Zeitschrift für Naturforschung / B / 4 (1949) - ZfN - Max

Über den Abbau von Serumalbumin durch Hypochlorit
V o n
H A N S HERKEN u n d
JOSEF
SCHUNK
Aus dem Pharmakologischen Institut der Universität Berlin
(Z. Naturforschg. 4 b, 19—£1 [1949]; eingegangen am 14. Dezember 1948)
Auf Grund von Untersuchungen an synthetischen niedermolekularen Eiweißkörpern
schien Hypochlorit zum Nachweis qualitativer Veränderungen an hochmolekularen
Proteinen geeignet. Es wurde die Wirkung bekannter Mengen Hypochlorit auf Serumalbumin im Warburg-Apparat untersucht und die dabei entstehende Kohlensäure sowie
der gasförmige Stickstoff gemessen. Bei bestimmten Erkrankungen wurden erheblich
vom Normalen abweichende Werte gefunden.
ntersuchungen an synthetischen Substraten
hatten ergeben, daß die Spaltung von Peptidbindungen durch Hypochlorit, je nach Struktur
der Eiweißkörper, mit verschiedener Geschwindigkeit erfolgt. So wurden z.B. Leucyltyrosin und
Glycylleucin sehr viel schneller gespalten als
Alanyl-, Valyl- und Leucylglycin. Die Verlängerung der Peptidkette um ein Glycinmolekül, zum
entsprechenden Tripeptid, änderte offenbar auch
die Stabilität der Bindung zwischen Alanin bzw.
Leucin und dem folgenden Glycin, denn beide
Tripeptide wurden in der gleichen Zeit weit besser abgebaut als die analogen Dipeptide 1 . Zur
Auslösung der Reaktion ist eine freie a-Aminogruppe notwendig, denn Carbobenzoxy-glycylalanin wurde ebenso wie Cfes-i-Leucin und Benzoylglykokoll unter gleichen Bedingungen nicht angegriffen. WTeitere Untersuchungen haben wir im
Warburg-Apparat an Serumproteinen durchgeführt, wobei die Geschwindigkeit des Abbaues
durch Messung der gebildeten CO2 und des gasförmigen Stickstoffes verfolgt wurde. Den Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung
entsprechend 2 , ergaben sich besonders deutliche
Differenzen zwischen dem am leichtesten fällbaren Globulinanteil und dem Albumin. Auf
Grund dieser Befunde schien das Verfahren zum
Nachweis qualitativer Veränderungen an Serumproteinen geeignet. W i r haben daher die Reaktionen bestimmter Mengen Hypochlorit mit Serumalbumin bei verschiedenen Erkrankungen geprüft. Der größte Teil der Globuline wurde durch
Fällung bei einer Konzentration von 24,5 g
Na 2 S0 4 in 100 H „ 0 entfernt. Bei dem zur Untersuchung gelangenden Eiwreißkörper handelt es
U
1 H. H e r k e n u. J. S c h u n k ,
Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 206, 102 [1949].
sich also nicht um ein einheitliches Protein, sondern um ein vorwiegend aus Albumin und einem
kleineren Anteil des sog. Pseudoglobulins bestehendes Gemisch.
Bei den Untersuchungen, die in der von 0 .
W a r b u r g angegebenen Apparatur durchgeführt
wurden, ergaben sich zunächst einige Schwierigkeiten, weil zur Spaltung von Peptidbindungen
z. Tl. ein erheblicher Überschuß von NaOCl notwendig war. Die Versuchsbedingungen mußten in
den meisten Fällen so gewählt werden, daß die
Umsetzungen bei annähernd neutraler Reaktion
abliefen. Dadurch wurde eine zu schnelle Zerstörung von Hypochlorit vermieden, die die manometrischen Versuche natürlich erheblich gestört
hätte. Andererseits durften die Lösungen nicht zu
alkalisch sein, um die Messung der freiwerdenden
Kohlensäure nicht zu beeinträchtigen. Die Versuche wurden daher unter folgenden Bedingungen
durchgeführt:
Ansätze in kegelförmigen Warburg-Gefäßen bei
38°. Inhalt: 200 y Serumprotein-N (in 0,5 cm 3 0,9-proz.
NaCl-Lösung), 1,5 cm3 m/10-Phosphatpuffer p H 6,3,
0,5 cm 3 NaOCl-Lösung (deren Hypochloritmenge in
der Tabelle angegeben ist) im seitlichen Anhang, die
nach Temperatur- und Druckausgleich in den Hauptraum der Gefäße eingekippt wurde. Die stark alkalische NaOCl-Lösung wurde unmittelbar vor dem Versuch mit m-Essigsäure auf p H 7,7 eingestellt. Die Messung der Wasserstoffionenkonzentration geschah mit
der Glaselektrode. Der gasförmige Stickstoff wurde
jeweils in Parallelversuchen ermittelt, bei denen die
Gefäße 1 cm3 10-proz. KOH in einem zum Zwecke der
schnellen C0 2 -Absorption stark vergrößerten Einsatz
enthielten. Untersuchungen an Aminosäuren ergaben,
daß unter den gewählten Bedingungen keine Retention von C 0 2 stattfand.
2 E. B r a n d , B. K a s s e 11 u. L. J. S a i d e 1, J.
clin. Invest. 23, 437 [1944].
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Für die Reaktion der Proteine mit Hypochlorit
ist die Einhaltung gleichmäßiger Versuchsbedingungen wichtig. Die Anwesenheit bestimmter
Konzentrationen von Neutralsalz beschleunigt den
Abbau 1 , und ebenso ist es nicht gleichgültig, ob
das Neutralsalz nach Abtrennung der Serumglobuline dürch Dialyse gegen aqua dest. oder
0,9-proz. NaCl entfernt wird. Die Gründe hierfür
müssen noch näher untersucht werden. Es ist
möglich, daß sie auf einer Änderung der räumlichen Anordnung der Peptidketten in den Sphäroproteinen beruhen, die den Ablauf der Reaktion
von Hypochlorit mit Proteinen vor allem dann
sehr stark beeinflussen könnte, wenn durch Strekkung der Peptidketten basische Gruppen frei
würden 3. Bei Versuchen mit Monobenzoylargininamid hat sich nämlich gezeigt, daß die Spaltung
der CO-NH.,-Bindung durch die Reaktion von
Hypochlorit mit den freien basischen Gruppen im
Guanidinanteil dieser Aminosäure beschleunigt
wird. In den angeführten Versuchen wurde das
zur Fällung der Globuline benutzte Neutralsalz
durch Dialyse gegen 0,9-proz. NaCl-Lösung bei 0 °
in einem Schaukeldialysator entfernt. Folgende
Ergebnisse wurden erhalten:
Serumalbumin
200 y N
NaOCl
in mg
1. Normal
2. Normal
Normal
3. Normal
4. Normal
5. Normal . • . . .
Normal
6. Chron.Hungerödem .
7. Chron. Hungerödem .
8. Lipophile Dystrophie
9. Chron. Nephritis . .
10. Chron. Nephritis . .
11. Lipoidnephrose . .
7,5
7,5
3,7
3,7
7,5
3,7
1,8
7,5
7,5
3,7
7,5
3,7
3,7
C0 2
N2
in mm 3 in mm3
141
146
112
126
102
108
24
24
16
72
123
120
88
20
20
15
35
27
32
20
1
3
9
29
21
110
Tab. 1. Einwirkung von Hypochlorit auf verschiedene
Serumalbumine. Versuchszeit bei 1—10 90 Min., bei 11
60 Minuten.
Bei der Einwirkung von Hypochlorit auf normales Serumalbumin sind zwischen den Mengen
7,5 und 3,7 mg auf 200 y Protein N keine Unterschiede zu erkennen. Erst bei 1.8 mg ist die CO„Entwicklung stark vermindert. Die bei den chronischen Hungerödemen und der von H. \Y. B a n s i 4
Vgl. G. A. B a 1 1 o u , P. D. B o v e r , J. M. L u c k
u. F. (1. L i n n , -7. clin. luvest. 23. 454 11944].
3
Puffer
Serumalbumin 200} N
Serumalbumin 200 -N
Harnalbumin 200) N
Harnalbumin 200; N
Phosphatpuffer
PH 6,3
Bernsteinsäureboratp.^jj 4,6
Phosphatpuffer
pR 6,3
Bernsteinsäureboratp.^u 4,6
C0 2
N2
in mm 3 in mm 3
33
110
63
103
58
139
57
134
Tab. 2. Einwirkung von Hypochlorit auf Serum- und
Harnalbumin bei Lipoidnephrose. Angewandt 1,8 mg
NaOCl während 10 Minuten.
Serumalbumin
200 y N
Puffer
1. Normal
.
.
.
Normal
.
.
.
2. Chron. Nephritis
3. Lipoidnephrose
Bernsteinsäureboratp.
4,6
Phosphatpuffer
p R 6,3
Bernsteinsäureboratp.
4,6
Bernsteinsäureboratp. j9 h 4,6
C0 2
: N»
in mm 3 in mm3
2
0
1,5
0
o
0
13,5
134
Tab. 3. Einwirkung sehr geringer Hypochloritmengen
(2 cm3 10-proz. Lösung von Chloramin T ) während
20 Minuten.
beschriebenen sogenannten lipophilen Dystrophie
gegenüber Normalen gefundenen Differenzen sind
so erheblich, daß sie nicht auf etwa wechselnde
Anteile Albumin/Pseudoglobulin in der untersuchten Fraktion zurückgeführt werden können,
sondern nur durch qualitative Veränderungen zu
erklären sind. Diese Befunde stützen frühere, mit
anderer Methode gewonnene Ergebnisse 5 . Wegen
der auffallenden Reaktion des Serumalbumins
bei der Lipoidnephrose, die ja schon häufig Anlaß zu Untersuchungen über Strukturveränderungen der verschiedenen Serumproteinkomponenten
gegeben hat, haben wir weitere Versuche mit geringen Mengen Hypochlorit unter Variation der
Versuchsbedingungen durchgeführt, wobei zum
Vergleich auch der Abbau des mit dem Harn ausgeschiedenen Proteins geprüft wurde.
1.8 mg ergeben mit 200 y Serumalbumin N der
Lipoidnephrose einen wesentlich stärkeren Abbau als mit dem unter gleichen Bedingungen geIL W. B a n s i , Med. Kl in. 1 9 4 7 . 317.
H. H e r k e n
u. II. R e m m e r , Klin. Wschr.
1 9 4 7 . 211. 469.
4
5
wonnenen Normalserumprotein. Zwischen Harnund Serumalbumin bestehen keine erheblichen
Differenzen. Das Albumin der Lipoidnephrose ist
ein besonders leicht spaltbares Protein, wie der
folgende Versuch mit p-Toluolsulfonchlorid-Natrium zeigt, das bekanntlich in wäßriger Lösung
Hypochlorit entwickelt. Diese Hypochloritmengen
sind offenbar sehr gering, denn bei der Reaktion
mit dem gleichen Eiweißanteil von Gesunden und
auch von Patienten mit chron. Nephritis läßt sich
keine C 0 o - oder N 2 -Entwicklung nachweisen.
Wie sich der Abbau der Proteine im einzelnen
vollzieht, muß noch näher untersucht werden.
Doch hat schon D a k i n " darauf hingewiesen,
daß bei der Einwirkung von Chloramin T auf
Aminosäuren intermediär verschiedene Reaktionsprodukte entstehen können. Die vorliegenden Ergebnisse sprechen dafür, daß bei manchen Erkrankungen Proteine vorkommen, die gegenüber
Hypochlorit resistenter sind als normale und
solche, die wesentlich leichter zerstört werden. Die
Ursachen für dieses verschiedene Verhalten sind
noch nicht klar. Wahrscheinlich können sie in
strukturellen Veränderungen der Proteine gesucht
werden.
» H. D. D a k i n , Biochemie. J. 11, 79 [1917].
Tri- und Tetrazoliumsalze als Reduktionsindikatoren bei Meerestieren
in verschiedenen Entwicklungsstadien
V o n
H A N S - J O A C H I M BIELIG u n d
HANS
QUERNER
Aus dem Kaiser-Wilhelm-Institut für medizinische Forschung Heidelberg, Institut für
Chemie, und dem Zoologischen Institut der Universität Heidelberg
(Z. Naturforschg. 4b, 21—23 [1049]; eingegangen am 7. März 1949)
ach K u h n und J e r c h e 1 1 reduzieren Bakterien, Hefen, keimende Samen, Keimpflanzen und die Wurzelspitzen von Kressepflanzen
farblose Tetrazoliumsalze vom Typ I—III zu
roten Formazanen. Die elektive Rotfärbung durch
Triphenylformazan (I) bei Embryonen verschiedener Pflanzensamen bildet nach L a k o n 2 die
Grundlage eines von der „Keimreife" des Samens
unabhängigen Keimfähigkeitsnachw^eises. Rötung
mit 5 - Furfuryl - 2.3 - diphenyl - tetrazoliumchlorid
geben u. a. auch der Liquor des Stierspermas sowie Chalazen und Blastoderm des Hühnereies 3 .
Der Test wurde ferner auf normales und neoplastisches menschliches Gewebe angewandt 4 . In
Coli- und Typhusbakterien findet man das Formazan an spezifischen „Reduktionsorten", die Gebiete hoher Nucleinsäure-Konzentration (Nucleoide) einschließen und der Einwirkung von
Bakteriophagen Widerstand leisten5.
N
1 R. K u h n
u. D. J e r c h e 1, Ber. dtsch. ehem.
Ges. 74, 949 [1941]. — D. J e r c h e l , Naturforschg.
u. Medizin in Deutschland 1939—1946, Bd. 39, S. 59,
Wiesbaden 1947.
2 G. L a k o n ,
Ber. dtsch. bot. Ges. 60, 299, 343
[1942]. — R. H. P o r t e r , M. D u r r e l l u. H. J.
Romm,
Plant Physiol. 22, 149 [1947]. — H. J.
C o 11 r e 1 1, Nature [London] 159, 748 [1947], — T. D.
W a u g h , Science [New Y o r k ] 108, 275 [1948].
3 A. M. M a t t s o n ,
C. 0 . J e n s e n u. R. A.
D u t c l i e r , Science [New Y o r k ] 106, 294 [1947].
Unsere Untersuchungen an der Biologischen
Anstalt Helgoland (z. Zt. List/Sylt) haben jetzt
ergeben, daß sich Tri- und Tetrazoliumsalze auch
bei Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien
als Reduktionsindikatoren bewähren. Die Triazoliumsalze (vgl. V I ) wurden von L u d o 1 p h y 8
dargestellt. Sie werden von keimfähigen Pflanzensamen zu roten Amino-azokörpern der Naphthalinreihe reduziert. Geprüft wunde die Einwirkung
der folgenden Substanzen auf einige Arten von
Echinodermen, Mollusken, Anneliden, Coelenteraten, Crustaceen und Protozoen: 2.3.5-Triphenyltetrazoliumchlorid(I), 5-Methyl-2.3-diphenyl-tetrazoliumchlorid (II), 5 - Äthyl - 2.3 - diphenyl - tetrazoliumchlorid (III), 5.5' -Dimethyl-3.3' -diphenyl2.2' -di -p-diphenylen-ditetrazoliumchlorid (IV) 6 ,
2.2' - Diphenyl - 3.3' - bis - (4 - carbaethoxy - phenyl) 5.5'-p-phenyl-ditetrazoliumchlorid ( V ) 7 und 1 Phenyl -2-(p-carboxyphenyl)-(naphtho -1'.2': 4.5 triazolium)-chlorid ( V I ) 6 . Soweit die in Meerwasser (p H
—8,4) gelösten Substanzen bei den
4 F. H. S t r a u s , N. D. C h e r o n i s u. E. St r a u s ,
Science [New Y o r k ] 108, 113 [1948].
5 H.-J. B i e 1 i g , G. A . K a u s c h e
u. H. H a a r d i c k , Z. Naturforschg. 4b, im Druck [1949],
ü E. L u d o l p h y , Diplomarbeit Univ. Heidelberg
1947.
7 D. J e r c h e 1 u.
II. F i s c h e r , Liebigs Ann.
Chem., im Druck [1949].