Versuch der Differenzierung von Peritonitis und - biomed

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wissenschaf t & praxis
Versuch der Differenzierung von
Peritonitis und Peritonealkarzinose
mittels immunhistologischer Methode
zeptors in situ und die Evaluierung der Expression dieser
Proteine in Fällen von Peritonitis und Peritonealkarzinosen
durch Ovarialkarzinome.
Material
Paraffinblöcke von 56 Patientinnen mit Fällen von Peritonitis und Peritonealkarzinose durch Ovarialkarzinom
wurden aus dem Archiv ausgehoben. Es handelte sich bei
den Ovarialkarzinomen um
serös-papilläre, muzinöse, tubulo-papilläre, mäßig bzw.
schlecht differenzierte bis undifferenzierte und endometroide
Karzinome. Die Peritonitisfälle deckten das gesamte Spektrum von akuter, eitriger bis chronischer Peritonitis mit Entwicklung von Adhäsionen ab. Die Paraffinschnitte wurden mit
Antikörpern gegen Zytokeratin, Ki-67, VEGF-A, VEGF-C
und VEGFR2 gefärbt, wobei Zytokeratin zur Identifikation
der Mesothelzellen benötigt wurde. Ki-67 wurde als Proliferationsmarker eingesetzt. Zur Detektion wurde der ChemMate Detection Kit der Firma DakoCyomation verwendet.
Geräte: das Schlittenmikrotom, wo zwei µm dicke bzw.
dünne Schnitte der Paraffinblöcke angefertigt wurden, der
Tissue-Tek automatic multiple slide stainer (Sakura) für die
HE-Färbung, der Eindeckautomat, und das Lichtmikroskop
für die Beurteilung der gefärbten Schnitte.
Kurzfassung der Diplomarbeit „Expression von VEGF und
VEGF-Rezeptoren bei Peritonitis und Peritonealkarzinose durch
Ovarialkarzinome“
Einleitung
VEGF ist die Abkürzung für vascular endothelial growth factor. Dieser Wachstumsfaktor
spielt in der Angiogenese (Auswachsen von Gefäßsproßen aus bestehenden Gefäßen) und Vaskulogenese
(Neubildung von Blutgefäßen aus Inseln von Vorläuferzellen)
eine wesentliche Rolle. Die Expression dieses Zytokins konnte in vielen physiologischen Zelltypen und Geweben nachgewiesen werden, wie zum Beispiel in Makrophagen, glatten
Muskelzellen und Osteoblasten. Einer der stärksten Regulatoren von VEGF ist die Hypoxie in einem Gewebe. Bei Tumoren zum Beispiel kommt es aufgrund des schnellen Zellwachstums bald zu einer Sauerstoffunterversorgung. Die VEGF-Familie besteht aus strukturell verwandten Glykoproteindimeren
und gehört zu der Superfamilie von PDGF (platelet-derived
growth factor) Wachstumsfaktoren. In dieser Diplomarbeit
wurden die Expression von VEGF-A und auf VEGF-C, das
für die Lymphangiogenese von Bedeutung ist, untersucht
Es gibt drei Rezeptoren in der VEGF Rezeptorfamilie. Sie
zählen zu den Tyrosin-Kinase-Rezeptoren. In dieser Arbeit war
der Rezeptor 2 von Bedeutung, auch bekannt als KDR (kinase insert domain containing receptor). Eine andere Bezeichnung ist flk-1(fetal liver kinase). An diesen Rezeptor kann
sowohl VEGF-A als auch VEGF-C binden.
Peritonitis: kann auf belebte (Bakterien, Viren, Pilze) oder
unbelebte (mechanische, aktinische, chemische) Ursachen
zurückgeführt werden. Sie kann akut, chronisch oder tuberkulös verlaufen.
Die Karzinose ist durch einen Einbruch eines Tumors in einen Hohlraum und das An- und Weiterwachsen an einer anderen Stelle definiert, in diesem Fall bedeutet es den Einbruch
eines Ovarialkarzinoms in die Bauchhöhle, was eine Peritonealkarzinose hervorruft.
Das Peritoneum ist ausgekleidet von einer zellulären Membran aus peritonealen Mesothelzellen HPMC (human peritoneal mesothelial cells). Sie können durch die Freisetzung verschiedener Zytokine aktiv in die Regulation der Entzündung
und der Freisetzung von Tumoren in der Bauchhöhle eingreifen.
Die Expression von VEGF in humanen peritonealen Mesothelzellen konnte in vitro gezeigt werden, nicht aber die
Produktion und Sezernierung von VEGF in situ für verschiedene Stadien der Peritonitis und Peritonealkarzinose durch
Ovarialkarzinome.
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Methode
1. Für ein Übersichtsbild wurde von jedem Block von einem
Paraffinschnitt eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung angefertigt.
2. Von allen Karzinomfällen wurde ein Schnitt mit der PASMethode gefärbt, um festzustellen, ob es sich um ein muzinöses Karzinom handelt.
3. Immunhistochemische Färbung: Vor jeder immunhistochemischen Färbung erfolgte die Antigendemaskierung,
wir verwendeten die hitzeinduzierte Demaskierung, die
Zielsetzung
Ziel war die Etablierung des immunologischen Nachweisverfahrens für VEGF-A, VEGF-C sowie des VEGF-Re-
VEGF-A-x400
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Schnitte wurden mit Citrat-Puffer (ChemMateT Target
Retrieval Buffer) im Wasserbad (95°C) erhitzt oder bei
120°C autoklaviert.
Durch diese Art von Antigendemaskierung können Antikörper auch solche Epitope erkennen, die zuvor zum Beispiel durch Aldehydvernetzungen maskiert waren. Zur
Darstellung der immunhistochemischen Färbung wurde
die LSAB-Methode, labelled streptavidin biotin Methode
angewendet. Die drei wesentlichen Schritte dieser Reaktion sind: Binden des Primärantikörpers an das Antigen,
Andocken des biotinylierten Brückenantikörpers an den
Primärantikörper und in Schritt drei das Binden des enzymmarkierten Strepavidins, dafür wurde der Detection
Kit verwendet. Die Visualisierung der Reaktion erfolgte
mit Hilfe von chromogenem Substrat.
4. Austesten der Antikörper und Etablierung der Färbungen: Dazu wurde Kontrollgewebe mit gesicherter Expression des jeweiligen Antigens, wo der entsprechende
Antikörper binden kann, verwendet. Die Testetablierung
diente dazu, ein geeignetes Färbeprotokoll für die verschiedenen Antikörper zu erstellen, nach dem im späteren
Verlauf gearbeitet werden konnte.
Ergebnisse
Die Testetablierung (nur exemplarisch erwähnt) ergab
bei VEGF-A eine Antigendemaskierung im Wasserbad von
fünf Minuten, eine Verdünnung des Antikörpers von 1:400
und eine Inkubationszeit im Kühlschrank bei 4°C für viereinhalb Stunden. Diese Protokolle wurden in der gesamten Arbeit manuell durchgeführt.
Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei Peritonitis
VEGF-A wurde im normalen Mesothel, das als Kontrolle
mitgeführt wurde, relativ schwach exprimiert. Im Gegensatz
dazu zeigten die Mesothelzellen bei Peritonitis eine wesentlich
stärkere Expression von VEGF-A (Abb.1). Insbesondere Mesothelzellen, die an der Basalmembran haften und reaktive
Zellveränderungen aufweisen, das heißt eine Abkugelung und
Schwellung des Zytoplasmas erkennen lassen, zeigten eine
starke Expression von VEGF-A (Abb.2). Auffallend war, dass
bei Peritonitis die Mesothelzellen eine spindelförmige Trans-
formation durchmachen. Es konnten phänotypische Übergänge von normalen epithelialen Mesothelzellen zu aktivierten Zellen und zu spindelig transformierten Mesothelzellen
nachgewiesen werden. Die stärkste VEGF-A Expression wiesen die kugelig aktivierten Mesothelzellen auf.
Leider konnte VEGF-C konsistent nicht nachgewiesen
werden. Der Rezeptor FLK-1 schien in der Stärke seiner Expression mit der Expression von VEGF-A zu korrelieren.
Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei
Peritonealkarzinosen von Ovarialkarzinomen
Alle innerhalb des Peritoneums metastatisch entwickelten
Tumoren zeigten eine VEGF-A Expression, die jedoch von Tumor zu Tumor erheblich schwankte. Es zeigte sich auch eine
fleckförmige Positivität der Tumorzellen, wie auf Abb. 2 zu
erkennen ist. Tumorzellen an der Oberfläche des Peritoneums
zeigen eine stärkere Expression. Signifikante Unterschiede
zwischen den Histiotypen der Ovarialkarzinome konnten
nicht nachgewiesen werden. Besonders interessant ist, dass es
bei einer Peritonealkarzinose ebenfalls zu einer erheblichen
spindelzelligen Transformation des Mesothels kommt. Abb. 2
zeigt die Expression von VEGF-A durch Zellen eines gering
differenzierten Ovarialkarzinoms und durch spindelig transformierte Mesothelzellen (400fache Vergrößerung).
Schlussfolgerung
Nach entsprechenden Vorversuchen und Modifikationen
der Inkubationsbedingungen sowie der Antigendemaskierungsverfahren konnte der Nachweis von VEGF-A am Gewebe zuverlässig etabliert werden. Die Expression von VEGFC war wesentlich schwächer entwickelt. In vielen Fällen ließ
sich VEGF-C nicht nachweisen. Die Etablierung dieser Reaktion ist somit nicht sicher geglückt.
Aufgrund der im vorherigen Punkt beschriebenen Beobachtungen ist anzunehmen, dass peritoneale Mesothelzellen
nicht nur bei Peritonitis, sondern auch bei Peritonealkarzinosen
eine entscheidende Quelle von VEGF darstellen. Die Befunde bestätigen experimentelle Arbeiten, die vor kurzem von verschiedenen Autoren in vitro gemacht wurden. VEGF wurde in hohen
Mengen im Aszites von Patientinnen mit Peritonealkarzinose
nachgewiesen. Unsere immunologischen in situ-Analysen deuten darauf hin, dass Mesothelzellen als die wichtigste Quelle von
VEGF auch in malignem Aszites anzusehen sind.
Besonders interessant ist das Phänomen der epithelialen
mesenchymalen Transition von Mesothelzellen. Bislang liegen
in der Literatur dazu keine Ergebnisse vor.
n
Christiane Maria Bauer
VEGF-A x400
Biomedizinische Analytikerin
Die Diplomarbeit zum Thema „Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei Peritonitis und Peritonealkarzinose durch Ovarialkarzinome“ wurde im Herbst
2005 an der Akademie für Biomedizinische AnalytikerInnen
im AZW Innsbruck abgeschlossen und am Institut für Pathologie des Landeskrankenhauses Feldkirch durchgeführt.
Diplomarbeitsbetreuung: Prim. Univ.-Doz. Dr. Felix Offner
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