mRNA-Abbau im Zytoplasma

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Posttranskriptionelle Genregulation
mRNA-Abbau im Zytoplasma
GEORG STOECKLIN
DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM, DKFZ-ZMBH ALLIANZ, HEIDELBERG
In eukaryotischen Zellen werden bestimmte mRNAs gezielt und schnell
abgebaut. Dies betrifft Transkripte, die ein frühzeitiges Stopp-Codon enthalten, an eine siRNA oder miRNA binden oder ein Adenosin/Uridinreiches Element besitzen. Wichtig dafür sind P-Bodies, kleine Körperchen
im Zellplasma, in denen RNA-abbauende Enzyme in hoher Konzentration
vorliegen. Dort werden mRNAs von der Translation vorübergehend ferngehalten oder direkt abgebaut.
In eukaryotic cells, certain classes of mRNAs are targeted for rapid
degradation. This includes mRNAs that harbour a premature termination
codon, bind to siRNAs or miRNAs, or contain an adenosine/uridine-rich
element. The process of mRNA silencing and degradation involves
P-bodies, small cytoplasmic foci that contain high concentrations of
RNA-degrading enzymes.
ó Jeder Molekularbiologe fürchtet sich vor
dem unspezifischen Abbau von RNA, der
immer dann eintritt, wenn Zellen aufge-
schlossen und RNasen freigesetzt werden. Im
Gegensatz dazu sind die meisten mRNAs
innerhalb einer eukaryotischen Zelle erstaun-
lich stabil. Dabei sind es im Wesentlichen
zwei Strukturen, welche die mRNA vor Abbau
schützen: eine modifizierte Nukleinsäure, 7Methylguanosin (m7G), am 5’-Ende der
mRNA und ein Poly-Adenosin(A)-Schwanz an
ihrem 3’-Ende. Bestimmte Klassen von
mRNAs dagegen werden von der Zelle
gezielt abgebaut, entweder weil sie einen
Defekt vorweisen und von der Qualitätskontrolle erfasst werden oder weil die Transkripte eine regulatorische Sequenz enthalten, welche über mRNA-Abbau die Expression des entsprechenden Gens dämpft. Dabei
verwendet die Zelle unterschiedliche Wege,
um den Abbau dieser mRNAs auszulösen
(Abb. 1).
Bestimmte mRNAs werden schnell
abgebaut
Wenn die Protein-codierende Region einer
mRNA vor dem eigentlichen Stopp-Codon ein
frühzeitiges Stopp-Codon (premature termination codon, PTC) enthält, erkennt die Proteinsynthese-Maschinerie diesen Defekt und
˚ Abb. 1: Abbauwege kurzlebiger mRNAs in eukaryotischen Zellen. mRNAs mit einem frühzeitigen Stopp-Codon (premature termination codon, PTC)
werden vom nonsense-mediated mRNA decay(NMD)-Weg erfasst und mittels einer Endonuklease (Smg6) abgebaut. siRNAs binden an mRNAs und
induzieren ebenfalls über eine Endonuklease (Ago2) den Abbau der mRNA. miRNAs binden an mRNAs mit unvollständiger Komplementarität und
beschleunigen die Deadenylierung der mRNA. mRNAs mit einem Adenosin/Uridin-reichen Element (ARE) werden über den ARE-mediated mRNA
decay(AMD)-Weg abgebaut, an dessen Anfang ebenfalls die Deadenylierung der mRNA steht. Danach können Exonukleasen des Exosoms (Exo) die
mRNA von 3’ nach 5’ abbauen. Gleichzeitig wird nach der Deadenylierung m7G vom 5’-Ende der mRNA durch das Decapping-Enzym Dcp2 entfernt, worauf die Exonuklease Xrn1 die mRNA von 5’ nach 3’ abbaut.
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B
C
˚ Abb. 2: Experimentelle Beobachtung der Abbaurate verschiedener mRNAs. In HeLa-Zellen wurde ein β-Globin-Reportergen stabil exprimiert, dessen
Transkription durch Wegnahme von Doxycyclin gehemmt werden kann. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Blockierung der Transkription wurde zytoplasmatische RNA isoliert. Die β-Globin-Reporter-mRNA wurde mittels Northern Blot detektiert, Nucleolin-mRNA dient als Ladekontrolle. A, β-Globin-mRNA ist
über einen Zeitraum von sechs Stunden stabil. B, Eine Variante der β-Globin-mRNA, die von einer miRNA (let-7) gebunden wird, zeigt eine beschleunigte
Abbaurate. C, β-Globin-mRNA, die in der 3’-untranslatierten Region ein AU-reiches Element (ARE) enthält, wird besonders schnell abgebaut.
aktiviert eine Endonuklease (Smg6), welche
die mRNA an der defekten Stelle zerschneidet.
Dieser Abbauweg wird nonsense-mediated
mRNA decay (NMD) genannt, weil das frühzeitige Stopp-Codon eine Nonsense-Mutation
darstellt [1]. Ein ähnlicher Abbauweg wird
durch kurze interferierende RNAs (small interfering RNAs, siRNAs) ausgelöst, die mit vollständiger Komplementarität an mRNAs binden und ebenfalls eine Endonuklease (Ago2)
aktivieren. siRNAs werden z. B. von Pflanzenzellen gebildet, wo sie fremde RNA viralen
Ursprungs abbauen und somit der Abwehr
von Krankheitserregern dienen. siRNAs werden heute auch sehr verbreitet von Forschern
eingesetzt, um experimentell die Expression
jeder gewünschten mRNA in Zellen oder ganzen Organismen zu vermindern.
Im Unterschied zu siRNAs werden mikroRNAs (miRNAs) von fast allen eukaryotischen
Zellen als Regulatoren der eigenen Genexpression hergestellt. miRNAs binden mit
unvollständiger Komplementarität an ihre
jeweiligen Ziel-mRNAs und hemmen entweder nur die Translation der mRNA oder lösen
deren Abbau aus (Abb. 2B). Bestimmte Proteine (Ago, GW182) binden zusammen mit
der miRNA an die Ziel-mRNA und beschleunigen deren Deadenylierung [2]. Ohne
Poly(A)-Schwanz ist die mRNA nun anfällig
für Exonukleasen des Exosoms, welche die
mRNA von 3’ nach 5’ abbauen. Gleichzeitig
führt die Deadenylierung auch dazu, dass
m7G vom 5’-Ende der mRNA entfernt wird
(Decapping), wodurch die Exonuklease Xrn1
Zugang zur mRNA bekommt und diese von
5’ nach 3’ abbaut [3].
AU-reiche Elemente sind posttranskriptionelle genetische Schalter
Im Zentrum unserer Forschung stehen
mRNAs, die in ihrer 3’-untranslatierten
Region (UTR) ein Adenosin/Uridin-reiches
Element (ARE) besitzen. ARE-bindende Proteine, wie etwa Tristetraprolin (TTP) oder butyrate response factor (BRF), sind verantwortlich für den schnellen Abbau solcher mRNAs
(Abb. 2C). TTP/BRF interagieren mit Exonukleasen die bewirken, dass die mRNA rasch
deadenyliert und anschließend von beiden
Seiten her abgebaut wird [4, 5]. Dieser Abbauweg, ARE-mediated mRNA decay (AMD) genannt, erscheint auf den ersten Blick äußerst
verschwenderisch. Warum eine mRNA herstellen, wenn sie gleich wieder abgebaut wird?
AMD bietet den Vorteil, dass die Expression
wichtiger Gene besonders schnell an- und
abgeschaltet werden kann, ohne dass die
Transkription des Gens reguliert werden
muss. Wenn Makrophagen z. B. auf einen bakteriellen Erreger treffen und Zytokine ausschütten, die das Immunsystem alarmieren,
dann geschieht dies über eine Stabilisierung
von Zytokin-mRNAs. In ruhenden Makrophagen dagegen sind Zytokin-mRNAs sehr
kurzlebig, wodurch die Synthese von Zytokinen und damit die chronische Stimulation
des Immunsystems verhindert wird. In der
Tat kommen AREs in vielen rasch induzierbaren Genen vor, wie etwa Tumornekrosefaktor-α (TNFα), Interferon-γ und diversen
Interleukinen. So gesehen sind AREs genetische Schalter, die auf posttranskriptioneller
Ebene nicht nur den schnellen Abbau einer
mRNA auslösen, also hemmend auf Genex-
pression wirken, sondern auch zeitlich
begrenzt die Stabilisierung einer mRNA zulassen und damit effiziente Genexpression
ermöglichen.
Die Stabilisierung von mRNAs, die ein ARE
enthalten, erfolgt über die Phosphorylierung
von ARE-bindenden Proteinen. Werden
Makrophagen durch bakterielles Lipopolysaccharid stimuliert, dann wird unter anderem der p38-MAP-Kinase-Signalweg aktiviert,
in dessen Verlauf die MK2-Kinase TTP an
zwei wichtigen Stellen phosphoryliert [6].
Dies wiederum führt zur Anlagerung von zwei
14-3-3-Adaptermolekülen, wodurch TTP an
Aktivität verliert und Zytokin-mRNAs stabilisiert werden. Im Gegenzug entfernt die Phosphatase PP2A die beiden Phosphate und
erzielt damit die Aktivierung von TTP [7]. Dieser Mechanismus trägt dazu bei, dass im späteren Verlauf einer Immun- oder Entzündungsreaktion die Synthese von Zytokinen
auch wieder abgeschaltet wird. Dabei steuert
TTP nicht nur entzündungsfördernde Zytokine, wie etwa TNFα, sondern auch entzündungshemmende Zytokine, wie etwa Interleukin-10 [8]. TTP erweist sich somit als ein
bedeutender Regulator der gesamten Entzündungsreaktion. In der Tat leidet eine
Maus, in der TTP genetisch inaktiviert wurde,
unter chronischen Entzündungen in diversen
Geweben, wie etwa der Haut, den Gelenken
und dem Darm [4].
In P-Bodies werden Transkripte
stillgelegt und abgebaut
Wie schafft es die Zelle eigentlich, die meisten mRNAs stabil zu halten, wenn einzelne
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Transkripte schnell abgebaut werden müssen? Und wie können Endo- und Exonuklease dazu gebracht werden, nur ganz bestimmte mRNAs anzugreifen? Zwei Aspekte tragen
dazu bei, dass der mRNA-Abbau in der Zelle
ein sehr spezifischer Prozess ist. Erstens werden, wie oben beschrieben, die zum Abbau
bestimmten Transkripte besonders gekennzeichnet, etwa durch die Basenpaarung mit
einer siRNA oder miRNA oder durch das Binden bestimmter Proteine wie TTP oder BRF.
Zweitens stellen wir in der Zelle eine räumliche Trennung fest: RNA-abbauende Enzyme kommen im Zytoplasma nicht überall
gleichermaßen vor, sondern sammeln sich in
hohen Konzentrationen in ProzessierungsKörperchen (P-Bodies) [9]. Hierbei handelt es
sich um kleine, im Lichtmikroskop rund
erscheinende Strukturen (Abb. 3A), die im
Zellplasma aller bisher untersuchten eukaryotischen Zellen beobachtet wurden (Einzeller, Pflanzen, Hefe, Invertebraten und Vertebraten). P-Bodies bestehen auf molekularer
Ebene aus einer Ansammlung von mRNA-Par-
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tikeln (mRNPs), das heißt mRNAs zusammen
mit ihren assoziierten Proteinen (Abb. 3B).
Neben mRNPs enthalten P-Bodies fast alle
Enzyme, die im Zellplasma am Abbau von
RNA beteiligt sind: Deadenylasen (Caf1, Ccr4
sowie der assoziierte Not-Komplex), das
Decapping-Enzym Dcp2 zusammen mit seinen Aktivatoren (Dcp1, Hedls, Rck, Pat1,
Edc3) sowie die 5’→3’-Exonuklease Xrn1, die
eng mit dem Lsm1–7-Ring verknüpft ist (Abb.
3C). Nicht in P-Bodies enthalten ist das Exosom, ein Komplex von etwa zehn Proteinen,
bestehend aus RNA-Helikasen, 3’→5’-Exonukleasen und einer Endonuklease. Warum
die Zelle die meisten, jedoch nicht alle RNAabbauenden Enzyme des Zytoplasmas auf
engstem Raum konzentriert, ist derzeit
unklar.
Des Weiteren finden wir in P-Bodies all jene
Faktoren, welche die zum Abbau bestimmten
Transkripte kennzeichnen, also etwa siRNAs,
miRNAs, Ago-Proteine, GW182, diverse NMDKomponenten sowie TTP und BRF. In der Tat
lokalisieren mRNAs, die ein ARE enthalten,
spezifisch in P-Bodies, wogegen mRNAs, die
stabil sind und translatiert werden, sich nicht
dort befinden [10]. In der Hefe wurden sogar
solche Transkripte in P-Bodies nachgewiesen,
die bereits teilweise verdaut waren [11]. Der
Nachweis solcher RNA-Intermediate ist das
beste Indiz, dass mRNA-Abbau tatsächlich in
P-Bodies stattfindet. Allerdings wurden in
ihnen auch Transkripte nachgewiesen, die
nicht zum Abbau bestimmt sind, sondern
durch eine miRNA lediglich an der Translation gehindert werden [12]. Deshalb gehen
wir heute davon aus, das P-Bodies eine doppelte Funktion haben: Sie beherbergen
mRNPs, deren Translation aktiv verhindert
wird, und sie dienen als Orte, wo mRNAs sehr
schnell durch die konzertierte Aktion von Deadenylasen, Decapping-Enzymen und der Exonuklease Xrn1 abgebaut werden.
RNA-Abbau verstehen und nutzen
Noch ungeklärt ist die Frage, wie in P-Bodies
auf engstem Raum zwischen mRNAs unterschieden wird, die lediglich von der Transla-
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˚ Abb. 3: Der Aufbau von P-Bodies. A, mikroskopische Aufnahme einer COS7-Zelle, in der mittels Immunfluoreszenz P-Bodies (gelb) dargestellt wurden. Folgende Proteine wurden einzeln gefärbt: Dcp1 (grün), GW182 (rot), eIF3 (blau). B, schematische Darstellung von mRNA-Protein-Komplexen
(mRNPs), aus denen P-Bodies aufgebaut sind. C, P-Bodies enthalten mRNAs, die durch eine miRNA an der Translation gehindert oder durch ein ARE
dem Abbau zugeführt werden. miRNA-assoziierte Proteine wie Ago2 und GW182 sowie ARE-bindende Proteine wie TTP und BRF kommen ebenfalls in PBodies vor. Zudem befinden sich in P-Bodies Deadenylasen (Caf1, Ccr4) mit dem assoziierten Not1–5-Komplex, das Decapping-Enzym Dcp2 zusammen
mit seinen Aktivatoren (Dcp1, Rck, Hedls, Edc3, Pat1) sowie die 5’→3’-Exonuklease Xrn1, die mit dem heptameren Lsm1–7-Ring verbunden ist.
tion ferngehalten werden, und solchen, die
abgebaut werden. Diese Tatsache ist umso
erstaunlicher, als dass wir in P-Bodies beinahe das gesamte Arsenal an zytoplasmatischen
Endo- und Exonukleasen vorfinden. Zudem
wissen wir nicht, ob P-Bodies auch in der
Immunantwort eine Rolle spielen. Dies wäre
zu erwarten, da Reporter-Transkripte, die ein
ARE besitzen, spezifisch in P-Bodies nachgewiesen werden konnten. Allerdings fehlt uns
bis heute der direkte Beweis, dass in Immunzellen die mRNAs von endogenen Zytokinen
auch tatsächlich in P-Bodies festgehalten und
abgebaut werden. Ein Hauptziel ist es, eines
Tages Medikamente zu haben, mit denen wir
spezifisch die Lokalisation und den Abbau
bestimmter mRNAs beeinflussen können.
Über die Manipulation von AMD hoffen wir,
in entzündliche Krankheitsprozesse eingreifen zu können. Die Verwendung von siRNAs
hat die experimentellen Möglichkeiten in der
Zell- und Molekularbiologie bereits revolutioniert. Am therapeutischen Einsatz von
siRNAs oder miRNAs zur Behandlung verschiedenster Krankheiten wird zurzeit auf
der ganzen Welt fieberhaft gearbeitet.
Danksagung
Mein Dank geht an Jochen Kreth für die experimentelle Unterstützung und an Johanna
Schott für die sorgfältige Durchsicht des
Manuskripts.
ó
Literatur
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AUTOR
Georg Stoecklin
Jahrgang 1969. 1989–1996 Studium der Humanmedizin an den Universitäten
Neuchâtel und Basel. 1997–2001 MD-PhD-Programm mit Promotion in Biologie und
Postdoc an der Universität Basel. 2002–2006 Postdoc und Instructor of Medicine
am Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston. Seit 2006
Helmholtz-Nachwuchsgruppenleiter am DKFZ Heidelberg.
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Korrespondenzadresse:
Dr. Georg Stoecklin
Helmholtz-Nachwuchsgruppe
Posttranskriptionelle Genregulation
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