Schadwirkung von Nosema Apis und Nosema Ceranae bei der
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Universität Hohenheim Landesanstalt für Bienenkunde Dr. rer. nat. Peter Rosenkranz Vergleich der Schadwirkung von Nosema apis und Nosema ceranae auf der Honigbiene im Käfigversuch Bachelorarbeit vorgelegt von Lars Kurt Steiner im Studiengang Agrarwissenschaften Stuttgart - Hohenheim August 2009 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Material und Methoden 2.1. Artdifferenzierung 2.2. Infektionsexperiment 2.3. Lichtmikroskopische Untersuchung des Infektionsverlaufs 4 4 4 6 3. Ergebnisse 3.1. Artdifferenzierung 3.2. Verhalten 3.3. Mortalität 3.4. Infektionsverlauf 3.4.1. Infektionsverlauf 1h nach Versuchsbeginn bis Tag 5 3.4.2. Infektionsverlauf Tag 12 bis Tag 26 3.4.3. Infektion des Totenfalls 6 7 7 7 10 10 10 14 4. Diskussion 4.1. Artdifferenzierung 4.2. Verhalten 4.3. Mortalität und Infektionsverlauf 15 15 15 16 5. Zusammenfassung 22 6. Literatur 6.1. Literaturverzeichnis 6.2. Tabellenverzeichnis 6.3. Abbildungsverzeichnis 26 26 28 28 Dieser Versuch wurde in Zusammenarbeit mit Anne-Amelie Larue durchgeführt, die in ihrer Bachelorarbeit, „Molekulargenetische Diagnose von Nosema apis und Nosema ceranae und Etablierung eines Käfigtests zur Untersuchung der Schadwirkung dieses Bienenparasites“, schwerpunktmäßig die Methodenentwicklung für den Biotest und die PCR-Analyse der beiden Nosema-Arten bearbeitet hat. 1. Einleitung Bei Nosemose handelt es sich um das Auftreten von Mikrosporidien, die den Mitteldarm der Honigbiene befallen und dort die Epithelzellen zerstören, sodass die Stoffwechselleistung reduziert wird. Dies führt zu einer verminderten Aufnahme von Proteinen, welche die Biene über eine erhöhte Futteraufnahme zu kompensieren versucht und dies wiederum zu einem aufgeblähten Hinterleib führt (Ritter, 1996). Bei der westlichen Honigbiene Apis mellifera wurde vor 100 Jahren Nosema apis (Zander, 1909) entdeckt. Die asiatische Art Nosema ceranae wurde 1994 in China auf der asiatischen Honigbiene Apis cerana entdeckt (Fries et al., 1996). Mittels molekulargenetischer Verfahren wurde ein Unterschied der DNA zwischen N. apis und N. ceranae festgestellt. Zudem gibt es äußerliche Unterschiede zwischen den Sporen, die aber lichtmikroskopisch nicht zu erkennen sind. Die Sporen von N. ceranae sind durchschnittlich kürzer und Ultraschalluntersuchungen belegen eine geringere Anzahl an Fadenwindungen im Gegensatz zu N. apis (Huang et al., 2007). 1998 wurde N. ceranae das erste Mal auf der westlichen Honigbiene Apis mellifera in Europa entdeckt. Forschungen, bei denen Bienenproben aus Finnland aus den Jahren 1986-2006 auf ihre Nosema-Art untersucht wurden, haben ergeben, dass sich mindestens seit 1998 in Finnland N. ceranae befindet. Ferner finden Neuinfektionen ausschließlich durch N. ceranae oder durch Mischinfektionen aus N. ceranae und N. apis statt (Paxton et al., 2007). Demnach hat N. ceranae die Fähigkeit nicht nur seinen ursprünglichen Wirt Apis cerana, sondern auch einen fremden Wirt, Apis mellifera, zu parasitieren. Bei Proben von Apis mellifera aus Mittel- und Südeuropa aus den Jahren 1999 bis 2002 wurde der geringste Befall von Nosema in den Sommermonaten festgestellt, was auf die Saisonalität von N. Apis hinweist. Bei Proben aus den Jahren 2003-2005 hingegen hat sich der Nosemabefall auf alle Monate ausgedehnt, was auf das Vorhandensein von N. ceranae deutet. Betrachtet man die Untersuchung von 1999-2005, so waren 30% der Proben ohne Befall, 54% der Proben mit N. ceranae, 9% mit N. apis und 7% mit einer Mischinfektion infiziert. Dabei hat die Infektion durch N. ceranae von 2003-2005 stark zugenommen (Martin-Hernández et al., 2007). Zudem wurden beide Arten in allen untersuchten Ländern (Spanien, Frankreich, Deutschland, Schweiz) festgestellt. Es scheint, dass sich seit 2003 N. ceranae großflächig in Europa verbreitet hat und N. apis nahezu verdrängt wurde. So wurde beispielsweise in Proben von 2005/2006 aus 26 Völkern der Art Apis mellifera in Italien ausschließlich N. ceranae gefunden. Ausschließlich N. apis infizierte Völker hat man nach 2003 in Europa nur noch in Irland gefunden. Beschreibend für die große Ausbreitungsgeschwindigkeit von N. ceranae ist das Auftreten auf der dänischen Insel Laeso, welche sich 20 km vom Festland entfernt befindet, und dadurch bedingt äußerst schwer für Bienen zu erreichen ist (Klee et al., 2007). Bei Proben von Apis mellifera von 2006/2007 im Osten der USA und im Südosten von Kanada wurde ebenfalls N. ceranae entdeckt (Williams et al., 2008). Bereits in einer früheren Probe aus den USA von 2004 wurde N. ceranae nachgewiesen. Ebenso hat man N. ceranae in Brasilien und in Vietnam festgestellt (Klee et al., 2007). Bienenproben von Apis mellifera, die 2007/2008 in Australien gesammelt wurden, wiesen eine Infektion mit N. ceranae auf, wenngleich der Befall von N. apis wesentlich größer war. Es scheint, als steht die Ausbreitung von N. ceranae in Australien am Anfang ihrer Entwicklung. Dies ist wahrscheinlich in der von anderen Kontinenten gelegenen Abgeschiedenheit begründet, welche eine Kontamination lediglich über importierte Güter ermöglicht, wobei Australien strenge Auflagen in Bezug auf Quarantänemaßnahmen besitzt, was allerdings das Einschleppen von N. ceranae lediglich verzögern konnte (Giersch et al., 2009). Betrachtet man die globale Verbreitung von N. ceranae, so scheint es, dass N. ceranae tropisches Klima bevorzugt, sich aber auch in kühlerem Klima etablieren kann. Dies begründet das ganzjährige Auftreten von N. ceranae im Gegensatz zu N. apis, welches eher im Frühjahr und Herbst auftritt. Es ist anzunehmen, dass N. ceranae beispielsweise stärker in Spanien auftritt, als in mittelund nordeuropäischen Ländern mit kühleren Klimata (Martin-Hernández et al., 2007; MartinHernández et al., 2009). Dieses Phänomen ist auch in Australien zu beobachten, wo Staaten mit tropischen Klima, wie Queensland, einen höheren Infektiondruck durch N. ceranae aufweisen, als Staaten mit gemäßigteren Klimata, wie New South Wales und Victoria (Giersch et al., 2009). 2 Es ist schwer den genauen Zeitpunkt zu bestimmen, an dem N. ceranae seinen ursprünglichen Wirt verließ und Apis mellifera parasitierte, da es heute in großem Umfang keine Proben von vor 2000 gibt, die auf N. ceranae untersuchen werden können. Schuld an der späten Entdeckung von N. ceranae ist sicherlich die bis dahin einzig praktizierte lichtmikroskopische Diagnose gewesen, die eine Unterscheidung der beiden Arten nicht möglich machte. Erst die Diagnose mittels molekulargenetischer Verfahren hat die Unterscheidung der beiden Arten leicht und zuverlässig gesichert (Huang et al., 2008; Klee et al., 2007). Man nimmt an, dass sich N. ceranae innerhalb der letzen 10-15 Jahre verbreitet hat. Die Zunahme des weltweiten Handels mit der ökonomisch sehr bedeutenden Apis mellifera ist ein Hauptfaktor für die Verbreitung von N. ceranae weltweit. Auch der Handel mit kontaminierten Pollen und Honig trägt zu einer Verbreitung von N. ceranea bei. Kontaminierter Pollen stellt einen Infektionsherd dar, beispielsweise als in Waben eingelagertes Bienenbrot (Higes et al., 2008a). Honig kann ebenso mit N. ceranae kontaminiert sein und einen potentiellen Infektionsherd bilden (Giersch et al., 2009). Seit 2000 beobachten Imker in Europa und USA ein drastisches Völkersterben, welches als Colony Collapse Syndrom bezeichnet wird. Kennzeichen dieses Syndroms ist ein plötzlicher Verlust der adulten Bienen außerhalb des Bienenstocks sowohl bei schwachen, als auch bei starken Völkern. Untersuchungen, bei denen Bienenvölker mit N. ceranae infiziert wurden, haben gezeigt, dass eine Infektion innerhalb von zwei Jahren zu einem Colony Collapse führen kann (Higes et al., 2008b). Wie es scheint, stellt N. ceranae aktuell eine große Bedrohung für die weltweite Imkerei dar und nimmt daher einen zunehmend größeren Stellenwert in der Bienenforschung ein. Ziel dieses Experimentes ist es, die Schadwirkung von N. ceranae und N. apis an Hand des Verhaltens und der Mortalität bei der Honigbiene, unter Berücksichtigung des Infektionsverlaufs, zu vergleichen. 3 2. Material und Methoden 2.1. Artdifferenzierung Den Beweis, dass die Bienen mit der entsprechenden Nosamaart infiziert wurden, lieferte man mit Hilfe einer molekulargenetischen Methode. Diese beinhaltet DNA-Extraktion, Polymerasekettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese. Dabei wurden die für die Auszählung des Infektionsverlaufs hergestellten Darmsuspensionen (N =15) der Versuchsbienen untersucht. Mit Hilfe der DNA-Extraktion wurde die Nosema-DNA aus der Suspension extrahiert, indem die Nosemasporen physikalisch aufgebrochen wurden. Die PCR diente der Vermehrung der extrahierten DNA. Von der DNA wurde eine bestimmte Sequenz ausgewählt und vermehrt. Nach die Vermehrung konnte mittels der Gelelektrophorese die entsprechende Nosemaart erkannt werden. 2.2. Infektionsexperiment Zwei verdeckelte Brutwaben aus zwei verschiedenen Bienenvölkern, die nach Annahme nosemafrei waren, wurden entnommen und in einem Brutschrank bei 35° C und erhöhter Luftfeuchte bebrütet. Die über Nacht geschlüpften Bienen dienten als Ausgangsbienen, um mit nosemafreien Bienen das Experiment durchzuführen (Webster et al., 2008). Sechs Käfige mit jeweils 40 Bienen wurden angesetzt. Jeweils zwei Käfige mit N. apis und N. ceranae infizierten Bienen und zwei Käfige als Kontrolle. Die Bezeichnung der Käfige war Ceranae 1 (C1) und Ceranea 2 (C2) für die mit N. ceranae infizierten Bienen. Analog dazu Apis 1 (A1), Apis 2 (A2), Kontrolle 1 (K1) und Kontrolle 2 (K2). Ein siebter Käfig mit 20 N. ceranae infizierten Bienen wurde zusätzlich angesetzt (C3). Bei den ersten 80 frisch geschlüpften Bienen wurde jede Biene mit 10µl einer 50%igen Zuckerlösung, die 185.000 N. apis-Sporen enthielt, gefüttert. Bei den verwendeten Sporen handelte es sich um Material von zwei bis drei Jahre tiefgefrorenen Bienen aus Schweden, bezogen von der Universität Uppsala. Die Anzahl Sporen in der Suspension wurde mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer (Haemocytometer) unter dem Mikroskop (x400) bestimmt. Dabei werden fünf der 16 4 Großquadrate ausgezählt. Aufgrund der Standardisierung der Quadratvolumina kann die Sporendichte bestimmt werden. Die nächsten 100 Bienen wurden ebenfalls mit einer 50%igen Zuckerlösung auf gleiche Weise gefüttert und in den nächsten drei Käfigen (C1, C2, C3) untergebracht. In der Suspensionslösung von 10µl/Biene waren 200.000 N. ceranae-Sporen enthalten. Die Sporen stammten aus drei kurz zuvor lebenden Bienen von Völkern der Landesanstalt für Bienenkunde in Hohenheim. Die nächsten 80 Bienen der Kontrolle wurden mit je 10µl einer reinen 50%igen Zuckerlösung gefüttert. Käfige Ceranae 1 Ceranae 2 Ceranae 3 Apis 1 Apis 2 Kontrolle 1 Kontrolle 2 (C1) (C2) (C3) (A1) (A2) (K1) (K2) Bezeichnung der Käfige Infektion ohne ohne N. ceranae N. ceranae N. ceranae N. apis N. apis Anzahl 40 40 20 40 40 40 40 Bienen Probenahme 12, 14, 16, 12, 14, 16, 1h, 30h, 12, 14, 16, 12, 14, 16, 12, 14, 16, 12, 14, 16, nach 19, 21, 23, 19, 21, 23, Tag 5 19, 21, 23, 19, 21, 23, 19, 21, 23, 19, 21, 23, Infektion in 26 26 26 26 26 26 Tagen bzw. h und Tage bei C3 Tabelle 1. Übersicht über die angesetzten Käfige nach Bezeichnung, Infektion, Anzahl Bienen und Probenahme nach Infektion in Tagen. Bei C3 wird die Probenahme nach Infektion u.a. in Stunden angegeben. Jedem Käfig wurden nach der Fütterung fünf Ammen zur Stabilisierung der frisch geschlüpften Bienen hinzugefügt. Die Bienen konnten sich in allen Käfigen nach der Infektion ad libitum von einer 2 molaren Zuckerlösung ernähren. Die Zuckerlösung wurde mit Hilfe einer Spritze, durch ein Loch im Oberrahmen der Käfige, dargereicht. Eine Ausnahme stellte A1 dar. Dort erfolgte die Fütterung über ein gebogenes Glasrohr mit drei kleinen Löcher, über welche das Futter aufgenommen werden konnte. Zusätzlich wurden alle Käfige mit Bienenbrot (ab Tag 5) ausgestattet und einem Stück ausgebauter Wabe. Das Bienenbrot stammte frisch aus einem Bienenvolk, von dem man annahm, dass es nosemafrei sei. Die Käfige wurden darauf für 26 Tage im Brutschrank bei 30° C und erhöhter Luftfeuchte untergebracht. Ein Ausnahme stellte C3 dar. Dieser Käfig wurde nur fünf Tage geführt. 5 Täglich wurden die Käfige auf Tote und Verhalten untersucht. Bei Bedarf wurde nachgefüttert. Die Toten wurden entnommen und eingefroren. Bei C3 wurden 1h, 30h und 5 Tage nach Infektion je vier Proben entnommen. Die weitere Probenentnahme erfolgte bei den restlichen Käfigen an Tag 12, 14, 16, 19, 21, 23 und 26. Je Käfig wurden drei Bienen (keine Ammen) entnommen und anschließend eingefroren. 2.3. Lichtmikroskopische Untersuchung des Infektionsverlaufs Bei den entnommenen Proben und dem Totenfall wurde der Infektionsverlauf unter dem Lichtmikroskop ausgewertet. Bei den Proben wurden die Sporen ausgezählt. Beim Totenfall wurde die Sporendichte nach kein, vereinzelter, geringer, mittlerer und starker Befall geschätzt (Augenmaß). Die Untersuchung der Toten beschränkte sich grob auf drei Zeiträume je Käfig. Tag 15 (Beginn des Totenfalls), Tag 20 und Tag 26 (Ende des Experiments). Bei K2 konnten nur zwei Zeitpunkte berücksichtigt werden. Bei K1 nur einer. Als Schätz- und Auszählmittel diente die Thoma-Zählkammer. Jeder Biene wurde der Mitteldarm entnommen und in 1 mL H2O homogenisiert. Dabei wurde im ersten Schritt das Caput der Biene abgetrennt. Anschließend setzte man eine Pinzette am letzte Segment des Abdomens an und präparierte vorsichtig den Mitteldarm samt Honigblase heraus. Die homogenisierte Darmflüssigkeit wurde nochmals 1:1 mit H2O verdünnt, um das Auszählen unter dem Mikroskop (x400) zu erleichtern. Die Anzahl Sporen pro Biene ergab sich aus der Multiplikation der gezählten Sporen aus den fünf Großquadraten mit dem Verdünnungsfaktor. Die Sporenzahl der Untersuchungen von Tag 12-26 wurde jeweils aus dem Mittelwert der untersuchten drei Proben pro Tag ermittelt. 3. Ergebnisse Die Käfige A1 und K2 können nicht für den Vergleich der Schadwirkung herangezogen werden. Die Fütterung bei A1, mittels des gebogenen Glasrohres, führte dazu, dass die Bienen mit Zuckerwasser verklebten, was wahrscheinlich die Mortalitätsrate auf Grund des Synergieeffekts positiv beeinflusst hat. Bei K2 wurde eine Infektion mit N. ceranae festgestellt. Die Ergebnisse der beiden Käfige werden dennoch der Vollständigkeit halber präsentiert. 6 3.1. Artdifferenzierung Die molekulargenetische Auswertung der infizierten Käfige bestätigte bei C1 und C2 eine Infektion mit N. ceranae. Bei A1 und A2 wurde eine Infektion mit N. apis nachgewiesen. K2 war mit N. ceranae infiziert. 3.2. Verhalten Es wurden zu Beginn keine Unterschiede im Verhalten zwischen den einzelnen Käfigen festgestellt. Die Bienen legten insgesamt ein aufgeregtes und lebendiges Verhalten an den Tag. Bei A1 jedoch nahm die Vitalität im Vergleich früher ab. Die Bienen waren teilweise stark mit Zucker verklebt, welcher aus der Fütterungseinrichtung (gebogenes Glasrohr) beim Nachfüttern und Transportieren austrat. Ab Tag 5 konnte das erste Mal Trophallaxis festgestellt werden. Bei weiteren Beobachtungen wurde Trophallaxis ab diesem Zeitpunkt in allen Käfigen festgestellt. Während 5 Minuten langer Beobachtungen wurde in einem Käfig ungefähr 5-7 mal Trophallaxis beobachtet. Während der 26 Tage Versuchszeit konnten keine Anzeichen einer Durchfallerkrankung in Form von Kotspritzern und eines aufgeblähten Hinterleibs beobachtet werden. Allerdings koteten Bienen, die bei der Probeentnahme entwischt sind, innerhalb kurzer Zeit während des Flugs oder des Aufenthalts an einer Glasscheibe, ab. 3.3. Mortalität Bei Beschreibung der Mortalität wird lediglich der Totenfall der je 40 infizierten Bienen und der Kontrolle betrachtet. Die 5 Ammen je Käfig werden nicht berücksichtigt. Die Mortalität setzte ab dem zwölften Tag ein. Zuerst bei C2 mit einer toten Biene. C1 verzeichnete an Tag 14 die erste tote Biene, wie auch A1 mit drei toten Bienen. An Tag 15 folgten A2 und K1 mit jeweils einer toten Biene. Bei K2 setzte der Totenfall erst ab Tag 18 mit zwei toten Bienen ein, also sechs Tage später als bei C2. Die höchste Mortalität während der 26 Tage verzeichnete C2 mit 19 Toten. Danach folgten C1 und A1 mit jeweils 16 Toten, gefolgt von A2 mit 12 Toten, K2 mit 9 Toten und K1 mit 3 Toten. Dies entspricht während der 26 Tage Versuchszeit pro Tag einem durchschnittlichen Totenfall von 0,62 0,98 C1; 0,73 1,19 C2; 0,62 1,20 A1; 0,46 1,17 A2; 0,12 0,33 K1; 0,35 0,69 K2. 7 Totenfall Tag 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 C1 1 3 6 6 8 11 12 12 13 14 14 14 16 C2 1 1 2 4 6 6 10 13 14 14 16 16 16 16 19 Aufsummierter Totenfall pro Käfig A1 A2 K1 3 7 1 1 8 2 1 8 2 1 11 5 2 12 5 2 12 5 2 12 5 2 12 5 2 13 7 2 13 7 2 13 7 2 16 12 3 K2 2 3 5 6 6 7 7 7 9 Tabelle 2. Aufsummierter Totenfall je Käfig je entsprechendem Tag. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. Bei Betrachtung der Verläufe der verschiedenen Mortalitäten wurden grob drei unterschiedliche Verläufe festgestellt. Der erste Verlauf wurde durch C1, C2 und A1 dargestellt. Alle drei Verläufe begannen zwischen dem 12. und 14. Tag und wiesen bis zum 26. Tag sehr ähnlich hohe Zuwachsraten auf. So stieg der Totenfall bis zum 20. Tag sehr rasch auf 12 (C1), 14 (C2) und 12 (A1) an. Zwischen dem 20. und 25. Tag nahm die Mortalität gemäßigter auf 14 (C1), 16 (C2) und 14 (A1) zu. Tag 26 zeichnete sich durch einen sehr hohen Totenfall aus. C1 2 Tote, C2 3 Tote und A1 3 Tote. Ein hoher Totenfall an Tag 26 wurde bei allen Käfigen beobachtet. Einen anderen ähnlichen Verlauf der Mortalität wiesen A2 und K2 auf, wobei hier der Verlauf in zwei Abschnitte, von Tag 15-20 und Tag 21-26, zu unterteilen ist. 8 Im ersten Abschnitt (Tag 15-20) war der Verlauf weniger ähnlich, als im zweiten (Tag 21-26). Beginn des Totenfalls bei A2 war Tag 15. Daraufhin stieg die Zahl der Toten sehr rasch auf 5 bis zum 18. Tag. Dieses Niveau hielt A2 bis Tag 23. Bei K2 hingegen begann die Mortalität erst an Tag 18 mit 2 Toten. Bis zum 20. Tag nahm die Zahl der Toten rasch auf 5 zu und befand sich somit auf dem gleichen Niveau wie A2. Ab dem 20.Tag stieg der Totenfall in beiden Käfigen langsamer auf jeweils 7 Tote bis zum 25. Tag an. Die Abnahme der Mortalitätsrate ab Tag 20 war ähnlich wie bei C1, C2 und A1. Am 26. Tag erreichte die Zahl der Toten das Maximum mit einem Zuwachs um 5 auf 12 Tote bei A2 und um 2 auf 9 Tote bei K2. Den dritten charakteristischen Verlauf der Mortalitätsrate stellte K1 dar, wo der niedrigste Totenfall zu verzeichnen war. Bei K1 begann die Mortalität, ähnlich wie bei den anderen Käfigen, an Tag 15 mit einer Toten. Drei Tage später (Tag 18) erfolgte der zweite Totenfall. Ab Tag 18 wurde das bis dahin erreichte Niveau von 2 Toten bis kurz vor Ende des Experiments (Tag 25) gehalten. An Tag 26 kam eine Tote hinzu, was zusammen einen Totenfall von 3 ergab. Aufsummierte Anzahl toter Bienen Totenfall 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage nach Infektion C1 C2 A1 A2 K1 K2 Diagramm 1. Aufsummierter Totenfall nach Infektion von Apis mellifera entweder mit N. ceranae, oder mit N. apis , oder ohne Infektion. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. 9 3.4. Infektionsverlauf 3.4.1. Infektionsverlauf 1h nach Versuchsbeginn bis Tag 5 1h nach Infektion wurden vier Proben aus C3 unter dem Mikroskop untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass sich bei allen Proben keine Sporen im Darm befanden. Bei Untersuchung der Honigblase konnten einzelne Sporen festgestellt werden. Die Zahl der Sporen lag zwischen 3 und 18. Zudem waren keine vegetativen Stadien sichtbar. Die nächste Probenahme fand 30h nach Infektion statt. Dabei wurden Sporen sowohl in der Honigblase (zwischen 4-6 Sporen), als auch im Darm (zwischen 5-18 Sporen) beobachtet. Eine Probe hatte weder in der Honigblase, noch im Darm Sporen zu verzeichnen. Fünf Tage nach Beginn wiesen alle Proben einen relativ starken Nosemabefall auf. Sporen wurden dann ausschließlich im Darm festgestellt. 3.4.2. Infektionsverlauf Tag 12 bis Tag 26 Es konnten drei ähnliche Infektionsverläufe beobachtet werden. Die Verläufe wurden durch C1 und C2, weiter durch A1 und K2, und zuletzt durch A2 dargestellt. Proben von C1 und C2 wiesen über den gesamtem Zeitraum (Tag 12-26) eine signifikant höhere Infektionsetablierung auf, als die restlichen Käfige. Am 26. Tag verzeichnete C1 160,03 Mio. Sporen und C2 119,6 Mio. Sporen pro Biene. Bei K2 waren es 43,9 Mio. Sporen, bei A1 29,53 Mio. Sporen und bei A2 4,63 Mio. Sporen pro Biene. K1 blieb während des Experiments infektionsfrei. An Tag 12 wurde bei Proben der C-Käfige bereits eine sehr hohe Infektionsetablierung mit 54,77 Mio. (C1) und 73,45 Mio. (C2) Sporen pro Biene erfasst. Dahingegen fiel die Infektion bei A1 mit 0,3 Mio. und A2 mit 0,74 Mio. Sporen pro Biene deutlich niedriger aus. Bei K2 wurde an Tag 14 das erste Mal eine Infektion festgestellt, die in Höhe von 7,9 Mio. Sporen pro Biene ausgefallen ist. Die durchschnittliche Infektionsrate während der Beobachtung war mit 103,63 40,19 Mio. Sporen pro Biene bei C2 am größten, dicht gefolgt von C1 mit 100,7 34,41 Mio. Sporen pro Biene. Darauf folgten K2 mit durchschnittlich 11,19 15,52 Mio. Sporen, A1 6,46 10,61 Mio. Sporen und A2 0,87 1,68 Mio. Sporen je Biene. An Tag 19 wurde die größte Sporenbelastung mit 168,67 Mio. je Biene bei C2 beobachtet. 10 Der Verlauf von C2 unterschied sich von C1 durch eine höhere Volatilität. Nur an den Tagen 14, 16 und 19 stieg die Infektion hintereinander an. Ansonsten wurde ein Ab- und Zunehmen gegenüber dem letztgemessenen Tag festgehalten. Bei C1 hingegen stieg die Infektion relativ gleichmäßig an. Lediglich an Tag 23 nahm die Infektion gegenüber dem letztgemessenen Wert ab. Unterteilt man die durchschnittliche Sporenbelastung je Biene in zwei zeitliche Hälften, so betrug während der ersten Hälfte (Tag 12-19) die Sporenrate je Biene 75,68 Mio. bei C1 und 81,63 Mio. bei C2. In der zweiten Hälfte (Tag 19-26) zählte man 125,72 Mio. Sporen je Biene bei C1 und 125,63 Mio. Sporen je Biene bei C2. Dies stellt eine Steigerung von 66% bei C1 und 54% bei C2 dar. A1 und K2 zeichneten sich im Vergleich zu C1 und C2 insgesamt durch einen wesentlich geringeren durchschnittlichen Befall aus. Die Auswertung der je drei Proben von A1, A2 und K2 pro Auswertungstag zeigte, dass nicht immer alle drei Bienen einen Befall aufwiesen. Während der ersten Hälfte lag der durchschnittliche Befall bei A1 in Höhe von 0,47 Mio. Sporen und bei K2 in Höhe von 2,39 Mio. Sporen je Biene. In der zweiten Hälfte nahm die durchschnittliche Infektion zu auf 12,44 Mio. Sporen bei A1 und 19,99 Mio. Sporen je Biene bei K2. Dies ergab ein Plus von 2.547% bei A1 und 736% bei K2. Eine geringere Sporenwachstumsrate ließ sich bei A2 feststellen. Bei A2 wurde insgesamt die niedrigste durchschnittliche Infektionsrate je Biene erfasst. Die Sporenbelastung je Biene zwischen Tag 12-19 und Tag 19-26 lag bei einem Plus von 227%. Die Infektion bei A2 hielt sich kontinuierlich auf einem sehr niedrigen Niveau. An Tag 23 wurde bei den drei untersuchten Proben gar kein Befall festgestellt. An Tag 26 erreichte die Infektion mit 4,63 Mio. Sporen je Biene ihr Maximum. Charakteristisch für A1, A2 und K2 war die relativ niedrige Infektionsetablierung zwischen Tag 12 und 19. Daraufhin stieg die Infektion deutlich stärker bei A1 und K2 im Gegensatz zu A2 an. Der Infektionsanstieg ab Tag 19 verlief bei A1, A2 und K2 relativ gleichmäßig. Größere Schwankungen waren nicht zu verzeichnen im Vergleich zu C2. Eine zusätzliche Beobachtung an Tag 19 stellte bei einer Amme aus C2 einen Befall in Höhe von 42,4 Mio. Sporen fest. 11 Infektionsverlauf Tag Anzahl Sporen der entnommenen Proben [Mio.] C2 A1 A2 K1 73,45 48,01 0,3 0 0,74 0,93 0 0 (0) (0) (0) 61 20,37 0,5 0,2 0,25 0,35 0 0 (0) (0) (1) 66,93 20,77 0,33 0,46 0,4 0,61 0 0 (0) (1) (1) 168,67 71,02 1,03 1,3 0,05 0,07 0 0 (0) (1) (1) 98,87 24,1 5,5 3,98 0,03 0,06 0 0 (0) (0) (2) 136,9 39,88 8 8,75 0 0 0 0 (0) (0) 119,6 46,64 29,53 11,49 4,63 4,81 0 0 (0) (0) (1) C1 54,77 71,27 (0) 73,97 21,51 (0) 82,83 30,51 (0) 106,63 35,07 (0) 119,87 52,99 (0) 106,8 6,51 (0) 160,03 36,8 (0) 12 14 16 19 21 23 26 K2 0 0 7,9 13,68 (2) 0,1 0,1 (1) 0,7 0,89 (1) 13,33 23,09 (2) 12,37 16,94 (0) 43,9 43,15 (0) Tabelle 3. Durchschnittliche Anzahl Sporen pro Bienen in Mio., der je drei, an den entsprechenden Tagen, entnommenen Proben. Zahl in Klammer gibt die Anzahl der Bienen, die keinen Befall aufwiesen an. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. Infektionsverlauf Sporen pro Biene [Mio.] 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 12 14 16 19 21 23 26 Tage nach Infektion C1 C2 A1 A2 K1 K2 Diagramm 2. Anzahl Sporen pro Biene in Mio. nach Infektion von Arbeiterinnen der Art Apis mellifera. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von drei Bienen dar. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. 12 Durchschnittliche Sporenmenge Tag 12-26 Anzahl Sporen pro Biene [Mio.] 120 100,7 103,63 100 80 60 40 20 6,46 11,19 0,87 0 A2 K1 0 C1 C2 A1 K2 Diagramm 3. Durchschnittliche Sporenmenge in Mio. pro Biene von Tag 12-26. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. Durchschnittliche Sporenmenge Tag 12-19 Anzahl Sporen pro Biene [Mio.] 90 80 70 75,68 81,63 60 50 40 30 20 10 0,47 0,41 0 2,39 A1 A2 K1 K2 0 C1 C2 Diagramm 4. Durchschnittliche Sporenmenge in Mio. pro Biene von Tag 12-19. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. 13 Durchschnittliche Sporenmenge Tag 19-26 Anzahl Sporen pro Biene [Mio.] 140 125,72 125,63 120 100 80 60 40 19,99 12,44 20 1,34 0 A2 K1 0 C1 C2 A1 K2 Diagramm 5. Durchschnittliche Sporenmenge in Mio. pro Biene von Tag 19-26. C1 und C2 mit N. ceranae infizierte Käfige; A1 und A2 mit N. apis infizierte Käfige; K1 und K2 Käfige ohne Infektion. 3.4.3. Infektion des Totenfalls Die Angaben über den Befall beziehen sich jeweils auf eine tote Biene, die an dem entnommen Tag gestorben ist. Der Totenfall von C1 wies an Tag 15, 20 und 26 einen starken Befall auf. Ein starker Befall liegt im Rahmen von etwa 120 Mio. Sporen pro Biene. C2 zeigte nur an Tag 20 einen starken Befall. An Tag 15 und 26 wurde ein mittlerer Befall festgestellt. A1 wies an Tag 15 keinen Befall auf. An Tag 18 und Tag 26 wurden vereinzelt Sporen gesichtet. Dies dürfte einem Befall in Höhe von 1-5 Mio. Sporen pro Biene entsprechen. Bei A2 zeigten sich an Tag 15 vereinzelt Sporen. An den Tagen 23 und 26 wurde kein Befall festgestellt. K1 zeigte an Tag 15 keinen Befall. Bei K2 wurde an Tag 18 ein vereinzelter Befall festgestellt. Die Untersuchung von Tag 21 wies keinen Befall auf. 14 4. Diskussion 4.1. Artdifferenzierung Die Infizierung der Käfige C1, C2, A1 und A2 hat wie geplant mit dem jeweils richtigen Erreger stattgefunden. Außergewöhnlich ist die nicht geplante Infektion von K2 mit N. ceranae. Es ist möglich, dass durch unhygienisches Arbeiten, beispielsweise während der Infektion mit kontaminiertem Arbeitsgerät, die Infektion erfolgte. Dagegen spricht, dass K1 infektionsfrei war und bei den anderen Käfigen keine Mischinfektionen aufgetreten sind. Es ist davon auszugehen, dass die Infektion über eine befallene Amme stattgefunden hat. Dafür spricht, dass eine Infektion mit N. ceranae erfolgte. Leider konnten nachträglich nur zwei Ammen aus K2 auf einen Befall untersucht werden (Ergebnis negativ), da sich bei den drei restlichen Ammen die Markierung gelöst hat. Einen anderen potentiellen Infektionsherd könnte das zugeführte Bienebrot gebildet haben (Higes et al., 2008a). Das Bienenbrot in allen Käfigen stammte von derselben Wabe. Sollte das Bienenbrot zur Infektion geführt haben, so wäre anzunehmen, dass auch K1 infiziert worden wäre und bei A1 und A2 eine Mischinfektion aufgetreten wäre. 4.2. Verhalten Bei Analyse des Verhaltens unter Berücksichtigung krankheitsbedingter Symptome wäre anzunehmen, dass die Vitalität und das Erregtsein, insbesondere der mit N. ceranae infizierten Bienen in energetischem Stress, also durch die ausbleibende Verdauung, begründet ist, da die Bienen zunehmend auf Nahrungssuche sind (Mayack et Naug, 2009). Dem widerspricht, dass in allen Käfigen das Erregtsein festgestellt wurde. Die frühere Abnahme der Vitalität von A1 ist in der Futtervorrichtung begründet, auf Grund derer die Bienen in höherem Maße mit Zuckerwasser verklebten, was die Bewegungsfähigkeit einschränkte und von den Bienen vergleichsweise mehr Kraft und Energie abverlangte. Weiterhin wurden in keinem Käfig Kotspritzer entdeckt, was Hinweis auf eine Nosemaerkrankung wäre. Das Abkoten von Bienen kurz nach Flucht aus dem Käfig weist daraufhin, dass das Bedürfnis des Kotens vorhanden war, jedoch unterdrückt werden konnte. In Anbetracht erfahrungsgemäßer Symptomen eines starken Nosemabefalls wäre 15 anzunehmen, dass dieses Bedürfnis nicht hätte unterdrückt werden können, sodass in die Käfige gekotet würde. Hiesiges Verhalten entspricht den Beobachtungen eines früheren Versuchs, der die Auswirkungen einer N. apis-Infektion untersucht hat, wo ebenfalls nicht in die Käfige gekotet wurde, obwohl die Infektion dort wesentlich höher ausfiel (Malone et Giacon, 1996). In allen Käfigen wurde Trophallaxis beobachtet. Dies ist an für sich keine Begründung, dass Bienen nicht von Nosema befallen sind. Einer Untersuchung nach weisen jedoch Bienen, die mit N. ceranae infiziert sind eine signifikant geringere Bereitschaft zur Futterweitergabe und einen höheren Futterverbrauch auf, als nicht infizierte Bienen (Naug et Gibbs, 2009). Zuckerwasserverbrauch wurde in diesem Versuch nicht genau und nicht käfigabhängig gemessen. Hierzu wären genauere Untersuchungen, auch bezüglich Trophallaxis nötig, weshalb man an Hand der beobachteten Parameter und erhobenen Daten keinen Schadeffekt in den infizierten Käfigen diagnostizieren kann. 4.3. Mortalität und Infektionsverlauf Die höhere Mortalität von Bienen, die mit N.ceranae infiziert wurden im Vergleich zu den mit N. apis infizierten Bienen wurde in einem früheren Versuch bestätigt (Paxton et al., 2007). Das Ergebnis wies dort einen signifikanten Unterschied zwischen beiden Nosemaarten auf. Dabei waren nach zwei Wochen bei N. ceranae infizierten Bienen 14 von 25 am Leben, bei N. apis infizierten Bienen waren dagegen noch 23 von 25 Bienen lebend. Solch ein extremer Unterschied wurde in hiesigem Versuch nicht beobachtet. Im Gegenteil. Betrachtet man die Infektionsetablierung, die bei A2 deutlich geringer war als bei C1 und C2, so fällt die relative Mortalität von A2 wesentlich größer aus, als die von C1 und C2. Ergebnis in hiesigem Versuch wäre daher, dass bereits eine relativ niedrige Infektionsetablierung von N. apis einen wesentlich höheren beschleunigenden Effekt auf die Mortalität ausübt, als diejenige von N. ceranae infizierten Bienen. Bei Paxton et al (2007) begann der Totenfall sowohl bei N. ceranae, als auch bei N. apis infizierten Bienen recht zeitnahe nach bereits drei bzw. vier Tagen. Zwei Wochen nach Versuchsbeginn war über die Hälfte der N. ceranae infizierten Bienen gestorben, zu einem Zeitpunkt, als der Totenfall in diesem Versuch erst startete. Merkwürdig daran ist, dass bei Paxton et al (2007) nach 14 Tagen eine Sporenmenge von 27 Mio. pro Biene sowohl bei N. apis, als auch bei N. ceranae ermittelt wurde. In hiesigem 16 Versuch lag bei C1 und C2 nach 14 Tagen die Sporenmenge bei durchschnittlich 67 Mio. je Biene. Es wäre daher anzunehmen, dass die Mortalität bei C1 und C2 wesentlich höher hätte ausfallen müssen. Dies weist möglicherweise auf eine niedrigere Virulenz der Sporen hin, die in diesem Versuch verwendet wurden. Bei einem weiteren Experiment wurde ein noch extremeres Ergebnis erzielt, nämlich eine Mortalität von 100% nach acht Tagen bei mit 125.000 Sporen (N. ceranae) infizierten Bienen (Higes et al., 2006). Bei Paxton et al (2007) stieg der Totenfall relativ gleichmäßig bei N. ceranae infizierten Bienen an. Im Gegensatz dazu wurde bei Higes et al (2006) ein nahezu exponentieller Totenfall registriert. In hiesigem Versuch fand eine Art etappenweises Ansteigen des Totenfalls bei C1, C2 und A2 statt. Es könnte sein, dass dies im Zusammenhang mit Vermehrungs- und Wirkungsstadien der Sporen steht. Beispielsweise, dass Sporen einen gewissen Vermehrungs- und Entwicklungszyklus durchlaufen, während dessen sie harmlos sind. Nach Beenden dieses Zyklussees zeigen sie schlagartig Wirkung. Dies könnte Grund für den starken Anstieg der Mortalität an Tag 26 sein. In einem weiteren Infektionsexperiment mit N.apis (200.000 Sporen pro Biene) begann der Totenfall, ähnlich wie bei Paxton et al (2007), nach wenigen Tagen (Malone et Gatehouse, 1998). Jedoch stieg der Totenfall kontinuierlich an, bis ca. zwei Wochen später eine Mortalitätsrate von etwa 25% und drei Wochen später eine Rate von etwa 50% erreicht wurde. Nach ca. 25 Tagen stieg die Mortalität sehr stark an, ähnlich wie in diesem Versuch und im Gegensatz zu Paxton et al (2007). Leider wurde im Versuch von Malone et Gatehouse (1998) keine Untersuchung zum Infektionsverlauf durchgeführt, sodass die Virulenz von N. apis des hiesigen Versuchs nicht mit derjenigen von Malone et Gatehouse (1998) verglichen werden kann. In zwei anderen Versuchen wurde bei Infektionen mit N. apis eine durchschnittliche Lebensdauer der Bienen von etwa 27 und 35 Tagen ermittelt (Malone et Giacon, 1996; Malone et Stefanovic, 1999). Die durchschnittliche Lebensdauer in hiesigem Versuch kann nicht ermittelt werden, da zu Versuchsende noch Bienen lebten. Vermutlicherweise wäre die durchschnittliche Lebensdauer niedriger gewesen, da an Tag 26 bei A2 nur noch 7 Bienen im Vergleich zu 12 toten Bienen lebten. Verwunderlich ist, dass in beiden anderen Versuchen die Sporenbelastung je Biene wesentlich höher ausfiel. Die Infektion bei Malone et Giacon (1996) wies etwa einen durchschnittlichen Befalle pro Biene von 50 Mio. Sporen auf. Malone et Stefanovic (1999) stellten nach 20 Tagen eine Belastung von etwa 10-20 Mio. Sporen je 17 Biene fest. Es wäre daher anzunehmen, dass die Mortalität im Vergleich zu hiesiger Mortalität wesentlich drastischer hätte ausfallen müssen. K2 stellt ein besonderes Ergebnis dar. Der Totenfall setzte am spätesten ein und nahm innerhalb kurzer Zeit stark zu. Sollte die Infektion über eine Amme erfolgt sein, so würde dies die später einsetzende Mortalität begründen, da mehr Zeit für die Etablierung der Krankheit benötigt wurde. Die Infektion hätte dann über frische Sporen, mittels Trophalaxis, stattgefunden. Dies stimmt mit dem Infektionsverlauf überein, der zu Beginn sehr niedrig gewesen ist und später überdurchschnittlich anstieg. Erstaunlich ist die kurze Etablierungsphase von K2 von Tag 21 bis Tag 26 auf ein deutlich höheres Niveau, als jenes von A2, was N. ceranae eine enorme Infektiösität bescheinigen würde. Möglicherweise sind Sporen, die über Futteraustausch weitergegeben werden infektiöser und virulenter, als Sporen, wie sie C1 und C2 verabreicht wurden, die etwa 6h alt gewesen sind. Diesen Vermutungen widerspräche allerdings, dass bei den ausgewerteten toten Bienen von K2 kein bis ein geringer Befall festgestellt wurde. Merkwürdigerweise wiesen ebenso die toten Bienen von A2 einen sehr geringen Befall auf. Teilweise konnte gar kein Befall nachgewiesen werden. Daher sollte man nicht davon auszugehen, dass Nosema ausschließlich Todesursache gewesen ist, sondern, dass die Bienen beispielsweise an Altersschwäche gestorben sind. Im Vergleich dazu war der Befall bei C1 und C2 mittel bis stark und sehr wahrscheinlich Hauptursache für die Mortalität. In früheren durchgeführten Infektionsexperimenten (Paxton et al., 2007; Higes et al., 2006; Malone et Gatehouse, 1998; Mayack et Naug, 2009) wiesen die Kontrollen eine deutlich niedrigere Mortalität auf, als die infizierten Bienen. So auch in diesem Versuch. Demnach muss ein Zusammenhang zwischen Mortalität und Infektion bestehen, wenn auch die toten Bienen von A2 und K2 nur einen sehr geringfügigen Befall aufwiesen. Diese Annahme bestätigt der Versuch von Malone et Giacon (1996), bei deren Auswertung von toten Biene teilweise keine Infektion durch N. apis festgestellt werden konnte. Jedoch wurde auch dort ein signifikanter Unterschied der Mortalitäten zwischen infizierten Bienen, auch wenn keine Infektion festgestellt werden konnte, und der Kontrolle beobachtet. Es scheint, als könne durch eine lichtmikroskopische Untersuchung mit der hier verwendeten Verdünnung des Bienendarms durch H2O eine Infektion unter einem bestimmten Befallsgrad nicht mehr festgestellt werden (Malone et Giacon, 1996). Trotzdem könnte durchaus solch ein niedriger Befall die Biene schädigen. Zudem wurde bei Malone et Giacon (1996) festgestellt, dass Bienen, bei denen teilweise kein Befall mit N. apis festgestellt werden konnte, signifikant kürzer lebten, als Bienen mit erkennbarem Befall. Malone et Giacon (1996) 18 folgerten aus ihren Ergebnissen, dass eine Infektion bei frisch geschlüpften Bienen einigen Bienen einen schnellen Tod bereitet, jedoch bei der Mehrzahl ein langsameres Sterben bewirkt. Es scheint daher üblich zu sein, dass Bienen, die mit N. apis infiziert sind, an sehr unterschiedlichen Sporenmengen sterben, die in keine Beziehung zur Lebensdauer gebracht werden können. Dies würde beispielsweise begründen, weshalb bei A2 die Mortalität bereits ab Tag 15 einsetzte, obwohl sich die Infektion ganzheitlich auf sehr niedrigem Niveau hielt und erst am letzten Versuchstag deutlich anstieg. Dieser Argumentation widerspricht jedoch, dass selbiges Phänomen auch bei K2 beobachtet wurde, wo eine Infektion mit N. ceranae vorlag. Es konnten 1h nach Infektion keine N. ceranae-Sporen im Darm, sondern lediglich in der Honigblase festgestellt werden. Ferner waren keine vegetativen Stadien sichtbar. Bereits 10 min. nach Infektion gelangen N. apis-Sporen in den Mitteldarm (de Graaf et al., 1994). Bei der Aufnahme von N. ceranae-Sporen ist anzunehmen, dass es sich ähnlich verhält. Vermutlicherweise wandern die Sporen innerhalb 1h in die Epithelzellen, um dort ihren Vermehrungszyklus zu starten und insofern in hiesigem Versuch nicht mehr gesichtigt werden konnten. Dieser Beobachtung steht das Ergebnis von Higes et al (2006) gegenüber (Higes et al., 2006), in dem 3h nach Infektion reife, leere und keimende Sporen im Lumen beobachtet wurden. Am dritten Tag nach Infektion wurden bei Higes et al (2006) alle intrazellulären Stadien des Lebenszyklussees von N. ceranae festgestellt. Dieses Ergebnis bestätigt, dass in hiesigem Experiment ab Tag 5 vegetative Stadien im Darm beobachtet wurden. Bei Beobachtung des Infektionsverlaufs ab Tag 12 stellt man eindeutig fest, dass die Infektion von N.ceranae ein signifikant höheres Niveau erreichte, als diejenige von N.apis. Jedoch deckt sich hiesiges Resultat sowohl in Bezug auf die Etablierung von N. ceranae, als auch von N. apis nicht mit dem Ergebnis von Paxton et al (2007), welches angibt, dass die Anzahl der Sporen je Biene bei beiden Infektionen auf max. 27 Mio. nach zwei Wochen angestiegen ist. Die Zunahme der Sporen erfolgte dort bei N. apis infizierten Bienen sogar schneller. Zum einen wiesen bei Paxton et al (2007) an Tag 12 N. ceranae infizierte Bienen ca. 22 Mio. Sporen je Biene auf. Hiesiger Versuch wies eine bereits deutlich fortgeschrittenere Infektion auf, die möglicherweise in einer höheren Infektiösität der verwendeten Sporen für die Infektion begründet sein könnte, sofern Unterschiede bestehen. Zudem wurden im Vergleich zu Paxton et al (2007) doppelt so viele Sporen gefüttert. Dies dürfte jedoch keine große 19 Auswirkung gehabt haben, da eine höhere Dosis nur ein geringfügig schnelleres Erreichen einer voll entwickelten Infektion bedingt. Nach etwa zwei Wochen wird dasselbe Infektionslevel, auch mit einer niedrigeren Dosis, erreicht (Fries, 1988; Malone et Stefanovic, 1999). Es hätte also nach zwei Wochen bei Paxton et al (2007) in etwa dieselbe Sporenmenge ermittelt werden müssen. Zum anderen konnte keine Etablierung von N. apis in dem Maße wie bei Paxton et al (2007), festgestellt werden. Die Etablierung fiel bei A2 deutlich niedriger aus. Eine weitere Untersuchung belegte, dass mit N. apis infizierte Bienen nach 15 Tagen eine Anzahl von 18 Mio. Sporen je Biene aufwiesen (Fries, 1988). Zudem wiesen, wie o.g., die Versuche von Malone et Giacon (1996) und Malone et Stefanovic (1999) bei N. apisInfektionen Sporenbelastungen in Höhe von mehreren Mio. pro Biene auf. Eine Untersuchung belegt, dass eine Infektion, die mit 70.000 N. apis-Sporen durchgeführt wird, bei 60% der Bienen anschlägt (Webster et al., 2004). Ein anderer Versuch kam zu dem Ergebnis, dass bei einer Infektion mit 100.000 N. apisSporen nach einem Tag 66% der Bienen infiziert waren und nach drei Tagen 100%. Eine Infektion mit 100.000 N. ceranae-Sporen führte hingegen bereits ab dem ersten Tag zu einer 100%igen Infektion der Bienen (Martin-Hernandez et al., 2009). Dieses Ergebnis stellt eine höhere Pathogenität von N. ceranae unter Beweis und würde mitunter Faktor für die schnellere und deutlich höhere Etablierung von C1 und C2 gegenüber A2 sein. Werden einem Käfig mit gesunden Bienen 10% N. apis infizierte Bienen zugeführt, so infizieren sich innerhalb einer Woche 60% der vorhandenen Bienen (Webster et al., 2004). Wäre bei K2 eine Amme infiziert gewesen, so entspräche dies 2,2%, weshalb die Krankheitsetablierung bei K2 entsprechend länger dauerte und nicht alle untersuchten Proben infiziert waren. Die o.g. Versuchsergebnisse bezüglich der Etablierung von N. apis können nicht in Übereinstimmung mit hiesigem Ergebnis gebracht werden, da sie lediglich ein Verzögern einer Etablierung um wenige Tage und nicht um 26 Tage begründen würden. Zudem liefern sie keine Rückschlüsse auf das sehr niedrige Etablierungsniveau von N. apis in hiesigem Versuch. Der geringe Erfolg der Etablierung von N. apis ist sehr wahrscheinlich in einer sehr geringen Infektiösität der zugeführten Sporen begründet. Die infizierten Bienen, aus denen die Infektionssuspension hergestellt wurde, waren bereits mehrere Jahre tiefgefroren. Dies könnte die Infektiösität eingedämmt haben, wenn auch Untersuchungen belegen, dass das Einfrieren von N. apis-Sporen deren Infektiösität kaum beeinträchtigt (Bailey, 1972). Zudem wurde der 20 Versuch von Malone et Giacon (1996) ebenfalls mit eingefrorenem N. apis-Sporen durchgeführt. Die Infektionslösungen in den Versuchen von Paxton et al (2007) und Fries (1988) stammten hingegen sowohl bei N. ceranae, als auch bei N. apis von frischem Material. Wenn man wiederum bedenkt, dass die Anzahl an keimfähigen Ausgangssporen für das Erreichen eines bestimmten Infektionsniveaus irrelevant ist und nach zwei Wochen dasselbe Niveau erreicht wird, wie bei einer Infektion mit deutlich mehr Ausgangssporen, so hätte keine differente Etablierung zwischen N. apis und N. ceranae stattfinden dürfen (Fries, 1988). Der große Unterschied in hiesigem Versuch weist darauf hin, dass die Zahl der keimfähigen Sporen bei N. apis deutlich geringer gewesen sein muss, sodass das Niveau von N. ceranae in der Versuchszeit nicht erreicht werden konnte. Eine weitere Ursache der geringen Infektiösität könnte das Alter des Ausgangsmaterials gewesen sein, wenn man annimmt, dass die Infektiösität mit zunehmendem Alter abnimmt. Die Infektion einer Amme in C2 bewiese die Krankheitsübertragung untereinander, angenommen die Amme ist nicht zuvor infiziert gewesen. Betrachtet man nochmals die in diesem Versuch bestätigte hohe Fähigkeit von N. ceranae sich zu etablieren, vergleichend mit derselben Fähigkeit von N. apis anderer Versuche, so erreicht N. ceranae unter ähnlichen Voraussetzungen ein wesentlich höheres Etablierungsniveau. N. ceranae besäße demnach eine viel höhere Pathogenität. Dies könnte eine Ursache sein, dass sich N. ceranae in den letzten Jahren stark ausgeweitete und scheinbar N. apis verdrängt hat. In weiteren Versuchen wäre anzustreben den Krankheitsverlauf direkt nach Infektion zu beobachten. Dies hieße zum einen, Beobachtungen innerhalb der ersten Stunde durchzuführen, zum anderen, den Infektionsverlauf innerhalb des ersten Tages und ab dem ersten Tag beispielsweise in Abständen von drei Tagen bis Tag 12 zu erheben, um eine ganzheitliche Entwicklung der Infektion zu erfassen. Ferner ist es unumgänglich die Infektion mit frischem Sporenmaterial durchzuführen, um einen direkten Vergleich der Schadwirkung von N. apis und N. ceranae zu ermöglichen. Zudem sollten alle Käfige einen identischen Aufbau vorweisen, sodass es nicht zu ungleichen Voraussetzungen, wie hier die unterschiedliche Futtervorrichtung bei A2, kommen kann und Ergebnisse nicht adäquat beurteilt werden können. 21 Es muss das Problem gelöst werden, Jungbienen ohne Ammen im Käfig aufzuziehen, bzw. ist sicherzustellen, dass sie befallsfrei sind, sodass potentielle Infektionsquellen von vornherein ausgeschlossen werden. Dies trifft ebenso auf das Bienenbrot zu. Anzuregen wäre, den Versuch unter Freilandbedingungen durchzuführen, um eine realtypische Krankheitsentwicklung und insbesondere deren Auswirkungen erfassen zu können, um die Möglichkeit zu schaffen, konkrete und reale Rückschlüsse auf einen Zusammenhang zwischen Nosemose und Colony Collapse Syndrom ziehen zu können. Der Effekt einer Infektion auf den Totenfall würde höchst wahrscheinlich in einem Freilandversuch stärker ausfallen, da die Bienen eine höhere Arbeitsleistung erbringen müssen, was mit einem höheren Energiebedarf einhergeht, dessen Deckung durch die Nosemose beeinträchtigt wird (Ritter, 1996). 5. Zusammenfassung „Vergleich der Schadwirkung von Nosema apis und Nosema ceranae auf der Honigbiene im Käfigversuch“ Um Unterschiede der Schadwirkung von Nosema ceranae und Nosema apis feststellen zu können, wurden Käfige erstellt und über einen Zeitraum von 26 Tagen untersucht. Frisch geschlüpfte Bienen wurden mit 10 µl einer 50%igen Zuckerlösung infiziert, die etwa 200.000 entsprechende Sporen enthielt. Die Infektionssporen stammten bei N. ceranae von frischem Material, bei N. apis war das Material zwei bis drei Jahre tiefgefroren gewesen. Drei Käfige wurden mit N. ceranae infizierten Bienen gefüllt. Diese wurden aufgeteilt in 2 Käfige á 40 Bienen und 1 Käfig á 20 Bienen. Der Käfig mit 20 Bienen wurde nur fünf Tage geführt. Die nächsten zwei Käfige enthielten je 40 mit N. apis infizierte Bienen. Die letzten zwei Käfige enthielten, analog dazu je 40 Bienen, die als Kontrolle fungierten. Die Schadwirkungen wurden an Hand der Parameter Verhalten und Mortalität, unter Rücksichtnahme auf den Infektionsverlauf, beurteilt. Dabei bestätigte dieser Versuch eine hohe Pathogenität von N. ceranae. Die Pathogenität von N. apis fiel dahingegen wesentlich niedriger aus. Hiesiger Versuch lässt jedoch nicht den Schluss zu, dass N. ceranae im Vergleich zu N. apis pathogener sei, da die Voraussetzungen, die zur Infektion führten, auf Grund der unterschiedlichen Ausgangsbedingungen, nicht adäquat gewesen sind, sodass kein direkter Vergleich zulässig ist. 22 Es ist anzunehmen, dass die Infektiösität der N. apis-Sporen signifikant niedriger gewesen ist. Dabei ist jedoch nicht sicher, ob das Tiefkühlen oder das Alter der Sporen die Infektiösität negativ beeinflusst haben oder andere Faktoren. Während sich die Nosemose bei N. ceranae nach knapp zwei Wochen auf einem extrem hohen Niveau etabliert hat, setzte eine zunehmende Etablierung bei N. apis erst nach drei Wochen ein, jedoch auf einem signifikant niedrigeren Niveau. Der Vergleich zwischen der Krankheitsetablierung und der Mortalitätsrate zeigt allerdings, dass die Schadwirkung von N. apis, relativ gesehen, größer ausfiel, als bei N. ceranae. Jedoch ist auch dieser Vergleich, auf Grund der o.g. differenten Rahmenbedingungen, im Prinzip nicht möglich. Es scheint, auch auf Grund des Bezugs zu anderen Versuchen, dass mit N. apis infizierte Bienen bereits bei einer relativ niedrigen Sporenbelastungen und bei sehr unterschiedlichen Sporenbelastungen sterben können, da im Totenfall keine bzw. nur eine sehr niedrige Krankheitsetablierung nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich dazu wies der Totenfall von N. ceranae einen deutlichen Nosemabefall auf. Im Vergleich zu früheren Untersuchungen hat sich die Nosemose bei N. ceranae schneller und stärker und bei N. apis langsamer und schwächer etabliert. Zudem fiel die Mortalität bei N. ceranae infizierten Bienen in geringerem Maße und deutlich verzögert, als anzunehmen gewesen wäre, aus. In Bezug auf das Verhalten konnten keine Schadwirkungen unter Berücksichtigung potentieller Krankheitssymptome beobachtet werden. In allen Käfigen wurde Trophallaxis festgestellt, was jedoch einen Befall nicht ausschließen lässt. Ferner wurden in keinem der Käfige Kotspritzer erfasst und die Bienen zeichneten sich nicht durch aufgeblähte Hinterleiber aus. Im Verhalten der einzelnen Käfige konnte kein Unterschied festgestellt werden. Es wäre anzustreben, weitere Versuche unter gleichen Rahmenbedingungen durchzuführen, um die hier unvermutete hohe Schadwirkung von N. apis und die sehr hohe Pathogenität von N. ceranae, jedoch vergleichsweise geringe Schadwirkung, bestätigen oder widerlegen zu können. 23 Abstract “Comparision of damages effected by Nosema apis and Nosema ceranae on the western honeybee at a cage test” In order to find differences of damages, effected by nosema ceranae and nosema apis, we established cages and researched them for 26 days. Recent emerged bees were fed with 10µl of a 50% sucrosesuspension, containing about 200.000 according spores. The infectioned spores of N. ceranae originate from freshly material. The infectioned spores of N. apis originate from 2-3 year long frozen material. 3 cages were filled with N. ceranae infected bees. They were fragmented in 2 cages á 40 bees and 1 cage á 20 bees. The cage with 20 bees was observed only for 5 days. The next 2 cages were filled with every 40 bees, infeted by N. apis. The last 2 cages were filled with every 40 bees, which attend as the kontroll. The damageeffects were estimated with the parameters behavior and mortality under reference to infectionlevel. Thereby this experiment attests a high pathogenicity of N. ceranae. Whereas the pathogenicity of N. apis was significant lower. But the experiment do not draw the conclusion, that N. ceranae is more pathogen than N. apis, because the requirements for the infection were different as it was used freshly and frozen material for the infection. It seems that the Infectifity of N. apis-spores was signinificant lower. Thereby it is not clear, if the frozing or the ageing of the spores or other factors reduced the infectifity. Whereas Nosemose after 2 weeks, by N. ceranae infected bees, established on an extrem high level, the increasing establishment, by N. apis infected bees, primary entered after3 weeks, however on an significant lower level. Certainly the comparision of the establishment and the mortality shows, that the damageeffect of N. apis is, relative considered, higher than by N. ceranae. However, this comparision is not acceptable, as mentioned the indifferent requirements. It semms, also with regard to other experiments, that bees, infected by N. apis, already die by a relative low spore mass and by very different spore masses, because in dead bees partial no infection or a very low infectionlevel was detected. In comparision to this, dead bees of N. ceranae offered a clearly infestation. 24 In comparision to previous analyses has Nosemose by N. ceranae established faster and higher and by N. apis slowlier and lower. Besides the mortality by N. ceranae infected bees was on a lower and delayed kind, as supposed to be. Regarding to behavior, no disease indication could be obtained. In all cages trophallaxis was noticed. But this is not a sign, that there is no infestation. Also in the cagees no dirt was detectioned and the bees had no expended abdomen. Furtheron the behavior in all cages was the same. It should be aspire to accomplish further experiments with the same basic conditions, to attest or to confute the unexpected high damageeffect by N. apis and the very high pathogenicity of N. ceranae, but comparetively low damageeffect. 25 6. Literatur 6.1. Literaturverzeichnis Bailey L. (1972) The preservation of infective microsporidian spores, J. Invertebr. Pathol. 20, 252-254. De Graaf D.C., Raes H., Sabbe G., De Rycke P.H., Jacobs F.J. (1994) Early Development of Nosema apis (Microspora: Nosematidae) in the Midgut Epithelium of the Honeybee (Apis mellifera), J. Invertebr. Pathol. 63, 74-81. 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Zander, E., (1909) Tierische Parasiten als Krankheitserreger bei der Biene, Münchener Bienenzeitung 31, 196-204. 27 6.2. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Käfige 5 Tabelle 2: Totenfall 8 Tabelle 3: Infektionsverlauf 12 6.3. Abbildungsverzeichnis Diagramm 1: Totenfall 9 Diagramm 2: Infektionsverlauf 12 Diagramm 3: Durchschnittliche Sporenmenge Tag 12-26 13 Diagramm 4: Durchschnittliche Sporenmenge Tag 12-19 13 Diagramm 5 : Durchschnittliche Sporenmenge Tag 19-26 14 28 Erklärung Ich erkläre hiermit, dass die vorliegende Arbeit von mir selbst und ohne fremde Hilfe, lediglich unter Benutzung der hier aufgeführten Literatur, angefertigt worden ist. Diese Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. 29 30 31 32
