Erkennung des RNA-5`-caps durch Proteine

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Molekulare Sandwiches
THOMAS MONECKE, ACHIM DICKMANNS, RALF FICNER
ABTEILUNG FÜR MOLEKULARE STRUKTURBIOLOGIE, UNIVERSITÄT GÖTTINGEN
Ein gemeinsames Merkmal einiger eukaryotischer RNA-Spezies ist deren
5’-m7G-cap. Proteine, die dieses erkennen, sind in die unterschiedlichsten
Prozesse involviert und strukturell sehr verschieden. Dennoch wird von
allen eine ähnliche Strategie zur Erkennung und Bindung des m7G-caps
verfolgt.
The presence of a 5’-m7G-cap is a common feature of several RNA
species. Proteins recognizing and binding the cap use closely related
binding pockets even though their overall structure is very different.
ó Ribonukleinsäuren (RNAs) spielen eine
wesentliche und essenzielle Rolle im Stoffwechsel aller lebenden Organismen sowie in
den Replikationszyklen der Viren. Nahezu
alle eukaryotischen mRNAs sowie bestimmte andere RNA-Moleküle werden nach der
Transkription an ihrem 5’-Ende modifiziert.
Dabei wird durch mehrere enzymatische
Aktivitäten zunächst ein weiteres Guanosin
mit dem 5’-Ende der RNA-Kette verbunden
und dieses daraufhin an seinem Stickstoff 7
(N7) methyliert [1]. Das entstehende Ende
wird cap (Kappe) genannt, da es den 5’-Terminus der RNA charakterisiert und ihn vor
dem Abbau durch Ribonukleasen schützt
(Abb. 1). Bei der Verbindung der angefügten
˚ Abb. 1: Struktur des m7G-caps. Das am N7 methylierte Guanosin ist durch eine 5’-5’-Triphosphatbindung mit dem ersten Nukleotid des RNA-Primärtranskripts verbunden. Diese ungewöhnliche Struktur verleiht dem m7G-cap als 5’-Ende von Polymerase-II-Transkripten eine hohe Stabilität. Dabei wird die Knüpfung der 5’-5’-Bindung sowie die Modifikation der 5’-Base von separaten
enzymatischen Aktivitäten oder Proteinen katalysiert.
Base mit dem Rest der RNA handelt es sich
jedoch nicht um die normale 5’-3’-Verknüpfung, sondern um eine ungewöhnliche 5’-5’Bindung mit drei Phosphatgruppen. Das Guanosin wird gewissermaßen verkehrt herum
an das erste Nukleotid der RNA-Kette angehängt. Diese besondere Verknüpfung ist für
die hohe Stabilität des 5’-Endes diverser RNASpezies verantwortlich, da die zellulären
Ribonukleasen zwar 5’-3’-, nicht aber 5’-5’Verknüpfungen hydrolysieren können.
Zusätzlich führt die Methylgruppe am N7 zu
einer positiven Ladung des methylierten Guanins (m7 G), welche über das aromatische
Ringsystem verteilt ist. Diese Modifikation
verleiht der Base daher eine besondere Eigenschaft, die sie von den anderen, konventionellen Basen unterscheidet. Aufgrund dieser
Eigenschaft und der exponierten Lage am 5’Ende der entsprechenden RNA ist diese Base
prädestiniert für die spezifische Erkennung
durch verschiedene zelluläre und virale Proteine.
Neben den mRNAs werden in Eukaryoten
auch verschiedene andere RNA-Spezies in
dieser Weise modifiziert. So erhalten z. B.
auch kleine nukleäre RNAs (small nuclear,
snRNAs), einige kleine nukleoläre RNAs
(small nucleolar, snoRNAs) und die Telomerase-RNA (TLC1) ein solches m7G-cap [1].
Proteine, die dieses m7G-cap erkennen oder
verändern, sind in die unterschiedlichsten
zellulären Prozesse wie Translationsinitiation, RNA-Transport, mRNA-Abbau, Biogenese von Ribonukleoproteinpartikeln (RNPs)
und virale Replikation involviert. Obwohl all
diese Proteine strukturell, wie auch funktionell grundlegend verschieden sind und sich
evolutiv auf den unterschiedlichsten Ebenen
entwickelt haben, verfolgen alle eine ähnliche Strategie zur Erkennung des m7G-caps,
die ggf. leicht modifiziert und angepasst wird.
Die Anforderungen an das Protein selbst,
seine Sequenz und an die das m7G-cap umgebenden Aminosäuren sind dabei genauso einfach wie effektiv. In der Regel wird das positiv geladene 7-Methyl-Guanin zwischen zwei
aromatischen Aminosäuren in einer Art SandBIOspektrum | 07.09 | 15. Jahrgang
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˚ Abb. 2: Strukturen zellulärer und viraler cap-bindender Proteine im Vergleich. Die Strukturen
der cap-bindenden Proteine sind im Cartoon-Modus und in verschiedenen Farben gezeigt (gelb:
CBP20, PDB ID 1H2T; orange: eIF4E, PDB ID 1L8B; dunkelgrau: PARN, PDB ID 3D45; türkis: DcpS,
PDB ID 1ST0 (zweites DcpS-Monomer in hellgrau); grün: TGS1, PDB ID 3GDH; blau: SPN1, PDB ID
1XK5; rot: PB2, PDB ID 2VQZ; lila: VP39, PDB ID 1AV6). Jeweils rechts dargestellt ist die Detailansicht des gebundenen m7Guanins und der an der Basenstapelung beteiligten Aminosäuren.
wich gebunden [2]. Solche Basen-Aminosäure-Stapel stellen aus mehreren Gründen eine
feste und effektive Bindung dar. Die π-Elektronen der aromatischen Ringsysteme interagieren miteinander und bilden eine sogenannte π-π-Interaktion aus. Einen weiteren
Beitrag leistet die Interaktion der π-Elektronen der aromatischen Aminosäuren mit der
positiven Ladung des m7Guanin-Rings. Durch
diese Kationen-π-Interaktion sind die m7Gcap-bindenden Proteine in der Lage, die
methylierte Base von einem konventionellen,
unmethylierten Guanin zu unterscheiden.
Den dritten Beitrag zur Bindung liefern Interaktionen verschiedenster Aminosäuren mit
den Atomen N1, N2 oder O6 der 5’-Base.
Schließlich besteht ein vierter Beitrag zur Bindung in der Fixierung der Phosphat- oder der
Ribose-Hydroxylgruppen. Bei all diesen Gemeinsamkeiten bezüglich der Bindung des
m7G-caps durch Proteine liegen die Unterschiede im Detail. So ist die Identität und
Natur der Aminosäuren, welche das m7Guanin flankieren, aber auch deren Anzahl oder
Position variabel [3–10].
RNA-Export
Beim Export diverser RNAs aus dem Nukleus
in das Zytoplasma dient das 5’-m7G-cap als
molekulare Markierung, die unter anderem
mRNAs, snRNAs und einige snoRNAs kennzeichnet. Nach der Transkription der snRNA
im Zellkern wird die 5’-Modifikation von
einem Proteinkomplex erkannt und gebunden. Dieser als cap-Bindekomplex (cap binding complex, CBC) bekannte Komplex besteht
aus den zwei cap-Bindeproteinen CBP20 und
CBP80 (cap binding protein) [11]. Zusammen
mit dem phosphorylierten Adapter für den
RNA-Export (phosphorylated adapter for RNA
export, PHAX) werden die snRNA und der daran gebundene cap-Bindekomplex durch den
Exportfaktor CRM1 (chromosome region
maintanance 1) und den kleinen molekularen Schalter Ran in seiner GTP-gebundenen
Form aus dem Zellkern in das Zytoplasma
transportiert. Während die große Untereinheit (CBP80) des CBC in Interaktionen mit
anderen Proteinen involviert ist, bildet die
kleine Untereinheit CBP20 die strukturelle
Plattform, um das m7G-cap zu binden [6].
CBP20 bindet in Anwesenheit von CBP80 das
positiv geladene, methylierte Guanin zwischen den zwei aromatischen Seitenketten
von Tyrosin 20 (CBP20Y20) und Tyrosin 43
(CBP20Y43) (Abb. 2). Zusätzlich bilden weitere Aminosäuren von CBP20 Interaktionen mit
den Atomen O6, N1 und N2 der Guanin-Base,
den Ribose-Hydroxylgruppen und dem Triphosphat aus.
Neben dem m7G-cap der snRNAs wird auch
das cap der mRNAs durch den cap-Bindekomplex erkannt und gebunden. Die Bindung
des CBC erhöht dabei auch die Effizienz des
Spleißens und der Polyadenylierung unreifer
mRNA beträchtlich. Obwohl der cap-Bindekomplex auch an das m7G-cap der mRNAs
bindet, erfolgt deren Export in das Zytoplasma nicht durch PHAX und das Exportin
CRM1. Stattdessen werden mRNAs hauptsächlich von einem Komplex, bestehend aus
den Proteinen TAP (oder NXF1) und p15 (oder
NXT1), exportiert, und einige weitere Proteine sind zusätzlich für diesen Transportvorgang nötig. Nach dem Export der mRNAs in
das Zytoplasma wird der cap-Bindekomplex
durch den eukaryotischen Translations-Initiationsfaktor 4E ersetzt, der die ribosomale
Translation der mRNA in die Proteinsequenz
einleitet [12].
Translationsinitiation
Die Translation von zytoplasmatischen
mRNAs in Eukaryoten wird durch die Bindung des eukaryotischen Translations-Initiationsfaktors 4E (eIF4E) an das m7G-cap der
mRNA initiiert. Ein Komplex, bestehend aus
eIF4E, 4G, 4A und 4B sowie dem Poly(A)-bindenden Protein (PABP), bindet das m7G-cap
und den Poly(A)-Schwanz der mRNA und aktiviert diese [12]. Durch eine Reihe weiterer
Proteine und die kleine Untereinheit des Ribosoms wird schließlich der 48S-Prä-Initiationskomplex gebildet.
Das m7Guanin wird von eIF4E zwischen
den zwei Tryptophanen 56 und 102 (eIF4EW56
und eIF4EW102) gebunden (Abb. 2, [8]). Durch
die ausgeprägten π-Elektronensysteme der
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Seitenketten beider Aminosäuren ist die resultierende Bindung sehr stark und die Freiheitsgrade der Base sind damit sehr gering,
was sehr zu der hohen Affinität des Proteins
für seinen Bindungspartner beiträgt.
mRNA-Abbau
Das 5’-cap spielt auch während des mRNAAbbaus eine wichtige Rolle. Die meisten
mRNA-Abbauwege werden durch die Deadenylierung des 3’-Endes der mRNA initiiert
[13]. Dabei hydrolysieren spezielle Exonukleasen die Esterbindung zwischen benachbarten Nukleotiden des Poly(A)-Schwanzes
der mRNA. Die Poly(A)-spezifische Ribonuklease (PARN) bindet dabei nicht nur den
Poly(A)-Schwanz, sondern gleichzeitig auch
das 5’-m7G-cap der mRNA. Die Bindung des
caps erhöht die Prozessivität und Aktivität
von PARN. Das Vorhandensein des 5’-caps
trägt somit zur Deadenylierung der mRNA
durch diese Exonuklease bei. Interessanterweise bindet PARN das m7G-cap durch sein Cterminales RNA-Erkennungsmotiv (RRM),
welches aus vier β-Strängen und drei α-Helices besteht. Das positiv geladene m7Guanin
wird an der Außenseite des RRM lediglich
durch ein einzelnes Tryptophan (PARNW475)
gebunden, wohingegen die zweite Flanke des
caps frei bleibt (Abb. 2, [10]). Das ist insofern
ungewöhnlich, als dass bei allen anderen charakterisierten cap-Bindeproteinen beide Seiten des caps von Aminosäuren flankiert werden.
Nachdem der Poly(A)-Schwanz der mRNA
durch Exonukleasen entfernt wurde, wird die
verbleibende RNA-Kette meist in 3’→5’-Richtung von weiteren Nukleasen abgebaut [13].
Das m7Guanin kann zurückgewonnen und
wiederverwertet werden. Dazu wird die 5’-5’Triphosphatbindung durch das scavenger
decapping enzyme (DcpS) gespalten [14]. Zu
diesem Zweck bindet das Protein das m7Gcap, indem das modifizierte Guanin auf der
einen Seite von der aromatischen Seitenkette des Tryptophans 175 (DcpSW175) flankiert
wird, wohingegen auf der anderen Seite ein
Leucin (DcpSL206) die cap-Bindetasche abschließt (Abb. 2, [3]). Sowohl die π-π- als auch
die Kationen-π-Interaktion wird in diesem Fall
ausschließlich von einem Tryptophan ausgebildet, was die niedrigere Affinität des Proteins zum Substrat erklären kann.
snRNP-Biogenese
Die spleißosomalen UsnRNPs sind die Hauptkomponenten des Spleißosoms und bestehen
aus einer snRNA und verschiedenen Pro-
teinkomponenten. Bei der Biogenese dieser
Protein-RNA-Komplexe wird die transkribierte
UsnRNA zunächst ins Zytoplasma transportiert, dort mit speziellen Proteinen komplexiert und anschließend wieder in den Zellkern zurücktransportiert [15]. Hier findet die
finale Reifung dieser Partikel, deren Lagerung sowie die Zusammensetzung des Spleißosoms statt, das im Nukleoplasma die nichtcodierenden Sequenzen aus der prä-mRNA
entfernt. Da diese snRNAs ebenfalls von der
RNA-Polymerase II transkribiert werden,
erhalten sie während ihrer Synthese ein m7Gcap. Dieses stellt im weiteren Verlauf eine
wichtige Transport-Markierung dar und wird
im Reifungszyklus der snRNPs durch zwei
weitere Methylierungen am N2 verändert.
Die Trimethylguanosin-Synthase (TGS1)
erkennt und bindet das m7G-cap der in das
Zytoplasma exportierten snRNAs. TGS1 transferiert nacheinander zwei Methylgruppen von
je einem Molekül S-Adenosyl-L-Methionin auf
den exozyklischen Stickstoff N2 der GuaninBase. Das so veränderte cap, welches jetzt
m2,2,7G (2,2,7 für zwei Methylgruppen an N2
und eine an N7) oder m3G-cap (für drei
Methylgruppen insgesamt) genannt wird,
stellt wieder eine Markierung dar, die vom
snRNP-Transportadapter snurportin1 (SPN1)
erkannt wird. SPN1 bindet damit eine veränderte Form des caps, welche jetzt den
Abschluss des zytoplasmatischen Reifungsschritts signalisiert. SPN1 fungiert dabei als
Adapter zwischen der snRNA und dem Transportfaktor Importinβ, der den Import des
snRNPs in den Zellkern vermittelt. Obwohl
beide Proteine, TGS1 und SPN1, das cap in
ähnlichen, direkt aufeinander folgenden Stadien erkennen, erfordert der Unterschied der
cap-Varianten auch Unterschiede in deren
Bindung. Durch die Dimethyltransferase TGS1
wird das m7G-cap an einer Seite durch die
Seitenkette von Tryptophan 766 (TGS1W766)
gestapelt (Abb. 2, [7]). Die andere Seite des
m7Guanins wird ähnlich wie bei DcpS von
einer kleineren, nicht aromatischen Aminosäure (Serin 671; TGS1S671) okkupiert. Dieser
Bindungsmodus lässt, im Gegensatz zur Stapelung durch zwei Aromaten, wie bei eIF4E
oder CBP20, der Base mehr Bewegungsspielraum und bedingt so zum Teil auch die niedrigeren Affinitäten dieser Proteine zu ihrem
Substrat.
Im Gegensatz zu allen bisher vorgestellten
cap-bindenden Proteinen muss der Importadapter SPN1 eine Unterscheidung zwischen
dem 7-Methyl-Guanin und dem 2,2,7-Trimethyl-Guanin vornehmen. SPN1 flankiert das
m2,2,7G-cap auf einer Seite durch die Seitenkette von Tryptophan 276 (SPN1W276), wohingegen die andere Seite der m2,2,7Guanin-Base
nicht durch einen weiteren Proteinrest, sondern durch die zweite RNA-Base – ein Guanin
– flankiert wird (Abb. 2, [9]). Lediglich die
hydrophobe Seitenkette des Leucins 104
(SPN1L104) packt als Abschluss des Sandwiches gegen die zweite RNA-Base (Leucin 104,
in Abb. 2 nicht gezeigt). Interessanterweise
konnte durch Bindungsstudien gezeigt werden, dass die Affinität von SPN1 für das m7Gcap deutlich geringer ist als für den eigentlichen Bindungspartner (m2,2,7G-cap).
Virale Proteine
Da nahezu alle eukaryotischen mRNAs während der Transkription ein m7G-cap erhalten
und dieses im weiteren Verlauf sowohl für die
Stabilität der mRNA als auch für die effektive Translation wichtig ist, ist es nicht verwunderlich, dass viele Viren ihre mRNATranskripte ebenfalls mit einem m7G-cap versehen. Hierzu haben sich im Laufe der Evolution verschiedene Strategien entwickelt [1].
So codiert die RNA einiger Viren für eigene
virale Proteine, die das Anfügen einer 5’-m7Gcap-Struktur katalysieren, oder es wird der
capping-Apparat der Wirtszelle benutzt. Andere Viren stehlen die 5’-caps von zellulären
Wirts-mRNAs (cap snatching) und übertragen
diese abgeschnittenen 5’-Sequenzen auf ihre
eigenen mRNAs, um deren effektive Translation zu gewährleisten. Zu diesem Zweck
schneidet beispielsweise die Untereinheit PB1
der RNA-Polymerase des Influenza-Virus die
ersten zehn Nukleotide von Wirts-mRNAs ab.
Diese kurzen cap-Transkripte werden dann
durch die Polymerase-Untereinheit PB2
gebunden und wirken als kurze Startstücke
für die Synthese viraler mRNAs, deren effektive Translation und hohe Stabilität dadurch
gewährleistet wird. Die Kristallstruktur dieser
PB2-Untereinheit zeigt, dass Influenza-PB2
das m7G-cap auf einer Seite durch Phenylalanin 404 (PB2F404) und auf der anderen Seite durch Histidin 357 (PB2H357) stapelt (Abb.
2, [4]).
Eine Methyltransferase aus dem Vakziniavirus (VP39) modifiziert bereits auf virale
mRNAs transferierte m7G-caps an der 3’Hydroxylgruppe ihrer zweiten Base durch das
Anfügen einer Methylgruppe. Diese Modifikation steigert ebenfalls die Effektivität der
Translation solcher mRNA-Transkripte. Durch
Kristallstrukturanalysen konnte gezeigt werden, dass die VP39-Methyltransferase dazu
das m7Guanin zwischen den zwei aromatiBIOspektrum | 07.09 | 15. Jahrgang
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schen Resten Phenylalanin 180
(VP39F180) und Tyrosin 22 (VP39Y22) bindet (Abb. 2, [5]). Hierdurch wird wieder,
ähnlich wie bei eIF4E, eine effektive und
feste Bindung des Substrats an das Protein durch die zwei auf jeder Seite lokalisierten großen π-Elektronensysteme
gewährleistet.
Zusammenfassend zeigen alle Strukturanalysen der m7G-cap-bindenden Proteine, dass diese Proteine trotz unterschiedlichster Faltung eine gemeinsame
Strategie zur spezifischen Erkennung des
7-Methyl-Guanosins besitzen.
ó
Literatur
[1] Cougot N, van Dijk E, Babajko S et al. (2004) ’Captabolism’. Trends Biochem Sci 29:436–444
[2] Worch R, Stolarski R (2008) Stacking efficiency and
flexibility analysis of aromatic amino acids in cap-binding proteins. Proteins 71:2026–2037
[3] Gu M, Fabrega C, Liu S et al. (2004) Insights into
the structure, mechanism, and regulation of scavenger
mRNA decapping activity. Mol Cell 14:67–80
[4] Guilligay D, Tarendeau F, Resa-Infante P et al.
(2008) The structural basis for cap binding by influenza virus polymerase subunit PB2. Nat Struct Mol Biol
15:500–506
[5] Hodel AE, Gershon PD, Quiocho FA (1998)
Structural basis for sequence-nonspecific recognition of
5’-capped mRNA by a cap-modifying enzyme. Mol Cell
1:443–447
[6] Mazza C, Segref A, Mattaj IW et al. (2002) Largescale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.
EMBO J 21:5548–5557
[7] Monecke T, Dickmanns A, Ficner R (2009)
Structural basis for m7G-cap hypermethylation of small
nuclear, small nucleolar and telomerase RNA by the
dimethyltransferase TGS1. Nucleic Acids Res 37:3865–
3877
[8] Niedzwiecka A, Marcotrigiano J, Stepinski J et al.
(2002) Biophysical studies of eIF4E cap-binding pro-
Seite 725
tein: recognition of mRNA 5’ cap structure and synthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins. J Mol Biol
319:615–635
[9] Strasser A, Dickmanns A, Luhrmann R et al. (2005)
Structural basis for m3G-cap-mediated nuclear import
of spliceosomal UsnRNPs by snurportin1. EMBO J
24:2235–2243
[10] Wu M, Nilsson P, Henriksson N et al. (2009)
Structural basis of m(7)GpppG binding to poly(A)-specific ribonuclease. Structure 17:276–286
[11] Lewis JD, Izaurralde E (1997) The role of the cap
structure in RNA processing and nuclear export. Eur J
Biochem 247:461–469
[12] Sonenberg N, Hinnebusch AG (2009) Regulation of
translation initiation in eukaryotes: mechanisms and
biological targets. Cell 136:731–745
[13] Garneau NL, Wilusz J, Wilusz CJ (2007) The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol
8:113–126
[14] van Dijk E, Le Hir H, Seraphin B (2003) DcpS can
act in the 5’-3’ mRNA decay pathway in addition to the
3’-5’ pathway. Proc Natl Acad Sci USA 100:12081–
12086
[15] Neuenkirchen N, Chari A, Fischer U (2008)
Deciphering the assembly pathway of Sm-class U
snRNPs. FEBS Lett 582:1997–2003
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Ralf Ficner
Institut für Mikrobiologie und Genetik
Göttinger Zentrum für Molekulare Biowissenschaften (GZMB)
Abteilung für Molekulare Strukturbiologie
Justus-von-Liebig-Weg 11
Universität Göttingen
D-37077 Göttingen
Tel.: 0551-39-14071
Fax: 0551-39-14082
[email protected]
AUTOREN
Achim Dickmanns, Ralf Ficner,
Thomas Monecke (v. l. n. r.)
Thomas Monecke
Jahrgang 1979. 1999–2005 Biologiestudium an der Universität Göttingen. Dort 2009 Promotion; seit 2009 Postdoc am Lehrstuhl für Molekulare Strukturbiologie.
Achim Dickmanns
Jahrgang 1963. 1985–1990 Biologiestudium an der Universität Bayreuth. 1995 Promotion
an der LMU München. 1995–1998 Postdoc an der Vanderbilt University, Nashville, und The
Scripps Research Institute, La Jolla, USA. 1998–2001 Postdoc an der Universität Marburg
und am MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen. Seit 2001 wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Abteilung für Molekulare Strukturbiologie, Universität Göttingen.
Ralf Ficner
Jahrgang 1963. 1983–1989 Chemiestudium an der Universität Erlangen. 1992 Promotion.
1992–1993 Postdoc am MPI für Biochemie in Martinsried. 1994–1996 Postdoc am EMBL
Heidelberg. 1997–2000 Nachwuchsgruppenleiter an der Universität Marburg. Seit 2001
Professor für Molekulare Strukturbiologie, Universität Göttingen.
BIOspektrum | 07.09 | 15. Jahrgang