Interleukin-2 Produktion neonataler T

Aus der Klinik für Kinder und Jugendmedizin
am St. Josef Hospital-Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Christian Rieger
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach
Stimulation mit Staphylococcus aureus in
Abhängigkeit vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Susanne Grinzinger
aus Freiburg im Breisgau
2004
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. U. Schauer
Korreferentin:
Prof. Dr. med. C. Szliska
Tag der mündlichen Prüfung: 07.02.2006
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG .......................................................................................................1
1.1 Einführung zur atopischen Dermatitis ...........................................................1
1.2 Besiedlung der Haut mit Staphylococcus aureus bei AD..............................2
1.3 Immunmodulation durch bakterielle Stimuli ..................................................3
1.4 Die Zellwand grampositiver Bakterien...........................................................5
1.5 Immunpathologie der atopischen Dermatitis.................................................7
1.6 Einfluss von IL-2 auf T-Zellproliferation und Differenzierung ........................8
1.7 Fragestellungen ..........................................................................................10
2 PROBANDEN, MATERIAL UND METHODEN..................................................11
2.1 Einleitung ....................................................................................................11
2.2 Probanden ..................................................................................................11
2.3 Diagnosekriterien ........................................................................................13
2.4 Isolierung der CBMCs (Cord Blood Mononuclear Cells)............................14
2.5 Nachstimulation der Zellen .........................................................................15
2.6 Fixierung der Zellen ....................................................................................15
2.7 Färbung der Zellen......................................................................................15
2.8 Durchflusszytometrische Messung .............................................................16
2.9 Statistik .......................................................................................................17
2.10 Herstellernachweis....................................................................................18
3 ERGEBNISSE....................................................................................................20
3.1 Die IL-2 Synthese ist im Nabelschnurblut bei Kindern mit AD nach
SAC Stimulation signifikant vermindert ....................................................20
3.2 Die IL-2 Produktion CD45R0+ Nabelschnurblutzellen ist bei Kindern
mit AD nicht signifikant vermindert ...........................................................21
3.3 Der Anteil CD45R0+ Nabelschnurblutzellen ist nach SAC-Stimulation
bei Kindern mit AD nicht signifikant vermindert ........................................22
3.4 Die IL-2 Synthese nach SAC-Stimulation ist im 6.Lebensmonat
bei Kindern mit AD nicht signifikant vermindert ........................................23
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
I
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
3.5 Der Anteil CD45R0+ Zellen nach SAC-Stimulation ist im
6. Lebensmonat in der AD-Gruppe nicht signifikant vermindert .............24
4 DISKUSSION.....................................................................................................25
4.1 Die IL-2 Synthese naiver T-Zellen ist nach Stimulation mit SAC
bei Kindern mit AD zum Zeitpunkt der Geburt vermindert .......................25
4.2 IL-2 bewirkt Proliferation und Differenzierung
antigenspezifischer naiver T-Zellen..........................................................26
4.3 Der Anteil IL-2 produzierender memory T- Zellen ist bei Kindern,
die eine AD entwickeln zum Zeitpunkt der Geburt nicht
signifikant beeinträchtigt ...........................................................................29
4.4 Immunpathologie der AD..........................................................................30
4.5
Wechselwirkungen zwischen S. aureus und dem Immunsystem bei AD 32
4.6 Faktoren, welche die Hautbesiedlung mit S. aureus
bei der AD begünstigen ............................................................................33
4.7 Immunmodulatorische Wirkungen von SAC.............................................34
4.8 Die Verknüpfung unspezifischer und spezifischer Abwehrmechanismen
ist für die Aktivierung naiver T-Zellen erforderlich ...................................36
4.9 T-Zellvermittelte Immunität des Neugeborenen .......................................37
4.10 Nach 6 Monaten ist die IL-2 Synthese nach Stimulation mit SAC
bei Kindern mit AD nicht mehr vermindert..............................................40
4.11 Die T-Zellausreifung nach Stimulation mit SAC ist bei Kindern mit AD
im 6.Lebensmonat normal........................................................................40
4.12 Faktoren, welche die Proliferation der T-Zellen bei der AD beeinflussen.41
4.13 Schlussfolgerungen..................................................................................42
5 ZUSAMMENFASSUNG .....................................................................................43
6 LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................46
7 ANHANG............................................................................................................64
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II
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
I.
Abkürzungsverzeichnis
AD
Atopische Dermatitis
APC
Antigenpräsentierende Zelle (Antigen presenting cell)
CBMC
Mononukleäre Nabelschnurblutzellen (Cord blood mononuclear cells)
CD
Differenzierungscluster (Cluster of differentiation)
Fab
Antigenbindendes Fragment
Fc
Kristallisierbares Fragment (Fragment crystallizable)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
GM-CSF
Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor
HBD
Humanes-Beta-Defensin
IFN-γ
Interferon-gamma
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
LPS, LPB Lipopolysaccharid Lipopolysaccharidbindendes Protein
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (Major Histocompatibility Complex)
MyD88
Myeloid Differentiation Antigen 88
NF- -B
Nukleärer Faktor kappa B
NK
Natürliche Killerzelle
PE
Phycoerythrin
PGN
Peptidoglykan
PHA
Phytohämagglutinin
PMA
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
SAC
Staphylococcus aureus Cowan 1
SEA (B)
Staphylokokkenenterotoxin A (B)
(L)TA
(Lipo-) Teichonsäure ((Lipo-)teichoic acid))
TGF-
Tumor-growth-factor-beta
TH
T-Helfer
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF-α
Tumornekrosefaktor-alpha
TSST
Toxic-shock-syndrome-toxin
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III
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
1 Einleitung
1.1 Einführung zur atopischen Dermatitis
Die Zunahme von Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis wie der allergischen Rhinokonjunktivitis, dem allergischen Asthma bronchiale und der atopischen Dermatitis (AD) stellt ein wachsendes Gesundheitsproblem in der Bevölkerung der Industrienationen dar. In Schweden ließ sich beispielsweise eine Verdoppelung der Prävalenz dieser Erkrankungen innerhalb von 1979 und 1991 dokumentieren [3]. Aktuell liegt die Prävalenz der AD in Deutschland bis zum Schulanfang bei 8-16%, weltweit in den am stärksten betroffenen Ländern wie in Großbritannien sogar bei bis zu 20% [30, 33, 61, 140, 143]. Da sich die Erkrankung
durch Knochenmarkstransplantation übertragen lässt, ist davon auszugehen, dass
der zugrunde liegende Defekt bereits im Bereich der hämatopoetischen Stammzellen liegt [8]. Ein weiterer Hinweis in diese Richtung sind einige primäre Tzellabhängige Immundefekte, die mit einer der AD sehr ähnlichen Ekzemreaktion
der Haut assoziiert sind, wie zum Beispiel das Wiskott-Aldrich-Syndrom [118]. Der
rasche Zuwachs atopischer Erkrankungen schließt jedoch rein genetische Mechanismen als alleinige Ursache aus und wirft die Frage nach relevanten Umweltfaktoren auf. In den letzten Jahren hat sich zunehmend die Hygiene-Hypothese etabliert, welche die Zunahme atopischer Erkrankungen auf die reduzierte bakterielle Exposition im Kindesalter, vor allem in den am stärksten betroffenen westlichen Industrienationen, zurückführt [47, 75, 145].
Die atopische Dermatitis beginnt bei etwa 60% der betroffenen Individuen während des 1. Lebensjahres, zusätzliche 30% erkranken bis zum 5. Lebensjahr. Etwa die Hälfte der Patienten mit AD entwickelt in der späteren Kindheit Asthma, bei
bis zu zwei Drittel der Betroffenen tritt eine allergische Rhinokonjunktivitis auf, bei
vielen ist dabei die AD rückläufig [41, 43, 127].
Klinisch imponiert die AD als chronisch rezidivierende von starkem Juckreiz begleitete ekzematöse Hauterkrankung, bakterielle Infektionen komplizieren häufig
den Verlauf. Obgleich jede Körperregion betroffen sein kann findet sich häufig ein
typisches Verteilungsmuster der Ekzeme in Abhängigkeit vom Alter [43].
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Die Prognose der Erkrankung hängt von verschiedenen Faktoren ab, Patienten
mit mehreren atopischen Familienmitgliedern, assoziiertem Asthma bronchiale
oder allergischer Rhinitis, mit frühem Beginn der Ekzeme und trockener Haut
tendieren zu einem ungünstigeren Krankheitsverlauf [98, 115].
Die Therapie beinhaltet vor allem Allgemeinmaßnahmen wie eine optimale Pflege
der Haut, die Evaluierung und Vermeidung von Exazerbationsfaktoren sowie eine
individuelle symptomorientierte Therapie. Glukokortikoide sind seit vielen Jahren
das Mittel der Wahl zur Behandlung der inflammatorischen Hautreaktionen. Neuere topische nicht-steroidale Immunmodulatoren wie Tacrolimus werden seit einiger Zeit erfolgreich eingesetzt [13]. In einigen schweren Fällen kann eine systemische immunsuppressive Therapie entweder in Form einer Stoßtherapie mit Steroiden oder mit Cyclosporin indiziert sein.In den Leitlinien der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft und des Berufsverbandes Deutscher Dermatologen werden die aktuellen und anerkannten Behandlungsstrategien alle 2 Jahre aktualisiert, um eine optimale Qualität der Therapie zu gewährleisten [29]. Trotz der zahlreichen zur Verfügung stehenden Therapieoptionen bedeutet die Erkrankung jedoch für die Betroffenen als auch deren Angehörige häufig eine Beeinträchtigung
der Lebensqualität [17]. Die Erkenntnisse über die der AD zugrunde liegenden
Pathomechanismen konnten in den letzten Jahren deutlich erweitert werden und
bieten damit Ansatzpunkte für die weitere Entwicklung spezifischer Therapiemaßnahmen.
1.2 Besiedlung der Haut mit Staphylococcus aureus bei AD
Bei über 90% der Patienten mit AD ist Staphylococcus aureus der dominierende
Keim der Hautflora, auch auf klinisch unauffälliger Haut beträgt sein Anteil an der
gesamten aeroben bakteriellen Population 30-80% [45, 89]. Darüber hinaus korreliert die Besiedlung der Haut mit S. aureus mit dem Schweregrad der AD [37, 48,
147]. Bei Normalpersonen hingegen besiedelt S. aureus die Haut selten chronisch, sein Anteil beträgt weniger als 5% der aeroben isolierten Hautflora [89].
Die chronische Kolonisation der Haut mit S. aureus bei AD wurde bis vor einigen
Jahren als ein unspezifisches Epiphänomen der Erkrankung angesehen. Zunehmende Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen S. aureus und dem
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Immunsystem von Patienten mit AD weisen jedoch darauf hin, dass Staphylokokkenbestandteile an der Entstehung und Aufrechterhaltung der inflammatorischen
Hautreaktionen bei der AD beteiligt sind. Hierfür spricht auch die klinische Beobachtung, dass eine antibiotische Therapie die entzündlichen Hautreaktionen
günstig beeinflusst [2, 14].
Einige Besonderheiten der Haut von AD Patienten begünstigen die Besiedlung mit
S. aureus. Die Keratinozyten exprimieren vermehrt Fibronektin, an das sich die
Teichonsäure und das fibronektinbindende Protein der Staphylokokkenober-fläche
binden können [53, 18]. Eine erste Barriere der unspezifischen Abwehr gegen infektiöse Erreger bilden endogene antimikrobielle Peptide wie Beta-Defensine
(HBD) und Cathelicidine, die von Keratinozyten gebildet werden und eine stark
zytotoxische Wirkung auf S. aureus haben. Bei Patienten mit AD ließ sich in chronischen und akuten Ekzemherden eine verminderte Expression dieser Peptide
nachweisen. Eine Ursache scheinen die in atopischen Läsionen nachweisbaren
TH2 Zytokine zu sein, da sie die Synthese dieser antimikrobiellen Peptide inhibieren können [91, 94].
1.3 Immunmodulation durch bakterielle Stimuli
Durch eine bakterielle Infektion werden zunächst unspezifische Abwehrmechanismen aktiviert, die eine unkontrollierte Ausbreitung des Erregers verhindern sollen, während die spezifische Immunantwort vorbereitet wird. Makrophagen sowie
das Komplementsystem können durch Erregerbestandteile direkt aktiviert werden.
In Makrophagen führt dies zu einer Freisetzung inflammatorischer Zytokine, wie
unter anderem IL-1, TNF-α, IL-6 und anderer Mediatoren, die in einer lokalen
Entzündungsreaktion resultiert. Neben lokalen Effekten werden systemische Reaktionen, wie eine Erhöhung der Körpertemperatur ausgelöst. Die von aktivierten
Makrophagen sezernierten Zytokine IL-1, TNF-α und IL-6 führen in der Leber zu
einer verstärkten Produktion und Freisetzung von Proteinen der akuten Phase,
diese binden an bakterielle Oberflächenmoleküle und können so weitere Phagocyten und das Komplementsystem aktivieren [51].
Seit langem sind ubiquitär vorkommende Bakterienbestandteile bekannt, die eine
unspezifische Immunantwort auslösen und auch die Art der spezifischen AbDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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wehrmechanismen beeinflussen. Die Lipopolysaccharide (LPS) in der Membran
gramnegativer Bakterien binden sich beispielsweise im Serum an lipoproteinbindendes Protein (LBP) und führen CD14 abhängig zu einer Monozytenstimulation
[135]. Peptidoglykane und Teichonsäuren, die sich in großer Menge in der Zellwand grampositiver Bakterien finden, sind starke Immunstimulatoren, ebenso wie
Staphylokokkenenterotoxine, die antigenunspezifisch zu einer oligoklonalen TZellaktivierung führen können. Gemeinsam ist diesen Bakterienderivaten, dass sie
bei einer überschießenden Immunreaktion ein septisches Zustandsbild mit Multiorganversagen und disseminierter intravasaler Gerinnung hervorrufen können [26,
64].
Erst in den letzten Jahren ließen sich zunehmende Erkenntnisse über die Stimulationsmechanismen der angeborenen Immunabwehr und die damit verbundene
Aktivierung adaptiver Immunantworten gewinnen. Im Mittelpunkt dieser Erkenntnisse steht die Identifizierung der evolutionsgeschichtlich sehr alten Toll-like Rezeptoren (TLR) auf Makrophagen, Granulozyten und dendritischen Zellen, die
zahlreiche bakterielle Bestandteile erkennen können und angeborene Abwehrmechanismen aktivieren. Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane binden an den Tolllike Rezeptor TLR2. TLR4 dagegen wird durch LPS sowie zahlreiche sehr unterschiedliche Moleküle einschließlich mikrobieller, synthetischer und auch endogener Substanzen stimuliert [46, 121, 146].
Die Effizienz einer spezifischen Immunantwort auf mikrobielle Erreger (die TLRLiganden enthalten) hängt wesentlich vom Vorhandensein intakter Toll-like Rezeptoren ab. Bindeglied zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem
stellen hier die dendritischen Zellen dar, die über TLRs zur Expression von MHC
Molekülen und costimulierenden Signalen aktiviert werden und naive T-Zellen stimulieren. Im murinen Modell ließ sich zeigen, dass die Inaktivierung der TLRs
Proliferation und IFN- Produktion der T-Zellen sowie die Entstehung antigenspezifischer Antikörper nach bakterieller Stimulation inhibiert. Interessanterweise fand
sich hier zugleich ein TH2 dominantes Zytokinsekretionsmuster [25, 46]. Dieses
Zytokinsekretionsmuster spielt eine zentrale Rolle in der Pathogenese atopischer
Erkrankungen.
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Das Ausmaß sowie die Art einer Immunreaktion auf Pathogene wird darüber hinaus durch regulatorische T-Zellen beeinflusst, deren Rolle im Rahmen der Infekttoleranz in den letzten Jahren zunehmend diskutiert wird. Es handelt sich hierbei
um eine heterogene Gruppe CD4+ T-Zellen, die entweder über kontaktabhängige
Mechanismen oder die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 oder
TGF-
Suppressoraktivitäten ausüben. So produzieren TH3 Zellen überwiegend
TGF- , während Tr1-Zellen in erster Linie IL-10 synthetisieren. Eine weitere
Gruppe regulatorischer T-Zellen, die CD4+CD25+ T-Zellen üben ihre Aktivität über
kontaktabhängige Mechanismen aus. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei
der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz. Darüber hinaus besitzen sie die Fähigkeit Supressoraktivität auf CD25-CD4+ Zellen zu übertragen, ein Mechanismus,
welcher der Infekttoleranz zugrunde liegt. Eine Aufgabe dieser Zellen scheint die
Balance zwischen Erregerelimination und gewebsschädigender inflammatorischer
Wirtsreaktion zu sein. Andererseits besitzen einige Erreger die Fähigkeit dieses
Gleichgewicht zuungunsten des Wirtes zu verschieben, indem sie selektiv regulatorische T-Zellen aktivieren und die Ausbildung einer protektiven Immunreaktion
verhindern [6, 55, 81].
1.4 Die Zellwand grampositiver Bakterien
Die Zellwand von S. aureus setzt sich aus den drei Hauptkomponenten Peptidoglykan (50%), Teichonsäuren (40%) und Protein A (5%) zusammen (Abb. 1).
Peptidoglykane oder Murein, die nur bei Bakterien vorkommen, bestehen aus Polymeren von Aminozuckern und einer kleinen Gruppe von Aminosäuren, welche
die sich wiederholende Einheit, das Glykantetrapeptid, bilden. Peptidbindungen,
entweder direkt zwischen den Aminosäureresten oder wie bei S. aureus über zusätzliche Peptidbrücken, führen zur Ausbildung eine Netzwerkes, welches die
Festigkeit der Zellwand gewährt. Während die Zellwand gramnegativer Bakterien
nur zu etwa 10% aus Peptidoglykanen besteht, stellen diese bei den grampositiven Erregern mit bis zu 90% eine Hauptkomponente der Zellwand dar. Teichonsäuren sind saure Polysaccharide, die sich häufig in der Zellwand grampositiver
Bakterien finden, einige glycerolhaltige Teichonsäuren sind mit den Lipidmolekülen der Zellmembran assoziiert und tragen daher den Namen Lipoteichonsäuren.
Über 90% der Stämme von S. aureus tragen auf ihrer Oberfläche das sogenannte
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Protein A, dessen größter Teil kovalent mit der Peptidoglykanschicht verbunden
ist, ein kleiner Teil wird in das umgebende Milieu abgegeben [72, 87, 88, 136].
(a)
Teichonsäure
(b)
Protein A
Lipoteichonsäure
Glu
Mur
Glu
Mur
Peptidbindung
-NH-CO-
Peptidoglykan
Mur
Zytoplasmamembran
Glu
Mur
Glu
-Glykantetrapeptid
Abbildung 1: (a) Struktur der Zellwand grampositiver Bakterien; (b) schematische Darstellung der Peptidoglykanschicht, N-Acetylmuraminsäure (Mur) und N-Acetylglucosamin
(Glu) alternieren innerhalb der Polysaccharidketten, die durch Peptidseitenketten miteinander vernetzt werden.
Aminosäuren.
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1.5 Immunpathologie der atopischen Dermatitis
Häufig sind allergische Erkrankungen assoziiert mit einer Eosinophilie und hohen
Serumkonzentrationen von allergenspezifischem IgE. Klassische allergische Typ I
Reaktionen werden durch die Bindung eines Allergens an spezifische IgE Antikörper ausgelöst, indem IgE-Rezeptor tragende Zellen, wie Mastzellen, Basophile
und aktivierte eosinophile Granulozyten, durch Freisetzung von Entzündungsmediatoren zur Ausbildung der allergietypischen klinischen Symptome führen. Die
Frage nach den Mechanismen, die diese übermäßige IgE Produktion begünstigen, steht im Vordergrund für das Verständnis der Pathogenese atopischer Erkrankungen.
Der erste Kontakt mit einem Allergen führt in B-Zellen zur Synthese von IgMAntikörpern, im Verlauf erfolgt durch zusätzliche Signale wie IL-4 der Isotypenwechsel nach IgE. Diese zusätzlichen Signale, welche die Art des Isotypenwechsels beeinflussen stammen von T-Helferzellen [114, 129]. T-Helferzellen lassen
sich nach dem ursprünglich von Mosmann et al. 1986 im murinen System entwickelten Konzept anhand ihrer Zytokinsekretionsmuster in funktionell unterschiedliche Subpopulationen einteilen: TH1-Zellen produzieren Zytokine, die in erster Linie eine zelluläre Immunantwort vermitteln, während TH2-Zellen zur Ausbildung
einer vorwiegend humoralen Immunantwort führen. Das TH1/TH2 Gleichgewicht
unterliegt hierbei einer strengen reziproken Regulation durch die von diesen Zellen produzierten Zytokine. TH1-Zellen sezernieren IFN-γ, während TH2-Zellen IL4, IL-5, IL-9 und IL-13 produzieren. TH2 Zellen proliferieren in der Gegenwart von
IL-4 und stimulieren die IgE Synthese, während sie negativ regulierend auf TH1
Zellen wirken. IFN-γ hingegen stimuliert TH1-Zellen und ist der wichtigste Antagonist der IL-4 vermittelten IgE Synthese [70, 84, 130]. Obgleich sich eine so strikte
Trennung zwischen TH1 und TH2-Zellen beim Menschen nicht findet, zeigt sich
im Rahmen atopischer Erkrankungen eine Polarisierung in Richtung eines TH2
dominanten Zytokinsekretionsmusters. Diese Dysregulation zugunsten der TH2
Zellen ist ein entscheidender Faktor in der Genese atopischer Erkrankungen [62,
78, 99, 100].
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Das klinische und histologische Bild der AD entspricht jedoch eher einer Typ IV
Immunreaktion, wie beispielsweise dem allergischen Kontaktekzem, als einer IgE
vermittelten Typ I Immunreaktion. Tatsächlich lässt sich in chronischen Ekzemherden vermehrt das TH1 Zytokin IFN-γ nachweisen, während in akuten ekzematösen Hautveränderungen vor allem die IL-4 Menge erhöht ist. Diese Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass die Initiierung der entzündlichen Hautveränderungen durch TH2 Zellen vermittelt wird, in situ kommt es im Verlauf zu einer
TH1 Aktivierung, welche die Entzündungsreaktion perpetuiert [39, 49].
Zunehmende Erkenntnisse über regulatorische T-Zellen, die insbesondere entscheidend für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz sind weisen darauf hin,
dass diese Zellen auch im Kontext atopischer Erkrankungen wichtige Kontrollfunktionen ausüben. Ein Fehlen CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen, wie es sich
eindrucksvoll beim XLAAD (X-linked autoimmunity-allergy dysregulation) Syndrom
zeigt, resultiert in aggressiven Autoimmunreaktionen sowie allergischen Reaktionsmustern einschließlich eines Ekzems, einer Eosinophilie sowie hohen IgE Serumspiegeln [55, 137]. Die Isolierung regulatorischer T-Zellen aus der Haut sowie
der Nachweis der Expression spezifischer Oberflächenmarker, der diesen Zellen
ermöglicht in die Haut zu gelangen legt eine funktionelle Rolle auf der Haut nahe
sowie eine Beteiligung in der Pathogenese zahlreicher Hauterkrankungen [10].
1.6 Einfluss von IL-2 auf T-Zellproliferation und Differenzierung
IL-2 ist ein zentraler Faktor in der Regulation der T-Zellfunktion. Es wird primär
von aktivierten T-Helferzellen und einigen zytotoxischen T-Zellen produziert [34,
133]. Die Aktivierung durch bestimmte Mitogene oder die Interaktion zwischen TZellrezeptor und Antigen/MHC Komplexen auf antigenpräsentierenden Zellen resultiert in einer Expressionsinduktion für IL-2 und IL-2 Rezeptoren, die zu einer
klonalen Expansion antigenspezifischer T-Zellen führt. Aufgrund dieser autokrinen
Eigenschaften wurde zunächst der Begriff „T-cell growth factor" für IL-2 geprägt,
inzwischen weiß man jedoch, dass IL-2 auch die Reifung von T-Zellen bewirkt und
andere Zellen des Immunsystems stimulieren kann. Natürliche Killerzellen (NK)
werden durch IL-2 aktiviert und zur Proliferation angeregt, Wachstum und Differenzierung von B-Zellen werden gefördert [65, 95]. Im Nabelschnurblut sind die
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überwiegend in ihrer naiven Form vorliegenden T-Zellen die Hauptproduzenten
von IL-2. Erst nach klonaler Proliferation differenzieren diese naiven T-Zellen zu
Effektorzellen aus. Die Antigenerkennung allein durch den T-Zellrezeptor führt
nicht zur IL-2 Synthese in naiven T-Zellen. Dafür ist mindestens ein costimulierendes Signal erforderlich, das von der antigenpräsentierenden Zelle dargeboten wird
[50]. IL-2 besitzt darüber hinaus eine wichtige Funktion im Rahmen der Selbsttoleranz. Mäuse, die kein IL-2 Gen oder keine IL-2 Rezeptoren besitzen, leiden an
einer letalen generalisierten Autoimmunerkrankung [116, 131].
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1.7 Fragestellungen
Die Entwicklung effektiver Therapieansätze und gezielter präventiver Maßnahmen
bei ansteigender Prävalenz der atopischen Dermatitis setzt ein eingehendes Verständnis der Pathogenese der Erkrankung voraus. Die meisten immunpathologischen Veränderungen bei der AD stellen T-zellabhängige Phänomene dar, darüber hinaus weisen die vielfältigen Wechselwirkungen zwischen S. aureus und
dem Immunsystem von Patienten mit AD darauf hin, dass dieser Keim einen pathogenetisch relevanten Faktor darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde in einer
prospektiven Studie die intrazelluläre Synthese von IL-2, bakteriell stimulierter Nabelschnurblutzellen, unter folgenden Fragestellungen untersucht:
1. Besteht bei Kindern, die eine AD entwickeln, zum Zeitpunkt der Geburt eine
veränderte Stimulierbarkeit der IL-2 Synthese durch Staphylokokkenwandbestandteile ?
2. Unterscheiden sich naive und memory T-Zellen bezüglich ihrer Stimulierbarkeit
in Abhängigkeit vom Auftreten einer AD ?
3. Gibt es einen Unterschied bezüglich der Aktivierbarkeit der T-Zellen von Kindern mit AD im 6. Lebensmonat und zum Zeitpunkt der Geburt ?
4. Ist der Anteil ausdifferenzierter memory T-Zellen nach bakterieller Stimulation
zum Zeitpunkt der Geburt und nach 6 Monaten in Abhängigkeit vom Auftreten
einer AD verändert ?
5. Ergeben sich aus den Beobachtungen Hinweise auf die Ursachen einer vermehrten Besiedlung der Haut mit S. aureus bei AD und die Entstehung allergiefördernder Zytokinsekretionsmuster ?
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2 Probanden, Material und Methoden
2.1 Einleitung
Die Entnahme des für die Untersuchungen erforderlichen Nabelschnurblutes erfolgte nach Etablierung der Abnahmetechnik durch die Hebammen der jeweiligen
Geburtskliniken. Die Blutproben wurden innerhalb eines Zeitraumes von maximal
6 Stunden von der Antragsstellerin in das Labor der Universitätskinderklinik transferiert. Die Weiterverarbeitung der Blutproben wie in den Abschnitten 2.4-2.8 beschrieben erfolgte durch die Antragsstellerin. Die Untersuchung der Kinder nach
Ablauf von 6 Monaten wurde in Kooperation mit einem dermatologisch erfahrenen
Facharzt für Kinderheilkunde durchgeführt.
2.2 Probanden
Die Nabelschnurblutproben stammten von Kindern, die im St. Elisabeth-Hospital
und im Augusta Krankenhaus in Bochum geboren wurden. Die Eltern wurden in
einem Brief über das Anliegen und die Durchführung der Studie informiert, das
schriftliche Einverständnis zur Teilnahme wurde daraufhin im Rahmen einer Befragung eingeholt. Die Genehmigung der Studie durch die Ethikkommission des
Fachbereichs Humanmedizin der Ruhr-Universität lag vor.
Waren die Eltern zur Teilnahme bereit, wurden anhand eines Fragebogens folgende Daten ermittelt:
• Allergische Erkrankungen der Eltern
• Allergische Erkrankungen bei Verwandten 1. Grades der Eltern.
• Sonstige Krankheiten der Eltern
• Ernährungsgewohnheiten der Mutter während der Schwangerschaft
• Nikotinkonsum der Eltern
• Wohnverhältnisse der Familie
• Medikamente während der Schwangerschaft
• Schwangerschafskomplikationen
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• Schwangerschaftsdauer ,Geburtsmodus ,-komplikationen
• APGAR
• Geschlecht des Neugeborenen
• Geburtsgewicht und Größe
• Besonderheiten in der Neugeborenenperiode
Für die vollständige Teilnahme an der Studie war eine klinische Untersuchung der
Haut sowie eine Blutentnahme bei den Kindern im Alter von 6 Monaten erforderlich. Wie in Tabelle 1 aufgeführt lehnten von insgesamt 50 befragten Eltern 17 die
Teilnahme an der Studie ab, 33 willigten in die Untersuchung des Nabelschnurblutes und die Anamneseerhebung ein, 29 nahmen an der gesamten Studie teil. Das
Probandenkollektiv für die vollständige Untersuchung bestand aus 12 weiblichen
und 17 männlichen Neugeborenen. Das Alter der Mütter lag zwischen 18 und 38
Jahren, das der Väter zwischen 23 und 45 Jahren. Die Zahl der Geschwister
reichte von 0 bis 4. Bezüglich dieser Daten ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Probanden, die nicht, nur teilweise oder vollständig an
der Studie teilnahmen.
Tabelle 1: Probandenkollektiv. Anzahl der befragten Eltern, Geschlecht der Probanden,
Mittelwerte sowie Minimum und Maximum des Alters der Eltern und der Anzahl der Geschwister der Probanden, die in die Studie einwilligten/nicht einwilligten unter Angabe des
Signifikanzniveaus; n.s.: nicht signifikant.
Einwilligung für
Keine
Einwilligung
Nabelschnurblut- Vollständige
untersuchung
Untersuchung
Signifikanzniveau
Zahl
17
33
29
n.s.
Geschlecht w/m
10/7
15/18
12/17
n.s.
Alter der Mutter
(Jahre)
30
(20-37)
29
(19-38)
26
(18-38)
n.s.
Alter des Vaters
(Jahre)
32,5
(22-41)
31
(22-50)
28
(23-45)
n.s.
Geschwisterzahl
1
(0-3)
1
(0-4)
1
(0-4)
n.s.
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Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Nach 6 Monaten wurde bei 6 der 29 Probanden eine atopische Dermatitis diagnostiziert. Das Atopierisiko wurde beim Vorliegen atopischer Erkrankungen bei
beiden Eltern, bei 1 Elternteil und/oder 1 Geschwister oder bei unsicherer Elternanamnese als positiv bewertet. Es fanden sich keine signifikanten Unterschiede
in Bezug auf Atopierisiko, Gestationsalter, Geburtsgewicht, Alter der Eltern und
Geschwisterzahl zwischen den Kindern mit atopischer Dermatitis und der Kontrollgruppe (Tab. 2).
Tabelle 2: Gegenüberstellung der Probanden mit AD und der Kontrollgruppe. Anzahl der
Probanden, Atopierisiko, Mittelwerte sowie Minimum und Maximum von Gestationsalter,
Geburtsgewicht, Alter der Eltern und Geschwisterzahl unter Angabe des Signifikanzniveaus; n.s.: nicht signifikant.
Kontrolle
Atopische
Dermatitis
Signifikanzniveau
Zahl
23
6
Atopierisiko
(nein/ja)
6/17
3/3
n.s.
Gestationsalter
(SSW)
40
(37-42)
40
(37-43)
n.s.
Geburtsgewicht (g)
3490
(2820-4920)
3305
(2320-4000)
n.s.
Alter der Mutter
(Jahre)
28,0
(18-34)
28,5
(20-38)
n.s
Alter des Vaters
(Jahre)
29
(22-45)
31
(26-38)
n.s.
Geschwisterzahl
1
(0-3)
1
(0-4)
n.s.
2.3 Diagnosekriterien
Die Diagnosestellung der atopischen Dermatitis erfolgte nach Ablauf von 6 Monaten mit Hilfe der unten aufgeführten Diagnosekriterien von Seymour, die speziell
für Kinder unter 2 Jahren entwickelt wurden durch einen dermatologisch erfahrenen Facharzt für Kinderheilkunde [124].
Mindestens zwei der Haupt- oder ein Haupt- und ein Nebenkriterium aus der folgenden Liste sind für die Diagnosestellung einer AD erforderlich:
Hauptkriterien:
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•
Atopische Erkrankungen in der Familienanamnese (Asthma, Heuschnupfen,
Neurodermitis)
•
Nachweis entzündlicher Hautveränderungen mit Juckreiz
•
Typische Ekzeme im Gesicht oder an den Streckseiten der Gelenke oder lichenifizierte Ekzeme
Nebenkriterien:
•
Xerosis/ Ichthyosis/ Vertiefung der Handlinien
•
Periaurikuläre Fissuren
•
Perifollikuläre Betonung der Ekzeme
•
Milchschorf
2.4 Isolierung der CBMCs (Cord Blood Mononuclear Cells)
Das Nabelschnurblut wurde in sterilen 50 ml Röhrchen bei Raumtemperatur maximal 6 Stunden aufbewahrt. Die Röhrchen enthielten jeweils 10 ml eines gerinnungs- und keimhemmenden Transportpuffermediums aus folgenden Substanzen:
• Heparin-Natrium (Vetren) 100 I.E./ml
• Penicillin 100 I.E./ml /Streptomycin 100 µg/ml
• Amphotericin B 2,5 µg/ml gegen Pilz- und Hefekontamination
• HEPES-,HBSS-Puffer
Die Kultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen. Zunächst wurde das Blut im
Verhältnis 1:2 mit HBSS Puffer verdünnt, dann mit 15 ml Ficoll 1.077g/ml unterschichtet und anschließend für 20 min. mit 450 x g zentrifugiert. Die mononukleären Zellen der Interphase wurden vorsichtig abpipettiert und zweimal mit HBSS
mit 300 x g für 10 min. gewaschen. Nach Anfärbung der Zellen mit Türkscher Lösung erfolgte die mikrokopische Bestimmung der Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer und die Einstellung der Zellkonzentration auf 1x106 /ml Kulturmedium.
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Das Kulturmedium setzte sich zusammen aus: RPMI 1640 mit 10% FCS und 4%
Zusatzlösung aus:
• 1% Penicillin/Streptomycin
• 1% Glutamin
• 1% Natrium-Pyruvat
• 1% Nichtessentielle Aminosäuren
Jeweils 1ml der Zellsuspension wurde in eine 24-well Zellkulturplatte pipettiert und
10 l Pansorbin (Verdünnung 1:100 in RPMI) dazugegeben. Pro well lag anschließend eine Pansorbinkonzentration von 10ng/ml vor.
Die Kultivierung der Zellen fand für 7 Tage bei 37°C in einer 5% CO2 -haltigen
Atmosphäre im Brutschrank statt.
2.5 Nachstimulation der Zellen
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit folgenden Substanzen
nachstimuliert :
• PMA
10ng/ml
• Ionomycin 1 µM
• Monensin 2.5 µM
Die Ansätze wurden daraufhin für 5h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
2.6 Fixierung der Zellen
Die geernteten Zellen wurden jeweils in 10 ml Röhrchen überführt und für 10 Minuten bei 300 x g gewaschen. Zur Fixierung erfolgte die Aufnahme der Zellen für
10 Minuten in 1 ml 4%iges Paraformaldehyd. Das Paraformaldehyd wurde anschließend gründlich mit HBSS Puffer ausgewaschen.
2.7 Färbung der Zellen
Für die durchflusszytometrische Analyse der Zellen erfolgte die Färbung der Oberflächenantigene mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern. Die AntiDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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körper waren direkt an die Fluoreszenzfarbstoffe PE oder FITC gekoppelt. Die
Bestimmung des intrazellulären IL-2 erfolgte nach der von Jung et al. entwickelten
Methode ebenfalls durchflusszytometrisch nach Kopplung von Anti-IL-2-biotin an
Streptavidin-FITC [58].
Nach Aufnahme der Zellen in Saponinpuffer zur Zellpermeabilisierung wurden
folgende Antikörper in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen zu den
Ansätzen gegeben:
1. IL-2-bio-Strept-FITC+CD45R0-PE+CD3-tricolor
2. IgG1-KO-bio-Strept-FITC+CD45R0-PE+CD3-tricolor
Die Proben wurden für 20 min. bei 4°C inkubiert und der Antikörperüberschuss
anschließend mit 1 ml Saponin für 5 min. bei 300 x g ausgewaschen. Für die
Messung wurden die Zellen in 200 l HBSS aufgenommen.
2.8 Durchflusszytometrische Messung
Die Durchflusszytometrie dient der Analyse von Einzelzellen auf der Grundlage
von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Anhand der Streulichteigenschaften lassen sich morphologische Merkmale wie Zellgröße und Granularität bestimmen, was eine Abgrenzung von aktivierten Lymphozyten („Blasten“) einerseits und
ruhenden Lymphozyten sowie Monozyten andererseits ermöglicht. Die Bestimmung weiterer Zelleigenschaften wie Oberflächenmarker und intrazelluläre Zytokinsynthese erfolgt mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern unterschiedlicher Emissionsspektren, die durch einen Laserstrahl (488 nm Wellenlänge) angeregt werden, dabei erfolgt die Analyse der Fluoreszenzfarbe sowie der Fluoreszenzintensität. Bei jeder Messung wurden 10 000 Zellen aufgenommen und 5 Parameter simultan bestimmt: Zellgröße, Zellgranularität und Fluoreszenzemissionen der Wellenlängen 530 nm (FITC), 585nm (PE) sowie 680nm (tricolor). Die korrelierte
Zweiparameterdarstellung
(„DOT
PLOT“)
ermöglichte
das
Herausfiltern
(„GATING“) der Blastenregion und die Bestimmung des Prozentsatzes zytokinproduzierender und durch einen bestimmten Oberflächenmarker gekennzeichneter Lymphozyten innerhalb dieser Region. Die Aufnahme der Daten erfolgte im
LIST-MODE, dabei werden die einzelnen Zelldaten als Liste im Computer gespeiDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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chert und sind jederzeit reproduzierbar. Die Daten wurden anschließend mit dem
Softwarepaket „LYSIS II“ ausgewertet [105].
2.9 Statistik
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Wilcoxon rank sum test
(Mann-Whitney U-Test) für kontinuierliche Variablen und dem Fisher exact Test
für diskrete Variablen.
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2.10 Herstellernachweis
Aminosäuren, nicht-essentielle: Biochrom, Berlin, Deutschland
Amphotericin B: Biochrom, Berlin, Deutschland
Anti-IL-2 biotin: Hölzel Diagnostika, Köln, Deutschland
Anti-CD3-tricolor: Caltag, San Francisco, USA
Anti-CD45R0-PE: Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Brutschrank: Heraeus, Deutschland
Conical Tubes 50ml: Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Durchflußzytometer: FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
FCS (Fetal Calf Serum): Biochrom, Berlin, Deutschland
Ficoll 1.077g/ml: Biochrom, Berlin, Deutschland
Hanks balanced salt solution (HBSS): Biochrom, Berlin, Deutschland
Heparin-Natrium (“Vetren”): Promonta, Hamburg, Deutschland
HEPES-Pufferlösung: Biochrom, Berlin, Deutschland
Ionomycin: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland
L-Glutamin 200 mM: Biochrom, Berlin, Deutschland
Lysis II Softwarepaket: Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Maus-IgG1-biotin: Pharmingen, Hamburg, Deutschland
Monensin: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland
Natriumpyruvat: Biochrom, Berlin, Deutschland
Paraformaldehyd: Riedel de Haen, Seelze, Deutschland
Penicillin 100 I.E./ml/Streptomycin 100 µg/ml: Biochrom, Berlin, Deutschland
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA): Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland
RPMI 1640: Biochrom, Berlin, Deutschland
Saponin: Riedel de Haen, Seelze, Deutschland
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Staphylococcus aureus Cowan 1: Pansorbin® , Calbiochem, Großbritannien
Türk`sche Lösung: Fluka, Buchs, Schweiz
24-well-Zellkulturplatte: Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Streptavidin-FITC: Serotec, Oxford, Großbritannien
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3 Ergebnisse
3.1 Die IL-2 Synthese ist im Nabelschnurblut bei Kindern mit AD nach SAC
Stimulation signifikant vermindert
Nach
7-tägiger
Inkubationszeit
der
mononukleären
Nabelschnurblutzellen
(CBMCs) mit SAC zeigte sich bei den Kindern, die innerhalb der ersten 6 Lebensmonate eine AD entwickelten ein signifikant niedrigerer Anteil IL-2 positiver
IL-2 produzierende Zellen [%]
Zellen (p<0.05) als bei der Kontrollgruppe.
6
5
4
3
2
1
0
keine Hautbeteiligung
Hautveränderungen
Abbildung 2: IL-2 positive Zellen in Prozent der Blastenregion der CBMCs nach 7-tägiger
Inkubationszeit mit SAC (10ng/ml) und anschließender 5-stündiger Restimulation mit
PMA (10ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter der Einwirkung von Monensin (2.5µM) in Abhängigkeit vom Auftreten einer atopischen Dermatitis in den ersten 6 Lebensmonaten.
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3.2 Die IL-2 Produktion CD45R0+ Nabelschnurblutzellen ist bei Kindern mit
AD nicht signifikant vermindert
Der duchflusszytometrisch bestimmte Anteil IL-2 produzierender CD45R0+ Nabelschnurblutzellen nach 7-tägiger SAC Stimulation war bei den Kindern, die innerhalb der ersten 6 Lebensmonate an einer AD erkrankten vermindert, der Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe war jedoch nicht signifikant (p>0.05).
IL-2 Synthese in
CD45R0 Zellen [%]
7
6
5
4
3
2
1
0
keine Hautveränderung Hautveränderungen
Abbildung 3: IL-2 positive CD45R0+ Zellen in Prozent der Blastenregion der CBMCs
nach 7-tägiger Inkubationszeit mit SAC (10ng/ml) und anschließender 5-stündiger Restimulation mit PMA (10ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter der Einwirkung von Monensin
(2.5µM) in Abhängigkeit vom Auftreten einer AD.
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3.3 Der Anteil CD45R0+ Nabelschnurblutzellen ist nach SAC-Stimulation bei
Kindern mit AD nicht signifikant vermindert
Der Anteil CD45R0+ Zellen nach 7-tägiger Kultivierung der Nabelschnurblutzellen
mit SAC war bei den Kindern, die im Verlauf der ersten 6 Lebensmonate eine AD
entwickelten im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht signifikant vermindert (p>0.05).
CD45R0 Zellen [%]
25
20
15
10
5
0
keine Hautbeteiligung
Hautveränderungen
Abbildung 4: CD45R0+ Zellen in Prozent der Blastenregion nach 7-tägiger Inkubationszeit mit SAC (10ng/ml) und anschließender 5-stündiger Restimulation mit PMA (10ng/ml)
und Ionomycin (1µM) unter der Einwirkung von Monensin (2.5µM) in Abhängigkeit vom
Auftreten einer AD.
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3.4 Die IL-2 Synthese nach SAC-Stimulation ist im 6.Lebensmonat bei Kindern mit AD nicht signifikant vermindert
Die durchflusszytometrische Bestimmung der IL-2 positiven mononukleären Zellen im Alter von 6 Monaten zeigte nach 7-tägiger Stimulation mit SAC keinen signifikanten Unterschied zwischen
den Kindern mit AD und der Kontrollgruppe
IL-2 produzierende Zellen [ [%]
(p>0.05).
20
10
0
keine Hautbeteiligung
Hautveränderungen
Abbildung 5: IL-2 positive-Zellen im 6.Lebensmonat in Prozent der Blastenregion nach
7-tägiger Inkubationszeit mit SAC (10ng/ml) und anschließender 5-stündiger Restimulation mit PMA (10ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter der Einwirkung von Monensin (2.5µM)
in Abhängigkeit vom Auftreten einer AD.
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3.5 Der Anteil CD45R0+ Zellen nach SAC-Stimulation ist im 6. Lebensmonat
in der AD-Gruppe nicht signifikant vermindert
Im 6.Lebensmonat ergab die Bestimmung der CD45R0+ Zellen nach einwöchiger
Cokultivierung der mononukleären Zellen mit SAC keinen signifikanten Unterschied zwischen den Kindern mit AD und der Kontrollgruppe (p>0.05).
CD45R0 Zellen [%]
25
20
15
10
5
0
keine Hautbeteiligung
Hautveränderungen
Abbildung 6: CD45R0+ Zellen im 6.Lebensmonat in Prozent der Blastenregion nach 7tägiger Inkubationszeit mit SAC (10ng/ml) und anschließender 5-stündiger Restimulation
mit PMA (10ng/ml) und Ionomycin (1µM) unter der Einwirkung von Monensin (2.5µM) in
Abhängigkeit vom Auftreten einer AD.
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4 Diskussion
Die Haut von Patienten mit atopischer Dermatitis ist signifikant häufiger mit
Staphylococcus aureus besiedelt als die Haut von Gesunden. Darüber hinaus
weisen die Wechselwirkungen zwischen S. aureus und dem Immunsystem von
Patienten mit atopischer Dermatitis darauf hin, dass dieser an der Entstehung und
Aufrechterhaltung der ekzematösen Hautveränderungen beteiligt ist. Es ist nicht
eindeutig geklärt, ob die verstärkte Besiedlung eine Ursache oder Folge der Erkrankung darstellt und welche Faktoren die Besiedlung bei der AD begünstigen.
Im Rahmen einer prospektiven Studie wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob sich bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine veränderte Stimulierbarkeit
des Immunsystems durch Staphylokokkenwandbestandteile in Abhängigkeit vom
Auftreten einer atopischen Dermatitis nachweisen lässt. Nabelschnurblutzellen
wurden mit formalinfixiertem, hitzeinaktiviertem und enterotoxinfreiem Staphylococcus aureus vom Typ Cowan I (SAC) stimuliert und anschließend durchflusszytometrisch die IL-2 Synthese bestimmt. Nach 6 Monaten erfolgte eine Wiederholung der Untersuchung, die Probanden wurden auf Hautveränderungen untersucht
und in eine AD und eine Kontrollgruppe unterteilt.
Es konnte gezeigt werden, dass zum Zeitpunkt der Geburt bei den Kindern, die
eine atopische Dermatitis innerhalb der ersten 6 Lebensmonate entwickeln, die IL2 Synthese der naiven T-Zellen nach Stimulation mit SAC vermindert ist. Im Alter
von 6 Monaten ließ sich kein signifikanter Unterschied bezüglich der IL-2 Synthese nach Stimulation mit SAC zwischen den beiden Probandengruppen mehr
nachweisen.
4.1 Die IL-2 Synthese naiver T-Zellen ist nach Stimulation mit SAC bei Kindern mit AD zum Zeitpunkt der Geburt vermindert
Nach Stimulation mit SAC ließ sich bei den Kindern, die innerhalb der ersten 6
Monate eine AD entwickelten eine signifikant verminderte IL-2 Synthese im Nabelschnurblut im Vergleich zur Kontrollgruppe nachweisen. Die Bestimmung des
Oberflächenmarkers CD45R0 ergab, dass die naiven nicht jedoch die memory TZellen weniger IL-2 produzieren.
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Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Die Frage nach eindeutigen prädiktiven Faktoren für das Auftreten atopischer Erkrankungen führte zu einer Reihe von Untersuchungen zur Synthese verschiedener Zytokine im Nabelschnurblut Atopierisikoneugeborener. Kondo et al. konnten
in diesem Zusammenhang nachweisen, dass Antigene wie beispielsweise Ovalbumin oder Rinderalbumin die IL-2 Synthese neonataler T-Zellen von Probanden
mit AD in gleichem Ausmaß wie die der T-Zellen gesunder Kinder stimulieren [63].
Auch die Aktivierung mit Mitogenen wie PMA führte zu keinem signifikanten Unterschied bezüglich der IL-2 Synthese zwischen neonatalen T-Zellen Atopierisikoneugeborener und Kontrollen [42, 74, 107].
Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass die T-Zellen Neugeborener mit erhöhtem Atopierisiko keinen Defekt bezüglich der Fähigkeit IL-2 zu produzieren aufweisen, sondern nur auf bestimmte Stimuli wie SAC mit einer verminderten IL-2
Synthese reagieren. In diese Richtung weisen auch weitere Befunde aus unserem
Labor, hier konnte eine verminderte IFN-γ Synthese SAC stimulierter neonataler
naiver T-Zellen Atopierisikoneugeborener nachgewiesen werden [102].
Es liegt die Vermutung nahe, dass infolge einer verminderten IL-2 Synthese die
Ausbildung einer spezifischen Immunantwort auf SAC bei Neugeborenen mit erhöhtem Atopierisiko beeinträchtigt ist und auf diese Weise die frühe Besiedlung
der Haut mit diesem Keim begünstigt wird. Der Nachweis einer verminderten Aktivierbarkeit neonataler T-Zellen durch SAC deutet zudem darauf hin, dass die
vermehrte Kolonisation der Haut mit diesem Keim eine Folge und nicht eine Ursache der Erkrankung darstellt.
4.2 IL-2 bewirkt Proliferation und Differenzierung antigenspezifischer naiver
T-Zellen
Die Entwicklung antigenspezifischer T-Effektorzellen ist von IL-2 abhängig, eine
verminderte IL-2 Synthese zum Zeitpunkt der Geburt nach SAC Stimulation trägt
möglicherweise zu einer ineffektiven Erregerelimination in vivo bei der AD bei. IL-2
wird vor allem von aktivierten naiven T-Zellen produziert und ist der wichtigste TZellwachstumsfaktor im Nabelschnurblut. Naive T-Zellen unterscheiden sich in
vielerlei Hinsicht von den ausdifferenzierten Effektorzellen (Abb.7). Sie können
von Antigen/MHC Komplexen nur in Anwesenheit eines costimulierenden Signals,
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Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
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das von der antigenpräsentierenden Zelle dargeboten wird aktiviert werden [117].
Zu den am besten charakterisierten costimulierenden Signalen gehören die sogenannten B7 Moleküle (CD80, CD86), die sich nur auf der Oberfläche von Zellen
finden, die das T-Zellwachstum anregen können [92]. Die Rezeptoren für B7 auf
T-Zellen sind CD28 und CTLA4. Die Fähigkeit neben der Antigenpräsentation die
erforderlichen costimulierenden Signale für naive T-Zellen zu liefern beschränkt
sich auf dendritische Zellen und aktivierte B-Zellen, die eine große Anzahl dieser
Moleküle exprimieren [24]. Die wesentliche Funktion der Costimulation besteht in
der Induktion der IL-2 Produktion. Experimentelle Beobachtungen konnten zeigen,
dass eine Aktivierung naiver T-Zellen unter Zugabe von exogenem IL-2 ohne
costimulierendes Signal erfolgen kann; eine Antigenerkennung durch naive TZellen ohne Costimulation hingegen führt zu einer Anergie der T-Zellen [117, 122].
Stimulierte naive T-Zellen treten in die G1 Phase des Zellzyklus ein und synthetisieren IL-2 sowie die α-Kette des IL-2 Rezeptors. Ruhende T-Zellen exprimieren
eine Rezeptorform, die nur β- und γ-Ketten besitzt und eine niedrige Affinität für
IL-2 aufweist. Erst die Aktivierung der T-Zellen führt zur Synthese der α-Kette und
damit zur Expression des hochaffinen Rezeptors für IL-2. Die Sekretion von IL-2
und IL-2R führt zu einer Proliferation antigenspezifischer T-Zellen und fördert die
Differenzierung der naiven Zellen zu Effektorzellen [38].
Die Aktivierung der naiven T-Zellen führt außerdem zur Expression eines Oberflächenmoleküls, das als CD40 Ligand bezeichnet wird. Die Bindung des CD40 Liganden an CD40 auf B-Zellen induziert in diesen die Immunglobulinsynthese sowie die Expression von B7 Molekülen und MHC-Komplexen, auf diese Weise
können weitere T-Zellen aktiviert werden [5, 20]. Johnson-Leger et al. konnten
nachweisen, dass für die Aktivierung der B-Zellen neben der CD40/CD40L Interaktion die Anwesenheit von IL-2 erforderlich ist [54].
Der Oberflächenmarker CD45RA auf naiven T-Zellen unterliegt im Rahmen der
Aktivierung einer Veränderung, so wird auf Effektorzellen die Isoform CD45R0
exprimiert, was zu einer höheren Empfindlichkeit der T-Zelle gegenüber geringen
Konzentrationen von Antigen/MHC Komplexen führt [11, 93, 104]. Aktivierte TZellen exprimieren außerdem einen weiteren Rezeptor für B7, CTLA4, der eine
wesentlich höhere Bindungsaffinität für B7 besitzt und der T-Zelle negative SignaDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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le vermittelt sowie die IL-2 Synthese limitiert. Hierdurch wird die proliferative Antwort aktivierter T-Zellen begrenzt [15, 119].
Der wichtigste Unterschied zwischen naiven T-Zellen und T-Effektorzellen besteht
in ihren unterschiedlichen Stimulationsmechanismen, da für die Aktivierung einer
Effektorzelle kein costimulierendes Signal mehr benötigt wird und sie somit von
den meisten antigenpräsentierenden Zellen, einschließlich ruhender B-Zellen, aktiviert werden kann [24, 117].
!
Proliferation/Differenzierung
Abbildung 7: Naive T-Zellen benötigen für ihre Aktivierung ein costimulierendes Signal,
das von der antigenpräsentierenden Zelle (APC) geliefert wird. Ausdifferenzierte TEffektorzellen benötigen kein costimulierendes Signal mehr für ihre Aktivierung.
Die verminderte Aktivierbarkeit der naiven T-Zellen nach SAC Stimulation lässt
vermuten, dass die Fähigkeit der antigenpräsentierenden Zellen costimulierende
Signale zu liefern im Nabelschnurblut bei der AD Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe reduziert ist. Die erniedrigte IL-2 Synthese in der AD Gruppe kann somit auf eine verminderte Aktivierbarkeit der naiven T-Zellen selbst und/oder eine
Funktionsbeeinträchtigung der antigenpräsentierenden Zellen zurückgeführt werden.
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4.3 Der Anteil IL-2 produzierender memory T- Zellen ist bei Kindern, die eine
AD entwickeln zum Zeitpunkt der Geburt nicht signifikant beeinträchtigt
Für eine Beeinträchtigung der Funktion antigenpräsentierender Zellen im Nabelschnurblut der AD Gruppe spricht weiterhin die Beobachtung, dass in dieser
Gruppe die neonatalen memory T-Zellen- deren Aktivierung, im Gegensatz zu
den naiven T-Zellen, in geringerem Ausmaß von der Anwesenheit costimulierender Signale abhängt- der AD Gruppe im Nabelschnurblut nicht signifikant weniger
IL-2 produzieren als die memory T-Zellen der Kontrollgruppe.
Darüber hinaus fand sich kein signifikanter Unterschied bezüglich des Anteils
CD45R0 positiver neonataler T-Zellen nach Stimulation mit SAC zwischen den
Probandengruppen. Zum Zeitpunkt der Geburt exprimiert die Mehrzahl der TZellen die CD45RA Isoform, nur wenige CD3+ Zellen exprimieren CD45R0. Es
kommt jedoch schon innerhalb der ersten Lebenstage zu einer deutlichen Zunahme CD45R0+ Zellen. In vitro lässt sich die Expression von CD45R0 durch
Stimulation naiver T-Zellen mit Mitogenen wie PHA oder allogenen Antigenen erreichen [23, 71].
Die Angaben in der Literatur zur CD45R0/RA Expression bei Atopierisikoneugeborenen weichen voneinander ab. Miles et al. konnten im Nabelschnurblut Atopierisikoneugeborener, die innerhalb des ersten Lebensjahres eine Erkrankung aus
dem atopischen Formenkreis entwickelten eine reduzierte Anzahl memory TZellen nachweisen [80]. Hagendorens et al. fanden dagegen keinen Unterschied
bezüglich der Expression von CD45R0/RA zwischen Atopierisikoneugeborenen
und Kontrollgruppe [42]. Auch eine vermehrte Anzahl von memory T-Zellen bei
zugleich verstärkter Proliferation ließ sich im Nabelschnurblut Atopierisikoneugeborener nach polyklonaler Stimulation beobachten [138].
Ein primärer Ausreifungsdefekt der T-Zellen Atopierisikoneugeborener erscheint
aufgrund dieser Befunde unwahrscheinlich. Entscheidend für die Expression von
CD45R0 scheinen die Stimulationsbedingungen wie die zur Aktivierung eingesetzten Mitogene oder Antigene zu sein. Zusätzlich kann die Ausdifferenzierung
der naiven T-Zellen durch Zytokine, insbesondere IL-2, beeinflusst werden. So
konnte Roth in vitro demonstrieren, dass IL-2 die Konversion naiver T-Zellen zu
CD45R0+ Zellen verstärkt, andere Zytokine wie IL-4, IL-6 oder IL-7 haben dageDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
gen keinen Einfluss auf die CD45R0 Expression [113]. Es liegt die Vermutung nahe, dass die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesene verminderte IL-2 Synthese
der naiven T-Zellen nach SAC Stimulation bei AD die Ausdifferenzierung antigenspezifischer CD45R0+ T-Zellen inhibiert. Widersprüchlich erscheint jedoch der
fehlende Unterschied bezüglich der CD45R0 Expression zwischen den Probandengruppen. Dies lässt sich möglicherweise auf die mitogenen Eigenschaften der
Zellwandbestandteile von S. aureus zurückführen, die antigenunspezifisch zu einer polyklonalen Stimulation und damit auch CD45R0 Expression führen können.
Die erhobenen Befunde deuten an, dass die Aktivierbarkeit neonataler memory TZellen durch SAC bei Kindern mit AD nicht beeinträchtigt ist.
4.4 Immunpathologie der AD
Interleukin-2 ist ein entscheidender Faktor für die Entwicklung der T-Zellen, indem
es die Proliferation und Ausreifung antigenspezifischer T-Zellen fördert. Veränderungen der T-zellvermittelten Immunität haben eine zentrale Bedeutung in der
Pathogenese der AD.
Anhand ihrer Zytokinsekretionsmuster lassen sich TH-Zellen in funktionell unterschiedliche Subklassen einteilen: TH-1 Zellen sezernieren vorwiegend IFN-γ,
während TH2-Zellen die Interleukine IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13 produzieren. IL-3,
GM-CSF und TNF werden von beiden Zelltypen synthetisiert. T-Zellen, die TH1
und TH2 Zytokine produzieren werden als TH0-Zellen bezeichnet. Die wichtigste
Aufgabe von IFN-γ besteht in einer Makrophagenaktivierung, so induzieren TH1
Zellen eine überwiegend zelluläre Immunantwort. TH2-Zytokine begünstigen die
Entstehung einer vorwiegend humoralen Immunantwort, indem IL-4 B-Zellen aktiviert und den Isotypenwechsel zur IgE-Synthese auslöst; durch IL-5 werden darüber hinaus Wachstum und Differenzierung eosinophiler Granulozyten gefördert
[70, 78, 84, 130].
Die Entscheidung, ob eine TH1 oder TH2 dominante Immunantwort ausgelöst
wird, fällt beim ersten Antigenkontakt, ausschlaggebend ist das umgebende Zytokinmilieu, die Art des Antigens, der antigenpräsentierenden Zelle sowie zusätzlicher costimulierender Signale [59, 73, 123].
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vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Die Regulation des TH1/TH2 Gleichgewichtes, die zur Entstehung einer adäquaten TH1 oder TH2 dominanten Immunantwort erforderlich ist, erfolgt durch die von
diesen Zellen produzierten Zytokine: IFN-γ wirkt inhibitorisch auf TH2-Zellen und
antagonisiert die IL-4 vermittelte IgE-Synthese. Das TH2 Zytokin IL-4 führt zu einer starken Proliferation von TH2-Zellen und wirkt inhibitorisch auf TH1 Zellen.
Darüber hinaus besitzen regulatorische T-Zellen die Fähigkeit TH1/TH2 Antworten
zu modulieren. Der Begriff regulatorische T-Zellen subsumiert eine heterogene
Gruppe von T-Zellen, die über kontaktabhängige Mechanismen oder die Sekretion
immunsuppressiver Zytokine wie IL-10 und/oder TGF- inhibitorisch auf TH1 und
TH2 Zellen wirken. Die natürlichen CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen sind
insbesondere entscheidend für die Prävention von Autoimmunerkrankungen
[137].
Die im Vordergrund stehenden immunpathologischen Veränderungen bei der AD
sind durch eine Verschiebung des TH1/TH2 Gleichgewichtes zugunsten der TH2
Population charakterisiert [62, 70, 78, 100]. Die zunehmenden Erkenntnisse über
regulatorische T-Zellen weisen darauf hin, dass diese ebenfalls eine Rolle in der
Pathogenese atopischer Erkrankungen spielen. Überraschenderweise ließ sich im
peripheren Blut von AD Patienten eine größere Anzahl regulatorischer T-Zellen
mit normaler immunsuppressiver Aktivität als bei gesunden Kontrollpersonen oder
Asthmatikern nachweisen [96, 137]. Möglicherweise beeinflussen hier, wie von
Bellinghausen et al. bei Probanden mit Wespengiftallergie oder allergischer Rhinitis dargestellt werde konnte
zusätzliche Faktoren wie Allergentyp und -
konzentration die regulatorische Aktivität [7].
Die Ausbildung der TH1/TH2 Dysregulation beruht auf zwei wesentlichen Faktoren, zum einen wird sie durch eine genetische Prädisposition begünstigt andererseits beeinflussen Umweltfaktoren ihre Entstehung. In den letzten Jahren hat sich
zunehmend die Hygiene-Hypothese etabliert, nach der die verminderte bakterielle
Exposition von Kindern, insbesondere in den westlichen Industrienationen, entscheidend am Prävalenzanstieg atopischer Erkrankungen beteiligt ist [74].
Die Mechanismen, die der Hygiene-Hypothese zugrunde liegen, werden jedoch
noch kontrovers diskutiert. Eine Erklärung geht davon aus, dass eine verminderte
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Stimulation der Zellen der unspezifischen Abwehr durch mikrobielle Bestandteile
die Polarisierung in Richtung einer TH2 Immunantwort begünstigt: Einige Zellen
der angeborenen Immunabwehr wie dendritische Zellen oder NK-Zellen produzieren nach Interaktion mikrobieller Substanzen mit ihren Toll-like Rezeptoren Interferone und IL-12, die einerseits die Entwicklung von TH1 Zellen fördern und andererseits inhibitorisch auf TH2 Antworten wirken.
Andererseits führt eine Stimulation mit mikrobiellen Bestandteilen zur Aktivierung
regulatorischer T-Zellen, dies resultiert in der Sekretion immunsuppressiver Zytokine, als Grundlage für die Hygiene Hypothese wird in diesem Zusammenhang
eine reduzierte suppressive Aktivität als Folge einer verminderten bakteriellen Exposition, die dann in verstärkten TH2 Antworten resultiert diskutiert [111].
Es liegt die Vermutung nahe, dass eine verminderte Stimulierbarkeit neonataler TZellen durch SAC, ähnlich einer reduzierten bakteriellen Exposition, die Entstehung von TH2-Zellen begünstigt.
4.5 Wechselwirkungen zwischen S. aureus und dem Immunsystem bei AD
Die immunstimulatorischen Wirkungen von S. aureus bei der AD unterliegen nicht
den allergieprotektiven Effekten, die einer insgesamt keimreichen Umgebung zugesprochen werden. Vielmehr weisen die Interaktionen zwischen S. aureus und
dem Immunsystem von Patienten mit AD darauf hin, dass dieser einen pathogenetisch relevanten Faktor darstellt, indem er Entstehung und Perpetuierung der
inflammatorischen Hautreaktionen begünstigt. Eine Ursache für die vermehrte
Besiedlung der Haut mit S. aureus bei der AD stellt möglicherweise die
hier
nachgewiesene verminderte Aktivierbarkeit naiver neonataler T-Zellen durch SAC
dar.
Die T-zellvermittelte Immunität auf Zellwandbestandteile von S. aureus ist bei der
AD verändert: T-Zellen von AD Probanden proliferieren nach Stimulation mit Protein-A freiem, nicht enterotoxinproduzierendem S. aureus Wood verstärkt, bei
gleichzeitig vermehrter IL-4 Synthese und reduzierter IFN- Produktion [16]. Darüber hinaus stimulieren Peptidoglykane (PGN) und Lipoteichonsäuren (LTA) von
S. aureus bei Probanden mit AD nicht jedoch bei Normalpersonen die Synthese
von IL-5 [76].
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Neuber et al. konnten demonstrieren, dass Zellwandbestandteile von S. aureus
die zytokinvermittelte humorale Immunantwort bei der AD modulieren: In Anwesenheit von IL-4 stimulieren PGN und Teichonsäuren (TA) bei AD die Synthese
von IgE und CD23. TA hemmt hingegen die Synthese von IgG und IgA. Die Suppression von IgG und IgA begünstigt möglicherweise die Besiedlung mit S. aureus, der wiederum durch seinen Einfluss auf IgE-Synthese und CD23 Expression
die entzündliche Ekzemreaktion unterstützt [88].
Die Mehrzahl der Stämme von S. aureus auf der Haut von Patienten mit AD produziert Enterotoxine, insbesondere SEA, SEB und TSST-1, die als Superantigene
starke T-Zellstimuli darstellen [51, 68]. Die T-Zellen von Patienten mit AD produzieren nach Stimulation mit SEB die TH2 Zytokine IL-4 und IL-5 sowie IgE bei
gleichzeitig verminderter IFN-γ Synthese. Bei Normalpersonen hingegen führt SEB
zu einer starken Stimulation von TH1 Zellen [90]. Interessanterweise verlieren regulatorische T-Zellen nach Stimulation mit dem Staphylokokkenenterotoxin B ihre
suppressiven Eigenschaften, auf diese Weise könnten Staphylokokken bei der AD
das Immunsystem modulieren [96].
4.6 Faktoren, welche die Hautbesiedlung mit S. aureus
bei der AD begünstigen
Ein Merkmal der AD ist die chronische Besiedlung der Haut mit S. aureus. In der
vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits vor dem Auftreten einer
AD die Stimulierbarkeit der naiven T-Zellen durch SAC beeinträchtigt ist. Dies
stellt möglicherweise einen relevanten Faktor für die frühe Besiedlung der Haut
mit diesem Keim dar und deutet darauf hin, dass die S. aureus Besiedlung eine
Folge und nicht eine Ursache der Erkrankung darstellt.
Voraussetzung für die chronische Besiedlung der Haut mit S. aureus ist eine verstärkte Adhärenz an die Korneozyten bei der AD. Im stratum corneum ekzematöser Hautveränderungen wird vermehrt Fibronektin exprimiert, mikrobielle Oberflächenmoleküle der Staphylokokken wie Fibrinogen- und Fibronektinbindendes Protein können so die Besiedlung atopischer Haut begünstigen [18, 53]. Fibronektin
kann sich darüber hinaus an die Teichonsäure der Staphylokokkenzellwand binden und so zu der gesteigerten Adhärenz beitragen. Zusätzliche Adhäsine wie
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Protein A oder Lamininrezeptoren könnten ebenso an diesem Prozess beteiligt
sein [22, 108].
Die Expression endogener antimikrobieller Peptide in der Haut bildet eine erste
effektive Barriere der unspezifischen Abwehr gegen infektiöse Erreger. Diese sogenannten Beta-Defensine und Cathelicidine werden von den Keratinozyten synthetisiert und entfalten antimikrobielle Eigenschaften gegen Pilze sowie bakterielle
und virale Erreger, indem sie die Zellwand des Pathogens zerstören oder in die
Mikroben eindringen und mit intrazellulären Funktionsabläufen interagieren. Die
Expression des humanen beta-Defensins 2 (HBD-2) sowie des Cathelicidins LL37 wird durch eine Entzündungsreaktion oder eine Verletzung der Haut getriggert.
Interessanterweise ließ sich in akuten und chronischen ekzematösen Läsionen
von AD Patienten eine verminderte Expression dieser Peptide nachweisen, die
eine starke zytotoxische Aktivität auf S. aureus ausüben. Der Nachweis, dass TH2
Zytokine wie IL-4 und IL-13, die sich in großer Menge in finden die Synthese von
HBD-2, HBD-3, IL-8 und iNOS supprimieren, führte zu der Hypothese, dass eine
verminderte Expression antimikrobieller endogener Peptide die Folge einer lokalen Erhöhung der TH2 Zytokine darstellt und so die Entwicklung bakterieller Hautinfektionen begünstigt wird. Hierfür spricht weiterhin, dass S. aureus eine wesentlich höhere Bindungsaffinität für entzündliche Hautläsionen, die durch TH2 Zellen
hervorgerufen werden als für TH1 vermittelte inflammatorische Hautreaktionen
besitzt [19, 94].
Eine erniedrigte Aktivierbarkeit der T-Zellen durch SAC vor der vollständigen Ausprägung der immunpathologischen Veränderungen und klinischen Manifestation
der AD weist darauf hin, dass die Entwicklung antigenspezifischer T-Zellen und
damit eine effektive Erregerelimination bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt
beeinträchtigt ist und dadurch die S. aureus Besiedlung begünstigt wird.
4.7 Immunmodulatorische Wirkungen von SAC
Die Zellwandbestandteile von S. aureus besitzen starke immunstimulatorische
Eigenschaften. Dies wirft die Frage auf, wie T-Zellen durch SAC aktiviert werden
und welche Mechanismen für die hier beobachtete reduzierte Aktivierbarkeit der
neonatalen T-Zellen in der AD-Gruppe verantwortlich sind.
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Die Zellwand von S. aureus setzt sich aus den drei Komponenten Peptidoglykan
Teichonsäuren und Protein A zusammen. Protein A besitzt mitogene Eigenschaften vor allem für B- und auch T-Zellen [109]. Über eine seiner 5 Fc-gamma bindenden Domänen erfolgt die Bindung von Protein A an das Fc-Fragment der
meisten Immunglobulinklassen. Eine weitere Bindungsstelle für Protein A ist in
der Fab Region innerhalb der schweren Kette der Immunglobuline
lokalisiert.
Diese Bindungsstelle ist restringiert auf die VHIII Familie der schweren Kette der
Immunglobuline und findet sich auf zahlreichen IgM, IgA und IgG Antikörpern. Auf
diese Weise kann Protein A einen großen Anteil der B-Zellen aktivieren und wird
daher auch als Superantigen für B-Zellen bezeichnet [67, 87]. Auch die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie IFN- , TNF-alpha und IL-1 wird durch
Protein A stimuliert, im murinen Modell ließ sich zugleich eine Suppression von
IL-4, IL-10 und IL-6 nachweisen, so wird durch Protein A vornehmlich eine TH1
Antwort induziert [125, 126].
Seit langer Zeit ist bekannt, dass Peptidoglykane und Teichonsäuren eine zentrale
Rolle im Rahmen von Infektionen durch grampositive Erreger spielen. Sie aktivieren die unspezifische Abwehr, indem sie die Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-10 in Makrophagen induzieren [9, 40, 128,
141]. PGN und LTA besitzen darüber hinaus mitogene Eigenschaften für B- und
T-Zellen [1, 31, 106].
Obgleich die pathogenetische Relevanz dieser bakteriellen Stimuli lange bekannt
ist, waren Erkennungsstrukturen sowie Signalverarbeitungsprozesse, die zu einer
Aktivierung der unspezifischen Abwehr führen, lange weitgehend unbekannt. Erst
in den letzten Jahren gelang die Identifizierung einer evolutionsgeschichtlich sehr
alten Gruppe von Rezeptoren, die eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung
der unspezifischen Abwehr spielen [110]. Diese sogenannten Toll-like Rezeptoren
auf Makrophagen, Granulozyten und dendritischen Zellen, von denen bisher 10
verschiedene Typen bekannt sind, werden durch bakterielle sowie zum Teil auch
körpereigene und synthetische Bestandteile stimuliert. LPS gramnegativer Bakterien interagieren vorwiegend mit dem Toll-like Rezeptor TLR4, Lipoteichonsäuren
und Peptidoglykane dagegen mit TLR2, einem Rezeptor, der für die Induktion einer Immunantwort auf grampositive Bakterien erforderlich ist [83]. Über die meisDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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ten Toll-like Rezeptoren wird der Ablauf einer Enzymkaskade getriggert, der in
der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF- -B resultiert. Hierdurch wird die Zytokinproduktion induziert und eine unspezifische Abwehrreaktion etabliert [97]. Die
Bedeutung der TLR im Rahmen einer S. aureus Infektion ließ im murinen Modell
eindrucksvoll demonstrieren. Mäuse, die kein MyD88, ein Adapter Protein der
meisten TLRs, exprimieren sowie auch TLR2 defiziente Mäuse zeichnen sich
durch eine deutlich verringerte Produktion proinflammatorischer Zytokine als auch
eine erheblich erhöhte Mortalität aus [132].
4.8 Die Verknüpfung unspezifischer und spezifischer Abwehrmechanismen
ist für die Aktivierung naiver T-Zellen erforderlich
Dendritische Zellen können über Toll-like Rezeptoren in den Wirt eingedrungene
Pathogene erkennen. Die Aktivierung über TLRs löst in den dendritischen Zellen
einen Reifungsprozess aus, der zur Expression von MHC Molekülen und costimulierenden Signalen führt, auf diese Weise können sie naive T-Zellen stimulieren
[79, 139]. Das umgebende Zytokinmilieu beeinflusst, ob sich aus den naiven TZellen TH1 oder TH2 Zellen entwickeln. IL-12 fördert die Entwicklung von TH1
Zellen, ein IL-4 reiches Zytokinmilieu trägt zur Entwicklung von TH2 Zellen bei.
Bakterielle Infektionen führen zur Aktivierung zahlreicher TLRs und diese Aktivierung ist für die Entstehung einer antigenspezifischen TH1 Antwort erforderlich.
Dies ließ sich daran zeigen, dass bei Mäusen, die kein MyD88 exprimieren nach
Stimulation mit Ovalbumin und Freund`s Adjuvant
die antigenspezifische T-
Zellproliferation, die IFN-γ Produktion sowie die Synthese von IgG2a Antikörpern
supprimiert sind [86, 110]. Stattdessen fand sich bei diesen Mäusen eine TH2
Antwort. Dies führte zu der Hypothese, dass eine Abwehr bakterieller Erreger, die
TLR-Liganden besitzen, die Induktion einer TH1 Antwort erfordert [120]. Darüber
hinaus scheint das Ausmaß der bakteriellen TLR Stimulation ebenso entscheidend für die Entwicklung einer TH1 oder TH2 dominierten Immunantwort zu sein
[32]. Dies unterstützt die bereits seit einigen Jahrzehnten bestehende Hygiene
Hypothese nach der eine verminderte bakterielle Exposition in den Industrienationen für den Prävalenzanstieg von Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis
verantwortlich ist.
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Die Ausbildung einer effektiven Immunantwort auf S. aureus ist vom Vorhandensein intakter TLRs abhängig. Dies legt die Vermutung nahe, dass TLR vermittelte
Effekte an der hier beobachteten verminderten IL-2 Synthese der naiven T-Zellen
in der AD Gruppe beteiligt sind. Die Expression der TLR kann darüber hinaus
durch Zytokine beeinflusst werden. IL-2 verstärkt beispielsweise die Expression
von TLR4 auf Monozyten [82].
Die immunstimulatorischen Wirkungen von SAC im Kontext mit den immunpathologischen Veränderungen bei der AD, die durch eine vermehrte T-Zellaktivität gekennzeichnet sind, lassen eigentlich vermuten, dass der T-Zellwachstumsfaktor
IL-2 in großer Menge produziert wird. Verschiedene Besonderheiten des neonatalen Immunsystems, auf die im folgenden näher eingegangen werden soll, tragen
vermutlich zu der erniedrigten IL-2 Synthese in der AD Gruppe nach SAC Stimulation bei.
4.9 T-Zellvermittelte Immunität des Neugeborenen
Die erhöhte Infektanfälligkeit Neugeborener wird auf eine Unreife des Immunsystems zurückgeführt, insbesondere die Ausbildung zellulärer TH1 Immunantworten ist zum Zeitpunkt der Geburt verzögert. Im Rahmen der Pathogenese atopischer Erkrankungen wird eine verzögerte Entwicklung der von TH1 Zellen vermittelten zellulären Immunität bei gleichzeitiger Konsolidierung neonataler TH2 Antworten diskutiert [103].
Im Nabelschnurblut liegen die meisten T-Zellen in ihrer naiven durch den Oberflächenmarker CD45RA gekennzeichneten Form vor. Hassan und Reen konnten
nachweisen, dass sich naive T-Zellen Neugeborener in ihrer Stimulierbarkeit von
adulten CD45RA+ T-Zellen unterscheiden. Nach Inkubation mit monoklonalen
Antikörpern gegen CD2 und CD28 beobachteten sie bei den neonatalen Zellen
eine verminderte Proliferation und IL-2 Synthese sowie IL-2 mRNA und CD25 Expression. Nach zusätzlicher Inkubation mit PMA, einem direkten Aktivator der Proteinkinase C, ließen sich beide Zellgruppen jedoch in gleichem Ausmaß stimulieren [44]. Clerici et al. untersuchten die Ausbildung von TH-Antworten, gemessen
an der IL-2 Produktion und Proliferation, auf verschiedene Antigene bei Kindern
unterschiedlichen Alters. Im Nabelschnurblut fanden sie einen selektiven Defekt
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der IL-2 Synthese auf Antigene, die durch Selbst-MHC-Komplexe präsentiert werden, während APC unabhängige T-Zellstimuli wie PHA in allen Altersgruppen,
einschließlich Neugeborener zu einer starken T-Zellaktivierung führten [21].
Diese Befunde lassen vermuten, dass zum Zeitpunkt der Geburt die Aktivierbarkeit der neonatalen T-Zellen reduziert ist und zusätzlich die Funktion der antigenpräsentierenden Zellen eingeschränkt ist .
Einen weiteren Hinweis auf die eingeschränkte Stimulationsfähigkeit neonataler
antigenpräsentierender Zellen liefert eine Arbeit von Trivedi et al., in der nachgewiesen werden konnte, dass antigenpräsentierende Zellen Neugeborener im Vergleich zu adulten APCs sowohl in Nabelschnurblutzellen als auch in mononukleären Zellen Erwachsener die INF-γ Produktion nur in geringem Ausmaß stimulieren
können [134]. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass dendritische Zellen
Neugeborener nach bakterieller Stimulation weniger costimulierende Moleküle wie
CD80 und CD86 auf ihrer Oberfläche exprimieren und die IFN-γ Produktion naiver
allogener T-Zellen nur geringfügig stimulieren können [27, 66]. Da in der Induktion der IL-2 Synthese die Hauptaufgabe der Costimulation besteht, liegt die Vermutung nahe, dass ein Reifungsdefekt antigenpräsentierender Zellen bei Kindern,
die eine AD entwickeln an der verminderten IL-2 Synthese naiver T-Zellen nach
bakterieller Stimulation beteiligt ist.
Die Intensität der CD28 vermittelten Costimulation beeinflusst zusätzlich das Zytokinsekretionsmuster neonataler T-Zellen. Starke costimulatorische Signale induzieren die Sekretion hoher Spiegel von TH1 Zytokinen, TH2 Zytokine dagegen
werden nur in geringem Ausmaß produziert. Geringe costimulierende Signale begünstigen hingegen die Entwicklung von TH2-Zellen [28, 60]. Die hier beobachtete
verminderte Aktivierbarkeit neonataler T-Zellen durch SAC könnte auf diese Weise an der Entstehung der TH1/TH2 Dysregulation bei der AD beteiligt sein.
Im Vergleich zu adulten CD45RA T-Zellen sind Zytokinsekretionsmuster und
Funktion der naiven neonatalen T-Zellen eingeschränkt: sie produzieren wenig
IFN-γ und nur sehr geringe Mengen IL-4 [12]. Die IFN-γ Produktion ist nach optimaler Stimulation mit PMA und Concavalin A in neonatalen CD4+ Zellen um das
5-10fache im Vergleich zu adulten CD4+/CD45RA T-Zellen erniedrigt. Die MechaDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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nismen, welche zu einer Herabregulation der IFN-γ Synthese zum Zeitpunkt der
Geburt führen, sind nicht eindeutig geklärt. Zunehmende Erkenntnisse weisen
darauf hin, dass eine verstärkte Methylierung in der Promotorregion des IFN-γ
Gens in naiven neonatalen CD4+ T-Zellen an der verminderten IFN-γ Genexpression bei Neugeborenen beteiligt ist [142].
Möglicherweise unterliegt die Kontrolle der IL-2 Genexpression, ähnlich wie bei
IFN-γ, zum Zeitpunkt der Geburt einer strengeren Regulation. In diese Richtung
weisen Untersuchungen von Mouzaki et al., die zeigen konnten, dass die
Transkription des IL-2 Gens in naiven T-Zellen durch ein Repressor- und ein Aktivatorprotein in der IL-2 Promotorregion reguliert wird. In memory T-Zellen lässt
sich dieses Repressorprotein nicht mehr nachweisen, die IL-2 Genaktivierung
wird dann durch den jeweiligen Aktivierungszustand eines positiven Transkriptionsfaktors kontrolliert [85].
TLR vermittelte Effekte sind vermutlich ebenfalls an der erhöhten Suszeptibilität
Neugeborener für bakterielle Infektionen beteiligt. So konnten Yan et al. kürzlich
nachweisen, dass Neugeborene und Erwachsene nach Stimulation mit hohen
LPS Konzentrationen ähnlich hohe Mengen TNF-α produzieren können. Niedrige
LPS Konzentrationen führten jedoch bei Neugeborenen zu einer wesentlich
schwächeren TNF-α Synthese. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass
bei Neugeborenen die Expression von MyD88, einem Adapter Protein der meisten
TLRs, deutlich vermindert ist [144]. MyD88 ist von essentieller Bedeutung für die
Aktivierung einer zellulären Immunantwort auf PGN [132]. Eine reduzierte TZellaktivierung durch SAC bei Geburt ist somit auch als Folge einer verminderten
Aktivierung antigenpräsentierender Zellen über Toll-like-Rezeptoren denkbar.
Die Aktivierung neonataler T-Zellen durch SAC kann durch die geschilderten Besonderheiten des Immunsystems in der Neugeborenenperiode auf verschiedenen
Ebenen moduliert werden. Die hierdurch vermittelten Effekte tragen vermutlich zu
der hier nachgewiesenen verminderten IL-2 Synthese durch SAC in der AD Gruppe bei.
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4.10 Nach 6 Monaten ist die IL-2 Synthese nach Stimulation mit SAC bei
Kindern mit AD nicht mehr vermindert
Bei den Kindern, die eine AD entwickelten, ließ sich im Alter von 6 Monaten nach
Stimulation mit SAC keine verminderte IL-2 Produktion im Vergleich zur Kontrollgruppe mehr nachweisen.
Andere Autoren hingegen berichten über eine verminderte IL-2 Produktion sowohl
CD45R0+ als auch CD45R0- T-Zellen nach Mitogenstimulation bei atopischen
Probanden [56]. Martinez et al. fanden nach Mitogenstimulation eine erniedrigte
IL-2 Synthese der T-Zellen von Kindern mit erhöhtem Atopierisiko im Alter von 9
Monaten [75]. Bei Kindern mit AD wurde hingegen auch eine gesteigerte IL-2 Synthese nach Stimulation mit Nahrungsmittelallergenen beobachtet [4]. Romano et
al. konnten ebenfalls eine verminderte IL-2 Produktion und Proliferation
nach
CD2 und CD3 Stimulation bei Atopikern nachweisen, die Zugabe von anti-CD28
führte in der Atopiegruppe jedoch zu einer stärkeren Proliferation und IL-2 Produktion als in der Kontrollgruppe [112]. Die Aktivierung der T-Zellen von Atopikern
wird demnach stärker von costimulierenden Signalen beeinflusst als die T-Zellen
von Normalpersonen. Im Unterschied zu diesen Beobachtungen scheint die Aktivierbarkeit der T-Zellen durch SAC nach klinischer Manifestation der AD nicht verändert zu sein. Dieser Befund lässt einen Reifungsdefekt der T-Zellen selbst oder T-zellstimulierender Mechanismen zum Zeitpunkt der Geburt bei den Kindern
mit AD, der bis zum 6. Lebensmonat ausgeglichen ist, vermuten. Anhand der hier
aufgeführten Ergebnisse lässt sich jedoch nicht feststellen zu welcher Art von TEffektorzelle die aktivierten naiven T-Zellen ausreifen. Es ist davon auszugehen,
dass in der AD Gruppe vorwiegend TH2 Zellen entstehen, wie Untersuchungen an
SAC stimulierten mononuklären Zellen bei AD Patienten vermuten lassen [16].
4.11 Die T-Zellausreifung nach Stimulation mit SAC ist bei Kindern mit AD
im 6.Lebensmonat normal
Im 6. Lebensmonat ließ sich bei den Kindern mit AD nach SAC Stimulation kein
Unterschied bezüglich der CD45R0 Expression zur Kontrollgruppe nachweisen.
Übereinstimmend konnten Jung et al. zeigen, dass die Konversion von CD45RA+
Zellen zu CD45R0+ Zellen nach Stimulation mit monoklonalen Antikörpern gegen
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CD28 und CD3 bei Probanden mit atopischer Dermatitis und einer Kontrollgruppe
gleich ist [57]. Andererseits beschreiben Matsuyama et al. eine deutlich reduzierte
Anzahl von memory T-Zellen bei AD Probanden nach Stimulation mit Hausstaubmilbenantigenen [77]. Pawlik et al. beobachteten ebenfalls einen erniedrigten Anteil CD45R0+ T-Zellen bei Allergikern mit saisonaler Symptomatik, unter zunehmender Allergenexposition ließ sich jedoch eine Zunahme der CD45R0+ T-Zellen
im Serum nachweisen. Dies führten die Autoren auf eine vermehrte Abwanderung
allergenspezifischer memory T-Zellen in entzündliche Gebiete zurück, eine verstärkte Allergenexposition stimuliert die Konversion naiver T-Zellen, so dass der
Anteil CD45R0+ T-Zellen im peripheren Blut ansteigt [101].
Der hier erhobene Befund spricht dafür, dass die Ausreifung der naiven T-Zellen
zu Effektorzellen nach bakterieller Stimulation mit SAC bei AD nicht beeinträchtigt
ist.
4.12 Faktoren, welche die Proliferation der T-Zellen bei der AD beeinflussen
Die vermehrte T-Zellaktivität bei der AD im Zusammenhang mit den immunstimulatorischen Wirkungen von S. aureus lässt eigentlich erwarten, dass IL-2 als zentraler T-Zellwachstumsfaktor vermehrt produziert wird. Die hier beobachtete verminderte beziehungsweise ausgeglichene IL-2 Synthese der T-Zellen in der AD
Gruppe wirft die Frage auf, welche weiteren Faktoren bei der AD die T-Zellaktivität
stimulieren.
In vivo produzieren die meisten Staphylokokkenstämme auf der Haut von AD Patienten Enterotoxine, die als Superantigene zu einer oligoklonalen T-Zellaktivierung führen. Da die Stimulation in der vorliegenden Arbeit mit enterotoxinfreiem
SAC erfolgte, ist dies möglicherweise eine Ursache für die verminderte IL-2 Synthese der neonatalen T-Zellen in der AD Gruppe. Dagegen spricht, dass andere
Autoren bereits eine verstärkte Proliferation und IL-4 Synthese nach Stimulation
mit enterotoxinfreiem S. aureus bei AD Probanden nachweisen konnten [16].
Die Mehrzahl der T-Zellen bei der AD produziert IL-4, das neben der Induktion der
IgE Synthese in B-Zellen Wachstum und Proliferation von T-Zellen fördert
[60,
103]. Die T-Zellen von AD Patienten reagieren darüber hinaus auf IL-4 mit einer
verstärkten Proliferation [35] .
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Im Zusammenhang mit den hier erhobenen Befunden ist davon auszugehen, dass
nicht nur IL-2 sondern zusätzliche Faktoren wie IL-4 die gesteigerte T-Zellaktivität
bei der AD vermitteln.
4.13 Schlussfolgerungen
In der vorliegenden Arbeit konnte eine verminderte Aktivierbarkeit neonataler naiver T-Zellen nach Stimulation mit SAC bei Kindern, die innerhalb der ersten 6 Lebensmonate eine atopische Dermatitis entwickelten, nachgewiesen werden. Dies
begünstigt möglicherweise die frühe Besiedlung der Haut mit diesem Keim in deren Folge die Wechselwirkungen zwischen S. aureus und dem Immunsystem bei
AD die Entstehung der entzündlichen Hautreaktionen fördert. In Anlehnung an die
Hygiene Hypothese lässt sich darüber hinaus spekulieren, dass eine verminderte
Aktivierbarkeit, ähnlich einer verminderten bakteriellen Exposition die Entstehung
allergiefördernder Reaktionsmuster begünstigt.
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5 Zusammenfassung
Die Zunahme der Prävalenz der atopischen Dermatitis sowie weiterer Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis wie dem allergischen Asthma bronchiale
und der allergischen Rhinokonjunktivitis stellt ein wachsendes Gesundheitsproblem dar und die zur Verfügung stehenden Therapiemaßnahmen sind häufig noch
unzureichend. Die Kenntnisse über die der AD zugrunde liegenden Pathomechanismen konnten in den letzten Jahren erheblich erweitert werden, eindeutig geklärt ist die Entstehung der Erkrankung jedoch nicht. Es konnten bisher sowohl
genetische als auch Umweltfaktoren identifiziert werden, welche die Pathogenese
der AD beeinflussen. So hat sich in den letzten Jahren zunehmend die HygieneHypothese bestätigt, nach der die reduzierte bakterielle Exposition von Kindern,
vor allem in den am stärksten betroffenen westlichen Industrienationen, entscheidend für den Prävalenzanstieg der Erkrankungen aus dem atopischen Formenkreis verantwortlich ist.
Ein besonderes Merkmal der atopischen Dermatitis ist die chronische Besiedlung
der Haut mit S. aureus, auch auf klinisch unauffälligen Hautarealen. Zunehmende
Erkenntnisse über die Interaktionen von S. aureus mit dem Immunsystem bei der
AD weisen darauf hin, dass die Besiedlung mit diesem Keim nicht nur ein unspezifisches Begleitphänomen darstellt sondern Entstehung und Aufrechterhaltung
der inflammatorischen Hautreaktionen begünstigt. Die Ursachen für die chronische Besiedlung der Haut sowie die genauen Mechanismen, durch welche S. aureus die entzündlichen Hautveränderungen bei der AD begünstigt, sind nicht eindeutig geklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde in einer prospektiven Studie die
Wirkung von Staphylococcus aureus Cowan I (SAC) auf das Immunsystem Neugeborener, die eine AD entwickeln, unter folgenden Fragestellungen untersucht:
(1) Ist die Stimulierbarkeit der T-Zellen durch SAC bereits vor dem Auftreten der
AD verändert?
(2) Gibt es einen Unterschied bezüglich der Aktivierbarkeit der T-Zellen von Kindern mit AD im 6. Lebensmonat und zum Zeitpunkt der Geburt?
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(3) Ergeben sich aus den Beobachtungen Hinweise auf die Ursachen für die vermehrte Besiedlung der Haut mit S. aureus bei der AD und die Entstehung allergiefördernder Zytokinsekretionsmuster?
Die mononukleären Nabelschnurblutzellen von 29 Neugeborenen wurden für 7
Tage mit SAC stimuliert, anschließend erfolgte die durchflusszytometrische Bestimmung der intrazellulären IL-2 Synthese sowie der Oberfächenmarker CD3 und
CD45R0. Im Alter der Kinder von 6 Monaten wurden die Messungen wiederholt,
zusätzlich wurden die Probanden klinisch untersucht und in eine AD- und eine
Kontrollgruppe unterteilt. Bei 6 der 29 Probanden wurde eine atopische Dermatitis
diagnostiziert.
Im Nabelschnurblut der Neugeborenen, die eine AD entwickelten, war die IL-2
Synthese gegenüber der Kontrollgruppe signifikant vermindert. Nach Differenzierung der Zellen anhand des Oberflächenmarkers CD45R0 zeigte sich bei den naiven, nicht jedoch bei den memory T-Zellen der AD Gruppe, eine signifikant verminderte IL-2 Produktion. Nach 6 Monaten war die IL-2 Synthese in der AD Gruppe nicht mehr signifikant vermindert. Weiterhin fand sich zwischen den Probanden
zum Zeitpunkt der Geburt und im Alter von 6 Monaten kein Unterschied bezüglich
der Expression des Oberflächenmarkers CD45R0.
Die Ergebnisse weisen auf eine verminderte Aktivierbarkeit naiver T-Zellen nach
SAC Stimulation bei Kindern mit AD zum Zeitpunkt der Geburt hin. Dies begünstigt möglicherweise die frühe Besiedlung mit diesem Keim, indem eine effektive
Erregerelimination behindert wird. Darüber hinaus wird infolge einer verminderten
Aktivierbarkeit möglicherweise die Entstehung eines allergiefördernden TH2Zytokinsekretionsmusters begünstigt. Der fehlende Nachweis eines signifikanten
Unterschieds bezüglich der IL-2 Produktion nach 6 Monaten lässt vermuten, dass
bei der AD Gruppe zum Zeitpunkt der Geburt ein Ausreifungsdefekt der T-Zellen
und/oder akzessorischen Zellen besteht, der bis zum 6. Lebensmonat ausgeglichen ist. Anhand der hier aufgeführte Ergebnisse kann nicht nachvollzogen werden, zu welchem Typ von Effektorzellen die SAC stimulierten T-Zellen ausdifferenzieren. Es ist jedoch davon auszugehen, dass sich zu diesem Zeitpunkt bereits
eine Dysregulation des TH1/TH2 Gleichgewichtes etabliert hat, die nach SAC
Stimulation in der AD Gruppe die Ausbildung einer effektiven TH1 Antwort inhiDissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
biert. Zusammengefasst lässt sich die Hypothese aufstellen, dass aufgrund einer
Unreife des Immunsystems Atopierisikoneugeborener die Besiedlung der Haut mit
Staphylokokken begünstigt wird und die Wechselwirkungen zwischen S. aureus
und dem Immunsystem bei AD die Entstehung eines allergiefördernden Zytokinsekretionsmusters begünstigen.
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Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
7 Anhang
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Struktur der Zellwand grampositiver Bakterien
Abbildung 2:
Die IL-2 Synthese ist im Nabelschnurblut nach SAC-
S. 6
S. 20
Stimulation bei Kindern mit AD vermindert.
Abbildung 3:
Die IL-2 Produktion CD45R0+ Nabelschnurblutzellen
ist bei Kindern mit AD nicht signifikant vermindert
Abbildung 4:
S.21
Der Anteil CD45R0+ Nabelschnurblutzellen ist nach
SAC Stimulation bei Kindern mit AD nicht signifikant
S.22
vermindert
Abbildung 5:
Die IL-2 Synthese nach SAC Stimulation ist im 6. Lebensmonat bei Kindern mit AD nicht signifikant ver-
S. 23
mindert
Abbildung 6:
Der Anteil CD45R0+ Zellen nach SAC-Stimulation ist
im 6. Lebensmonat in der AD Gruppe nicht signifi-
S. 24
kant verändert
Abbildung 7:
Naive T-Zellen benötigen für ihre Aktivierung ein
costimulierendes Signal
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S.28
Seite 64
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Probandenkollektiv
S. 12
Tabelle 2:
Gegenüberstellung der Probanden
S. 13
mit AD und der Kontrollgruppe
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Seite 65
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Bochumer Allergiestudie
Sehr geehrte Eltern !
Etwa jedes dritte Kind leidet inzwischen unter Neurodermitis, Asthma oder Heuschnupfen.
Die Veranlagung zu diesen Erkrankungen ist angeboren und oft schon im ersten Lebensjahr zu erkennen. Die allergologische Arbeitsgruppe der Universitäts-Kinderklinik beschäftigt sich seit vielen Jahren mit den Möglichkeiten der Früherkennung und Vorbeugung
allergischer Erkrankungen bei Säuglingen.
In diesem Jahr führen wir eine Untersuchung durch, die mit neuen und verbesserten Methoden das Ziel hat, das Abwehrsystem von Neugeborenen zu untersuchen. Wir wollen
vor allem die Blutzellen genauer kennen lernen, die für die Auslösung von Neurodermitis
und Asthma verantwortlich sind.
Wir möchten Sie auf diesem Weg fragen, ob Sie interessiert sind, mit Ihrem Kind an der
Untersuchung teilzunehmen.
Für Sie und Ihr Kind würde das bedeuten:
1. Mit dem Nabelschnurblut, das während der Geburt routinemäßig gewonnen wird,
würden wir eine Untersuchung des Abwehrsystems Ihres Kindes durchführen.
2. Bei beiden Elternteilen würden wir mit Hilfe eines Fragebogens eine eventuell vorhandene Neigung zu allergischen Erkrankungen überprüfen.
3. Nach 6 Monaten wollen wir Ihr Kind noch einmal untersuchen. Eine Untersuchung
der Haut stellt den Abschluss der Untersuchungen dar.
4. Jederzeit können Sie Frau Dr. med. Leinhaas oder Herrn Dr. med. Schauer anrufen, wenn Sie Fragen zur Gesundheit Ihres Kindes haben und wenn Sie Hautveränderungen feststellen. Tel. 0234/509-2630 bzw. 2631
Diese Studie soll ausschließlich der Verbesserung unseres Verständnisses allergischer
Erkrankungen dienen.
Bitte besprechen Sie mit Ihrem Partner, ob Sie teilnehmen möchten. Wir werden Sie in
den nächsten Tagen auf jeden Fall noch einmal persönlich ansprechen und um Ihr schriftliches Einverständnis bitten.
Mit freundlichen Grüßen
Prof. Rieger
Direktor der UniversitätsKinderklinik imSt. JosefHospital
Dr. med. Strunz
Chefarzt d. Abt. für Gynäkologie und Geburtshilfe im St. Elisabeth
Hospital
Dipl.-Biol.
Anja-M. Thurau
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
G. Janecka
S. Grinzinger
D. Tomi
Seite 66
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Dokumentation der Allergiestudie
Klinik:__________________________
Name des Patienten:_______________________
Name der Mutter:________________
Adresse:___________________________
Plz:_____________ Wohnort:_______________________
Telefon:____________
Probennummer:_________________
1. Allgemeine Daten
NR
Teilnahmenummer
________________
GEB
Geburtsdatum
________________
GESCH
Geschlecht
NAT
Nationalität
1
Weiblich
2
männlich
1
Deutsch
2
Europäisch
3
Sonst. Nationalität
2. Risikozuordnung
RISIKO
Risikoscore
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
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1
Elternanamnese
negativ
2
Elternanamnese unsicher
4
1 Eltern-/ Geschwisteranamnese positiv
5
2 Elternanamnesen
positiv
Seite 67
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
FAMILIE
Allergie in d. Familie
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
keiner
Mutter: fragliche Allergie
Mutter: Allergie
Vater: Allergie
beide Eltern: Allergie
Geschwister: Allergie
Mutter: Allergie; Vater: fraglich
Mutter: fraglich; Vater: Allergie
Vater: fragliche Allergie
Anamnese neg., IgE erhöht
beide Eltern: fragliche Allergie
Geschwister Allergie; Vater: fraglich
Geschwister Allergie; Mutter fraglich
3. Familienanamnese
3.1
Anamnese der Mutter
MAGE
Alter der Mutter:
MALL
Mutter Allergie
0
1
2
nein fraglich
ja
MHAUT
Erkrankungen der Haut
0
1
2
3
4
5
keine Neurodermitis Kontaktekzem Urtikaria
Schuppenflechte
sonstige
MKON
Kontaktekzem
0
1
2
3.
keines
gegen Metalle
gegen Pflegemittel
sonstige
MNEU
Neurodermitis
0
1
2
nein fraglich ja
MNTH
Therapie der Neurodermitis
0
1
2
3
4
keine Cortisonsalben Harnstoffsalben fettende Salben
sonstige
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_____________
Seite 68
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
MURT
Urtikaria
0
1
2
3
keine
bei Nahrungsmitteln
sonstige
Nahrungsmittel und sonstige
MRHIN
Allergische Rhinitis
0
1
2
3
4
5
keine
Gräserpollen
Baumpollen
Tierhaare
Hausstaub
sonstige
MRTH
Therapie all. Rhinitis
0
1
2
3
4
keine
DNCG
Cortisonspray
Hyposensibilisierung
sonstige
MASTH
Asthma
0
1
2
3
4
5
kein
intrinsic
Pollen
Tierhaare
Hausstaub
sonstige
MATH
Therapie des Asthmas
0
1
2
3
4
keine
ß2-Mimetika
Cortisonspray
DNCG
sonstige
MTEST
Allergietestung
0
1
2
3
4
5
6
7
keiner
Pollen
Tierhaare
Hausstaub
Nahrungsmittel
sonstige
alles negativ
Ergebnis unbekannt
MHI
Verfahren der Testung
0
1
2
3
kein
Hauttest
spez. IgE
Hauttest und spez. IgE
MERK
Weitere Erkrankungen
0
keine
1
2
3
4
5
6
7
Schilddrüsenunterfunktion
Schilddrüsenüberfunktion
Hypotonie
Hypertonus
Bewegungsapparat
Rheumat. Erkrankung
Sonstige
0
1
2
3
nicht
1-10 Zigaretten/Tag
11-20 Zigaretten/Tag
20 und mehr Zigaretten/Tag
Rauchen vor Schwangerschaft
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Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Rauchen in Schwangerschaft
0
1
2
3
4
nicht
1-10 Zigaretten/Tag
11-20 Zigaretten/Tag
20 und mehr Zigaretten/Tag
Anfang SS aufgehört
Milchproduktzufuhr in SS
0
1
2
3
Keine
wie immer
mehr als sonst weniger als sonst
Obst und Gemüse in der SS
0
1
2
3
keine
wie immer
mehr als sonst weniger als sonst
Fleisch in der SS
0
1
2
3
keine
wie immer
mehr als sonst weniger als sonst
3.2
Anamnese des Vaters
VAGE
Alter des Vaters:
VALL
Vater Allergie
0
1
2
nein
fraglich
ja
VHAUT
Erkrankungen der Haut
0
1
2
3
4
5
keine
Neurodermitis Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
sonstige
VKON
Kontaktekzem
0
1
2
3.
keines
gegen Metalle
gegen Pflegemittel
sonstige
VNEU
Neurodermitis
0
1
2
nein
fraglich
ja
VNTH
Therapie der Neurodermitis
0
1
2
3
4
keine
Cortisonsalben Harnstoffsalben
fettende Salben
sonstige
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
_____________
Seite 70
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
VURT
Urtikaria
0
1
2
3
keine
bei Nahrungsmitteln
sonstige
Nahrungsmittel und sonstige
VRHIN
Allergische Rhinitis
0
1
2
3
4
5
keine
Gräserpollen
Baumpollen
Tierhaare
Hausstaub
Sonstige
VRTH
Therapie all. Rhinitis
0
1
2
3
4
keine
DNCG
Cortisonspray
Hyposensibilisierung
Sonstige
VASTH
Asthma
0
1
2
3
4
5
kein
intrinsic
Pollen
Tierhaare
Hausstaub
sonstige
VATH
Therapie des Asthmas
0
1
2
3
4
keine
ß2-Mimetika
Cortisonspray
DNCG
sonstige
VTEST
Allergietestung
0
1
2
3
4
5
6
7
keiner
Pollen
Tierhaare
Hausstaub
Nahrungsmittel
sonstige
alles negativ
Ergebnis unbekannt
VHI
Verfahren der Testung
0
1
2
3
kein
Hauttest
spez. IgE
Hauttest und spez. IgE
VERK
Weitere Erkrankungen
0
1
2
3
4
5
6
7
keine
Schilddrüsenunterfunktion
Schilddrüsenüberfunktion
Hypotonie
Hypertonus
Bewegungsapparat
Rheumat. Erkrankung
sonstige
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
Seite 71
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
VR
Rauchen
3.3
nicht
1-10 Zigaretten/Tag
11-20 Zigaretten/Tag
20 und mehr Zigaretten/Tag
Anfang SS aufgehört
Geschwister
GNR
Anzahl der Geschwister
GALL
Allergieanamnese d. Geschwister
GANR
Anzahl der Geschwister
mit Allergie
GAD1
GAD2
3.4
0
1
2
3
4
________
0
1
2
Nein
fraglich
ja
________
Allergiediagnosen 1
0
1
2
3
4
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
Allergiediagnosen 2
1
allergische Rhinitis
2
3
Asthma
sonstige
Familienanamnese
MMAL1
Mutter der Mutter 1
0
1
2
3
4
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
MMAL2
Mutter der Mutter 2
1
2
3
allergische Rhinitis
Asthma
sonstige
MVAL1
Vater der Mutter 1
0
1
2
3
4
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
MVAL2
Vater der Mutter 2
1
2
3
allergische Rhinitis
Asthma
sonstige
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
Seite 72
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
MGAL1
Geschwister Mutter 1
0
1
2
3
4
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
MGAL2
Geschwister Mutter 2
1
2
3
allergische Rhinitis
Asthma
sonstige
VMAL1
Mutter des Vaters 1
VMAL2
Mutter des Vaters 2
0
1
2
3
4
0
1
2
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
allergische Rhinitis
Asthma
sonstige
VVAL1
Vater des Vaters 1
0
1
2
3
4
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
VVAL2
Vater des Vaters 2
1
2
3
allergische Rhinitis
Asthma
sonstige
VGAL1
Geschwister d. Vaters 1
VGAL2
Geschwister d. Vaters 2
0
1
2
3
4
1
2
3
keine
Neurodermitis
Kontaktekzem
Urtikaria
Schuppenflechte
allergische Rhinitis
Asthma
sonstige
4. Wohnverhältnisse der Familie
WSOS
Sozialer Status der Familie
1
2
2
niedrig
mittel
gehoben
WAGE
Alter der Wohnung
1
2
3
>10 Jahre
1-10 Jahre
Neubau
WFU
Überwiegender Fußbodenbelag
1
2
3
4
Teppichboden
Holz
Stein
Linoleum
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vorgelegt durch Susanne Grinzinger
Seite 73
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
WFK
Fußbodenbelag Kinderzimmer
1
2
3
4
Teppichboden
Holz
Stein
Linoleum
WFS
Fußbodenbelag Schlafzimmer Eltern
1
2
3
4
Teppichboden
Holz
Stein
Linoleum
WFW
Fußbodenbelag Wohnzimmer
1
2
3
4
Teppichboden
Holz
Stein
Linoleum
WPFL
Pflanzen im Wohnbereich
WTW
Tiere in der Wohnung
WTG
Tiere in Garten, Stall, Balkon
0
1
2
3
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
Keine
wenige
mittel
viele
keine
Hund
Katze
Nagetiere
Vögel
sonstige
keine
Hund
Katze
Nagetiere
Vögel
sonstige
WTU
Tiere bei Nachbarn/Freunden
0
1
2
3
4
5
keine
Hund
Katze
Nagetiere
Vögel
sonstige
WRAU
Rauchen in der Wohnung
WBD
Decke des Kindes
WBK
Kopfkissen des Kindes
0
1
2
3
4
1
2
3
0
1
2
3
niemand raucht
rauchen nur auf Balkon
rauchen nur im Wohnzimmer
nur Besuch
ganze Wohnung
Synthetik
Daune
Schurwolle
Keines
Synthetik
Daune
Schurwolle
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
Seite 74
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
5. Schwangerschaft, Geburt, Neugeborenenperiode
U1SSB
Besonderheiten in der Schwangerschaft
0
1
2
3
Keine
vorz. Wehen
Blutungen
bakt. Infektionen
U1SSM
Medikamente in der Schwangerschaft
0
1
2
3
4
Keine
Eisenpräparate
Magnesium
Calcium
sonstige
U1SSW
Schwangerschaftswochen
U1GM
Geburtsmodus
1
2
3
Normal
Vakuum/Zange
Sectio
U1GB
Besonderheiten bei der Geburt
0
1
2
3
4
5
Keine
Abfall kindl. HT
vorzeit. Blasensprung
Infektion
kindl. Größe
grünes Fruchtwasser
U1NB
Besonderheit Neugeborenenperiode 0
1
2
3
4
5
6
Keine
postpart. Anpassungsst.
V.a. Infektion
Infektion
Ikterus
Frühgeburtlichkeit
sonstiges
U1NK
Behandlung in Kinderklinik
0
1
Nein
0
1
2
3
4
Keine
Phototherapie
Beatmung
Antibiotikatherapie
sonstige
U1NT
Erforderliche Therapie
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
________
ja
Seite 75
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
5. Vorsorgeuntersuchungen
V1LC
U1 Länge cm
_______
V1LP
U1 Länge Percentilen
_______
V1GG
U1 Gewicht g
_______
V1GP
U1 Gewicht Percentilen
_______
V1KC
U1 Kopfumfang cm
_______
V1KP
U1 Kopfumfang Percentilen
_______
V1B
U1 Bemerkungen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
0
Keine
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Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Danksagung
Meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. U. Schauer, danke ich für die freundliche
Überlassung des Themas und die hervorragende Unterstützung bei der Erstellung
der Arbeit. In zahlreichen Gesprächen hat er durch sein kompetentes Fachwissen,
nützliche Tipps und seine Bereitschaft jederzeit auf meine Fragen einzugehen das
Gelingen der Arbeit ermöglicht.
Ich danke Frau Anja-Maria Thurau, Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika
Michel für die Unterstützung und Anregung bei der praktischen Durchführung der
Untersuchungen im Immunologischen Labor.
Ich danke meinen Eltern Christel und Peter Grinzinger für ihr Interesse an der Arbeit und die sorgfältige Durchsicht.
Ich danke meinem Lebenspartner, Stefan Krampe für die geduldige Unterstützung
und Motivierung bei der Erstellung der Arbeit.
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
vorgelegt durch Susanne Grinzinger
Seite 77
Interleukin-2 Produktion neonataler T-Zellen nach Stimulation mit Staphylococcus aureus in Abhängigkeit
vom Auftreten einer atopischen Dermatitis
Lebenslauf
Angaben zur Person
Name
Susanne Grinzinger
Geburtsdatum/-ort
19. Mai 1972 in Freiburg im Breisgau
Familienstand
ledig
Staatsangehörigkeit
deutsch
Anschrift
Zwingenbergerstr. 11A, 64665 Alsbach
Schulausbildung
8/1978 - 6/1982
Grundschule in Konstanz
8/1982 - 6/1991
Heinrich-Suso-Gymnasium in Konstanz; Abitur
Hochschulausbildung
10/1991 - 4/1998 Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum
4/1998
Drittes Staatsexamen
Berufstätigkeit
1/1999 - 6/2000
Ärztin im Praktikum in der Neurologischen Klinik des
städtischen Klinikums Darmstadt; Leitung Professor Dr.
Detlev Claus.
2/2001-2/2004
Assistenzärztin in den Abteilungen für Innere Medizin
und Neurologische Rehabilitation des Kreiskrankenhauses Jugenheim unter der Leitung von Herrn Dr. W.
Dotzel.
Alsbach, September 2004
Susanne Grinzinger
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vorgelegt durch Susanne Grinzinger
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