Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Ras

Funktionelle und Strukturelle
Charakterisierung von Ras-Effektoren
Eigenschaften des kleinen Ras-Effektors
Novel Ras Effector 1 (Nore1)
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktor der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Daniel Schwarz
aus Dortmund
Dezember 2002
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 1999 bis Dezember 2002 in der
Abteilung Strukturelle Biologie am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in
Dortmund unter der Anleitung von Herrn Prof. Dr. Alfred Wittinghofer und Herrn PD
Dr. Christian Herrmann angefertigt.
1. Gutachter Prof. Dr. Alfred Wittinghofer
2. Gutachterin PD Dr. Andrea Blöchl
Inhaltsverzeichnis
EINLEITUNG
SIGNALTRANSDUKTION UND REGULATORISCHE GTPASEN
RAS-SUPERFAMILIE
RAS-PROTEIN
Struktur und Funktion
RAP-PROTEIN
Struktur und Funktion
EFFEKTOREN
Affinitäten
DER NORE1-EFFEKTOR
Entdeckung
Biologische Charakterisierung von Nore1-Effektor
Oligomerisierung von Nore1
Nore1 Homologe
PROTEIN-DOMÄNEN VON RAS-EFFEKTOREN
Rasbindende Domäne (RBD)
Cysteinreiche Domäne (C1)
Coiled-Coil Domäne (CC)
1
1
3
3
6
12
13
14
16
17
17
20
21
21
22
24
26
26
ZIELSETZUNG DER ARBEIT
32
MATERIALIEN
34
CHEMIKALIEN
ENZYME
GEBRAUCHSWAREN
34
34
35
PUFFER UND STAMMLÖSUNGEN
36
MEDIEN, ANTIBIOTIKA UND AGARPLATTEN
40
MEDIEN FÜR BAKTERIEN
MEDIEN FÜR HEFEN
ANTIBIOTIKA
X-GAL-AGARPLATTEN
VERWENDETE BAKTERIEN- UND HEFESTÄMME, VEKTOREN,
OLIGONUKLEOTIDE, BIBLIOTHEKEN UND DATENBANKEN
BAKTERIEN- UND HEFESTÄMME
VEKTOREN
SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE
DATENBANKEN UND SOFTWARE
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA
ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA: KLONIERUNGSTECHNIKEN
DARSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN
DARSTELLUNG KOMPETENTER HEFEN
TRANSFORMATION VON BAKTERIEN
TRANSFORMATION VON HEFEN
40
41
43
43
43
43
44
44
45
46
46
46
47
47
48
48
48
Transformation im kleinen Ansatz
Transformation im großen Ansatz
ELEKTROPHORESE VON NUKLEINSÄUREN
ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
METHODEN DER POLYMERASE KETTEN REAKTION (PCR)
GELRETARDATIONSASSAY (GELSHIFT)
PROTEINBIOCHEMISCHE TECHNIKEN
EXPRESSION
PRÄPARATION VON PROTEINEN
Zellaufschluß
Proteinreinigung und Chromatographie (FPLC)
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN
ELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
NUKLEOTIDCHEMISCHE METHODEN
48
49
49
50
50
52
53
53
53
53
54
55
55
56
NUKLEOTIDAUSTAUSCH
HPLC-ANALYSE VON NUKLEOTIDEN
56
57
BIOPHYSIKALISCHE METHODEN
58
ITC
DSC
GDI
FLUORESZENZMESSUNGEN
CD-SPEKTROSKOPIE
MASSENSPEKTROSKOPIE
KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN
58
59
60
60
61
62
63
KRISTALLISATION
PRINZIP DER ZÜCHTUNG VON PROTEINKRISTALLEN
KRISTALLISATION NACH DER METHODE DES HÄNGENDEN TROPFENS
KRISTALLMONTAGE
MARKIERUNG VON AMINOSÄUREN ZUR PHASIERUNG
RÖNTGENOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNG
Grundlagen
Datensammlung
Phasenproblem
MIR / SIR
MAD / SAD
Molekularer Ersatz
Verfeinerung
63
63
64
64
65
66
66
67
68
68
68
69
69
YEAST-TWO-HYBRID-SCREENING (FIELDS UND SONG, 1989)
71
BESCHREIBUNG DER EINGESETZTEN MATERIALIEN
SELEKTION RELEVANTER TRANSFORMANTEN
VERIFIKATION POSITIVER KLONE DURCH KOTRANSFORMATION MIT LEERVEKTOR
ISOLIERUNG DES AD-PLASMIDS AUS HEFEZELLEN UND KLON-ANALYSE
GST-PULLDOWN (SMITH UND JOHNSON, 1988)
EXPRESSION UND ISOLIERUNG DER GST-FUSIONSPROTEINE
PULLDOWN-INKUBATION UND ANALYSE MITTELS PAGE
LUMINOMETRISCHE MESSUNGEN
71
71
71
72
72
72
73
73
Messung der β-Galactosidase-Aktivität
ERGEBNISSE
NORE1-DOMÄNENSTRUKTUR
GDI- UND ITC-MESSUNGEN
ENTWICKLUNG EINES ALIGNMENTS NORE1-RBD AUF BEKANNTE RBD’S
HEFE 2-HYBRID-SCREEN
2-Hybrid Statistik/Bestimmung der Transformationseffizienz
Verifikation positiver Klone durch Segregation
Semiquantitative Bestimmung von Bindungsaffinitäten
Identifikation von HIS3- und lacZ-positiven Hefetransformanten
Kotransformation mit Nore1-Fragmenten
GST-Pulldown
Affinitätsmessungen
Kompetetiver GDI
GELRETARDATIONSASSAY (GELSHIFT)
DIMERISIERUNG VON NORE1
STRUKTUREN
NORE C1
KRISTALLISATION
MODELLBAU UND VERFEINERUNG
COILED COIL-STRUKTUR
Orientierung
Charakterisierung des Interface
Kristallpackung
MODELLIERUNGEN
KRISTALLE DER NORE1-RBD UND RASSF1C-RBD
DISKUSSION
NORE1-DOMÄNENSTRUKTUR
AFFINITÄTEN ZWISCHEN RAS UND NORE
MUTANTEN
ALIGNMENT VON NORE1-RBD AUF BEKANNTE RBD’S
INTERAKTIONSPARTNER VON NORE1
DIE EINZELNEN INTERAKTIONSPARTNER
RNF4
MSS4
Spry1
MAP1B
eIF4γ2
S/T PP Typ 1α
tenascin-C
MacF, SerRSmt und LCCP
GST-PULLDOWN
ITC/GDI VON INTERAKTIONPARTNERN
GELRETARDATIONSASSAY
NORE1 C1-DOMÄNE
NORE1 COILED-COIL STRUKTUR
BINDUNG VON NORE1 AN MST1
73
75
75
77
78
81
82
82
85
86
88
91
93
95
97
97
100
100
101
105
105
107
107
111
114
116
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118
119
121
121
122
122
122
123
124
124
125
126
126
126
127
127
129
129
130
133
AUSBLICK
136
ZUSAMMENFASSUNG
136
LITERATUR
139
ABKÜRZUNGEN
151
ANHANG
KLONIERTE NORE1-FRAGMENTE
OLIGONUKLEOTIDE
ACCESSION-NR. VON NORE1 UND DESSEN HOMOLOGE
ALIGNMENTS DER VERSCHIEDENEN NORE1-HOMOLOGEN
ALIGNMENT DER RASSF1-ISOFORMEN
GLEICHUNGSDATEIEN
GESAMTSTATISTIK FÜR NORE1-CC
GESAMTSTATISTIK FÜR NORE1-RBD
GESAMTSTATISTIK FÜR RASSF1C-RBD
154
154
154
158
159
160
161
167
168
170
Einleitung
Signaltransduktion und regulatorische GTPasen
Biochemische und zellbiologische Abläufe innerhalb eines Organismus werden durch
intermolekulare Interaktionen vermittelt, wie z. B. Protein-DNA-, Protein-Protein- oder
Protein-Kleinmolekül-Interaktionen. Bei den Kleinmolekülen handelt es sich um
Lipide, Hormone (auch Peptidhormone), Nukleotide u. a.
Die beiden Nukleotide ATP und GTP spielen hierbei eine besondere Rolle. Sie sind an
einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt. Die chemische Energie, die bei der
Hydrolyse von ATP gewonnen wird, wird als essentieller „Kraftstoff“ für biochemische
Reaktionen im Zellmetabolismus genutzt. Solche Reaktionen können aufgrund hoher
energetischer Barrieren vielfach nicht von selbst ablaufen. Beispiele hierfür sind u. a.
Phosphoryltransfer, Proteinbiosynthese und Glycolyse. Letztere liefert zwar Energie,
jedoch bedürfen einzelne Schritte Energie, die durch ATP-Hydrolyse bereit gestellt
wird.
GTP hingegen ist oft an der Transmission von Signalen beteiligt. Ausnahmen sind
beispielsweise Tubulin und Aktin. Diese Proteine binden ebenfalls GTP, bzw. ATP,
jedoch wird die frei werdende Energie während der Hydrolyse dieser Nukleotide zur
Polymerisation verwendet
Signaltransduktion kann auf vielfältige Weise erfolgen. Dabei unterscheidet man
zwischen interzelluläre Kommunikation zwischen chemischen Botenstoffen (diese
werden von den Zielzellen spezifisch an Rezeptoren registriert und biochemische
Reaktionen umgewandelt), Gap Junctions (benachbarte Zellen über direkte Kontakte
durch Kanäle zwischen zwei Zellen) Zell-Zell-Interaktion über Oberflächenproteine
(Oberflächenproteine binden ein komplementäres Protein auf einer anderen Zelle mit
anschließender biochemischer Reaktion) und elektrischen Vorgängen (Reizleitung im
Nerv durch Änderungen des Membranpotentials).
Bei der rezeptorvermittelten Signaltransduktion werden u. a. Transmembranrezeptoren
verwendet. Die Aktivierung dieser Rezeptoren (in der Regel durch Multimerisierung)
führt zu einer Vielzahl biochemischer Ereignisse, bei denen regulatorische GTPasen
eine entscheidende Rolle spielen.
1
Allen regulatorischen GTPasen gemeinsam ist die Mg2+-abhängige Bindung von
Guaninnukleotiden und die Hydrolyse von GTP zu GDP und freiem Orthophosphat, die
durch konservierte Sequenzmotive vermittelt wird (Bourne et al., 1991). Man unterteilt
die GTP-bindenden Proteine in fünf Hauptgruppen:
1.
2.
3.
4.
5.
Faktoren für die Proteinsynthese:
Å-Untereinheiten der Heterotrimere G-Proteine:
Superfamilie der Ras-verwandten Proteine:
Signalerkennungsparitkel und sein Rezeptor:
Proteine mit helikalen Erweiterungen:
Septine
EF-Tu, EF-G, IF-2, RF-3
Gαs, Gαi, Gαq
Ras, Rho, Ran, Rab...
SRP54, SR, Ffh
Dynamin,
Mx,
hGBP,
Daneben unterscheidet man noch GTP-bindende Proteine mit völlig unterschiedlichen
Faltungen (verschieden von den oben genannten): Tubulin,
Enzyme
2
FtsZ,
metabolische
Ras-Superfamilie
Ras-Protein
Das Ras-Gen und das von ihm codierte Genprodukt, das Ras-Protein oder p21ras, wurde
zuerst bei Retroviren gefunden, die in Ratten Tumore vom Sarkom-Typ auslösen
können (Ras = rat sarcoma).
Ras-verwandte kleine GTP-bindende Proteine umfassen in Säugern eine große Familie
von ungefähr 50-60 Mitgliedern. Basierend auf Sequenzhomologien kann diese
Superfamilie weiter in Unterfamilien unterteilt werden:
Familie
Mitglieder
Funktion
Ral,
Proliferation
Differenzierung
Apoptose
Ras sarcoma
Ras, Rap,
TC21
RHO
Ras homologue
Cytoskelett
Rho, Rac, Cdc42,
Proliferation
TC10
Genexpression
RAB
Ras-like isolated from rat
Rab
brain
ARF
Ras
Übersicht
(Vojtek und Der, 1998)
(Mackay und Hall, 1998; Sander und
Collard, 1999)
vesikuläe
Transportprozesse
(Schimmoller et al., 1998; Somsel
und Wandinger-Ness, 2000)
ADP-ribosylation factor
Arf, Ard, Arl, Arp, vesikuläre
Sar1, CIN4
Transportprozesse
(Jackson und Casanova, 2000; Moss
und Vaughan, 1998)
RAN
Ras-related
protein
Ran, TC4
RAD
Ras-like associated with Rad, Gem, Rem,
Glucose-Haushalt
diabetes
Kir
RHEB
Ras homologue highly
Rheb
enriched in brain
Ras-Antagonist
synaptische
Platizität
(Yee und Worley, 1997)
RIN
Ras-like
neurons
Calcium-Haushalt
Ca2+-vermittelte
Signaltransduktion
(Lee et al., 1996; Shao et al., 1999;
Wes et al., 1996)
RAG
Ras-related GTP-binding
Rag, Gtr
protein
nuclear
expressed
in
Rin, Rit, Ric
Nukleocytoplasmatischer
Transport
(Moore, 1998)
(Bilan et al., 1998)
(Hirose et al., 1998; Schurmann et
al., 1995)
Die Klassifizierung dieser Proteine in diese Gruppe geschieht aufgrund ihrer
Sequenzhomologie, insbesondere aufgrund Ihrer Ähnlichkeiten in der Effektoregion.
Diese Domäne ist eine Region, die mit downstream Zielen (Effektormoleküle, s. weiter
unten) für die Signaltransduktion interagiert.
Das Ras-Protein ist eine monomere GTPase von ca. 21 kD. Die GTP-gebundene Form
repräsentiert den aktiven, angeschalteten Zustand, die GDP-gebundene Form den
3
inaktiven, abgeschalteten Zustand. Dabei wechselt es zwischen zwei Konformationen
(Schweins und Wittinghofer, 1994; Wiesmuller und Wittinghofer, 1994). Der Übergang
zwischen der aktiven und der inaktiven Form erfolgt in einem unidirektionalen Zyklus.
Für beide Formen des Ras-Proteins sowie für mehrere mutierte Ras-Proteine existieren
hochaufgelöste Kristallstrukturen, sowohl im Komplex mit anderen Proteinen, als auch
separat. Darüber hinaus liegen Strukturinformationen zur Bindung eines Rasverwandten Proteins, des Rap-Proteins, mit dem Ras-nachgeschalteten Effektormolekül,
der Raf-Kinase, vor (Nassar et al., 1995; 1996).
Ras liegt in vier Isoformen vor: H-, K- (Unterformen A und B) und N-Ras. Diese
spielen eine entscheidende Rolle in der Zellproliferation, -differenzierung und Apoptose
(Boguski und McCormick, 1993; Bourne et al., 1990; 1991; Lowy und Willumsen,
1993). Die drei Isoformen sind innerhalb der ersten 86 Aminosäuren identisch, die auch
die Effektorregion umfassen. Darüber hinaus ist die Sequenz der drei Isoformen bis zur
Aminosäure 167 sehr homolog. Sequenzunterschiede sind in den C-terminalen
Bereichen zu finden, wobei alle Isoformen am C-Terminus ein konserviertes Cystein,
gefolgt von zwei aliphatischen und einer beliebigen Aminosäure (die CaaX-Box)
aufweisen.
Diese
wird
post-translational
modifiziert
(farnesyliert,
bzw.
geranylgeranylisiert) und ist verantwortlich für die Lokalisation von Ras an der
Zellmembran (Abb. 1).
Von entscheidender Bedeutung für die signalübertragende Funktion des Ras-Proteins ist
die Zeitdauer, die das Ras-Protein im aktiven, GTP-gebundenen Zustand verbringt. Nur
im GTP-Zustand kann das Signal an das nachgeschaltete Effektormolekül weitergeben
werden. Das Zeitfenster, das für die Signalübertragung zur Verfügung steht, wird durch
die Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse bestimmt. Eine niedrige Geschwindigkeit der
GTP-Hydrolyse und ein damit verbundenes langes Verweilen im aktiven GTP-Zustand
ist mit einer hohen Intensität der Signalübertragung verbunden. Eine Verkürzung des
Zeitfensters durch eine Stimulation der GTPase führt dagegen zu einer Abschwächung
der Signalübertragung.
Isoliert betrachtet stellt das Ras-Protein ein sehr ineffizient arbeitendes Enzym dar. Zum
einen ist die Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse sehr niedrig, zum anderen ist der
Komplex aus Ras-Protein und GDP sehr stabil und dissoziiert nur sehr langsam. Die
Geschwindigkeitskonstanten beider Prozesse liegen im Bereich von 10-4 s-1(John et al.,
1990). Beide Reaktionen können aber im Zuge einer Signalübertragung gezielt
4
beschleunigt werden und haben entscheidenden Einfluß auf die Signalübertragung
durch das Ras-Protein.
Guaninnukleotid Austauschfaktoren (GEFs) induzieren die Dissoziation von GDP und
bewirken die Assoziation des in höherer Konzentration vorliegendem GTP.
Austauschfaktoren gehen mit der GDP-gebundenen Form der GTPasen eine Bindung
ein. GDP verläßt den Komplex, wobei der Austauschfaktor noch an der nukleotidfreien
GTPase gebunden bleibt. GTP wird daraufhin gebunden und verursacht durch
konformative Änderung der GTPase, daß der Austauschfaktor den Komplex verläßt und
die GTPase in ihrer aktiven Form hinterläßt (Bourne et al., 1990).
Das gebundene GTP wird bei Inaktivierung durch die intrinsische GTPase Aktivität
hydrolysiert. Die Hydrolyse durch die GTPase-eigene intrinsische GTPase Aktivität ist
sehr langsam. Die Halbwertszeit liegt in einer Größenordnung von Minuten bis
Stunden. Diese Aktivität kann jedoch um ein Vielfaches gesteigert werden. Diese
Steigerung ermöglichen sogenannte GTPase-aktivierende Proteine (GAPs). Sie erhöhen
die GTPase-Aktivität bis zu 105-fach; bis zu Halbwertzeiten von Millisekunden bis
Sekunden (Scheffzek et al., 1998). Die GAPs kontrollieren somit den Aktivitätszustand
des Ras-Proteins, indem sie die Lebensdauer des aktiven GTP-Zustands verkürzen
(Abb. 1).
Extrazelluläre Stimuli bewirken im Falle der Ras-Aktivierung die Rekrutierung eines
Austauschfaktors
(z. B.
SOS)
zur
Plasmamembran
membrangebundenem Ras, welches daraufhin aktiviert wird.
5
in
die
Nähe
von
Abb. 1
GTPase-Zyklus. Eine kleine GTPase (z. B. Ras) wird durch eine Transferase C-terminal modifiziert und
bindet an Guanosin-Dinukleotid Dissoziations-Inhibitor (GDI). Ein GDI-Dissoziations-Faktor bewirkt die
Dissoziation der GTPase von dem Inhibitor; die GTPase bindet an die Membran. Durch GuanosinnukleotidAustausch-Faktoren (GEF) wird der Austausch von Guanosin-Dinukleotid (GDP) durch GunosinTrinukleotid (GTP) katalysiert. Der Austausch bewirkt eine Konformationsänderung und aktiviert die
GTPase. Hydrolyse des GTP, die durch GTPase-Aktivierende Proteine (GAP) beschleunigt wird inaktiviert
die GTPase.
Struktur und Funktion
Die Struktur der GTP-gebundenen Form des Ras-Proteins ist in Abb. 3 wiedergegeben.
Für die Schalterfunktion des Ras-Proteins sind drei Strukturelemente von besonderer
Bedeutung, die Schalter-I-, Schalter-II- und P-Schleife. Alle drei Schleifen kontaktieren
das γ-Phosphat des GTP (Pai et al., 1989).
Die P-Schleife (auch Walker A Motiv oder G1 genannt) kontaktiert das α-, β- und γPhosphat des Nukleotids über mehrere Kontakte zu Amidwasserstoffen der Hauptkette
sowie der ε-Aminogruppe des Lysin. Die Hydroxylgruppe des Serins oder Threonins ist
außerdem noch in der GDP- und GTP-gebundenen Form an der Koordination des Mg2+Ions beteiligt. Zwischen dem ersten und zweiten Motiv liegt ein konserviertes Threonin,
das mit seiner Hydroxylgruppe ebenfalls an der Mg2+-Koordination beteiligt ist und
über den Amidwasserstoff der Hauptkette das γ-Phosphat kontaktiert. Das Glycin im
streng konservieren zweiten Bindungsmotiv kontaktiert das γ-Phosphat in gleicher
Weise.
6
Das dritte Motiv ist für die spezifische Erkennung der Guaninbase verantwortlich.
Während das Aspartat eine bidentate Wasserstoffbrücke zum Guaninteil ausbildet,
stabilisieren
die
beiden
anderen
konservierten
Reste
die
Struktur
der
Nukleotidbindungsstelle durch Kontakte zur P-Schleife.
Abb. 2
Konservierte Sequenzmotive von GTP-bindenden Proteinen. Das erste Motiv (P-Schleife) kontaktiert das α, β- und γ-Phosphat des Nukleotids und koordiniert das Mg2+-Ion, das folgende Threonin ist ebenfalls an der
Mg2+-Koordination beteiligt. Das Glycin im zweiten Sequenzmotiv kontaktiert das γ-Phosphat in gleicher
Weise. Das dritte Motiv ist für die spezifische Erkennung der Guaninbase verantwortlich.
In der P-Schleife befindet sich Gly12, das als Sensitivste gegen Aminosäuresubstitutionen in onkogenen Mutanten des Ras-Protein sehr häufig mutiert gefunden
wird (neben Mutationen von Gly13 und Gln61). Diese Mutationen sind resistent
gegenüber der GAP-vermittelten GTPase. Sie bleiben dann konstitutiv in der aktiven
Form (Hall, 1990; Trahey und McCormick, 1987).
Der Schalter-I-Schleife (auch als Effektorschleife oder switch I bezeichnet) kommt
besondere Bedeutung für die biologische Aktivität des Ras-Proteins zu und enthält die
Aminosäurereste 32-40, die aufgrund von Mutationsexperimenten als wichtig für die
Wechselwirkung mit den GTPase-aktivierenden Proteinen erkannt worden sind
(Marshall, 1995). Die Schalter-I-Schleife ist Teil der Effektorregion des Ras-Proteins.
Thr35 der Schalter-I-Schleife geht H-Brückenkontakte zum γ-Phosphat und zum Mg2+
ein (Abb. 4) und hilft so, den GTP-Mg2+-Komplex im aktiven Zentrum korrekt zu
positionieren.
Abb. 3
Vergleich der Ras-Struktur in der GDP- (A) und in der GppNH-gebundenen (B) Form. Die Bereiche, die
eine Konformationsänderung durchlaufen, sind blau dargestellt. Hierbei handelt es sich um die
Schalterschleifen I (Effektorschleife) und II.
7
Die Hydrolyse von GTP an sich benötigt ein divalentes Kation, für gewöhnlich Mg2+
(Schweins et al., 1997). Dieses Mg2+ schirmt die Ladungen von β- und γ-Phosphat von
GTP ab, somit wird ein nukleophiler Angriff von Wasser (dissoziativer Mechanismus)
(Maegley et al., 1996) an diesen Phosphatresten möglich (Abb. 4).
Abb. 4
Detaildarstellung der Nukleotidbindung. Gezeigt ist die Koordination des Mg2+ durch Reste der
Schalterschleife I. Threonin 35 ist aktiv an der Koordination des Mg2+ und an der Bindung des γ-Phosphat
des Nukleotids beteiligt. Bei Hydrolyse des Nukleotids geht folglich diese Bindung verloren, die
Schalterschleife I ändert seine Konformation (Wittinghofer und Pai, 1991).
Die Schalter-II-Schleife (switch II) bildet über Gly60 ebenfalls eine H-Brücke zum γPhosphat aus. Die Schalter-II-Schleife enthält den katalytisch essentiellen Gln61-Rest
und ist ebenfalls an der Wechselwirkung mit den GTPase-aktivierenden Proteinen
beteiligt.
Der Vergleich der Struktur der aktiven Ras-GTP-Form mit der inaktiven Ras-GDPForm zeigt deutliche Konformationsänderungen der beiden Schleifen (I und II) auf. Als
Folge der GTP-Hydrolyse gehen die Kontakte der drei Schleifen zum γ-Phosphat
verloren. Der Strukturunterschied zwischen der aktiven GTP-Form und der inaktiven
GDP-Form läßt sich vor allem durch Positionsänderungen der beiden Schalter-Schleifen
beschreiben (Abb. 3).
Die Effektorschleife erfährt eine drastische Umorientierung, da die Koordination zum γPhosphat und zum Mg2+ wegfällt. Auch die Wechselwirkung des konservierten Gly60
der Schalter-II-Schleife mit dem γ-Phosphat entfällt während der GTP-Hydrolyse.
Für den Mechanismus der GAP-vermittelten GTP-Hydrolyse bei Ras kann man zwei
mögliche Modelle aufführen. Das erste Modell beruht auf der Voraussetzung, daß Ras
8
an sich eine effiziente GTPase ist, und GAP bewirkt eine Konformationsänderung, um
die Hydrolyse zu ermöglichen und Ras in den inaktiven Zustand (d. h. in den GDPgebundenen Zustand) zu bringen. Im zweiten Modell nimmt GAP mittels basischer
Seitenketten aktiv an der Hydrolyse teil und macht sie somit effizient (Maegley et al.,
1996; Schweins et al., 1996). Experimente mit Aluminiumfluorid liefern Hinweise für
den letzten Mechanismus (Mittal et al., 1996).
Die Effekte von Aluminiumfluorid sind sehr detailliert für die α-Untereinheiten der
heterotrimeren G-Proteine gezeigt worden (Coleman et al., 1994; Sondek et al., 1994).
Im Gegensatz zu den Ergebnissen für die Gα-Proteine bindet Ras alleine kein
Aluminiumfluorid, sondern benötigt stöchiometrische Mengen an RasGAP, um
Aluminiumfluorid zu binden (Mittal et al., 1996). Das deutet an, daß das katalytische
Zentrum von Ras unvollständig ist, solange GAP nicht anwesend ist. Diese Annahme ist
durch die Auflösung der räumlichen Struktur des Komplexes zwischen RasGDP und der
katalytischen Domäne von p120-GAP bestätigt worden, der in der Anwesenheit von
Aluminiumfluorid kristallisiert wurde. Die Struktur zeigt, daß GAP mit einem
„Argininfinger“ in Richtung aktives Zentrum zeigt. Dieser Argininfinger neutralisiert
die negative Ladung zwischen den β- und γ-Phosphatresten des GTP im
Übergangszustand
der
GTPase-Reaktion
mit
seiner
positiv
geladenen
Guanidiniumseitenkette (Scheffzek et al., 1997) und stabilisiert ihn.
Die Struktur zeigt auch, daß Glutamin 61 von Ras, das im unkomplexierten Ras sehr
beweglich ist, in der Gegenwart von GAP durch den Argininfinger fixiert wird und
ebenfalls an der Stabilisierung des Übergangszustandes teilnimmt.
Betrachtet man die Triphosphat-Struktur, so existiert Ras in mindestens zwei
Konformationen. Für Ras, welches GppNHp gebunden hat, konnten Geyer et al. (1996)
mit Hilfe von
31
P-NMR zeigen, daß Ras-GppNHp bei Temperaturen unterhalb von
20°C eine Aufspaltung des β-Phosphatsignals in zwei Linien aufweist (Abb. 5). Bei
Erhöhung der Temperatur über 20°C verschmelzen diese Linien als Folge des schnellen
Konformationsübergangs
zu
einer
Linie
(Koaleszenz).
Die
Verfolgung
der
Konformationsänderung bei verschiedenen Temperaturen ermöglichte die Bestimmung
der Aktivierungsenergie ∆HT und der Entropie T∆ST für diesen Übergang (der Index
„T“ kennzeichnet Energien für den Übergang). Aufgrund der relativ großen Aufspaltung
der beiden β-Phosphatlinien von 1 ppm konnte man auf eine strukturelle Ursache für
diesen Übergang schließen. Durch verschiedene Mutationsanalysen innerhalb der
Effektorregion und durch
1
H-NMR konnte der Bereich, der durch strukturelle
9
Veränderungen die Aufspaltung bewirkt, bestimmt werden. Dieser deckt sich mit der
oben bereits erwähnten Schalter-I-Schleife (Effektorschleife oder switch I ).
Betrachtet man die Bindung von Effektoren an Ras, so beobachtet man, daß sich die
Aufspaltung des β-Phosphats zugunsten des Zustandes 2 verändert; Zustand 1
verschwindet dabei. Dieser Zustand wird als der bindende Zustand von Ras angesehen
(Geyer et al., 1996).
Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die Ras-Mutante T35S nur eine Konformation
im GppNHp-gebundenen Zustand einnimmt, nämlich die nicht bindende Konformation
(Zustand 1). Eine Effektor-RBD (Raf-RBD) kann bei der T35S-Mutante einen Shift in
die bindende Konformation induzieren. Bei der T35A-Mutante ist dies hingegen nicht
möglich, Abb. 6 (Spoerner et al., 2001).
Abb. 5
31
P-NMR-Spektren von Ras-Gpp(NH)p, dem ein Effektor (AF6-RBD) in unterschiedlichen Verhältnissen
hinzu titriert wurde (Linnemann et al., 1999). Deutlich erkennbar ist die Aufspaltung der β-Phosphatlinie im
Falle des langsamen Austausches bei geringer Effektorkonzentration. Auch beim α-Phosphat ist eine
Aufspaltung in zwei Zustände anhand der Linienform zu erahnen. Zustand 2 wird durch weitere Zugabe von
Effektor stabilisiert.
10
Abb. 6
31
P-NMR spektroskopische Analyse der Komplexbildung zwischen Ras(T35S) und Ras(T35A) in der
GppNHp-Form nach Titration mit cRaf-RBD. Ansteigende Mengen des Effektors bewirken bei Ras(T35S)
eine Verschiebung der Resonanzen des β-Phosphats des Nukleotids zugunsten der bindenden Konformation
von Ras (Zustand 2). Dieser Effekt tritt bei Ras(T35A) nicht auf.
Kinetische
Stopped-Flow
Experimente
mit
dem
fluoreszierenden
mGppNHp-
gebundenen Ras (methyl-anthraniloyl-Derivat des GppNHp) zeigten, daß Ras einen
Effektor in einem Zwei-Stufen Model bindet (ein schwach affiner Initialkomplex
isomerisiert zu dem finalen hoch affinen Komplex). In Abb. 7 sind die gemessenen
Daten graphisch dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß ein Alanin in Position 35, das
das Mg2+ nicht koordinieren kann, eine andere effektorbindende Konformation bildet.
Von Serin in Position 35 wird erwartet, daß es mit seiner Hydroxylgruppe das Ion
ähnlich wie Threonin koordinieren kann (Spoerner et al., 2001).
11
Abb. 7
Stopped-Flow Experimente der Ras-Mutanten T35S und T35A mit ansteigender Konzentration an cRafRBD; im Vergleich dazu ist Ras wt gezeigt. Die T35S-Mutante interagiert mit cRaf-RBD qualitativ ähnlich
dem wt-Protein. Ras(T35A) verhält sich anders, wobei keine Sättigung wie in den beiden anderen Fällen
eintritt.
Rap-Protein
Von allen kleinen GTPasen der Ras-Superfamilie weisen die Rap-Proteine die höchste
Sequenzhomologie zu Ras auf (52%), was den Namen Rap (Ras proximate) begründet.
Ähnlich
wie
Ras
findet
man
auch
Rap
in
zahlreichen
Organismen
aller
Organisationsstufen. Es hat gleichfalls eine essentielle Bedeutung für Wachstums- und
Differenzierungsvorgänge.
Die Rap Familie unterteilt sich in zwei Hauptgruppen Rap1 und Rap2. Jede dieser tritt
in zwei Isoformen A und B auf. Die Expression scheint gewebespezifisch zu sein; so
kommt Rap1A in Säugetieren vor allem im Gehirn vor. Die Rap-Proteine haben eine
identische Effektorregion (Reste 32-40), wobei Rap2 in einer einzigen Aminosäure von
Rap1-Effektorregion abweicht (Abb. 8).
Abb. 8
Aminosäuresequenz der Effektorregionen von Rap und Ras. Bis auf einen Rest in Rap2 stimmt die
Aminosäuresequenz bei den verschiedenen Proteinen im Bereich 32 bis 40 (Effektorregion) zu (fast) 100%
überein.
12
Funktionell können Rap1-Proteine als Ras Antagonisten agieren; Rap2 Proteine sind
dazu nicht fähig (Kitayama et al., 1989). Rap unterscheidet sich von Ras außerdem noch
in der Position 61; während Ras an dieser Stelle ein Glutamin aufweist, findet man bei
Rap Proteinen an dieser Stelle ein Threonin. Dieses Threonin ist verantwortlich für die
10-fach niedrigere GTPase-Aktivität (Frech et al., 1990).
Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen Ras und Rap ist beispielsweise an der
CaaX-Box des C-Terminus zu finden. Während Ras (Sequenz CVLS) hier eine
Farnesylierung aufweist, wird Rap1 (Sequenz CLLL)
geranylgeranyliert. Die
unterschiedliche Lipidmodifikation ist vermutlich der Grund für die verschiedene
Lokalisation der Proteine in der Zelle. Ras wird überwiegend an der Plasmamembran
gefunden,
die
Rap-Proteine
vornehmlich
in
den
Membranen
subzellulärer
Kompartimente wie dem Golgi-Komplex (Beranger et al., 1991).
Struktur und Funktion
Die Struktur von Rap1A wurde zunächst im Komplex mit der RBD der c-Raf-1-Kinase
bestimmt (Nassar et al., 1995). Dabei bestätigte sich die Ras-ähnliche Faltung. Auch
konnte der Mechanismus der GTP-Hydrolyse anhand der strukturellen Daten erklärt
werden (Horn, 1996)
Rap wurde 1989 als strukturell verwandtes Ras-Gen entdeckt, das in hohen
Konzentrationen Transformationen durch K-Ras umkehren konnte (Kitayama et al.,
1989), daher auch die synonyme Bezeichnung K-rev1. K-rev1 ist identisch mit Rap1,
das auf der Basis der Ras-Sequenzhomologie kloniert wurde (Kawata et al., 1988; Pizon
et al., 1988).
Zunächst vermutete man, daß Rap1A mit dem onkogenen Ras um einen gemeinsamen
Effektor konkurriert, wobei es sich z.B. um p120GAP oder cRaf-1-Kinase handeln
könnte. Je nach Bindungsaffinität würde der Signalweg des K-Ras, der zur
Zellentartung führt, dadurch praktisch inhibiert. Für die Blockade des Signalweges über
Ras und GAP sprach zudem ein Befund, wonach Ras-GAP mit hoher Affinität an
Rap1A binden soll, ohne die GTP-Hydrolyse zu stimulieren (Frech et al., 1990). Auf
der anderen Seite gab es Untersuchungen, nach denen die Affinität von Rap1A zu RasGAP nicht ausreichend wär, um Ras-GAP effektiv aus dem Gleichgewicht zu entfernen
(Horn, 1996). Zudem konnte mit Immunopräzipitationsassays keine Kolokalisation der
13
Proteine unter physiologischen Bedingungen in der Zelle gezeigt werden (Horn, 1996).
Diese Ergebnisse sprechen eher für eine negativ regulatorische Funktion des Rap1A.
Für Rap1 Proteine konnte dann gezeigt werden, daß sie an Ras Effektoren wie Raf
(Ruggieri et al., 1994; Zhang et al., 1993), P(I)3-Kinase (Marte et al., 1997) und
RalGDS (Spaargaren und Bischoff, 1994) binden. Mutationen innerhalb der Rap1A
Effektorschleife beeinträtigen die Bindung an Effektoren (Herrmann et al., 1996) und
die Fähigkeit, Transformationen durch Ras zu inhibieren (Kitayama et al., 1990). Es
sind bisher keine Mutationen bei Rap bekannt, die zu bösartigem Zellwachstum führen.
Effektoren
Wie bereits erwähnt, fungieren GTPasen als molekulare Schalter. Je nach gebundenem
Nukleotid
existieren
sie
in
einem
der
zwei
möglichen
Schalterstellungen
(Konformationen) – „an“ oder „aus“. Durch diese Fähigkeit, konformative Änderungen
zu durchlaufen, können sie ihre Affinitäten zu ihren Zielproteinen ändern. Diese
Zielproteine erfüllen vielfältige Aufgaben innerhalb der Zelle und haben vor allem
einen entscheidenden Effekt auf die Zellproliferation und Zelldifferenzierung.
GTPasen spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Krebs, da sie
vielfach das Ziel von Mutationen und mikrobiellen Toxinen sind (Bos, 1989). Es stellt
sich die Frage, warum und wie GTPasen (insbesondere Ras) Krebs verursachen können,
da in ca. 20-30% aller menschlichen Tumoren Ras-Mutationen gefunden werden. Wie
oben beschrieben ist Ras in der GTP gebundenen Form aktiv.
Proteine, die an der GTP gebundenen Form der GTPasen binden und auf die Zelle
einwirkende Signale über die GTPase an nachgeschaltete Proteine weiterleiten können,
nennt man Effektoren (McCormick und Wittinghofer, 1996). Diese müssen für eine
individuelle Signalweiterleitung spezifisch an die jeweilige GTPase binden.
Zahlreiche Effektoren von Ras wurden mittels geeigneter Techniken wie Hefe 2-Hybrid
und Säulen-Affinitätschromatographie aufgespürt. Dazu zählt neben den Proteinen cRaf-1-Kinase, Ras-GAP, RalGDS, Rin1, PI-3-K, Byr2, AF6 auch Nore1.
Ras interagiert mit verschiedenen Effektoren in evolutionär divergierenden Organismen
(Marshall, 1995, 1996). Aber auch innerhalb desselben Organismus, selbst in derselben
Zelle, interagiert Ras mit vielen Zielproteinen; da aktiviertes Ras zelluläre Antworten
induziert, die durch nur einen Effektor alleine nicht erwirkt werden können. So ist unter
14
anderem beschrieben worden, daß Ras unterschiedliche Pathways aktivieren (oder mit
ihnen interferieren) kann (s. Abb. 9). Verbindungen von Ras zu anderen Pathways
wurden für die Organisation des Aktincytoskeletts gezeigt, welche durch die Rho/Rac
Unterfamilie kontrolliert wird (Chang et al., 1994).
Evidenzen dafür liefert auch die Tatsache, daß verschiedene Reste in der Effektorregion
verantwortlich für die Aktivierung von verschiedenen Zielen zu sein scheinen. So
konnte u.a. gezeigt werden, daß die Ras Mutante Y40C zwar fähig ist, PI3-Kinase zu
aktivieren, Raf (und die nachgeschaltete MAPK Kaskade – den Ras-Raf-Pathway)
jedoch nicht mehr (Rodriguez-Viciana et al., 1997). Als konkreten Effekt konnte
Membranfuffling beobachtet werden, jedoch keine DNA Synthese; die T35S-Mutaion
hingegen aktiviert über Raf die MAP Kinase, aber stimuliert kein Membranruffling und
DNA Synthese (Joneson et al., 1996).
Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Mutantenpaar E37G und T35S (White et al.,
1995) erhalten. Hierbei interagiert Ras mit der Mutation E37G mit Byr2, einem
Effektormolekül in Schizosaccharomyces pombe, aber nicht mit Raf; wohingegen T35S
an Raf, aber nicht mehr an Byr2 bindet.
Diese als „Partial loss of function“ bezeichneten Mutationen untermauern die Tatsache,
daß Ras mehrere Zielproteine innerhalb einer Zelle hat.
Bereits bekannte Effektoren von Ras sind in Abb. 9 aufgeführt. Nore1 ist dabei das
1998 entdeckte Effektormolekül (s. auch weiter unten).
Abb. 9
Übersicht einer Auswahl von Effektoren, die mit Mitgliedern der Ras-Superfamilie interagieren. Dargestellt
ist neben der GTPase-Effektor-Interaktion noch der Pathway, der durch diese Interaktionen verfolgt wird.
15
Affinitäten
Die folgende Tabelle zeigt die Affinitätskonstanten der Bindung von Ras-Proteinen an
die RBDs ausgewählter Effektoren:
Die Werte zeigen, daß die Effektor-RBDs teilweise sehr unterschiedliche Affinitäten zu
verschiedenen Proteine der Ras-Familie haben. Besonders beim Vergleich von H-Ras
und Rap1A fallen deutliche Unterschiede auf. So bindet RalGDS mit 100fach höherer
Affinität an Rap1A als an H-Ras, während umgekehrt c-Raf mit 60fach höherer
Affinität an H-Ras als an Rap1A bindet (dieser Fall wird mit Kreuzspezifität
bezeichnet). Betrachtet man die Sequenzen der Effektorregionen der Ras- und RapProteine (Abb. 8), so ist die Effektorspezifität trotz der hohen Homologie untereinander
sehr erstaunlich.
Dies läßt vermuten, daß die spezifischen Wechselwirkungen stark von einzelnen
Aminosäuren abhängt.
KD (µM)
H-Ras
Rap1A
Rap2A
TC21
R-Ras
c-Raf
0,02
1,2
0,3
0,37
1,1
B-Raf
0,06
0,35
2,3
3,2
RalGDS
1,0
0,01
4,5
6,0
Byr2
0,48*
0,49*
0,68*
1,3*
AF-6
1,4
0,12
16*
16*
Tab. 1
1,0
3,7*
Die KD-Werte wurden mit Hilfe der GDI-Methode bestimmt (siehe Material und Methoden) bei 37°C, pH
7,4, 50mM Tris, 5mM MgCl2, (+100mM NaCl)* (Zusammenstellung nach C.Herrmann).
16
Der Nore1-Effektor
Entdeckung
Der NOvel Ras Effector (Nore1) ist ein 413 Aminosäuren großes Protein. Seine
Molekularmasse beträgt 46,4 kD, und es ist mit einem pI von 9,41 ein basisches
Polypeptid. Die Nore1/RasSF1 Genfamilie umfaßt fünf Mitglieder: Nore1, RasSF1, 2, 3
und Ad037.
Das Nore1-Protein wurde (1998) von Vavvas et al. in einem Hefe 2-Hybrid Assay mit
C-terminal verkürztem und konstitutiv aktivem RasG12V in einer Maus-T-Zellen
cDNA-Bank gefunden. Hierbei wurde eine 2,5 kb große cDNA isoliert. Die komplette
cDNA von 3 kb Größe wurde mit dem 2,5 kb großen Fragment als Vorlage bei der
Durchsuchung einer cDNA-Bank aus Mäusegehirn isoliert (Vavvas et al., 1998).
Die Nukleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz sind unter der
Zugriffsnummer AF053959 in der GenBank-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
abgelegt. In Abb. 10 ist die Aminosäuresequenz dargestellt. Vergleiche mit anderen
Effektoren von Ras und das Programm SMART (Schultz et al., 2000) ergab eine in
Abb. 10 dargestellte Sekundärstruktur von Nore1.
Abb. 10 Aminosäuresequenz und Sekundärstruktur von Nore1. Die einzelnen Domänen sind unterstrichen und
farblich gekennzeichnet; cyan: C1-Domäne, rot: RBD und grün: Coiled Coil-Domäne, die prolinreiche
Domäne ist der Übersicht halber nicht dargestellt.
17
Diese Domänenabfolge (verkürzt -----C1----RBD-----) existiert für eine Reihe von
Proteinen. In Tab. 2 sind Proteine dargestellt, die dieselbe Domänenabfolge wie Nore1
aufweisen.
-----C1----RBD-----
Organismus
Accession-Nr.
Nore1 *
mus musculus
O70407
Maxp1 *
rattus norvegicus
O35141
T24F1.3
caenorhabditis elegans
Q22744
RasSF1, Isoform B
homo sapiens
Q8WWV9
RasSF1, Isoform A *
homo sapiens
Q8WWV0
Ras association domain family
mus musculus
Q99MK9
pancreas-specific ras association (RalGDS/AF6) homo sapiens
domain family 1 protein, Isoform 1E
Q9NS22
cardiac-specific ras association (RalGDS/AF6)
domain family 1 protein, Isoform 1D
homo sapiens
Q9NS23
protein similar to protein interacting with GEF
homo sapiens
Q9BT995
Tab. 2
Proteine mit ähnlicher Domänenanordnung wie bei Nore1. Die Proteine, die mit * gekennzeichnet sind,
verfügen zusätzlich noch über eine C-terminale Coiled Coil Domäne.
In der Arbeit von Vavvas et al. wurde ebenfalls die Spezifität von Nore1 zu RasMutanten und Ras-verwandten Proteinen untersucht, mit dem Ergebnis, daß Nore1
exklusiv mit Ras und Rap1B interagiert. In einem Pull-Down Assay mit isoliertem
GST-Nore1 (188-413) und RasG12V, das entweder mit GTP-γ-S oder GDP-β-S beladen
wurde, konnte gezeigt werden, daß Nore1 exklusiv mit der GTP-Form des Ras-Proteins
interagiert und daß es durch EGF-Stimulation an Ras in vivo rekrutiert wird. Mittels des
2-Hybrid Systems wurde ebenfalls gezeigt, daß Nore1 an die onkogene Mutation
RasG12V bindet, jedoch nicht an die Effektorschleifenmutanten RasG12V, ∆P34,
D38A und Ras G12V, D38N, die bekannte Effektoren wie Raf nicht mehr binden und
somit eine Transformation der Zelle durch Ras behindern (Zhang et al., 1993).
Nore1 ist neben Raf-Kinase der zweite Ras-Effektor in Säugern, für den eine
Assoziation mit Ras in vivo nach Rezeptoraktivierung gezeigt wurde.
Diese
Eigenschaften
zeichnen
das
Nore1-Protein
Effektorprotein aus.
18
als
einem
physiologischen
Durch Northern Blot Experimente wurde gezeigt, daß Nore1 zu großen Anteilen im
Gehirn, Milz, Lunge und in der Leber exprimiert wird, zu geringeren Anteilen auch in
den Nieren, Skelettmuskulatur und in den Hoden.
Vorkommen:
Tab. 3
Gewebe
Nore1A
Nore2A =
RasSF1C
RasSF3
Gehirn
x
-
x
Hoden
x
-
x
Lunge
x
x
x
Milz
x
x
x
Leber
x
x
x
Skelettmuskulatur
x
x
x
Niere
x
-
x
Herz
(x)
-
x
Colon
-
-
x
Thymus
x
x
x
Plazenta
x
-
x
Leukozyten
-
x
x
Pankreas
x
-
x
Prostata
x
-
x
Ovarien
-
-
x
Expression von Nore1 und RasSF1 in verschiedenen Geweben (Northern Analysen). Nore1A: (Vavvas et
al., 1998); Nore1 1B : (Tommasi et al., 2002); RasSF1: (Dammann et al., 2000; Vos et al., 2000)
Nore1 hat keine detektierbare katalytische Domäne. Die einzigen aus der Primärstruktur
erkennbaren
Proteinmotive
sind
ein
potentielles
diacylglycerol-
und
phorbolesterbindendes Segment (Cystein-Histidin-reiches Segment; Zinkfingermotiv,
typisch für eine C1-Domäne; Aminosäuren 118-165: H-X13-C-X2-C-X2-C-X10-C-X2-CX4-H-X2-C-X7-C) in der Nähe des N-Terminus, eine Ras-bindende Domäne
(Aminosäuren 267-358) und eine Coiled-Coil Domäne (Aminosäuren 376-411) am CTerminus.
19
Der N-Terminus umfaßt fünf PXXP-Sequenzen (Aminosäuren 17-20: PEPP; 31-34:
PPPP; 34-37: PARP; 77-80: PVRP; 105-108: PQDP), welche mögliche SH3Domänenbindestellen sein können.
Die biologische Funktion von Nore1 ist bisher nicht bekannt. Anzeichen gibt es durch
Untersuchungen mit Nore1 in einem Two-Hybrid-Assay, daß Nore1 bei der Rasvermittelten Apoptose beteiligt ist (Khokhlatchev et al., 2002). Hierbei wurde MST1
(mammalian Ste20 Homolog) als direkter Interaktionspartner von Nore1 entdeckt und
ein möglicher Pathway nach Bindung an Ras-GTP postuliert.
Biologische Charakterisierung von Nore1-Effektor
Es
werden
zwei
mögliche
Mechanismen
hinter
der
Ras-vermittelten
Wachstumsinhibition postuliert. Zum einen können bestimmte Ras-Effektoren eine
duale Rolle spielen, bei der sie entweder eine wachstumsinduzierende oder –
inhibierende Funktion aufweisen. Dies scheint für Raf-1 der Fall zu sein. Hierbei kann
beobachtet werden, daß eine moderate Aktivierung Wachstum hervorruft, jedoch
exzessive, lang andauernde Aktivierung kann ein gehemmtes Wachstum und Alterung
verursachen (Sewing et al., 1997; Zhu et al., 1998). Zum anderen können bestimmte
Ras-Effektoren spezialisiert sein, Wachstum nur zu inhibieren. Solche Effektoren
würden demzufolge als Ras Tumorsuppressoren dienen. Als einen Vertreter dieser
Gruppe sei der Tumorsuppressor RASSF1 genannt. Dieser weist aufgrund von Sequenzvergleichen eine Ras-assoziierte (RA) Domäne auf und wird in den zwei
Hauptspleißvarianten A und C gebildet (Dammann et al., 2000). Die Expression von
RasSF1 ist häufig in Eierstocktumorzellinien herunterreguliert. Darüber hinaus konnte
gezeigt werden, daß die Spleißvariante C von RasSF1 das Ras in einer GTP-abhängigen
Weise bindet und eine wirksame, Ras-abhängige Apoptose vermittelt (Vos et al., 2000).
Nore1 bindet neben Ras noch das Ras-verwandte Rap-Protein (und vermutlich auch RRas). Diese GTPasen haben, wie bereits erwähnt, alle eine effektorbindende Domäne,
die sehr ähnlich der von Ras ist und eine ähnliche Auswahl von Proteinen in vivo
binden. Aus bisher noch nicht verstandenen Gründen haben diese Proteine verschiedene
biologische Wirkungen innerhalb der Zelle. Phosphoinositide-3-kinase (PI-3-kinase)
kann Apoptose in vielen Zellsystemen beständig verhindern, indem sie den Lipid
Second Messenger Phosphoinositid 3,4,5-P3 und Phosphoinositid 3,4-P2 und bildet.
20
Letzterer aktiviert die Serin/Threonin Proteinkinase Akt/PKB, deren Aktivierung zur
antiapoptotischen Wirkung beisteuert (Kauffmann-Zeh et al., 1997; Khwaja et al.,
1997).
Ein weiteres Ziel von Ras sind die Raf-Kinasen, die wirksam die Proliferation vieler
Zelltypen durch die Aktivierung der Raf/MEK/ERK-Kinasekaskade stimuliert.
Eine Reihe Veröffentlichungen geben Hinweise für die Existenz eines weiteren RasEffektor-Pathways, der das Zellüberleben negativ beeinflußt. Dies wäre der gegenteilige
Effekt von PI-3-Kinase, welche Apoptose verhindert. Dieser weitere Pathway
unterdrückt Ras-induzierte Onkogenese, indem Apoptose in transformierten Zellen
eingeleitet wird. Dieser neue Signalweg wird durch Interaktionen von Ras mit einem
Komplex aus Nore1 und MST1 (mammalian Ste20-like kinase) vermittelt.
Oligomerisierung von Nore1
Ortiz-Vega et al. (2002) konnten zeigen, daß Nore1 homodimerisieren kann. Diese
Fähigkeit liegt in dem N-terminalen Bereich (1-267), wobei der C-terminale Bereich
(251-413) sich nicht mit Nore1 fl. assoziiert. Die Fähigkeit von Nore1 mit RasSF1A zu
heterodimerisieren, wird durch den zu Nore1 nichthomologen N-terminalen Bereich von
RasSF1A vermittelt (1-119, von 330 Aminosäuren). Dieses Segment tritt nur bei der
Spleißvariante A von RasSF1 auf, Varianten B und C hingegen fehlt dieser Abschnitt.
Demzufolge kann nur RasSF1A ein Dimer mit Nore1 bilden.
Daneben besteht noch die Möglichkeit, daß Nore1 mit seinem prolinreichen NTerminus ein SH3-Domänen bindendes Protein ist.
Nore1 Homologe
Datenbankanalysen mit dem Programm BLAST resultierten in einem homologen
Protein der Hefe C. elegans T24F1.3. Dieses 615 Aminosäuren großes Protein enthält
ein eigenes N-terminales Segment, ein zentrales C1-Zinkfinger Motiv und eine putative
RA-Domäne (40% Ähnlichkeit zu Nore1).
Fast zeitgleich wurde zu Maus-Nore1 ein Rattenhomolog (Maxp1) gefunden.
(DeCamilli, 1997, unveröffentlicht, Accession-Nr. AAB71821)
21
Zudem ist Nore1 in seiner Primärstruktur am meisten verwandt mit einer Familie von
humanen Polypeptiden, die durch das RASSF1-Gen kodiert werden (Dammann et al.,
2000). Fünf Spleißvarianten von RASSF1 wurden bisher berichtet, die für Proteine mit
einer Länge von 189 bis 344 Aminosäuren kodieren. Die drei längsten Isoformen A, D
und E (340, 344 und 344 Aminosäuren) enthalten jeweils ein zentrales C1-Zinkfinger
Motiv N-terminal vor einer RA-Domäne und sind annäherungsweise zu 50% identisch
(75% ähnlich) zu den C-terminalen 300 Aminosäuren von Nore1.
Die 270 Aminosäuren große Isoform RasSF1C ist identisch in ihrem C-terminalen 221
Aminosäure langen Bereich mit den längeren RasSF1 Polypeptiden, weist aber ein
eigenes 49 Aminosäuren langes N-terminales Segment auf; RasSF1C fehlt das C1Motiv, besitzt aber wie die anderen Isoformen die RA-Domäne (Abb. 11).
Abb. 11 Übersicht der mit Nore1 alignten Sekundärstrukturen von RasSF1A, C und T24F1.3. Die
Sequenzähnlichkeiten für die RA-Domäne sind ebenfalls mit angegeben.
Protein-Domänen von Ras-Effektoren
Eine Domäne ist definiert als eine unabhängige strukturelle Einheit, die entweder
alleine, in Verbindung mit anderen Domänen oder sich wiederholend auftritt.
Die verschiedenen Effektoren von Ras (und dessen Homologe) weisen keinerlei
Homologie auf und enthalten teilweise eine Vielzahl unterschiedlicher Domänen.
22
Obwohl die Struktur einer Domäne meist nicht bekannt ist, ist es dennoch oftmals
möglich, die Domänen alleine aufgrund ihrer Sequenz zu definieren (Überblick s. Abb.
12).
Abb. 12 Überblick über Ras-Effektoren. Dargestellt sind die Domänenstrukturen ausgewählter Effektoren. Die
Domänengrenzen wurden zum Teil mit dem Programm SMART und zum Teil experimentell bestimmt.
Im folgenden sollen die RBD sowie die in Nore1 enthaltenen C1- und Coiled CoilDomänen eingehender dargestellt werden.
23
Rasbindende Domäne (RBD)
Die einzige Domäne, die allen Effektoren gleich ist, ist die Ras bindende
Domäne (RBD). Ras-GTP interagiert über diese mit den Effektoren.
Hochaufgelöste Strukturen der rasbindenden Domäne existieren für RafRBD, Rgl-RBD, Rlf-RBD, RalGDS-RBD, PI(3)-Kinase, Byr2-RBD und AF6-RBD.
Diese Strukturen weisen eine gemeinsame Faltung auf, die der von Ubiquitin ähnelt.
Aus diesem Grund wird diese Faltungsklasse Ubiquinfaltung genannt. Charakteristisch
ist die lineare Abfolge von fünf β-Strängen, flankiert von zwei α-Helices nach dem
Schema ββαββαβ. Bei Byr2 und AF6 existiert eine zusätzliche α-Helix am C-, bzw. am
N-Terminus, deren Funktion noch unbekannt ist. Von G. Steiner wurde in seiner
Dissertation (2001) versucht zu zeigen, daß diese zusätzliche Helix bei AF6 die
Spezifität zur GTPase Rap1A ausmacht. Das gemischte β-Faltblatt bisher bekannter
RBD’s ist in folgender Form angeordnet.
Abb. 13 Lineare Abfolge der 5 β-Stränge innerhalb der Ubiquitin-Faltung, zu deren Faltungsklasse die bisher
bekannten RBD’s gehören.
RBD’s unterschiedlicher Effektoren zeigen oftmals sehr geringe Sequenzhomologien
untereinander; auch die Größe der RBD’s variiert zwischen 70 und 160 Aminosäuren.
Tab. 4 faßt die bisher strukturell charakterisierten RBD’s zusammen.
24
NMR
PDBCode
Röntgenstruktur
PDBCode
Raf-1
Emerson et al.(1995)
Terada et al. (1999)
1RFA
1RRB
Nassar et al. (1995)
Nassar et al.(1996)
1C1Y
1GUA
Rgl
Kigawa et al. (1998)
1EF5
Rlf
Esser et al. (1998)
1RLF
RalGDS
Geyer et al. (1997)
Mueller et al. (1999)
2RGF
1RAX
Huang et al. (1997)
1LXD
Byr2
Gronwald
(2001)
et
AF6
Steiner (2001)
al.
1I35
et
al.
1K8R
---
P(I)3Kinase
Tab. 4
Scheffzek
(2001)
Pacold et al. (2000)
1HE8
Zusammenfassung bisher strukturell charakterisierte RBD’s. Die Struktur einiger Domänen sind sowohl
durch NMR als auch röntgenkristallographisch gelöst worden. Der PDB-Code ist mit angegeben.
Die minimale RBD von Nore1 umfaßt die Reste 198-358 (160 Aminosäuren) und ist
somit die längste RBD unter den oben genannten RBD’s, und es ist daher nicht von
vornherein von einer identischen Faltung auszugehen. Es wird vermutet, daß Nore1
zusätzliche Strukturelemente N-, bzw. C-terminal, oder Insertionen innerhalb der RBD
besitzen
muß.
Ein
Alignment
mit
AF6-RBD
(1-141)
liefert
die
beste
Sequenzhomologie. Hierbei ist deutlich eine Insertion von Rest 254-281 zu erkennen
(Abb. 14).
Abb. 14 Alignment von Nore1-RBD und AF6-RBD. Konservierte Reste sind rot dargestellt, chemisch äquivalente
Reste sind grün markiert. Nicht-alignte Reste sind blau markiert.
25
Cysteinreiche Domäne (C1)
Eine weitere wichtige Domäne ist die zinkbindende Domäne, die bei der
Proteinkinase C als konservierte Region 1 (C1) gefunden wurde.
Einige C1-Domänen sind als Akzeptoren für Phorbolester (PE) und
Diazylglycerol (DAG) beschrieben worden (Nishizuka, 1984; 1992; 1995) andere
wurden als Interaktionspartner von RasGTP (Brtva et al., 1995) beschrieben worden.
DAG ist ein wichtiger Botenstoff (Second Messenger). Phorbolester sind Analoge des
DAG
und
starke
Tumorpromotoren,
die
eine
Vielfalt
von
physiologischen
Veränderungen bewirken, sobald sie Zellen und Geweben angeboten werden. DAG
aktiviert eine Familie von Serin/Threonin-Kinasen, zusammengefaßt bekannt als
Proteinkinase C (PKC). PE können PKC direkt stimulieren. Von der N-terminalen
Region von PKC, bekannt als C1, wurde gezeigt, daß sie PE und DAG in einer
phospholipid- und zinkabhängigen Art binden. Die C1-Region enthält eine oder zwei
Kopien (abhängig von dem Isozym der PKC) cysteinreicher Domänen von ca. 50
Aminosäuren Länge, die essentiell für die DAG/PE-Bindung sind. Die DAG/PEbindende Domäne bindet zwei Zinkionen Die Liganden dieser Metallionen sind
konservierte Reste (sechs Cysteine und zwei Histidine).
Typisch für eine C1-Domäne ist das Motiv H-X13-C-X2-C-X2-C-X10-C-X2-C-X4-H-X2-CX7-C.
Coiled-Coil Domäne (CC)
Coiled-Coils sind ein generell auftretendes Oligomerisationsmotiv im
Interface zwischen separierten Proteienketten. Sie finden sich in vielen
cytoskelettären
und
kontraktilen
Systemen
(zum
Beispiel
Intermediatfilamente, Kern-Lamine und Mysosine), Transkriptionsregulatoren (wie zum
Beispiel Myc und Max, Fos und Jun, GCN4), viralen Hüllenproteinen (wie zum
Beispiel MoMLV, HIV, SIV und Influenza) und anderen Systemen (Cohen und Parry,
1994) wieder. In ihrer Rolle als Mediatoren der Proteinkomplexierung verrichten sie
vielfältige Funktionen, die strukturelle Unterstützung (α-Keratin, Actin, usw.), DNABindung (bZIP Transkriptionsfaktor), Rezeptoroligomerisierung (Mannose bindendes
Protein) und Membranfusion (HIV, Influenza, usw.) umfassen.
26
Analyse von Genomdatenbanken mit Coiled-Coil Vorhersageprogrammen sagen
voraus, daß 3-5% aller Proteinreste als Coiled-Coils existieren (Wolf et al., 1997).
Coiled-Coil Strukturen können sowohl homo- als auch heterotypisch auftreten. Dabei
lagern sich die Helices parallel oder antiparallel aneinander. Letzteres findet sich
besonders bei Intraketten-Coiled-Coils wieder (bekannt als anti-paralleles Helix-LoopHelix-Motiv). Coiled-Coils können sich zu Di-, Tri-, Tetra- oder Pentameren anlagern.
Beispiele hierfür sind Intermediatfilamente (Steinert, 1993), der SNARE-Komplex
(Sutton et al., 1998) und die Spindelpolkörperchen (Wigge et al., 1998).
Die präzise Verzahnung der Seitenketten im Interface wird erreicht, indem sich die
rechtshändigen α Helices linkshändig winden und ein Supercoil ausbilden. Da das
Heptad-Muster etwas kürzer als 2 komplette Windungen einer regulären α-Helix ist,
winden sich die a- (und d-) Positionen um die α-Helix-Oberfläche in entgegengesetzter
Richtung zum „Twist“ der Helix. Dieses Phänomen wird als Supercoiling bezeichnet
und ist für ein kontinuierliches Interface Bedingung. Dies hat eine Reduktion der
Periodizität von ungefähr 3,6 bis 3,5 Resten pro Windung im Bezug auf die
Supercoilachse zur Folge. Diese Reduktion wird in jedem siebenten Rest erreicht. Diese
sieben strukturellen Positionen werden a bis g bezeichnet. Die Positionen a und d
werden (in den allermeisten Fällen) von hydrophoben Resten besetzt und bilden das
Helix Interface, indem sie einen hydrophoben Streifen auf der Helix bilden. Positionen
b, c, e, f und g sind oft hydrophil (e und g werden oft von geladenen Aminosäuren
besetzt (Akey et al., 2001)) und bilden den lösungsmittelexponierten Teil der
Helixoberfläche (Abb. 15). Die Sequenzen von Coiled-Coil Proteinen zeigen
demzufolge
eine
Heptad-Periodizität,
(abcdefg)n.
Dieses
Heptad-Muster
von
alternierenden hydrophilen und hydrophoben Resten kann zur Detektion von CoiledCoils in Proteinen verwendet werden. Trotz der weiten Verbreitung von hydrophoben
Resten sind ca. 20% der a und d Reste polar oder geladen (Berger et al., 1995; Cohen
und Parry, 1994; Lupas et al., 1991; Parry, 1982; Wolf et al., 1997; Woolfson und
Alber, 1995).
27
Abb. 15 Schematische Ansicht eines parallelen dimeren Coiled Coils. Die a- und d-Positionen sind rot und die eund g-Positionen blau gekennzeichnet.
Einige Motive für die Oligomerisierung und Helix-Orientierung wurden bisher
charakterisiert. So beeinflußt die Besetzung der a- und d-Positionen (Harbury et al.,
1993; 1994; Woolfson und Alber, 1995) stark die Oligomerisierung. Elektrostatische
Wechselwirkungen zwischen Seitenketten der e- und g-Positionen von benachbarten
Helices dienen der spezifischen Bindung von Interaktionspartnern (Kohn et al., 1998;
O'Shea et al., 1992; Vinson et al., 1993). Noch fast vollkommen unverstanden sind die
Determinanten für die Anzahl und Art (homo- oder heterotypisch) der Partner-Helices.
Die Interaktion zwischen den Helices wird als Knopf/Loch-Packung bezeichnet (Crick,
1953). Hierbei verflechten sich zwei Helices mit Heptad-Repetitionen über einen
unbestimmten Bereich (Abb. 16). Jeder erste und vierte Rest eines Heptads repräsentiert
einen Knopf,
der
sich in ein rautenförmiges Loch aus vier
Resten der
gegenüberliegenden Helix einpaßt. Drei der vier Reste dieses Lochs sind selbst Knöpfe,
so daß eine komplementäre Struktur resultiert. Diese Eigenschaft des Interfaces weicht
vom generellen Modell der α-Helix-Packung in globulären Domänen ab (Chothia et al.,
1981).
28
Abb. 16 Darstellung des helicalen Netzes eines Coiled-Coil Interface (Crick, 1953). Die linken beiden Bilder zeigen
die externen Oberflächen von zwei identischen α-Helices, mit den relativen Positionen der Cα-Atome. Die
a- und d-Positionen sind hervorgehoben und für jede Helix durch einen ausgehüllten und gefüllten Kreis
symbolisiert. Die restlichen Positionen sind als Punkte und Kreuze dargestellt. Das rechte Diagramm zeigt
das verflochtene Muster bei Interaktion, wenn die beiden Oberflächen sich gegenüberstehen. In blau
dargestellt ist das Loch, das durch vier Reste der dem Knopf gegenüberliegenden Helix gebildet wird.
29
Diskontinuitäten im Heptad-Motiv
Im allgemeinen sind Coiled Coil Strukturen sehr geordnete Strukturen, jedoch existieren
nur wenige solcher Strukturen ohne jegliche Diskontinuitäten.
Diese Diskontinuitäten können in vier Hauptgruppen unterteilt werden:
1.
2.
3.
4.
Nicht-helikale Regionen
Auslassung von drei Resten (Stutter)
Auslassung von vier Resten (Stammer)
Insertion zusätzlicher Reste (Skip)
Nicht-helikale Regionen variieren in ihre Größe von wenigen Resten bis zu ganzen
Unterdomänen und verleihen den Coiled Coil segmentiertes Aussehen. Ein Beispiel
hierfür sind Intermediatfilamente.
Die Auslassung von drei Resten aus dem Heptad-Muster bewirkt eine lokale Abnahme
der Supercoil-Ausbildung, da diese Auslassung weniger als eine volle Windung der
Helix verursachen.
Die Auslassung von vier Resten aus dem Heptad-Muster bewirkt das Gegenteil von den
Stutter. So nimmt die lokale Supercoil-Ausbildung zu und bewirkt eine Erhöhung der
Helixwindung.
Skips mit Insertion von einem Rest entsprechen mathematisch zwei Stutter, da eine
Auslassung von n Resten einer Insertion von 7-n Resten entspricht. Skips können
Knicke in Helices verursachen. Obwohl die Core-Interaktionen weitestgehend regulär
bleiben, sind die Abstände zwischen den interagierenden Resten erhöht.
In Abb. 17 gibt einen graphischen Überblick über die Situation im Falle eines Stutters.
30
Abb. 17 Helix-Netz-Diagramme, die den Stutter-Typ im Vergleich mit einem kontinuierlichen Heptad darstellt. Der
N-Terminus befindet sich links unten. Die durchgezogene Linie folgt dem Verlauf der hydrophoben Reste
(durch H gekennzeichnet). A repräsentiert ein perfektes Heptadmotiv innerhalb einer Coiled Coil. B zeigt
eine Diskontinuität im Heptadmotiv (Stutter). Hier taucht eine Deletion von drei Resten auf (was
gleichzeitig einer Insertion von vier Resten entspricht). Die gestrichelte Linie zeigt hier den theoretischen
Verlauf der hydrophoben Reste. Der Winkel, der sich zwischen dem idealen und dem abweichenden
Verlauf ergibt, wird Azimutatwinkel (ϑ) genannt, die Verschiebung vom idealen Fall dementsprechend
Azimutat-Verschiebung.
31
Zielsetzung der Arbeit
Kleine GTP-bindende Proteine sind ein essentieller Bestandteil der zellulären
Signaltransduktion. Die Bindung von GDP oder GTP durch diese GTPasen befähigt sie,
in regulierter Weise zwischen mehreren Konformationen mit unterschiedlichen
biologischen Eigenschaften zu wechseln. Die GTP gebundene Form wird als aktiver
Zustand bezeichnet und nur dieser bindet spezifisch weitere Proteine (Effektoren), die
daraufhin ebenfalls aktiviert werden, oder die Aktivierung weiterer Zielproteine
vermitteln.
Die Untersuchung der Interaktionen zwischen den GTPasen und den Effektoren ist
gerade im Hinblick auf die Differenzierung und Transformation einer Zelle wichtig.
Unter bestimmten Umständen (z. B. durch Mutationen) kann dieses regulierte
Interaktionsgleichgewicht gestört werden und die Zelle entartet. In den meisten Fällen
sorgen zelleigene Programme (Degradation von Proteinen, gezielte Inhibition bis hin zu
Apoptose) für die Beseitigung derartiger Mißfunktionen.
Einer der Ras-Effektoren ist Nore1, ein Protein mit keiner enzymatischen Aktivität.
Jedoch wurde für Nore1 kürzlich eine Funktion in Apoptose gezeigt.
Ziel dieser Arbeit ist die biochemische und strukturelle Charakterisierung dieses
Proteins.
An Anfang steht die Charakterisierung der Spezifität von Nore1, bzw. von Fragmenten
von Nore1, zu verschiedenen GTPasen. Durch die Herstellung und biochemische
Charakterisierung von gezielten Punktmutationen sollen die Rolle von verschiedenen
Regionen des Proteins in Bezug auf die Bindung an Ras untersucht werden und einen
Vergleich mit bereits charakterisierten Effektoren ermöglichen.
Die biochemische und strukturelle Charakterisierung der einzelnen Proteindomänen von
Nore1 ist Bestandteil dieser Arbeit. Dazu wurde mit verschiedenen Techniken
(thermodynamische und spektroskopische Methoden) die mögliche Funktion einzelner
Proteindomänen und deren Struktur untersucht. Dazu ist u. a. die dreidimensionale
Struktur einzelner Nore1-Domänen sowohl isoliert, als auch im Komplex mit
Interaktionspartner mittels Röntgenkristallographie und NMR aufzuklären.
Da Nore1 keine enzymatische Aktivität aufweist, liegt die Frage nach dessen Funktion
nahe. Um diese Frage in Ansätzen beantworten zu können, werden in einem Hefe-2Hybrid-Screen Interaktionspartner von Nore1 gesucht. Diese Interaktionspartner gilt es
32
dann zu charakterisieren; sowohl deren Interaktion mit Nore1 zu quantifizieren, als auch
deren mögliche Rolle in einem GTPase-Nore1-Pathway zu beleuchten.
Eine bereits postulierte Funktion von Nore1 als Adapterprotein innerhalb eines
Pathways, welcher Apoptose einleitet, sollte durch strukturelle und theoretische
Überlegungen verifiziert werden.
33
Materialien
Chemikalien
Alle Chemikalien wurden in höchster Reinheit von verschiedenen Firmen geliefert:
Acetonitril, Acrylamid (AppliChem), Agar-Agar, Agarose (Gibco Brl, Life
Technologies), Ampicillin (Angewandte Gentechnologie Systeme GmbH), APS =
Ammoniumperoxidsulfat (Merck), Bradford Reagenz (Coomassie Protein Assay Plus
Reagens, Pierce, USA), Bromphenolblau, BSA = Rinderserumalbumin,
Chloramphenicol, Coomassie brillant blue G250 und R250 (Serva), Desoxynukleosid5’Triphosphate, Dextranblau-Lösung, DMSO = Dimethylsulfoxid, DTE =
Dithioerythrol (Gerbu Biotechnik GmbH, D), EDTA = Ethylendiamin-N,N,N’,N’Tetraessigsäure-Dinatriumsalz (Gerbu Biotechnik GmbH, D), Essigsäure (Riedel-de
Haën, D), Ethanol 100 %, Ethanol, Ethidiumbromid, GDP = Guanosindiphosphat
(Pharma Waldorf), Glycerin, HCl, Isopropanol (J. T. Baker, NL), IPTG = Isopropyl-βD-Thiogalactopyranosid, Liciumacetat, Natriumacetat (Fluka), Natriumchlorid,
Natriumhydroxid (J. T. Baker, NL), NaN3 = Natrium-Azid, PEG 3350 & 8000 =
Polyethylenglycol (Fluka), PMSF = Phenylmethansulfonylfluorid, SDS =
Natriumdodecylsulfat (Gerbu Biotechnik GmbH, D), Sucrose, TBA-Br =
Tetrabutylammonium-Bromid), TEMED = N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin
(Serva), Tricin, Tris = Tris (-hydroxymethyl-) aminomethan (Roth), Triton X-100,
Xylen-Cyanol, Zinkchlorid (Sigma)
Enzyme
Restriktionsenzyme (New England Biolabs, Schwalbach), Pfu-Polymerase (Stratagene),
Taq-Polymerase, Thrombin (Serva), T4 DNA-Ligase (New England Biolabs,
Schwalbach)
34
Gebrauchswaren
Geräte und Materialien
Gelfiltration (FPLC):
Pharmacia Biotech, Säule: Superdex 75
„prep-grade“ (Amersham-Pharmacia,
Freiburg)
GSH-Affinitäts-Chromatographie (FPLC): Pharmacia Biotech, Säule: Sepharose
Superflow (Amersham-Pharmacia,
Freiburg)
HPLC:
Mechanischer Zellaufschluß:
PCR:
Protein-Aufkonzentration:
Zentrifugen:
Gelelektrophorese:
ITC
DSC
Fluoreszenzspektrometer
Quarzküvetten
Inkubationsschüttler
Rotoren
Tischzentrifuge
Zentrifugen
Detektor
Röntgenanode
110B Solvent Delivery Module, Beckman,
Säule: ODS-Hypersil C-18 Ultrasphere 5
µm RP (0,4 x 25 cm) (Abimed)
Nucleosin 100 C18 Vorsäule, Bischoff,
Leonberg
Sonifier 450, Branson Ultrasonics,
Danburry, USA
Biometra TRIO-Thermoblock (Göttingen)
VivaSpin 10 kD, 30 kD (Millipore, USA)
Beckmann, Eppendorf, Hettich
Mini-Protean II (BioRad)
MCS
ITC
Kalorimeter,
MicroCal,
Northhampton, Massachusetts, USA
VP-DSC Microkalorimeter, MicroCal,
Northhampton, Massachusetts, USA
LS50B Spektrometer, Perkin Elmer und
FluoroMax-II-Spektrofluorometer,
Spex
Industries, Inc., Edison, NJ, USA
0,5x1,0 cm Quarzküvetten, Hellma,
Müllheim, Baden
Multitron, Infors AG, Bottmingen, Schweiz
JA10, JA12, JA30.5, Beckman, Palo Alto,
USA
5410 C, Eppendorf, Hamburg
JS-HC, JS-HS und Avanti J-301, Beckman,
Palo Alto, USA
MAR 345 Image Plate System, X-Ray
Research GmbH, Norderstedt
Rotating Anode von Nonius (CuKαRöntgenstrahlen, λ = 1,54179 Å)
35
Puffer und Stammlösungen
Lösungen für den routinemäßigen Gebrauch wurden stets frisch angesetzt oder von
einer Stammlösung frisch verdünnt. Die benötigten Chemikalien wurden den
Erfordernissen gemäß in Milipore Wasser gelöst und nach Bedarf autoklaviert oder
steril filtriert.
Acrylamid-Stammlösung
30% Acrylamid
0,8% Bisacrylamid
gebrauchsfertig bezogen von
AppliChem, Darmstadt
Anodenpuffer (10x)
242, 25 g Tris ad 1 l
pH 8,9 (einzustellen mit HCl)
Bindepuffer für GST-Pulldown
50 mM K-Phosphatpuffer, pH 7,5
100 mM KCl
10% Glycerol
0,1% Triton-X-100
BU-Salz (10x)
70 g/l Na2HPO4 7 H2O
30 g/l NaH2PO4
pH 7,0
Dextranblau
0,2 % SDS
200 mM EDTA
Spatelspitze Dextranblau
pH 7,0
DNA-Probenpuffer
40 % Sucrose
0,1 % Xylen-Cyanol FF
5 mM EDTA, pH 8,0
dNTP-Mix (25 mM)
100 mM dATP
100 mM dGTP
100 mM dCTP
100 mM dTTP
36
Entfärbelösung für Gele
10% Ethanol
in A. dest.
Färbelösung für Gele
40 % Ethanol 100 %
0,5 % Coomassie brillant blue G250
0,5 % Coomassie brillant blue R250
in A. dest.
Glycerin Stock
300 µl Bakterien in Kulturmedium
700 µl Glycerin (autoklaviert)
Lagerung bei –80°C
GSH-Puffer:
1x Puffer X, 20 mM Glutathion
(reduziert)
GSH+-Puffer:
1x Puffer X, 20 mM Glutathion
(reduziert), 100 mM NaCl
HPLC-Puffer
32,2 g Tetrabutylammoniumbromid
(TBA-Br)
57,48 g K2HPO4
93,25 g KH2PO4
0,13 g NaN3
pH 6,5 ad 10 L
7,5 %, bzw. 20% Acetonitril
Kathodenpuffer (10x)
121,2 g Tris
180 g Tricin
10 g SDS
0,1 g NaN3 ad 1 l
pH 8,25
Laemmli Probenpuffer (5x)
12,5 ml Puffer 1
2,5 g SDS
12,5 ml Glycerin
Bromphenolblau
Lachs-Spermien-DNA
9 mg/ml
Ligationspuffer (10x)
600 mM Tris-HCl (pH 7,5)
80 mM MgCl2
100 mM DTT
37
Lithiumacetat (1 M)
100 mM LiAc
pH 7,8 (einzustellen mit Essigsäure)
steril filtrieren
PBS (10x)
130 mM NaCl
7 mM Na2HPO4
4 mM NaH2PO4
PMSF (100 mM)
gelöst in Ethanol
Terminator-Mix (BigDyeTerminator Kit, ABI)
1,58 µM A-DyeDesoxy
47,37 µM C-DyeDesoxy
0,42 µM GdyeDesoxy
94,74 µM T-DyeDesoxy
15,79 µM dATP
15,79 µM dCTP
15,79 µM dTTP
78,95 µM dGTP
168,42 mM Tris-HCl, pH 9,0
4,21 mM Ammoniumsulfat
42,1 mM Magnesiumchlorid
0,42 U/µl AmpliTaqFS-DNA-
Polymerase
TAE-Puffer (50x)
242 g Tris
57,1 ml Essigsäure
100 ml EDTA 0,5 M
pH 8,0
ad 1 l A. dest.
TE-Puffer (10x)
100 mM Tris
50 mM EDTA
pH 7,75 (einzustellen mit 25 % HCl)
autoklavieren
TSS-Puffer
10 % PEG 8000
5 % DMSO
50 mM MgCl2
auf gewünschtes Volumen mit LB
ohne NaOH pH 6,5 auffüllen
38
Waschpuffer für GST-Pulldown
50 mM K-Phosphatpuffer, pH 7.5
100 mM KCl
X-Gal
20 mg/ml in N,N-Dimethylform
amid (DMF)
Z-Puffer
60 mM Na2HPO4
40 mM NaH2PO4
10 mM KCl
1 mM MgSO4
PEG 3350 (50 %)
50 g PEG 3350
ad 100 ml A. dest.
Puffer 1
(Two-Hybrid)
1 ml 1 M LiAc
1 ml 10 x TE
8 ml A. dest.
Puffer 2
(Two-Hybrid)
1 ml 1 M LiAc
1 ml 10 x TE
8 ml 50 % PEG 3350
Puffer X (10x)
500 mM TrisHCl
50 mM MgCl2
1 mM NaN3
pH 7,4
SDS Probenpuffer (5x)
(für Protein-Marker)
50 ml Tris (200 mM, pH 6,8)
15 ml Glycerin
1,2 g SDS
0,06 g Bromphenolblau
10 mM DTE
Reagenzienkits
„QIAprep Spin Miniprep Kit“:
„QIAfilter Plasmid Midi Kit“:
„QIAfilter Plasmid Maxi Kit“:
„QIAquick Gel Extraction Kit“:
Qiagen (Hilden)
Qiagen (Hilden)
Qiagen (Hilden)
Qiagen (Hilden)
39
Medien, Antibiotika und Agarplatten
Medien für Bakterien
LB-Medium (Luria-Bertani Medium)
1% Trypton
0,5% Hefeextrakt
0,5% NaCl
pH 7,5 mit NaOH
Das Medium wurde mit A. dest. aufgefüllt und autoklaviert und bei 4°C gelagert.
Antibiotika werden bis zur gewünschten Endkonzentration (100 µg/ml Ampicillin, 50
µg/ml Kanamycin oder 25 µg/ml Chloramphenicol) nach Sterilfiltration nach dem
Autoklavieren hinzugegeben.
LB-Agar Medium
LB-Medium
1,5% Agar
TB-Medium (Terrific Broth)
1,2% Bacto-Trypton
2,4% Bacto-Hefe-Extrakt
0,4% Glycerin
17 mM KH2PO4
72 mM K2HPO4
Standard-I-Medium:
25 g/l Standard-Fertigmedium (Merck, Darmstadt)
Minimalmedium für Seleo-L-Methionin Kultur
28/5 g/l K2HPO4
8/5 g/l KH2PO4
4/5 g/l (NH4)2SO4
1/5 g/l Na Citrat
40
0,4/5 g/l MgSO4-7H2O
32 mM Glucose
32 mg/l Thiamin
32 mg/l Thymin
50 mg/l Seleno-L-Methionin
200 ml Aminosäurelösung
Aminosäurelösung (pH 7,5)
je 0,2 g/l
je 0,5 g/l
Alanin
Arginin
Asparagin
Cystein
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Prolin
Serin
Tryptophan
Tyrosin
Glutamin
Asparaginsäure
Isoleucin
Leucin
Lysin
Phenylalanin
Threonin
Valin
Medien für Hefen
YPD-Medium (Vollmedium)
20 g/l BactoPeptonE
10 g/l Hefeextrakt
2% Glucose
18 g/l Agar (bei festem Nährmedium)
pH 5,8
YPDAD-Medium
41
YPD-Medium
0,1 g/l Adenin
Minimalmedium
1,2 g/l Hefe-Nitrogen-Extrakt ohne Aminosäuren oder Ammoniumsulfat
5 g/l Ammoniumsulfat
10 g/l Succinat
6 g/l NaOH
40 ml/l 50% Glucose
1fach konzentrierte Mangel-Nährlösung
Mangel-Nährlösung
je 0,1 g/l
je 0,05 g/l
Adenin
L-Arginin
L-Cystein
L-Leucin
L-Lysin
L-Threonin
L-Tryptophan
Uracil
L-Asparaginsäure
L-Histidin
L-Isoleucin
L-Methionin
L-Phenylalanin
L-Prolin
L-Serin
L-Tyrosin
L-Valin
Hefeselektionsmedium UTLMinimalmedium ohne Uracil, Tryptophan und Leucin
Hefeselektionsmedium UTLyMinimalmedium ohne Uracil, Tryptophan und Lysin
42
Hefeselektionsmedium THULLyMinimalmedium ohne Uracil, Tryptophan, Leucin, Lysin und Histidin
10-25 mM 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT)
Antibiotika
Von den verwendeten Antibiotika wurden Stammlösungen angelegt, steril filtriert und
bei –20°C gelagert. Die gewünschten Antibiotika wurden den Medien erst nach dem
Autoklavieren zugegeben.
Stammlösung
Ampicillin (Amp)
gelöst in
100 mg/ml H2O
Endkonzentration
100 µg/ml
Chloramphenicol (Cam)
10 mg/ml Isopropanol
25 µg/ml
Kanamycin (Kan)
25 mg/ml H2O
50 µg/ml
X-Gal-Agarplatten
Zur Herstellung von X-Gal-Platten (Blau-Weiß-Selektion) wurden dem THULLyMedium Agar, X-Gal (80 mg/l) und BU-Salz (1x) in entsprechenden Konzentrationen
zugegeben und in Petrischalen gegossen. Die Platten wurden bei 4°C gelagert. Das BUSalz sorgt dafür, daß das Medium einen pH von 7,0 konstant hält; dies ist der optimale
pH-Wert für die β-Galactosidase. Daneben liefert es das nötige Phosphat für den
Galactosidase Assay.
Verwendete Bakterien- und Hefestämme, Vektoren,
Oligonukleotide, Bibliotheken und Datenbanken
Bakterien- und Hefestämme
Aufbewahrung und Amplifikation von Plasmid-DNA erfolgte in Bakterien (TG1). Zur
Protein-Expression wurden verschiedenen im folgenden Aufgeführte Bakterienstämme
verwendet.
BL21(DE3)
Escherichia coli
F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), dcm, gal (λcIts857, ind1, Sam7,
nin5, lacUV5-T7 gene1) (DE3)
Studier, 1986
43
TG1
XL1-Blue
L40
Escherichia coli
K12, ∆(lac-pro), supE, thi, hsd∆5, [F-, traD36, proAB+,
lacIq, lacZ∆M15] Gibson, 1984
Escherichia coli
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’
proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]
Stratagene
Saccharomyces cerevisiae
MATa, trp1-901, leu, leu2-3, his3-200, 112 ade2
Lys2::(lexAop) 4-HIS3 URA::(lexAop)8-lacZ GAL4
gal80 Vojtek, 1993
Vektoren
Plasmid
Größe
in kb
Charakteristika
pBTM116
~5,6
Klonierungsvektor, Shuttle-Vektor, AmpResistenz, Köderplasmid
pBTM116*
~5,6
Klonierungsvektor,
Resistenz
Shuttle-Vektor,
Cam-
pVP16
3,3
Klonierungsvektor, Shuttle-Vektor,
Resistenz, Beuteplasmid
Amp-
pGEX2T, 4T1, 4T3
4,9
Klonierungs- und Transkriptionsvektor, GSTTag, Thrombin-Erkennungsstelle, lacIq-Gen
Synthetische Oligonukleotide
Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) in
einer Konzentration von 100 pmol/µl hergestellt. Die Sequenzen sind im Anhang
aufgeführt.
44
Datenbanken und Software
Nukleotid- und Proteinsequenzen wurden mit den Sequenzdatenbanken Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und EMBL (http://www.ebi.ac.uk) mit Hilfe des
BLAST-Programms (Altschul et al., 1990) analysiert. Strukturelle- und funktionelle
Motive von Proteinen wurden mit dem Programm SMART (Simple Modular
Architecture Research Tool; http://SMART.embl-heidelberg.de); (Schultz et al., 2000))
analysiert. Sekundärstrukturvorhersagen wurden mit dem PSORT II-Programm
(http://psort.nibb.ac.jp/psort/helpwww2.html) oder mit dem Prosite-Programm
(http://isrec.isb-sib.ch/software/PFSCAN_form.html) durchgeführt.
45
Molekularbiologische Methoden
Isolierung von Nukleinsäuren
Maxi-/Minipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien
Zur Isolation hochreiner Plasmid-DNA werden die Präparationskits der Firma Qiagen
(Hilden) verwendet. Die Zellen werden dazu unter alkalischen Bedingungen lysiert und
die DNA dabei über eine Säule affinitätschromatographisch aufgereinigt. Die
Aufarbeitung erfolgt nach dem Protokoll des Herstellers. Die mit dieser Methode
isolierte Plasmid-DNA kann u.a. für die Transformation in Bakterien oder Hefen,
Restriktionsanalysen,
Hybridisierungsexperimente,
zur
Subklonierung
oder
Sequenzierung eingesetzt werden. Es werden die Kits für Mini- und Maxi-Präparationen
verwendet.
Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen
Bei den Hefen wurde analog zu den Bakterien mit den Präparationskits der Firma
Qiagen (Hilden) vorgegangen. Hierbei wurden die Hefen mit dem Lysepuffer des Kits
zusammen mit Glaskugeln mechanisch aufgeschlossen. Die Aufarbeitung der PlasmidDNA erfolgte dann nach dem Protokoll des Herstellers.
Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Konzentration von Nukleinsäuren wird mit einem Spektralphotometer (Pharmacia
Biotech, Schweden) bestimmt. Nach Abgleichen der Nullwerte kann das
Absoptionsmaximum der Nukleinsäuren (bei 280 nm) bestimmt werden. Gleichzeitig
können Verunreinigungen durch Proteine (bei 280 nm) bzw. Salze (bei 230 nm)
gemessen werden. Die Berechnung der Nukleinsäurekonzentration wird nachfolgender
Formel durchgeführt:
c [µg/µl] = (E260-E320) ⋅ f ⋅ c’
E
f
c’
= Extinktion
= Verdünnungsfaktor
= nukleinsäurespezifischer Koefizient in µg/µl
für dsDNA: c’ = 0,05 µg/µl
für ssDNA: c’ = 0,025 µg/µl
Der Quotient E260/E280 ist ein Maß für die Reinheit der DNA und sollte 2,0 ± 0,2
betragen.
46
Enzymatische Modifikation von DNA: Klonierungstechniken
Restriktionsenzymatische Spaltung von DNA
Die Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen wird in einem Volumen von
mindestens 30 µl bei der enzymspezifischen Temperatur für 3-16 h im
enzymspezifischen Reaktionspuffer durchgeführt, wobei pro µg DNA 5-10 U des
jeweiligen Restriktionsenzyms eingesetzt werden.
Es kann bei entsprechender Wahl auch ein Doppelverdau (zwei Restriktionsenzyme)
angesetzt werden. Dabei ist der Puffer für diese Restriktion entsprechend der
Empfehlung des Herstellers zu wählen.
Anschließend wird die DNA gelelektrophoretisch aufgereinigt und in Wasser gelöst bei
–20°C gelagert.
Desphosphorylierung von Plasmid-DNA
Um eine Religation von Plasmid-DNA, die nur mit einem Enzym geschnitten wird,
während einer nachfolgenden Ligation zu verhindern, wird das Plasmid
dephosphoryliert. Dazu wird nach der Restriktionsspaltung 1 U alkalische Phophatase
direkt zum Verdauungsansatz gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C
wird die dephosphorylierte DNA durch eine Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt
und in Wasser gelöst bei –20°C aufbewahrt.
Ligation eines DNA-Inserts in einen Plasmid-Vektor
Die geschnittenen, isolierten und gegebenenfalls dephosphorylierten DNA-Fragmente
konnten direkt in die komplementären Restriktionsschnittstellen des Plasmid-Vektors
ligiert werden. Der Ansatz wurde entweder für 3 Stunden bei 37°C oder bei 16°C üN
inkubiert.
Ligationsansatz:
30-120 ng DNA-Insert
30 ng Plasmid-DNA
2 µl 10x Ligationspuffer
1 µl T4-DNA-Ligase (5 U/µl)
ad 20 µl H2O
Darstellung kompetenter Bakterien
Zur Herstellung kompetenter E. coli Zellen nach der MgCl2-Methode nach (Chung et
al., 1989) werden 100 ml LB-Flüssigmedium, dessen pH nicht mit NaOH justiert
wurde, mit 1 ml einer Vorkultur ( >16 h bei 37°C) inokuliert und bei 37°C, 180 UpM
bis zu einer OD600 = 0,5 ± 0,05 inkubiert. Nach Abkühlung der Kultur für mind. 20 min
47
auf Eis werden die Zellen bei 12000 g und 4°C für 5 min sedimentiert, in 10 ml
eisgekühltem TSS-Puffer resuspendiert und mit 1,5 ml Glycerin versetzt. Aliquots von
maximal 300 µl werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
Darstellung kompetenter Hefen
Zur Herstellung kompetenter S. cerevisiae L40 werden 5 ml YPD-Medium mit einer
Kolonie L40 inokuliert, üN bei 30°C, 180 UpM inkubiert und am folgenden Tag auf 50
ml YPD-Medium verdünnt. Nach weiteren 3 Stunden bei 30°C wurden die Zellen bei
1000 g sedimentiert, einmal in 9 ml Lithiumacetat-Lösung (100 mM Lithiumacetat in
TE-Puffer) gewaschen und abschließend in 1 ml Lithiumacetat-Lösung resuspendiert
(Schiestl und Gietz, 1989). Die nun kompetenten Zellen wurden sofort für
Transformationen weiterverarbeitet.
Transformation von Bakterien
Für die Transformation der Bakterien mit Plasmiden läßt man die kompetenten Zellen
zunächst langsam auf Eis auftauen. Danach wird entweder ein kompletter
Ligationsansatz oder 1-2 µl einer DNA-Minipräparation mit 100 µl der kompetenten
Bakterien gemischt und für 30-60 min auf Eis inkubiert. Es folgt ein Hitzeschock des
Ansatzes für 60 s bei 42°C. Nach 2 min Inkubation auf Eis wird der Transformationsansatz mit 1 ml LB-Medium versetzt und für 15-30 min bei 37°C inkubiert. 100 µl dieser
Zellsuspension werden auf Platten mit LB Festmedium mit geeignetem Antibiotikum
ausgestrichen. Die verbleibenden Zellen werden in ca. 60 s bei 14.000 UpM
(Tischzentrifuge) zentrifugiert und in 100 µl des Überstandes resuspendiert und
ebenfalls auf eine weitere Platte ausgestrichen. Inkubation der Agarmedien bei 37°C
üN.
Transformation von Hefen
Für die Transformation der Hefen mit Plasmiden werden die kompetenten Hefen stets
frisch hergestellt.
Transformation im kleinen Ansatz
100 µl kompetente Hefen wurden mit 10 µl (100 µg) Lachs-Sperma DNA (Sigma,
Typ III) und 1 µg Plasmid-DNA (Köder- und Bank-Plasmid, nach Schiestl (1989))
gemischt. Nach Zugabe von 600 µl Puffer 2 wurde der Ansatz für 30 min bei 180 UpM
bei 30°C belassen. Anschließend wurden 70 µl DMSO hinzugefügt und weitere 20 min
bei 42°C (Hitzeschock) ohne Schütteln belassen. Die Zellen wurden hiernach für 2 min
auf Eis gelagert und fü 3 min bei voller Leistung in der Tischzentrifuge sedimentiert.
Das Sediment wurde in 200 µl 1x TE Puffer resupsendiert und je 100 µl auf UTL- (zur
Bestimmung der Transformationseffizienz) und THULLy-Platten (Interaktionsstudie)
ausgestrichen. Die Platten wurden für 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.
48
Transformation im großen Ansatz
Um eine möglichst große Transformationseffizienz zu erreichen, wurde für den Screen
zuerst das Köderplasmid vortransformiert und anschließend die cDNA-Bank.
Dazu wurden kompetente Hefen analog wie im kleinen Ansatz nur mit dem
Köderplasmid transformiert und auf UTLy-Platten ausgestrichen.
Von den gewachsenenKolonien wurde eine Kolonie in 10 ml UTLy-Medium
resupsendiert und üN bei 30°C, 180 UpM inkubiert. Diese wurde am nächsten Tag auf
100 ml UTLy-Medium verdünnt und ebenfalls üB bei 30°C, 180 UpM inkubiert. 1000
ml YPAD-Medium wurde bis zu einer OD600 von 0,2-0,3 mit der 100 ml UTLy-Kultur
versetzt und für weitere 4 h bei 30°C, 180 UpM inkubiert. anschließend wurden die
Hefen bei 1000xg in 10 min sedimentiert und einmal mit 400 ml TE-Puffer und einmal
mit 30 ml Puffer 1 gewaschen und erneut sedimentiert und abschließend in 8 ml Puffer
1 resuspendiert. Danach erfolgte eine abschließende Inkubation bei RT für mindestens
10 min.
Für die Transformation wurden dann zu den 8 ml 2 mg Lachs-Sperma DNA, 1 mg
embryonale Mausbank cDNA und 25 ml Puffer 2 gegeben und analog wie bei dem
kleinen Ansatz verfahren. Nach Zugabe von 3,3 ml DMSO erfolgte bei 42°C für 20 min
der Hitzeschock. Die abschließend sedimentierten Hefen (1000xg, 10 min, RT) wurden
in YPD-Medium aufgenommen und 1 h bei 30°C, 180 UpM regeneriert.
Die Zellen wurden nach Sedimentation in 30 ml TE-Puffer resuspendiert und in 300 µl
Aliquots auf THULLy-Platten (∅ 160 mm) ausgestrichen.
Elektrophorese von Nukleinsäuren
Gelelektrophorese von DNA
Es wurden für die Aufreinigung von PCR-Produkten 1-1,5% Agarosegele verwendet,
für die Aufreinigung von Plasmid-DNA wurden 0,7-1% Agarosegele verwendet. Die
Agarose wurde stets in 1x TAE-Puffer in der Mikrowelle aufgelöst. Die DNA wurde
mit DNA-Probenpuffer versetzt und bei konstanter Voltzahl (5 V/cm) im Gel
aufgereinigt. Sichtbarmachung der DNA erfolgte durch 5-10 min Schütteln in
Ethidiumbromidlösung (6,25 µg/ml in TAE-Puffer) und anschließender Betrachtung bei
UV-Licht (320 nm).
Größenstandards
Um die Größe der DNA-Fragmente bei der Gelelektrophorese bestimmen zu können,
wurde parallel zu den DNA-Proben der 1 kb DNA Ladder-Längenstandard der Firma
Gibco BRL (Karlsruhe) auf das Elektrophoresegel aufgetragen.
49
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolierung der DNA aus Agarosegelen erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction
Kit der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers. Die DNA wurde stets in
sterilem Wasser gelöst und bei –20°C gelagert.
Methoden der Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
PCR an Plasmid-DNA
Standard-PCR
Die Standard-PCR diente der in vitro Amplifikation linearisierter DNA (Mullis und
Faloona, 1987; Saiki et al., 1985) für Subklonierungen, wobei sowohl neue
Restriktionsstellen eingeführt als auch verkürzte Genfragmente erzeugt wurden.
Die Methode wurde nach folgendem Reaktionsansatz (100 µl Gesamtvolumen)
durchgeführt:
30–500 ng Template DNA
1 µl 5’-Primer (sense) (100 µM)
1 µl 3’-Primer (anti-sense) (100 µM)
2 µl dNTP-Mix
10 µl DMSO
10 µl 10x Pfu-Polymerase Puffer
1 µl Pfu-Polymerase (Clonetech)
Der Ansatz wurde für 30-40 Zyklen in einem Thermocycler mit folgendem Programm
belassen:
94°C
120 s Denaturierung
50°C
60 s Hybridisierung
72°C
60 s Elongation
Vor Beginn wurden die Proben 2 min lang bei 94°C denaturiert. Nach Beendigung der
gewünschten Zyklen schloß sich ein letzter Elongationsschritt von 5 min bei 72°C an.
Der gesamte Ansatz wurde anschließend gelelektrophoretisch aufgearbeitet.
50
Mini-PCR
Zur raschen Identifizierung erfolgreich transformierter E. coli Kolonien wurden ganze
Zellen als Template in einer verkürzten Standard-PCR (20-25 Zyklen) eingesetzt. Dazu
wurden Teile ausgewählter Kolonien für 2 min in der Mikrowelle aufgeschlossen. Nach
Zugabe von 50 µl des Reaktionsgemisches erfolgte die PCR mit demselben Programm
wie für die Standard-PCR. Anschließend wurden die Ansätze gelelektrophoretisch
analysiert. Der restliche Teil der verwendeten Kolonien wurde in Minikulturen
inokuliert.
Reaktionsansatz für 50 µl
39 µl H2O
0,02 µl 1 µl 5’-Primer (sense) (100 µM)
0,02 µl 3’-Primer (anti-sense) (100 µM)
5 µl 10x PCR-Puffer
5 µl Q-Solution
0,1 µl dNTP-Mix
0,02 µl Taq-Polymerase (Qiagen)
Ortspezifische Mutagenese
Die Substitution einzelner Aminosäuren erfolgt auf DNA-Ebene mittels ortsspezifischer
Mutagenese nach dem „QuikChange“-Protokoll der Firma Stratagene (Amsterdam,
Niederlande). Bei dieser Methode wird zirkuläre, als Vorlage (Template) dienende
Plasmid-DNA mittels zweier mutagener komplementärer Oligonukleotide in einer
einzelnen PCR-Reaktion amplifiziert. Die als Vorlage dienende Plasmid-DNA ist
methyliert und kann mit der methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease Dpn I
degradiert werden. Die neu synthetisierten, die gewünschte Mutation enthaltene DNA
ist nicht methyliert und kann anschließend in E. coli transformiert werden.
Die Durchführung erfolgt nach den Angeben des Herstellers: Ein einzelner 50 µl Ansatz
enthält 5 µl 10x Reaktionspuffer, 5 µl DMSO, 5-50 ng Plasmid-DNA, je 125 ng 5’- und
3’-Primer, 1 µl dNTP-Lösung, 1 µl Pfu-Polymerase („Turbo-Pfu“, Stratagene). Das
PCR-Programm besteht aus einem initialen Denaturierungsschritt bei 95°C (30 s) und
18 Zyklen mit je 30 s Denaturierung bei 95°C, 60 s Hybridisierung bei 55°C und
120s/kb Plasmidlänge Elongation bei 68°C. Der Ansatz wird anschließend mit 10 U
Dpn I für 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend in E. coli TG1 transformiert.
Mutageneseansatz:
5 µl 10x Pfu Puffer
5 µl DMSO
5-50 ng Template-Plasmid-DNA
125 ng 5’-Primer (sense)
125 ng 3’-Primer (anti-sense)
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100 nM dNTP-Mix
1 µl Turbo-Pfu DNA-Polymerase
34,5 µl H2O
Sequenzieranalyse
Die Sequenzierung wurde modifiziert nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et
al. (1977) durchgeführt. Die Methode beruht auf dem Prinzip der durch den Einbau von
(fluoreszenzmarkieren) Didesoxynukleotiden statistisch unterbrochenen DNANeusynthese. Für die Sequenzierungs-PCR wurde die Dye Terminator Cycle
Sequencing Methode (Perkin Elmer) angewendet. Dazu wurde das Protokoll des
BigDyeTerminator Kits (ABI) befolgt. 0,5-1 µg Plasmid-DNA wurden jeweils
zusammen mit 5 pmol eines geeigneten Oligonukleotids für die Sequenzierungs-PCR
eingesetzt. Die Kettenabbruchreaktion wurde als PCR in einem Thermocycler
durchgeführt. Nach Denaturierung bei 96°C (2 min) wurden die Proben für 25 Zyklen
folgendem Programm unterzogen:
96°C
30 s
Denaturierung
50°C
15 s
Hybridisierung
60°C
4 min
Elongation
Nach der PCR wurde die DNA mit 2,5x Ethanol und 1/10 Vol. 3 M NaAc, pH 4,7
gefällt und erneut mit 70%igem Ethanol gewaschen. Zur Sichtbarmachung der gefällten
DNA wurde 1 µg Dextranblau der Mischung beigegeben.
Die gefällte DNA wurde abschließend in 20 µl 10% Formamid in A. dest.
aufgenommen und in einem Kapillarelektrophoresegerät der Firma ABI aufgearbeitet.
Die Chromatogramme wurden anschließend mit dem dem Gerät beiliegenden Software
Paket ausgewertet.
Gelretardationsassay (Gelshift)
Zur Überprüfung, ob ein Protein DNA bindet, wurde das Protein in einer konstanten
Konzentration mit ansteigenden DNA-Mengen versetzt, in Hybridisierungspuffer 1 h
bei 4°C inkubiert und auf einem 1, bzw. 2%igen Agarosegel aufgetrennt und durch
Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Elektrophorese dauerte
typischerweise 2 h bei konstanter Spannung (100 V). Bei Interaktion zwischen dem
Protein und DNA zeigt die komplexierte DNA ein anderes Laufverhalten als die freie
DNA.
52
Proteinbiochemische Techniken
Expression
Expression von Proteinen wurden im Bakterienstamm BL21 durchgeführt. Eine 100200 ml Vorkultur in LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum wird üN bei 37°C
inkubiert. Diese wird dann auf die gewünschte Menge TB-Medium mit entsprechendem
Antibiotikum gegeben. Diese wird dann bei 37°C bis zu einer OD600 von ca. 0,7
herangezogen (ca. 4 Stunden, bei vorgewärmten Medium). Die Induktion mit IPTG
(Endkonzentration 0,1 mM) erfolgte je nach Protein bei 15, 23 oder 30°C für
mindestens 18 Stunden. Dabei war darauf zu achten, daß das Medium mit den Bakterien
gut mit Luftsauerstoff in Berührung kommt, um eine anaerobe Vermehrung zu
vermeiden (typischerweise wurden die Kulturen bei 150-180 UpM geschüttelt). Die
Bakterien wurden anschließend bei 8.000 rpm abzentrifugiert. Die Bakterien können bei
–80°C gelagert werden.
Präparation von Proteinen
Zellaufschluß
Der Proteinreinigung vorangestellt ist der Zellaufschluß, wobei die löslichen Proteine
aus dem Cytosol der Bakterien mechanisch oder chemisch befreit werden. Dazu wurden
drei unterschiedliche Methoden angewandt.
Zellaufschluß enzymatisch
Hierbei wurde die oben erhaltene Zellpaste in Puffer X (150 ml Puffer pro Sediment aus
10 l Kultur) aufgenommen und mit 100 mg Lysozym pro 100 ml Zellsuspension
30 min. lang bei Raumtemperatur gerührt; man beobachtete eine Erhöhung der
Viskosität. Weiteres Rühren bei 4°C für 30 min. unter Zugabe von 3,5 ml NaDeoxycholat (6%) pro 150 ml Suspension lieferte eine gallertartige Masse. Eine Zugabe
von 15 mg DNAse I pro 300 ml Zellsuspension für 30 min. bei 4°C überführt die
gallertartige Masse wieder in einen flüssigeren Zustand durch Hydrolyse
chromosomaler DNA (Tucker et al., 1986; leicht modifiziert). Diese Lösung wird dann
in der Ultrazentrifuge bei 45000 UpM in einem TI 45 Rotor 45 min. zentrifugiert und
von Zelltrümmern befreit. Der rötlich-braune Überstand enthielt das gelöste Protein, das
Sediment wurde verworfen.
Zellaufschluß im Fluidizer
Bei dieser Methode werden die Zellen mit Druck durch eine sehr dünne Düse gepreßt,
dabei scheren sie aneinander und platzen auf. Hierbei ist besonders darauf zu achten,
daß die Düse gut gekühlt wird, da sonst eine starke Temperaturerhöhung zu beobachten
ist. Diese würde die Proteine zerstören.
Die Zellpaste wurde wie oben beschrieben in Puffer X aufgenommen und durch den
Fluidizer gegeben. Die erhaltene Lösung wurde ebenfalls wie oben beschrieben
zentrifugiert.
53
Diese Methode hat den Vorteil, daß sie sehr schnell durchzuführen ist; jedoch kann eine
Temperaturerhöhung schnell stattfinden und Scherkräfte die Proteine schädigen.
Zellaufschluß mit Ultraschall
Bei dieser Methode werden die Zellen in entsprechendem Puffer resuspendiert und im
Ultraschall in Intervallen von (je nach Dichte der Zellen) 10 – 15 mal je eine Minute
lang aufgeschlossen. Auch hier ist eine Temperaturerhöhung durch zu langes Behandeln
mit Ultraschall zu vermeiden. Die Zellsuspension wird auf Eis gehalten.
Anschließend wird das Zellysat durch Zentrifugation von Zelltrümmern befreit.
Proteinreinigung und Chromatographie (FPLC)
Bei der Aufreinigung der Proteine (Tucker et al., 1986) wurden verschiedene
Säulenmaterialien verwendet.
Q-Sepharose Anionenaustausch-Chromatographie
Nach Zellaufschluß wurden die Proteine zuerst nach Ladungen getrennt. Dazu wurde
eine Q-Sepharose Fast Flow Säule (QAE-Sepharose, Diethyl-(2-hydroxypropyl)ammonioethyl-Sepharose) verwendet. Hierbei handelt es sich um einen starken
Anionenaustauscher. Als funktionelle Gruppen dienen quartäre Amine, die an einer
quervernetzten Agarosematrix immobilisiert sind. An diesen Aminen binden dann netto
negativ geladenen Proteine. Die netto positiv geladenen und z. T. auch nicht geladenen
Bestandteile des Zellaufschlusses verlassen die Säule während der Waschschritte (ca. 2
Säulenvolumen mit Puffer X + 0,2 g/l DTE). Die an der Säule gebundenen Proteine
wurden dann mittels eines NaCl-Gradienten von 0 mM bis 300 mM (in 0,5x Puffer X +
0,2 g/l DTE) von der Säule eluiert. Dies hat ebenfalls einen trennenden Effekt, da nicht
alle Proteine mit der gleichen Stärke an die Säule gebunden sind. So werden schwach
gebundene Proteine bei einer NaCl-Konzentration ab 50 mM NaCl bereits eluiert.
Andere, fester gebundene Proteine eluieren erst bei höherem Salzgehalt. Die Elution
wurde bei 280 nm photometrisch verfolgt. Eine angeschlossene Leitfähigkeitsmeßzelle
mißt den Salzgehalt und somit den Salzgradienten.
Die proteinhaltigen Fraktionen wurden mittels PAGE (s. weiter unten) untersucht. Die
Fraktionen mit dem gewünschten Protein wurden vereinigt und in einer
Amiconkonzentrationszelle, bzw. VivaSpin/Amicon Ultra (s. weiter unten) unter
Stickstoffdruck konzentriert und der Proteingehalt bestimmt.
Superdex 75 Gelfiltration
Hierbei handelt es sich um eine mit Puffer X equilibrierte Gelfiltrationssäule. Das
Fast Flow Säulenmaterial besteht aus hochvernetzter Agarose mit kovalent gebundenem
Dextran. Kleinere Moleküle können beim Passieren dieses Netzes in die Poren der
Matrix eindringen. Sie werden länger zurückgehalten als größere Moleküle und dadurch
erst bei einem größeren Elutionsvolumen eluiert. Die Trennung erfolgt also nach
Molekülgröße und Molekülform und somit in etwa nach der Molekülmasse. Die Säule
wurde mit mindestens zwei Säulenvolmen equilibriert.
54
Aufgetragen wurde stets eine vorgereinigte und konzentrierte Proteinprobe. Die Elution
wurde bei 280 nm photometrisch verfolgt.
Ausgewählte Fraktionen wurden mittels PAGE überprüft. Ausgewählte Fraktionen
werden vereinigt und konzentriert. Die konzentrierte Proteinlösung kann
schockgefroren bei –80°C gelagert werden.
Konzentrationsbestimmung von Proteinen
Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Bradford et al. (1976) mit Hilfe
des Coomassie Plus (Pierce), bzw. Coomassie Protein Assay Reagent (Uptima)
bestimmt. Der dem Assay zugrundeliegende Farbstoff Coomassie ändert sein
Absorptionsverhalten bei 595 nm linear zur Proteinkonzentration im Bereich zwischen
OD595 0,2 und 0,7. Durch Kalibrierung mit einer Konzentrationsreihe mit dem
mitgelieferten Rinderserumalbumin konnte die Proteinkonzentration aus der
Kalibriergerade ermittelt werden. Die Messungen wurden in 1,5 ml EinmalKunstoffküvetten durchgeführt. Je Probe wurden 3 unabhängige Messungen
durchgeführt und die Ergebnisse gemittelt.
Elektrophorese von Proteinen
Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)
Zur Analyse der Reinheit einer Proteinlösung wurde die diskontinuierliche PAGE
durchgeführt (Laemmli, 1970; Schagger und Vonjagow, 1987). Die Denaturierung der
Proteine mit SDS bewirkt eine einheitliche negative Ladung entlang der
Aminosäurekette. Dadurch kann eine Auftrennung nach dem Molekulargewicht im
elektrischen Feld erfolgen.
Sämtliche elektrophoretischen Analysen wurden in einem BioRad Mini-Protean II
System durchgeführt. Dabei wurden 5% (w/v) Acrylamid (Sammelgel) und 15% (w/v)
Acrylamid (Trenngel) unter reduzierenden Bedingungen (Laemmli, 1970) bei
konstantem Stromfluß (54 mA) verwendet. Die jeweiligen Proben wurden durch
Erhitzen bei 95°C für 5 min in Probenpuffer reduziert. Ein anschließendes Lagern auf
Eis verhinderte eine Reformation der Sekundärstruktur.
Die Dauer der Elektrophorese dauerte gewöhnlich zwischen 30 und 60 min.
Transfer von Proteinen (Semidry Blot)
Proteine wurden standardmäßig nach einer gelelektrophoretischen Auftrennung auf eine
PVDF-Membran (Boehringer, Mannheim) transferiert. Hierzu wurden 6 Filterpapierte
(Whatman) sowie die PVDF-Membran in der Größe des Trenngels zurecht geschnitten.
Für den semidry blot wurden die Graphitplatten der Transferapparatur mit Wasser
benetzt. Drei Filterpapiere wurden in Transferpuffer getränkt und luftblasenfrei auf die
Anodenplatte aufgelegt. Die PVDF-Membran wurde in Methanol für eine Minute
aktiviert und kurz mit Wasser gewaschen und in Transferpuffer gelegt. Anschließend
wurde die Membran auf die Filterpapiere gelegt. Das Trenngel wurde vorsichtig auf der
55
Membran plaziert. 3 weitere Filterpapiere wurden ebenfalls mit Transferpuffer getränkt
und auf das Gel gelegt. Nach Aufbringen der Kathodenplatte erfolgte der Transfer für
20 min bei 0,8 mA/cm2. Nach dem Transfer wurde die Membran mit einem
monoklonalen Antikörper bzw. polyklonalen Antiserum (peroxidasekonjugiert)
umgesetzt. Die Detektion erfolgte mit einem ECL-Kit nach Angaben des Herstellers.
Färbung von Polyacrylamidgelen
Polyacrylamidgele wurden standardmäßig mit Coomassie Brilliant Blue G250 und
R250 gefärbt. Die Gele wurden nach der Elektrophorese in Färbelösung gelegt und nach
Aufkochen in der Mikrowelle für 5-10 min unter Schwenken gefärbt.
Entfärbt wurden die Gele mit Leitungswasser. Die Gele wurden in Wasser in der
Mikrowelle aufgekocht und mit Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 10%
versetzt. Unter leichtem Schütteln wurde für ca. 20 min entfärbt.
Nukleotidchemische Methoden
Nukleotidaustausch
Die Dissoziationsrate des Nukleotids ist abhängig von der Konzentration an
Magnesiumionen. In Gegenwart von Magnesium bindet das Nukleotid sehr viel stärker
an das Protein (Tucker et al., 1986). Das gebundene Nukleotid wird durch Zugabe von
20 mM EDTA, 200 mM Ammoniumsulfat und Überschuß (meist 50 bis 100fach) eines
anderen Nukleotids ausgetauscht. Dabei wird das Magnesiumion von EDTA
komplexiert und die Dissoziation des Nukleotids begünstigt, was den Austausch der
Nukleotide beschleunigt. Der Vorteil dieser Methode liegt in der recht einfachen
Durchführbarkeit. Der Nachteil ist, daß sehr viel des Ziel-Nukleotids eingesetzt werden
muß. Dies kann besonders bei schwer synthetisierbaren Nukleotidanaloga o. ä. sehr
nachteilig sein.
Bei einer anderen Methode hydrolysiert man das gebundene Nukleotid durch Zugabe
von alkalischer Phosphatase (AP). Diesen Verdau unternimmt man in Ammoniumsulfat
(ca. 20 mM), der ein Abdissoziieren des Nukleotids fördert. Das abdissoziierte
Nukleotid wird daraufhin von der AP hydrolysiert, wobei die Bindungsaffinität des
Nukleotids zum Protein abnimmt (GTP > GDP > GMP > Guanosin). Neu
hinzugegebenes Nukleotid hat im Gegensatz zum GMP nun eine viel höhere Affinität
und wird somit bevorzugt gebunden. Soll ein Nukleotid durch ein ebenfalls von AP
hydrolysierbares Nukleotid ausgetauscht werden, so hydrolysiert man das erste
Nukleotid, reinigt das nukleotidfreie Protein von der AP (über sogenannte NAP5 oder
PD10 Säulen) und fügt das neue Nukleotid hinzu. Bei Nukleotiden, die nur schwer oder
gar nicht von AP hydrolysiert werden können (z. B. GppNHp, mGppNHp oder cagedGTP), gibt man sowohl AP als auch das neue Nukleotid zum Ansatz hinzu. Die Dauer
der Hydrolyse richtet sich nach der Temperatur und Menge der eingesetzten AP. Bei
5 U AP pro mg Protein ist die Hydrolyse bei Raumtemperatur bereits nach 2 bis 3
Stunden abgeschlossen, bei 4°C hingegen nach 12 Stunden.
56
EDTA-Methode
50 mM Tris/HCl
10 mM EDTA
50 – 100 fach GppNHp
Phosphatase-Methode
3-5 U/(mg Protein) AP
20 mM Ammoniumsulfat
enthält 0,1 mM ZnCl2
2-5 fach GppNHp
3 h, 25°C
12 h (über Nacht), 4°C
3 h, 25°C
HPLC-Analyse von Nukleotiden
Um den Nukleotidaustausch qualitativ und quantitativ zu überprüfen, wurde eine
„reversed phase“ HPLC verwendet. Das Prinzip dieser Chromatographie beruht auf der
Wechselwirkung einer mobilen polaren Phase (Puffer und Nukleotide, gebunden an den
Proteinen) und einer stationären Phase (hydrophobe Säulenmatrix). Durch Anlagerung
positiv geladener Tetrabutylammoniumionen (HPLC-Puffer) werden die negativ
geladenen Phosphatgruppen der Nukleotide maskiert (Ionenpaarbildung). Die
Anwesenheit von Acetonitril im Puffer erhöht die Hydrophobizität der
Phosphatgruppen. Unter diesen Bedingungen können die zu analysierenden Nukleotide
mit der stationären Phase wechselwirken. Die Retentionszeit nimmt mit steigender Zahl
der Phosphatgruppen zu.
Um quantitativ arbeiten zu können, muß zuvor eine Kalibrierung mit definierten
Nukleotiden vorgenommen werden. Die zu untersuchende Proteinmenge wird danach
über eine denaturierende Vorsäule gegeben und die Nukleotide somit von den Proteinen
abgetrennt. (Nicht gebundene Nukleotide vom Nukleotidaustausch werden durch die
PD 10, bzw. NAP 5 Säulen in einem vorangehenden Schritt entfernt.) Durch die
quantitative Nukleotidbestimmung kann die Konzentration an aktivem Protein bestimmt
werden.
Der Nukleotidaustausch erweist sich bei allen verwendeten GTPasen als erfolgreich. So
lagen die Austauschraten bei 74 – 84%.
Abb. 18 HPLC-Diagramm des Nukleotidaustausches von Raps. A vor dem Nukleotidaustausch; B nach dem
Nukleotidaustausch. Man erkennt, daß der Peak bei 3,0 (GDP) bei B durch einen Hauptpeak bei 3.9 min
(GppNHp) ausgetauscht wurde.
57
In der nicht-ausgetauschten Proteinlösung erkennt man ein starkes Signal für GDP
(3,0 min), das von Raps gebunden wird (Abb. 18 A). Nach Inkubation mit alkalischer
Phosphatase und nicht hydrolysierbarem GppNHp erkennt man deutlich zwei Signale
für verdautes GDP (Guanosin 1,7 min und GMP 2,4 min) und ein starkes Signal für
GppNHp (3,9 min; Abb. 18 B). GppNHp wird aufgrund der höheren Affinität
gegenüber GMP und G von Raps bevorzugt gebunden. Die Abbauprodukte und
überschüssiges GppNHp werden durch eine PD 10-Säule entfernt.
Biophysikalische Methoden
ITC
Isotherme Titrationskalorimetrie (Pierce et al., 1999; Wiseman et al., 1989) wurde zur
Bestimmung der Bindungskonstanten (KD) in Lösung benutzt. Desweiteren konnte diese
Methode auch zur Bestimmung der Stöchiometrie der Komplexbildung zwischen den
beiden Interaktionspartner verwendet werden. Der letzt genannte Wert kann u. a. als
„Fitness des Proteins“ beschrieben werden und für Assays und für die Kristallographie
verwendet werden.
Während der Titration der zwei Proteinlösungen wurde die aufgrund von ProteinProtein Interaktion gebildete oder verbrauchte Wärmemenge bei konstanter Temperatur
gemessen. Die freigesetzte Wärmemenge aufgrund der Ligandenbindung kann durch
folgende Gleichung beschrieben werden.
Q = V0∆Hb[M]tKa[L] / (1 + Ka[L]) (Gleichung 1)
Wobei V0 das Volumen der Zelle ist, ∆Hb ist die Bindungsenthalpie pro Mol Ligand,
[M]t ist die totale Makromolekülkonzentration (gebundene und freie Fraktionen); Ka ist
die Bindungskonstante und [L] ist die freie Ligandenkonzentration. Für einen Liganden
L, der an ein Makromolekül bindet, ist die Bindungskonstante Ka definiert durch
Ka = [besetzte Bindungsstellen] / [freie Bindungsstellen][L]
Die Änderung der Freien Enthalpie ist gegeben durch
∆G0 = -RT lnKa = ∆H0 – T∆S0 (Gleichung 2)
Wobei ∆H0 und T∆S0 die Enthalpie- und Entropieänderungen für eine einfache
Bindungsstelle darstellen. Die Parameter K, ∆H0 und die Stöchiometrie wurden direkt in
einem einzelnen Experiment durch eine nicht-lineare Anpassung der kalorimetrischen
Daten nach der Methode der kleinsten Quadrate bestimmt.
Üblicherweise wurde bei 25°C gemessen, wobei die Proteinkonzentration in der Zelle
100 µM und die in der Spritze 1 mM (bzw. 50 µM in der Zelle und 500 µM in der
Spritze) betrug. Es wurde mit kleinen Volumina in definierten Zeitintervallen titriert
58
(typischerweise jeweils 8 µl-Injektionen). Puffer war vornehmlich 50 mM Tris, pH 7,4.
Die Konstante KD wurde durch Integration der Wärmeeffekte, die auf die
Injektionsmenge normalisiert wurde, bestimmt. Die Kurvenanpassung erfolgte durch
ein 1:1-Bindungsmodell mit dem Softwarepaket Origin für ITC V.2.9 (Microcal
Software Inc., Northhampton, Massachusetts, USA).
Zum Vergleich von ITC-Daten mit thermodynamischen Daten, die mit anderen
physikalischen Methoden als ITC bei anderen Temperaturen gemessen wurden (z. B.
GDI) können die Gleichgewichtskonstanten mit Hilfe der van’t Hoffsche
Reaktionsisochore umgerechnet werden.
Die
d ln K
dT
Temperaturabhängigkeit
= − R1
0
d ( ∆G / T )
dT
von
G
ln K = − ∆RT
0
kann
durch
die
Beziehung
dargestellt werden. Mittels der Gibbs-Helmholtz-Gleichung läßt sich
der rechte Teil des exakten Differentials durch
1 ∆H 0
R T2
ersetzen, hierbei ist ∆H0 die
Reaktionsenthalpie bei gegebener Temperatur T. Mit der Beziehung dT / T 2 = −d (1 / T )
vereinfacht sich obige Gleichgewichtsgleichung zu
d ln K
d (1 / T )
= − ∆HR .
0
Aufgrund der geringen Temperaturabhängigkeit der Reaktionsenthalpie kann man aus
der letzt genannten Gleichung die Gleichgewichtskonstante bei einer anderen
Temperatur bestimmen (gilt für kleine Temperaturänderungen). Dies wird durch das
Integral der letzt genannten Gleichung vorgenommen. Es gilt:
∫ d ln K = −
∆H 0
R
∫ d ( ) (Gleichung 3)
1
T
Die Integrationsgrenzen sind K und K’ (zu bestimmendes K), bzw. T und T’
(Zieltemperatur). Die Lösung ergibt für die neue Gleichgewichtskonstante K’:
ln K ' = ln K − ∆HR
0
(T1' − T1 ) (Gleichung 4)
ITC-Experimente wurden auch zur Bestimmung von Komplexbildungskonstanten von
homodimerem Nore1-CC angewandt. Dazu wurden 0,5-1 mM Nore1-CC in der Spritze
vorgelegt und mit kleinen Volumina (3-8 µl) in Puffer X titriert. Die Temperatur bei
diesen Experimenten variierte von 15-55°C. Die Änderung der Wärmemenge in
Abhängigkeit der titrierten Nore1-CC-Menge wurde aufgezeichnet. Die Auswertung der
Daten erfolgte mit dem Programm Scientist, das Modell ist im Anhang aufgeführt. So
konnte die Freie Enthalpie ∆G bestimmt werden und mit der in Gleichung 4
angegebenen Beziehung der Wert für die Komplexbildungskonstante abgeschätzt
werden.
DSC
Untersuchungen zur thermischen Entfaltung von Proteinen und Bestimmung von
Bindungskonstanten bei Homodimeren erfolgten an einem Microcal VP-DSC
Microkalorimeter (Microcal, Northhampton, Massachusetts, USA). Die Auswertung
erfolgte mit dem Programm Microcal Origin 4.1 für DSC.
59
GDI
Fluoreszenzmessungen
Um die Affinitäten von Effektoren zu den GTPasen zu bestimmen, wurden
Fluoreszenzmessungen durchgeführt (Herrmann et al., 1995).
Dazu werden die GTPasen mit einem Nukleotid mit fluoreszierender Gruppe beladen.
Dies erfolgte wie bereits oben beschrieben.
Die Affinitäten zwischen den GTPasen und Effektoren (Gleichung 5) wurden durch die
Ausnutzung der Inhibition der Nukleotiddissoziation der GTPasen durch die Bindung
des Effektors bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante (kobs) der mGppNHp
Dissoziation von der GTPase wurde bei verschiedenen Effektor-Konzentrationen
gemessen. Dieses Gemisch inkubiert man nun bei 37°C im Fluoreszenzküvetten.
Die Reaktion, die man verfolgen möchte, wird durch Zugabe von 100 bis 200fachem
Überschuß von nicht fluoreszenzmarkiertem Nukleotid gestartet. Man beobachtet nun
den Fluoreszenzabfall in einem Spektrofluorometer in Abhängigkeit von der Zeit.
Die erhaltenen Fluoreszenzkurven wurden anschließend mit dem Programm GRAFIT
(Erithakus Software) angepaßt. Dabei wird eine einfach exponentielle Funktion
angewandt. Dies liefert die Geschwindigkeitskonstante kobs für die mGppNHpDissoziation. Wie in dem Schaubild unten und nach Gleichung 2 zu sehen, ist diese
Geschwindigkeitskonstante die Summe aus zwei Funktionen. Zum einen die
Dissoziation des Nukleotids (N) von der GTPase (R) alleine (k-1) und zum anderen die
Dissoziation vom Komplex mit dem Effektor (E), definiert als k-2. Wegen des sehr
großen Überschusses an nicht markiertem GTP können die Geschwindigkeitskonstanten
für die Reassoziation von mGppNHp, k+1 und k+2, vernachlässigt werden. Gleichung 7
ergibt sich aus der Kombination von Gleichung 5 und Gleichung 6. Die Werte für die
Affinitätskonstanten werden anhand der Gleichung 7 ebenfalls mit dem Programm
GRAFIT bestimmt.
Gleichungen:
[R − N]⋅ [E] (Gleichung 5)
[R − N − E]
[R − N] + k ⋅ [R − N − E ] (Gleichung 6)
k obs = k −1 ⋅
−2
[E 0 ]
[R 0 ]
Kd =
k obs
([R 0 ] + [E 0 ] + K d ) − ([R 0 ] + [E 0 ] + K d )2 − 4 ⋅ ([R 0 ]⋅ [E 0 ])
= k −1 − (k −1 − k − 2 ) ∗
2 ⋅ [R 0 ]
(Gleichung 7)
Hierbei sind E die Konzentration des Effektors (hier NoreRBD) und R die
Konzentration der GTPase (hier Ras), N die Nukleotidkonzentration (hier mGppNHp)
und R0, bzw. E0 die Gesamtkonzentrationen. Die Werte für koff ergeben sich aus
folgendem Schaubild (Herrmann et al., 1995; 1996):
60
Abb. 19 Schaubild des GDI. Der Einfluß der RBD auf die Dissoziation des Nukleteotids von Ras wird detektiert und
mit der Gleichgewichtskonstante KD korreliert.
Kompetetiver GDI
Für Interaktionsmessungen, bei denen eine RBD (oder Fragmente, die eine RBD
enthalten) beteiligt ist, wurde der kompetetive GDI angewandt. Im Schaubild Abb. 20
ist das Prinzip dargestellt.
Abb. 20 Schematische Darstellung des Reaktionsgleichgewichtes bei einem kompetetiven GDI-Experiment. Ein
Interaktionspartner der RBD entfernt die RBD aus dem Gleichgewicht. Die konzentrationsabhängige
Änderung von kobs wird detektiert. KD ist die Dissoziationsgleichgewichtskonstante, koff (k-1, bzw. k-2) die
Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante, mGppNHp ist mant-markiertes GTP-Analog.
Es wird ein Komplex aus GTPase und RBD mit bekannter Affinität vorgelegt. Der
Interaktionspartner der RBD wird hinzu titriert. Findet eine Interaktion mit der RBD
statt, so wird diese dem Gleichgewicht entzogen, die GTPase liegt unkomplexiert vor.
Unkomplexierte GTPasen binden das fluoreszenzmarkierte Nukleotid anders als
komplexiert (GDI). In Abhängigkeit von der Konzentration des Interaktionspartners
ändert sich kobs. Diese Änderung wird zeitlich verfolgt.
CD-Spektroskopie
Die Aufnahme von CD-Spektren erfolgte im Fern-UV (190 nm - 250 nm) oder Nah-UV
(250 nm – 320 nm) an einem Jasco J-710 Spektropolarimeter (Japan Spectroscopic Co.,
Ltd., Tokyo, Japan) in 0.5 mm Quarzküvetten mit 1 nm Bandbreite, 0.2 nm
Schrittweite, 50 nm·Min-1 Vorschubgeschwindigkeit und 1 s Integrationszeit bei
50 mGrad Empfindlichkeit. Alle Spektren wurden zehnfach akkumuliert. Die
Umrechnung der Elliptizität Θ in mittlere molare Elliptizität pro Aminosäurerest [Θ]MRE
erfolgte mit Gleichung 8 (Schmid, 1989).
[Θ]MRE = (Θ·100) / (c·d·N) (Gleichung 8)
61
Θ
c
d
N
= gemessene Elliptizität
= Proteinkonzentration in der Küvette in M
= Schichtdicke der Küvette in cm
= Anzahl der Aminosäuren pro Molekül
Massenspektroskopie
Die exprimierten Proteinfragmente von Nore1 wurden mittels MALDI
massenspektroskopisch analysiert. Dabei wurden 2 µl einer 20-40 mg/ml konzentrierten
Proteinlösung mit gleicher, bzw. zweifacher Menge an „Matrix“ gemischt und auf
einem MALDI-Probenträger luftgetrocknet. Gemessen wurde dann mit gepulstem Laser
unterschiedlicher Intensität. Evaluierung erfolgte durch vorgefertigte Analysevorlagen
für Proteine bis 20, bzw. 100 kD.
Matrix
333 µl Acetonitril
333 µl Methanol
33 µl 1% TFA
300 µl Wasser
Sinapinsäure bis zur Sättigung
62
Kristallographische Methoden
Kristallisation
Prinzip der Züchtung von Proteinkristallen
Kristallkeime wachsen nicht innerhalb gesättigter Lösungen. Das System muß dazu
übersättigt sein (sogenanntes Nicht-Gleichgewicht), um die treibende thermodynamische Kraft für eine Kristallisation zu liefern.
Wenn das Lösungsmittel z. B. durch Verdunstung entfernt wird, wird das
Löslichkeitslimit überschritten, und das System wird übersättigt. Wenn eine feste Phase
(Kristalle, Präzipitat) vorhanden ist (oder initiiert wird), verlassen Proteine die Lösung,
um sich an die feste Phase anzulagern.
Die feste Phase (Kristall) bildet sich nicht spontan, wenn das Löslichkeitslimit
überschritten wird, da hierzu Energie – analog zur Aktivierungsenergie bei chemischen
Reaktionen – benötigt wird. Deshalb muß die Übersättigung des Systems die nötige
Energie zur Bildung von Kristallkeimen liefern. Hat sich in einer übersättigten Lösung
ein stabiler Keim gebildet, wird er kontinuierlich weiterwachsen, bis der
Gleichgewichtszustand wieder erreicht ist. Ein stabiler Keim ist ein molekulares
Aggregat mit bestimmten physikalischen Eigenschaften, das neue Moleküle schneller in
seine wachsende Oberfläche einbaut, als andere in Lösung gehen.
Abb. 21 Es gibt zwei Regionen oberhalb der Sättigung. Eine, in der Kristallwachstum unterstützt wird, aber keine
Bildung von stabilen Keimen stattfindet (metastabile Region) und die andere, in der sowohl
Kristallwachstum unterstützt wird als auch Keime gebildet werden (labile Region) (McPherson, 1990).
Ideales Kristallwachstum beginnt mit Keimen, die in der labilen Phase gerade oberhalb
der Phasengrenze der metastabilen Phase gebildet werden. Das Kristallwachstum
vollzieht sich dann langsam, und die Lösung geht in die metastabile Phase über, in der
keine weiteren Keime mehr gebildet werden, gebildete Kristalle aber weiterwachsen.
63
Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens
Um eine übersättigte Lösung zu erhalten, wendet man verschiedene Methoden an, wie
zum Beispiel die Methode des hängenden Tropfens, des sitzenden Tropfens oder
flüssig-flüssig Diffusion.
Bei der ersten Methode kann eine kontrollierte Konzentrierung von Fällungsmittel und
Proteinkonzentration folgendermaßen erreicht werden: Es werden Tropfen auf
silikonisierte Glasplättchen aufgebracht, die aus einer Mischung von 1,5 – 3 µl
Proteinlösung mit dem gleichen Volumen an Fällungsreagenz bestehen. Das Plättchen
wird kopfüber auf eine Vertiefung gelegt, die mit Fällungsreagenz gefüllt ist.
Man benutzt dabei für Zellkulturen entwickelte Platten (Linbro-Platten) mit 24
Vertiefungen, um 24 Ansätze parallel durchzuführen. Es ist besonders darauf zu achten,
daß die Glasplättchen luftdicht (zum Beispiel mit Hilfe von Silikonöl oder
Klebestreifen) aufsitzen.
Da die Fällungsmittelkonzentration im Reservoir nun höher ist als die im Tropfen,
findet durch Diffusionsvorgänge eine Equilibrierung zwischen den beiden Medien statt.
Wasser diffundiert aus dem Tropfen heraus, dadurch erhöht sich sowohl die
Fällungsmittelkonzentration, als auch die Proteinkonzentration. Das Wasser diffundiert
so lange aus dem Tropfen heraus, bis sich ein thermodynamisches Gleichgewicht
zwischen Reservoir und Tropfen eingestellt hat. Die daraus resultierende übersättigte
Lösung im Tropfen liefert nun die treibende thermodynamische Kraft zur
Kristallisation.
Abb. 22 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Kristallisation nach der Methode des hängenden
Tropfens. Die Vertiefungen sind mit 500 bis 1000 µl Kristallisationspuffer gefüllt. Der Tropfen besteht
normalerweise aus einem Teil Proteinlösung und einem Teil Kristallisationspuffer. Luftdicht abgedichtet
werden die Glasplättchen mit Silikonöl. Analog dazu funktioniert die Methode des sitzenden Tropfens, bei
der die Tropfen auf einer silikonisierten Einbuchtung sitzen. Diese Methode verwendet man z. B., wenn die
Proteinlösung eine sehr geringe Oberflächenspannung besitzt.
Die Geschwindigkeit des Prozesses kann durch Vorgabe des Konzentrationsunterschieds zwischen Tropfen und Reservoir gesteuert werden. Die Endkonzentration
des Fällungsmittels im Tropfen entspricht dann im wesentlichen der des Reservoirs. Bei
der richtigen Temperatur, dem richtigen Fällungsreagenz etc. beginnt die Proteinlösung
zu kristallisieren. Zur Veranschaulichung siehe Abb. 22, oben. In dieser Arbeit wurde
die Methode des hängenden Tropfens angewandt.
Kristallmontage
Makromolekulare Kristalle bestehen durchschnittlich zu ca. 50% aus Lösungsmittel,
dies kann von Makromolekül zu Makromolekül zu 25 – 90% variieren. Das restliche
Volumen füllt das Makromolekül selbst aus, so daß der gesamte Kristall in vieler
Hinsicht als geordnetes Gel angesehen werden kann. Dieses hat ausgedehnte
Zwischenräume, durch die Lösungsmittel und andere kleine Moleküle frei diffundieren
können.
64
Damit der Kristall nun im Röntgenstrahl nicht austrocknet, muß der Verlust des im
Kristall eingebauten Lösungsmittel vermieden werden. Dies ist durch zwei prinzipielle
Vorgehensweisen gewährleistet: Zum einen kann der Kristall gefroren vermessen
werden. Dazu wird der Kristall in eine Kryolösung überführt und bei 100 K in den
Röntgenstrahl gesetzt. Dabei befindet sich der Kristall in einem Nylonloop. Diese
Methode wendet man an, wenn Synchrotronstrahlung verwendet werden soll, oder
wenn der Kristall sehr lange dem Röntgenstrahl ausgesetzt wird. Zum anderen wird der
Kristall in einer sehr dünnwandigen Quarzkapillare mit einem dem Kristall
entsprechenden Durchmesser montiert. Die beiden Enden werden mit Mutterlauge
gefüllt, so daß der Kristall zwar trocken liegt, sich aber in einer mit Lösungsmittel
gesättigten Umgebung befindet. Die Kapillare wird abschließend noch mit Hartwachs
verschlossen. Gemessen kann der Kristall nun bei 4°C bis Raumtemperatur.
Abb. 23 Die beiden angewandten Kristallmontagemethoden. A. Quarzkapillare mit Kristall in der Mitte. Der Kristall
ist von einer mit Mutterlauge gesättigten Atmosphäre umgeben, damit er nicht austrocknet. Die Kapillare ist
mit Hartwachs luftdicht verschlossen. B. Der Kristall wird in Cryo-Agens überführt und mit einem
Nylonloop in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Messung erfolgt bei 100 K.
Markierung von Aminosäuren zur Phasierung
Seleno-L-Methionin
BL21 (DE3) können für Methionin auxotroph gemacht werden, indem sie in einem
Medium aufgezogen werden, dessen Bestandteile die Methionin-Synthese unterdrücken.
Dem Medium liegt Minimalmedium zugrunde, in dem die folgenden Aminosäuren in
2,5fach höheren Konzentrationen vorliegen als alle übrigen:
Ile, Leu, Lys, Phe, Thr, Val
Den Zellen wird dann als einzige Methioninquelle Seleno-L-Methionin angeboten. Für
eine 5 l Medienkultur werden 250 mg Seleno-L-Methionin angeboten.
Eine in 1 ml LB Medium angezogene Bakterienkultur wird für 1 Min. zentrifugiert und
das Medium abgegossen. Die Zellen werden dann in 100 ml Minimalmedium mit
Seleno-L-Methionin resuspendiert und für mind. 5 h bei 37°C inkubiert. Mit dieser
Kultur werden dann 5 l Minimalmedium mit Seleno-L-Methionin angeimpft und für
weitere 5-7 h bei 37°C inkubiert, bis eine OD600 von mind. 0,6 erreicht ist; die
Temperatur wird auf 25°C gesenkt. Die Proteinexpression wird mit 0,2 mM IPTG
induziert und üN inkubiert.
65
Eine üN Kultur sollte mit Seleno-L-Methionin für ungefähr 12 h inkubieren. Diese
Dauer erhöht die exprimierte Proteinmenge. Alle anderen Faktoren wie Temperatur,
IPTG Konzentration, Induktionslänge, usw. werden konstant wie bei einer
Vollmediumkultur gehalten.
Röntgenographische Untersuchung
Grundlagen
Die molekulare Struktur und die Anordnung der Moleküle in der Einheitszelle
bestimmen die Intensitäten der am Kristallgitter gebeugten Strahlen.
Der Streuvorgang ist eine Interaktion zwischen Röntgenstrahlen als elektromagnetische
Wellen und den Elektronen in den Proteinen. Wenn elektromagnetische Wellen auf ein
Elektronensystem einwirken, üben die elektronischen und magnetischen Komponenten
der Wellen eine Kraft auf die Elektronen aus. Dies bewirkt ein Oszillieren der
Elektronen mit der gleichen Frequenz wie die der einwirkenden Welle. Die
oszillierenden Elektronen wirken wie „Strahlungsstreuer“ und senden ihrerseits
Strahlung aus (Sekundärwellenbildung). Durch die Elektronen wird Energie der
einwirkenden Welle absorbiert und dann eine neue Welle emittiert. Die Elektronen
eines Atoms können bei der Röntgenstreuung als freie Elektronen angesehen werden.
Die durch einen Kristall gestreuten Wellen können als Summation einer riesigen Zahl
von Einzelwellen angesehen werden. Jede dieser Einzelwellen wird durch
Wechselwirkung mit einem einzelnen Elektron gebildet. Eine Einheitszelle in einem
typischen Kristall umfaßt mehrere hunderttausend Elektronen, und ein Kristall besteht
aus einer riesigen Zahl von Einheitszellen. Die Interferenz zwischen allen vom
Röntgenstrahl im Kristallgitter getroffenen Elektronen führt zu deutlich voneinander
getrennten Beugungspunkten (Reflexen) in bestimmten Richtungen. Jeder dieser Punkte
wird gebildet aus der Summe aller positiven Interferenzen mit gleichem
Beugungswinkel. Das führt zur Entstehung charakteristischer Beugungsmuster. Eine
gesetzmäßige Beschreibung dieser Beziehung wird durch die Braggsche
Reflexionsbedingung (Bragg, 1913) gegeben.
Nach Bragg kann man sich die Streuung von Röntgenstrahlung als Reflexion der
Röntgenstrahlen an Ebenen im Kristall vorstellen. Die geometrischen Verhältnisse sind
in Abb. 24 dargestellt. Trifft ein einfallender Strahl unter dem Glanzwinkel Θ auf eine
Netzebenenschar, so kommt es genau dann zu konstruktiver (positiver) Interferenz der
an den einzelnen Ebenen gestreuten Strahlen, wenn der Gangunterschied ein
ganzzahliges Vielfaches der Wellenlänge ist. Dies ist der Fall, wenn Θ die Braggsche
Gleichung erfüllt. Unter der Voraussetzung, daß die betreffenden Ebenen mit Atomen
besetzt sind, erhält man einen Reflex, der genau diese Netzebenenschar repräsentiert.
Braggsche Reflexionsbedingung:
2d sin Θ = nλ (Gleichung 9)
Wobei d der Netzebenenabstand im Kristall, λ die Wellenlänge der Röntgenstrahlung,
Θ der Glanzwinkel und n die Beugungsordnung sind.
66
Abb. 24 Schematische Darstellung der Gegebenheiten in einem Kristall im Zusammenhang mit der Braggschen
Reflexionsbedingung.
Datensammlung
Die Streudaten der einzelnen Kristalle wurden an einem MAR 345 Image Plate Detektor
bei 100 K gesammelt. Als Röntgenquelle wurde ein Noniusgenerator verwendet. Dieser
arbeitet bei 10 kV und 20 mA und liefert monochromatisierte CuKα Röntgenstrahlen.
Es wurde ein Collimator mit 0,3 mm Breite verwendet. Die Versuchsanordnung ist in
der Skizze unten dargestellt.
Abb. 25 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. In dieser Abbildung ist eine geschlossene Röntgenröhre
gezeigt; die Untersuchung innerhalb dieser Arbeit wurde jedoch mit einer rotierenden Anode durchgeführt,
bei der das Ziel (target) des Elektronenstrahls eine rotierende Kupfertrommel ist.
67
Phasenproblem
Die Elektronendichte ist definiert durch:
ρ(xyz) =
1
V
∑ F(hkl) exp[− 2πi(hx + ky + lz) + iα(hkl)] (Gleichung 10)
hkl
Wobei
F(hkl ) die
Strukturfaktoramplitude
des
Reflexes
(hkl)
ist,
inklusive
Temperaturfaktor. α(hkl) ist der Phasenwinkel; x, y und z sind die kartesischen
Koordinaten in der Einheitszelle. Aus dem gemessenen Streumuster kann man die
Werte I(hkl) der einzelnen Intensitäten der Reflexe erhalten. Mit der Beziehung
I(hkl ) = F(hkl) können die Amplituden F(hkl ) der mit den Millerschen Indizes h, k, l
bezeichneten Reflexe bestimmt werden. Leider erhält man aus der Messung keine
Informationen über die Phasenwinkel.
Aus oben aufgeführter Gleichung geht hervor, daß für die Strukturbestimmung, bzw. für
die Berechnung von Elektronendichtekarten, sowohl die Phasenwinkel als auch die
Amplitude bekannt sein müssen. Mit Hilfe dieser Werte lassen sich dann die
Strukturfaktoren berechnen.
Es gibt verschiedene Techniken, um Informationen über die Phasen zu erhalten. Zum
einen gibt es direkte Methoden, die bei kleinen Molekülen angewendet werden können.
Diese Methode basiert auf statistischen Beziehungen von Intensitätsverteilungen
(Hauptman, 1997). Die Gültigkeit dieser statistischen Beziehungen fällt mit
ansteigender Anzahl von Atomen in der Einheitszelle, deshalb ist diese Methode für die
Phasenbestimmung für Proteine nicht brauchbar (Karle, 1989).
2
MIR / SIR
Die zweite Methode ist der molekulare isomorphe Ersatz (MIR). Die MIR Methode
benötigt die Anlagerung einer kleinen Anzahl von Schweratomen (Atome mit einer
großen Zahl an Elektronen) an die Proteinmoleküle. Der Intensitätsunterschied für jeden
Reflex zwischen dem derivatisierten und nativen Kristall wird benutzt, um die
Positionen der Schweratome zu bestimmen und damit die gesuchten Proteinphasen.
Ausgenutzt werden hierbei die isomorphen Differenzen aufgrund der angelagerten
Schweratome. Bei SIR wird dementsprechend nur ein Schweratom angelagert und
dessen isomorphe Differenz zum nativen Signal ausgenutzt. Der Vorteil von mindestens
zwei Schweratomderivaten liegt in der Ambiguität der Phasen, die u. U. bei der
Verwendung von nur einem Schweratom nicht gelöst werden kann.
MAD / SAD
Bei der dritten Methode handelt es sich um multiple anomale Wellenlängenstreuung
(MAD). Hierbei sind Schweratomderivate nicht unbedingt nötig, wohl aber die Präsenz
von anomal streuenden Atomen. Die anomale Streuung wird von Elektronen
hervorgerufen, die innerhalb des Kristalls nicht als komplett frei betrachtet werden
können und mit den Röntgenstrahlen in Resonanz treten. Dieser Effekt hängt von der
benutzten Wellenlänge ab, der Streufaktor f unterteilt sich dann in zwei Teile:
f (λ ) = f ° + f ' (λ ) + if ' ' (λ ) (Gleichung 11)
wobei f° der normale freie Elektronenstreufaktor ist. f´ und f´´ sind die anomalen
wellenlängenabhängigen Korrekturen. Der reale Teil der anomalen Streuung (f´) ist der
dispersive Teil und der imaginäre Teil, f´´, ist der Absorptionsterm.
68
Die Phaseninformation wird durch die Lokalisation der Atome erhalten, die durch
Variationen ihrer anomalen Streueigenschaften bei verschiedenen Wellenlängen
identifiziert werden. Diese Methode benötigt eine in der Wellenlänge veränderbare
Röntgenquelle (z. B. Synchrotronstrahlung).
Analog kann auch mit nur einer Wellenlänge gearbeitet werden, hierbei wird dann die
dispersive Differenz zum nativen Datensatz ausgenutzt.
Molekularer Ersatz
Bei der vierten Methode handelt es sich um den molekularen Ersatz. Hierbei wird die
Ähnlichkeit einer unbekannten Struktur mit einer bekannten Struktur ausgenutzt.
Diese Methode geht aus Arbeiten von Rossmann und Blow hervor (Rossmann und
Blow, 1962). Man kann sie anwenden, sofern die Struktur eines Proteins mit homologer
Aminosäuresequenz bekannt ist. Die Struktur dieses homologen Proteins wird dann als
Ausgangspunkt für das neue Protein verwendet. Diese Initialstruktur dient als erstes
Modell und kann schrittweise angepaßt werden.
Dieses Vorgehen beruht auf der Beobachtung, daß homologe Proteine eine ähnliche
Faltung ihrer Polypeptidkette aufweisen. Diese Methode kann auch dann angewandt
werden, wenn davon ausgegangen werden kann, daß ein Protein mit unbekannter
Struktur eine ähnliche Struktur wie ein bekanntes Protein aufweisen wird. Dabei muß
die Aminosäuresequenz nicht zwingend homolog sein. Dies ist z. B. bei vielen
unterschiedlichen Enzymen der Fall, die nach dem gleichen Wirkmechanismus arbeiten.
Um die unbekannte Struktur zu bestimmen, sind bei dem molekularen Ersatz zwei
Schritte durchzuführen:
Rotation
Translation
Für den Ersatz muß die genaue Orientierung der einzelnen Strukturelemente bekannt
sein. Im ersten Schritt wird die räumliche Orientierung der bekannten und unbekannten
Moleküle gegeneinander bestimmt. Im nächsten Schritt muß durch Translation der
Moleküle gegeneinander die nun (fast) korrekte Orientierung des einen Moleküls auf
das bekannte Molekül gelegt werden. Durch diese Prozedur erhält man die
Phaseninformation aus der bekannten Struktur für die unbekannte und kann dann
sukzessive das neue Modell anpassen und verfeinern.
Verfeinerung
Das Refinement bzw. die Verfeinerung ist der abschließende Schritt in der
Strukturbestimmung. Mit diesem Prozeß werden die beobachteten und berechneten
Strukturfaktoren des Modells aneinander angepaßt (Drenth, 1994). Im allgemeinen sind
vier verschiedene Parameter pro Atom zu verfeinern: Die Raumkoordinaten x, y und z
und der Temperaturfaktor B.
Proteinkristalle streuen für gewöhnlich nicht in Auflösungsbereiche, wie sie für kleine
Moleküle (Salzkristalle u. a.) üblich sind. Aus diesem Grunde ist das Verhältnis
zwischen Zahl der beobachteten Reflexen und Modellparametern nicht sehr groß. Die
Position der einzelnen Atome kann deshalb nicht alleine durch die Streudaten bestimmt
werden, sondern man muß gewisse stereochemische Einschränkungen bei der
Proteinstrukturbestimmung machen. Selbst bei Auflösungen von 1.8 – 1.5 Å sind solche
Einschränkungen nötig. Die stereochemische Information wird von den
Kristallstrukturen kleiner Moleküle (Aminosäuren, Peptide u. a.) her bezogen, die bei
69
hoher Auflösung bestimmt wurden. Diese Informationen betreffen Bindungswinkel,
Bindungslängen, Torsionswinkel und Planarität. Diese Parameter werden in den
verwendeten Programmen als Energieterme eingebunden. Beim Refinement wird die
Gesamtenergie für das System minimiert und die Qualität des Modells durch einen
Parameter, den sogenannten R-Faktor, bewertet.
Der größte Teil das Modell wird mit dem Programm CNS Vers. 1.1 (Brunger et al.,
1998) durchgeführt. Die Verfeinerungen werden visuell mit dem Programm O unter
Verwendung von Elektronendichtekarten korrigiert.
Letzte Verfeinerungsschritte und der Einbau von Wasser wurden mit dem Programm
Arp (V5.0) in Kombination mit Refmac (V5.0.36) gemacht.
Um ein „Überverfeinern“ des Modells zu vermeiden, wird ein Satz von 5-10% zufällig
ausgewählter Reflexe von sämtlichen Verfeinerungschritten ausgeschlossen (Brunger,
1992). Der mit diesen Daten berechnete R-Faktor wird mit Rfree bezeichnet und ist ein
Hilfsparameter der Strukturverfeinerung. Bei gut verfeinerten Modellen sollte der
Unterschied zwischen Rfree und Rworking nur wenige Prozent betragen.
∑ F − κF
=
∑F
obs
R working
calc
hkl
∑ F −κF
∑F
obs
bzw. R free =
calc
hkl⊂ T
obs
hkl ⊂ T
hkl
(Gleichung 12, a und b)
obs
Hierbei sind Fobs und Fcalc die beobachteten bzw. berechneten Strukturfaktoren und κ ein
Skalierfaktor, h, k und l sind die Millerschen Indizes. hkl ⊂ T sind alle Reflexe, die zum
Testset T gehören.
Wassermoleküle wurden sowohl mit CNS als auch mit Arp eingebaut. Sie wurden
schrittweise dem Modell hinzugefügt, wann immer passende Stellen in den 2Fobs-Fcalc
Differenzelektronendichtekarten auftraten. Weitere Kriterien für den Einbau von
Wassermolekülen sind korrekte Abstände zu benachbarten Atomen und der
Temperaturfaktor (B-Faktor) von bereits verfeinerten Wassermolekülen.
Der B-Faktor ist ein Maß für die Beweglichkeit eines Moleküls oder Atoms in einer
bestimmten Umgebung. Temperaturänderungen beeinflussen die thermischen
Bewegungen von Atomen; dies beeinflußt wiederum die Streuintensitäten. Die
thermische Bewegung von Atomen bewirkt einen Intensitätsabfall um den Faktor
exp{− B(sin 2 θ / λ2 )}. Wobei B = 8πu i der Temperaturfaktor ist und u i die
Beweglichkeit des Teilchens i in den drei Raumrichtungen x, y, z angibt.
Beim Wassereinbau werden alle Moleküle entfernt, deren B-Faktor größer als 50 Å2 ist.
Darüber hinaus sind Abstände kleiner als 2.2 Å, bzw. größer als 3,6 Å zu benachbarten
Atomen (vor allem N, O, H und S) nicht sinnvoll, Wasser mit solchen Eigenschaften
werden aus dem Modell entfernt.
2
2
70
Yeast-Two-Hybrid-Screening (Fields und Song, 1989)
Beschreibung der eingesetzten Materialien
Köder („Bait“)-Protein:
Der komplette offene Leserahmen des Maus-Nore1-Proteins wurde unter Beibehaltung
des Leserahmens als Fusionskonstrukt an den C-Terminus der lexA-DNABindungsdomäne in den pBTM116-Vektor kloniert.
cDNA-Bibliothek:
Die Quelle der cDNA-Bibliothek war die mRNA von ganzen, 9,5 bis 10,5 Tage alten
embryonalen Mäusen, die mittels eines NotI –Primers in die entsprechenden cDNAs
umgeschrieben worden war. Die cDNAs waren unidirektional über die Schnittstellen
NotI/NotI in den Vektor pVP16 kloniert worden. Die Anzahl unabhängiger Klone
betrug 7x109 (Clontech, Heidelberg).
Hefe-Stamm ScL40:
Die Plasmide pBTM116-Nore1 und pVP16-cDNA-Bibliothek wurden seriell in den
Hefestamm ScL40 transformiert. Der Hefestamm ScL40 trägt sowohl das lacZ als auch
das HIS3 als Reportergene.
Selektion relevanter Transformanten
Durch die Selektion sollten Transformanten ausfindig gemacht werden, in denen das
DNA-BD/Nore1-Fusionsprotein mit einem AD-Fusionsprotein der Bibliothek
interagiert. Da der verwendete Hefestamm ScL40 zwei Reportergene (HIS3 und lacZ)
besitzt, die beide unter der Kontrolle des GAL4-Transkriptionsaktivators stehen, jedoch
verschiedene Promotoren haben, ist eine Doppelselektion der erhaltenen
Kotransformanten möglich. Die Selektion HIS3-exprimierender Zellen ist durch ihre
Fähigkeit zum Wachstum auf THULLy-Nährböden erfolgt. Die hier erhaltenen
Kolonien wurden darüber hinaus auf die Expression des lacZ-Gens bzw. auf die
Aktivität der ß-Galactosidase getestet. Dazu wurden die Kolonien auf THULLyNährböden, denen zusätzlich X-Gal beigefügt wurden steril übertragen. Sofern das
(künstliche) Substrat X-Gal durch die ß-Galactosidase umgesetzt wurde, zeigten die
entsprechenden Kolonien eine Blaufärbung.
Verifikation
Leervektor
positiver
Klone
durch
Kotransformation
mit
Da in einigen bei der Doppelselektion erhaltenen putativ positiven Klonen die
Aktivierung der Reportergene nicht auf einer Interaktion der beiden Fusionsproteine
beruht, sondern allein durch das AD- Fusionsprotein hervorgerufen wird, wurden durch
Kotransformation mit leerem pBTM116-Vektor überprüft, ob Wachstum der Hefe
71
durch Interaktion zwischen Nore1 und einem Protein der cDNA-Bank hervorgerufen
wird oder nur durch das AD-Fusionsprotein alleine. Um positive Klone zu
identifizieren, wurden daraufhin die kotransformierten Hefe-Zellen sowohl auf UTLNährböden (Überprüfung der Transformation) als auch auf THULLy-Nährböden
(Überprüfung der Interaktion) ausgestrichen. Kolonien, die nach Kotransformation mit
Leervektor pBTM116 auch auf Selektionsmedium wuchsen, wurden als Falsch-Positive
verzeichnet.
Isolierung des AD-Plasmids aus Hefezellen und Klon-Analyse
Nachdem die Interaktion eines AD-Fusionsproteins mit Nore1 durch die oben
beschriebenen Verfahren bestätigt worden war, wurde das entsprechende AD-Plasmid
(pVP16) aus den Hefezellen isoliert. Dafür wurden die kotransformierten Hefezellen auf
THULLy-Nährböden zwei Tage lang herangezogen. Für die Isolierung wurden dann die
Hefezellen mit TE-Puffer resuspendiert und mit 100 µl Glaskugeln in der Kugelmühle
5 min lang auf höchster Stufe aufgeschlossen. Die unlöslichen Bestandteile wurden
anschließend bei 14000 rpm pelletiert und verworfen.
Die Isolierung des Plasmids aus dem Überstand erfolgte anschließend über ein
Minipräparations-Kit (QIAGEN) nach Anleitung des Herstellers.
Anschließend wurde die isolierte Plasmid-DNA mit 5’- und 3’-Sequenzierprimern für
pVP16 nach der Methode von Sanger (1977) sequenziert und anschließend mit dem
BLAST-Programm (Altschul et al., 1990) analysiert worden.
GST-Pulldown (Smith und Johnson, 1988)
Ein GST-Pulldown wurde durchgeführt, um die im Hefe 2-Hybrid-Screening
gefundenen Proteininteraktionen mit einer zweiten unabhängigen Methode zu
verifizieren. In dem Verfahren wurde der zu untersuchende Interaktionspartner von
Nore1 (bzw. ein Fragment davon) im pGEX Vektor (Amersham, Braunschweig)
integriert und in Bakterien als Fusion mit der Glutathion-S-Transferase (GST)
exprimiert. Diese GST-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch aus dem
bakteriellen Lysat aufgereinigt, wobei eine Sepharose-Matrix benutzt wurde, die mit
Glutathion, dem Substrat der GST, gekoppelt war. Nore1-Fragmente und die
aufgereinigten Fusionsproteine wurden anschließend in vitro inkubiert.
Expression und Isolierung der GST-Fusionsproteine
Die GST-Fusionsproteine wurden in Escherichia coli BL-21 (DE3) exprimiert, die mit
den rekombi-nanten pGEX-Plasmiden transformiert worden waren. Die
Proteinexpression von einem pGEX-Plasmid steht unter der Kontrolle eines tacPromotors, der durch das Laktose-Analogon IPTG induziert wird. Durch zeitlich
begrenzte IPTG-Applikation kann so die gebildete Proteinmenge kontrolliert werden.
100 ml TB-Nährlösung (+ 100 µg/ml Ampicillin) wurden mit 5 ml einer ÜbernachtVorkultur von E.coli BL-21(DE3)/pGEX angeimpft und bei 37°C inkubiert. Die
Induktion erfolgte nach 2 h mit 0,1 mM IPTG. Nach weiteren 10-12 h Wachstum bei
23°C wurden die Zellen geerntet und in 5 ml eiskalter PBS-Lösung mit 1 mM DTE und
72
0,5 mM PMSF suspendiert. Der Zellaufbruch wurde mit einer Ultraschallbehandlung
erzielt (Branson Sonifier 450, 4 x 20 sec, gepulst, Leistungsgrad 5). Das Zellysat wurde
nach Zugabe von 250 µl Trition X-100 (25%ig) 20 min bei 4°C leicht geschüttelt und
anschließend abzentrifugiert (12000 x g, 10 min, 4°C). Der so erhaltene Zell-Rohextrakt
wurde mit 100 µl 50%iger Glutathion-Sepharose 4B (=50 µl Bettvolumen) vermischt
und unter leichtem Schütteln 2h bei 4°C inkubiert. Zur Aufreinigung der GSTFusionsproteine wurde die Sepharose-Matrix pelletiert, dreimal mit 500 µl PBS
gewaschen (Zentrifugationen: 5000 x g, 1 min, 4°C) und schließlich in 150 µl dieser
Lösung suspendiert.
Pulldown-Inkubation und Analyse mittels PAGE
400 µg gereinigtes Nore1-Fragment und 50 µl aufgereinigtes Sepharose-GSTFusionsprotein wurden zusammen mit 200 µl Bindepuffer 2 h unter leichtem Schütteln
bei 4°C inkubiert. Danach wurde die Sepharose (einschließlich der gebundenen
Moleküle) pelletiert (10000 x g, 5 min, 4°C), der Überstand vorsichtig abgenommen
(für eine PAGE aufbewahrt) und die Sepharose zunächst einmal mit 200 µl Bindepuffer,
dann mit jeweils 200 µl Waschpuffer für den GST-Pulldown dreimal gewaschen, der
letzte Waschschritt wurde für eine PAGE aufgehoben. Für die PolyacrylamidGelelektrophorese wurde das Pellet in 15 µl Waschpuffer suspendiert, mit dem gleichen
Vol. an SDS-PAGE-Probenpuffer versetzt und vor dem Auftragen 10 min bei 95°C
inkubiert. Die PAGE wurde mit einer 10 x 15 cm großen Gelkammer mit einem
13%igen Gel durchgeführt. Die Elektrophorese erfolgte über einen Zeitraum von 3 h bei
50 mA.
Luminometrische Messungen
Messung der β-Galactosidase-Aktivität
Zur Quantifizierung der Interaktion zwischen zwei Proteinen im 2-Hybrid Screen wurde
der Chemilumineszenz-Reportergen-Assay GalactoStar der Firma Tropix Inc.
verwendet. In dem Assay wird die Umsetzung des im GalactoStar Kit enthaltenen
Substrats für die von den Hefen exprimierte β-Galactosidase unter Zuhilfenahme des
Verstärkers Sapphire-II bestimmt. Mit diesen Assay lassen sich β-Galactosidasemengen
zwischen 2 fg und 20 ng messen (Martin, 1997).
Von THULLy-Platten wurden Hefekolonien in THULLy-Flüssigmedium suspendiert
und die OD600 auf 0,6 in einem Gesamtvolumen von 6 ml eingestellt. Es wurden pro zu
messendem Interaktionspartner zwei unabhängige Ansätze hergestellt. Nach
anschließender Sedimentierung für 10 min. bei 4000 UpM im Ausschwingrotor JS4.3
bei 4°C werden die Hefen mit unten angegebenem Ansatz lysiert und die βGalactosidaseaktivität gemessen.
73
Ansatz:
800 µl Z-Puffer mit 3,24 µl/ml β-Mercaptoethanol
50 µl Chlorophorm
50 µl 0,1% SDS
Jeder Ansatz wurde genau 20 s stark geschüttelt (Vortex). Nach Phasentrennung wurden
von der oberen, chlorophormfreien Phase 60 µl in ein Sarstedt Luminometerröhrchen
pipettiert und 300 µl des frisch angesetzten Substratreagenz (1:50 Substrat des
GalactoStar Kits) unter leichtem Mischen hinzugegeben. Nach einer Inkubation von
genau 30 min bei RT wurde die Lichtemission im Luminometer für 5 s gemessen.
Als Referenz wurde die bereits charakterisierte Interaktion von NoreRBD (198-358) mit
verkürztem Ras (1-166) benutzt.
74
Ergebnisse
Nore1-Domänenstruktur
Klonierung und Isolierung von Nore1-Fragmenten
Die cDNA von Nore1 (fl.) wurde als EcoRI/SalI-Restriktionsprodukt in den
Expressionsvektor pGEX 4T1 insertiert und in den Bakterienstamm E. coli BL21(DE3)
transformiert.
Die Reinigung von Nore1 (fl.) war nicht möglich, da sowohl eine Kultivierung bei
verschiedenen
Temperaturen
als
auch
in
verschiedenen
Kulturmedien
keine
Überexpression von Nore1 (fl.) ergab. Auch eine Insertion der cDNA in verschiedene
andere Expressionsvektoren (pQE9, pET) führte nicht zum Erfolg. Eine Expression in
Hefe im Expressionsvektor pFM410 und pAB1 führte ebenfalls zu keinem Erfolg. Eine
Insertierung in den Insektenzellenvektoren pIZ/V5 und pBAC4 war aus bisher
unbekannten Gründen nicht möglich.
Für die biochemische Charakterisierung wurde die cDNA von Nore1 (fl.) dann als
EcoRI/SalI-, bzw. BamHI/SalI-Fragmente (Klonierdetails s. Anhang) ebenfalls in den
Bakterienvektor pGEX 4T1, bzw. 4T3 eingefügt, in E. coli BL21(DE3) transformiert
und als GST-Fusionsproteine exprimiert. Um Fragmente der verschiedenen Domänen
von Nore1 zu entwerfen, wurde das Programm SMART verwendet.
Die von SMART vorgeschlagenen Grenzen für die Domänen wurden bei der
Klonierung berücksichtigt und experimentell überprüft.
Wo notwendig (z. B. wegen mangelhafter Überexpression oder Unlöslichkeit) wurden
die Domänengrenzen N- und C-terminal verkürzt, bzw. verlängert, um eine stabile
Minimaldomäne zu erhalten. Die einzelnen Fragmente sind in Tab. 5, Abb. 26 und Abb.
27 dargestellt.
Tab. 5
SMART
experimentell
C1
116-165
95-166
RBD
267-359
198-358
CoiledCoil
376-411
370-413
Vorhergesagte (SMART) und klonierte Domänen des Nore1-Effektors.
75
Abb. 26 Sekundärstruktur von Nore1. Dargestellt sind die vorhergesagten (SMART, schwarz) und die klonierten
Domänengrenzen (grau).
Abb. 27 Polyacrylamidgel von verschiedenen, stabilen Nore1-Fragmenten. Spur 1: Nore1-CC (370-413), Spur 2:
Nore1-C1 (95-166), Spur 3: Nore1-RBD (198-358), Spur 4: Nore1-RBD+CC (198-413), Spur 5: Nore1C1+RBD+CC (100-413)
Die Reinigung dieser Fragmente erfolgte ausschließlich in 50 mM Tris/HCl-Puffer,
pH 7,4 mit 100 mM NaCl als GST-Fusionsproteine mittels Affinitätschromatographie
(GSH-Sepharose, Pharmacia). Die Fusionsproteine wurden über Nacht mit Thrombin
bei 4°C verdaut. Anschließend erfolgte eine Gelfiltration mit salzfreiem Puffer (oder sofern notwendig - Umpufferung in Phosphatpuffer) über eine Superdex S75-Säule.
76
Durch MALDI wurden die Massen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 6 aufgeführt.
Der Unterschied zu den theoretischen Massen wird durch zusätzliche Aminosäuren am
N-Terminus hervorgerufen, die durch die Klonierung in den Expressionsvektor mit
angehängt wurden.
Mit
diesen Fragmenten wurden die im folgenden beschriebenen Messungen
durchgeführt.
Fragment
theoretische Masse [D] experimentelle
[D]
Nore1-CC (370-413)
5454,91
5467,85
GS
Nore1-C1 (95-166)
9322,32 (9686,70)
9799,54
GSPEF
Nore1-RBD (198-358)
18209,87 (18636,28)
18682,44
GSPNS
Nore1-RBD+CC (198-413)
24737,90 (24939,07)
25214,24
GSPNS
Nore1-C1-RBD (95-358)
29768,63 (30199,07)
30430,18
GSPEF
Nore1-C1+RBD+CC (100-413)
35730,03 (36103,42)
36453,25
GSPEF
Tab. 6
Masse zusätzliche
Reste
Durch MALDI bestimmte Proteinmassen verschiedener Nore1-Fragmente. Die im Vergleich mit den
theoretischen Massen (Wert in Klammern ist ein theoretischer Wert inklusive der zusätzlichen Reste)
auftretende Differenz wird durch zusätzliche Reste am N-Terminus hervorgerufen, die durch die Klonierung
an das jeweilige Fragment angehängt wurden. GS wird durch die Thrombinschnittstelle verursacht.
GDI- und ITC-Messungen
Interaktionen zwischen Nore1-Fragmenten und GTPasen. GDI-Experimente wurden bei
37°C durchgeführt, ITC-Daten wurden nach der van’t Hoffschen Reaktionsisochore für
die zum Vergleich notwendige Temperatur umgerechnet.
In Gegensatz zur Interaktion von Raf1-C1 mit Ras in der GTP-Form (Brtva et al., 1995;
Hu et al., 1995) wurde für Nore1-C1 keine Bindung an Ras in der GTP-Form gemessen.
Die Bindung der Nore1-RBD zu Ras-GTP wurde durch Nore1-C1 im C1-RBDKonstrukt nicht signifikant beeinflußt (2fach schlechtere Bindung); eine Bindung von
Nore1-C1 an Nore1-RBD war nicht nachweisbar (NMR-Experimente mit
15
N-
markiertem Nore1-RBD, Daten nicht gezeigt). Die Coiled-Coil Domäne hat ebenfalls
keinen Einfluß auf die Bindung von Nore1-RBD mit Ras.
77
KD-Werte in µM bei 37°C
Nore1-Fragment
C1
RBD
CC
C1RBD
C1-RBDCC
RBDCC
H-Ras fl. mGppNHp
─
0,11*
─
0,23*
0,30*
0,15*
K-Ras mGppNHp
0,15*
N-Ras mGppNHp
0,13*
M-Ras GppNHp
0,16#
Rap1A 1-167 mGppNHp
1,40*
Raps Y40A mGppNHp
47*
H-Ras fl. mGppNHp E31K
0,45*
H-Ras fl. mGppNHp Y40A
30*
H-Ras fl. mGppNHp
D30E/E31K
2,25*
2,40*
ITC#
GDI*
Entwicklung eines Alignments Nore1-RBD auf bekannte RBD’s
Da die RBD von Nore1 wenig homolog zu bisher charakterisierten RBD’s ist, wurde
ein Sequenz-Alignment zu bisher bekannten RBD’s (Kandidaten für ein Alignment
waren Raf-Kinase-RBD, RalGDS-RBD und AF6-RBD) manuell durchgeführt. Dazu
mußten bestimmte Reste identifiziert werden, für die bei bekannten RBD’s im Falle
einer Mutation signifikante Veränderungen in der Bindungsaffinität zur GTPase
auftreten; analog zu Mutationen bei Raf-RBD in den Resten Arginin 59, 67 und
Lysin 84, wonach die Affinität zu Ras 30-, bzw. 12-fach geschwächt wird. Die anfangs
durch ein mit Clustal W durchgeführtes, automatisches Alignment von Nore1-RBD mit
Raf-RBD und RalGDS-RBD ausgewählten Mutationskandidaten (Aminosäuren Arginin
216, 242, 243 und Lysin 236 und 240) zeigten jedoch keine, bzw. sehr geringe
Änderung der Affinität zu Ras.
Da die Struktur von RalGDS-RBD bekannt war, wurde diese RBD unter Zuhilfenahme
eines manuell erstellten Alignments zwischen RalGDS-RBD und Nore1-RBD als
Vorlage für eine Modellierung der Nore1-RBD verwendet. Durch Ersatz der
Aminosäuresequenz von RalGDS-RBD durch die der Nore1-RBD und durch
Energieminimierung erhielt man ein Modell für die Nore1-RBD. Anhand von
78
Vergleichen des elektrostatischen Potentials von Raf-RBD und RalGDS-RBD, wurden
potentielle Kandidaten als Mutationsstellen identifiziert (Abb. 28).
Abb. 28 Gegenüberstellung: modellierte Nore1-RBD mit Vorlage RalGDS-RBD; AF6-RBD und Raf-RBD sind zum
Vergleich ebenfalls mit aufgeführt. Dargestellt sind elektrostatische Oberflächenpotentiale. Die
Kontaktfläche zu Ras liegt in der Papierebene, wobei das Ras nicht dargestellt ist. Positiv geladene Reste
(blau) zeigen in Richtung Effektorschleife von Ras. Potentielle Mutationskandidaten von Nore1-RBD sind
Aminosäuren Arginin 272, Lysin 283, 302 und 303.
Auf diese Weise wurden die Reste Arginin 272, Lysin 283, 302 und 303 als potentielle
Mutationskandidaten identifiziert. Und in der Tat bewirkten diese Mutationen eine bis
zu 50fache Erniedrigung der Affinität zu Ras (Aminosäure Lysin 283).
79
KD [µM]
Mutante/Wildtyp
ITC
H Ras fl. GppNHp
Nore1 (198-358)
0,29
-
H Ras fl. GppNHp
Nore1 (198-358) K283A
15,08
50
H Ras fl. GppNHp
Nore1 (198-358) K302D
1,48
5
H Ras fl. GppNHp
Nore1 (198-358) K303A
4,28
15
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358)
0,11
-
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) K236A
0,58
6
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) K240A
0,18
2
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) K283A
25,40
280
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) K302D
1,15
13
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) K303A
9,50
105
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) R216A
0,19
2
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) R242A
0,10
1
H Ras fl. mGppNHp
Nore1 (198-358) R243A
0,08
1
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131)
0,08
-
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131) R59A
2,50
30
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131) N64A
0,17
2
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131) R67A
1,00
12
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131) V69A
0,26
3
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131) K84A
2,50
30
H Ras fl. mGppNHp
c-Raf (51-131) V88A
0,07
1
GDI
ITC
Tab. 7
Gemessene Dissoziationsgleichgewichtskonstanten für verschiedene Nore1-RBD-Mutanten mit
Ras fl. GppNHp. Einige Werte wurden sowohl mit ITC als auch mit dem GDI gemessen. Zum Vergleich
sind die Daten für Raf-RBD-Mutanten mit aufgeführt (Rudolph et al., 2001).
Die Reste K283 und K303 haben im Vergleich mit Raf-RBD eine ähnliche Auswirkung
auf die Bindung an Ras. Diese Reste wurden im Alignment besonders berücksichtigt.
Es sollte noch ein auffälliges Merkmal der modellierten Nore1-RBD erwähnt werden.
Hierbei ist eine auffällig große Schleife (Loop, Bereich R340 – L350) vorhanden, die in
Größe von Raf-RBD über RalGDS-RBD zu Nore1-RBD hin zunimmt. Isoliert
betrachtet wird dieser Bereich durch Sekundärstrukturvorhersage-Programme als Helix
80
vorausgesagt. Das Alignment dieses Bereiches mit AF6-RBD (1-141) zeigt, daß dieser
Bereich homolog zu dem Bereich Q114-G124 in AF6-RBD ist; AF6-RBD weist in
diesem Bereich eine Helix auf.
Abb. 29 zeigt das finale Alignment von Nore1-RBD auf bekannte RBD’s (Raf-RBD,
RalGDS-RBD, AF6-RBD (1-141) und spByr2-RBD). Die durchweg konservierten
Aminosäuren sind rot markiert, chemisch äquivalente Reste entsprechend cyan und
grün. Die beiden Reste K283 und K303 und der zusätzliche Loop sind ebenfalls
markiert.
Abb. 29 Ergebnis des manuellen Alignments von Nore1-RBD auf andere RBD’s. Die N-terminalen Reste 198-257
bei Nore1 wurden nicht alignt. Von diesem Bereich wird analog zu AF6 angenommen, daß dieser Nterminal eine Helix ausbildet. Die durchweg konservierten Reste sind rot markiert, chemisch äquivalente
Reste sind entsprechend cyan und grün dargestellt. Zwei Reste sind markiert, die bei Mutation zu Ala einen
ähnlichen Effekt wie die entsprechenden Reste in den anderen RBD’s aufweisen. Die anderen beiden Reste
kennzeichnen den in dem Nore1-RBD-Modell gefundene Extra-Loop.
Hefe 2-Hybrid-Screen
Die Domänenvorhersage für Nore1 durch SMART ergab drei verschiedene, nichtkatalytische Domänen für Nore1. Die Funktion von Nore1 ist unbekannt. Um mögliche
Bindungspartner und damit auch die zelluläre Signaltransduktion von Nore1 näher zu
evaluieren, wurden Interaktionspartner von Nore1 unter Verwendung des Hefe 2Hybrid-Systems gesucht.
81
2-Hybrid Statistik/Bestimmung der Transformationseffizienz
Das Screenen der embryonalen full mouse cDNA-Bank wurde in einem großen Ansatz
(large scale) durchgeführt. Dabei wurden 1 mg cDNA eingesetzt und in den Hefestamm
S. cerevisiae L40 (ScL40) transformiert. Die Transformationseffizienz wurde mit Hilfe
der Kontrollausstriche auf UTL-Nährböden, auf denen alle doppelt transformierten
Hefezellen Kolonien bildeten, berechnet.
Transformationseffizienz:
(cfu/µg transformierter DNA) ⋅ (Vges/vProbe)
cfu = colony forming units (auf UTL-Nährboden)
Vges = Gesamtvolumen des
Transformationsansatzes
VProbe = Kontrollausstrich-Volumen
Anzahl der getesteten Klone:
cfu ⋅ (Vges/VProbe)
Vges=25 ml, Vprobe=100µl, cfu=1,188·106 Kolonien
Insgesamt wurden in dem durchgeführten Ansatz 2,97·108 Transformanten dem
Screening unterzogen, bei einer Transformationseffizienz von 0,3·106 Kolonien pro µg
cDNA.
Nach 5 Tagen erhielt man auf selektivem Medium (ohne 3AT) ca. 10000 Klone. Von
diesen wurden 1000 Klone manuell und subjektiv auf selektives Medium mit 50 mM
3AT zur Unterdrückung basaler Histidinproduktion übertragen. 541 Klone sind
daraufhin interaktionsabhängig gewachsen. 300 Klone wurden sequenziert. Es ergaben
sich 43 mögliche Interaktionspartner für Nore1.
Verifikation positiver Klone durch Segregation
Die erhaltenen Plasmide, die für Fragmente der möglichen Interaktionspartner kodieren,
wurden aus den Hefen isoliert und im Bakterium TG1 amplifiziert. Eine
Kotransformation dieser Plasmide mit dem Nore1-Köder wurde zur Kontrolle
durchgeführt (s. Abb. 30). Bei positiver Interaktion wuchsen Hefe-Kolonien auf dem
Selektionsmedium THULLy. Zur Kontrolle, daß der Interaktionspartner selber nicht
DNA bindet, um die Histidin-Synthese (Selektionsmarker) in der Hefe zu induzieren,
82
wurden die erhaltenen Plasmide mit Leervektor kotransformiert. Kolonien auf dem
UTL-Medium bestätigen positive Transformation.
Abb. 30 Kontrolltransformationen. Positivkontrolle (A), hier sind relativ viele Kolonien auf dem Selektionsmedium
nur mit dem 2-Hybridvektor pBTM 116* mit Nore1 fl. Insert gewachsen, bei der Negativkontrolle (B)
hingegen nicht. Hierbei handelt es sich um einen falschpositiven Klon.
Durch die Kotransformation konnte eine Reihe Falschpositiver identifiziert werden.
Anschließend wurden die durch die Kotransformation als positiv identifizierten Klone
sequenziert. Sequenzvergleiche mit Datenbanken mit dem Programm BLAST (Altschul
et al., 1990) ergaben dadurch weitere Falschpositive (z.B. Plasmidinserts, die 3’-5’ in
pVP16 kloniert waren). In Tab. 8 sind die gefundenen, möglichen Interaktionspartner
gruppiert dargestellt und in Tab. 9 die Funktionen der einzelnen Interaktionspartner
zusammengefaßt.
83
Gruppe
Proteine
Anzahl
Falschpositive
Clic4, SH3D5, Fbx5, ADPrt1, PHAX, ADP, Hnrp U, 14
Snrp70, Cu/Zn Dismutase (Sod1), Crim1, L18,
Mbeta4, Plag 12, Polg
Proteine des Cytoskeletts
MAP1B, MacF
DNA bindende Proteine
CHD4, Pole, Bdp, Pax3, ALL1, Tbx1, eIF4γ2, 9
NAT1, SerRSmt
regulatorische Proteine
MSS4, S/T PP, Spry1, RNF4
4
LDLR-verwandte Proteine
LDP6, LRP1, Megalin
3
2
sonstige
Tab. 8
11
Gruppierung der im 2-Hybrid gefundenen Interaktionspartner.
Interaktionspartner
Funktion
Übersicht
MAP1B
Microtubule associated protein Spielt eine Rolle in cytoskeletalen Änderungen Noble et al. (1989)
1B
bei Neuritextensionen.
MSS4
mammalian suppressor of Sec4
Guaninnukleotid-Austauschfaktor
Sec4/Ypt1/Rab-Familie
Spry1
Sprouty homologue 1
Antagonist der FGF-Pathways; negativer Minowada et al. (1999)
Modulator der respiratorischen Organogenese
MacF
Microtubule-actin crosslinking F-actinbindendendes Protein, involviert bei der Leung et al. (1999)
factor
Quervernetzung von Actin an andere Proteine des
Cytoskeletts; bindet auch an Microtubuli
LCCP
Leman Coiled Coil Protein
S/T PP
Ser/Thr protein Phosphatase Typ Dephosphoryliert spezifisch
1α
Serine und Threonine
Pole1
DNA Polymerase ε
CHD4
Chromodomain helicase DNA möglicher Transkriptionsaktivator
binding protein 4
eIF4γ2
eucaryotic translation initiation bindet an eIF4A und eIF3, aber nicht an eIF4E; Shaughnessy
factor 4, γ2
inhibiert CAP-abhängige Translation/Vermittelt (1997)
Resistenz gegenüber IFγ induz. Apoptose
SerRSmt
mitochondrial
Synthetase
megalin
Megalin
Mitglied der LDL Rezeptor Familie
tenascin
Tenascin-C
Inhibiert Zellmigration;
verschiedene Integrine
LRP6
low density lipoprotein-related
protein 6
RNF4
RING finger protein 4
verstärkt
steroiderezeptorvermittelte Galili et al. (2000)
Transkriptionsaktivierung;
aktiviert
auch
Basaltranskription
NAT1
novel APOBEC-1 target No. 1
Synonym zu eIF4γ2
Tab. 9
für
unbekannt
die Feig (1994), Yu und
Schreiber (1995)
Kessler und Brunet
(unveröffentlicht)
phosphorylierte Sangrador (1998)
Enzym des DNA-Reparatur- und chromosomalen Huang et al. (1999)
DNA-Replikationssystems
Seelig et
1996)
al.
(1995;
et
al.
seryl-tRNA Katalysiert die Acylierung von Serin an seine Yokogawa et al. (2000)
zugehörige tRNA
ist
Saito et al. (1994)
Ligand
für Saga et al. (1991)
Brown et al. (1998)
Übersicht der Funktionen einzelner, möglicher Interaktionspartner
84
Semiquantitative Bestimmung von Bindungsaffinitäten
Mit einem β-Galactosidase-Assay („GalactoStar“) konnte eine semi-quantitative
Aussage über die Stärke der Interaktion gewonnen werden. Durch die Interaktion der
beiden
Proteine
in der
Transkriptionsfaktors
u. a.
Hefe
auch
wurde
durch Bildung
β-Galactosidase
eines
exprimiert.
funktionsfähigen
Die
Menge
der
exprimierten β-Galactosidase ist proportional zur Stärke der Interaktion der beiden
Proteine. Dieser Assay ermöglicht die Messung einer durch β-Galactosidase
umgesetzten Substanz durch Detektion infolge der Reaktion auftretenden Lumineszenz.
In Abb. 31 sind alle gefundenen Interaktionspartner von Nore1 fl. aufgeführt und auf
die bekannte Interaktion mit Ras (1-167) normiert.
Abb. 31 Ergebnis des semiquantitativen β-Galactosidase-Assays („GalactoStar“). Rot dargestellt sind diejenigen
Interaktionspartner, deren Interaktionen mit Nore1 fl. im weiteren Verlauf charakterisiert werden sollen. Die
relative β-Galactosidase-Aktivität ist jeweils auf die bekannte Interaktion mit Ras normiert worden.
Aus diesen wurden dann 14 Proteine ausgewählt (rot markiert in Abb. 31), deren
relative β-Galactosidase-Aktivität über der von Ras lag, und weiter charakterisiert.
Das Programm SMART ergab mögliche Domänenstrukturen und Lage dieser in den
einzelnen Proteinen (Abb. 32). Die Balken oberhalb der Domänenstrukturdarstellung
kennzeichnen das in dem 2-Hybrid identifizierte Proteinfragment, das mit Nore1 fl.
interagiert.
85
Um auszuschließen, daß die zu charakterisierenden Proteine nicht zufällig eine
Konsensussequenz in dem mit Nore1 interagierenden Fragment enthalten, wurde ein
Alignment über alle ausgewählten Interaktionspartner erstellt. Dabei stellte sich heraus,
daß
diejenigen
Proteinfragmente,
die
mit
Nore1
interagieren,
keinerlei
Konsensussequenz aufwiesen. Jedes Fragment wird demzufolge an verschiedene
Bereiche von Nore1 binden.
Abb. 32 Domänenstruktur ausgewählter Interaktionspartner, wie sie durch SMART vorausgesagt wurden. Oberhalb
der einzelnen Interaktionspartner sind diejenigen Fragmente mit aufgeführt, die im 2-Hybrid identifiziert
wurden und möglicherweise mit Nore1 fl. interagieren. Zum Teil liegen diese Fragmente in definierten
Domänen.
Identifikation von HIS3- und lacZ-positiven Hefetransformanten
Die
mit
den
beiden
Plasmiden
pBM116/Nore1 fl.
und
pVP16/cDNA-Bank
transformierten ScL40-Hefezellen wurden abschließend zur Identifikation von HIS3positiven Transformanten auf Selektivnährböden (THULLy) ausgestrichen, dem X-Gal
als Substrat für die β-Galactosidase beigefügt wurde. Führt die Interaktion zwischen
Nore1 (Köder) mit einem Protein der cDNA-Bank zur Rekonstitution des
Transaktivatorkomplex, wird infolge dessen die Transkription des Reportergens HIS3
86
angeregt. Es bilden sich Kolonien, die Histidin-prototroph sind. Parallel wird die
Expression des zweiten Reportergens lacZ angeregt, was zu einer Expression von βGalactosidase führt. Die Aktivierung des lacZ-Reportergens geschieht analog zur
Aktivierung des HIS3-Reportergens. Von den 14 ausgewählten Proteinen zeigten alle
eine positive β-Galactosidasefärbung (Blaufärbung, Abb. 33).
Abb. 33 HIS3- und lacZ-positive Hefetransformanten. Es wurden jeweils pBTM116/Nore1 fl. und pVP16/Interaktionspartner in ScL40 transformiert und auf THULLy-, bzw. THULLy-X-Gal-Nährböden ausplattiert. Bei
Interaktion zwischen Nore1 und einem Interaktionspartner werden die Histidinsynthese und βGalactosidaseexpression angeregt. Letztere kann das Substrat X-Gal umsetzen und ruft eine Blaufärbung
hervor.
Um Kontaminationen bei der Ausplattierung zu vermeiden, wurden die Hefen vorher
großflächig auf THULLy-Nährböden ausplattiert und nach 4 Tagen von diesem
Heferasen einige Kolonien ausgewählt und erneut ausplattiert. Es wurde jeweils eine
Zahnstocherspitze Hefe ausplattiert.
Die transformierten Hefen wuchsen auf dem THULLy-Medium nach 3 Tagen zu der in
Abb. 33 dargestellten Dichte heran. Auf THULLy-X-Gal-Nährböden wuchsen die
Hefen generell schlechter. Vermutlich wirkt sich das β-Galactosidase-Substrat X-Gal
negativ auf das Hefewachstum aus.
87
Kotransformation mit Nore1-Fragmenten
Um zu testen, welche Nore1-Fragmente für die einzelnen Interaktionen mit den im 2Hybrid gefundenen Protein-Fragmenten verantwortlich sind, wurden die einzelnen
Domänen von Nore1 separat und als Konstrukte aus mehreren Domänen in pBTM116
kloniert und zusammen mit den Interaktionspartnern in ScL40 kotransformiert. Die
Ergebnisse sind in Abb. 34 dargestellt.
Bei den Nore1-Konstrukten wurde darauf geachtet, den C-Terminus entsprechend der
Domänenvorhersage durch SMART zu klonieren.
Da der N-Terminus an die DNA-bindende Domäne des sich auszubildenden
Transkriptionsfaktors
fusioniert
ist,
muß
an
dieser
Seite
ein
verlängertes
Verbindungsstück (Linker) eingebaut werden, damit sich das Konstrukt genügend
flexibel bewegen kann, um mit den Interaktionspartnern zu interagieren. Durch diesen
Linker haben die beiden Domänen des Transkriptionsfaktors im Falle einer Interaktion
genügend Platz, einen funktionellen Komplex bilden zu können.
Als Negativkontrollen wurden die experimentellen Grenzen der Minimaldomänen
verwendet (198-413; 95-166, 198-358, 370-413).
experimentelle Minimaldomäne
Minimaldomäne mit Linker
PRO
—
1-111
PRO-C1
—
1-174
PRO-C1-RBD
—
1-358
C1
95-166
1-166
C1-RBD
95-358
95-358 + 1-358
C1-RBD-CC
95-413
95-413 + 1-413
RBD
198-358
188-358
RBD-CC
198-413
188-413
CC
370-413
335-413
fl.
—
1-413
Tab. 10 Klonierte Fragmente für den 2-Hybrid. Aufgeführt sind die experimentellen Minimaldomänen, wie sie für
die Proteinexpression verwendet werden und die durch einen Linker verlängerten Domänen, die für den 2Hybrid in pBTM116 kloniert werden.
88
Abb. 34 Kotransformationen der einzelnen Domänen von Nore1 in Kombination mit ausgewählten
Interaktionspartnern. Kontrolle ist die Interaktion mit Ras (1-167). Das jeweils zu testende Fragment ist in
der Domänensruktur blau dargestellt; nd steht für nicht bestimmt.
89
Aufgrund dieser Ergebnisse lassen sich die Interaktionspartner, wie in Tab. 11 zusammengefaßt, gruppieren. Des weiteren wurde die N-terminale, prolinreiche Region für
keine Interaktion benötigt, da sowohl Nore1 fl., als auch Nore1 (95-413) mit allen
Interaktionspartnern interagierten.
Fragment
1-111 1-174 1-413 95-174 95-358 95-413 188-358 335-413
Interaktionspartner
-
-
+
-
+
+
+
-
Map1B (2001-2143) -
-
+
-
+
+
+
+
Spry1 (131-245)
-
-
+
-
+
+
+
-
MSS4 (1-123)
-
-
+
-
+
+
+
-
LCCP (38-166)
-
+
+
-
-
+
-
+
SerRSmt (39-133)
-
-
+
-
-
+
-
+
tenascin (122-304)
-
+
+
-
+
+
+
-
RNF4 (27-168)
+
+
+
+
+
+
+
+
MacF (4301-4402)
-
+
+
-
-
+
-
+
LRP6 (1166-1334)
-
+
+
-
+
+
+
-
eIF4γ2 (1-170)
-
+
+
-
-
+
-
-
MG50 (1398-1496)
-
+
+
-
+
+
+
-
Pole1 (1189-1303)
-
-
+
-
-
+
-
+
CHD4 (272-400)
-
+
+
-
+
+
+
-
Ras (1-167)
-
-
+
-
+
+
+
-
S/T PP (1-109)
Tab. 11 Übersicht der Ergebnisse des 2-Hybrid. Interaktion mit dem betreffenden Nore1-Fragment ist durch ein +
(Plus) gekennzeichnet.
Durch die Kotransformation der einzelnen Interaktionspartner mit den Nore1Fragmenten stach RNF4 heraus, da es bei jeder Kotransformation immer zur Anregung
der Transkription des HIS3-Gens kam. RNF4 wurde dadurch auch als Falschpositiver
charakterisiert, obwohl es alle vorhergegangenen Tests positiv durchlaufen hat. Bei
tenascin und
MacF
ist
ebenfalls
eine
Beobachtung
zu verzeichnen.
Diese
Interaktionspartner scheinen an Konstrukte, die die Nore1-C1-Domäne enthalten, zu
binden. Jedoch nicht mit der Nore1-C1 alleine. Darüber hinaus scheint tenascin
ebenfalls nur mit der Nore1-RBD zu interagieren. Dieser Interaktionspartner scheint
90
aufgrund dieses Verhaltens ebenfalls als Falschpositiver zu sein, jedoch ist eine
eindeutige Aussage an dieser Stelle nicht möglich.
GST-Pulldown
Die GST-Fusionsproteine ausgewählter Interaktionspartner wurden im pGEX-Vektor in
E. coli BL21(DE3) transformiert und in 200 ml TB-Medium mit 100 µg/ml Ampicilin
bei 23°C nach IPTG-Induktion exprimiert.
Wie bei Material und Methoden beschrieben wurde der GST-Pulldown-Assay
durchgeführt.
In Abb. 35 sind die Ergebnisse dargestellt. Die Proben wurden vor der PAGE bei 95°C
für 10 min denaturiert.
Sowohl MSS4 als auch Map1B interagieren in diesem Assay mit der Nore1-RBD. Die
Bande bei 24 kD entspricht der GST-Bande, die sich durch die Nore1-Zugabe aus einer
nicht zu 100% gereinigten Probe an der GSH-Sepharose akkumuliert hat.
Pulldowns, die mit anderen Nore1-Konstrukten mit weiteren Interaktionspartnern
durchgeführt wurden, zeigten keine Bindung. In Tab. 12 sind die Ergebnisse des
Pulldowns zusammengefaßt.
91
Abb. 35 GST-Pulldown ausgewählter Interaktionspartner mit Nore1-RBD. Zur Kontrolle des GST-Pulldown sind
Ras und Rap mit aufgeführt. Ras und Rap sind mit GppNHp beladen. Bei allen mit Nore1-RBD
durchgeführten GST-Pulldowns tritt eine Bande bei 24 kD auf, welche zu GST gehört, das durch die
Zugabe von Nore1-RBD aus einer nicht zu 100% gereinigten Probe zum Assay an der GSH-Sepharose
akkumuliert. Nore1-RBD ist die Bande bei ca. 20 kD (unterer Pfeil). Spur 1: GST-Fusionsprotein; Spur 2:
GST-Fusionsprotein mit Nore1-RBD; Spur 3: Überschüssiges Nore1-RBD im Überstand; Spur 4: letzter
Waschschritt; M: Marker-Bande
Ras (fl.) GppNHp
Nore1-RBD
Bindung
Rap1A c’ GppNHp
Nore1-RBD
Bindung
MSS4 (1-123)
Nore1-RBD
Bindung
MAP1B (2001-2143) Nore1-RBD
Bindung
tenascin (122-304)
Nore1-C1-RBD keine Bindung
LCCP (38-166)
Nore1-CC
keine Bindung
Pole1 (1189-1303)
Nore1-CC
keine Bindung
Spry1 (131-245)
Nore1-RBD
keine Bindung
eIF4γ2 (1-170)
Nore1-C1-RBD keine Bindung
Tab. 12 Tabellarische Zusammenfassung der Pulldown-Ergebnisse.
92
Affinitätsmessungen
Mit dem 2-Hybrid-Assay wurden verschiedene mögliche Interaktionspartner gefunden.
Für einige von ihnen konnte eine direkte Interaktion mit Nore1 (-Fragmenten) gezeigt
werden.
Mit Hilfe der ITC (Isotherme Titrationskalorimetrie) und durch Fluoreszenzmessungen
(GDI-Effekt) konnten für MSS4 (1-123) und MAP1B (2001-2143) Affinitätskonstanten
bestimmt werden.
Für MSS4 (1-123) konnte im ITC direkt eine Affinität gemessen werden (Abb. 36). Der
Wert für die Dissoziationskonstante KD wurde auf 1,4 µM bestimmt. Durch 2-Hybrid
Kotransformationen war herausgefunden worden, daß die Nore1-RBD für die
Interaktion mit MSS4 verantwortlich ist. Vorlage von Nore1-RBD und Titration eines
Gemisches aus Ras fl. GppNHp und MSS4 resultierte in einer 7fach verringerten
(apparenten) Affinität von Nore1-RBD an Ras (9,4 µM).
Titration von Nore1-RBD (K302A) mit MSS4 zeigte keine mit ITC meßbare Bindung
mehr. Diese Mutation bewirkt somit einen drastischen Abfall der Affinität zwischen
Nore1-RBD und MSS4. Bei Ras hingegen hat diese Mutation einen 5-15fachen Effekt
(1,5-1,2 µM) auf die Affinität.
Die Nore1-C1 Domäne einen negativen Einfluß auf die Affinität zwischen Nore1 und
MSS4.. Nore1-C1 bindet alleine nicht an MSS4.
Im Gegensatz zu der Bindung zu Ras hat die C1-Domäne einen negativen Einfluß auf
die Bindung von Nore1 an MSS4. Vermutlich sind hier sterische Gründe zu nennen; der
Einfluß der C1-Domäne verringert die Affinität fast 8fach.
Die Dissoziationsgleichgewichtskonstante zwischen Rab3a fl. nukleotidfrei und MSS4
wurde ebenfalls bestimmt. So ergibt sich ein KD von 3 µM bei 25°C.
Die Tab. 13 faßt die ITC-Ergebnisse zusammen.
93
Abb. 36 ITC-Diagramm. A: Gemessene Interaktion zwischen MSS4 (1-123) und NoreRBD (198-358). B: Zu Nore1RBD wird ein Gemisch aus MSS4 (1-123) und Ras fl. GppNHp titriert. Zu erkennen ist die relativ schnelle
Sättigung. Die apparente Dissoziationsgleichgewichtskonstante wurde auf 9,4 µM bestimmt.
ProteinSpritze
ProteinZelle
T [°C] N
KD [µM]
GST-eIF4γ2 (1-170)
Nore (95-166)
25
keine Bindung
GST-Spry1 (131-245)
Nore (95-166)
25
keine Bindung
GST-Spry1 (131-245)
Nore (100-413)
25
keine Bindung
GST-Spry1 (131-245)
Nore (198-358)
25
keine Bindung
LCCP (49-166)
Nore (198-413)
25
keine Bindung
MSS4 (1-123)
Nore (95-166)
25
keine Bindung
MSS4 (1-123)
Nore (95-358)
25
MSS4 (1-123)
Nore (100-413)
25
MSS4 (1-123)
Nore (198-358)
25
MSS4 (1-123)
Nore (198-358) K302A
25
keine Bindung
MSS4 (1-123)
RasSF1c (58-218)
25
keine Bindung
MSS4 (1-123)
Rab3a fl. nt-free
25
0,8
3,07
MSS4 (1-123)/H Ras fl GppNHp
Nore (198-358)
25
0,5
9,35 (apparent)
LCCP (49-166)
Nore (370-413) L379M
25
keine Bindung
tenascin (122-304)
Nore (188-372)
20
keine Bindung
1,4
10,59
keine Bindung
0,9
1,36
Tab. 13 Übersicht über die durch ITC-Messungen erzielten Dissoziationsgleichgewichtskonstanten. Dabei wurde
stets ein Nore1-Fragment in der Zelle vorgelegt und der Interaktionspartner in jeweils 10fach höherer
Konzentration hinzu titriert. Sämtliche Messungen wurden in Puffer X durchgeführt. N ist hierbei der
Stöchiometrie-Faktor.
94
Kompetetiver GDI
Im kompetetiven GDI-Assay wurde ein Komplex aus Ras fl. (mit mGppNHp beladen)
und NoreRBD, bzw. jedes andere Konstrukt mit RBD in der Küvette vorgelegt und mit
einem Interaktionspartner titriert. Die Änderung von kobs wird detektiert und der Einfluß
des Interaktionspartners auf die Nore1-Ras-Interaktion mit dem Programm Scientist
analysiert.
In diesem Assay konnten für MSS4 (1-123) und für Map1B (2001-2143) Interaktionen
gezeigt werden.
In Abb. 37 sind die Ergebnisse des kompetetiven GDI-Assays für Nore1-RBD/Ras fl.
mit MSS4 dargestellt. Zu erkennen ist ein relativ steiler Anstieg von kobs, was eine in
Abhängigkeit von der MSS4-Konzentration schnellere Dissoziation des mantNukleotids (mGppNHp) von Ras darstellt. Der Nukleotid-Austausch wird durch das
Entfernen der Nore1-RBD durch MSS4 aus dem Ras-Nore1-RBD-Gleichgewicht
hervorgerufen.
Der Assay mit Map1B hingegen zeigt einen sehr steilen Anstieg von kobs. Dies weist auf
eine relativ hohe Affinität zwischen Nore1-RBD und Map1B (Abb. 37), höher als die
Affinität zwischen Nore1-RBD (und auch Nore1-RBD-CC) und Ras fl. Dies ist auch
durch den semiquantitativen β-Galactosidase-Assay bestätigt worden, hierbei ist die
relative β-Galactosidase-Aktivität für Map1B 2,5fach höher als bei Ras. Die Coiled Coil
Domäne hat keinen Einfluß auf die Bindung von Map1B an die Nore1-RBD (s. Abb.
37).
95
Abb. 37 Graphische Darstellung des kompetetiven GDI mit MSS4 (1-123) und Nore1-RBD (198-358), bzw.
Map1B (2001-2143) mit Nore1-RBD und Nore1-RBD-CC. Mit zunehmender MSS4-/Map1BKonzentration wird Nore1-RBD/Nore1-RBD-CC aus dem Gleichgewicht mit Ras entfernt, was eine
Änderung von kobs mit sich zieht.
Die Anpassung der Daten an das Scientist-Modell (s. Anhang) ergab die in Tab. 14
aufgelisteten Affinitätskonstanten.
KD [µM]
NoreRBD (198-358)
MSS4 (1-123)
2,01
NoreRBD (198-358)
Map1B (2001-2143) 0,040
Nore1 (198-413)
Map1B (2001-2143) 0,045
Tab. 14 Dissoziationskonstanten KD, wie sie durch den kompetetiven GDI-Assay bestimmt wurden.
96
Gelretardationsassay (Gelshift)
Oft werden Protein-DNA-Interaktionen durch Coiled Coil Domänen vermittelt. Um zu
überprüfen, ob Nore1 mit seiner Coiled Coil Domäne an DNA bindet, wurden
Gelretardationsassays durchgeführt. Dazu wurde zu einer konstanten Menge Coiled
Coil ansteigend DNA zugeführt und im Agarosegel überprüft, ob die DNA infolge einer
Bindung an das Protein ein anderes Laufverhalten als reine DNA aufwies. Als DNA
wurden verschiedene Plasmide (verdaute und unverdaute Fragmente) und synthetische
Oligonukleotide (AT-, bzw. GC-reich) verwendet.
Es konnte keine Bindung zwischen Nore1-CC und DNA im Gelretardationsassay
gezeigt werden.
Dimerisierung von Nore1
Bei der Analyse der Primärstruktur von Nore1-CC mit Vorhersageprogrammen für
Coiled Coils wurde ein Dimer vorausgesagt. Die verwendeten Säulenmaterialien
(Superdex S75 und S200) hatten ein zu geringes Auflösungsvermögen, als daß sie ein
Nore1-CC-Dimer (ca. 10,8 kD) von einem Monomer auf einer Gelfiltration hätten
auftrennen können. Ebenso waren native Gele bei solch einer Größe nicht erfolgreich.
DLS-Untersuchungen waren ohne Erfolg, was auf eine mögliche, langgezogene und
gestreckte Struktur von Nore1-CC-Dimeren zurückzuführen war.
Durch ITC-Experimente, bei denen eine konzentrierte Nore1-CC-Lösung in Puffer
titriert wurde, konnte eine Komplexbildungskonstante abgeschätzt werden. In Abb. 38
ist ein ITC-Experiment exemplarisch wiedergegeben.
Die Komplexdissoziationskonstante KD konnte mit Hilfe des im Anhang aufgeführten
Modell mit dem Programm Scientist auf einen Mindestwert von ca. 15 µM bestimmt
werden.
Ein CC-Dimer bestätigte sich später auch in der Struktur (s. weiter unten).
97
Abb. 38 Mit Scientist angepaßte Daten eines ITC-Experiments. Hier wurde 1 mM Nore1-CC in 8 µl Schritten bei
25°C in Puffer X titriert.
Gelfiltrationsanalysen mit einem RBD-CC-Konstrukt hingegen waren bzgl. der
Darstellung eines Dimers erfolgreich. Es konnten Dimer (50 kD) und Monomer (25 kD)
erfolgreich voneinander getrennt werden.
Dazu wurden 1 mg Nore1-RBD-CC in Puffer X mit 2 mM DTE und 200 mM NaCl mit
einer Flußgeschwindigkeit von 0,25 ml/min auf einer analytischen und kalibrierten
Superdex S200 30/10
über
eine
ÄKTA-FPLC
(Pharmacia,
Schweden)
chromatographisch aufgetrennt. In Abb. 39 ist das Elutionsdiagramm aufgeführt.
98
Abb. 39 Analytische Gelfiltration. Auf einer kalibrierten Superdex S200 wurden jeweils ca. 1 mg des jeweiligen
Proteins aufgetragen. Nore1-RBD-CC eluiert hauptsächlich als Monomer (Ve/V0 = 0,52), Nore1-RBD
eluiert ausschließlich als Monomer (Ve/V0 = 0,55), der Peak bei Ve/V0 = 0,51 stammt von Verunreinigungen
durch GST.
Ve/V0
Masse [kD]
Nore1-RBD
0,55
17,1
Monomer
0,51
40
GST-Dimer (?)
0,52
30
Monomer
0,47
60
Dimer
40
GST-Dimer (?)
Nore1-RBD-CC
GST
0,51
Tab. 15 Auf das Gesamtelutionsvolumen V0 normierte Elutionsvolumina Ve der durchgeführten analytischen
Gelfiltrationen. Anhand einer Kalibrierkurve konnten die Massen bestimmt werden.
99
Strukturen
Nore C1
Die Nore1-C1-Domäne (Fragment 95-174) wurde mit
15
N und
13
C markiert und die
Struktur mittels NMR von Elena Guiberman (AG Dr. Peter Bayer) gelöst.
Die Zuordnung erfolgte anfangs durch kombinierte Auswertung von COSY-, TOCSYund NOESY-Experimenten. Durch die Doppelmarkierung konnten viele Probleme der
Zuordnung überwunden werden, da sich die großen skalaren 1J-Kopplungskonstanten
zu den 15N- und 13C-Kernen zunutze gemacht werden konnten, die im Gegensatz zu den
3
JHH-Kopplungen aus den homonuklearen Messungen weitgehend unabhängig von der
Sekundärstruktur sind und auch bei größeren Molekülen einen recht effizienten
Magnetisierungstransfer erlauben.
Im heteronuklearen Tripelresonanz-Experiment
HNCO wird die Magnetisierung vom Amidproton (HN) über den Amidstickstoff (N)
zum Carbonyl-Kohlenstoff (CO bzw. C’) der Vorgänger-Aminosäure (und zurück)
übertragen.
Zweidimensionale und dreidimensionale NOESY- und TOCSY-Spektren sowie 1H-15NHSQCs wurden bei 800 MHz, die restlichen heteronuklearen Datensätze bei 600 MHz
Resonanzfrequenz gemessen.
Die aus den Messungen und Zuordnungen resultierende Struktur ist in Abb. 40
dargestellt. Der C-Terminus könnte eine Helix ausbilden, jedoch kann diese aus Mangel
an NOEs nicht definiert werden (Elena Guiberman, persönliche Mitteilung).
Die Struktur war bis dato noch zu ungenau, als daß detailiert über deren Charakteristika
beschrieben werden könnte. Selbst ein Vergleich mit PKC-C1 oder Raf-C1 wäre in
diesem Stadium noch zu vage.
100
Abb. 40 NMR-Struktur der Nore1-C1 (Fragment 95-174). Die gebundenen Zink-Ionen sind in blau dargestellt.
Kristallisation
Die
Struktur
der
C-terminalen
Coiled
Coil
Domäne
von
Nore1
wurde
röntgenkristallographisch gelöst. Nore1-CC ist als Fragment 370-413 sehr gut
exprimierbar und auch löslich. Um zu überprüfen, daß Nore1-CC in Lösung eine
Sekundärstruktur
aufwies,
wurden
Experimente
mit
einem
CD-Spektrometer
durchgeführt. Hierbei wurden 30 µM Nore1-CC in 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,3 in
einer 0,05 cm dicken Quartzküvette verwendet. Es wurde im Bereich 250-190 nm
gescannt. In Abb. 41 ist ein Scan bei 25°C dargestellt.
Abb. 41 CD-Spektrogramm für Nore1-CC. Gemessen bei 25°C, 30 µM Nore1-CC in 20 mM Phosphatpuffer,
pH 7,3. Es wurden 15 Scans gemessen und gemittelt. Die Auswertung erfolgte mit dem Dichroweb
Webserver.
101
Daneben wurde mit Hilfe der CD-Spektroskopie ein Temperaturscan durchgeführt und
die Veränderung der Sekundärstruktur verfolgt (s. Abb. 42).
Abb. 42 Temperaturscan von Nore1-CC mit Hilfe CD-Spektroskopie. A: Nore1-CC wurde in 5°C-Schritten von
25°C auf 100°C im CD-Spektrometer aufgeheizt und die Änderung der Sekundärstruktur optisch verfolgt.
B: Beobachtete Änderung von Theta (Θ) bei 222 nm. Man erkennt die temperaturabhängige Denaturierung
von Nore1-CC. Messungen wurden in 20 mM Phosphat-Puffer, pH 7,3 bei einer Nore1-CC Konzentration
von 30 µM durchgeführt.
Gereinigtes Nore1-CC (Wildtyp) kristallisierte über Nacht unter den in Tab. 16
angegebenen Bedingungen in ca. 150 x 120 x 30 µm großen Kristallen (Abb. 43). Durch
Seeden mit zuvor zerkleinerten Kristallen wurde die Größe der Kristalle geringfügig
erhöht.
Da sich Cadmium für die Kristallisation als notwendig erwies, wurde versucht,
Cadmium durch Zink oder Calcium zu ersetzen, um diese Ionen als anomale Streuer bei
der Phasierung zu verwenden. Cadmium ist im Gegensatz zu den beiden Letztgenannten
102
ein sehr schlechter anomaler Streuer. Ein Austausch von Cadmium durch ein anderes
mono- oder bivalentes Ion mit ähnlichem Ionenradius lieferte keine Kristalle.
Für die Datensammlung bei 100 K wurde Paraffinöl (wasserfrei), bzw. Mutterlauge als
Cryoagens verwendet. Beste Ergebnisse wurden mit Paraffinöl erzielt.
Für die Phasierung wurde gereinigtes Nore1-CC mit der Mutation L379M als SeMetVariante kristallisiert. Diese Mutante wurde gewählt, da einerseits Leucin chemisch
gesehen dem Methionin ähnelt und da dieser Rest in Vorhersageprogrammen keine
Änderung (Verschiebung) des Heptad-Motivs bewirkte (L379 und M379 besetzen beide
eine d-Position im Heptad-Motiv). Die Inkorporation von SeMet wurde durch MALDI
überprüft.
Die
in
Tab.
16
aufgelisteten
Bedingungen
führten
zu
einem
Kristallisationserfolg. Man erkennt die unterschiedliche Kristallform im Vergleich mit
dem
Wildtyp
(Abb.
43).
Die
Prozessierung
erbrachte
eine
vom
Wildtyp
unterschiedliche Raumgruppe. Wie Tab. 23 zu entnehmen kristallisiert SeMetsubstituiertes Nore1-CC in der Raumgruppe I222, wohingegen der Wildtyp in C2221
kristallisiert. Dadurch resultiert auch die Änderung der Zellkonstanten der beiden
Kristalle. Die SeMet-Variante bildete Kristalle von 150 x 60 x 30 µm Größe. Bei der
SeMet-substituierten Mutante wurde als Cryoagens ausschließlich Mutterlauge
verwendet.
Auch hier konnte die Größe der Kristalle durch Seeden mit zerkleinerten Kristallen und
durch Zugabe des Additivs Dioxan geringfügig erhöht werden (etwa gleiche Größe wie
beim Wildtyp).
Zur Überprüfung, daß die Coiled Coil Domäne alleine kristallisiert ist, wurden einige
Kristalle gesammelt, in Präzipitationslösung gewaschen und in SDS-Probenpuffer
aufgelöst in einer PAGE analysiert. Die Proteine wurden durch Silberfärbung sichtbar
gemacht.
103
Abb. 43 Kristalle der Nore1-Coiled Coil (370-413) Domäne. A: Wildtyp; B: L379-Mutante, SeMet Variante.
Nore1-CC (Wildtyp)
Nore1-CC (L379M, SeMet)
Konzentration
17,8 mg/ml
10 mg/ml
PEG 400
25-26%
28-30%
Natriumacetat, pH 4,6
100 mM
100 mM
Cadmium-Chlorid
45-50 mM
50-55 mM
Dioxan
---
6%
Temperatur
18°C
18°C
Tab. 16 Kristallisationsbedingungen der Coiled-Coil Domäne von Nore1.
Die Daten wurden bei 100 K am ESRF (Grenoble) gesammelt. Die erhaltenen
Diffraktionsintensitäten wurden mit den Programmen XDS Vers. Sept. 2002 (Kabsch,
1988) und DENZO (Otwinowski und Minor, 1997) integriert und mit dem Programm
XDSCONV Vers. Sept. 2002 (Kabsch, 1988), bzw. TRUNCATE des CCP4
Programmpakets (Collaborative Computational Project, 1994) auf ihre Strukturfaktoren
reduziert.
104
Modellbau und Verfeinerung
Experimentelle Phasen wurden vom SeMet-Datensatz (Raumgruppe I222) mit den
Programmen CNS (Brunger et al., 1998) und SOLVE (Terwilliger und Berendzen,
1999) durch SAD bestimmt. Da bei mehreren Wellenlängen Daten gesammelt wurden,
wurde ebenfalls MAD versucht, wobei die besten Ergebnisse durch SAD erzielt
wurden.
Mit den experimentellen Phasen wurde eine Elektronendichte gerechnet (FFT des
CCP4-Programmpakets) und anhand der durch SOLVE bestimmten Positionen der
Selene das Modell als antiparalleles Homodimer gebaut. Dieses Modell wurde bis zu
einem freien R-Faktor von 40,2% bei einer Auflösung von 2,8 Å verfeinert.
Dieses Modell wurde als Modell für einen molekularen Ersatz mit dem Programm
AMORE (Teil des CCP4-Programmpakets) verwendet, um Phasen für das WildtypProtein aus dem nativen Datensatz (Raumgruppe C2221) zu erhalten. AMORE lieferte
genau eine Lösung mit signifikant höherer Korrelation und niedrigen R-Faktoren. Das
Wildtyp-Protein wurde anschließend mit den Programmen CNS und REFMAC5
(Programm des CCP4-Programmpakets) zu einem freien R-Faktor von 23,3%
verfeinert. Wassermoleküle wurden mit denselben Programmen eingefügt. CadmiumIonen wurden durch Differenz-Fourier-Dichten anhand des anomalen Streusignals der
Cadmium-Ionen verifiziert.
Die Datenstatistik ist im Anhang aufgeführt.
Coiled Coil-Struktur
Wie durch entsprechende Programme (Lupas, 1997; Walshaw et al., 2001)
vorhergesagt, liegt bei dem Fragment 370-413 von Nore1 ein antiparalleles,
linksgängiges Coiled Coil vor.
Die Zuteilung des Heptadmotivs ist in Abb. 44 dargestellt. Dabei wurden zwei Stutter
gefunden (Vier-Reste-Insertionen in eine Sequenz mit einem kontinuierlichen HeptadMotivs; Reste A/B383-A/B385, A/B401-A/B404). Stutters bewirken eine lokale
Erniedrigung der Supercoilausdehnung, da sie die Windung (Turn) leicht verringern.
Stutters drängen Reste in der a-Position in Richtung Corezentrum, was in einer
speziellen Geometrie (sog. x-layer: abcdefgxefg) resultiert, während die Reste in d105
Positionen aus dem Core herausgedrängt werden. Bemerkenswert ist auch die Tatsache,
daß die a- und d-Positionen an zwei Stellen von Glutaminsäure A/B383 und Tyrosin
A/B394 als nicht hydrophobe Aminosäuren besetzt werden. Diese Abweichungen von
der verlangten hydrophoben Besetzung dieser Positionen sind nach Walshaw et al.
(2001) relativ häufig.
Es sind sehr wenige ionische Wechselwirkungen im Interface der Struktur beobachtbar.
So bilden A383 mit B398 (Glutaminsäure/Arginin; 3,09 Å), A398 mit B383
(Arginin/Glutaminsäure; 2,73 Å) und A398 mit B380 (Arginin/Glutaminsäure; 3,30 Å)
die einzigen Salzbrücken innerhalb des core-bildenden Heptad-Motivs; die Reste A380
und A383 kontaktieren die B-Helix (Arginin 398) neben der Salzbrücke noch über
Wassermoleküle.
Abb. 44 Schematische Darstellung der Anordnung der Reste in der Coiledcoil-Struktur. Das Heptad-Motiv ist durch
a, b, c, d, e, f, g gekennzeichnet. Der durch Elektronendichte definierte Bereich ist grau unterlegt.
Hydrophobe interhelikale Interaktionen sind durch weiße Balken dargestellt, ionische Wechselwirkungen
gestrichelt. Interhelikaler Kontakt über Wassermoleküle sind mit einem blauen Kreis dargestellt. Die mit *
gekennzeichneten Aminosäuren sind in der Struktur nicht sichtbar und zu Alanin mutiert. Die auftretenden
Stutter
im Heptadmotiv sind schwarz hervorgehoben. In Helix B ist das Serin (kursiv) der
Thrombinschnittstelle in der Elektronendichte definiert.
106
Orientierung
Die Nore1-Coiled Coil Domäne liegt in der Struktur als antiparalleles Dimer vor. Die
relative Lage der beiden Helices ist etwas verschoben, wobei ausreichend Platz für die
N-terminale RBD vorhanden ist (Abb. 45). Eine Dimerisierung eines RBD-Coiled Coil
Konstruktes (Nore1 198-413) konnte ebenfalls durch Gelfiltration gezeigt werden (Abb.
39).
Abb. 45 Coiled Coil Dimer mit der N-terminalen RBD. Um einen Eindruck über die Größenverhältnisse zu
bekommen, wurde die RBD als Kugel dargestellt. Die Größe der RBD entspricht der von Raf-RBD. Der
Linker zwischen RBD und CC umfaßt 22 Aminosäuren.
Charakterisierung des Interface
Das durch die beiden Helices abgedeckte (buried) Interface hat eine Gesamtgröße von
4671 Å2, wobei hydrophobe Interaktionen den größten Teil ausmachen (2083 Å2). Das
Interface-Volumen umfaßt 11628 Å3.
Die Oberfläche der Coiled Coil Struktur ist überzogen mit geladenen und polaren
Resten; viele von ihnen sind an kristallographischen Kontakten beteiligt (siehe weiter
unten). Eine Serie von geladenen Resten ist an den Positionen e und g des HeptadMotivs lokalisiert, die nicht im Coiled Coil Interfaces liegen und möglicherweise
intermolekulare elektrostatische Interaktionen eingehen können.
Besonders auffällig ist die durch die Reste A397Phe, A401Leu, B379Leu und B375Phe
aufgespannte hydrophobe Ebene innerhalb des Coiled Coil Interface, dieses Beispiel
demonstriert die hydrophobe Interaktion zwischen den beiden Helices (Abb. 46).
107
Abb. 46 Hydrophobe Ebene, die durch Phenylalanin und Leucin der beiden Helices beschrieben wird.
Wie bereits in der Einleitung beschrieben, ist eine notwendige Voraussetzung für das
Vorliegen einer Coiled Coil Struktur das Vorhandensein der Knopf/Loch-Packung. Die
im Rahmen dieser Arbeit gelöste Struktur zeigt bei einem Suchradius (Cutoff) von 8,0 Å
an 5 Stellen deutlich diese Packung. Hierbei handelt es sich in drei Fällen um eine
Typ 4 Interaktion (Reste A379Leu mit B394Tyr, B397Phe, B398Arg und B401Leu) und in
zwei Fällen um eine Typ 2 Interaktion (Reste A390Leu mit B383Glu, B386Lys, B387Ile und
B390Leu, s. Abb. 47 für Details). Bei einem Cutoff von 7,0 Å (bzw. 6,8 Å) ergeben sich
4 Stellen; je zwei vom Typ 4 und Typ 2 (Reste A379Leu mit B394Tyr, B397Phe, B398Arg
und B401Leu, bzw. Reste A390Leu mit B383Glu, B386Lys, B387Ile und B390Leu; Abb. 47).
Der Cutoff ist ein Maß der Dichte der Packung, je kleiner der Wert, desto geringer der
Suchradius für Interaktionspartner und somit näher an der idealen Packung, ausgewertet
mit dem Programm SOCKET (Walshaw und Woolfson, 2001)
108
Abb. 47 Typ 2 und Typ 4 Interaktionen, wie sie in der vorliegenden Coiled Coil Struktur vorliegen. Isolierte
Knopf/Loch-Interaktionen werden mit Typ 1 und Typ 2 bezeichnet. Wobei sich beim Typ 1 die „Knöpfe“
entlang des „Lochs“ positionieren, beim Typ 2 hingegen ragen die „Knöpfe“ direkt ins Loch. Beim Typ 2
befinden sich demnach sowohl der Schwerpunkt der Seitenketten als auch das äußerste Seitenkettenatom
zusammen innerhalb des Cutoffs (6,8, bzw. 8,0 Å) im Loch der gegenüberliegenden Helix. Bei Typ 3 und
Typ 4 ist ein Knopf selbst Teil eines Loches eines benachbarten Knopfes. Auch hier positionieren sich beim
Typ 3 die „Knöpfe“ entlang des „Lochs“, bei Typ 4 findet eine Kombination aus zwei Typ 2 Interaktionen
statt.
Das Programm PIA wird verwendet, um Kontaktflächen darzustellen. Das Programm
macht
einen Schnitt durch die Kontaktebene und projiziert alle beteiligten
Wechselwirkungen auf eine Ebene.
Das Interface ist in Abb. 48 graphisch wiedergegeben. Es ist zu bemerken, daß keinerlei
polare Interaktionen zwischen Helix A und B herrschen. Auch Wasserstoffbrücken
wurden nicht gefunden.
109
Abb. 48 Graphische Darstellung des hydrophoben Interface von Nore1 Coiled Coil. Schwarze Punkte: Grenze der
Oberflächen, die die Kontaktfläche vom umgebenden Wasser abschirmt; grüne Linien: Bereiche, in denen
die van-der-Waals-Radien weniger als 1 Å angenähert sind; schwarze Kreise: hydrophobe
Wechselwirkungen; magentafarbene Kreise: Salzbrücken; gelbe Kreise: Wassermoleküle, blau: CαRückgrat (Projektion) von Helix A. Die Größe der Kreise ist umgekehrt proportional zum Abstand zwischen
den Aminosäuren.
Betrachtet man die A-Helix, so beobachtet man eine Zunahme des Supercoil-Radius ab
Aminosäure A390Leu relativ zur B-Helix. Der Radius der durch die beiden Helices
beschriebenen Superhelix ändert sich von durchschnittlich 5,3 Å auf 6,35 Å am CTerminus von Helix A. Abb. 49 stellt den Radius der Superhelix (Interhelixabstand) als
Funktion der Aminosäurereste dar (Werte bestimmt mit dem Program TWISTER;
Strelkov et al., 2002). Für die B-Helix gilt entsprechendes. Um auszuschließen, daß
dieser Effekt durch flexible Reste verursacht wird, wurden die B-Faktoren näher
betrachtet. Eine Analyse dieser ergab keine signifikant abweichenden B-Faktoren am
jeweiligen C-Terminus.
110
Abb. 49 Graphische Darstellung des Superhelix-Radius (Interhelixabstand) als Funktion der Aminosäure-Nummer.
Zu erkennen ist eine Helix-Separation am C-terminalen Ende von Helix A von Helix B.
Kristallpackung
Wie eingangs beschrieben scheiterten Versuche, das Cadmium durch ein anderes Metall
zu ersetzen. Cadmium stand somit essentiell mit der Kristallpackung in Verbindung.
Die Struktur von Nore1-CC zeigt eine dichte Kristallpackung. Die Dimer-DimerKontakte werden im Kristall über vier Cadmium-Ionen vermittelt. Dabei treten DimerDimer-Kontakte N- und C-terminal und in der Mitte des Dimers auf.
Bei den N- und C-terminalen Kontakten wird ein Cadmium-Ion von 6 Liganden
koordiniert. B403Glu und B407Glu koordinieren das Cadmium Cd2 aus dem realen
Dimer. Symmetrieverwandte Dimere kontaktieren das Ion mit den Resten B408’Glu,
B403’Glu, A407’’Glu und A407’’’Glu. Analog wird das Cadmium-Ion Cd1 von A407Glu
im realen Dimer zusammen mit A407’Glu, B403’Glu, B407Glu, B403’’Glu und B407’’Glu
von symmetrieverwandten Dimeren koordiniert (Abb. 50).
111
Abb. 50 Darstellung der Kristallpackung des Nore1 Coiled Coil Dimers. Grau dargestellt ist das reale Dimer mit im
Kontakt stehenden symmetrieverwandten Dimeren. Im rechten Teil ist die Detailansicht der CadmiumKoordination dargestellt. Helix A und B sind jeweils grau dargestellt. In oberen Detailansicht sind die
koordinierenden Wassermoleküle und das Magnesium-Ion der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt.
B388His koordiniert ein Cadmium (Cd3) zusammen mit einem symmetrieverwandten
B388’His. Die Anordnung ist fast planar. Ein Vergleich mit Chlorophyll lieferte eine
ähnliche Anordnung. Die fehlenden Liganden werden durch Wasser-Moleküle und
einem Magnesium-Ion ergänzt.
Cadmium Cd4 scheint alternative Positionen aufzuweisen, da für dieses Ion die
Differenz-Fourier Elektronendichte zwei deutliche, benachbarte Peaks aufweist.
Bestätigt wird diese Annahme durch die Tatsache, daß die Cd4 koordinierenden Reste
A392Glu aus dem realen Dimer und aus einem symmetrieverwandten in der
Elektronendichte nicht sichtbar sind. Cd4 ist ein mobiler Mediator der Kristallpackung
112
mit einem B-Faktor von 30 Å2 (Abb. 51). Im Vergleich dazu haben die übrigen
Cadmium-Ionen einen durchschnittlichen B-Faktor von 15-20 Å2.
Abb. 51 Darstellung der Kristallpackung. Koordination von Cadmium 3 durch Histidin B388 und B388’. Die
Cadmium 4 koordinierende Seitenkette Glutaminsäure A392 ist partiell ungeordnet. Aus diesem Grunde
liegt Cadmium 4 auch in alternativer Lokalisation vor. Helix A und B sind jeweils grau dargestellt.
Allgemein
sind
die
Reste
der
Helix
A
durch
fehlende
Kontakte
zu
Symmetrieverwandten nicht so gut definiert wie die Reste der Helix B. Helix A beginnt
mit Aminosäure A370Pro; Helix B weist hingegen sogar Dichte für den Rest Serin (ein
Rest der Thrombinschnittstelle) vor der ersten Aminosäure B370Pro auf (s. Abb. 44).
113
Bei Helix A sind die Reste A389Gln, A392Lys, A396Lys, A399Gln, A400Lys, A402Glu und
A403Glu partiell nicht geordnet und durch Alanin ersetzt worden. Bei Helix B ist
lediglich der Rest B371Glu nicht komplett sichtbar und demnach ebenfalls durch Alanin
ersetzt worden.
Modellierungen
Bindung von CC an MST1
Wie von Khokhlatchev et al. (2002) in Pulldown-Experimenten von in COS-7-Zellen
koexprimiertem Nore1 und MST1 gezeigt werden konnte, bindet der C-terminale Rest
von Nore1 (Reste 358-413) an den C-terminalen Rest von MST1 (Reste 456-487). Der
C-Terminus von Nore1 enthält genau die Coiled Coil Domäne.
Vorhersageprogramme für Sekundärstrukturen ergaben für den C-Terminus von MST1
eine Helix. Eine Gruppe um Caretha Creasy (1996) bestätigte dies ebenfalls. Diese
Helix wurde mit Hilfe des JigSaw-Webservers für die Reste 456-487 modelliert. Bei
Betrachtung dieser Helix fallen die Reste 453Pro und 472Pro auf, die die modellierte
Helix an genau diesen Positionen „brechen“.
Modellierungen der Interaktion zwischen Nore1-Coiled Coil und MST1 wurden mit
dem Graphik-Programm VMD, Vers. 1.5 (Humphrey et al., 1996) durchgeführt.
Energieminimierung mit dem Programm Charmm ergab eine Lösung für eine Bindung
der C-terminalen MST1-Helix an eine monomere Nore1-Coiled Coil Helix. Die
Interaktion wurde als antiparallel vorausgesetzt, da sowohl der Nore1-CC, als auch
MST1 N-terminal Aminosäuren (370 bei Nore1, bzw. 456 bei MST1) vorausgehen.
Als Kontrolle wurde das Nore1-CC Dimer in zwei einzelne Helices separiert und mit
dem Programm VMD versucht, das Dimer durch Kraftfeld-Analysen (Forcefield)
wieder zu finden. Energieminimierung der gefundenen Lösung ergab eine relative
Energie für die Interaktion (definiert als EInertaktion = EKomplex-EHelix A-EHelix B) in der Höhe
–740 kcal/mol. Die Modellierung zwischen Nore1-CC-Monomer und MST1-Helix
ergab eine relative Energie für die Interaktion von –675 kcal/mol.
Im Falle einer Interaktion zwischen Nore1-CC und MST1 würden sich die C-terminalen
Helices beider Proteine in der in Abb. 52 dargestellten Art im Nore1-CC-Interface
aneinander anlagern. Analysen des erhaltenen Proteinkomplexes mit dem Programm
SOCKET (Walshaw und Woolfson, 2001) zeigte, daß die beiden Interaktionspartner
114
nicht über eine Coiled Coil Interaktion miteinander interagieren. Die Interaktion wird
vornehmlich über Salzbrücken vermittelt.
Bei der Modellierung sind alle Freiheitsgrade (Torsionswinkel, Rotation und
Translation) des gesamten Systems freigegeben worden. Aus diesem Grunde ist die
durch die Modellierung C-terminal von MST auftretende Aufwindung der MST-Helix
zu beachten. Untersucht man diejenigen Positionen, an denen die Helix aufgewunden
wird, so passiert dies genau an den oben erwähnten zwei Prolin-Resten. Ob und welche
Interaktionen mit Wassermolekülen stattfinden, konnte bei den Berechnungen nicht
berücksichtigt werden.
MST1
Nore1-CC
Abstand [Å]
Pro 452 mc
Arg 398
2,72
Gln 457
Asn 395
3,00
Glu 458
Arg 398
2,68
Glu 460
Tyr 394
2,57
Glu 460
Lys 393
2,61
Lys 459
Glu 383
2,68
Lys 459
Glu 380
3,77
Tab. 17 Interaktionen innerhalb des modellierten Nore1-CC-MST1-Dimers.
Abb. 52 Mögliche Interaktion zwischen Nore1-CC und der putativen C-terminalen Helix von MST1. Der Komplex
wurde mit dem Programm VMD erstellt und mit Charme energieminimiert. Vergleiche der Energie für die
Interaktion des zur Kontrolle modellierten Nore1-CC-Dimers ist mit der Energie dieses Komplexes
vergleichbar.
115
Kristalle der Nore1-RBD und RasSF1C-RBD
Nore1-RBD und seine homologe RasSF1C-RBD kristallisierten als Mutanten jeweils im
Komplex mit Ras, bzw. mit verkürztem Rap1A. Die Kristallisationsbedingungen sind in
Tab. 18 zusammengefaßt.
Die Kristalle wuchsen bei Nore1-RBD innerhalb von 5 Tagen, bei RasSF1C nach
2 Tagen.
Die Statistiken der einzelnen Kristalle und Derivate sind im Anhang aufgeführt.
Als Cryoagens wurde bei Nore1-RBD Mutterlauge mit entweder 10% Xylitol und 10%
D-(+)-Sucrose, oder 25% PEG400 verwendet. Bei RasSF1C wurde ausschließlich
Mutterlauge mit 10% Xylitol und 10% D-(+)-Succrose verwendet.
Abb. 53 Kristalle des Ras-NoreRBD-Komplexes.
Ras (1-166) GppNHp (D30E/E31K) Rap1Bc’ (1-167) GppNHp
/
/
NoreRBD (198-358) K302D
RasSF1C 58-218 (R161D)
Konzentration
16 mg/ml
8-16 mg/ml
Temperatur
18°C
18°C
Kristallisationsbedingung
26-30% PEG 1000, bzw.
24-28% PEG 3000
21-24% PEG 4000
0,2 M (NH4)2SO4
0,2 M (NH4)2SO4
0.1M NaAC pH 4,6
0,1 M NaAc, pH 4,6
Kristalldimensionen 100 x 60 x 50 µm
120 x 50 x 50 µm
Tab. 18 Kristallisationsbedingungen für Nore1-RBD K302D und RasSF1C R161D.
116
Phasierung
Nore1-RBD wurde als Komplex mit Ras in einem Kristallansatz angeboten. Jedoch
konnte nicht ausgeschlossen werden, daß nur einer der beiden Komplexpartner
kristallisiert. Analysen der gesammelten Daten mittels Eigenrotation zeigte eine
zweifache, nichtkristallographische Symmetrieachse, so daß sich in der asymmetrischen
Einheit zweimal dasselbe Protein befinden muß. Versuche mit Molekularem Ersatz mit
Ras, bzw. bekannte RBD’s als Vorlage versagten. Selbst die Annahme, daß trotz der
Ergebnisse der Eigenrotation ein Komplex aus zwei verschiedenen Proteinen vorläge,
erzielte mit dem Molekularen Ersatz keine interpretierbaren Ergebnisse. Dasselbe gilt
auch für RasSF1C. Hier wurde mit Rap1A und Ras als Vorlage gesucht. Genauso wie
mit bekannten RBD’s.
Anschließend wurde mit SAD, MAD, SIR und MIR für Nore1-RBD versucht, Phasen
für die Elektronendichte zu bestimmen.
Leider konnten nicht alle theoretisch möglichen Positionen der Schweratome bestimmt
werden. So konnte nur eine anstatt der 4, bzw. 2 (für den Fall, daß zwei Nore1-RBD’s
in der asymmetrischen Einheit vorliegt, bzw. ein Komplex aus Ras und Nore1-RBD)
möglichen Selen-Positionen mit größtmöglicher Sicherheit bestimmt werden. Ebenso
verhielt es sich mit Quecksilber. Hierbei wurde angenommen, daß Quecksilber an
Cysteine bindet. Demnach wären 4, bzw. 3 Positionen möglich, von denen jedoch nur
zwei bestimmt werden konnten. Die gefundenen Positionen reichten für eine Phasierung
und für eine interpretierbare Elektronendichte nicht aus.
Bei der Methode MIR kam die Schwierigkeit noch hinzu, daß die Kristalle des SeMetDerivates nicht zu 100% isomorph zu den Kristallen des Hg-Derivates waren, was die
Interpretation der Ergebnisse noch weiter erschwerte.
117
Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit war es gelungen, stabile Fragmente des Ras-Effektors Nore1
zu klonieren und zu präparieren. Es wurden verschiedene Konstrukte generiert, von
denen zwei auch kristallisiert sind (RBD und CC). Die Struktur der Nore1-CC Domäne
konnte röntgenkristallographisch gelöst werden.
Zudem wurden in einem Hefe-Zwei-Hybrid Assay verschiedene Interaktionspartner
gefunden, von denen einige isoliert wurden und die Interaktion mit Nore1 auch
biophysikalisch gezeigt werden konnte. Daneben wurde die Relevanz einiger
Interaktionspartner im Hinblick auf die Interaktion zwischen aktivem Ras und Nore1RBD hin diskutiert.
Nore1-Domänenstruktur
Nore1 ähnelt im Aufbau seiner Domänenstruktur den homologen Tumorsuppressoren
RasSF1. RasSF1 existiert in verschiedenen Isoformen (A-E). RasSF1 und Nore1
werden ubiquitär in den Zellen in fast jedem Gewebe exprimiert (Dammann et al., 2000;
Tommasi et al., 2002; Vavvas et al., 1998; Vos et al., 2000).
Da Nore keine katalytische Domäne oder sonstige enzymatische Aktivität aufweist,
wäre eine Funktion als Adapterprotein denkbar.
Für eine biochemische Charakterisierung wurden die einzelnen Domänen kloniert und
präpariert. Dabei erwiesen sich die in Tab. 19 aufgeführten Fragmente als sehr stabil
und gut exprimierbar.
Nore1-Konstrukt
Reste
Nore1-C1
95-166
Nore1-RBD
198-358
Nore1-CC
370-413
Nore1-C1-RBD
95-358
Nore1-C1-RBD-CC
100-413
Nore1-RBD-CC
198-413
Tab. 19 Nore1-Konstrukte, wie sie für die biochemische Charakterisierung verwendet wurden
118
Mit einem pI von 9,41 konnte Nore1 als basisches Polypeptid eingestuft werden. Durch
eine relativ hohe Dichte an hydrophoben Resten im prolinreichen Segment (54% im
Bereich 1-111) und durch die C1-Domäne wäre eine Membranbindung denkbar.
Affinitäten zwischen Ras und Nore
Die Dissoziationsgleichgewichtskonstante (KD) zwischen Nore1-RBD und H-Ras ist
mit 0,11 µM verglichen mit Raf-RBD (Herrmann et al., 1996) relativ stark. Nore1-RBD
verhält sich in der Affinität zu Rap1A (1,4 µM) ähnlich wie Raf-RBD (1,2 µM), so
binden beide Effektor-RBD’s mit relativ schlechtem KD an diese GTPase. Vergleiche
mit RalGDS-RBD (KD zu H-Ras: 1,0 µM, zu Rap1A: 0,01 µM) zeigen, daß Nore1RBD sich in Sinne von KD-Werten wie Raf-RBD verhält. AF6-RBD (1-141) zeigt ein
KD zu H-Ras von KD = 2,5 µM, zu Rap1A KD = 0,22 µM (Linnemann et al., 1999).
Betrachtet man die Kreuzspezifität zwischen den RBD’s der beiden Enzyme Raf und
RalGDS in Bezug auf H-Ras und Rap1A, so könnte man bei dem RBD-Paar der
(putativen) Adapterproteine Nore1 und AF6 ebenfalls solch eine Kreuzspezifität
annehmen.
Bemerkenswert ist der relativ konstante KD zu den Ras-Isoformen:
H-Ras fl. mGppNHp
0,11*
K-Ras mGppNHp
0,15*
N-Ras mGppNHp
0,13*
M-Ras GppNHp
0,16#
GDI*
ITC#
Die bisher nur qualitativ untersuchten Interaktionen zwischen Nore1 und M-Ras/R-Ras3
durch Ortiz-Vega et al. (2002) konnten durch Affinitätsmessungen mit der Nore1-RBD
bestätigt werden. Die ebenfalls durch Ortiz-Vega et al. postulierte Idee, daß Nore1 als
M-Ras/R-Ras3 Effektor agiert, konnte in dieser Arbeit nicht zweifelsfrei bestätigt
werden. So bindet Nore1-RBD an M-Ras (0,16 µM, ITC) mit vergleichbarer Affinität
wie an H-Ras (0,11 µM, GDI; 0,29 µM, ITC). Wenn man noch die Tatsache mit in
Betracht zieht, daß Messungen durch ITC gelegentlich zu etwas „schlechteren“ KD119
Werten führen (Gründe sind einerseits in der Verwendung von fl. Ras versus
verkürztem Ras und andererseits mant-Nukleotid versus nicht-mant-Nukleotid zu
suchen), läßt die Vermutung erhärten, daß die Affinität von Nore1 an M-Ras
mindestens genauso gut ist wie an H-Ras, wenn nicht sogar besser. Dennoch ist
innerhalb der Meßreihen keine signifikant höhere Affinität zu einer der aufgeführten
Isoformen meßbar.
Nore1-RBD bindet an die loss of function Mutation E37G in H-Ras (Vavvas et al.,
1998) und verhält sich somit genau entgegengesetzt wie Raf-RBD (White et al., 1995).
Die Mutation Raps Y40A (Raps ist Rap1A mit der Doppelmutation E30D, K31E) zeigt
ebenfalls eine sehr schwache Affinität zu Nore1-RBD (~50 µM; zu H-Ras Y40A:
~30 µM), verglichen mit der Affinität von Raps Y40A zu Raf-RBD (>100 µM)
(Schwarz, 1999).
Betrachtet man verlängerte Konstrukte der Nore1-RBD, so erkennt man eine
Veränderung der Affinität zu H-Ras. So hat die C1-Domäne einen (nicht signifikanten)
schwächenden Einfluß (2fach) auf die Affinität zu H-Ras. Erweitert man das C1-RBDKonstrukt noch um die Coiled Coil Domäne (CC), so verändert sich die Affinität zu HRas im Vergleich mit dem C1-RBD-Konstrukt nicht mehr. Das Konstrukt RBD-CC
weist eine ähnliche Affinität zu H-Ras auf wie die RBD alleine. Der geringe Einfluß der
C1-Region auf die Ras-Bindung wird durch sterische Einwirkungen erklärt. Eine
Bindung von C1 alleine an H-Ras GppNHp konnte nicht festgestellt werden; ebenso
keine Bindung von CC an H-Ras.
Nore1-Fragment an
H-Ras fl. mGppNHp
Dissoziationskonstante
KD [µM] bei 37°C
RBD
0,11
C1-RBD
0,23
C1-RBD-CC
0,30
RBD-CC
0,15
C1
keine Bindung
CC
keine Bindung
120
Mutanten
Die durch Modellierungen der Nore1-RBD auf bekannte Strukturen identifizierten,
prominenten Mutationskandidaten bestätigten sich in biochemischen Experimenten. So
haben die Mutationen K283A, K302D und K303A einen signifikanten Einfluß auf die
Ras-Bindung.
Durch diese Mutationen konnte ein Alignment zu bekannten RBD’s aufgestellt werden.
Die durch ein anfängliches Alignment identifizierten Reste R216A, K236A, K240A,
R242A und R243A haben kaum bis keinen Effekt auf die Ras-Bindung.
KD [µM]
H Ras fl. GppNHp Nore1 (198-358)
0,11
H Ras fl. GppNHp Nore1 (198-358) K283A
15,08
H Ras fl. GppNHp Nore1 (198-358) K302D
1,48
H Ras fl. GppNHp Nore1 (198-358) K303A
4,28
Alignment von Nore1-RBD auf bekannte RBD’s
Ein automatisches Alignment war aufgrund der geringen Homologie von Nore1 zu
bisher charakterisierten RBD’s nicht zufriedenstellend möglich. Aus diesem Grunde
wurde ein Alignment von Hand durchgeführt. Dabei wurde von AF6-RBD (42-142)
ausgegangen, da Nore1-RBD zu dieser RBD mit 51% die höchste Homologie aufweist.
Des weiteren wurden anschließend Aminosäuren identifiziert, die durch Mutation (zu
Alanin, bzw. Ladungsumkehr) einen signifikanten Effekt auf die Affinität zu H-Ras
haben. Diese Daten wurden im Vergleich mit entsprechenden Mutationsstudien für RafRBD, bzw. RalGDS-RBD in dem Alignment vereint.
Die identifizierten Aminosäuren, die in Nore1 einen signifikanten Einfluß auf die
Affinitäten haben, sind K283A, K302D und K303A.
Nach dem hier aufgestellten Alignment entsprechen diese Reste denen in Tab. 20
aufgelisteten Resten in andern RBD’s.
Von diesen Resten wurde gezeigt, daß sie an der Interaktion mit Ras direkt involviert
sind.
121
Nore1
wt (0,29) K283A (15,1) K302D (1,48) K303A (4,28)
Raf
wt (0,08) R67A (1.0)
RalGDS wt (1,13) K28A (200)
M83
K84A (2,5)
D47A (0,75)
K48A (223)
Tab. 20 Gegenüberstellung der durch ein Alignment von Nore1-RBD mit Raf-RBD und RalGDS-RBD
entsprechenden Aminosäurereste, die bei Mutation einen signifikanten Effekt auf die Bindung an H-Ras
haben. Die Dissoziationsgleichgewichtskonstante KD ist in Klammern in µM mit angegeben.
Interaktionspartner von Nore1
Im 2-Hybrid-Assay wurden sehr viele Interaktionspartner von Nore1 gefunden. Nach 5
Tagen Inkubation erschienen ca. 10000 Klone; in einem 2-Hybrid Screen, der im Labor
von Joseph Avruch durchgeführt wurde, wurde eine ähnliche Anzahl an Klonen erzielt
(persönliche Mitteilung).
Positive Klone wurden anschließend aufgrund ihrer Funktion gruppiert und in Bezug
auf ihre Relevanz zu Nore1 weiterverfolgt und die Bindung charakterisiert.
Durch die Kotransformation mit Nore1-Fragmenten konnten diejenigen Minimaldomänen zweifelsfrei ausfindig gemacht werden, die für die Bindung an die einzelnen
Interaktionspartner nötig sind.
Von einigen der im 2-Hybrid gefundenen Proteinfragmente konnte eine Bindung zu
Nore1 (bzw. zu einem Fragment) in vitro nachgewiesen werden.
Die einzelnen Interaktionspartner
RNF4
Das humane RING-Finger Gen (RNF4) kodiert ein 190 Aminosäure großes Protein.
RNF4 besitzt neben seinem C-terminal lokalisierten RING-Finger Motiv (RING steht
für really interesting new gene) noch zwei mögliche NLS-Sequenzen und Ausläufer
saurer Aminosäuren, die ähnlich den Aktivatordomänen einiger Transkriptionsfaktoren
sind. RNF4 wird in allen Geweben exprimiert; mit sehr hoher Expression in den Hoden.
Das RING-Finger Motiv ist ein cysteinreiches Sequenzmotiv, das dem Zink-Finger
Motiv ähnlich ist (Freemont et al., 1991; Lovering et al., 1993; Saurin et al., 1996).
Dieses Motiv wurde vielfach beschrieben, sowohl bei Protein-DNA als auch bei
Protein-Protein Interaktionen beteiligt zu sein. Mitglieder der RING-Finger Familie
122
zeigen eine Vielzahl von Funktionen und sind meist an der Regulation der Entwicklung
und Zelldifferenzierung beteiligt (Saurin et al., 1996). Viele humane RING-Finger
Proteine wurden im Nukleus lokalisiert und sind dort in der Signaltransduktion und in
der Onkogenese involviert (Saurin et al., 1996).
Durch verschiedene Techniken (Kotransformation, Segregation, lacZ/X-Gal-Tests,
Sequenzierung) konnten falschpositive Klone identifiziert werden; jedoch konnte
hierdurch nicht vermieden werden, einen falschpositiven Klon (RNF4) als positiven
Klon
einzustufen
und
weiter
zu
charakterisieren.
Dieser
fiel
erst
durch
Kotransformation mit den einzelnen Nore1-Fragmenten auf, da dieses Protein mit allen
Domänen zu interagieren schien, was für unwahrscheinlich gehalten wurde.
Anschließende Literaturrecherche (Chiariotti et al., 1998) bestätigte dann die
Vermutung, daß RNF4 selbst als DNA-bindendes Protein die HIS-Auxotrophie der
Hefen überwindet. Dieses Protein war fähig, den His+/LacZ+ Phänotyp in dem
Hefestamm ScL40 hervorzurufen, wenn es in ScL40 entweder alleine oder in
Kombination mit Plasmiden, die nicht-verwandte Köder enthielten und an Sequenzen
fusioniert waren, die für die LexA DNA-bindende Domäne kodierten (Vojtek und
Hollenberg, 1995). Solche unspezifischen Interaktionen wurden in diesem Falle durch
die DNA-bindende Fähigkeit des RNF4-Proteins hervorgerufen (Chiariotti et al., 1998).
Aufgrund dieser Tatsache wurde RNF4 nicht weiter verfolgt.
MSS4
MSS4 (mammalian suppressor of Sec4) ist ein Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF)
für die Sec4/Ypt1/Rab-Familie. Diese Familie ist an der Regulation intrazellulärer
Vesikeltransporte beteiligt. Rab-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der gerichteten
Verankerung und/oder Fusion von Carrier-Vesikeln an Zielmembranen (Bourne, 1988).
MSS4 (und sein Hefe-Homolog DSS4) sind hydrophile Moleküle die ubiquitär als
Monomere im Cytosol vorkommen. In vitro beschleunigen MSS4 und DSS4 den
Nukleotidaustausch bei verschiedenen Mitgliedern der Rab Familie, die am
anterograden Transport durch den exocytotischen Pathway involviert sind (Rab1 und
Rab3). MSS4 und DSS4 sind jedoch inaktiv gegenüber Rab-Proteinen, die am
endocytotischen Pathway beteiligt sind (Burton et al., 1994).
123
MSS4 (1-123) ist das einzige Protein, das als fl. Protein für eine Interaktion mit Nore1
vorlag. Hierbei handelt es sich um einen Austauschfaktor (GEF) für Rab3a. Bindung
von Nore1 (besonders Nore1-RBD) an dieses Protein würde eine Verbindung zwischen
aktiviertem Ras (und dessen Pathway) und Rab3a (und dessen Pathway) bedeuten. Im
Zuge der Signalweiterleitung würde Nore1 durch Bindung an Ras mit seiner RBD zur
Membran rekrutiert.
Spry1
Spry1 ist das Säuger-Homolog zum Drosophila sprouty Gen-Produkt. In Drosophila ist
das sprouty Gen-Produkt ein Antagonist zur FGF-Familie (Fibroblast Growth Factor)
und ihrer zugehörigen Rezeptorfamilie.
In Drosophila aktiviert ein FGF-Homolog (Branchless) das FGF-Rezeptor-Homolog
Breathless. Dieser lenkt tracheale Zellmigration und induziert sekundäre und terminale
Verzweigungen (Sutherland 1996; Glazer 1991). Das sprouty Gen-Produkt blockiert die
Aktivierung von Downstream Effektoren in dem Branchless Pathway und verhindert
somit die Verzweigung und Differenzierung des respiratorischen Systems.
Es wurde gezeigt, daß Spry1 ebenfalls Signalwege, die durch EGF stimuliert werden,
inhibiert. So wurde direkt gezeit, daß Spry1 ein Antagonist des Ras/MAPK-Pathways
ist, wobei angenommen wird, daß Spry1 oberhalb von Raf agiert (Casci et al., 1999;
Reich et al., 1999). Die Vermutung, daß Nore1 ein negativ regulatorisches Element der
Ras-vermittelten Pathways ist, wird durch Khokhlatchev et al. bestätigt. Khokhlatchev
et al. haben eine Interaktion zwischen Nore1 und MST1 gezeigt, wonach der Zelltod
eingeleitet wird, sobald MST1 zur Membran rekrutiert wird.
Im Laufe der Charakterisierung der Interaktionspartner konnte keine direkte Interaktion
zwischen Nore1 und Spry1 gezeigt werden.
MAP1B
MAP1B ist ein während der Entwicklung exprimiertes microtubulusassoziiertes Protein
und wird u. a. im sich entwickelnden Nervensystem exprimiert. Avruch et al. isolierten
ebenfalls mehrere Kopien von MAP1B in einem im Jahre 2000 durchgeführten Hefe 2Hybrid Screen, indem sie eine Gehirn cDNA-Bank verwendeten. Da von Avruch et al.
ebenfalls Spectrin B isoliert wurde (in dem hier durchgeführten 2-Hybrid wurden
Spectrin Repeats innerhalb von MacF gefunden, mit denen Nore1 interagiert), wurde
124
vermutet, daß Nore1 an Dentrit- oder Neurit-Ausdehnung beteiligt sein könnte, evtl.
indem es die Membran mit dem Zytoskelett verbindet. Experimente, die eine Förderung
der Neurit-Ausdehnung durch Nore1 oder Nore1-CaaX beweisen sollten, waren ohne
Erfolg (Avruch et al., persönliche Mitteilung).
Nore1-RBD (und auch Nore1-RBD-CC) zeigt eine sehr hohe Affinität zu Map1B (KD
von 0,040 µM). Man muß jedoch berücksichtigen, daß das im 2-Hybrid identifizierte
Fragment (2001-2143, nur 6% der Gesamtgröße) nur ein sehr kleines Fragment eines
2464 Aminosäuren großen Proteins darstellt. Durch SMART konnten keine pominenten
Domänen für Map1B detektiert werden. Aus diesem Grunde wurden keine weiteren
Fragmente von Map1B in Bezug auf die Bindung an Nore1-RBD hin untersucht. Es ist
jedoch denkbar, daß die Interaktion zwischen dem fl. Map1B Protein und der Nore1RBD geringer ausfallen könnte.
GABARAP ist ein Protein, das aufgrund von Sequenzvergleichen ein Map-Protein sein
kann. Dessen N-terminalen 117 Aminosäuren wurden kristallisiert und die Struktur
aufgelöst (Wang et al., 1999). Die Struktur des 117 Aminosäuren großen Gate-16Proteins fl. (einem nahe Verwandten des GABARAP) zeigt, daß dieses Protein und
GABARAP einer Faltungsklasse angehört, die eine Ubiquitinfaltung aufweisen (Paz et
al., 2000). Der Unterschied zu der Ubiquitinfaltung, wie sie in Effektor-RBD’s
gefunden wird, besteht im Fehlen eines C-terminalen β-Stranges (Strang β4 von fünf βSträngen bei Ubiquitin) und zwei zusätzliche N-terminale α-Helices (Abb. 54).
Paz et al. überlagerten Gate-16 (28-114) mit RalGDS-RBD und bestimmten einen ZScore von 6,5 und eine Standardabweichung von ca. 2,2 Å für die Cα-Atome.
Abb. 54 Abfolge der β-Stränge und α-Helices in RBD’s und in den GABARAP-like Proteinen.
Bei der Untersuchung der Interaktion zwischen Map1B und Nore1 wurde neben der
Charakterisierung der Interaktion keine weitere Charakterisierung vorgenommen.
eIF4γ2
Hierbei handelt es sich um ein zentrales Translations-Protein. eIF4γ2 führt das
capbindende Protein 4E, die RNA Helicase 4A und eIF3 zusammen, so daß die mRNA
125
zur Ablesung durch die 40S Untereinheit der Ribosomen vorbereitet wird. Es konnte
hierbei keine offensichtliche Verbindung zu Ras gefunden werden.
S/T PP Typ 1α
Diese Proteinphosphatase ist insofern interessant, da es sich hierbei um ein
regulatorisches Protein handelt. Die Idee, daß Nore1 einen Einfluß auf die Regulierung
dieser Phosphatase hat, bestätigte sich nicht, da diese S/T PP nach Analyse mit SMART
keine regulatorische Domäne besitzt. Eine Interaktion zwischen Nore1 und S/T PP
konnte biochemisch ebenfalls nicht gezeigt werden.
tenascin-C
Eine Interaktion zwischen Nore1 und tenascin scheint unwahrscheinlich, da tenascin in
der extrazellulären Matrix lokalisiert ist.
MacF, SerRSmt und LCCP
Diese Proteine zeigen in dem im 2-Hybrid gefundenen Proteinfragment ein HeptadRepeat, was eine Interaktion durch die Coiled Coil Domäne von Nore1 möglich macht.
Und in der Tat interagiert das Fragment 335-413 von Nore1 nach Kotransformation in
ScL40 mit diesen Proteinen.
Eine Proteinreinigung war nur für LCCP möglich. Eine Interaktion zur Nore1-Coiled
Coil Domäne konnte nicht gezeigt werden (aber auch nicht eindeutig ausgeschlossen),
da Nore1-Coiled Coil in Lösung als Dimer vorliegt. Die verwendeten Methoden (ITC,
Pull Down und ELISA) konnten keine Interaktion beweisen.
In diesem Zusammenhang erwähnenswert ist die von Khokhlatchev et al. (2002)
beschriebene Interaktion zwischen Nore1 und der proapoptotischen S/T-Proteinkinase
MST1. Die Autoren zeigten in Pulldown-Experimenten, daß der C-terminale Teil von
Nore1 mit dem C-terminalen Teil von MST1 interagiert - möglicherweise durch Coiled
Coil Interaktionen (s. dazu weiter unten).
Für die prolinreiche Region von Nore1 (1-111) wurden keine Interaktionspartner
gefunden. Dieser Bereich ist von Avruch et al. als mögliche Bindestellen von SH3Domänen postuliert worden. Im 2-Hybrid wurden jedoch keine SH3-Domänen
identifiziert. Dies mag unter Umständen daran liegen, daß Nore1 mit seiner ersten
126
Aminosäure direkt
an die DNA-bindende Domäne des sich auszubildenden
Transkriptionsfaktors fusioniert war. Möglicherweise hätte ein einzubringender Linker
zwischen DNA-bindender Domäne und Nore1-prolinreicher Region den N-Terminus
von Nore1 flexibel genug gestaltet, mit potentiellen Kandidaten Interaktionen
einzugehen.
GST-Pulldown
In dem GST-Pulldown Assay konnte eine qualitative Bindung zwischen Nore1Fragmenten und ausgewählten Interaktionspartnern in vitro gezeigt werden. Hierbei
wurde eine Interaktion zwischen MSS4 und Map1B mit der Nore1-RBD qualitativ
gezeigt.
Durch den Pulldown konnte in vitro keine Bindung zwischen den in Tab. 21
aufgeführten Kombinationen aus Nore1-Fragmenten und Interaktionspartnern gezeigt
werden.
Nore1-RBD
Spry1 (131-245)
Nore1-C1-RBD
tenascin (122-304)
Nore1-C1-RBD
eIF4γ2 (1-170)
Nore1-CC
LCCP (38-166)
Nore1-CC
Pole1 (1189-1303)
Tab. 21 Kombinationen aus Nore1-Fragmenten und Interaktionspartnern, für die im GST-Pulldown qualitativ keine
Bindung gezeigt werden konnten. tenascin wurde als Negativkontrolle mit verwendet, tenascin sollte durch
seine extrazelluläre Lokalisation nicht mit Nore1 interagieren, obwohl die Kotransformation in Hefe positiv
war.
Da der Pulldown Assay relativ hohe Affinitäten zwischen den zu untersuchenden
Proteinen voraussetzt, bedeutet ein negatives Ergebnis nicht zweifelsfrei, daß keine
Interaktion stattfindet. Jedoch wurden keine weiteren Versuche der Charakterisierung
der Bindung zwischen Nore1 und den Interaktionspartnern, die im Pulldown keine
Bindung gezeigt haben, durchgeführt.
ITC/GDI von Interaktionpartnern
Durch ITC-Messungen konnte auch quantitativ eine Bindung von Nore1-RBD anMSS4
gezwigt werden. Die Dissoziationsgleichgewichtskonstante KD = 1,4 µM ist verglichen
127
mit der zwischen Nore1-RBD und Ras-GppNHp (0,3 µM) 4fach schwächer, jedoch
signifikant.
Die Bindungsstelle von MSS4 an Nore1-RBD konkurriert mit der, die an Ras-GTP
bindet. Titrationen von MSS4 zu einen Nore1-RBD/Ras-GTP-Komplex entfernten
Nore1-RBD
aus
dem
Gleichgewicht;
ebenso
wurde
die
Dissoziationsgleichgewichtskonstante KD zwischen Nore1-RBD und Ras (GppNHp)
geschwächt, wenn Nore1-RBD zu einer Mischung aus Ras und MSS4 titriert wurde.
Bestätigt wurde dieser Fund auch durch Ergebnisse, die im Labor von DeCamilli in
Yale erzielt wurden (unveröffentlicht, Accession-Nr. AAB71821). 1998 isolierten
Mitarbeiter von DeCamilli das Ratten-Homolog zu Nore1 Maxp1 in einem Hefe 2Hybrid Screen mit MSS4 als Köder. Der Fund von MSS4 in diesem 2-Hybrid scheint
eine reproduzierbare Interaktion zu sein.
Die Mutation K302A in Nore1-RBD hat auf die Affinität zu Ras einen etwa 5-15fachen
Einfluß. Durch diese Mutation konnte keine Bindung von MSS4 mehr an Nore1-RBD
gemessen werden. Diese Aminosäure könnte als Determinante der MSS4-Bindung
angesehen werden. Es ist denkbar, daß MSS4 mit Ras im Cytosol um die Bindung an
Nore1-RBD konkurriert.
Ras modifiziert einige sekretorische Antworten und Endozytose, so daß die Interaktion
zwischen MSS4 und Nore1 eine Modifizierung Ras-regulierter Antworten vermuten
läßt, jedoch sind die Rab-Pathways zu komplex und involvieren zu viele Komponenten,
so daß die Visualisierung spezifischer biochemische Experimente äußerst schwierig
scheint. Einflüsse der Interaktion zwischen Nore1 und MSS4 wurden daher nicht weiter
verfolgt.
Der Befund, daß Nore1-RBD mit zunehmender Größe (Nore1-C1-RBD, bzw. Nore1C1-RBD-CC) immer schwächer an MSS4 zu binden scheint, macht es als realen
Interaktionspartner eher unwahrscheinlich. Es müßten alle Domänen von Nore1 weit
von der Nore1-RBD entfernt lokalisiert sein, damit Nore1 mit seiner RBD an MSS4
bindet. Zudem rekrutiert aktiviertes Ras infolge der Bindung an Nore1 dieses an die
Zellmembran, an der es für eine Interaktion mit dem cytosolischen MSS4 nicht mehr
zur Verfügung stünde.
Kristallisationsansätze eines Komplexes zwischen Nore1-RBD und MSS4 fl. ergaben
keine Kristalle.
128
Die Ergebnisse der Titration von MSS4 zu einen Ras/Nore1-RBD-Komplex konnten
dazu verwendet werden, einen Kompetitionsassay aufzustellen (komp. GDI). Mit
diesem konnte eine Affinität zwischen zwei Proteinen bestimmt werden, die keine
Chromophore binden. Voraussetzung aber ist, daß einer dieser beiden Proteine an ein
Protein bindet, das mit einem Chromophor beladen oder markiert werden kann. Konkret
wird dann in diesem Fall die Dissoziation von gebundenem Chromophor (mGppNHp)
von Ras im Komplex mit Effektor-RBD in Abhängigkeit von der Konzentration des mit
der RBD interagierenden Proteins beobachtet. Die Affinität von MSS4 zur Nore1-RBD
wurde auf 2,0 µM bestimmt.
Durch komp. GDI konnte ebenfalls die Bindung von Nore1-RBD an Map1B quantitativ
nachgewiesen werden (0,040 µM).
Gelretardationsassay
Viele DNA-Protein-Interaktionen werden durch Coiled Coil Strukturen vermittelt.
Hierbei bindet das Protein wie mit einer Pinzette die DNA.
Versuche, eine Interaktion zwischen Nore1-CC und DNA zu zeigen, waren erfolglos.
Die verwendete Methode des Gelshifts zeigte keine Interaktion zwischen Nore1-CC mit
willkürlich ausgewählten DNA-Fragmenten.
Da Nore1-CC im 2-Hybrid mit anderen Proteinen (vornehmlich mit Proteinen, die
ebenfalls ein Coiled Coil Motiv aufwiesen) interagiert und durch die Ergebnisse durch
Khokhlatchev et al. (2002), wonach Nore1 mit seinem C-Terminus an die S/T-Kinase
MST1 bindet, wurde eine Bindung von Nore1-CC an DNA ausgeschlossen.
Nore1 C1-Domäne
Die vorläufige Struktur der C1-Domäne von Nore1 zeigt im weitesten Sinne keine
signifikanten Unterschiede zu anderen C1-Domänen, sofern man einen solchen
Vergleich in einem solch frühen Stadium ansetzen kann. Da die Zuordnung der Peaks
durch Elena Guiberman noch nicht abgeschlossen war, ist eine weitergehende Analyse
nicht möglich gewesen. Es ist möglich, daß die Nore1-C1-Domäne im Gegensatz zu
anderen C1-Domänen eine zusätzliche, verlängerte α-Helix aufweist. Diese kann jedoch
aus Mangel an NOE’s nicht eindeutig zugeordnet werden (Elena Guiberman,
persönliche Mitteilung).
129
Nore1 Coiled-Coil Struktur
Obwohl die meisten Coiled Coil Proteine Fasermoleküle von beachtlicher Länge sind
(z. B. Tropomyosin), sind dennoch viele Coiled Coil Proteine überraschend kurz
(20 Reste oder weniger), viele amphipatische Helices von globulären Helices fallen
ebenfalls in diese Größenordnung. Aus diesem Grund erweist sich die Identifikation
von Coiled Coil Proteinen anhand der Primärsequenz oft als sehr schwierig. Mehrere
Sequenzmerkmale müssen vorhanden sein (z. B. das Heptad-Motiv). Ebenfalls ist die
strukturelle Anordnung der beteiligten Helices wichtig. So müssen bestimmte
Packungsmuster erfüllt werden (Knopf/Loch-Muster). Parameter, die eine Coiled Coil
beschreiben, sind Periodizität (3.5 versus 3.6), Pitch, Pitchwinkel und Helix-Überkreuzungswinkel.
Die Struktur von Nore1-CC (Reste 370-413) konnte bei einer Auflösung von 1,9 Å bis
zu einem freien R-Faktor Rfree = 23,3% verfeinert werden. In der Struktur ist ein
antiparalleles, linksgängiges Homodimer sichtbar, von dem die Reste 370-407 eindeutig
definiert sind. Die verbleibenden Reste 408-413 sind vermutlich flexibel. Erklärungen
dafür wurden durch Coiled Coil Vorhersageprogramme gegeben. Dabei gehören die Cterminalen 5 Aminosäuren nicht mehr zum Coiled Coil Heptad Motiv. Die
vorhergesagten und für eine Coiled Coil Struktur notwendigen Aminosäuren sind alle
definiert.
In der vorliegenden Struktur kann man das für Coiled Coils notwendige Heptad-Motiv
erkennen. Die von Harbury et al. (1993; 1994) und Woolfson et al. (1995) postulierte
Wichtigkeit der Reste auf der a- und d-Position auf den Einfluß der Oligomerisierung,
kann in dieser Struktur bestätigt werden. So wird verlangt, daß die a- und d-Positionen
durch vornehmlich hydrophobe Reste besetzt werden, die das hydrophobe Interface
bilden (Ausnahmen sind die Reste Glutaminsärue A/B383 und Tyrosin A/B394). Die eund g-Positionen werden von geladenen/polaren Aminosäuren besetzt, die durch
elektrostatische Interaktionen mit benachbarten Helices bei der Spezifität zu
(verschiedenen) Bindungspartnern behilflich sind (Kohn et al., 1998; O'Shea et al.,
1992; Vinson et al., 1993).
Es sind sehr wenige ionische Wechselwirkungen in der Struktur beobachtbar. So bilden
A383 mit B398 (Glutaminsäure/Arginin; 3,09 Å), A398 mit B383 (Arginin/Glutaminsäure; 2,73 Å) und A398 mit A380 (Arginin/Glutaminsäure; 3,30 Å) die einzigen
130
Salzbrücken; die Reste A380 und A383 kontaktieren die B-Helix (Arginin 398) neben
der Salzbrücke noch über Wassermoleküle. Polare Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrücken wurden nicht gefunden.
Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das Nore1-CC in wäßrigen Lösungsmitteln nur
als Dimer stabil sein sollte und vornehmlich auch nur so vorkommen wird. Alternativ
könnte man eine intramolekulare Anlagerung annehmen, wobei sich die Nore1-CCHelix eines Nore1-Proteins an sich selbst anlagert; beispielsweise an eine Helix der
RBD.
Das Heptad Motiv wurde manuell zugeordnet. Die zwei auftretenden Unterbrechungen
des kontinuierlichen Heptad-Motivs (Stutter) wurden ebenfalls anhand der Struktur
ermittelt.
Die für ein Coiled Coil notwendige Knopf/Loch-Packung tritt hier als Typ2- und Typ4Interaktion auf. Da diese Interaktionen innerhalb eines Suchradius von 6,8 Å auftreten,
wird von einer relativ festen Dimer-Interaktion ausgegangen. Das Nore1-CC-Dimer ist
somit ein relativ festes Dimer. Auch das Konstrukt Nore1-RBD-CC dimerisiert, was
durch Gelfiltration gezeigt werden konnte (Abb. 39). Durch ITC-Experimente konnte
eine Mindestaffinität von 15 µM für die Nore1-CC-Domäne bestimmt werden.
In der Kristallstruktur ist ein Auseinanderdriften der beiden Helices an deren C-Termini
zu beobachten. Es ist eine Änderung des Supercoil-Radius von mehr als 1 Å zu
verzeichnen. Im Vergleich mit anderen Coiled Coil Strukturen (Day und Alber, 2000)
erscheint diese Änderung gering. Hervorgerufen wird die Änderung vermutlich durch
Kristall-Kontakte symmetrieverwandter Dimere. Es ist denkbar, daß diese Änderung in
Lösung oder in einem N-Terminal verlängerten Konstrukt (z.B. Nore1-RBD-CC) nicht
mehr auftaucht.
Da sich die B-Faktoren zu den Termini hin nicht signifikant verändern, wird dieser
Effekt in dieser Struktur als real interpretiert. Abb. 55 gibt einen Überblick über eine
mögliche Verringerung des Auseinanderdriftens bei einem N-terminal verlängerten
Nore1-CC-Konstrukt wider.
131
Abb. 55 Mögliche Verringerung des Auseinanderdriftens bei einem N-terminal verlängerten Nore1-CC-Konstrukts.
Durch die zusätzlichen Aminosäuren, die durch die N-terminale Verlängerung angeboten werden, könnte
der absolute C-Terminus durch Bindung fixiert werden.
Von Ortiz-Vega et al. (2002) wurde eine Homo- und Heterodimerisierung von Nore1,
bzw. mit RasSF1A (nicht RasSF1B und nicht RasSF1C, da diesen Spleißvarianten die
N-terminale Domänen, wie sie bei RasSF1A vorhanden sind, fehlen) gezeigt. Für diese
Oligomerisierung wurde der N-terminale Bereich (Reste 1-267 bei Nore1 und 1-119 bei
RasSF1A) identifiziert. Für die Coiled Coil Domäne von Nore1 konnte eine
antiparallele Homodimerisierung beobachtet werden. Antiparallele Dimere sind relativ
häufig und als generelles Oligomerisierungsmotiv bekannt.
Die meisten Parameter, die die Geometrie einer Coiled Coil Struktur definieren,
weichen nicht signifikant von den Parametern ab, die für andere Coiled Coil Strukturen
in der Literatur (Harbury et al., 1994) beschrieben wurden. Lediglich die SupercoilGanghöhe (und die davon abhängige Anzahl der Reste pro Supercoil-Turn) weicht von
dem Wert für ein durchschnittliches Coiled Coil aus der Literatur ab (Crick, 1953).
Dieser 2,5fach höhere Wert weist auf eine langgestreckte, linksgängige Supercoilhelix
hin.
Gesamt
Literatur1
Supercoil Parameter
Supercoil-Radius, R0 [Å]
5,6
4,9
Reste pro Supercoil-Turn, 2/ω0
260
100
Supercoil-Ganghöhe, P [Å]
387
148
α-Helix Parameter
Reste pro Turn
3,65
3,62
α-Helix-Radius, RI [Å]
2,31
2,28
Tab. 22 Übersicht der Coiled Coil Parameter nach 1F.H.C Crick (1953).
132
Bindung von Nore1 an MST1
Khokhlatchev et al. konnten in Pulldown-Experimenten zeigen, daß Nore1 mit der
proapoptotischen S/T-Proteinkinase MST1 (487 Aminosäuren, eine Gruppe II GCKinase) interagiert. Für eine Interaktion zwischen Nore1 und MST1 ist auf der Seite
von Nore1 das Segment von Position 358-413 wichtig. Auf der Seite von MST1 ist der
Bereich 456-487 für die Interaktion mit Nore1 verantwortlich.
Die H-Ras (G12V) Effektor-Loop-Mutante E37G bindet Nore, aber nicht Raf oder die
PI 3-Kinase. Die Bindung an Nore zeigt eine proapoptotische Wirkung, die der von KRas (G12V) nahe kommt. Die apoptotische Wirkung beider Ras-Proteine (KRas (G12V) und H-Ras (G12V, E37G)) wird durch alleinige Überexpression des Cterminalen,
nicht
katalytischen
Segments
von
MST1,
oder
durch
alleinige
Überexpression des Nore1-Coiled Coil Segments unterdrückt (Khokhlatchev et al.,
2002).
Die katalytische Domäne von MST1 ist zu Ste20 und zu anderen Ste20-ähnlichen
Kinasen am meisten homolog (62-65% Ähnlichkeit), wobei der mit Nore1
interagierende C-terminale Teil keine signifikante Homologie zu anderen Proteinen
aufweist.
Das Nore1-Fragment 358-413 umfaßt die in dieser Arbeit gelöste Coiled Coil-Struktur
(Reste 370-413).
Für eine Interaktion mit dem MST1-Fragment könnte eine Heterooligomerisierung mit
Nore1-Coiled Coil stattfinden. Da keine Strukturen des C-terminalen Bereichs von
MST1 bekannt sind, wurde eine Sekundärstrukturvorhersage für MST1 durchgeführt.
Dabei könnte der mit Nore1 interagierende Teil eine Helix ausbilden, die wiederum mit
der Coiled Coil-Struktur interagieren kann. Bestätigt wurde diese Annahme durch eine
Gruppe um Caretha Creasy (Creasy et al., 1996), die ebenfalls computergestützte
Vorhersagen für den C-Terminus von MST1 durchgeführt haben. Auch die Mutation
L444P (Prolin als bekannter Helixbrecher) untermauerte die Vermutung einer α-Helix.
Bedingung für eine Interaktion wäre eine dem Solvent zugewandte Helix bei MST1.
MST1 wird durch Caspase 3 aktiviert, das die Kinaseaktivität von MST1 durch
Abspaltung der inhibitorischen Dimerisationsdomäne am C-Terminus von MST1
stimuliert (Graves et al., 1998; Lee et al., 1998). In Abb. 56 ist eine spekulierte und
133
modellierte Interaktion zwischen einer monomeren Nore1-Coiled Coil Helix und der Cterminalen potentiellen MST1-Helix gezeigt.
Zum Aktivierungsmechanismus von MST1 kann man spekulieren, daß die C-terminale
Helix ein flexibles Gebilde sein könnte, das – ungebunden an Nore1 – zusammen mit
dem N-terminal lokalisierten inhibitorischen Abschnitt (Reste 331-360) an die
katalytische Domäne von MST1 bindet und so die Kinaseaktivität inhibiert (oder das
aktive Zentrum sterisch behindert) (Creasy et al., 1996). Bindung an Nore1 würde dann
die Caspase 3 Schnittstelle der Caspase 3 exponieren (Abb. 56) und durch
proteolytischen Abbau des inhibitorischen Abschnitts die MST1 teilweise aktivieren
(Lee et al., 1998).
Aktiviertes
Ras
rekrutiert
den
Nore1-MST1-Komplex
zur
Plasmamembran
(Khokhlatchev et al., 2002), an der MST1 nach Abspaltung seines C-terminalen
Bereichs phosphoryliert werden kann und dadurch seine volle enzymatische Aktivität
erhält.
Abb. 56 Modell der Aktivierung der S/T-Proteinkinase MST1 durch Nore1. Durch die C-terminale inhibitorische
Domäne liegt MST1 in der Zelle inaktiv vor. Bindung dieser Domäne an den C-terminalen Teil von Nore1
(Coiled Coil Domäne) macht diese Domäne der Caspase 3 zugänglich, die durch Abspaltung dieser die
Kinaseaktivität stimuliert. Die Caspase 3 Schnittstelle (Reste 323-327) ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
MST1: CR steht für katalytische Region, IR für inhibitorische Region. Nore1: PRO steht für prolinreiche
Region, C1 für cysteinreiche Domäne, RBD für Ras-bindende Domäne und CC für Coiled Coil Domäne.
Eine Bindung von Nore1-CC an MST1 müßte folgenden Bedingungen genügen:
Interaktion zwischen zwei Helices und heterodimere Interaktion
Interaktion antiparallel
Interaktion Nore1-CC/MST1 ist stärker als Nore1-CC/Nore1-CC
Die erste Bedingung wird vermutlich erfüllt sein, da Vorhersageprogramme für den Cterminalen Bereich von MST1 eine Helix voraussagen mit einem relativ hohen Anteil
an hydrophoben Aminosäuren (47% über den Bereich 456-487). Eine Coiled Coil
134
Vorhersage für diesen Bereich konnte kein Heptad-Motiv bestimmen, von einer Coiled
Coil Interaktion kann demnach nicht ohne Strukturinformationen ausgegangen werden.
Da sowohl der Nore1-CC, als auch MST1 N-terminal Aminosäuren (370 bei Nore1,
bzw. 456 bei MST1) vorausgehen, sollte eine Interaktion aus sterischen Gründen
antiparallel mit einem Nore1-CC-Monomer erfolgen.
Um das Nore1-CC-Dimer in wäßriger Lösung aufzubrechen, sollte MST1 an Nore1-CC
mit relativ hoher Affinität binden.
Durch Modellierungen eines möglichen Komplexes zwischen Nore1-CC und MST1
ergab sich ein antiparalleles
Heterodimer.
Die zur
Kontrolle durchgeführte
Modellierung des Nore1-CC-Dimers (hierbei wurden die beiden Dimer-Helices
separiert und zum Dimer modelliert) ergab eine minimierte Interaktions-Energie von ca.
–740 kcal/mol. Berechnungen für das Nore1-CC-MST1-Dimer ergaben –675 kcal/mol.
Korreliert man diese Energien qualitativ mit der Affinität, so erhält man vage eine
Aussage über die Stärke der Bindung zwischen Nore1-CC und MST1.
Nore1 heterodimerisiert mit seiner N-terminalen Hälfte mit RasSF1A, das als
Tumorsuppressor bekannt ist (Dammann et al., 2000; Ortiz-Vega et al., 2002). Durch
gleichzeitige Bindung von MST1 wird ein Effektorkomplex aus Nore1-MST1RasSF1A-MST1 gebildet, der über Nore1 (vermutlich auch über RasSF1A) an
aktiviertes Ras bindet und zur Membran rekrutiert.
Die Funktion von Nore1 könnte demnach als Adapter postuliert werden. Nore1
vermittelt den Kontakt zwischen den Tumorsuppressoren RasSF1, der Serin/ThreoninKinase MST1 und aktiviertem Ras. Die Bildung eines „Effektorkomplexes“ aus Nore1MST1-RasSF1A ist für die proapoptotische Wirkung von MST1 Bedingung.
135
Ausblick
Für die Struktur der Nore1-RBD sollten entweder weitere Schweratomderivate gesucht
werden oder durch Mutationen bestimmter Resten zu Methionin und durch Substitution
mit SeMet eine Phasierung durchgeführt werden. Kandidaten hierfür wären L385, L300
oder L301, da diese Reste aus chemischer Sicht dem Methionin ähneln und zudem in
der Nähe der in dieser Arbeit identifizierten Reste K283 und K303 liegen. Da diese
Reste direkt an der Ras-Bindung beteiligt sind, sollten Mutationskandidaten demnach
relativ fixiert sein und im Kristall geordnet auftreten.
Im Unterschied zu anderen RBD’s besitzt Nore1 N- und C-terminal Insertionen. Aus
diesem Grunde ist die Struktur besonders interessant.
Ebenso im Hinblick auf die Bindung an MSS4 und Map1B, da beide mit der Bindestelle
von Ras konkurrieren.
Die
Interaktion
zwischen
Nore1-RBD
und
Map1B
sollte
in
Bezug
auf
Neuritausdehnung in Zellkulturen weiter charakterisiert werden.
Zusammenfassung
Von Nore1 konnten verschiedene stabile Fragmente generiert und exprimiert werden.
So ist es gelungen, Nore1 sowohl in seine einzelnen Domänen zu unterteilen und zu
exprimieren, als auch als Domänenkombinationen darzustellen.
Es
konnten
quantitativ
die
Dissoziationsgleichgewichtskonstanten
(KD)
zu
verschiedenen GTPasen bestimmt werden. Dabei zeigte sich ein relativ ähnlicher KD–
Wert für alle Ras-Isoformen. In diesem Zusammenhang konnte in Bezug auf die
Bindung zu Ras, bzw. Rap für das Effektorpaar AF6/Nore1 eine „Kreuzspezifität“
identifiziert werden, wie sie schon für das Effektorpaar Raf/RalGDS beschrieben wurde.
Bemerkenswert dabei ist, daß es sich bei dem ersten Paar um Effektoren mit
Adapterfunktion handelt, während letztere eine enzymatische Funktion haben.
Desweiteren konnte eine bisher nur angenommene Interaktion zwischen Nore1 und MRas quantitativ gezeigt werden.
136
Ein Hefe-2-Hybrid-Screen brachte eine Reihe möglicher Interaktionspartner hervor. Für
einige dieser konnten diejenigen Bereiche von Nore1 bestimmt werden, die für eine
Interaktion verantwortlich sind.
Daneben konnten in vitro zwei Interaktionspartner quantitativ charakterisiert werden. So
binden
MSS4
(ein
Austauschfaktor
von
Rab3a)
und
Map1B
(ein
microtubulusassoziiertes Protein des Cytoskeletts) beide an die Nore1-RBD. Es konnte
gezeigt werden, daß die Bindung dieser Interaktionspartner mit der Bindung von Ras
konkurriert. Dazu wurde eigens ein geeigneter Assay entwickelt und etabliert.
Die Ras-Bindungsdomäne (RBD) von Nore1 ist mit 160 Aminosäuren die bisher größte
bekannte RBD. Modellierungen von Nore1-RBD mit RalGDS-RBD als Vorlage wurden
durchgeführt. Anhand derer konnten Mutationskandidaten identifiziert werden, die im
Interface zu Ras liegen. Durch Punktmutationen konnten diese Aminosäurereste im
Vergleich mit anderen RBD’s charakterisiert werden.
Durch diese Charakterisierung konnte ein Alignment auf bekannte RBD’s entwickelt
werden, was einen Vergleich mit anderen RBD’s ermöglichte.
Die C1-Domäne von Nore1 wurde mit NMR gelöst. Weitergehende Analysen waren
bisher nicht möglich, da sich die C1-Domäne noch in der Evaluierung befand.
Die Coiled Coil-Domäne (CC) von Nore1 konnte kristallisiert und die Struktur
röntgenkristallographisch
gelöst
werden.
Dabei
ergab
sich
ein
antiparalleles
linksgängiges CC-Supercoildimer.
Durch ITC-Messungen konnte die Komplexbildungskonstante auf eine Mindestaffinität
von 15 µM bestimmt werden.
Durch Gelfiltrationsanalysen mit einem N-terminal verlängerten Fragment (Nore1RBD-CC) konnte ebenfalls ein Dimer dargestellt werden. Für Nore1 konnte demnach
neben der bereits durch Ortiz-Vega et al. (2002) beschriebenen N-terminalen
Dimerisierung eine C-terminale Dimerisierung gezeigt werden.
Die durch Khokhlatchev et al. (2002) gezeigte Interaktion zwischen Nore1 und der
Serin/Threonin-Kinase MST1 wurde von den Autoren für den jeweiligen C-Terminus
bestimmt. Da die Struktur von Nore1-CC verfügbar war, wurde eine Interaktion
zwischen dem C-Terminus von
MST1 (eine modellierte Helix) und Nore1-CC
modelliert. Dabei ergab sich ein antiparalleles Heterodimer. Des weiteren wurde ein
Modell zur Aktivierung von MST1 durch Nore1 aufgestellt, wonach die Bindung der Cterminalen Helix von MST1 (die innerhalb der inhibitorischen Domäne von MST1
137
liegt) an Nore1-CC die Caspase 3-Schnittstelle zugänglich macht. Caspase 3 könnte
daraufhin die inhibitorische Domäne proteolytisch verdauen und MST1 aktivieren.
Die Nore1-RBD kristallisierte als K302D-Mutante mit Ras (1-166) GppNHp
(D30E/E31K). Ebenso kristallisierte ein homologes Protein von Nore1, RasSF1C (58218), ebenfalls als Mutante (R161D) im Komplex mit Rap1Bc’ (1-167) GppNHp.
Von beiden Kristalle konnten sehr gute und vollständige Datensätze gesammelt werden
(Auflösungsgrenzen: 2,5 Å für Nore1-RBD – Ras und 2.05 Å für RasSF1C – Rap).
Für die Phasierung wurden verschiedene Schweratomderivate von Nore1-RBD
erfolgreich
dargestellt.
Quecksilberderivats
und
So
wurde
eines
jeweils
ein
kompletter
SeMet-substituierten
Derivats
Datensatz
am
eines
Synchrotron
gesammelt. Die jeweiligen Schweratompositionen, bzw. die Positionen der anomalen
Streuer konnten nicht bestimmt werden, da sie vermutlich ungeordnet sind. Aus diesem
Grund war eine interpretierbare Phasierung nicht möglich.
Mit den in dieser Arbeit erzielten strukturellen und biochemischen Daten konnten
Einblicke in die Dimerisierung von Nore1 gewonnen werden. Weiterhin existieren nun
durch die Struktur der Coiled Coil Domäne Vorstellungen bezüglich der Interaktion mit
der C-terminalen Helix von MST1.
138
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150
Abkürzungen
(k)D
Å
Abb.
Amp
AP
APS
AS
BSA
cC-Terminus
DMSO
DNA
DSC
DTE
E.coli
EDTA
ERK
FPLC
g
G
GAP
GDI
GDP
GEF
GMP
GMppNHp
GppNHp
GppNHp
GSH
GST
GTP
h
HEPES
HPLC
IPTG
ITC
Kan
KD
Lac
mMAD
MAP
MAPK
MAPKK
MAPKKK
(kilo-) Dalton
Ångström (0,1 nm)
Abbildung
Ampicillin
alkalische Phosphatase
Ammoniumperoxodisulphat
Aminosäure
Bovine serum albumin
cellular (zellulär)
Carboxyterminus
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonucleinsäure
differenzielle Scanning-Kalorimetrie
1,4-Dithioerythrit
Escherichia coli
Ethylene-diamine-tetraacetic acid
Extrazellulär regulierte Kinase
Fast pressure liquid chromatography
Gramm, Erdbeschleunigung
Guanosin
GTPase-aktivierendes Protein
guaninnukleotid Dissoziations-Inhibition
Guanin-5’-diphosphat
Guaninnukleotid Austauschfaktor (exchange factor)
Guanin-5’-monophosphat
5‘-Guanosyl-β,γ-Imido-Triphosphat = GppNHp
5‘-Guanosyl-Imido-Triphosphat = GMppNHp
Guanosin-[β/γ-imido]-triphosphat
reduziertes Glutathion
Glutathion-S-Transferase
Guanin-5’-triphosphat
Stunde
4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethan-sulfonsäure
High Performance Liquid Chromatography
Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid
isotherme Titrationskalorimetrie
Kanamycin
Dissoziationsgleichgewichtskonstante
Lactose
2‘,3‘-(N-methylanthraniloyl)- (kurz: mant-)
multiple anomalous dispersion
Mitogenaktivierte/s Protein
MAP-Kinase
MAPK-Kinase
MAPKK-Kinase
151
MEK
MES
min
MIR
mme
MOPS
MR
NMR
N-Terminus
NTP
OD
PAGE
PEG
Pi
PIA
PMSF
RafRBD
RalGDS
RalGEF
Raps
rms
rpm
SAD
SDS
SeMet
SIR
Tab.
TEMED
Tris
U
UZ
v/v
w/v
MAP/ERK-Kinase
2-Morpholino-ethansulfonsäure
Minute/-n
multiple isomorphous replacement
Monomethylether
3-Morpholino-propansulfonsäure
molecular replacement
Kernspinresonanz
Aminoterminus
Nukleosid-5’-triphosphat
optische Dichte
Polyacrylamide gel electrophoresis
Polyethylenglykol
anorganischer Phosphatrest
Protein Interface Analyse (protein interface analysis)
Phenylmethanesulfonyl-Fluorid
c-Raf-1 Protein Kinase Ras-Bindende Domäne (binding domain), kurz RBD
Ral Guaninnukleotiddissoziationsstimulator = RalGEF
RalGDS
Rap1A (E30D, K31E), am C-Terminus verkürzt
root mean square = mittlere quadratische Abweichung
Drehungen pro Minute
single anomalous dispersion
Natriumdodecylsulfat
Seleno-L-Methionin
single isomorphous replacement
Tabelle
N,N,N’,N’-Tetramethylethyldiamin
Trizma base = Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Unit (Einheit)
Ultrazentrifuge
volume per volume
weight per volume
Für die Aminosäuren wurde der Ein- und Dreibuchstabencode verwendet:
A
a
C
D
E
F
G
H
I
K
L
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Alanin
hydrophobe AS
Cystein
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
Isoleucin
Lysin
Leucin
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
x
152
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
Methionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Arginin
Serin
Threonin
Valin
Tryptophan
Tyrosin
beliebige AS
Eigene Veröffentlichungen
Poster anläßlich des 51. Mosbacher Kolloquiums
„GTP-binding Proteins – Central Regulators in Cell Biology“
Mosbach, Baden, 02.04.-05.04.2000
Daniel Schwarz, Christina Kiel, Ingrid Vetter, Alfred Wittinghofer und Christian
Herrmann
Thermodynamic and structural analysis of Ras proteins and their Effectors
Abstract in Biol. Chem. Vol 381, Special Supplement, pp. S55, Sept. 2000, 51.
Mosbacher Kolloquium
Christina Kiel, Daniel Schwarz, Alfred Wittinghofer und Christian Herrmann
Analysis of the H-Ras-RalGDS/-Raf Interface by Double Mutant Cycles
Abstract in Biol. Chem. Vol 381, Special Supplement, pp. S33, Sept. 2000, 51.
Mosbacher Kolloquium
Poster anläßlich eines SFB-Meetings
„Sonderforschungsbereich 394: Strukturelemente und Molekulare Mechanismen von
Proteinen bei Energieübertragund und Signalvermittlung“
Bochum, 09.10.2001
Daniel Schwarz, Christian Herrmann
Quantitative Beziehung zwischen Struktur und Funktion von Ras/Effektorkomplexen
Biochemical and Structural Characterisation of Novel Ras Effector Nore1 and search
for Interaction Partners.
Daniel Schwarz, Eva Wolf, Sabine Wohlgemuth und Christian Herrmann
The Structure of Nore1 C-terminal Coiled Coil Region and its modelled interaction to
the C-terminal Helix of MST1
in Vorbereitung
Daniel Schwarz, Sabine Wohlgemuth und Christian Herrmann
The Rab3a GEF MSS4 and the Microtubulus associated Protein Map1B compete with
Ras for the Nore1 RBD
in Vorbereitung
Daniel Schwarz, Ingrid Vetter, Christian Herrmann, Alfred Wittinghofer
The Effector-Loop Mutant Y40A of the Double Mutant Rap1B (E30D/K31E)
determines the Orientation of the Raf-RBD
in Vorbereitung
153
Anhang
Klonierte Nore1-Fragmente
Fragment
Restriktionsprodukt Vektor
Nore1 fl.
EcoRI/SalI
pGEX 4T1
Nore1 RBD (198-358)
EcoRI/SalI
pGEX 4T1
Nore1 C1 (95-166)
EcoRI/SalI
pGEX 4T1
Nore1 CC (370-413)
BamHI/SalI
pGEX 4T3
Nore1 RBD-CC (198-419)
EcoRI/SalI
pGEX 4T1
Nore1 C1-RBD (95-358)
EcoRI/SalI
pGEX 4T1
Nore1 C1-RBD-CC (100-413) EcoRI/SalI
pGEX 4T1
Oligonukleotide
Olikonukleotide von Nore1
Name mit Schnittstelle
Sequenz
Nore1_1s_EcoRI
CCGGAATTC_ATGGCTTCCCCGGCCATCGGGCAACG
Nore1_1s_NotI
ATAAGAATGCGGCCGC_ATGGCTTCCCCGGCCATCGG
Nore1_7s_EcoRI
CCGGAATTC_GGGCAACGTCCCTACCCGCTGCTCCTAGAT
Nore1_39s_EcoRI
CCGGAATTC_CGCTGCATCCCCACGGCCC
Nore1_75s_EcoRI
CCGGAATTC_GCTCGCCCTGTCCGGCCC
Nore1_95s_EcoRI
CCGGAATTC_CCCCGCGACGTGAGGAGCATC
Nore1_100s_EcoRI
CCGGAATTC_AGCATCTTCGAGCAGCCGCAG
Nore1_188s_EcoRI
CCGGAATTC_CAGAATGTCTGTAAGGCAGTGG
Nore1_188s_EcoRI
CGGAATTCC_CAGAATGTCTGTAAGGCAGTGG
Nore1_198s_EcoRI
CGGAATTCC_CACCCGCCCACGATACAGG
Nore1_200s_EcoRI
CCGGAATTC_CCGCCCACGATACAGGAG
Nore1_211s_EcoRI
CGGAATTCC_GACAGCTATAACAGCAGGGAG
Nore1_225s_EcoRI
CCGGAATTC_CTGAGTGAAGATGGCACC
Nore1_228s_EcoRI
CGGAATTCC_GATGGCACCTACACAGG
Nore1_242s_EcoRI
CGGAATTCC_CGACGGCCAGTGACGGTGCCC
Nore1_250s_EcoRI
CCGGAATTC_GGGATCCGGCCCCAGTCC
Nore1_266s_EcoRI
CCGGAATTC_GCCACCACAGACAAGCGG
Nore1_275s_EcoRI
CCGGAATTC_TTCTACCTGCCACTCGATGCC
Nore1_275s_EcoRI
CGGAATTCC_TTCTACCTGCCACTCGATGCC
154
Nore1_334s_EcoRI
CCGGAATTC_TCATATCCTCTCTACCTTCGTCTG
Nore1_344s_BamHI
CGCGGATCC_GGGCCTGACACCGATGTTCTCAGC
Nore1_368s_BamHI
CGCGGATCC_ATTCCTGAACTCCAGAACTTTTT
Nore1_370s_BamHI
CGCGGATCC_CCTGAACTCCAGAACTTTTTAAC
Nore1_EcoRIas
CCGGAATCCCGCGTCGACTCA...
EcoRI/SalI_Konvert_s
CGCGTCGACCCGGAATTC
Nore1_111as_SalI
CGCGTCGACTCACAAGACGCGGGGATCCTGCGGCTGCTCGAA
Nore1_166as_SalI
CGCGTCGACTCATCTGCAGTCCAACTGGATCAGGCTGCGGCA
Nore1_174as_SalI
CGCGTCGACTCAATCCAGGGCAGGGCCCCC
Nore1_312as_SalI
CGCGTCGACTCACTTCTGTGGGTTGTCCAC
Nore1_338as_SalI
CGCGTCGACTCAGTAGAGAGGATAGTCAGC
Nore1_347as_Sall
CGCGTCGACTCAGGTGTCAGGCCCAGCGAGC
Nore1_358as_SalI
CGCGTCGACTCATTCATTCTCCTTTAGCACAAAGC
Nore1_372as_SalI
CGCGTCGACTCAGAGTTCAGGAATGGAAAAGGCATCCC
Nore1_413as_SalI
CGCGTCGACTCACCCCGGCTTCCCTTGGGACTCTCG
Nore1_413as_EcoRI
GGAATTCCGTCACCCCGGCTTCCCTTGGGACTC
Nore1_413as_NotI
ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCCCGGCTTCCCTTGGG
Mutanten
Nore1_R216As
CAGCTATAACAGCGCGGAGAAGCACTGC
Nore1_R216Aas
GCAGTGCTTCTCCGCGCTGTTATAGCTG
Nore1_K236As
CACAGGTTTCATCGCAGTGCATTTGAAGC
Nore1_K236Aas
GCTTCAAATGCACTGCGATGAAACCTGTG
Nore1_K240As
CAAAGTGCATTTGGCGCTCCGACGGCC
Nore1_K240Aas
GGCCGTCGGAGCGCCAAATGCACTTTG
Nore1_R242As
GCATTTGAAGCTCGCACGGCCAGTGAC
Nore1_R242Aas
GTCACTGGCCGTGCGAGCTTCAAATGC
Nore1_R243As
TTGAAGCTCCGAGCGCCAGTGACGGTG
Nore1_R243Aas
CACCGTCACTGGCGCTCGGAGCTTCAA
Nore1_R272As
CCTGCAGCCACCACAGACAAGGCGACTTCCTTCTACCTGCCAGAT
Nore1_R272Aas
ATCTGGGACGTAGAAGGAAGTCGCCTTGTCTGTGGTGGCTGCAGG
Nore1_K283As
CCACTCGATGCCATCGCGCAGCTACATATC
Nore1_K283Aas
GATATGTAGCTGCGCGATGGCATCGAGTGG
Nore1_K302Ds
CAGGGGCTGCTCGACAAGTTCATGGTTGTG
Nore1_K302Das
CACAACCATGAACTTGTCGAGCAGCCCCTG
Nore1_K303As
CAGGGGCTGCTCAAGGCGTTCATGGTTGTG
Nore1_K303Aas
CACAACCATGAACGCCTTGAGCAGCCCCTG
Nore1_L379Ms
CTTTTTAACTATCATGGAAAAAGAGGAGC
Nore1_L379Mas
GCTCCTCTTTTTCCATGATAGTTAAAAAG
Nore1_L401Ms
TTCCGTCAGAAAATGGAAGAGGCATTACG
155
Nore1_L401Mas
CGTAATGCCTCTTCCATTTTCTGACGGAA
Sequenzierprimer
Nore_420s
GCGGCAGGCGCTGCGCTGCGCT
Nore_420as
AGCGCAGCGCAGCGCCTGCCGC
Nore_885s
GGTCATCCAGGGGCTGCTC
Nore_885as
GAGCAGCCCCTGGATGACC
Oligonukleotide der Interaktionspartner
Name
Sequenz
MacF_4301s_BamHI
CGCGGATCC_CTTGATACACATATGGAACTACAT
MacF_4402as_SalI
CGCGTCGAC_TCA_CAGGCTGGGAGGAGAGGCGATGTTTAA
MacF_4357s_BamHI
CGC GAA TCC_AGT AAG GTG GAA GAG AGA AAG TCA AAG
MacF_4398as_SalI
CGC GTC GAC_ TCA_AGA GGC GAT GTT TAA ACT CTG CTC TGC
TAG AGT
Spry1_131s_BamHI
CGCGGATCC_GGACGGTCTCCGCCCACCAGG
Spry1_245as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_GGGACTGTGAACAGGAGATG
tenascin_116s_BamHI CGCGGATCC_GCTCCAGATGTGAAGGAGCTCTGAGCAGGCTGG
tenascin_122s_BamHI CGCGGATCC_CTCTGAGCAGGCTG
tenascin_304as_EcoRI GGAATTCCG_TCA_GCCCTCGTCGCAGAC
Eif4g2_1s_BamHI
CGCGGATCC_ATGGAGAGTGCGATTGCAG
Eif4g2_157as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_CTCTCCTGGTTGACCC
Eif4g2_170as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_TTTGGAAATCAAGAGGCGTTGAATG
Pole1_1189s_BamHI
CGCGGATCC_CTTGAAGGAAAGAGACAGATTGTG
Pole1_1307as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_AGGCCCAAGCCTTGGCATATCTTCTGC
Pole1_1303as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_AAGCCTTGGCATATCTTCTGCTGA
CHD4_272s_BamHI
CGCGGATCC_AAGCCCAAGGGCAGCCCGCGAGTGCCT
CHD4_400as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_GTCGGGATCCAGGCACACCATGTGGTA
CHD4_406as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_GGGAGCCTTCTCCATGTCGGGATCCAGGCA
LRP6_1166s_BamHI
CGCGGATCC_ATGATTGAAAAAATTGACAT
LRP6_1334as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_GGCACAGCGGAACTGATCAAT
Map1B_2001s_BamHI CGCGGATCC_ATGGAGAAGATCACCAAG
156
Map1B_2143as_EcoRI GGAATTCCG_TCA_GGGTGGCGTTTCATCGCATTGCCTGCCTGTTG
S/T PP_1s_BamHI
CGCGGATCC_ATGTCCGACAGCGAGAAG
S/T PP_109as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_GGCCAGCAACAGGCAGATGG
RNF4_22s_BamHI
CGCGGATCC_AAGCGAACTGCCGAAACAACTTCGACCCCTGAG
RNF4_172as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_CTTAAGGGAATCACGGAGGCACTGGCTAC
MG50_1398s_BamHI
GCGGGATCC_GGGACAAATGACTTCAGAGAATTTGTTCTGGAAATG
MG50_1496as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_ACCCTTTTCCTCTGCACT
MSS4_1s_BamHI
GCGGGATCC_ATGGAACCCTGCGAG
MSS4_123as_EcoRI
GGAATTCCG_TCA_CTCGTGGGAAACTCGTTCGAAGGC
SeRSmt_96s_EcoRI
CCG GAA TTC TTG GAG CAG CTT CGA GAG CAG ATC CGG
SeRSmt_123as_SalI
CGC GTC GAC TCA GTT TGC CAG CAG GGC CCG CAC TGC CTC
LCCP_49s_EcoRI
CCG GAA TTC CTG ATG AGG ACC TCT TCC AAG CGT GAG GCC
LCCP_115s_EcoRI
CCG GAA TTC TAT GAG CAG CAA CAG GAA CAG GAG AAG CTG
LCCP_166as_SalI
CGC GTC GAC TCA CTT TTT GCG TAG CTC TTC TTC AGC CCG
157
Accession-Nr. von Nore1 und dessen Homologe
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
AF053959 3018 bp mRNA linear ROD 31-MAR-1998
Mus musculus putative ras effector Nore1 mRNA, complete cds.
AF053959
LOCUS
DEFINITION
Rassf5 3018 bp mRNA linear ROD 19-SEP-2002
Mus musculus Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 5
(Rassf5), mRNA.
NM_018750
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
LOCUS
DEFINITION
ACCESSION
AF286217 1777 bp mRNA linear PRI 03-SEP-2000
Homo sapiens Ras association domain family protein isoform 1F
(RASSF1) mRNA, complete cds, alternatively spliced.
AF286217
Rassf1 1548 bp mRNA linear ROD 30-APR-2002
Mus musculus ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1
(Rassf1), mRNA.
XM_109511
Rassf3 1224 bp mRNA linear ROD 19-SEP-2002
Mus musculus Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 3
(Rassf3), mRNA.
NM_138956
AF102772 1880 bp mRNA linear PRI 14-MAY-2002
Homo sapiens pancreas-specific ras association (RalGDS/AF-6)
domain family 1 protein isoform 1E (RASSF1) mRNA, complete cds;
alternatively spliced.
AF102772
AF102770 1860 bp mRNA linear PRI 14-MAY-2002
Homo sapiens ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1 protein isoform 1A
(RASSF1) mRNA, complete cds; alternatively spliced.
AF102770
AF445801 3499 bp mRNA linear PRI 06-DEC-2001
Homo sapiens ras effector-like protein (NORE1B) mRNA, complete
cds.
AF445801
AF291719 1650 bp mRNA linear PRI 03-SEP-2000
Homo sapiens Ras association domain family protein isoform 1G
(RASSF1) mRNA, complete cds, alternatively spliced.
AF291719
158
Alignments der verschiedenen Nore1-Homologen
159
Alignment der RasSF1-Isoformen
160
Gleichungsdateien
Die Auswertungen des kompetetiven GDI und der ITC-Daten zur Bestimmung der
Komplexbildungskonstante erfolgten mit dem Programm Scientist. Nach der Definition
aller Variablen werden alle Differenzialgleichungen für die Änderung der einzelnen
Spezies aufgeführt, die dem zu Grunde gelegten Modell entsprechen. Zusätzlich werden
noch Schätzwerte für die zu bestimmenden Parameter und die Anfangsbedingugnen
eingegeben.
Die
Auswertung
der
ITC
Experimente
zur
Bestimmung
von
Dissoziationsgleichgewichtskonstanten von Nore1-CC erfolgte mit dem Programm
Origin.
Scientist-Modell Datei zur Auswertung des kompetetiven GDI:
// Scientist Compet. GDI
IndVars: C
DepVars: A, B, AB, AC, Cf, F
// A=RBD, B=Ras.mantGppNHp, C=compet. RBD-Binder
Params: K1, K2, ATOT, BTOT, Yb, Yab
// Yb=off-rate von Ras, Yab=off-rate vom Ras-RBD Complex
AB=A*B/K1
AC=A*Cf/K2
ATOT=A+AB+AC
BTOT=B+AB
C=Cf+AC
0<A<ATOT
0<B<BTOT
0<Cf<C
F=(B*Yb+AB*Yab)/BTOT
//
***
Scientist-Modell Datei zur Auswertung der ITC-Daten zur Bestimmung der
Komplexbildungskonstante von Nore1-CC. Dieses Modell wurde freundlicherweise von
Dr. A. Blume, Halle-Wittenberg zur Verfügung gestellt.
// MicroMath MINSQ Model File "cmc_dh13", A. Blume, IPC, MLU Halle-Wittenberg
//
// Variante des Modells "cmc_dh7" bzw. "cmc_dh8" mit Berücksichtigung der
Gegenionenkondensation
161
// und Aggregationszahl n als variabler Parameter.
//
// Es wurde zur Berechnung der Verduennungswaermen der Mizellen und
// der Monomeren die Differenzen der jeweiligen Konzentration in der Spritze
// und der Zelle benutzt
//
// Calculation of the calorimetric titration curves for nonionic and ionic surfactants.
// based on the mass-action model with equilibrium constant K and aggregation number n.
// Variation of previous models. This one includes the counterion condensation effect.
//
// This is based on the model of Coello et al. J. Phys. Chem. 97 (1993) 10186
//
// Variables and parameters
//======================
// cell volume = vcell in mL
// concentration of monomers in the cell after n-1th addition = x1
// concentration of surfactant in micellar form in cell after n-1th addition = xn
// concentration of monomers in the cell after nth addition = x1e
// concentration of surfactant in micellar form in cell after nth addition = xne
// total concentration of surfactant in cell = c. This is calculated from a similar dilution formula
// as used by MicroCal in the ITC worksheets.
// integrated volume of injection from syringe = vs (in mL)
// total surfactant concentration in syringe = c1 in mol/L
// concentration of monomers in syringe = x1mon
// concentration of surfactant in micellar form in syringe = x1mic
// volume of injection = vspritz
// Deltag-G0 for demicellization for mass-action model = deltag
//
// The Delta-G0 values are based con concentration units!! They have to be converted to DeltaG0 values based on mole fraction
// units. The relevant equation for the ratio of the Delta-G0 values calculated from Kc and Kx for
a nonionic surfactant is:
// Delta-G0x/Delta-G0c = ln Kx/ln Kc = 1 + (n-1)*4.017*RT/(n*Delta-G0c) which leads to
// Delta-G0x = Delta-G0c + (n-1)*4.017*RT/n
// For an ionic surfactant it is:
//D elta-G0x = Delta-G0c + (n(1+beta)-1)*4.017*RT/n
//
// aggregation number = n
// Temperature = t
// enthalpy of demicellization = dhdemic
// dilution enthalpy for monomers = dhvmon
// dilution enthalpy for micelles = dhvmic
// activity coefficient = gamma
// ionic strength = mu
// degree of counterion condensation = beta. This value must be taken from published data.
// it is between 0.2 and 0.8 and depends on the system, the ionic strength etc.It makes no sense
// to use beta as variable parameter.
//=======================================================================
===
162
// The equations contain implicit variables, the first derivative cannot be calculated by
SCIENTIST.
// Therefore the difference in concentrations after the nth and nth-1 addition of vspritz mL
// have to be calculated.
// Therefore new concentrations x1e, xne, ce for the nth addition are calculated.
// The difference in the number of moles of monomers and surfactant
// in micellar form has then to be calculated, i.e. deltanm is the difference in number of moles
// of monomers after and before the addition.
// The observed heat can then be calculated by multiplication with the molar enthalpy = deltanm
// of demicellization plus dilution terms for the monomers (dhvmon) and micelles (dhvmic).
//
// Berechnung der Titrationskurven fuer Demizellisierung von Deoxycholat
// Es werden zuerst die Konzentrationen der Monomeren (x1) und Monomeren in
// Mizellen (xn) in Abhaengigkeit von der Vorlagekonzentration (c) bzw der
// zugegebenen Gesamtmenge aus der Spritze in Milliliter (vs) berechnet
// Parameter sind dabei Aggregationszahl n, Temperatur (temp) und Delta-G-Wert
// (deltag) Dann wird eine zweite Kurvenschar, versetzt um Zugabevolumen (vspritz) der
// Spritze, dh zB 0.010 Milliliter, berechnet (x1e, xne) Die Anfangskonzentrationen
// der Monomeren in der Spritze und der Monomeren in Mizellform in der Spritze
// sind x1mon und x1mic bei Gesamtkonzentration in der Spritze von c1
// Die Differenz der Molzahlen der Monomeren vor und nach Zugabe von jeweils
// vspritz Milliliter (deltanm) wird dann anschliessend ausgerechnet
// Die naechste Groesse ist das Delta-Q, das aus deltanm*dhdemic und den Beitraegen
// der Verduennungsenthalpien fuer die Monomeren und Mizellen bestimmt wird
// ausgehend von den Konzentrationen x1mon und x1mic in der Spritze.
// Die Delta-Q-Werte werden dann noch normiert und auf molare Groessen umgerechnet.
// Vcell ist das Zellvolumen in ml.
// Die Volumina sind in ml einzugeben in den Parametersatz, die Konzentration in M.
//
// The Delta-g values are in kJ/mol, the delta-h values can be in kJ/mol or kcal/mol, depending
// whether the originial MicroCal worksheet data are used or not. These are in kcal/mol.
// Attention: be careful with using different dimensions!!
//
// The aggregation number n can either be fixed or not. In this present model, the concentrations
// are calculated using the logarithm. Therefore, n can be continuous variable.
// However, sometimes it is advisable to fix n to an integer and vary it by hand.
//
// die Deltag-Werte in J/mol, die Deltah-Werte in J/mol oder cal/mol, je nachdem,
// ob im Worksheet die Delta-Q-Werte in die entsprechenden Dimensionen haben.
// ORIGIN gibt normalerweise die Werte in kcal/mol aus!!! Dadurch entstehen unter// schiedliche Dimensionen für Deltag und die Deltah-Werte!!!!
//
///Die Werte von n koennen bis nahe an 100 gewaehlt werden. Bedingung ist,
// dass die Eingrenzung von xn und x1 bis zu maximalen Konzentration c gesetzt
// wird, die in der Vorlage erreicht werden kann.
// Im eingeladenen ORIGIN Worksheet muessen folgende Spalten erscheinen:
// IndVars: vs=zugegebene Menge in Milliliter, muss erst generiert werden.
// DepVars: Deltah=Ndh; c=xt/1000, muss auch erst generiert werden
//
163
// The spreadsheet must contain the following columns:
// IndVars: vs=added in jection volume in mL, this must be generated with increments in mL
// as used in the experiments, for instance, 25 injections, each of 0.01 mL.
// DepVars: Deltah=Ndh from Origin worksheet; c=xt/1000: has to be generated from xt column
// in Origin worksheet.
//
// Neue Variante mit Gegenionenkondensation, d.h. dem Parameter beta, der zwischen 0 und 1
liegen
// kann. Für Gallensalze liegt er zwischen 0.05 und 0.3
// In dieser Variante werden zwischendurch Logarithmen berechnet. Dann funktioniert die
Berechnung
// offensichtlich auch mit Dezimalbrüchen von Beta.
//
//
// Programmbeginn
//
IndVars:vs
//
DepVars:deltah,x1,x1e,x1mon,x1mic, xn
//
Params: deltag,temp,n,vcell,c1,vspritz,dhdemic,dhvmon,dhvmic,deltac,beta,delta
//
// Equations:
//
// Berechnung der Gleichgewichtskonstante
//
// Calculation of equilibrium constant
//
k=exp(n*deltag/(8.3144*temp))
//
// Berechnung der Konzentrationen fuer Zugabe n-1
//
// Calculation of concentrations for n-1th addition
//
c=c1*vs/vcell*(1-0.5*vs/vcell)
lnxn=ln(n)+ln(k)+n*ln(x1)+beta*n*ln(c*(1-beta)+beta*x1)
//xn1=n*x1^(n*(1+beta))*k
xn=exp(lnxn)
x1=c-xn
//
// Berechnung der Konzentrationen fuer Zugabe n
//
// Calculation of concentrations for nth addition
//
ce=c1*(vs+vspritz)/vcell*(1-0.5*(vs+vspritz)/vcell)
lnxne=ln(n)+ln(k)+n*ln(x1e)+beta*n*ln(ce*(1-beta)+beta*x1e)
//xne1=n*x1e^(n*(1+beta))*k
xne=exp(lnxne)
x1e=ce-xne
164
//
// Berechnung der Monomer und Mizellkonzentration in der Spritze
//
// Calculation of monomer and micellar concentration in syringe
//
lnx1mic=ln(n)+ln(k)+n*ln(x1mon)+beta*n*ln(c1*(1-beta)+beta*x1mon)
x1mic=exp(lnx1mic)
x1mon=c1-x1mic
//
// Berechnung der Differenz der Molzahlen nach Zugabe in die Zelle
//
// Calculation of the difference in number of moles of monomers after injection in the cell
// from the change in the number of surfactants in micellar form.
deltanm=vcell*(xne-xn)+vspritz*(xne-x1mic)
//
// Berechnung der Waermemengen.
// geaendert gegenueber cmc_dh7, s.o.
//
// Calculation of the observed heats
//
deltaqdemic=-deltanm*dhdemic
deltanmon=(x1mon-x1e)*vspritz
deltaqvmon=deltanmon*dhvmon
deltanmic=(x1mic-xne)*vspritz
//0<xne<.05
0<x1mon<.05
0<vs<0.25
***
deltaqvmic=deltanmic*dhvmic
deltah=(deltaqdemic+deltaqvmon+deltaqvmic)/(vspritz*c1)
//
// Berechnung der Aktivitätskoeffizienten gamma und Ionenstärke mu
// nur zu Kontrolle, zur Simulation nicht erforderlich
//
// Calculation of activity coefficients gamma and ionic strength mu
// just for control, not necessary for the simulation
//
mu=0.5*(x1+c*(1-beta)+beta*x1+delta^2*n^2*(1-beta)^2*xn)
loggamma=-0.5*16*sqr(mu)/(1+sqr(mu))
gamm=10^loggamma
//
//Grenzen der impliziten Variablen
//
// Limits of the implicit variables. The upper limit of x1 and x1e should be
// above the cmc. For a start the upper limits for x1, x1e, xne can be set to
// the maximum value of the total concentration in the cell reached after the
// total injection volume of 0.25 mL. The upper limit of x1mon should be set to
// a value above the cmc, maximum is the concentration c1 in the syringe.
165
// Upper limit for vs is the total volume of the syringe.
//
0<x1<0.050
0<x1e<.050
166
Gesamtstatistik für Nore1-CC
wt
SeMet
Datensammlung
Peak
Inflection
Röntgenquelle
ESRF ID 14-4
ESRF ID 29
ESRF ID 29
Auflösung [Å]
1,9
2,8
2,8
Wellenlänge [Å]
0,9393
0,9793 (peak)
0,97943
(inflection)
20428
19165
Anzahl
Reflexe
beobachteter 62896
Anzahl gleicher Reflexe
17640
3170
5960
Vollständigkeit
(gesamt/letzte
[%]
98,6 / 96,6
95,2 / 96,3
94,3 / 91,5
C2221
I222
I222
a, b, c [Å]
70,9 x 84,4 x 39,2
46,1 x 69,8 x 70,8 46,1 x 69,8 x 70,8
α,β,γ [°]
90, 90, 90
90, 90, 90
90, 90, 90
pro 1
Moleküle1
asymmetrischer Einheit
1
1
Rsymm (gesamt,
Schale) [%]
7,9 / 20,4
5,7 / 21,6
8,04
7,39
4,68
Auflösungsbereich [Å]
19-1,9
20-2,8
Anzahl Reflexe
60238
19523
Rwork [%]
21,0
34,5
Rfree [%]
23,3
40,2
Schale)
Raumgruppe
Zelldimensionen
letzte 6,7 / 26,9
I/σ
Verfeinerung
Tab. 23 Statistik der gesammelten und prozessierten Daten. Rsymm =
18752
∑∑ I
h
i
hi
− Ih
∑I
hi
, wobei hi die
hi
skalierte Intensität der i-ten symmetrieverwandten Beobachtung des Reflexes h und Ih ist der Mittelwert.
Rwork =
∑F
oh
h
− Fch
∑F
oh
, wobei Foh und Fch die beobachteten und kalkulierten
h
Strukturfaktoramplituden für den Reflex h sind. 1Als Molekül wird hier ein Nore1-CC-Dimer angesehen.
167
Gesamtstatistik für Nore1-RBD
Wildtyp
Datensammlung
Röntgenquelle
DESY BW 7A
Auflösung
2,2 Å
Wellenlänge [Å]
0,9280
Anzahl beobachteter Reflexe
65867
Anzahl gleicher Reflexe
18212
Vollständigkeit (gesamt/letzte Schale) [%] 97,3 / 95,2
Raumgruppe
C2
Zellkonstanten
a, b, c [Å]
79,04 x 87,31 x 56,11
α, β, γ [°]
90 124,94 90
Moleküle pro asymmetrischer Einheit
2
Rsymm (gesamt, letzte Schale) [%]
6,2/24,3
I/σ
5,63
Auflösungsbereich [Å]
15-2,5
Anzahl Reflexe
78833
HgCl2-Derivat
Datensammlung
Peak
Inflection
Remote
Röntgenquelle
DESY BW 7A
DESY BW 7A
DESY BW 7A
Auflösung
2,5 Å
2,5 Å
2,7 Å
Wellenlänge [Å]
1,0031
1,0056
0,928037
Anzahl beobachteter Reflexe
67434
48329
43240
Anzahl gleicher Reflexe
20497
20378
20488
Vollständigkeit (gesamt/letzte Schale) [%] 95,5 / 89,0
94,2 / 81,9
94,2 / 93,1
Raumgruppe
C2
C2
C2
Zellkonstanten
a, b, c [Å]
79,5 x 87,9 x 56,5 79,5 x 87,9 x 56,5 79,5 x 87,9 x 56,5
α, β, γ [°]
90 124,9 90
90 124,9 90
90 124,9 90
Moleküle pro asymmetrischer Einheit
2
2
2
Rsymm (gesamt, letzte Schale) [%]
7,3/28,2
6,4/28,5
7,2/28,3
I/σ
4,51
3,78
3,70
Auflösungsbereich [Å]
15-2,5
15-2,5
15-2,7
Anzahl Reflexe
76985
55328
41398
168
SeMet-Derivat
Datensammlung
Peak
Inflection
Röntgenquelle
SLS PX
SLS PX
Auflösung
2,95 Å
3,3 Å
Wellenlänge [Å]
0,97943
0,97960
Anzahl beobachteter Reflexe
48352
43941
Anzahl gleicher Reflexe
28875
29235
Vollständigkeit (gesamt/letzte Schale) [%] 90,9 / 92,9
87,9 / 94,9
Raumgruppe
C2
C2
Zellkonstanten
a, b, c [Å]
79,5 x 87,32 x 94,51 80,58 x 87,92 x 95,46
α, β, γ [°]
90 99,3 90
90 99,6 90
Moleküle pro asymmetrischer Einheit
2
2
Rsymm (gesamt, letzte Schale) [%]
10,2/28,1
12,5/19,3
I/σ
2,67
3,54
Auflösungsbereich [Å]
20-2,95
20,3,3
Anzahl Reflexe
55372
41186
Tab. 24 Statistik der gesammelten und prozessierten Daten. Rsymm =
∑∑ I
h
i
hi
− Ih
∑I
hi
, wobei hi die
hi
skalierte Intensität der i-ten symmetrieverwandten Beobachtung des Reflexes h und Ih ist der Mittelwert.
Rwork =
∑F
oh
h
− Fch
∑F
oh
, wobei Foh und Fch die beobachteten und kalkulierten
h
Strukturfaktoramplituden für den Reflex h sind.
169
Gesamtstatistik für RasSF1C-RBD
Wildtyp
Datensammlung
Röntgenquelle
inhouse
Auflösung
2,05 Å
Wellenlänge [Å]
1,5418
Anzahl beobachteter Reflexe (gesamt/letzte Schale) 138563
Anzahl gleicher Reflexe (gesamt/letzte Schale)
20292
Vollständigkeit (gesamt/letzte Schale) [%]
92,3 / 96,0
Raumgruppe
P212121
Zellkonstanten
a, b, c [Å]
41,7 x 66,2 x 112,0
α, β, γ [°]
90 90 90
Moleküle pro asymmetrischer Einheit
2
Rsymm (gesamt, letzte Schale) [%]
13,7 / 25,6
I/σ
6,54
Auflösungsbereich [Å]
10-2,05
Anzahl Reflexe
155594
Tab. 25 Statistik der gesammelten und prozessierten Daten. Rsymm =
∑∑ I
h
i
hi
− Ih
∑I
hi
, wobei hi die
hi
skalierte Intensität der i-ten symmetrieverwandten Beobachtung des Reflexes h und Ih ist der Mittelwert.
Rwork =
∑F
oh
h
− Fch
∑F
oh
, wobei Foh und Fch die beobachteten und kalkulierten
h
Strukturfaktoramplituden für den Reflex h sind.
170
Danksagung
Ich möchte mich bei Herrn Prof. Dr. A. Wittinghofer für die Anfertigung des
Erstgutachtens und die Bereitstellung des Arbeitsplatzes bedanken
Bei Frau Dr. A. Blöchl bedanke ich mich für ihre Bereitschaft, das Zweitgutachten
anzufertigen.
Meinem Betreuer Dr. Christian Herrmann möchte ich mich besonders für die nette
Aufnahme in seine Arbeitsgruppe bedanken. Seine ständige Diskussionsbereitschaft und
Anregungen waren stets hilfreich und haben sehr zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen.
Desweiteren bedanke ich mich bei Dr. Eva Wolf für die besonders gute Betreuung und
Diskussionsbereitschaft bei der Bestimmung der Nore1-Coiled Coil-Struktur.
Desweiteren bedanke ich mich bei Dr. Ilme Schlichting, Dr. Axel Scheidig, Dr. Ingrid
Vetter, Dr. Eva Wolf, Dr. Alexey Rak, Dr. Wulf Blankenfeldt und Özkan Yildiz für die
Datensammlung am Synchrotron.
Bedanken möchte ich mich bei Dr. Ingrid Vetter und Dr. Wulf Blankenfeldt für deren
Hilfe bei computertechnischen Fragen. Radovan Dvorsky danke ich für die Hilfe bei
den Modellierungen.
Ganz besonders möchte ich mich noch bei Sabine Wohlgemuth bedanken. Ihre Hilfe
und außerordentliche Unterstützung im Labor trugen sehr zum Gelingen dieser Arbeit
bei.
Dr. Michael Hanzal-Bayer danke ich sehr für die Einführung in die Technik des Hefe-2Hybrid.
Dr. Ioanna-Maria Karaguni möchte ich sehr für ihre Freundschaft danken. Sie war in
schwierigen Zeiten immer für mich da.
Meinen Laborkollegen Agnidipta Ghosh, Simone Kunzelmann, Benjamin Stieglitz,
Christina Kiel und Utz Benscheid danke ich für die gute Stimmung und für die oft sehr
amüsanten Zeiten im Labor.
Dr. Sergei V. Strelkov (Universität Basel, Schweiz) danke ich für die Hilfe bei der
Charakterisierung der Coiled Coil Struktur.
Martin Würtele danke ich sehr für seine Diskussionsbereitschaft und für seine kritischen
Anmerkungen während der Entstehung dieser Arbeit.
Meinen Bürokollegen Marc Saric, Gretel Buchwald, Martin Würtele und Michael
Seewald danke ich für ihre vielfältige Unterstützung und gute Zusammenarbeit.
Allen anderen Mitarbeitern der anderen Arbeitsgruppen möchte ich für ein sehr gutes
Arbeitsklima danken. Besonders die gemeinsamen Mittagspausen waren eine sehr gern
gesehene Abwechslung und Unterhaltung.
Desweiteren bedanke ich mich bei meinen Eltern und besonders bei meinem Bruder, bei
Christoph, Haris und Anja für die Geduld, die sie während der Promotion in mich
investiert haben.