EBV-Infektion - Diagnostik heute

fhg – Zentrum für Gesundheitsberufe Tirol GmbH
FH-Bachelor-Studiengang Biomedizinische Analytik
EBV Infektion
Diagnostik heute
Bachelorarbeit 1
VerfasserIn: Sabine Leist
BetreuerIn: Dr. Maria Elisabeth Mustafa-Korninger
Innsbruck, im Juli 2013
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung!
3
2. Material und Methoden!
4
3. Allgemeine Einleitung!
5
3.1 Taxonomie!
5
3.2 Aufbau und Genom!
5
3.3 Epidemiologie!
7
3.4 Übertragung!
8
3.5 Pathogenese und Replikationszyklus!
8
3.6 Reaktion des Immunsystems!
12
3.7 Infektionsverlauf!
14
3.8 Therapie!
15
3.9 EBV-assoziierte Komplikationen und Erkrankungen!
15
3.10 EBV-assoziierte maligne Erkrankungen!
16
4. Diagnostik!
18
4.1 Serologische Nachweismethoden!
19
4.2 Erregernachweis/PCR!
19
4.3 Immunhistologischer Nachweis!
19
4.4 Nachweis zellulärer Immunität!
20
4.5 Veränderungen anderer im Labor erhobener Befunde!
20
5. Diskussion!
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6. Schlussfolgerung!
22
7. Literatur!
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2
1. Einleitung
Der Einsatz molekularbiologischer Methoden für den Erregernachweis und die
Verwendung von hochgereinigten oder rekombinant gewonnenen Antigenen zum
Nachweis von spezifischen Immunglobulinen bei der Abklärung von Infektionserkrankungen konnte die Sensitivität und Spezifität labordiagnostischer Untersuchungen
verbessern. Die infektiöse Mononukleose wird durch das humanpathogene Epstein
Barr Virus (EBV) verursacht. Das Virus kann in menschlichen Zellen ein Leben lang
persistieren, reaktivieren und Karzinome verursachen. Erstinfektionen können
serologisch nur innerhalb eines definierten Zeitfensters eindeutig erfasst werden.
Reaktivierte Infektionen, das Auftreten von Folgeerkrankungen oder die virusinduzierte Transformation von Zellen in Tumorzellen werden jedoch mit den
Untersuchungstechniken, die in der Routine eingesetzt werden, nur unzulänglich
erfasst. Der Erregernachweis mit molekularbiologischen Methoden eignet sich vor
allem zur Bestimmung der Viruslast. Die Verwendung unterschiedlicher viraler
Antigene für den Nachweis einer Infektion oder die Beurteilung des Immunstatus
sollte von Alter, Anamnese, und klinischer Symptomatik der Patienten abhängig
gemacht werden. Die Aussagekraft von Resultaten der Antikörperbestimmung wird
durch die Verknüpfung mit anderen labordiagnostisch erhobenen Werten, wie zum
Beispiel Veränderungen des peripheren Blutbildes oder eine Erhöhung der
Transaminasen, verbessert.
Ziel dieser Arbeit ist es, die neuesten Erkenntnisse über das Epstein Barr Virus durch
eine Zusammenfassung der rezenten Literatur zu beschreiben. Dabei wird unter
anderem auf Aufbau, Übertragung, Pathogenese, Replikation, Immunantwort und
das onkogene Potential des Virus eingegangen. Weiters werden alle Untersuchungsmethoden, die zur Erfassung des Erregers oder zum Nachweis einer Immunantwort
derzeit bekannt sind, beschrieben. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden die Grundlage
für die retrospektive Auswertung serologischer Daten und die Entwicklung eines
Algorithmus in der EBV Diagnostik.
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2. Material und Methoden
Ein Teil der Literatur wurde von Frau Dr. Mustafa-Korninger zur Verfügung gestellt,
einiges auch aus Fachbüchern recherchiert.
Im Internet wurde gezielt in der medizinischen Datenbank Pubmed und auf http://
www.thecochranelibrary.com/view/0/index.html gesucht. Die Schlüsselwörter
ergaben sich aus dem Ziel der Arbeit. Die Ergebnisse wurden anhand des Abstracts
nach Relevanz selektiert. Verwendet wurde Literatur aus den Jahren 2000 bis 2013.
Schlüsselwörter: ebv diagnosis, ebv infection ,ebv algorithmus, ebv guidelines,
epstein barr virus, life cycle ebv, replication ebv, latency ebv ,ebv genome, laboratory
tests ebv;
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3. Allgemeine Einleitung
Mit Hilfe elektronenmikroskopischer Untersuchungstechniken konnten Anthony
Epstein und Yvonne Barr 1964 das Herpesvirus in kultivierten Burkitt-Lymphomzellen
nachweisen [1]. Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Erreger der infektiösen
Mononukleose, die bei immunkompetenten Patienten in der Mehrzahl der Fälle
inapparent verläuft. Diese Erkrankung wird auch Studentenkrankheit, Kissing
Disease, Morbus Pfeiffer oder Pfeiffer‘sches Drüsenfieber genannt [1,2,3,4] und
wurde 1968 von Werner und Gertrude Henle beschrieben. [9]
3.1 Taxonomie
Das Epstein-Barr-Virus gehört zur Familie der Herpesviridae. Es wird als Humanes
Herpesvirus 4 (HHV 4) bezeichnet und zählt zur Subfamilie der Gamma-Herpesviridae. Das Genus wird als Lymphocryptovirus bezeichnet.
Das Wort „Herpes“ leitet sich vom Griechischen ab: „herpein“ - „kriechen“. [1]
3.2 Aufbau und Genom
Das EBV ist ein doppelsträngiges DNA Virus mit einem Durchmesser von ungefähr
200 nm. Das Herpesvirus besteht aus einem isokaedrischen Kapsid, einer Hülle und
dem Tegument. Das Tegument enthält regulatorische Proteine und ist der Raum
zwischen Kapsid und Hülle (siehe Abb. 1). Das Kapsid besteht aus 162 Kapsomeren,
die eine lineare, dicht gepackte Doppelstrang-DNA (dsDNA) umgeben. Die Hülle des
EBV enthält viruskodierte Proteine, die für den Zelltropismus und die Bindung an die
Rezeptoren der Wirtszelle verantwortlich sind. [1]
5
Abb. 1: Struktur des Epstein Barr Virus. Quelle: http://cullenlab.duhs.duke.edu/research/ebv/
Je nach Literatur enthält das in Abbildung 2 dargestellte Genom zwischen 164 kbp
bis 186 kbp und hat repetitive und nicht-repetitive Abschnitte [1,4,9]. Bis jetzt sind 80
bis 100 virale Gene, die Proteine kodieren, beschrieben worden [1,6,9]. Das virale
Genom kodiert mehrere miRNAs (microRNAs) [9], sowie Gene für latente Membranproteine (LMP) und für nukleäre Antigene (EBNAs) [1]. Zusätzlich enthält es zwei
kurze, häufig exprimierte, nicht translatierte nukleäre RNAs, die durch die Gene,
EBER 1 und EBER 2 kodiert werden [9]. Es sind zwei Subtypen des EBV
beschrieben. Sie unterscheiden sich durch unterschiedliche Kodierung der nukleären
Antigene. [3]
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Abb. 2: Das Genom des Epstein Barr Virus. Quelle: http://journals.cambridge.org/fulltext_content/
ERM/ERM6_23/S1462399404008440sup002
3.3 Epidemiologie
Einziger Wirt für das Epstein Barr Virus ist der Mensch. Primärinfektionen erfolgen
üblicherweise bei Kindern und Jugendlichen. Weltweit sind über 95% aller
Erwachsenen mit EBV infiziert. Subtyp 1 findet sich hauptsächlich in Europa und
Südostasien, Subtyp 2 kommt gemeinsam mit Subtyp 1 in Afrika vor.
Eine Infektion mit EBV kann proliferative Erkrankungen auslösen, die auch zu
malignen Tumoren führen kann. [1,3,6,7,9]
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3.4 Übertragung
Die Übertragung von EBV erfolgt hauptsächlich über den Speichel als Kontakt- oder
Tröpfcheninfektion. EBV ist hochkontagiös, die Inkubationszeit beträgt ungefähr 6
Wochen. In seltenen Fällen kann EBV bei Verabreichung von Blut, Blutprodukten und
bei Organtransplantationen übertragen werden. [1] Ob eine Infektion auch durch
Sexualkontakt möglich ist, ist noch nicht gesichert [2].
Gamma-Herpesviridae infizieren B-Lymphozyten und persistieren lebenslang. Es
kann immer wieder zu einer Reaktivierung des Virus kommen, der während dieser
Phase auch im Speichel ausgeschieden wird. [1]
3.5 Pathogenese und Replikationszyklus
Das EBV infiziert die Epithelzellen und die B-Lymphozyten im Nasenrachenraum und
führt zur Virusvermehrung oder Viruspersistenz in den B-Lymphozyten.
Im lytischen Replikationszyklus erfolgt die Vermehrung des Virus in den B-Zellen. Die
Virionen können über den Speichel wieder ausgeschieden werden. Mit Hilfe
ausgewählter Proteine kann das Virus die infizierten B-Lymphozyten zur Proliferation
anregen und die Differenzierung in Gedächtnis-B-Zellen bewirken. Latent infizierte BGedächtnis-Zellen verbreiten sich über das Gefäßsystem und können während der
Erstinfektion im peripheren Blut nachgewiesen werden. Nach der Erstinfektion sinkt
die Viruslast und das Virus ist in niedrigen Konzentrationen lebenslang im peripheren
Blut nachweisbar. Während der Latenzphase wird kein infektiöses Virus gebildet, das
Genom liegt zirkulär in Episomen im Zellkern der B-Lymphozyten vor. Es werden
Latenz-assoziierte Transkripte exprimiert. Durch interne und/oder externe Stimuli
kann es zu einer Reaktivierung kommen, der lytische Replikationszyklus wird initiiert
und es werden erneut infektiöse Virionen gebildet. (siehe Abb. 3)
8
Abb. 3: Schematischer Ablauf einer EBV-Infektion und der Persistenz. Quelle: http://
journals.cambridge.org/fulltext_content/ERM/ERM6_23/S1462399404008440sup004.htm
Lytische Replikation
Das virale Membranprotein Glykoprotein 350 (gp350) adsorbiert an den zellulären
Komplement-Rezeptor CD21 (Cluster of Differentiation 21). Moleküle des Humanen
Leukozyten Antigens (HLA) Klasse II fungieren als Korezeptoren und binden an das
virale Membranprotein Glykoprotein 42 (gp42). [1]
Neuere Daten beschreiben auch eine Bindung von gp350 an den Adhäsions- und
Phagozytenrezeptor CD35 [8]. Epithelzellen tragen keinen CD21 Rezeptor und EBV
wird mit Hilfe von Integrinen an die Zellmembran gebunden. Das Viruskapsid wird
durch Endozytose in das Zytoplasma freigesetzt. Entlang der Mikrotubuli gelangt das
Virus zu den Kernporen des Zellkerns. Die lineare DNA wird durch Kernporen in den
Zellkern eingeschleust und durch Fusion der freien Enden zirkulär. Mit Hilfe der
zellulären RNA-Polymerase II und den transkriptionsaktivierenden Tegumentproteinen werden Immediate-Early-Gene transkribiert, die die Transkription von
Early- und Late-Proteinen steuern. Im Zytoplasma werden die produzierten mRNAs
translatiert und die betreffenden Proteine in den Zellkern zurück transportiert.
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Dadurch wird die Genexpression von sehr frühen zu frühen Proteinen umgeschaltet.
Early-Proteine (EA, Early Antigen) werden transkribiert, zu diesen gehört die virale
DNA-Polymerase. Die virale DNA wird repliziert und Late-Proteine (VCA, Virus
Capsid Antigen) transkribiert. Bei den Late-Proteinen handelt es sich hauptsächlich
um virale Strukturproteine für den Aufbau des Kapsids und der Hülle.
Die im Zellkern gebildeten neuen Kapside sprossen durch die Kernmembran und
erhalten ihre erste Hülle. Diese Hülle geht vermutlich durch die Fusion mit der
äußeren Kernmembran wieder verloren. Es lagern sich über 15 Tegumentproteine an
das freigesetzte Nukleokapsid an. Durch einen zweiten Knospungsprozess in den
Vesikeln des Trans-Golgi-Apparates erhält das Virus seine endgültige Hülle. Ein
entsteht ein vollständiges, umhülltes Herpesviruspartikel, das sich in einem zellulären
Vesikel befindet und über den Sekretionsweg freigesetzt wird. Die Virionen werden
durch den Speichel wieder ausgeschieden oder können Zellen infizieren. [1]
Latenz
Man vermutet, dass in latent infizierten B-Lymphozyten das EBV Genom als
extrachromosomale Minichromosomen, den Episomen, vorliegt. Eine Persistenz des
EBV in infizierten naiven B-Zellen ist aufgrund der kurzen Lebensdauer der
Lymphozyten nicht möglich. Um in diesen B-Lymphozyten länger persistieren zu
können, induziert das EBV mit Hilfe Ausprägung bestimmter Gene die Proliferation
der B-Zellen. Im Gegensatz zu der lytischen Replikation verwendet EBV für die
episomalen Replikation die chromosomale DNA-Polymerase der Wirtszelle. Mit Hilfe
des Latenzprogramms 3 (siehe Tabelle 1) kommt es durch die Ausprägung der
nukleären Antigene (EBNA) und der latenten Membranproteine (LMP) zur
Transkription zellulärer Gene und zur Proliferation der infizierten B-Zelle. [9] Diese BLymphozyten wandern in die Keimzentren der Lymphfollikel. Für die weitere
Proliferation und Selektion der EBV-infizierten B-Zellen im Keimzentrum beginnt EBV
mit dem Latenzprogramm 2 (siehe Tabelle 1). Im Lymphfollikel werden in diesen
Zellen nur noch die viralen Proteine EBNA-1, LMP-1 und LMP-2A gebildet. LMP-1
imitiert kostimulierende Signale für die B-Zell-Proliferation, die normalerweise vom
CD40-Rezeptor ausgehen. LMP-2A imitiert Signale, die physiologischerweise von
membranständigen Antikörpern ausgehen. Mit Hilfe dieser Proteine täuscht EBV den
infizierten B-Zellen Antigenkontakt vor, um weiter zu proliferieren und als GedächtnisB-Zellen differenzieren. Durch deren lange Lebensdauer kann EBV hier eine
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lebenslange Persistenz etablieren. Zur Erhaltung des viralen Genoms wird nur noch
EBNA-1 exprimiert. [9]
Tabelle 1: Latenzprogramme in latent infizierten B-Zellen [9]
Expressionsprofil virale Proteine
Latenz 0
LMP-2A
Latenz 1
EBNA1, EBERs
Latenz 2
EBNA1, LMP1, LMP2A
Latenz 3
LMP1, LMP2A, EBNA-LP, EBNA2, EBNA3A/B/C
Infizierte B-Zellen werden üblicherweise durch die Signalwirkung der T-Zellen
eliminiert. Durch die beschriebenen Latenzprogramme entgehen die infizierten BZellen der Immunantwort und können als EBV-positive Gedächtnis-B-Zellen weiter
bestehen. [1]
Reaktivierung
Gelegentlich muss EBV in latent infizierten Zellen reaktivieren, um neue Viruspartikel
zu bilden und einen neuen Wirt zu infizieren.
Reife B-Zellen des Keimzentrums differenzieren zur Antikörperproduktion, bzw.
reaktivieren Gedächtnis-B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen zu Plasmazellen.
Durch die beteiligten Signalwege kommt es zu einer Reaktivierung des Virus. Der
produktive Replikationszyklus wird aktiviert und neue Virionen werden gebildet. In
der Mukosa finden sich Plasmazellen, die auf den Schleimhautoberflächen
Immunglobuline sezernieren. Auf diesem Weg können die Virionen im Nasenrachenraum sezerniert und über den Speichel übertragen werden. [9]
Virämie
Bei Patienten mit Primärinfektion kann man 2 Wochen nach Infektionsbeginn EBV im
peripheren Blut nachweisen. Der Höhepunkt der Viruslast ist nach Auftreten der
ersten klinischen Symptome überschritten (siehe Abbildung 4). Nach einigen Wochen
bis Monaten liegt die Viruslast bei immunkompetenten Patienten im peripheren Blut
zwischen 1 bis 50 copies EBV DNA/1 Mio Leukozyten. Bei manchen Patienten kann
es innerhalb eines Jahres nach Infektion zu einem nochmaligen Anstieg der Viruslast
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im peripheren Blut kommen. Bei Patienten mit EBV-assoziierten Tumorerkrankungen
steigt die Viruslast noch vor Auftreten der klinischen Symptomatik (siehe Abbildung
4). Ein Therapieerfolg zeigt sich auch durch das Sinken der Viruslast. [10] Jedoch
schließt eine negative EBV-PCR im Plasma das Vorhandensein eines EBVassoziierten Tumors nicht aus [1]. Hochrisikopatienten wie Patienten nach
Organtransplantation werden mittels quantitativer PCR Methoden überwacht, um
EBV frühzeitig zu detektieren [10].
Abb. 4: Verlauf der Viruslast im Blut. Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC2438195/figure/fig2/
3.6 Reaktion des Immunsystems
Angeborene Immunantwort
Bei Infektion regt das EBV die Synthese von Interferon, inflammatorischen Zytokinen
wie Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) an. Interferon γ
verursacht Fieber, Abgeschlagenheit und Kopfschmerzen. IL-10 fungiert als
Gegenspieler von Interferon γ und vermindert die zytopathologischen Effekte. NKZellen dürften die Entstehung chronischer viraler EBV Infektionen verhindern. Diese
werden während der Infektion vermehrt gebildet. Die Höhe der Vermehrung korreliert
mit der Schwere der Erkrankung. [11]
Erworbene humorale Immunantwort
Sieben Tage nach Beginn der klinischen Symptomatik können bei der Mehrzahl der
Patienten IgM Antikörper gegen das Viruskapsidantigen VCA nachgewiesen werden.
Zeitgleich beginnt die Bildung von IgG Antikörpern, die gegen das Kapsidantigen
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gerichtet sind und lebenslang nachweisbar sind. Nach ungefähr 3 Monaten können
IgG Antikörper gegen das nukleäre Antigen EBNA nachgewiesen werden, das in
allen EBV-infizierten Zellen exprimiert wird. Abbildung 5 zeigt den Verlauf der
Antikörperbildung gegen die EBV-Antigene sowie die Viruslast.
Einige Patienten verlieren diese Antikörper wieder bzw. bilden sie nie. [1,3] Antikörper
gegen Early Antigene (EA) des EBV sind für die Abklärung einer Infektion nicht
geeignet. Sie werden zur Bestätigung EBV-induzierter Tumore eingesetzt. Der
Nachweis anderer spezifisch gegen Virusproteinstrukturen gerichteter Antikörper wird
derzeit noch erforscht.
Erworbene zelluläre Immunantwort
Eine akute EBV-Infektion wir durch spezifische zytotoxische T-Zellen eingedämmt.
Am Beginn der Infektion und während der lytischen Replikation wird die zelluläre
Immunantwort vorwiegend durch CD8 positive T-Zellen gesteuert. Labordiagnostisch
findet sich eine massive Vermehrung der CD8 positiven T-Zellen, die auch als
Downey Zellen beschrieben werden. CD4 und CD8 positive T-Zellen, die spezifisch
einige der Latenz 3-Proteine erkennen, halten die durch EBV angeregte B-ZellProliferation unter Kontrolle. Sie induzieren auch die Umschaltung von
Latenzprogramm 3 auf 2. [9]
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Abb. 5: Verlauf der EBV-spezifischen Antikörper und der Viruslast im Blut. Quelle: http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3021204/figure/f2/
3.7 Infektionsverlauf
Eine Erstinfektion im Kleinkindalter wird häufig nicht diagnostiziert, da sie meist
symptomlos verläuft. Bei immunkompetenten Jugendlichen und Erwachsenen kann
es zum Erscheinungsbild der infektiösen Mononukleose kommen. Die Erkrankung
beginnt mit unspezifischen Symptomen wie Fieber, Halsschmerzen, Tonsillitis und
Schwellung der Halslymphknoten. In 80 % der Fälle kommt es zu Erhöhung der
Transaminasen, in Einzelfällen zu ausgeprägter Leber- und Milzbeteiligung.
Charakteristisch ist die Vermehrung mononukleärer lymphatischer Zellen im
peripheren Blut. Bei diesen mononukleären Zellen handelt es sich um aktivierte CD 8
positive T-Zellen. Die charakteristischen klinischen Symptome sind Ausdruck der
massiven Immunantwort und der schnell expandierenden EBV-spezifischen T-Zellen.
Da im Kindesalter diese Immunreaktion weniger ausgeprägt ist, wird die Erkrankung
häufig nicht diagnostiziert. [9] Innerhalb von 2 - 6 Wochen heilt die Erkrankung in den
meisten Fällen komplikationslos aus [1].
14
3.8 Therapie
Die Therapie beschränkt sich auf die Behandlung der Symptome [1,2,3,6,9]. Bei
Haarleukoplakie (weiße Beläge am Zungenrand) kommt Aciclovir zur Anwendung
[6,9]. Die Virusausscheidung kann durch antivirale Substanzen reduziert werden,
verkürzt aber nicht die Dauer der Erkrankung [1]. Bei immunsupprimierten Patienten
nach Transplantation werden in manchen Fällen der Einsatz des humanen
monoklonalen Anti-CD20-Antikörper (Rituximab) oder die Gabe von CD8 positiven TZellen beschrieben [11]. Eine Impfung ist derzeit in Entwicklung [9].
3.9 EBV-assoziierte Komplikationen und Erkrankungen
Typisch ist in etwa 80 -90 % ein Arzneimittelexanthem nach Antibiotikagabe.
In seltenen Fällen kann es zu neurologischen Symptomen wie z. B. Meningoenzephalitis, Radikulitis und in schweren Fällen zu Pneumonie, Anämie und
Thrombozytopenie kommen. [1]
Chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV)
In sehr seltenen Fällen kommt es zur lebensbedrohlichen, chronisch aktiven EBVInfektion (CAEBV). Diese tritt fast nur bei Kindern auf, die zuerst häufig wiederkehrende mononukleoseartige Symptome zeigen und innerhalb weniger Jahre
Lymphome bilden. Auffällig ist eine hohe Viruslast im peripheren Blut und der hohe
Titer gegen Kapsid- und Early-Antigene [9]. Zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen
kommen vermehrt vor, können jedoch die immer wiederkehrende Virusreplikation
nicht verhindern. Die Sterblichkeit nach 4 Jahren liegt bei 40 %. [1]
X-linked lymphoproliferative Erkrankung (XLP)
Bei Trägern des rezessiv vererbten Defektes am XLP-Gen führt eine Infektion mit
EBV zu einer defekten Aktivierung der zellulären Immunantwort. Durch eine Mutation
in der Signalübertragung der T-Zellen kommt es zu massiver polyklonaler
Vermehrung infizierter B-Zellen. Bei über 50 % der Erkrankten kommt es zu einer
fulminant verlaufenden infektiösen Mononukleose mit hoher Letalitätsrate. Bei
Überlebenden treten oft Lymphome und/oder eine Hypogammaglobulinämie auf. [1]
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PTLD (Post-Transplantations-Lymphoproliferative Erkrankung)
Immunsuppression bei transplantierten Patienten sowie bei HIV-Erkrankung können
infolge der Verminderung von T-Zellen zu unkontrollierter EBV-Replikation führen, die
eine massive Vermehrung von B-Zellen, eine Vermehrung von Plasmazellen oder die
Bildung von Lymphomen verursacht. Kinder nach Organ-, Knochenmark- oder
Stammzelltransplantation sind besonders gefährdet. [9]
3.10 EBV-assoziierte maligne Erkrankungen
EBV ist nach WHO in der höchsten Karzinogenklasse (I) eingestuft [1,9].
Burkitt-Lymphom
Das Burkitt-Lymphom ist ein aggressiver Tumor, bei dem klinisch drei Varianten
unterschieden werden. Das endemische Burkitt-Lymphom tritt gehäuft bei Kindern in
Äquatorialafrika auf. Malaria erhöht vermutlich das Risiko für eine Erkrankung. In der
Literatur wird beschrieben, dass in 90 - 100 % der Fälle von Burkitt-Lymphomen
(maligne B-Zell-Lymphome [1]) EBV nachweisbar ist. [1,6]
Das sporadische Burkitt-Lymphom findet man weltweit bei Kindern und jungen
Erwachsenen. Das mit Immundefizienz assoziierte Burkitt-Lymphom findet man
gehäuft bei an HIV Erkrankten. Allen gemeinsam ist eine reziproke Translokation
zwischen dem Chromosom 8 und dem Chromosom 14 (t8;14) oder dem Chromosom
22 (t8;22). Diese Chromosomen kodieren die schweren und leichten Ketten der
Immunglobuline. Chromosom 8 ist Träger des c-myc-Onkogens und reguliert die
Genexpression. Durch Translokation steuern die DNA-Kontrollsequenzen der
Immunglobulin-Leicht- bzw. Schwerketten die c-myc-Expression. Die Zellteilungsrate
und die Apoptoseneigung der proliferierenden Zellen werden erhöht. In latent EBVinfizierten B-Zellen vermitteln einige virale Proteine einen Schutz vor Apoptose und
B-Zellen, in der eine c-myc-Translokation stattgefunden hat, können ungehindert
proliferieren.
Spontane Burkitt-Lymphome entstehen aus der Folge der Translokation ohne Hilfe
vom EBV und sind viel seltener. [9]
Nasopharynxkarzinom
Hierbei handelt es sich um einen malignen, undifferenzierten Tumor der Epithelzellen
des Naso- und Oropharynx [1]. Das Nasopharynxkarzinom kommt endemisch in der
16
chinesischen Bevölkerung Südostasiens und auch an der Nordküste Afrikas und in
Grönland vor [9] und ist zu fast 100 % mit EBV assoziiert [1]. Die epithelialen
Tumorzellen enthalten EBV-DNA in latenter Form. Sie exprimieren EBV-Proteine, wie
z. B. LMP-1, die onkogenes Potential haben. Die geografische Verteilung lässt eine
Beteiligung weiterer Umweltkarzinogene vermuten. [9]
Hodgkin-Lymphom
EBV-positive Reed-Sternberg-Zellen finden sich in etwa bei der Hälfte der HodgkinLymphome. Diese exprimieren oft Proteine, die während des Latenzprogramms 2
aktiv sind. Reed-Sternberg-Zellen entstehen vermutlich aus defekten B-Zellen, die
eliminiert werden sollten, aber durch kostimulierende Signale latenter Membranproteine immortalisiert wurden. 5 - 10 Jahre nach einer symptomatischen infektiösen
Mononukleose steigen die Fälle von EBV-positiven Hodgkin-Lymphomen signifikant
häufiger an. [9]
Magenkarzinom
Bei <10 % der Magenkarzinome findet man EBV-infizierte epitheliale Tumorzellen. [9]
NK-/T-Zell-Lymphome
In T-Zell-Lymphomen ist sehr selten EBV nachweisbar. [9]
17
4. Diagnostik
Auch eine klinisch eindeutige Symptomatik der infektiösen Mononukleose muss
labordiagnostisch bestätigt werden, da bei 5 - 10 % der Patienten eine andere
Erkrankung vorliegen kann. Differentialdiagnostisch sind eine HIV-Primärinfektion
sowie Infektionen mit Cytomegalievirus, humanem Herpesvirus 6, Adenovirus,
Rötelvirus, Mumpsvirus, Influenza A und B Virus und Toxoplasmose gondii
auszuschließen. [1]
Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über die derzeit vorhandenen Methoden.
Tabelle 2: Diagnostische Nachweismethoden. Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC497621/table/t1/
Method
Analyte, antigen, or substrate
Comment
Serology
IFA
Cell lines like P3HR-1 and Raji
Classical method; gold standard; highly specific;
staging of EBV infections possible with a single serum
sample
Complement fixation reaction
Lysate of EBV-transformed cell
lines
Less sensitive, less specific; not widely used; staging
of EBV infections not possible with a single serum
sample
EIA, ELISA, or
chemoluminescence with
coated beads
Lysate of EBV-transformed cell
lines; EBV lysates; combination
of lysates and recombinant
proteins; recombinant proteins;
synthetic peptides
Rapid, highly sensitive, suitable for automation;
synthetic peptides as antigens less sensitive and less
specific (due to cryptic epitopes in native molecules);
with a single serum sample
Blot techniques (Western blot
analysis or line blot assays)
Lysate of EBV-transformed cell
lines; EBV lysates; recombinant
proteins; combination of lysates
and recombinant proteins
Highly specific; mostly a confirmatory method; staging
of EBV infections possible with a single serum sample
IgG avidity determination, IFA,
and/or ELISA or Western blot
analysis
Titration of antibodies in the
absence and presence of
increasing amounts of urea or
other chaotropic reagents
Rather special method used for confirmation of
indeterminate results (Table 2) (antibodies in an acute
EBV infecti on are of low avidity)
Heterophile antibody
agglutination
Paul-Bunnell antigens; bovine
erythrocytes
Less sensitive, less specific; 10-50% of children <4
years of age do not produce heterophile antibodies
Lymphoblastoid cell lines from
patient lymphocytes
Performed only in special laboratories; long-lasting
test (up to 4-8 weeks)
Lymphocytes, plasma, serum,
cerebrospinal fluid, tissue
Method of choice if EBV-associated
meningoencepahlitis (from cerebrospinal fluid) is
suspected; used to detect virus load and reactivation
Virus isolation
Nucleic acid detection
PCR
In situ hybridization, in situ PCR Tumor tissue; paraffin-embedded Used to detect EBV-associated tumors
sections
Virus antigens,
immunhistochemistry and
immunocytology
Tumor tissue; paraffin-embedded Used to detect EBV-associated tumors
sections
18
4.1 Serologische Nachweismethoden
Paul-Bunnel-Test
Das Testprinzip beruht auf der Beobachtung der amerikanischen Ärzte John
Rodmann Paul und Walls Willard Bunnel, dass heterophile Antikörper von Patienten
mit infektiöser Mononukleose mit Pferde- und Rinder-Erythrozyten agglutinieren.
Kinder unter 4 Jahren bilden häufig noch keine heterophilen Antikörper. In diesen
Fällen ist der Test falsch negativ. [4]
Nachweis spezifischer Immunglobuline
Durch die Bildung spezifischer Immunglobuline kann die EBV-Infektion labordiagnostisch nachgewiesen werden. Für das Routinescreening werden ELISA
(enzyme linked immuno assay) und CLIA (Chemilumineszenz-Immuno-Assay)
verwendet. Zur Abklärung einer EBV-Infektion werden Antikörper gegen Viruskapsidantigene und nukleäre Virusproteine bestimmt. Bei ausgesuchten Fragestellungen,
wie z. B. beim Nasopharynxkarzinom, werden auch die Bestimmung der Antikörper
gegen Early Proteine (EA) und IgA-Antikörper gegen VCA eingesetzt. [3]
Immunoblots eignen sich zur Bestätigung einer Infektion und um eine genauere
Aussage über das Infektionsstadium zu treffen [4].
4.2 Erregernachweis/PCR
Für den quantitativen Nachweis von EBV werden real time PCR Methoden eingesetzt. Als Material können Vollblut, Serum, Plasma oder auch Leukozyten verwendet
werden [3]. Die Primersequenzen müssen hochkonservierte Regionen des Virus
erfassen. Bei kommerziell erhältlichen Tests werden unterschiedliche Primersequenzen und unterschiedliche Maßeinheiten verwendet, sodass die Testergebnisse nicht vergleichbar sind. Durch die hohe Sensitivität und Spezifität eignet
sich der Erregernachweis zum Nachweis sowie für die Therapieüberwachung
immun-supprimierter Patienten und bei EBV assoziierten Tumorerkrankungen. [10]
4.3 Immunhistologischer Nachweis
Diese Methode wird verwendet, um EBV-assoziierte maligne Erkrankungen zu
erkennen. [4]
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4.4 Nachweis zellulärer Immunität
Bei transplantieren Patienten mit PLTD ist der Nachweis der zellulären Immunität von
Bedeutung. Hier werden Methoden wie Elispot, Multimertechnik oder intrazelluläre
Zytokinfärbung angewandt. Diese sind aber noch nicht für die Routinediagnostik
etabliert. [3]
4.5 Veränderungen anderer im Labor erhobener Befunde
Blutbild
Im Rahmen der Infektion kommt es zur Vermehrung CD8 positiver Lymphozyten, die
im Differentialblutbild atypischen Lymphozyten entsprechen. Diese reaktiven
Lymphozyten werden auch Downey Zellen genannt. [11]
Transaminasen
80% der Patienten weisen am Beginn und während der Infektion erhöhte Werte bei
der Bestimmung der Transaminasen, insbesondere der Alaninaminotransferase
(ALAT) auf. [11]
20
5. Diskussion
Pathogenese, Replikation, Immunantwort und das onkogene Potential des Epstein
Barr Virus sind eingehend beschrieben. Der Einsatz molekularer Techniken
ermöglicht es, bei gezielten Fragestellungen den Erreger und die Viruslast zu
erfassen. Diese Techniken können aber nicht zwischen Viruslatenz, lytischer
Replikation oder Reaktivierung des Virus unterscheiden. Auch die Transformation der
infizierten Zellen in Tumorzellen kann nur durch aufwändige Testmethoden
nachgewiesen werden, die für die Routinediagnostik nicht geeignet sind. Ebenso
kann das Versagen der zellulären Immunantwort nur durch aufwändige Testmethoden erfasst werden. ELISA- oder CLIA-Methoden können Immunglobuline nur
gegen bestimmte Virusproteine nachweisen, die Resultate können eine Diagnose
einer akuten Infektion unterstützen, sind jedoch für die Abklärung EBV-assoziierter
Folgeerkrankungen nicht ausreichend.
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6. Schlussfolgerung
Differentialdiagnostisch kann die infektiöse Mononukleose durch die Bestimmung
spezifisch gebildeter Immunglobuline nachgewiesen werden. Für die Routinediagnostik wird derzeit die Bestimmung der Antikörper gegen VCA-IgG, VCA-IgM und
EBNA-1-IgG empfohlen. Die zeitlich unterschiedliche Expression der viralen Antigene
und die damit verbundene Antikörperbildung ermöglichen es, nicht immer alle
Antikörper zu bestimmen, um eine Aussage treffen zu können. Unter Berücksichtigung des Alters des Patienten kann ein Nachweis von Antikörpern gegen das virale
nukleäre Antigen (EBNA) genügen, um eine vorangegangene Infektion zu beweisen.
Der Einsatz IgG- und IgM-spezifischer Antikörper gegen Viruskapsid-antigene sollte
danach stufenweise erfolgen. Die Automatisierung und die kurze Analysenzeit
unterstützt ein stufenweises Vorgehen. Für die Entscheidungsfindung können die
Ergebnisse der Blutbildanalyse und der Bestimmung der leber-spezifischen
Transaminasen mit einbezogen werden. Für immunsupprimierte Patienten und
Gravide, sowie bei Verdacht auf Reaktivierung und dem Ausschluss eines EBVassoziierten Tumors sollte ein Erregernachweis durchgeführt werden. Eine
stufenweise Diagnostik zur Abklärung einer infektiösen Mononukleose soll einen
effizienten Einsatz der Antikörperbestimmungen bei gleicher diagnostischer Aussage
sowie eine kostengünstigere Alternative darstellen. Dies soll in einer weiterführenden
Arbeit überprüft werden.
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