Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus
Werbung
Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus der Abteilung Bakteriologie (Nationales Referenzzentrum für Systemische Mykosen) des Universitätsklinikums Göttingen Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Nicole Denikus aus Horstedt Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung durch die Tierärztliche Hochschule: Univ.-Prof. Dr. G. F. Gerlach Wissenschaftliche Betreuung durch das Universitätsklinikum Göttingen: Priv.-Doz. Dr. U. Reichard 1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. G. F. Gerlach 2. Gutachter/in: Prof. Dr. K. H. Böhm Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2004 Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Re 953/3). Teile dieser Arbeit sind auf folgenden Kongressen vorgestellt worden: DENIKUS, N., B. RIEMENSCHNEIDER und U. REICHARD (2003) Identification of antigens of A. fumigatus expressed during invasive mycosis Poster, 6th VAAM-Meeting “Molecular Biology of Fungi” Göttingen, 03.-05.09.2003 DENIKUS, N., B. RIEMENSCHNEIDER und U. REICHARD (2003) A rabbit model for identification of Aspergillus antigens expressed during invasive mycosis Poster, 55. Annual Meeting of the “Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie” Dresden, 28.09.-01.10.2003 Inhaltsverzeichnis A Einleitung S. 9 B Schrifttum S. 10 B.1 Aspergillen S. 10 B.1.1 Taxonomie S. 10 B.1.2 A. fumigatus S. 10 B.1.2.1 Morphologie S. 11 B.1.2.2 Vorkommen und Bedeutung S. 12 B.1.2.2.1 A. fumigatus und seine Bedeutung in der Veterinärmedizin S. 12 B.1.2.2.2 A. fumigatus und seine Bedeutung in der Humanmedizin S. 18 B.1.2.2.2.1 Invasive Aspergillose S. 18 B.1.2.2.2.2 Andere durch Aspergillen verursachte Erkrankungen des Menschen S. 20 B.1.3 Immunologie S. 21 B.1.3.1 Angeborene Immunität S. 21 B.1.3.2 Erworbene Immunität S. 22 B.1.3.3 Immunität im Tiermodell S. 23 B.1.4 Tiermodelle der invasiven Aspergillose S. 24 B.1.5 Antigene und Virulenzfaktoren S. 26 B.1.6 Diagnostik S. 30 B.1.7 Genomprojekt S. 30 C Material S. 31 C.1 Geräte S. 31 C.2 Verbrauchsmaterial und Chemikalien S. 31 C.3 Lösungen, Puffer und Nährmedien S. 31 C.4 A. fumigatus D141 S. 31 C.5 A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek S. 31 C.6 Bakterienstämme S. 32 C.7 Antikörper S. 32 C.8 Primer S. 32 C.9 Versuchstiere S. 32 D Methoden S. 33 D.1 Tierexperimentelle Methoden S. 33 D.1.1 Blutentnahmen und Serumgewinnung S. 33 D.1.2 Immunsuppression S. 33 D.1.3 Infektion der Tiere S. 33 D.1.3.1 Infektionsbegleitende Kontrollen S. 34 D.1.3.2 Kontrolle des Infektionserfolges S. 34 D.1.3.3 Serologische Diagnostik S. 35 D.1.4 Tötung der Tiere S. 35 D.1.4.1 Sektion und weiterführende Untersuchungen S. 35 D.2 Mikrobiologische, proteinchemische und immunologische Methoden S. 36 D.2.1 Herstellung von Ausgangsmaterial von A. fumigatus D 141 S. 36 D.2.1.1 Herstellung der Zellwandfraktion S. 38 D.2.1.2 Herstellung der intrazellulären Proteinfraktion S. 38 D.2.2 Bestimmung des Proteingehalts S. 39 D.2.3 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) S. 40 D.2.3.1 Herstellung der Gele S. 41 D.2.3.2 Coomassie-Brillantblau-Färbung S. 42 D.2.4 Zweidimensionale Gelelektrophorese S. 43 D.2.4.1 Vorbereitung der Proben S. 43 D.2.4.2 Erste Dimension (Isoelektrische Fokussierung) S. 44 D.2.4.3 Zweite Dimension (Proteinseparation nach dem Molekulargewicht) S. 44 D.2.4.3.1 Herstellung der Gele S. 44 D.2.4.3.2 Gelelektrophorese S. 45 D.2.4.3.3 Silberfärbung S. 46 D.2.4.3.4 Kolloidale Coomassie-Färbung S. 47 D.2.5 Proteintransfer mittels Westernblot S. 48 D.2.6 Immundetektion nach Westerblot (Immunblot) S. 48 D.3 Molekularbiologische Methoden S. 50 D.3.1 Screening einer A. fumigatus-cDNA-Expressionsbank mit Antikörpern (Immunscreening) S. 50 D.3.1.1. Vorbereitungen S. 50 D.3.1.2 Absorption von Anti-E.coli-Antikörpern durch Pseudoscreening S. 51 D.3.1.3 Screening der λ-ZAP-cDNA-Phagenbank mit Infektionsseren S. 52 D.3.1.4 Aufreinigung der isolierten Phagenklone S. 53 D.3.1.5 Infektionsspezifität der Klone S. 53 D.3.1.6 Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene S. 54 D.3.2 Umklonierung der cDNA aus λ-ZAP in ein Plasmid S. 54 D.3.3 Plasmid-Minipräparation S. 55 D.3.4 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektroporation S. 56 D.3.5 Transfektion von Plasmid-DNA in E.coli DH 5α S. 56 D.3.6 DNA-Sequenzanalyse S. 57 D.3.6.1 Sequenzierung S. 57 D.3.6.2 Computeranalyse der Sequenzdaten S. 57 D.3.7 Klonierung von pET-Expressionsplasmiden S. 58 D.3.7.1 Produktion HIS-getagter pET-Proteine S. 58 D.3.7.2 Aufarbeitung HIS-getagter pET-Proteine S. 58 D.3.7.2.1 Verwendete Puffer, Säulenäquilibrierung und Vorbereitung des Probenmaterials S. 59 D.3.7.2.2 Affinitätschromatographie HIS-getagter pET-Proteine S. 60 E Ergebnisse S. 61 E.1 Tierversuch S. 61 E.1.1 Anzahl der Tiere und Infektionsdosen S. 61 E.1.2 Infektionsbegleitende Kontrollen S. 62 E.1.2.1 Gewichtsabnahme und Körpertemperatur S. 62 E.1.2.1.1 Prozentuale Gewichtsabnahme der Tiere im Verlauf der Infektionen S. 73 E.1.2.1.2 Körpertemperaturen der Tiere im Verlauf der Infektionen S. 74 E.1.2.2 Auswertung der infektionsbegleitenden Kontrollen S. 75 E.1.3 Überprüfung und Darstellung des Infektionserfolges S. 75 E.1.3.1 Auswertung der eindimensionalen Immunblots S. 78 E.1.3.2 Zweidimensionale Gele und Immunblots S. 79 E.1.4 PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA S. 82 E.1.5 Sektionen S. 83 E.1.5.1 Sektionsbilder S. 84 E.1.6 Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells S. 86 E.2 Screening einer A. fumigatus- cDNA- Expressionsbibliothek mit Infektionsseren (Immunscreening) S. 87 E.2.1 Screeningzeitpunkt S. 97 E.2.2 Gescreente und aufgereinigte Plaques S. 97 E.2.3 Infektionsspezifität der Antigene S. 99 E.2.3.1 Darstellung infektionsspezifischer Antigene S. 99 E.2.4 Zusammenfassende Darstellung der durch das Screening der cDNA-Bank isolierten Antigene S. 101 E.2.4.1 Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene S. 103 E.2.4.2 Darstellung der Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene S. 104 E.2.5 Einordnung der Antigene S. 105 E.2.6 Rekombinante Proteine S. 107 F Diskussion S. 108 F.1 Aspf 16 S. 109 F.2 Weitere Antigene mit Enzymfunktion S. 110 F.3 Proteine mit Chaperonfunktion S. 111 F.4 Proteine mit bislang unbekannter Funktion S. 113 F.5 Tiermodell S. 115 G Zusammenfassung S. 118 H Summary S. 119 I Literaturverzeichnis S. 120 J Anhang S. 158 J.1 Geräte S. 158 J.2 Verbrauchsmaterial S. 159 J.3 Chemikalien S. 160 J.4 Stammlösungen S. 162 J.5 Nährmedien S. 163 J.6 Abbildungsverzeichnis S. 164 J.7 Tabellenverzeichnis S. 166 Abkürzungsverzeichnis A. = Aspergillus Abb. = Abbildung A. bidest. = Aqua bidestillata bspw. = beispielsweise bzw. = beziehungsweise ca. = circa cDNA = copy deoxyribonucleic acid et al. = et alii d = Tage g = Erdbeschleunigungskonstante ggf. = gegebenenfalls ggr. = geringgradig h = Stunde hgr. = hochgradig Ig = Immunglobuline i.v. = intravenös kDa = Kilodalton KGW = Körpergewicht λ = Lambda M = Molarität (mol/l) mgr. = mittelgradig 3 m = Kubikmeter MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex mRNA = messenger ribonucleic acid p. inf. = post infectionem SDS-PAGE = Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Tab. = Tabelle U = unit UV = Ultraviolett v. a. = vor allem V = Volt [v/v] = volume per volume [w/v] = weight per volume A Einleitung Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender Schimmelpilz, der sich asexuell über Konidien fortpflanzt. Die Inhalation der Konidien ist in der Regel für immunkompetente Individuen ohne Folgen, da die angeborene Immunität ein invasives Wachstum des Pilzes verhindert. Bei Immunsupprimierten hingegen verursacht A. fumigatus als opportunistischer Krankheitserreger sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin Erkrankungen mit oftmals letalem Ausgang. So wird die Zahl der humanen Patienten, die an einer invasiven Aspergillose erkranken, allein in Deutschland auf 5000 pro Jahr geschätzt (MÜLLER 1994). Die Erkrankung verläuft trotz Therapie in ca. 50 bis 60 % der Fälle tödlich und betrifft insbesondere Leukämiepatienten und Empfänger von Organtransplantaten (BODEY et al. 1992; DENNING 1995; 1996; GROLL et al. 1996; DENNING 1998; LATGÉ 1999; LIN et al. 2001). Obwohl die normale Abwehr von A. fumigatus durch unspezifische angeborene Immunmechanismen (Granulozyten, Makrophagen, Komplement) erfolgt, ist es gelungen, im Tierversuch eine Immunität gegen invasives Wachstum von A. fumigatus zu erzeugen. Welche Antigene diesen Schutz vermitteln, ist jedoch weitgehend unklar. Bislang ist lediglich ein einziges immunitätsvermittelndes Antigen des Pilzes (Aspf 16) identifiziert worden (BOZZA et al. 2002). Ziel dieser Arbeit ist es, weitere Antigene von A. fumigatus zu identifizieren und damit einen Beitrag für die mögliche Entwicklung eines Impfstoffes für Risikopatienten zu leisten. Des Weiteren ergibt sich durch die Identifikation von Antigenen die Option, neue auf Antigen-Detektion basierende Tests zu entwickeln, die eine frühzeitige Diagnostik der invasiven Aspergillose ermöglichen könnten. 9 B Schrifttum B.1 Aspergillen B.1.1 Taxonomie Die Gattung Aspergillus ist im Jahre 1729 begründet worden (MICHELI 1729). Aufgrund der Morphologie der Aspergillen werden diese Schimmelpilze auch als Gießkannenschimmel bezeichnet. Aspergillen gehören zur Abteilung der höheren Pilze. Ihre taxonomische Zuordnung richtet sich nach Art ihrer Fortpflanzung. So werden Aspergillen, die sich sexuell (teleomorph) fortpflanzen, der Unterabteilung der Ascomycotina (Schlauchpilze) zugeordnet. Hier gehören sie der Ordnung der Eurotiales (KWON-CHUNG u. BENETT 1992) an. Die teleomorphen Arten der Gattung Aspergillus werden innerhalb dieser Ordnung unter anderen Namen geführt als die Arten, die sich als so genannte imperfekte Pilze durch ihre ungeschlechtliche (anamorphe) Fortpflanzung auszeichnen. Diese sich asexuell reproduzierenden Aspergillen werden zu der Unterabteilung der Deuteromycotina (Fungi imperfecti) gezählt. In dieser Unterabteilung ist eine Vielzahl von Pilzen zusammengefasst, von denen bisher nur die ungeschlechtliche Fortpflanzung und keine sexuelle Vermehrungsform bekannt ist (ROLLE u. MAYR 1993). Bei den imperfekten Pilzen ist die Gattung Aspergillus der Ordnung Moniliales und der Klasse der Fadenpilze (Hyphomyceten) zugehörig (KWON-CHUNG u. BENETT 1992). Heutzutage sind mehr als 180 Aspergillus-Arten bekannt. Davon sind ungefähr 70 Arten mit teleomorpher Fortpflanzung beschrieben (SAMSON 1999). B.1.2 Aspergillus fumigatus Das erste Mal wurde die Art A. fumigatus im Jahre 1863 von Fresenius beschrieben. Dieser berichtete über Aspergillus-Formen, die er in der menschlichen Lunge und in dem Respirationstrakt einer Trappe aufgefunden hatte (SCHMIDT u. SCHMIDT 1999). Da für A. fumigatus bisher nur die asexuelle Fortpflanzung in Form von Konidien bekannt ist, wird er als imperfekter Pilz in die Klasse der Fadenpilze (Hyphomyceten) und der Ordnung der Moniliales gruppiert. 10 B.1.2.1 Morphologie Aspergillus fumigatus pflanzt sich asexuell über so genannte Konidiosporen fort. Diese Konidien werden von ausdifferenzierten Anteilen des Myzels, den Konidiophoren, gebildet und in die Umgebung abgegeben. Die Sporen sind von graugrüner Farbe und 2-3 µm groß (RAPER u. FENELL 1965). Konidien Konidiophorvesikel Konidiophor Phialiden Fußzelle Nährmyzel 10 µm Abb. 1: Morphologie von Aspergillus fumigatus Auf Sabouraud- und Malzextraktagar wachsen innerhalb von 2-3 Tagen bei 37°C Pilzkolonien von samtiger Textur (KWON-CHUNG u. BENETT 1992). Aspergillus fumigatus ist ein thermophiler Schimmelpilz, dessen Wachstumsoptimum bei 37° bis 42°C liegt. Jedoch ist er in der Lage, selbst bei minimalen Temperaturen von 10°12°C und maximalen Gradzahlen von 55°C zu wachsen (REISS 1997). 11 B.1.2.2 Vorkommen und Bedeutung Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender, heterotropher Schimmelpilz mit saprophytärer Lebensweise. Er findet sich in Heu, Müll und Blumenerde, sowie in Vogelnestern, Hühnerställen und Tierbauten (REISS 1997). Aufgrund seiner Thermotoleranz konnte er sogar in der oberen Atmosphäre, der Sahara und der Antarktis gefunden werden (BARDANA 1980). Die durchschnittlichen Sporenkonzentrationen in Räumen und der freien Natur liegen bei 2-5 Konidien pro m3. Mensch und Tier atmen daher täglich mehrere hunderte dieser Konidien ein (GOODLEY et al. 1994; HOSPENTHAL et al. 1998). Bedingt durch ihre geringe Größe von lediglich 2-3 µm gelangen sie mit dem Luftstrom bis in die Lungenalveolen eines Individuums (RAPER u. FENELL 1965; SAMSON u. VANREENEN-HOEKSTRA 1988). Die Inhalation der Konidien ist in der Regel für immunkompetente Individuen ohne Folgen, da die angeborene Immunität ein invasives Wachstum des fakultativ pathogenen Pilzes verhindert (SCHNEEMANN u. SCHAFFNER 1999). Bei Immunsupprimierten hingegen verursacht A. fumigatus zunehmend Erkrankungen mit oftmals letalem Ausgang (COHEN et al. 1993; ROGERS 1995; RUCHLEMER et al. 1996). Aspergillen sind als opportunistische Infektionserreger sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin bekannt. B.1.2.2.1 A. fumigatus und seine Bedeutung in der Veterinärmedizin In der Veterinärmedizin werden Erkrankungen, die durch Aspergillen hervorgerufen werden, in Aspergillosen des Geflügels und Aspergillosen der Säugetiere unterschieden. Die Aspergillose des Geflügels wird hauptsächlich durch A. fumigatus hervorgerufen. Vereinzelt kommen auch A. flavus, A. niger, A. nidulans und A. terreus als Krankheitsverursacher in Frage (GEDEK 1989; PAL 1992; HEIDENREICH 1997). Da der besondere Atmungsapparat der Vögel dem Pilz in Bezug auf Temperatur, Feuchtigkeit und Belüftung ideale Wachstumsbedingungen bietet, ist das Geflügel relativ häufig von der Erkrankung betroffen (GEDEK 1989). 12 Bei der Geflügelaspergillose werden Einzeltiererkrankungen und Enzootien in der Massentierhaltung unterschieden. Bei letzteren kann ein seuchenartiges Auftreten der Erkrankung beispielsweise durch Sägespäneeinstreu begünstigt werden, da dieses Schleimhautläsionen im Atmungstrakt der Tiere hervorruft und somit das Eindringen des ubiquitär vorkommenden Erregers in den Wirt fördert. Die hohe Besatzdichte der Tiere in der Intensivhaltung und die sich daraus entwickelnde Staubentwicklung tragen ihr Übriges zu einer Infektion bei (ROLLE u. MAYR 1993). Aspergillus fumigatus ist sogar in der Lage, Eier zu infizieren, die gerade bebrütet werden. Der Pilz siedelt sich auf der Oberfläche des Eis an und dringt durch die Poren der Eischale ein. Durch sein Wachstum auf der Schalenhaut tötet er schließlich den Embryo (GEDEK 1989). Für die Aspergillose des Geflügels sind akute Formen (v. a. bei Küken) durch das Einatmen einer großen Konidienzahl aufgrund mangelnder Stallhygiene ebenso beschrieben, wie chronische Verläufe bei gestressten und immunsupprimierten adulten Tieren. Letztere werden durch eine kontinuierliche Exposition mit dem ubiquitären Pilz hervorgerufen (REDIG 1986; GEDEK 1989; OGLESBEE 1997). Die akute Erkrankung führt bei Küken zu einer zügigen Kolonisation der Lungen und äußert sich klinisch hauptsächlich als schwere Dyspnoe. Daneben können Apathie, Fieber, Diarrhoe und Krämpfe beobachtet werden. In der Lunge lassen sich massenhaft diffus verstreute stecknadelkopfgroße Pilzgranulome nachweisen (GEDEK 1989; OGLESBEE 1997). Bei der chronischen Form der Erkrankung werden zunächst die Luftsäcke und der Syrinx befallen. Im Krankheitsverlauf kommt es zu einer Verbreitung des Erregers im gesamten Respirationstrakt (OGLESBEE 1997). Klinisch ist die Erkrankung durch Dyspnoe, akzessorische Atemgeräusche und gestörte Bewegungskoordination gekennzeichnet. Pathologische Veränderungen sind in Form von konzentrischen graugünen Herden in der Lunge, den Bronchien und den Luftsäcken festzustellen. Vereinzelt sind plattenförmige, käsige, von Pilzrasen bedeckte Schwielen zu sehen, die das gesamte Lumen der Luftsäcke einnehmen und sekundär verkalken können (GEDEK 1989). Das Erkrankungsrisiko hängt von vielerlei Faktoren wie Stress (z. B. durch Gefangennahme, Verschiffung), Trauma (z. B. Verletzung, Rauchinhalation), zu hohem Stallbesatz, ungenügender Stallhygiene und Mangelernährung (Hypovitaminose A) ab. Prädisponierend sind besonders bereits bestehende Erkrankungen, die fortwährende Gabe von Antibiotika (Tetrazyklin) oder eine 13 Therapie mit immunsupprimierenden Kortikosteroiden (AGUILAR u. REDIG 1995; HEIDENREICH 1997; OGLESBEE 1997; ZIEMER 2001). Die Aspergillose ist die am häufigsten auftretende Endomykose bei frei lebenden, in Gefangenschaft gehaltenen oder domestizierten Spezies (GEDEK 1989). Für frei lebende Tiere wurden tödliche Krankheitsverläufe bei Kakadus (BURR 1981), Möwen (BRAND et al. 1988), Stockenten (BAIR et al. 1988) und Krähen (ZINKL et al. 1977) beschrieben. Die Erkrankung wird bei frei lebenden Raubvögeln hingegen selten beobachtet (HEIDENREICH 1997), spielt für in Gefangenschaft gehaltene Tiere (z. B. in Zoos) durch die mit dem Arrest verbundene Steigerung des Erkrankungsrisikos jedoch eine Rolle (DYKSTRA et al. 1997; REDIG 1997; FAUCETTE et al. 1999). Von tödlichen Krankheitsverläufen bei jungen Straußen, die durch eine kontaminierte Umgebung und inadäquate Haltungsbedingungen infiziert wurden, berichteten PERELMAN u. KUTTIN (1992) und YOKOTA et al. (2004). MARKS et al. (1994) und FITZGERALD u. MOISAN (1995) beobachteten die Erkrankung bei adulten Tieren im Zusammenhang mit lang andauernden Antibiotikatherapien. Sehr empfänglich für eine Infektion mit A. fumigatus sind auch verschiedene Pinguinarten. In zoologischen Gärten und Aquarien wurden Infektionsausbrüche mit letalem Ausgang bei kurz zuvor importierten Tieren beobachtet (KHAN et al. 1977; NAKEEB et al. 1981). FLACH et al. (1990) analysierten retrospektiv die Mortalität von Pinguinen eines Zoos und stellten fest, dass die Aspergillose bei den meisten Tieren die Todesursache war. Ebenso waren junge Tiere wesentlich empfänglicher für die Erkrankung als adulte Pinguine. REIDARSON u. MC BAIN (1992) vertreten die Meinung, dass jeder in Gefangenschaft gehaltene Pinguin in gewissem Ausmaß mit Aspergillen infiziert ist, es jedoch nur bei prädisponierten Tieren, bspw. durch Stress oder andere Erkrankungen, zur klinischen Manifestation einer Aspergillose kommt. Unter den domestizierten Vögeln gelten Graupapageien, Amazonen und Kakadus als besonders anfällig für die Erkrankung (RITCHIE 1990; ZIEMER 2001). Als häufige Ursache für die Aspergillose kommen bei diesen Tieren eine nichtartgerechte Haltung (trockene Heizungsluft, Bewegungsmangel) sowie Mangelernährung (Vitamin-A-Mangel durch ausschließliche Samennahrung, Verfütterung von Nüssen und Samen, die mit Pilzsporen kontaminiert sind) infrage (SIMPSON u. EUDEN 1991; ZIEMER 2001). Prädisponiert sind auch hier Jungtiere, Tiere mit bestehender 14 chronischer Erkrankung oder Vögel, denen Antibiotika und/ oder Cortison verabreicht wird (MC MILLAN u. PETRAK 1989; VAN DER HEYDEN 1993; ZIEMER 2001). Die Aspergillose der Säugetiere ist weniger verbreitet als die Aspergillose des Geflügels. Seuchenartige Infektionsausbrüche gibt es bei Säugetieren nicht, die Erkrankung ist stets auf Einzeltiere beschränkt (GEDEK 1989). Bezüglich der Pathogenese gibt es viele Parallelen zu der Erkrankung des Geflügels. So wirken sich bereits bestehende Erkrankungen, die anhaltende Gabe von Antibiotika oder eine Therapie mit immunsupprimierenden Kortikosteroiden auch bei diesen Tieren prädisponierend für eine Aspergillose aus (WEILER et al. 1991; GREENE 1998; PÉREZ et al. 1998, 1999). Die Erkrankung ist in den meisten Fällen auf den Atmungstrakt der Tiere beschränkt, bei Wiederkäuern sind jedoch auch Mastitiden und daraus resultierende systemische Infektionen beschrieben worden (ROLLE u. MAYR 1993; PÉREZ et al. 1998, 1999). Klinisch äußern sich Aspergillosen der Lunge durch Husten, Dyspnoe und unspezifische Symptome wie Inappetenz, Fieber und ggf. Durchfall. Im Falle einer Aspergillose des Euters bestimmt eine akute Mastitis mit hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden das klinische Bild (STEPHAN et al. 2000; BLEUL et al. 2002). Außerdem sind Einzelfälle über mykotische Aborte durch A. fumigatus und andere Aspergillen bei Rind und Pferd (ROLLE u. MAYR 1993) als auch beim Schwein (EUSTIS et al. 1981) bekannt. Des Weiteren sind Infektionen mit A. fumigatus bei einem Lama (SEVERO et al. 1989), einem Delphin (REIDARSON et al. 1998) und bei Kamelen (EL-KHOULY et al. 1992) beschrieben worden. Im Folgenden wird auf die Erkrankungen unserer Haussäugetiere näher eingegangen. Die Luftsackmykose des Pferdes ist eine sporadisch auftretende Einzeltiererkrankung, die durch verschiedene Pilze (Aspergillus ssp., Penicillium ssp., Mucorales) hervorgerufen wird (COOK et al. 1968; GUILLOT et al. 1997; FREEMAN 1999). Häufig wird A. fumigatus als ursächlicher Erreger angesehen (RIES 1903; DIETZ u. WIESNER 1982; GUILLOT et al. 1997). Die Ätiologie der Luftsackmykose ist noch weitestgehend unklar (GUILLOT et al. 1997). Es wird jedoch angenommen, dass prädisponierende Faktoren eine Rolle spielen. So werden traumatische Ursachen (DIETZ u. WIESNER 1982), pathologisch-anatomische Besonderheiten wie Aneurysmen (COLLES u. COOK 1983; GREET 1987) und der Erkrankung vorangegangene intensive Antibiotika-Therapien (LEEMANN u. 15 SEIFERLE 1970; WEILER et al. 1991) genauso diskutiert wie eine reduzierte systemische oder lokale Immunabwehr des Tieres (WEILER et al. 1991). Die Pathogenese dieser im deutschsprachigen Raum eher selten diagnostizierten Erkrankung (GRABNER 1987; WEILER et al. 1991; OHNESORGE et al. 1999) ist bis heute nicht ausreichend geklärt. Die Eintrittspforte für die Pilze in den Luftsack ist die Pharyngealöffnung der Tuba auditiva (DIETZ u. WIESNER 1982). In den Luftsäcken verursachen die Erreger Schleimhautentzündung, die zunächst in der eine Regel diphteroid-nekrotisierende klinisch inapparent verläuft. Lebensbedrohliche Blutungen kann die Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium hervorrufen, wenn Pilzmyzel große, dem Luftsack anliegende Arterien, arrodiert (HILBERT et al. 1981; DIETZ u. WIESNER 1982). Neurologische Ausfallerscheinungen (bspw. Dysphagie, Hemiplegia laryngis, Fazialisparese) zeigen die Tiere, wenn die Mykoseerreger Nerven in der Umgebung des Luftsacks geschädigt haben (HILBERT et al. 1981; WEILER et al. 1991). MC LAUGHLIN u. O’BRIEN (1986) und GRABNER (1987) berichten sogar von zentralnervösen Störungen, die durch das Eindringen von Pilzmyzel in das Gehirn verursacht wurden. Infektionen durch Aspergillen sind auch bei Hunden beschrieben worden (RUDOLPH 1974; SHARP 1998; KOHN et al. 2002). Diese beschränken sich in der Regel auf die Nasen und Nasennebenhöhlen. Nasale Aspergillosen des Hundes werden laut SHARP (1998) am häufigsten durch A. fumigatus verursacht, aber auch A. nidulans, A. niger und A. flavus kommen gelegentlich als Erreger in betracht. Die oftmals sehr spät im Infektionsverlauf diagnostizierte Erkrankung (RUDOLPH 1974; KOHN et al. 2002) ist durch ihr invasives Wachstum häufig mit Destruktion von Turbinalschleimhaut und Knochen vergesellschaftet (SHARP 1998; KOHN et al. 2002). Die Pathogenese der Erkrankung ist auch bei Hunden nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch angenommen, dass die Immunkompetenz des Tieres, die bspw. lokal durch sekretorische IgA-Immundefizienzen vermindert sein kann, genauso eine Rolle spielt wie lange Antibiotikatherapie und bereits bestehende Nasenerkrankungen anderer Genese (GREENE 1998). In den bisher durchgeführten Studien konnte keine prädisponierte Rasse bestimmt werden, es wurde jedoch gezeigt, dass sich nasale Aspergillosen ausschließlich bei dolicho- und mesozephalen Hunderassen manifestieren (RUDOLPH 1974; HARVEY u. O’BRIEN 1983; KOHN et al. 2002). 16 Aspergillosen bei Wiederkäuern äußern sich vorwiegend als Mastitiden. Euterentzündungen durch fadenförmig wachsende Pilze sind selten, werden jedoch in den meisten Fällen von A. fumigatus verursacht (SCHÄLLIBAUM et al. 1980; FUCHS 1994). Die klinische Symptomatik einer durch A. fumigatus hervorgerufenen Mastitis reicht von akut verlaufenden Entzündungen bis zu chronischen und latenten Infektionen (WALSER u. KLEINSCHROTH 1979). Da bei einer klinisch manifesten Mastitis pathomorphologisch eitrige Eutergewebseinschmelzungen im Vordergrund stehen, ist die Prognose trotz Therapieversuchen oftmals infaust (FUCHS 1994; PODSTATZKY et al. 1999; BLEUL et al. 2002). JENSEN et al. (1996) berichten über Milchziegen, die im Puerperium eine nicht therapierbare Euterentzündung entwickelten, welche durch A. fumigatus hervorgerufen wurde. PODSTATZKY et al. (1999) u. STEPHAN et al. (2000) diagnostizierten durch A. fumigatus verursachte Mastitiden bei Milchkühen. Dass die Pilzinfektion nicht immer auf das Organ der Primärinfektion und dessen regionäre Lymphknoten beschränkt bleiben muss, zeigt ein Fall einer Kuh, bei der eine chronische, durch A. fumigatus hervorgerufene Mastitis und Bronchopneumonie diagnostiziert wurde (BLEUL et al. 2002). Allerdings konnte nicht geklärt werden, ob die hämatogene oder lymphogene Streuung des Erregers aus der Lunge oder aus dem Euter stattgefunden hat. Eine Verbreitung von A. fumigatus aus der Milchdrüse über das Blut vermuten auch PÉREZ et al. (1998, 1999), die sowohl systemische Aspergillosen als auch auf das Euter beschränkte A. fumigatus-Infektionen bei Milchschafen beschrieben. Da der Erreger als fakultativ pathogen eingestuft wird, sind viele Autoren der Meinung, dass für die Auslösung einer derartigen Mastitis und der sich daraus ggf. entstehenden systemischen Infektion, prädisponierende Faktoren vorhanden sein müssen. Übereinstimmend wird der Einsatz von Antibiotika in der Mastitisprophylaxe (Trockenstellen) und Mastitistherapie als ursächlich für eine galaktogene Infektion mit Aspergillus angenommen (JENSEN et al. 1996; PÉREZ et al. 1998, 1999; PODSTATZKY et al. 1999; STEPHAN et al. 2000). Dazu gehört die iatrogene Übertragung des Erregers durch unsaubere Applikation des Antibiotikums in das Euter genauso wie ein durch die Antibiose begünstigtes Angehen der Pilzinfektion durch Hemmung des bakteriellen Wachstums (PÉREZ et al. 1998; BLEUL et al. 2002). 17 B.1.2.2.2 A. fumigatus und seine Bedeutung in der Humanmedizin B.1.2.2.2.1 Invasive Aspergillose Die bedeutsamste durch Aspergillen verursachte Erkrankung des Menschen ist die invasive Aspergillose (IA). Diese, erstmals 1953 von RANKIN beschriebene Krankheit, betrifft allein in Deutschland ca. 5000 Patienten pro Jahr (MÜLLER 1994). Ihren Namen verdankt die IA dem unaufhaltsam invasiven Wachstum der Hyphen von Aspergillus durch das Wirtsgewebe (BODEY u. VARTIVARIAN 1989). In den letzten Jahrzehnten verzeichnete die Humanmedizin eine starke Zunahme opportunistischer Infektionen. Dies wird von HENDERSON u. HIRVELA (1996) durch den zunehmend häufigen Einsatz immunsupprimierender Maßnahmen in der modernen Medizin erklärt. Als Erreger dieser Infektionen sind unter den Pilzen die Gattungen Candida und Aspergillus für > 99% der klinischen Fälle verantwortlich (MÜLLER 1994 u. HENNEQUIN 1996). Aspergillus fumigatus ist in 90 % aller durch Aspergillen hervorgerufenen Erkrankungen der herausragende Krankheitsverursacher (DENNING 1998; LATGÉ 1999). Nach DENNING (2000) können jedoch vereinzelt auch andere Arten wie z.B. Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus und Aspergillus nidulans ursächlich für Erkrankungen sein. Eine invasive Aspergillose tritt schätzungsweise im Verlauf von 10 bis 25 % aller Leukämien auf, wobei ihre Letalität trotz Therapie zwischen 50 und 60 % liegt (BODEY et al. 1992; DENNING 1995, 1996; GROLL et al. 1996; DENNING 1998; LATGÉ 1999; LIN et al. 2001). Somit ist die invasive Aspergillose zu einer der Haupttodesursachen in hämatologischen und Knochenmarkstransplantations- Zentren geworden (SAUGIER-VEBER et al. 1993; JANTUNEN et al. 1997; WALD et al. 1997). Aber auch die Immunsuppression im Rahmen solider Organtransplantationen, insbesondere von Lunge, Leber und Herz, stellt einen Risikofaktor für diese Erkrankung dar. Nach BODEY et al. (1992), PATEL u. PAYA (1997) und WAKAYAMA et al. (2000) gilt die invasive Aspergillose auch bei diesen Patienten als Haupttodesursache unter den infektiösen Erkrankungen. Die Inzidenz einer invasiven Aspergillose ist außerdem bei Autoimmunerkrankungen, die mit immunsuppressiver Therapie begleitet werden, und bei HIV-Patienten erhöht (DENNING 1998; LATGÉ 1999). Zu Beginn der AIDS-Epidemie spielte die invasive Aspergillose nur eine untergeordnete Rolle. AIDS-Patienten kamen jedoch durch die 18 stetige Optimierung der Therapie ihrer opportunistischen Infektionen zunehmend in fortgeschrittenere Stadien ihrer Grunderkrankung. Dieses begünstigte eine Zunahme der invasiven Aspergillose (KHOO u. DENNING 1994; GROLL et al. 1996; MYLONAKIS et al. 1998 und WOITAS et al. 1998). Die invasive Aspergillose manifestiert sich primär zu ca. 90 % in der Lunge (DENNING 2000). Im Falle eines Versagens der unspezifischen Abwehr werden Konidien von Aspergillus nicht phagozytiert bzw. werden im Phagolysosom der Alveolarmakrophagen nicht abgetötet. Sie können dann innerhalb weniger Stunden auskeimen und als Hyphen invasiv in das Lungengewebe einwachsen. Im Verlauf der Erkrankung ist ein nahezu ungebremstes Wachstum der Aspergillen innerhalb der Lunge typisch. Eine sich entwickelnde, diffuse Pneumonie kennzeichnet die Erkrankung (BODEY u. VARTIVARIAN 1989; KWON-CHUNG u. BENETT 1992; DENNING 1998; LATGÉ 1999; RÜCHEL u. REICHARD 1999; DENNING 2000). Häufig kommt es auch zu einer vaskulären Invasion, die mit Obliteration und Infarzierung distaler Gewebeabschnitte vergesellschaftet ist. Im Falle der Zerstörung von Gefäßwänden können massive Hämoptysen beobachtet werden (ALBELDA et al. 1985; BODEY u. VARTIVARIAN 1989; KWON-CHUNG u. BENETT 1992; PAGANO et al. 1995). Da die A. fumigatus-Hyphen durch ihr invasives Wachstum in der Lage sind, sämtliche bindegewebige Organgrenzen zu durchdringen, kann es zum Einwachsen des Pilzmyzels durch das Diaphragma in den Magen oder die Leber kommen. Auch eine Penetration des Perikards mit daraus resultierender Infektion des Herzens ist möglich (BODEY u. VARTIVARIAN 1989; KWON-CHUNG u. BENETT 1992). Eine hämatogene Disseminierung der Erkrankung wird bei ca. einem Drittel der Aspergillose-Patienten beobachtet (YOUNG et al. 1970). Wird die Erkrankung nicht therapiert, beträgt die Letalität nahezu 100 % (DENNING 1996), und selbst bei einer systemisch antimykotischen Behandlung versterben die meisten Patienten innerhalb von 10-14 Tagen nach dem Auftreten der ersten klinischen Symptome (DENNING 1998). Die hohe Mortalität bei Aspergillose-Patienten und die mit der Erkrankung verbundenen erheblichen Behandlungskosten (633 Millionen Dollar in den USA 1996) machen eine Identifikation von Antigenen und die sich daraus ergebende Möglichkeit, eine Vakzine für oben genannte Risikogruppen zu entwickeln, laut STEVENS (2004) dringend erforderlich. 19 B.1.2.2.2.2 Andere durch Aspergillen verursachte Erkrankungen des Menschen Hierzu zählen Aspergillosen des immunkompetenten Individuums und allergische Erkrankungen. Bei den Aspergillosen des Immunkompetenten unterscheidet man saprophytische und invasive Aspergillosen. Erstere werden vor allem durch Aspergillome repräsentiert. Beim Menschen wachsen diese nicht-invasiv in einer Nasennebenhöhle zu einem Tumor heran und werden in den meisten Fällen durch A. fumigatus und A. flavus hervorgerufen (KWONG-CHUNG u. BENETT 1992; FERREIRO et al. 1997). KARAS et al. (1976) und JEWKES et al. (1983) diagnostizierten Aspergillome in präexistierenden Kavitäten der menschlichen Lunge. Diese können beispielsweise nach einer Tuberkulose entstehen. Gelegentlich kommt es hierbei zu Lungenblutungen mit letalem Ausgang, wenn der sonst eher nicht-invasiv wachsende Schimmelpilz größere, pulmonale Arterien arrodiert. Invasive Aspergillosen kommen bei Immunkompetenten selten vor (KARAM u. GRIFFIN 1986; KARIM et al. 1997; CLANCY u. NGUYEN 1998). Verglichen mit der akuten invasiven Aspergillose des Immunsupprimierten verlaufen diese Erkrankungen chronisch. Die Infektionsabwehr geht mit der Ausbildung von Granulomen einher (DENNING 1998). Eine Sonderform stellt hierbei die von KERN et al. (1998) beschriebene Chronische Systemische Aspergillose dar. Bei dieser kommt es wahrscheinlich in der aplastischen Phase unter einer Chemotherapie zu einer Infektion mit Aspergillen. Klinisch manifestiert sich die Erkrankung jedoch erst einige Zeit später, wenn sich die Abwehr des Patienten bereits regeneriert hat. Daher ist ein granulomatöser Entzündungstyp charakteristisch2. Zu den durch Aspergillen hervorgerufenen allergischen Erkrankungen zählen die Allergische Bronchopulmonale Aspergillose (ABPA), die Extrinsische Allergische Alveolitis (EAA) und das Aspergillus-Asthma. Die ABPA ist eine Erkrankung, die häufig im Rahmen eines exogen-allergischen Asthma bronchiale oder einer Zystischen Fibrose auftritt (VAUGHAN 1993; COCKRILL u. HADES 1999; SALEZ et al. 2000). Die Immunreaktionen gegen 2 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn R. Rüchel, Göttingen 2002 20 Antigene von Aspergillus sind durch Allergie-Typ I, III und IV repräsentiert (PEPYS 1969). Der Pilz siedelt nicht-invasiv in den Bronchiallumina (VAUGHAN 1993; COCKRILL u. HADES 1999), wo mit Myzel durchwachsene Schleimpfröpfe entstehen (HEBISAWA et al. 1997). Klinisch imponiert die Erkrankung mit asthmatischen Episoden, flüchtigen pulmonalen Infiltraten sowie kutanen Hypersensitivitätsreaktionen vom Soforttyp (SCHØNHEYDER 1987; KWONGCHUNG u. BENETT 1992; COCKRILL u. HADES 1999; SALEZ et al. 2000). Bei der Extrinsischen Allergischen Alveolitis und dem Aspergillus-Asthma werden die allergischen Symptome durch Inhalation der Konidien hervorgerufen. Die EAA ist eine selten auftretende Sonderform der so genannten „Farmer-Lunge“. Dabei kommt es Stunden nach dem Einatmen einer hohen Konidienzahl von A. fumigatus zu einer gewebelokalisierten Immunreaktion vom Typ III (RICHERSON 1983; SCHØNHEYDER 1987). Bei Patienten mit einem allergischen Asthma bronchiale wurden Schimmelpilze, insbesondere A. fumigatus, als Typ I-Allergene zusammen mit anderen häufigen Allergenen wie bspw. Hausstaubmilben oder Pollen identifiziert HENDRICK et al. 1975; BEAUMONT 1988). B.1.3 Immunologie B.1.3.1 Angeborene Immunität Für die Abwehr der Infektion mit A. fumigatus ist beim Immunkompetenten primär die unspezifische, angeborene Immunität zuständig. Die dabei beteiligten Komponenten setzen sich aus anatomisch-physiologischen Barrieren, humoralen Faktoren und phagozytierenden Zellen zusammen (LATGÉ 1999). Das Flimmerepithel verkörpert die bedeutendste anatomisch-physiologische Barriere, da es durch den Zilienschlag einen Großteil der eingeatmeten Konidien aus der Lunge hinausbefördert. Nach KOZEL (1996) ist für die unspezifische humorale Abwehr besonders das Komplementsystem von Bedeutung. Zum einen werden Konidien und Hyphen von A. fumigatus durch das Komplementsystem direkt geschädigt, zum anderen soll die Anlagerung des Komplements an die Konidien eine Entzündungsreaktion sowie eine Opsonierung für die nachgeschaltete zelluläre Abwehr vermitteln (STURTEVANT u. 21 LATGÉ 1992). Zudem ist Komplement nicht ausschließlich ein Bestandteil des Blutes, sondern ebenso im Bronchialsekret vorhanden (ROBERTSON et al. 1976; FICK et al. 1986; VAN DE GRAAF et al. 1992). Daher ist es wahrscheinlich, dass eine Opsonierung bereits in den Alveolen stattfindet. Dort werden die Konidien bei immunkompetenten Individuen von residenten Alveolarmakrophagen phagozytiert (SCHAFFNER et al. 1982). Diese Makrophagen können lediglich kurz vor der Aussprossung stehende, metabolisch aktive Konidien abtöten (SCHAFFNER 1994). Diese Wachstumsphase wird von den Konidien erst Stunden nach der Inhalation erreicht. Zu diesem Zeitpunkt befinden sie sich entweder noch in den terminalen Luftwegen, oder schon in den Phagosomen der Makrophagen. Da die Abwehr durch das Makrophagensystem aber ausgesprochen wirkungsvoll ist, sind die Konidien nach spätestens ca. 36 Stunden vollständig verdaut (SCHAFFNER 1994). Auch neutrophile Granulozyten stellen eine Abwehrfront gegen eine AspergillusInfektion dar. Diese sind ebenfalls erst in der Lage, Konidien des Pilzes abzutöten, wenn diese die oben beschriebene Wachstumsphase erreicht haben (SCHAFFNER et al. 1982; LEVITZ und DIAMOND 1985). Den Granulozyten ist gegenüber den Makrophagen eine Fähigkeit vorbehalten. Sie können nicht nur phagozytierte Konidien eliminieren, sondern sich sogar an Hyphen anheften, welche aufgrund ihrer Größe nicht durch Makrophagen phagozytiert werden können. Die an die Hyphen gehefteten Granulozyten setzen Defensine und Sauerstoffradikale frei und greifen so die Myzelform des Pilzes an (DIAMOND et al. 1978; SCHAFFNER et al. 1982; SCHAFFNER et al. 1986). B.1.3.2 Erworbene Immunität Erworbene Immunmechanismen scheinen bei der Abwehr einer erstmaligen akuten invasiven Aspergillose nur eine untergeordnete Rolle zu spielen (KWON-CHUNG u. BENETT 1992; DENNING 1998; LATGÉ 1999; SCHNEEMANN u. SCHAFFNER 1999; DENNING 2000). Es ist hingegen denkbar, dass erworbene Immunität bei chronischen Verlaufsformen der Aspergillose von Bedeutung ist. Die sich bisher mit dieser Thematik befassenden Studien gehen auf Tierversuche mit Mäusen zurück (zur Übersicht s. LATGÉ 1999). Diese ahmen zum einen die ABPA (Allergische Bronchopulmonale Aspergillose) durch Infektion der Tiere mittels Inhalation von 22 Konidien, zum anderen die invasive Aspergillose, durch intravenöse Injektion der Sporen von Aspergillus, nach. Die Immunantwort durch TH-1-Lymphozyten ist gekennzeichnet durch einen Anstieg der Interleukine 2 und 12 sowie durch eine Erhöhung des Interferon γ- Wertes (IFNγ). Diese soll für eine Resistenz gegen eine mykotische Erkrankung verantwortlich sein (LATGÉ 1999). Dem gegenüber steht die Immunantwort der TH-2-Lymphozyten, die sich durch steigende Antikörperspiegel und damit assoziierte Interleukinproduktion (IL-4, IL-5, IL-10) auszeichnet. Die humorale Immunantwort ist bei der ABPA in Mensch und Maus gleichermaßen assoziiert mit einer Eosinophilie, dem Anstieg von Antikörpern (IgE, IgG1, IgA) und der damit verbundenen Produktion der Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 (KNUTSEN et al. 1994; KURUP et al. 1994a, 1994b; WANG et al. 1994; CHU et al. 1995, 1996; KURUP et al. 1996; KURUP et al. 1998). Bei der invasiven Aspergillose reichen die Untersuchungen von der Empfänglichkeit einzelner Mausstämme über unterschiedliche murine Tiermodelle bis hin zu Untersuchungen über Mutanten von A. fumigatus mit verschiedenen Wachstumsund Virulenzcharakteristika. CENCI et al. (1997; 1998) zeigten, dass sowohl bei immunkompetenten als auch bei immunsupprimierten Mäusen eine negative Korrelation zwischen dem Fortschreiten der Erkrankung und der TH-2-Antwort vorlag. Diese war im Krankheitsverlauf mit einem stetigen Anstieg der Zytokine IL-4 und IL10, sowie einem sinkenden IFN-γ-Wert korreliert. B.1.3.3 Immunität im Tiermodell LEHMANN u. WHITE zeigten bereits 1976, dass Mäuse, die durch eine erste intravenöse Infektion mit Konidien eine isolierte Nierenmykose entwickelten, gegenüber einer normalerweise unter Cortison systemisch-disseminiert verlaufenden erneuten Infektion immun waren. Die erste, nicht unter Cortison gesetzte Nierenmykose musste also zu einer protektiven, Cortison-unabhängigen Immunantwort geführt haben. CORBEL u. EADES (1977) wiederum stellten fest, dass das Alter der Mäuse hinsichtlich der Infektion ebenfalls eine Rolle spielt. So waren ältere Tiere gegenüber einer Infektion resistenter als jüngere Tiere. Die in den 70er Jahren erworbenen Kenntnisse führten zu verschiedenen Studien über Vakzinierungsversuche. So fanden RICHARD et al. (1982) durch Verimpfung von verschiedenen Wachstumsstadien des Pilzes an Puten heraus, dass eine subkutan 23 injizierte, inaktivierte Germlingfraktion von A. fumigatus gegenüber einer ansonsten tödlichen Aerosolkonzentration von Konidien 38 % der Tiere vor einer Infektion schützte. DE REPENTIGNY et al. (1993) induzierten in Mäusen eine Immunität, indem sie die Tiere intravenös mit einer subletalen Dosis von Aspergillus infizierten. Diese konnte durch den Transfer von Serum eines immunen Tieres auf ein naives Tier nicht übertragen werden. Es gelang jedoch, eine Immunität durch den Transfer von Milz-Makrophagen zu erzielen. CENCI et al. (1999, 2000) postulierten darauf, dass die protektiven Immunreaktionen weniger humoralen Ursprungs sind, sondern eher zellulär, also durch TH-1-Lymphozyten und Makrophagen, vermittelt werden. Sie demonstrierten, dass sich durch die Verimpfung von A. fumigatus-Kulturüberstand eine TH-1-Antwort ausbildet, die die Mäuse vor einer erneuten Infektion schützt. BOZZA et al. (2002) erzielten in Mäusen eine zelluläre Immunität gegen Aspergillus durch die gleichzeitige Verimpfung eines Antigens von A. fumigatus, dem Aspf 16, zusammen mit einem unmethylierten CpG-Oligodeoxynukleotid (ODN) als Adjuvans. B.1.4 Tiermodelle der invasiven Aspergillose In der Literatur sind zahlreiche Tiermodelle der invasiven Aspergillose beschrieben. Ob es zu einer Etablierung der IA kommt, hängt von vielerlei verschiedenen Faktoren, wie Tierart, Infektionsdosis, Virulenz des verwendeten AspergillusStammes, Körpergewicht und Alter der Tiere, Immunkompetenz und Infektionsroute ab. Verwendung finden Mäuse, Kaninchen, Ratten und Meerschweinchen (SHIBUYA et al. 1999a; SCHMIDT 2002). Obwohl Kaninchen als empfänglichsten für eine Infektion gelten (SCHMIDT 2002), werden am häufigsten Mäuse verwendet, da sie leichter zu handhaben sind. Kaninchenmodelle sind Mausmodellen aber aus dem Grund überlegen, weil diesen Tieren eine wesentlich größere Blutmenge entnommen werden kann (SHIBUYA et al. 1999a). Für ein Mausmodell hingegen spricht eine nahezu beliebig hohe Versuchstierzahl, die im Kaninchenmodell in praxi (Platzbedarf der Tiere) nicht zu realisieren ist. CORBEL u. EADES (1977) zeigten, dass das Alter der Tiere für eine Etablierung einer Erkrankung ebenfalls von Bedeutung ist, da ältere Mäuse höhere Infektionsdosen benötigten als jüngere Tiere. DIXON et al. (1989) stellten fest, dass = auskeimende Konidien 24 für Tiere mit höheren Körpergewichten größere Infektionsdosen pro kg nötig waren als für leichtere Tiere. Die Infektionsdosis und –route sowie die Abwehrlage des Versuchstieres ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. So lässt sich beispielsweise in immunkompetenten Mäusen durch eine hoch dosierte intranasale Applikation von A. fumigatus keine Erkrankung erzeugen, aber durch eine intravenöse Injektion des Erregers (LATGÉ 1999). Einen Zusammenhang zwischen der Infektionsdosis und der Immunkompetenz des Wirtes beschreibt auch DE REPENTIGNY et al. (1991). Er zeigte sowohl bei immunkompetenten als auch bei immunsupprimierten Kaninchen eine inverse Beziehung zwischen Überlebenszeit der Tiere nach der Infektion und der Höhe der Infektionsdosis. Identische Infektionsdosen führten bei immunsupprimierten Kaninchen im Vergleich zu den immunkompetenten Tieren schneller zum Tod. Da viele Tiermodelle der IA zur Erforschung der Wirkungsweise von Antimykotika oder der Bewertung diagnostischer Tests dienten, wurden in den meisten Kaninchenmodellen immunsupprimierten bzw. Spezifisch-Pathogen-Freien (SPF) Tieren überwiegend letale Infektionsdosen (106 bis 107 Konidien) verabreicht, die innerhalb weniger Tage zum Tod der Tiere führten (DE REPENTIGNY et al. 1987; NIYO et al. 1988; PATTERSON et al. 1993; VISSIENNON et al. 1997; HURST et al. 2000). Bisher wählten nur DE REPENTIGNY et al. (1991) einen Versuchsansatz, der längere Überlebenszeiten der Tiere und damit verbundene detektierbare Antikörperproduktion gewährleistete. Sie analysierten die serologische Antwort der Tiere auf Antigene von A. fumigatus anhand von Immunblots und stellten fest, dass eine Serokonversion bei Tieren, die mehr als 10 Tage überlebten, zu verzeichnen war. Ebenso bemerkten sie, dass sich Immunreaktionen der Tiere, welche p. inf. auftraten, bis zum Versuchsende nicht veränderten. Allerdings zeigten nicht alle Tiere dieselben Reaktionen auf die Antigene, was sich DE REPENTIGNY et al. (1991) damit erklärten, dass genetische Unterschiede zwischen den Kaninchen die Beschränkung der Immunreaktion auf bestimmte Epitope nach sich zieht. Als Infektionsweg wird oftmals die intranasale Verabreichung von A. fumigatus gewählt, da diese die natürliche Infektionsroute nachahmt (TANG et al. 1993; SMITH et al. 1994). Infolge der Inokulation des Erregers kommt es zunächst zu einer Manifestation der Erkrankung in der Lunge und erst im Anschluss daran zu einer disseminierten Aspergillose (LATGÉ 1999). Durch die Wahl eines intravenösen 25 Infektionsweges hingegen kann die Ausbildung einer systemischen Aspergillose ohne zeitliche Verzögerung erreicht werden (SHIBUYA et al. 1999a). Über die klinische Symptomatik einer experimentellen invasiven Aspergillose gibt es kaum Informationen. Vereinzelt wird von Inappetenz bzw. Gewichtsabnahme, Apathie und neurologischen Ausfallerscheinungen berichtet (NIYO et al. 1988; VISSIENNON et al. 1997). Als entscheidendes Kriterium der Infektion wird die Letalität der Tiere aufgeführt. Übereinstimmend wird von pathologischen Organveränderungen, die häufig in Nieren, Gehirn, Lunge, Leber und Milz auftreten, berichtet (DE REPENTIGNY et al. 1987; NIYO et al. 1988; DE REPENTIGNY et al. 1991; VISSIENNON et al. 1997; LATGÉ 1999). Unterschiedliche Virulenzen bei Aspergillus-Stämmen beschreibt SCHMIDT (2002), der eine deutlich stärkere Virulenz bei klinischen Isolaten von A. fumigatus als bei bestimmten unpigmentierten Umwelt-Isolaten des Pilzes feststellte. B.1.5 Antigene und Virulenzfaktoren Um sich in einem Wirt invasiv ausbreiten zu können, muss A. fumigatus in der Lage sein, an den Epithelien des Respirationstrakts eines Individuums zu haften und diese zu penetrieren. Ferner muss er die Fähigkeit besitzen, der Abwehr des Wirtes zu entgehen oder diese zu schwächen (LATGÉ et al. 1994a, 1997). Antigene von A. fumigatus, denen solche Virulenz-vermittelnden Eigenschaften zugesprochen werden, lassen sich in vier Kategorien (Adhesine, Pigmente, toxische Moleküle und Enzyme) einteilen. Die Adhesine fördern Interaktionen zwischen Wirtszellen und dem Pilz. In diese Gruppe gehören Komplementrezeptoren (STURTEVANT u. LATGÉ 1992), ein von TRONCHIN et al. (1997) beschriebener Lamininrezeptor und Hydrophobine, welche von THAU et al. (1994) identifiziert wurden. Die Pigmente inhibieren die Phagozytose der Konidien durch die Abwehrreaktion des Wirtes. Dieser Gruppe wird das Dihydroxynaphthalene-Melanin zugeordnet (JAHN et al. 1996; TSAI et al. 1997). Zu den toxischen Molekülen von A. fumigatus gehören sekundäre Metaboliten wie bspw. das Gliotoxin. Dieses Protein ist ein Metabolit der EpipolythiodioxopiperazinFamilie und zeichnet sich durch seine immunsuppressive Wirkung aus 26 (MÜLLBACHER u. EICHNER 1984; MÜLLBACHER et al. 1985; EICHNER et al. 1986; SUTTON et al. 1994, 1996). Das Hämolysin, ein 30 kDa-Protein, bedingt eine Lyse der Erythrozyten und erleichtert möglicherweise aus diesem Grund die Entwicklung einer AspergillusInfektion (EBINA et al. 1983; YOKOTA et al. 1985; FUKUCHI et al. 1996). Die von A. fumigatus sezernierte RNase (18 kDa) (LAMY et al. 1991; LATGÉ et al. 1991) wird aufgrund ihrer Eigenschaft, Wirtszellen abzutöten als Virulenzfaktor ebenfalls in die Gruppe der toxischen Moleküle von A. fumigatus eingeordnet. Enzyme spielen bei der Invasion des Wirtsgewebes durch einen Pilz eine entscheidende Rolle (ODDS 1991; HOGAN et al. 1996). Da das Lungenbindegewebe primär aus Elastin und Kollagen besteht, wird angenommen, dass Proteasen in der Pathogenese der Aspergillose von Bedeutung sind (MONOD et al. 1995). Katalasen und Superoxiddismutasen (HOLDOM et al. 1995, 1996; CRAMERI et al. 1996; CALERA et al. 1997) wirken nach der Phagozytose durch Wirtszellen als Antioxidantien. Phopholipasen wird eine Epithelien-zerstörende Funktion zugeschrieben (BIRCH et al. 1996). Nach heutigem Wissensstand sind ungefähr 100 (Glyko-)Proteine von A. fumigatus in der Lage, humane Immunglobuline zu binden (LATGÉ 1999). Die meisten dieser Antigene wurden jedoch nicht näher charakterisiert, es wurde lediglich ihr Molekulargewicht im Immunblot bestimmt (LATGÉ 1999). Bisher sind von den 100 (Glyko-)Proteinen weniger als ein Dutzend Antigene mittels proteinchemischer und molekulargenetischer Methoden, wie z. B. Screening von Expressionsbanken mit Patientenseren, näher charakterisiert worden. Die meisten dieser Antigene können hinsichtlich ihrer mutmaßlichen Virulenz den Kategorien toxische Moleküle und Enzyme zugeordnet werden. Die bereits erwähnte RNase ist ebenfalls unter der Bezeichnung Ag 3 (LONGBOTTOM 1986), Restrictocin (FANDO et al. 1985; LAMY u. DAVIS 1991; LAMY et al. 1991) und ASPF1 (ARRUDA et al. 1992) bekannt. Ob die RNase eine tragende Rolle im Infektionsgeschehen spielt, ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. So zeigten LATGÉ et al. (1991) dass Versuchstiere, denen das Protein injiziert wurde, keine toxischen Schocks erleiden. Es konnten hinsichtlich des 27 Wachstums im Wirtsgewebe und der Mortalität im Tierversuch keine Unterschiede zwischen einer ASPF1-Knock-out-Mutante und dem parentalen Wildstamm gefunden werden (PARIS et al. 1993; SMITH et al. 1993). Andere Aspergillen, wie beispielsweise der aus medizinischer Sicht nicht unbedeutende Aspergillus flavus, synthetisieren keine RNase, dafür aber einige apathogene Spezies (LATGÉ 1999). Ein positiv kumulativer toxischer Effekt konnte bei Lymphozyten beobachtet werden, die sukzessive mit subinhibierenden Dosen von Gliotoxin und ASPF1 behandelt wurden (DEBEAUPUIS et al. 1995). YANG u. KENEALY (1992) stellten fest, dass eine ASPF1-Mutante, die keine RNase-Aktivität zeigte, die Immunantwort in höherem Maße stimulierte, als das native ASPF1. Aus diesen Versuchen folgerte LATGÉ (1999), dass der Effekt eines mutmaßlichen Virulenzfaktors davon abhängig ist, ob er allein oder in Kombination mit anderen Aspergillus-Molekülen wirken kann. Ebenso ist ein und dasselbe Antigen in der Lage, eine Immunantwort zu stimulieren oder supprimierend in diese einzugreifen. Aus der großen Gruppe von Enzymen, die als mutmaßliche Virulenzfaktoren von A. fumigatus verstanden werden, konnten mehrere Proteasen (ALP, PEP und MEP) identifiziert werden. ALP ist eine von Aspergillus sezernierte Serinprotease, die der Subtilisinfamilie angehört (REICHARD et al. 1990; MONOD et al. 1991; JATON-OGAY et al. 1992; MOUTAOUAKIL et al. 1993; MOSER et al. 1994). Dieses 33 kDa-Protein ist zum Gegenstand intensiver Forschung geworden. Allerdings wurde im Tierversuch gezeigt, dass kein signifikanter Virulenz-Unterschied zwischen ALP-produzierenden Wildtypen von A. fumigatus und ALP-Deletionsmutanten besteht (TANG et al. 1992, 1993; MONOD et al. 1993a; SHIBUYA et al. 1999b). FROSCO et al. (1994) verabreichten in einem Infektionsversuch immunsupprimierten Mäusen gegen ALP gerichtete Antikörper und stellten fest, dass diese die Tiere nicht gegen eine Infektion mit A. fumigatus schützten. Die Anti-ALP-Antikörper bewirkten jedoch bei immunkompetenten Mäusen, welche mit hohen Konidiendosen infiziert wurden, Schutz vor einer Infektion. IADAROLA et al. (1998) fanden heraus, dass diese Serinprotease sowohl in vitro als auch in vivo in der Lage ist, extrazelluläre Matrixkomponenten der Lunge zu degradieren. Eine signifikante Hemmung der polymorphkernigen Leukozyten bezüglich ihrer Chemotaxis und Hyphenzerstörung konnte ALP genauso 28 nachgewiesen werden (IKEGAMI et al. 1998; HASEGAWA et al. 1999), wie die morphologische Veränderung bronchialer, epithelialer Zelllinien mit einer dadurch bedingten Ablösung von Plastikoberflächen (TOMEE et al. 1997; KAUFFMAN et al. 2000). PEP ist eine pepsinähnliche Aspartatprotease mit einem Molekulargewicht von 38 kDa (REICHARD et al. 1994). Auch hier wurde im Tierversuch festgestellt, dass hinsichtlich der Virulenz kein Unterschied zwischen einer PEP-Gendeletionsmutante und eines parentalen PEP-Wildstamms bestand (REICHARD et al. 1997). MONOD et al. (1993b) isolierten aus einem Kulturüberstand einer ALPDeletionsmutante eine sezernierte Metalloprotease (MEP) mit einem Molekulargewicht von 40 kDa. Im Tierversuch testeten JATON-OGAY et al. (1994) MEP- und auch ALP-MEP-Doppeldeletionsmutanten hinsichtlich ihrer Virulenz. Es gab wie bei ALP und PEP keine signifikant verminderte Virulenz gegenüber dem Wildstamm. Von BEAUVAIS et al. (1997a; 1997b) wurden zwei Dipeptidylpeptidasen (88 kDa und 94 kDa) beschrieben. Das 88 kDa-Enzym verfügt über ein Signalpeptid. HEARN et al. (1992), LOPEZ-MEDRANO et al. (1995) und CALERA et al. (1997) beschrieben eine Katalase von A. fumigatus. CALERA et al. (1997) klonierten das zugehörige Gen und fanden anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz heraus, dass die Katalase sowohl über ein Signal- als auch über ein Propeptid verfügte. Es sind bisher zwei Superoxiddismutasen von A. fumigatus beschrieben worden. Eine 27 kDa-Superoxiddismutase (CRAMERI et al. 1996, 1998), welche auch von HEMMANN et al. (1998) isoliert werden konnte und eine Superoxiddismutase (67 kDa), die von HAMILTON et al. (1995) und HOLDOM et al. (1995, 1996) charakterisiert wurde. Es wurden des Weiteren zwei Antigene identifiziert, die jedoch nicht in eine der oben genannten Kategorien einzuordnen sind. So identifizierte bspw. CRAMERI (1998) ein peroxisomales Protein von 19 kDa. Das erste Antigen von Aspergillus, welches in experimentell infizierten Tieren und in Patienten mit einer invasiven Aspergillose gefunden wurde, war das Galactomannan (GM) (LEHMANN u. REISS 1978; REISS u. LEHMANN 1979; ANDREWS u. WEINER 1981; DUPONT et al. 1987). Dieses Polysaccharid ist in der Zellwand von 29 Aspergillen lokalisiert (LATGÉ et al. 1994b). Es ist das einzige Polysaccharid-Antigen von A. fumigatus, welches bislang charakterisiert wurde. B.1.6 Diagnostik Die derzeitige Diagnostik der Aspergillose stützt sich auf bildgebende Verfahren, dem direkten Nachweis des Erregers aus Gewebeproben und Sekreten sowie auf die Detektion von A. fumigatus-Molekülen in Körperflüssigkeiten mittels eines AntigenSandwich-ELISA´s (zur Übersicht siehe: RÜCHEL u. REICHARD 1999). Letzterer weist oben erwähntes Galactomannan (GM) von Aspergillen in Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin und Bronchiallavagen nach und ist derzeit die labordiagnostische Methode der Wahl (LATGÉ 1999). Jedoch ist der GM-ELISA sowohl in seiner Spezifität als auch in seiner Sensitivität zu bemängeln. Zum einen zeigt er eine hohe Rate an falsch positiven Ergebnissen, zum anderen spricht er oftmals erst sehr spät im Verlauf der invasiven Aspergillose an (STYNEN et al. 1995; SULAHIAN et al. 1996; PINEL et al. 2003). Diagnostische Tests, die auf spezifische Antikörper reagieren, sind ebenfalls wenig geeignet, da die Antikörperproduktion der zumeist immunsupprimierten Patienten stark eingeschränkt oder verzögert ist (YOUNG u. BENETT 1971; RÜCHEL u. REICHARD 1999). B.1.7 Genomprojekt Um einen besseren Einblick in die Pathogenität von A. fumigatus zu gewinnen, wurde 1998 ein internationales Konsortium gegründet, welches die Sequenzierung des kompletten Genoms von A. fumigatus (~ 30 Mb) anstrebte (DENNING et al. 2002). Mittlerweile ist die Sequenzierung nahezu abgeschlossen, erste Annotierungen sind von dem „Wellcome Trust Sanger Institute“ (GB) und „The Institute for Genomic Research“ (TIGR, USA) ausgeführt worden (MABEY et al. 2004). Die in dieser Arbeit isolierten Antigene wurden mittels Blast-Search-Analyse der hier ansequenzierten cDNAs unter Verwendung der TIGR-Datenbanken identifiziert. 30 C Material C.1 Geräte Die in dieser Arbeit benutzten Geräte sind im Anhang aufgeführt (J.1). C.2 Verbrauchsmaterial und Chemikalien Die in dieser Arbeit verwendeten Materialien und Chemikalien sind in einer Auflistung im Anhang zusammengestellt (J.2, J.3). C.3 Lösungen, Puffer und Nährmedien Gebrauchslösungen und Puffer sind im Text beschrieben. Stammlösungen und Nährmedien sind im Anhang (J.4, J.5) aufgeführt. C.4 A. fumigatus D 141 Der in dieser Arbeit verwendete Stamm, A. fumigatus D 141, wurde von Prof. Dr. Dr. F. Staib aus Berlin zur Verfügung gestellt. Er wurde aus dem Sputum eines 45jährigen Patienten isoliert, welcher auf dem Boden einer kavernösen Lungentuberkulose ein Aspergillom entwickelte und an einer durch den Pilz verursachten Arrosion einer Lungenarterie mit konsekutiver Blutung verstarb (STAIB et al. 1980). C.5 A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek Die in dieser Arbeit verwendete cDNA-Expressionsbank wurde aus der mRNA des Wachstumsstadiums 3 (auskeimende Konidien) (s. D.2.1) angefertigt. Dazu wurden Sporen von A. fumigatus in Minimalmedium (Schüttelkultur) bei 37°C über 12-14 Stunden inkubiert. 31 C.6 Bakterienstämme Tab. 1: verwendete Bakterienstämme Bakterienstamm Anwendung E. coli Propagation der λ-ZAP-Phagen STRATAGENE, der cDNA-Expressionsbank Amsterdam, Niederlande XL1-Blue MRF´ E. coli Herkunft In vivo-Umklonierung von Inserts STRATAGENE, von A. fumigatus λ-ZAP-Express Amsterdam, Niederlande in Plasmide XLOLR C.7Antikörper Tab. 2: verwendete Antikörper Antikörper Anwendung Herkunft 1. Antikörper Screening cDNA-Bank Seren der Versuchstiere 2. Antikörper=monokl. AntiKaninchen-Ig (IgM+IgA+IgGSchwere Kette)-Ak-PeroxidaseKonjugat von der Maus Konjugat SIGMA, Steinheim C.8 Primer Tab. 3: verwendete Primer Primer Sequenz Herkunft T3 5´-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´ SIGMA, Steinheim T7 5´-GTAATACGACTCACTATAGGG-3´ SIGMA, Steinheim Anwendung: Der T3 Primer hybridisiert mit dem pBK-CMV Plasmid. Bei Verlängerung seines 3`-Endes durch Taq-Polymerase und teilweise fluoreszenzmarkierten Nukleotiden erfolgt eine Ansequenzierung der im Plasmid einklonierten Aspergillus-cDNA des N-terminal kodierenden Abschnitts. Der T 7 Primer hybridisiert mit dem pBK-CMV-Plasmid in gegenüberliegender Position des cDNA-Inserts. Wird er verwendet, kann der C-terminal kodierende cDNA-Teil inklusive des Poly-A-Schwanzes sequenziert werden (Sequenzierung s. D.3.6.1). C.9 Versuchstiere Es wurden insgesamt 10 weibliche New Zealand White Kaninchen verwendet. Die Tiere wurden von der Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, bezogen. 32 D Methoden D.1 Tierexperimentelle Methoden D.1.1 Blutentnahmen und Serumgewinnung Die Blutentnahmen vor der Infektion erfolgten innerhalb der ersten Woche bzw. an Tag 28 nach Einstallung der 10 Tiere. Nach der Infektion wurde erstmalig 14 d p. inf. Blut entnommen, daraufhin im wöchentlichen Abstand. Es wurden je ca. 12 ml Blut aus der zentralen Ohrarterie entnommen. Dieses wurde nach Gerinnung in einer Swing-out-Zentrifuge bei Raumtemperatur (RT) über 20 Minuten zentrifugiert (300 x g). Das Serum wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei –20 °C aufbewahrt. D.1.2 Immunsuppression Den Kaninchen wurde täglich von Tag –2 bis Tag +3 der Infektion (= Tag 0) Cortisonacetat (10 mg/kg KGW) subkutan injiziert. Zur Vermeidung bakterieller Sekundärinfektionen wurden während dieser Zeit außerdem täglich 200 mg Ceftazidim s.c. verabreicht. D.1.3 Infektion der Tiere Die Infektion erfolgte intravenös über die Ohrrandvene mit dem Konidienstadium von A. fumigatus. Dazu wurden die Konidien einer, mit A. fumigatus bewachsenen Sabouraud-Platte mit physiologischer NaCl-Lösung abgeschwemmt und in ein 50-mlPolystyrolgefäß überführt. Nachdem die Konidiensuspension zur Auflösung größerer Aggregate über mehrere Minuten gevortext worden war, wurde sie in einer Swingout-Zentrifuge kurz anzentrifugiert. Nach der Zentrifugation zeigte der Überstand eine gleichmässige Suspension und wurde für die Bestimmung der Konidienkonzentration weiterverwendet. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch Auszählen der Konidien mithilfe eines Hämocytometers. Nach Ermittlung der Konidienkonzentrationen wurden die individuellen Infektionsdosen nach einem von DE REPENTIGNY et al. (1991) beschriebenem Schema (Abb. 2) angesetzt. Erforderliche Verdünnungen der originären Konidiensuspension wurden mit physiologischer NaCl-Lösung vorgenommen. 33 Original aus : DE REPENTIGNY et al., 1991 Abb. 2 : Infektionsschema nach DE REPENTIGNY et al. (1991) D.1.3.1 Infektionsbegleitende Kontrollen Der Gesundheitszustand der Tiere wurde mit Beginn der Immunsuppression täglich beurteilt. Dabei wurde im Rahmen einer Allgemeinuntersuchung besonderes Augenmerk auf die rektale Körpertemperatur (Normalwert 38,5-39,5°C (WIESNER 1988; BERGHOFF 1989)) und auf das Körpergewicht gelegt. D.1.3.2 Kontrolle des Infektionserfolges Der Erfolg einer Infektion wurde 14 d p. inf. anhand eines Immunblots auf Aspergillus-Proteine (s. Punkt D.2.6/E.1.3) überprüft. Dabei wurden Immunreaktionen vor der Infektion denen nach der Infektion (14. Tag p. inf.) gegenübergestellt. Im Falle eines positiven Blots wurden die entsprechenden Seren für das Screening der -Phagen-cDNA-Expressionsbank weiterverwendet. Bei einem nicht eindeutigen oder negativen Blotergebnis wurden die Tiere erneut mit einer höheren Infektionsdosis infiziert. 34 D.1.3.3 Serologische Diagnostik Derzeit wird in der serologischen Diagnostik von A. fumigatus ein Antigen-DoppelSandwich-ELISA verwendet. Dieser weist im Blut zirkulierendes Galactomannan (GM) von A. fumigatus nach. Dieser Test ist z. Zt. trotz deutlicher Einschränkungen hinsichtlich Sensitivität und Spezifität der einzige auf dem Markt verfügbare Antigentest. Daher wurden die Seren einiger Tiere mittels des PLATELIA AspergillusAg-ELISAs überprüft. Der Test wurde nach Herstellerangaben von Frau Meike Schaffrinski bzw. Frau Petra Schobert (Labor Mykologische Diagnostik, Abteilung Bakteriologie des Universitätsklinikums Göttingen) durchgeführt. D.1.4 Tötung der Tiere Die Tötung der Tiere erfolgte bei hochgradigen Störungen des Allgemeinbefindens. Dazu wurden die Kaninchen mit 5 mg/kg KGW Xylazin + 25 mg/kg KGW Ketamin i.m. narkotisiert und anschließend durch Blutentzug über die zentrale Ohrarterie bzw. Herzpunktion getötet. Das Blut wurde zur Serumgewinnung verwendet. D.1.4.1 Sektion und weiterführende Untersuchungen Die Sektion umfasste eine gezielte Untersuchung der Körperhöhlen und ihrer Organe auf pathologische Veränderungen. Wurden hierbei mykotische Herde festgestellt, wurde eine Gewebeprobe des betreffenden Organs entnommen und mit einem optischen Aufheller (Calcofluor-Weiß) vermengt. Unter dem Mikroskop konnten im positiven Fall die Hyphen von A. fumigatus identifiziert werden. Zur Sicherung der Verdachtsdiagnose wurde das pathologisch veränderte Organstück über eine Sabouraud-Agarplatte gestrichen und für 3 Tage bei 37°C zur kulturellen Anzucht des Pilzes bebrütet. 35 D.2 Mikrobiologische, proteinchemische und immunologische Methoden D.2.1 Herstellung von Ausgangsmaterial von A. fumigatus D 141 Als Ausgangsmaterial für die Probengewinnung wurden mit A. fumigatus D141 beimpfte Sabouraud-Agarplatten verwendet, auf denen der Pilz 3 Tage bei 37°C inkubiert wurde. Die dicht sporulierten Kulturen wurden unter einem Abzug mit Minimalmedium abgeschwemmt und in 2 Liter-Glasflaschen, welche jeweils 250 ml Minimalmedium enthielten, überführt. Pro zu inkubierender Flasche wurden die Sporen von je einer abgeschwemmten Platte verwendet. Die Inkubation erfolgte als Schüttelkultur (150 U/min) bei 37°C unter aeroben Bedingungen. Die Dauer der Inkubation war abhängig von dem gewünschten Wachstumsstadium des Pilzes, welches mikroskopisch beurteilt und fotodokumentiert wurde. 36 Wachstums- Inkubationsstadium/ zeit Kulturnr. 1 1 Std. Erwünschte Mikroskopie bei Stop Fotodokumentation ù 2-4µm Konidien 5 µm 2 7,5 Std. aufgeblähte Konidien 5 µm 3 9-10 Std. auskeimende Konidien 5 µm 4 15 Std. logarithmische Wachstumsphase 5 µm 5 48-72 Std. stationäre Wachstumsphase 50 µm Abb. 3: Wachstumsstadien von Aspergillus fumigatus D141 Die Kulturen wurden nach der jeweiligen Inkubation einige Minuten auf Eis gestellt, um fortschreitendes Wachstum zu stoppen und das erreichte Stadium zu sichern. Anschließend wurden die Kulturen Nr. 1 und 2 jeweils durch einen Bottle-Top-Filter, die Kulturen Nr. 3 bis 5 jeweils durch Filterpapier (Schleicher&Schuell Rundfilter Ø 240 mm) filtriert. Jede zurückbehaltene Konidienmasse bzw. jedes Myzel wurde mehrere Male mit 0,02 M Na-Citratpuffer, pH 5,5, durchspült und nachfolgend auf 37 einem 3 mm zellwandständiger starken Whatmann-Papier Proteine wurden die trocken gesaugt. abgetropften Zur Pilzzellen Ablösung in 50-ml- Polystyrolgefäße überführt und es wurden je ca. 40 ml eines 0,1 M Tris-HCl-Puffers, pH 8,5, sowie je 100 µl β-1,3-Glucanase-Stammlösung (s. J.4) zugegeben. Nach einer halbstündigen Inkubation bei 37°C auf einem Überkopfrührer wurden die Proben bei 500 x g für 10 Minuten in einer auf 4°C gekühlten Swing-out Zentrifuge zentrifugiert. Die nun Zellwandprotein enthaltenden Überstände wurden in neue Polystyrolgefäße dekantiert und sofort weiterverarbeitet (s. D.2.1.1). Die Myzelien wurden für die intrazelluläre Probengewinnung (D.2.1.2) bei –20°C aufbewahrt. D.2.1.1 Herstellung der Zellwandfraktion Die Überstände wurden jeweils mit einer Spritze aufgezogen und mit geringem Druck durch 0,2 µm-Sterilfilter in frische Tubes überführt. Nachfolgend wurden die Durchflüsse mit 1 M HCl auf einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 titriert und mit PMSF (Endkonzentration 150 µM) versetzt. Die Proben wurde anschließend bei –80°C eingefroren und gefriergetrocknet. Nach der Gefriertrocknung wurden die Proben in möglichst kleinen Volumina (100-1000 µl) bidestillierten, auf 4°C temperierten, Wassers aufgenommen und anschließend wiederholte Male mittels Zentrifugalkonzentratoren (Vivaspin 20, 10,000 kDa) bei 500 x g in einer auf 4°C gekühlten Swing-out Zentrifuge gegen H2O dialysiert und weiter eingeengt. Daraufhin folgte die Bestimmung des Proteingehaltes der Proben nach der Bradford-Methode (s. Punkt D.2.2). Nicht sofort benötigtes Probenmaterial wurde ggf. gefriergetrocknet, aliquotiert und bei –20°C aufbewahrt. Das in dieser Arbeit verwendete Zellwandmaterial stammte aus dem Wachstumsstadium 3 (auskeimende Konidien, vgl. Abb. 3). D.2.1.2 Herstellung der intrazellulären Proteinfraktion Für die intrazelluläre Probengewinnung wurden ca. 2 g Myzel der einzelnen Kulturstadien auf Eis aufgetaut und mit 4 g Glasperlen ( Ø 0,45-0,5 mm) in 50-mlPolystyrolgefäße überführt. Diesen wurden jeweils ca. 5 ml eines 0,05 M Tris-HClPuffers, pH 8,5, zugefügt. Anschließend wurden die Tubes 5 x über eine Minute auf höchster Stufe gevortext, wobei sie zwischendurch auf Eis gekühlt wurden. Nachdem die Proben bei 500 x g in einer auf 4°C gekühlten Swing-out Zentrifuge 38 abzentrifugiert waren, wurden die Überstände sterilfiltriert (0,2 µm Porengröße) und in frischen Tubes aufgefangen. Der pH-Wert wurde auf 6,5 bis 7,5 eingestellt und den Probenvolumina wurde PMSF (Endkonzentration 150 µM) hinzugegeben. Daraufhin folgte die Bestimmung des Proteingehaltes der Proben mit der BIOQUANT Protein-Reagenzlösung nach der Bradford-Methode, anschließender Gefriertrocknung und Aufbewahrung bei –20°C. Die in dieser Arbeit verwendete intrazelluläre Proteinfraktion entstammt dem Wachsstumsstadium 3 (auskeimende Konidien). D.2.2 Bestimmung des Proteingehaltes Durch die Bindung des in der BIOQUANT -Protein-Reagenzlösung vorhandenen Farbstoffs Coomassie Brillant Blau G-250 tritt an positiv geladenen Proteinen eine Veränderung im Absorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 nm zu 595 nm ein. Diese kann photometrisch gemessen, und zur Proteinkonzentrationsbestimmung durch Vergleich mit bekannten Standards genutzt werden. Aus den zu messenden Probenvolumina wurden je nach Probengesamtvolumen jeweils 15 bzw. 75 µl in Eppendorfreagenzgefäße pipettiert und mit je 750 µl BIOQUANT-Protein-Reagenzlösung versehen, kurz gevortext und in Plastikküvetten überführt. Nach 2 Minuten konnte die Reaktion im Photometer bei 595 nm gemessen werden. Die erhaltenen Werte wurden in eine Standard-Eichkurve eingezeichnet, sodass die Proteinkonzentration der Proben in µg/ml direkt abgelesen werden konnte. 39 D.2.3 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) (modifiziert nach LAEMMLI 1970) Die Auftrennung von Aspergillus-Proteinen erfolgte anhand einer SDS-PAGE in einem vertikalen Elektrophoresesystem (Hoefer Scientific Instruments, SE 200). Dabei wurden folgende Lösungen und Puffer verwendet: Tab. 4: Lösungen und Puffer für die eindimensionale SDS-PAGE Stammlösung Acrylamid N,N´-MethylenBisacrylamid APS-Lösung 10 % Ammoniumpersulfat 10 % (w/v) SDS 10 % Natriumdodecylsulfat 40 % Acrylamid- 38,8 % (w/v) (SDS) Bromphenolblau-Lösung Bromphenolblau Trenngelpuffer 1 M Tris-HCl pH 8,8 Sammelgelpuffer 1 M Tris-HCl pH 6,8 TEMED (N,N,N´,N´Tetramethylethylendiamin) Probenpuffer (2 x konzentriert) 1,2 % (w/v) 10 % (w/v) 1% (w/v) Sammelgelpuffer 3 ml SDS-Lösung 5 ml Glycerol 2 ml Bromphenolblau 1 mg β-Mercaptoethanol* 10 % (v/v) (*Zugabe kurz vor Gebrauch) Laufpuffer Tris 0,025 M Glycin 0,192 M SDS 0,1 % (w/v) 40 D.2.3.1 Herstellung der Gele Zunächst wurde die Gelgießkammer („Mighty-Small“-System) für zwei Minigele (10 x 8 cm) nach Herstellerangaben beschickt. Es folgte das Ansetzen der Trenngellösung mit einer Acrylamidgesamtkonzentration von 12,5% nach folgendem Rezept: 40 % Acrylamid-Stammlösung Trenngelpuffer 9,4 ml 11,3 ml Aqua bidest 8,8 ml 10 % SDS 300 µl 1 % BPB 75 µl 10 % APS 255 µl TEMED 30 µl (Zugabe kurz vor Gebrauch) Die Trenngellösung wurde daraufhin in die vorbereitete Gelgießkammer gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Das Gel war nach ca. 2 Stunden bei RT vollständig polymerisiert. Für die Sammelgellösung wurde folgender Ansatz vorbereitet: 40 % Acrylamid-Stammlösung 2 ml Sammelgelpuffer 2 ml Aqua bidest 11,6 ml 10 % SDS 160 µl 10 % APS 160 µl 1 % BPB 40 µl Die Oberfläche des Trenngels wurde mit 2 x 2 ml dieser Sammelgellösung gespült, um verbliebenes Isopropanol zu entfernen. Anschließend wurden der restlichen Lösung 8 µl TEMED zugegeben, gemischt und auf die Trenngele pipettiert, bis die oberen Glasränder erreicht waren. Nun wurden Taschenkämme aus Kunststoff zwischen die Glas- und Teflonplatten gesteckt. Nach ca. 1 Stunde konnten die auspolymerisierten Gele verwendet werden. 41 Die einzusetzenden Probenvolumina wurden in dem Probenpuffer im Verhältnis 1:1 aufgenommen. Bei geringerem Probenvolumen wurde dieses mit H2O entsprechend ergänzt. Anschließend wurde das Proben-Puffer-Gemisch für 3 Minuten bei 95°C erhitzt und schließlich in die Geltaschen pipettiert. Abhängig von der Fragestellung wurde in einigen Fällen außerdem ein Proteinstandard (Biorad-Marker Low Standards) verwendet. Die Elektrophorese erfolgte zu Beginn bei 90 V, nachdem die Proben das Sammelgel passiert hatten, wurde die Spannung auf 120 V erhöht. Nach der Elektrophorese wurden die Gele entweder gefärbt oder geblottet. D.2.3.2 Coomassie-Brillantblau-Färbung Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine können durch die Färbung mit CoomassieBrillantblau sichtbar gemacht werden. Dazu wurden die Gele auf einem Orbitalschüttler für mehrere Stunden in der Färbelösung geschwenkt. Die Lösung wurde unmittelbar vor ihrer Verwendung hergestellt und bestand aus folgenden Inhalten: 33 % (v/v) Coomassie Brillant Blue® (0,5 % w/v) 33 % (v/v) Essigsäure 33 % (v/v) Methanol Nachdem der Färbevorgang abgeschlossen war, wurde das Gel in folgender Lösung entfärbt: 30 % (v/v) Methanol 7,5 % (v/v) Essigsäure 42 D.2.4 Zweidimensionale Gelelektrophorese In der zweidimensionalen Gelelektrophorese werden Proteine sowohl nach ihrem Molekulargewicht, als auch nach ihrem isoelektrischen Punkt getrennt. Somit ist die 2D-Gelelektrophorese der eindimensionalen SDS-PAGE hinsichtlich der Qualität der Proteinauftrennung weit überlegen. D.2.4.1 Vorbereitung der Proben Die gefriergetrockneten Proben (jeweils 200 µg) wurden je in 360 µl Rehydratationspuffer aufgenommen, welcher sich wie folgt zusammensetzte: 12 g Urea 0,5 g Chaps 125 µl IPG-Puffer (0,5%) eine Spur Bromphenolblau 16 ml Aqua bidest. (Lagerung bei –20°C in 2,5 ml Aliquots, Zugabe von 7 mg DTT (Dithiothreitol) pro Aliquot kurz vor Gebrauch) Die gelöste Probe wurde über 2 h bei RT unter Schütteln inkubiert und anschließend über 2 Minuten bei 16.000 x g abzentrifugiert. Daraufhin wurde die Probe zwischen die Elektroden der silikonisierten und gereinigten Keramikschiffchen (IPG-StripHolder, 18 cm) pipettiert. Auf die im Schiffchen verteilte Probe wurde die Gelseite des IPG-Streifens nach Entfernen der Schutzfolie platziert. Nach Überschichtung des Streifens mit dem Immobiline Drystrip Cover Fluid wurde der Deckel auf das Schiffchen gelegt und der Keramikhalter wurde in der IPGphor-Einheit positioniert. 43 D.2.4.2 Erste Dimension (Isoelektrische Fokussierung) Es folgte ein zwölfstündiger Rehydratationsschritt mit anschließender isoelektrischer Fokussierung (IEF) über vier Stufen bei 20°C: 1. 500 V für 2 h 2. 1000 V für 1 h 20 min 3. 8000 V für 13 h 20 min (>108700 Gesamt-Voltstundenzahl) 4. 30 V für 24 h (Step-n-hold, bis das Programm manuell beendet wird) Wenn nach erfolgter IEF nicht direkt mit der zweiten Dimension fortgefahren wurde, wurden die fokussierten Streifen bei –80°C in 20 cm langen Plastik-Tubes aufbewahrt. D.2.4.3 Zweite Dimension (Proteinseparation nach dem Molekulargewicht) D.2.4.3.1 Herstellung der Gele Für die zweite Dimension wurden 15 bis 18 % -Gradientengele (18 x 20 cm) in einer vertikalen Gelgießkammer (DALT-Gel-Caster) mit Gradientenmischer nach Hoefer gegossen. Dazu wurden für 6 Gele folgende Lösungen angesetzt, welche vor ihrer Verwendung ca. 1 Stunde bei 4°C auf Eis gestellt wurden. Tab. 5: Lösungen für 2D-Gele Schwere Lösung (18%) Leichte Lösung (15%) 249 ml 208 ml 104 ml 104 ml 28 ml 95 ml 4,15 ml 4,15 ml Glycerol 100% 28 ml 0 ml Bromphenolblau 1% 0,3 ml 0 ml 2,08 ml 4,15 ml 0,135 ml 1,02 ml Acrylamid-Bis-Stammlösung (30% Acrylamid + 0.8% Bisacrylamid) 1,5 M TrisHCl pH 8,8 H2O SDS 10% APS 10% (Zugabe kurz vor Gebrauch) TEMED 10% (Zugabe kurz vor Gebrauch) 44 Nachdem der Caster nach Herstellerangaben beladen und mit dem Gradientenmischer verbunden worden war, wurden die gekühlten, mit APS und TEMED versehenen Lösungen, in den Gradientenmischer gegeben. Sobald beide Lösungen in den Caster eingelaufen waren, wurde die Deplatzierungslösung (0,375 M Tris-HCl, pH 8,8 + 50 % (v/v) Glycerol (100 %) + 0,1% (v/v) einer 1-%-igen Bromphenolblau-Lösung) in die Gelkassette eingeleitet, bis die V-förmige Vertiefung ausgefüllt war. Im direkten Anschluss wurde jedes Gel mit 750 µl wassergesättigtem Butanol überschichtet. Nach der ca. zweieinhalb Stunden dauernden Polymerisation wurden die Gele unter fließendem Wasser von Acrylamid- und Butanolresten befreit und bis zu ihrer Verwendung bei 4°C in Gellagerungspuffer (0,375 M Tris-HCl, pH 8,8 + 0,1% (w/v) SDS) bis zu 2 Wochen aufbewahrt. D.2.4.3.2 Gelelektrophorese Für die Gelelektrophorese wurde die vertikale DALT-Gelelektrophorese-Anlage nach Hoefer mit Laufpuffer (0,025 M Tris + 0,192 M Glycin + 0,1% (w/v) SDS) gefüllt und mittels der angeschlossenen Kühlung auf 14°C eingestellt. Die elektrofokussierten IPG-Streifen aus der Ersten Dimension wurden auf einem Orbitalschüttler über 15 Minuten in SDS-Äquilibrierungspuffer (0,05 M Tris-HCl pH 8,8 + 6 M Harnstoff + 30% (v/v) Glycerol + 2% (w/v) SDS + ein paar Körnchen Bromphenolblau + 1% (w/v) DTT (kurz vor Gebrauch)) geschwenkt. Nach der Äquilibrierung wurden die Gelstreifen kurz durch Elektrophoresepuffer gezogen und anschließend jeweils auf den oberen Rand der Gradientengele platziert. Dabei wurde das spitze Ende des IPG-Streifens zur Scharnierseite, das stumpfe Ende zur offenen Seite der Gelkammer gelegt und darauf geachtet, dass die Plastikseite des Strips direkt am Glas anlag, sodass die Geloberfläche nicht mit der ihr gegenüberliegenden Glasplatte in Berührung kam. In einigen Fällen wurde ein auf Papier pipettierter Molekulargewichtsstandard verwendet, welcher am stumpfen Pol des IPG-Streifens platziert wurde. Um sowohl den Markerstreifen, als auch den IPG-Streifen in ihren Positionen zu halten, wurden sie mit Agaroselösung überschichtet. Nachdem die Agarose erkaltet war, wurden die Gelkammern so in den mit Laufpuffer gefüllten Elektrophoresetank eingeschoben, dass sich der stumpfe Pol der eingegossenen IPG-Strips senkrecht in der Kammer am Kathodenende befand. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V und wurde beendet, wenn die Farbfronten am Ende der Gele angekommen waren. Pro 45 Versuchsansatz wurden jeweils zwei identische Gele produziert. Ein Gel wurde nach der Elektrophorese für den späteren Vergleich mit dem Immunblot gefärbt, das andere Gel wurde geblottet. D.2.4.3.3 Silberfärbung Durch die Silberfärbung von Proteinen ist es möglich, Proteinspots ab einer Menge von 1 ng optisch nachzuweisen. Folgende Lösungen wurden für diese Färbung benötigt: Tab. 6: Lösungen für die Silberfärbung Fixierlösung 30 % (v/v) Isopropanol (100%) 10 % (v/v) Essigsäure (100%) Nachfixierlösung 0,5 M Natriumacetat 0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat 30 % (v/v) Ethanol (100%) 0,5 % (v/v) Glutaraldehyd Silberlösung 0,1 % (w/v) Silbernitrat 0,02 % (v/v) Formaldehyd (37%) Entwicklerlösung 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat 0,01 % (v/v) Formaldehyd Stopplösung 0,05 M EDTA Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel für eine Stunde auf einem Orbitalschüttler in der Fixierlösung geschwenkt. Im Anschluss wurde es über Nacht in der Nachfixierlösung belassen. Am nächsten Morgen folgten drei je halbstündige Waschschritte in H2O und daraufhin die Färbung in der Silberlösung für eine Stunde. Nachdem das Gel für maximal 2 Minuten in H2O geschwenkt wurde, wurde es für ca. 10-20 Minuten in Entwicklerlösung geschüttelt. Sobald sich die Spots darstellten, wurde das Gel für ca. 10 Minuten in die Stopplösung überführt und anschließend kurz mit H2O gewaschen. Für die dauerhafte Aufbewahrung wurden die Gele in einer Trockenapparatur (Hoefer) nach Herstellerangaben getrocknet. 46 D.2.4.3.4 Kolloidale Coomassie-Färbung Die kolloidale Coomassie-Färbung zur Darstellung von Proteinen ist in ihrer Sensitivität (ca. 1ng/Proteinspot (Herstellerangabe Fa. Roth)) der konventionellen Coomassie-Färbung überlegen. Durch die kolloidalen Eigenschaften des Farbstoffes bindet dieser spezifisch an die Proteine und nur sehr gering an die Matrix des Gels. Es wurden folgende Lösungen verwendet: Tab. 7: Lösungen für die kolloidale Coomassie-Färbung Fixierlösung 1 % (v/v) o-Phosphorsäure (85%) 20 % (v/v) Methanol (100%) ad 200 ml H2O Roti®-Blue 20 % (v/v) Methanol (100%) Färbelösung 20 % (v/v) Roti®-Blue (5x konzentriert) ad 200 ml H2O Waschlösung 25 % (v/v) Methanol (100%) ad 1000 ml H2O Nach der Elektrophorese wurde das Gel für 60 Minuten in der Fixierlösung geschwenkt und anschließend für 2–15 Stunden in der Roti®-Blue Lösung gefärbt. Das Entfärben durch die Waschlösung wurde solange durchgeführt, bis der Gelhintergrund klar war. Die entfärbten Gele wurden in H2O bei 4°C gelagert. 47 D.2.5 Proteintransfer mittels Western-Blot (modifiziert nach TOWBIN et al. 1979) Der Western-Blot erfolgte sowohl im Anschluss an die eindimensionale, als auch an die zweidimensionale Gelelektrophorese in einer Nassblot-Apparatur mit Kühlungseinheit (kleines System für die eindimensionale SDS-PAGE, Hoefer Gelelektrophoresekammer mit Bloteinsatz für die 2 D). Dabei wurden die in der Elektrophorese aufgetrennten Proteine (Zellwand- bzw. intrazelluläre Proteinfraktionen) auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Als Transfermedium wurde Tris-Glycinpuffer, pH 8,3 (0,025 M Tris, 0,192 M Glycin) mit 15 % (v/v) Methanol (100%) verwendet. Die Nitrocellulosemembran wurde einige Minuten in H2O gewässert und anschließend im Transferpuffer äquilibriert. Die Gelkassette wurde im Transfermedium wie folgt zusammengebaut: Schwammtuch Filterpapier Nitrocellulosemembran Gel Filterpapier Schwammtuch Die gepackte Gelkassette wurde senkrecht in die Halterungen der Nassblotkammer geschoben, sodass sich die Nitrocellulosemembran auf der, der Anode zugewandten Seite des Gels befand. Der elektrophoretische Proteintransfer erfolgte bei 30 V und 4°C über Nacht. Anschließend wurde die geblottete Membran für den Nachweis immunogener Proteine weiterverwendet. D.2.6 Immundetektion nach Western-Blot (Immunblot) Die mit A. fumigatus-Proteinfraktionen beladene Nitrocellulosemembran wurde zunächst getrocknet. Anschließend wurden die Proteine bei einer Energie von 700 x 100 µJ/cm2 in einem UV-Crosslinker kovalent an die Membran gebunden. Die nachfolgenden Inkubations- und Waschschritte wurden alle auf einem Horizontalschüttler ausgeführt. Dem Crosslinken folgten zwei je fünfminütige 48 Waschschritte mit PBS + 0,4 % (v/v) Tween 20, pH 7,4. Im Anschluss daran wurde die Membran für eine Dauer von 30 bis 90 Minuten in einer Tuschelösung [PBS + 0,3 % (v/v) Tween 20, pH 7,4 + 0,1% (v/v) Pelikantusche Schwarz Nr. 17] geschwenkt. Tuschepartikel färben Proteinspots mit einer ungefähren Sensitivität von 100 ng/Spot, ohne die sich anschließende Immun- und Chemilumineszenz-Reaktion zu behindern (EYNARD u. LAURIERE 1998). Nachdem sich die Proteinbanden auf der Membran angefärbt hatten, wurde der Blot dreimal über 10 Minuten in PBS, pH 7,4, gewaschen. Nach diesem Schritt wurde die Membran mit Blockpuffer [10 % (w/v) Magermilchpulver (Sucofin®) in PBS + 0,2 % (v/v) Tween 20, pH 7,4] bei RT für zwei Stunden inkubiert, um die unspezifischen Bindungsstellen der Membran zu blockieren. Die Inkubation des Blots mit Kaninchenseren (Verdünnung 1:100 in Blockpuffer) erfolgte im Anschluss daran bei 4°C über Nacht. Nach diesem Inkubationsschritt folgte ein dreimaliges Waschen der Membran in PBS + 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,4. Auf die Membran wurde nun das in Blockpuffer 1:10.000 verdünnte Konjugat (an Anti-Kaninchen-Antikörper gekoppelte Peroxidase) gegeben und für zwei Stunden bei RT oder bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt für 3 x 10 Minuten in PBS + 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,4 erfolgte die Darstellung der Antigen-Antikörper-Konjugat–Bindungen mittels einer Chemilumineszenzdetektion (ECL-System, Fa. Amersham). Dafür wurde die Nitrocellulosemembran für eine Minute mit einer im Verhältnis 1:1 hergestellten Lösung aus den beiden Komponenten des ECL-Kits inkubiert und anschließend unter eine Klarsichthülle gelegt. Diese wurde zusammen mit dem Film (BIOMAX, Fa. Kodak) in eine Röntgenkassette verbracht und abhängig von der Strahlungsintensität für 2–30 Minuten belichtet. Nach der Entwicklung wurden sowohl Film als auch Membran luftgetrocknet. 49 D.3 Molekularbiologische Methoden D.3.1 Screening einer A. fumigatus-cDNA-Expressionsbank mit Antikörpern (Immunscreening) Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, immunologische Reaktionen gegen Proteine der A. fumigatus-Bank zu erfassen, ihre kodierenden Gene zu isolieren und zu analysieren. D.3.1.1 Vorbereitungen Zur Propagation der λ-ZAP-Phagen der cDNA-Bank wurde ein E. coli (XL1-Blue MRF` der Firma Stratagene) benutzt. Der Stamm wurde über Nacht bei 30°C in LBMedium + 0,2 % (w/v) Maltose + 10 mM MgSO4 unter Schütteln angezogen. Am nächsten Morgen wurde das inkubierte Medium 10 min bei 300 x g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 10 mM MgSO4 aufgenommen und bei einer Wellenlänge von 600 nm auf eine optische Dichte (OD) von 0,5 (D.3.1.2D.3.1.5) bzw. 1,0 (D.3.2) eingestellt. Je nach Verwendungszweck wurden je 200 µl dieser Bakteriensuspension zugesetzt und bei 37°C für 20 Minuten unter Schütteln in einem Thermomixer inkubiert: 50 Tab. 8: Zusätze zur Bakteriensuspension, Endkonzentrationen und Verwendungszwecke Endkonzentration in Zusatz und Konzentration der Bakterien- Verwendungszweck suspension Absorption von Anti- E. coliAntikörpern durch λ-ZAP-Phagen ohne Insert (P.o.I.) 1.5 x 104 pfu (8 x 108 pfu*/ml) Pseudoscreening (s. Punkt D.3.1.2) und Kontrolle der Infektionsspezifität (s. Punkt D.3.1.5) λ-ZAP-cDNA-Phagenbank 9 (3.8 x 10 pfu/ml) Isolierte Phagenklone aus dem Screening 1.52 x 104 pfu Screening (s. Punkt D.3.1.3) 1 x 102 – 1x 103 pfu Aufreinigung (s. Punkt D.3.1.4) (ca. 5 x 105 pfu/ml) Infektionsspezifität (s. Punkt D.3.1.5) und Kontrolle der Monoklonale Phagen- 1 x 102 – 1x 103 pfu lösung Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene (s. Punkt D.3.1.6) Ex Assist Helferphage 6 (> 1x 10 pfu/µl) > 1 x 105 pfu Umklonierung (s. Punkt D.3.2) > 1x 106 pfu Umklonierung (s. Punkt D.3.2) pfu*= plaque forming units D.3.1.2 Absorption von Anti-E. coli-Antikörpern durch Pseudoscreening Um unerwünscht reaktive Antikörper gegen E. coli aus den Kaninchenseren zu entfernen, wurde eine Vorabsorption der Seren durchgeführt. Diese war notwendig, da die Reaktionen der Kaninchenseren auf Proteine von E. coli sonst die Immunreaktionen mit Aspergillus-Antigenen auf den Plaques überlagert hätten. Dazu wurden die mit P.o.I. (Phagen ohne Inserts) versetzen E. colis für 20 Minuten bei 51 37°C unter Schütteln im Thermomixer inkubiert und anschließend mit jeweils 3 ml LB-Top-Agarose gemischt und auf 37°C vorgewärmte LB-Agar-Platten gegossen. Sobald sich nach ca. vierstündiger Inkubation bei 42°C lytische Plaques darstellten, wurden die Nitrocellulose-Membranen bei 37°C auf die Platten gelegt. Nach ca. sechs Stunden Inkubation wurden die Membranen abgezogen und mit der noch unbenutzten Seite über Nacht auf frische, ebenfalls plaquebesetzte Agar-Platten gelegt. Diese, doppelseitig mit E. coli-Proteinen beschickten Membranen wurden kurz vor Gebrauch eine Stunde in Blockpuffer (PBS, pH 7,4 + 0,1 % Tween 20 + 10 % (w/v) Milchpulver) geschwenkt und anschließend je ca. zwölf Stunden mit dem Serum (500 µl Serum + 15 ml Blockpuffer + 37,5 µl Natriumazid-Stammlösung) bei 4°C inkubiert. Es wurden pro Serum mindestens 4 Membranen zur Vorabsorption verwendet. D.3.1.3 Screening der λ-ZAP-cDNA-Phagenbank mit Infektionsseren Für das Screening der A. fumigatus-cDNA-Expressionsbank wurden Seren verwendet, die 14 Tage nach einer als positiv bewerteten Infektion gewonnen wurden. Die mit der λ-ZAP-cDNA-Phagenbank versetzte Bakteriensuspension (s. Punkt D.3.1.1) wurde nach der Inkubation in jeweils 3 ml flüssiger LB-Top-Agarose aufgenommen und im direkten Anschluss auf LB-Agarplatten gegossen. Die Platten wurden bei 42°C inkubiert, bis lytische Plaques zu erkennen waren. Dies war in der Regel nach ca. 4-5 Stunden der Fall. Nachdem die Nitrocellulosemembranen beschriftet und in einer 0,01 M IPTG-Lösung zwecks Induktion der Transkription äquilibriert waren, wurden sie kurz angetrocknet und für mindestens vier Stunden bei 37°C auf die Platten gelegt. Für die spätere Zuordnung der positiven Plaques wurden die Membranen und der Agar an einigen Stellen mithilfe einer Kanüle perforiert. Nach der Inkubation wurden die Membranen abgezogen und über Nacht bei 4°C in Blockpuffer geschwenkt. Die Platten wurden bis zu ihrer weiteren Verwendung bei 4°C aufbewahrt. Am nächsten Morgen wurden die Nitrocellulosemembranen direkt in den, mit Serum versetzten, Blockpuffer (Verdünnung 1:100) überführt und für drei Stunden bei 37°C geschwenkt. Im Anschluss daran wurden die Membranen 3 x über 10 Minuten in PBS + 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,4 gewaschen und des Weiteren für zwei Stunden 52 mit dem in BP aufgenommenen Konjugat bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt von 3 x 10 Minuten in PBS + 0,1 % (v/v) Tween 20, pH 7,4 wurden die Membranen in einer im Verhältnis 1:1 hergestellten ECL-Lösung für eine Minute inkubiert und im Anschluss in eine Klarsichthülle verbracht. Diese Hülle wurde zusammen mit einem Film (BIOMAX, Fa. Kodak) in eine Röntgenkassette gelegt und je nach Signalstärke für 2-10 Minuten belichtet. Im Anschluss an die Entwicklung des Filmes wurden positive Klone den Plaques auf den Originalplatten zugeordnet und jeweils mithilfe einer abgeschnittenen sterilen Pipettenspitze aus dem Agar gestochen. Jeder isolierte Klon wurde in 500 µl SMPuffer + 20 µl Chloroform bei 4°C aufbewahrt. D.3.1.4 Aufreinigung der isolierten Phagenklone Durch die hohe Zahl von Plaques pro gescreenter Agarplatte (ca. 15.000 pfu/ Platte) konnte eine monoklonale Isolierung der positiv reagierenden Phagen zunächst nicht erfolgen. Dies konnte jedoch in einem sich anschließenden Aufreinigungsschritt erreicht werden. Dazu wurden zunächst Titerbestimmungen jedes isolierten Klons vorgenommen (1:500 Verdünnung der Klone in SM-Puffer, Zugabe von je 2-20 µl dieser Verdünnung zu je 200 µl E. coli-Suspension (OD 0,5)). Auf dieser Basis wurden Verdünnungen gewählt, die Platten mit ca. 1 x 102 – 3 x 102 Plaques erbrachten, da bei dieser Anzahl eine monoklonale Isolierung der Phagen möglich war. Der Reinigungsschritt diente zudem gleichzeitig der Überprüfung der aus dem Screening isolierten Klone, da falsch positive Klone bzw. Artefakte keine Signale mehr zeigten. Alle weiteren Arbeitsschritte waren mit denen aus dem Screening (s. Punkt D.3.1.3) identisch. D.3.1.5 Infektionsspezifität der Klone Dieser Versuch umfasste den Vergleich der durch das Screening isolierten monoklonalen Phagenklone mit einem Vorserum (= Serum vor einer Infektion). Dadurch konnten die Klone hinsichtlich ihrer Infektionsspezifität beurteilt werden. Ein Klon galt als spezifisch, wenn er ausschließlich mit dem Infektionsserum reagierte oder eine deutlich stärkere Reaktion mit dem Infektionsserum im Vergleich zum 53 Vorserum aufwies (s. Punkt E.2.3). Um einen Klon nach seiner Infektionsspezifität beurteilen zu können, wurde er zunächst mit der Bakteriensuspension unter gleichzeitiger Zugabe von λ-ZAP-Phagen ohne Insert (s. Punkt D.3.1.1) ausplattiert. Die Nitrozellulosemembranen wurden für die Inkubation mit dem 1. Antikörper halbiert und getrennt mit Infektions- bzw. Vorserum inkubiert. Alle weiteren Arbeitsschritte entsprachen denen des Screenings (s. Punkt D.3.1.3, 3. Absatz), auf die Isolierung der Klone von den Originalplatten konnte allerdings bei diesem Versuch verzichtet werden. D.3.1.6 Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene Die in dieser Arbeit verwendete cDNA-Expressionsbank wurde von der mRNA des Wachstumsstadiums 3 (auskeimende Konidien, s. Abb. 3) angefertigt. Die Häufigkeit der isolierten Antigene lässt bei der, aus in vitro gewachsenem Pilz hergestellten, cDNA-Bank keine Rückschlüsse über die tatsächliche Expressionsstärke des Antigens während der Infektion zu. So ist zum Beispiel denkbar, dass in vitro lediglich basal transkribierte, und somit auch nur in geringer Zahl aus der Bank isolierte Gene, im Tier während der Infektion eine starke Expression aufweisen. Ebenfalls ist es möglich, dass in vitro schwach exprimierte Antigene durch das Screening der cDNA-Bank nicht bei allen Tieren isoliert wurden, obwohl Immunreaktionen vorhanden waren. Aus diesem Grunde wurden die Immunreaktionen von sechs Kaninchen auf 12 ausgesuchte Antigene überprüft. Dabei dienten die erstmalig bei den jeweiligen Tieren isolierten Antigene zugleich als Positivkontrolle. Die Methodik entsprach der unter Punkt D.3.1.5 (Infektionsspezifität der Klone) beschriebenen Vorgehensweise. Die Ergebnisse sind in einer Tabelle unter Punkt E.2.4.1 dargestellt. D.3.2 Umklonierung der cDNA aus λ-ZAP in ein Plasmid Die Inserts der Phagenklone, die ausschließlich mit dem Infektionsserum reagierten, wurden in Plasmide umkloniert. Dazu wurden zunächst 20 µl jedes isolierten Phagenklons unverdünnt mit 200 µl Bakteriensuspension (OD600=1,0) gemischt und wie beschrieben ausplattiert. Nach zwölfstündigem Wachstum bei 37°C und Plaquebildung wurden auf jede Platte 2-4 ml SM-Puffer gegeben. Die Platten wurden 54 über Nacht bei 4°C auf einem Orbitalschüttler geschwenkt und am nächsten Morgen wurde die Phagenlösung geerntet. Diese wurde zusammen mit einer E. coliSuspension und dem Ex Assist Helferphagen für 15 Minuten bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert und anschließend über Nacht in je 3 ml LB-Medium bei 37°C bebrütet. Am nächsten Morgen wurde das inkubierte Medium für 20 Minuten bei 68°C im Wasserbad belassen, um den E. coli zu inaktivieren. Anschließend wurde es bei 1000 x g über 15 Minuten abzentrifugiert. Die Überstände, welche nun die filamentösen Phagenpartikel (=Plasmidstammlösung) enthielten, wurden in frische Polystyrolgefäße überführt und bis zu 2 Monaten bei 4°C gelagert. Als Bakterienstamm für die filamentösen Phagenpartikel wurde ein kanamycinempfindlicher E. coli (XLOLR der Firma Stratagene) verwendet. Dieser wurde auf die gleiche Art und Weise wie der XL1-Blue MRF` angezogen. Für die Aufnahme der Kanamycinresistenz vermittelnden Plasmide wurden je 200 µl der XLOLR-Colis (OD 600=1,0) mit jeweils 100 µl Plasmidstammlösung (bzw. 100 µl LB- Medium für die Negativkontrolle), gemischt und für 15 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Daraufhin wurden zu jeder Bakterien-Plasmid-Suspension 300 µl LBMedium + 0,2 % (w/v) Maltose + 0,01 M MgSO4 gegeben und für weitere 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden jeweils 200 µl der Suspensionen fraktioniert auf LB-Kanamycin-Agar (50 µg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet. D.3.3 Plasmid-Minipräparation Es wurden pro Plasmid 3 ml LB-Medium + 50 µg/ml Kanamycin mit je einer plasmidtragenden Bakterienkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C als Schüttelkultur inkubiert. Am nächsten Morgen wurden für die Anfertigung von Dauerkulturen je 20 µl der inkubierten Medien in jeweils 2 ml LB-Medium + 50 µg/ml Kanamycin überimpft und wiederum bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach 3–4 Stunden wurden pro Subkultur 850 µl inkubiertes Medium entnommen und mit je 150 µl sterilfiltriertem Glycerol versetzt. Die Aufbewahrung dieser Dauerkulturen erfolgte bei –80 °C. Die Plasmid-Minipräparation aus den oben genannten Schüttelkulturen wurde unter Verwendung eines Kitsystem der Fa. Qiagen (QIAprep Spin® Miniprep Kit) nach Herstellerangaben durchgeführt. Im Anschluss daran wurde die DNA-Konzentration der Plasmide photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. 55 D.3.4 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektroporation Bei einer Transfektion von Plasmid-DNA in eine Zelle werden kompetente Zellen benötigt (s. Punkt D.3.5). Für deren Herstellung wurde ein E. coli DH 5α verwendet, welcher über Nacht auf einer LB-Agarplatte bei 37°C angezogen wurde. Am nächsten Morgen wurden 4 x 4-5 Bakterienkolonien von dem Nährboden isoliert und in je 3 ml physiologischer NaCl-Lösung suspendiert. Anschließend wurde jeder Ansatz in einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben, welcher jeweils 250 ml autoklaviertes LBMedium (37°C) enthielt, überführt. Die Lösungen wurden daraufhin für ca. 3-5 Stunden bei 37°C und 90 U/min auf einem Orbitalschüttler geschwenkt. Die Inkubation wurde bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,35 bis maximal 0,40 gestoppt. Im Anschluss wurden die Zellen der Ansätze gepoolt und in zwei vorgekühlten Zentrifugenbechern bei 4.000 x g für 15 Minuten und 4°C zentrifugiert. Nachdem die Zellen jeweils in 500 ml sterilfiltriertem H2O (4°C) resuspendiert wurden, wurden sie erneut zentrifugiert. Es folgten zwei weitere Waschschritte mit jeweils 250 ml H2O (4°C) und sich anschließender Zentrifugation. In einem letzten Reinigungsschritt wurden die Zellen in je 10 ml H2O (4°C) resuspendiert und nachfolgend in einem 50-ml-Polystyrolgefäß gepoolt. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in 2-3 ml sterilfiltrierten H2O-Glycerol-Gemischs (10:1) aufgenommen und im Anschluss in flüssigen Stickstoff getaucht. Die Zellen wurden bei -70°C aufbewahrt. D.3.5 Transfektion von Plasmid-DNA in E. coli DH 5 α Die Elektroporation von Zellen ist eine einfache aber sehr effiziente Transfektionsmethode. Dabei werden suspendierte Zellen in ein elektrisches Feld gebracht und kurzzeitigen elektrischen Pulsen hoher Feldstärke ausgesetzt. Dieses Vorgehen bewirkt eine vorübergehende Porenbildung in der Plasmamembran und somit die Möglichkeit des Eindringens von Plasmid-DNA in die Zelle. Für die Transfektion von Plasmid-DNA wurden 40 µl eines kompetenten E. coli DH 5 α (s. Punkt D.3.4) verwendet. Dieser wurde auf Eis aufgetaut und mit 1 µl einer 1:100.000 Verdünnung des Plasmids (Minipräp mit ca. 0,5 µg/ml) versetzt. Dieser Ansatz wurde in vorgekühlte 1 mm-BTX-Küvetten überführt und zwischen die Elektroden des auf 1,3 bis 1,5 kV eingestellten Transformators (ElectroCell Manipulator 600, Fa. BTX Electroporation System) eingespannt. Im direkten 56 Anschluss an die Pulsgebung wurden 500 µl SOC-Medium in den Ansatz gegeben und durch Suspendieren gemischt. Für die Inkubation wurde die Suspension in ein 13-ml-Polystyrolgefäß überführt und bei 37°C für eine Stunde unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden 200 µl dieser Suspension auf LB-Kanamycin-Agar (50 µg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C bebrütet. D.3.6 DNA-Sequenzanalyse D.3.6.1 Sequenzierung Die durch die Minipräparation isolierte DNA wurde zur Sequenzierung eingeschickt (Fa. Seqlab, Göttingen). Pro Plasmid wurden 0,8 µg DNA und 4 µl T3 bzw. T7-Primer (5 pMol/µl) ad 10 µl H2O vorbereitet. D.3.6.2 Computeranalyse der Sequenzdaten Die Analyse der Sequenzdaten erfolgte mithilfe der Daten aus dem noch nicht abgeschlossenen A. fumigatus Genomprojekt durch exklusiven (z. Zt. noch nicht öffentlichen) Zugriff auf die entsprechende TIGR (The Institute for Genomic Research)-Internetseite (http://www.tigr.org.). Es wurde ein dort integriertes BLASTSearch Programm (Gish, W. (1996-2004) http://blast.wustl.edu) genutzt. Dabei wurden die ermittelten Nukleotidsequenzen der isolierten cDNA-Klone eingegeben und vom BLAST-Search auf Basis aller sechs möglichen Readingframes mit einer durch vorläufige Annotierung des Genoms aufgestellten Aspergillus- Proteindatenbank abgeglichen. 57 D.3.7 Klonierung von pET-Expressionsplasmiden Die Klonierung der pET-Expressionsplasmide für die rekombinante Antigenexpression erfolgte durch Herrn Prof. Dr. Michel Monod, Laboratoire de Mycologie, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Schweiz. D.3.7.1 Produktion HIS-getagter pET-Proteine Für die Produktion von je ca. 10 mg rekombinantem Protein wurden mit den jeweiligen Expressionsplasmiden transformierte E. colis (BL21 (DE3)) in 2,5 ml LBMedium + 80 µg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C als Schüttelkultur angezogen. Diese Kulturen wurden am nächsten Morgen in 2 Liter-Schikanekolben mit jeweils 250 ml LB-Medium + 80 µg/ml Ampicillin überführt und bei 37°C unter Schütteln bis zu einer Absorption von 0.6–0.8 bei 600 nm inkubiert. Bei Erreichen des angegebenen Wertes wurden zur Induktion der Proteinexpression jedem Kolben 0,5 ml einer 0,5 M IPTG-Stammlösung (Endkonzentration 1 mM) zugegeben und weiterhin inkubiert. Nach ca. 3 – 4 Stunden wurden die Kulturen für 20 Minuten in einer auf 4°C gekühlten Zentrifuge bei 1500 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das E. coli-enthaltende Pellet wurde in 40 ml PBS resuspendiert. Nach Überführen in ein neues 50-ml-Polystyrolgefäß und anschließendem Zentrifugieren unter unveränderten Bedingungen wurde das Pellet bei –20°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. D.3.7.2 Aufarbeitung HIS-getagter pET-Proteine Die HIS-getagten pET-Proteine wurden mittels einer Affinitätschromatographie aufgereinigt. 58 D.3.7.2.1 Verwendete Puffer, Säulenäquilibrierung und Vorbereitung des Probenmaterials Für die Aufarbeitung HIS-getagter pET-Proteine wurden folgende Puffer frisch angesetzt und sterilfiltriert: Tab. 9: Übersicht der verwendeten Puffer für die Aufarbeitung HIS-getagter pET-Proteine Puffer A Zusammensetzung und pH-Wert Verwendung 6 M Guanidine-Hydrochlorid + 0,1 M - Entfernung der Einschlusskörperchen NaH2PO4 + 0,01 M Tris; aus E. coli Einstellung des pH-Wertes mit 10 M - Äquilibrierung der Säule NaOH auf pH 8,0 - Puffer für die HIS-tag-Proteine 8 M Urea + 0,1 M NaH2PO4 + 0,01 M B Tris; Bindung des HIS-tag an das Einstellung des pH-Wertes mit 10 M Säulenmedium NaOH auf pH 8,0 8 M Urea + 0,1 M NaH2PO4 + 0,01 M C Tris; Entfernung von unerwünschten Einstellung des pH-Wertes mit HCl Kontaminanten auf pH 6,3 8 M Urea + 0,1 M NaH2PO4 + 0,01 M E Tris; Einstellung des pH-Wertes mit HCl auf pH 4,5 Ablösung des HIS-tag vom Säulenmedium und somit Elution des aufgereinigten Proteins Als Säulenmaterial wurde eine entleerte und mit H2O gewaschene Plastiksäule (1,5 ml/cm) mit Fritte verwendet. Diese wurde mit 1,5 ml Nickel-NTA-Medium (Bindungskapazität ca. 10 mg HIS-getagtes pET-Protein/ml) gefüllt und anschließend mit 25 ml 30 % Ethanol gewaschen. Sobald das Ethanol durch die Säule gelaufen war, wurde mit 25 ml H2O und im Anschluss daran mit 25 ml Puffer A gewaschen. Das bei –20°C (s. Punkt D.3.7.1) aufbewahrte Probenmaterial wurde in 25 ml Puffer A resuspendiert und gevortext, bis das Pellet vollständig gelöst war. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 37°C mittels eines Überkopfrührers mit anschließender Zentrifugation bei 10.000 x g über 20 Minuten. Der proteinenthaltende Überstand (25 ml) wurde in eine Glasflasche dekantiert und mit 75 ml Puffer A versetzt. 59 D.3.7.2.2 Affinitätschromatographie HIS-getagter pET-Proteine Die Probensuspension (Gesamtvolumen 100 ml) wurde sukzessive auf die Säule gegeben. Anschließend wurde mit 15 ml Puffer A gespült und daraufhin wurde die Säule nacheinander mit jeweils 25 ml Puffer B bzw. C gewaschen. Zur Elution des Proteins wurden 20 ml des Puffer E auf die Säule gegeben. Die eluierte Probe wurde aliquotiert und bei –20 °C aufbewahrt. Ein Aliquot wurde zwecks Kontrolle der Aufreinigung für eine SDS-PAGE verwendet. Im Anschluss daran wurde die Probe durch Zentrifugalkonzentratoren (Vivaspin 20, 10.000 kDa) entsalzt und eingeengt. Dabei wurde zunächst bei RT das Probenvolumen von 20 ml zentrifugiert (4.000 x g). Sobald das Volumen auf ca. 500 µl reduziert war, wurde zweimalig mit jeweils 20 ml PBS, pH 7,4, bei 4°C dialysiert. Daraufhin wurde eine Konzentrationsbestimmung des Proteingehaltes der Proben nach der Bradford-Methode durchgeführt (s. Punkt D.2.2). Die Proben wurden erneut mithilfe von SDS-PAGE und CBB-Färbung dargestellt und auf Homogenität geprüft (s. Punkt E.2.6). 60 E Ergebnisse E.1 Tierversuch E.1.1 Anzahl der Tiere und Infektionsdosen Insgesamt wurden 10 Tiere nach dem unter Punkt D.1.3 beschriebenem Schema infiziert. Tab.10: Anzahl der Tiere und Infektionsdosen Versuchsansatz I II IIa Tier 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1. Infektion 2. Infektion 3. Infektion 4. Infektion 1 x 104 2 x 104 1 x 105 1 x 103 2 x 103 3 4 5 x 10 5 x 10 5 x 104 3 4 5 5 x 10 5 x 10 5 x 10 5 x 103 5 x 104 5 x 105 5 x 106 2 x 104 5 x 105 4 5 6 2 x 10 5 x 10 1 x 10 2,5 x 105 1 x 106 5 2,5 x 10 - Der Versuchsansatz I (Tier 1-4) basierte auf Infektionsdosen, die zuvor ausreichend für die Etablierung einer invasiven Aspergillose von DE REPENTIGNY et al. (1991) beschrieben wurden. Dabei repräsentiert Tier 1 ein nicht immunsupprimiertes Kaninchen. Nach der 1. Infektion reagierte klinisch nur Tier 4 aufgrund der Gewichtsabnahme (s. Abb. 7) wie erwartet. Tier 2 und 3 zeigten Reaktionen im Immunblot (s. E.1.3), jedoch keine klinische Symptomatik. Diese wurde erst nach einer zusätzlichen Infektion mit höherer Dosis beobachtet. Bei Tier 1 stellten sich selbst nach der 3. Infektion keine klinischen Symptome oder Immunreaktionen ein. Im Versuchsansatz II zeigten alle 4 Tiere (5-8) bereits bei der 1. Infektion klinische Symptome (s. E.1.2.2). Obwohl die Tiere 7 und 8 eine Infektionsdosis erhielten, die laut Literatur bereits nach durchschnittlich wenigen Tagen tödlich sein sollte, überlebten diese Tiere. Im Gegensatz zu Tier 5, welches nach der ersten Infektion starke Reaktionen im Immunblot zeigte, waren in den Blots der Tiere 7 und 8 nur geringe Unterschiede im Vergleich zum Vorserum zu sehen (s. E.1.3). Die Immunreaktion von Tier 6 war nicht darstellbar. Weitere Infektionen sollten zeigen, ob Reaktionen im Immunblot auftreten (Tier 6) bzw. zusätzliche Immunreaktionen präsentiert werden (Tier 5,7,8) und ob Protektion durch vorangegangene Infektion besteht. Dabei wurden z. T. erheblich höhere Infektionsdosen verwendet als im 61 Schema von DE REPENTIGNY et al. (1991) beschrieben (Tier 5, 3. Infektion; Tier 6, 3. und 4. Infektion; Tier 7, 2. Infektion und Tier 8, 2. und 3. Infektion). Bei Tier 9 und 10 (Versuchsansatz IIa) wurde aufgrund der Ergebnisse aus dem Versuchsansatz I und II bereits bei der ersten Infektion eine Dosis gewählt, die die in der Literatur zur Erzeugung einer invasiven Aspergillose beschriebenen Infektionsdosen weit überstieg. Beide Tiere zeigten nach der ersten Infektion sowohl klinische Symptomatik als auch starke Reaktionen im Immunblot (s. E.1.2.2 bzw. E.1.3). Die zweite Infektion von Tier 9 mit höherer Dosis sollte klären, ob das Kaninchen durch die erste Infektion Schutz erlangt hat. E.1.2 Infektionsbegleitende Kontrollen Von den 10 infizierten Tieren zeigten 9 klinische Symptome. Diese äußerten sich insbesondere durch Gewichtsabnahme und Erhöhung der Körpertemperatur. E.1.2.1 Gewichtsabnahme und Körpertemperatur In den folgenden Diagrammen sind die Gewichtsabnahmen und die Körpertemperaturen der Tiere im Verlauf der einzelnen Infektionen dargestellt. Das Körpergewicht der Kaninchen wurde von Tag -2 bis maximal Tag 54 der Infektion jeden zweiten Tag erfasst. Die Körpertemperatur wurde von Tag -2 bis maximal Tag 28 täglich kontrolliert. Verkürzte Darstellungen des Körpergewichts (KGW) oder der Körpertemperatur sind auf erneute Infektionen oder Tierabgänge (†) zurückzuführen. Der obere Normalwert der Körpertemperatur von 39,5°C (WIESNER 1988; BERGHOFF 1989) ist in den Diagrammen mittels einer Linie dargestellt. 62 42 4900 41,5 Tier 1 Gewicht 4650 1. Infektion 2. Infektion 41 3. Infektion 4400 Temperatur 40,5 40 39,5 † 3900 39 38,5 3650 38 3400 Temperatur (°C) Gewicht (g) 4150 37,5 3150 37 36,5 2900 36 2650 35,5 35 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 Tage 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 10.000.000 1.000.000 Infektionsdosis 20.000 10.000 100.000 100.000 10.000 Konidienzahl 2400 1.000 100 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 Tage Abb. 4: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 1) 63 42 4900 41,5 Tier 2 4650 Gewicht 4400 2. Infektion 1. Infektion Temperatur 40,5 40 4150 39,5 † 3900 39 38,5 3650 38 3400 Temperatur (°C) Gewicht (g) 41 37,5 3150 37 36,5 2900 36 2650 35,5 2400 35 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage 10.000.000 1.000.000 Infektionsdosis 100.000 2.000 1.000 10.000 1.000 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage Abb. 5: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 2) 64 Konidienzahl 0 42 4900 41,5 Tier 3 4650 Gewicht 2. Infektion 4400 40,5 40 1. Infektion 39,5 3900 39 † 3650 38,5 38 3400 Temperatur (°C) Gewicht (g) 4150 Temperatur 41 37,5 3150 37 36,5 2900 36 2650 35,5 2400 35 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage 1.000.000 50.000 100.000 5.000 10.000 1.000 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage Abb. 6: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 3) 65 Konidienzahl 10.000.000 Infektionsdosis 42 4900 1. Infektion 41,5 Tier 4 4650 41 4400 40,5 Temperatur 40 39,5 3900 39 † 38,5 3650 38 3400 Temperatur (°C) Gewicht (g) 4150 Gewicht 37,5 3150 37 36,5 2900 36 2650 35,5 2400 35 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage 10.000.000 1.000.000 100.000 Infektionsdosis 50.000 10.000 1.000 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage Abb. 7: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektion (Tier 4) 66 Konidienzahl 0 42 4900 Gewicht Temperatur Tier 5 4650 4400 1. Infektion 2. Infektion 3. Infektion 41,5 41 40,5 Gewicht (g) 39,5 3900 39 38,5 3650 38 3400 37,5 3150 Temperatur (°C) 40 4150 37 36,5 2900 36 2650 35,5 2400 35 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 10.000.000 Tage 500.000 Infektionsdosis 1.000.000 50.000 100.000 5.000 10.000 Konidienzahl 0 1.000 100 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 Tage Abb.8: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 5) 67 42 Tier 6 4900 1. Infektion 3. Infektion 2. Infektion 41,5 4. Infektion 4650 41 40,5 4400 40 39,5 3900 39 3650 38,5 38 3400 Temperatur (°C) 37,5 3150 37 Gewicht Temperatur 2900 2650 36,5 36 35,5 2400 35 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 Tage 0 8 16 24 32 40 48 5.000.000 10.000.000 500.000 50.000 1.000.000 Infektionsdosis 100.000 5.000 10.000 1.000 Konidienzahl Gewicht (g) 4150 100 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 Tage Abb.9: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 6) 0 8 16 24 32 40 48 68 42 4900 41,5 Tier 7 4650 41 4400 2. Infektion 40 Temperatur 39,5 3900 39 38,5 3650 38 3400 Temperatur (°C) 1. Infektion 4150 Gewicht (g) 40,5 Gewicht 37,5 3150 37 † 2900 36,5 36 2650 35,5 2400 35 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage 1.000.000 50.000 20.000 100.000 10.000 1.000 Konidienzahl 10.000.000 Infektionsdosis 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage Abb.10: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 7) 69 42 4900 41,5 3. Infektion Tier 8 Gewicht Temperatur 4650 1. Infektion 2. Infektion 41 40,5 4400 40 39,5 3900 39 38,5 3650 38 3400 Temperatur (°C) Gewicht (g) 4150 37,5 3150 37 36,5 2900 36 2650 35,5 2400 35 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 0 8 16 24 32 40 48 Tage 10.000.000 Infektionsdosis 1.000.000 1.000.000 50.000 20.000 100.000 10.000 1.000 Konidienzahl 0 100 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 // 0 8 16 24 32 40 48 Tage Abb.11: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 8) 70 42 4900 Tier 9 Gewicht 4650 Temperatur 41,5 41 40,5 4400 2. Infektion 1. Infektion 40 4150 3900 39 38,5 3650 38 3400 Temperatur (°C) Gewicht (g) 39,5 37,5 3150 37 † 2900 36,5 36 2650 35,5 2400 35 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage 10.000.000 Infektionsdosis 1.000.000 250.000 100.000 10.000 1.000 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 // 0 Tage 4 8 Abb.12: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 9) 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 71 Konidienzahl 1.000.000 42 4900 41,5 Tier 10 4650 41 4400 Gewicht 40,5 Temperatur 40 4150 Gewicht (g) 39,5 3900 39 3650 38,5 3400 38 Temperatur (°C) 1. Infektion 37,5 3150 37 † 2900 36,5 2650 36 2400 35,5 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage 250.000 1.000.000 Infektionsdosis 100.000 10.000 1.000 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Tage Abb.13: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektion (Tier 10) 72 Konidienzahl 10.000.000 E.1.2.1.1 Prozentuale Gewichtsabnahme der Tiere im Verlauf der einzelnen Infektionen Die Prozentangaben in der Tabelle 11 beziehen sich auf das Ausgangsgewicht der Tiere (Tag –2 der Infektion) und auf den niedrigsten Wert des Körpergewichts, der im Verlauf der Infektion erreicht wurde. Außerdem ist angegeben, in welchem Zeitraum die Gewichtsabnahme erfolgte. Tab. 11: Prozentuale Gewichtsabnahme der Tiere im Verlauf der einzelnen Infektionen Tier Gewichtsab- Zeitraum (in d) Gewichtsab- Zeitraum (in d) Gewichtsab- Zeitraum (in d) Gewichtsab- Zeitraum (in d) nahme in % im p. 1. inf. bis nahme in % im p. 2. inf. bis nahme in % im p. 3. inf. bis nahme in % im p. 4. inf. bis Verlauf der 1. zum Erreichen Verlauf der 2. zum Erreichen Verlauf der 3. zum Erreichen Verlauf der 4. zum Erreichen Infektion der höchsten Infektion der höchsten Infektion der höchsten Infektion der höchsten Gewichtsab- Gewichtsab- Gewichtsab- Gewichtsab- nahme nahme nahme nahme 1 keine keine keine 2 keine keine k.w.I. 3 keine 11,8 4 16,3 46 k.w.I. 5 17,9 16 9,6 6 5,5 18 keine 7 6,3 10 17,3 8 7,9 12 keine 9 5,4 12 16,3 10 19,4 14 k.w.I. 24 k.w.I. 8 5,6 keine 24 k.w.I. 4 k.w.I. 2,27 6 k.w.I. keine 22 k.w.I. k.w.I. = keine weitere Infektion 73 In der Tabelle 11 sind Werte, die eine Gewichtsabnahme von 5 % übersteigen, hervorgehoben. Insgesamt wurde bei 8 der 10 infizierten Kaninchen eine Reduzierung des Gewichts von > 5 % festgestellt. Der Zeitraum, in dem derartige Gewichtsabnahmen erreicht wurden, war bei 7 von 8 Tieren im Mittel 14 +/- 3 Tage bei der 1. Infektion und im Mittel 20 +/- 8 Tage bei der 2. Infektion. Lediglich Tier 4 wies eine kontinuierliche Gewichtsabnahme auf, die sich über einen Zeitraum von 46 Tagen bis zur Tötung des Tieres erstreckte. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass das Tier bereits ab Tag 20 p. inf. einen Gewichtsverlust von 6,3 % gegenüber seinem Ausgangsgewicht zeigte. Eine weiterführende statistische Auswertung der Infektionsversuche erfolgte nicht, da diese nicht in Relevanz zur Zielvorgabe dieser Arbeit stand und zudem größere Fallzahlen erfordert hätte. E.1.2.1.2 Körpertemperaturen der Tiere im Verlauf der Infektionen Aus den Diagrammen (Abb. 4-13) ist ersichtlich, dass 2 der 10 Tiere (Tier 1, 4) während des Infektionsverlaufes keinen Anstieg der Körpertemperatur verzeichneten. Bei 8 Tieren wurde eine Erhöhung der Körpertemperatur beobachtet (Tier 2,3,5-10). 74 E.1.2.2 Auswertung der infektionsbegleitenden Kontrollen Tab.12: Auswertung der infektionsbegleitenden Kontrollen Tier Anzahl der Infektionen 1. Infektion 2. Infektion 3. Infektion 4. Infektion 1 3 2 2 3 2 + 4 1 + 5 3 + 6 4 + 7 2 + + 8 3 + 9 2 + + 10 1 + Legende: + + + = Gewichtsabnahme > 5 % = Temperaturanstieg Die Tiere 1 und 2 wurden trotz Fehlens klinischer Symptome getötet und obduziert. Wegen klinischer Symptomatik (v. a. Gewichtsabnahme) mussten 5 Kaninchen (Tier 3, 4, 7, 9, 10) getötet werden. 3 von 10 Tieren (Tier 5, 6, 8) überlebten die Infektionen trotz des Auftretens klinischer Symptome. E.1.3 Überprüfung und Darstellung des Infektionserfolges Der Infektionserfolg bzw. die Antikörperreaktion wurde bei jedem Tier, unabhängig von dem Auftreten klinischer Symptome, 14 d nach der Infektion mittels eines eindimensionalen Immunblots überprüft. Die dargestellten Immunblots zeigen die Reaktionen der Kaninchen, die eine Serokonversion aufwiesen (Tier 2,3,5,7-10), vor (VS=Vorserum) und nach der Infektion (IS= Infektionsserum p. inf.) auf aus der Zellwand von A. fumigatus gelöste Proteine (ZW-Proteine), (s. D.2.1.1), sowie auf intrazelluläre Proteinfraktionen (IZProteine), (s. D.2.1.2). Unterschieden sich die Immunreaktionen der Kaninchen nach 75 einer Infektion deutlich von denen vor einer Infektion, wurde die Infektion als positiv (mit P gekennzeichnet) bewertet. Einige Tiere (Tier 2, 5, 8, 9) wurden nach einer positiven Infektion erneut infiziert. Dadurch sollte überprüft werden, ob sich die Immunreaktionen der Kaninchen verändern. Auf die Verwendung eines Proteinstandards wurde hier verzichtet, da die Immunreaktionen der Tiere ausschließlich qualitativ dargestellt werden sollten. Tier 2 ZW IZ Tier 3 ZW ZW IZ ZW IZ ZW IZ IZ ZW IZ ZW IZ ZW IZ P 1. VS 2. VS P IS p.1.inf. IS p.2.inf. 1. VS 2. VS IS p.1.inf. IS p.2.inf. Tier 5 ZW IZ ZW IZ ZW IZ ZW IZ ZW IZ P 1. VS 2. VS IS p.1.inf. IS p.2.inf. IS p.3.inf. Legende siehe nächste Seite Abb. 14: Darstellung der Immunreaktionen auf zellwandständige und intrazelluläre A. fumigatus-Proteine vor und nach den Infektionen mittels eindimensionaler Immunblots 76 Tier 7 ZW IZ Tier 8 ZW IZ ZW IZ ZW ZW IZ IZ ZW IZ ZW IZ P 1. VS 2. VS IS p.1.inf. IS p.2.inf. 1. VS 2. VS IS p.1.inf. IS p.2.inf. IS p.3.inf. Tier 10 ZW IZ ZW ZW IZ ZW IZ IZ ZW IZ P 1. VS 2. VS ZW IZ P Tier 9 ZW IZ ZW IZ ZW IZ P 1. VS IS p.1.inf. IS p.2.inf. 2. VS IS p.1.inf. Fortsetzung Abb. 14 Legende: ZW Zellwand-Proteine IS p.1.inf. Infektionsserum, das nach der ersten Infektion gewonnen wurde IZ Intrazelluläre Proteine IS p.2.inf. Infektionsserum, das nach der zweiten Infektion gewonnen wurde 1. VS Erstes Vorserum (nach IS p.3.inf. Einstallung gewonnen) 2. VS Zweites Vorserum Infektionsserum, das nach der dritten Infektion gewonnen wurde P Positiv bewertete Infektion (direkt vor Infektion gewonnen) 77 E.1.3.1 Auswertung der eindimensionalen Immunblots Tab.13: Auswertung eindimensionaler Immunblots Tier Immunreaktionen Immunreaktionen auf Zellwand- Bewertung der auf intrazelluläre Immunreaktionen verstärkte (ZW)-Proteine im (IZ)-Proteine im Vergleich zum Vergleich zum durch weitere Vorserum Vorserum Infektionen 1 - - Neg. 2 ++ - Pos. Nein 3 +(+) - Pos. Ja 4 - - Neg. 5 +++ +++ Pos. 6 fraglich fraglich Neg. 7 +++ +++ Pos. k.w.I. 8 +++ +++ Pos. Nein 9 +++ +++ Pos. k.w.I. 10 +++ +++ Pos. k.w.I. Legende: (pos./neg.) Zusätzliche bzw. Immunreaktionen Nein - keine Veränderungen der Immunreaktionen im Vergleich zum Vorserum + geringgradige Zunahme der Immunreaktionen im Vergleich zum Vorserum ++ mittelgradige „ +++ hochgradige „ k.w.I. = keine weiteren Infektionen nach der pos. Infektion 78 E.1.3.2 Zweidimensionale Gele und Immunblots 97 kD 97 kD 66 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 3 pH 10 14 kD Intrazelluläre Proteine 3 pH 10 14 kD Zellwandständige Proteine Abb. 15: Silbergefärbte 2D-Gele Abb. 15: Die silbergefärbten 2D-Gele zeigen intrazelluläre und zellwandständige Aspergillus fumigatus-Proteine, aufgetrennt nach ihrem isoelektrischen Punkt und ihrem Molekulargewicht. Aufgrund der dargestellten Spotverteilung wurden für alle weiteren Gele pH-Bereiche von 4-7 für intrazelluläre Proteinfraktionen und pHBereiche von 4-5 für zellwandständige Proteine verwendet (nicht näher dargestellt). Die zweidimensionalen Blots dienten zur weiteren Veranschaulichung der Immunreaktionen der Kaninchen. Zudem sollten die Blots die Basis für spätere Arbeiten schaffen, welche sich mit der massenspektrometrischen Analyse der reagierenden Antigene befassen werden. In Abbildung 16 sind beispielhaft die Immunreaktionen von zwei Kaninchen (Tier 5 und 8) dargestellt. Dabei handelt es sich um die humorale Reaktion der Tiere auf intrazelluläre und zellwandständige Proteine von A. fumigatus vor der Infektion, 14 Tage nach der ersten Infektion (14 d p.1.inf.) und 2 Wochen nach der zweiten Infektion (14 d p.2.inf.). Es ist zu erkennen, dass das erste Infektionsserum (14 d p.1.inf.), verglichen mit dem Vorserum, eine Zunahme der Immunreaktionen auf A. fumigatus-Proteine zeigt. Wesentlich ausgeprägtere Signale sind im zweiten Infektionsserum (14 d p.2.inf.) im Vergleich zum Vor- und ersten Infektionsserum zu erkennen. 79 97 kD 66 kD 97 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 14 kD 14 kD 4 pH 4 7 Tier 5: Vorserum, IZ pH 5 Tier 5: Vorserum, ZW 97 kD 66 kD 97 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 14 kD 14 kD 4 pH 4 7 Tier 5: Serum 14 d p.1.inf., IZ pH 5 Tier 5: Serum 14 d p.1.inf., ZW 97 kD 66 kD 97 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 14 kD 14 kD 4 pH 7 Tier 5: Serum 14 d p.2.inf., IZ 4 pH 5 Tier 5: Serum 14 d p.2.inf., ZW Legende siehe nächste Seite Abb. 16: Darstellung der Immunreaktionen ausgewählter Tiere (5,8) auf intrazelluläre und zellwandständige A. fumigatus-Proteine vor Infektion, nach der ersten und nach der zweiten Infektion mittels 2D-Immunblots 80 97 kD 66 kD 97 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 14 kD 14 kD 4 pH 7 4 pH 5 Tier 8: Vorserum, ZW Tier 8: Vorserum, IZ 1 4 pH 97 kD 66 kD 97 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 14 kD 14 kD 7 4 Tier 8: Serum 14 d p.1.inf., IZ 4 pH 7 Tier 8: Serum 14 d p.2.inf., IZ Legende: IZ 14 d p.1.inf. 14 d p.2.inf. Fortsetzung Abb. 16 pH 5 Tier 8: Serum 14 d p.1.inf., ZW 97 kD 66 kD 97 kD 66 kD 45 kD 45 kD 31 kD 31 kD 22 kD 22 kD 14 kD 14 kD 4 pH 5 Tier 8: Serum 14 d p.2.inf., ZW ZW Zellwandständige Proteine Intrazelluläre Proteine Serum, das 14 Tage nach der ersten Infektion gewonnen wurde Serum, das 14 Tage nach der zweiten Infektion gewonnen wurde 81 E.1.4 PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA Tab. 14: Ergebnisse des PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA Bestätigung 1. Test des 2. Test erwarteten Ergebnisses Tier Vorserum Infektionsserum Vorserum Infektionsserum 2 negativ negativ - - nein 3 negativ negativ - - nein 5 negativ negativ - - nein 6 positiv negativ positiv negativ nein 7 negativ negativ - - nein 8 negativ positiv negativ positiv ja 10 negativ negativ - - nein Da der Test auf im Blut zirkulierendes Galactomannan von A. fumigatus anspricht, sollten Vorseren negativ und Infektionsseren positiv getestet werden. Insgesamt wurde der PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA mit Seren (Vorseren bzw. 14 d p. inf.) von 7 Tieren durchgeführt. Zwei Vor- und Infektionsseren wurden zusätzlich einem 2. Test unterzogen, um etwaige falsch positive Ergebnisse aus dem 1. Test zu überprüfen. 82 E.1.5 Sektionen In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der Sektionen zusammengestellt. Aspergillus fumigatus manifestierte sich in Form mykotischer Herde in den aufgeführten Organen. Die Organveränderungen sind mit +++ für hochgradigen, ++ für mittelgradigen und + für geringgradigen Befall bewertet. Keine pathologischen Veränderungen der Organe sind mit – gekennzeichnet. Tab. 15: Ergebnisse der Sektionen Tier Lunge Leber Milz Nieren 1 - - - - 2 - - - + 3 - - - - 4 - - - - 5 Keine Sektion- Infektionen wurden überlebt! 6 Keine Sektion- Infektionen wurden überlebt! 7 ++ - Keine Sektion- Infektionen wurden überlebt! 8 Bei + - 9 + +++ + +++ 10 ++ - - +++ 4 der 7 sezierten Kaninchen (Tier 2,7,9,10) wurden pathologische Organveränderungen festgestellt. Diese wurden nachweislich durch A. fumigatus hervorgerufen (s. D.1.4.1). 83 E.1.5.1 Sektionsbilder 100 x linke Niere Tier 2 linke Niere Tier 2 rechte Niere Tier 7 Leber Tier 7 Leber Tier 9 rechte Niere Tier 9 A. fumigatus-Hyphen, Calcuflorweissfärbung (Isolat aus Niere Tier 2) 40 x A. fumigatus-Hyphen, Calcuflorweissfärbung (Isolat aus Leber Tier 7) 10 x A. fumigatus-Hyphen, Calcuflorweissfärbung (Isolat aus Niere Tier 9) Abb.17: Darstellung der Organveränderungen und mikroskopische Bilder 84 Lunge Tier 9 linke Niere Tier 10 Milz Tier 9 Milz Tier 9 rechte Niere Tier 10 40 x A. fumigatus-Hyphen, Calcuflorweissfärbung (Isolat aus Niere Tier 10) Lunge Tier 10 Fortsetzung Abb. 17 85 E.1.6 Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells Tab. 16: Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells Tier Anstieg der Körpertemperatur Immunblot Sektion 1 Gewichtsabnahme > 5% nein nein Neg. Neg. 2 nein ja Pos. Pos. 3 ja ja Pos. Neg. 4 ja nein Neg. Neg. 5 ja ja Pos. - 6 ja ja Neg. - 7 ja ja Pos. Pos. 8 ja ja Pos. - 9 ja ja Pos. Pos. 10 ja ja Pos. Pos. Aufgrund der in der Tabelle 16 dargestellten Ergebnisse wurden von den 10 infizierten Kaninchen 7 Tiere als erfolgreich infiziert betrachtet. Bei 4 der 7 Tiere (2,7,9,10) konnte eine invasive Aspergillose durch die Sektionen zweifelsfrei nachgewiesen werden. Ein Tier (3) war in der Sektion ohne pathologische Veränderungen, obwohl klinische Symptomatik und ein positiver Immunblot vorangegangen waren. Zwei der erfolgreich infizierten Tiere (5,8) überlebten die Infektionen. Für die Identifikation infektionsrelevanter Antigene von A. fumigatus durch Screening einer -Phagen-cDNA-Expressionsbank wurden Seren der Kaninchen 2,3,5,7,8 und 10 ausgewählt. 86 E.2 Screening einer A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek mit Infektionsseren (Immunscreening) Tab. 17: Übersicht Screening der cDNA-Expressionsbibliothek Verwendete Infektionsseren Tier 2 Tier 3 Tier 5 Tier 7 Tier 8 Tier 10 14 d p. 14 d p. 14 d p. 14 d p. 14 d p. 14 d p. 14 d p. 14 d p. 14 d p. 1.inf 2.inf 1.inf 2. inf 1.inf 2. inf 1.inf 2. inf 1.inf 2 x 105 2 x 105 4,5 x 105 1,5 x 105 3 x 105 3 x 105 3 x 105 3 x 105 1.5 x 105 37 20 19 47 21 33 21 30 15 18 7 19 47 6 33 6 30 15 7 2 6 10 5 5 4 3 7 Gesamtzahl der gescreenten Plaques pro Serum (Screening) aufgereinigte, reagierende Plaques davon infektionsspezifische Plaques Zahl der identifizierten Gene aus den infektionsspezifischen Plaques Die Verwendung von Einzelseren ermöglicht eine detaillierte Aussage darüber, welches Tier auf welche Antigene reagiert. Antigene, die durch mehrere verschiedene Infektionsseren isoliert werden, weisen eventuell auf eine besondere Bedeutung im Infektionsgeschehen hin. d. h. Plaques, die ausschließlich mit dem Infektionsserum reagierten oder eine deutlich stärkere Reaktion mit dem Infektionsserum als mit dem Vorserum aufwiesen Allen Plaques konnten Gene zugeordnet werden. Die Differenz erklärt sich durch Mehrfachisolierungen ein und derselben cDNA (s. Tabelle 17a) 87 Tab.17a: Identifizierte Antigene Tier 2 (14 d p. 1.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) Erma >69.m15029|||reticulocyte binding protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69 BipA >57.m05760|||ER chaperone BiP|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5210|57 Myosin 2 >71.m15694|||reticulocyte binding protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0037b07.p1c|71 RNA-Helicase >72.m18954|||Cdc28p protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0346e02.q1ca|72 Coatmer A >57.m05557|||coatomer protein gamma 2subunit|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5210|57 Methyltransferase >89.m01968|||methlytransferase, UbiE/COQ5 family|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5049|89 6x 6x 2x 1x 1x 1x 1x Proteindatenbank (Aspergillus fumigatus- Translationsinitiationsfaktor >69.m15713|||eif-2b|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69 *= TIGR (The Institute for Genomic Research) 88 Fortsetzung Tab. 17a Tier 3 (14 d p. 2.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques Proteindatenbank (Aspergillus fumigatusGenomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) 6x Elongationsfaktor 1 1x Transketolase >62.m03150|||elongation factor 1-gamma 2|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62 >70.m15291|||transketolase|a_fumigatus| chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 89 Fortsetzung Tab. 17a Tier 5 (14 d p. 1.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques 8x 7x 1x 1x 1x (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) HSP90 AHP1 >53.m03692|||heat shock protein 90|a_fumigatus|chr_0| TIGR.5147|53 >62.m03473|||antioxidant, AhpC/Tsa family|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62 Enolase >69.m14844|||enolase|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69 Histon H3 >70.m15320|||histone H3|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 Erma >69.m15029|||reticulocyte binding protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69 1x MCAP >59.m09500|||cytoskeleton assembly control protein homolog Sla2|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 90 Fortsetzung Tab. 17a Tier 5 (14 d p. 2.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) 15x AHP1 >62.m03473|||antioxidant, AhpC/Tsa famly|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62 11x HSP90 >53.m03692|||heat shock protein 90|a_fumigatus|chr_0| TIGR.5147|53 8x Aspf 16 >70.m15565|||allergen|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 6x Enolase 2x Phosphoglucomutase 1x Acyl-CoA 1x Cation-Ex 1x Nucl-Seggr. 1x Pyruvatdecarboxylase 1x Formatdehydrogenase >69.m14844|||enolase|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69 >59.m08711|||phosphoglucomutase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 >72.m19226|||Acyl CoA binding protein family|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0346e02.q1ca|72 >89.m01969|||cation exchanger, putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5049|89 >70.m15353|||similar to yeast nuclear segregation protein Bfr1 involved in Mitosis and Vesicular transport, putative|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 >59.m08784|||pyruvate decarboxylase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 >62.m03114|||NAD-dependent formate dehydrogenase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62 91 Fortsetzung Tab. 17a Tier 7 (14 d p. 1.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) 2x SMC >69.m14905|||hypothetical protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGD80TR|69 1x DNA-Helicase >89.m02073|||reticulocyte binding protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5049|89 1x Bromo >58.m07590|||bdf1 protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58 1x Aldolase >59.m08909|||class II aldolase/adducin domain protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 1x N-Acetylglucosamindecacetylase >20078.m00050||AO070241000019|conserved hypothetical protein|a_oryzae|chr_0|Con0241|20078 92 Fortsetzung Tab. 17a Tier 7 (14 d p. 2.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) >59.m08784|||pyruvate decarboxylase| 18 x Pyruvatdecarboxylase 9x hypoth. Membranprotein >59.m08614|||conserved hypothetical protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 3x HSP70 >70.m15203|||heat shock protein Hsp70|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 2x Coatmer B >70.m15529|||CG14813PA|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 1x DnaJ >66.m04645|||unnamed protein product|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGUU35TF|66 a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 93 Fortsetzung Tab. 17a Tier 8 (14 d p.1.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques 3x 1x 1x 1x (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) ATPase Myosin >58.m07519|||related to nonmuscle myosin-II heavy chain, putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58 HSP70 >70.m15203|||heat shock protein Hsp70|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 HSP 30 >59.m08448|||30 kDa heat shock protein|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 PEP2 >59.m08754|||cellular aspartic protease|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 94 Fortsetzung Tab. 17a Tier 8 (14 d p. 2.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) 27 x Erma >69.m15029|||reticulocyte binding protein|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGDP80TR|69 2x ATPase Myosin >58.m07519|||related to nonmuscle myosin-II heavy chain, putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58 1x MutL >72.m19437|||PMS1|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0346e02.q1ca|72 95 Fortsetzung Tab.17a Tier 10 (14 d p.1.inf) Genverteilung auf vorläufige Bezeichnungen laut TIGR*-Proteindatenbank in dieser Arbeit verwendete Abkürzung Plaques (Aspergillus fumigatus-Genomprojekt AFU1.pep; Stand 05/2004) 5x Elongationsfaktor 1 >62.m03150|||elongation factor 1-gamma 2|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62 4x Aspf 16 >70.m15565|||allergen|a_fumigatus|chr_0|Sanger.Af0121f02.p1c|70 2x AHP-1 >62.m03473|||antioxidant, AhpC/Tsa family|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5201|62 1x HSP90 >53.m03692|||heat shock protein 90|a_fumigatus|chr_0| TIGR.5147|53 1x Cholindehydrogenase >67.m02964|||choline dehydrogenase|a_fumigatus|chr_0|Sanger.AFGFF15TF|67 1x Phosphoglucomutase >59.m08711|||phosphoglucomutase|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5237|59 1x hyp. Signalprotein >58.m07276|||hypothetical signal peptide protein, putative|a_fumigatus|chr_0|TIGR.5231|58 96 E.2.1 Screeningzeitpunkt Für das Screening wurden Seren von 6 Kaninchen (Tier 2,3,5,7,8,10) 14 d p. inf. verwendet (s. Tab. 17). Dieser Zeitpunkt wurde zum einen gewählt, da protektive Immunantworten bereits früh im Infektionsverlauf auftreten (LEHMANN u. WHITE 1976), zum anderen, weil es vermieden werden sollte, dass überwiegend Abräumprodukte des Pilzes identifiziert werden. Im Folgenden sind beispielhaft die Ergebnisse des Screenings der cDNA-Expressionsbank dargestellt. E.2.2 Gescreente und aufgereinigte Plaques Pro Serum wurden zwischen 150.000 und 450.000 -Phagen–cDNA-Plaques gescreent. In der Tabelle 17 ist aufgeführt, wie viele aufgereinigte d. h. monoklonale Phagen bei jedem Screening der A. fumigatus-cDNA-Expressionsbibliothek isoliert wurden. Abb. 18a Abb. 18b Abb.18a,b: Zwei Beispiele für das Screening der -Phagen–cDNA-Plaques mit dem Infektionsserum von Tier 7 (14 d p.1. inf.). Positiv reagierende Klone wurden nummeriert, isoliert und anschließend aufgereinigt (Beispiele s. Abb.19a,b). 97 Abb. 19a Abb. 19b Abb.19a,b: Beispiele für aufgereinigte Plaques (Tier 5, 14 d p. 1.inf., Abb. 19a; Tier 8 14 d p.2.inf., Abb. 19b). Da alle positiv reagierenden cDNA-Plaques identisch sind, ist hier nur die Isolierung eines Klons (eingekreist) notwendig. Schwach sichtbare Plaques im Hintergrund entsprechen Reaktionen gegen E. coli-Proteine, die trotz Vorabsorption der Seren nicht komplett zu beseitigen waren. 98 E.2.3 Infektionsspezifität der Antigene Es wurden insgesamt mehr als 2 Millionen Phagenplaques der A. fumigatus-cDNAExpressionsbibliothek gescreent. Von den reagierenden Klonen waren lediglich 181 infektionsspezifisch (Tab. 17). E.2.3.1 Darstellung infektionsspezifischer Antigene Die Bilder zeigen die Immunreaktionen der Tiere auf die cDNA-Plaques von A. fumigatus. Ein Klon galt als spezifisch, wenn er ausschließlich mit dem Infektionsserum (rechte Membranhälften) reagierte oder eine deutlich stärkere Reaktion mit dem Infektionsserum im Vergleich zum Vorserum (linke Membranhälften) aufwies. Idealerweise zeigte das Vorserum nur unspezifische Hintergrundreaktionen gegen Proteine von E. coli und Phagen ohne Inserts, während das Infektionsserum im Optimalfall spezifische Reaktionen gegen Phagenplaques präsentierte. Abb.20: Beispiel für die Infektionsspezifität beider dargestellter Phagenklone (Tier 5, Vorserum linke Membranhälften, Infektionsserum (14 d p.2.inf.) rechte Membranhälften). 99 Abb. 21: Tier 7, Beispiel eines infektionsspezifischen Phagenklons (deutlich stärkere Reaktion mit dem Infektionsserum 14 d p.2.inf. (rechte Membranhälfte) als mit dem Vorserum (linke Membranhälfte)) Abb. 21 Abb. 22a,b: Tier 2, zwei Beispiele für unspezifisch reagierende Phagenklone (Infektionsserum 14 d p.1.inf.: rechte Membranhälfte, Vorserum linke Membranhälfte) Abb. 22a Abb. 22b 100 E.2.4. Zusammenfassende Darstellung der durch das Screening der cDNABank isolierten Antigene Die cDNA der Klone wurde in Plasmide umkloniert und nach einem Aufreinigungsschritt isoliert. Im Folgenden wurde die Plasmid-DNA sequenziert. Die anschließende Auswertung der Sequenzdaten erbrachte, dass durch das Screening der cDNA-Expressionsbank insgesamt 36 verschiedene Antigene isoliert wurden. Darunter gab es 8 Antigene, auf die mehr als ein Tier Immunreaktionen zeigte (schattierte Felder der Tab. 18). Tab. 18: Auflistung der isolierten Antigene Antigen Tier 2 Tier 3 Tier 5 Acyl-CoA X AHP-1 X Aldolase Tier 7 X X Aspf 16 X X ATPase Myosin Bip A Tier 8 Tier 10 X X Bromo X Cation-Ex X Cholindehydrogenase Coatmer A X X Coatmer B X DNA-Helicase X DNAJ X Elongationsfaktor 1 X Enolase Erma X X X X Formatdehydrogenase X Histon H3 X X HSP 30 X HSP 70 HSP 90 hyptoth. Membranprotein X X X X X 101 Fortsetzung Tab. 18: Antigen Tier 2 Tier 3 Tier 5 Tier 7 Tier 8 Tier 10 hyptoth. Signalprotein X MCAP Methyltransferase1 X X MutL Myosin 2 X X N-Acetylglucosamindeacetylase X Nucl.Seggr. X PEP2 X X Phosphoglucomutase Pyruvatdecarboxylase RNA-Helicase X X X SMC X Transketolase Translationsinitiationsfaktor X X X 102 E.2.4.1 Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene Es wurden die Immunreaktionen der sechs Kaninchen, deren Seren aufgrund positiver Immunblots für das Screening der cDNA-Bank verwendet wurden (s. E.1.3), auf 12 der insgesamt 36 verschiedenen Antigene überprüft (s. D.3.1.6). Aus technischen Gründen wurden Antigene ausgewählt, die aufgrund der Sequenzdatenanalysen und Literaturrecherche als vorrangig interessant eingestuft wurden. In der Tabelle 19 repräsentieren die schattierten Kreuze die Antigene, die durch Screening der cDNA-Bank bei den einzelnen Tieren isoliert wurden (vgl. Tab. 17a) und hier zugleich als Positivkontrolle des Versuches dienten. Die nicht farbig unterlegten Kreuze stellen Immunreaktionen der Tiere auf Antigene dar, die nicht durch das Screening, sondern erst durch den Vergleich der Immunreaktionen ermittelt werden konnten. Mit Ausnahme von Tier 3 reagierten alle Tiere auf einige der ausgewählten Antigene. X X X X X X X X X Histon X Cation MCAP X Hyp.MP X X Erma 14 d p. inf. Enolase X HSP 30 HSP 70 X PEP2 HSP 90 2 Vorserum Serum AHP-1 Tier Aspf 16 Tab.19: Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene Vorserum 3 14 d p. inf. Vorserum 5 14 d p. 1. inf. X 14 d p. 2. inf. X X X X X X X X 14 d p. 1. inf. X 14 d p. 2. inf. X X X X Vorserum 8 X X Vorserum 7 X 14 d p. 1. inf. X 14 d p. 2. inf. X X X X X X Vorserum 10 14 d p. 1. inf. X X X X X 103 E.2.4.2 Darstellung der Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene Abb. 23: Beispielhaft sind die Immunreaktionen der Tiere 5 (14 d p.1.inf; linkes Membranviertel) und 10 (rechtes Membranviertel) auf ERMA dargestellt. Abb. 23: Immunreaktionen der Tiere auf ERMA Abb. 24: Das rechte Membranviertel repräsentiert die Immunreaktionen des Tieres 5 (14 d p. 1. inf.), das linke Membranviertel stellt die Immunreaktion des Kaninchens 7 (14 d p. 2. inf.) Abb. 24: Immunreaktionen der Tiere auf Enolase auf Enolase dar Auf dem Hintergrund der Membranen sind unspezifische Restreaktionen gegen E. coli-Proteine und Phagen ohne Aspergillus-cDNA-Inserts zu sehen. 104 E.2.5 Einordnung der Antigene Die insgesamt 36 identifizierten Antigene sind nach Gruppen sortiert dargestellt. So weit deren Funktion bekannt ist, ist diese ebenfalls angeführt. Tab. 20: Antigenfunktion und Anzahl der Tiere mit einer antigenspezifischen Immunantwort Anzahl Kaninchen mit Antigen Funktion antigenspezifischer Immunantwort Proteine mit Chaperonfunktion: 1. Heat Shock Proteine (HSP) Korrekte Faltung von HSP 90 Polypeptidketten; unter 3 HSP 70 Stress exprimierte Proteine 3 HSP 30 Bip A Unterstützen Funktion der 1 DNAJ HSPs 1 Antioxidatives Enzym 2 Aspartatprotease 1 2. AHP-1 1 Proteine mit Enzymfunktion: -Intrazellulär: PEP2 Enolase Transketolase Aldolase Phosphoglucomutase Glykogenstoffwechsel 2 Pyruvatdecarboxylase Alkohol. Gärung 2 Acyl-CoA Fettstoffwechsel 1 Cholindehydrogenase Proteinstoffwechsel 1 N-Acetylglucosamindeacetylase Funktion unbekannt 1 Translationsiniationsfaktor Elongationsfaktor Formatdehydrogenase 3 Glykolyse 1 1 Proteinsynthese 1 2 Oxidoreduktase 1 -intrazellulär (Zellkern): RNA-Helicase Entwindung der RNA 1 DNA-Helicase Entwindung der DNA 1 Methyltransferase Genregulation 1 MutL DNA-Repairenzym 1 Glucanase 2 -extrazellulär: Aspf 16 105 Fortsetzung Tab. 20 Anzahl Kaninchen mit Antigen Funktion antigenspezifischer Immunantwort Proteine mit bislang unbekannter oder teilweiser bekannter Funktion: Erma 3 Hypoth. Membranprotein 3 Hypoth. Signalprotein Cation-Ex 1 Nuccl. Segg. 1 Myosin 2 1 ATPase Myosin 1 SMC 1 Coatmer A und B Funktion unbekannt Vesikeltransport im GolgiApparat 1 Je 1 MCAP Funktion unbekannt 4 Bromo chromatinassoziiert 1 Histon Komponente Chromatinkomplex 2 106 E.2.6 Rekombinante Proteine Im Hinblick auf die Entwicklung eines Impfstoffes wurden bisher 3 der 12 mehrfach isolierten Antigene rekombinant hergestellt und aufgereinigt (s. D.3.7 f.). Die linke SDS-PAGE zeigt beispielhaft den in E. coli exprimierten C-terminalen Teil von HSP 90 vor und nach der Affinitätschromatographie, sowie nach der Einengung mittels Zentrifugalkonzentratoren. Das rechte Bild stellt die aufgearbeiteten rekombinanten Proteine dar. AHP-1 und Enolase liegen vollständig vor, das HSP 90 erreicht hier ein niedrigeres Molekulargewicht, weil nur der C-terminale Teil des Proteins rekombinant hergestellt wurde. kDa kDa 97 97 66 66 45 45 31 31 21 21 14 14 P vA nA nZ K P AHP-1 Enolase HSP 90 Abb. 25: Darstellung rekombinanter Proteine P Proteinstandard, Biorad-Marker Low vA vor Affinitätschromatographie nA nach Affinitätschromatographie nZ nach Zentrifugalkonzentration K Kontrolle, HSP 90 (M.Monod) 107 F Diskussion Aspergillus fumigatus ist ein fakultativ pathogener Schimmelpilz, der sowohl beim stark immunsupprimierten Menschen (insbesondere Leukämiepatienten, Empfänger von Organtransplantaten) als auch beim prädisponierten Tier invasive Mykosen verursachen kann. Die serologische Diagnostik der Erkrankung ist unsicher, Antikörpertests sind bei den oft schwach immunreaktiven Patienten wertlos (YOUNG u. BENETT 1971; RÜCHEL u. REICHARD 1999), der einzige auf dem Markt verfügbare kommerzielle Antigentest (Antigen-Doppel-Sandwich-ELISA) ist hinsichtlich Sensitivität und Spezifität deutlich eingeschränkt (STYNEN et al. 1995; SULAHIAN et al. 1996; PINEL et al. 2003). Häufig wird die Erkrankung daher erst sehr spät im Infektionsverlauf diagnostiziert und therapeutische Maßnahmen sind deshalb oftmals erfolglos (AISNER et al. 1977). Dementsprechend hoch ist die Letalität bei Patienten mit einer invasiven Aspergillose. Für die Entwicklung alternativer Tests besteht dringender Bedarf, Antigene von A. fumigatus, die während der Infektion exprimiert werden, zu identifizieren. Auch aus einem zweiten Grund sind solche Antigene interessant: Sie könnten als Impfstoff für prädisponierte Patienten dienen (STEVENS 2004), da man im Tierversuch festgestellt hat, dass eine überlebte Infektion bleibende Immunität induziert (LEHMANN u. WHITE 1976; DE REPENTIGNY et al. 1993; CENCI et al. 1999, 2000). Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation solcher infektionsrelevanter Antigene. Als Grundlage diente ein unter kontrollierten Infektionsbedingungen durchgeführtes Tiermodell einer invasiven Aspergillose, wobei Antigene nicht direkt, sondern mittels der gegen sie gerichteten humoralen Immunantwort des Wirtes identifiziert werden sollten. Durch extensives Screening einer Aspergillus-cDNA-Expressionsbank wurden 36 verschiedene Antigene identifiziert. Diese wurden mithilfe neuester Daten aus dem kurz vor dem Abschluss stehenden Aspergillus-Genomprojekt, Genen und Proteinen zugeordnet. Dies ist ein großer Fortschritt, wenn man bedenkt, dass die meisten bislang identifizierten Antigene von A. fumigatus lediglich anhand ihres Molekulargewichts im Western-Blot beschrieben wurden (LATGÉ 1999). Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene lassen sich in drei Gruppen, nämlich i) Proteine mit Enzymfunktion, ii) Proteine mit Chaperonfunktion, iii) Proteine mit bislang unbekannter Funktion, einteilen. Ausgewählte Antigene dieser Gruppen werden im Folgenden, besonders unter dem Gesichtspunkt ihrer möglichen Eignung als Vakzinekandidaten, diskutiert. An den Anfang dieser Diskussion, herausgelöst 108 aus der Gruppe mit Enzymfunktion, wurde das durch das Screening gefundene Aspf 16 gestellt. Unabhängig von dieser Arbeit konnte von BOZZA et al. (2002) kürzlich gezeigt werden, dass eine Verimpfung mit gerade diesem Antigen im Tierversuch tatsächlich Immunität gegen eine invasive Aspergillose vermittelt. Somit ein „proof of principle“ für den gesamten Ansatz dieser Arbeit, der die Bedeutung aller weiteren gefundenen Antigene unterstreicht. F.1 Aspf 16 Zwei von sechs Kaninchen zeigten Immunreaktionen gegen Aspf 16 (Tier 5 und 10). Interessanterweise wurde dieses 43 kDa-Antigen durch Screening einer cDNA-Bank mit Allergischen Bronchopulmonalen Aspergillose-Patientenseren isoliert und identifiziert (BANERJEE et al. 2001). Dem Aspf 16 wird eine bedeutsame Rolle sowohl in der humoralen als auch in der zellulären Immunantwort bei ABPAPatienten zugewiesen. So demonstrierten BANERJEE et al. (2001) Aspf 16spezifische Antikörper vom IgE-Typ bei ABPA-Patienten als auch eine Stimulation von peripheren mononukleären Blutzellen durch Aspf 16 in vitro. BOZZA et al. (2002) erreichte im Mausmodell durch Verimpfung des Aspf 16 in Kombination mit einem definierten unmethylierten CpG-Oligodeoxynukleotid (ODN), einem Adjuvans, welches durch Stimulierung von Toll-Rezeptor 9 eine zelluläre Immunantwort favorisiert, einen Schutz vor einer systemischen Aspergillose. Aspf 16 ist somit die bislang einzige Monosubstanz von A. fumigatus, mit der eine protektive Immunantwort induziert werden konnte. Bei dem Antigen handelt es sich von seiner biologischen Funktion wahrscheinlich um ein Enzym. Homologienvergleiche mit S. cerevisiae legen nahe, dass Aspf 16 eine putative GPI-verankerte Glucanase der Zellmembran, möglicherweise auch der Zellwand ist (BANERJEE et al. 2001). Denkbar ist, dass dieses Enzym aufgrund seiner peripheren Lokalisation ein leicht erreichbares Ziel für Immunantworten darstellt, seine Protektion-induzierenden Eigenschaften also über ein besseres „Erkennen“ der Pilzzelle durch das Immunsystem vermittelt werden. Dieser Mechanismus ließe sich modellhaft z. B. wie folgt erklären: Konidien werden von Alveolarmakrophagen phagozytiert. Sie produzieren nach kurzer Zeit in der fungiphoren Vakuole Aspf 16, was GPI-verankert an der Membran vorhanden ist. Die Pilzzelle transloziert den GPI-Anker in die Zellwand, ein Prozess, der bei Hefen beobachtet wurde (HAMADA et al. 1999). 109 Diese Translokation könnte durch enzymatische Aktivität der Wirtsvakuole gestört sein, sodass freies Aspf 16 in die Vakuole selbst gelangt und letztlich in Peptide zerlegt an der Oberfläche des Makrophagen über MHC-II-Moleküle präsentiert wird. Nun könnten bereits durch Immunisierung vorhandene TH-1-Lymphozyten diese Peptide spezifisch erkennen und den Makrophagen über Zytokine (insbesondere IL-2 und INFγ) aktivieren. Der so aktivierte Makrophage wird in die Lage versetzt, die Pilzzelle effizienter und früher abzutöten. Welche Bedeutung dem Aspf 16, beispielsweise in der Morphogenese des Pilzes zukommt, ist bis dato nicht bekannt. Sollte es eine essenzielle Bedeutung haben, ist es auch vorstellbar, dass durch die gerichtete Immunantwort des Wirtes das Wachstum des Pilzes unterbunden wird. Auch dieser Mechanismus könnte die Protektion-induzierende Wirkung des Antigens erklären. F.2 Weitere Antigene mit Enzymfunktion Durch das Screening der cDNA-Expressionsbank wurden neben dem wahrscheinlich extrazellulären Enzym Aspf 16 auch intrazelluläre Enzyme, Enolase, PEP2 und Elongationsfaktor 1, isoliert. Die von 3 Kaninchen (Tier 5, 7, 10) erkannte Enolase von A. fumigatus wurde erst kürzlich von LAI et al. (2002) beschrieben. Enolasen gelten als zytoplasmatische Enzyme, die an der Glykolyse beteiligt sind. Allerdings wiesen EROLES et al. (1997) auch die Präsenz von Enolase in der Zellwand von C. albicans in vivo nach. Sie vermuten, dass Enolase zwar primär zytoplasmatisch lokalisiert ist, aber über bislang noch unbekannte Sorting-Mechanismen auch aus der Zelle ausgeschleust und nicht-kovalent an die Zellwand gebunden werden kann. SUNDSTROM et al. (1994) zeigten, dass Enolase von C. albicans im Mausmodell einer systemischen Candidiasis sowohl eine humorale, als auch eine zelluläre Immunantwort auslöst. VAN DEVENTER et al. (1996) erzielten im Mausmodell einer systemischen Candidiasis durch die Verabreichung von Anti-Enolase-Antikörpern sogar einen partiellen Schutz gegen eine originär letale Infektion. Ob der Enolase von A. fumigatus eine ähnliche Bedeutung zukommt, muss durch weitere Untersuchungen ermittelt werden. Bei vergleichbaren Ergebnissen wäre hier nicht nur eine präventive, sondern durch die passive Übertragung von Immunglobulinen auch eine therapeutische Vakzinierungsstrategie denkbar. 110 Die Aspartatprotease PEP2 konnte durch die Immunreaktionen eines Tieres (Kaninchen 8) isoliert werden. Da dieses Enzym zwar wahrscheinlich primär vakuolär lokalisiert, unter bestimmten Umständen aber ebenfalls mit der Zellwand assoziiert zu sein scheint (REICHARD, pers. Mitteilung 2002) ist es denkbar, dass die Penetration des Wirtsgewebes durch Hyphen von A. fumigatus proteolytisch von PEP2 unterstützt und somit erleichtert wird. Protektive Immunreaktionen wären also auch hier, ähnlich wie für Aspf 16, sowohl auf einer funktionell-inhibierenden, als auch auf einer, die Erkennung fördernden Ebene, vorstellbar. Auf den Elongationsfaktor 1 reagierten zwei Tiere (3 und 10). Elongationsfaktoren sind an der Proteinsynthese beteiligte Enzyme, jedoch sind sie bei Mycobacterium leprae auch als Zelloberflächenproteine beschrieben worden (MARQUES et al. 1998). Bei Candida albicans fanden URBAN et al. (2003) einen Elongationsfaktor ebenfalls in der Zellwand. Sie vermuteten, dass das Enzym zwar primär intrazellulär lokalisiert ist, aber sekundär zusätzliche Funktionen in der Zellwand ausübt. Vorstellbar ist, dass Antigene mit solch einer peripheren Lokalisation für immunologische Antworten leicht zugänglich sind und protektive Eigenschaften über ein effizienteres „Erkennen“ der Pilzzelle durch das Immunsystem vermittelt werden. Interessanterweise konnten BERBERICH et al. (2003) in Mäusen durch die Verabreichung von Dendritischen Zellen, die mit einem Leishmanien-homologen Elongations-und Initiationsfaktors (LeIF) beladen waren, einen Schutz vor einer Leishmanien-Infektion bewirken. F.3 Proteine mit Chaperonfunktion Heat Shock Proteine (HSPs) sind intrazelluläre, molekulare Chaperone (Begleitproteine), die unter physiologischen Bedingungen für die korrekte Faltung von Polypeptidketten verantwortlich sind. Zudem verhindern sie die Aggregation von Proteinen (WALTER u. BUCHNER 2002). Die auch zytoprotektiven Moleküle werden unter Zellstress (Hitze, Sauerstoff- oder Nährstoffmangel, virale Infektionen usw.) überexprimiert (POCKLEY 2003). Durch das Screening der cDNA-Expressionsbank von A. fumigatus wurden bei vier von sechs Kaninchen HSPs unterschiedlichen Molekulargewichts (90, 70, 30 kDa) isoliert. Eine Immundominanz von Heat Shock 111 Proteinen wurde auch von anderen Autoren beschrieben. So wiesen beispielsweise BURNIE u. MATTHEWS (1991) Antikörper gegen HSP 90 von A. fumigatus in Seren von Patienten nach, die unter einer invasiven Aspergillose (IA) litten. Interessanterweise waren bei Patienten, bei denen die Erkrankung tödlich endete, keine Antikörper bzw. nur geringe Titer detektierbar. Bei Patienten, die die IA überstanden, zeigte sich hingegen, dass das Überleben mit ansteigenden HSP 90Antikörpertitern assoziiert war. Für Candida albicans wurde ein immundominantes 47 kDa-Protein beschrieben, welches einem Spaltprodukt von HSP 90 zugeordnet werden konnte (MATTHEWS u. BURNIE 1989). Diese Proteinkomponente rief bei Patienten mit systemischer Candidiasis starke Immunantworten hervor (MATTHEWS u. BURNIE 1989). Auch hier ließ sich bezüglich der Immunreaktion eine Korrelation zwischen dem Auftreten von Antikörpern gegen das Pilzantigen und dem Überleben einer Infektion zeigen (MATTHEWS u. BURNIE 1988; BURNIE u. MATTHEWS 1991). In dieser Arbeit reagierten 3 Tiere auf das HSP 90 (Tier 2,5,10). Das Kaninchen Nr. 5 bildete bereits nach der 1. Infektion Antikörper gegen HSP 90 und schien interessanterweise gegenüber höheren Infektionsdosen resistent zu sein. Möglicherweise hat die Immunreaktion auf Heat Shock Proteine der Erreger per se einen teilprotektiven Charakter, es ist aber auch vorstellbar, dass HSPs als „Adjuvantien“ für andere potenziell protektive Antigene eine Rolle spielen. In den letzten Jahren konnte durch Verimpfung von kovalent an HSPs gebundenen erregerbzw. tumorspezifischen Peptiden gezeigt werden, dass HSPs Immunantworten stimulieren: SUZUE u. YOUNG (1996a, b) zeigten, dass mykobakterielle Heat Shock Proteine (HSP 60 und 70) als immunogene Trägerproteine für erregerspezifische Moleküle, gegen die eine Immunantwort hervorgerufen werden sollte, geeignet waren. Durch die Verimpfung von HSP-Peptidkomplexen wurden sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induziert. Protektive Immunantworten beobachteten CIUPITU et al. (1998) nach einer Immunisierung von Mäusen mit einem viralen Peptid und HSP 70. Auch hier diente das Heat Shock Protein als Trägermolekül. Ebenfalls protektiv wirkte sich die Verimpfung von an HSP 70 gebundenen Sarkomzellen aus (CIUPITU et al. 2002). Eine tumorspezifische Immunität konnte auch durch die Immunisierung von Mäusen mit Tumorzellen und HSP 90 und gp 96 erzielt werden (SRIVASTAVA et al. 1986; UDONO u. SRIVASTAVA 1993; SRIVASTAVA u. UDONO 1994). Bei Histoplasma capsulatum, einem primär humanpathogenen Pilz, konnten von DEEPE u. GIBBONS (2002) 112 durch Verimpfung von HSP 60 ebenfalls protektive Immunantworten in Mäusen erzielt werden. Aufgrund ihrer immunologischen Eigenschaften, stehen HSPs im Mittelpunkt intensiver Forschung. Ihre potenzielle Eignung als Impfstoffkomponente bei Tumoren, Infektionskrankheiten und degenerativen Erkrankungen wird aktuell durch klinische Studien mit HSP-basierten Vakzinen evaluiert (MILANI et al. 2004). Als ein weiteres Antigen mit möglicher Chaperonfunktion wurde AHP-1 (Peroxiredoxin) identifiziert. Peroxiredoxine scheinen nicht nur Chaperone zu sein, sondern besitzen weitere Funktionen z. B. als antioxidative Enzyme und Regulatoren der Signaltransduktion (WOOD et al. 2003). Auf das, auch als Aspf 3 bekannte Molekül (HEMMANN et al. 1997), reagierten Tier 5 und 10. Da IgE-Antikörper von Asthma bronchiale-Patienten rekombinantes Aspf 3 erkannten, schlussfolgerten HEMMANN et al. (1997), dass das Protein ein wichtiges Allergen des Pilzes darstellt. CRAMERI et al. (1998) stellten ergänzend fest, dass das rAspf 3 IgEImmunantworten nicht nur bei Patienten induzierte, die unter allergischem Asthma bronchiale litten, sondern auch Patienten mit einer Allergischen Bronchopulmonalen Aspergillose (ABPA) Antikörper gegen das Protein bildeten. Inwieweit AHP-1 neben seiner Bedeutung als Allergen eine Rolle bei der invasiven Form der Aspergillose spielt, ist bislang unklar. Durch diese Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass Immunreaktionen gegen Aspf 3 auch frühzeitig im Verlauf einer invasiven Aspergillose auftreten und somit das Molekül während der Erkrankung wahrscheinlich in größeren Mengen exprimiert, und möglicherweise sogar aus der Zelle ausgeschleust wird. F.4 Proteine mit bislang unbekannter Funktion Für einige der durch diese Arbeit isolierten Antigene sind Funktion und Bedeutung bekannt bzw. werden aufgrund von Sequenzhomologien zu bekannten Proteinen vermutet (z.B. Aspf 16, Enolase, AHP-1 (vgl. Tab. 20). Eine Protektion-induzierende Wirkung konnte bislang nur für das Aspf 16 nachgewiesen werden. Für eine Reihe weiterer durch diese Arbeit identifizierten Antigene sind zur Zeit noch keine Daten über Funktionen erhältlich. Inwieweit diese Proteine aus immunologischer oder pathologischer Sicht von Interesse sind, können nur weiterführende Untersuchungen 113 zeigen. In jedem Fall soll auch ihre mögliche Eignung als Vakzinekandidaten in der Zukunft untersucht werden. Einige Autoren (DE REPENTIGNY et al. 1993; CENCI et al. 1999, 2000) zeigten, dass erworbene Immunität im Tiermodell einer IA primär durch TH-1-Zellen vermittelt wird. Zwar lassen sich einzelne Proteine auf ihre TH-1-Abwehr-induzierende Antigenität gut untersuchen, für einen Antigen-Screening-Ansatz eignet sich die zelluläre Immunreaktion im Gegensatz zur humoralen Immunreaktion jedoch kaum. Mit letzterer hingegen lassen sich z. B. aus kruden Proteingemischen nach Auftrennung immunreaktive Antigene selektieren (1D- und 2D-Immunblot). Wie hier angewendet, eignet sich die humorale Immunantwort im Gegensatz zur zellulären Reaktion auch zur Identifikation von reagierenden Phagenklonen, die Aspergillusspezifische Proteine, abgeleitet aus einer multigenetischen mRNA-Population, exprimieren (cDNA-Expressionsbankenscreening). Dabei ist die Wahrscheinlichkeit, mit einem Antikörper-Screening-Ansatz genau diejenigen Antigene zu identifizieren, die auch zelluläre Immunreaktionen induzieren, groß: Die Differenzierung einer TH-0Zelle zu einer TH-1 oder TH-2-Zelle ist u. a. abhängig von der über MHC-II präsentierten Peptidsequenz der Antigen-präsentierenden Zelle (Dendritische Zelle und Makrophagen). Allgemein gilt, dass die meisten Antigene (Proteine), die eine CD4-T-Zellantwort auslösen sowohl TH-1 als auch TH-2 Antworten hervorrufen. Dieses reflektiert die in den meisten Proteinen vorkommende Präsenz von mehreren verschiedenen Peptidsequenzen, die an MHC II binden und sequenzabhängig entweder eine TH-1 oder TH-2-Antwort auslösen (JANEWAY et al. 2001). Somit sollten die meisten Proteine, die durch ein Immunscreening mittels Antikörpern identifiziert werden, ebenso eine TH-1-Antwort auslösen. Gerade das in dieser Arbeit mit dem humoralen Screeningansatz gefundene Aspf 16 unterstützt diese Annahme, da es wie bereits erwähnt, in der Lage ist eine zelluläre protektive Immunreaktion auszulösen. Die meisten in dieser Arbeit identifizierten Antigene gelten als primär intrazelluläre Moleküle und bei kritischer Betrachtungsweise könnte angenommen werden, dass hier keine "infektionsrelevanten Antigene" identifiziert wurden, sondern lediglich eine Immunreaktion auf Bestandteile bereits abgestorbener und abgetöteter Pilzzellen untersucht wurde. Dieser Überlegung stehen jedoch beispielhaft die Erkenntnisse von EROLES et al. (1997) über die Präsenz von Enolase in der Zellwand von C. 114 albicans genauso entgegen, wie die Feststellungen von URBAN et al. (2003), die originär zytosolische Proteine von C. albicans auf der Zelloberfläche identifizierten. Es wurden, ähnlich wie in dieser Arbeit, eine Reihe verschiedenartiger Antigene isoliert, wobei interessanterweise deutliche Parallelen hinsichtlich der identifizierten Moleküle vorhanden sind. So identifizierten URBAN et al. (2003) auch Heat Shock Proteine (HSP 90 und 70) und Enzyme der Glykolyse. Des Weiteren wurde eine nicht näher charakterisierte Transketolase identifiziert. Auch in dieser Arbeit konnte eine Transketolase isoliert werden (Tier 3). Zudem fanden URBAN et al. (2003) auf der Zelloberfläche von C. albicans einen Elongationsfaktor. Dessen AspergillusHomologes wurde ebenfalls in dieser Arbeit gefunden. F.5 Tiermodell In dem Kaninchenmodell sollte bei 10 Tieren eine subletale, systemische invasive Aspergillose erzeugt werden. Das Tiermodell basierte auf einem von DE REPENTIGNY et al. (1991) beschriebenen Schema. Da die entsprechend infizierten Versuchstiere klinisch nicht symptomatisch wurden, wurde durch Erhöhung der Infektionsdosen von dem publizierten Schema abgewichen. Unterschiedliche klinische Reaktionen der Tiere auf eine Infektion könnten durch verschieden virulente A. fumigatus-Stämme begründet sein. Dass es differente Virulenzen von Wildtyp-, klinischen und Umweltisolaten von A. fumigatus gibt, ist durch Tierversuche erwiesen worden (KOTHARY et al. 1984; MONDON et al. 1996; SCHMIDT 2002). Ebenso ist denkbar, dass die Empfänglichkeit der Tiere für eine Infektion mit unterschiedlichen Aufzucht- und Haltungsbedingungen zusammenhängen könnte. Eine Exposition der Tiere mit A. fumigatus als ubiquitären Pilz bedingt wahrscheinlich eine höhere Resistenz gegenüber einer Erkrankung. Außerdem ist das Alter der Tiere für eine Empfänglichkeit bedeutend. CORBEL u. EADES (1977) fanden heraus, dass adulte Tiere höhere Infektionsdosen benötigen als junge Tiere. Diese Tatsache ist wahrscheinlich ebenfalls als Folge unterschiedlicher Exposition anzusehen. Bei den für diese Arbeit verwendeten immunsupprimierten Tieren wurden klinische Symptome nach angepasster Infektionsdosis insbesondere in Form von Gewichtsabnahme und Fieber beobachtet (Tier 2-10). Lediglich das nicht immunsupprimierte Tier (Tier 1) wies keine Anzeichen einer Erkrankung auf. Infektionskrankheiten äußern sich klinisch oft in Fieber und unspezifischen Allgemeinsymptomen wie bspw. Inappetenz und Störung des Allgemeinbefindens 115 (ROLLE u. MAYR 1993). Insgesamt wurden 7 der 10 Versuchstiere aufgrund der klinischen Symptomatik und der Reaktionen im Immunblot als erfolgreich infiziert beurteilt (Tier 2, 3, 5, 7-10). Von den 7 Tieren wurden 5 Kaninchen seziert, 2 Tiere (5, 8) erholten sich nach den Infektionen und wurden zur Beobachtung evtl. auftretender Spätfolgen der Erkrankung am Leben gelassen. Von den 5 obduzierten Kaninchen zeigten 4 Tiere (2, 7, 9, 10) pathologische Organveränderungen, die nachweislich durch A. fumigatus verursacht wurden. Übereinstimmend mit den Angaben anderer Autoren (DE REPENTIGNY et al. 1987; NIYO et al. 1988; DE REPENTIGNY et al. 1991; VISSIENNON et al. 1997) konzentrierten sich Veränderungen auf Lunge, Leber, Nieren und Milz. Die Beurteilung der Infektion wurde anhand mehrerer Kriterien vorgenommen und war entscheidend für die Auswahl der Tiere, mit deren Seren die Identifikation infektionsspezifischer Antigene durch das Screening der A. fumigatus-cDNA-Bank erfolgte. So wurden besonders klinische Symptomatik, Reaktionen im Immunblot vor und nach einer Infektion und das Sektionsergebnis bewertet. Eine Infektion wurde als positiv beurteilt, d.h., die Seren des infizierten Tieres waren für das Screening der cDNA-Expressionsbank geeignet, wenn sich im Immunblot Reaktionen auf extrahierte Zellwand- und intrazelluläre Proteine von A. fumigatus darstellten. Die Reaktionen auf Antigene von A. fumigatus vor bzw. nach einer Infektion wurden in ein- bzw. zweidimensionalen Immunblots gegenübergestellt. Reaktionen in den Vorseren reflektieren wahrscheinlich die Auseinandersetzung des Immunsystems der gesunden Kaninchen mit den ubiquitären Pilzsporen. In den Immunantworten nach der Infektion reagierten einige Kaninchen nach ähnlichem Muster, jedoch nicht identisch. Diese Gegebenheit erklären sich DE REPENTIGNY et al. (1991) damit, dass es genetische Unterschiede zwischen den Kaninchen gibt und diese dazu führen könnten, dass Epitope unterschiedlich immundominante Reaktionen auslösen. Der in der serologischen Diagnostik von A. fumigatus verwendete Antigen-DoppelSandwich-ELISA ist trotz deutlicher Einschränkungen hinsichtlich Sensitivität und Spezifität der einzige auf dem Markt kommerziell verfügbare Antigentest (STYNEN et al. 1995; SULAHIAN et al. 1996; PINEL et al. 2003). Vor- und Infektionsseren einiger Tiere wurden diesem Test unterzogen. Insgesamt wurde der PLATELIA AspergillusAg-ELISA mit Seren von 7 Tieren durchgeführt. Dabei reagierte er lediglich bei einem getesteten Infektionsserum (Tier 8), aber auch bei einem Vorserum (Tier 6) positiv. 116 Von falsch positiven Testergebnissen in Seren von nicht infizierten Kaninchen berichten auch HURST et al. (2000), die dem PLATELIA-Test eine Fehlerquote von ca. 50 % zuweisen. Die übrigen 5 Seren wurden negativ getestet. Darunter waren die Seren der Tiere 2, 7 und 10, deren invasive Aspergillosen einwandfrei durch die Sektion mit folgendem mikroskopischen Direktnachweis, als auch durch Kultur bestätigt wurden. Eingeschränkte Sensitivität und Spezifität des häufig kritisierten Antigentests können somit bestätigt werden. Die in dieser Arbeit verwendete cDNA-Bank wurde in vitro aus der mRNA von auskeimenden Konidien hergestellt, weil dieses Wachstumsstadium auch hinsichtlich des Infektionsgeschehens von besonderem Interesse ist. Es ist anzunehmen, dass die Proteinexpression in vivo wahrscheinlich nicht identisch ist mit der in vitro. Aus diesem Grund soll in der Arbeitsgruppe, in der diese Arbeit erfolgte, zukünftig das Screening der cDNA-Expressionsbank auf Basis der hier generierten Infektionsseren mit einem 2D-Gelelektrophorese-Ansatz komplementiert werden. Antigene aus verschiedenen Wachstumsphasen und Kulturbedingungen sollen durch 2 D-Immunblots dargestellt und aus parallel angefertigten, gefärbten Gelen isoliert werden. Mittels massenspektroskopischer Methoden (MALDI) und dem Vergleich der Spektren mit dem in Kürze komplett annotierten Genom von A. fumigatus sollen weitere Antigene identifiziert werden. Einige der in dieser Arbeit identifizierten Moleküle stehen aufgrund ihrer potenziellen Eignung als diagnostische Antigene oder Impfstoffkandidaten bereits im Mittelpunkt intensiver Forschung. Kandidaten für eine Vakzine oder neuartige diagnostische Tests werden in einem dieser Arbeit folgenden Projekt rekombinant hergestellt. Mit einigen Antigenen (HSP 90, AHP-1, Enolase) ist dies bereits geschehen. Im Anschluss sollen diese Proteine in einem Mausmodell der invasiven Aspergillose hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Induktion einer protektiven Immunantwort untersucht werden. 117 G Zusammenfassung Nicole Denikus (2004): Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ist der wichtigste Erreger invasiver Mykosen bei immunsupprimierten Patienten (Inzidenz bei Leukämiepatienten z. B. 5-25%). Trotz jüngster therapeutischer Fortschritte verläuft die systemische Aspergillose meistens tödlich. Natürliche Resistenz gegen Aspergillus wird zwar durch das angeborene Immunsystem vermittelt, jedoch wurde im Tierversuch erworbene Immunität nach einer systemischen Infektion festgestellt. Demzufolge sollten Antigene, die im Verlauf der Erkrankung exprimiert werden, eine spezifische und protektive Immunantwort hervorrufen. Die Identifikation solcher Antigene ist eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung von Impfstoffen für Risikopatienten. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein Kaninchenmodell einer subletalen Aspergillose etabliert. Von 6 Tieren wurden Infektionsseren für ein Screening einer Aspergillus-λ-Phagen-cDNA-Expressionsbank verwendet. Von mehr als 2 Millionen gescreenten Phagenplaques waren nur 180 reaktiv. Die cDNA aller Phagenklone wurde subkloniert und sequenziert. Ihre Analyse mithilfe des bislang vorläufig annotierten Aspergillus-Genoms erbrachte abzüglich Redundanz eine Gesamtzahl von 36 verschiedenen Antigenen. Eine geringe Anzahl wenn berücksichtigt wird, dass das Genom von Aspergillus etwa 10.000 Gene umfasst. Die meisten identifizierten Moleküle scheinen primär intrazellulär lokalisiert zu sein. So fanden sich z. B. verschiedene Heat Shock Proteine (HSPs), Enolase oder der Elongationsfaktor 1. Trotz ihrer intrazellulären Lokalisation zählen diese Antigene als wertvolle Vakzinekandidaten, denn bei anderen pathogenen Pilzen wie Candida albicans und Histoplasma capsulatum sind bereits ebenfalls Heat Shock Proteine (HSPs) und Enolase als immunitätsvermittelnde Antigene beschrieben worden. Außerdem konnte durch Verimpfung des homologen Elongationsfaktors-1 (EGF-1) bei Leishmanien eine protektive Immunantwort erzeugt werden. Zwei der in dieser Arbeit verwendeten Kaninchen zeigten starke Immunreaktionen gegen eine GPIverankerte Glucanase (Aspf 16), die vermutlich in der Zellmembran oder -wand lokalisiert ist. Interessanterweise ist dieses Antigen das bislang einzige Molekül von A. fumigatus, dem die Vermittlung einer protektiven Immunantwort im Mausmodell einer invasiven Aspergillose nachgewiesen werden konnte (BOZZA et al. 2002; Microbes and Infection 4, 1281-1290). Drei der hier identifizierten Antigene wurden bereits rekombinant in E. coli exprimiert. In Zukunft sollen weitere Antigene folgen. Ob sie sich als Impfstoffe gegen eine invasive Aspergillose eignen, soll in einem Mausmodell evaluiert werden. Bei Erfolg sind im Anschluss klinische Studien geplant. 118 H Summary Nicole Denikus (2004): Identification of antigens of A. fumigatus expressed during invasive mycosis Aspergillus fumigatus is the most important mould causing invasive mycosis in immunocompromised patients, e.g. suffering from leukemia, with incidence rates of 5 to 25%. Despite recent advances in treatment modalities, systemic aspergillosis still remains a mostly fatal disease in this patient population. Natural resistance against Aspergillus is mediated by the innate immune system. In addition, however, acquired immunity after systemic infection has been documented in animals. Thus, fungal antigens expressed in the course of the disease may elicit a specific, protective immune response. Identification of those antigens is a prerequisite for the development of vaccines envisioned to be offered to high risk patients. For this purpose, a rabbit model of sublethal aspergillosis was established. Sera of 6 rabbits were used to screen an Aspergillus -phage-cDNA-expression library. Screening more than 2 million phage plaques, only 180 plaques were detected as reactive, representing the cDNAs encoding 36 different antigens only, a comparably small number in respect to an anticipated 10 000 genes being present in the genome of Aspergillus. Among those antigens, the cDNAs of which were all subcloned into plasmids, sequenced and analysed according to a preliminary annotation of the unfinished A. fumigatus genome, most seem to have an intracellular location. However, in two other pathogenic fungi, Candida albicans and Histoplasma capsulatum a number of intracellular proteins, especially heat shock proteins (HSPs) and enolase conferred immunity in vaccination trials. In Leishmania, a human and animal parasite, the intracellular elongation factor 1 (EGF-1) was shown to elicit a protective immune response against the respective disease. Indeed, Aspergillus’ homologues of various HSPs, of the enolase and of EGF1 were identified as strongly reacting antigens by this investigation as well. In addition, a GPI-anchored, and thus presumably membrane or cell wall associated glucanase of A. fumigatus was detected as a strongly reacting antigen in the sera of two rabbits. Interestingly, this very antigen, up to now, is the first and only molecule which has recently been shown to mediate a protective immune response against invasive aspergillosis in mice (Bozza et al. 2002, Microbes and Infection 4, 1281-1290). Thus, most likely, other antigens identified by this investigation are also promising vaccine candidates. Three of them were already expressed recombinantly in Escherichia coli. Others will follow in future and will be tested in trials eventually with the aim to improve the overall prognosis of immunocompromised patients. 119 I Literaturverzeichnis AGUILAR, R. F. u. P. T. REDIG (1995): Diagnosis and treatment of avian aspergillosis. in: J. D. BONAGURA u. R. KIRK (Hrsg.): Current Veterinary Therapy. Small Animal Practice XII., Saunders, Philadelphia AISNER, J., P. H. WIERNIK u. S. C. SCHIMPFF (1977): Treatment of invasive aspergillosis: relation of early diagnosis and treatment to response. Ann. Intern. Med. 86 (5), 539-543 ALBELDA, S. M., G. H. TALBOT, S. L. GERSON, W. T. MILLER u. P. A. CASSILETH (1985): Pulmonary cavitation and massive hemoptysis in invasive pulmonary aspergillosis. Influence of bone marrow recovery in patients with acute leukemia. Am. Rev. Respir. Dis. 131, 115-120 ANDREWS, C. P. u. M. H. WEINER (1981): Immunodiagnosis of invasive pulmonary aspergillosis in rabbits. Fungal antigens detected by radioimmunoassay in bronchoalveolar lavage fluid. Am. Rev. Respir. Dis. 124, 60–64 ARRUDA, L. K., B. J. MANN u. M. D. CHAPMAN (1992): Selective expression of a major allergen and cytotoxin, Asp f1, in Aspergillus fumigatus. Implications for the immunopathogenesis of Aspergillus-related diseases. J. Immunol. 149, 3354–3359 BAIR, W. C., S. G. SIMPSON u. R. M. WINDINGSTAD (1988): Acute aspergillosis in mallards at Oahe Seep near Pierre, South Dakota. Prairie Naturalist 20 (3), 153-156 120 BANERJEE, B., V. P. KURUP, P. A. GREENBERGER, B. D. JOHNSON u. J. N. FINK (2001): Cloning and expression of Aspergillus fumigatus allergen Aspf 16 mediating both humoral and cell-mediated immunity in allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA). Clin. Exp. Allergy 31, 761-770 BARDANA, E. J. (1980): The clinical spectrum of aspergillosis. 2. Epidemiology, pathogenicity, infection in animals and immunology of Aspergillus. CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 13, 21-84 BEAUMONT, F. (1988): Clinical manifestations of pulmonary Aspergillus infections. Mycoses 31, 15-20 BEAUVAIS, A., M. MONOD, J. P. DEBEAUPUIS, M. DIAQUIN, H. KOBAYASHI u. J. P. LATGÉ (1997a): Biochemical and antigenic characterization of a new dipeptidyl-peptidase isolated from Aspergillus fumigatus. J. Biol. Chem. 272, 6238–6244 BEAUVAIS, A., M. MONOD, J. WYNIGER, J. P. DEBEAUPUIS, E. GROUZMANN, N. BRAKCH, J. SVAB, A. G. HOVANESSIAN u. J. P. LATGÉ (1997b): Dipeptidyl-peptidase IV secreted by Aspergillus fumigatus, a fungus pathogenic to humans. Infect. Immun. 67, 3042–3047 BERBERICH, C., J. R. RAMIREZ-PINEDA, C. HAMBRECHT, G. ALBER, Y. A. W. SKEIKY u. H. MOLL (2003): Dendritic Cell (DC)-bases protection against an intracellular pathogen is dependent upon DC-derived IL-12 and can be induced by moleculary defined antigens. J. Immunol. 170, 3171-3179 121 BERGHOFF, P. C. (1989): Kleine Heimtiere und ihre Erkrankungen. in: P. C. BERGHOFF (Hrsg.): Tierärztliche Heimtierpraxis 1 Verlag Parey, Berlin u. Hamburg BIRCH, M., G. ROBSON, D. LAW u. D. W. DENNING (1996): Evidence of multiple extracellular phospholipase activities of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 64, 751–755 BLEUL, U., A. POSPISCHIL, F. GERBER u. U. BRAUN (2002): Bronchopneumonie und Mastitis durch Aspergillus fumigatus bei einer Kuh. Tierärztl. Umsch. 57, 354 – 359 BODEY, G. P., B. BUELTMANN, W. DUGUID, D. GIBBS, H. HANAK, M. HOTCHI, G. MALL, P. MARTINO, F. MEUNIER u. S. MILLIKEN (1992): Fungal infections in cancer patients: an international autopsy survey. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11, 99-109 BODEY, G. P. u. S. VARTIVARIAN (1989): Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8, 413-437 BOZZA, S., R. GAZIANO, G. B. LIPFORD, C. MONTAGNOLI, A. BACCI, P. DI FRANCESCO, V. P. KURUP, H. WAGNER u. L. ROMANI (2002): Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Microbes and Infection 4, 1281-1290 BRAND, C. J., R. M. WINDINGSTAD, L. M. SIEGFRIED, R. M. DUNCAN u. R. M. COOK (1988): Avian morbidity and mortality from botulism, aspergillosis, salmonellosis at Jamaica Bay wildlife refuge, New York, USA. Colonial Waterbirds 11 (2), 284-292 122 BURNIE, J. P. u. R. C. MATTHEWS (1991): Heat shock protein 88 and Aspergillus infection. J. Clin. Microbiol. 29 (10), 2099-2106 BURR, E. W. (1981): Enzootic aspergillosis in wild red vented cockatoos in the Phillipines. Mycopathologia 73 (1), 21-28 CALERA, J. A., S. PARIS, M. MONOD, A. J. HAMILTON, J. P. DEBEAUPUIS, M. DIAQUIN, R. LOPEZ-MEDRANO, F. LEAL u. J. P. LATGÉ (1997): Cloning and disruption of the antigenic catalase gene of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 65, 4718–4724 CENCI, E., A. MENCACCI, A. BACCI, F. BISTONI, V. P. KURUP u. L. ROMANI (2000): T cell vaccination in mice with invasive pulmonary aspergillosis. J. Immunol. 165, 381-388 CENCI, E., A. MENCACCI, C. F. D'OSTIANI, C. MONTAGNOLI, A. BACCI, G. D. SERO, S. PERITO, F. BISTONI u. L. ROMANI (1998): Cytokine- and T-helper-dependent immunity in murine aspergillosis. Res. Immunol. 149, 445-453 CENCI, E., A. MENCACCI, G. DEL SERO, A. BACCI, C. MONTAGNOLI, C. F. D'OSTIANI, P. MOSCI, M. BACHMANN, F. BISTONI, M. KOPF u. L. ROMANI (1999): Interleukin-4 causes susceptibility to invasive pulmonary aspergillosis through suppression of protective type I responses. J. Infect. Dis. 180, 1957-1968 CENCI, E., S. PERITO, K. H. ENSSLE, P. MOSCI, J. P. LATGÉ, L. ROMANI u. F. BISTONI (1997): Th1 and Th2 cytokines in mice with invasive aspergillosis. Infect. Immun. 65, 564-570 123 CHU, H. W., J. M. WANG, M. BOUTET, L. P. BOULET u. M. LAVIOLETTE (1995): Increased expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in a murine model of pulmonary eosinophilia and high IgE level. Clin. Exp. Immunol. 100, 319-324 CHU, H. W., J. M. WANG, M. BOUTET, L. P. BOULET u. M. LAVIOLETTE (1996): Immunohistochemical detection of GM-CSF, Il-4 and Il-5 in a murine model of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Clin. Exp. Allergy 26, 461-468 CIUPITU, A.-M. T., M. PETERSSON, K. KONO, J. CHARO u. R. KIESSLING (2002): Immunization with heat shock protein 70 from mehylcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell responses. Cancer Immunol. Immunther. 51 (3), 163-170 CIUPITU, A.-M. T., M. PETERSSON, C. L. O’DONELL, K. WILLIAMS, S. JINDAL, R. KIESSLING u. R. M. WELSH (1998): Immunization with a lymphocytic choriomeningitis virus peptid mixed with heat shock protein 70 results in protective antiviral immunity and specific cytotoxic T lymphocytes. J. Exp. Med. 187 (5), 685-691 CLANCY, C. J., u. M. H. NGUYEN (1998): Acute community-acquired pneumonia due to Aspergillus in pesumably immunocompetent hosts: clues for recognition of a rare but fatal disease. Chest 114, 629-634 COCKRILL, B. A., u. C. A. HADES (1999): Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Annu. Rev. Med. 50, 303-316 COHEN, J., D. W. DENNING, M. A. VIVIANI u. EORTC INVASIVE FUNGAL INFECTIONS COOPERATIVE GROUP (1993): Epidemiology of invasive aspergillosis in european cancer centers. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12, 392-393 124 COLLES, C. M., u. W. R. COOK (1983): Carotid and cerebral angiography in the horse. Vet. Rec. 113 (21), 483 - 489 COOK, W. R., R. S. F. CAMPBELL u. C. DAWSON (1968): The pathology and aetiology of guttural pouch mycosis in the horse. Vet. Rec. 83, 422 - 428 CORBEL, M. J., u. S. M. EADES (1977): Examination of the effect of age and acquired immunity on the susceptibility of mice to infection with Aspergillus fumigatus. Mycopahtologia 60, 79-85 CRAMERI, R. (1998): Recombinant Aspergillus fumigatus allergens: from the nucleotide sequences to clinical applications. Int. Arch. Allergy Immunol. 115, 99–114 CRAMERI, R., S. HEMMANN, C. ISMAIL, G. MENZ u. K. BLASER (1998): Disease-specific recombinant allergens for the diagnosis of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Int. Immunol. 10 (8), 1211-1216 CRAMERI, R., S. HEMMANN, R. JAUSSI, C. ISMAIL, G. MENZ u. K. BLASER (1996): Humoral and cell-mediated autoimmunity in allergy to Aspergillus fumigatus. J. Exp. Med. 184, 265–270 DEBEAUPUIS, J. P., J. SARFATI, H. KOBAYASHI, D. G. BOUCIAS, P. I. GUMOWSKI, A. BEAUVAIS, S. PARIS, M. MONOD u. J. P. LATGÉ (1995): Antigens of Aspergillus fumigatus expressed during infection. Can. J. Bot. 73, 1087–1091 125 DEEPE, G. S. u. R. S. GIBBONS (2002): Cellular and molecular regulation of vaccination with Heat Shock Protein 60 from Histoplasma capsulatum. Infect. Immun. 70 (7), 3759-3767 DENNING, D. W. (1995): Issues in the management of invasive aspergillosis. Ann. Med. Interne. 146, 106-110 DENNING, D. W. (1996): Therapeutic outcome in invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 23, 608-615 DENNING, D. W. (1998): Invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26, 781-805 DENNING, D. W. (2000): Aspergillus species in: G. L. MANDELL, J. E. BENETT u. R. DOLIN (Hrsg.): Principles and Practice of Infectious Diseases. Churchill Livingstone, Philadelphia, London, Toronto, 2, 2674-2685 DENNING, D. W. (2002): Sequencing the Aspergillus fumigatus genome. Lanc. Inf. Dis. 2 (4), 251-253 DE REPENTIGNY, M. BOUSHIRA, L. STE-MARIE u. G. BOSISIO (1987): Detection of galactomannan antigenemia by enzyme immunoassay in experimental invasive aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 25 (5), 863-867 126 DE REPENTIGNY, L., E. KILANOWSKI, L. PEDNEAULT u. M. BOUSHIRA (1991): Immunoblot Analyses of the serologic response to Aspergillus fumigatus antigens in experimental invasive aspergillosis. J. Inf. Dis. 163, 1305-1311 DE REPENTIGNY, L., S. PETITBOIS, M. BOUSHIRA, E. MICHALISZYN, S. SENECHAL, N. GENDRON u. S. MONTPLAISIR (1993): Acquired immunity in experimental murine aspergillosis is mediated by macrophages. Infect. Immun. 61, 3791-3802 DIAMOND, R. D., R. KRZESICKI, B. EPSTEIN u. W. JAO (1978): Damage to hyphal forms of fungi by human leukocytes in vitro. A possible host defense mechanism in aspergillosis and mucormycosis. Am. J. Pathol. 91, 313-328 DIETZ, O. u. E. WIESNER (1982): Handbuch der Pferdekrankheiten für Wissenschaft und Praxis. VEB Fischer Verlag, Jena, S. 447-448 DIXON, D. M., A. POLAK u. T. J. WALSH (1989): Fungus dose-dependent primary pulmonary aspergillosis in immunosuppressed mice. Infect. Immun. 57, 1452-1456 DUPONT, B., M. HUBER, S. J. KIM u. J. E. BENNETT (1987): Galactomannan antigenemia and antigenuria in aspergillosis: studies in patients and experimentally infected rabbits. J. Infect. Dis. 155, 1–11 DYKSTRA, M. J., M. LOOMIS, K. REININGER, D. ZOMBECK u. T. FAUCETTE (1997): A comparison of sampling methods for airborne fungal spores during an outbreak of aspergillosis in the forest aviary of the North Carolina Zoological Park. J. Zoo. Wildl. Med. 28 (4), 454-463 127 EBINA, K., K. YOKOTA u. O. SAKAGUCHI (1983): Studies on toxin of Aspergillus fumigatus. XVI. Biological properties of Asp-hemolysin as a parasitic factor. Jpn. J. Med. Mycol. 24, 247-252 EICHNER, R. D., M. AL-SALMI, P. R. WOOD u. A. MÜLLBACHER (1986): The effects of gliotoxin upon macrophage function. Int. J. Immunopharmacol. 8, 789-797 EL-KHOULY, A. B., F. A. GADIR, D. D. CLUER u. G. W. MANEFIELD (1992): Aspergillosis in camels affected with a specific respiratory and enteric syndrome. Aust. Vet. J. 69 (8), 182-186 EROLES, P., M. SENTANDREU, M. VICTORIA ELORZA u. R. SENTANDREU (1997): The highly immunogenic enolase and Hsp70p are adventitious Candida albicans cell wall proteins. Microbiol. 143, 313-320 EUSTIS S. L., C. A. KIRKBRIDE, C. GATES u. L. D. HALEY (1981): Porcine abortions associated with Fungi, Actinomycetes, and Rhodococcus sp.. Vet. Pathol. 18 (5), 608-613 EYNARD, L. u. M. LAURIERE (1998): The combination of Indian ink staining with immunochemiluminescence detection allows precise identification of antigens on blots: application to the study of glycosylated barley storage proteins. Electrophoresis 19 (8-9), 1394-1396 FANDO, J. L., I. ALABA, C. ESCARMIS, J. L. FERNANDEZ-LUNA, E. MENDEZ u. M. SALINAS (1985): The mode of action of restrictocin and mitogillin on eucaryotic ribosomes. Inhibition of brain protein synthesis, cleavage and sequence of the ribosomal RNA fragment. Eur. J. Biochem. 149, 29–34 128 FAUCETTE, T. G., M. LOOMIS, K. REININGER, D. ZOMBECK, H. STOUT, C. PORTER u. M. J. DYKSTRA (1999): A Three-year study of viable airborne fungi in the North Carolina Zoological Park R. J. R. Nabisco Rocky Coast Alcid Exhibit. J. Zoo. Wildl. Med. 30 (1), 44-53 FERREIRO, J. A., B. A. CARLSON u. D. T. CODY, 3rd (1997): Paranasal sinus fungus balls. Head Neck 19, 481-486 FICK, R. B., Jr., R. A. ROBBINS, S. U. SQUIER, W. E. SCHODERBEK u. W. D. RUSS (1986): Complement activation in cystic fibrosis respiratory fluids: in vivo and in vitro generation of C5a and chemotactic activity. Pediatr. Res. 20, 1258-1268 FITZGERALD, S. D. u. P. G. MOISAN (1995): Mycotic rhinitis in an ostrich. Avian diseases 39, 194-196 FLACH, E. J., M. F. STEVENSON u. G. M. HENDERSON (1990): Aspergillosis in gentoo penguins (Pygoscelis papua) at Edinburgh Zoo, 1964 to 1988. Vet. Rec. 126 (4), 81-85 FREEMAN, D.E. (1999): Guttural pouch. in: J.A. AUER u. J.A. STICK (Hrsg.): Equine surgery. 2. Aufl. Verlag Saunders, Philadelphia, S. 368 – 376 FROSCO, M., T. CHASE u. J. D. MC MILLAN (1994): The effect of elastase-specific monoclonal and polyclonal antibodies on the virulence of Aspergillus fumigatus in immunocompromised mice. Mycopathologia 125, 65–76 129 FUCHS, H. W. (1994): Schimmelpilzinfektionen. in: K. WENDT, H. BOSTEDT, H. MILKE u. H. W. FUCHS (Hrsg.): Euter- und Gesäugekrankheiten. Verlag Fischer, Jena, S. 430 FUKUCHI, Y., T. KUMAGAI, K. EBINA u. K. YOKOTA (1996): Apolipoprotein B inhibits the hemolytic activity of Asp-hemolysin from Aspergillus fumigatus. Biol. Pharm. Bull. 19, 547–550 GEDEK, B. (1989): Endomykosen bei Tieren in: H. GEMEINHARDT (Hrsg.): Endomykosen. Verlag Fischer, Jena, S. 426-425 GOODLEY, J. M., Y. M. CLAYTON u. R. J. HAY (1994): Environmental sampling for aspergilli during building construction on a hospital site. J. Hosp. Infect. 26, 27-35 GRABNER, A. (1987): Diagnose und Therapie der Luftsackmykosen des Pferdes. Tierärztl. Praxis, Suppl. 2, 10 - 14 GREENE, C. E. (1998): Aspergillosis and penicilliosis. in: C. E. GREENE (Hrsg.): Infectious diseases of the dog and cat. Saunders, Philadelphia, S. 404 GREET, T. R. C. (1987): Outcome of treatment in 35 cases of guttural pouch mycosis. Equine Vet. J. 19 (5), 483 – 487 130 GROLL, A. H., P. M. SHAH, C. MENTZEL, M. SCHNEIDER, G. JUST-NUEBLING u. K. HUEBNER (1996): Trends in the postmortem epidemiology of invasive fungal infections at a university hospital. J. Infect. 33, 23-32 GUILLOT, J., J. SARFATI, X. RIBOT, H.E. JENSEN u. J.P. LATGÉ (1997): Detection of antibodies to Aspergillus fumigatus in serum of horses with mycosis of the auditory tube diverticulum (guttural pouch). Am. J. Vet. Res. 58, 1364-1366 HAMADA, K., H. TERASHIMA, M. ARISAWA, N. YABUKI u. K. KITADA (1999): Amino acid residues in the ω-minus region participate in cellular localisation of yeast glycosylphosphatidylinositol-attached proteins. J. Bacteriol. 181, 3886-3889 HAMILTON, A. J., M. D. HOLDOM u. R. J. HAY (1995): Specific recognition of purified Cu,Zn superoxide dismutase from Aspergillus fumigatus by immune human sera. J. Clin. Microbiol. 33, 495–496 HARVEY, C. E. u. J. A. O´BRIEN (1983): Nasal aspergillosis – penicillosis. in: R. W. KIRK (Hrsg.): Current Veterinary Therapy VIII. Saunders Philadelphia, S. 236-241 HASEGAWA, Y., T. NIKAI, K. OGAWA u. H. SUGIHARA (1999): The effect of an Aspergillus fumigatus derived elastolytic proteinase on human neutrophils. Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi 40, 235-238 HEARN, V. M., E. V. WILSON u. D. W. R. MACKENZIE (1992): Analysis of Aspergillus fumigatus catalases possessing antigenic activity. J. Med. Microbiol. 36, 61–67 131 HEBISAWA, A., A. KURASHIMA, H. NAGAI, H. KOMATSU, R. YONADA u. S. SAIKI (1997): Pathology of bronchopulmonary aspergillosis. Kekkaku 72, 109-118 HEIDENREICH, M. (1997): Birds of prey: medicine and management. Blackwell Sciene HEMMANN, S., K. BLASER u. R. CRAMERI (1997): Allergens of Aspergillus fumigatus and Candida boidinii share IgE-binding epitopes. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 1956-1962 HEMMANN, S., W. H. NIKOLAIZIK, M. H. SCHONI, K. BLASER u. R. CRAMERI (1998): Differential IgE recognition of recombinant Aspergillus fumigatus allergens by cystic fibrosis patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis or Aspergillus allergy. Eur. J. Immunol. 28, 1155–1160 HENDERSON, V. J. u. E. R. HIRVELA (1996): Emerging and reemerging microbial threats. Nosocomial fungal infections. Arch. Surg. 131, 330-337 HENDRICK, D. J., R. J. DAVIES, M. F. D`SOUZA u. J. PEPYS (1975): An analysis of skin prick test reactions in 656 asthmatic patients. Thorax 30, 2-8 HENNEQUIN, C. (1996): Epidemiology of invase mycoses. Experience of a university hospital center in Paris. Rev. Med. Interne. 17, 754-760 HILBERT, B. J., C. R. HUXTABLE u. A. J. BRIGHTON (1981): Erosion of the internal carotid artery and cranial nerve damage caused by guttural pouch mycosis in a horse. Austr. Vet. J. 57, 346 - 347 132 HOGAN, L. H., B. S. KLEIN u. S. M. LEVITZ (1996): Virulence factors of the medically important fungi. Clin. Microbiol. Rev. 9, 469–488 HOLDOM, M. D., R. J. HAY u. A. J. HAMILTON (1995): Purification, N-terminal amino acid sequence and partial characterization of a Cu,Zn superoxide dismutase from the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. Free Radical Res. 22, 519–531 HOLDOM, M. D., R. J. HAY u. A. J. HAMILTON (1996): The Cu,Zn superoxide dismutases of Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus: purification and biochemical comparison with the Aspergillus fumigatus Cu, Zn superoxide dismutase. Infect. Immun. 64, 3326–3332 HOSPENTHAL, D. R., K. J. KWON-CHUNG u. J. E. BENETT (1998): Concentrations of airborne Aspergillus compared to the incidence of invasive aspergillosis: lack of correlation. Med. Mycol. 36, 165-168 HURST, S. F., G. H. REYES, D. W. MC LAUGHLIN, E. REISS u. C. J. MORRISON (2000): Comparison of commercial latex agglutination and sandwich enzyme immunoassays with a competitive binding inhibition enzyme immunoassay for detection of antigenemia and antigenuria in a rabbit model of invasive aspergillosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7 (3), 477-485 IADAROLA, P., G. LUNGARELLA, P. A. MARTORANA, S. VIGLIO, M. GUGLIELMINETTI, E. KORZUS, M. GORRINI, E. CAVARRA, A. ROSSI, J. TRAVIS u. M. LUISETTI (1998): Lung injury and degradation of extracellular matrix components by Aspergillus fumigatus serine proteinase. Exp. Lung Res. 24, 233-251 133 IKEGAMI, Y., R. AMITANI, T. MURAYAMA, R. NAWADA, W. J. LEE, R. KAWANAMI u. F. KUZE (1998): Effects of alkaline protease or restrictocin deficient mutants of Aspergillus fumigatus on human poymorphnuclear leukocytes. Eur. Respir. J. 12, 607-611 JAHN, B., A. STUEBEN u. S. BHAKDI (1996): Colorimetric susceptibility menadione-augmented testing for Aspergillus fumigatus: 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 comparison of diphenyl-2H-tetrazolium bromide and alamar blue tests. J. Clin. Microbiol. 34, 2039-2041 JANEWAY, C. A., P. TRAVERS, M. WALPORT u. M. J. SCHLOMCHIK (2001): Immunobiology. Garland, New York, S. 395 JANTUNEN, E., P. RUUTU, L. NISKANEN, L. VOLIN, T. PARKKALI, P. KOUKILAKAHKOLA u. T. RUUTU (1997): Incidence and risk factors for invasive fungal infections in allogeneic BMT recipients. Bone Marrow Transplant 19, 801-808 JATON-OGAY, K., S. PARIS, M. HUERRE, M. QUADRONI, R. FALCHETTO, G. TOGNI, J. P. LATGÉ u. M. MONOD (1994): Cloning and disruption of the gene encoding an extracellular metalloprotease of Aspergillus fumigatus. Mol. Microbiol. 14, 917–928 JATON-OGAY, K., M. SUTER, R. CRAMERI, R. FALCHETTO, A. FATIH u. M. MONOD (1992): Nucleotide sequence of a genomic and a cDNA clone encoding an extracellular alkaline protease of Aspergillus fumigatus. FEMS Microbiol. Lett. 92, 163–168 134 JENSEN, H. E., A. ESPINOSA DE LOS MONTEROS u. L. CARRASCO (1996): Caprine mastitis due to aspergillosis and zygomycosis: a pathological and immunohisotchemical study. J. Comp. Pathol. 114 (2), 183-191 JEWKES, J., P. H. KAY, M. PANETH u. K. M. CITRON (1983): Pulmonary aspergilloma: analysis of prognosis in relation to haemoptysis and survey of treatment. Thorax 38, 572-578 KARAM, G. H. u. F. M. GRIFFIN (Jr.) (1986): Invasive pulmonary aspergillosis in nonimmunocompromised, nonneutropenic hosts. Rev. Infect. Dis. 8, 357-363 KARAS, A., J. R. HANKINS, S. ATTAR, J. E. MILLER u. J. S. McLAUGHLIN (1976): Pulmonary aspergillosis: an analysis of 41 patients. Ann. Thorac. Surg. 22, 1-7 KARIM M., M. ALAM, A. A. SHAH, R. AHMED u. H. SHEIKH (1997): Chronic invasive aspergillsis in apparently immunocompetent hosts. Clin. Infect. Dis. 24, 723-733 KAUFFMAN, H. F., J. F. TOMEE, M. A. VAN DE RIET, A. J. TIMMERMAN u. P. BORGER (2000): Protease-dependent activation of epithelial cells by fungal allergens leads to morphologic changes and cytokine production. J. Allergy Clin. Immunol. 105, 1185-1193 KERN, W., J. BRAESS, H. BERTZ, C. POTT, E. SCHLEYER, J. FINKE, R. RUCHEL u. W. HIDDEMANN (1998): Chronic systemic aspergillosis in a patient with acute myloid leukemia. Ann. Hematol. 76, 175-177 135 KHAN, Z. U., M. PAL, D. K. PALIWAL u. V. N. DAMODARAN (1977): Aspergillosis in imported penguins. Sabouraudia 15 (1), 43-45 KHOO, S. H. u. D. W. DENNING (1994): Invasive aspergillosis in patients with AIDS. Clin. Infect. Dis. 19 Suppl. 1, 41-48 KNUTSEN, A. P., K. R. MUELLER, A. D. LEVINE, B. CHOUHAN, P. S. HUTCHESON u. R. G. SLAVIN (1994): Asp f I CD4+ TH2-like T-cell lines in allergic bronchopulmonary aspergillosis. J. Allergy Clin. Immunol. 94, 215-221 KOHN, B., A. KITTNER, H. WERNER, S. SCHMITZ, R. RUDOLPH u. L. BRUNNBERG (2002): Nasale Aspergillose beim Hund – Diagnostik und Therapie. Kleintierpraxis 47 (7), 415-425 KOTHARY, M. H., T. J. CHASE u. J. D. MCMILLAN (1984): Correlation of elastase production by some strains of Aspergillus fumigatus with ability to cause pulmonary invasive aspergillosis in mice. Infect. Immun. 43, 320-329 KOZEL, T. R. (1996): Activation of the complement system by pathogenic fungi. Clin. Microbiol. Rev. 9, 34-46 KURUP, V. P., H. CHOI, P. S. MURALI u. R. L. COFFMAN (1994a): IgE and eosinophil regulation in a murine model of allergic aspergillosis. J. Leukoc. Biol. 56, 593-598 KURUP, V. P., G. GRUNIG, A. P. KNUTSEN u. P. S. MURALI (1998): Cytokines in allergic bronchopulmonary aspergillosis. Res. Immunol. 149, 466-477 136 KURUP, V. P., V. HARI, J. GUO, P. S. MURALI, A. RESNICK, M. KRISHNAN u. J. N. FINK (1996): Aspergillus fumigatus peptides differentially express Th1 and Th2 cytokines. Peptides 17, 183-190 KURUP, V. P., B. W. P. SEYMOUR, H. Y. CHOI u. R. L. COFFMAN (1994b): Particulate Aspergillus fumigatus antigens elicit a Th2 response in BALB/c mice. J. Allergy Clin. Immunol. 93, 1013-1020 KWONG-CHUNG, K. J., u. J. BENETT (1992): Aspergillosis. in: LEA & FEBIGER (Hrsg.): Medical Mycology. Lea & Ferbiger, Philadelphia, S. 201-247 LAEMMLI, U. K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 LAI, H. Y., M. F. TAM, R. B. TANG, H. CHOU, C. Y. CHANG, J. J. TSAI u. H. D. SHEN (2002): cDNA cloning and immunological characterization of a newly identified enolase allergen from Penicillium citrinum and Aspergillus fumigatus. Int. Arch. Allergy Immunol. 127 (3), 181-190 LAMY, B., u. J. DAVIES (1991): Isolation and nucleotide sequence of the Aspergillus restrictus gene coding for the ribonucleic toxin restrictocin and its expression in A. nidulans: the leader sequence protects producing strains from suicide. Nucleic Acids Res. 19, 1001–1006 LAMY, B., M. MOUTAOUAKIL, J. P. LATGÉ u. J. DAVIES (1991): Secretion of a potential virulence factor, a fungal ribonucleotoxin, during human aspergillosis infections. Mol. Microbiol. 5, 1811–1815 137 LATGÉ, J. P. (1999): Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12, 310-350 LATGÉ, J. P., H. KOBAYASHI, J. P. DEBEAUPUIS, M. DIAQUIN, J. SARFATI, J. M. WIERUSZESKI, E. PARRA, J. P. BOUCHARA u. B. FOURNET (1994b): Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan secreted by Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62, 5424–5433 LATGÉ, J. P., M. MOUTAOUAKIL, J. P. DEBEAUPUIS, J. P. BOUCHARA, K. HAYNES u. M. C. PRÉVOST (1991): The 18- kilodalton antigen secreted by Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 59, 2586-2594 LATGÉ, J. P., S. PARIS, J. SARFATI, J. P. DEBEAUPUIS, A. BEAUVAIS, K. JATON-OGAY u. M. MONOD (1997): Infectivity of Aspergillus fumigatus. in: H. VANDEN BOSSCHE, D. A. STEVENS u. F. C. ODDS (Hrsg.): Host- fungus interplay. National Foundation of Infectious Diseases, Bethesda, S. 99-110 LATGÉ, J. P., S. PARIS, J. SARFATI, J. P. DEBEAUPUIS u. M. MONOD (1994a): Exoantigens of Aspergillus fumigatus: serodiagnosis and virulence. in: K. A. POWELL, A. RENWICK u. J. F. PEBERDY (Hrsg.): The genus Aspergillus: from taxonomy and genetics to industrial application. Plenum Press London, S. 321-340 LEEMANN, W. u. E. SEIFERLE (1970): Mykosen des Luftsackes beim Pferd. Schweiz. Arch. Tierheilkd. 112 (12), 627-632 138 LEHMANN, P. F. u. E. REISS (1978): Invasive aspergillosis: antiserum for circulating antigen produced after immunization with serum from infected rabbits. Infect. Immun. 20, 570–572 LEHMANN, P. F., u. L. O. WHITE (1976): Acquired immunity to Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 13, 1296-1298 LEVITZ, S. M. u. R. D. DIAMOND (1985): Mechanisms of resistance of Aspergillus fumigatus Conidia to killing by neutrophils in vitro. J. Infect. Dis. 152, 33-42 LIN, S.-J., J. SCHRANZ u. S. TEUTSCH (2001): Aspergillosis Case-Fatality Rate: Systematic review of the literature. Clin. Inf. Dis. 32, 358-366 LONGBOTTOM, J. L. (1986): Antigens and allergens of Aspergillus fumigatus II. Their further identification and partial characterization of a major allergen (Ag 3). J. Allergy Clin. Immunol. 78, 18–24 LOPEZ-MEDRANO, R., M. C. OVEJERO, J. A. CALERA, P. PUENTE u. F. LEAL (1995): An immunodominant 90-kilodalton Aspergillus fumigatus antigen is the subunit of a catalase. Infect. Immun. 63, 4774–4780 MABEY, J. E., M. J. ANDERSON, P. F. GILES, C. J. MILLER, T. K. ATTWOOD, N. W. PATON, E. BORNBERG-BAUER, G. D. ROBSON, S. G. OLIVER u. D. W. DENNING (2004): CADRE: the Central Aspergillus DATA REpository. Nucl. Acids Res. 32, D410-D405 139 MARKS, S. L., E. H. STAUBER u. S. B. ERNSTROM (1994): Aspergillosis in an ostrich. JAVMA 204 (5), 784-785 MARQUES, M. A. M., S. CHITALE, P. J. BRENNAN u. M. C. V. PESSOLANI (1998): Mapping and identification of the major cell wall-associated components of Mycobacterium leprae. Infect. Immun. 66 (6) 2625-2631 MATTHEWS, R. u. J. BURNIE (1988): Diagnosis of systemic candidiasis by an enzyme-linked dot immunobinding assay for a circulating immunodominant, 47 -kilodalton antigen. J. Clin. Microbiol. 26, 459-463 MATTHEWS, R. u. J. BURNIE (1989): Cloning of a DNA sequence encoding a major fragment of the 47 kilodalton stress protein homologue of Candida albicans. FEMS Microbiol. Lett. 60, 25-30 MC LAUGHLIN, B. G., u. J. L. O’BRIEN (1986): Guttural pouch mycosis and mycotic encephalitis in a horse. Can. Vet. J. 27, 109 – 111 MC MILLAN, M. C. u. M. L. PETRAK (1989): Retrospective study of aspergillosis in pet birds. JAAV 3 (4), 211-215 MICHELI, P. A. (1729): Nova plantarum genera. Juxta tournefortii methodum disposita. Florence, 1729 aus: KWONG-CHUNG, K. J., u. J. BENETT (1992): Aspergillosis. in: LEA & FEBIGER (Hrsg.): Medical Mycology. Lea & Ferbiger, Philadelphia, S. 201-247 140 MILANI, V., M. ENDRES, M. C. KUPPNER, R. D. ISSELS u. E. NOESSNER (2004): Hitzeschockproteine, Immunkompetenz und Vakzinierung. Dtsch. Med. Wochenschr. 129, 31-35 MONDON, P., C. DE CHAMPS; A. DONADILLE, P. AMBROISE-THOMAS u. R. GRILLOT (1996): Variation in virulence of Aspergillus fumigatus strains in a murine model of invasive aspergillosis. J. Med. Microbiol. 45, 186-191 MONOD, M., A. FATIH, K. JATON-OGAY, S. PARIS u. J. P. LATGÉ (1995): The secreted proteases of pathogenic species of Aspergillus and their possible role in virulence. Can. J. Bot. 73, 1081–1086 MONOD, M., S. PARIS, D. SANGLARD, K. JATON-OGAY, J. BILLE u. J. P. LATGÉ (1993b): Isolation and characterization of a secreted metalloprotease of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 61, 4099–4104 MONOD, M., S. PARIS, J. SARFATI, K. JATON-OGAY, P. AVE u. J. P. LATGÉ (1993a): Virulence of alkaline protease-deficient mutants of Aspergillus fumigatus. FEMS Microbiol. Lett. 106, 39–46 MONOD, M., G. TOGNI, L. RAHALISON u. E. FRENK (1991): Isolation and characterization of an extracellular alkaline protease of Aspergillus fumigatus. J. Med. Microbiol. 35, 23–28 141 MOSER, M., G. MENZ, K. BLASER u. R. CRAMERI (1994): Recombinant expression and antigenic properties of a 32-kilodalton extracellular alkaline protease, representing a possible virulence factor from Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62, 936–942 MOUTAOUAKIL, M., M. MONOD, M. C. PRÉVOST, J. P. BOUCHARA, S. PARIS u. J. P. LATGÉ (1993): Identification of the 33-kDa alkaline protease of Aspergillus fumigatus in vitro and in vivo. J. Med. Microbiol. 39, 393–399 MÜLLBACHER, A. u. R. D. EICHNER (1984): Immunosuppression in vitro by a metabolite of a human pathogenic fungus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3835-3837 MÜLLBACHER, A., P. WARING u. R. D. EICHNER (1985): Identification of an agent in cultures of Aspergillus fumigatus displaying antiphagocytic and immunomodulating activity in vitro. J. Gen. Microbiol. 131, 1251-1258 MÜLLER, J. (1994): Epidemiology of deep-seated, domestic mycosis. Mycoses 37, 1-7 MYLONAKIS, E., T. F. BARLAM, T. FLANIGAN u. J. D. RICH (1998): Pulmonary aspergillosis and invasive disease in AIDS: review of 342 cases. Chest 114, 251-262 NAKEEB, S. M., B. BABUS u. A. Y. CLIFTON (1981): Aspergillosis in the Peruvian penguin (Spheniscus humboldti). J. Zoo Animal Med. 12 (2), 51-54 142 NIYO, K. A., J. L. RICHARD, Y. NIYO u. L. H. TIFFANY (1988): Pathologic, hematologic, and serologic changes in rabbits given T-2 mycotoxin orally and exposed to aerosols of Aspergillus fumigatus conidia. Am. J. Vet. Res. 49 (12), 2151-2160 ODDS, F. C. (1991): Potential for penetration of passive barriers to fungal invasion in humans. in: G. T. COLE u. H. C. HOCH (Hrsg.): The fungal spore and disease initiation in plants and animals. Plenum Press, New York, S. 287–295 OGLESBEE, B. L. (1997): Mycotic Diseases. in: R. B. ALTMAN, S. L. CLUBB, G. M. DORRESTEIN u. K. QUESENBERRY (Hrsg.): Avian medicine and surgery. Saunders, Philadelphia, S. 323-331 OHNESORGE B., F. GLITZ u. E. DEEGEN (1999): Lasertherapie von Luftsackmykosen des Pferdes. in: 51. BPT - Kongress 1999, Nürnberg, S. 195 PAGANO, L., P. RICCI, A. NOSARI, A. TONSO, M. BUELLI, M. MONTILLO, L. CUDILLO, A. CENACCHI, C. SAVIGNANA u. L. MELILLO (1995): Fatal haemoptysis in pulmonary filamentous mycosis: an underevaluated cause of death in patients with acute leukaemia in haematological complete remission. A retrospective study and review of the literature. Gimema Infection Program (Gruppo Italiano Malattie Ematologiche dell' Adulto). Br. J. Haematol. 89, 500-505 PAL, M. (1992): Disseminated Aspergillus terreus infection in caged pigeon. Mycopathologia 119 (3), 137-139 143 PARIS, S., M. MONOD, M. DIAQUIN, B. LAMY, L. K. ARRUDA, P. J. PUNT u. J. P. LATGÉ (1993): A transformant of Aspergillus fumigatus deficient in the antigenic cytotoxin ASPF1. FEMS Microbiol. Lett. 111, 31–36 PATEL, R., u. C. V. PAYA (1997): Infections in solid-organ transplant recipients. Clin. Microbiol. Rev. 10, 86-124 PATTERSON, T. F., A. W. FOTHERGILL u. M. G. RINALDI (1993): Efficacy of Itraconazole Solution in a rabbit model of invasive aspergillosis. Antimicrob. Agents Chemother. 37 (11), 2307-2310 PEPYS, J. (1969): Hypersensitivity diseases of the lungs due to fungi and organic dusts. Monogr. Allergy 4, 1-147 PERELMAN, B. u. E. S. KUTTIN (1992): Aspergillosis in ostriches. Avian Pathology 21, 159-163 PÉREZ, V., J. M. CORPA, J. F. GARCIA MARIN, J. J. ADURIZ u. H. E. JENSEN (1998): Mammary and systemic aspergillosis in dairy sheep. Vet. Pathol. 35, 235-240 PÉREZ, V., J. M. CORPA, J. F. GARCIA MARIN, J. J. ADURIZ u. H. E. JENSEN (1999): Generalized aspergillosis in dairy sheep. Zbl. Vet. Med. [B], 46 (9), 613-621 144 PINEL, C., H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, F. GARBAN, R. HAMIDFAR, P. AMBROISE-THOMAS u. R. GRILLOT (2003): Detection of circulating Aspergillus fumigatus galactomannan: value and limits of the Platelia Test for diagnosing invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 41 (5), 2184-2186 POCKLEY, G. (2003): Heat shock proteins as regulators of the immune response. The Lancet 362, 469-476 PODSTATZKY, L., P. WINTER, F. SCHILCHER u. M. BUCHACHER (1999): Mastitis durch Aspergillus fumigatus bei einem Rind. Wien. Tierärztl. Mschr. 86, 274-279 RANKIN, N. E. (1953): Disseminated aspergillosis and monoliasis associated with agranulocytosis and antibiotic therapy. Br. Med. J. 183, 918-919 RAPER, K. B. u. D.I. FENELL (1965): Aspergillus fumigatus group. in: K. B. RAPER u. D.I. FENELL (Hrsg.): The genus Aspergillus The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md., S. 238-268 REDIG, P. T. (1986): Mycotic infections of birds of prey. in: M. E. FOWLER (Hrsg.): Zoo and wild animal medicine. 2nd ed., Saunders, Philadelphia, 420-425 145 REDIG, P. T. (1997): Raptors. in: R. B. ALTMAN, S. L. CLUBB, G. M. DORRESTEIN u. K. QUESENBERRY (Hrsg.): Avian medicine and surgery. Saunders, Philadelphia REICHARD, U., S. BÜTTNER, H. EIFFERT, F. STAIB u. R. RÜCHEL (1990): Purification and characterization of an extracellular serine proteinase from Aspergillus fumigatus and its detection in tissue. J. Med. Microbiol. 33, 243–251 REICHARD, U., H. EIFFERT u. R. RÜCHEL (1994): Purification and characterization of an extracellular aspartic proteinase from Aspergillus fumigatus. J. Med. Vet. Mycol. 32, 427–436 REICHARD, U., M. MONOD, F. ODDS u. R. RÜCHEL (1997): Virulence of an aspergillopepsin-deficient mutant of Aspergillus fumigatus and evidence for another aspartic proteinase linked to the fungal cell wall. J. Med. Vet. Mycol. 35, 189–196 REIDARSON, T. H, J. H. HARRELL, M. G. RINALDI u. J. MC BAIN (1998): Bronchoscopic and serologic diagnosis of Aspergillus fumigatus pulmonary infection in a bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). J. Zoo. Wildl. Med. 29 (4), 451-455 REIDARSON, T. H. u. J. F. MC BAIN (1992): Diagnosis and treatment of aspergillosis in temperate penguins. Erkrg. Zootiere 34, 155-158 REISS, E. u. P. F. LEHMANN (1979): Galactomannan antigenemia in invasive aspergillosis. Infect. Immun. 25, 357–365 146 REISS, J. (1997): Schimmelpilze. 2. Aufl. Verlag Springer, Heidelberg RICHARD, J. L., J. R. THURSTON, R. C. CUTLIP u. A. C. PIER (1982): Vaccination studies of aspergillosis in turkeys: subcutaneous inoculation with several vaccine preparations followed by aerosol challenge exposure. Am. J. Vet. Res. 43, 488-492 RICHERSON, H. B., (1983): Hypersensitivity pneumonitis--pathology and pathogenesis. Clin. Rev. Allergy 1, 469-486 RIES , J.N. (1903) J. Comp. Path. 16, 383 (Abstr.): zit. in: COOK, W. R., R. S. F. CAMPBELL u. C. DAWSON (1968): The pathology and aetiology of guttural pouch mycosis in the horse. Vet. Rec. 83, 422 - 428 RITCHIE, B. W. (1990): Avian therapeutics. Proc. AAV 1990, 415-430 ROBERTSON, J., J. R. CALDWELL, J. R. CASTLE u. R. H. WALDMAN (1976): Evidence for the presence of components of the alternative (properdin) pathway of complement activation in respiratory secretions. J. Immunol. 117, 900-903 ROGERS, T. R. (1995): Epidemiology and control of nosocomial fungal infections. Curr. Opin. Infect. Dis. 8, 287-290 ROLLE, M., u. A. MAYR (1993): Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre 6. Aufl. Verlag Enke, Stuttgart, S. 500, 836-840 147 RUCHLEMER, R., A. M. YINNON u. C. HERSHKO (1996): Changes in the natural history of invasive pulmonary aspergillosis in neutropenic leukemic patients. Isr. J. Med. Sci. 32, 1089-1092 RUDOLPH, R. (1974): Rhinitis mycotica durch Aspergillus fumigatus Fresenius beim Hund- Diagnose und Differentialdiagnose unter besonderer Berücksichtigung des Röntgenbildes. Berl. Münch. tierärztl. Wochenschr. 86, 87-91 RÜCHEL, R. u. U. REICHARD (1999): Pathogenesis and clinical presentation of aspergillosis. Contrib. Microbiol. 2, 21-43 SALEZ, F., C. LAMBLIN u. B. WALLAERT (2000): Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Rev. Mal. Respir. 17, 265-278 SAMSON, R. A. (1999): The genus Aspergillus with special regard to the Aspergillus fumigatus group. Contrib. Microbiol. 2, 5-20 SAMSON, R. A. u. E. S. VAN-REENEN-HOEKSTRA (1988): Introduction to food-borne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baar, Delft, The Netherlands SAUGIER-VEBER, P., A. DEVERGIE, A. SULAHIAN, P. RIBAUD, F. TRAORE, H. BOURDEAU-ESPEROU, E. GLUCKMAN u. F. DEROUIN (1993): Epidemiology and diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis in bone marrow transplant patients: results of a 5 year retrospective study. Bone Marrow Transplant 12, 121-124 148 SCHÄLLIBAUM, M., J. NICOLET, H. KONIG (1980): Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus as causal agents of bovine mastitis. Sabouraudia 18 (1), 33-38 SCHAFFNER, A., (1994): Macrophage-Aspergillus interactions. Immunol. Ser. 60, 545-552 SCHAFFNER, A., C. E. DAVIS, T. SCHAFFNER, M. MARKERT, H. DOUGLAS u. A. I. BRAUDE (1986): In vitro susceptibility of fungi to killing by neutrophil granulocytes discriminates between pathogenicity and oppurtunism. J. Clin. Invest. 78, 511-524 SCHAFFNER, A., H. DOUGLAS u. A. BRAUDE (1982): Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphnuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J. Clin. Invest. 69, 617-631 SCHMIDT, A. (2002): Animal models of aspergillosis – also useful for vaccination strategies? Mycoses 45, 38-40 SCHMIDT, A., u. D.I. SCHMIDT (1999): J.B. Georg W. Fresenius and the Description of the Species Aspergillus fumigatus. Contrib. Microbiol. 2, 1-4 SCHNEEMANN, M. u. A. SCHAFFNER (1999): Host defense mechanism in Aspergillus fumigatus infections. Contrib. Microbiol. 2, 57-68 149 SCHØNHEYDER, H., (1987): Pathogenetic and serological aspects of pulmonary aspergillosis. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 51, 1-62 SEVERO, L. C., J. C. BOHRER, G. R. GEYER u. L. FERREIRO (1989): Invasive aspergillosis in an alpaca (Lama pacos). J. Med. Vet. Mycol. 27 (3), 193-195 SHARP, N. J. H. (1998): Canine nasal aspergillosis - penicilliosis. in: C. E. GREENE (Hrsg.): Infectious diseases of the dog and cat. Saunders, Philadelphia, S. 404-409 SHIBUYA, K., S. NAOE u. H. YAMAGUCHI (1999a): Animal models of A. fumigatus infections. Contrib. Microbiol. 2, 130-138 SHIBUYA, K., M. TAKAOKA, K. USHIDA, M. WAKAYAMA, H. YAMAGUCHI, K. TAKAHASHI, S. PARIS, J. P. LATGÉ u. S. NAOE (1999b): Histopathology of experimental invasive pulmonary aspergillosis in rats: pathological comparison of pulmonary lesions induced by specific virulent factor deficient mutants. Microb. Pathog. 27, 123-131 SIMPSON, V. R. u. P. R. EUDEN (1991): Aspergillosis in parrots. Vet. Rec. 128 (8), 191-192 SMITH, J. M., J. E. DAVIES u. D. W. HOLDEN (1993): Construction and pathogenicity of Aspergillus fumigatus mutants that do not produce the ribotoxin restrictocin. Mol. Microbiol. 9, 1071–1077 150 SMITH, J. M., C. M. TANG, S. VAN NOORDEN u. D. W. HOLDEN (1994): Virulence of Aspergillus fumigatus double mutants lacking restrictocin and an alkaline protease in a low-dose model of invasive pulmonary aspergillosis. Infect. Immun. 62, 5247-5254 SRIVASTAVA, P. K., A. B. DELEO u. L. J. OLD (1986): Tumor rejection antigens of chemically induces sarcomas in inbred mice. Proc. Natl. Aca. Sci. USA 83, 3407-3411 SRIVASTAVA, P. K. u. H. UDONO (1994): Heat shock protein-peptide complexes in cancer immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 6, 728-732 STAIB, F., S. K. MISHRA, C. RAJENDRAN, R. VOIGT, J. STEFFEN, K. H. NEUMANN, C. A. HARTMANN u. G. HEINS (1980): A notable Aspergillus from a mortal aspergilloma of the lung. New aspects of the epidemiology, serodiagnosis and taxonomy of Aspergillus fumigatus. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. [A] 247, 530-536 STEPHAN, R., D. SENCZEK, CH. MÜLLER u. CH. FEUSI (2000): Isolierung von Listeria spp. und Aspergillus fumigatus- zwei Fallberichte aus der Mastitisdiagnostik. Schweiz. Arch. Tierheilk. 142 (7), 387-390 STEVENS, D. A. (2004): Vaccinate against aspergillosis! A call to arms of the immune system. Clin. Inf. Dis. 38, 1131-1136 STURTEVANT, J. E., u. J. P. LATGÉ (1992): Participation of complement in the phagocytosis of the conidia of Aspergillus fumigatus by human polymorphnuclear cells. J. Infect. Dis. 166, 580-586 151 STYNEN, D., A. GORIS, J. SARFATI u. J. P. LATGÉ (1995): A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with invasive aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33, 497–500 SULAHIAN, A., M. TABOURET, P. RIBAUD, J. SARFATI, E. GLUCKMAN, J. P. LATGÉ u. F. DEROUIN (1996): Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of invasive aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 139–145 SUNDSTROM, P., J. JENSEN u. E. BALISH (1994): Humoral and cellular immune responses to enolase after alimentary tract colonization or intravenous immunization with Candida albicans. J. Infect. Dis. 170 (2), 390-395 SUTTON, P., N. R. NEWCOMBE, P. WARING u. A. MÜLLBACHER (1994): In vivo immunosuppressive activity of gliotoxin, a metabolite produced by human pathogenic fungi. Infect. Immun. 62, 1192-1198 SUTTON, P., P. WARING u. A. MÜLLBACHER (1996): Exacerbation of invasive aspergillosis by the immunosuppressive fungal metabolite, gliotoxin. Immunol. Cell Biol. 74, 318-322 SUZUE, K. u. R. A. YOUNG (1996a): Heat Shock proteins as immunological carriers and vaccines. EXS. 77, 451-465 SUZUE, K. u. R. A. YOUNG (1996b): Adjuvant-free hsp 70 fusion protein system elicits humoral and cellular immune responses to HIV-1 p24. J. Immunol. 156 (2), 873-879 152 TANG, C. M., J. COHEN u. D. W. HOLDEN (1992): An Aspergillus fumigatus alkaline protease mutant constructed by gene disruption is deficient in extracellular elastase activity. Mol. Microbiol. 6, 1663–1671 TANG, C. M., J. COHEN, T. KRAUSZ, S. VAN NOORDEN u. D. W. HOLDEN (1993): The alkaline protease of Aspergillus fumigatus is not a virulence determinant in two murine models of invasive pulmonary aspergillosis. Infect. Immun. 61, 1650-1656 THAU, N., M. MONOD, B. CRESTANI, C. ROLLAND, G. TRONCHIN, J. P. LATGÉ u. S. PARIS (1994): Rodletless mutants of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62, 4380-4388 TOMEE, J. F., A. T. WIERENGA, P. S. HIEMSTRA u. H. K. KAUFFMAN (1997): Proteases from Aspergillus fumigatus induce release of proinflammatory cytokines and cell detachment in airway epithelial cell lines. J. Infect. Dis. 176, 300-303 TOWBIN, H., T. STAEHELIN u. J. GORDON (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 76, 4350-4354 TRONCHIN, G., K. ESNAULT, G. RENIER, R. FILMON, D. CHABASSE u. J. P. BOUCHARA (1997): Expression and identification of laminin-binding protein in Aspergillus fumigatus conidia. Infect. Immun. 65, 9-15 153 TSAI, H. F., R. G. WASHBURN, Y. C. WANG u. K. J. KWON-CHUNG (1997): Aspergillus fumigatus arp1 modulates conidial pigmentation and complement deposition. Mol. Microbiol. 26, 175-183 UDONO, H. u. P. K. SRIVASTAVA (1993): Heat shock protein 70-associated peptides elicit specific cancer immunity. J. Exp. Med. 178, 1391-1396 URBAN, C., K. SOHN, F. LOTTSPEICH, H. BRUNNER u. S. RUPP (2003): Identification of cell surface determinants in Candida albicans reveals Tsa1p, a protein differentially localized in the cell. FEBS Letters 544, 228-235 VAN DE GRAAF, E. A., H. M. JANSEN, M. M. BAKKER, C. ALBERTS, J. K. EEFTINCK SCHATTENKERK u. T. A. OUT (1992): ELISA of complement C3a in bronchoalveolar lavage fluid. J. Immunol. Methods 147, 241-250 VAN DER HEYDEN, N. (1993): Aspergillosis in psittacine chicks. Proc. AAV 1993, 207-212 VAN DEVENTER, H. J., W. H. GOESSENS, A. J. VAN VLIET u. H. A. VERBRUGH (1996): Anti-enolase antibodies partially protective against systemic candidiasis in mice. Clin. Microbiol. Infect. 2 (1), 36-43 VAUGHAN, L. M. (1993): Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Clin. Pharm. 12, 24-33 154 VISSIENNON, T., M. A. GORDON, B. BRESLIN, C. CSIZA u. K. BERGMANN (1997): Case report: Pathomorphology of an experimental disseminated Aspergillus fumigatus infection in rabbits. Berl. Münch. tierärztl. Wochenschr. 110, 12-14 WAKAYAMA, M., K. SHIBUYA, T. ANDO, K. TAKAHASHI, T. OHARASEKI, S. NAOE u. W. F. COULSON (2000): Deep-seated mycosis in patients with solid-organ transplantation--a study of autopsied cases in the United States. Kansenshogaku Zasshi 74, 378-386 WALD, A., W. LEISENRING, J. A. VAN BURIK u. R. A. BOWDEN (1997): Epidemiology of Aspergillus infections in a large cohort of patients undergoing bone marrow transplantation. J. Infect. Dis. 175, 1459-1466 WALSER, K. u. E. KLEINSCHROTH (1979): Über einige Fälle von Aspergillus-Mastitiden beim Rind. Berl. Münch. tierärztl. Wochenschr. 92, 129-131 WALTER, S. u. J. BUCHNER (2002): Molecular chaperones-cellular machines for protein folding. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 1098-1113 WANG, J. M., M. DENIS, M. FOURNIER u. M. LAVIOLETTE (1994): Experimental allergic bronchopulmonary aspergillosis in the mouse: immunological and histological features. Scand. J. Immunol. 39, 19-26 WIESNER, E. (1988): Kompendium der Heimtierkrankheiten. Verlag Fischer, Stuttgart, S. 16 155 WEILER, H., F. STAIB, H. KELLER u. W. STÄCKER (1991): Luftsackmykose beim Pferd, ein Beitrag zur Pathologie und Ätiologie. Pferdeheilkunde 7, 179 - 187 WOITAS, R. P., J. K. ROCKSTROH, A. THEISEN, C. LEUTNER, T. SAUERBRUCH u. U. SPENGLER (1998): Changing role of invasive aspergillosis in AIDS--a case control study. J. Infect. 37, 116-122 WOOD, Z. A., E. SCHRÖDER, J. R. HARRIS u. L. B. POOLE (2003): Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. TRENDS Biochem. Sci. 28 (1), 32-40 YANG, R. u. W. R. KENEALY (1992): Effects of amino-terminal extensions and specific mutations on the activity of restrictocin. J. Biol. Chem. 267, 16801–16805 YOKOTA, K., S. ICHINOWATARI, K. EBINA u. N. WAKABAYASHI (1985): Studies on toxin of Aspergillus fumigatus. XXI. Site of binding of Asp-hemolysin to erythrocytes and mechanism of inhibition of hemolysis. Jpn. J. Med. Mycol. 26, 70–73. YOKOTA, T., T. SHIBAHARA, Y. WADA, R. HIRAKI, Y. ISHIKAWA u. K. KADOTA (2004): Aspergillus fumigatus Infection in an Ostrich (Struthio camelus). J. Vet. Med. Sci. 66 (2), 201-204 YOUNG, R. C. u. J. E. BENNETT (1971): Invasive aspergillosis: absence of detectable antibody response. Am. Rev. Respir. Dis. 104, 710–716 156 YOUNG, R. C., J. E. BENNETT, C. L. VOGEL, P. P. CARBONE u. V. T. DE VITA (1970): Aspergillosis. The spectrum of the disease in 98 patients. Medicine (Baltimore) 49, 147-173 ZIEMER, P. (2001): Aspergillose bei Papageien. Papageien 10, 339-340 ZINKL, J. G., J. M. HYLAND u. J. J. HURT (1977): Aspergillosis in common crows in Nebraska, 1974. J. Wildl. Dis. 13 (2), 191-193 157 J Anhang J.1 Geräte Axioskop 50 Blockthermostat, Thermomixer 5436 Blotkammer TE SERIES TRANSPHOR ELECTROPHORESIS UNIT Brutschrank DALT-Gelelektrophorese-Tank mit Multitemp III-Kühlung und Hoefer EPS- Fa. Zeiss, Jena Fa. Eppendorf, Hamburg Hoefer, San Francisco, USA Fa. Memmert, Schwabach Hoefer, San Francisco, USA Spannungsgeber 2 D-Gelelektrophorsekammer, vertikal Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden Durchlichttisch Fa. Vilber Lourmat, Marne-La-Vallee Cedex 1 , Frankreich ElectroCell Manipulator 600 Elektrophoresegerät, Electrophoresis Power Supply EPS 500/400 Gefriertrocknungsanlage Fa. BTX Electroporation System Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden Fa. Edwards, Kniese & Co. Hochvakuum GmbH, Marburg IPGphor-Einheit pH-Meter CG, 804 Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala, Schwed. Fa. Schott, Hofheim a. Ts. Photometer Ultrospec 1000 Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala, Schwed. Schüttelgerät Duomax 1030 Fa. Heidolph Tischzentrifuge Eppendorf 5415 D Überkopfschüttler, test- tube- rotator 34528 UV Crosslinker UV C 500 Wasserbad Fa. Eppendorf, Hamburg Fa. Snijders Scientific, Tilburg, Holland Hoefer, San Francisco, USA Fa. GFL, Hannover Kühleinheit MGW RM 6 Fa. Lauda, Königshofen Zentrifuge, Digifuge GL Fa. Heraeus, Osterode Zentrifuge mit Kühlfunktion Fa. Heraeus, Osterode 158 J.2 Verbrauchsmaterial Bottle-Top-Filter (Porengrösse 0,22 µm) CORNING, New York, USA Polystyrolgefäße, 50 ml GREINER bio-one, Solingen Polystyrolgefäße, 13 ml GREINER bio-one, Solingen Sterilfilter (0,2 µm) Zentrifugalkonzentratoren (Vivaspin 20, CORNING, New York, USA VIVASCIENCE, Hannover 10,000 kD) Glasperlen (0,45-0,5 mm) Eppendorfreagenzgefäße (0,5-2,0 ml) Plastikküvetten BRAUN, Melsungen EPPENDORF, Hamburg MBT, Gießen IPG-Streifen, pH 4-5; 4-7, 18 cm AMERSHAM, Buckinghamshire, GB Immobiline Drystrip Cover Fluid AMERSHAM, Buckinghamshire, GB Nitrozellulose-Membranen, SCHLEICHER & SCHUELL, Dassel Protran BA 83 0,2 µm; 82 mm Nitrozellulose-Membranen, SCHLEICHER & SCHUELL, Dassel Protran BA 83 0,2 µm; 102 x 103 mm Pelikantusche Schwarz, Nr. 17 Magermilchpulver (Sucofin®) ECL-System Kodax Biomax Light Film PELIKAN, Hannover TSI, Zeven AMERSHAM, Buckinghamshire, GB EASTMAN KODAK COMPANY, New York Einmal-Injektionskanülen BRAUN, Melsungen ® (Sterican ,Gr.1; 20 G x 1,5") 159 J.3 Chemikalien Acrylamid Bestellnr. 7906.2 Agarose Bestellnr. 840.004 BIOZYM, Hess. Old.dorf Ammoniumsulfat Bestellnr. 101216 MERCK, Darmstadt Ammoniumtartrat Bestellnr. A 4767 SIGMA, Deisenhofen Ampicillin Bestellnr. A 9393 SIGMA, Deisenhofen APS (Ammoniumperoxodisulfat) Bestellnr. 101200 MERCK, Darmstadt Bacto®-Tryptone Bestellnr. 0123179 DIFCO, Augsburg Bacto -Yeast extract Bestellnr. 0127179 DIFCO, Augsburg Bisacrylamid Bestellnr. 7867.1 ROTH, Karlsruhe Bioquant Protein Reagenzlösung Bestellnr. 110306 MERCK, Darmstadt Bromphenolblau Bestellnr. B 0126 SIGMA, Deisenhofen Butanol, wassergesättigt Bestellnr. 109630 MERCK, Darmstadt Calciumchlorid Bestellnr. 102378 MERCK, Darmstadt CHAPS Bestellnr. 1703801 SERVA, Heidelberg Chloroform Bestellnr. 102445 MERCK, Darmstadt Coomassie Brillant Blau G 250 Bestellnr. 102082 MERCK, Darmstadt Coomassie Brillant Blau R 250 Bestellnr. 102085 MERCK, Darmstadt Cortisonacetat Bestellnr. C 3130 SIGMA, Deisenhofen Dodecylsulfat Natriumsalz (SDS) Bestellnr. 113760 MERCK, Darmstadt DTT (1,4 Dithiothreitol) Bestellnr. 111474 MERCK, Darmstadt Dinatrium-EDTA Bestellnr. 108418 MERCK, Darmstadt Essigsäure Bestellnr. 100062 MERCK, Darmstadt Ethanol Bestellnr. 100983 MERCK, Darmstadt Formaldehyd Bestellnr. 104003 MERCK, Darmstadt Gelatine Bestellnr. 104070 MERCK, Darmstadt ® ROTH, Karlsruhe 160 D-(+)-Glucose-Monohydrat Bestellnr. 108342 MERCK, Darmstadt Glutaraldehyd Bestellnr. 104239 MERCK, Darmstadt Glycerol Bestellnr. 104091 MERCK, Darmstadt Glycin Bestellnr. 104201 MERCK, Darmstadt Guanidine-Hydrochlorid Bestellnr. 0035.1 ROTH, Karlsruhe Harnstoff Bestellnr. 108487 MERCK, Darmstadt Isopropanol Bestellnr. 109634 MERCK, Darmstadt IPTG (Isopropyl--D-thiogalactosid) Bestellnr. 37-2020 PEQLAB, Erlangen Kaliumdihydrogenphosphat Bestellnr. 104877 MERCK, Darmstadt Kaliumchlorid Bestellnr. 104936 MERCK, Darmstadt Kanamycin Bestellnr. 46356 Magnesiumsulfat Bestellnr. 106067 MERCK, Darmstadt Magnesiumsulfat-Heptahydrat Bestellnr. 105886 MERCK, Darmstadt Maltose Bestellnr. 105910 MERCK, Darmstadt 2-Mercaptoethanol Bestellnr. 805740 MERCK, Darmstadt Methanol Bestellnr. 106009 MERCK, Darmstadt Natriumacetat Bestellnr. 106268 MERCK, Darmstadt Natriumazid Bestellnr. 106687 MERCK, Darmstadt Natriumcarbonat Bestellnr. 106392 MERCK, Darmstadt Natriumchlorid Bestellnr. 106404 MERCK, Darmstadt Natriumhydrogenphosphat Bestellnr. 106586 MERCK, Darmstadt Natriumhydroxid Plätzchen Bestellnr. 106462 MERCK, Darmstadt PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) Bestellnr. P 7626 SIGMA, Deisenhofen Saccharose Bestellnr. 107651 MERCK, Darmstadt Salzsäure Bestellnr. 100317 MERCK, Darmstadt Silbernitrat Bestellnr. 101512 MERCK, Darmstadt Stickstoff, flüssig ohne Bestellnr. SIGMA, Deisenhofen MESSER GRIESHEIM, Krefeld 161 TEMED (N, N, N´, N´- Bestellnr. 110732 MERCK, Darmstadt Tri(hydroxymethyl)aminomethan Bestellnr. 108382 MERCK, Darmstadt Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Bestellnr. 106446 MERCK, Darmstadt Tween 20 Bestellnr. 822184 MERCK, Darmstadt Tetramethylethylendiamin) (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) J.4 Stammlösungen β-1,3-Glucanase (20 U/µl) Bestellnr. QUA QUANTUM 2001 Biotechnologies, Montreal, Canada Natriumazid, 20% MERCK, Darmstadt IPTG (Isopropyl--D-thiogalactosid), PEQLAB, Erlangen 0,5 M Spurenelementlösung eigene Herstellung (40 mg Na2B4O7 .10 H2O 400 mg CuSO4 . 5 H2O 800 mg FePO4 . 2 H2O 800 mg MnSO4 . 2 H2O 800 mg Na2MoO4 .2 H2O 8 g ZnSO4 .7 H2O ad 1 Liter H2O, Sterilfiltration, Lagerung bei –20°C) 162 J.5 Nährmedien Luria-Bertani-(LB)- 10 g NaCl ® Agar 10 g Bacto -Tryptone 5 g Bacto® -Yeast Extract 20 g Agar 950 ml H2O Einstellung des pH-Wertes mit 5 N NaOH auf 7,0; ad 1 Liter H2Oauf 1 Liter; autoklavieren ® Luria-Bertani-(LB)- 10 g Bacto -Tryptone ® Medium 5 g Bacto -Yeast Extract 10 g NaCl 950 ml H2O Einstellung des pH-Wertes mit NaOH auf 7,0; ad 1 Liter H20, autoklavieren Luria-Bertani-(LB)- 10 g NaCl Top-Agarose 10 g Bacto® -Tryptone 5 g Bacto® -Yeast Extract 7 g Agarose 950 ml H2O Einstellung des pH-Wertes mit NaOH auf 7,0; ad 1 Liter H20, autoklavieren Minimalmedium 10,0 g Glukose 0,92 g Ammoniumtartrat 0,52 g KCl 0,52 g MgSO4. 7 H2O 1,52 g KH2PO4 1,0 ml Spurenelementlösung ad 1 Liter H2O, Einstellung des pH-Wertes mit NaOH auf pH 6,8; Sterilfiltration Sabouraud-Agar 65 g Sabouraud-4%-Glucose-Agar (Fertigagar Fa. MERCK) ad 1 Liter H2O, autoklavieren, Zugabe von 1 ml Gentamycin (16 mg/ml) und 1 ml Chloramphenicol (16 mg/ml) SOC-Medium 5 g Bacto® -Yeast Extract ® 20 g Bacto -Tryptone 0,5 g NaCl (MW 58.44) 970 ml H2O autoklavieren und mit sterilfiltrierten 10 ml 1 M MgCl2 + 10 ml 1 M MgSO4 + 10 ml 2 M Glucose komplementieren 163 J.6 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Morphologie von Aspergillus fumigatus S. 11 Abb. 2: Infektionsschema nach DE REPENTIGNY et al. (1991) S. 34 Abb. 3: Wachstumsstadien von Aspergillus fumigatus D141 S. 37 Abb. 4: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur S. 63 S. 64 S. 65 S. 66 S. 67 S. 68 S. 69 S. 70 S. 71 S. 72 Infektionen mittels eindimensionaler Immunblots S. 76 Abb. 15 Silbergefärbte 2D-Gele S. 79 Abb. 16: Darstellung der Immunreaktionen ausgewählter Tiere (5,8) S. 80 im Verlauf der Infektionen (Tier 1) Abb. 5: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 2) Abb. 6: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 3) Abb. 7: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektion (Tier 4) Abb. 8: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 5) Abb. 9: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 6) Abb. 10: Darstellung des Köpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 7) Abb. 11: Darstellung des Köpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 8) Abb. 12: Darstellung des Köpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektionen (Tier 9) Abb. 13: Darstellung des Körpergewichts und der Körpertemperatur im Verlauf der Infektion (Tier 10) Abb. 14: Darstellung der Immunreaktionen auf zellwandständige und intrazelluläre A. fumigatus-Proteine vor und nach den auf intrazelluläre und zellwandständige A. fumigatusProteine vor Infektion, nach der ersten und nach der zweiten Infektion mittels 2D-Immunblots 164 Abb. 17: Darstellung der Organveränderungen und mikroskopische Bilder S. 84 Abb. 18a, b: Screening der -Phagen–cDNA-Plaques S. 97 Abb. 19a, b: Aufgereinigte Plaques S. 98 Abb. 20: Darstellung infektionsspezifischer Antigene S. 99 Abb. 21: Infektionsspezifischer Phagenklon S. 100 Abb. 22a, b: Unspezifische Phagenklone S. 100 Abb. 23: Immunreaktionen der Tiere auf ERMA S. 104 Abb. 24: Immunreaktionen der Tiere auf Enolase S. 104 Abb. 25: Darstellung rekombinanter Proteine S. 107 165 J.7 Tabellenverzeichnis Tab. 1: verwendete Bakterienstämme S. 32 Tab. 2: verwendete Antikörper S. 32 Tab. 3: verwendete Primer S. 32 Tab. 4: Lösungen und Puffer für die eindimensionale SDS-PAGE S. 40 Tab. 5: Lösungen für 2D-Gele S. 44 Tab. 6: Lösungen für die Silberfärbung S. 46 Tab. 7: Lösungen für die kolloidale Coomassie-Färbung S. 47 Tab. 8: Zusätze zur Bakteriensuspension, Endkonzentrationen und S. 51 getagter pET-Proteine S. 59 Tab. 10: Anzahl der Tiere und Infektionsdosen S. 61 Tab. 11: Prozentuale Gewichtsabnahme der Tiere im Verlauf der einzelnen Infektionen S. 73 Tab. 12: Auswertung der infektionsbegleitenden Kontrollen S. 75 Tab. 13: Auswertung eindimensionaler Immunblots S. 78 Tab. 14: Ergebnisse des PLATELIA Aspergillus-Ag-ELISA S. 82 Tab. 15: Ergebnisse der Sektionen S. 83 Tab. 16: Zusammenfassung der Ergebnisse des Tiermodells S. 86 Tab. 17: Übersicht Screening der cDNA-Expressionsbibliothek S. 87 Tab. 17a: Identifizierte Antigene S. 88 Tab. 18: Auflistung der isolierten Antigene S. 101 Tab. 19: Immunreaktionen auf ausgewählte Antigene S. 103 Tab. 20: Antigenfunktion und Anzahl der Tiere mit einer Verwendungszwecke Tab. 9: Übersicht der verwendeten Puffer für die Aufarbeitung HIS- antigenspezifischen Immunantwort S. 105 166 Danksagung Bei Herrn Prof. Dr. G. F. Gerlach möchte ich mich ganz besonders für seine Bereitschaft bedanken, diese Arbeit zu betreuen. Herrn PD Dr. U. Reichard danke ich herzlichst für die stets engagierte wissenschaftliche Betreuung, für unzählige aufschluss- und lehrreiche Gespräche und Diskussionen sowie für das mir entgegengebrachte Vertrauen. Herrn Dr. Ortwin Schunck gilt mein besonderer Dank für die „Vermittlung“ dieser Arbeit und für die Hilfe bei dem Tierversuch. Herrn Prof. Dr. R. Rüchel danke ich für seine uneingeschränkte Hilfsbereitschaft bei der Dokumentation der Sektionsergebnisse, für hilfreiche Korrekturen und seine stets aufmunternden Worte. Meike, Birgit und Petra danke ich vielmals für die gute und humorvolle Zusammenarbeit im Labor sowie für die jeweilige Unterstützung dieser Arbeit. Herrn Prof. Dr. H. Prange danke ich ganz besonders dafür, dass er mir für die Zeit des Zusammenschreibens einen Arbeitsplatz in seinem Institut zur Verfügung gestellt hat. Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir mein Studium ermöglicht haben und dass sie stets Interesse an meinem Lebensweg zeigen. Richard und Anne, vielen herzlichen Dank für den seelischen Beistand und die finanzielle Unterstützung in der Endphase meines Studiums. Tausend Dank an Christian, der zeitgleich die Last seiner Doktorarbeit trug und mir trotzdem mit Ratschlägen, Hilfe mit dem Feind Computer, Korrektur lesen und vor allem Verständnis zur Seite stand. 167 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation "Identifikation infektionsrelevanter Antigene von Aspergillus fumigatus“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation in der Abteilung Bakteriologie (Nationales Referenzzentrum für Systemische Mykosen) des Universitätsklinikums Göttingen durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover, angefertigt. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. ......................................................... Nicole Denikus Halle, den 27.07.04 168
