Neue Aspekte zur immunologischen Kontrolle der Infektion mit dem

Institut für Molekulare Immunologie
Christine S. Falk
AKTUELLE
THEMEN
Neue Aspekte zur immunologischen
Kontrolle der Infektion mit dem
humanen Zytomegalievirus
New Aspects of the Immunological Control of Infection
with Human Cytomegalovirus
as humane Zytomegalievirus (HCMV)
gehört zur Familie der Herpesviren
und bedingt ebenso wie andere Mitglieder dieser Virusfamilie eine lebenslang
anhaltende Infektion. Die Pathogenität wird
einerseits durch die Infektiosität und andere Eigenschaften des Virus bestimmt und
andererseits vom Immunsystem der Patienten beeinflusst, das für eine fein regulierte Balance zwischen latenten und aktiven
Zuständen des Virus sorgt. Die zytotoxischen Effektorzellen des Immunsystems
spielen dabei eine Schlüsselrolle: Sie kontrollieren die erstmalige Infektion durch
das Virus ebenso wie seine Reaktivierung –
besonders bei Patienten mit eingeschränkten Immunfunktionen, z.B. bei HIV oder
nach Knochenmarkstransplantation. Die
endemische Infektion ganzer PatientenPopulationen mit ausgeprägten Variationen
unter den Virusstämmen belegen die Notwendigkeit, diese immunologische Kontrolle der HCMV-Infektion besser zu verstehen. Dieses Wissen kann als Basis für
die Entwicklung neuer Therapieansätze
dienen.
Virusinfektionen, insbesondere Herpesvirusinfektionen treten sehr häufig auch
bei gesunden Menschen auf: Mehr als 90%
der Bevölkerung in den Industrienationen
sind mit Herpesviren infiziert. Zu Komplikationen kommt es jedoch in der Regel nur
D
uman cytomegalovirus (HCMV)
belongs to the family of herpesviruses and, as with the other
members of this family, leads to lifelong
infection. The pathogenicity is determined
by the infectiousness and other characteristics of the virus, but is also influenced by
the immune system of the patient, which
maintains a fine balance between latent
and active states of the virus. The cytotoxic
effector cells of the immune system play a
key role. They regulate both the primary
infection by the virus and its reactivation –
particularly in patients with a compromised
immune function, for example patients
with HIV or following bone marrow transplantation. The endemic infection of whole
populations of patients with marked
variations in the virus strains, underlines
the necessity to improve our understanding
of the immunological regulation of HCMV
infection. This knowledge can be used as a
basis for developing new approaches to
therapy.
H
65
GSF
KAR(KIR-S)
HLA-A,B,C
KIR-L
HLA-A,B,C
ILT-2
CD94
HLA-E
NKG2C
CD94
–
HLA-E
NKG2A
Class Ia,, G
2DL4
HLA-G
MHC
ILT2
MHC
(LIR-1)
NKG2D
MICA/B
ULBP1-3
2B4
CD48
+
EpCAM
CD66a
CD66a
?
NON-MHC
LAIR-1
NCR
NON-MHC
Abb. 1: Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) werden durch ein Gleichgewicht zwischen positiven
und negativen Signalen reguliert. Diese Signale werden durch eine Fülle verschiedener Transmembranrezeptoren vermittelt. Unter den aktivierenden Rezeptoren lassen sich solche mit Liganden für MHC-Klasse I-Moleküle (HLA-A, -B, -C, -E, -G) von solchen mit Nicht-MHC-Liganden (MICA/B, ULBP) unterscheiden. Eine Unterteilung entsprechend der Natur der Liganden (MHC oder
Nicht-MHC) lässt sich auch für die verschiedenen inhibitorischen Rezeptoren treffen. Die Komplexität der NK-Regulation ergibt sich aus den verschiedenen, z.T. entgegengesetzten Signalen, die
bei einem Zielzellkontakt gleichzeitig ausgelöst werden. Die jeweilige Reaktion der NK-Zelle (Aktivierung oder Abschaltung) hängt entscheidend von der Intensität der Signale ab – das stärkere
Signal „gewinnt“.
bei Patienten mit einem gestörten Immunsystem, zum Beispiel bei AIDS oder nach
Knochenmarkstransplantationen (KMT).
Welche Rolle die Natürlichen Killerzellen
(NK-Zellen) des Immunsystems bei der
Kontrolle einer HCMV-Infektion spielen, ist
bislang nur ansatzweise untersucht. Es ist
jedoch wahrscheinlich, dass die NK-Zellen
Einfluss nehmen auf die Regulation der Virusvermehrung und -reaktivierung (Abb. 1).
Denn wie wir wissen, treten eine Reihe der
von HCMV kodierten Proteine spezifisch
mit zentralen Komponenten des Immunsystems in Wechselwirkung und beeinflussen
so die Immunreaktion. Von vier Virus-Proteinen (US2, US3, US6 und US11) ist bekannt, dass sie nach der künstlich herbeigeführten Infektion Bindegewebszellen
(Fibroblasten) die Herstellung von körpereigenen Proteinen der HLA Klasse I behindern (Abb. 2). Normalerweise wandern
diese HLA-Proteine an die Oberfläche von
66
GSF
Zellen und weisen diese gegenüber den
weißen Blutkörperchen als körpereigen
aus. Die Virus-Proteine der US-Gruppe
blockieren an verschiedenen Stellen den
Transport von HLA zur Zelloberfläche und
vermindern so deren Neuproduktion. Wir
wollten wissen, ob dieser Effekt auf die
künstlich herbeigeführte Überproduktion
isolierter US-Gene beschränkt ist oder auch
im Rahmen des gesamten Virusgenoms –
also wärend der Infektion einer Zelle – auftritt und sich auf die Immunantwort auswirkt. Um zu klären, welche Bedeutung die
veränderte HLA-Expression auf die immunologische Kontrolle der Infektion hat, haben
wir zusammen mit Dr. med. Gabriele Hahn
von der Abteilung Virologie des Max-vonPettenkofer-Instituts ein In-vitro-HCMVInfektionsmodell für menschliche Fibroblasten entwickelt. Die Funktion einzelner
Gene im Kontext des restlichen viralen Genoms lässt sich besonders gut an mutier-
dann bleibt die Modulation der HLA-Expression aus. Mit Hilfe weiterer Virusmutanten
konnten wir die Dominanz der US2-11-Gene hinsichtlich der HLA-Modulation gegenüber anderen HCMV-Genen aufzeigen. Ein
weiteres Gen (gpUL40), dessen Interaktion
mit HLA-Klasse I-Proteinen in isolierten
Transfektionssystemen beschrieben ist,
konnte ebenfalls gezielt aus dem AD169Genom entfernt werden. Allein die Deletion des gpUL40-Gens hatte in infizierten
Fibroblasten überraschenderweise keinen
Einfluss auf die HLA-Klasse I-Expression.
Vielmehr richtete sich diese nach der Aktivität der Gene US2 bis US11: Waren sie anwesend, dann verloren die Fibroblasten
mehr als 90% ihrer HLA-Expression; fehlten sie, dann blieb die HLA-Expression unverändert (Abb. 2).
Die immunologisch interessante Frage
war nun, ob Natürliche Killerzellen auf
diese Veränderung der HLA-Klasse I-Expression durch die US2-11-Gene reagieren
AKTUELLE
THEMEN
ten Viren aus klonierten Virusstämmen untersuchen. Vor wenigen Jahren gelang es
Dr. Hahn, mit Hilfe der Bakteriellen Klonierungstechnologie (BAC) erstmals das vollständige HCMV-Genom zu klonieren. Dies
ermöglichte uns die Herstellung von Virusmutanten, bei denen die Genregionen US2
bis US11 vollständig entfernt wurden
(US2-11). So konnten wir vergleichen, wie
viel HLA-Klasse I die Fibroblasten exprimierten, wenn sie mit dem HCVM-Wildtypstamm AD169 bzw. mit der mutierten
Virusvariante US2-11 infiziert werden.
Während der Wildtypvirus AD169 die HLAKlasse I-Expression tatsächlich drastisch
verminderte, zeigten die US2-11 Mutanten
diese Wirkung nicht (Abb. 3). Erstmals
konnten wir so zweierlei beweisen: Erstens
verhindern die US2-11-Gene auch unter
natürlichen Infektionsbedingugen die HLAKlasse I-Expression. Zweitens liegen alle
dafür ursächlichen Gene auf der US2-11Region: Entfernt man nämlich diese Region,
HLA-A, B, C
HLA-E
Signal
sequence
US3
HC
+ß m
HLA-E leader motifs:
HLA-G
HLA-A2, B8, Cw7, Cw3,
HCMV
US2, 11
2
TAP
US6
proteasome
US2-11
US2-11 genes of HCMV are early genes: 48-72 h post infection
Abb. 2: Effekt der Infektion humaner Fibroblasten mit verschiedenen Cytomegalievirus (HCMV)Mutanten auf die MHC-Klasse I-Expression. Nach Infektion mit dem HCMV-Wildtypstamm AD169
(48-72 h) werden die HCMV-Proteine US2, US3, US6 und US11 exprimiert. Diese behindern an
verschiedenen Stellen den Transport von HLA-Klasse I-Molekülen an die Zelloberfläche.
Um zu zeigen, dass alle HLA-Klasse I-modulierenden HCMV-Gene in der Virusregion US2 bis
US11 lokalisiert sind, wurde ein rekombinantes Virus hergestellt, bei welchem die gesamte Region
zwischen US2 und US11 entfernt wurde (US2-11). Der Unterschied zwischen Infektion mit
Wildtypvirus und US2-11-Mutante wurde bzgl. der HLA-Klasse I-Expression und der Erkennung
durch NK-Zellen getestet (s. Abb. 3).
67
GSF
80
NKL
60
mock
AD169-WT
US2-11
80
B.3NK
60
mock
AD169-WT
US2-11
40
40
20
20
0
0
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
100
immediate
early (24 h)
80
60
40
20
0
early (48 h)
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
100
Cell count
% RCR
80
60
40
20
0
late (72 h)
100
80
60
40
20
0
100
101
102
103
104
fluorescence intensity
Abb: 3: Verminderung der HLA-Klasse I-Expression nach HCMV-Wildtypinfektion ist in DUS2-11infizierten Zellen ausgeschaltet. Die mit HCMV-Wildtypviren (AD169-WT) infizierten Fibroblasten
zeigen nach 24 h einen schwachen, nach 48 und 72 h einen fast vollständigen Verlust der
HLA-Klasse I-Expression (blaue Kurvenlinien) verglichen mit mock-infizierten Kontrollzellen
(graue Kurve). US2-11-infizierte Zellen (rote Kurvenlinie) dagegen weisen keine Verminderung
der HLA-Klasse I-Expression auf. Nach 72 h ist sogar eine leichte Steigerung zu erkennen.
Damit ist nachgewiesen, dass alle HLA-Klasse I herunterregulierenden HCMV-Gene in der Region
zwischen US2 und US11 lokalisiert sind. Analysiert man parallel dazu die Erkennung durch
zwei verschiedene NK-Zellen (NKL und B.3NK), so korreliert die Abnahme der HLA-Klasse IExpression mit einer Zunahme der Lyse der AD169-WT-infizierten Zellen. Bleibt eine Abnahme
der HLA-Klasse I Expression jedoch aus, wie im Falle der DUS2-11-infizierten Zellen, ist keine
signifikante Steigerung der Lyse zu beobachten. Der Grund dafür liegt in der Inhibition der
NK-Aktivität durch die erhalten gebliebene, hohe HLA-Klasse I-Expression.
können. HLA-Klasse I-Moleküle treten nämlich nicht nur in Wechselwirkung mit zytotoxischen T-Zellen, sondern auch mit NKZellen: Sie binden an inhibitorische Rezeptoren (killer cell inhibitory recepors, KIR),
wodurch die zytotoxische Aktivität von NKZellen abgeschaltet wird. NK-Zellen können
nur dann zytotoxisch aktiv werden, wenn
keine inhibitorischen Signale durch Interaktionen zwischen KIR und HLA-Molekülen
„stören“ – die entsprechenden HLA-Moleküle also nicht oder nur schwach exprimiert
sind (Abb. 1). Das Prinzip dieser negativen
68
GSF
Regulation wird nach Klas Kärre vom
Karolinska Institut in Stockholm (Schweden) auch als „missing self“-Hypothese
bezeichnet.
In einem nächsten Schritt analysierten
wir, welche Auswirkungen die HCMV-vermittelte Veränderung der HLA-Expression
auf die Aktivität der Natürlichen Killerzellen
hat. Dazu standen uns definierte NK-Zellpopulationen zur Verfügung. Zunächst infizierten wir Fibroblasten mit HCMV-Wildtypviren AD169. Dies führte – wie bereits
erwähnt – zu einer drastischen Verminde-
ter Proteine ließ sich auch für die Erkennung
durch NK-Zellen belegen: Während die
Entfernung anderer Gene wie pgUL40 keine
Auswirkungen auf die Lyse infizierter
Fibroblasten durch NK-Zellen zeigten, führte
die Deletion der US2-11-Gene (die eine
unveränderte HLA-Expression zuließ) zur
vollständigen Resistenz gegenüber der
Lyse durch Natürliche Killerzellen. Die
US2-11-Gene domierten also via Regulation
der HLA-Expression auch die Erkennung
infizierter Zellen durch NK-Zellen.
Mit unserem Modell aus mutanten
Viren konnten wir erstmals zeigen, dass
virale Gene im Kontext des gesamten
AKTUELLE
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rung der HLA-Expression. Dieser Effekt zog
die Lyse infizierter Zellen durch NK-Zellen
nach sich. Dagegen blieb eine durch NKZellen vermittelte Lyse von Fibroblasten,
die mit der mutierten Virusvariante US2-11
infiziert waren, aus – denn deren HLA-Expression hatte sich gegenüber uninfizierten
Kontrollzellen nicht verändert. Dass die
Höhe bzw. der Verlust der HLA-Expression
mit der Empfindlichkeit gegenüber Lyse
durch NK-Zellen korrelliert ist, konnten wir
durch Blockierungsexperimente mit monoklonalen Antikörpern bestätigen (Abb. 3).
Die erwähnte Dominanz der US2-11-Gene
über die Funktionen anderer HCMV kodier-
KAR
KIR
NKG2D
CD94/
NKG2A
P
adaptor
ITIMs
ITAMs
phosphorylation
SHP-1
/ SHP-2
P
dephosphorylation
of pp36, PLC, syk,
JAK2
2B4
P
SAP
Fyn, Syk
ZAP-70
P
effector functions
„TURN OFF“
cytokines, kill
Abb. 4: Schematische Darstellung der Balance in der Signaltransduktion durch positive und
negative NK-Rezeptoren. Initial muss die NK-Zellaktivierung durch Bindung eines Liganden an
einen positiven Rezeptor KAR (z.B. NKG2D oder 2B4) erfolgen. Über Adaptormoleküle wie CD3,
DAP10 oder DAP12 wird das Signal dann intrazellulär mittels Phosphorylierung der Tyrosinreste
der ITAM-Sequenzen („immune receptor tyrosine-based activation motif“) weitergeleitet. Dadurch wird über die Tyrosinkinasen syk, fyn oder ZAP-70 die Tyrosinkinasekaskade angestoßen,
die schließlich in messbare Effektorfunktionen wie Zytotoxizität und Zytokinfreisetzung umgesetzt
wird. Wenn jedoch gleichzeitig ein inhibitorischer Rezeptor KIR z.B. CD94/NKG2A über seinen
Liganden (HLA-E) getriggert wird, folgt daraus ein negatives Signal. Dabei wird zunächst das
ITIM-Motiv („immune receptor tyrosine-based inhibition motif“) durch eine Kinase ebenfalls
phosphoryliert, was zur Rekrutierung von Phosphatasen wie SHP-1 führt. Nach Aktivierung der
Phosphatasen über Phosphorylierung „schneiden“ diese Phosphatasen durch Dephosphorylierung
der Kinasen das positive Signal schnell und effektiv ab. Die Ausübung der Effektorfunktionen wird
also schon im Vorfeld gestoppt, die NK-Zelle ist abgeschaltet.
69
GSF
Virusgenoms nicht gleichberechtigt ihre
Funktionen ausüben können, sondern einer
hierarchischen Ordnung unterliegen.
Diese Erkenntnisse sollten bei der Entwicklung immunologischer Ansätze zur Therapie
von HCMV-Komplikationen z.B. nach Knochenmarkstransplantation berücksichtigt
werden. Bislang ging man davon aus,
dass die Ausprägung klinischer Symptome
nach einer HCMV-Infektion hauptsächlich
von CD8+ T-Zellen kontrolliert wird. Auf
der Basis unserer Ergebnisse muss nun
auch die Relevanz der NK-Zellen für die
Kontrolle der Virusinfektion neu überdacht
werden.
Eine derartige Modulation durch virale
Gene ist nur möglich, weil das Grundprinzip der NK-Regulation auf dem dynamischen Gleichgewicht zwischen positiven
und negativen Signalen beruht, das ständig
überprüft wird (Abb. 4). Die Balance der
NK-Regulation durch aktivierende und inhibitorische Rezeptoren stellt eine besondere
Herausforderung – intellektuell wie experimentell – dar: einerseits wirken mehrere
Rezeptoren gemeinsam und verstärken
sich gegenseitig. Andererseits erfolgt eine
entgegengesetzte Regulation durch negative
Signale, die zur Abschaltung der NK-Zelle
führen sollen. Dabei entscheidet die Stärke
der jeweiligen Signale darüber, ob Aktivierung oder Inhibition erfolgt. Ein Schema
der Balance zwischen positiven und negativen Signalen zeigt, dass die NK-Zelle blitzschnell messen muss, wie viele positive
und wie viele negative Signale gleichzeitg
eingehen, um dann das richtige Maß z.B.
an „Killer-Aktivität“ zu entfalten.
Ausgewählte Veröffentlichungen
Falk, C.S., Mach, M., Schendel, D.J., Weiss, E.H.,
Hilgert, I. and Hahn, G. 2002. NK cell activity during
human cytomegalovirus infection is dominated by
US2-11-mediated HLA class I down-regulation.
J. Immunol. 169: 3257–3266.
Falk, C.S., Noessner, E., Weiss, E.H., and Schendel, D.J.
2002. Retaliation against tumor cells showing aberrant
HLA expression using lymphokine activated killerderived T cells. Cancer Res. 62: 480–487.
Falk, C.S. and Schendel, D.J. 2002. Allogeneic MHC
class I ligands and their role in positive and negative
regulation of human cytotoxic effector cells.
Hum. Immunol. 63: 8–19.
70
GSF
Falk, C.S., Nossner, E., Frankenberger, B., and
Schendel, D.J. 2000. Non-MHC-restricted CD4+
T lymphocytes are regulated by HLA-Cw7-mediated
inhibition. Hum. Immunol. 61: 1219–1232.
Falk, C.S. and Schendel, D.J. 1997. HLA-C revisited.
Ten years of change. Immunol. Res. 16: 203–214.