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Einfluss von Interleukin-10 auf die Differenzierung von Monozyten
zu Dendritischen Zellen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von:
Annika Meielie Schwarz, geb. Hanke,
geboren am 31.03.1978 in Heidelberg
angefertigt an:
Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin (Direktor: Prof. Dr. med. W. Kiess)
Betreuer:
Prof. Dr. med. Dieter Körholz
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 17.06.2014
Bibliographische Beschreibung:
Schwarz, Annika
Einfluss von Interleukin-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu Dendritischen
Zellen
Universität Leipzig, Dissertation
85 S., 125 Lit., 12 Abb., 2 Tab.
Referat:
Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte
nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um
einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem
Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der
Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von
tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die
Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer
Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es
daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die
Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf
die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht.
Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4
und
Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor
nachhaltigen
Hemmung
des
Differenzierungsprozesses
von
führt
zu
einer
Monozyten
zu
Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von
cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10
nicht nur einen
Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter
Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die
Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend
irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen,
wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer
Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.
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Inhaltsverzeichnis
1. Verzeichnis der Abkürzungen ............................................................................ 5 2. Einleitung ............................................................................................................. 7 Fragestellung ......................................................................................................... 11 3. Material und Methoden ..................................................................................... 12 3.1 Verwendete Materialien ................................................................................... 12 3.1.1 Reagenzien für Zellseparation und Zellkultur ............................................ 12 3.1.2 Stimulatoren .............................................................................................. 12 3.1.3 Reagenzien für FACS-Analysen ................................................................ 12 3.1.4 Molekularbiologische Reagenzien und Puffer ........................................... 13 3.1.4.1 RNA-Isolierung .................................................................................... 13 3.1.4.2 RT-PCR .............................................................................................. 13 3.1.4.3 cDNA Microarrays ............................................................................... 14 3.2 Zellen und Kulturbedingungen ......................................................................... 15 3.2.1 Isolierung von Monozyten aus dem peripheren Blut ................................. 15 3.2.2 Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen ................................. 16 3.3 Durchflusszytometrie ........................................................................................ 16 3.4 RNA Isolierung ................................................................................................. 18 3.4.1 Prinzip und Protokoll der RNA-Isolierung .................................................. 18 3.4.2 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit ........................... 19 3.4.2.1 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration ........................ 19 3.4.2.2 Agarosegelelektrophorese .................................................................. 20 3.4.2.3 RNA-Fällung ....................................................................................... 21 3.5 cDNA Expressions-Ansätze ............................................................................. 21 3.5.1 mRNA-Amplifikation .................................................................................. 21 3.5.2 Membranmarkierung ................................................................................ 23 3.5.2.1 Prinzip des cDNA-Array ...................................................................... 23 3.5.2.2 Probensynthese .................................................................................. 23 3.5.2.3 Aufreinigung ........................................................................................ 24 3.5.2.4 Hybridisierung der Nylonmembran ..................................................... 25 3.5.2.5 Auswertung der Ergebnisse ................................................................ 26 3.6 Statistische Auswertung ................................................................................... 27 3
4. Ergebnisse ......................................................................................................... 28 4.1 Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen unter dem
Einfluss von IL-4 und GM-CSF ...................................................................... 28 4.2 Ermittlung der wirksamen hemmenden Konzentration von IL-10 .................... 29 4.3 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung von Monozyten zu unreifen
Dendritischen Zellen ...................................................................................... 30 4.3.1 Oberflächenexpression nach 7 Tagen....................................................... 30 4.3.2 Oberflächenexpression nach 2 Tagen....................................................... 32 4.3.3 Oberflächenexpression nach 24 Stunden und 48 Stunden für die
Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7 ................................................... 33 4.4 Ausreifung von unreifen Dendritischen Zellen zu reifen Dendritischen Zellen
unter dem Einfluss von KLH, TNF-α und GM-CSF........................................ 36 4.5 Kann eine adäquate Ausreifung die hemmenden Effekte von IL-10
überwinden? .................................................................................................. 37 4.6 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen .................... 38 4.7 Genexpressionsmuster in der frühen Phase der Differenzierung
Dendritischer Zellen ....................................................................................... 40 5. Diskussion ......................................................................................................... 49 5.1 Hintergrund ...................................................................................................... 49 5.2 Einfluss von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu unreifen
Dendritischen Zellen ...................................................................................... 51 5.3 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen .................... 53 5.4 Genexpression ................................................................................................. 55 5.4.1 Übersicht ................................................................................................... 55 5.4.2 Regulation von CCR1 und CCR2 durch IL-10 ........................................... 56 5.4.3 Regulation von IL-1ß und IL-1R1 durch IL-10 ........................................... 57 5.4.4 Regulation von S100A8 und S100A9 durch IL-10 ..................................... 59 5.5 Biologische Bedeutung .................................................................................... 61 6. Zusammenfassung ........................................................................................... 63 7. Literaturverzeichnis .......................................................................................... 67 4
1. Verzeichnis der Abkürzungen
Abb.
Abbildung
AP2
apoptosis protein 2, auch CSRNP2, cysteine-serine-rich nuclear protein
2, oder TGF beta induced apoptosis protein
CCR
Rezeptor für Chemokine des Aufbaus C-C
CD
cluster of differentiation
cDNA
complementary DNA
CSF
colony stimulating factor
CTGF
connective tissue growth factor
DC
Dendritische Zelle
dsRNA
Doppelstrang RNA
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorter
FITC
Fluoreszeinisothiozyanat
GM-CSF
Granulozyten/Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor
h
Stunde
HBEGF
heparin-binding EGF-like growth factor
HLA-DR
Humanes Leukozytenantigen DR
IFN-γ
Interfreon gamma
IL
Interleukin
KLH
Hämocyanin aus Schlüssellochschnecken (Kehole limpet hemocyanin)
L
Ligand
LPS
Lipopolysaccharid
MCP-1
Monocyte chemoattractant protein 1
M-CSF
Macrophagen-Kolonie stimulierender Faktor
MHC
major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
MIP-1α
macrophage-inflammatory protein 1 alpha
mRNA
messenger RNA
MWA
Mittelwertabweichung
NF-κB
nuclear factor κappa-B
PAFR
platelet activating factor receptor
PC5
Phykoerythrin-Cyanin 5.1
PCR
Polymerase Kettenreaktion
PDGF
platelet derived growth factor
5
PE
Phycoerythin
PGE2
Prostaglandin E2
R
Rezeptor
RANTES
regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted
Rh
rekombinant human
SD
standard deviation, Standardabweichung
S100
Familie der calciumbindenden S100 Proteine
Tab.
Tabelle
TGF-ß
transforming growth factor beta
TLR
toll like receptor
TNF-α
Tumornekrosefaktor alpha
VEGF
Vascular endothelial growth factor
WNT
wingless type MMTV integration site family
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2. Einleitung
Dendritische Zellen zählen zu den potentesten Antigen-präsentierenden Zellen des
Immunsystems
und können sowohl CD4 (cluster of differentiation-4) positive T-
Zellen über Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse-II als auch CD8 positive
T-Zellen über MHC Klasse-I aktivieren (Banchereau et al., 2000). Wegen der hohen
Dichte an kostimulatorischen Molekülen auf der Zelloberfläche genügt eine
Dendritische Zelle um bis zu 3000 T-Zellen zu stimulieren (Stockwin et al., 2000).
Neben ihrer Fähigkeit Antigene aufzunehmen und erfolgreich zu präsentieren,
verfügen sie zudem über unterstützende Funktionen für die Antikörperproduktion,
stehen in engem Kontakt mit der Funktion von NK-Zellen und weisen selbst
zytotoxische Fähigkeiten auf (Litinskiy et al., 2002; Ferlazzo et al., 2002; Larmonier
et al., 2009). Sie stellen daher ein Bindeglied zwischen spezifischer und
unspezifischer Immunität dar.
Es werden zwei Reifungsstufen der Dendritischen Zelle unterschieden. Unreife
Dendritische Zellen zeichnen sich durch eine starke phagozytische Fähigkeit aus und
werden an Eintrittspforten des Organismus vorgefunden (Stockwin et al., 2000).
Kommt es zu einem Antigenkontakt, beginnen der Reifungsprozess und die durch
Chemokine geleitete Reise zu den sekundären lymphatischen Organen, wo die reife
Dendritische Zelle das aufgenommene Antigen präsentiert (Guermonprez et al.,
2002; D’Amico und Wu, 2003; Randolph et al., 2005). Der Reifungsprozess wird
durch eine Reihe von phänotypischen Veränderungen begleitet. Die Zelle verliert ihre
Fähigkeit zur Phagozytose, exprimiert ein neues Set an Chemokinrezeptoren für
ihren Weg zu den sekundären Lymphorganen und vergrößert ihre Fähigkeit zur
Antigenpräsentation und T-Zell-Stimulation durch Oberflächenexpression von
kostimulatorischen und MHC Klasse I und II Molekülen (Winzler et al., 1997; Dieu et
al., 1998; de Saint-Vis et al., 1998).
Dendritische Zellen werden im peripheren Blut nur während ihrer Wanderung
vorgefunden. Eine Isolation ausreichender Mengen von Dendritischen Zellen ist
daher äußerst schwierig. Eine Vielzahl von Kulturansätzen zielt deswegen darauf ab,
Dendritische Zellen ex-vivo aus Vorläuferzellen zu generieren. Dabei werden als
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Ausgangszellen sowohl CD34-positive Stammzellen, als auch CD14-positive
Monozyten verwendet. Während Monozyten den Vorteil bieten in ausreichender Zahl
im peripheren Blut vorhanden zu sein, besitzen CD34-positive Stammzellen noch die
Fähigkeit zur Expansion (Rubio et al., 2005; Royer et al., 2006; Breckpot et al., 2005;
Rutella et al., 2006).
Lange
Zeit
herrschte
unterschiedlicher
das
Dendritischer
Paradigma,
Zellen
dass
gäbe,
es
lediglich
plasmozytoide
zwei
und
Formen
myeloide
Dendritische Zellen (Schakel et al., 2002). Immer neue Berichte zeigen jedoch, dass
es deutlich mehr als nur diese beiden Arten gibt (Dzionek et al., 2000; MacDonald et
al., 2002). Dabei wird zunehmend das Augenmerk auch auf regulatorische und
tolerogene Dendritische Zellen gelegt, die eine hemmende Wirkung auf das
Immunsystem ausüben (Zhang et al., 2004; Enk et al., 2005).
Wegen ihrer besonderen Wirkung zur Unterstützung des Immunsystems haben
Dendritische Zellen Einzug in Studien zur Bekämpfung von Tumoren gefunden. Eine
Vielzahl von Ansätzen verwendet dabei Dendritische Zellen, die in unterschiedlicher
Weise mit Tumorantigenen beladen werden, als Impfvakzine (Wang et al., 2003;
Schuurhuis et al., 2009; Delirezh et al., 2009). Sowohl Daten aus in-vitro-Versuchen
als auch in-vivo-Daten bei Menschen und Mäusen zeigen dabei einen protektiven
Effekt der Dendritischen Zellen. Vielversprechende Ergebnisse konnten jedoch nur
dann erzielt werden, wenn keine große Tumormasse vorhanden war, also entweder
nach vorangegangener Chemotherapie/Bestrahlung/chirurgischer Intervention oder
als präventive Impfung bevor es zu einem Kontakt mit Tumorzellen kam (Vicari et al.,
2002; Banchereau und Palucka, 2005; Finn et al., 2003). Die Entwicklung einer
großen Tumormasse scheint daher mit einem Defekt der immunstimulierenden
Funktion der Dendritischen Zellen im Zusammenhang zu stehen. In der Tat konnten
bei Individuen, die an einem etablierten Tumor litten sowohl geringere Mengen an
Dendritischen Zellen im peripheren Blut und Tumormilieu detektiert als auch Defekte
in deren Funktion nachgewiesen werden (Almand et al., 2000; Lissoni et al., 1999;
Gabrilovich et al., 1997).
Tumore verfügen über eine großes Spektrum an Fähigkeiten, einer spezifischen
Immunantwort zu entgehen. Die Produktion von immunsupprimierenden Zytokinen
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wie Interleukin-10 (IL-10), IL-6, Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF)
und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sind dabei nur einige zu nennende
Möglichkeiten (Smith et al., 1994; Takahashi et al., 2002; Bellone et al., 2006).
IL-10 ist für seine das Immunsystem hemmende Wirkung seit langem bekannt. Es
wird durch unterschiedliche Subklassen von T-Zellen, Makrophagen, Monozyten,
Dendritischen Zellen, Mastzellen, B-Zellen, Keratinozyten, Eosinophilen sowie von
einer großen Anzahl von Tumorzelllinien produziert (O’Garra et al., 2008). Neben der
Unterdrückung der Produktion von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen
weist es ebenfalls hemmende Effekte auf Zellinteraktionen wie die Aktivierung von TZellen durch Antigenpräsentierende Zellen auf (de Waal Malefyt et al., 1991;
Fiorentino et al., 1991; Bogdan und Nathan, 1993).
Der Einfluss von IL-10 auf das Verhalten von Dendritischen Zellen wurde ausgiebig
untersucht. Im Vordergrund stand dabei häufig der hemmende Effekt auf die
Ausreifung von unreifen zu reifen Dendritischen Zellen. Neben der Suppression der
Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, sowie der Produktion
von IL-12 weist IL-10 auch einen direkten hemmenden Effekt auf den Transport der
mit Antigen beladenen MHC-Moleküle an die Zelloberfläche und damit deren
Präsentation auf (Koppelman et al., 1997). Mit IL-10 gereifte Dendritische Zellen
zeichnen sich zudem durch eine hohe phagozytische Fähigkeit aus, die eher der
unreifer Dendritischer Zellen oder der von Makrophagen entspricht (Fortsch et al.,
2000). Der außergewöhnliche Effekt von IL-10 auf die Ausreifung der Dendritischen
Zellen konnte in dem Versuch von Corinti et al. (2001) demonstriert werden, indem
allein die Zugabe eines hemmenden IL-10-Antikörpers zur Kultur unreifer
Dendritischer Zellen genügte, um zu einer spontanen Ausreifung dieser Zellen durch
die Unterbindung endogener IL-10-Effekte zu führen.
Parallel zur Inhibierung der Ausreifung zeigt IL-10 ebenfalls einen hemmenden Effekt
auf das Migrationsverhalten Dendritischer Zellen, was zur Verhinderung eines
Kontaktes von Dendritischen Zellen mit T-Zellen in den sekundären lymphatischen
Organen führt (Sozzani et al., 1999). IL-10 verhindert dabei nicht nur den
„Chemokinrezeptorswitch“, den Wechsel von CCR1 (C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 1)
und CCR2 zu CCR7, sondern führt ebenfalls zu einer Unterdrückung der Antwort auf
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ein chemotaktisches Signal trotz in großer Zahl vorhandener Rezeptoren (D’Amico et
al., 2000).
In einer Kokultur von Dendritischen Zellen und T-Zellen führt IL-10 durch die oben
genannten
Mechanismen
zu
einer
herabgesetzten
Stimulationsfähigkeit
der
Dendritischen Zellen (de Gruijl et al., 2006). Durch den Mangel an IL-12 wird zudem
die Immunantwort von einer T-Helferzell-1 (Th1)- zu einer Th2-Antwort verschoben
(Gerard et al., 1993). T-Zellen, die in dieser Gemischten Lymphozyten-Reaktion
stimuliert wurden, produzieren verringerte Mengen an Interferon-gamma (IFN-γ),
weisen eine verringerte Proliferationsfähigkeit auf und werden in Abhängigkeit der
Menge an IL-10, endogen oder exogen, zu toleranten T-Zellen (Steinbrink et al.,
1997).
Diese
Ergebnisse
belegen
das
Scheitern
Dendritischer
Zellen,
im
IL-10
produzierenden Tumormilieu eine suffiziente Immunantwort zu initiieren. Als
prognostische Marker konnten sowohl der Gehalt an IL-10 im Bereich des Tumors
als auch die Menge an reifen, aktiven Dendritischen Zellen in diesem als schlecht
bzw. gut korreliert werden. Der Gesamtanzahl der Dendritischen Zellen im
Tumormilieu,
unabhängig
vom
Aktivierungsgrad,
konnte
allerdings
keine
prognostische Relevanz zugeschrieben werden, was auf einen Defekt in der
Funktion der Dendritischer Zellen und nicht deren Zahl im Tumormilieu hinweist
(Iwamoto et al., 2003; Ambe et al., 1989; Gastl et al., 1993).
Demgegenüber wird im Tumor beherbergenden Organismus eine generelle
Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen gefunden, wenn das Augenmerk nicht
nur auf das direkte Tumormilieu gerichtet wird (Almand et al., 2000; Lissoni et al.,
1999). Es scheint, dass neben dem engen System des Tumormilieus, die durch
Tumoren produzierten Faktoren nicht nur eine hemmende Wirkung auf die Funktion
vorhandener Dendritischer Zellen ausüben, sondern auch zu einer Unterdrückung
des Pools an Vorläuferzellen und deren Differenzierung führen. Der Mechanismus ist
allerdings nicht ausreichend erklärt.
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Fragestellung
In dieser Arbeit wird daher der Einfluss von IL-10 auf den frühen Entwicklungsschritt
von Monozyten zu Dendritischen Zellen näher beleuchtet. Mit Hilfe von
Genexpressionsanalysen und der Messung der Oberflächenexpression mittels
Durchflusszytometrie wird das Profil von Monozyten untersucht, die neben den
Standardkulturbedingungen mit IL-4 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonienstimulierender-Faktor (GM-CSF) ebenfalls IL-10 ausgesetzt sind. Auf diese Weise
sollen die zugrundeliegenden Mechanismen aufgedeckt werden, wie IL-10 bereits
den Pool an Vorläuferzellen reduziert und somit die Anzahl an funktionsfähigen
Dendritischen Zellen minimiert.
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3. Material und Methoden
3.1 Verwendete Materialien
3.1.1 Reagenzien für Zellseparation und Zellkultur
Heparin (Hoffman-La Roche AG, Schweiz)
Biocoll Separationslösung (Biochrom AG Berlin, Deutschland)
Phosphat-gepuffertes Kochsalz (PBS) (0,2 mmol/l Phosphatpuffer pH7,2 und 50
mmol/l NaCl, Herstellung Apotheke Universitätsklinikum Leipzig)
Fetales Kälberserum, bei 65°C hitzeinaktiviert (Life Technologies, Darmstadt,
Deutschland)
RPMI 1640 mit Glutaminzusatz (Life Technologies, Darmstadt, Deutschland)
Penicillin/Streptomycin (10000E/ml Penicillin und Streptomycin, Life Technologies,
Darmstadt, Deutschland)
MACS-Separationssäulen (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland)
CD14-Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland)
MACS-Puffer: PBS (Herstellung Apotheke Universitätsklinikum Leipzig) mit 1 mM
EDTA (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) und 0,5% Kälberserumalbumin
(BSA) (Life Technologies, Darmstadt, Deutschland)
3.1.2 Stimulatoren
Rekombinantes humanes Interleukin-4 (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland)
Rekombinantes humanes GM-CSF (AL-Immunotools, Friesoythe, Deutschland)
Rekombinantes humanes Interleukin-10 (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland)
Rekombinantes humanes TNF-α (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland)
KLH (Hämocyanin aus Schlüssellochschnecken, Keyhole limpet hemocyanin, Sigma
Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
3.1.3 Reagenzien für FACS-Analysen
Gereinigtes humanes IgG (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
Maus Anti-CD14 FITC (Fluoreszeinisothiozyanat)-markierter Antikörper, Maus AntiCD1a
PE
(Phycoerythrin)-markierter
Antikörper,
Maus
Anti-HLA-DR
PC5
(Phycoerythrin-Cyanin 5.1)-markierter Antikörper, Maus Anti-CD80 FITC-markierter
Antikörper, Maus Anti-CD83 PE-markierter Antikörper, Maus Anti-IgG2b FITC12
markierter Antikörper, Maus Anti-IgG1 PC5-markierter Antikörper (alle Immunotech,
Marseille, Frankreich), Maus Anti-CCR1 PE-markierter Antikörper, Maus Anti-CCR2
PE-markierter Antikörper, Maus Anti-CCR7 PE-markierter Antikörper (alle R&D
Systems, Wiesbaden, Deutschland), Maus Anti-IgG2a PE-markierter Antikörper
(Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland)
Propidiumiodid/Annexin V-FITC (Immunotech, Marseille, Frankreich)
3.1.4 Molekularbiologische Reagenzien und Puffer
3.1.4.1 RNA-Isolierung
Invisorb Spin Cell RNA Mini Kit (Invitek, Berlin, Deutschland)
RNase-free DNase Set (Quiagen, Düsseldorf, Deutschland)
TAE-Puffer:
242 g Tris (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) Base
57,1 ml Eisessig
37,2 g Na2EDTA2H2O
mit H2O auf 1l auffüllen
Agarose (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
Ethidiumbromid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
Bromphenolblau (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
Ethanol 70% (Herstellung Universitätsapotheke Leipzig)
Ethanol 96% (Herstellung Universitätsapotheke Leipzig)
Glykogen (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
DEPC (Diethylpyrocarbonat)-Wasser (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
Natrium-Acetat (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
3.1.4.2 RT-PCR
SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, Mountain View, USA), bestehend aus:
Advantage 2 PCR Kit
NucleoSpin RNA II Kit
NucleoSpin Extract II
Easy Dilution-Lösung
13
3.1.4.3 cDNA Microarrays
Clontech AtlasTM Human Cytokine/Receptor Array (Cat. # 7744-1; mit 347 bekannten
Gensequenzen). (Clontech, Mountain View, USA)
[α-32P] dATP (10 µCi/ µl ; 3000 Ci/mmol, Amersham)
10 mg/ml ultraschallbehandelte Lachshoden DNA (Sigma, Taufkirchen, Deutschland)
10x Denaturierungslösung:
1M NaOH
10 mM EDTA
2 x Neutralisierungslösung: (1M NaH2PO4, bei pH7)
27,6g NaH2PO4H2O
mit 190 ml H2O auffüllen, den pH-Wert mit 10 N NaOH einstellen und mit 200 ml H2O
auffüllen
20 x SSC
175,3 g NaCl
88,2 g Na3Citrat2H2O
mit 900 ml H2O auffüllen, den pH-Wert mit 10 N NaOH einstellen und mit H2O auf 1l
auffüllen
20% SDS
200g SDS
mit 1l H2O auffüllen, auf 65°C erwärmen und auflösen
Waschlösung 1:
2 x SSC
1% SDS
Waschlösung 2:
0,1 x SSC
0,5% SDS
14
3.2 Zellen und Kulturbedingungen
3.2.1 Isolierung von Monozyten aus dem peripheren Blut
Das Blut von vier gesunden Spendern wurde zur Isolierung von Monozyten während
der Abnahme mit Heparin versetzt (500IE/50 ml). Zunächst wurde eine Verdünnung
mit PBS 1:1 vorgenommen, dann wurden jeweils 25ml des Gemisches auf 15ml
Biocoll Separationslösung aufgeschichtet. Bei 10°C und 2200U/min wurden die
Zellen über 15 Minuten separiert. Die Zentrifuge wurde nicht gebremst, sondern
rotierte aus. Der sich in der Interphase angereicherte Ring aus mononukleären
Zellen wurde vorsichtig abpipettiert und mit 50ml PBS bei 1700 U/min und 10°C für
10 Minuten gewaschen. Die entstandenen Pellets wurden resuspendiert und in ein
Röhrchen überführt und erneut mit 50ml PBS bei 1700 U/min und 10°C für 10
Minuten gewaschen. Um Zellhaufen oder Fibrinfäden zu entfernen wurde das Pellet
in MACS-Puffer aufgenommen und über einen 70µm-Filter gegeben. Nach
Feststellung der Zellzahl und erneutem Zentrifugieren bei 1700 U/min und 10°C für 5
Minuten wurde das Zellpellet in 80µl MACS-Puffer und 20µl CD14 MicroBeads pro 1
x 107 Zellen aufgenommen und 15-20 Minuten bei 6-12 °C inkubiert. Im Anschluss
wurden die Zellen mit der 10-20-fachen Puffermenge bei 1300 U/min und 10°C für 10
Minuten gewaschen. Die Separationssäule wurde auf den Magneten gesetzt und mit
500µl MACS-Puffer befeuchtet. Das Zellpellet wurde zweimalig in je 500µl MACSPuffer
aufgenommen
und
unter
Vermeidung
von
Blasenbildung
über
die
Magnetsäule gegeben. Im Anschluss wurde dreimal mit je 500µl MACS-Puffer
gespült. Im Folgenden wurde die Säule vom Magneten genommen und zweimal mit
1000 µl MACS-Puffer und dem entsprechenden Stempel gespült um die
Positivfraktion aus der Separationssäule zu entfernen. Nach einem erneuten
Waschschritt in MACS-Puffer bei 1700 U/min und 10 °C für 10 min wurde eine Probe
zur Kontrolle der Reinheit mittels Durchflusszytometrie (s.u.) entnommen. Bei
ungenügender Reinheit wurde der Separationsschritt über eine neue Säule ohne
nochmalige Antikörperinkubation wiederholt. Die Zellen wurden in einer Dichte von 1
x 106 /ml RPMI Medium in 25cm3 Kulturflaschen angesetzt. Die mittlere Reinheit
betrug 91,85% ± 5,08 (Mittelwert ± Standardabweichung) und wurde mittels
Durchflusszytometrie kontrolliert.
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3.2.2 Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen
Die Differenzierung von Monozyten zu Dendritischen Zellen erfolgt in zwei Schritten.
Zunächst
entwickeln
sich
durch
einen
adäquaten
Zytokin-Cocktail
unreife
Dendritische Zellen, die über ein hohes Potential zur Phagozytose verfügen und invivo an Eintrittspforten anzutreffen sind. Nach Kontakt mit einem Antigen verändert
sich die Dendritische Zelle erneut, indem sie ihre Fähigkeit zur Phagozytose verliert
und die Fähigkeit zur Antigenpräsentation in den Vordergrund rückt. Diese Prozesse
werden durch eine Reihe von Veränderungen des Phänotyps begleitet.
Isolierte CD14-positive Monozyten wurden über einen Zeitraum von sieben Tagen in
Medium
mit
dem
Zusatz
von
5%
fetalem
Kälberserum
(FCS)
und
1%
Penicillin/Streptomycin unter Standardkulturbedingungen (5% CO2, 37°C) kultiviert.
Um die Differenzierung zu Dendritischen Zellen zu initiieren, wurde dem Medium
700U/ml rhIL-4 und 1000U/ml rhGM-CSF zugesetzt. Jeden zweiten Tag wurde die
Hälfte des Mediums, das sich im Überstand befand vorsichtig abgenommen, bei
1700 U/min, Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert, und das Pellet in frischem
Medium in die Kulturflasche zurückgegeben. Zudem wurden 350U/ml rhIL-4 und
500U/ml rhGM-CSF zugegeben. Einige Ansätze erhielten zusätzlich 10 oder
100ng/ml rhIL-10, das zu Beginn der Inkubation zugesetzt wurde. Auch dieses
Zytokin wurde entsprechend alle zwei Tage mit Wechsel des Mediums substituiert.
Nach sieben Tagen Inkubation wurde das Kulturmedium komplett entfernt und die
entnommenen Zellen mehrfach mit Phosphat-gepuffertem Kochsalz (1700 U/min,
Raumtemperatur, für 10 Minuten) gewaschen.
Nach Aufnahme der Zellen in frisches Medium wurde die Ausreifung durch die
Zugabe von 10µg/ml KLH (Hämocyanin aus Schlüssellochschnecken), 50ng/ml
rhTNF-α und 1000U/ml rhGM-CSF für einen Zeitraum von drei Tagen erzielt.
Während dieses Zeitraums erfolgte kein Waschen der Zellen und kein Wechsel von
Medium oder Zytokinen.
3.3 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung von
Oberflächenmolekülen, intrazellulären Proteinen, Peptiden und DNA. Dabei bindet
ein mit einem Fluorochrom gekoppelter Antikörper an die zu bestimmende
Zellstruktur. Die Fluorochrome verfügen über unterschiedliche Wellenlänge des
16
emittierten Lichts, so dass eine Mehrfachfärbung von Zellen möglich ist. Die
markierten Zellen werden an einem Laserstrahl vorbei geführt, dadurch werden die
Fluorochrome angeregt und emittieren Licht der für sie spezifischen Wellenlänge.
Durch Färbung der Zellen mit Isotyp-Kontrollen kann ein Grenzwert für jede Färbung
festgelegt werden, so dass das Positivsignal für den gewünschten Antikörper
abzugrenzen ist.
Um unspezifische Bindungsereignisse zu verhindern wurden die Zellen, vor der
Inkubation mit dem spezifischen Antikörper, 15 Minuten mit 10µg humanem
Immunglobulin/100µl
Zellsuspension
(im
Mittel
300-1.000
Zellen/µl)
bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurde dem Röhrchen 1ml PBS zugegeben
und bei 1700 U/min und Raumtemperatur für 10 Minuten gewaschen. Die Zellen
wurden erneut in 100µl PBS aufgenommen und für 10 Minuten für die Antikörper der
Firma Immunotech (anti-CD14, -CD1a, -HLA-DR, -CD80, -CD83, FITC-IgG2b, PC5IgG1, PE-IgG2a) bei Raumtemperatur inkubiert. Pro Färbung wurden 10µl des
spezifischen monoklonalen Antikörpers pro 5 x 105 Zellen verwendet. Für die
Färbung mit den Antikörpern der Firma R&D Systems (anti-CCR1, -CCR2 und CCR7) wurde eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei 6-10°C gewählt. Nach einem
erneuten Waschschritt (1700 U/min, Raumtemperatur, 5 Minuten) wurden die Zellen
in 500µl PBS aufgenommen, Die Fluoreszenzintensität der spezifisch angefärbten
Zellen wurde mit dem Durchflusszytometer Epics XL (Beckman Coulter Fullerton,
USA) gemessen. Es wurden Fluorochrome folgender Farbe und Wellenlänge
verwendet: FITC, grün, 525 nm; PE, orange-rot, 575 nm; PC5, dunkel-rot, 670 nm.
An Hand der Positivität der Zellen für AnnexinV und Propidiumiodid wurden bereits
abgestorbene Zellen von der Auswertung ausgenommen wie von Ozdemir et al.
(2003) beschrieben. 5 x 105 - 5 x 106 Zellen/ml wurden in 100µl des zuvor 10-fach
verdünnten Bindungspuffers aufgenommen und streng auf Eis weiterverarbeitet. 1µl
Annexin-V-FITC und 5µl Propidiumiodid wurden für 10 Minuten mit den Zellen in
Dunkelheit inkubiert. Nach Zugabe von 400µl Bindungspuffer wurde die Probe mittels
Durchflusszytometrie analysiert.
Alle Zellen, die entweder einfach oder doppelt
positiv für AnnexinV und Propidiumiodid waren, wurden aus der weiteren Auswertung
ausgenommen. Ein direktes Gaten der Negativ-Fraktion für die übrigen Färbungen
war auf Grund des ähnlichen Farbspektrums mit PE nicht möglich. Daher wurden die
Ergebnisse der Färbung mit AnnexinV und Propidiumiodid auf das Vorwärts17
Seitwärts-Gitter übertragen und das entsprechende Gate für die Auswertung der
übrigen Färbungen übernommen.
3.4 RNA Isolierung
3.4.1 Prinzip und Protokoll der RNA-Isolierung
Das Prinzip der RNA-Isolierung mit Hilfe des Kits der Firma Invitek besteht darin, die
Zellen unter stark denaturierenden Bedingungen zu lysieren und zu homogenisieren.
Der Lysepuffer enthält Guanidin-Isothiocyanat und ß-Mercaptoethanol um RNasen
zu inaktivieren. Zudem werden alle Arbeitsschritte möglichst kühl, bzw. auf Eis
durchgeführt.
Zunächst wird die Probe auf einen Filter aufgebracht, der genomische DNA bindet.
Nach Zugabe von Ethanol wird die gereinigte RNA auf eine Silicagel-Membran
aufgebracht und durch verschiedene Waschschritte von Kontaminationen gereinigt
und mit dem Elutionspuffer von der Membran gelöst. Um die Reinheit weiter zu
verbessern folgte diesem Isolierungsschritt eine Inkubation mit DNAse.
CD14-positive
Monozyten
wurden
entsprechend
den
oben
genannten
Kulturbedingungen (siehe 2.2.1) für zwei Tage inkubiert. Anschließend wurden die
Zellen auf Eis gestellt und durch Spülen aus den Kulturflaschen entfernt. Nach
zweimaligem Waschen mit PBS bei 1700 U/min und 4°C für 10 Minuten wurde der
Überstand komplett entfernt und mit der RNA-Isolierung begonnen.
Für bis zu 5 x 106 Zellen wurde 350µl des Lösungspuffers R, für eine Zellzahl von 5 x
106
–
1 x 107 wurde die doppelte Menge des Lösungspuffers verwendet. Nach
komplettem Abgießen des PBS wurde das Pellet vorsichtig in den Lösungspuffer R
aufgenommen und so lange gemischt, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar waren.
Dieses Gemisch wurde auf den DNA-Bindungs-Filter, der in ein Eppendorf-Röhrchen
platziert wurde, aufgetragen und für eine Minute inkubiert. Nach einer Zentrifugation
bei 12000 U/min bei 4 °C für 2 Minuten wurde der DNA-Bindungs-Filter verworfen.
Um die RNA-Bindung optimal vorzubereiten, wurde die Probe in 350 bzw. 700µl 70%
Ethanol aufgenommen, entsprechend der Menge an Lösungspuffer R, und gut
durchmischt. Das Gemisch wurde dann auf die RNA-Bindungsmembran aufgebracht,
die erneut in ein Eppendorf-Röhrchen platziert wurde, und für eine Minute inkubiert.
Nach einer Zentrifugation bei 10000 U/min und 4°C für 30 Sekunden wurde die
Flüssigkeit, die den Filter passiert hat verworfen, die Membran jedoch in dasselbe
18
Röhrchen platziert. Sodann wurden 300µl der Waschlösung R1 auf die Membran
aufgebracht und das Röhrchen bei 10000 U/min und 4°C für 30 Sekunden
zentrifugiert.
Die
passierte
Flüssigkeit
wurde
verworfen,
das
Röhrchen
weiterverwendet.
80µl RNasefreie DNase (1:7 mit RDD Puffer verdünnt) wurde auf den Filter
aufgebracht und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Im Anschluss wurde der Waschschritt mit Waschpuffer R1 wiederholt (s.o.).
Nach Zugabe von 500µl Waschlösung R2 auf die Membran wurde bei 10000 U/min
und 4°C für 30 Sekunden zentrifugiert. Erneut wurde die passierte Flüssigkeit
verworfen und das Röhrchen beibehalten. Der Waschschritt mit der Waschlösung R2
wurde einmalig wiederholt. Um die Bindungsmembran zu trocknen und letzte Spuren
des Ethanols zu beseitigen, wurde das Röhrchen bei 12000 U/min und 4°C für 3
Minuten zentrifugiert. Die RNA-Bindungsmembran wurde auf ein neues, RNAsefreies Röhrchen versetzt und der Filter wurde mit 55µl Lösungspuffer R benetzt.
Nach einer Inkubationszeit von 2 Minuten wurde das Röhrchen bei 10000 U/min
und 4°C für eine Minute zentrifugiert. Die Membran wurde verworfen und die
gewonnene RNA sofort auf Eis gestellt. Wenn die RNA nicht sofort weiterverwendet
wurde, wurde sie bei -80°C eingefroren.
3.4.2 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit
3.4.2.1 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration
Die optische Dichte einer Nukleinsäurelösung bei 260 nm (OD260) ist ein Maß für die
Konzentration an Nukleiden. Die optische Dichte bei 280 nm (OD280) lässt den Grad
der Verunreinigung der Probe durch Proteine erkennen. Der Quotient OD260/OD280
sollte innerhalb bestimmter Grenzwerte liegen, da sonst keine lineare Abhängigkeit
der Absorption bei 260 nm zur Nukleinsäurekonzentration gegeben ist.
Eine optische Dichte von 1 entspricht bei 260 nm 40µg/ml ssRNA. Aus diesem
Verhältnis lässt sich mit folgender Formel die Konzentration der isolierten RNA
errechnen:
Konzentration RNA = 40 µg/ml x OD260 x Verdünnungsfaktor
Die OD260/OD280 -Ratio sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen. Geringere Werte sprechen
für eine Verunreinigung durch Substanzen, die ebenfalls UV-Licht absorbieren, oder
für Schwankungen des pH-Wertes.
19
3.4.2.2 Agarosegelelektrophorese
Zur Analyse der Reinheit sowie zur Trennung von Nukleinsäuren, werden horizontale
Agarosegele verwendet. Diese werden in ein Spannungsfeld gebracht, so dass die
negativ geladenen Nukleinsäuren im Laufpuffer zum positiven Pol wandern. Je nach
Größe der Nukleinsäuren weisen diese eine bestimmte Laufgeschwindigkeit auf. Für
aufgereinigte RNA ist ein spezielles Bandenmuster zu erwarten. Dabei zeigen sich
zwei scharf getrennte Banden, die 18S- (ca. 2kb) und 28S- (ca. 5kb) rRNA, die 95%
der Gesamt-RNA ausmachen. Die 28S-Bande sollte doppelt so stark ausgeprägt
sein wie die 18S-Bande. mRNA ist nur als Schimmer zu sehen. Eine unscharfe
Trennung spricht für eine Kontamination durch RNAsen.
Das 1 % Agarosegel wurde wie folgt hergestellt: 0,5g Agarose wurden in 50ml TAEPuffer aufgenommen und 0,5µl Ethidiumbromid zugegeben. Das Gemisch wurde in
der Mikrowelle aufgekocht und bei ersten Zeichen des Kochens solange geschwenkt,
bis sich eine Emulsion gebildet hat. Das Gel mit Kammeinsatz wurde möglichst
blasenfrei gegossen und bei Raumtemperatur 15-20 Minuten trocknen gelassen.
Zum Auftragen der Probe wurde jeweils ein Gemisch aus 2µl Probe, 2µl
Bromphenolblau und 6µl TAE-Puffer verwendet und das Gel bei 90Volt laufen
gelassen. Mit Hilfe von UV-Licht einer Wellenlänge von 245nm wurden die Banden
sichtbar gemacht und abfotografiert.
Abb.1 Exemplarische Darstellung dreier RNA-Proben mit Darstellung von 18S- und 28S-RNA mittels
Auftrennung über ein Agarosegel.
20
3.4.2.3 RNA-Fällung
Zur Erhöhung der RNA Konzentration wurde folgendes Protokoll verwendet:
Das RNA-Pellet wurde in 2,5µl Glykogen der Konzentration 10mg/ml in DEPCWasser, 3,5µl Natriumacetat und 87µl Ethanol 96% aufgenommen und bei 14000
U/min und 4°C 15-30 Minuten gewaschen. Das Pellet wurde sodann in 100µl 70%
Ethanol aufgenommen und erneut bei 10000 und 4°C für 10 Minuten gewaschen.
Nach Abgießen des Überstandes wurde die Probe über Nacht getrocknet.
Im Anschluss wurden Reinheit und Konzentration erneut mittels photometrischer
Bestimmung und Agarosegelelektrophorese kontrolliert. Nur solche Proben, deren
OD280/OD260
zwischen
1,8
und
2
lagen
und
die
ein
charakteristisches
Auftrennungsmuster in der Agarosegelelektrophorese aufzeigten wurden für die
weitere Verarbeitung verwendet.
3.5 cDNA Expressions-Ansätze
Die folgenden Arbeiten wurden freundlicherweise von Frau Dipl. Biochem. K. Seidel
durchgeführt.
3.5.1 mRNA-Amplifikation
Da die meisten Proben nicht ausreichende Mengen an mRNA für die Markierung der
Membranen enthielten wurde die vorhandene mRNA mit Hilfe des SMART PCR
cDNA Synthesis Kit zunächst revers transkribiert und die erhaltene ssRNA im
Anschluss im Sinne einer Polymerasekettenreaktion (PCR) so oft amplifiziert, dass
eine ausreichende Anzahl an cDNA für die Markierung der Nylonmembran zur
Verfügung stand. Die PCR wurde hierbei mit einem oligo(dT) Primer am 3’ Ende
initiiert. Das Prinzip der PCR basiert auf einem Zyklus, der aus Denaturierung,
Anlagerung und Synthese besteht. Die erforderliche Zyklenzahl wurde an Hand der
oben
(2.3.1
und
2.3.2)
beschriebenen
photometrischen
Bestimmung
und
Agarosegelelektrophorese bestimmt.
Bei der Durchführung der RT-PCR wurden RNase-freie Röhrchen verwendet und
sämtliche Schritte außerhalb des Gerätes wurden auf Eis durchgeführt.
Protokoll:
21
1. Mindestens 2ng Gesamt RNA in einem Volumen von 1-3,5µl wurden mit 1µl
des oligo(dT) Primer mit deionisiertem Wasser auf ein Startvolumen von 4,5µl
aufgefüllt.
2. Die Probe wurde bei 72°C in einem Cycler für 3 Minuten inkubiert und sodann
die Temperatur auf 42°C reduziert und die Probe weitere 2 Minuten inkubiert.
3. Herstellung des PCR Master Mix 1 (5,5 µl Volumen zu jeder Reaktion):
2 µl 5 x First-Strans Puffer
0,25 µl DTT (100 mM)
1 µl dNTP Mix (10 mM)
1 µl SMARTer IIA Oligonucleotide (12µM)
0,25 µl RNase Inhibitor
1 µl SMARTScribe Reverse Transcriptase
4. Zugabe des Master Mix 1 zur Probe und vorsichtiges Vermischen.
5. Inkubieren der Probe bei 42 °C für eine Stunde
6. Die Reaktion wurde durch Erhöhung der Temperatur auf 70 °C für 10 Minuten
beendet.
7. Der Probe wurden 40µl TE Puffer zur Verdünnung zugegeben.
8. Herstellung des PCR Master-Mix 2:
74 µl deionisiertes Wasser
10 µl 10 x Advantage 2 PCR Puffer
2 µl 50 x dNTP Mix (10 mM)
2 µl 5’ PCR Primer IIA (12 µM)
2 µl 50 x Advantage 2 Polymerase Mix
9. Die RNA Probe wurde vorsichtig gemischt und gevortext
10. Zugabe von 90 µl des PCR Master Mix
11. Platzieren des Gemisches in den vorgewärmten Cycler
12. Start der Reaktion mit folgendem Programm:
95°C für 1 Minute
dann für jeden Zyklus:
95°C für 15 Sekunden
65°C für 30 Sekunden
68°C für 3 Minuten
13. Nach 15 Zyklen wurde das Programm pausiert. 30µl wurden aus dem
Röhrchen zur Konzentrationsbestimmung entnommen, die übrige Probe bei
4°C gekühlt.
22
Aus der Probe zur Konzentrationsbestimmung wurden 5µl entnommen und mit
den verbleibenden 25µl drei weitere Zyklen gefahren. Erneut wurden 5µl
entnommen und mit den verbleibenden 20µl drei weitere Zyklen gefahren. Auf
diese Weise wurde fortgefahren, bis Proben der Zyklenzahlen 15, 18, 21, 24
und
27
zur
Verfügung
standen.
Diese
wurden
gemeinsam
zur
Konzentrationsbestimmung und Qualitätssicherung mittels Photometrie und
Agaraosegelelektrophorese untersucht.
14. Die bei 4°C gekühlte Probe wurde nun
entsprechend der gewünschten
Zyklenzahl in den Cycler gegeben.
15. Die Reaktion wurde mit 2µl 0,5 M EDTA beendet.
3.5.2 Membranmarkierung
3.5.2.1 Prinzip des cDNA-Array
Die positiv geladene Nylonmembran der Firma Clontech ist mit 347 bekannten
Gensequenzen, die im weitesten Sinne mit Zytokinen, Chemokinen und deren
Rezeptoren zu tun haben, gespickt. Jede Gensequenz ist hierbei doppelt angelegt.
Als
Positivkontrollen
dienen
Housekeeping-Gene
(ubiquitin
C,
tyrosine-3-
monooxygenase, hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1, glyceraldehydes-3phosphatase dehydrogenase, tubulin alpha, MHC IC, actin beta, ribosomal protein
L13a and ribosomal protein S9), als Negativkontrollen dienen Plasmid- und
Bakteriophagen-DNA. Die amplifizierte Proben-mRNA wurde in Gegenwart von
radioaktiv markierten Oligonukelotiden amplifiziert und über Nacht mit der Membran
hybridisiert. Die verwendeten Primer sind für jeden Array spezifisch und führen dazu,
dass nur die Gensequenzen amplifiziert werden, für die es ein Äquivalent auf der
Membran gibt. Mit Hilfe eines Phospho-Imagers wurde nach Abschluss der
Hybridisierung die spezifische Bindung der Proben-mRNA an die Membran
gemessen. Es handelt sich um ein semiquantitatives Verfahren, so dass die
Intensität der Radioaktivität nicht mit einer bestimmten Konzentration gleichzusetzten
ist.
3.5.2.2 Probensynthese
Protokoll:
1. Herstellung eines Master-Mixes für jeweils ein Hybrdisierungsexperiment:
5 x Reaktionspuffer
2 µl
23
10 x dNTP-Mix
1 µl
[α-32P] dATP
3,5 µl
DTT (100mM)
0,5 µl
Cycler auf 70 °C vorheizen
2. Je 1µg poly A+ RNA und 1µl CDS Primer Mix wurden in ein Röhrchen
gegeben und bis zu einem Endvolumen von 3µl deionisiertes Wasser
zugegeben
3. Ausgiebiges Mischen mit Hilfe einer Pipette. Das Röhrchen wurde für 2
Minuten in den vorgeheizten Cycler bei 70°C gegeben.
4. Die Temperatur wurde auf 50°C reduziert und für weitere 2 Minuten inkubiert.
Während dieser Inkubation wurden 1µl MMLV Reverse Transkriptase in den
Master-Mix gegeben und gut vermischt.
5. Nach Abschluss der Inkubation bei 50°C wurden der Probe 8µl des
Mastermixes zugegeben und gut durchmischt.
6. Das Gemisch wurde bei 50°C für 25 Minuten im Cycler inkubiert
7. Zum Abschluss der Reaktion wurden der Probe 1µl Terminierungs-Mix
zugegeben.
3.5.2.3 Aufreinigung
Um die Reinheit der cDNA zu vergrößern und nicht eingebautes
32
P zu entfernen
wurde folgender Aufreinigungsschritt durchgeführt:
1. Zugabe von 95% Ethanol zum Puffer NT3
2. Zugabe von 190µl Puffer NT2 zur Probe
3. Platzieren einer NucleoSpin Extraktion-Säule in ein 2ml-Röhrchen und
langsames Aufpipettieren der gelösten Probe auf die Säule
4. Zentrifugieren des Röhrchens inklusive Säule bei 14000 U/min und
Raumtemperatur für eine Minute. Verwerfen des Durchflusses mit dem
Röhrchen.
5. Platzieren der Säule in ein neues 2ml-Röhrchen. Zugabe von 400µl Puffer
NT3 und Zentrifugieren bei 14000 U/min und Raumtemperatur für 1
Minute. Verwerfen des Durchflusses mit dem Röhrchen.
Schritt 5. wurde noch zweimal wiederholt.
6. Platzieren der Säule in ein neues 1,5-ml Röhrchen und Zugabe von 100µl
Puffer NE und Inkubation für 2 Minuten.
24
7. Zentrifugieren bei 14000 U/min und Raumtemperatur für 1 Minute, die
Probe ist aus der Säule gelöst und befindet sich im Röhrchen.
8. Testung der Radioaktivität :
a. Zugabe von 2µl der Probe zu 5ml Scintillationsflüssigkeit.
b. Messung der
32
P-Aktivität und Errechnung der cpm (counts per
minute). Es sollten 5 – 20 x 106 cpm gemessen werden.
9. Falls die Proben nicht direkt weiterverarbeitet wurden, wurden sie bei -20 °C
eingefroren.
3.5.2.4 Hybridisierung der Nylonmembran
1. Zubereitung einer Lösung aus Express Hyp und ultraschallbehandelter LachsDNA:
a. Aufwärmen der Express Hyp Lösung auf 68°C
b. Aufwärmen der ultraschallbehandelten Lachs-DNA auf 95-100°C für 5
Minuten und rasches Abkühlen auf Eis.
c. Mischen der Lachs-DNA mit der Express Hyp-Lösung und Halten der
Temperatur bei 68°C.
2. Auffüllen einer Hybridisierungsflasche mit deionisiertem Wasser.
Anfeuchten der Membranen mit deionisiertem Wasser und anschließend
Gabe in die Hybridisierungsflasche. Im Anschluss Entfernen des Wassers aus
der Flasche. Die Membran sollte an die Wand der Flasche angelegt sein,
gleichmäßig feucht sein und keine Luftblasen zeigen.
Zugabe von 5ml der Lösung, die in 1. hergestellt wurde.
3. Beginn der Prähybridisierung für 30 Minuten bei 68°C und ständiger
Bewegung der Hybridsierungsflasche.
4. Zur Vorbereitung der cDNA-Probe werden 5µl C0t-1 DNA zugegeben und für 2
Minuten bei 95°C inkubiert. Im Anschluss wurde die Probe für 2 Minuten auf
Eis gestellt.
5. Zugabe der Probe in die Hybridisierungsflasche. Dabei wurde darauf geachtet,
dass die Probe nicht direkt auf die Membran gegeben wurde, sondern sich
möglichst gut mit der Prähybridisierungslösung mischt.
6. Hybridisierung über Nacht bei 68°C und kontinuierlicher Bewegung. Bei
unzureichender Flüssigkeit, Zugabe von 2 -3ml der Express Hyb-Lösung.
7. Am nächsten Tag: Aufwärmen der Waschlösungen 1 und 2 auf 68°C.
25
8. Vorsichtiges Abgießen der Hybridisierungslösung. Zugaben von 200 ml
Waschlösung 1 und Waschen für 30 Minuten bei 68°C. Dieser Waschschritt
wurde insgesamt 4 mal durchgeführt.
9. Einmaliges Waschen mit 200ml Waschlösung 2 für 30 Minuten, 68°C und
kontinuierlicher Bewegung.
10. Zuletzt fünfminütiges Waschen mit 200ml 2 x SSC und Raumtemperatur,
sowie kontinuierlicher Bewegung.
11. Vorsichtiges Entfernen der Membran aus der Hybridisierungsflasche und
zügige Gabe in einen Plastikbeutel, der sofort versiegelt wurde. Die Membran
sollte keinesfalls trocken werden.
12. Auslesen
der
Membran
mit
Hilfe
eines
Phospho-Imagers
bei
Raumtemperatur.
3.5.2.5 Auswertung der Ergebnisse
Das Genexpressionsmuster konnte an Hand des Orientierungsgitters der Firma
Clontech zugeordnet werden. Um die drei unterschiedlichen Populationen an Zellen
zu vergleichen, wurde die Software der Firma Raytest (AIDA Array Metrix/AIDA Array
Compare, Straubenhardt, Deutschland) verwendet. Alle Hybridisierungsreaktionen
wurden in Duplikaten angefertigt und der jeweilige Mittelwert wurde als Grundlage
zur weiteren Analyse genommen.
Die Ergebnisse sind als Normalized-Bkg [%] wiedergegeben: Für die Fläche des
radioaktiv-positiven Spots wurde das Integral mit Hilfe der Pixelinformationen durch
das Programm Array Metrix berechnet. Leere Spots oder die umgebende Fläche
zählen als Integral des Hintergrundes und werden von den spezifischen Spots
subtrahiert. Das mittlere Integral aus der Pixelinformation der houskeeping-Gene
(Positivkontrollen) wurde für die Normalisierung der Spots in die Auswertung
herangezogen.
(Normalized-Bkg
[%]
=
Integral
der
Pixelinformation
eines
spezifischen Spots minus Integral des Hintergrundes geteilt durch das mittlere
Integral der Positivkontrollen).
In die Auswertung wurden nur solche Gene einbezogen, die bei allen drei Probanden
in allen drei Versuchsbedingungen gleichsinnig reguliert wurden. Wegen großer
interindividueller Unterschiede zwischen den Probanden wurde für die weitere
Auswertung die Normalized-Bkg [%] der Zellen, die IL-4/GM-CSF ausgesetzt waren
26
als 1 gesetzt und die jeweilige Zu- oder Abnahme der übrigen Bedingungen im
Vergleich dazu errechnet.
3.6 Statistische Auswertung
Da nur drei cDNA-Array-Experimente gemacht wurden, habe ich nach Absprache mit
meinem Betreuer der Arbeit auf eine statistische Auswertung der Experimente
verzichtet. Diese wurden deskriptiv dargestellt. Aufgrund der hohen Kosten für die
einzelnen Experimente war es nicht möglich mehr als die genannte Zahl der
Analysen durchzuführen.
27
4. Ergebnisse
4.1 Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen
unter dem Einfluss von IL-4 und GM-CSF
CD14-positive Monozyten, die über einen Zeitraum von sieben Tagen mit IL-4 und
GM-CSF kultiviert wurden (im Folgenden Standardkulturbedingungen genannt),
wiesen den typischen Phänotyp von unreifen Dendritischen Zellen auf: sie zeigten
einen nahezu vollständigem Verlust der CD14-Expression, sowie eine hohe
Expression an HLA-DR und CD1a. Die Zellen, die jeweils positiv für HLA-DR oder
CD1a waren, waren gleichzeitig in einem hohen Prozentsatz negativ für CD14. Die
Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR2 waren bereits nur noch gering exprimiert, die
Expression von CCR7 war vernachlässigbar (Abb.2).
CD14+
0,20
CD1a+
92,33
CD1a+/CD14-
90,05
Antigen
HLA-DR+
48,34
DR+/CD14-
47,33
CCR1+
2,30
CCR1+/CD14-
2,30
CCR2+
3,88
CCR2+/CD14-
3,83
CCR7+
0,50
CCR7+/CD14-
0,45
% positiver Zellen
Abb.
2.
Phänotyp
unreifer
Dendritischer
Zellen
nach
Ausreifung
unter
Standardkulturbedingungen. CD14-positive Monozyten wurden mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4
und 1000U/ml rhGM-CSF für sieben Tage inkubiert. Nach Gewinnung der Zellen und ausführlichem
Waschen mit PBS wurden die Zellen zunächst mit humanem IgG und anschließend mit den
spezifischen fluoreszenzmarkierten Oberflächenantikörpern inkubiert. Nach Waschen der Zellen
wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen mittels FACS gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte der
prozentualen Oberflächenexpression aus acht Versuchen nach Abzug der entsprechenden
Isotypkontrolle.
28
4.2 Ermittlung der wirksamen hemmenden Konzentration von IL-10
Um zu eruieren, welche Konzentration an IL-10 für eine Hemmung der
Differenzierung ausreichend ist und auszuschließen, dass die Zugabe von IL-10
lediglich zu einem erhöhten Zelltod führt, wurde den Monozyten, zusätzlich zu IL-4
und GM-CSF 10ng bzw. 100ng/ml IL-10 zugegeben und die Oberflächenexpression
von CD14 bestimmt. Wie bei allen übrigen FACS-Analysen wurde der Prozentsatz
der Zellen gemessen, die Annexin V aufnehmen oder positiv für Propidiumiodid
waren.
Unter Zugabe von IL-10 zeigte sich ein hemmender Einfluss auf die Reduktion der
CD14-Expression (Abb.3). Hier zeigte sich ein größerer Effekt von 100ng versus
10ng/ml IL-10 im Hinblick auf den Mittelwert aus vier unabhängigen Versuchen.
60,00
% positiver Zellen
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
IL-4/GM-CSF
IL-4/GM-CSF +10 ng/ml
IL-10
IL-4/GM-CSF +100 ng/ml
IL-10
Abb. 3. Oberflächenexpression von CD14 unter dem Einfluss von IL-10. CD14-positive
Monozyten wurden mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF für sieben Tage
inkubiert. In einigen Experimenten wurde der Kultur 10 ng/ml oder 100 ng/ml rhIL-10 zugegeben.
Nach Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen zunächst mit
humanem IgG und anschließend mit den spezifischen fluoreszenzmarkierten Oberflächenantikörpern
inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen mittels FACS gemessen.
Gezeigt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Oberflächenexpression von
vier weiteren Probanden nach Abzug der entsprechenden Isotypkontrolle. Mittelwert und
Standardabweichung der Zellen, die in IL-4/GM-CSF für sieben Tage inkubiert wurden betragen 0.
Betrachtet man den Anteil der lebenden Zellen, so zeigt sich ein Trend zu
vermehrtem Zelltod unter der Zugabe von IL-10 zum Differenzierungscocktail mit
einer geringen Zunahme mit erhöhter IL-10-Konzentration (Abb.4).
29
% der Zellen, die negativ für
Annexin V und PI sind
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
IL-4/GM-CSF
IL-4/GM-CSF +10 ng/ml
IL-10
IL-4/GM-CSF +100 ng/ml
IL-10
Abb. 4. Messung der Anzahl der lebenden Zellen mit Hilfe der Negativität für Annexin V und
Propidiumiodid CD14-positive Monozyten wurden mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000
U/ml rhGM-CSF für sieben Tage inkubiert. In einigen Experimenten wurde der Kultur 10 ng/ml oder
100 ng/ml rhIL-10 zugegeben. Nach Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS
wurden die Zellen mit 1 µl Annexin V-FITC und 5 µl Propidiumiodid in Dunkelheit für 10 Minuten
inkubiert und nach Zugabe von Bindungspuffer ohne zusätzlichen Waschschritt gemessen. Dargestellt
sind die Mittelwerte und Standardabweichung aus vier unabhängigen Experimenten.
Die gezeigten Ergebnisse zeigen einen eindeutigen Effekt unter der Zugabe von
10ng/ml auf die Herabregulation von CD14. Somit erscheint die genannte Menge für
die hemmende Wirkung ausreichend zu sein. Da mit Zunahme der IL-10Konzentration der Anteil der in Apoptose und Nekrose befindlichen Zellen zunahm,
wurde in den folgenden Experimenten die IL-10-Konzentration von 10ng/ml
verwendet.
4.3 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung von Monozyten
zu unreifen Dendritischen Zellen
4.3.1 Oberflächenexpression nach sieben Tagen
Im Folgenden wurde der hemmende Einfluss von 10ng/ml IL-10 zur Zugabe des
Ausreifungscocktails auf die Oberflächenexpression von typischen Markern unreifer
Dendritischer Zellen untersucht. Als zusätzliche Proben wurden Zellen, die während
des Inkubationszeitraums lediglich in Medium kultiviert wurden, mit aufgenommen,
um zu eruieren, ob IL-10 lediglich die Wirkung von IL-4/GM-CSF hemmt, oder auch
eigene Wirkungen hervorbringt.
30
Abbildung 5 zeigt, dass der Zusatz von IL-10 zum Differenzierungscocktail zu einer
Hemmung der Herabregulation von CD14 führte. Es handelt sich hierbei jedoch nicht
um einen vollständigen Block der Induktion durch IL-4 und GM-CSF. Zellen die mit
dem Zusatz von IL-10 kultiviert wurden, erreichten nicht das Expressionsniveau
derjenigen Zellen, die nur in Medium alleine inkubiert wurden. Der hemmende
Einfluss von IL-10 machte sich ebenfalls sehr deutlich auf die Expression von CD1a
bemerkbar, auch hier vermochte IL-10 jedoch nicht, die Effekte von IL-4 und GMCSF vollständig aufzuheben.
Im Hinblick auf die Chemokinrezeptoren CCR1, CCR2 und CCR7 waren die Effekte
von IL-10 nicht einheitlich. Während es bei CCR2 zu einer Hemmung der
Herabregulation kam, ähnlich derer für CD14, so scheint IL-10 auf die Expression
von CCR1 eine zusätzliche induzierende Wirkung zu haben.
Im Gegensatz zu Zellen, die unter Standardkulturbedingungen kultiviert wurden,
wiesen die Zellen, die nur in Medium kultiviert wurden, sowie diejenigen, die unter
dem Zusatz von IL-10 inkubiert wurden, bereits geringe Mengen an CCR7 an der
Zelloberfläche auf.
Zusammengefasst
zeigte
sich,
dass
die
Zugabe
von
IL-10
zum
Differenzierungscocktail hemmend auf die Induktion von IL-4 und GM-CSF wirkt.
Zusätzlich bringt IL-10 jedoch auch spezifische Wirkungen mit sich, die zur
Entstehung eines eigenen Zellphänotyps führen.
31
% positiver Zellen
65,55
CD14+
0,20
24,06
0,59
92,33
CD1a+
19,96
69,88
48,34
Antigen
HLA-DR+
78,85
23,53
CCR1+
2,30
47,40
30,78
CCR2+
3,88
21,60
11,70
CCR7+
13,25
Medium
IL-4/GM-CSF
IL-4/GM-CSF+ IL-10
Abb. 5 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung zu unreifen Dendritischen Zellen. CD14positive Monozyten wurden in Medium, mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF
oder der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF und 10 ng/ml rhIL-10 für sieben Tage
inkubiert. Nach Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen
zunächst mit humanem IgG und anschließend mit den spezifischen fluoreszenzmarkierten
Oberflächenantikörpern inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen
mittels FACS gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte der prozentualen Oberflächenexpression aus
acht Versuchen nach Abzug der entsprechenden Isotypkontrolle.
4.3.2 Oberflächenexpression nach zwei Tagen
Die Ergebnisse der Oberflächenexpression weisen auf einen früh einsetzenden
Effekt von IL-10 hin. Daher wurden Zellen, die für zwei Tage zur Differenzierung
angeregt wurden ebenfalls untersucht (Abb.6).
32
50,00
% positiver Zellen
45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
Medium
20,00
IL-4/GM-CSF
15,00
IL-4/GM-CSF +10 ng IL-10
10,00
5,00
0,00
CD14+
HLA-DR+
CD1a+
Antigen
Abb. 6. Einfluss von IL-10 auf die frühe Differenzierung Dendritischer Zellen. CD14-positive
Monozyten wurden in Medium, mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF oder
der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF und 10 ng/ml rhIL-10 für zwei Tage
inkubiert. Nach Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen
zunächst mit humanem IgG und anschließend mit den spezifischen fluoreszenzmarkierten
Oberflächenantikörpern inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen
mittels FACS gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte der prozentualen Oberflächenexpression aus
vier Versuchen nach Abzug der entsprechenden Isotypkontrolle.
Es zeigte sich, dass der Effekt von IL-10 auf die Herabregulation von CD14, sowie
die Induktion von CD1a bereits nach 48h zu Tage tritt. Im Gegensatz hierzu wiesen
Zellen, die zu diesem Zeitpunkt unter Standardkulturbedingungen kultiviert wurden,
den höchsten Prozentsatz für HLA-DR auf. Dieses Verhältnis wird sich in den
folgenden fünf Tagen der Inkubation umdrehen.
4.3.3 Oberflächenexpression nach 24 Stunden und 48 Stunden für die
Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7
Die Ergebnisse der Oberflächenexpression an Tag 7 zeigen, dass es bereits zu
diesem Zeitpunkt zu einer Induktion des Chemokinrezeptors CCR7 bei Zellen, die
zusätzlich zum Differenzierungscocktail IL-10 ausgesetzt waren, kam. Zudem weisen
die Versuche auf eine direkte induzierende Wirkung von IL-10 für CCR1 hin.
Daher wurde die Oberflächenexpression dieser beiden Rezeptoren nach 24 und 48
Stunden untersucht.
Bereits 24 Stunden nach Kulturbeginn führte die Inkubation mit IL-4 und GM-CSF zu
einer deutlichen Reduktion der Expression von CCR1 (Abb. 7a). Diese nahm
innerhalb der nächsten 24 Stunden nur unwesentlich zu. Unter der Zugabe von IL-10
33
zum Differenzierungs-Cocktail wurde diese Herabregulation aufgehoben. Es wurden
Expressionsmuster ähnlich derer gemessen, wie für Zellen die nur in Medium
kultiviert wurden. Ein eigener induzierender Effekt auf die Expression von CCR1, den
die Daten der Oberflächenexpression an Tag 7 vermuten ließen, konnte weder nach
24 noch nach 48 Stunden gezeigt werden. Die Expression von CCR1 überstieg an
beiden Tagen nicht die der Zellen, die in Medium alleine kultiviert wurden.
Für CCR7 wurden nach 24 und 48 Stunden die höchsten Werte in der Zellpopulation
gemessen, die in Medium alleine kultiviert wurden (Abb. 7b). Dies weist auf eine
unspezifische Aktivierung der Zellen hin. Für die beiden anderen Kulturbedingungen
ließen sich weder nach 24 noch nach 48 Stunden wesentliche Expressionswerte
messen.
Insbesondere
ergab
sich
kein
Unterschied
zwischen
der
Standardkulturbedingung und der Zugabe von IL-10.
34
% CCR1-positiver Zellen
A
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
Medium
15,00
IL-4/GM-CSF
10,00
IL-4/G/IL-10
5,00
0,00
24h
48h
Inkubationszeit
B
% CCR7-positiver Zellen
25,00
20,00
15,00
Medium
10,00
IL-4/GM-CSF
IL-4/G/IL-10
5,00
0,00
24h
48h
Inkubationszeit
Abb. 7. Einfluss von IL-10 auf die Expression der Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7. CD14positive Monozyten wurden in Medium, mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF
oder der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF und 10 ng/ml rhIL-10 für zwei Tage
inkubiert. Nach Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen
zunächst mit humanem IgG und anschließend mit den spezifischen fluoreszenzmarkierten
Oberflächenantikörpern inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen
mittels FACS gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte der prozentualen Oberflächenexpression aus
drei Versuchen nach Abzug der entsprechenden Isotypkontrolle. A: Expression von CCR1.
B:Expression von CCR7.
35
4.4 Ausreifung von unreifen Dendritischen Zellen zu reifen
Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von KLH, TNF-α und
GM-CSF
Monozyten, die unter Standardkulturbedingungen für sieben Tage kultiviert wurden,
wurden nach ausführlichem Waschen für drei Tage mit KLH, rhTNF-α und rhGMCSF inkubiert. Dieser Ausreifungs-Cocktail führte zu einer Zunahme der Expression
von HLA-DR und CCR7, sowie dem Anteil der Zellen die HLA-DR-negativ oder
CCR7-positiv und gleichzeitig negativ für CD14 waren. Zudem zeigten diese Zellen
eine hohe Expression für die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD83. Es
zeigte sich kein weiterer Anstieg der bereits an Tag 7 hohen Expression von CD1a.
Für die Oberflächenexpression von CD14, CCR1 und CCR2 zeigte sich ebenfalls
keine Änderung der bereits kaum mehr vorhandenen Expression. Damit wiesen die
untersuchten Zellen den bekannten Phänotyp von reifen Dendritischen Zellen auf.
Antigen
CD14+
0,07
CD1a+
93,90
CD1a+/CD14-
93,10
HLA-DR+
96,10
DR+/CD14-
95,73
CCR1+
0,63
CCR1+/CD14-
0,57
CCR2+
1,40
CCR2+/CD14-
1,27
CCR7+
17,40
CCR7+/CD14-
17,30
CD80+
87,70
CD83+
92,10
CD80+/CD83+
86,30
% positiver Zellen
Abb. 8. Phänotyp reifer Dendritischer Zellen. CD14-positive Monozyten wurden mit 700 U/ml rhIL-4
und 1000 U/ml rhGM-CSF für sieben Tage inkubiert. Für drei weitere Tage erfolgte die Ausreifung mit
10 µg/ml KLH, 50 ng/ml rhTNF-α und 1000 U/ml rhGM-CSF. Nach Gewinnung der Zellen und
ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen zunächst mit humanem IgG und anschließend mit
den spezifischen fluoreszenzmarkierten Oberflächenantikörpern inkubiert. Nach Waschen der Zellen
wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen mittels FACS gemessen. Gezeigt sind die Mittelwerte der
prozentualen Oberflächenexpression aus drei Versuchen nach Abzug der entsprechenden
Isotypkontrolle.
36
4.5 Kann eine adäquate Ausreifung die hemmenden Effekte von IL10 überwinden?
Wurden Monozyten, die während der ersten siebentägigen Inkubation IL-10
ausgesetzt waren, entsprechend mit KLH, TNF-α und GM-CSF ausgereift, zeigte
sich eine erniedrigte Expression von CD1a, HLA-DR, CD80 und CD83 (Abb.9). Der
Anteil der Zellen, die positiv für CD14, CCR1 und CCR2 waren, war demgegenüber
weiterhin erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch unter optimalen Bedingungen
eine Ausreifung in Abwesenheit von IL-10 von Zellen, die während der Frühphase IL10 ausgesetzt waren nicht möglich ist. Die Zugabe von IL-10 während der frühen
Phase der Differenzierung zu Standardkulturbedingungen führt daher zu einer
irreversiblen Blockade der Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen.
CD14+
0,07
53,33
CD1a+
93,9
35,53
Antigen
HLA-DR+
CCR1+
CCR2+
CCR7+
CD80+
CD83+
96,1
82,17
0,63
Tag 1-7 ohne IL-10,
Ausreifung ohne IL-10
39,53
1,4
Tag 1-7 mit IL-10,
Ausreifung ohne IL-10
38,13
17,4
51,3
41,33
39,53
87,7
92,1
% positiver Zellen
Abb. 9. Früher Einfluss von IL-10 auf die Ausreifung Dendritischer Zellen. CD14-positive
Monozyten wurden mit 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF mit und ohne Zusatz von 10 ng/ml
rhIL-10 für sieben Tage inkubiert. Nach einem ausführlichen Waschschritt erfolgte für drei weitere
Tage die Ausreifung mit 10 µg/ml KLH, 50 ng/ml rhTNF-α und 1000 U/ml rhGM-CSF. Nach
Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen zunächst mit
humanem IgG und anschließend mit den spezifischen fluoreszenzmarkierten Oberflächenantikörpern
inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen mittels FACS gemessen.
Gezeigt sind die Mittelwerte der prozentualen Oberflächenexpression aus drei Versuchen nach
Abzug der entsprechenden Isotypkontrolle.
37
4.6 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen
Des Weiteren wurde der Einfluss von IL-10 in der Ausreifungsphase untersucht. Die
Zugabe von IL-10 zum Ausreifungscocktail KLH, TNF-α und GM-CSF führte bei
Zellen, die zuvor unter Standardkulturbedingungen behandelt wurden, zu einer
verringerten Expression der Oberflächenmoleküle CD80 und CD83. Ein wesentlicher
Einfluss auf die Expression von CD1a, HLA-DR, CD14 oder die Chemokinrezeptoren
CCR1, CCR2 und CCR7 war nicht zu verzeichnen (Abb 10a).
Die Zugabe von IL-10 zum Ausreifungscocktail zeigte keine weitere hemmende
Wirkung auf Zellen, die bereits während der ersten sieben Tage unter dem Einfluss
von IL-10 standen. Ein Trend zu erniedrigter Expression konnte lediglich auf die
Expression von CCR7, HLA-DR sowie auf die Expression von CD80 und CD83
beobachtet werden (Abb. 10b).
A
CD14+
0,07
0,6
93,9
92,93
CD1a+
96,1
97,07
Antigen
HLA-DR+
CCR1+
0,63
1,13
CCR2+
1,4
5,2
CCR7+
CD80+
CD83+
Tag 1-7 ohne IL-10,
Ausreifung ohne IL-10
Tag 1-7 ohne IL-10,
Ausreifung mit IL-10
17,4
22,5
87,7
82,13
92,1
86,83
% positiver Zellen
38
B
53,33
56,47
CD14+
CD1a+
35,53
36,7
Antigen
HLA-DR+
CCR1+
CCR2+
CCR7+
CD80+
CD83+
72,33
39,53
30,07
38,13
45,37
82,17
Tag 1 -7 mit IL-10,
Ausreifung ohne IL-10
Tag 1-7 mit IL-10,
Ausreifung mit IL-10
51,3
45,8
41,33
40,03
39,53
29,97
% positiver Zellen
Abb. 10. Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen. CD14-positive
Monozyten wurden entweder mit 700 U/ml rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF (A) oder mit IL-4/GM-CSF
und 10 ng/ml rhIL-10 (B) für sieben Tage inkubiert. Für drei weitere Tage erfolgte die Ausreifung mit
10 µg/ml KLH, 50 ng/ml rhTNF-α und 1000 U/ml rhGM-CSF mit oder ohne 10 ng/ml rh IL-10. Nach
Gewinnung der Zellen und ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen zunächst mit
humanem IgG und anschließend mit den spezifischen fluoreszenzmarkierten Oberflächenantikörpern
inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurde die Fluoreszenzdichte der Zellen mittels FACS gemessen.
Gezeigt sind die Mittelwerte der prozentualen Oberflächenexpression aus drei Versuchen nach Abzug
der entsprechenden Isotypkontrolle.
39
4.7 Genexpressionsmuster in der frühen Phase der Differenzierung
Dendritischer Zellen
Die
Ergebnisse
der
Oberflächenexpression
weisen
auf
einen
frühen
und
nachhaltigen Effekt von IL-10 auf die Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen
Zellen hin. Daher wurde zur Untersuchung des Genexpressionsmusters eine
Inkubationszeit von 48 Stunden nach Beginn der Zellkultur gewählt. Mit Hilfe des
AtlasTM Human Cytokine/Receptor Array wurde die Genexpression von 347
unterschiedlichen Genen, die im weitesten Sinne etwas mit Zytokinen, Chemokinen
und deren Rezeptoren zu tun haben, untersucht. Diese Gene sind vom Hersteller
vorgegeben. Neben Monozyten, die unter Standardkulturbedingungen inkubiert
wurden, wurden ebenfalls Zellen eingesetzt, die zusätzlich IL-10 ausgesetzt waren
und solche, die für 48 Stunden lediglich in Medium kultiviert wurden.
Eine große Anzahl der untersuchten Gene wurde in keiner der drei Zellpopulationen
oder nur in sehr geringem Maße exprimiert. (Abb. 11 A-C).
Abb. 11A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
40
Abb. 11B
Abb. 11C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Abb.11.Darstellung der spezifischen Hybridisierung isolierter cDNA mit dem Clontech Human
Cytokine/Receptor Array. CD14-positive Monozyten wurden entweder ausschließlich in Medium(A)
mit der Zugabe von 700 U/ml rhIL-4 und 1000U/ml rhGM-CSF(B) oder mit IL-4/GM-CSF und 10 ng/ml
rhIL-10(C) inkubiert. 48h nach Beginn der Zellkultur wurden die Zellen gewonnen und ihre RNA
extrahiert. In Gegenwart von dCTP wurde die RNA sodann revers-transkribiert und mit dem Clontech
Human Cytokine/Receptor Array inkubiert. Gezeigt sind die durch einen Phospho-Imager erhaltenen
Hybridisierungssignale von einem der drei Probanden für die genannten Bedingungen. Alle
ausgewählten Gene sind als Duplikate angelegt. An der linken Seite der Membran befinden sich die
Positivkontrollen.
41
Tabelle 1 zeigt alle Gene, für die ein Absolutwert von 50 Normalized-Bkg [%] bei
mindestens zwei der drei Probanden für eine Kulturbedingung überschritten wurde.
Dabei handelt es sich hauptsächlich um proinflammatorische Zytokine oder deren
Rezeptoren. Für MCP-1(Monocyte chemoattractant protein-1), S100A8 (Familie der
S100 Proteine A8/small inducible cytokine A8), IL-8 und PDGF-α (platelete-derivedgrowth-factor-alpha) wurde einheitlich die höchste Expression in den Zellen
gemessen, die in Medium alleine kultiviert wurden. Die Expression von IL1R1(Interleukin-1 Rezeptor Typ 1) war in Zellen, die unter Zugabe von IL-10 inkubiert
wurden am höchsten, die Expressionsmuster von RANTES (regulated upon
activation, normal T cell expressed and secreted), Thymosin-ß10 und IL-2Rα waren
bei den drei unterschiedlichen Probanden uneinheitlich.
42
Tabelle 1. Hoch exprimierte cDNA in Monozyten in Differenzierung
cDNA
Medium
IL-4/GM-CSF
IL-4/GM-CSF
+IL-10
Normalized-Bkg [%]
MCP-1 (7D)
Normalized-Bkg [%]
Normalized-Bkg [%]
2665,35±2806,48
10,82±6,31
36,65±42,01
678,33±481,13
445,85±265,15
319,28±185,23
49,48±31,45
98,78±84,18
313,12±176,96
7541,43±5867,13
84,73±68,75
154±114,88
33,05±16,03
45,05±18,13
34,95±16,09
202,07±198,17
141,18±67,02
52,98±19,17
2931,98±4261,72
189,70±207,98
81,37±67,05
877,63±417,38
17,90±3,43
12,47±10,38
RANTES (7F)
IL-1R1 (4G)
S 100A8 (6H)
Thymosin-ß 10 (23H)
IL-2 RA (4I)
IL-8 (3J)
1
PDGF alpha (14N)
1
Normalized-Bkg [%]= Integral über die Fläche des spezifischen Spots minus mittleres Integral des
Hintergrundes geteilt durch das mittlere Integral der Positivkontrollen, gezeigt sind die Mittelwerte aus
zwei Proben von drei Probanden mit zugehöriger Standadabweichung. In Klammern hinter der
Genbezeichnung ist der Standort auf der Hybridisierungsmembran angegeben.
Für
insgesamt
elf
der
347
getesteten
Gene
konnte
ein
einheitliches
Regulationsmuster im Hinblick auf alle drei gewählten Bedingungen beobachtet
werden. Da es zwischen den drei Probanden große interindividuelle Unterschiede
gab, erschien ein Vergleich der Absolutwerte nicht sinnvoll. Daher wurde das
Expressionsprofil der Zellen, die unter Standardkulturbedingungen behandelt
wurden, als 1 gesetzt und die jeweilige Zunahme, beziehungsweise Abnahme der
Expression für Zellen unter den beiden anderen Bedingungen berechnet. Abbildung
12 zeigt hierbei vier verschiedene Regulationsmechanismen.
43
Relative Expression (IL-4/GM-CSF := 1)
0.1
IL-4/GMCSF + IL10
10
10
1
1
0.1
1000
0.1
100
S100A8
100
10
1
0.1
IL-4/GM-CSF + IL10
100
IL-4/GM-CSF
CTGF
medium
100
IL-4/GM-CSF
medium
Abb 12A
CCR2
(7L)
CCR2
(7M)
10
1
44
Relative Expresison (IL-4/GM-CSF := 1)
1
0.1
0.1
0.01
0.1
100
CSF3
10
0.01
100
IL-4/GM-CSF + IL10
1
100
IL-4/GM-CSF
IL1B
medium
10
IL-4/GM-CSF + IL10
IL-4/GM-CSF
medium
Abb 12B
S100A9
10
1
0.1
HBEGF
10
1
45
10
10
IFNGR2
WNT8B
1
1
0.1
0.1
0.1
IL-4/GM-CSF + IL10
0.1
IL-4/GM-CSF + IL10
1
IL-4/GM-CSF
1
PTAFR
IL-4/GM-CSF
10
GLG1
medium
10
0.01
medium
Relative Expression (IL-4/GM-CSF := 1)
Abb 12C
Abb. 12. Expressionsmuster der Gene, die bei allen Probanden gleichsinnig reguliert wurden.
CD14-positive Monozyten wurden entweder ausschließlich in Medium, mit der Zugabe von 700 U/ml
rhIL-4 und 1000 U/ml rhGM-CSF oder mit IL-4/GM-CSF und 10 ng/ml rhIL-10 inkubiert. 48h nach
Beginn der Zellkultur wurden die Zellen gewonnen und ihre RNA extrahiert. In Gegenwart von dCTP
wurde die RNA sodann revers-transkribiert und mit dem Clontech Human Cytokine/Receptor Array
hybridisiert. Dargestellt sind die Zunahme/Abnahme der Genexpression im Verhältnis zu
Standardkulturbedingungen von drei unterschiedlichen Probanden. Standort der genannten Gene auf
der Hybridisierungsmembran: IFNGR: 6B, Golgi glycoprotein 1: 17G, WNT 8B: 20I, CTGF: 22D,
S100A8: 6H, CCR2: 7L und 7M, IL1ß: 3C, S100A9: 6I, CSF-3: 6J, NOTCH1: 21G, HBEGF: 17M,
PAFR: 23C.
46
Die Inkubation von Monozyten mit IL-4 und GM-CSF führte zu einer Herabregulation
von connective tissue growth factor (CTGF), S100A8 und CCR2. Dieser
Mechanismus wurde durch IL-10 aufgehoben (Abb.12A). Dabei werden für CTGF
und CCR2 Expressionswerte erreicht, die diejenigen von Monozyten in Mediumkultur
übersteigen. Ebenfalls reduzierte Expressionsprofile werden für interleukin-1ß (IL1B), S100A9, colony stimulating factor 3 (CSF3), und heparin-binding EGF-like
growth factor (HBEGF) durch die Kultur in IL-4/GM-CSF erreicht. IL-10 Zugabe führte
hier jedoch zu einer weiteren Reduktion der Expression (Abb. 12B).
Interferon-γ Rezeptor 2 (IFNGR2), golgi glycoprotein 1(GLG1) und wingless type
MMTV integration site family 8B (WNT8B) waren in Monozyten unter Standardkulturbedingungen im Vergleich zu unstimulierten Zellen erhöht. Dieser Effekt wurde durch
IL-10 aufgehoben (Abb12C).
Der platelet-activating factor Rezeptor (PTAFR) erfuhr ebenfalls eine Hochregulation
durch IL-4/GM-CSF und dieser Mechanismus wurde durch die Zugabe von IL-10
noch verstärkt (Abb. 12C).
47
Zwei der 347 untersuchten Gene zeigten eine vornehmliche Expression in den mit IL10 kultivierten Zellen, im Vergleich zu den beiden anderen Kulturbedingungen kam
es zu mindestens einer Verdopplung der Genexpression (Tab. 2).
Tabelle 2. Vornehmlich durch IL-10 induzierte cDNA
cDNA
Medium
IL-4/GM-CSF
IL-4/GM-CSF
+IL-10
Normalized-Bkg
[%]
Normalized-Bkg [%]
Normalized-Bkg [%]
1
IL-1R type 1(4G)
Proband 1
83,2 ± 3,82
57,85 ± 19,59
270 ± 9,76
Proband 2
44,3 ± 1,41
42,9 ± 4,24
161,7 ± 0,85
Proband 3
20,95 ± 0,49
195,6 ± 8,34
507,65 ± 31,47
Proband 1
0±0
1,1 ± 0,42
7,6 ± 0,14
Proband 2
0,45 ± 0,21
0,05 ± 0,07
4,3 ± 0,28
Proband 3
0,1 ± 0
0,3 ± 0,57
4,85 ± 0,21
Apoptosis
protein
2
(22B)
1
Normalized-Bkg [%]= Integral über die Fläche des spezifischen Spots minus mittlerer Integral des
Hintergrundes geteilt durch den mittleren Integral der Positivkontrollen, gezeigt ist der Mittelwert aus
zwei Proben ± Standardabweichung von drei unterschiedlichen Probanden. In Klammern angegeben
ist der Standort der Gene auf der Hybridisierungsmembran.
Hierbei handelt es sich um den IL-1R type 1 und um apoptosis protein 2 (auch
cysteine-serine-rich nuclear protein 3(CSRNP3)). Diese Ergebnisse zeigen auf, dass
der Einfluss von IL-10 nicht nur auf einer Umkehr der durch IL-4/GM-CSF induzierten
Genexpression beruht, sondern dass IL-10 zur Entwicklung eines spezifischen
Expressionsprofils beiträgt, das weder dem von unreifen Dendritischen Zellen, noch
dem von Zellen, die nur in Medium kultiviert wurden, entspricht.
48
5. Diskussion
5.1 Hintergrund
Monozyten aus dem peripheren Blut stellen eine übliche Ausgangspopulation zur
Generierung von Dendritischen Zellen für Tumorvakzinierungsprotokolle dar (Rubio
et al., 2005). Diese Herangehensweise ermöglicht es, eine große Zahl phänotypisch
einheitlicher Zellen zu generieren, die, in Abhängigkeit von dem gewählten ZytokinCocktail, Merkmale unreifer oder reifer Dendritischer Zellen aufweisen (Dauer et al.,
2006; Chomarat et al., 2000). Neben diesem „proof of principle“ in in-vitro-Versuchen
gibt es ebenfalls den in-vivo-Nachweis, dass Monozyten im Organismus als
Vorläuferzellen der Dendritischen Zellen herangezogen werden (Yrkid et al., 2006;
Naik et al., 2006). Das am Ort der Entstehung vorherrschende Zytokinmilieu zeigt
sich dabei für den Phänotyp und die Funktion der entstehenden Zellpopulation
verantwortlich.
Für eine Vielzahl durch Tumoren gebildeter Substanzen konnte ein hemmender
Einfluss auf die Ausreifung Dendritischer Zellen, sowie die Interaktion mit TEffektorzellen nachgewiesen werden. Nicht immer gelang dabei die Zuordnung zu
einzelnen Proteinen (Kuang et al., 2008; Rita et al., 2005). Für IL-10, IL-6, M-CSF,
VEGF, Prostanoide und Ganglioside sind jedoch eindeutig hemmende Effekte auf die
Funktion der Dendritischen Zellen gezeigt worden (Matsuura et al., 2006; Young et
al., 2006; Beckenbaum et al., 2004; Harizi und Gualde 2005). Neben der direkten
Inhibierung der Dendritischen Zell-T-Zell-Interaktion wird im Tumor tragenden
Organismus jedoch zusätzlich zu Dendritischen Zellen, die in ihrer Funktion
eingeschränkt sind auch eine reduzierte Anzahl an Dendritischen Zellen angetroffen
(Bellone et al., 2006; Allmand et al., 2000; Lissoni et al., 1999).
Ein möglicher zugrundeliegender Mechanismus ist eine erhöhte Apoptose der
Dendritischen Zellen, ausgelöst durch von Tumoren gebildeten Substanzen. So
konnten Esche et al. (1999) zeigen, dass Dendritische Zellen in Biopsien aus
verschiedenen murinen und humanen Tumoren eine erhöhte Rate an Apoptose
aufweisen. Ito et al. (2006) konnten zudem aufzeigen, dass auch in den WächterLymphknoten von Patienten mit kleinzelligen Lungentumoren Dendritische Zellen
einer erhöhten Apoptose unterworfen sind. In keinem der genannten Modelle wurde
eine erhöhte Apoptose in anderen Lymphknoten oder der Milz detektiert.
49
Zum anderen gibt es viele Hinweise dafür, dass Tumoren der Immunüberwachung
durch die Dendritischen Zellen auch dadurch entgehen, dass sie den Pool an
Vorläuferzellen an der Differenzierung zu Dendritischen Zellen hindern. Gabrilovich
et al. (1996) zeigten in einem Mausmodell mit einem Tumor mit p53-Defekt eine
unzureichende Anti-Tumor-Antwort, die durch Funktionsverluste bei der Fraktion der
Dendritischen Zellen zu erklären war. Die Ausreifung von funktionsfähigen
Dendritischen Zellen aus dem Knochenmark dieser Mäuse war ex-vivo jedoch
möglich und rief eine gute Immunantwort hervor. Daher ist von einer Hemmung der
dendritischen Zellfunktion auf der Ebene der Vorläuferzellen auszugehen.
Pinzon-Charry et al. (2005) konnten in Patienten mit Brustkrebs zeigen, dass die
absolute Anzahl an funktionsfähigen Dendritischen Zellen im peripheren Blut im
Vergleich zu gesunden Probanden reduziert ist. Diese Reduktion geschieht zu
Gunsten einer neuen Zellfraktion, die als unreife Dendritische Zellen mit Defekten in
der folgenden Ausreifung gekennzeichnet sind.
Somit ist die unzureichende Antitumor-Antwort das Ergebnis mehrerer Faktoren, die
von unterschiedlichsten Tumorprodukten ausgelöst werden.
IL-10 wird durch eine Reihe an Tumoren gebildet (Smith et al., 1994; KrugerKrasagakes et al., 1994) und Conrad et al. (1999) konnten zeigen, dass eine erhöhte
Expression vornehmlich in weit fortgeschrittenen Tumorläsionen gefunden wird.
Während der hemmende Einfluss von IL-10 während der Ausreifung der
Dendritischen Zellen viel untersucht wurde (de Waal Malefyt et al., 1991; Fiorentino
et al., 1991; Bogdan und Nathan, 1993), sind die Mechanismen, wie IL-10 den Pool
an Vorläuferzellen reduziert, nicht abschließend geklärt. De Gruijl et al. (2006) und
Förtsch et al. (2000) berichten von der Entwicklung eines Zelltyps, der eher
Merkmale von Makrophagen als von Dendritischen Zellen aufweist, wenn Monozyten
mit IL-10 differenziert wurden. Dieser Effekt war jedoch teilweise reversibel. Welche
molekularen Mechanismen der Reduktion an funktionsfähigen Dendritischen Zellen
zugrunde liegen, ist Inhalt dieser Arbeit. Dabei
Aufzeigen
genereller
Regulationsmechanismen
wurde der Schwerpunkt auf das
und
nicht
auf
funktionelle
Untersuchungen gelegt.
50
5.2 Einfluss von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu
unreifen Dendritischen Zellen
Die Zugabe von IL-10 zum Differenzierungs-Cocktail aus IL-4 und GM-CSF während
der ersten sieben Kulturtage konnte die Ausbildung unreifer Dendritischer Zellen
weitgehend hemmen. Während unreife Dendritische Zellen durch den Verlust von
CD14, der hohen Expression von CD1a und einer moderaten Expression von HLADR charakterisiert sind (Banchereau und Steinmann, 1998; Bell et al., 1999; Hart,
1997), führte die Zugabe von IL-10 zum Differenzierungs-Cocktail zur Ausbildung
einer Zellpopulation mit einem eigenen Phänotyp:
Die Zellen exprimierten weiterhin in einem signifikanten Anteil den Monozytenmarker
CD14 und wiesen eine deutlich reduzierte Expression von CD1a an der
Zelloberfläche auf. Zu diesem Zeitpunkt ergaben sich keine Unterschiede im
Expressionsprofil für HLA-DR. Beide Prozesse, die Hemmung der Herabregulation
von CD14, sowie die Induktion von CD1a setzten bereits nach 48h Inkubationszeit
ein und wurden im weiteren Verlauf noch verstärkt.
CD1a gilt als einer der wenigen spezifischen Marker für Dendritische Zellen. Es wird
durch
GM-CSF
induziert
und
an
der
Zelloberfläche,
sowie
in
den
Recyclingkompartimenten des endosomalen Transportpfades vorgefunden (Cao et
al., 2002; Porcelli et al., 1998). Wie den übrigen Mitgliedern der CD1-Familie wird
CD1a eine Rolle in der Präsentation von hydrophoben Proteinen zugeschrieben.
Diese Präsentation ist unabhängig vom Reifezustand der Dendritischen Zellen und
ruft eine Immunantwort zu einem Zeitpunkt hervor, an dem die Dendritische Zelle
noch nicht bereit ist, Antigene über MHC Klasse-I- oder MHC Klasse-II-Moleküle zu
präsentieren (Cernadas et al. 2010; Gumperz et al. 2001).
In
verschiedenen
Studien
konnte
das
Vorhandensein
von
CD1a-positiven
Dendritischen Zellen im Tumormilieu mit einer besseren Prognose korreliert werden
(Übersichtsarbeit: Coventry et al. 2004). Cernades et al. (2009) konnten zudem einen
direkten Zusammenhang zwischen der Expression von CD1a auf Dendritischen
Zellen und deren Fähigkeit, IL-12 zu produzieren aufzeigen. Die Abwesenheit von
CD1a auf der Zelloberfläche von Dendritischen Zellen ist daher mit einem Verlust
nicht nur ihrer Fähigkeit hydrophobe, sondern auch hydrophile Antigene zu
präsentieren verbunden.
51
Wie in unseren Experimenten, so konnten auch Förtsch et al. (2000) nachweisen,
dass die durch IL-4/GM-CSF induzierte Expression von CD1a durch IL-10 gehemmt
wird. Die resultierende Zellpopulation zeigt somit bereits vor dem Erreichen der
Ausreifung reduzierte Fähigkeiten zur Antigenpräsentation.
Die in unseren Versuchen an Tag 7 der Differenzierung erhaltenen Zellen
exprimierten nur noch in geringem Maße die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR2.
Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Daten von Stumbles et al. (2001)
und Sato et al. (2001) die diese Rezeptoren auf unreifen Dendritischen Zellen
wiederfinden. Auf der anderen Seite zeigten die in unseren Versuchen verwendeten
Zellen noch keine Expression von CCR7. 24h und 48h nach Inkubationsbeginn
konnten wir zeigen, dass die Herabregulation von CCR1 durch IL-4/GM-CSF bereits
zu einem frühen Zeitpunkt beginnt. Somit muss an dem Paradigma, dass es erst bei
der Ausreifung von unreifen zu reifen Dendritischen Zellen zum Wechsel der
Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR2 hin zu CCR7 kommt, gerüttelt werden.
Vielmehr handelt es sich wahrscheinlich um einen fließenden Prozess.
Im Literaturvergleich ist die von uns gewählte Inkubationszeit von sieben Tagen zum
Erhalt von unreifen Dendritischen Zellen eher lang. Motta et al. (2010) und VukPavlovik et al. (2010) konnten auch nach fünf bzw. drei Tagen ähnliche Werte für die
Oberflächenmarker CD1a und HLA-DR zeigen, zu einem vollständigen Verlust von
CD14, wie in unseren Experimenten, kam es jedoch nicht, so dass in diesen
Modellen alle Ergebnisse der folgenden Versuche die Daten einer gemischten
Zellpopulation aufzeigen. Die in unseren Versuchen erhaltene Zellpopulation an Tag
7 ist durch den vollständigen Verlust von CD14 charakterisiert und präsentiert sich
daher als homogene Zellfraktion.
Die gewählte Inkubationszeit kann zumindest zum Teil für die diskrepanten Werte
der Chemokinrezeptoren verantwortlich gemacht werden. Dennoch zeigt die
Hochregulation von CCR7 und HLA-DR in der folgenden Ausreifung mit KLH, TNF-α
und GM-CSF, dass die verwendeten Zellen für Ausreifungsstimuli empfänglich sind.
52
5.3 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen
Die meisten Studien zum Einfluss von IL-10 auf Dendritische Zellen betrachten den
Ausreifungsprozess von unreifen zu reifen Dendritischen Zellen sowie deren T-ZellStimulationsfähigkeit. Es herrscht Einigkeit darüber, dass IL-10 die Produktion von
IL-12p70 durch die Dendritischen Zellen reduziert und die Proliferation von T-Zellen
in der gemischten Lymphozyten-Reaktion eingeschränkt wird. (Knödler et al. 2009;
Muthana et al., 2006).
Als Mechanismus für die reduzierte T-Zell-Stimulationsfähigkeit wird der Mangel an
präsentiertem Antigen sowie zusätzlicher Kostimulation genannt. Dennoch gibt es für
die zugrundeliegenden phäntotypischen Veränderungen der Dendritischen Zellen
uneinheitliche Daten. Für die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, sowie für
CD83 sind hemmende Effekte von IL-10 beschrieben worden. Es gibt jedoch auch
Arbeiten, die diesen Effekt von IL-10 auf ein oder mehrere der kostimulatorischen
Moleküle verneinen. Nur für CD1a gibt es einheitliche Daten hinsichtlich eines
hemmenden IL-10-Effekts (Allavena et al., 1998; Morel et al., 1997; Sato e al., 1999).
Für HLA-DR gehen die Untersuchungen ebenfalls auseinander. Während einige
Autoren einen hemmenden Einfluss von IL-10 auf den prozentualen Anteil der für
HLA-DR-positiven
Zellen
berichten,
zeigen
andere
Autoren
lediglich
eine
Verringerung der mittleren Fluoreszenzintensität und wieder andere Berichte
sprechen von einem fehlenden Unterschied zwischen Zellen, die mit oder ohne IL-10
kultiviert wurden (Buelens et al., 1997; Steinbrink et al., 1997; De Smedt et al., 1997).
Unterschiede in den gewählten Ausreifungsstimulanzien sind die wahrscheinliche
Ursache für diese diskrepanten Ergebnisse. Die unterschiedlichen phänotypischen
Veränderungen zeigen jedoch auch auf, dass die Präsentation von Antigenen für TZellen ein Prozess ist, der viele Mitwirkende benötigt und der sicherlich nicht von
einem einzelnen Molekül abhängt. Die Messung der Oberflächenmarker der
Dendritischen Zellen kann daher immer nur als Hinweis, nicht aber als Beweis für
deren tatsächliche Fähigkeiten verwendet werden.
Monozyten, die unter Standardkulturbedingungen für sieben Tage behandelt wurden,
zeigten unter der Ausreifung mit KLH, TNF-α und GM-CSF in unseren Versuchen
den typischen Phänotyp reifer Dendritischer Zellen mit hohem Expressionsprofil für
HLA-DR, CD1a, CD80 und CD83 sowie fehlender Expression von CD14, CCR1 und
CCR2 mit moderater Expression von CCR7. Wurde nun in diesem Ansatz den Zellen
53
zusätzlich IL-10 verabreicht, zeigten sich eindeutige, aber insgesamt marginale
Unterschiede nur bezüglich der Moleküle CD80 und CD83.
Im Gegensatz hierzu zeigte sich ein ausgeprägter Effekt von IL-10 in der
Zellpopulation, die während der ersten sieben Tage diesem Zytokin ausgesetzt war.
Selbst nach adäquater Stimulation für die Ausreifung, präsentierten sich die Zellen
mit deutlich veränderter Oberflächenexpression im Vergleich zu Kontroll-reifen
Dendritischen Zellen. Neben der reduzierten Expression von CD80 und CD83 wies
diese Zellpopulation ebenfalls erniedrigte Expressionswerte für CD1a und HLA-DR
auf, sowie erhöhte Expressionswerte für CD14, CCR1 und CCR2.
Caux et al. (1994) konnten zeigen, dass Vorläuferzellen aus dem Knochenmark
während eines Zeitraums von zwölf Tagen in ihrer Differenzierung für die Effekte von
IL-10 empfänglich waren. Im Gegensatz dazu ist bei der Gewinnung von
Dendritischen Zellen aus Monozyten der Zeitpunkt der Zugabe von IL-10 zum
Ausreifungs-Cocktail
entscheidend.
Tokayama
et
al.
(2001)
sahen
einen
ausgeprägten Effekt von IL-10 auf die Expression von Chemokinrezeptoren auf
Dendritischen Zellen nur, wenn IL-10 bereits zu Beginn der Differenzierung
zugegeben wurde. Bei Zugabe von IL-10 an Tag 4 der Kultur war kein Effekt zu
verzeichnen.
Steinbrink et al. (1997) konnten zudem zeigen, dass der Einfluss von IL-10 auf ihre
Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren vom Reifungszustand der Dendritischen abhängt.
Mit zunehmender Ausreifung nahm der inhibierende Effekt von IL-10 ab.
Wie bereits bei den Ergebnissen der Oberflächenexpression an Tag 7, so kam auch
bei den Resultaten der Oberflächenmoleküle an Tag 10 die von uns im Vergleich
recht lang gewählte Inkubationszeit zum Tragen. Der fehlende Einfluss von IL-10,
welches lediglich während der Ausreifung mit KLH, GM-CSF und TNF-α zugegeben
wurde, kann daher gut mit dem bereits fortgeschrittenen Reifungsstatus der
Zellpopulation erklärt werden.
Es muss jedoch hervorgehoben werden, dass der Einfluss von IL-10, das während
der ersten sieben Tage der Zellkultur anwesend war, so stark war, dass auch nach
Auswaschen und adäquater Stimulation der Effekt nicht mehr überwunden werden
konnte.
54
In den vergangenen Jahren wurde wiederholt von einer Zellpopulation berichtet, die
als Myeloide Suppressor Zellen (myeloid derived suppressor cells, MDSC) oder
tolerogene Dendritische Zellen bezeichnet wird. Diese Zellen weisen Merkmale
Dendritischer Zellen auf, sind jedoch in ihrer Fähigkeit, Antigene zu präsentieren
eingeschränkt und rufen in den stimulierten T-Zellen eine anerge, antigenspezifische
Reaktion hervor (Torres-Aguilar et al., 2010; Hegde et al., 2009). Durch Tumore und
auch durch Leukämien gebildete Substanzen kommt es vornehmlich zur Entwicklung
dieser
Zellpopulation
aus
Vorläuferzellen
zu
Ungunsten
funktionsfähiger
Dendritischer Zellen. Ihr Phänotyp ähnelt dem der in unseren Versuchen durch die
Zugabe von IL-10 erhaltenen Zellfraktion mit einer hohen Expression von CD14,
geringer
oder
fehlender
Antigenpräsentationsfähigkeit
Expression
durch
von
erniedrigtes
CD1a
HLA-DR,
und
CD80
erniedrigter
und
CD83
(Ghirighelli et al., 2005; Shkloskaya und Fazekas de St. Groth, 2007).
Weiterführende Versuche sind notwendig, um die Funktionalität der in unseren
Experimenten gewonnenen Zellfraktion näher zu beleuchten.
Zusammengefasst geben die Ergebnisse der Oberflächenexpression einen klaren
Hinweis darauf, dass die Zugabe von IL-10 zu IL-4/GM-CSF nicht zu einem
generellen Stopp der Ausreifung führt, sondern vielmehr eine spezifische
Zellpopulation hervorbringt, die eigene Merkmale aufweist.
5.4 Genexpression
5.4.1 Übersicht
Die
Ergebnisse
der
Oberflächenexpression
weisen
auf
einen
frühen
und
nachhaltigen Effekt von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu unreifen
Dendritischen Zellen hin. Daher wurde zur Untersuchung der Genexpressionsprofile
der Zeitpunkt von 48h nach Zellisolierung gewählt.
Interessanterweise zeigten die Zellen, die während dieses Zeitraums lediglich in
Medium kultiviert wurden, insgesamt die höchsten Expressionsprofile. Vor allem
proinflammatorische Proteine wiesen dabei hohe Expressionswerte auf. Durch
Entzug adäquater Wachstumsfaktoren ist eine vermehrte Apoptose und damit
verbunden eine unspezifische Aktivierung der Zellen nicht auszuschließen. Ein
Hinweis darauf zeigte sich in einer wiederholt erniedrigten Zellausbeute in dieser
Population (Daten nicht gezeigt). Die Wahl unstimulierter Zellen vor Beginn der
55
Kultivierung wäre jedoch nicht unbedingt vorzuziehen gewesen, da viele Berichte
ebenfalls von einer unspezifischen Aktivierung durch den Prozess der Isolierung
durch CD14-Microbeads berichten (Elkord et al., 2005; Oren et al., 2005). Ein
Isolierungsprozess mit Hilfe von Zelladhärenz dagegen erbringt eine deutlich
unreinere Zellpopulation (Nimura et al., 2006 und eigene Vorversuche).
Für insgesamt elf der untersuchten Gene konnte eine gleichsinnige Regulierung
unter Berücksichtigung der drei Kulturbedingungen und der drei Probanden
beobachtet werden. Nur sechs der elf Gene wiesen hierbei auf einen hemmenden
Effekt von IL-10 hin.
Exemplarisch sollen im Folgenden die Expression von CCR1 und CCR2, IL1ß und
IL-1R1 sowie S100A8 und S100A9 betrachtet werden.
5.4.2 Regulation von CCR1 und CCR2 durch IL-10
Die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR2 empfangen durch die Botenstoffe MIP1-α
(macrophage-inflammatory protein 1 alpha) und MCP-1 Signale vom Ort der
Entzündung oder aus dem Tumormilieu, wohin die unreifen Dendritischen Zellen
bzw. ihre Vorläufer ihre Reise aufnehmen (Kaufmann et al., 2001; Sato et al., 2001;
Sozzani et al., 1998). Zu den phänotypischen Veränderungen im Rahmen der
Ausreifung von unreifen zu reifen Dendritischen Zellen gehört die Reduktion der
Expression von CCR1 und CCR2 sowie die zunehmende Expression von CCR7 an
der Zelloberfläche. Geleitet durch die Liganden für CCR7 MIP-3ß bzw. CCL21
gelangt die reife, mit Antigen beladene Dendritische Zelle zu den sekundären
lymphatischen Organen, wo das Antigen in den T-Zell-reichen Regionen der
Lymphknoten oder der Milz präsentiert wird (Foti et al., 1999).
Bereits die Ergebnisse der Oberflächenexpression zeigten, dass die Zugabe von IL10 zum Differenzierung- und Ausreifungs-Cocktail zu einer fortbestehenden
Expression dieser beiden Rezeptoren führt.
Wie in unseren Versuchen beschrieben, konnten auch D’Amico et al. (2000) einen
hemmenden Effekt von IL-10 auf den „chemokinreceptor switch“ nachweisen. In
Kombination mit einem proinflammatorischen Signal gelang ihnen der Nachweis,
dass es sich bei den so stimulierten Rezeptoren CCR1 und CCR2 um „decoy“
Rezeptoren handelt, das heißt, um Rezeptoren, die kein Signal nach intrazellulär
56
weiterleiten, sondern die Botenstoffe lediglich aus dem Extrazellulärraum abfangen
und damit verhindern, dass weitere unreife Dendritische Zellen an den Ort der
Entzündung/zum Tumormilieu gelangen.
Parallel zu diesen Veränderungen an der Zelloberfläche zeigten unsere cDNA-Arrays
einen hemmenden Effekt von IL-10 auf die durch IL-4/GM-CSF eingeleitete
Herabregulation von CCR2. Dabei schien IL-10 nicht nur die Wirkung von IL-4/GMCSF aufzuheben, sondern eine eigene induzierende Wirkung hervorzurufen.
Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einem Mausmodell von Sun et al. (2010),
die zeigten, dass die durch IL-10 getriggerte Lungenfibrose von der Anwesenheit von
CCR2/MCP-1 abhängig ist. Roca et al. (2007) zeigten zudem auf, dass die
hemmenden Einflüsse von Dexamethason auf die IL-12-Produktion Dendritischer
Zellen durch MCP-1 und seinen Rezeptor CCR2 übermittelt werden. Hierbei wurde
jedoch die direkte Wirkung von IL-10 im System nicht untersucht, erscheint jedoch
wahrscheinlich.
Eine gleichsinnige Regulation für CCR1, entsprechend den Ergebnissen der
Oberflächenexpression, konnte für die cDNA nur bei zwei von drei Probanden
nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
berichten, dass IL-10 ebenfalls die
Während Williams et al. (2004)
Produktion der mRNA von CCR1 induzieren
kann, ergaben die Untersuchungen von Li et al. (2003), dass es durch IL-10 zu einer
Verlängerung der Halbwertszeit und nicht der Produktion der CCR1 mRNA kommt.
Diese Ergebnisse können erklären, warum es in unseren Versuchen zu einer
Diskrepanz der Ergebnisse für die Oberflächenexpression und cDNA für CCR1
kommt.
Über die Expression der cDNA für CCR7 kann keine Aussage gemacht werden, da
CCR7 nicht Teil der Hybridisierungsmembran war.
Die Ergebnisse für CCR1 und CCR2 weisen auf einen eigenen durch IL-10
induzierten Differenzierungsweg der Monozyten hin, der nicht einer globalen
Hemmung von IL-4/GM-CSF entspricht.
5.4.3 Regulation von IL-1ß und IL-1R1 durch IL-10
Ende der 90er Jahre wurden verschiedene Zytokin-Cocktails entwickelt, um eine
adäquate Ausreifung der Dendritischen Zellen in-vitro ohne Antigenstimulus zu
57
gewährleisten. Jonuleit et al. (1997) zeigten damals auf, dass die Kombination von
TNF-α, IL-1ß und IL-6 eine Ausreifung induzieren kann, die dem Einfluss von
Monozyten-konditioniertem-Medium gleich kam. Die Zugabe von Prostaglandin-E2
(PGE2) verstärkte den Effekt und erhöhte zudem die Zellausbeute. Seit diesem
Zeitpunkt gilt die Kombination der genannten Zytokine als Standard für eine
adäquate Ausreifung der Dendritischen Zellen in Abwesenheit eines Antigens
(Hildenbrand et al., 2008).
Der Effekt von IL-1ß ist dabei in einer Zunahme der Produktion von IL-12, sowie in
einer erhöhten Expression der kostimulatorischen Moleküle CD54 und CD86, sowie
HLA-DR zu sehen. Es ist jedoch zu beachten, dass IL-1ß alleine nur einen geringen
Einfluss ausübt. Ein weiterer Stimulus, wie CD40L, IFN-γ oder TNF-α ist notwendig
um eine synergistische Reaktion hervorzurufen (Wesa et al., 2001; Nakahara et al.,
2004). Neben diesen in-vitro-Versuchen konnten Lee et al. (2009) im Rahmen einer
Vakzinierungsstudie nachweisen dass Dendritische Zellen die mit Melanomzellen,
CD40L, TNF-α und IL-1ß ausgereift wurden, zu einer Reduktion der Tumormasse
führen und dass dieser Effekt abhängig von der Produktion von IL-12 ist.
Der hemmende Effekt von IL-4 und IL-10 auf die Expression von IL-1ß ist
hinreichend bekannt (Vannier et. al., 1996; Fuchs et al., 1996; Chang et al., 1995).
Zudem
induziert
IL-10
IL-1Rezeptor-Antagonist
(IL1RA),
einen
endogenen
Antagonisten der IL-1ß-Wirkung am IL1R1. Nach Bindung kommt es zu keiner
intrazellulären Signaltransduktion, so dass IL-1RA die Umwandlung des IL-1R1 in
einen „Decoy-Rezeptor“ bewirkt (Carl et al., 2004; Jenkins et al., 1994). Das
Verhältnis von IL-1ß und IL-1RA ist für das Resultat der Immunantwort verantwortlich
(Arend et al., 1991). Durch die gleichzeitige Hemmung der IL-1ß-Produktion sowie
der Induktion von IL-1RA setzt IL-10 an zwei Punkten an um die IL-1ß-Wirkung zu
reduzieren.
Die in unseren Versuchen durch IL-4/GM-CSF eingeleitete Herabregulation von IL1ß wurde 48h nach Beginn der Differenzierung durch die Zugabe von IL-10 verstärkt.
Gleichzeitig zählt der IL-1R1 zu einem der Gene, welches vornehmlich in den
Zellpopulationen exprimiert wurde, die IL-10 ausgesetzt waren. Die Expression von
IL-1RA war in allen drei Zellpopulationen gering und folgte keinem einheitlichen
Regulationsmechanismus (Daten nicht gezeigt). Dies kann zum einen darin
begründet liegen, dass ein zusätzliches inflammatorisches Signal zur Induktion von
58
IL-1RA im Differnezierungs-Cocktail fehlte. So zeigten Carl et al. (2004), dass IL-10
alleine nicht in der Lage war, eine Änderung der Promotoraktivität oder der mRNA
Expression von IL-1RA in Makrophagen oder RAW 264.7-Zellen hervorzurufen. Im
Gegensatz dazu kam es zu einem signifikanten Anstieg der Promotoraktivität, der
mRNA Expression, sowie der mRNA Halbwertszeit durch die Stimulation von IL-10 in
Kombination mit LPS in diesen Zellen.
Der wahrscheinlichere Mechanismus des fehlenden Anstiegs der IL-1RA-cDNA in
unseren Experimenten liegt jedoch im gewählten Zeitpunkt der Durchführung der
Versuche. So konnten Tilg et al. (1994) und Jenkins et al. (1994) zeigen, dass es
bereits 2-4h nach Stimulation mit IL-10 zur Induktion von IL-1RA kommt und dass
dieser Effekt kaum mehr als 24h anhält.
Zusammengefasst lässt sich festhalten, dass der Effekt von IL-10 auf das System
IL1-ß/IL-1R1/IL-1RA ein hemmender ist. Trotz erhöhter Werte für IL-1R1 führt die
weitere Reduktion von IL-1ß durch IL-10-Zugabe zu einem fehlenden IL-1ß-Effekt.
IL-10 führt dabei jedoch nicht zu einer Umkehr der durch IL-4/GM-CSF eingeleiteten
Differenzierung, sondern verstärkt zum einen den Effekt (IL-1ß) oder ruft
eigenständige Effekte hervor (IL-1R1).
Daher werden bereits zu diesem frühen Zeitpunkt Weichen für die spätere
Ausreifung gestellt. Und es zeigt sich nach 48h ein Hinweis auf die fehlende
Reversibilität des IL-10-Effekts auf die Dendritischen Zellen, die trotz adäquater
Stimulation keine Ausreifung erfahren.
5.4.4 Regulation von S100A8 und S100A9 durch IL-10
S100A8 und S100A9 sind Mitglieder der Familie der S100 calciumbindenden
Proteine. Mittlerweile sind mehr als 25 Mitglieder bekannt, deren unterschiedliche
Funktionen noch nicht abschließend geklärt sind (Nacken et al., 2003; Odink et al.,
1987). S100A8 und S100A9 werden im Zytoplasma von Neutrophilen Granulozyten
und Monozyten vorgefunden. Ihr Wirkspektrum ist dabei recht vielfältig. Im Inneren
der Zelle tragen sie zur Organisation des Zytoskeletts bei. Nach Ausschleusen der
Proteine in den Extrazellulärraum sind S100A8 und S100A9 chemotaktische,
antimikrobielle, Apoptose-induzierende und wachstumshemmende Eigenschaften
zugesprochen worden (Rammes et al., 1997). Eine erhöhte Expression von S100A8
und S100A9 konnte in chronisch entzündlichen Prozessen wie arteriosklerotischen
59
Plaques oder arthritischen Gelenken, aber auch im engen Kontext mit etablierten
Tumoren gezeigt werden (Gebhardt et al., 2006; Ehrchen et al., 2009). Es wurde
zudem berichtet, dass S100A8 und S100A9 durch Zellen, die sehr früh den Ort der
Entzündung erreichen, gebildet werden, und als chemotaktischer Reiz für ein großes
Spektrum an weiteren Leukozyten dienen (Pouilot et al., 2008). Im KnockoutMausmodell für S100A9 zeigten die Tiere sich gegenüber einem septischen Schock
weniger anfällig. S100A8 scheint für die frühe embryonale Entwicklung von
Bedeutung, weswegen ein Knockout-Mausmodell nicht existiert (Gebhart et al.,
2006). Mittlerweile ist Toll like receptor 4 (TLR4) als der Rezeptor für S100A8, nicht
aber S100A9 identifiziert. Als „Pattern recognition Receptor“ unterstützt er die
Aussage, dass S100A8 als Teil des unspezifischen Immunsystems zu einem frühen
Zeitpunkt während der Immunantwort eine Rolle spielt (Sinha et al., 2008).
Während
S100A8
und
S100A9
zunächst
vor
allem
proinflammatorische
Eigenschaften zugesprochen wurden, zeigt sich nun immer wieder ein Hinweis
darauf, dass die Moleküle auch antiinflammatorische Effekte ausüben. So konnten
Endoh et al. (2009) zeigen, dass S100A8 freie Radiale abfängt und somit eher zur
Beendigung einer Immunantwort führt als diese weiter zu unterstützen. Cheng et al.
(2008) stellten zudem fest, dass die Expression von S100A8 und S100A9 parallel mit
der Anhäufung von Myeloiden Suppressor-Zellen im Tumomilieu einherging und
dass S100A9 eine hemmende Wirkung auf die Differenzierung von Dendritischen
Zellen ausübt.
Immer mehr Veröffentlichungen zeigen zudem auf, dass die beiden Moleküle nicht
nur gemeinsame, sondern auch sehr unterschiedliche Funktionen wahrnehmen
(Donato et al., 2003; Passey et al., 1999).
Durch Zugabe von IL-10 zu Standardkulturbedingungen zeigte sich in unseren
Versuchen eine Hemmung der durch IL-4 und GM-CSF ausgelösten Herabregulation
von S100A8. Die gemessenen Werte überstiegen jedoch nicht diejenigen der
unstimulierten Zellen, so dass ein direkt induzierender Effekt durch IL-10
auszuschließen ist. Im Gegensatz dazu wies die durch IL-10 stimulierte
Zellpopulation ein noch weiterhin reduziertes Expressionsprofil für S100A9 auf.
Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Arbeiten von Xu et al (2001) und
Endoh et al. (2009), die zeigen, dass IL-10 alleine keinen induzierenden Effekt auf
die Expression von S100A8 ausübt. In Kombination mit LPS, TNF-α oder
60
Doppelstrang RNA (dsRNA) wirkt IL-10 jedoch synergistisch auf die S100A8Expression.
Kumar et al. (2003) zeigten diesen synergistischen IL-10 Effekt auf S100A8 in
Dendritischen Zellen, die sich in Ausreifung mit TNF-α, IL-1ß und PGE2 befanden. In
diesen Versuchen konnten sie auch einen Anstieg der S100A9-Expression um den
Faktor 1,7 nachweisen. In unseren Experimenten wird die durch IL-4/GM-CSF
induzierte Herabregulation von S100A9 durch IL-10-Zugabe noch verstärkt. Diese
unterschiedlichen Ergebnisse können zum einen durch den unterschiedlichen
Zeitpunkt der Untersuchungen 2 versus 6 Tage, zum anderen, aber auch durch das
fehlende inflammatorische Signal erklärt werden.
Ein weiteres Mal zeigen unsere Ergebnisse auf, dass IL-10 im System der
Differenzierung Dendritischer Zellen sehr spezifische Effekte ausübt und nicht nur
hemmend eingreift.
Durch die fortbestehende Expression von S100A8 kann dieses seine Rolle als
Antioxidans wahrnehmen und eine Immunantwort eindämmen.
Sicherlich sind die Effekte und Regulationsmechanismen von S100A8 und S100A9
jedoch noch nicht ausreichend aufgeklärt um eine eindeutige Zuordnung unserer
cDNA-Ergebnisse zu ermöglichen.
5.5 Biologische Bedeutung
Die
vorliegenden
Ergebnisse
präsentieren
durch
Messung
der
Oberflächenexpression sowie der cDNA-Profile den Einfluss von IL-10 während der
Ausreifung von Monozyten zu reifen bzw. unreifen Dendritischen Zellen.
Hierbei zeigt sich IL-10 nicht als global hemmender Faktor, der die Zellen in ihrem
Ausgangsstadium verharren lässt, sondern vielmehr, dass die Zugabe von IL-10 zu
IL-4/GM-CSF eine eigenständige Zellpopulation hervorbringt. Die Zugabe von IL-10
zu Beginn der Differenzierung führt zu einem nachhaltigen Effekt, der auch durch
adäquate Stimulation nicht mehr aufgehoben werden kann.
Bei den Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR2 sowie im System IL-1ß/IL-1R1/IL-1
Rezeptor Antagonist übt IL-10 seine Effekte aus, indem es zur Ausbildung von
„decoy“ Rezeptoren führt. Damit wird die Immunantwort eingedämmt und die
Zuhilfenahme anderer Mitglieder des Immunsystems reduziert.
Die entstandenen Veränderungen bei CD1a und S100A8 belegen, dass IL-10 früh in
das Immungeschehen eingreift. Seine Effekte sind nicht nur hemmend auf die
61
spezifische Immunantwort im Rahmen der Antigenpräsentation durch MHC-Moleküle
der Dendritischen Zellen, sondern hemmen bereits die unspezifische Immunreaktion
nach kurzer Zeit.
Die gewonnen Einblicke in die Effekte von IL-10 auf die Ausreifung von Monozyten
zu Dendritischen Zellen zeigen in einem einfachen System, wie es zur Depletion der
Vorläuferzellen kommt und es im Endergebnis zu einer reduzierten Zahl
funktionsfähiger Dendritischer Zellen zu Gunsten einer neuen Zellpopulation kommt.
62
6. Zusammenfassung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.
Einfluss von Interleukin-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu
Dendritischen Zellen
eingereicht von:
Annika Schwarz, geb. Hanke,
angefertigt an der:
Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Kinder- und
Jugendmedizin, Abteilung für Pädiatrische Hämatologie
und Onkologie
betreut von:
Prof. Dr. med. Dieter Körholz
Juli 14
Wegen ihrer hervorragenden Rolle als Antigenpräsentierende Zellen haben
Dendritische Zellen Einzug in Therapieprotokolle zur Tumorvakzinierung gefunden.
Dabei werden die Dendritischen Zellen in-vitro aus Monozyten oder CD34-positiven
Stammzellen generiert und auf verschiedenste Weise mit Tumorzelllysat oder
spezifischen Tumorantigenen beladen. Durchschlagende Erfolge konnten jedoch nur
dann erzielt werden, wenn es sich um eine prophylaktische Impfung oder um eine
zusätzliche Maßnahme nach vorheriger Reduktion der Tumormasse handelte. Diese
Daten zeigen den fehlenden Einfluss von Dendritischen Zellen im Organismus mit
einem etablierten Tumor auf und weisen zudem auf einen Defekt der Dendritischen
Zellfunktion während der Etablierung des Tumors hin. Tatsächlich konnte eine
Korrelation zwischen der Anzahl an funktionsfähigen Dendritischen Zellen im
63
Tumormilieu und dem Überleben bei Patienten mit Brustkrebs nachgewiesen
werden. Zusätzlich zu dem durch Tumoren hervorgerufenen hemmenden Effekt auf
die Funktion der Dendritischen Zellen ist im tumortragenden Organismus die
Gesamtzahl an Dendritischen Zellen reduziert. Die Fähigkeit von Tumoren, einer
adäquaten Immunantwort zu entgegen, konnte mit einer Reihe durch Tumoren
gebildeter Botenstoffe in Verbindung gebracht werden. Dabei stellt Interleukin-10
einen prominenten Kandidaten dar, der durch eine große Anzahl von Tumorzellen
produziert wird. Das Vorhandensein von Interleukin-10 im Tumormilieu konnte mit
dem Überleben bei einigen Tumorarten negativ korreliert werden. Die hemmende
Wirkung von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierende Funktion Dendritischer
Zellen
wurde
ausführlich
untersucht.
Neben
der
verminderten
Expression
kostimulatorischer Moleküle verhindert Interleukin-10 auch direkt den Transport der
mit Antigen beladenen MHC-Moleküle an die Zelloberfläche. Zudem führt das
Vorhandensein
von
Interleukin-10
während
der
T-Zellstimulation
zu
einer
erniedrigten Produktion von Interleukin-12 durch die Dendritischen Zellen und
konsekutiv zu einer verminderten Produktion von IFN-γ durch die stimulierten TZellen.
Daten, die den frühen
Einfluss von Interleukin-10 auf die Rekrutierung von
Vorläuferzellen für Dendritische Zellen betreffen sind jedoch nur unzureichend
vorhanden. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den frühen Einfluss von Interleukin-10 auf
die Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen sowie deren
konsekutive Ausreifung zu untersuchen.
Die Zugabe von Interleukin-10 direkt zu Beginn der Zellkultur zu den üblichen
Differenzierungs-Zytokinen Interleukin-4 und GM-CSF führte zu einer deutlichen
Hemmung der Entstehung unreifer Dendritischer Zellen. Neben erniedrigten Werten
für die Oberflächenexpression von CD1a wiesen die durch Interleukin-10-Zugabe
erhaltenen Zellen ein Verharren der Oberflächenmarker CD14, CCR1 und CCR2 auf.
Durch die Stimulation der unreifen Dendritischen Zellen mit einem Antigen sowie
einem Set an definierten Ausreifungs-Stimulantien verändert die Dendritische Zelle
ihren Phänotyp hin zur klassischen Antigenpräsentierenden Zelle. Zellen, die
während der ersten sieben Tage der Kultur Interleukin-10 ausgesetzt waren, zeigten
trotz adäquater Stimulation nur eine unzureichende Differenzierung zu reifen
64
Dendritischen Zellen. Dies deutet darauf hin, dass die Effekte von Interleukin-10
nachhaltig sind und nicht überwunden werden können.
Die alleinige Zugabe von Interleukin-10 nach Abschluss der frühen Phase der
Differenzierung hatte nur noch marginale Effekte auf die Ausreifung der unter IL4/GM-CSF entstandenen unreifen Dendritischen Zellen.
Um diesen ausgeprägten Effekt von Interleukin-10 während der frühen MonozytenDifferenzierung näher zu beleuchten, wurden Versuche zur Expressionsmessung
von 347 Genen, die im weitesten Sinne zum Pool an Chemokinen, Zytokinen und
deren Rezeptoren gehören, unternommen. Dabei zeigte sich, dass im Gegensatz zu
den Daten der Oberflächenexpression der Einfluss von Interleukin-10 nicht
ausschließlich in einer Hemmung der IL-4/GM-CSF induzierten Differenzierung führt.
Nur für etwa die Hälfte der gleichsinnig regulierten Gene führte die Zugabe von
Interleukin-10 zu einer Hemmung der durch Interleukin-4 und GM-CSF ausgelösten
Kaskade an Genexpressionsprofilen. Eines dieser genannten Gene ist, analog zu
Oberflächenexpression, der Chemokinrezeptor CCR2. Die Zugabe von Interleukin-10
hemmte die durch Interleukin-4 und GM-CSF induzierte Herabregulation auf cDNA –
Ebene. Zudem ergaben sich Hinweise auf eine durch Interleukin-10 induzierende
Wirkung auf die CCR2 cDNA.
Als Beispiel für ein Gen, auf das Interleukin-10 eine Wirkung ausübt, die den
eingeschlagenen Weg durch Interleukin-4 und GM-CSF noch verstärkt, ist IL-1ß zu
nennen. IL-1ß ist ein bekannter, wichtiger Faktor für die Ausreifung Dendritischer
Zellen. Die Ergebnisse auf cDNA-Ebene zeigen bereits nach 48h, wie Interleukin-10
seine hemmende Wirkung auf die zukünftige Ausreifung der Dendritischen Zelle
vorbereitet.
Die S100-Moleküle A8 und A9 gehören der Familie der calciumbindenden Proteine
an. Sie sind im Zusammenhang mit der Entstehung von Myeloiden SuppressorZellen genannt worden. Die Zugabe von Interleukin-10 zum Differenzierungscocktail
bewirkte eine Hemmung der herabregulierenden Wirkung von S100A8 durch
Interleukin-4 und GM-CSF. Im Gegensatz dazu wurde der Effekt von Interleukin-4
und GM-CSF auf S100A9 durch Interleukin-10 verstärkt.
Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass Interleukin-10 bereits in der frühen
Phase der Differenzierung von Monozyten zu Dendritischen Zellen einen weitgehend
65
irreversiblen, hemmenden Effekt auf die Entstehung von funktionstüchtigen reifen
Dendritischen Zellen ausübt. Es handelt sich jedoch nicht ausschließlich um einen
hemmenden Effekt, vielmehr führt die Zugabe von Interleukin-10 zur Entstehung
einer Zellpopulation die trotz adäquater Stimulation nicht mehr zu reifen
Dendritischen Zellen ausreifen kann.
66
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Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland
noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde
zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt
wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene
Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen
wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
14. Juli 2014
……………………………….
83
Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen und Vorträge
Vortrag:
Einfluss von IL-10 auf die Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen
13.06.2002, XV. Jahrestagung der Kind-Philipp-Stiftung für Leukämieforschung in
Willsede, Klin Padiatr 214:255-277
Veröffentlichungen:
Substitution of cyclophosphamide and busulfan by fludarabine, treosulfan and
melphalan in a preparative regimen for children and adolescents with ShwachmanDiamond syndrome;
Sauer M, Zeidler C, Meissner B, Rehe K, Hanke A, Welte K, Lohse P, Sykora KW.
Bone Marrow Transplant 2007;39:143-7.
Perinatal hemorrhagig schock after fetal scalp blood sampling
Sabir H, Srannigel H, Schwarz A, Fleisch M, Mayatepek E, Hoehn T.
Obstet Gynecol. 2010;115:419-20.
Impact of interleukin-10 on phenotype and gene expression during early monocyte
differentiation into dendritic cells
Schwarz A, Banning-Eichenseer U, Seidel K, Mauz-Körholz C, Staege MS, Körholz
D.
Im Druck
84
ANNIKA SCHWARZ
Goethestrasse 41 • 80336 München • Tel: (0177) 4224200
Email: [email protected]
AKADEMISCHE LAUFBAHN
2000-2005 UNIVERSITÄT LEIPZIG
Klinischer Studienabschnitt
• Erstes bis drittes Staatsexamen; Gesamtnote: gut (2,49)
• 04/2005: Approbation als Ärztin
1998-2000 ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITÄT FREIBURG
Vorklinischer Studienabschnitt
• Physikum
• Stipendiatin der Studienstiftung des deutschen Volkes
1996-1998 SCHULE SCHLOSS SALEM
Abitur
•
•
Abiturnote: 1,2
Heinrich-Blendinger Stipendium für soziales Engagement
KLINISCHE ERFAHRUNG
11/201105/2013
DR. VON HAUNERSCHES KINDERSPITAL MÜNCHEN
01/200811/2011
UNIVERSITÄTSKINDERKLINIK DÜSSELDORF
Koordinierende Ärztin der Geschäftsstelle der BMBF-geförderten Forschungsverbünde für seltene
Erkrankungen (Prof. Dr. C. Klein)
Assistenzärztin der Abteilung für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie (Prof. Dr. A. Borkhardt)
•
•
•
•
•
07/200512/2007
KINDERKLINIK DER MEDIZINISCHEN HOCHSCHULE HANNOVER
Assistenzärztin der Abteilung für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie (Prof. Dr. Karl Welte)
•
•
•
•
2004
8 Monate pädiatrisch hämatologische Ambulanz und Tagesklinik
6 Monate pädiatrische Kardiologie und Pulmologie
8 Monate Allgemeinpädiatrie mit Infektiologie, Stoffwechselabteilung und päd. Neurologie
13 Monate pädiatrische und neonatologische Intensivstation
2 Monate Sonographie
12 Monate Station für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie
11 Monate Station für Knochenmarktransplantation
1 Monat Rehabilitationsklinik für Familien mit einem krebskranken Kind auf Sylt
Regelmäßige Notaufnahmedienste
CHILDREN’S HOSPITAL, UNIVERSITY OF CHICAGO
Praktisches Jahr, Tertial Pädiatrie
•
•
2004
1 Monat Station für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie
1 Monat Neonatologische Intensivstation
HÔPITAL ARNAUD DE VILLENEUVE, UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER
Praktisches Jahr, Tertial Chirurgie
2001-2003 UNIVERSITÄTSKINDERKLINIK LEIPZIG
Praktisches Jahr, Tertial Pädiatrie, Famulatur
Wissenschaftliche Hilfskraft der Abteilung für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie
85
86