Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Ras
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Inhaltsverzeichnis EINLEITUNG SIGNALTRANSDUKTION UND REGULATORISCHE GTPASEN RAS-SUPERFAMILIE RAS-PROTEIN Struktur und Funktion RAP-PROTEIN Struktur und Funktion EFFEKTOREN Affinitäten DER NORE1-EFFEKTOR Entdeckung Biologische Charakterisierung von Nore1-Effektor Oligomerisierung von Nore1 Nore1 Homologe PROTEIN-DOMÄNEN VON RAS-EFFEKTOREN Rasbindende Domäne (RBD) Cysteinreiche Domäne (C1) Coiled-Coil Domäne (CC) 1 1 3 3 6 12 13 14 16 17 17 20 21 21 22 24 26 26 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 32 MATERIALIEN 34 CHEMIKALIEN ENZYME GEBRAUCHSWAREN 34 34 35 PUFFER UND STAMMLÖSUNGEN 36 MEDIEN, ANTIBIOTIKA UND AGARPLATTEN 40 MEDIEN FÜR BAKTERIEN MEDIEN FÜR HEFEN ANTIBIOTIKA X-GAL-AGARPLATTEN VERWENDETE BAKTERIEN- UND HEFESTÄMME, VEKTOREN, OLIGONUKLEOTIDE, BIBLIOTHEKEN UND DATENBANKEN BAKTERIEN- UND HEFESTÄMME VEKTOREN SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE DATENBANKEN UND SOFTWARE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA: KLONIERUNGSTECHNIKEN DARSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN DARSTELLUNG KOMPETENTER HEFEN TRANSFORMATION VON BAKTERIEN TRANSFORMATION VON HEFEN 40 41 43 43 43 43 44 44 45 46 46 46 47 47 48 48 48 Transformation im kleinen Ansatz Transformation im großen Ansatz ELEKTROPHORESE VON NUKLEINSÄUREN ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN METHODEN DER POLYMERASE KETTEN REAKTION (PCR) GELRETARDATIONSASSAY (GELSHIFT) PROTEINBIOCHEMISCHE TECHNIKEN EXPRESSION PRÄPARATION VON PROTEINEN Zellaufschluß Proteinreinigung und Chromatographie (FPLC) KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN ELEKTROPHORESE VON PROTEINEN NUKLEOTIDCHEMISCHE METHODEN 48 49 49 50 50 52 53 53 53 53 54 55 55 56 NUKLEOTIDAUSTAUSCH HPLC-ANALYSE VON NUKLEOTIDEN 56 57 BIOPHYSIKALISCHE METHODEN 58 ITC DSC GDI FLUORESZENZMESSUNGEN CD-SPEKTROSKOPIE MASSENSPEKTROSKOPIE KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN 58 59 60 60 61 62 63 KRISTALLISATION PRINZIP DER ZÜCHTUNG VON PROTEINKRISTALLEN KRISTALLISATION NACH DER METHODE DES HÄNGENDEN TROPFENS KRISTALLMONTAGE MARKIERUNG VON AMINOSÄUREN ZUR PHASIERUNG RÖNTGENOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNG Grundlagen Datensammlung Phasenproblem MIR / SIR MAD / SAD Molekularer Ersatz Verfeinerung 63 63 64 64 65 66 66 67 68 68 68 69 69 YEAST-TWO-HYBRID-SCREENING (FIELDS UND SONG, 1989) 71 BESCHREIBUNG DER EINGESETZTEN MATERIALIEN SELEKTION RELEVANTER TRANSFORMANTEN VERIFIKATION POSITIVER KLONE DURCH KOTRANSFORMATION MIT LEERVEKTOR ISOLIERUNG DES AD-PLASMIDS AUS HEFEZELLEN UND KLON-ANALYSE GST-PULLDOWN (SMITH UND JOHNSON, 1988) EXPRESSION UND ISOLIERUNG DER GST-FUSIONSPROTEINE PULLDOWN-INKUBATION UND ANALYSE MITTELS PAGE LUMINOMETRISCHE MESSUNGEN 71 71 71 72 72 72 73 73 Messung der β-Galactosidase-Aktivität ERGEBNISSE NORE1-DOMÄNENSTRUKTUR GDI- UND ITC-MESSUNGEN ENTWICKLUNG EINES ALIGNMENTS NORE1-RBD AUF BEKANNTE RBD’S HEFE 2-HYBRID-SCREEN 2-Hybrid Statistik/Bestimmung der Transformationseffizienz Verifikation positiver Klone durch Segregation Semiquantitative Bestimmung von Bindungsaffinitäten Identifikation von HIS3- und lacZ-positiven Hefetransformanten Kotransformation mit Nore1-Fragmenten GST-Pulldown Affinitätsmessungen Kompetetiver GDI GELRETARDATIONSASSAY (GELSHIFT) DIMERISIERUNG VON NORE1 STRUKTUREN NORE C1 KRISTALLISATION MODELLBAU UND VERFEINERUNG COILED COIL-STRUKTUR Orientierung Charakterisierung des Interface Kristallpackung MODELLIERUNGEN KRISTALLE DER NORE1-RBD UND RASSF1C-RBD DISKUSSION NORE1-DOMÄNENSTRUKTUR AFFINITÄTEN ZWISCHEN RAS UND NORE MUTANTEN ALIGNMENT VON NORE1-RBD AUF BEKANNTE RBD’S INTERAKTIONSPARTNER VON NORE1 DIE EINZELNEN INTERAKTIONSPARTNER RNF4 MSS4 Spry1 MAP1B eIF4γ2 S/T PP Typ 1α tenascin-C MacF, SerRSmt und LCCP GST-PULLDOWN ITC/GDI VON INTERAKTIONPARTNERN GELRETARDATIONSASSAY NORE1 C1-DOMÄNE NORE1 COILED-COIL STRUKTUR BINDUNG VON NORE1 AN MST1 73 75 75 77 78 81 82 82 85 86 88 91 93 95 97 97 100 100 101 105 105 107 107 111 114 116 118 118 119 121 121 122 122 122 123 124 124 125 126 126 126 127 127 129 129 130 133 AUSBLICK 136 ZUSAMMENFASSUNG 136
