Versuch der Differenzierung von Peritonitis und - biomed
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6 wissenschaf t & praxis Versuch der Differenzierung von Peritonitis und Peritonealkarzinose mittels immunhistologischer Methode zeptors in situ und die Evaluierung der Expression dieser Proteine in Fällen von Peritonitis und Peritonealkarzinosen durch Ovarialkarzinome. Material Paraffinblöcke von 56 Patientinnen mit Fällen von Peritonitis und Peritonealkarzinose durch Ovarialkarzinom wurden aus dem Archiv ausgehoben. Es handelte sich bei den Ovarialkarzinomen um serös-papilläre, muzinöse, tubulo-papilläre, mäßig bzw. schlecht differenzierte bis undifferenzierte und endometroide Karzinome. Die Peritonitisfälle deckten das gesamte Spektrum von akuter, eitriger bis chronischer Peritonitis mit Entwicklung von Adhäsionen ab. Die Paraffinschnitte wurden mit Antikörpern gegen Zytokeratin, Ki-67, VEGF-A, VEGF-C und VEGFR2 gefärbt, wobei Zytokeratin zur Identifikation der Mesothelzellen benötigt wurde. Ki-67 wurde als Proliferationsmarker eingesetzt. Zur Detektion wurde der ChemMate Detection Kit der Firma DakoCyomation verwendet. Geräte: das Schlittenmikrotom, wo zwei µm dicke bzw. dünne Schnitte der Paraffinblöcke angefertigt wurden, der Tissue-Tek automatic multiple slide stainer (Sakura) für die HE-Färbung, der Eindeckautomat, und das Lichtmikroskop für die Beurteilung der gefärbten Schnitte. Kurzfassung der Diplomarbeit „Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei Peritonitis und Peritonealkarzinose durch Ovarialkarzinome“ Einleitung VEGF ist die Abkürzung für vascular endothelial growth factor. Dieser Wachstumsfaktor spielt in der Angiogenese (Auswachsen von Gefäßsproßen aus bestehenden Gefäßen) und Vaskulogenese (Neubildung von Blutgefäßen aus Inseln von Vorläuferzellen) eine wesentliche Rolle. Die Expression dieses Zytokins konnte in vielen physiologischen Zelltypen und Geweben nachgewiesen werden, wie zum Beispiel in Makrophagen, glatten Muskelzellen und Osteoblasten. Einer der stärksten Regulatoren von VEGF ist die Hypoxie in einem Gewebe. Bei Tumoren zum Beispiel kommt es aufgrund des schnellen Zellwachstums bald zu einer Sauerstoffunterversorgung. Die VEGF-Familie besteht aus strukturell verwandten Glykoproteindimeren und gehört zu der Superfamilie von PDGF (platelet-derived growth factor) Wachstumsfaktoren. In dieser Diplomarbeit wurden die Expression von VEGF-A und auf VEGF-C, das für die Lymphangiogenese von Bedeutung ist, untersucht Es gibt drei Rezeptoren in der VEGF Rezeptorfamilie. Sie zählen zu den Tyrosin-Kinase-Rezeptoren. In dieser Arbeit war der Rezeptor 2 von Bedeutung, auch bekannt als KDR (kinase insert domain containing receptor). Eine andere Bezeichnung ist flk-1(fetal liver kinase). An diesen Rezeptor kann sowohl VEGF-A als auch VEGF-C binden. Peritonitis: kann auf belebte (Bakterien, Viren, Pilze) oder unbelebte (mechanische, aktinische, chemische) Ursachen zurückgeführt werden. Sie kann akut, chronisch oder tuberkulös verlaufen. Die Karzinose ist durch einen Einbruch eines Tumors in einen Hohlraum und das An- und Weiterwachsen an einer anderen Stelle definiert, in diesem Fall bedeutet es den Einbruch eines Ovarialkarzinoms in die Bauchhöhle, was eine Peritonealkarzinose hervorruft. Das Peritoneum ist ausgekleidet von einer zellulären Membran aus peritonealen Mesothelzellen HPMC (human peritoneal mesothelial cells). Sie können durch die Freisetzung verschiedener Zytokine aktiv in die Regulation der Entzündung und der Freisetzung von Tumoren in der Bauchhöhle eingreifen. Die Expression von VEGF in humanen peritonealen Mesothelzellen konnte in vitro gezeigt werden, nicht aber die Produktion und Sezernierung von VEGF in situ für verschiedene Stadien der Peritonitis und Peritonealkarzinose durch Ovarialkarzinome. wissenschaft & praxis Methode 1. Für ein Übersichtsbild wurde von jedem Block von einem Paraffinschnitt eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung angefertigt. 2. Von allen Karzinomfällen wurde ein Schnitt mit der PASMethode gefärbt, um festzustellen, ob es sich um ein muzinöses Karzinom handelt. 3. Immunhistochemische Färbung: Vor jeder immunhistochemischen Färbung erfolgte die Antigendemaskierung, wir verwendeten die hitzeinduzierte Demaskierung, die Zielsetzung Ziel war die Etablierung des immunologischen Nachweisverfahrens für VEGF-A, VEGF-C sowie des VEGF-Re- VEGF-A-x400 wissenschaf t & praxis Schnitte wurden mit Citrat-Puffer (ChemMateT Target Retrieval Buffer) im Wasserbad (95°C) erhitzt oder bei 120°C autoklaviert. Durch diese Art von Antigendemaskierung können Antikörper auch solche Epitope erkennen, die zuvor zum Beispiel durch Aldehydvernetzungen maskiert waren. Zur Darstellung der immunhistochemischen Färbung wurde die LSAB-Methode, labelled streptavidin biotin Methode angewendet. Die drei wesentlichen Schritte dieser Reaktion sind: Binden des Primärantikörpers an das Antigen, Andocken des biotinylierten Brückenantikörpers an den Primärantikörper und in Schritt drei das Binden des enzymmarkierten Strepavidins, dafür wurde der Detection Kit verwendet. Die Visualisierung der Reaktion erfolgte mit Hilfe von chromogenem Substrat. 4. Austesten der Antikörper und Etablierung der Färbungen: Dazu wurde Kontrollgewebe mit gesicherter Expression des jeweiligen Antigens, wo der entsprechende Antikörper binden kann, verwendet. Die Testetablierung diente dazu, ein geeignetes Färbeprotokoll für die verschiedenen Antikörper zu erstellen, nach dem im späteren Verlauf gearbeitet werden konnte. Ergebnisse Die Testetablierung (nur exemplarisch erwähnt) ergab bei VEGF-A eine Antigendemaskierung im Wasserbad von fünf Minuten, eine Verdünnung des Antikörpers von 1:400 und eine Inkubationszeit im Kühlschrank bei 4°C für viereinhalb Stunden. Diese Protokolle wurden in der gesamten Arbeit manuell durchgeführt. Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei Peritonitis VEGF-A wurde im normalen Mesothel, das als Kontrolle mitgeführt wurde, relativ schwach exprimiert. Im Gegensatz dazu zeigten die Mesothelzellen bei Peritonitis eine wesentlich stärkere Expression von VEGF-A (Abb.1). Insbesondere Mesothelzellen, die an der Basalmembran haften und reaktive Zellveränderungen aufweisen, das heißt eine Abkugelung und Schwellung des Zytoplasmas erkennen lassen, zeigten eine starke Expression von VEGF-A (Abb.2). Auffallend war, dass bei Peritonitis die Mesothelzellen eine spindelförmige Trans- formation durchmachen. Es konnten phänotypische Übergänge von normalen epithelialen Mesothelzellen zu aktivierten Zellen und zu spindelig transformierten Mesothelzellen nachgewiesen werden. Die stärkste VEGF-A Expression wiesen die kugelig aktivierten Mesothelzellen auf. Leider konnte VEGF-C konsistent nicht nachgewiesen werden. Der Rezeptor FLK-1 schien in der Stärke seiner Expression mit der Expression von VEGF-A zu korrelieren. Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei Peritonealkarzinosen von Ovarialkarzinomen Alle innerhalb des Peritoneums metastatisch entwickelten Tumoren zeigten eine VEGF-A Expression, die jedoch von Tumor zu Tumor erheblich schwankte. Es zeigte sich auch eine fleckförmige Positivität der Tumorzellen, wie auf Abb. 2 zu erkennen ist. Tumorzellen an der Oberfläche des Peritoneums zeigen eine stärkere Expression. Signifikante Unterschiede zwischen den Histiotypen der Ovarialkarzinome konnten nicht nachgewiesen werden. Besonders interessant ist, dass es bei einer Peritonealkarzinose ebenfalls zu einer erheblichen spindelzelligen Transformation des Mesothels kommt. Abb. 2 zeigt die Expression von VEGF-A durch Zellen eines gering differenzierten Ovarialkarzinoms und durch spindelig transformierte Mesothelzellen (400fache Vergrößerung). Schlussfolgerung Nach entsprechenden Vorversuchen und Modifikationen der Inkubationsbedingungen sowie der Antigendemaskierungsverfahren konnte der Nachweis von VEGF-A am Gewebe zuverlässig etabliert werden. Die Expression von VEGFC war wesentlich schwächer entwickelt. In vielen Fällen ließ sich VEGF-C nicht nachweisen. Die Etablierung dieser Reaktion ist somit nicht sicher geglückt. Aufgrund der im vorherigen Punkt beschriebenen Beobachtungen ist anzunehmen, dass peritoneale Mesothelzellen nicht nur bei Peritonitis, sondern auch bei Peritonealkarzinosen eine entscheidende Quelle von VEGF darstellen. Die Befunde bestätigen experimentelle Arbeiten, die vor kurzem von verschiedenen Autoren in vitro gemacht wurden. VEGF wurde in hohen Mengen im Aszites von Patientinnen mit Peritonealkarzinose nachgewiesen. Unsere immunologischen in situ-Analysen deuten darauf hin, dass Mesothelzellen als die wichtigste Quelle von VEGF auch in malignem Aszites anzusehen sind. Besonders interessant ist das Phänomen der epithelialen mesenchymalen Transition von Mesothelzellen. Bislang liegen in der Literatur dazu keine Ergebnisse vor. n Christiane Maria Bauer VEGF-A x400 Biomedizinische Analytikerin Die Diplomarbeit zum Thema „Expression von VEGF und VEGF-Rezeptoren bei Peritonitis und Peritonealkarzinose durch Ovarialkarzinome“ wurde im Herbst 2005 an der Akademie für Biomedizinische AnalytikerInnen im AZW Innsbruck abgeschlossen und am Institut für Pathologie des Landeskrankenhauses Feldkirch durchgeführt. Diplomarbeitsbetreuung: Prim. Univ.-Doz. Dr. Felix Offner 7
