in das
bis zu drei histologische Subtypen eingehen können, deren unterschiedliche
Differenzierungsgrade, von ihrem flächenmäßigen Anteil anhängig, addiert wurden.
Die Tumore wurden somit einer Bösartigkeitsskala mit den Werten 3-12 zugeordnet,
wobei angenommen wurde, dass mit steigendem Zahlenwert die Bösartigkeit
zunehmend und die Überlebenswahrscheinlichkeit demnach abnehmend war. Die
Klassifizierung erfolgte nach dem histologischen Anteil, der bezogen auf alle zu
Verfügung stehenden Schnitte eines Tumors anteilsmäßig überwiegte. Darüber
hinaus erfolgte eine Einteilung der 1022 Bronchialkarzinome des Kollektives nach
gängigem WHO-Schema. Nachdem beide histologischen Graduierungssysteme mit
dem Patientenüberleben korreliert wurden zeigte sich, dass der histologische
Differenzierungsgrad bei der Einteilungen einen vergleichbaren Einfluss auf die
Prognose hat, wobei weder die etablierte WHO-Graduierung, noch das neu
entwickelten Scoringsystems die statistische Signifikanzschwelle erreichen konnte.
40
Bei der Bewertung ist zu berücksichtigen, dass die Fallzahl mit 1022 Tumoren immer
noch zu gering war um bei einer Einteilung in 9 Gruppen (entsprechend der
Bösartigkeitsskala
3-12)
jeder
Gruppe
eine
ausreichende
Anzahl
Tumore
zuzuordnen. Insbesondere die gut differenzierte Tumore mit einem niedrigen ScoreWert und die völlig undifferenzierten mit einem hohen Score-Wert traten selten auf.
Es ist anzunehmen, dass bei einer höheren Fallzahl geringe Abweichung statistisch
weniger ins Gewicht fallen würden und die Signifikanz erhöhen würden. Es wäre also
Bedarf an einer Überprüfung an einem noch weitaus größeren Kollektivs um den
prognoserelevanten
Wert
eines
solchen
detaillierten
histologischen
Differenzierungssystems zu belegen.
Trotzdem muss festgestellt werden, dass auch für dieses neue Gradingsystem keine
prognostische Relevanz nachgewiesen werden konnte, die derjenigen des pTNM
Systems nahe kommt, dementsprechend besitzt der Differenzierungsgrad (WHO und
Riede) kein unabhängige Prognoserelevanz.
Die Resultate dieser Untersuchung ergaben einen signifikanten Zusammenhang
zwischen EGFR- Expression und dem Tumorstadium. Dies passt zu der Mehrzahl
der vorangegangenen Untersuchungen (Selvaggi et al. 2004, Suzuki et al. 2005).
Lediglich einzelne ältere Studien hatten keinen signifikanten Zusammenhang
zwischen einer EGFR-Positivität und einem fortgeschrittenen Tumorstadium
gefunden (Rusch et al. 1993) Es fand sich kein Zusammenhang zwischen einer
EGFR- Expression und einer ungünstigen Prognose bei Lungenkarzinompatienten.
Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu einer früher veröffentlichten Studie, wo
Selvaggi et al. eine etwas ungünstigere Prognose bei EGFR-positiven als bei EGFRnegativen Tumoren gefunden hatte (Selvaggi et al. 2004). Andere Untersuchungen
hatten aber ebenfalls keinen Zusammenhang zwischen EGFR-Expression und dem
klinischen Verlauf von Bronchialkarzinomen gezeigt (Rusch et al. 1997, Pastorino et
al. 1997, Pfeiffer et al. 1998, Berghmans et al. 2005). Ebenfalls zu den Ergebnissen
früherer Studien passt die deutlich höhere EGFR- Positivität in Plattenepithel- als in
Adenokarzinomen (Ohsaki et al. 2000, Berghmans et al. 2000). Generell scheint
EGFR vor allem bei Plattenepithelkarzinomen unterschiedlichster Herkunft häufig
überexprimiert zu werden. Von Interesse war der Zusammenhang zwischen EGFRExpression und dem Differenzierungsgrad. Es scheint, dass eine EGFR- Expression
insbesondere bei Tumoren von einem mittlere Differenzierungsgrad häufig ist,
41
während sehr hoch differenzierte und sehr wenig differenzierte eher EGFR negativ
sind. Möglicherweise deutet dieses Resultat auf drei verschiedene Subtypen des
Bronchialkarzinoms hin. Der erste ist demnach hoch differenziert und typischerweise
EGFR- negativ, der zweite sehr wenig differenziert und ebenfalls EGFR- negativ und
der dritte und häufigste Subtyp eher mäßig differenziert und EGFR- positiv. Obwohl
in dieser Untersuchung keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen EGFRVeränderungen und dem Tumor- Phänotyp oder Prognose gefunden werden können,
unterstreichen
unsere
Daten
die
große
Bedeutung
dieses
Gens
beim
Bronchialkarzinom. Das am besten mit EGFR vergleichbare bereits etablierte
Therapieziel bei menschlichen Tumoren ist das HER-2 Gen. HER-2 wird
insbesondere beim Mammakarzinom häufig überexprimiert und spezifische gegen
HER-2 gerichtete Antikörper haben sich sowohl als Monotherapie, insbesondere in
Kombination mit zytotoxischen Medikamenten als erfolgreiches Therapeutikum
erwiesen. Die Überexpression des mit EGFR verwandten HER-2 Gens wird
insbesondere beim Mammakarzinom fast immer durch eine Genamplifikation
hervorgerufen. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass die
Situation für EGFR beim Bronchialkarzinom nicht mit derjenigen von HER-2 beim
Mammakarzinom vergleichbar ist. EGFR- Amplifikationen kommen zwar vor und
führen dann immer zu einer starken EGFR- Überexpression, doch ist die EGFRÜberexpression in den meisten Fällen durch andere Mechanismen als eine GenAmplifikation bedingt. Auch bei Tumoren mit nur 2 EGFR- Kopien pro Tumorzellkern
ist eine starke EGFR- Expression häufig. Interessanterweise konnte, ebenso wie in
einer früheren Studie an einem Multitumorgewebearray, eine dosisabhängige
Beziehung zwischen der Genexpression und der Genzahl pro Tumorzellkern
gefunden werden. Dieser Befund deutete darauf hin, dass eine geringgradige
Vermehrung von EGFR- Genen in Tumorzellen zu einer nachweisbaren EGFRExpressionssteigerung führen.
Eine EGFR- Expression ist demnach beim Bronchialkarzinom häufig, aber nicht mit
einer ungünstigen Prognose oder einem fortgeschrittenen Tumorstadium assoziiert.
Die Gen- Amplifikation ist einer der möglichen molekularen Mechanismen, welche zu
einer EGFR- Überexpression führen. In der Mehrzahl der Fälle sind aber andere,
bisher nicht bekannte Mechanismen für die EGFR- Überexpression.
42
In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass die Signaltransduktion über
EGFR
die
Proliferation,
Metastasierung,
Stromainvasion,
Angiogenese
und
Apoptose- Resistenz neoplastischer Zellen fördert (Pedersen et al. 2005). Das auch
in dieser Studie nachgewiesene gehäufte Auftreten einer EGFR- Überexpression in
nicht- kleinzelligen- Bronchialtumoren weist darauf hin, dass durch die Hemmung von
EGFR das Tumorwachstum bei Bronchialkarzinomen reduziert werden könnte und
bestätigt die Bedeutung von EGFR als attraktives Ziel für die Entwicklung neuer
Chemotherapeutika. Nach ersten vielversprechenden Ergebnissen in den Phase II
Studien für Gefitinib, einem monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne
des EGF- Rezeptors (Kris et al. 2002, Fukuoka et al.2002), erhielt dieser als erster
EGFR- Blocker die Marktzulassung in den USA und Japan. In den folgenden
doppelblinden, placebokontrollierten Phase III Studien, in denen Gefitinib in
Kombination mit den Standardtherapien Paclitaxel und Carboplatin (Johnson 2002)
oder Gemcitabine und Cisplatin (Giaccone et al. 2002) an einem größeren Kollektiv
von Patienten, die an einem therapieresistenten nicht- kleinzelligem Lungenkarzinom
erkrankt waren, getestet wurden zeigte sich jedoch kein Vorteil bezüglich des
Ansprechens der Tumore oder des Patientenüberlebens. Die Ursachen dieser fatalen
Ergebnisse könnte einerseits in einer mangelhaften Dosierung oder durch eventuell
bestehende antagonistische Effekte von Standardtherapie und EGFR- Blockern
begründet sein. Eine andere mögliche Fehlerquelle wäre, dass die Auswahl der
Studienpatienten nicht darauf basierte, ob sie an Tumoren erkrankt waren, bei denen
ein relevanter Zusammenhang zwischen EGFR- Expression und EGFR- Aktivierung
und Tumorproliferation nachgewiesen wurde (Betenski et al. 2002, Dancey et al.
2003). Aufgrund der weiterhin fehlenden genauen Identifikationsmöglichkeiten der
Anti- EGFR- sensiblen Tumore ist zur Zeit noch nicht klar, wie groß der Anteil von
Bronchialkarzinomen ist, welche auf die verschiedene Behandlungen mit einer
Remission reagieren. Zukünftige Studien werden unter anderem zu untersuchen
haben, in wie weit eine neben der Überexpression nachweisbare Veränderung der
EGFR- Genzahl pro Tumorzellkern für ein Therapieansprechen prädiktiv sein könnte.
Eine EGFR- Expression ist beim Bronchialkarzinom häufig, ist aber nicht mit einer
ungünstigen Prognose oder einem fortgeschrittenen Tumorstadium assoziiert. AntiEGFR- Behandlungen sind beim Bronchialkarzinom aufgrund der großen Häufigkeit
der Überexpression von höchstem Interesse.
43
Die Gen- Amplifikation ist einer der möglichen molekularen Mechanismen, welche zu
einer EGFR- Überexpression führen. In der Mehrzahl der Fälle scheinen aber
andere, bisher nicht bekannte Mechanismen für die EGFR- Überexpression
verantwortlich zu sein.
44
5. ZUSAMMENFASSUNG
Das Bronchialkarzinom ist die häufigste Krebstodesursache bei Männern in
westlichen Gesellschaften. Mehr als 80% der erkrankten Patienten versterben an
ihrem Tumor. Die histologische Klassifizierung der Subtypen ist aufgrund ihrer
morphologischen Heterogenität schwierig. Es wurde basierend auf dem GleasonScore für Prostatakarzinome ein Graduierungssysthem erstellt und dieses mit der
Überlebensprognose korreliert. Es zeigte sich jedoch keine prognostische Relevanz
die dem etablierten WHO- Graduierungssystem überlegen wäre.
Der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) ist ein membrangebundenes
Rezeptorprotein für EGF und TGFβ. Mit dem Vorhandensein von verschiedenen
neuen Therapeutika, die sich direkt gegen das EGFR- Gen richten hat sich das
Interesse an der molekulare Epidemiologie der EGFR- Expression deutlich verstärkt.
In dieser Untersuchung wurde ein Bronchialkarzinomgewebearray bestehend aus
Gewebeproben von 1022 Patienten mit klinischen Verlaufsdaten hergestellt. Schnitte
dieses Gewebearrays wurden mit einem Antikörper gegen EGFR (Zymed) inkubiert.
Zusätzlich
wurde
eine
Fluoreszenz
in
situ
Hybridisierung
mit
einer
Kombinationsprobe gegen das EGFR- Gen und Centromer 7 (als Referenzprobe)
durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass EGFR beim Bronchialkarzinom häufig
exprimiert wird. 58,2% der Tumoren zeigten eine starke, 20,8% eine schwache
Expression.
Nur
21,0%
wurden
als
EGFR-
negativ
klassifiziert.
Plattenepithelkarzinome (92,3%) waren häufiger EGFR- positiv als Adenokarzinome
(74,4%). Am seltensten fand sich eine EGFR- Expression in neuroendokrinen
Karzinomen (13,5%). Die Expression war nicht eindeutig mit dem Tumorstadium oder
dem
Differenzierungsgrad
assoziiert.
Die
FISH-
Untersuchung
ergab
eine
Amplifikation in 5,6% und einen geringgradigen EGFR- Zugewinn in weiteren 25,2%
der Tumoren. Alterationen des EGFR- Gens waren nicht mit dem Tumorphenotyp
assoziiert. Sowohl relative EGFR- Kopiezahl (Centromer 7-Kopiezahl) als auch
absolute Vermehrungen des EGFR- Gens in Tumorzellen war signifikant mit einer
zunehmenden EGFR- Expression assoziiert. Dieser Befund deutet auf eine
Gendosis- abhängige Erhöhung der Expression bei geringgradigen Vermehrungen
des EGFR- Gens hin. Weder die EGFR- Expression noch die Gen- Amplifikation war
mit einer ungünstigen Prognose bei Bronchialkarzinompatienten assoziiert.
45
6. ANHANG
6.1 Literaturverzeichnis
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6.2. Lebenslauf
Claus Zimmer, wohnhaft in Perth, Australien
Geboren am 16. Februar 1973 in Bonn, Deutschland.
Abitur 1993 am Gymnasium an der Kurt- Schumacher- Allee, Bremen.
Studium der Musikwissenschaften 1994 – 1996 an der Universität Köln.
Medizinstudium 1997 - 2003 an den Universitäten Bonn und Freiburg.
2004 bis 2006 Assistenzarzt am St. Vincentius- Krankenhaus, Heidelberg.
2007 Assistenzarzt (Registrar) am Nambour General Hospital, Nambour, Australien.
Seit Januar 2008 Assistenzarzt (Registrar) am Royal Perth Hospital, Perth,
Australien.