Aktuelle Themen Bakterielle Signalstoffe im Wurzel

14.05.2004
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Bakterielle Signalstoffe im Wurzelraum und ihre Wirkung auf Pflanzen
Bacterial signalling substances in the
rhizosphere and their effect on plants
Institut für Bodenökologie, Abteilung Rhizosphärenbiologie1
Institut für Biochemische Pflanzenpathologie2
Anton Hartmann1 und Christian Langebartels2
akterienpopulationen besitzen die
Fähigkeit, ökophysiologisch wichtige
Leistungen wie die Antibiotika-Produktion, Schwärmen oder Biofilmbildung in
einer von der Populationsdichte abhängigen
Weise auszuprägen. In der Rhizosphäre von
Pflanzen können so entweder phytopathogene Bakterien ihren Angriff auf die Wurzel
„abstimmen“ oder nützliche Biokontrollbakterien ihre Aktivitäten zur Bekämpfung
von konkurrierenden Pilzen koordinieren.
Als Basis dieser kommunikativen Leistung
scheiden diese Bakterien niedrigmolekulare
Substanzen aus und erkennen deren Konzentration in der Zellumgebung mit Hilfe
spezifischer Rezeptorsysteme. Dabei können
auch Signalmoleküle anderer Populationen
erkannt werden. Eine Reihe von Gram-negativen Bakterien, die u.a. auch die Rhizosphäre
von Pflanzen besiedeln, benutzen N-Acylhomoserinlactone (AHLs) mit unterschiedlichen molekularen Detailstrukturen als
Signalmoleküle. Es gelang nun mit Hilfe
spezifisch markierter Reporterbakterien, die
in situ-Synthese von HomoserinlactonMolekülen darzustellen und quantitativ die
Ausbreitung dieser Moleküle an der Wurzeloberfläche zu erfassen. Erste Hinweise deuten darauf hin, dass die „AHL-Sprache“ nicht
nur von Bakterien, sondern auch von Pflanzen verstanden werden, die sich damit rechtzeitig auf einen mikrobiellen Angriff bzw.
Kontaktaufnahme mit einem symbiotischen
Partner einstellen können. Eine systemisch
induzierte Resistenz konnte als Reaktion auf
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acterial populations are able to regulate certain cellular functions like the
production of antibiotics, swarming
activity, and formation of biofilms in a
population density dependent manner. In
the rhizosphere of plants, phytopathogenic
bacteria can coordinate their attack towards
roots, and beneficial biocontrol bacteria can
organise their activities to limit the growth
of competing (phytopathogenic) fungi. In
order to ‘communicate’, these bacteria
excrete small diffusable molecules and
recognise their concentration in the environment using specific receptor systems. Structurally similar signalling molecules produced
by other populations can also be detected.
A number of Gram-negative bacteria use
the N-acyl homoserine lactones (AHLs) with
a varying molecular structure in the acyl part
as signal molecules. We have demonstrated
in situ production and spread of AHLs over
the root surface using bacterial reporter
constructs that colonise the rhizoplane. In
addition, we showed that the AHL language
was also understood by the plants, allowing
them to prepare for a microbial attack or for
contact with a symbiotic partner. Systemically induced resistance was demonstrated
in tomato plants as a response to exposure
to AHLs. AHL compounds also play a crucial
role in the interaction of opportunistic
pathogenic bacteria with humans, for
example in cystic fibrosis patients. These
signalling substances can also modulate
the human immune response.
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OH
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Abb. 1: Verschiedene Substitutionsmuster der N-Acyl-Homoserinlactone: R = Rest = Kohlenwasserstoffkette (C-4 bis C-14). Links: N-Acyl-Homoserinlacton, mitte: N-(3-Oxo-Acyl)-Homoserinlacton,
rechts: N-(3-Hydroxy-Acyl)-Homoserinlacton
Bakterielle Signalstoffe vom AHL-Typ
und das „Quorum sensing“
Bakterien sind Einzeller und mit einer Größe
von einem tausendstel Millimeter sehr kleine
Organismen, die keinen Zellkern oder andere
Organellen haben. Sie besitzen jedoch
neben höchst erstaunlichen und in der
Lebewelt einmaligen Stoffwechselfähigkeiten
auch die Fähigkeit zur Kommunikation. 1970
wurde erstmals die Fähigkeit von Leuchtbakterien (Vibrio fischeri) in Tiefseefischen
entdeckt, dichteabhängig Licht zu produzieren. Dieses bakterielle Verhalten, von der
Zelldichte oder von einem „quorum“ abhängig eine Leistung auszuprägen, wurde lange
Zeit als relativ exotisches Regulationsphänomen des „Quorum sensing“ gehalten.
Aktuell gibt es nun aber sehr viele Beispiele
für diesen Regulationstyp, und man hat die
„Sprachen“ der Bakterien, die rein chemischer Struktur sind, lesen gelernt. Die
benutzten Wörter besitzen bei vielen Gramnegativen Bakterien die Grundstruktur eines
N-Acyl-Homoserinlactons (AHL). Je nach
„Dialekt“ unterscheidet sich die Struktur der
Signalmoleküle in der Länge und Art der
Kohlenstoffseitenkette (Abb. 1).
Mit Hilfe einer mizellar-elektrophoretischen
Trennung konnten diese Substanzen in
geringsten Mengen und hochspezifisch
analysiert werden (Abb. 2, Moritz Frommberger und Philippe Schmitt-Kopplin, Institut für Ökologische Chemie).
Die AHLs werden in den Zellen durch ein
Lux I-homologes Enzym konstitutiv syntheti-
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siert und gelangen per Diffusion in die Zellumgebung. Die Umgebungskonzentration
wird durch die Bindung an ein Lux R-homologes Rezeptorprotein festgestellt, und
schließlich kommt es durch die Bindung des
AHL-Rezeptorkomplexes in der Rezipientenzelle zur Aktivierung von Promotorbereichen
spezifischer Strukturgene (Abb. 3A). In Grampositiven Bakterien werden spezifische Peptide als Signalstoffe synthetisiert und in die
Zellumgebung transportiert. Die Rezeption
der Umgebungskonzentration des Signalstoffes geschieht durch ein Zweikomponentensystem mit einem membranständigen
Sensorprotein und einer cytoplasmatischen
Phosphorylierungskaskade. Das Regulatorprotein P ermöglicht dann analog zu den
Lux R-homologen Proteinen Gram-negativer
Bakterien die Expression bestimmter Strukturgene (Abb. 3B, Bonnie L. Bassler, 2002).
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Relative Intensität
die Exposition mit AHL-Molekülen festgestellt werden. AHLs spielen auch bei Erkrankungen des Menschen, wie z.B. der durch
opportunistisch pathogene Bakterien hervorgerufenen cystischen Fibrose eine Rolle.
Auch die humane Immunantwort kann
durch diese Signalstoffe beeinflusst werden.
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Verzögerungszeit (min)
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Abb. 2: Analyse von AHLs in einem Extrakt der
Kulturflüssigkeit von Burkholderia cepacia LA3
durch PF-MEKC-MS. Oben: N-Octanoyl Homoserinlacton, OHL (Mr = 227); Mitte: N-Hexanoyl
Homoserinlacton, DHL (Mr = 255); unten: Kulturextrakt von B. cepacia LA3.
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Transport
H
LuxR
A
+
+
Luxl
Zielgene
P
Peptidsynthese
Zielgene
Abb. 3: Signalsysteme bei Bakterien:
A: Das Signalsystem bei Gram-negativen Bakterien wird durch ein Produktionsgen (Lux I-homolog)
und ein Rezeptorprotein (Lux R-homologes Protein) gesteuert. AHL-Signalmoleküle sind als blaue
Rauten dargestellt.
B: Das Signalsystem bei Gram-positiven Bakterien wird von einer Peptidsynthese, einem Exportsystem sowie einem Zweikomponenten-Aufnahmesystem geleitet. Peptid-Signalmoleküle sind als
grüne Balken dargestellt.
Gram-negative Bakterien können mit Hilfe
der AHL-Signalmolekülsprache unterschiedlichste Funktionen und Wechselwirkungen
steuern. Dazu gehören die Produktion von
abbauenden Enzymen wie Proteasen und
Cellulasen in phytopathogenen Erwinia –
Arten sowie die Aktivierung von Virulenzfaktoren bei Agrobacterium tumefaciens
(Tab. 1). Andererseits spielt die Regulation
über AHLs bei der Induktion der Knöllchenbildung bei Rhizobien eine wichtige Rolle
und ist bei der Aktivierung der Antibiotikaund Siderophorproduktion von Rhizosphärenbakterien beteiligt, welche das Wachstum
von phytopathogenen Pilzen hemmen.
In der Rhizosphäre von Pflanzen gibt es
zahlreiche Bakterienarten, welche diese
chemische Sprache beherrschen und die
oben erwähnte Signalmoleküle produzieren.
In einer indisch-deutschen Zusammenarbeit
wurden aus der Rhizosphäre von traditionellen Reissorten Stickstoff-fixierende Bakterien
isoliert und diese auf die Produktion von
AHL-Substanzen getestet. Alle Bakterien des
Burkholderia cepacia-Artenclusters und
auch Bakterien wie Pantoea und Erwinia
konnten ein oder zwei AHLs (N-Hexanoyl
Homoserinlacton, HHL oder N-Octanoyl
Homoserinlacton, OHL) produzieren. Ein
ähnlich häufiges Auftreten der Fähigkeit zur
AHL-Produktion ergab sich bei der Analyse
der Bakteriengemeinschaft von Tomatenwurzeln. Ferner war in zwei von französischen
Kollegen entdeckten neuen BurkholderiaArten, die in tropischen Leguminosen
N2-fixierende Knöllchen induzieren, die
Produktion von drei AHLs (HHL, OHL, DHL)
nachweisbar, die denen von Rhizobien
ähnlich ist.
Das Bakterium Serratia liquefaciens,
welches die Wurzeln verschiedener Pflanzen
besiedeln kann, wird biotechnologisch als
Gegenspieler von phytopathogenen Bakterien eingesetzt. Diese Bakterien konnten
durch gentechnische Verfahren mit einem
grün-fluoreszierenden Protein (GFP) markiert und somit ihre Kolonisierung der Wurzeloberfläche von Tomatenpflanzen sichtbar
gemacht werden (Abb. 4).
In situ-Detektion von AHLs in der
Rhizosphäre
Durch gezielte genetische Manipulationen
im sog. Promotorbereich von AHL-regulierten Genen konnten in Zusammenarbeit mit
Leo Eberl vom Lehrstuhl für Mikrobiologie
der TU München/Weihenstephan Dolmetscher „ausbildet“ werden, die in der Lage
sind, die Unterhaltung der Bakterien zu
übersetzen. Dabei handelt es sich um Fusio-
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Tab. 1: Vorkommen und Bedeutung von N-Acyl Homoserinlactonen (Beispiele)
Bakterium
AHL-Molekül
Regulierte Eigenschaft
Wirtsorganismus
Vibrio fischeri
(Fischsymbiont)
N-3-Oxohexanoyl
Homoserinlacton
(OHHL)
Luciferaseproduktion im
Leuchtorgan von Fischen
Fische
Erwinia carotovora
(Pflanzenpathogen)
N-3-Oxohexanoyl
Homoserinlacton
(OHHL)
Produktion von Cellulasen
und Proteasen
Karotte
Agrobacterium
tumefaciens
(Pflanzenpathogen)
N-3-Oxooctanoyl
Homoserinlacton
(OOHL)
konjugativer Transfer des
Tumor-induzierenden
Plasmids
Kartoffel u.a.
Rhizobium
leguminosarum
(Wurzelsymbiont)
N-3-Hydroxy-7
cis-tetradecanoyl
HSL, (TDHL)
Induktion der Knöllchenbildung bei Leguminosenwurzeln
Erbse
Pseudomonas
aureofaciens
(Biokontrollstamm)
N-Hexanoyl
Homoserinlacton
(HHL)
Produktion des
Antibiotikums Phenazin
Weizen u.a.
Pseudomonas
aeruginosa
(opp. humanpathogenes Bakt.)
N-Octanoyl und
N-Hexanoyl
Homoserinlacton
(OHL, HHL)
Biofilmbildung,
Induktion von Virulenzfaktoren
Mensch
(cystische
Fibrose-CFPatienten)
Burkholderia cepacia
(Biokontrollstamm,
PGPR-Bakterium,
opp. Humanpathogen)
N-Octanoyl und
N-Hexanoyl
Homoserinlacton
(OHL, HHL)
Biofilmbildung,
Produktion von Protease
und des Siderophors
Ornibactin
Mensch (CF),
Rhizosphäre
von Reis u.a.
nen eines AHL-regulierten Promotors mit
einem Gen für ein autofluoreszierendes
Protein (gfp- oder rfp-Gen). Fallen im Laufe
eines „Gesprächs“ bestimmte Schlüsselwörter, d.h. binden AHL-Rezeptorkomplexe
an den Promotorbereich, produzieren diese
Reporterkonstrukte ein rot oder grün fluo-
reszierendes Protein, welches durch die
Fluoreszenzfärbung der somit aktivierten
Zellen sichtbar wird (Abb. 5).
Mit Hilfe solcher Reporter- oder Spionzellen
kann unmittelbar in der Wurzelzone die
AHL-Sprache belauscht werden. Abbildung 6
zeigt einen Ausschnitt der Oberfläche einer
Abb. 4: Tomatenpflanze der Sorte ‚MiniTom’ (links). Kolonisierung der Wurzel durch das
gfp-markierte Bakterium Serratia liquefaciens MG1, das intensiv grün fluoreszierend leuchtet
(rechts, laserscanning-mikroskopische Aufnahme: Stephan Gantner).
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Sensorkonstrukt
rfp
ohne
AHL
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auszuwerten. Es ergab sich eine maximale
Distanz der AHL-Diffusion auf der Wurzeloberfläche von 30 bis über 60 µm, je nach
Wurzelbereich. Dies entspricht dem 30- bis
60-fachen der Länge einer durchschnittlich
großen Bakterienzelle.
kein Produkt
AHL-regulierter Promotor
mit
AHL
rfp
Synthese
des RFP
Rot fluoreszierende
Reporterbakterien
Abb. 5: Schematische Darstellung eines Reportergenkonstrukts, welches sensitiv für AHL-Signalmoleküle ist (RFP: rot fluoreszierendes Protein).
Induktion von systemischer Resistenz
bei Pflanzen
Befunde aus der Literatur sprechen für eine
resistenzsteigernde Wirkung von Rhizosphärebakterien in pathogeninfizierten Pflanzen,
ohne dass bisher die Mechanismen geklärt
wurden. Beimpfung der Wurzeln von Tomatenpflanzen mit Serratia liquefaciens MG1
bewirkte eine drastische Induktion der
Resistenz gegen den sprosspathogenen Pilz
Alternaria alternata, der zu einer schnellen
Welke der Blätter führt. Im Gegensatz zum
Wildtyp wirkte eine Serratia liquefaciens
AHL-Defektmutante nicht mehr induzierend
auf das Resistenzsystem. Schließlich war es
möglich zu zeigen, dass auch die Zugabe
des AHL-Signalstoffes HHL (N-Hexanoyl
Homoserinlacton) in die Rhizosphäre axenisch, d.h. in sterilisiertem Quarzsand wachsender Tomatenpflänzchen die Induktion
von Funktionen in Pflanzen hervorruft, die
mit der Pathogenabwehr verbunden sind,
z.B. PR1a (pathogenesis related protein)
oder Chitinase (Abb. 7a). In einem Screening der Genexpression dieser AHL-induzier-
Tomatenwurzel, an dem offensichtlich gerade eine Unterhaltung der Bakterien stattfindet: grün fluoreszierende gfp-markierte
AHL-Produzentenstämme bewirken, dass
AHL-Reporterbakterien in ihrer Nachbarschaft rot (RFP) aufleuchten. Um die Eigenfluoreszenz der Wurzel möglichst zu eliminieren, wurde hier die Technik der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie eingesetzt,
welche auch in komplexen Umweltproben
eine eindeutige Identifizierung und Lokalisierung ermöglicht. Mit Hilfe der CMEIASSoftware (Center of Microbial Ecology
Image Analysis System), die von Frank B.
Dazzo an der Michigan State University, East
Lansing, USA, entwickelt wurde, gelang es,
die jeweiligen Ortsbeziehungen der AHLProduzentenzellen (grün) und aktivierten
AHL-Reporterzellen (rot) zu vermessen und
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Häufigkeit
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Zellabstand (µm)
Abb. 6: Reporterbakterien in der Rhizosphäre einer Tomate, welche durch Ausprägung des rot
fluoreszierenden Proteins die Anwesenheit von bestimmten AHL-Signalstoffen anzeigen
(Gantner, Stephan: Diss. LMU München 2003). AHL-produzierende Bakterien sind mit dem
gfp-Markerprotein grün gefärbt.
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Kontrolle:
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Zeit (h)
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HHL 10µM SA 0,5 mM
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PR1a (P4)
30 kD
Chitinase
28S rRNA
Kontrolle
10 µM HHL auf die
Wurzel appliziert
Abb. 7: Die Genexpression in Tomatenpflanzen
unter dem Einfluss von HHL (N-Hexanoyl Homoserinlacton) in der Rhizosphäre. (Schuhegger,
Regina: Diss. TU München 2003).
Oben: Analyse spezifischer m-RNAs in NorthernBlots; als Kontrolle diente die Analyse der ribosomalen 28S rRNA und die Wirkung des bekannten
pflanzlichen Signalstoffs Salicylsäure, SA.
Unten: Arrayanalyse der Transkripte von pathogenabwehr-relevanten Genen (TOMSTRESS);
mehr als 80 bekannte Abwehrgene der Tomate
wurden hier parallel untersucht.
ten Pflanzen konnten weitere Gene gefunden werden, welche auf die Behandlung
durch HHL (N-Hexanoyl Homoserinlacton)
ansprechen (Abb. 7b).
Medizinische Bedeutung der
AHL-Signalstoffe – Ausblick
Bakterien der Burkholderia cepacia-Gruppe
kommen nicht nur in der Rhizosphäre vor,
sondern werden auch häufig aus dem Sputum von cystischer Fibrose-Patienten isoliert. Im Zusammenwirken mit Pseudomonas aeruginosa sind sie als opportunistische
Pathogene zu bezeichnen. Obwohl es sich
nicht um identische Stämme handelt, ist
von Umwelt- wie auch von klinischen Isolaten bekannt, dass sie AHL-Signalstoffe
produzieren. Es erhärten sich die Hinweise,
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dass die Fähigkeit zur AHL-Produktion ein
wichtiger Virulenzfaktor von B. cepacia ist.
Ferner ist in den letzten Jahren mehrfach
berichtet worden, dass AHL-Signalstoffe,
wie sie z.B. von P. aeruginosa produziert
werden, das Immunsystem modulieren
können.
Es ergibt sich also das Bild, dass bakterielle Signalstoffe sowohl Auslöser einer
spezifischen Signalkette der systemischen
Resistenz von Pflanzen sein können als auch
im menschlichen Immunsystem eine spezifische Wirkung entfalten können. Die Erforschung der Wirkung von AHLs auf das
„innate“ Immunsystem von Pflanzen wird
auch im Rahmen des Überzeichnungsprojekts „Funktionelle Genomik und Metabolomik der molekularen Interaktion in der
Rhizosphäre“ des POF-Programms Biogeosysteme untersucht. Die mögliche Bedeutung von bakteriellen Signalstoffen für das
menschliche Immunsystem könnte eine
vernetzende Fragestellung der Umwelt- und
Gesundheitsforschung der GSF werden.
Danksagung
Für die sehr gute Zusammenarbeit im Rahmen eines BMBF-Projekts wird Leo Eberl,
Lehrstuhl für Mikrobiologie, TU München/
Weihenstephan, und den engagiert arbeitenden Doktorand/innen Annette Steidle, Regina Schuhegger und Stephan Gantner herzlich gedankt.
Ausgewählte Veröffentlichungen
Frommberger, M., Schmitt-Kopplin, P., Menzinger, F.,
Albrecht, V., Schmid, M., Eberl, L., Hartmann, A. and
Kettrup, A.: Analysis of N-acyl-L-homoserine lactones
produced by Burkholderia cepacia with partial filling
micellar electrophoretic chromatography – electrospray
ionization-ion trap mass spectrometry. Electrophoresis
24, 3067-3074 (2003)
Hartmann, A., Gantner, S., Schuhegger, R., Steidle, A.,
Dürr, C., Schmid, M., Dazzo, F. B., Eberl, L. and Langebartels, C.: N-acyl-L-homoserine lactones of rhizosphere
bacteria trigger systemic resistance in tomato plants. In:
Lugtenberg, B., Tikhonovich, I., Provorov, N. (Eds.)
Biology of molecular plant-microbe interactions, Vol. 4,
MPMI-Press, St. Pauls, Min., U.S.A. (im Druck) (2004)
Steidle, A., Sigl, K., Schuhegger, R., Ihring, A., Schmid,
M., Gantner, S., Stoffels, M., Riedel, K., Givskov, M., Hartmann, A., Langebartels, C. and Eberl, L.: Visualization of
N-acyl-L-homoserine lactone-mediated cell-cell communication between bacteria colonizing the tomato rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5761-5770 (2001)