Praktikumsskript III - Ernst-Moritz-Arndt

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald,
Praktikum Transfusionsmedizin, Version 2011
Teil III
HLA-Typisierung
1. Einführung
Das HLA- (Human Leucocyte Antigen-) System repräsentiert den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) des Menschen. Es stellt sich als ein höchst komplexes Antigensystem dar,
das an der Oberfläche fast aller kernhaltigen Zellen und auf Thrombozyten nachgewiesen
werden kann. Genetisch ist das gesamte System als Block auf dem kurzen Arm des
Chromosoms 6 lokalisiert; der Genort umfaßt etwa 3 cM. Das folgende Schema zeigt die
Organisation der HLA-Gene auf dem Chromosom 6 in stark vereinfachter Form:
HLA-System
II
DP+ DQ+
DP
DQ
DP-Ag DQ-Ag
III
21OHB C4B 21OHA C4A FB
DR+
DR
DR-Ag 21OHB C4B 21OHA C4A FB
I
C2
HSP1 HSP2 TNF
TNF
B
C2
HSP1 HSP2 TNF
TNF
B-Ag
C
A
Cw-Ag A-Ag
Abb. 1: HLA-Gene auf Chromosom 6 und deren Genprodukte
(Nach Roitt, M.: Roitt`s essential Immunology 1997)
Aus der Abbildung 1 wird ersichtlich, dass eine Unterteilung des HLA-Genkomplexes in
Klasse I-, Klasse II- und Klasse III-Gene vorgenommen wurde, der unterschiedliche
Strukturen und Funktionen der entsprechenden Genprodukte zugrunde liegen.
Insgesamt spielen die MHC-Antigene eine Schlüsselrolle innerhalb der Reaktionen der
Immunerkennung. Indem sie Antigen-Peptidfragmente binden, machen sie sie für die TZellrezeptoren sichtbar und es kommt zur Aktivierung der T-Lymphozyten und zur Initiierung
einer spezifischen Immunantwort.
1.1. Struktur und Funktion der HLA-Genprodukte
Die Grundstrukturen von Klasse I- und Klasse II-Antigenen sind unterschiedlich. Jedes
Klasse I-Antigen besteht aus einer glykosylierten Polypeptidkette, die in der Zellmembran
verankert und mit einem
ß2-Mikroglobulin nichtkovalent assoziiert ist. Demgegenüber
setzen sich Klasse II-Antigene aus 2 verschiedenen Polypeptidketten zusammen, die
ebenfalls nichtkovalent verbunden sind und beide die Zellmembran durchdringen. Abb. 2
zeigt die geschilderten Strukturen stark schematisiert.
Aus Röntgenstrukturanalysen weiß man, daß HLA-Klasse I- und HLA-Klasse II-Moleküle in
sehr ähnlicher Weise sogenannte Taschen formen, deren Boden jeweils von einer
Faltblattstruktur und deren Seitenwände von 2  -Helices gebildet werden. Die räumliche
Struktur eines Klasse I-Antigens ist in Abb. 3 schematisch dargestellt.
1
Peptidantigene werden in die Hohlräume der HLA-Taschen aufgenommen und in dieser
Form vom T-Zellrezeptor erkannt. Dabei sind die CD8-positiven zytoxischen T-Zellen in
erster Linie auf die Erkennung von HLA-Klasse I-Antigenen spezialisiert. Auf diese Weise
können virusinfizierte Zellen im Organismus entdeckt und eliminiert werden.
MHC-Klasse II-Strukturen finden sich nur auf speziellen Zellen des Immunsystems, den
sogenannten antigenpräsentierenden Zellen (APC: dendritische Zellen, Makrophagen, BZellen). Komplexe von HLA-Klasse II und Peptid-Antigenen auf der Oberfläche dieser Zellen
werden von CD4-positiven T-Helfer-Zellen erkannt und bewirken deren Aktivierung.
Unter HLA-Klasse III werden eine Reihe von Antigenen zusammengefaßt, die in Struktur und
Funktion sehr unterschiedlich sind und mit dem Prozeß der Antigenerkennung in keinem
direkten Zusammenhang stehen (Komplementfaktoren 2 und 4, 21-Hydroxylase, Tumornekrosefaktor, 70-kDa-Hitzeschockprotein u.a.). Bei einer HLA-Typisierung werden sie
gewöhnlich nicht berücksichtigt.
2
Abb. 2: Schema der Sekundärstruktur von HLA-Klasse I- und Klasse II-Antigenen
(Nach Waßmut, R.: Einführung in das HLA-System 1995)
Abb. 3: Tertiärstruktur von HLA-Klasse I-Antigenen am Beispiel von HLA-A2
(Nach Waßmuth, R.: Einführung in das HLA-System 1995 )
3
1.2. Nomenklatur und Genetik
Ein Individuum erbt ein mütterliches und ein väterliches Chromosom 6. Das bedeutet, dass
jeweils zwei HLA-haploide Genotypen (Haplotypen) vorliegen, wobei jeder von einem
Elternteil stammt. Jeder MHC-Haplotyp setzt sich aus verschiedenen Genorten zusammen,
die mit Großbuchstaben benannt werden. Für die Klinik wesentlich sind innerhalb des HLAKlasse I-Genkomplexes die Genorte A, B und C, innerhalb des HLA-Klasse II-Genkomplexes
die Loci DR und DQ
(der dritte Genort DP findet bei Transplantationen bislang kaum
Berücksichtigung).
Da im Bereich der einzelnen Genorte ein extremer Polymorphismus herrscht, weist eine
Population eine enorme Vielfalt verschiedener Haplotypen auf. Mit serologischen Techniken
lassen sich zur Zeit
24 A-Antigene, 57 B-Antigene, 11 Cw-Antigene, 21 DR-Antigene und
9 DQ-Antigene bestimmen. Die Anwendung empfindlicherer Methoden, insbesondere die
HLA-Alleltypisierung mit sequenzspezifischen Oligonukleotiden oder mit sequenzspezifischen Primern, erlaubt eine enorme Erweiterung der serologisch definierten HLA-Antigene in
etwa 200 A-Allele, knapp 400 B-Allele, etwa 100 C-Allele, über 300 DR-Allele und 43 DQAllele.
Familientypisierung: Phänotypen
Mütterlicher Phaenotyp
A1, 11
B8, 35
Väterlicher Phaenotyp
Cw4, 7 DR1,17 DQ2, 5
A3, 24
B7, 44
Cw5, 7 DR4,15 DQ6, 8
Kindlicher Phaenotyp
A3, 11
B7, 35
Cw4, 7 DR1,15 DQ5, 6
Abzuleitende Genotypen (Haplotypen):
Kindlicher Genotyp
A11
B35
Cw4
DR1
DQ5
A3
B7
Cw7
DR15
DQ6
Väterlicher Genotyp
Mütterlicher Genotyp
A11
B35
Cw4
DR1
DQ5
A3
B7
Cw7
DR15
DQ6
A1
B8
Cw7
DR17
DQ2
A24
B44
Cw5
DR4
DQ8
Abb. 4: Vererbung von HLA-Antigenen
(Lüdtke,J.2002)
4
1.3. HLA-Frequenzen und Kopplungsungleichgewicht
Die
Frequenzen
der
einzelnen
HLA-Allele
sind
bedeutsame
Parameter
für
die
Bevölkerungscharakterisierung. In Tabelle 1. sind die durchschnittlichen HLA-Antigenhäufigkeiten innerhalb der drei Hauptrassen des Menschen aufgeführt.
A1
A2
A3
A11
A23
A24
A25
A26
A28
A29
A30
A31
A32
A33
A34
A36
A43
A66
X
14,2
28,9
13,2
6,3
1,4
10,3
2,4
3,2
4,7
2,9
3,5
2,9
3,9
1,4
0,1
0,1
0
0,2
0,4
Mongoloid
e
1,0
28,1
1,5
11,7
0,1
31,4
0
7,2
2,1
0,4
2,3
5,2
0,4
6,0
0,3
0,1
0
0,5
1,7
DR
Europide
Mongoloid
Negride
DR 1
DR 2
DR 3
DR 4
DR 7
DR 8
DR 9
DR10
DR11
DR12
DR13
DR14
X
9,5
15,8
12,0
12,7
12,0
3,0
0,8
0,8
12,3
2,0
5,4
5,8
7,9
5,0
15,1
1,8
21,8
2,9
7,3
11,5
0,5
4,0
7,2
2,9
6,8
13,2
5,1
15,1
14,9
7,6
13,2
0,8
1,5
2,3
16,5
3,4
3,8
10,7
5,3
A
Europide
Negride
B
8,1
17,5
6,7
1,9
8,0
4,8
0
4,5
9,9
4,9
11,0
1,6
2,3
3,9
5,1
3,2
1,3
5,0
5,0
B7
B8
B13
B18
B27
B35
B37
B38
B39
B41
B42
B44
B45
B46
B47
B48
B49
B50
B51
B52
B53
B54
B55
B56
B57
B58
B60
B61
B62
B63
B64
B65
B67
B71
B72
B73
X
Europide
Negride
11,5
9,6
2,9
5,5
3,4
10,5
1,6
2,5
2,0
0,9
0,2
12,3
0,4
0,1
0,2
0
1,8
1,1
6,1
2,0
0,5
0,1
1,6
1,1
Mongoloid
e
4,7
0,2
3,8
0,3
1,6
10,4
0,6
0,7
0,4
0,1
0,5
6,0
0,1
3,6
0,4
1,6
0,3
0,3
7,8
7,3
0,3
6,7
2,1
1,5
2,9
0
3,8
2,1
6,1
0,7
1,1
2,6
0
0,1
0,3
0,1
0,4
0,7
1,2
6,5
11,7
9,6
0
0
0,2
0,1
0,4
0,5
0,2
1,6
2,9
0
2,3
1,5
2,6
1,9
1,3
0,6
0
0,8
7,1
0
1,3
Tab. 1: HLA-Antigenfrequenzen der drei Hauptrassen des Menschen
(Nach Schießl,B.: HLA-Bestimmung: Probleme und Lösungen München1986,)
5
12,1
5,5
1,6
4,2
1,9
7,1
1,3
1,6
0
2,3
5,8
7,7
2,3
0
0
0
2,3
0,6
1,9
0,6
6,7
0
0
0,3
Es wird ersichtlich, dass erhebliche Rassenunterschiede bestehen. Die Antigene HLA-A1, A3
und B8 haben nur bei Europiden eine große Verbreitung, während A24, B22 und B61 bei
Mongoliden und A23, A30 und B42 bei Negriden gehäuft vorkommen.
Die große Variabilität innerhalb der Genorte und die zumeist geringe Antigenfrequenz (in der
Mehrzahl unter 10%) bedingen einen hohen Heterozygoten-Anteil von fast 90%. Damit
besitzt
das
HLA-System
den
umfangreichsten
Polymorphismus
aller
auf
Zellen
anzutreffenden Antigensysteme.
Die extrem große Zahl theoretisch möglicher Kombinationen innerhalb eines Haplotyps wird
jedoch etwas eingeschränkt durch das Phänomen des Kopplungsungleichgewichtes, das
sich evtl. durch den Selektionsvorteil bestimmter Allelkombinationen während früherer
epidemiereicher Zeiten entwickelt hat.
1.4. Klinische Bedeutung des HLA-Systems
Unumstritten ist heute die wichtige Rolle, die das HLA-System bei allen Organtransplantationen spielt. Zahlreiche Studien haben eindeutig den Zusammenhang zwischen
HLA-DR, B und A-Match (Grad der Übereinstimmung bei Spender und Empfänger) und der
Organüberlebenszeit
belegt.
In
ganz
besonderem
Maße
gilt
dies
für
allogene
Stammzelltransplantationen.
Auch die Hämatologie kann das HLA-System heute nicht mehr unbeachtet lassen.
Thrombozyten- oder Leukozytensubstitutionen führen häufig zu Immunisierungen im HLASystem, so daß Transfusionserfolge nur noch bei HLA-Verträglichkeit zwischen Spender und
Empfänger erreicht werden können.
Ein Phänomen, das in erster Linie die HLA-Forschung beschäftigt, in geringem Maße aber
auch für die Diagnostik Bedeutung hat, ist die beobachtete Assoziation zwischen einigen
HLA-Antigenen
und
bestimmten
Erkrankungen,
vor
allem
rheumatischen
und
Autoimmunerkrankungen. Als Beispiele sollen hier die Narkolepsie mit ihrer Assoziation zum
Antigen DR2 (DRB1*1501) und der Morbus Bechterew mit der Assoziation zum HLA-B27
genannt werden.
Aufgrund seines extremen Polymorphismus ist das HLA-System außerdem sehr gut als
Parameter forensischer Analysen oder individueller Identifizierungen in der Rechtsmedizin
geeignet.
6
2. Die klassische Methode der Gewebetypisierung
Traditionell wird die HLA-Typisierung mit serologischen Techniken durchgeführt. Man
verwendet dazu eine Palette verschiedener Allo-Antiseren, die im Idealfall monospezifisch
reagieren, d.h. sie erkennen antigene Determinanten, die nur für ein HLA-Antigen typisch
sind. Ein großer Teil der zur Verfügung stehenden Seren reagiert jedoch mit Epitopen, die
einer ganzen Gruppe verschiedener Antigene gemeinsam sind - ein Umstand, der die
Auswertung der Reaktionsmuster häufig erschwert. Zielzellen für die Antiseren sind in der
Regel Lymphozyten, die zumeist mittels Dichtegradientenzentrifugation aus dem peripheren
Blut isoliert, seltener aus einem Lymphknoten oder der Milz gewonnen werden. Für die
Bestimmung der HLA-Klasse II-Antigene, die nur auf B-Lymphozyten vollständig exprimiert
sind, muß zuvor eine Anreicherung dieser Zellen vorgenommen werden. Dazu kann man
sich verschiedener Methoden bedienen (siehe unten!).
Erfolgte Reaktionen zwischen Antiseren und HLA-Antigenen der Lymphozyten können durch
Zugabe von Komplement sichtbar gemacht werden; das durch die Immunkomplexe auf dem
klassischen Wege aktiviert wird und die Lymphozytenmembran perforiert. Mit Hilfe von
Vitalfarbstoffen können lysierte und intakte Lymphozyten mikroskopisch voneinander
unterschieden werden.
Die übliche Bezeichnung für die geschilderte Methode der Gewebetypisierung ist MIKROLYMPHOZYTOTOX-TEST, kurz MLCT.
2.1. Isolierung der Lymphozyten aus dem peripheren Blut
Die Präparation der Lymphozyten aus dem peripheren Blut erfolgt mittels einer
diskontinuierlichen
Dichtegradientenzentrifugation
unter
Verwendung
eines
Präparationsmediums definierter Dichte (1,077). Solche Medien werden gebrauchsfertig im
Handel angeboten; sie bestehen aus Gemischen hochpolymerer Zucker. Verdünntes
antikoaguliertes Vollblut (Heparin-, EDTA- oder Citrat-Blut) wird vorsichtig auf dieses Medium
aufgetragen. Bei vorgegebener Zentrifugation sedimentieren Erythrozyten und Granulozyten,
während die sogenannten mononukleären Zellen (Lymphozyten und Monozyten) und die
Thrombozyten auf der Gradientenoberfläche zurückgehalten werden. In der Grenzschicht
entsteht auf diese Weise ein Zellring, der mit einer Pipette vorsichtig abgehoben und in ein
neues Röhrchen überführt werden kann. Durch nachfolgende Waschschritte (in der Regel
zwei) mit PBS (isotonische Pufferlösung) bei niedrigtouriger Zentrifugation können die
Thrombozyten weitestgehend entfernt werden. Sie bleiben im Überstand, während die
mononukleären Zellen sedimentieren (Abb.5). Dieses Zellpellet wird mit PBS resuspendiert
und auf eine Zellkonzentration von etwa 2 – 3 Millionen Zellen pro Mikroliter verdünnt
7
Abb.5: Präparation mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut
(Nach Schießl, B.: HLA-Bestimmung: Probleme und Lösungen München 1986)
8
2.2. Trennung von T- und B-Lymphozyten
Wie oben erwähnt, ist für die serologische Typisierung der HLA-KlasseII-Antigene zuvor eine
Anreicherung der B-Lymphozyten erforderlich. Diese kann auf verschiedene Weise erfolgen.
Eine in der Routineserologie verbreitete Methode soll hier vorgestellt und demonstriert
werden.
Man verwendet dazu sogenannte Magnet-Beads, wenige m große Partikel, die einen
Eisenkern enthalten. Ihre Oberfläche wird von einer Matrix gebildet, die Antikörpermoleküle
an deren Fc-Region fest binden kann. Handelt es sich um Antikörper gegen
Oberflächenantigene bestimmter Zellen, binden sich die antikörperbeladenen Partikel
rosettenartig an deren Membran. Anschließend wird das Reaktionsgefäß
in eine
Magnetkammer eingebracht und die eisenhaltigen Beads lagern sich gemeinsam mit den
gebundenen Zellen an die Gefäßwand an, während die unmarkierten Zellen in der
Suspension verbleiben und abgetrennt werden können.
Für die serologische HLA-Klasse II-Typisierung werden Beads verwendet, die mit
Antikörpern gegen einen Pan-B-Zellmarker, z. B. CD19, beschichtet sind. Auf diese Weise
lassen sich die B-Lymphozyten von den T-Lymphozyten abtrennen, wobei die TLymphozyten für die Typisierung der HLA-Klasse I-Antigene, die B-Lymphozyten für die
Bestimmung
der
HLA-Klasse
II-Antigene
eingesetzt
werden.
Die
spezifischen
Antikörperreaktionen mit den HLA-Antigenen werden durch die Magnetbeads nicht
beeinflusst.
9
2.3. Lymphozytotox-Test
Die spezifischen HLA-Antiseren können käuflich erworben werden. In der Mehrzahl stammen
sie von Frauen, die während einer Schwangerschaft Antikörper gegen die väterlichen
Antigene des Feten gebildet haben. Daneben werden zum Nachweis einiger Antigene auch
schon monoklonale Antikörper angeboten. Die Auswahl der Seren muß so erfolgen, daß alle
bekannten HLA-Antigene sicher bestimmt werden können. Wir typisieren die HLA-Klasse IAntigene mit insgesamt 116 verschiedenen Antiseren, die Klasse II-Antigene DR und DQ mit
insgesamt 58 verschiedenen Antiseren. Als Reaktionsgefäße werden allgemein TerasakiPlatten (Mikrotest-Platten) benutzt, die 60 oder 72 kleine Kavitäten enthalten, in denen die
Immunreaktionen ablaufen. Jede Kavität wird mit 1 l spezifischem Antiserum und 1 l
Zellsuspension (ca. 2.000 bis 3.000Lymphozyten) beschickt. Um das Austrocknen dieser
geringen Flüssigkeitsmengen zu verhindern, werden sie mit Paraffinöl überschichtet.
Nach einer Reaktionszeit von 30 min bei Raumtemperatur werden in jede Kavität 4-6 l
Kaninchenkomplement pipettiert. Die Komplementreaktion bis zur Zellyse findet innerhalb
von einer Stunde ebenfalls bei Raumtemperatur statt. Im Anschluß werden die Zellen mit
einer 5%igen EDTA-Lösung fixiert und mit einem Fluoreszenzfarbstoffgemisch für die
Auswertung gefärbt (Ethidiumbromid und Acridinorange). Die Auswertung wird mit Hilfe
eines Fluoreszenzmikroskopes durchgeführt, wobei jede Kavität kontrolliert und das
Ergebnis in einem Protokoll festgehalten wird. Lysierte Zellen werden durch Ethidiumbromid
leuchtend rot gefärbt, während der Farbstoff in intakte Zellen nicht eindringen kann. Diese
Zellen werden durch den leuchtend grünen Kernfarbstoff Acridinorange sichtbar gemacht.
Anhand des Reaktionsmusters lassen sich die auf der Lymphozyten anzutreffenden HLAAntigene definieren.
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