Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiplen Sklerose

Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose...........................................................
Aus der Abteilung für Humangenetik
der Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
Leiter: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen
Immungenetische Prädispositionsfaktoren
der Multiplen Sklerose
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Marcus D`Souza
aus Wuppertal
2004
1
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose...........................................................
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. J. T. Epplen
Korreferent: PD Dr. med. E. Sindern
Tag der mündlichen Prüfung: 25.01.2005
2
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose...........................................................
In Gedenken an meinen im Juli 1994 plötzlich verstorbenen Vater
Frank D`Souza
3
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose...........................................................
4
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
7
1.1.
Multiple Sklerose
7
1.2.
Das Immunsystem
14
1.2.1.
Grundlagen des Immunsystems
1.2.2.
Immunantwort
14
1.2.3.
Toleranz
16
1.2.4.
Autoimmunität
17
1.2.5.
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)
18
1.2.6
T-Zell-Rezeptor
21
1.2.7
Zytokine und Zytokinrezeptoren
22
1.3.
Zielsetzung der Arbeit
24
2.
Untersuchungsklientel, Material und Methoden
26
2.1.
Untersuchungsklientel
26
2.2
Material
27
2.2.1.
Oligonucleotidsynthese
27
2.2.2.
PCR-Bedingungen
27
2.2.3.
Lösungen und Puffer
31
2.3.
Methoden
34
2.3.1.
DNA-Isolierung aus MSTA-Blut
34
2.3.2.
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
35
2.3.3.
Polymerasekettenreaktion
35
2.3.4.
Gelelektrophorese
36
2.3.5.
Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden
37
2.3.6.
Hybridisierung
38
2.3.7.
Dokumentation
39
2.3.8
Computerprogramme und statistische Auswertung
39
2.3.9.
Gentechnologische Sicherheitsbestimmung
40
1 14
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5
3.
Ergebnisse
41
3.1.
Charakterisierung des Untersuchungskollektivs
41
3.2.
Gene des MHC und ihre Assoziation mit MS
43
3.2.1.
HLA-DRB1-Gen
43
3.2.2.
TNFa–Mikrosatellit
46
3.3.
Gene von T-Zellrezeptoren und ihre Assoziation mit MS
47
3.3.1.
Gene des T-Zellrezeptor beta Komplexes
47
3.3.2.
Gene des T-Zellrezeptor alpha Komplexes
52
3.3.3.
Diallelischer Polymorphismus des Transkriptionselements
52
3.3.4.
Gene von T-Zell assoziierten Determinanten
53
3.4.
Gene von Zytokinen und Rezeptoren und ihre
Assoziation mit MS
53
3.4.1.
Interleukin 1 A
53
3.4.2.
Interleukin 2
53
3.4.3.
Interleukin 5 Rezeptor A
54
3.4.4.
Fibroblastenwachstumsfaktor 1A
54
3.4.5.
Interferon alpha
54
4.
Diskussion
57
4.1.
Analyse immunrelevanter Genorte mittels hochinformativer Mikrosatelliten
4.2.
57
Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes
als Prädispositionsfaktoren für MS
59
4.2.1.
HLA-DRB1* Gen
59
4.2.2.
TNFa
61
4.3.
Gene des T-Zellrezeptor (TZR)-Komplexes als Prädispositionsfaktoren für MS
63
4.3.1.
Gene des T-Zellrezeptor beta Komplexes
63
4.3.2.
Gene des T-Zellrezeptor alpha Komplexes
65
4.4.
Gene von Zytokinen und Zytokinrezeptoren als
Prädispositionsfaktoren für MS
65
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6
5.
Zusammenfassung
67
6.
Literaturverzeichnis
68
7.
Danksagung
83
8.
Lebenslauf und Publikationen
84
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7
1. Einleitung
1.1. Multiple Sklerose
Definition
Die Multiple Sklerose (MS, Encephalomyelitis disseminata) ist eine chronische,
meist schubförmig verlaufende, entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Charakteristisch sind autoreaktive Immunprozesse und
herdförmige Demyelinisierungen im ZNS.
Epidemiologie
Frauen sind im Verhältnis 3:2 häufiger von einer MS betroffen als Männer. Das
Prädilektionsalter liegt zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr. Klinische Erstmanifestationen vor dem 10. und nach dem 50. Lebensjahr sind selten. In Europa liegt die alterskorrigierte Inzidenz bei 3 pro 100.000, die Prävalenz bei 90,7
pro 100.000 Einwohner [Zivadinov et al., 2003]. Das bisher in der Literatur postulierte und als Indikator für den Einfluss von Umweltfaktoren genutzte NordSüd-Gefälle der Prävalenz konnte nach Alters- und Geschlechtskorrektur nicht
bestätigt werden [Zivadinov et al., 2003]. Bei unterschiedlichen Bevölkerungsgruppen findet man eine verschieden hohe Prävalenz (z.B. fast null bei der Ursprungsbevölkerung Afrikas und den Inuits). Auffällig ist das weltweit erhöhte
Auftreten der MS in der kaukasischen Bevölkerung [Hensiek et al., 2003]. Bei
einem Wechsel des Wohnorts nach der Pubertät bleibt das gleiche Risiko, an
MS zu erkranken, wie im Ursprungsland, ein früherer Wechsel geht einher mit
der Übernahme des Erkrankungsrisikos des neuen Heimatlandes [Kurtzke,
1993]. Einige Untersuchungen betonen ein häufigeres Auftreten in höheren als
in niedrigeren sozioökonomischen Gruppen. Für die MS ist eine familiäre Häufung bereits 1896 vermutet worden [Eichhorst, 1896]. Verwandte 1. Grades haben eine Lebenszeiterkrankungswahrscheinlichkeit von ca. 3%, Verwandte 2.
Grades von 1% und Verwandte 3. Grades von 0,9%. In der europäischen Bevölkerung liegt sie bei 0,3%. Bei monozygoten Zwillingen liegt sie bei 33%, Kinder von einem betroffenen Elternteil haben eine Wahrscheinlichkeit von 0,7%,
sind beide Elternteile betroffen (sog. konjugale MS) liegt sie bei 12,2%. Weder
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für nicht blutsverwandte Ehepartner oder Adoptivkinder fand sich ein erhöhtes
Risiko [Ebers et al., 2000, Robertson et al., 1996]. Diese Ergebnisse machen
einen übertragbaren infektiösen Erreger unwahrscheinlich und betonen einen
genetischen Einfluss. Für zukünftige epidemiologische Studien sollten ethnische
Zugehörigkeit und Migrationsveränderungen der untersuchten Bevölkerung sowie Alters- und Geschlechtsverteilung berücksichtigt werden. Mit zunehmender
Mobilität der Menschen kommt es zu einer Veränderung der genetischen Zusammensetzung einer geographisch begrenzt betrachteten Bevölkerung.
Genetik
Ein Hinweis auf den Einfluss genetischer Prädispositionsfaktoren zeigt sich neben Familienstudien in der häufigen Assoziation der MS mit bestimmten Humanen Leukozyten Antigenen (HLA) [Compston and Coles, 2002]. In der europäischen und nordamerikanischen Bevölkerung findet sich überwiegend der
Haplotyp DRB1*1501 - DQA1*0102 - DQB1*0602. Verschiedene Populationen
zeigen jedoch unterschiedliche HLA-Assoziationen [Compston and Coles,
2002]. Neben HLA-Merkmalen wurden verschiedene Kandidatengene einzeln
untersucht, es fand sich aber keine eindeutige Assoziation [Compston and Coles, 2002, Kenealy et al., 2003]. Bei Betrachtung der Kombinationen von Kandidatengenen konnte für ein T-Zellrezeptor-V-Element (TZRBV6S3*2-Allel) kombiniert mit HLA-DRB1*03 ein mehr als 20fach erhöhtes relatives Risiko gefunden werden [Epplen et al., 1997]. Somit ist unter der Annahme einer komplexen
polygenen Prädisposition eine Assoziation mit bestimmten Kandidatengenkombinationen möglich [Böhringer et al., 2003].
Ätiopathogenese
Weder die Pathogenese noch die Ätiologie der Erkrankung sind bisher geklärt.
Die epidemiologischen Daten weisen auf eine Beziehung zwischen polygener
Prädisposition und bestimmten bisher unbekannten Umweltfaktoren hin
[Compston and Coles, 2002]. Prinzipiell finden sich zwei Schädigungsbereiche:
An der Blut-Hirn-Schranke (Migration aktivierter Immunzellen) und an den Oligodendrozyten
(Zerstörung
der
Myelinscheiden).
Die
pathologisch-
anatomischen Veränderungen bei der MS ähneln jenen der experimentellen
allergischen Enzephalomyelitis (EAE) [Kamholz et al., 1988, Warren et al.,
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1995]. So können sowohl im Tiermodell als auch bei Patienten T-Zellen mit einer Antigenspezifität für das basische Myelinprotein (MBP) gefunden werden.
Bei der EAE werden darüber hinaus auch spezifisch aktivierte CD4+ T-Zellen
gegen andere Myelinkomponenten wie Proteolipidprotein (PLP), myelinassoziierte Glykoprotein (MAG) und Myelin-Oligodendrozytenprotein (MOG) nachgewiesen [Hohlfeld et al., 1995]. Tiermodelle könnten Hinweise geben auf die immunologische Pathogenese. Möglicherweise lassen sich hieraus therapeutische
Konsequenzen ableiten [Martin et al., 1992, Kamholz et al., 1988, Warren et al.,
1995]. Zusätzliche Hinweise auf die immunologische Pathogenese liefern die
charakteristisch entzündlichen Läsionen im ZNS (= zentrales Nervensystem)
[Compston and Coles, 2002]. Neben diesem Autoimmunitäts-Model werden
weiterhin primäre ZNS-Infektionen und primäre Neurodegeneration mit konsekutiver Entzündungsreaktion diskutiert [Giuliani and Yong, 2003].
Pathologie
Im ZNS werden die Axone der Nervenzellen von Zellscheiden (= Myelinscheiden) umgeben, welche durch Zytoplasmafortsätze der Oligodendrozyten gebildet werden. Sie dienen der elektrischen Isolierung und erhöhen die Geschwindigkeit der Reizweiterleitung. Ein Axon ist von mehreren Myelinschichten umgeben, jede Schicht besteht aus einer Doppelschicht von Lipidmolekülen
(Phospholipide, Glykolipide, Cholesterin), dazwischen befinden sich die verschiedenen Myelinproteine (z.B. MBP, PLP, verschiedene Glykoproteine). Das
pathologisch-anatomische Substrat der MS ist eine Entzündungsreaktion mit
der Folge einer Entmarkung der Nervenfasern. Die makroskopisch sichtbaren
Entmarkungsherde (Plaques) sind meist scharf begrenzt und finden sich im
ZNS vor allem periventrikulär in der weißen Substanz sowie auch im Rückenmark. Die Entmarkungsherde zeigen unterschiedliche Größe und sind meist
perivaskulär angeordnet. Sie können zu größeren Entmarkungsflächen konfluieren. Frische Herde zeigen eine lokale Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Entwicklung eines postkapillären Ödems. Bisher wurden histopathologisch 3 Stadien unterschieden (frühe aktive, späte aktive und inaktive demyelinisierende
Läsionen). Aktuelle standardisierte histopathologische Untersuchungen von Biopsiematerialien zeigen jedoch 4 Demyelinisierungsmuster und darüber hinaus
eine axonale Degeneration, welche auch ohne weitere Entzündungsreaktion im
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Verlauf weiter fortschreitet [Compston and Coles, 2002, Kornek and Lasmann,
2003]. Makroskopisch erscheinen aktive (frische) Herde leicht erhaben und
weißlich-gelb. Mikroskopisch finden sich perivaskuläre Infiltrate von Lymphozyten, welche frische Herde fast vollständig durchsetzen und in chronisch aktiven
Plaques einen diffusen, entzündlichen Randsaum um den gesamten Herd bilden. Des Weiteren können Plasmazellen und Makrophagen, die z.T. phagozytierte Myelinbestandteile enthalten, nachgewiesen werden. Sobald die Myelinzerfallsprodukte abgeräumt sind, kommt es zu einer Astrogliazellproliferation
mit nachfolgender Gliose. Chronische Entmarkungsherde sind makroskopisch
eingefallen, gräulich und von harter Konsistenz. Ein Ödem ist nicht mehr nachweisbar. Nur in den Randzonen finden sich Axone mit dünnen Myelinscheiden
als Anhalt einer beginnenden Remyelinisierung [Martin et al., 1992].
Klinik
Die Erstmanifestation der MS kann mit unterschiedlichen Symptomen beginnen.
Innerhalb von Minuten, Stunden, Tagen oder sogar Jahren kommt es zu sensiblen und/oder motorischen Ausfällen. Je nach initialer Symptomatik, MRTBefund und Alter bei Erstmanifestation kann eine ungefähre Prognose bzgl. des
Verlaufs gegeben werden. Eine Einteilung entsprechend dem Ausmaß der Behinderung sowie der Progressionsrate erfolgt nach der Skala von Kurtzke,
EDSS (extended disability status scale) [Kurtzke, 1983]. Es lassen sich prinzipiell zwei Verlaufsformen unterscheiden: Schubförmiger Verlauf mit wechselnder Symptomatik und primär chronisch progredienter Verlauf. In 80% der Fälle
findet sich ein schubförmiger Verlauf (Schub = Symptome mindestens für 24
Stunden). Die Intervalle zwischen zwei Schüben sind unterschiedlich lang (Mindestabstand 30 Tage). Von den Schüben müssen Exazerbationen unterschieden werden, welche durch äußere Umstände erklärt werden können. Z.B. bedingt die Erhöhung der Körpertemperatur bei einer Grippe eine Verschlechterung der Symptome. Die Schubrate liegt bei 0,5 bis 0,8 pro Jahr mit einer
durchschnittlichen Rückbildung innerhalb von 1 bis 2 Monaten. Obgleich zu Beginn der Erkrankung den Schüben fast vollständige Remissionen folgen, zeigen
60% der Patienten innerhalb von 15 Jahren einen Übergang zur sekundär
chronisch progredienten Verlaufsform, bei Erkrankungsdauer über 25 Jahre sogar fast 90%. Bei ca. 20% beginnt die Erkrankung primär chronisch progredient,
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sie weisen eine zunehmende Symptomatik über mehr als 6 Monate ohne nennenswerte Remissionen auf. Diese Verlaufsform ist prognostisch ungünstig und
tritt i.d.R. (in der Regel) bei Patienten mit einem höheren Erkrankungsalter auf
und führt am schnellsten zu bleibenden Behinderungen (EDSS von 6 innerhalb
von 10 Jahren). Die Lebenserwartung ist i.d.R. nicht verkürzt. Bei 3-5% der MSPatienten findet man einen malignen Verlauf mit sehr schwerer Behinderung
oder Tod innerhalb der ersten 5 Jahre [Steinbrecher et al.,1995]. Die verschiedenen Verläufe mit zum Teil unterschiedlicher Alterskorrelation und Veränderungen in der Bildgebung sowie die histopathologische Typeneinteilung legen
den Verdacht nahe, es handele sich um unterschiedliche Erkrankungen. Somit
würde eine Zuordnung evtl. gefundener Kandidatengene eine exakte klinische
Charakterisierung der untersuchten Patienten erfordern.
Diagnose
Die Diagnose wird in erster Linie aufgrund der Anamnese und der neurologischen Untersuchungen gestellt, ergänzt durch eine Liquoruntersuchung und ein
MRT. Für die Diagnose MS gibt es weder eine spezifische klinische Symptomatik noch pathognomonische paraklinische Kriterien. Für die diagnostische Einordnung werden daher standardisierte diagnostische Kriterien verwendet. Aktuell werden die modifizierten Diagnosekriterien nach McDonald [McDonald at al.,
2001] empfohlen. Die Untersuchung des Liquors zeigt eine leichte lymphoplasmazytäre Pleozytose (< 50/µl) und eine erhöhte autochtone IgG-Produktion (oligoklonale Banden in der isoelektrischen Fokussierung des Liquors, IgG-Index
>0,7), welche sich jedoch auch bei anderen entzündlichen ZNS-Erkrankungen
finden. Des Weiteren finden sich Antikörper (AK) gegen Masern-, Röteln- und
Zosterviren, welche jedoch auch bei anderen Autoimmunerkrankungen vorkommen. Evozierte Potentiale (insbesondere die visuell evozierten Potentiale,
VEP) zeigen Veränderungen der Nervenleitgeschwindigkeit und geben somit
Hinweise auf die Entmarkung betroffener Nervenzellen [Steinbrecher et al.,
1995]. Kernspintomographisch lassen sich im ZNS typische hyperintense Läsionen in T2-gewichteten Bildern nachweisen. Durch Gabe von Gadolinium (paramagnetisches Kontrastmittel) lässt sich in T1-gewichteten Bildern eine Störung der Blut-Hirn-Schranke in aktiven Läsionen erkennen. In der Bildgebung
zeigt sich eine variable Atrophie. Im Rückenmark finden sich die Läsionen meist
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dorsolateral mit einer Längenausdehnung <2 Segmenten, das Halsmark ist am
häufigsten betroffen. Differenzialdiagnostisch müssen u.a. cerebrale Vaskulitiden, die chronische Neuroborreliose, die Neurosarkoidose und der cerebrale
Lupus erythematodes abgegrenzt werden.
Therapie
Eine kausale Therapie ist z.Z. noch nicht möglich. Der akute Schub wird mit einer hochdosierten (1.000 mg/d) Glukokortikoidstoßtherapie über 3-5 Tage behandelt. Cortison hemmt die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen.
Für die verlaufsmodifizierende Therapie werden Interferon β-1a/1b, Glatirameracetat, Imunglobulin G und Mitoxantron sowie Azathioprin eingesetzt. Typ-1Interferone, zu Beginn wegen ihrer antiviralen Eigenschaft eingesetzt, zeigen
u.a. einen funktionellen Antagonismus zu proinflammatorischen Zytokinen und
eine Downregulation der MHC-II-Expression [Hall et al., 1997]. Glatirameracetat
unterdrückt die EAE, u.U. durch Hemmung der Bindung von MBP an den TZellrezeptor [Neuhaus et al., 2001]. Azathioprin hemmt u.a. die Lymphozytenproliferation, Mitoxantron hemmt die DNA-Topoisomerase II in Zellen. Der
sekundär chronisch progrediente Verlauf wird bei entzündlicher Krankheitsaktivität mit Interferonen behandelt, sonst mit Mitoxantron. Bei der primär chronisch
progredienten Verlaufsform kommt neben der Glukokortikoidstoßtherapie auch
die wiederholte intrathekale Gabe von Triamcinolon Acetonid zur Anwendung,
insbesondere bei der spinalen Verlaufsform [Hoffmann et al., 2003]. Entsprechend der Vielfalt neurologischer Störungen wird zusätzlich u.a. mit physiotherapeutischen Maßnahmen und Spasmolytika (z.B. als intrathekales Pumpsystem) sowie bei pathologischer Ermüdbarkeit (Fatigue) mit Modafinil oder Amantadin symptomatisch behandelt. Durch weitere Aufklärung immungenetischer
Faktoren ist eventuell die Entwicklung von noch selektiveren immunmodulierenden Medikamenten möglich. Aktuell sind bereits verschiedene Studien initiiert,
u.a. der mögliche Einsatz von Antegren oder von FTY 720. Antegren (Natalizumab) ist ein humanisierter monoklonaler AK gegen alpha 4 integrin (ein Zelladhäsionsmolekül auf Leukozyten), welcher das Einwandern von aktivierten TZellen durch die Blut-Hirnschranke hemmt. FTY 720 ist ein synthetisches Analogon von Myriacin was an Sphingosin 1-Phosphat auf Lymphozyten und Endothelzellen bindet. Nicht unerwähnt bleiben soll der Chemokin-Rezeptor 1-
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(CCR1-) Antagonist, welcher den CCR1-Rezeptor auf Leukozyten blockiert und
deren Migration durch das Endothel der Blut-Hirn-Schranke mindert.
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1.2. Das Immunsystem
1.2.1. Grundlagen des Immunsystems
Die Homöostase des Organismus ist durch ständig auf ihn einwirkende Pathogene (Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen, Würmer) und Noxen (Umweltgifte,
Medikamente, u.a.) gefährdet. Aber nur vergleichsweise selten kommt es zu
bewusst erlebten Erkrankungen, da sich das Immunsystem durch seine vielfältigen Funktionen den eindringenden Pathogenen entgegenstellt. Den ersten
Schutz bilden eine physikalische Barriere (intakte Haut- und Schleimhautoberflächen, mukoziliäre Tätigkeit, verschiedene Drüsensekrete) und eine angeborene Immunität, welche binnen weniger Stunden mittels zellulärer/humoraler
Komponenten (Makrophagen, alternativer Weg des Komplementsystems) wirksam wird. Parallel hierzu wird die antigenspezifische erworbene (adaptive) Immunantwort induziert. Zum Immunsystem zählen neben den Einzelzellen, Bund T-Lymphozyten sowie antigenpräsentierende Zellen (APZ), die primären
und sekundären lymphatischen Organe. Knochenmark (KM) und Thymus bilden
die primären lymphatischen Organe. Sie sind die Bildungs- und Reifungsorte
der Lymphozyten. Zu den sekundären lymphatischen Organen gehören Milz,
Lymphknoten und Mukosa-assoziierte lymphatische Organe (MALT).
1.2.2. Immunantwort
Die humorale Immunantwort erfolgt mittels B-Lymphozyten (Bildung und Differenzierung im KM), welche in den sekundären lymphatischen Organen durch
Interaktion mit antigenspezifischen T-Helferzellen (thymusabhängige Antigene)
oder direkt durch bestimmte mikrobielle Antigene (thymusunabhängige Antigene) zur Antikörperproduktion und -sekretion induziert werden. Antikörper können das Pathogen neutralisieren, über ihren Fc-Rezeptor das Komplementsystem aktivieren oder durch ihre Bindung die Phagozytose unterstützen (Opsonierung). Die zelluläre Abwehr vermitteln Subpopulationen von T-Lymphozyten
(Bildung im KM, Differenzierung im Thymus). Im Blut zirkulierende T-Zellen treffen in den sekundären lymphatischen Organen auf ihr spezifisches Antigen. Je
nach Oberflächenstruktur (CD = cluster of differentiation) lassen sich CD8+ T-
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Zellen (zytotoxische oder Suppressorzellen) und CD4+ T-Zellen (Helferzellen)
unterscheiden, die sowohl unterschiedliche Aktivierungsmechanismen als auch
Abwehrwirkungen besitzen. Sie erkennen mit ihren membranständigen TZR ein
Antigen nur, wenn es von APZ mittels körpereigener, peptidbindender Proteine,
den MHC-Molekülen, angeboten wird.
Die Antigenerkennung ist MHC-restringiert, d.h. fremde Peptide werden nur im
Zusammenhang mit eigenen MHC-Molekülen erkannt [Zinkernagel and Doherty, 1974]. Es gibt prinzipiell zwei unterschiedliche Arten von MHC-Molekülen
(Klasse I und Klasse II). Sie präsentieren Peptide, die in verschiedenen Kompartimenten der APZ prozessiert werden [Pieters, 2000, Rock and Goldberg,
1999, Trowsdale, 1993]. Die Bindung des TZR (assoziiert mit dem CD3Komplex) und der Differenzierungsantigene CD4 oder CD8 an die entsprechenden MHC-I- oder MHC-II-Moleküle reicht noch nicht für eine Aktivierung der TZellen aus. Es bedarf einer Kostimulierung durch weitere Oberflächenmoleküle:
B7 (B7.1 = CD80; B7.2 = CD86) auf den APZ oder B-Zellen und deren Liganden auf T-Zellen (CD28 und CTLA-4 = CD152). Darüber hinaus erfolgt eine zusätzliche Interaktion mit bestimmten Zytokinen (Interleukin-2 = IL-2, u.a.)
[Schwartz, 1992, Arai et al., 1990]. Nach Aktivierung der T-Zelle produziert diese IL-2, ein Zytokin, für welches sie selbst den entsprechenden Rezeptor
exprimiert. IL-2 regt die T-Zelle nun sowohl zur Proliferation sowie zur Differenzierung in eine T-Effektorzelle an [Suzuki et al., 1995, Smith, 1984, Fraser et
al., 1991].
Während MHC-I-Moleküle auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden, findet man MHC-II-Moleküle nur auf bestimmten Zellen (Makrophagen, dendritische Zellen und B-Lymphozyten). CD8+ T-Zellen werden induziert, wenn ihnen
ihr spezifisches Antigen vom MHC-I-Molekül der APZ angeboten wird. In der
zytotoxischen Effektorphase lysieren CD8+ T-Lymphozyten Zielzellen, welche
das entsprechende Peptid auf ihrer Zelloberfläche tragen, durch gezielte Freisetzung von sekretorischen Granula oder durch Auslösung des programmierten
Zelltods (Apoptose). CD4+ T-Zellen können sich zu zwei Arten von Effektorzellen differenzieren, den TH1- und den TH2-Zellen, abhängig vom Antigen, der
APZ sowie Zellinteraktionsmolekülen und löslichen Mediatoren [Paul and Seder,
1994]. Differenzieren sie zu inflammatorischen CD4 T-Zellen (TH1), z.B. durch
Präsentation des fremden Peptids durch ein MHC-II-Molekül eines infizierten
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Makrophagen, so aktivieren sie diesen durch Synthese und Sekretion bestimmter Zytokine (IL-2, IL-1, Interferon γ = INFγ, Tumornekrosefaktor α = TNFα und
Lymphotoxin = LT). Aktivierte Makrophagen können dadurch sowohl effektiver
phagozytierte Noxen verarbeiten und töten sowie über Zytokine und Expression
entsprechender Rezeptoren mit anderen Immunzellen kommunizieren. Des
Weiteren locken die TH1-Zellen zusätzliche Makrophagen an den Infektionsort
und aktivieren NK-Zellen (Natürliche Killerzellen). Differenzieren CD4+ T-Zellen
zu T-Helferzellen der Subklasse 2 (TH2-Zellen), z.B. nach Stimulation eines
fremden Peptids, präsentiert von einem MHC-II-Molekül eines B-Lymphozyten,
so tragen sie zur Aktivierung dieser B-Zellen bei. Die Aktivierung erfolgt unmittelbar über Zell-Zellkontakt, z.B. zwischen dem Oberflächenmolekül CD40 auf
B-Zellen und dem CD40-Liganden auf T-Zellen sowie Mediatoren (IL-4, IL-10,
IFN-ß und TGFß), die von TH2-Zellen synthetisiert und sezerniert werden.
1.2.3. Toleranz
T-Zellen entstehen ebenfalls im Knochenmark, wandern aber bereits in einem
frühen Stadium ihrer Entwicklung in den Thymus, wo sie heranreifen. Im Thymus wird zunächst nach entsprechender Genumordnung, ähnlich der von Immunglobulinen, ein spezifischer TZR auf der Oberfläche der heranreifenden TZellen exprimiert (in 95% der Fälle α/ß, seltener γ/δ) sowie gleichzeitig CD4 und
CD8 (ein Drittel CD8+, zwei Drittel CD4+, γ/δ-T-Zellen sind CD4 und CD8 negativ). Nun durchlaufen diese T-Zellen eine positive und eine negative Selektion.
T-Zellen, die einen hochaffinen Rezeptor für Selbstantigene besitzen, werden
negativ selektioniert [Nossal, 1994]. Parallel werden T-Zellen, die einen niederaffinen Rezeptor exprimieren, positiv selektioniert [von Boehmer, 1994] und
wandern als CD4+ bzw. CD8+ Zellen in die Peripherie. T-Zell-Toleranz wird
durch negative Selektion im Thymus, durch unzureichende Menge des Antigens, durch übermäßige Aktivierung von T-Zellen aufgrund hoher Antigenkonzentrationen oder durch unvollständige Kostimulierung (Anergie) [Nossal, 1994]
induziert bzw. aufrechterhalten. B-Zellen entstehen und entwickeln sich im Knochenmark. Jede einzelne B-Zelle exprimiert nur Immunglobuline einer Spezifität, diese wird durch somatische Rekombination der Immunglobulingene er-
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reicht. Im Gegensatz zur T-Zell-Reifung findet i.d.R. keine negative Selektion
statt.
1.2.4. Autoimmunität
Die große Variabilität in der Erkennungsmöglichkeit verschiedener Pathogene
bedingt zwangsläufig die Bildung von Rezeptoren, die mit körpereigenen Molekülen reagieren. Dennoch scheinen Kontrollmechanismen zum Schutz vor Autoreaktivität sehr effektiv zu sein, da 93-95% der Menschen keine Autoimmunerkrankungen entwickeln. Unter einer Autoimmunkrankheit versteht man eine
spezifische adaptive Immunreaktion gegen körpereigene Antigene. Diese kann
sowohl durch Autoantikörper als auch durch autoimmun wirkende T-Zellen verursacht werden. Bis heute ist die Entstehung von Autoimmunerkrankungen ungeklärt. Es konnte jedoch nachgewiesen werden, dass auch gesunde Menschen, sowohl Auto-Antikörper [Kaushik, 1994], als auch autoreaktive T-Zellen
[Ada and Rose, 1988] besitzen. Bestimmte allgemeine Faktoren scheinen das
Auftreten von Autoimmunität zu fördern (z.B. höheres Alter, Hormonstatus, u.a.)
[Todd and Steinman, 1992]. Oft findet sich eine familiäre Häufung. Bisher ist
jedoch der einzige eindeutig nachgewiesene genetische Marker für die Prädisposition zu komplexen Autoimmunerkrankungen der MHC-Genotyp. Nicht
typisch für die klassischen Autoimmunerkrankungen ist das Auftreten autoreaktiver Lymphozyten bei Präsentation von körpereigenen Proteinen, zu welchen
das Immunsystem bis dahin keinen Zugang hatte und auch keine Präsentation
im Thymus erfolgte (z.B. Dressler-Syndrom mit Auto-Antikörperbildung nach
myokardialer Ischämie gegen myokardiale Proteine oder Immunreaktion gegen
Augenlinsengewebe nach Augentrauma) [Jones and Diamond, 1995]. Bei bestimmten körpereigenen Proteinen, die nur in bestimmten Geweben exprimiert
und im Thymus nicht präsentiert werden, wird Toleranz durch fehlende Präsentation mittels MHC oder fehlende Kostimulierung erzeugt. Diese Proteine können trotzdem Ziele einer Autoimmunerkrankung sein, z.B. Auto-Antikörper gegen ein neuraminsäurehaltiges Glykoprotein, das in den Belegzellen der Magenschleimhaut gebildet wird, bei der Perniziösen Anämie [Jones and Diamond,
1995, Mardh et al., 1991]. Molekulare Ähnlichkeit von Strukturoberflächen ist
eine weitere diskutierte Ursache für Autoimmunität. Werden von APZ Pathoge-
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 18
ne präsentiert, welche Strukturhomologien mit körpereigenen Molekülen aufweisen, können bei adäquater Kostimulation autoreaktive Lymphozyten gegen
körpereigene Proteine aktiviert werden und somit die Selbst-Toleranz durchbrechen (z.B. rheumatisches Fieber oder ankylosierende Spondylitis). Defekte von
TH2-Zellen in der Kontrolle autoreaktiver TH1-Zellen, welche physiologischerweise in bestimmter Menge im peripheren Blut zu finden sind, können, z.B. bei
gleichzeitiger Infektion mit bestimmten Mikroorganismen, zur Entstehung einer
Autoimmunerkrankung führen [Paul and Seder, 1994].
1.2.5. Haupthistokompatibilitätskomplex
Übersicht
Der MHC-Komplex umfasst beim Menschen ungefähr 4 Millionen Basenpaare
und beinhaltet mehr als 200 bekannte Gene auf dem Chromosomenabschnitt
6p21.3. Telomerwärts liegt die MHC-I-Region mit den 3 Hauptgenen HLA-A, -B
und -C, welche für die α-Kette des MHC-I-Oberflächenmoleküls kodieren. Die
α-Kette ist mit dem β2-Mikroglobulin assoziiert, dessen Gen auf Chromosom 15
liegt. Centromerwärts liegt die MHC-II-Region mit Genen, die für die α- und ßKette der MHC-II-Oberflächenmoleküle kodieren, HLA-DR, -DP und –DQ. Häufig findet sich im HLA-DR-Cluster ein zusätzliches ß-Ketten-Gen. Darüber hinaus finden sich Gene für Transportproteine (TAP1 und TAP2; TAP = transporter
associated with antigen processing), LMP2 und LMP7 (LMP = large multifunctional protease) und das Gen für Tapasin. Die TAP- und LMP-Moleküle besitzen
eine Funktion bei der Antigenpräsentation. Der 1,1 Millionen Basenpaar große
Bereich zwischen der MHC-I-Region und der MHC-II-Region wird als MHC-IIIRegion bezeichnet. Hier finden sich Gene, die für verschiedene Proteine des
Immunsystems kodieren, z.B. für die Komplement-Komponenten C2, C4 und
Faktor B sowie für die Hitze-Schock-Proteine (HSP70-1/2/Hom). Des Weiteren
finden sich hier die Gene der Tumornekrosefaktor-Familie (TNFα, LTα, LTβ),
ein Gen für ein mikrosomales Enzym (CYP21, C21-Hydroxylase) und andere,
funktionell noch nicht charakterisierte Genprodukte [Beck and Trowsdale, 1999,
Trowsdale et al., 1992]. Die Gene der MHC-Region, die für die MHC-I- und II-
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 19
Oberfächenmoleküle kodieren, sind sehr polymorph, z.T. über 300 verschiedene Allele. Die Expression ist kodominant.
Die MHC-Moleküle
Die MHC-I/II-Moleküle sind membranständige Glykoproteine. Sie weisen untereinander Strukturhomologien auf und zeigen durch ihre Faltblattstruktur ihre
Zugehörigkeit zur Immunglobulinsuperfamilie an. Die dreidimensionale Struktur
der MHC-I/II-Moleküle wurde mittels Röntgenstrukturanalyse ermittelt. APZ präsentieren T-Zellen fremde Antigene mittels des MHC-Moleküls. Bei entsprechender Kostimulierung kommt es zur Aktivierung der T-Zellen. Es werden jedoch weit mehr eigene Peptide präsentiert als fremde. Moleküle der MHCKlasse-I bestehen aus 2 Polypeptidketten, einer α-Kette von 44 kD, die nicht
kovalent mit einer ß2-Kette (= ß2-Mikroglobulin) von 12 kD assoziiert ist. Nur
die α-Kette ist ein Transmembranprotein und faltet sich extrazellulär in 3 Domänen (a1-a3). Die a1- und a2-Domänen falten sich zu einer Struktur aus 2 segmentierten α-Helices, die auf einem Faltblatt aus 8 ß-Strängen liegen. Der dadurch entstehende Spalt dient der Antigenbindung [Bjorkman et al., 1987a und
1987b]. MHC-I-Moleküle präsentieren CD8+-T-Zellen Antigene von Pathogenen, die im Cytosol der APZ prozessiert wurden. MHC-Moleküle werden im endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert. In der Membran des ER finden
sich Transportproteine (deren Bestandteile durch die TAP1/2-Gene kodiert werden). Diese Transporter befördern selektiv Peptide in das ER, die durch den
Abbau von Proteinen im Cytosol mittels Proteasomen (LMP2 und 7) entstehen.
Dort binden sie an die MHC-I-Moleküle und werden über den Golgi-Apparat an
die Zelloberfläche transportiert [Rock and Goldberg, 1999, Trowsdale, 1993].
Die MHC-II-Moleküle bestehen aus 2 nicht kovalent assoziierten Polypeptidketten, einer α-Kette von 33 kD und einer ß-Kette von 28 kD. Beide Ketten sind
Transmembranproteine und werden von jeweils 2 Domänen gebildet, wobei α1
und ß1 die Faltblattstruktur für die Antigenbindungsstelle bilden [Brown et al.,
1993]. MHC-II-Moleküle präsentieren CD4+-T-Zellen Antigene, die in intrazellulären Vesikeln von B-Zellen oder Makrophagen prozessiert wurden. Die im ER
synthetisierten MHC-II-Moleküle binden zunächst an eine sogenannte invariante Kette, welche eine Bindung an Peptide im ER verhindert. Diese Kette führt
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 20
den Komplex über den Golgi-Apparat zu einem Endosom, welches Fragmente
von bereits verdauten Proteinen enthält. Nach Verschmelzung mit dem Endosom bauen die Proteasen des Endosoms die invariante Kette ab. Nun können
die Peptide an MHC-II-Moleküle binden. Dieser Komplex wird zur Zelloberfläche
transportiert [Pieters, 2000, Trowsdale, 1993].
Der MHC und Autoimmunität (MS)
Die stärkste Assoziation von HLA-Merkmalen und MS zeigte sich bei nordeuropäischen Patienten für die Haplotypen HLA-DRB1*1501, DQA1*0102 und
DQB1*0602
[Olerup
and
Hillert,
1991].
Ob
HLA-DRB1*-Allele
oder
DQA1/DQB1-Allele ein höheres Risiko beinhalten, ist aufgrund des starken
Kopplungsungleichgewichts beider Loci nicht zu klären [Begovich et al., 1992].
Bisher unbestätigte Ergebnisse aus Skandinavien zeigten eine unterschiedliche
HLA-DR/DQ Assoziation für den chronisch progredienten schubförmigen Verlauf der MS [Olerup et al., 1989, Hillert et al., 1992, Thompson et al., 1991].
Gene, welche an der Antigenprozessierung beteiligt sind, die multifunktionellen
Proteasen 2 und 7 (LMP) sowie die Transportproteine 1 und 2 (TAP), zeigten
keine Assoziation mit der MS [Liblau et al., 1993, Kellar-Wood et al., 1994]. Untersuchungen des Polymorphismus der Gene, die für LTα (TNFß) kodieren, ergaben bisher keine unabhängige Assoziation für diesen Locus [Fugger et al.,
1990a, Roth et al., 1994]. Die geringfügige Überrepräsentation bestimmter Allele steht wahrscheinlich im Zusammenhang mit dem Kopplungsungleichgewicht
der MHC-Region [Eoli et al., 1994].
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 21
1.2.6. Der TZR-Komplex
Übersicht
Die T-Zellrezeptoren sind transmembrane Heterodimere mit deutlicher Strukturhomologie zu den Immunglobulinen. Jeder TZR besteht aus 2 Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die TZR bestehen
entweder aus einer α- und einer ß-Kette oder einer γ- und einer δ-Kette. 9095% der zirkulierenden T-Lymphozyten exprimieren einen α/ß-TZR und nur 510% einen γ/δ-TZR. Während α/ß-T-Zellen MHC-restringiert sind, zeigen γ/δ-TZellen z.T. MHC-unabhängige zytotoxische Aktivität. Mit dem TZR assoziiert ist
der CD3-Proteinkomplex. Er wird aus einer γ, δ, ε und zwei ζ- oder einer ζ- und
η-Kette gebildet. Neben der Stabilisierung ist der CD3-Komplex für die
Signaltransduktion ins Zellinnere verantwortlich. Die Anordnung der Gene, die
für die α- und ß-Kette des TZR kodieren, ähnelt der von Immunglobulinen. In
der Keimbahn-DNA bestehen sie aus separaten V, (D), J und C-Gensegmenten, die durch somatische Rekombination während der Entwicklung im
Thymus miteinander verknüpft werden [Goldrath and Bevan, 1999, Siu et al.,
1984]. Die Gene des TZR α-Locus sind auf dem langen Arm des Chromosoms
14 in der Region 14q11-12 angeordnet. Für die α-Kette sind bisher 70 variable
(V) Elemente, 61 verbindende (J) und 1 konstantes (C) Element beschrieben.
Basierend auf einer größer als 50%igen Sequenzhomologie der Nukleotidsequenz von TZR AV-Gensegmenten, können 29 TZR AV-Familien zusammengefasst werden. Die Gene des TZR B-Locus befinden sich auf dem langen Arm
von Chromosom 7, in der Region 7q35. Es sind bisher 68 Vß-, 13 Jß-, 2Dß- und
2 Cß-Gene bekannt. Es wurden bisher 34 TZR BV-Familien beschrieben. Die
Variabilität des TZR wird nicht, wie bei den HLA-Antigenen, durch einen hohen
Polymorphiegrad erreicht, sondern über eine Vielzahl von Rekombinationsmöglichkeiten der V-, J- (D-) und C-Gensegmente sowie über Insertion von NNukleotiden und zusätzlich über die variable Paarung von α- und ß-Ketten [Imberti et al., 1992, Epplen J.T. et al., 1987]. T-Zellen tragen jeweils nur einen
spezifischen Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche (Allelausschluss).
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 22
Der TZR und Autoimmunität (MS)
T-Zellen sind Regulatoren des Immunsystems. Ihre Funktion hängt v. a. von
der Erkennung fremder Peptide in Zusammenhang mit einer Präsentation über
den MHC sowie von der Unterscheidung von Selbst- und Nicht-SelbstStrukturen während ihrer Entwicklung im Thymus ab. Es ist naheliegend, dass
Veränderungen der Antigenbindungsstelle im TZR Ausgangspunkt für Autoimmunerkrankungen sein können. Bei verschiedenen Erkrankungen sind Assoziationen mit TZR beschrieben worden [Übersicht bei Kay, 1996], diese Befunde
wurden jedoch z.T. widerlegt. Mehrere Untersuchungen der Gene, die für den
TZR kodieren, sind für eine Assoziation mit der MS durchgeführt worden. Für
die TZR-α-Kette besteht keine Assoziation [Eoli et al., 1994, Lynch et al., 1992],
in verschiedenen Studien sind jedoch Assoziationen für die ß-Kette gefunden
worden [Epplen C. et al., 1997, Martinez-Naves et al., 1993].
1.2.7. Zytokine und Zytokinrezeptoren
Übersicht
Zytokine sind Glykoproteine, die von Zellen gebildet werden und an spezifische
Zytokinrezeptoren anderer Zellen (parakrine Wirkung) oder der produzierenden
Zelle selbst (autokrine Wirkung) binden. Diese biologisch aktiven Proteine regulieren Wachstum, Differenzierung und Funktion der Zellen des Immun- und hämatopoetischen Systems. Im ZNS haben Zytokine neuroendokrine Wirkung,
wie z.B. die Temperaturregulation (Fieberinduktion durch TNFα und IL-1). Bei
Entzündungsreaktionen ist ihre Produktion und Expression erhöht. Je nach Stimulation entsteht ein Netzwerk stimulierender und/oder inhibitorischer interaktiver Signale. Charakteristisch für Zytokine ist ihre Wirksamkeit in extrem niedrigen Konzentrationen [Arai et al., 1990].
Zytokine und Autoimmunität (MS)
Die Rolle der Zytokine bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung der Entzündungsreaktionen im Rahmen der Autoimmunität wird durch verschiedene Tiermodelle und Nebenwirkungen von Immunsuppressiva verdeutlicht. Eine unkon-
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 23
trollierte Produktion kann eine Immunreaktion aus der Balance bringen und zu
einem Immundefekt führen [Schattner, 1994].
TNFα ist ein Entzündungsmediator, der im Rahmen einer Immunantwort auf
virale und bakterielle Infektionen, einer Sepsis oder im Verlauf von Autoimmunkrankheiten involviert ist. Im ZNS wird TNFα von infiltrierten Makrophagen, aber
auch von TH1-Zellen, Mikrogliazellen und Astrozyten gebildet. Die TNFαRezeptor-Bindung kann neben Wachstums- und Aktivierungssignalen auch den
programmierten Zelltod induzieren. TNFα induziert eine verstärkte Expression
von MHC-I- und Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Blutgefäßen und
assoziierten Zellen. TNFα führt so zu einer erhöhten Permeabilität der Gefäßwände und vermehrter Einwanderung von Leukozyten in den Entzündungsbereich. Eine verstärkte Expression von TNFα findet sich in einer Reihe von ZNSErkrankungen (MS, AIDS, Morbus Parkinson, u.a.) [Taupin et al., 1997]. TNFα
bewirkt im ZNS Astrogliose, Demyelinisierung und hat einen toxischen Effekt
(Apoptose) auf myelinsynthetisierende Oligodendrozyten [Selmaj et al., 1991a].
Im Tiermodell lässt sich der pathogene Effekt auf Oligodendrozyten durch Injektion entsprechender Antagonisten oder monoklonaler Antikörper (mAK) gegen
TNF aufheben. Eine Behandlung mit mAK, die spezifisch für TNF sind, konnte
die Entwicklung einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE)
verhindern [Ruddle et al., 1990]. Des Weiteren korreliert die Höhe der TNFαmRNA-Konzentration mit der Schwere der EAE [Renno et al., 1995]. Leider ergaben zwei Studien mit dem Einsatz von TNF-α Antagonisten bei MS eine Verschlechterung [Compston and Coles, 2002].
Interferone haben vielfältige Wirkungen auf verschiedene Zelltypen. IFNα und ß
führen neben einer antiviralen Wirkung zur verstärkten Expression von MHC- IMolekülen auf der Oberfläche von Zielzellen. IFNγ wird von TH1-Zellen und NKZellen produziert. Es besitzt eine antivirale und antiproliferative Wirkung. IFNγ
führt zu einer erhöhten MHC-I- und II-Expression auf APZ, Mikrogliazellen und
Astrozyten. Es bewirkt eine Hemmung der Differenzierung von T-Zellen zu TH2Zellen. Im Liquor von MS-Patienten findet sich eine Erhöhung von IFNγ produzierenden Zellen [Arai et al., 1990].
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 24
1.3. Zielsetzung der Arbeit
Die Multiple Sklerose ist eine multifaktoriell bedingte Erkrankung. Sowohl Umweltfaktoren als auch genetische Faktoren sind an ihrer Manifestation beteiligt.
Als Kandidatengene kommen insbesondere immunrelevante Gene in Betracht,
die ursächlich oder modulierend das Autoimmungeschehen beeinflussen. Ziel
dieser experimentellen Forschungsarbeit sind Untersuchungen zum immungenetischen Hintergrund, der zur Manifestation oder zum Verlauf der MS beiträgt.
Mikrosatelliten (Fragmentlängendifferenzen repetitiver Sequenzmotive, sowohl
im intronischen als auch in kodierenden Genombereichen) eignen sich aufgrund
ihres hohen Informationsgehalts, ihrer Verteilung im gesamten Genom und ihrer
einfachen Analysemöglichkeit hierfür ganz besonders. Für die Untersuchung
der Assoziation mit der MS wurden hochpolymorphe Mikrosatelliten ausgewählt, welche innerhalb oder in der Nähe immunrelevanter Gene liegen. Ein
Hauptziel war die Untersuchung der V-Elemente der TZRβ-Kette, welche in der
proximalen TZR-Region liegen. Eine Übersicht über die eingesetzten Marker
gibt Tabelle 1. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob die Kombination prädisponierender HLA-DRB1 Allele (Antigenpräsentation) mit bestimmten TZRAllelen die Wahrscheinlichkeit, an einer MS zu erkranken, verstärkt. Die Ermittlung prädisponierender Genkombinationen könnte sowohl eine individuelle Beschreibung des Risikos (Suszeptibilität), an der MS zu erkranken, als auch therapeutische Konsequenzen erlauben.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 25
Tabelle 1: Charakteristika der genetischen Marker
Marker
Poly-
Genbe-
immunologische
morphis-
zeichnung
Bezeichnung
HLA-DRB1
HLA-DR
Funktion
mus
HLA-DR
SNP
Peptidpräsentation
TNFa
IL-1A
Mikrosatellit
Mikrosatellit
interge-
Marker der TNF-
entzündungs-
netisch
Region
fördernd
IL-1A
Interleukin 1°
entzündungsfördernd
IL-2
Mikrosatellit
IL-2
Interleukin 2
entzündungsfördernd
IL-5RA
FGF1A (be-
Mikrosatellit
Mikrosatellit
nachbart)
IFNA/W/B
Mikrosatellit
IL-5RA
Interleukin 5
B-Zell-
Rezeptor α
Entwicklung
intergene-
Fibroblasten-
mitogen für
tisch
Wachstumsfaktor 1A
Astrozyten
IFNA
Interferon-α
entzündungshemmend
CD3D
Mikrosatellit
CD3D
δ-Kette von CD3
Signalweiterleitung
TCRDVAJ
Mikrosatellit
TCRDVAJ
TZR α/δ
Antigenerkennung
TEA
TCRBV6S1
TCRBV6S1
TCRBV6S3
TCRBV6S7
TCRBV6S7
Mikrosatellit
Mikrosatellit
SNP
Mikrosatellit
Mikrosatellit
SNP
TEA
TCRBV6S1
TCRVB6S1
TCRBV6S3
TCRBV6S7
TCRBV6S7
Transkriptionselement
VDJ-
α
Rekombination
V-Element der TZR-ß-
Antigen-
Kette
erkennung
V-Element der TZR-ß-
Antigen-
Kette
erkennung
V-Element der TZR-ß-
Antigen-
Kette
erkennung
V-Element der TZR-ß-
Antigen-
Kette
erkennung
V-Element der TZR-ß-
Antigen-
Kette
erkennung
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 26
2. Untersuchungsklientel, Material und Methoden
2.1. Untersuchungsklientel
Gesunde Probanden (Kontrollen)
Als Kontrollpopulation für die formalgenetischen Analysen und Assoziationsstudien dienten Blutproben von 395 bisher nicht an MS erkrankter Individuen, welche von Dr. Kühnl, Dr. Benn und Dr. Darda (Universitätsklinik Eppendorf,
Transplantations-Immunologie, Hamburg) freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. Das Alter der gesunden Probanden liegt zwischen 23 und 60 Jahren, im Durchschnitt bei 38 Jahren. Das Verhältnis von Frauen zu Männern beträgt 1:2,5.
Patienten
Die Patientengruppe setzte sich aus 358 nicht verwandten MS-Patienten zusammen. Sie wurden in den neurologischen Abteilungen der Universitätskliniken Bochum von Dr. Pöhlau (Neurologie, St. Josefs Hospital), Dr. Sindern
(Neurologie, Kliniken Bergmansheil), Dr. Haupts (Neurologie, KnappschaftsKrankenhaus) und Dr. Weber (Neurologie, Universitätsklinik Göttingen) klinisch
charakterisiert. Die Diagnose MS wurde gemäß den Kriterien nach Poser gestellt [Poser et al., 1983]. Das Ausmaß der Behinderung und die Verlaufsform
wurden mittels der Kurtzke-Skala (EDSS) ermittelt [Kurtzke, 1983]. Von den untersuchten Patienten zeigten 55% einen schubförmigen Verlauf, 27% einen sekundär chronisch progredienten Verlauf und 18% einen primär chronisch progredienten Verlauf. Das Alter bei Erstmanifestation lag zwischen 11 und 50 Jahren (im Durchschnitt bei 29 Jahren) und das Verhältnis von Frauen zu Männern
betrug 1,9:1.
Bochum, Göttingen und Hamburg liegen zwischen dem 51. und 54. Breitengrad. Die Städte und deren Einzugsgebiete zeigen ähnliche klimatische Bedingungen und eine ähnliche Zusammensetzung der Bevölkerung.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 27
2.2. Material
2.2.1. Oligonukleotidsynthese
Die Synthese von Oligonukleotiden (mehrere über Phosphodiesterbindungen
verknüpfte Mononukleotide) wird für die Herstellung von sogenannten Primern
bei der Polymerase-Kettenreaktion und die Herstellung von sogenannten Gensonden bei der Hybridisierung benötigt. Es wurden chemische Verfahren eingesetzt, die auf der Triester- oder Phosphoramiditmethode beruhen [Gassen and
Köhler, 1987]. Die eingesetzten Oligonukleotide wurden freundlicherweise von
Dr. Mäueler und Dipl. Biologe Träger nach der Phosphoramidit-Methode auf
einem Oligo 1000 DNA-Synthesizer der Firma Beckman hergestellt und anschließend in konzentriertem Ammoniak aufgenommen und für mindestens 5
Stunden bei 56°C entschützt. Anschließend wurde der Ammoniak in einer Vakuum-Zentrifuge abgedampft. Das Sediment wurde in 200 µl H2O aufgenommen.
2.2.2. PCR-Bedingungen
Multiplex PCR: IL-1, CD3D, TNF
Primer
Oligonukleotid
IL-15
5`- CCT GCC TAG TGA GTG TGG AAG
IL-13
5`- GTG TTG ATG TAG ATT GTG TGT GC -3`
CD3D5
5`- CTT TGC TGG ACA TGA GAC TGG A -3`
CD3D3
5`- TAG CTG GTG CAT AAG CTC AC
TNFB1
5`- CCT CTA GAT TTC ATC CAG CCA CA -3`
TNFB2a
5`- CTC TCT CCC CTG CAA CAC ACA
-3`
-3`
-3`
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 28
PCR-Bedingungen:
Zyklusschritt
TM
Zeit
TM
Zeit
TM
Zeit
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
Denaturieren
94
5,0
Denaturieren
94
1,0
94
1,0
94
0,3
Anlagerung
61
1,0
58
1,0
55
1,0
Erweiterung
72
1,0
72
1,0
72
1,0
Schleifen
1x
1x
25 x
72
Erweiterung
5,0
Multiplex PCR: IL-2, IL-5R
Primer
Oligonukleotid
IL-25
5`- AAA GAG ACC TGC TAA CAC A
-3`
IL-23
5`- CCT ATG TTG GAG ATG TTT AT
-3`
IL-5R5
5`- AAT GAT CTT TTT CTA GGT AGA -3`
IL-5R3
5`- CCT CTG GAG CTT GAG ATA
-3`
PCR-Bedingungen:
Zyklusschritt
TM
Zeit
TM
Zeit
TM
Zeit
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
Denaturieren
94
5,0
Denaturieren
94
1,0
94
1,0
94
0,3
Anlagerung
54
1,0
49
1,0
47
1,0
Erweiterung
72
1,0
72
1,0
72
1,0
Schleifen
1x
Erweiterung
1x
25 x
72
5,0
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 29
Multiplex PCR: FGF, IFNα
Primer
Oligonukleotid
FGFA5
5`- CAG CAC TGA GCG AGT GTG G
FGFA3
5`- GTA GCA TTA CAT TTG CAC TTG G -3`
IFNA5
5`- TGC GCG TTA AGT TAA TTG GTT
-3
ÌFNA3
5`- GTA AGG TGG AAA CCC CCA CT
-3`
-3`
PCR-Bedingungen:
Zyklusschritt
TM
Zeit
TM
Zeit
TM
Zeit
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
Denaturieren
94
5,0
Denaturieren
94
1,0
94
1,0
94
0,3
Anlagerung
59
1,0
56
1,0
53
1,0
Erweiterung
72
1,0
72
1,0
72
1,0
Schleifen
1x
1x
25 x
72
Erweiterung
Multiplex PCR: TCRBV6S1, TCRBV6S3
Primer
Oligonukleotid
TCRVB6S1
Vb6.15
5`- CAT CCT GCC CTG ACT CTG TC
-3`
Vb6.13
5`- GAC ACA AGT TGA GAA CAG GAT G -3`
TCRBV6S3
cgVb6L1
5`- CAG GCT CCT CTT CTG GGT GG
-3`
Vb6.3
5`- TTT GCG ACT TTG TAC CTA GGG G -3`
5,0
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 30
PCR-Bedingungen:
Zyklusschritt
TM
Zeit
TM
Zeit
TM
Zeit
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
Denaturieren
94
5,0
Denaturieren
94
1,0
94
1,0
94
0,3
Anlagerung
66
1,0
63
1,0
60
1,0
Erweiterung
72
1,0
72
1,0
72
1,0
Schleifen
1x
1x
25 x
72
Erweiterung
5,0
Multiplex PCR: TCRBV6S7, TCRDV3AJ61
Primer
Oligonukleotid
TCRBV6S7
cgVb6L1
5`- CAG GCT CCT CTT CTG GGT GG
-3`
Vb6.7
5`- TCT ACA TCC TTT CCC TTC TCT GT -3`
TCRDV3AJ61
prhVd1
5`- TGC CAC CCA TAA CCA ACC TCA A -3`
prhVd2
5`- AGA TAA GCT CCC TGC CCT CAT A -3`
PCR-Bedingungen:
Zyklusschritt
TM
Zeit
TM
Zeit
TM
Zeit
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
Denaturieren
94
5,0
Denaturieren
94
1,0
94
1,0
94
0,3
Anlagerung
66
1,0
63
1,0
60
1,0
Erweiterung
72
1,0
72
1,0
72
1,0
Schleifen
1x
Erweiterung
1x
25 x
72
5,0
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 31
Multiplex PCR: TEA
Primer
Oligonukleotid
TEA5
5`- TTG ATC ACT CAT ATC ACT GAG AAG -3`
TEA3
5`- GTA GAC AAG AAA ATG TCC ATT TAT C -3`
PCR-Bedingungen:
Zyklusschritt
TM
Zeit
TM
Zeit
TM
Zeit
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
[°C]
[Min]
Denaturieren
94
5,0
Denaturieren
94
1,0
94
1,0
94
0,3
Anlagerung
66
1,0
63
1,0
60
1,0
Erweiterung
72
1,0
72
1,0
72
1,0
Schleifen
1x
Erweiterung
1x
25 x
72
5,0
2.2.3 Lösungen und Puffer
Chemikalien
Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen J.T. Baker, Merck, Serva oder Sigma bezogen.
Plastikwaren
Einmalartikel, Reagenzgefäße etc. wurden von den Firmen Sarstedt, Greiner
oder Nunc bezogen.
Lösungen (allgemein)
Die Lösungen wurden nach Bedar entweder autoklaviert oder sterilfiltriert (0,22
µm). Es wurde ausschließlich bidestilliertes Wasser verwendet.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 32
Ladepuffer für Agarose-Gele:
0,25% Bromphenolblau
0,25% Xylencyanol FF
15% (w/v) Ficoll (Typ 400)
in bidestilliertem Wasser
Ethidiumbromidlösung:
0,5 mg/ml Ethidiumbromid
40%ige Polyacrylamid-Lösung (PAA):
76 g Acrylamid
4 g Bisacrylamid
auf 200 ml bidestilliertes Wasser
Ladepuffer für denaturierende PAA-Gele:
Formamid, deionisiert mit AG
501-XA
0,03% Bromphenolblau
0,03% Xylencyanol FF
20 mM MSTA
Ladepuffer für Gelelektrophorese:
89 mM Tris
89 mM Borsäure
2 mM MSTA
20x Standard-Salzlösung (SSC):
3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat (H 7,0)
Tris-MSTA (TE)-Puffer:
10 mM Tris/HCl (pH 8,0)
1 mM MSTA
Schwaches Detergenz:
0,1% Nonidet P40 (NP 40)
Starkes Detergenz:
10% SDS
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 33
Lösungen für die PCR
10x Taq-Puffer:
200 mM Tris/HCl (pH 8,4)
500 mM KCl
MgCl2-Lösung:
50 mM MgCl2
dNTP-Lösung:
je 2 mM aller 4 Nukleotide in H2O
(pH 7,5)
Oligonukleotidprimer für PCR:
je 10 pmM/µl in H2O
Lösungen für die Hybridisierung
Kinase-Puffer:
20 mM Tris HCl
4 mM MSTA
100 mM NaCl
pH 7,4
Denaturierungslösung für Filter:
0,5 M NaOH
0,15 M NaCl
Neutralisierungslösung für Filter:
0,5 M Tris/HCl (pH 8,0)
0,15 M NaCl
Hybridisierungslösung für Oligonukleotide:
5x SSPE
5x Denhardt`s Lösung
0,1% (v/v) SDS
10 µg/ml E.coli-DNA (ultraschallbehandelt und hitzedenaturiert)
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 34
20x Na-Phosphat-Puffer (SSPE):
3 M NaCl
0,2 M NaH2PO4
0,02 M Na2MSTA
pH 7,4
100x Denhardt`s Lösung:
2% Polyvinylpyrolidon (PVP40)
2% Rinderserumalbumin (BSA)
2% Ficoll (Typ 400)
2.3 . Methoden
2.3.1. DNA-Isolierung aus EDTA-Blut [verändert nach Miller et al., 1988]
10 ml EDTA-Blut wurden für die Isolierung von DNA mit der 3-4fachen Menge
an sterilem Wasser versetzt, um die Erythrozyten zur Lyse zu bringen. Nach
Zentrifugation bei 3300 g für 20 Minuten bei 4°C wurde das Zellsediment in 25
ml 0,1% NP40 resuspendiert. NP40 lysiert die Zellmembran der Leukozyten
ohne die Kernmembran anzugreifen. Nach erneuter Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde das Zellsediment in 3 ml Proteinase-K-Puffer resuspendiert und mit 200 µl 10% SDS und 20 µl Proteinase-K versetzt und mindestens 2 Stunden bei 55°C oder über Nacht bei 37°C inkubiert. Zur Fällung der
Proteine wurde 1 ml gesättigtes NaCl zugegeben und anschließend das gefällte
Protein durch Zentrifugation bei 3300 g und 4°C für 15 Minuten sedimentiert.
Der Überstand wurde mit doppeltem Volumen an 100%igem Ethanol versetzt,
die beiden Flüssigkeiten unter leichtem Schwenken vermischt und die frisch gefällte DNA mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet, in 200 µl TE aufgenommen und bei 37°C gelöst.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 35
2.3.2. Konzentrationsbestimmungen von Nukleinsäuren
Die Konzentration und der Reinheitsgehalt der DNA wurden durch die Messung
des Absorptionsspektrums (200-400 nm) in einem Spektralphotometer (Uvicon
930 Kontron) bestimmt. Hierzu wurde 1 ml einer 1:200 Verdünnung der DNA in
H2O hergestellt und in eine Quarzküvette überführt. Bei einer Wellenlänge von
260 nm entspricht 1 OD einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml [Sambrook et
al., 1989]. Weitere Messungen wurden bei 230 nm und 280 nm durchgeführt.
Der Quotient 260/280 gibt Anhalt über das ungefähre Maß der Verunreinigung
durch Proteine, und der Quotient 230/260 gibt einen Anhalt für die Verunreinigung durch Salze. Bei starker Verunreinigung durch Proteine wurde die DNA
mittels Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol-Extraktion nachgereinigt.
2.3.3. Polymerase-Kettenreaktion [modifiziert nach Saiki et al., 1988]
Die PCR ermöglicht eine beliebige Vermehrung von bestimmten DNASequenzen. Mittels eines Enzyms (Taq-DNA-Polymerase) wird nach Denaturierung der zu untersuchenden DNA in Gegenwart strangspezifischer Primer (Oligonukleotide mit komplementärer Sequenz zu den Randbereichen des zu vervielfältigen DNA-Abschnittes) und eines radioaktiv markierten Nukleotids der
interessierende DNA-Bereich neu synthetisiert. Das Enzym benötigt diese kurzen (15-20 Nukleotide) Startermoleküle mit einem freien 3`-OH-Ende als Startpunkt für die DNA-Synthese (5`→3`). Nach gelelektrophoretischer Auftrennung
der vervielfältigten DNA-Abschnitte werden die markierten Fragmente mittels
Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Zusammensetzung der Primer und die Bedingungen für die Durchführung
der PCR wurden bereits im Abschnitt 1 unter Material beschrieben.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 36
Ein Reaktionsansatz setzte sich zusammen aus:
200 ng DNA
x µl
10x Taq-Puffer
2,5 µl
dNTP (2 mM)
2,5 µl
1-3 Primerpaare (je 25 pmol/µl) 1-3 µl
MgCl2 (50 mM)
y µl
[α³²P]-dCTP (300 mCi/µmol)
0,1-0,2 µl
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
0,2 µl
Für die Versuche wurden entweder 200 µl Reaktionsgefäße oder 96erMikrotiterplatten (Costar) verwendet. Der Reaktionsansatz wurde mit einem
Tropfen leichten Mineralöls überschichtet, um die Lösung vor dem Verdampfen
zu schützen. Je nach Konzentration der in TE gelösten DNA wurde ein unterschiedliches Volumen (x µl) der DNA-Lösung eingesetzt. MgCl2 benötigt das
Enzym als Kofaktor und wurde deshalb für jede unterschiedliche Multiplex-PCR
titriert (unterschiedliche µl), um eine möglichst optimale und spezifische Amplifikation zu erhalten.
2.3.4. Gelelektrophoresen
Agarosegelelektrophorese
Als Amplifikationskontrolle wurden die PCR-Fragmente in einem 1-2%igen Gel
aufgetrennt. Hierzu wurden horizontale Elektrophoresesysteme benutzt. Als
Laufpuffer wurde 1x TBE verwendet.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
Für den Nachweis polymorpher Mikrosatelliten ist eine Auftrennung in hochauflösenden PAA-Gelen erforderlich (4-6%ige Polyacrylamid-Gele). Die Auftrennung der radioaktiv markierten Fragmente erfolgte entsprechend der Vorschrift
von Sambrook et al. [Sambrook et al., 1989]. Es wurden vertikale Elektrophoresesysteme von Stratagene eingesetzt. 5 µl eines PCR-Produktes wurden mit 5
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 37
µl Sequenziergeladefarbe versetzt und durch Erhitzen denaturiert. Anschließend wurden 3 µl dieses Ansatzes auf das PAA-Gel aufgetragen. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte bei Raumtemperatur und 60 W. Die Laufzeiten
betrugen je nach Größe der PCR-Produkte zwischen 3 und 5 Stunden. Anschließend wurde das PAA-Gel auf ein Filterpapier (Schleicher & Schüll, GB
002) transferiert und für 2 Stunden auf einem Vakuumtrockner bei 80°C getrocknet. Mittels Autoradiographie wurden die Laufunterschiede der PCRFragmente dokumentiert und anschließend ausgewertet.
2.3.5. Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden [modifiziert nach Thein
and Wallace, 1986]
Für die radioaktive Markierung des Oligonukleotids (Kinasierung) wurde folgender Reaktionsansatz gemischt:
10x Kinasepuffer
1 µl
10 pmol zu markierendes Oligonukleotid
1 µl
bidestilliertes Wasser
2 µl
[γ³²-P]-dATP (10 µCi/µl)
5 µl
T4-Polynukleotidkinase (1 U/µl)
1 µl
Der Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 10 µl wurde für 1-2 Stunden auf Eis inkubiert und anschließend das nicht eingebaute [γ³²-P]-dATP mittels Ionenaustauschchromatographie (DE52-Ionenaustauschsäule) von den
markierten Oligonukleotiden getrennt. Für die Elution wurde eine Säule vorbereitet. Eine mit Glaswolle gestopfte 2 ml-Spritze wurde mit 0,2 - 0,4 ml DE52
Cellulose gefüllt und anschließend mit 5 ml TE gewaschen. Zur Reinigung des
Oligonukleotids wurde der Reaktionsansatz mit TE auf 100 µl Gesamtvolumen
aufgefüllt und auf die Säule gegeben. Nun erfolgte ein zweimaliger Waschvorgang mit jeweils 2 ml TE, 2 ml 0,2 M NaCl in TE und 0,5 ml 0,5 M NaCl in TE
(Eluierung) pro Vorgang. Die Markierung des Oligonukleotids wurde mittels eines Szintillationszählers überprüft.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 38
2.3.6. Hybridisierung [modifiziert nach Miyada et al., 1985]
Unter Hybridisierung versteht man generell die Bildung eines doppelten DNAStranges aus 2 voneinander getrennten Einzelsträngen durch komplementäre
Basenpaarung unter geeigneten Reaktionsbedingungen. Mittels einer markierten Gensonde (spezifisches Oligonukleotid mit bekannter Sequenz) lässt sich
eine gesuchte Sequenz in einem bestimmten DNA-Bereich nachweisen.
Der DNA-Bereich des TEA-Gens wurde mittels PCR amplifiziert und danach die
DNA-Fragmente mit einem automatischen Pipettiergerät (Biomac 1000 der Firma Beckman) auf Nylon-Membranen übertragen. Die DNA wurde auf die NylonMembran fixiert. Die Hybridisierungen wurden in verschlossenen Glasröhren in
temperierbaren Drehinkubatoren (ca. 6 Upm, der Firma Bachofer) durchgeführt.
Die Filter wurden in Glasröhren gelegt und 10-20 ml Hybridisierungslösung dazu gegeben. Zunächst wurden die Filter vorhybridisiert (15 min. bis 1 Std.) und
anschließend das markierte Oligonukleotid zugegeben (ad 106 cpm/ml). Die
Hybridisierungsdauer betrug 2-4 Stunden bei einer Schmelztemperatur von minus 5°C. Die Temperatur wurde für Oligonukleotide von < 25 Basen nach der
Formel: TM = [(A+T) x 2°C] + [(C+T) x 4°C] errechnet [Saiki et al., 1988]. Die
Hybridisierung erfolgte i.d.R. bei TM minus 5°C, für die beiden Allele des TEAGens wurde bei 55°C hybridisiert. Das Einhalten exakter Temperaturen ist äußerst wichtig. Nach der Hybridisierung wurden die Filter dreimal jeweils 30 min.
mit 6xSSC bei Raumtemperatur gewaschen. Es folgte ein 90 Sekunden dauernder Waschgang in 6xSSC bei TM minus 5°C und ein Waschgang von 20
min. bei Raumtemperatur in 6xSSC. Die Filter wurden getrocknet, mit einem
Röntgenfilm exponiert und das Autoradiogramm ausgewertet. Für eine erneute
Hybridisierung wurden die Filter in 0,5 mM MSTA-Lösung (pH 8,0) für 30 Minuten bei 60°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurden sie für 5
min. bei Raumtemperatur mit 6xSSC equilibriert und standen für eine erneute
Hybridisierung zur Verfügung.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 39
2.3.7. Dokumentation der Ergebnisse
Fotografie
Mit
Ethidiumbromid
gefärbte
Agarosegele
wurden
auf
einem
UV-
Transiluminator (Model TR-302 der Firma Spectroline) bei einer Wellenlänge
von 302 nm betrachtet. Die visualisierten DNA-Fragmente wurden mittels Kamera der Firma Biotec Fischer aufgenommen, digitalisiert und die Bilder über
einen Thermodrucker (p66-E) der Firma Mitsubishi ausgedruckt.
Autoradiografie
Die Darstellung radioaktiv markierter DNA-Fragmente nach Gelelektrophorese
erfolgte durch Exposition mittels Röntgenfilm (Fuji RX oder Kodak), mit oder
ohne Verstärkerfolie (Quanta III-T Dupont). Die Expositionszeit betrug zwischen
wenigen Stunden und bis zu mehreren Wochen. Bei Verwendung von Verstärkerfolien erfolgte die Lagerung der Filmkassetten bei minus 70°C, sonst bei
Raumtemperatur. Die Filme wurden in einem M35 X-OMAT der Firma Kodak
entwickelt.
2.3.8. Computerprogramme und Statistische Auswertung
Die Daten wurden beurteilt unter der Annahme, dass geerbte Gene, die eine
Prädisposition für MS bewirken, entweder kodominant oder rezessiv vererbt
werden. Die Auswertung der Mikrosatelliten erfolgte über Eingabe der einzelnen
Genotypen
der
untersuchten
Individuen
in
ein
dBASE
IV-Tabellen-
kalkulationsprogramm. Das dBASE-Programm wurde freundlicherweise von Dr.
Charmley (USA) zur Verfügung gestellt und so erweitert, dass auch eine Analyse von 20 Allelen pro Locus möglich war. Für die statistische Auswertung wurden sowohl Allelfrequenzen, Genotypfrequenzen, als auch Phänotypfrequenzen
berechnet. Des Weiteren wurde nach der Formel von Botstein et al. [1980] der
Polymorphismus-Informationsgehalt für jeden Locus berechnet (PIC). Außerdem wurde die erwartete und beobachtete Heterozygotierate bestimmt. Relative
Risiken (RR), Werte für die ätiologische Fraktion (EF) und präventive Fraktion
(PF) wurden nach den Formeln von Svejgaard et al. [1982] berechnet. Die Be-
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 40
stimmung der stärksten Assoziation zwischen 2 gekoppelten Loci wurde untersucht mittels der ”2 bei 4”-Tafel [Svejgaard and Ryder, 1994]. Das Computerprogramm wurde freundlicherweise von Dr. Ansari zur Verfügung gestellt. Mit
einem Computerprogramm in Anlehnung an Arnold & Albert und Hansen et al.
[1979] wurde das Kopplungsungleichgewicht von DNA-Markern innerhalb der
MHC-Klasse-II-Region beurteilt.
2.3.9. Gentechnologische Sicherheitsbestimmungen
Alle gentechnologischen Experimente wurden unter S1-Bedingungen gemäß
den Vorschriften zur Regelung von Fragen der Gentechnik vom 20. Juni 1990
(BGB1.I S.1080) durchgeführt.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 41
3. Ergebnisse
3.1. Charakterisierung des Untersuchungskollektivs
Von gesunden Probanden und Patienten wurde die DNA aus 10 ml Frischblut
isoliert. Die klinischen Daten (Diagnose, Krankheitsverlauf, Alter, Geschlecht)
wurden von den beteiligten Kliniken zur Verfügung gestellt (Tabelle 2). Von den
358 Patienten zeigten 55% einen schubförmigen, 27% einen sekundär chronisch progredienten und 18% einen primär progredienten Verlauf. 39% der Patienten hatten einen EDSS-Wert von 0,5-3,5, 43% einen EDSS-Wert von 4,06,5 und 18% einen EDSS-Wert von 7,5-9,5. Der Krankheitsbeginn lag bei 111
Patienten weniger als 5 Jahre zurück, bei 102 Patienten 5-10 Jahre zurück, und
145 Patienten waren länger als 10 Jahre erkrankt. Von den anonymen Spendern waren Alter und Geschlecht bekannt. Die HLA-Typisierung der Patienten
und der gesunden Probanden erfolgte in der Arbeitsgruppe von Frau Dr. C.
Epplen, die Daten wurden mir für die Auswertung zur Verfügung gestellt. Patienten und gesunde Probanden wurden nach unterschiedlichen Kriterien in
Gruppen eingeteilt (Krankheitsbeginn, Krankheitsverlauf, Progression, Geschlecht, HLA-Typ) und auf eine mögliche Assoziation mit den verschiedenen
genetischen Markern überprüft.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 42
Tabelle 2: Charakterisierung der untersuchten Patienten
EDSS-Wert und
schubför-
sek. chron.
prim. pro-
Erkrankungsdauer miger
progredien- gredienter
in Jahren (MSJ)
ter Verlauf
EDSS 0,5 – 3,5
Verlauf
Gesamt
Verlauf
123 (35%)
8 (2%)
8 (2%)
139 (39%)
MSJ < 5
62
2
2
66
MSJ 5 – 10
36
2
3
41
MSJ > 10
25
4
3
32
69 (19%)
53 (15%)
33 (9%)
155 (43%)
MSJ < 5
21
7
10
38
MSJ 5 – 10
21
11
10
42
MSJ > 10
27
35
13
75
5 (1%)
34 (10%)
25 (7%)
64 (18%)
MSJ < 5
1
5
1
7
MSJ 5 – 10
3
8
8
19
MSJ > 10
1
21
16
38
197 (55%)
95 (27%)
66 (18%)
358
MSJ < 5
84
14
13
111
MSJ 5 – 10
60
21
21
102
MSJ > 10
53
60
32
145
EDSS 4,0 – 6,5
EDSS 7,0 – 9,5
Gesamt
EDSS = Progressionsrate nach Kurtzke, MSJ = Erkrankungsdauer in Jahren
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 43
3.2. Gene des MHC und ihre Assoziation mit MS
3.2.1. MHC Allel HLA-DRB1
MS-Patienten und gesunde Probanden wurden HLA-DRB1 typisiert. Tabelle 3
zeigt die Phänotypfrequenzen von 358 Patienten und 370 gesunden Personen.
Das relative Risiko (RR), an MS zu erkranken, ist 3-4mal höher bei Expression
des Allels HLA-DRB1*15 (RR 3,64, pc<10-8). Als zweiter genetischer Prädispositionsfaktor konnte HLA-DRB1*03 bestimmt werden (RR 1.42, pc <0,8). 75%
aller Patienten tragen zumindest eines der beiden prädisponierenden Allele,
während diese nur bei 47% der gesunden Probanden vorkommen (s. Tabelle
3). Aufgrund der höheren Frequenz der prädisponierenden Allele kommen die
Genotypen
HLA-DRB1*15/15
(8%),
HLA-DRB1*03/03
(4%)
und
HLA-
DRB1*03/15 (9%) bei den MS-Patienten häufiger vor als bei den gesunden
Probanden
[HLA-DRB1*15/15
(5%),
HLA-DRB1*03/03
(3%)
und
HLA-
DRB1*03/15 (3%)]. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verlaufsformen der MS, schubförmiger oder chronisch progredienter Verlauf, zeigte sich
kein signifikanter Unterschied in der Verteilung der Allele HLA-DRB1*15 und
HLA-DR1*03 (s. Tabelle 4).
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 44
Tabelle: 3 MHC Allel HLA-DRB1 Phänotypfrequenzen
Phänotypfrequenz in %
HLA-DRB
Patienten
Kontrollen
(N=358)
(N=370)
RR
EF
PF
pC
0,10
<0,13
01 (DR1)
13,97
22,34
0,56
15 (DR2)
56,42
26,22
3,64
16 (DR2)
2,23
3,24
0,68
03 (DR3)
28,49
21,89
1,42
04 (DR4)
20,39
21,62
0,93
NS
11 (DR5)
17,04
21,08
0,77
NS
12 (DR5)
3,35
4,32
0,77
NS
13 (DR6)
12,29
22,43
0,48
14 (DR6)
1,68
4,05
0,40
NS
07 (DR7)
15,36
17,84
0,84
NS
08 (DR8)
10,34
6,76
1,59
NS
09 (DR9)
1,40
3,24
0,42
NS
10
0,28
0,81
0,34
NS
<10-8
0,41
NS
0,08
<0,8
0,12
<0,013
(DR10)
NS = nicht signifikant, RR = relatives Risiko, EF = Ätiologische Fraktion,
PF = präventive Fraktion, pC = p-korrigiert nach Bonferoni
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 45
Tabelle 4: HLA-DRB1 Phänotypfrequenzen von MS-Patienten mit unterschiedlichem Verlaufstyp
HLA-DRB1
Kontrollen
MS
RRMS
SPMS
PPMS
(N=370)
(N=358)
(N=197)
(N=95)
(N=66)
01 (DR1)
22,34
13,97
16,24
9,47
13,64
15 (DR2)
26,22
56,42
54,31
55,79
63,64
16 (DR2)
3,24
2,23
2,03
3,16
1,51
03 (DR3)
21,89
28,49
26,90
30,52
30,30
04 (DR4)
21,62
20,39
21,32
24,21
12,12
11 (DR5)
21,08
17,04
18,27
11,58
21,21
12 (DR5)
4,32
3,35
4,06
2,10
3,03
13 (DR6)
22,43
12,29
14,21
13,68
4,54
14 (DR6)
4,05
1,68
1,52
3,16
0,00
07 (DR7)
17,84
15,36
14,72
15,79
16,66
08 (DR8)
6,76
10,34
9,64
13,68
7,58
09 (DR9)
3,24
1,40
1,52
1,05
1,51
10 (DR10)
0,81
0,28
0,51
0,00
0,00
RRMS = schubförmiger Verlauf, SPMS = sekundär progredienter Verlauf,
PPMS = primär progredienter Verlauf
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 46
3.2.2. TNFa
Die Gene, welche für den Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) und Lymphotoxin α
(LTα) kodieren, befinden sich im Bereich des MHC-Klasse-III auf dem kurzen
Arm von Chromosom 6 in der Region 6p21.3. Sie liegen etwa 320 kb centromerwärts von HLA-B und 340 kb telomerwärts von C2/BF. Der TNFaMikrosatellit ist 3,5 kb stromaufwärts des LTα-Gens lokalisiert [Nedospasov et
al., 1991, Udalova et al., 1993] und wurde als Marker für die TNF-Region benutzt. Er ist aus (GT)n-Wiederholungseinheiten zusammengesetzt und ist mit 14
Allelen hoch informativ. Die Auswertung des Längenpolymorphismus zeigte eine erhöhte Phänotypfrequenz des Allels 11 bei den MS-Patienten (48%) im
Vergleich zu den gesunden Probanden (31%), mit einem relativen Risiko von
2,05 (s. Tabelle 5). Die Assoziation des TNFa 11 Allels mit der MS war jedoch
bedingt durch die Kopplung mit HLA-DRB1*15. Das Kopplungsungleichgewicht
von HLA-DRB1*15 und TNFa 11 war sowohl hoch signifikant bei den Patienten
(∆=0,798; ∆ rel. 0,44; χ²=49,2) wie auch bei den gesunden Probanden
(∆=0,522; ∆ rel. 0,43; χ²=36,0). Im Gegensatz dazu scheinen die Allele TNFa 3,
TNFa 4 und TNFa 5 eher protektiv zu sein (s. Tabelle 5). Von diesen 3 Allelen
zeigte TNFa 5 ein signifikantes Kopplungsungleichgewicht mit HLA-DRB1*01,
die anderen beiden Allele zeigten kein auffälliges Kopplungsungleichgewicht mit
HLA-DRB1. Die ermittelte Allel-Verteilung wurde unter Berücksichtigung der
HLA-Typen HLA-DRB1*15 und -DRB1*03 sowie des unterschiedlichen Krankheitsverlaufs betrachtet (Ergebnisse s. Tabelle 9). Somit konnte keine Assoziation unabhängig vom HLA-Typ für den Mikrosatelliten Marker TNFa nachgewiesen werden.
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 47
Tabelle 5: TNFa Phänotypfrequenzen bei MS-Patienten und Kontrollen
Locus/
Patien-
Kontrol-
Allele
ten
len
%
%
TNFa
(N=325)
a14
RR
EF
PF
pC
(N=393)
0,51
0,24
NS
a13
2,46
2,54
0,97
NS
a12
2,77
1,02
2,77
NS
a11
47,69
30,79
2,05
a10
22,15
23,92
0,91
NS
a9
3,38
3,56
0,95
NS
a8
1,54
1,78
0,86
NS
a7
15,38
16,03
0,95
NS
a6
20,00
21,37
0,92
NS
a5
8,62
12,98
0,63
NS
a4
8,92
17,56
0,46
a3
0,62
1,53
0,40
NS
a2
48,62
48,09
1,02
NS
a1
1,54
1,78
0,86
NS
a0
0,00
0,25
0,40
NS
<10-4
0,24
0,09
<0,15
NS = nicht signifikant, RR = relatives Risiko, EF = Ätiologische Fraktion,
PF = präventive Fraktion, pC = p-korrigiert nach Bonferoni
3.3. Assoziationen von TZR-Genen und MS
3.3.1. Längenpolymorphismus der TCRBV-Familie
Auf dem langen Arm von Chromosom 7 in der Region q35, über einen Bereich
von 600 kb, befinden sich die Gene für die ß-Kette des TZR. Bis auf das
TCRBV21-Element liegen alle TCRBV-Elemente centromerwärts und 5` von
den Genen für die TCRBD-, TCRBJ- und TCRBC-Elemente. Mindestens 20%
der Gene für den TZRB-Gen-Komplex haben 2 oder mehr Allele, so z.B. die
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 48
Gene für TCRBV1S1, TCRBV2S1, TCRBV6S1, TCRBV6S3, TCRBV6S7,
TCRBV6S11, TCRBV6S12, TCRBV6S13 und TCRBV6S14. Die Polymorphismen können sich funktionell unterschiedlich auswirken. Sie beruhen entweder
auf Veränderungen der Nukleotidsequenz ohne Auswirkung auf die Aminosäuresequenz (stiller Austausch) oder führen zu Veränderungen der Aminosäuresequenz und zu strukturellen Veränderungen des TZR-Moleküls, z.B.
TCRBV6S7 und TCRBV6S1. Die Allele können über Längenvarianten von Dinukleotiden im 1. Intron des TZRBV-Elementes definiert werden, z.B. bei Mitgliedern der TZRBV6-Familie (TCRVB6S1 und TCRBV6S7 [Gomolka et al.,
1993]). Assoziationsanalysen wurden durchgeführt mit Mikrosatelliten, welche
im ersten Intron der Loci von TCRBV6S1, TCRBV6S3 und TCRBV6S7 gelegen
sind. Der TCRBV6S1-Locus besitzt 5 Längenvarianten einfach repetitiver Elemente, TCRBV6S3 besitzt 6 und TCRBV6S7 16 verschiedene Längenvarianten. Die intronischen Wiederholungseinheiten (GT)9-11 von TCRBV6S1 sind gekoppelt mit dem exonischen Allel TCRBV6S1*1, die intronischen Wiederholungseinheiten (GT)12-13 korrelieren hingegen mit dem Allel TCRBV6S1*2. Für
TCRBV6S7 gilt, dass intronische Wiederholungseinheiten (GT)18-28 mit dem exonischen Allel TCRBV6S7*1 und intronische Wiederholungseinheiten (GT)14-17
mit dem Allel TCRBV6S7*2 gekoppelt sind. Somit können exonische Polymorphismen indirekt über die (GT)n Wiederholungseinheiten ermittelt werden.
Die 6 verschiedenen Längenvarianten von TCRBV6S3 repräsentieren nur ein
Exon [Gomolka et al., 1993 und 1994, Li et al., 1990].
Die Auswertung der Allel-Verteilung der TZRBV-Familie zeigte für TCRBV6S1
und TCRBV6S7 weder für die unterschiedlichen Längenvarianten noch für die
exonischen Polymorphismen eine Assoziation mit MS (s. Tabelle 9). Es zeigte
sich jedoch eine signifikante Assoziation für Allel 2 des TCRBV6S3-Allels (RR =
2,72; pc < 0,006), die sich in Kombination mit dem HLA-DRB1*03-Allels deutlich
erhöhte (RR = 22,03; pc < 0,005). Im Gegensatz dazu scheinen die TCRBV6S3Allele 3, 4 und 5 eher protektiv zu sein (Tabellen 6, 9).
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 49
Tabelle 6: TCRBV6S3 Phänotypfrequenzen bei MS-Patienten und Kontrollen
TCRBV6 Phänotypfrequenzen in %
S3
Kontrollen
Patienten
Allel
(N=393)
(N=322)
RR
EF
PF
pc
1
0,51
0,31
0,61
2
5,09
12,73
2,72
3
23,41
12,73
0,48
0,12
<0,006
4
9,41
4,00
0,40
0,06
<0,06
5
0,25
0,00
0,41
7
96,69
97,20
1,19
HLA-
HLA-
DRB1*15
DRB1*15
(N=108)
(N=183)
1
0,93
0,00
0,20
2
4,63
10,93
2,53
3
33,33
13,11
0,30
0,23
<5x10-3
4
11,11
6,01
0,51
0,05
7
91,67
96,17
2,29
0,54
HLA-
HLA-
DRB1*03
DRB1*03
(N=81)
(N=99)
1
0,00
1,14
2,79
0,01
2
1,23
21,59
22,03
0,21
3
18,52
11,36
0,56
0,08
4
12,35
1,14
0,08
0,11
7
96,30
98,86
3,35
0,09
<0,006
0,16
0,07
<5x10-3
<0,18
0,69
NS = nicht signifikant, RR = relatives Risiko, EF = Ätiologische Fraktion,
PF = präventive Fraktion, pC = p-korrigiert nach Bonferoni
Obgleich die Verteilung von TCRBV6S1-Allelen bei Kontrollen und Patienten
keinen signifikanten Unterschied ergab (s. Tabelle 7), wurde für die Allele
TCRBV6S1 und TCRBV6S3 in beiden Gruppen ein unterschiedliches
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 50
Kopplungsungleichgewicht gefunden. Beide TZR-V-Elemente sind etwa 150 kb
voneinander entfernt. Bei MS-Patienten fand sich ein Kopplungsungleichgewicht für Allel 2 des TCRBV6S1 Locus mit Allel 3 des TCRBV6S3 Locus,
während bei den gesunden Probanden ein Kopplungsungleichgewicht für Allel 1
des TCRBV6S1 Locus mit Allel 3 des TCRBV6S3 Locus bestand. Ein Vergleich
bei HLA-DRB1*15+ und HLA-DRB1*15 - Patienten zeigte, dass die Allelkombination (TCRBV6S1, Allel 2 /TCRBV6S3, Allel 3) insbesondere
bei HLA-
DRB1*15+ positiven Personen mit einem höheren Risiko für MS verbunden ist.
Bei den gesunden HLA-DRB1*15 positiven Probanden war diese Allelkombination nur äußerst selten zu finden (s. Tabelle 8).
Tabelle 7: TCRBV-Allelfrequenzen von MS-Patienten und Kontrollen
Kontrollen
TCRBV
unselek- HLA-
Allel Nr
tiert
Patienten
HLA-
Unselek- HLA-
HLA-
DRB1*15 DRB1*15 tiert
DRB1*15 DRB1*15-
+
-
+
BV6S1
1
9,3%
10,8
8,6
9,9
9,1
11,1
2
21,1%
23,1
20,6
18,3
19,7
17,2
3
0,4%
0,0
0,6
0,8
0,6
1,1
4
0,1%
0,0
0,2
0,2
0,0
0,0
5
69,1%
66,1
70,0
70,8
70,6
70,6
1
0,3%
0,2
0,2
0,2
0,0
0,4
2
2,5%
2,4
2,3
7,1
6,6
8,0
3
11,8%
17,0
9,7
6,5
6,3
6,5
4
4,8%
5,7
4,5
2,0
2,9
0,8
5
0,1%
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
7
80,4%
74,5
83,3
84,2
84,3
84,4
BV6S3
Tabelle
8:
Zwei-Punkt-Haplotypfrequenzen
und
LD
(∆)
zwischen
TCRBV6S1- und TCRBV6S3-Allelen von Patienten und Kontrollen
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 51
HaploUntersuchungskollektiv
BV6S1 BV6S3 typfre- ∆ x 104
Allel
Allel
Rel. ∆
χ²
quenz
X (104)
Patienten (N=312)
Kontrollen (N=393)
Patienten DRB1*15+
1
3
69
3
0,01
0,0
2
3
309
189
0,35
12,5
1
3
337
226
0,28
22,6
2
3
371
119
0,13
3,1
1
3
94
36
0,06
0,5
2
3
369
244
0,48
11,0
1
3
549
365
0,41
10,4
2
3
49
-344
-0,88
5,0
1
3
35
-37
-0,51
0,3
2
3
202
91
0,35
1,3
1
3
222
138
0,18
7,2
2
3
411
210
0,27
7,9
(N=174)
Kontrollen DRB1*15+
(N=106)
Patienten DRB1*15(N=131)
Kontrollen DRB1*15(N=257)
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 52
3.3.2. Längenpolymorphismus von TCRDVAJ
Der TZRα-Gen-Komplex umfasst etwa 1000 kb und ist auf dem langen Arm von
Chromosom 14, in der Region q11.2, lokalisiert. Die Gene für die δ-Kette, etwa
20 kb, sind in diesem Bereich integriert [Kay, 1996]. Der Mikrosatellit TCRDVAJ
liegt 1,5 kb 3` vom TCRDV3-Locus und 3,8 kb 5` vom TCRAJ61P-Genelement
entfernt und wurde als polymorph beschrieben [Cornelis et al., 1992]. Es wurden 11 Allele mit Wiederholungseinheiten von (GT)19 bis (GT)28 sowie (GT)31
beschrieben.
Die Längenvarianten des Mikrosatelliten TZRDVAJ zeigen eine 2-gipfelige Verteilung, einen Gipfel bei Allel 5 und einen bei Allel 8. Dieser Verteilungsmodus
legte den Verdacht nahe, dass eine mögliche Kopplung oder Korrelation mit
funktionell unterschiedlichen Allelen vorliegen könnte. Aufgrund dessen wurde
ein diallelischer Polymorphismus des benachbarten Transkriptionselements α
mittels SSCP-Analyse und Sequenzierung identifiziert. Die Mikrosatelliten-Allele
der TZRDVAJ-Region und Polymorphismen des TEA-Gens kamen zwar häufiger als erwartet gemeinsam vor, waren aber nicht absolut eng miteinander gekoppelt [Gomolka et al., 1995]. Eine Assoziation für MS konnte bei 325 untersuchten Patienten für die Mikrosatelliten-Allele des TZRDVAJ Locus nicht
nachgewiesen werden (s. Tabelle 9).
3.3.3. Dialleler Polymorphismus von TEA
1,8 kb stromabwärts von dem Mikrosatelliten TCRDVAJ und 5` vom TCRAJElement-Cluster, liegt eine regulatorische Sequenz, Transcription Element α
(TEA). Die Transkription von TEA (kontrolliert durch den TEA-Promoter und
dem TCRA-Verstärker) führt vermutlich zum Öffnen des JA-Element-Clusters
für das Rearrangement und die Deletion von TCRDJC. TEA zeigt einen diallelen Polymorphismus (TEA1 und TEA2) in der Promotorregion mit jeweils einem
Basenaustausch [Gomolka et al. 1995, de Chasseval and de Villarty, 1993]. Eine Assoziation für MS konnte bei 288 untersuchten Patienten für den diallelischen Polymorphismus nicht nachgewiesen werden (s. Tabelle 9).
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 53
3.3.4. Längenpolymorphismus von CD3D
Die α- und ß-Kette, bzw. die γ- und δ-Kette des TZR sind nicht kovalent mit dem
CD3-Komplex assoziiert. Der CD3-Komplex besteht aus einer γ-, δ- und ε-Kette,
die eng gekoppelt auf Chromosom 11q23 lokalisiert sind und koordiniert exprimiert werden. Die ζ- und η-Kette sind auf Chromosom 1q22-23 lokalisiert. Diese 5 Untereinheiten des CD3-Komplexes dienen der Weiterleitung des Signals
vom TZR in das Zellinnere. Der Mikrosatellit CD3D wurde unter der Bezeichnung Mfd69 [Weber et al., 1990a] beschrieben. Er ist im Intron 3 des Gens lokalisiert, welches für die δ-Kette des CD3-Komplexes kodiert. Eine Assoziation für
MS konnte bei 320 untersuchten MS-Patienten für die Mikrosatelliten-Allele
nicht nachgewiesen werden (s. Tabelle 9).
3.4. Assoziationen von Zytokin-Genen und MS
3.4.1. Längenpolymorphismus von IL-1A
Die Interleukin-1-Familie besteht aus IL-1A, IL-1B sowie den Rezeptoren IL1RA und IL-1RB. Die Gene, welche für die IL-1-Familie kodieren liegen auf dem
langen Arm von Chromosom 2 in der Region q13-21. Zwischen IL-1A und IL-1B
besteht nur etwa 26% Homologie. Der Mikrosatellit IL-1A, bestehend aus
(CA)n-Wiederholungseinheiten, befindet sich im Intron 5 des IL-1A-Gens. Es
sind 9 unterschiedliche Längenvariationen beschrieben [Epplen C. et al., 1994].
Eine Assoziation für MS konnte bei 318 untersuchten MS-Patienten für die Mikrosatelliten-Allele nicht nachgewiesen werden (s. Tabelle 9).
3.4.2. Längenpolymorphismus von IL-2
Das Gen, welches für IL-2 kodiert, liegt auf dem langen Arm von Chromosom 4
in der Region q26-27. Es besteht aus 4 Exons. Der Mikrosatellit liegt in der 3`
flankierenden Region des IL-2-Locus und besteht aus einer gemischten
(CA)n(CT)m-Wiederholungseinheit. Es sind 17 verschiedene Längenvariationen
beschrieben [Epplen C. et al. 1994]. Eine Assoziation für MS konnte bei 324
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 54
untersuchten Patienten für die Mikrosatelliten-Allele nicht nachgewiesen werden
(s. Tabelle 9).
3.4.3. Längenpolymorphismus von IL-5RA
Das Gen, welches für den Rezeptor von IL-5 kodiert, liegt auf dem kurzen Arm
von Chromosom 3, in der Region p24-26. Der Mikrosatellit IL-5RA, eine (GA)nWiederholungseinheit, befindet sich in der 3` untranslatierten Region (UTR) des
IL-5RA-Gens. Es sind 10 verschiedene Längenvarianten beschrieben [Epplen
C. et al., 1994]. Eine Assoziation für MS konnte bei 322 untersuchten Patienten
für die Mikrosatelliten-Allele nicht nachgewiesen werden (s. Tabelle 9).
3.4.4. Längenpolymorphismus von FGF1A
Das Gen, welches für den Fibroblasten-Wachstums-Faktor (FGF) kodiert, befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 5, in der Region q31 [Gospodarowciz et al., 1987]. Es sind 8 verschiedene Längenvarianten beschrieben.
Eine Assoziation für MS konnte bei 322 untersuchten Patienten für die Mikrosatelliten-Alelle nicht nachgewiesen werden (s. Tabelle 9).
3.4.5. Längenpolymorphismus von IFNA
Interferone wurden erstmalig von Isaacs und Lindenmann 1957 als Proteine mit
antiviraler Wirkung beschrieben [Isaacs and Lindemann, 1957]. Interferone
werden in 3 Familien, IFNA, IFNB und IFNW, eingeteilt [Diaz et al., 1994]. α-IFN
sind Produkte einer Multigenfamilie mit einer Reihe von Pseudogenen. Das natürliche IFNα stellt immer ein Gemisch verschiedener Subtypen dar, das Molekulargewicht der α-IFN liegt zwischen 16-20 kD. Das Gen des schon lange bekannten β-1-IFN ist wie IFNα auf dem Chromosom 9 lokalisiert und weist eine
Sequenzhomologie von 40-50% auf. Deshalb geht man von einem gemeinsamen Vorläufergen aus und bezeichnet die IFNα und IFNß1 auch als Typ I IFN.
IFNγ repräsentiert den Typ II der Interferone. Die Gene, welche für die IFN vom
Typ I kodieren, liegen auf dem kurzen Arm von Chromosom 9, in der Region
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 55
p13-22.
Der
Mikrosatellit
IFNA,
bestehend
aus
einer
(CA)n-
Wiederholungseinheit, ist in der proximalen Hälfte des IFNA/IFNW-Gen-Cluster
lokalisiert [Kwiatkowski and Diaz, 1992]. Eine zunächst auffällige, inverse Korrelation von Allel 1 (N = 319 MS-Patienten, N = 370 Kontrollen; RR = 0,65; p <
0,01) und damit Schutzfaktor konnte nach Korrektur für multiple Vergleiche (pc
nicht signifikant) nicht bestätigt werden. Eine solche protektive Wirkung von
IFNα- stände im Einklang mit seiner antiviralen Funktion und einer möglicherweise viral ausgelösten MS. Somit konnte keine Assoziation für MS bei den untersuchten 319 Patienten nachgewiesen werden (s. Tabelle 9)
Immungenetische Prädispositionsfaktoren der Multiple Sklerose........................................................... 56
Tabelle 9: Assoziationen von polymorphen immunrelevanten Genen mit
MS
5`flank (GT)n
16(1402)
0,86
JA
-
IL-1°
2q13-21 Intron 5 (CA)n 10(1308)
0,72
-
IL-2
4q26-27 3`flank (CA)n
17(1466)
0,89
IL-5RA
3p24-26 3`UT (GA)n
11(1466)
7(1166)
CP f
6p21.3
R/R e
LTA (TNFa)
DRB1*03d
JA
DRB1*15c
erwartete
Heterozygotie
Totalb
0,89
phismus
13(740)
Polymor-
Exon 2
Lokalisation
6p21.3
Chromosom
HLA-DRB1*
Locus
Allele (N)
Assoziation mit MSa
HLAKomplex
JA
JA
-
JA
JA
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,78
-
-
-
-
-
0,54
-
-
-
-
-
-
-
Zytokine
FGF1A
5q31
5`UT (GT)n
Interferone
IFNB/A/W
9p22
Intergen.
(CA)n
10(1358)
0,66
[JA]
TZR/CD3
CD3D
11q23
TCRDVAJ
14q11.2
TEA
14q11.2
Intron 3 (CA)n
[JA]
[JA]
[JA]
[JA]
-
-
-
-
9(1410)
0,75
-
-
-
-
-
11(1356)
0,77
-
-
-
-
-
Promotor
2(1222)
0,46
-
-
-
-
-
Intron 1 (GT)n
5(1446)
0,45
-
-
-
-
-
2(1446)
0,41
-
-
-
-
-
Intergen.
(GT)n
TCRBV6S1
7q35
TCRBV6S1*1/2
7q35
TCRBV6S3
7q35
Intron 1 (GT)n
6(1458)
0,34
JA
JA
JA
JA
JA
TCRBV6S7*1/2
7q35
Intron 1 (GT)n 15(1560)
0,83
-
-
-
-
-
TCRBV6S7
7q35
0,43
-
-
-
-
-
Exon 2 VElement
Exon 2 VElement
2(1560)
a [JA]: p-Wert signifikant, pc-Wert nicht signifikant; JA: p-Wert signifikant, pcWert signifikant; b N=288-368; c N=176-208, d N=79-101; e N=157-197 (R/R
= schubförmig); f N=137-161 (CP = chronisch progredient)
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
57
4. Diskussion
4.1. Analyse immunrelevanter Genorte mittels Mikrosatelliten
Im Gegensatz zu Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLPs) haben Fragmentlängendifferenzen repetitiver Sequenzen, sogenannte Mikrosatelliten, einen höheren Informationsgehalt. Bei RFLP finden sich meist 2 Allele,
während die oft verwendeten Mikrosatelliten-Marker i.d.R. 15 (+/-10) Allele aufweisen. Der technische Ablauf konnte so organisiert werden (Pipettierautomaten, Mikrotiterplatten, PCR-Maschinen), dass in einem Arbeitsgang die DNA
von 96 Proben in mehreren Mikrotiterplatten vorgelegt wurde. Bei geeigneter
Auswahl von Startermolekülen für die PCR können der Fragmentlängenbereich
festgelegt und so mehrere Loci (Marker) gleichzeitig untersucht werden (Multiplex PCR, d.h. bis zu 3 PCR-Systeme gleichzeitig). Auf diese Weise konnte eine
Vielzahl von Analysen in kurzer Zeit und kostengünstig durchgeführt werden.
Mikrosatelliten sind über das gesamte Genom verteilt und häufig hochpolymorph (Heterozygotierate > 0,70) [Weber, 1990b, Edwards et al., 1991]. Mikrosatelliten, welche als Marker für Kandidatengene in Frage kommen, liegen entweder intronisch, im 3`UTR, im 5`UTR oder das Gen flankierend. Die Relevanz
unterschiedlicher
Allel-Verteilungen
intronischer
Wiederholungseinheiten
(Mikrosatellitenallele) als Marker exonischer Polymorphismen ist für einige der
eingesetzten Mikrosatelliten beschrieben. Ein Beispiel ist die Allel-Verteilung
einiger TZRBV-Mikrosatelliten (TZRBV6S1 und TZRBV6S7), welche je nach
Länge ihrer Wiederholungseinheiten eine Assoziation mit bestimmten exonischen Polymorphismen zeigen [Gomolka et al., 1994]. Für die Korrelation der
Mikrosatellitenallele mit exonischen Polymorphismen konnten Expressionsunterschiede nachgewiesen werden [Vissinga et al., 1994], die Auswirkungen auf
den Verlauf der Immunantwort haben können.
Mikrosatellitensysteme sind als Marker für Assoziationsstudien geeignet, wenn
ihre Mutationsrate nicht derart hoch ist, dass Kopplungsungleichgewichte zu
Suszeptibilitätsgenen nicht mehr nachgewiesen werden können. Des Weiteren
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
58
gelten sie als hochinformativ, wenn sie eine Heterozygotierate > 70 bzw. einen
PIC > 0,70 (Polymorphismus-Informationsgehalt) zeigen. Untersuchungen über
die Variabilität von Mikrosatelliten-Allelen zwischen und innerhalb von Populationen zeigten, dass z.T. signifikante Unterschiede vorliegen [Gomolka et al.,
1994, Wall et al., 1993, Edwards et al., 1992]. Somit muss jedes Mikrosatellitensystem in den unterschiedlichen ethnischen Gruppen separat untersucht
werden, um zuverlässige Aussagen über die Allelfrequenzen und über eine
mögliche Relevanz für die Prädisposition zu verschiedenen Autoimmunerkrankungen machen zu können. Insbesondere können Assoziationsstudien in ihrer
Relevanz stark eingeschränkt bzw. verfälscht werden, wenn die zum Vergleich
gezogenen gesunden Probanden nicht auf die ethnische Gruppe der untersuchten Patienten abgestimmt sind. Unterschiede in der Allelfrequenz von Populationen können auf verschiedenen Faktoren beruhen (Selektionsdruck, genetische Drift, Gründereffekte u.a.). Diese Fehlermöglichkeit bzgl. der Zusammensetzung des Patienten- und Kontrollkollektivs konnte in dieser Studie weitestgehend ausgeschlossen werden. In die Untersuchung wurden nur Kaukasier aus
dem Umkreis von Bochum, Göttingen und Hamburg einbezogen. Klimatische
Verhältnisse und Bevölkerungszusammensetzung der Patienten- und Kontrollpopulationen dürften sich weitgehend entsprechen.
Mittels der verwendeten genetischen Marker (Mikrosatellitensysteme) sollte überprüft werden, ob die gewählten Kandidatengene als Prädispositionsfaktoren
für die MS in Betracht kommen (Suszeptibilitätsgene). Hierbei geht man davon
aus, dass Mutationen in funktionell relevanten Bereichen eines Gens gemeinsam mit einer oder mehreren konsekutiven Längenvarianten vorkommen. Eine
enge Korrelation eines Polymorphismus und der Längenvariante(n) des Mikrosatelliten erlaubt so eine technisch einfache indirekte Typisierung. Sind solche
strengen Kopplungen noch nicht bekannt, so kann das Suchverfahren mittels
Mikrosatellitenanalyse ein Indikator für benachbarte evtl. funktionell relevante
Polymorphismen sein. Hinweisend sind insbesondere Assoziationen bestimmter
Allele mit dem Krankheitsbild und zweigipflige Allelverteilungskurven.
Die Vererbung von Suszeptibilitätsgenen kann dominant, rezessiv oder kodominant erfolgen. Somit müssen neben der Ermittlung der Allelfrequenz auch die
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
59
Phänotyp- und Genotypfrequenz bestimmt werden. Während bei dominanter,
u.U. auch bei kodominanter Vererbung das Vorhandensein von nur einem
betreffenden Allel für eine Prädiposition ausreicht (Analyse mittels Vergleich der
Phänotypfrequenz), so bedarf es bei rezessiver Vererbung der Untersuchung
auf Homozygotie der betreffenden Allele.
Bei der vorliegenden Arbeit wurde davon ausgegangen, dass die untersuchten
Marker entweder zur Manifestation der MS beitragen oder den Krankheitsverlauf beeinflussen. Deshalb wurden Patienten mit schubförmigem Verlauf, mit
sekundär progredientem Verlauf oder mit chronischem Verlauf ebenfalls evaluiert. Da anzunehmen ist, dass mehrere genetische Faktoren gemeinsam zur
MS prädisponieren, wurden die hier untersuchten genetischen Marker noch zusätzlich in den Patientengruppen ausgewertet, die bereits einen der bekannten
genetischen Prädispositionsfaktoren tragen, nämlich HLA-DRB1*15 oder HLADRB1*03, oder für die beiden Merkmale negativ sind. Diese Gruppen wurden
mit den entsprechenden Subgruppen des Kontrollkollektivs verglichen.
4.2. Gene des MHC-Komplexes als Prädispositionsfaktoren für MS
4.2.1. HLA-DRB1 Allele und MS
Der MHC enthält mehr als 200 bekannte Gene; eine Besonderheit ist die geringe Rekombinationhäufigkeit von etwa 1% (2-3 cM) für eine genetische Distanz
von 8 Millionen Basenpaaren. Deshalb erben die meisten Menschen je einen
unveränderten (nicht rekombinierten) Chromosomenabschnitt. Dieser Chromosomenabschnitt (Haplotyp) enthält i.d.R. die Allele der MHC-Gene von einem
der beiden möglichen Chromosomen der Mutter, während der zweite Haplotyp
die Allele eines Chromosomenabschnitts des Vaters enthält, ausgenommen bei
Rekombinationsereignissen. Auffällig ist, dass sich Haplotypfrequenzen zwischen verschiedenen ethnischen Gruppen unterscheiden. So finden sich die
Haplotypfrequenzen HLA-A1 und HLA-B8 5mal häufiger als erwartet in der Bevölkerung von Boston [Crozo et al., 1995]. Diese Diskrepanz, dass bestimmte
Haplotypen häufiger oder seltener auftreten als bei einem genetischen Gleich-
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
60
gewicht der Allele zu erwarten wäre, beruht auf dem sog. Kopplungsungleichgewicht. Das Kopplungsungleichgewicht reflektiert möglicherweise eine relativ
späte Entstehung einiger Allele, bevorzugte Fortpflanzung innerhalb von Populationen, Selektion bestimmter Haplotypen (z.B. Schutz vor der schweren Form
der Malaria [Hill and Allsopp, 1991] bei bestimmten MHC-I- oder MHC-IIMolekülen) oder eine Unterdrückung genetischer Rekombinationen. Das
Kopplungsungleichgewicht ist ein wesentlicher Faktor bei der Suche nach Suszeptibilitätsgenen.
Seit den 70er Jahren ist die Assoziation bestimmter HLA-Typen mit der MS bekannt. Bei Kaukasiern zeigt sich eine Assoziation zwischen den Haplotypen
DRB1*1501, DRB1*0101, DQA1*0102 und DQB2*0602 und dem Risiko für MS
[Olerup and Hillert, 1991]. Während HLA-DRB1*1501 bei nicht verwandten Patienten eine Assoziation zeigte, konnte dieses für Familienstudien nicht bestätigt
werden [Kellar-Wood et al., 1995]. Es zeigte sich bei den untersuchten deutschen Patienten und gesunden Kontrollen eine Erhöhung des relativen Risikos
für die HLA-Typen DRB1*15 und DRB1*03, ähnlich der bei den Schweden aus
der Studie von Olerup [Olerup and Hillert, 1991]. Mindestens einen dieser beiden HLA-Typen exprimierten 75% der untersuchten Patienten. Diese Assoziation lässt sich am besten durch das Vorhandensein von bestimmten unterschiedlichen Genkombinationen bei bestimmten Gruppen von Patienten erklären. Eine
Korrelation bestimmter HLA-Allele bei MS-Patienten und dem Krankheitsverlauf [Olerup et al., 1989] konnte für die hier untersuchte Patientengruppe nicht
bestätigt werden.
Welche Gemeinsamkeiten besitzen die beiden HLA-DRB1 Allele, die ein häufigeres Vorkommen von HLA-DRB1*15 und HLA-DRB1*03 erklären könnten?
Bei der Rheumatoiden Arthritis, einer chronisch-entzündlichen Systemerkrankung, findet sich eine Assoziation mit DR1, bestimmten DR4-Subtypen und einem bestimmten DRw6-Typ. Bei diesen HLA-DRB1-Allelen finden sich in der 3.
hypervariablen Region Gemeinsamkeiten in der Antigenbindungsstelle, die über
ein gemeinsames potentielles Antigen die Assoziation erklären.
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61
Bei den prädisponierenden HLA-Allelen der MS gibt es kein gemeinsames Epitop. Hier kann man von zwei Hypothesen ausgehen:
1. Bei der MS gibt es verschiedene potentielle Autoantigene, welche Bestandteile des Myelins (MBP, PLP, MOG und MAG) sind. Es ist somit möglich,
dass ein bestimmtes MHC-Molekül eines dieser Autoantigene besonders effektiv präsentieren kann, ist dann auch noch eine T-Zelle mit einem geeigneten Rezeptor vorhanden, kommt es zur Autoimmunität. Ein anderes potentielles Autoantigen könnte eine andere Kombination von TZR und MHCMolekül erforderlich machen.
2. Die ermittelten prädisponierenden HLA-DRB1*-Allele spielen keine unmittelbare Rolle, sondern bestimmte Allele von Genen, die im Kopplungsungleichgewicht mit dem HLA-Allel sind (s. Abschnitt über TNFa und MS).
4.2.2. TNFa und MS
ZNS-Läsionen im zentralen Nervensystem von MS-Patienten sind charakterisiert durch eine Migration und Infiltration von MHC-Klasse-II positiven Zellen
und Lymphozyten durch die Blut-Hirn-Schranke, Demyelinisierung der Nervenzellen und Astrocyten-Proliferation. TNFα und LTα (TNFß) sind in Astrocyten
von Entmarkungsherden nachgewiesen worden, sie werden von infiltrierten
Makrophagen und Mikrogliazellen gebildet. Des weiteren wurde eine erhöhte
Konzentration dieser Zytokine im Liquor von Patienten mit aktiver MS festgestellt. In Zellkulturen von ZNS-Gewebe zeigte TNFα eine hohe zytotoxische Aktivität gegenüber Oligodendrozyten, es induziert den Zelltod von Oligodendrozyten mittels Apoptose [Selmaj et al., 1991a]. Die TNFα-Konzentration im Liquor
von MS-Patienten mit chronisch progredientem Verlauf ist höher als bei den
Patienten mit stabilem Verlauf [Sharief and Hentges, 1991]. Bei Untersuchungen an transgenen Mäusen bewirkte eine hohe Expression von TNFα in Astrozyten die spontane Manifestation einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) mit toxischer Wirkung auf Oligodendrozyten [Taupin et al.,
1997, Probert et al., 1995]. Der pathogene Effekt auf Oligodendrozyten lässt
sich durch Injektion entsprechender Antagonisten oder monoklonaler Antikörper
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(= mAK) gegen TNF in Tiermodellen aufheben. Eine Behandlung mit mAK, die
spezifisch für TNF sind, konnte die Entwicklung einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) verhindern [Ruddle et al., 1990]. Des Weiteren
korreliert die Höhe der TNFα-mRNA-Konzentration mit der Schwere der EAE
[Renno et al., 1995]. Eine verstärkte Expression von TNFα findet sich in einer
Reihe von ZNS-Erkrankungen (MS, AIDS, Morbus Parkinson, u.a.) [Taupin et
al., 1997]. Somit hat TNF möglicherweise eine entscheidende Funktion bei der
Pathogenese der MS [Vasalli, 1992].
Die Assoziation des Auftretens von TNF-Produktion und eines bestimmten
HLA-Typs könnte auf einem Kopplungsungleichgewicht zwischen HLA- und
TNF-Allelen beruhen [Pociot et al., 1993]. Somit geben Assoziationen von bestimmten HLA-Allelen evtl. nur Hinweise auf die prädisponierenden TNF-Allele,
welche dann die eigentlichen strukturellen oder regulatorischen Defekte tragen.
Die ermittelte Assoziation des TNFa-Mikrosatellitenallels TNFa11 in dieser Studie zeigte, dass die Assoziation durch das Kopplungsungleichgewicht mit HLADRB1*15 bedingt war. Mittels der 2 mal 4 Tafel nach Svejgaard wurde die unabhängige Assoziation des HLA-DRB1-Gens vom TNFa11-Gen statistisch belegt. Diese Untersuchung schließt jedoch nicht aus, dass andere Gene des
MHC-Komplexes, die ebenfalls im Kopplungsungleichgewicht mit HLA-DRB1
stehen, die eigentlichen Kandidatengene sind. Andere potentielle Kandidatengene der TNF-Region (TNFα, LTα, LTß und das Leukozyten spezifische
Transkript 1 = LST-1) sollten unmittelbar untersucht werden.
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63
4.3. TZR-Komplex und MS
4.3.1. Die TCRBV6-Familie
Die Gene, welche für die TZRB-Kette kodieren, sind in einem Bereich von 600
kb auf dem langen Arm von Chromosom 7q35 angeordnet. Es wurden 34
TCRBV-Familien beschrieben, von denen die meisten aus nur jeweils einem
Mitglied bestehen [Slightom et al., 1994]. Fast alle der zuletzt beschriebenen
Familien bestehen aus Pseudogenen, so dass neuere Studien von 58 funktionell exprimierten TCRBV-Genen ausgehen [Wei et al., 1994]. Bei der Untersuchung dieser Region auf mögliche genetische Prädispositionen für MS wurden
in den meisten Studien RFLP-Analysen durchgeführt [Vandevyver et al., 1994,
Hillert et al., 1991, Lynch et al., 1991, Fugger et al., 1990b]. Nur in einer Studie
ist ein Mikrosatellit eingesetzt worden [Wood et al., 1995]. Die in dieser Studie
eingesetzten Mikrosatelliten sind im ersten Intron der TCRBV6S1-, TCRBV6S3und TCRBV6S7-Elemente lokalisiert.
Eine Assoziation bestimmter Allele konnte für TCRBV6S1 und TCRBV6S7 weder für die Mikrosatelliten- noch für die exonischen Polymorphismen nachgewiesen werden. Auch eine Betrachtung der Genotyp- und Phänotypfrequenzen
unter Berücksichtigung der HLA-Typen HLA-DRB1*15 und HLA-DRB1*03 sowie
der unterschiedlichen Verlaufsformen der MS zeigte keine Auffälligkeiten. Es
fand sich aber eine signifikante Assoziation von Allel 2 des TCRBV6S3 Allels
(RR = 2,72; pc < 0,006), die sich in Kombination mit dem HLA-DRB1*03 deutlich erhöhte (RR = 22,03; pc < 0,005). Interessanterweise besaß nur ein Individuum der 81 HLA-DRB1*03 positiven Kontrollpersonen dieses Allel 2. Bei einer
Prävalenz von etwa 0,001 würde man in einer Kontrollgruppe von ca. 500 Individuen einen potentiellen MS-Patienten erwarten. Somit ist es denkbar, dass
dieses Individuum zu einem späteren Zeitpunkt noch eine MS aufzeigen könnte. Weiterführende Analysen müssen nun zeigen, ob im kodierenden Sequenzbereich funktionell relevante Polymorphismen lokalisiert sind, die hier evtl. indirekt erfasst wurden. Ein funktionell relevanter Polymorphismus muss jedoch
nicht in dem Gen selbst lokalisiert sein, er kann sich auch in einem der benachbarten Gene befinden.
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Eine Zwei-Punkt-Haplotypanalyse zeigte Unterschiede im Kopplungsungleichgewicht der Mikrosatelliten TCRBV6S1 und TCRBV6S3. Ein Kopplungsungleichgewicht kann jedoch durch genetischen Drift sowie durch Zu- und Abwanderungen innerhalb einer Population deutlich beeinflusst werden [Ohta,
1982]. Darum sind hieraus ermittelte Schlussfolgerungen stets mit entsprechender Vorsicht zu ziehen. Kopplungsungleichgewichte, welche auf funktionellen Wechselwirkungen beruhen, lassen sich auf Grund bestimmter Charakteristika für Kopplungsungleichgewichte definieren [Thomson et al., 1987]. Der
Haplotyp TCRBV6S1*2/ TCRBV6S3*3 war vorherrschend bei den untersuchten
Patienten, wohingegen der Haplotyp TCRBV6S1*1/TCRBV6S3*3 bei den gesunden Probanden dominierte. Unter Berücksichtigung von HLA-DRB1*15 zeigt
sich bei HLA-DRB1*15+ Patienten ein vermehrtes Vorkommen des Haplotyps
TCRBV6S1*2/TCRBV6S3*3, hingegen findet man bei den HLA-DRB1*15- Patienten eine leichte Unterpräsentation dieses Haplotyps. Bei den Kontrollpersonen zeigt sich dieser Haplotyp bei den HLA-DRB1*15+, während er bei den
HLA-DRB1*15-
fast
völlig
fehlt.
Somit
scheint
der
Haplotyp
TCRBV6S1*2/TCRBV6S3*3 bei HLA-DRB1*15+ ein Prädispositionsfaktor zu
sein. In weiterführenden Untersuchungen ist zu klären, welches der 18 TCRBVGene innerhalb dieser Kopplungsgruppe für das Krankheitsbild relevant ist.
Kann die ursächliche Beteiligung eines bestimmten T-Zellrezeptor Allels ermittelt werden, wäre die Entwicklung einer T-Zellvakzine denkbar.
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4.3.2. TCRDVAJ und TEA
Das TEA liegt 1,8 kb stromabwärts vom Mikrosatelliten TCRDVAJ und 5` vom
TCRAJ-Element-Cluster. Die TEA-Transkription ist begrenzt auf die Entwicklung
von T-Zellen im Thymus [Wilson et al., 1996]. Die Transkription von TEA führt
vermutlich zum Öffnen des Jα-Clusters für die V(D)J-Rekombinase [de Villartay
and Cohen, 1990]. Untersuchungen an Mäusen mit einer Deletion des TEAGens zeigten, dass die Trankription von TEA für das Rearrangement nur bei
einer kleinen Gruppe von Jα-Segmenten (Jα61-Jα53) zwingend erforderlich ist
[Villey et al., 1996]. Bei den untersuchten Patienten zeigte sich keine Prädisposition für den diallelischen Polymorphismus von TEA. Für die TZRα-Kette konnte bisher weder für die variable noch für die konstante Region eine Korrelation
zur MS nachgewiesen werden [Eoli et al. 1994]. Ebenso wenig zeigten Familienstudien auffällige Assoziationen zwischen MS und der TZRα-Kette [Lynch et
al., 1992]. Der Mikrosatelliten-Marker TCRDVAJ, welcher zwischen DV und
AJ61P lokalisiert ist, zeigte keine Prädisposition für MS. Auch bei Berücksichtigung des HLA-Typs (HLA-DRB1*15 und 03) und des unterschiedlichen Krankheitsverlaufes (schubförmig oder chronisch progredient) zeigten sich keine Auffälligkeiten. Eine Übersicht der bisherigen Untersuchungen von Assoziationen
von Genen der TZRα-Kette liefert Compston et al. [1995].
4.4. Zytokine und Zytokin-Rezeptoren
Zytokine wirken u.a. toxisch auf Oligodendrozyten und Myelinscheiden von
Nervenzellen im ZNS. Darüber hinaus verstärken sie die Aktivität von Entzündungszellen. Weder IL-1 noch die bisher in keiner anderen Studie untersuchten
Mikrosatelliten-Marker für IL-2, IL-5R oder FGF1A zeigten eine auffällige Assoziation ihrer Allel-Verteilung mit einer Prädisposition für MS.
Das Allel 7 des hochpolymorphen Markers für die IFNA/W/B-Region fand sich
bei Patienten (8%) häufiger vor als bei den gesunden Probanden (1%), jedoch
war dieser Unterschied nach Korrektur der p-Werte nicht mehr signifikant. Das
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Allel 2 hingegen kam bei den gesunden Probanden (49%) häufiger vor als bei
den Patienten (39%) und hätte somit protektive Wirkung. Der Unterschied beider Gruppen war jedoch nach Korrektur der p-Werte ebenfalls nicht signifikant.
Interferone wurden primär als zelluläre Abwehrstoffe gegen die Ausbreitung von
Virusinfektionen im Gewebe entdeckt [Isaacs and Lindenmann, 1957]. Durch
Induktion verschiedener Stoffwechselprozesse verhindern sie die Virusvermehrung. Neben der antiviralen Wirkung (Hemmung der Virus-Replikation in der
Wirtszelle) induzieren Interferone die Expression von MHC-Klasse I und die
Produktion von TAP sowie die Aktivierung von NK-Zellen. Zusätzlich besitzen
sie antiproliferative Wirkung auf Tumoren sowie immunmodulatorische Aktivität
bei Autoimmunerkrankungen. IFNα zeichnet sich neben seiner antiviralen Wirkung besonders durch die Induktion der Expression von MHC-Klasse I und zusätzlich MHC-Klasse II aber auch durch die Aktivierung der NK-Zellen (Steigerung der Zytotoxizität) und Makrophagen (erhöhte Phagozytosekapazität) aus.
Das prädisponierende oder das protektive Allel des intergenischen Mikrosatelliten könnte hinweisend sein auf einen funktionell relevanten Polymorphismus,
der entweder im Interferon-beta Gen oder in einem der Interferon-alpha Gene
lokalisiert ist.
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67
5. Zusammenfassung
Der Einfluss genetischer Faktoren wird deutlich durch Adoptionsstudien, während sich der Beitrag von postulierten Umweltfaktoren, z.B. das geographische
Nord-Süd-Gefälle, unter Berücksichtigung von alterskorrigierten Erkrankungswahrscheinlichkeiten relativiert. Meine molekularbiologischen Untersuchungen
unterstreichen die Relevanz genetischer Prädispositionsfaktoren bei der MS.
Die Studie zeigt , dass insbesondere unter Berücksichtigung von Kandidatengenkombinationen signifikante prädisponierende genetische Merkmale bei der
MS erfasst werden können. Darüber hinaus weist die Studie auf genetische Heterogenität bei der MS hin, d.h. MS Patienten können unabhängig von ihrem
Krankheitsverlauf unterschiedliche Kombinationen prädisponierender Gene
aufweisen. Es scheint aber auch solche Prädispositionsfaktoren zu geben, die
den Krankheitsverlauf mitbestimmen. Hieraus ergibt sich ein Beitrag genetischer Faktoren bei der MS, der weitaus komplexer ist, als zunächst angenommen wurde. Dennoch werden eine standardisierte klinische Charakterisierung
von MS-Patienten und die Erstellung umfangreicher DNA-Profile dazu beitragen
können, verlässliche Parameter für Diagnostik, Prognose und Therapie zu etablieren. Eine zentrale Rolle wird weiterhin die Untersuchung von T-Zellen haben,
die in der Pathogenese der Autoimmunerkrankung im Vordergrund stehen. Der
Haplotyp TCRBV6S1*2 / TCRBV6S3*3 ist bei HLA-DRB1*15+ Patienten signifikant mit dem Krankheitsbild assoziiert. In weiterführenden Untersuchungen ist
zu klären, welches der 18 TCRBV-Gene innerhalb dieser Kopplungsgruppe für
das Krankheitsbild relevant ist. Kann die ursächliche Beteiligung eines bestimmten T-Zellrezeptor Allels ermittelt werden, wäre die Entwicklung einer TZellvakzine denkbar. Pathophysiologische Untersuchungen der Demyelinisierung und Remyelinisierung könnten weitere Kandidatengene erkennen lassen,
die nicht ausschließlich dem Immunsystem zuzuordnen sind. Gegebenfalls lassen sich auch hier therapeutische Strategien ableiten, die den Demyeliniserungsprozess verzögern, bzw. den Remyelinisierungsprozess unterstützen. Neben den rein genomischen Analysen könnten RNA-Expressionsprofile und Protein-Analysen, insbesondere zur Erfassung des Krankheitsverlaufs und zum
Therapie-Monitoring, künftig einen Beitrag leisten.
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83
7. Danksagung
Prof. Dr. med. J. T. Epplen danke ich für die Überlassung des Themas und die
Möglichkeit, in der Abteilung für Humangenetik selbständig zu arbeiten. Ganz
besonders danke ich Frau Prof. Dr. med. C. Hardt für die stets kompetente und
freundschaftliche Unterstützung in allen Bereichen meiner Promotion und darüber hinaus meiner wissenschaftlichen Laufbahn. Unter den vielen, stets hilfsbereiten Kollegen in der Abteilung möchte ich zwei namentlich hervorheben,
welche mir als Medizinstudent das praktische Arbeiten überhaupt erst ermöglicht haben: Frau G. Schlüter und Frau G. Rodepeter. Außerhalb der Abteilung
gilt mein ganz besonderer Dank sowohl für die Unterstützung bei der Überarbeitung des Layouts der Dissertation als auch für das unzählige Korrekturlesen
Frau S. Geisler. Für Inspiration und Korrektur sowie Verzicht auf viele gemeinsame Stunden möchte ich meiner Lebensgefährtin Pamela Christin Thissen
danken. Natürlich möchte ich nicht vergessen, meiner Mutter R. D’Souza und
meinem Bruder M. D’Souza für ihre Geduld beim langen Warten auf den
Abschluß der Doktorarbeit zu danken.
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
84
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Marcus D`Souza
Adresse:
Jägerhaus 95, 42287 Wuppertal
Telefonnummer:
0202/4604696
Geburtsdatum und -ort:
05.07.1969, Wuppertal
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
ledig
Ausbildung:
2003 –
AiP in der Klinik für Neurologie des St. Josef Hospitals in Bochum
1991 – 2002
Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum
1990 – 1991
Zahnmedizinstudium – Universität zu Köln
1989 – 1990
Zivildienst im Krankenpflegeheim „Haus Abendfrieden“, und in der Stiftung Tannenhof, beides Remscheid
1980 – 1989
Carl-Duisberg-Gymnasium,
Wuppertal;
Abschluss
Abitur
Wissenschaftliche Erfahrung:
2003 -
Aufbau eines Labors für Neurogenetik im Zentrum für
klinische Forschung (ZKF) an der Ruhr-Universität Bochum.
Forschungsarbeit über den genetischen Hintergrund bei
Morbus Parkinson und Betreuung einer Doktorarbeit
„Mutationen im TOR1-Gen bei Parkinson-Patienten“
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
2003
85
Stipendium für “The Baltic Summer School” in Kiel:
Neurodegenerative diseases: mechanisms and principles of
rational treatment. Theoretical part, 17.08.-29.08.03: Basic
and Clinical Sciences of Neurodegenerative Diseases;
Practical part, 01.09.-12.09.03: Clinical Management of PD
and Tremor.
1997
Teilnahme und Posterpräsentation auf dem 4.Workshop
Neurogenetik 2.-4.Oktober 1997 in Bochum
1994-1997
Doktorarbeit in der Molekulargenetik: “Immungenetische
Prädispositionsfaktoren der Multiplen Sklerose“, Institut für
Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum.
Eigene Seminare über Immungenetik und Immunologie
1995 – 1996
USA-Aufenthalt
Famulatur in der klinischen Genetik in der Abteilung für Kinderheilkunde und Forschungsarbeit in der Molekulargenetik
“Fabry disease“, Abteilung für Humangenetik, beides Mount
Sinai School of Medicine, New York City, N.Y., USA
Praktische Erfahrung:
2001 – 2002
Dozententätigkeit für die Ausbildung von Rettungsassistenten der Berufsfeuerwehr in Herne (Neurologie und Pathologie)
1997 – 2000
Dozententätigkeit für die Ausbildung von Krankenschwestern und -pflegern am Bethesda Krankenhaus
in Wuppertal (Anatomie, Physiologie, Mikrobiologie,
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Pathologie)
Immungenetische Grundlagen der Multiplen Sklerose--------------------------------------------------------
1994 – 1997
86
Dozententätigkeit für die Ausbildung von Krankenschwestern
und
-pflegern
am
St.
Elisabeth-
Krankenhaus in Bochum (Anatomie, Physiologie,
Mikrobiologie, Neurologie /Neurochirurgie, Pathologie, Innere Medizin und Chirurgie)
1994 – 1997
Nachtwachen auf der internistischen, septischen,
chirurgischen und orthopädischen Station im St. Josef-Krankenhaus, Wuppertal
1993 – 1997
Famulatur in der
Gastroenterologie
Prof. Menge, Remscheid
Kardiologie
Prof. Gülker, Wuppertal
Unfallchirurgie
Prof. Ahlers, Leverkusen
Neurologie
Prof. Przuntek, Bochum
Humangenetik
Prof. Epplen, Bochum
Pathologie
Prof. Morgenroth, Bochum
Veröffentlichungen:
Epplen, C., Buitkamp, J., D`Souza, M., Epplen, J. T. (1995). Immunoprinting
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Sclerosis. Journal of Neurology 243, 1
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Malin, J.-P., Przuntek, H., Epplen, J. T. (1997). Genetic Predisposition to Multiple Sclerosis as Revealed by Immunoprinting. Annals of Neurology 41, 341-352
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