Apoptose bei neoadjuvant behandelten nicht

Aus dem Institut für Pathologie
an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken “Bergmannsheil”Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller
Apoptose bei neoadjuvant behandelten nicht-kleinzelligen
Lungentumoren
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Aydan Yazar
aus Bochum
1999
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Priv.-Doz. Dr. med. K. Junker
Koreferent:
Prof. Dr. med. G. Schultze-Werninghaus
Tag der mündlichen Prüfung: 20.06.2000
Widmung
Ich widme diese Dissertation meinen Eltern
und Geschwistern.
Abstract
Yazar
Aydan
Apoptose bei neoadjuvant behandelten nicht-kleinzelligen Lungentumoren
Bei 54 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren wurde eine neoadjuvante (präoperative)
kombinierte Radio-/Chemotherapie im Rahmen einer kontrollierten Phase II-Studie durchgeführt.
Diesen Patienten ist vor Beginn der Therapie endoskopisch und danach operativ Tumorgewebe
entnommen worden. Prä- und posttherapeutisch entnommene Tumorproben sind unter der Fragestellung
nach Ausmaß, Form und Grad von Apoptose (programmierter Zelltod) histologisch untersucht worden.
Darüberhinaus wurde die Frage des Verhältnisses von prä- und posttherapeutischem Apoptoseverhalten
der Tumoren analysiert. Weitere Untersuchungsaspekte waren das Ausmaß der therapieinduzierten
Tumorregression und die Frage der prognostischen Relevanz der Apoptose.
Alle bösartigen Lungentumoren, die nach Therapie zur Operation gelangten, befanden sich im Stadium
IIIA oder IIIB, wobei 36 Plattenepithel- und 18 Adenokarzinome vorlagen.
Das Untersuchungsgut, prä- und posttherapeutisch gewonnen, wurde mittels ISEL- (in situ endlabeling) und TUNEL- (TdT-mediated dUTP-nick end-labeling) Technik aufgearbeitet und
anschließend lichtmikroskopisch analysiert.
Der relative Anteil apoptotischer Zellen bzw. Apoptosekörperchen wurde durch das Auszählen von
1.000 Tumorzellen mit einem 40er Objektiv lichtmikroskopisch bestimmt und als Apoptoseindex in
Prozent angegeben. Es wurden arithmetische Mittelwerte bei der ISEL- und TUNEL-Technik
prätherapeutisch von 1,609 % bzw. 0,93 % und posttherapeutisch von 1,691 % bzw. 1,1 % ermittelt.
Der Vergleich der prä- und posttherapeutisch nachgewiesenen Apoptoseindices zeigte keinen statistisch
signifikanten Unterschied zwischen den ermittelten Werten für die ISEL- (p = 0,35) und TUNEL(p = 0,45) Technik auf. Mit der ISEL-Technik wurden sowohl prä- als auch posttherapeutisch statistisch
signifikant höhere Apoptoseindices bestimmt als mit der TUNEL-Technik (p = 0,0001). Diese Werte
können einen Hinweis auf eine höhere Spezifität der TUNEL-Methode darstellen. Aber auch die
TUNEL-Methode ist letztlich nicht spezifisch für apoptotische Zellen. Sowohl durch die ISEL- als auch
durch die TUNEL-Technik werden neben apoptotischen Zellen auch nekrotische Tumorbezirke
markiert, so daß die konventionelle Morphologie zur Unterscheidung von Nekrose und Apoptose
zusätzlich berücksichtigt werden sollte.
Die Anwendung des Regressionsgradings nach Junker et al. (1997) zeigte posttherapeutisch bei 7,5 %
der Tumoren Grad I-, bei 25 % Grad IIa-, bei 50 % Grad IIb- und bei 17,5 % Grad IIITumorregressionen. Es ließ sich keine statistisch signifikante Abhängigkeit zwischen den mit den ISELund TUNEL-Techniken nachgewiesenen Apoptoseindices und dem Regressionsgrading
(Regressionsgrad I/IIa versus Regressionsgrad IIb/III) ableiten. Die Gesamtüberlebenszeit zeigte keine
statistisch signifikante Korrelation mit den prä- und posttherapeutisch ermittelten Apoptoseindices.
Für das gesamte Studienkollektiv (n = 54) betrug die mediane Überlebenszeit 20,4 Monate, für die 40
operierten Patienten 23,1 Monate. Bei 27 Studienpatienten der morphologisch bestimmten
Regressionsgrade IIb und III war die mediane Überlebenszeit mit 27,9 Monaten statistisch signifikant
länger als bei 13 Patienten der Regressionsgrade I und IIa mit einer medianen Überlebenszeit von 13,7
Monaten (p = 0,02).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Quantifizierung der Apoptose mittels ISEL- und
TUNEL-Techniken nur in Kombination mit der lichtmikroskopischen Beurteilung der Morphologie der
Tumorzellen möglich ist, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Die durch Apoptoseindices
ermittelten Apoptosephänomene werden durch eine neoadjuvante präoperative Therapie zumindest
nicht dauerhaft modifiziert.
Apoptose bei neoadjuvant behandelten nicht-kleinzelligen
Lungentumoren
Seite
1.
Einleitung
3
1.1
Klassifikation der Lungentumoren
3
1.2
Therapie bösartiger Lungentumoren
10
1.3
Morphologie der Tumorregression
12
1.4
Apoptose -programmierter Zelltod-
16
Literaturübersic ht
1.5
Onkogene, Tumorsuppressorgene und
Proliferationsindices
27
2.
Fragestellung
30
3.
Material und Methode
31
3.1
Patientenkollektiv
31
3.2
Apoptose
34
3.3
ISEL-Technik
36
3.4
TUNEL-Technik
40
3.5
Statistische Methoden
41
1
4.
Ergebnisse
42
4.1
Anwendung des Regressionsgradings
45
4.2
Quantifizierung der Apoptose
47
4.3
Korrelation zwischen Apoptoseindices und anderen
Parametern
53
4.4
Apoptoseparameter und Proliferationsindices
55
4.5
Apoptoseparameter und Tumorsuppressorgene
56
5.
Diskussion
58
5.1
Kombinierte neoadjuvante Chemo- und Radiotherapie
58
5.2
Stellenwert der Apoptose
64
5.3
Quantifizierung der Apoptose,
70
Sensitivität und Spezifität der
ISEL- und TUNEL-Technik
6.
Zusammenfassung
74
7.
Literaturverzeichnis
76
8.
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
91
2
1.
Einleitung
1.1
Klassifikation der Lungentumoren
Bösartige Lungentumoren können in zwei Hauptgruppen unterteilt werden, in nichtkleinzellige und kleinzellige Lungentumoren. Nach Angaben aus klinischen Studien
beträgt der Anteil der nicht-kleinzelligen Lungentumoren ca. 75 %. Plattenepithelkarzinome und Adenokarzinome sind zu etwa gleichen Anteilen vertreten.
Großzellige Karzinome werden zunehmend seltener diagnostiziert, wobei diese nun
überwiegend
den
niedrig
differenzierten
Plattenepithelkarzinomen
und
Adenokarzinomen zugeordnet werden. Das kleinzellige Lungenkarzinom macht ca.
25 % aller bösartigen Lungentumoren aus.
Die Unterteilung in kleinzellige und nicht-kleinzellige Lungentumore ist von
besonderer klinischer Relevanz.
Abb. 1.1.1 zeigt die wichtigsten histologischen Typen der bösartigen Lungentumoren.
Einteilung der Lungentumoren nach ihrer Histologie:
Die aktuelle WHO-Klassifikation der Lungentumoren aus dem Jahre 1999 unterteilt
Neoplasien in 8 übergeordnete Gruppen, die in Tabelle 1.1.1 dargestellt sind.
3
Abb. 1.1.1
Histologische Typen bösartiger Lungentumoren (Vergrößerung 375x)
A
kleinzelliges Lungenkarzinom
B
Plattenepithelkarzinom
C
Adenokarzinom
D
großzelliges Lungenkarzinom
4
Tab. 1.1.1
Histologische Klassifikation von Lungentumoren
(WHO 1999)
1.
Epithelial tumors
1.1
Benign
1.2
Preinvasive lesions
1.3
Malignant:
1.3.1
Squamous cell carcinoma
1.3.2
Small cell carcinoma
1.3.3
Adenocarcinoma
1.3.4
Large cell carcinoma
1.3.5
Adenosquamous carcinoma
1.3.6
Carcinomas with pleomorphic, sarcomatoid or sarcomatous elements
1.3.7
Carcinoid tumour
1.3.8
Carcinomas salivary gland type
1.3.9
Unclassified carcinomas
2.
Soft tissue tumours
3.
Mesothelial tumours
3.1
Benign
3.2
Malignant
4.
Miscellaneous tumours
5.
Lymphoproliferative diseases
6.
Secondary tumours
7.
Unclassified tumours
8.
Tumour-like lesions
5
Eine weitergehende klinische und posttherapeutische Möglichkeit der Einteilung von
Lungentumoren stellt das sogenannte Staging (= Stadium einer Tumorkrankheit) dar,
welches in Anlehnung an die Union Internationale Contre le Cancer (UICC 1978)
und das American Joint Committee on Cancer (AJCC 1979) anhand des TNMSystems durchgeführt wird. Das TNM-System wude erstmals von Denoix im Jahre
1946 beschrieben.
Die Staging-Systeme der UICC und der AJCC wurden weltweit nebeneinander
angewandt, so daß Mountain 1986 ein neues internationales Staging-System für
Lungentumoren veröffentlichte. Diese neue Einteilung diente der Vereinheitlichung
der beiden Staging-Systeme der UICC und des AJCC, um ein universelles Staging
durchführen zu können. Das internationale Staging-System dient als Grundlage der
vorliegenden Arbeit (Tab. 1.1.2).
Mountain stellte 1997 eine neue Überarbeitung des Staging-Systems aus dem Jahre
1986 vor, die dazu dienen sollte Patienten mit ähnlichen Prognosen und
Behandlungsmöglichkeiten besser identifizieren zu können.
6
Tab. 1.1.2
Stadieneinteilung der Lungentumoren (nach Mountain 1986)
occulter Tumor
TX
N0
Stadium 0
TIS
Carcinoma in situ
Stadium I
T1
N0
M0
T2
N0
M0
T1
N1
M0
T2
N1
M0
T3
N0
M0
T3
N1
M0
T1-3
N2
M0
jedes T
N3
M0
T4
jedes N
M0
jedes T
jedes N
M1
Stadium II
Stadium IIIA
Stadium IIIB
Stadium IV
7
M0
Die überaus große Bedeutung des bösartigen Lungentumors liegt darin, daß es das
häufigste Malignom bei Männern und die zweithäufigste bösartige Tumorerkrankung
bei Frauen in westlichen Industriestaaten ist.
Nach Zahlen des saarländischen Krebsregisters erkrankten 1990 etwa 35.000
Menschen in Westdeutschland an einem bösartigen Lungentumor (Gatzemeyer
1994).
Die bösartigen Lungentumoren bevorzugen das männliche Geschlecht mit einer etwa
dreifachen Inzidenz gegenüber den Frauen, wobei das mittlere Erkrankungsalter das
60. Lebensjahr ist. Nach Schätzungen des saarländischen Krebsregisters werden sich
die Erkrankungszahlen bis zum Jahre 2010 wegen des zunehmenden Nikotinabusus
bei Frauen auf ein Verhältnis 1:1 angleichen (Gatzemeyer 1994). Die Inhalation von
Tabakrauch wird als Hauptursache für die Entstehung bösartiger Lungentumoren
angeführt (Müller et al. 1995).
Nach Angaben des statistischen Bundesamtes verstarben im Jahre 1994 212.391
Menschen in Deutschland an bösartigen Neubildungen, darunter 36.160 an malignen
Tumoren der Trachea, der Bronchien und Lunge. Der Anteil der männlichen
Bevölkerung betrug 28.099 und der weiblichen 8.061, was einen Prozentsatz von
77,7 % bzw. 22,3 % darstellt (Statistisches Bundesamt, Wiesbaden 1996).
8
Risikofaktoren der bösartigen Lungentumoren:
Etwa 85 % - 90 % aller bösartigen Lungentumoren werden durch inhalatives
Tabakrauchen verursacht. Bei ca. 5 % aller Patienten spielen berufsbedingte
Schädigungen ätiologisch eine Rolle. Eine regelmäßige Asbestfeinstaubexposition,
Exposition gegenüber Chrom, polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen
wie Benzpyren, Benzol, Ruß und Teer, Arsen (z. B. Winzer), radioaktiven Stoffen (z.
B. Uranbergbau) mit dem sogenannten Schneeberger Lungenkrebs, Kokereirohgase
und Nickel sind wichtige berufsbedingte ätiologische Faktoren.
Als weitere Ursachen sind zu ca. 5 % die Luftverschmutzung und zu ca. 2 % andere
Faktoren wie Ernährungsprobleme (Viamin A-Mangel ?), genetische und unbekannte
Faktoren zu nennen (Abb. 1.1.2).
Risikofaktoren des Bronchialkarzinoms
5% 5%
inhalatives
Zigarettenrauchen
2%
berufsbedingte
Schädigungen
Luftverschmutzung
andere Faktoren
88%
9
1.2
Therapie bösartiger Lungentumoren
Die 5-Jahresüberlebensrate für Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungentumor
beträgt insgesamt unter 10 %. Hierbei wird die Prognose entscheidend vom
vorliegenden Tumorstadium bestimmt. Eine Studie von Mountain mit 3.753
Patienten aus dem Jahre 1986 zeigte die Beziehung zwischen Tumorstadium und
Überlebensrate auf. Die 5-Jahres-Überlebensrate lag im Stadium I zwischen 35,8 %
und 61,9 %, im Stadium II zwischen 22,7 % und 33,6 %, im Stadium III zwischen
4,9 % und 7,6 % und im Stadium IV bei 1,7 %.
Die Behandlung der Wahl der lokalisierten nicht-kleinzelligen Lungentumoren in
den Stadien I und II ist die chirurgische Resektion. Im Stadium IV stehen palliative
Maßnahmen im Vordergrund. Die chirurgische Behandlung der Lungentumoren ist
jedoch nur bei 10 % - 15 % aller Patienten bei Diagnosestellung möglich, wobei
diese Patienten eine 5-Jahresüberlebensrate von 28 % - 40 % aufweisen (Soukop
1984).
Das therapeutische Vorgehen im Stadium III ist noch Gegenstand kontroverser
Diskussionen. Es werden sowohl operative als auch chemo- und/oder radiotherapeutische Maßnahmen angewandt und diskutiert.
Der Vergleich hochdosierter hyperfraktionierter Radiotherapie (50-60 Gy) mit
niedrig dosierter fraktionierter Bestrahlung (< 40 Gy) bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren im Stadium III zeigte eine signifikant höhere 2-Jahresüberlebensrate
auf (p = 0,04) (Perez et al. 1986).
In einer randomisierten Studie von Wils et al. (1984) mit Patienten, die an einem
nicht-kleinzelligem Lungentumor im Stadium III erkrankten, wurden diese einer
Radiotherapie versus kombinierter Radio- und Chemotherapie zugeführt. Die
mediane Überlebenszeit der Patienten mit kombinierter Therapie betrug 11 Monate
und die der anderen Patienten 5 Monate (p = 0,025 im Log-Rank-Test).
In einer ähnlich randomisierten Studie von Mattson et al. (1988) an 288 Patienten,
die an inoperablem nicht-kleinzelligem Lungentumor erkrankten, wurde eine
Radiotherapie einer kombinierten Radio- und Chemotherapie gegenübergestellt. Die
Überlebensraten zeigten einen signifikanten Vorteil (p = 0,05) für die kombinierte
Behandlung.
10
Eine andere kontrollierte Studie von Dillman et al. (1990) mit der gleichen
Fragestellung zeigte, daß die mediane Überlebensrate 13,8 Monate bei Patienten, die
eine kombinierte Therapie erhalten hatten, betrug, dagegen 9,7 Monate bei Patienten
mit alleiniger Radiotherapie (p = 0,0066 im Log-Rank-Test).
Schaake-Koning et al. (1992) konnten in einer randomisierten Phase II-Studie mit
täglicher
Zugabe
von
Cisplatin
zur
Radiotherapie
bei
nicht-kleinzelligen
Lungentumoren im Stadium III signifikant längere Überlebensraten im Vergleich zu
alleiniger Bestrahlung ermitteln (p = 0,009).
Die neoadjuvante Therapie der nicht-kleinzelligen Lungentumoren im Stadium III
wird in kontrollierten Studien angewandt. Neoadjuvant bedeutet, daß vor einer
operativen Intervention eine Radio- und/oder Chemotherapie durchgeführt wird.
Harvey et al. (1992) fanden ein medianes tumorfreies Intervall von 12,7 Monaten mit
neoadjuvanter Therapie gegenüber 5,8 Monaten bei Patienten mit einer Bestrahlung
nach einer chirurgischen Tumorresektion. Rusch et al. (1993) konnten hohe
Ansprech- und Resektabilitätsraten mit der neoadjuvanten Therapie in den Stadien
IIIA
und
IIIB
bei
nicht-kleinzelligen
Lungentumoren
nachweisen.
Die
Arbeitsgruppen von Rosell et al. (1994) und Roth et al. (1994) zeigten in Phase-IIStudien signifikant längere Überlebenszeiten für Patienten im Stadium IIIA nach
neoadjuvanter Chemotherapie.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Patienten ebenfalls einer neoadjuvanten
Therapie unterzogen.
11
1.3
Morphologie der Tumorregression
Tumorregressionen treten einerseits spontan auf, andererseits werden sie im
Anschluß an eine Radio- und/oder Chemotherapie gefunden (Müller et al. 1995). Die
Morphologie
therapieinduzierter
Tumorregressionen
bei
nicht-kleinzelligen
Lungentumoren besteht aus unterschiedlich großen kokardenförmigen Herden mit
zentraler Nekrose, umgebender Resorptionszone, Übergang in ein gefäßreiches
Granulationsgewebe und peripherem Narbengewebe (Abb. 1.3.1 A und B) (Junker et
al. 1997). Es wurden teilweise auch Schaumzellnester gefunden, die keine zentrale
Tumornekrose aufwiesen und die ebenso wie die oben beschriebenen Herde im
Randbereich Ausfällungen von Cholesterinkristallen zeigten. Die Cholesterinkristalle
waren teilweise von mehrkernigen Riesenzellen vom ungeordneten Typ umgeben.
Zur Peripherie hin zeigte sich hierbei jedoch ebenfalls ein Übergang in ein
gefäßreiches Granulationsgewebe. Das Granulationsgewebe ging zur Peripherie hin
in ein kollagenfaserreiches Narbengewebe über, wobei z. T. eine Kondensierung und
Vermehrung elastischer Faserstrukturen und ein Einschluß von Nervenfasern und
Blutgefäßen zu erkennen waren (Abb. 1.3.1 A und B). Junker et al. verglichen das
Vorhandensein der narbigen Fibrosierung bei behandelten (n = 40) und nichtbehandelten nicht-kleinzelligen Lungentumoren (n = 50). In 80 % der Fälle konnte
bei den behandelten nicht-kleinzelligen Lungentumoren bzw. 16 % bei den nicht
behandelten nicht-kleinzelligen Lungentumoren eine narbige Fibrose beobachtet
werden. Im Rahmen der Tumorregression konnten im Tumor oder in seiner
Umgebung in allen Resektaten Gefäßwandveränderungen aufgezeigt werden, die von
einer Endangiitis bis zum kompletten Lumenverschluß reichten. In allen Resektaten
wurden unabhängig vom Regressionsgrad im Lungenparenchym intraalveolär
zahlreiche bräunlich-pigmentierte Makrophagen nachgewiesen, die besonders in der
Nähe des regressiv veränderten oder vitalen Tumorgewebes auftraten. Bei
kleinzelligen und nicht-kleinzelligen konnten nach
neoadjuvanter
Therapie
grundsätzlich gleichartige Reaktionsmuster aufgezeigt werden (Junker et al. 1995;
1997).
12
Die Morphologie der spontanen Tumorregression bei bösartigen Lungentumoren
wurde von Junker et al. (1997) an 50 präoperativ
nicht
radio-
und
chemotherapeutisch behandelten Patienten untersucht. Hierbei zeigten sich keine
Regressionsherde mit zentraler Nekrose, Granulationsgewebe und Vernarbung wie
bei den behandelten Tumoren. Bei 86 % der Patienten fanden sich neben vitalem
Tumorgewebe fokale Nekrosezonen. Diese fokalen Nekrosen waren von einem
vitalem Tumorsaum umgeben (Abb. 1.3.2 A). Ein komedoartiges histologisches Bild
fand
sich
bei
Kapillaren
umgebenden
vitalen
Tumorsäumen
mit
dazwischenliegenden schmalen Nekrosezonen. Bei ca. 56 % der Patienten zeigte sich
eine granulozytäre Reaktion im Randbereich der Nekrose (Abb. 1.3.2 B)
Das wichtigste Unterscheidungskriterium liegt demnach in der unterschiedlichen
Ausprägung
spontaner
Differenzierung
und
zwischen
therapieinduzierter
spontan
entstandener
Nekrosezonen.
und
Für
die
therapieinduzierter
Nekrosezonen sind dabei die im Bereich des Nekroserandes erhobenen Befunde von
besonderer Bedeutung (Junker et al. 1997).
13
Abb. 1.3.1
Therapieinduzierte Tumorregression bei nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen:
A
Ausschnitt aus einem Regressionsherd mit zentraler therapieinduzierter Nekrosezone (rechte Bildseite) und angrenzendem
Schaumzellsaum (linke Bildseite) (HE)
B
Schaumzellnest (obere Bildhälfte) mit Übergang in kollagenfaserreiches Narbengewebe (untere Bildhälfte) (EvG)
14
Abb. 1.3.2
Spontane Tumorregression bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren:
A
Spontan entstandene Nekrosezone, die um einen kapillarabhängigen vitalen Tumorsaum lokalisiert ist (HE)
B
Nekrosezone mit granulozytärer Reaktion (rechte Bildseite)
und angrenzendem vitalen Tumorsaum (linke Bildseite) (HE)
15
1.4
Apoptose -programmierter ZelltodLiteraturübersicht
Das Phänomen des programmierten Zelltodes in der Embryonalentwicklung hat
bereits Glücksmann (1950) beschrieben. Embryologen wie z. B. Rabl (1900), Jokl
(1918) und Peter (1936) bezeichneten die lichtmikroskopischen Korrelate des
Zellunterganges während der Entwicklung als mitotische Metaboliten.
Die Morphologie des Zelltodes wird anhand von Beobachtungen in der Embryonalentwicklung verdeutlicht. Es wird von drei Stadien berichtet, die als Chromatopyknose, Hyperchromatose der Kernmembran und Chromatolyse bezeichnet werden. Als
Oberbegriff wird die zelluläre Degeneration angeführt. Den Beweis, daß es sich bei
den degenerativen Körperchen um Kernmaterial handelt, erbrachte ihre positive
Feulgen-Reaktion (Bartels und Voigt 1931; Bieling 1937; Glücksmann 1940).
Glücksmann (1950) erkannte bereits, daß der Vorgang des Zelltodes eine recht kurze
Zeit in Anspruch nimmt und daher leicht übersehen werden könnte. Die kürzeste
Dauer betrug sieben Stunden, wobei eine noch kürzere Zeitspanne von ca. 0,5-1 h an
in-vitro Kulturen gemessen wurde.
Refsum und Berdal (1967) berichten vom Zellverlust in Tumoren beim Menschen.
Sie erklären dieses Phänomen durch den Vergleich der Tumorwachstumsrate von
langsam und schnell wachsenden Tumoren. Die Tatsache, daß es diese
Unterscheidung gibt, könne anhand einer hohen Zellverlustrate der langsam
wachsenden Tumoren erklärt werden.
Einer Arbeit von Steel (1967) zufolge hängt der Zelluntergang in Tumoren von drei
Parametern ab:
1. Verdopplungszeit der Tumorzellen
2. Masse der proliferierenden Zellen
3. Ausmaß des Zellverlustes
16
Die Zellverlustrate in verschiedenen menschlichen Tumoren beträgt im Mittel 50 %
der durch Mitose hinzugekommenen Zellen, wobei dies anhand spezieller Methoden
wie Thymidinmarkierung und DNA-Synthese-Dauer der Zellen geschätzt wird (Steel
1967). Der Zelltod kann laut Steel (1967) auf zwei Wegen geschehen:
1. in Nekrosegrenzgebieten
2. in Tumoren (ohne Nekrosen) als isolierter, degenerativer Prozeß.
Der programmierte Zelltod ist typisch für Vielzeller und in Tumoren, die andere
Wachstums- und Differenzierungsformen zeigen, beibehalten. Dies bedeutet
demnach,
daß
sowohl
Zellvermehrung
und
Zelltod
im
Normalgewebe
vorprogrammiert sind, als auch, daß Zellproduktion und Zellverlust in Tumoren
soweit im Einklang zueinander stehen, daß das Wachstum von neuem Gewebe erzielt
wird (Laird 1969).
Eine differenziertere Betrachtung von Mitose und kontrolliertem Zelltod nahmen
Kerr, Wyllie und Currie (1972) vor, indem sie letzterem eine ergänzende statt
gegenteilige Rolle in der Regulation der Zellentwicklung zuteilten. Der
programmierte Zelluntergang wird demnach in zwei Stadien unterteilt:
♦ 1. Kern- und Zytoplasmakondensation und Auflösung der Zelle in eine Vielzahl
membranumhüllter Fragmente. Diese Fragmente werden von Kerr et al. (1972)
auch “apoptotic bodies” (Apoptosekörperchen) genannt.
♦ 2. Die Apoptosekörperchen werden durch Phagozyten aufgenommen und machen
eine Reihe vom Veränderungen durch, ähnlich der in-vitro Autolyse in
Phagosomen, die mit der Zerstörung der membranumhüllten Fragmente
einhergeht.
17
Eine schemtische Darstellung des Ablaufs der Apoptose zeigt Abb. 1.4.1
Abb. 1.4.1
Schematische Darstellung des Ablaufs der Apoptose
18
Der Begriff Apoptose kommt aus dem Griechischen und bedeutet “herabfallen” in
Anlehnung an den Laubabwurf im Herbst.
Der Vorgang der Apoptose tritt spontan in nicht behandelten malignen Tumoren auf
und ist auch für die therapeutisch induzierte Tumorregression von Bedeutung. Dieser
Zelluntergang kann auch durch toxische Agentien wie Hepatotoxine und
elektromagnetische Strahlung in Embryos und erwachsenen Tieren getriggert werden
(Kerr et al. 1972).
Im Jahre 1980 veröffentlichten Wyllie et al. eine umfangreiche Darstellung des
Phänomens der Apoptose unter vielerlei Gesichtspunkten. Sie versuchten vor allen
Dingen die Apoptose von anderen Mechanismen, die ebenfalls zum Untergang der
Zelle führen, abzugrenzen und eine einheitliche Nomenklatur einzuführen.
Als erstes wurde die Nekrose von der Apoptose unterschieden, wobei auf die
exsudative Entzündungsreaktion bei der erstgenannten Form des Zellunterganges
und das Fehlen bei der zweiten Form hingewiesen wurde (Tab. 1.4.1).
Auffallend ist, daß die Nekrose meist in Zellverbänden auftritt und die Apoptose
verstreute, einzelne Zellen betrifft.
Die morphologischen Besonderheiten der Nekrose sind die Schwellung aller
Kompartimente im Zytoplasma mit anschließender Ruptur der Kern-, Organellenund Plasmamembran und das Auftreten von Matrixverdichtungen der Mitochondrien.
Im Zellkern kommt es zur Pyknose, Karyorrhexis und Karyolyse.
19
Tab. 1.4.1
Gegenüberstellung der Charakteristika von Apoptose und
Nekrose
Apoptose
Nekrose
erste Erscheinungsform
Zellschrumpfung
Zellschwellung
Zellkern
Pyknose, Kondensation
Karyolyse, Karyorrhexis
Kernchromatin
Segmentation
Zusammenballung
Zellmembran
Membranstabilität bis zu- gesteigerte Permeabilität
letzt erhalten
Organellen
strukturell intakt
geschwollen, geschädigt
Zytoplasma
Zellorganellen als Apop- Zellorganellen haben
tosekörperchen
Integrität verloren
Genexpression
p53 ↑, bcl-2 ↓, c-myc ↑
keine Veränderungen
betroffene Zellen
überwiegend
einzelne Zellverbände
Zellen
Zellelimination
Phagozytose durch Makrophagen
und
Verdauung
20
Entzündungsreaktion im
lysosomale umgebenden Gewebe
Erscheinungen, die bei der Apoptose
auftreten,
sind
vor
allem
durch
elektronenmikroskopische Bilder besser verstanden worden. Es kommt zur fokalen
Eliminierung von Zellen während der normalen embryonalen Entwicklung und
Metamorphose. Des weiteren ist die Apoptose bei verschiedenen Formen der
Atrophie, des Zellaufbaus und -abbaus im gesunden Gewebe, der hormonabhängigen
und nicht hormoninduzierten Hyperplasie von Gewebe beteiligt. Durch Bestrahlung,
zytotoxische Chemotherapeutika und Hyperthermie verursachter programmierter
Zelltod, Induktion der Apoptose durch zellvermittelte Immunität und das spontane
Auftreten in Neoplasien sind ebenfalls beobachtet worden (Wyllie et al. 1980).
Ein weiteres wichtiges Unterscheidungskriterium zwischen Apoptose und Nekrose
ist die gesteigerte Membranpermeabilität bei der Nekrose. Experimentelle
Untersuchungen geben nach Wyllie et al. (1980) Hinweise auf eine genetische
Kontrolle der Apoptose.
Abb. 1.4.2 zeigt ein Schema des Ablaufs der Apoptose in Drüsenepithelzellen
(Wyllie et al. 1980).
21
22
Cotter et al. (1990) betonen das Auftreten der Nekrose nach Beschädigung der Zellen
von außen und bei der Apoptose die programmierte Abfolge von Ereignissen ohne
äußeres “Trauma”. Die DNA-Spaltung bei der Apoptose geschehe durch eine
spezifische endogene Endonuclease und benötige im Gegensatz zur Nekrose ein
intaktes Energiesystem. Vergleiche mit maligenen Tumoren zeigen, daß der
programmierte Zelltod den Mechanismus darstellt, der beim Töten von Tumorzellen
durch zytotoxische T-Zellen beschrieben wird.
Williams (1991) vergleicht den programmierten Zelltod -Apoptose- mit der
Oncogenese und geht von der möglichen Unterdrückung des Zellunterganges aus.
Das Überleben von Zellen, welches durch eine solche Inhibition des Zelltodes
resultiert, könnte an der Oncogenese mitwirken.
Raff (1992) geht davon aus, obwohl der molekulare Mechanismus noch nicht
bekannt ist, daß die sterbenden Zellen sich selbst durch die Aktivierung eines
Selbstzerstörungsprogrammes eliminieren. Dieses Programm kann durch andere
Zellen bzw. Signale aktiviert und unterdrückt werden. Diese Hypothese wird anhand
von Studien, die an den Nematoden Caenorhabditis elegans durchgeführt wurden,
unterstützt. Demnach gibt es dort zwei Gene, ced-3 und ced-4, die den Zelltod
induzieren. Mutationen der Gene führen zur Inaktivierung und somit zum Ausbleiben
des Zelltodes. Ein weiteres Gen, ced-9, wird durch Mutation aktiviert und die Zellen
überleben. Wenn ced-3 und ced-9 inaktiviert sind, überleben alle Zellen ebenfalls.
Wyllie veröffentlichte 1993 einen Artikel, in dem er einen erweiterten Einblick in die
Regulation der Apoptose gibt. Die Rolle der Genexpression wird untersucht, wobei
Oncogene und Tumorosuppressorgene in die Regulation eingebunden sind. Die Rolle
des c-myc Oncogens ist zweideutig, da seine Aktivierung von dem Vorhandensein
oder Nichtvorhandensein von Wachstumsfaktoren oder anderen blockierenden
Agentien abhängt. In vivo bewirkt c-myc eine hohe Zellumsatzrate, bei der
23
Proliferation und Apoptose gemeinsam auftreten. Andere Oncogene wie ras
und
bcl-2
verhindern
die
Apoptose
und
führen
zu
einem
raschen
Populationszuwachs. Die Wildtypform des Tumorsuppressorgens p53 könnte die
Apoptose in Zellen, die c-myc exprimieren, induzieren, indem es einen ZellzyklusStillstand am Übergang von der G1- zur S-Phase herbeiführt (G1-Arrest).
Vermes und Haanen (1994) unterteilten die verschiedenen Faktoren in 3 Gruppen,
um sie näher zu klassifizieren:
I. Wachstums- und Proliferationsgene: myc, ras
II. Tumorsuppressorgene: p53
III. Regulatoren der Apoptose: bcl-2, APO-1/ Fas
APO-1 bzw. Fas-Produkt ist ein Oberflächenantigen mit einer molekularen Masse
von 52kDa. Ein anti-APO-1 Antikörper triggert den Apoptosevorgang, wenn er den
Kontakt zum APO-1 Antigen hergestellt hat. Abb. 1.4.3 zeigt die Beziehung
zwischen Proliferation und Apoptose (Vermes und Haanen 1994).
24
25
Vaux et al. (1994) stellten drei hypothetische Modelle für den Zelltod vor. Das erste
Modell stellt eine Cysteinprotease, interleukin-1β (IL-1β)-converting-enzyme (ICE)
als Ausgangspunkt vor, die eine Spaltung von pro-IL-1β und einer nicht bekannten
Substanz, welche für die strukturelle Integrität der Zelle zuständig ist, durchführt.
ICE kann durch verschiedene Signale aktiviert werden, z. B. durch den Verlust von
Wachstumsfaktoren,
geschädigte
bzw.
Einzelstrang-DNA
und
metabolische
Veränderungen, die durch Viren und Toxine verursacht werden. Reifes IL-1β kann
die Zelle verlassen, benachbarte Zellen und das Immunsystem alarmieren, so daß die
Zellen den Selbstzerstörungsmechanismus, die Apoptose, beginnen können. Dieser
Vorgang schützt die Zellen davor, Viruspartikel zu produzieren und verhindert somit
die Virusausbreitung.
Die zweite Hypothese besagt, daß es Viren gibt, die das Tumorsuppressorgen p53
blockieren bzw. wie das Oncogen blc-2 agieren, was wiederum die Inhibition von
ICE bedeutet. Apoptose und Schutz vor Viren sind somit nicht gewährleistet.
Das dritte Modell beschreibt die Rolle der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) bei
der Apoptose. CTL enthalten Granularkörperchen mit Perforin und Protease und
können durch bcl-2 nicht blockiert werden. In den Körperchen ist unter anderem die
Protease Granzyme B zu finden, welche sowohl wie ICE als auch ICE-aktivierend
durch Spaltung an dessen Aspartat-Ende wirkt.
26
1.5
Onkogene, Tumorsuppressorgene und Proliferationsmarker
In verschiedenen Studien wird versucht, relevante Faktoren und prognostische
Aussagen über nicht-kleinzellige Lungentumore aufzuzeigen. Einige Faktoren, denen
prognostische
Bedeutung
zukommt,
sind
bestimmte
Onkogene,
Tumor-
suppressorgene und Proliferationsmarker (Leoncini et al 1993, Korkolopoulou et al.
1993; Pezzella et al. 1993; Isobe et al. 1994; Volm et al. 1994; Lowe et al. 1994;
Dowell et al. 1995; Perdomo et al. 1998).
Das Tumorsupressorgen p53 befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 17
(17p31) und kodiert für ein phosphoryliertes Protein mit 393 Aminosäuren und
einem Molekulargewicht von 53 kDa. In der Wildtyp-Form reguliert es bei einem
DNA-Schaden die Zellzyklusdauer durch einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase
(G1-Arrest). Es kommt
zu einer Akkumulation als Reaktion auf die DNA-
Schädigung und Inhibierung der Zellproliferation während des Reparaturvorgangs.
Falls der DNA-Schaden nicht behoben werden kann, nimmt die Akkumulation weiter
zu, bis das genetische Programm der Apoptose aktiviert wird (Korkolopoulou et al.
1993; Sidransky et al. 1992; Perdomo et al. 1998).
p53 stellt in der Wildtyp-Form ein Tumorsupressorgen dar, dessen Inaktivierung
einen entscheidenden Schritt in Richtung Tumorentwicklung bedeutet.
Die Halbwertszeit des Wildtyp-p53 beträgt weniger als 30 Minuten (Oren et al.
1981), so daß es immunhistochemisch praktisch nicht nachzuweisen ist. Eine
Mutation des p53 in Tumoren kodiert für ein Protein, welches mit dem WildtypProtein ein Hetero-Oligomer bildet. Dies führt zu einer Stabilisierung und
Akkumulation des entsprechenden Genprodukts in ausreichenden Mengen, wodurch
der immunhistochemische Nachweis des p53 möglich wird (Iggo et al. 1990).
Dowell et al. (1995) gehen davon aus, daß die Inaktivierung von p53 eine schlechte
Prognose für den Patienten bedeutet.
Elledge et al. (1994) meinen dagegen, p53 sei ein schwacher prognostischer Faktor,
der über Behandlungsindikationen von Tumoren nicht entscheiden könne.
27
Korkolopoulou et al. (1993) vermuten einen positiven prognostischen Einfluß von
Wildtyp-p53, doch seien größere klinische Studien nötig um endgültige Aussagen
machen zu können (s.u.).
Eine Studie von Isobe et al. (1994) zeigt, daß p53-Abnormalitäten für die
Überlebensrate der Pateinten prognostisch ungünstig seien (p = 0,01) (s.u.).
In weiteren unabhängigen Studien konnte für p53-positive nicht-kleinzellige
Lungentumore
eine
signifikant
ungünstigere
Prognose
aufgezeigt
werden
(Mitsudomi et al. 1993; Ebina et al. 1994; Törmänen et al. 1995 (s.u.)).
McLaren et al. (1992) und Morkve et al. (1993) konnten keine prognostischen
Unterschiede zwischen p53-positiven und -negativen Lungentumoren aufzeigen.
Die Ergebnisse einer Arbeit von Carbone et al. (1994) weisen eine grenzwertig
signifikante negative Korrelation zwischen der Überlebenszeit und positivem p53Nachweis nach; eine prognostische Relevanz konnte jedoch nicht ermittelt werden.
Lee et al. (1995) zeigen in ihrer Studie, daß eine kräftige p53-Expression nur für
bestimmte Untergruppen von nicht-kleinzelligen Lungentumoren einen günstigen
prognostischen Faktor darstellt.
PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist ein Polypeptid mit einem
Molekulargewicht von 36 kDa. Hierbei handelt es sich um ein Protein, welches in
der Proliferationsphase von Zellen nachgewiesen wird (Kawai et al. 1994). Es konnte
gezeigt werden, daß PCNA zwischen der G1- und S-Phase synthetisiert wird und ein
Hilfsprotein für die DNA-Polymerase δ ist (Bravo et al. 1987; Prelich et al. 1987).
Bei Ki-67 handelt es sich ebenfalls um ein Protein, das mit der Zellproliferation
assoziert ist. Dieser Proliferationsmarker reagiert mit einem Antigen im Zellkern und
wird nur in proliferierenden Zellen nachgewiesen (Kawai et al. 1994).
28
Eine Untersuchung von Korkolopoulou et al. (1993) an kleinzelligen und nichtkleinzelligen Lungentumoren ergab eine signifikant positive Korrrelation zwischen
PCNA (proliferating cell nuclear antigen)- und p53-Expression (p < 0,001).
Leoncini et al. (1993) ermittelten eine Korrelation zwischen Apoptose und
Proliferationsindices (Ki-67 und PCNA) aufgrund immunhistochemischer Methoden
an malignen Non-Hodgkin-Lymphomen. Weiterhin wurde festgestellt, daß ein hoher
Apoptoseindex
und
eine
ungenügende
bcl-2-Expression
nachteilige
Prognosefaktoren für den Patienten darstellen.
Isobe et al. (1994) veröffentlichten eine Arbeit, in der sie 30 Patienten mit
Adenokarzinomen der Lunge im Stadium I nach kurativer Resektion untersuchten.
Es wurden insbesonders p53- und ras-Gen-Abnormalitäten im Hinblick auf ihre
prognostische Bedeutungen analysiert. Die Studie zeigte bei Pateinten mit p53Abnormalitäten (p53-Akkumulation oder -Mutation) einen signifikant ungünstigen
Faktor für die Überlebensrate dar (p = 0,01). Eine ras-Mutation war für die
Überlebenswahrscheinlichkeit unerheblich.
Törmänen et al. (1995) zeigten an 75 bösartigen Lungentumoren mit Hilfe der ISELTechnik und immunhistochemischer Methoden, daß es keine Korrelation zwischen
der Apoptoserate und der PCNA- bzw. p53-Expression gibt. Die bcl-2-Expression
korrelierte ebenfalls nicht mit der Apoptoserate. Eine weitergehende Analyse der
Ergebnisse legte ein 1,9fach (p = 0,04) bzw. 2,3fach (p = 0,005) erhöhtes Risiko bei
einer hohen Apoptoserate bzw. p53-Akkumulation für eine kürzere Überlebenszeit
dar.
29
2.
Fragestellung
Die Bedeutung des programmierten Zelltodes in Tumorzellen allgemein und speziell
in strahlen- oder chemotherapeutisch behandelten bösartigen Tumoren ist zur Zeit
Gegenstand reger Diskussionen. Hier stellt sich insbesondere die Frage, ob und
gegebenfalls in welchem Umfang die therapieinduzierte Tumorregression durch
einen apoptotischen Prozeß vermittelt wird. Diesbezüglich soll überprüft werden, ob
eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der therapieinduzierten Tumorregression
und der Apoptose vorhanden ist.
In der vorliegenden Studie wird durch histologische Untersuchungen anhand von
zwei speziellen Markierungstechniken, ISEL- (in situ end-labeling) und TUNEL(TdT-mediated dUTP-nick end-labeling) Technik, die Höhe der Apoptoseindices bei
bösartigen Lungentumoren vor und nach neoadjuvanter (präoperativ durchgeführte
Chemo- und Radio)-Therapie untersucht. Es wird insbesonders die Frage nach einer
signifikanten Änderung des Ausmaßes der Apoptose unter der neoadjuvanten
Therapie gestellt.
Neben der Ermittlung der Apoptoseindices wird die prognostische Relevanz der
Apoptose näher untersucht. Die Bestimmung von Überlebenszeiten bzw. -raten, die
Korrelation mit der Expression von Tumorsuppressorgenen, Proliferationsmarkern
und Onkogenen dient der Erkennung möglicher Prognosefaktoren.
Zusätzlich werden die beiden Markierungstechniken ISEL und TUNEL im Hinblick
auf ihre Spezifität zur Unterscheidung von Nekrose und Apoptose analysiert.
30
3.
Material und Methode
3.1
Patientenkollektiv und Therapieprotokoll
Bei 54 Patienten mit lokal fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Lungentumoren
wurde im Rahmen einer multizentrischen Phase II-Studie unter Leitung der
Medizinischen Klinik A der Universität Münster eine neoadjuvante Chemo- und
Radiotherapie durchgeführt.
Diese Patienten erfüllten folgende Kriterien, um in die Studie aufgenommen zu
werden:
Patienteneinschlußkriterien:
♦ histologisch gesicherter nicht-kleinzelliger Lungentumor im
Stadium IIIA oder IIIB
♦ funktionelle Operabilität
♦ Allgemeinzustand nach Karnowsky mindestens 70 %
♦ Alter der Patienten maximal 69 Jahre
♦ ausreichende Leber- und Nierenfunktion
♦ ausreichende Knochenmarksreserve vor Therapiebeginn
♦ Vorliegen der Patienteneinwilligung
Patientenausschlußkriterien:
♦ vorherige Radio- oder Chemotherapie
♦ Resektion des Primärtumors
♦ gleichzeitig bestehender maligner Zweittumor
♦ manifeste Infektion vor Therapiebeginn
31
Das Behandlungskonzept setzte sich aus drei Blöcken zusammen, wobei zwei Blöcke
aus einer Kombinationschemotherapie mit den Substanzen Ifosfamid, Carboplatin
und
Etoposid
(ICE-Schema)
bestanden.
Die
Radiotherapie
erfolgte
als
hyperfraktionierte, akzelerierte Bestrahlung, bei der eine Gesamtdosis von 45 Gy
innerhalb von drei Wochen appliziert wurde. Die Aufteilung der Dosis sah wie folgt
aus:
Fünf Tage pro Woche wurden täglich zwei Einzelfrakionen zu 1,5 Gy verabfolgt.
Simultan zur Strahlentherapie erfolgte an den Tagen 1, 8 und 15 eine
Kombinationschemotherapie mit den Substanzen Carboplatin und Vindesin.
Bei 40 Patienten konnte durchschnittlich sieben Wochen nach Abschluß der RadioChemotherapie eine Resektionsbehandlung unter kurativer Zielsetzung durchgeführt
werden (Abb. 3.1.1). Die Resektionspräparate wurden histologisch (HE- und EvGFärbungen) aufgearbeitet und einem Regressionsgrading nach Junker et al. (1997)
zugeordnet, welches in Tabelle 3.1.1 erläutert wird.
2 x Carboplatin/Ifosfamid/Etoposid
Radio-/Chemotherapie:
45 Gy (2 x 1,5 Gy/d), Carboplatin/Vindesin
Operation
Abb. 3.1.1
Therapieschema
Tab. 3.1.1
Regressionsgrading (Junker et al. 1997):
Grad I:
keine oder nur geringe, im allgemeinen spontane Tumorregression
Grad IIa: unvollständigeTumorregression mit mindestens 10 % vitalem Tumorgewebe
Grad IIb: unvollständige Tumorregression mit weniger als 10 % vitalem
Tumorgewebe
Grad III: komplette Tumorregression ohne Nachweis von vitalem Tumorgewebe
32
Das klinische Remissionsverhalten der Tumoren nach Chemo- und Radiotherapie
wurde nach den Remissionskriterien der Southwest Oncology Group (SWOG)
(Green und Weiss 1992) beurteilt (Tab. 3.1.2).
Tab. 3.1.2
Klinische Remissionskriterien der Southwest Oncology Group
(SWOG) (Green und Weiss 1992)
CR
komplette Tumorregression:
Verschwinden aller meßbaren Tumorparameter über zumindest 4 Wochen
PR
partielle Tumorregression:
Reduktion aller meßbaren Tumorparameter um mindestens 50 % über
zumindest 4 Wochen
NC
”no change” (gleichbleibende Tumorerkrankung):
Reduktion aller meßbaren Tumorparameter um weniger als 50 % bzw.
Größenzunahme um höchstens 25 % über zumindest 4 Wochen
PD
progressive Tumorerkrankung:
Größenzunahme der meßbaren Tumorparameter um mindestens 25 % oder
Auftreten von Metastasen
33
3.2
Apoptose
Bei der Apoptose (programmierter Zelltod) treten bereits sehr früh charakteristische
Veränderungen des Kernchromatins auf, die schon von Kerr und Wyllie im Jahre
1972 beschrieben wurden. Diese Veränderungen beruhen wahrscheinlich auf einer
Zerlegung der DNA in Fragmente durch eine Ca2+- und Mg2+-abhängige
Endonuklease. Die Spaltprodukte der Endonuklease umfassen ca. 180 Basenpaare
oder ein Vielfaches davon und stellen sich in der Gelelektrophorese als typisches
“Strickleitermuster” dar. Zu diesen regelmäßigen Läsionen kommt es durch die
Anordnung
der
DNA
im
Interphasekern
um
Nukleosomen,
wobei
die
internukleosomalen DNA-Abschnitte besser von der Endonuklease gespalten werden
können (Lorenzen et al. 1995).
Die Markierung apoptotischer Zellen in frühen Phasen des programmierten Zelltodes
geschieht in der ISEL-Methode an DNA-Strangbrüchen (“nicks”). Das Enzym DNAPolymerase I oder ihr sogenenntes Klenow-Fragment kann Desoxynukleotide an
Strangbrüchen einbauen (ISEL-Technik = in situ end-labeling oder in situ
Endmarkierung).
Eine andere Möglichkeit der Markierung stellt die TUNEL- (TdT-mediated dUTPnick end-labelling) Technik dar. Hierbei wird statt der DNA-Polymerase I terminale
Desoxynukleotidyltransferase (TdT) eingesetzt, die spezifisch an 3`-OH-Enden der
DNA bindet und somit Desoxynukleotide an DNA-Strangbrüchen einbauen kann
(Gavrieli et al. 1992).
Wenn man nun das entsprechende Enzym (Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
oder TdT) zusammen mit Digoxygenin-markiertem Desoxyuridintriphosphat (dUTP)
auf die Schnittpräparate einwirken läßt, kommt es zum Einbau des Digoxygenins im
Bereich der vorliegenden Strangbrüche. Der Nachweis efolgt mittels einer
anschließenden Immunfärbung mit anti-Digoxigenin-Antikörpern.
34
In der vorliegenden Arbeit wurde anhand des Untersuchungsgutes, welches prä- und
posttherapeutisch entnommen wurde, das Außmaß der Apoptose (programmierter
Zelltod) jeweils mit der ISEL- und TUNEL-Färbetechnik untersucht. Der relative
Anteil apoptotischer Zellen bzw. Apoptosekörperchen wurde jeweils durch
Auszählen von 1.000 Tumorzellen mit einem 40er Objektiv lichtmikroskopisch
bestimmt und als sogenannter Apoptoseindex in Prozent angegeben. Insbesondere
bei Tumoren, die dem Regressionsgrad IIb zugeordnet wurden lagen in den
angefertigten Schnittpräparaten z. T. deutlich weniger als 1.000 Tumorzellen vor. In
diesem Fall wurden alle beurteilbaren Tumorzellen ausgewertet und deren Anzahl
festgehalten.
35
3.3
ISEL-Technik
Die In situ Endmarkierung wurde erstmals von Jonker und seiner Arbeitsgruppe
beschrieben (Jonker et al. 1992). Dieses Verfahren wurde von Ansari und
Mitarbeitern weiter systematisiert (Ansari et al. 1993).
Es werden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:
1. Tumorgewebe wird formalinfixiert und in Paraffin eingebettet, danach werden 3-4
µm
dicke
Schnittpräparate
auf
einem
mit
wasserlöslichem
Silan-Kleber
beschichteten Objektträger aufgezogen. Hiernach wird das Präparat über Nacht bei
Raumtemperatur getrocknet.
2. Die Schnittpräparate werden zum Entparaffinieren zunächst für 20 min. bei 70 ° C
und anschließend für 10 min. in Xylol bei Raumtemperatur inkubiert. Die Präparate
werden dann in einer absteigenden Alkoholreihe gewässert. An diesen Arbeitsschritt
wird eine Trocknung der Schnitte für 15 min. bei Raumtemperatur angeschlossen.
3. Die Präparate werden für eine Stunde in der feuchten Kammer bei 37 ° C mit
Proteinase K (Firma Sigma. Deisenhofen; Ausgangskonzentration: 0,15 U/ml; 1:100
in 0,5 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,6 verdünnt) angedaut und anschließend dreimal in
Aqua bidest. gewaschen.
4. In einer aufsteigenden Alkoholreihe werden die Schnittpräparate dehydriert und
für 15 min. bei Raumtemperatur getrocknet.
5. Es wird ein Enzym-Cocktail auf die Schnitte aufgetragen, welcher aus 5 µl
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (Firma Life Technologies, Eggenstein),
0,5 µl 10 mM dATP-, dGTP-, dCTP-Mix (Firma Pharmacia, Freiburg), 5 µl 1 mM
Digoxigenin-11-dUTP (Firma Boehringer, Mannheim) und 500 µl Nick-Puffer (447
µl 0,5 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,6; 3 µl bovines Serum-Albumin 0,1 %, 50 µl 50 mM
36
MgCl2 besteht. 60 µl des Cocktails werden auf die Präparate gegeben und
anschließend werden die Schnitte für 1 Stunde in der feuchten Kammer bei 37 ° C
inkubiert. Hiernach erfolgt eine zweimalige Spülung der Präparate mit Aqua bidest.
6. Die Schnittpräparate werden für 30 min. bei Raumtemperatur mit einem
Antikörper, dem Anti-Digoxigenin-AP,
Fab
Fragment
(Firma
Boehringer,
Mannheim; Ausgangskonzentration: 150 U/200µl; 1:600 in bovinem SerumAlbumin 3 % verdünnt) inkubiert. Nach der Inkubation erfolgt eine Spülung der
Präparate mit 0,5 M Tris/HCl-Puffer (TBS, pH 7,6; Firma Sigma, Deisenhofen) für
2x5 min.
7. Im Anschluß an die Spülung werden die Schnitte für 5 min. bei Raumtemperatur
in Substratpuffer (20 ml 1 M Tris/HCl-Puffer pH 9,5; 4 ml 5 M NaCl; 10 ml 1 M
MgCl2 ; 166 ml Aqua dest.) inkubiert.
8. Es werden nun 200 µl eines NBT/BCIP-Farbkomplexes auf jedes Präparat
aufgetragen.
Bei
diesem
Farbkomplex
handelt
es
sich
um
folgende
Substratmischung:
45 µl NBT (Nitro Blue Tetrazolium, Firma Sigma, Deisenhofen; 75 mg in 1 ml Dimethylformamid 70 %), 45 µl BCIP (5-Brom-4 Chlor-3-Indolylphosphat, p-Toluidin,
Firma Sigma, Deisenhofen; 50 mg in 1 ml Dimethylformanid 100 %), 5 µl
Levamisol (Firma Sigma, Deisenhofen) und 5 ml Substratpuffer (s. o.). In
Abhängigkeit von der Farbstoffreaktion werden die Schnittpräparate für 15 min. bis
6 Stunden bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer inkubiert. Nach der
erfolgreichen Farbreaktion werden die Schnitte mit Aqua dest. gespült.
9. Die Darstellung des Zellkernes erfolgt mittels Färbung mit Kernechtrot für 5 min.
Anschließend werden die Schnitte mit Wasser gespült.
10. Die Schnittpräparate werden mit Aquatex (Firma Merck, Darmstadt) eingedeckt.
37
Als Positivkontrolle in dieser Untersuchungsreihe wurde Gewebe von Tonsillen mit
einer follikulären lymphatischen Hyperplasie verwendet.
Bei der Negativkontrolle wurde auf die Zugabe des Klenow-Fragmentes der DNAPolymerase I zum Enzym-Cocktail verzichtet.
Es wurde eine zweite Positivkontrolle verwendet, um zu überprüfen, ob die
Proteinase K auch die tieferen Schichten der Präparate angedaut hatte, wobei mit
DNAse I vorbehandelte Schnitte in allen Zellkernen DNA-Strangbrüche induzierten.
Hierbei wurden die jeweiligen Schnittpräparate vor der Zugabe des NukleotidEnzym-Gemisches für 15 min. bei Raumtemperatur mit 200 ng/ml DNAse I (Firma
Boehringer, Mannheim; 2000 U/mg) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,4); 10 mM
NaCl, 5 mM MgCl2 ; 0,1 mM CaCl2 und 25 mM KCL inkubiert (Abb. 3.3.1 A).
38
Abb. 3.3.1
Darstellung der apoptotischen Zellen in lymphatischem
Gewebe einer Tonsille
A
braunrot markierte Zelle in der Bildmitte mit der ISELTechnik
B
braunschwarz markierte Zellen in der Bildmitte mit der
TUNEL-Technik
39
3.4
TUNEL-Technik
Die TUNEL- (TdT-mediated dUTP-nick end-labelling) Technik wurde im Jahre
1992 von Gavrieli und seine Mitarbeitern (Gavrieli et al. 1992) eingeführt.
Bei dieser Methode werden die einzelnen Arbeitsschritte zunächst analog der unter
3.3 dargestellten ISEL-Technik durchgeführt. Der Enzym-Cocktail, welcher unter
Schritt 5 beschrieben wurde, wird durch das folgende Nukleotid-Enzym-Gemisch
ersetzt. Dieses setzt sich aus 10 µl TdT (rekombinante terminale Desoxynukleotidyltransferase 15 U/µl; Firma Life Technologies, Eggenstein), 0,5 µl 10 mM
dATP-, dCTP-, dGTP-Mix (Firma Pharmacia, Freiburg), 5 µl 1 mM Digoxigenin-11dUTP (Firma Boehringer, Mannheim), 200 µl TdT-Puffer (Firma Life Technologies,
Eggenstein) und 285 µl Aqua bidest zusammen (Abb. 3.3.1 B).
Die unter 3.3 beschriebenen Kontrollen wurden ebenfalls analog durchgeführt.
40
3.5
Statistische Methoden
Für die ermittelten Werte der prä- und posttherapeutischen Apoptoseindices wurden
die Spannweite bzw. der Range, der arithmetische Mittelwert, der Median und die
Standardabweichung berechnet.
Das statistische Testverfahren wurde jeweils in Abhängigkeit von der analysierten
Fragestellung ausgewählt. Die Überprüfung eines signifikanten Unterschiedes
zwischen zwei verbundenen bzw. paarigen Stichproben erfolgte mit dem WilcoxonTest für verbundene Stichproben, da eine Normalverteilung der vorliegenden Daten
nicht gegeben war. Entsprechend wurde das Vorliegen eines signifikanten
Unterschiedes für unverbundene Stichproben mit dem Wilcoxon-Test
für
unverbunde Stichproben durchgeführt, wobei auch hier keine Normalverteilung der
Daten vorlag. Zur Prüfung der Abhängigkeit zweier Parameter wurde der
Korrelationskoeffizient errechnet, die statistische Signifikanz mit dem “Test des
Korrelationskoeffizienten” überprüft. Die Abhängigkeit zweier klassifizierter
Variablen wurde mit dem Fisher´s-exact-Test geprüft. Im Hinblick auf die
Überlebenszeit wurden die entsprechenden Überlebenskurve nach Kaplan und Meier
(1958) im Log-Rank-Test (Peto et al. 1977)
auf signifikante Unterschiede in Abhängigkeit von anderen Merkmalen (z.B.
Apoptoseindices) verglichen.
Es wurde für alle Testverfahren die Irrtumswahrscheinlichkeit p für den Fehler der
ersten Art auf 5 % festgelegt, d. h. bei einem p < 0,05 wurde die Null-Hypothese H
Null (Unabhängigkeit der Variablen) verworfen.
41
4.
Ergebnisse
In der Studie sind insgesamt 54 Patienten berücksichtigt. Die 54 Studienpatienten
sind zwischen 37 und 69 Jahren alt, wobei das mediane Alter 57 Jahre beträgt. Die
Geschlechterverteilung lautet 49 männliche und 5 weibliche Patienten.
Die Untersuchung der nicht-kleinzelligen Lungentumoren nach dem führenden
histologischen Tumortyp ergibt 36 Plattenepithelkarzinome und 18 Adenokarzinome,
was einem Prozentsatz von 66,7 % bzw. 33,3 % entspricht.
Die Betrachtung der TNM-Stadien entsprechend der UICC aus dem Jahre 1992
ergibt folgendes Resultat:
•
20 Tumoren im T2-, 18 Tumoren im T3- und 16 Tumoren im T4-Stadium
•
2 Tumoren sind im N0-, 1 Tumor ist im N1-, 35 Tumoren sind im N2-, 15
Tumoren sind im N3-Stadium und bei einem Tumor konnten keine regionalen
Lymphknoten beurteilt werden (NX).
•
alle Tumoren befinden sich entsprechend der Einschlußkriterien im M0-Stadium
(Tab. 4.1)
Tab. 4.1
Darstellung der TNM-Stadien
TNM
X
0
1
2
3
4
T
0
0
0
20
18
16
N
1
2
1
35
15
54
0
M
42
Die Betrachtung des Tumorstadiums nach Mountain (1986) ergibt eine Verteilung
von 25 Studienpatienten, die sich im Stadium IIIA und 29 Patienten, die sich im
Stadium IIIB befinden.
Führender histologischer Tumortyp, TNM-Stadium und Tumorstadium nach
Internationalem
Staging
System
(Mountain
zusammengefaßt.
43
1986)
sind
in
Tabelle
4.2
Tab. 4.2:
Nr.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
Histologischer Tumortyp
PEC
PEC
PEC
ADC
PEC
PEC
ADC
ADC
PEC
ADC
ADC
PEC
PEC
PEC
ADC
PEC
ADC
PEC
PEC
ADC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
ADC
PEC
ADC
ADC
PEC
PEC
PEC
ADC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
PEC
ADC
ADC
PEC
ADC
PEC
PEC
PEC
PEC
ADC
ADC
ADC
TNM
T3N2M0
T3N2M0
T2N2M0
T2N3M0
T2N3M0
T2N2M0
T4N2M0
T4N2M0
T3N2M0
T3N2M0
T4N0M0
T2N3M0
T4N2M0
T4N2M0
T4NXM0
T3N2M0
T2N2M0
T3N3M0
T2N2M0
T4N2M0
T3N3M0
T3N2M0
T2N2M0
T4N2M0
T3N3M0
T3N2M0
T2N2M0
T3N2M0
T2N2M0
T2N2M0
T3N2M0
T3N0M0
T4N2M0
T2N2M0
T3N3M0
T4N2M0
T2N2M0
T2N2M0
T3N3M0
T2N2M0
T2N3M0
T4N3M0
T4N2M0
T3N3M0
T4N2M0
T3N2M0
T2N3M0
T4N2M0
T3N1M0
T4N3M0
T2N3M0
T4N2M0
T2N3M0
T2N2M0
Stadium
IIIA
IIIA
IIIA
IIIB
IIIB
IIIA
IIIB
IIIB
IIIA
IIIA
IIIB
IIIB
IIIB
IIIB
IIIB
IIIA
IIIA
IIIB
IIIA
IIIB
IIIB
IIIA
IIIA
IIIB
IIIB
IIIA
IIIA
IIIA
IIIA
IIIA
IIIA
IIIA
IIIB
IIIA
IIIB
IIIB
IIIA
IIIA
IIIB
IIIA
IIIB
IIIB
IIIB
IIIB
IIIB
IIIA
IIIB
IIIB
IIIA
IIIB
IIIB
IIIB
IIIB
IIIA
Erläuterung der Abkürzungen: PEC=Plattenepithelkarzinom
ADC=Adenokarzinom
44
4.1
Anwendung des Regressionsgradings
Bei 40 der 54 Studienpatienten konnte eine Resektionsbehandlung an die
kombinierte Chemo-/Radiotherapie angeschlossen werden. Die pathologischanatomische
Beurteilung
der
Tumorregression
wurde
gemäß
des
Regressionsgradings nach Junker et al. (1997) durchgeführt (s. Tab. 3.1.1, S. 32). Zu
dieser Gruppe gehören 36 männliche und 4 weibliche Patienten mit einem
Altersmedian von 57 Jahren. Die Verteilung der einzelnen Regressionsgrade ist in
Tab. 4.1.1 dargestellt.
Tab. 4.1.1
Absolute und relative Häufigkeiten der Regressionsgrade
Regressionsgrad
N
%
I
3
7,5
IIa
10
25
IIb
20
50
III
7
17,5
40
100
Bei 3 Tumoren, die dem Regressionsgrad IIb angeordnet wurden, konnten nur noch
in mediastinalen Lymphknoten kleine Tumorreste nachgewiesen werden, wobei im
Primärtumor kein vitales Tumorgewebe mehr zu finden war. In 3 Präparaten konnte
keine therapieinduzierte Tumorregression aufgezeigt werden, d. h. es lag ein
Regressionsgrad I vor.
45
Ein morphologisches Charakteristikum der Regressionsgrade IIa-III besteht in
unterschiedlich großen kokardenförmigen Herden, die eine zentrale Nekrose
aufweisen. Die therapieinduzierte und spontane Tumorregression sind in Kapitel 1.3
bereits ausführlich dargestellt und erläutert.
Das klinische Remissionsverhalten der Tumoren nach der Chemo- und Radiotherapie
wurde bei allen Studienpatienten, d. h. bei 54 Patienten nach den Remissionskriterien
der Southwest Oncology Group (SWOG) (Green und Weiss 1992) bestimmt (S. 33).
Der Remissionsstatus bei den 40 operablen Patienten zeigte 32 partielle oder komplette Remissionen und bei 8 Patienten ”no change”. Im Gesamtkollektiv (n = 54)
wurden 5 komplette, 32 partielle, 13 ”no change”-Remissionen und bei 4 Patienten
ein Tumorprogreß gefunden.
Für das gesamte Studienkollektiv (n = 54) betrug die mediane Überlebenszeit 20,4
Monate mit einer Spannweite von 1,5-53,9 Monaten. Die mediane Überlebenszeit
der 40 operierten Patienten betrug 23,1 Monate.
Die Untersuchung der Regressionsgrade bezüglich der medianen Überlebenszeiten
erbrachte, daß die 27 Patienten der Regressionsgrade IIb und III mit 27,9 Monaten
(Median) eine statistisch signifikant längere Überlebenszeit aufwiesen als die 13
Patienten der Regressionsgrade I und IIa mit einer medianen Überlebenszeit von 13,7
Monaten (Log-Rank-Test, p = 0,02).
46
4.2
Quantifizierung der Apoptose
Die Darstellung der Apoptose in den Präparaten erfolgte mittels der ISEL- und
TUNEL-Technik. Ihre Verteilung sah wie folgt aus: 54 Studienpatienten wurden in
die Studie aufgenommen, von 33 dieser Patienten stand prätherapeutisch im Rahmen
des Primärstagings mittels Bronchoskopie oder Medianstinoskopie entnommenes
Tumorgewebe zur Verfügung. An diesem Gewebe konnten ISEL- und TUNELMarkierungen durchgeführt und so die entsprechenden Apoptoseindices bestimmt
werden.
40 der 54 Patienten konnten einer Operation zugeführt und von 33 Patienten das
Tumorgewebe posttherapeutisch bezüglich der Apoptose untersucht werden. Die
übrigen 7 Patienten wiesen eine komplette Tumorregression (Regressionsgrad III)
ohne
Nachweis
vitalen
Tumorgewebes
auf
und
standen
somit
für
die
posttherapeutische Analyse der Apoptose nicht mehr zur Verfügung.
Tumorgewebe oder mediastinale Lymphknoten, welche vor der neoadjuvanten
Therapie zur Festlegung des Primärstagings gewonnen wurden, und auch nach der
Chemo- und Radiotherapie reseziertes Tumorgewebe wurde anhand der ISEL- und
TUNEL-Technik im Hinblick auf die Apoptoserate untersucht. Bei beiden Methoden
konnten im lichtmikroskopischen Bild Gemeinsamkeiten nachgewiesen werden. Die
Zellkerne waren teils kondensiert, teils in “apoptotic bodies” zerfallen und ergaben
eine braun-schwarze Markierung. Auffallend war die stärkere Anfärbbarkeit an der
Kernmembran bei der
TUNEL-Methode.
Eine
besondere
Anordnung
der
apoptotischen Zellen konnte nicht aufgezeigt werden, sie lagen teils vereinzelt, teils
in kleineren Gruppen vor (Abb. 4.2.1 A und B).
Da auch Zellkerne in größeren und kleineren Nekrosezonen teilweise saumartig
markiert wurden (Abb. 4.2.2), sind diese Areale bei der Auswertung nicht
berücksichtigt worden, um falsch-positive Resultate zu vermeiden (Ansari et al.
1993; Wijsman et al. 1993).
47
Abb. 4.2.1
A
Darstellung der apoptotischen Zellen (dunkelbraun markiert in
der Bildmitte) mittels ISEL-Technik in nicht-kleinzelligem
Lungentumor
B
Darstellung der apoptotischen Zellen (schwarz markierte Zellfragmente) mittels TUNEL-Technik in nicht-kleinzelligem
Lungentumor
48
Abb. 4.2.2
Darstellung der unspezifisch markierten Zellen in nekrotischen
Tumorbereichen eines nicht-kleinzelligem Lungentumors
A
schwarz markierte Zellkomplexe in der Bildmitte mit der
ISEL-Technik
B
dunkelrot markierte Zellkomplexe in der Bildmitte mit
der TUNEL-Technik
49
Spannweite bzw. Range
Die Apoptoseindices liegen bei der ISEL-Methode prätherapeutisch zwischen 0 %
und 5,3 % und posttherapeutisch zwischen 0 % und 9 %. Die Werte bei der TUNELMethode betragen prä- bzw. posttherapeutisch 0 % - 1,7 % bzw. 0 % - 4,5 %.
Arithmetischer Mittelwert
Der arithmetische Mittelwert beträgt für die mit der ISEL- und der TUNEL-Methode
ermittelten Apoptoseindices prätherapeutisch 1,609 % bzw. 0,93 %. Die
entsprechenden posttherapeutischen Werte lauten für die ISEL-Technik 1,691 %
bzw. 1,10 % für die TUNEL-Technik.
Die entsprechenden Werte sind in Tab. 4.2.1 zusammengefaßt.
Median
Der Median der prätherapeutisch dargestellten Apoptoseindices beträgt 1,6 % für die
ISEL- und 1 % für die TUNEL-Methode. Posttherapeutisch zeigen die
Apoptoseindices einen Median von 1,55 % für die ISEL- bzw. 1 % für die TUNELTechnik (Tab. 4.2.1).
50
Standardabweichungen der Stichproben
Die numerische Standardabweichung s ist ein Maß für die Abweichung der
Beobachtungen vom Mittelwert.
Die Apoptoseindices, die mittels ISEL- und TUNEL-Technik ermittelt wurden,
zeigen prätherapeutisch eine Standardabweichung s von 1,01 % bzw. 0,425 %. Die
entsprechenden posttherapeutischen Werte für die ISEL-Technik betragen 1,539 %
und 0,841 % für die TUNEL-Technik.
Tab. 4.2.1 stellt die erhobenen Daten dar.
51
Tab. 4.2.1
Arithmetischer Mittelwert, Median und Standardabweichung der mittels ISEL- und TUNELMethode ermittelten Apoptoseindices
Arithmetischer Mittelwert
Median
Standardabweichung
ISEL-Technik
TUNEL-Technik
Prätherapeutisch in %
1,609
0,93
Posttherapeutisch in %
1,691
1,10
Prätherapeutisch in %
1,60
1,00
Posttherapeutisch in %
1,55
1,00
Prätherapeutisch in %
1,01
0,425
Posttherapeutisch in %
1,539
0,841
52
4.3
•
Korrelation zwischen Apoptoseindices und anderen Parametern
Prä- und posttherapeutische Apoptoseindices:
Zwischen den prä- und posttherapeutisch ermittelten Apoptoseindices Zellen ließ
sich weder für die ISEL- (p = 0,35) noch für die TUNEL-Technik (p = 0,45) ein
statistisch
signifikanter
Unterschied
aufzeigen
(jeweils
Wilcoxon-Test
für
verbundene Stichproben). Mit der ISEL-Methode wurden sowohl prä- als auch
posttherapeutisch statistisch signifikant höhere Apoptoseindices bestimmt als mit der
TUNEL-Methode (jeweils p = 0,0001) (Wilcoxon-Test für verbunde Stichproben).
•
Gesamtüberlebenszeit:
Für verschiedene überprüfte cut-off-Werte konnte weder prä- noch posttherapeutisch
ein signifikanter Unterschied der Länge des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von
der Höhe der Apoptoseindices für beide Methoden ermittelt werden (Log-RankTest).
•
Regressionsgrading:
Bei der Analyse der Abhängigkeit der mit der ISEL- und TUNEL-Technik
nachgewiesenen Apoptoseindices und des Regressionsgradings (Regressionsgrad
I/IIa versus Regressionsgrad IIb/III) ließ sich keine statistisch signifikante
Abhängigkeit der beiden Parameter ableiten (Wilcoxon-Test für unverbunde
Stichproben).
•
Klinische Tumorremission:
Die Apoptoseindices wurden in Abhängigkeit von klinisch nach der Chemo- und
Radiotherapie bestimmten Remissionsverhalten der Tumoren (partielle/komplette
Remisssion versus ”no change”/progressive Erkrankung) miteinander verglichen.
Eine statistisch signifikante Abhängigkeit konnte hierbei nicht beschrieben werden
(Wilcoxon-Test für unverbunde Stichproben).
53
•
Histologische Tumortypen und -stadien:
Eine statistisch signifikante Abhängigkeit der bestimmten Apoptoseparameter vom
führenden histologischen Tumortyp (Adeno-Ca vesus Plattenepithel-Ca) oder vom
Tumorstadium (Stadium IIIA versus IIIB) konnte ebenfalls nicht aufgezeigt werden
(Wilcoxon-Test für unverbunde Stichproben).
54
4.4
Die
Apoptoseparameter und Proliferationsindices
prä-
und
posttherapeutische
Analyse
der
Zellproliferation
bei
den
Studienpatienten erfolgte durch die Bestimmung der ”PCNA- und Ki-67-Indices” in
einer parallel zur vorliegenden Studie durchgeführten Arbeit (Junker 1998;
Schulmann 1999).
Bei der Auswertung der prätherapeutischen Zellproliferation konnten 33 Fälle mit
dem anti-PCNA-Antikörper und 32 mit dem gegen Ki-67 gerichteten MiB1Antikörper untersucht werden. Die ermittelten PCNA-Indices lagen zwischen 2,25 %
und 50,72 %, mit einem arithmetischen Mittelwert von 21,12 % und einer
Standardabweichung von 13 %. Die Werte für den Ki-67-Index schwankten
zwischen 1,2 % und 43,07 %, mit einem arithmetischen Mittelwert von 19,87 % und
einer Standardabweichung von 11,4 %.
Die Bestimmung der posttherapeutischen Zellproliferation erfolgte bei 28 Tumoren
durch die PCNA- und bei 22 Tumoren durch die Ki-67-Methode. In den restlichen
Fällen war kein ausreichendes Tumorgewebe mehr vorhanden oder es lag ein
Regressionsgrad III vor. Die Werte der ermittelten PCNA-Indices lagen zwischen
2,32 % und 54,3 % (arithmetischer Mittelwert 23,71 %, Standardabweichung 14,8
%) und der Ki-67-Indices zwischen 0,12 % und 43,51 % (arithmetischer Mittelwert
17,57 %, Standardabweichung 11,8 %).
Eine positive oder negative Korrelation zwischen den prä- und posttherapeutisch
bestimmten Apoptoseindices und den parallel dazu ermittelten Proliferationsindices
ließ sich statistisch nicht aufweisen (Test des Korrelationskoeffizienten).
55
4.5
Apoptoseparameter, Tumorsuppressorgene und Onkogene
In der unter 4.4 genannten parallel zur eigenen Arbeit durchgeführten Studie wurden
Untersuchungen
zur
p53-Akkumulation
und
p21ras-Überexpression
des
Tumorgewebes in den Präparaten des Studienkollektivs durchgeführt (Junker 1998;
Schulmann 1999).
Eine prätherapeutische Analyse der p53-Akkumulation konnte bei 36 Patienten
durchgeführt werden. Der Nachweis einer p53-Akkumulation konnte bei 15
Resektionspräparaten (41,7 %) erbracht werden. An 30 Resektionspräparaten wurde
posttherapeutisch die p53-Akkumulation überprüft, wobei 12 Präparate (40 %) eine
positive nukleäre Reaktion aufwiesen. Es kam jeweils das CM1-Antiserum ( Firma
Novocastra, Newcastle, UK) zur Anwendung.
Mit Hilfe eines monoklonalen pan-ras Antikörpers (Firma Oncogene Science,
Uniondale, NY, USA) wurde an prä- und posttherapeutisch entnommenem
Tumorgewebe die p21ras-Überexpression untersucht. Von 34 Patienten stand im
Rahmen des Primärstagings entnommenes Tumorgewebe zur Verfügung, welches in
17 Fällen (50 %) eine positive zytoplasmatische Reaktion zeigte. Im Anschluß an die
neoadjuvante Behandlung konnte von 32 Studienpatienten Tumorgewebe analysiert
werden. Dieses wies in 15 Präparaten (46,9 %) eine positive zytoplasmatische
Reaktion auf.
Es konnten prä- und posttherapeutisch keine statistisch signifikanten Unterschiede
für das Gesamtüberleben der Patienten in Abhängigkeit von der p53-Akkumulation
und der p21ras-Überexpression nachgewiesen werden (Log-Rank-Test).
Die Höhe der Apoptoseindices zeigte prä- und posttherapeutisch keine statistisch
signifikante Abhängigkeit vom immunhistochemisch faßbaren p21ras-Status (jeweils
Wilcoxon-Test für unverbunde Stichproben).
56
Eine statistisch signifikante Abhängigkeit zwischen prä- und posttherapeutisch
nachgewiesener p53-Akkumulation und den gleichfalls bestimmten Apoptoseparametern ließ sich nicht belegen (jeweils Wilcoxon-Test für unverbundene
Stichproben).
57
5.
Diskussion
5.1
Kombinierte neoadjuvante Chemo- und Radiotherapie
Patienten mit lokal fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumoren
haben nach wie vor eine sehr schlechte Gesamtprognose, die sich in einer 5-JahresÜberlebensrate von unter 10 % widerspiegelt. Die Prognose ist im allgemeinen vom
Tumorstadium bei Diagnosestellung abhängig.
Mountain (1986) hat anhand von 3.753 Patienten mit bösartigem Lungentumor in
verschiedenen Stadien die 5-Jahres-Überlebesrate bestimmt. Patienten im Stadium I
haben demnach eine 5-Jahres-Überlebensrate zwischen 36 % und 62 %, im Stadium
II zwischen 23 % und 34 %, im Stadium III zwischen 5 % und 8 % und im Stadium
IV von nur 2 %. Die Operabilität unter kurativer Zielsetzung der Patienten im
Stadium I und II trägt wesentlich zu den höheren Überlebensraten bei. Dagegen ist
das Therapiekonzept der Patienten im Stadium III ein viel diskutiertes Thema. Durch
das Fehlen von klinisch faßbaren Fernmetastasen könnte hier ebenfalls eine bessere
Prognose erzielt werden, wenn diese Tumoren in einen operablen Zustand überführt
werden könnten. Ein relativ neues Therapiekonzept stellt die kombinierte
neoadjuvante Chemo- und Radiotherapie dar, wie es bei den Patienten im eigenen
Untersuchungsgut in einer kontrollierten klinischen Studie der Fall war.
Das gesamte Studienkollektiv (n = 54) des eigenen Untersuchungsgutes, das dem
Kollektiv der Münsteraner Phase II-Studie entspricht, bestand aus 25 Patienten, die
sich im Stadium IIIA und 29 Patienten, die sich im Stadium IIIB befanden. Alle
Patienten (n = 54) wurden einer neoadjuvanten präoperativen Radio- und Chemotherapie unterzogen, die sich aus drei Behandlungsblöcken zusammensetzte. Zwei
dieser Blöcke bestanden aus einer Kombinationstherapie mit den Chemotherapeutika
Ifosfamid, Carboplatin und Etoposid (ICE-Schema). Der dritte Block stellt eine
simultane Radiotherapie mit einer Gesamtdosis von 45 Gy und einer Chemotherapie
mit den Substanzen Carboplatin und Vindesin dar. Von den insgesamt 54
58
Studienpatienten konnten durchschnittlich sieben Wochen im Anschluß an dieses
Behandlungsschema 40 Patienten einer Resektionsbehandlung unter kurativer
Zielsetzung zugeführt werden.
Die mediane Überlebenszeit für das gesamte Studienkollektiv (n = 54) betrug 20,4
Monate mit einer Spannweite von 1,5-53,9 Monaten. Die Auswertung der medianen
Überlebenszeit für 40 operierte Studienpatienten ergab 23,1 Monate. Die Spannweite
lag bei 5,8-53,9 Monaten.
Vergleich der eigenen Ergebnisse mit denen verschiedener Studien bezüglich
medianer Überlebenszeiten
Eisert et al. (1976) stellten als einzige kurative Maßnahme für inoperable Patienten
mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren die Radiotherapie vor, wobei die lokale
Tumorkontrolle der ausschlaggebende Aspekt war.
Salazar et al. (1976) befürworteten die fraktionierte Radiotherapie, bei der insgesamt
bessere Ergebnisse erzielt wurden.
Petrovich et al. (1981) zeigten die Ergebnisse einer randomisierten Studie einer
Radiotherapie bei lokal fortgeschrittenen Lungentumoren anhand von 343 Patienten.
Es wurden zwei Gruppen gebildet, wobei zum einen eine Radiotherapie bestehend
aus 5.000 rad und 25 Fraktionen und eine kurze Radiotherapie mit 4.200 rad und 15
Fraktionen durchgeführt wurde. Die Langzeit-Überlebensraten unterschieden sich
nicht, jedoch betrug die mediane Dauer des Ansprechens auf die Therapie für die
intermediäre Therapie 18,4 und für die kurze Therapie 34,4 Wochen. 1984 stellten
Wils et al. eine randomisierte Phase II Studie über eine alleinige Radiotherapie
versus kombinierter Radio- und Chemotherapie und eine Studie über eine alleinige
Chemotherapie im Stadium IV bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren vor. Die
Ergebnisse zeigten eine signifikant längere mediane Überlebenszeit für Patienten im
Stadium III mit kombinierter Therapie (11 Monate) als bei alleiniger Radiotherapie
(5 Monate). Vergleichbare Werte liefern auch Arbeiten von Mattson et al. (1988),
Dillman et al. (1990), Le Chevalier et al. (1991) und Hazuka et al. (1992).
59
Thomas et al. (1995) verglichen Therapiekonzepte bei inoperablen Patienten im
Stadium III, die im folgenden aufgelistet sind:
1. sequentielle Chemo- und Radiotherapie versus alleinige Radiotherapie: die
kombinierte Therapie zeigte eine Verlängerung der medianen Überlebenszeit von
durchschnittlich
vier
Monaten
und
eine
Verdopplung
der
3-Jahres-
Überlebensrate.
2. simultane Chemo- und Radiotherapie: mediane Überlebenszeit 26 Monate,
2-Jahresüberlebensrate von 51 %
3. Neoadjuvante Chemo- und Radiotherapie: tendentiell günstigere Resektionsrate
vor allem für Patienten im Stadium III und erhöhte Rate pathologisch kompletter
Remissionen im Resektat.
Faber et al. (1989) und Rusch et al. (1993) führten an 85 bzw. 146 Patienten mit
nicht-kleinzelligen Lungentumoren im Stadium III eine kombinierte neoadjuvante
Radio- und Chemotherapie durch.
Das Patientenkollektiv in der Studie von Faber et al. wurde in zwei Gruppen mit
n = 56 und n = 29 Patienten unterteilt. Der Therapieplan bestand für 56 Patienten aus
vier Zyklen, die eine tägliche Kombinationschemotherapie mit den Substantzen
Cisplatin (60 mg/m²/Tag), 5-Fluoruracil (800 mg/m²/Tag) und eine Radiotherapie mit
Einzelfraktionen a 2 Gy 5 Tage jede zweite Woche beinhalteten. Für 29 Patienten
bestand die Kombinationschemotherapie zusätzlich aus Etoposid (VP-16) (60
mg/m²/Tag) und wurde jede dritte Woche verabreicht. Bei operablen Patienten
(n = 62) wurde ca. fünf Wochen nach Ende der Radio-/Chemotherapie die radikale
Operation durchgeführt. Die mediane Überlebenszeit betrug für das Gesamtkollektiv
n = 85 Patienten 22,1 Monate und für n = 62 operierte Patienten 36,6 Monate.
Der Vergleich der eigenen Ergebnisse mit den Ergebnissen der Studie von Faber et
al. zeigt eine recht gute Übereinstimmung bezüglich der Überlebenszeit der
Gesamtkollektive. Die neoadjuvante Radio- und Chemotherapie trug zu einer für das
Gesamtkollektiv (n = 85) bei Faber et al. medianen Überlebenszeit von 22,1 versus
20,4 Monaten für das eigene Patientengesamtkollektiv (n = 54) bei. Die medianen
Überlebenszeiten der im Anschluß an die Radio- und Chemotheapie operierten
60
Patienten betrugen 36,6 für n = 62 (Faber et al.) versus 23,1 Monate für n = 40 im
eigenen Untersuchungsgut. Die längere Überlebenszeit der operierten Patienten bei
Faber et al. könnte zum einen eine Verbesserung der Resektabilität der bösartigen
Lungentumoren im Stadium III durch das angewandte Therapiekonzept im
Gegensatz zum Behandlungsschema beim eigenen Untersuchungsgut bedeuten. Zum
anderen ist es jedoch so, daß Faber et al. keine Unterteilung des Patientenkollektivs
in die Stadien IIIA und IIIB vorgenommen haben und somit keine Aussage bezüglich
der präoperativen Voraussetzungen im Vergleich beider Studien möglich ist.
In der Studie von Rusch et al. (1993) erhielten 146 Patienten eine kombinierte
neoadjuvante Radio- und Chemotherapie, die aus zwei Behandlungsblöcken bestand.
Es liegen zur Zeit Studienergebnisse von 75 Patienten vor. Den Patienten wurde eine
Kombinationstherapie mit Cisplatin (50 mg/m²) an den Tagen 1, 8, 29 und 36 und
Etoposid (VP-16) (50 mg/m²) an den Tagen 1-5 und 29-33 verabreicht. Gleichzeitig
erhielten die Studienpatienten eine Radiotherapie mit täglichen Einzelfraktionen a
1,8 Gy, wobei die Gesamtdosis 45 Gy betrug. Eine radikale Operation wurde 3-5
Wochen nach der Radio-/Chemotherapie bei 63 Pateinten durchgeführt. Die mediane
Überlebenszeit für das gesamte Studienkollektiv (n = 75) betrug 17 Monate. Es
wurden keine Angaben zur medianen Überlebenszeit für die 63 operierten Patienten
gemacht.
Die Ergebnisse im eigenen Untersuchungsgut bezogen auf das Gesamtkollektiv sind
mit denen von Rusch et al. vergleichbar (mediane Überlebenszeit 20,4 Monate),
jedoch ist leider der Vergleich mit den kurativ operierten Patienten aufgrund
fehlender Daten nicht möglich.
In einer Phase II-Studie von Eberhardt et al. (1998) wurden 94 Patienten mit lokal
fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Lungentumoren in den Stadien IIIA und IIIB
mit einer intensiven multimodalen neoadjuvanten Chemotherapie gefolgt von einer
gleichzeitigen hyperfraktionierten Chemo-Radiotherapie und einer operativen
Resektionsbehandlung behandelt. 52 der Patienten befanden sich im Stadium IIIA
und 42 im Stadium IIIB. Die Therapie bestand aus drei Chemotherapie-
61
Behandlungsblöcken mit Cisplatin (60 mg/m²) an den Tagen 1 und 7 (oder 8) und
Etoposid (150 mg/m²) an den Tagen 3, 4 und 5. Diese Zyklen wurden alle 22 Tage
wiederholt. Die Studienpatienten erhielten in der 10. Behandlungswoche gleichzeitig
eine Radiotherapie a 3 Gy/Tag fünfmal in der Woche mit einer Gesamtdosis von 45
Gy in drei Wochen und eine Chemotherapie bestehend aus Cisplatin (50 mg/m²) an
den Tagen 2 und 9 und Etoposid (100 mg/m²) an den Tagen 4, 5 und 6 (nach Beginn
der Radiotherapie). 62 der 94 Studienpatienten befanden sich nach der Therapie in
einem operablen Zustand und konnten 3-4 Wochen nach Therapiebeginn einer
Operation zugeführt werden. Bei 50 Patienten wurde eine R0-Resektion
durchgeführt. Die mediane Überlebenszeit der 52 Studienpatienten im Stadium IIIA
betrug 20 Monate, der Patienten im Stadium IIIB 18 Monate (p = 0,59). Die 50
Studienpatienten, bei denen eine R0-Resektion durchgeführt werden konnte, wiesen
eine mediane Überlebenszeit von 42 Monaten auf im Vergleich zu den 44 Patienten
ohne R0-Resektion mit 13 Monaten (p = 0,0001).
Der Vergleich dieser Studien mit der Münsteraner Phase II-Studie im Hinblick auf
die Stadien IIIA und B zeigt auch hier übereinstimmende Ergebnisse (20,4 versus 20
bzw. 18 Monate).
Tabelle 5.1.1 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse der Münsteraner Phase II-Studie
mit denen von Faber et al. (1989), Rusch et al. (1993) und Eberhardt et al. (1998).
62
Tab. 5.1.1
Ergebnisse der kombinierten neoadjuvanten Chemo- und
Radiotherapie
Faber et al.
Rusch et al.
Münsteraner
Eberhardt et al.
1989
1993
Phase II Studie 1997
1998
n = 85
n = 75
n = 54
n = 52 Patienten im
Stadium IIIA
n = 42 Patienten im
Stadium IIIB
Neoadjuvante
Chemo- und
Radiotherapie,
22,1
17
20,4
Median der
Überlebenszeit
20 für Patienten im
Stadium IIIA
in
18 für Patienten im
Monaten
Stadium IIIB
63
5.2
Stellenwert der Apoptose
Die Apoptose (programmierter Zelltod) mit den typischen morphologischen
Veränderungen der Zelle ist seit ihrer Erstbeschreibung durch Kerr et al. 1972 in
zahlreichen Studien untersucht worden. Besonders wichtig ist, daß die Apoptose
durch unterschiedliche Agentien initiiert werden kann. Hierzu gehören u. a.
ionisierende Strahlung, Toxine und zytotoxische Medikamente (Fesus et al. 1991). In
der Krebsforschung ist das Auftreten des programmierten Zelltodes bei malignen
Tumorzellen als möglicher Ansatzpunkt für die Tumortherapie anzusehen (Trauth et
al. 1989). Tumorwachstum scheint mit einem Verlust der Fähigkeit der entarteten
Zellen, das Programm der Apoptose zu aktivieren, verbunden zu sein (Fisher 1994).
In der vorliegenden Studie ist kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den
prä- und posttherapeutisch ermittelten Apoptoseindices mittels der ISEL- (p = 0,35)
oder TUNEL- (p = 0,45) Methode zu erkennen.
Die eigenen Ergebnisse zeigen im Hinblick auf die Tumorbiologie, daß das Ausmaß
der Apoptose durch eine kombinierte neoadjuvante Radio- und Chemotherapie bei
lokal fokal fortgeschrittenen bösartigen Lungentumoren nicht dauerhaft modifiziert
wird.
P53
Die Untersuchungen der Apoptose auf molekularer Ebene haben entscheidende
Hinweise auf eine genetische Kontrolle erbracht. P53 ist ein Phosphoprotein von 53
kDa und bewirkt in seiner Wildtyp-Form die Aktivierung eines Zellzykluscheckpunktes mit nachfolgendem Verharren der Zellen in der G1-Phase und
unterbindet somit die Zellproliferation. Nach einer irreparablen DNA-Schädigung
bewirkt Wildtyp-p53 die Einleitung des programmierten Zelltodes.
Perdomo et al. (1998) führten in vivo-Untersuchungen an Mäusen mit nichtkleinzelligen Lungentumoren durch, um den Einfluß des p53-Status auf die
64
Zellproliferation und Chemoradiosensibilität darzustellen. Die Mäuse wurden in zwei
Gruppen unterteilt, denen man nicht-kleinzellige Lungentumoren mit jeweils
mutiertem p53 und Wildtyp-p53 implantierte. Die Tiere erhielten nach vier Wochen
eine kombinierte Chemo- und Radiotherapie mit Cisplatin (3 mg/kg KG und 15
mg/kg KG), eine einmalige Bestrahlung von 4 und 15 Gy und wurden im Anschluß
an die Therapie getötet. Mittels der TUNEL-Technik (s. 3.4) erfolgte nach 24, 48 und
72 Stunden die Markierung der apoptotischen Zellen im Tumorgewebe. Nach der
Cisplatinapplikation ermittelte Apoptoseindices waren bei den nicht-kleinzelligen
Lungentumoren mit Wildtyp-p53 statistisch signifikant höher als bei Tumoren mit
mutiertem p53 (p < 0,001). Bei den bösartigen Lungentumoren mit mutiertem p53
wurden die höchsten Apoptoseindices 48 Stunden nach einer hohen Cisplatin-Dosis
(15 mg/kg KG) erreicht, die jedoch nicht so hoch waren wie die der bösartigen
Lungentumoren mit Wildtyp-p53. Die Apoptoseindices zeigten 72 Stunden nach
einer niedrigen (3 mg/kg KG) und 48 Stunden nach einer hohen Cisplatin-Dosis (15
mg/kg KG) maximale Werte.
Diese tierexperimentellen Untersuchungsergebnisse zeigen, daß der programmierte
Zelltod als ein frühes Ereignis im Rahmen der therapieinduzierten Tumorregression
anzusehen ist und daher nur in diesem Stadium mittels hoher Apoptoseindices
aufgezeigt werden kann.
Die Auswertung der eigenen Ergebnisse ergibt, daß kein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen den prä- und posttherapeutisch erzielten Werten für den
programmierten Zelltod zu erkennen ist. Dies kann darauf zurückgeführt werden, daß
die Entnahme der Tumorresektionspräparate 7 Wochen nach Abschluß der Radio-/
Chemotherapie erfolgte. Nach dieser Zeit können hohe Apoptoseindices, die bereits
früh im Rahmen der therapieinduzierten Tumorregression auftreten, mit Hilfe der
ISEL- und TUNEL-Technik nicht mehr nachgewiesen werden.
Prognostische Relevanz von p53
Die Bedeutung des p53-Suppressorgens wird sehr oft in Untersuchungen bezüglich
der Prognose von Patienten mit Tumoren aufgezeigt. Die im vorliegenden
65
Untersuchungsgut ermittelten prä- und posttherapeutischen Apoptosewerte sowie die
im Rahmen paralleler Untersuchungen (Junker 1998, Schulmann 1999) nachgewiesene prä- und posttherapeutische p53-Akkumulation zeigen keine signifikante
Abhängigkeit.
Ein allgemein akzeptiertes Modell zur Funktion der Wildtyp-Form des p53 ist die
Aufrechterhaltung der Genstabilität und Induktion des G1-Arrestes im Zellzyklus
und der Apoptose in der Gegenwart von genotoxischen Substanzen. Hinzu kommt,
daß Untersuchungen von Gatter et al. (1990) und Dowell et al. (1995) aufzeigen, eine
regelrechte
p53-Aktivierung
sei
für
eine
effektive
Zellschädigung
durch
Chemotherapie notwendig.
Doch der Vergleich zahlreicher Studien mit Untersuchung verschiedener Tumoren,
z.B. nicht kleinzellige Lungentumoren (Tormänen et al. 1995) und Plattenepithelkarzinome im Gesichts- und Halsbereich (Hamada et al. 1995), zeigt, daß das p53Suppressorgen zwar einen Einfluß auf die Prognose der Patienten hat, aber
keinesfalls als unabhängige prognostische Variable anzusehen ist.
Auch Passlick et al. (1994) konnten für nicht-kleinzellige Lungentumoren im
Stadium III keine signifikante Abhängigkeit zwischen immunhistochemischem p53Status und Überlebenszeit nachweisen.
Proliferationsmarker PCNA und Ki-67
Die in der vorliegenden Studie mit Hilfe der ISEL- und TUNEL-Technik ermittelten
prä- und posttherapeutischen Apoptosewerte sowie die im Rahmen paralleler
Untersuchungen (Junker 1998, Schulmann 1999) bestimmten Proliferationsindices
(PCNA und Ki-67) zeigen keine signifikante Abhängigkeit.
Für die beiden Proliferationsmarker PCNA und Ki-67 ließ sich kein statistisch
signifikanter Unterschied zwischen prä- und posttherapeutisch ermittelten Werten
aufzeigen (Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben: PCNA: p = 0,84; Ki-67:
p = 0,23) (Junker 1998; Schulmann 1999).
66
Törmänen et al. (1995) führten an 75 Patienten mit bösartigen Lungentumoren
Untersuchungen mittels der ISEL-Methode und Immunhistochemie durch. Es konnte
keine Korrelation zwischen der Apoptoserate und der PCNA-Expression aufgezeigt
werden.
Korkolopoulou el al. (1993) analysierten die Expression des Tumorsuppressorgenes
p53 und dessen Korrelation mit dem Proliferationsmarker PCNA (proliferating cell
nuclear antigen) in nicht-kleinzelligen und kleinzelligen Lungentumoren. Bei nichtkleinzelligen Tumoren konnte eine positive signifikante Korrelation zwischen p53und PCNA-Indices (p < 0,001) festgestellt werden. Die Pathogenese der malignen
Tumoren wird wesentlich durch mutiertes p53 beeinflußt, welches zu vermehrter
Zellproliferation, genetischer Instabilität und erniedrigtem Apoptoseindex führt
(Symonds et al. 1994; Götz und Montenarh 1995).
ras
Ein Oncogen, welches in der Genetik der nicht-kleinzelligen Lungentumoren eine
Rolle spielt ist das ras-Oncogen. Ras-Gene sind in einer Gen-Superfamilie
zusammengefaßt, bestehend aus K-ras, H-ras und N-ras. Ras-Proteine sind aktiv,
wenn sie an GTP gebunden sind. Mutationen an oder in der Nähe der GTPBindungsstelle führen zur kontinuierlichen ras-Aktivität.
Im
Rahmen
von
Untersuchungen der letzten Jahre konnte auch ein Einfluß der p21-ras-Onkoproteine
auf die Apoptose aufgezeigt werden ( de Vries et al. 1996).
Im eigenen Untersuchungsgut konnte dagegen keine statistisch signifikante
Abhängigkeit zwischen den prä- und posttherapeutisch bestimmten Apoptoseindices
und der parallel analysierten prä- und posttherapeutisch ermittelten ras-Expression
(Junker 1998, Schulmann 1999) festgestellt werden.
Nach Fong et al. (1995) werden ras-Mutationen, v. a. von K-ras, in 13 % - 36 % der
nicht-kleinzelligen Lungentumoren gefunden und zwar vornehmlich in Adenokarzinomen.
67
Korrelation der Apoptoseindices mit der Überlebenszeit
In den eigenen Untersuchungen konnte weder prä- noch posttherapeutisch ein
signifikanter Unterschied der Länge des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von der
Höhe der Apoptoseindices ermittelt werden.
Eine Arbeit von Leoncini et al. (1993) zeigt eine signifikant positive Korrelation
zwischen Apoptoseindices und Proliferationsindices bei malignen Non-HodgkinLymphomen. Besonders interessant ist die Feststellung, daß nur der Apoptoseindex
signifikant (p < 0,05) mit der Gesamtüberlebensrate korreliert.
Eine interessante Studie über das Ausmaß der Apoptose in nicht-kleinzelligen
Lungentumoren und dessen Bedeutung als prognostischer Marker wurde von
Törmänen et al. (1995) durchgeführt. Es wurden 75 bösartige Lungentumoren in
Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit der ISEL-Methode markiert, um eine
Beurteilung des programmierten Zelltodes durchführen zu können. Die Arbeit war
darauf ausgerichtet, die Arbeitshypothese, daß eine hohe Apoptoseaktivität für ein
langsames Tumorwachstum steht und somit mit einer besseren Überlebenzeit der
Patienten verbunden ist, zu beweisen. Überrraschenderweise kam jedoch genau das
Gegenteil als Ergebnis dieser Studie heraus. Patienten mit einem Apoptoseindex
größer als 1,5 % hatten eine signifikant kürzere Überlebenszeit als die mit einem
Index ≤ 1,5 % (p < 0,01). Überexpression von mutiertem p53 war ebenfalls mit einer
schlechteren Prognose assoziiert (p < 0,002). Risikoabschätzungen legten dar, daß
eine hoher Apoptoseindex ein 1,9faches (p = 0,04) und eine Akkumulation von p53
ein 2,3 faches (p = 0,005) Risiko für ein verkürzteres Überleben darstellen. Es ist
festzuhalten, daß dieser Studie zufolge Apoptose und p53 unabhängige Parameter für
die Prognose des Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren sind. Der
Vergleich des programmierten Zelltodes mit dem Proliferationsmarker PCNA und
Nekrose zeigte demnach folgendes Resultat. Die Apoptoseindices waren in Tumoren
mit mehr als 50 % PCNA-positiven Zellkernen größer als in denen mit weniger als
50 % PCNA-positiven Kernen. Tumoren mit mehr als 20 % Nekroseanteil wiesen
ebenfalls höhere Apoptoseindices auf als Geschwülste mit wenigen nekrotischen
68
Bereichen, doch weder das eine noch das andere zeigte eine statistische Signifikanz.
Auffallend war, daß in bösartigen Lungentumoren im Stadium III ein signifikant
höherer Prozentsatz an apoptotischen Zellen gefunden wurde als im Stadium I und II
(p = 0,0019). Eine Korrelation zwischen TNM-Status des Tumors und dessen
Apoptoseindex wurde nicht gefunden.
Ein Vergleich dieser Studienergebnisse mit den eigenen Ergebnissen ist insofern
nicht aussagekräftig, als daß bei Tormänen und Mitarbeitern keine therapierten
Lungentumoren vorliegen und überwiegend frühere Tumorstadien untersucht
wurden. Das Patientenkollektiv bestand aus 70 Männern und 5 Frauen mit einem
Durchschnittsalter von 62 Jahren. Einige Gemeinsamkeiten sind trotzdem
festzustellen. In der eigenen Arbeit liegen die Apoptoseindices im Mittel mit der
ISEL-Technik prätherapeutisch bei 1,609 % und posttherapeutisch bei 1,691 % und
können zu den 1,5 %, die Törmänen et al. als Grenzwert angeben, in Beziehung
gebracht werden.
Des weiteren konnte keine Korrelation zwischen dem Ausmaß der Apoptose und
dem Auftreten von p53-positiven Zellen gefunden werden. Die eigene Studie zeigt
ebenfalls
keine
posttherapeutisch
statistisch
signifkante
nachgewiesener
Abhängigkeit
Apoptoseindices
und
zwischen
prä-
und
p53-Akkumulation.
Törmänen et al. (1995) zeigten statistisch signifikante Unterschiede in der
Überlebenszeit bei Patienten mit größer als 1,5 % und ≤ 1,5 % Apoptoseindex auf.
Die eigenen Resultate stellen dagegen weder prä- noch posttherapeutisch statistisch
signifikante Unterschiede der Länge des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von der
Höhe der Apoptoseindices für verschiedene überprüfte cut-off-Werte dar, so daß sich
hier eine prognostische Relevanz der Apoptoserate für neoadjuvant behandelte, lokal
weit fortgeschrittene Lungentumoren nicht ableiten läßt.
69
5.3
Quantifizierung der Apoptose, Sensitivität und Spezifität der
ISEL-und TUNEL-Technik
Der programmierte Zelltod ist ein relativ schnell ablaufender Prozeß, wobei die
angegebene Zeitdauer zwischen vier (Fesus et al. 1991) und 24 Stunden (Kerr et al.
1972) liegt.
Apoptose und ISEL-Technik
Die Untersuchungen anderer Autoren (Wijsman und Jonker et al. 1993, Gold et al.
1993, Ansari et al. 1993, Migheli et al. 1995) erfolgten ebenfalls nach gleichen oder
modifizierten Methoden der ISEL- (in situ end-labeling) Technik wie in der
vorliegenden Arbeit unter Kapitel 3.3 beschrieben.
Die eigene Arbeit zeigt, daß es nicht möglich ist, apoptotische und nekrotische Zellen
mittels der ISEL-Methode färberisch zu differenzieren. Die unterschiedliche
Morphologie beider Formen des Zellunterganges wie sie in Kapitel 1.4 dargestellt
wird, erlaubt letztlich eine Unterscheidung.
Wijsman und Jonker et al. (1993) stellten als erste die Methode der ISEL-Technik
vor, mit dem in formalinfixiertem und Paraffin-eingebettetem Gewebe apoptotische
Zellen nachgewiesen werden können. Die Unterscheidung der Apoptose von der
Nekrose, die beide durch DNA-Strangbrüche gekennzeichnet sind, ist mit dieser
Methode aber nicht ohne weiteres möglich. Die ISEL-Technik stellt laut Wijsman
und Jonker et al. eine Methode zur Quantifizierung der Apoptose dar.
Diese Feststellung deckt sich durchaus mit den eigenen Ergebnissen, wenn als
Schlußfolgerung eine hohe Sensitivität, aber geringere Spezifität der Methode für die
Darstellung des programmierten Zelltod angenommen wird.
70
Gold et al. (1993) stellen eine Arbeit vor, bei der sie die morphologischen
Erscheinungen der Apoptose in Thymuskulturen und bei in Paraffin eingebettetem
Gewebe eines Rattenrückenmarks u. a. mittels ISEL-Technik und einer Kombination
von Immunhistochemie und ISEL-Methode aufzeigen. Die Zellkuturen wurden mit
2.000 rad bestrahlt und als Vergleichsgruppe eine Bestrahlung mit gleichzeitiger
Gabe von Cycloheximid angelegt. Die ISEL-Technik zeigte eine Zunahme der
Apoptoserate nach Bestrahlung und eine Abnahme nach Gabe von Cycloheximid,
was auf eine inhibierende Potenz des Chemotherapeutikums hinweist. Die
Immunhistochemie diente zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen, um
Subpopulationen der Zellen und deren pogrammierten Zelltod darzustellen. Auch in
den fixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben, konnte man eine Kondensation des
Kernchromatins mit folgendem Zerfall des Kernes in viele basophile Körperchen
(apoptotic bodies), die von der Zellmembran umhüllt werden, erkennen. Die Autoren
folgern, die ISEL- Methode sei nicht in der Lage, frühe Stadien des nekrotischen
Zelluntergangs darzustellen. Sie könne jedoch nach den vorliegenden Ergebnissen als
hoch sensitiv und spezifisch für den Nachweis des programmierten Zelltodes
angesehen werden. Die Kombination mit der oben genannten Immunhistochemie
führe zu einer exakten Identifikation der Zellen, die apoptotisch seien.
Die Aussage der hohen Sensitivität deckt sich durchaus mit den eigenen Resultaten,
die hohe Spezifität kann aber unsererseits nicht bestätigt werden.
Ansari et al. (1993) zeigen ähnliche Resultate wie Wijsman et al. (1993). Sie
vergleichen die ISEL-Technik mit der normalen Hämatoxylin-Eosin-Färbung, bei der
ebenfalls lichtmikroskopisch Apoptosezellen zu sehen sind. Die Indentifizierung der
Apoptosekörperchen in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung ist wesentlich schwieriger,
da bespielsweise die Chromatinkondensation nicht so gut zu erkennen ist. Die ISELTechnik erlaubt auch eine Darstellung von einzelnen apoptotischen Zellen, da der
Zellkern intensiver zur Darstellung kommt. Hervorzuheben ist, daß die ISELTechnik auch Zellen markiert, die keine morphologischen Eigenschaften der
Apoptose aufweisen, z. B. nekrotische Zellen.
71
Als Schlußfolgerung könnte man auch hier eine hohe Sensitivität, aber geringere
Spezifität der Methode für die Darstellung des programmierten Zelltod anmerken.
Migheli et al. (1995) untersuchten das Auftreten von Apoptosezellen mittels ISELTechnik und Elektronenmikroskopie. Die morphologischen Zellveränderungen
wurden unter ultrastrukturellen Darstellungsmethoden verifiziert und DNAStrangbrüche in apoptotischen und möglicherweise prä-apoptotischen Zellen des
Nervengewebes gezeigt. Diese Ergebnisse zeigten, daß mit Hilfe der ISEL-Methode
und der Elektronenmikroskopie retrospektive Studien an Archivmaterialien
durchgeführt werden könnten.
Apoptose und TUNEL-Technik
Im eigenen Untersuchungsgut sind signifikant höhere Apoptoseindices mit der ISELals mit der TUNEL-Technik ermittelt worden (p = 0,0001), wobei auch hier das
Problem der Sensitivität und Spezifität zu erkennen ist.
Gavrieli et al. (1992) beschreiben eine andere Methode, mit der apoptotische Zellen
lichtmikroskopisch dargestellt werden können, die TUNEL- (TdT-mediated dUTPnick end-labeling) Technik. Diese Methode ist in Kapitel 3.4 beschrieben. Der
Unterschied zur ISEL- Technik besteht in der Zusammensetzung des EnzymCocktails.
Dieser
besteht
aus
TdT
(rekombinante
terminale
Desoxynukleotidtransferase), Digoxigenin-11-dUTP und einem dATP-, dCTP- und
dGTP-Mix. Die TUNEL-Methode ist wie die ISEL-Technik in der Lage den
programmierten Zelltod darzustellen, wobei auch hier die Morphologie der
Apoptosekörperchen wie bei der ISEL-Methode eine sehr wichtige Rolle spielt. Die
TUNEL-Reaktion markiert mit einer höheren Spezifität die Zellkerne, die in den
programmierten Zelltod eintreten.
72
Gold et al. (1993) interpretieren die Ergebnisse der ISEL-Technik als gute Methode
zur Identifizierung und Quantifizierung der Apoptose in normalem und pathologisch
verändertem Gewebe. Sie betonen aber, daß diese Technik nicht spezifisch für den
Nachweis des programmierten Zelltod ist und die Resultate mit Vorsicht und
Korrelation zu den morphologischen Kriterien der Apoptose zu interpretieren sind.
Gavrieli et al. (1992) beschreiben die TUNEL-Technik als in situ Darstellung des
programmierten
Zelltodes
auf
Einzelzellebene.
Die
Untersuchungen
an
verschiedenen Geweben wie lymphatische Organe, Epidermis, Dünn- und Dickdarm,
Ovar u.a. hätten gezeigt, daß die TUNEL-Reaktion spezifisch sei und nur die Kerne
angefärbt würden, wo ein programmierter Zelltod stattfände.
Diese Aussage kann unsererseits jedoch nicht bestätigt werden.
Vergleich ISEL- und TUNEL-Methode
Die eigenen Ergebnisse zeigen, daß nekrotische Tumorbezirke sowohl mit der ISELals auch mit der TUNEL-Technik markiert werden. Eine Unterscheidung von
Apoptose und Nekrose ist auch mit der TUNEL-Methode nur dann möglich, wenn
die konventionelle Lichtmikroskopie ebenfalls berücksichtigt wird, um falsch
positive Resultate zu vermeiden.
Mit der ISEL-Technik wurden im eigenen Untersuchungsgut sowohl prä- als auch
posttherapeutisch statistisch signifikant höhere Apoptoseindices bestimmt als mit der
TUNEL-Technik. Dies spricht für eine höhere Spezifität der TUNEL-Methode
gegenüber der ISEL-Technik.
Im Gegensatz zu den Aussagen von Gavrieli et al. (1992) ist aber eine 100 %ige
Spezifität der TUNEL-Methode zur Erkennung apoptotischer Zellen nicht gegeben.
73
6.
Zusammenfassung
Bei 54 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren wurde eine neoadjuvante
(präoperative) Therapie durchgeführt. Diese bestand aus einer präoperativen
kombinierten Radio-/Chemotherapie im Rahmen einer kontrollierten Phase II-Studie
mit der Zielsetzung, die Studienpatienten einer Resektionsbehandlung zuzuführen.
Untersuchungsgut, welches prä- und posttherapeutisch gewonnen wurde, ist unter der
Fragestellung von Ausmaß, Grad und Form der Apoptose histologisch untersucht
worden.
Darüberhinaus wurde die Frage des Verhältnisses von prä- und posttherapeutischem
Apoptoseverhalten der Tumoren analysiert und verglichen. Ein weiterer Untersuchungsaspekt war das Regressionsgrading der Tumoren nach Therapie.
Alle Tumoren befanden sich im Stadium IIIA oder IIIB, wobei 36 Plattenepithel- und
18 Adenokarzinome vorlagen.
Von den insgesamt 54 Patienten stand bei 33 prätherapeutisch Tumormaterial zur
weiteren mikroskopischen Untersuchung in Bezug auf das Apoptoseverhalten zur
Verfügung. Von 33 Patienten konnte posttherapeutisch entnommenes Tumorgewebe
untersucht werden.
Apoptose und ISEL- und TUNEL-Technik
Die prä- und posttherapeutisch gewonnenen Gewebeproben der Tumoren wurden
mittels ISEL- (in situ end-labeling) und TUNEL- (TdT-mediated dUTP-nick endlabeling) Technik aufgearbeitet und anschließend lichtmikroskopisch analysiert.
Der relative Anteil apoptotischer Zellen bzw. Apoptosekörperchen wurde durch das
Auszählen von 1.000 Tumorzellen mit einem 40er Objektiv lichtmikroskopisch
bestimmt und als Apoptoseindex in Prozent angegeben. Es wurden arithmetische
Mittelwerte bei der ISEL- und TUNEL-Technik prätherapeutisch von 1,609 % bzw.
0,93 % und posttherapeutisch von 1,691 % bzw. 1,1 % ermittelt. Der Vergleich der
prä- und posttherapeutisch mittels der beiden Methoden nachgewiesenen Apoptose-
74
indices zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den ermittelten
Werten für die ISEL- (p = 0,35) und TUNEL- (p = 0,45) Technik auf. Mit der ISELTechnik wurden sowohl prä- als auch posttherapeutisch statistisch signifikant höhere
Apoptoseindices bestimmt als mit der TUNEL-Technik (p = 0,0001) (Wilcoxon-Test
für verbundene Stichproben). Diese Werte können einen Hinweis auf eine höhere
Spezifität der TUNEL-Methode darstellen. Es wird aber auch deutlich, daß auch die
TUNEL-Methode keine 100%ige Spezifität für apoptotischen Zellen aufweist.
Regressionsgrading
Die Anwendung des Regressionsgradings nach Junker et al. (1997) zeigte
posttherapeutisch bei 7,5 % der Tumoren Grad I-, bei 25 % Grad IIa-, bei 50 % Grad
IIb- und bei 17,5 % Grad III-Tumorregressionen. Es ließ sich keine statistisch
signifikante Abhängigkeit zwischen den mit der ISEL- und TUNEL-Technik
nachgewiesenen Apoptoseindices und dem Regressionsgrading (Regressionsgrad
I/IIa versus Regressionsgrad IIb/III) ableiten.
Prognostische Relevanz der Apoptose
Die mediane Überlebenszeit für das gesamte Studienkollektiv (n = 54) betrug 20,4
Monate, für die 40 operierten Patienten 23,1 Monate.
Bei 27 Studienpatienten der Regressionsgrade IIb und III war die mediane
Überlebenszeit mit 27,9 Monaten statistisch signifikant länger als bei 13 Patienten
der Regressionsgrade I und IIa mit einer medianen Überlebenszeit von 13,7 Monaten
(Log-Rank-Test, p = 0,02). Die Gesamtüberlebenszeit zeigt keine statistisch
signifikante Korrelation mit den prä- und posttherapeutisch ermittelten Apoptoseindices auf.
Die eigenen Ergebnisse zeigen bei Vergleich der prä- und posttherapeutisch
ermittelten Apoptoseindices, daß das Ausmaß des programmierten Zelltodes durch
eine neoadjuvante Therapie zumindest nicht dauerhaft modifiziert wird.
75
7.
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90
8.
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Abbildungen
Abb. 1.1.1
Häufigste
histologische
Typen
bösartiger
Lungentumoren
(Vergrößerung 375x)
Abb. 1.1.2
A
kleinzelliges Lungenkarzinom
B
Plattenepithelkarzinom
C
Adenokarzinom
D
großzelliges Lungenkarzinom
Diagramm
zur
Darstellung
von
Risikofaktoren
bösartiger
Lungentumoren
Abb. 1.3.1
Therapieinduzierte Tumorregression bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren:
A
Ausschnitt aus einem Regressionsherd mit zentraler therapieinduzierter Nekrosezone (rechte Bildseite) und angrenzendem
Schaumzellsaum (linke Bildseite) (HE)
B
Schaumzellnest (obere Bildhälfte) mit Übergang in kollagenfaserreiches Narbengewebe (untere Bildhälfte) (EvG)
Abb. 1.3.2
Spontane Tumorregression bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren:
A
Spontan entstandene Nekrosezone, die um einen kapillarabhängigen vitalen Tumorsaum lokalisiert ist (HE)
B
Nekrosezone mit granulozytärer Reaktion (rechte Bildseite)
und angrenzendem vitalen Tumorsaum (linke Bildseite) (HE)
91
Abb. 1.4.1
Schematische Darstellung des Ablaufs der Apoptose mit intakter
Zelle, Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, DNAFragmentierung, Bildung von ”apoptotic bodies” und Phagozytose
durch Makrophagen
Abb. 1.4.2
Schema des Ablaufs der Apoptose in Drüsenepithelzellen
(Wyllie et al. 1980)
1) Frühstadium der Kern- und Zytoplasmaveränderungen
2) Gruppe interzellulärer ”apoptotic bodies”
3) Abschnürung der Apoptosekörperchen ins Drüsenlumen
4) Phagozytose durch benachbarte Epithelzellen
5) Phagozytose durch Makrophagen
6) Degeneration und lysosomale Verdauung
Abb. 1.4.3
Beziehung zwischen Proliferation und Apoptose (Vermes und Haanen
1994) dargestellt durch c-myc, APO-1/Fas, bcl-2 und p53
Abb. 3.1.1
Therapieschema der kombinierten neoadjuvanten Chemo-/Radiotherapie bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren im Stadium III
Abb. 3.3.1
Darstellung der apoptotischen Zellen in lymphatischem Gewebe einer
Tonsille
A
braunrot markierte Zelle mit der ISEL-Technik
B
braunschwarz markierte Zellen in der Bildmitte mit der
TUNEL-Technik
92
Abb. 4.2.1
A
Darstellung der apoptotischen Zellen (dunkelbraun markiert in
der Bildmitte) mittels ISEL-Technik in nicht-kleinzelligem
Lungentumor
(behandeltes niedrig differenziertes Adenokarzinom,
Regressionsgrad IIa, männlich, 37 Jahre)
B
Darstellung der apoptotischen Zellen (schwarz markierte
Zellfragmente) mittels TUNEL-Technik in nicht-kleinzelligem
Lungentumor (behandeltes, regressiv verändertes Adenokarzinom,
Regressionsgrad IIb, männlich, 56 Jahre)
Abb. 4.2.2
Darstellung der unspezifisch markierten Zellen in nekrotischen
Tumorbereichen eines nicht-kleinzelligem Lungentumors
A
schwarz markierte Zellkomplexe in der Bildmitte mit der
ISEL- Technik
B
dunkelrot markierte Zellkomplexe in der Bildmitte mit der
TUNEL-Technik
93
Tabellen
Tab. 1.1.1
Histologische Klassifikation von bösartigen Lungentumoren
nach der WHO (1999)
Tab. 1.1.2
Stadieneinteilung der Lungentumoren nach Mountain et. al (1986)
Tab. 1.4.1
Tabellarische Gegenüberstellung der Charakteristika von Apoptose
und Nekrose
Tab. 3.1.1
Regressionsgrading bei neoadjuvant behandelten nicht-kleinzelligen
Lungentumoren (Junker et al. 1997)
Tab. 3.1.2
Klinische Remissionskriterien der Southwest Oncology Group
(SWOG) (Green und Weiss 1992)
Tab. 4.1
Darstellung der TNM-Stadien der 54 Studienpatienten mit nichtkleinzelligem Lungentumor
Tab. 4.2
Histologischer Tumortyp, TNM, Stadium der 54 Studienpatienten mit
nicht-kleinzelligem Lungentumor
Tab. 4.1.1
Absolute und relative Häufigkeiten der Regressionsgrade der
resezierten Lungentumoren der 40 operierten Studienpatienten nach
Junker et al. (1997)
Tab. 4.2.1
Arithmetischer Mittelwert, Median und Standardabweichung der
mittels ISEL- und TUNEL-Methode ermittelten Apoptoseindices der
nicht-kleinzelligen Lungentumoren
94
Tab. 5.1.1
Vergleich der Ergebnisse der kombinierten neoadjuvanten Chemound Radiotherapie der nicht-kleinzelligen Lungentumore
verschiedener Studien (Faber et al. 1989, Rusch et al. 1993,
Münsteraner Phase II Studie 1997, Eberhardt et al. 1998)
95
Danksagung
Ich möchte mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Dr. med. Müller, Direktor des
Instituts für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil
Bochum, bedanken, da seine Anregungen und Kritiken sehr hilfreich für den
Abschluß meiner Dissertation waren.
Mein ganz besonderer Dank geht an Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Junker, der mich
durch seine Anregungen, Anmerkungen und Kritiken sehr unterstützt hat. Ich konnte
jederzeit auf seine Unterstützung zählen und hätte mir keinen besseren Betreuer
meiner Dissertation wünschen können.
Des weiteren gilt mein Dank Frau U. Thomek und C. Troske, die mich im
praktischen Teil meiner Arbeit unterstützt haben, ebenfalls den anderen Mitarbeitern
des Instituts für Pathologie im Bergmannsheil Bochum, die mir eine große Hilfe
waren.
96
Lebenslauf
Name:
Aydan Yazar
Geburtsdatum:
10.06.1974
Geburtsort:
Bochum
Schulbildung:
1980-1984
Grundschule Eppendorf in Bochum
1984-1990
Realschule Höntrop in Bochum
1990-1993
Goethe-Gymnasium in Bochum
1993-1995
Studium der Humanmedizin,
Medizinstudium:
vorklinischer Studienabschnitt,
an der Ruhr-Universität in Bochum
August 1995
Physikum
1995-1999
Studium der Humanmedizin,
klinischer Studienabschnitt,
an der Ruhr-Universität in Bochum
August 1996
Erstes Staatsexamen
August 1998
Zweites Staatsexamen
1998/1999
Praktisches Jahr (Innere Medizin und
Chirurgie)
in
den
Berufsgenossen-
schaftlichen Kliniken Bergmannsheil in
Bochum mit dem Wahlfach Pädiatrie in
der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital in Bochum
November 1999
Drittes Staatsexamen
98