Post-transkriptionelle Vorgänge
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4. Post-Transkriptionelle Vorgänge Post-transkriptionelle Vorgänge DIA1Reifung/Prozessierung des durch Pol II synthetisierten Primärtranskripts/hnRNA schliesst die folgenden Schritte ein: -Hinzufügen einer Kappe (capping) am 5’ Ende -Entfernen der Introns, Spleissen (splicing) -Polyadenylierung am 3’ Ende -RNA-Editierung tritt sehr selten auf. RNA-Editierung kommt nur einigen Genen vor, die andere drei Prozessen aber bei Genen sehr häufig sind. Spleißen und Polyadenilierung auch sehr häufig sind, aber zB. im Fall von Hystongenen beide fehlen. Der erste Schritte der mRNA-Reifung die Capping ist, sie folgt Spleißen, dann Polyadenilierung ist das letzte Prozess. Die Reifungschritte der mRNA erfolgt vor dem Ende der Transkription, diese Prozesse können selbst die Transkription regulieren. Die meisten eukaryontischen Gene sind Mosaikgene, die aus Exons und Introns zusammengesetzt sind. In dem Vorgang des Spleissens (splicing) werden die Intronbereiche aus dem Primärtranskript herausgeschnitten und die Exons miteinander verbunden. DIA2 Der erste Schritt der Spleiss-Reaktion (Splicing) ist die Interaktion zwischen der 5’Spleiss-Donorstelle und einem A des Introns, der strohmaufwärts kurz vor den PyrimidinReste liegt. Hier wird die Phosphodiesterbindung zwischen dem ersten Nukleotid des Introns (G) und dem letztem Nukleotid des Exons 1 (G) in engen Kontakt mit der 2’ OH-Gruppe des A gebracht. Die 2’ OH-Gruppe greift diese 5’-3’ Bindung an, und in einer Transesterifikationsreaktion eine 5’-2’ Esterbindung wird entstehen, damit die Bindung an der 5’ Spleiss-Donorstelle gelöst wird. Das Intron bildet eine sog. Lariat-(Lasso)-Struktur aus. Im nächsten Schritt erfolgt der Angriff des freigelassenen 3’ Ende des Exons 1 an der 3’ Spleiss-Akzeptorstelle zwischen Intron und Exon 2, und die Bindung gespaltet wird. Dadurch wird das Intron als Lariat-Struktur freigesetzt und durch Nukleasen rasch abgebaut. Gleichzeitig die Ausbildung einer neuen Phosphodiesterbindung zwischen dem 3’ OH Ende des Exon 1 und dem 5’ Phosphat Ende des Exon 2 verknüpft die beiden Exons miteinander. Das Spleissen erfolgt in nukleären RNA-Protein-Partikeln, in den Spleissosomen. Das Spleissosom besteht aus zahlreichen Proteinen und snRNAs (kurze Kern-RNAs, small nuclear RNAs). Die snRNAs sind kurze 100-200 nukleotide lange, uracilreiche RNAs, genannt als U1- U2-, U4- U5- und U6-snRNA und sind mit sechs bis zehn Proteinen assoziiert. Erkennung der Exon-Intron Grenzen und Iniziiering des Spleissvorgangs werden durch Basenparenbildung zwischen der U1- und U2-snRNA und dem Primärtranskript gewährleistet. Während der weiterer Schritten wird der Spleissosom aufgebaut, die Intronsequenz entfernt und die Exons kovalent zusammengefügt. Die Erkennung der Spleißstellen enthält noch die Verzweigungstelle CURAY (R: Purin = A + G, Y: Pyrimidin =C + U) und eine Pyrimidin-reiche Region. Die herausgespleißten Introns eine Lasso-förmige (Lariat) Struktur bilden. Der erste Schritt des Spleißens ist die Bindung von U1 snRNP an der 5 '(Akzeptor)-Spleißstelle, welche eine mehrstufige Sequenz von Ereignissen folgt (siehe Animation), und schließlich werden die Introns herausgeschnitten. Das richtige Spleißen der Introns ermöglichen die ESE (Exon Splicing Enhancer)-Sequenzen und ihre SR-Proteine (S = Serin, R = Arginin). Erleidet ESE eine Mutation, wird die Exon-Sequenz mit der umgebenden Introns herausgeschnitten. Es ist nicht verwunderlich, dass SR-Proteine spielen eine wichtige Rolle in dem Mechanismus des alternativen Spleißens. Grundanforderung 4. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 1 4. Post-Transkriptionelle Vorgänge Spleissen kann auf verschiedene Weise auch erfolgen, das als autokatalytisches Spleissen, oder Selbst-Spleissen genannt wurde. Das Primärtranskript erlangt durch seine Faltung enzymatische Aktivität, als Ribozym (Ribonukleinsäure + Enzym). Diese Aktivität erlaubt es der RNA ihre eigenen Introns zu entfernen. Die Ribozym-Aktivität besitzen Klasse-I Introns aller rRNA-Genen und Klasse-II Introns proteinkodierender Genen von Pflanzen und Pilzen. DIA3 Kappung (capping) das 5'-Ende der mRNA eine posttranskriptionale Modifikation ist. Vor der Beendigung der Transkription der RNA 5'-Ende ein Frei-Triphosphat-Rest enthält. Im Zuge der Kappung eine Triphosphat-Gruppe als "Kappe" auf eine 7-Methyl Guanosin Molekül (7. Kohlenstoffatom: Guanin-Methylrest) ersetzt wird, mit 3 Phosphatgruppen an der erste Base gebunden. Die Kappe und die erste Base ist nicht in der herkömmlichen 5'-3 ', aber in 5'-5'-Richtung (umgekehrt) verbunden ist. Die Verbindung mit der mRNA tut das mRNAGuanyl-Transferaseenzym und dann anschließend Guanylat-Methyltransferase ein Methylrest zur Kappe anknüpft. Funktionen: (1) Regulation der Transkription, (2) Schutz gegen Exonukleasen, (3) Bindung an Ribosomen. Prokaryonten und manche eukaryontische Viren sind in der Lage polycistronisch (multiple-Gen) mRNA zu transkribieren; die eukaryontischen mRNAs jedoch meist nur ein einziges Gen (zB Hox Gene) enthalten. Der Grund dafür ist, dass die keine interne Ribosomenbindungsstelle besitzen, also nur die Kappe dient zur Ribosomenbindung. Der Startpunkt der Transkription und Translation können jedoch mehrere hundert Basenpaare voneinander entfernt liegen. Der Start der Transkription wird von der TATA-Box (oder InrSequenz) bestimmt. Die Translation fängt bei dem AUG-Code (kodiert Methionin) an. Zwischen dem Beginn der mRNA und dem Protein-kodierende Region mehrere AUG-Triplett auftreten. Woher weisst der Tranlationsapparatus, welche der richtige AUG-Triplett ist? Das Abtasten (Scanning) -Hypothese besagt, dass die Kappe mRNA an Ribosomen zuordnet, die dann weitergehen, bis die mRNA-Sequenzen eine geeigneten Basiszusammensetzung mit AUG, GCCRCCAUGG (R = Purin) gefunden wird (Kozak-Sequenz), wovon die Translation losgeht. In Bakterien sie entspricht an Shine-Dalgarno-Sequenz. Die zweite Funktion der mRNA-Kappe ist Abwehr des Moleküls. Diese Aufgabe wird mit der CBC (cap-bindenden Komplex) erreicht. Der CBC, zusätzlich zur Verteidigung spielt eine Rolle in mRNA Export (NES Peptide, Kernexportsignal). Nach dem Transport ein Translationsfaktor das CBC entfernt, damit der Start der Proteinsynthese los gehen kann. Die dritte Funktion der Kappe ist als Kontrollpunkt (checkpoint) regelt Transkription. Die RNA-Synthese durch Polymerase stoppt bei den ersten 20-30 Basen, und erst dann wird fortgesetzt sobald die Kappe angelagert wird. kurze Zusammenfassung: Als das wachsende Transkript eine Länge von 25-30 Nukleotiden erreicht, wird an sein 5’ Ende durch das Enzym Guanyltransferase ein modifiziertes Guanosin, das 7-Methylguanosin hinzugefügt, und m7Gppp-Kappe genannt. Die Kappe stabilisiert biochemisch die mRNA, und hat eine wichtige funktion bei der Initiation der Translation. Die Scanning-Hypothese besagt, dass die Ribosomen binden an Kappe-Sequenzen und suchen bis auf der Kozak-Sequenz (GCCRCCAUGG, R=Purin), welche die Translationsintiationscodon, AUG (Met) enthält. Die Kappe verteidigt die mRNA mit der CBC (cap-binding complex) gebunden. Das CBC-Protein nimmt in mRNAExport mit seinem NES-Peptid (nuclear export signal peptid). DIA5 Polyadenylierung Es befindet sich am 3’ Ende fast aller eukaryontischen RNAs (Ausnahme Histon-mRNAs) ein aus 100-200 A’s bestehender poly(A)-Schwanz [poly(A)RNA]. Die Polyadenylierung erfolgt in zwei Schritten. Im ersten Schritt RNA-spaltende Enzyme, Endonukleasen erkennen die konservierte Sequenz AAUAAA (das Polyadenilierungssignal), und schneiden (hydrolisieren) das Primärtranskript 10-35 Nukleotide strohmabwärts, damit Primärtranskripte einheitlich lang werden. An die schon einheitlich geschnittene RNA katalysiert die Poly(A)-Polymerase und andere Faktoren die Grundanforderung 4. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 2 4. Post-Transkriptionelle Vorgänge Polymerisation der A’s, wobei sie keine DNA als Matrize benötigt! Der Poly(A) Schwanz im Kern und im Zytoplasma mit dem poly(A)-bindenden Protein (PABP) assoziiert ist, spielt eine Rolle in der Stabilität der RNA und in der Translationsregulation. Die polyA-Stelle wird von zwei Konsensussequenzen umgeben. Die erste ist die polyA-Signal (AAUAAA), die distale eine weniger konservierte G- und U-reiche Sequenz ist. An AAUAAA-Sequenz verknüpft der CPSF (Cleavage-and-Polyadenylierungs Spezifitätsfaktor; Schneiden und Polyadenylierungs Spezifitätsfaktor), an zweiten der CstF (Cleavage Stimulationsfaktor, Schneiden-stimulierender Faktor). Nun die zwei gebundenen Faktoren biegen die RNA, die durch RNA-Endonuklease einheitlich geschnitten wird. Dann wird in ein 50 bis 250 Nukleotide lang polyA-Schwanz hinzugefügt zu dem 3'-Ende durch mRNA-Polyadenilat-Polymeraseenzym, ohne DNA-Templat. Funktionen: (1) Schutz gegen Exonukleasen, (2) Bestimmung der Lebensdauer und (3) die Regelung des Effizienz der Translation. In vielen Fällen der erste Schritt des RNAsAbbaus Deadenylierung ist (Abschneiden des Poly-A-Schwanzes). Die Histon-mRNAs enthalten keinen polyA Schwanz; diese Moleküle können das 3'-Ende zu schützen, um eine Schleife zu bilden, welche beständig ist gegen Exonucleasen. DIA5 Die mRNA Reifungprozesse sind miteinander im Zusammenhang Die verschiedene post-Transkriptionelle Prozesse sind miteinander als auch mit der Transkription im Zusammenhang. CBC, Speißensomen und CPSF sind in einer gemeinsamen Wechselwirkung. DIA6 mRNA-Editierung: ein posttranskriptioneller Mechanismus ist, der die Information-Gehalt der mRNA ändert. Zum Beispiel durchläuft der mRNA von Säuger Apolipoprotein durch Cytidindesaminase-Enzym eine Transformationen: CAA Triplett, kodierend für Glutamin sich in UAA Stopp-Codon ändert, die in ein trunkiertes Protein im Darm resultiert; im Leber wird das normale Protein gebildet. Das Glutamat (Glutaminsäure)-Rezeptor wird in vielen neuronalen Zelltypen exprimiert. In der mRNA dieses Rezeptors mehrere Änderungen auftreten können, was beinhaltet den Austausch von Aminosäuren. Die verschiedenen Aminosäuren Rezeptoren funktionieren etwas anders. Wie zB eine Änderung in AUC (kodiert Isoleucin) Triplett "A" Basis "G" zu ändern, so dass GUC (kodiert Valin) entsteht, und dies beinhaltet den Austausch von Aminosäuren auch. RNA-Editing seltener Prozess ist, sich nur wenige Gene beteiligen. Dieser Prozess ist sehr viel häufiger unter tRNAs, wo die seltenen Basen entstehen durch RNAEditierung. DIA7 mRNA-Transport Die reifen mRNAs gelungen über Zelkernmembran-Poren ins Zytoplasm mithilfe von NESProteine (nuclear export signal), die den REC-Komplex (RNA exporter complex) bilden. Dessen Teil sind die im Spleissen –teilnehmenden, phosphorylierten SR-Proteine und die Kappe-bildende CBC-Proteine auch. Unreife RNA bleibt im Kern eingeschlossen. SR-Proteine werden während des Spleißens phosphoryliert. Doch nach Ausschneiden der Introns Dephosphorylierung auftritt, die aktiviert die SR-Proteine, und so sind sie nun auf die REC verbunden und führt mit der RNA-Transport in das Zytoplasma. Nicht nur das Spleißen, sondern Kappungsfaktoren sich jedoch beim Transport von RNA beteiligen, da die CBC an Transportermoleküls gebunden ist. Die mRNA-Moleküle werden in der Nähe der Kernpore transkribiert, doch innerhalb des Kerns, und müssen deshalb nicht dazu einen langen Weg transportiert werden. Der hohe Anteil der unreifen mRNAs kann immer noch nicht den Zellkern verlassen. Transport der Proteine ins Zytoplasma steuern die bei dem N-terminalliegende Signalpeptide. Eine andere Möglichkeit ist, dass die Proteine in der entsprechenden Zellteilchen platziert sind, ist dass die mRNA selbst wird hin transportiert und abgelesen. Viele mRNA sogenannte Postleitzahl (Zip Kode) trägt, und dies bestimmt die subzelluläre Lokalisation von mRNA (Ort). Die Postleitzahl erkennen die Motorproteine. In einem typischen Beispiel die mRNA des Gens ASH1 zwei verschiedenen PLZ-Sequenzen besitzt: Sequenz-abhängig in der Grundanforderung 4. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 3 4. Post-Transkriptionelle Vorgänge codierenden Region und Struktur-basierte am 3'-Ende. Die Sequenz-spezifische PLZ erkennen Transportproteine auf die Basensequenz basiert, Struktur-spezifische wird durch sekundäre Struktur erkennt. Zusammenfassung: Zahlreiche mRNA-Moleküle einen Zip-Code (Postleitzahl) tragen, die die intrazellulare Lokalisation bestimmen. Den Transport gewährleisten Motor-Proteine. Der ZipCode kann durch Sequenz oder Sekundärstruktur bestimmt werden. DIA8 mRNA-Stabilität der verschiedenen mRNAs zeigt hohe Variabilität. Dei Halblebenszeit der mRNA wird durch AU-reiche Elemente, Länge des poly-A-Schwanzes An- oder Abwesenheit der Kappe beeinflusst. Die kurze Halblebenszeit der mRNAs ist ein bestimmtes Prozess, die Menge der Proteinen einer Zelle kann durch die mRNA-Stabilität geregelt werden. Grundanforderung 4. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 4
