doktorin der veterinärmedizin

Aus dem Institut für Tierzucht und Tierverhalten (Mariensee)
der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Braunschweig
Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)
mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien
in aktivierte Oozyten beim Schwein
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Sabine Probst
aus Bad Gandersheim
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. D. Rath
1. Gutachter:
Prof. Dr. D. Rath
2. Gutachter:
Prof. Dr. D. Waberski
Tag der mündlichen Prüfung:
19.11.2001
Meinen Eltern
in liebevoller Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
9
2
SCHRIFTTUM
11
2.1
Oozytenreifung
11
2.1.1
In-vivo-Reifung
11
2.1.2
In-vitro-Reifung
12
2.2
Befruchtung und Aktivierung
14
2.2.1
Physiologie der Befruchtung
14
2.2.2
Aktivierung und parthenogenetische Entwicklung der Oozyte
15
2.2.2.1
Grundlagen der Oozytenaktivierung
15
2.2.2.2
Parthenogenese
18
2.2.2.3
Methoden der artifiziellen Aktivierung gereifter Säugeroozyten
19
2.2.3
In-vitro-Fertilisation (IVF)
26
2.2.4
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)
27
2.2.4.1
Grundlagen
27
2.2.4.2
ICSI-Technik
28
2.2.4.3
Einsatz der ICSI bei verschiedenen Haustierspezies
31
2.2.4.4
Artifizielle Aktivierung von Oozyten zur ICSI bei verschiedenen
Haustierspezies
32
2.3
Embryonalentwicklung
36
2.3.1
Entwicklung nach IVF
36
2.3.2
Entwicklung nach ICSI
36
2.3.3
Entwicklung porziner Oozyten nach parthenogenetischer Aktivierung
41
2.4
Erzeugung von Nachkommen mit vorherbestimmtem Geschlecht
43
2.4.1
Geschlechtsspezifische Trennung von Spermien mittels Flowzytometrie
43
2.4.2
Einsatz von gesexten Spermien bei IVF und ICSI
46
3
MATERIAL UND METHODEN
48
3.1
In-vitro-Maturation (IVM) porziner Oozyten
49
3.1.1
Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe
49
3.1.2
In vitro Maturation porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU 37
50
3.1.3
Denudierung und Vorbereitung der in vitro gereiften Oozyten für ICSI
50
Inhaltsverzeichnis
3.1.4
Bestimmung der Maturationsrate
51
3.2
In-vivo-Maturation porziner Oozyten
51
3.2.1
Versuchstiere
51
3.2.2
Gewinnung in vivo gereifter porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe
52
3.2.3
Denudierung und Vorbereitung der in vivo gereiften Oozyten für ICSI
52
3.3
Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe
53
3.4
Gewinnung und Aufbereitung der verwendeten Spermien
53
3.4.1
Nebenhodenschwanzspermien
53
3.4.2
Flüssigkonservierte Spermien
54
3.4.3
Flowzytometrisch sortierte, flüssigkonservierte Spermien
54
3.5
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)
55
3.5.1
Mikroinjektionsausstattung
55
3.5.2
Durchführung der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion
59
3.6
Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI
62
3.6.1
Aktivierung durch CaCl2-Injektion
62
3.6.2
Aktivierung durch Ca2+-Ionophor
63
3.6.3
Aktivierung durch elektrischen Puls
64
3.7
In-vitro-Kultur
65
3.8
Beurteilung der Entwicklungsraten in vitro kultivierter Embryonen
nach ICSI
65
3.8.1
Beurteilung anhand der Vorkernstadien nach 20 und 48 Stunden
65
3.8.2
Beurteilung der Teilungsrate nach 48 Stunden
67
3.8.3
Beurteilung anhand der Zellkernzahlen nach 168 Stunden
67
3.8
Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit der ICSI-Embryonen
durch Embryotransfer
68
3.9.1
Empfängertiere
68
3.9.2
Transfer von Embryonen im Zwei- bis Vier-Zell-Stadium
68
3.9.3
Transfer von Embryonen im Zygotenstadium
69
3.10
Statistische Auswertung
70
4
ERGEBNISSE
71
4.1
Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI
71
4.1.1
Aktivierung durch CaCl2-Injektion
71
4.1.2
Aktivierung durch Ca2+-Ionophor
74
Inhaltsverzeichnis
4.1.3
Aktivierung durch elektrischen Puls
4.1.4
Vergleich der Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten nach Aktivierung durch CaCl2, Ca2+-Ionophor oder elektrischen Puls
4.2
77
80
Einsatz von flüssigkonservierten, ungesexten und gesexten Spermien
zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit und ohne CaCl2Aktivierung
83
4.2.1
Entwicklungsraten 48 Stunden nach ICSI
83
4.2.1.1
Teilungsrate
83
4.2.1.2
Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate
84
4.2.2
Entwicklungsraten 168 Stunden nach ICSI
87
4.3
Überprüfung der Entwicklungsfähigkeit spermieninjizierter
Oozyten durch Embryotransfer
4.3.1
Transfer von Embryonen aus in vitro gereiften, mit ungesexten Spermien
injizierten und mit CaCl2 aktivierten Oozyten
4.3.2
5.1.
DISKUSSION
5.4
96
97
Einsatz von sortierten und unsortierten Spermien beim Einsatz
zur ICSI mit und ohne CaCl2-Aktivierung
5.3
93
Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur intrazytoplasmatischen
Spermieninjektion
5.2.
91
Transfer von Embryonen aus in vivo gereiften, mit sortierten, y-chromosomalen Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten Oozyten
5
91
102
Überprüfung der Vitalität mit ICSI erstellter Embryonen durch
Embryotransfer
105
Schlussfolgerungen
107
6
ZUSAMMENFASSUNG
108
7
SUMMARY
111
8
LITERATURVERZEICHNIS
114
9
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
144
Inhaltsverzeichnis
10
ANHANG
147
10.1
Zusammensetzung der verwendeten Medien
147
10.1.1
Kulturmedien
147
10.1.2
Paraformaldehyd-Triton X-100-Lösung
148
10.1.3
Mounting Medium
148
10.1.4
Lacmoid-Färbelösung
148
10.1.5
Medium zur elektrischen Aktivierung
149
10.1.6
Hoechst 33342-Farbstofflösung
149
10.1.7
2 %-TEST-Eidotter-Lösung
149
10.2
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
150
10.2.1
Tabellen
150
10.2.2
Abbildungen
152
Einleitung
1
9
EINLEITUNG
In der Reproduktionsmedizin wurden in den letzten Jahrzehnten durch die Weiter- und
Neuentwicklung verschiedener biotechnischer Verfahren große Fortschritte erzielt. In der
Humanmedizin wurde dabei zur Therapie männlicher Sub- und Infertilität eine spezielle
Technik der In-vitro-Befruchtung entwickelt, die die Verwendung unreifer, immotiler oder
morphologisch abnormaler Spermien zulässt: die intrazytoplasmatische Spermieninjektion
(ICSI). Mit Hilfe dieser Technik werden viele Schritte der normalen Befruchtung umgangen,
indem ein einzelnes Spermium direkt in das Zytoplasma einer gereiften Oozyte injiziert und
diese somit befruchtet wird. Ein einzelnes, normalerweise nicht befruchtungsfähiges
Spermium reicht somit zur Befruchtung einer Oozyte aus.
Diese Methode wurde auch in der Tierzucht erfolgreich erprobt (Kaninchen: HOSOI et al.
1988; Rind: GOTO et al. 1990; Schaf: GOMEZ et al. 1998a; Katze: POPE et al. 1998; Pferd:
McKINNON et al. 1998; Schwein: MARTIN 2000). Ein Einsatzgebiet der ICSI-Technik ist
dabei beispielsweise die Erhaltung bedrohter Tierarten, bei denen nur unzureichende
Samenmengen mit zum Teil schlechter Qualität zur Verfügung stehen bzw. kein
Konservierungsverfahren verfügbar ist (CATT 1996; IRITANI et al. 1998; POPE et al. 1998).
Des weiteren stehen die Anwendungen der ICSI im Zusammenhang mit neueren
Biotechniken zur Debatte. Es besteht z. B. die Möglichkeit, ICSI zur Produktion transgener
Schweine einzusetzen (LAVITRANO et al. 1999; PERRY et al. 1999a; KIM und SHIM 2000).
Interessant ist auch die Anwendung der ICSI im Zusammenhang mit dem Einsatz
flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten Spermas, das z. B. für das Schwein noch
nicht in ausreichenden Mengen für normale Besamungen produziert werden kann
(JOHNSON 2000). Der Einsatz sortierter Spermien in der In-vitro-Befruchtung ist beim
Schwein aufgrund hoher Polyspermieraten bisher ebenfalls noch eingeschränkt (RATH et al.
1997, 1999), so dass die ICSI eine gute Alternative bieten würde.
Jedoch befindet sich die ICSI-Technik bei landwirtschaftlichen Nutztieren erst am Anfang der
Entwicklung und das Entwicklungspotential spermieninjizierter Oozyten ist noch sehr
begrenzt. Eine zusätzliche Aktivierung der Oozyten zur ICSI mit exogenen Stimulantien wäre
eine Möglichkeit, die Entwicklungsraten zu verbessern. Dies hat sich beim Rind bereits
bewährt (GOTO et al. 1990; GOTO 1993; HAMANO et al. 1999).
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zum einen, eine Methode zur künstlichen Aktivierung
porziner Oozyten zur ICSI zu entwickeln, um die frühembryonalen Entwicklungsraten zu
verbessern. Zum anderen sollten porzine Embryonen mit vorherbestimmtem Geschlecht
durch ICSI mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien produziert werden. Als Kriterium
10
Einleitung
des Entwicklungspotentials mittels ICSI erstellter Embryonen sollte der Embryotransfer mit
der Geburt von Ferkeln dienen.
Schrifttum
2
11
SCHRIFTTUM
2.1
Oozytenreifung
2.1.1
In-vivo-Reifung
Als Oozytenreifung werden Entwicklungen der Oozyte bezeichnet, die zwischen dem
Diplotänstadium der Prophase der ersten Meiose und der Metaphase der zweiten Meiose
stattfinden und sowohl den Zellkern als auch Zytoplasma, Zellorganellen und die der Zona
pellucida anheftenden, somatischen Zellen (Cumulus oophorus) betreffen. Sie bilden die
Voraussetzung für die erfolgreiche Befruchtung und Aktivierung der Oozyte durch das
Spermium und für eine ungestörte frühembryonale Entwicklung (THIBAULT et al. 1987;
SCHNORR 1989; MOOR et al. 1983,1990).
Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion beim Schwein ist sowohl für in vivo gereifte als
auch für in vitro gereifte Oozyten beschrieben worden (z. B. CATT u. RHODES 1995; KIM et
al. 1998b; KLOCKE 1999, KOLBE u. HOLTZ 1999, MARTIN 2000).
Für die Gewinnung in vivo gereifter, porziner Oozyten werden Sauen zur Östrusinduktion
hormonell stimuliert, kurz vor der Ovulation geschlachtet und die Oozyten aus den dem
Schlachttier entnommenen Ovarfollikeln aspiriert. Als Spendertiere können präpuberale
Jungsauen, zyklische Jungsauen oder Altsauen verwendet werden, wobei sich die
Verwendung von präpuberalen Jungsauen aufgrund der einfachen Zyklusinduktion bewährt
hat (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Bei den Tieren ist in jedem Fall auf Allgemein- und
Geschlechtsgesundheit zu achten, um die Qualität der Oozyten durch diese Faktoren nicht
zu gefährden.
Zur Östrusinduktion sind verschiedene hormonelle Stimulationsprotokolle entwickelt worden,
wobei die Anwendung der verschiedenen Protokolle abhängig von Alter und Zyklusstand der
verwendeten Sauen ist (NIEMANN u. MEINECKE 1993; SCHNURRBUSCH u. HÜHN 1994).
Um die Ausbeute an gereiften Oozyten zu maximieren, werden die Tiere superovuliert. Der
Einsatz von PMSG (Pregnant mare´s serum Gonadotropin) in Kombination mit hCG (human
Choriogonadotropin) hat sich bei präpuberalen Jungsauen bewährt (RATH u. NIEMANN
1996). Üblich ist dabei z. B. eine einmalige, intramuskuläre Injektion von ca. 1500 I.E.
PMSG, gefolgt von einer intramuskulären Injektion von 500 I.E. hCG 72 Stunden später
(NIEMANN u. MEINECKE 1993; RATH 1992). Die Oozytengewinnung durch Schlachtung
des Tieres, oder auch durch Laparotomie, erfolgt 38 Stunden später, kurz vor der Ovulation,
die ca. 40 Stunden nach hCG-Gabe auftritt (YOSHIDA 1987, 1989; NAGASHIMA et al.
1993).
12
Schrifttum
Verschiedene Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass die Anwendung in vivo gereifter Oozyten
bei der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion beim Schwein bisher deutlich bessere
Ergebnisse lieferte als in vitro gereifte Oozyten (KOLBE 1998; KLOCKE 1999; MARTIN
2000).
2.1.2
In-vitro-Reifung
Das Problem der In-vitro-Reifung ist, neben der Kernreifung auch eine vollständige
zytoplasmatische Reifung zu erreichen (CRAN u. CHENG 1985; MOOR et al. 1990), die sich
in der regelrechten Ausbildung des männlichen Vorkerns und der frühembryonalen
Entwicklung ausdrückt (DAY 2000).
Unreife Oozyten (primäre Oozyten im Germinal-Vesikel-Stadium (GV-Stadium) (MOOR et
GANDOLFI 1987; SCHNORR 1989)) können aus Ovarien präpuberaler Sauen nach der
Schlachtung durch Aspiration von 2-5 mm großen Follikeln gewonnen werden. Oozyten aus
kleineren Follikeln sind ungeeignet, da diese eine verminderte Kompetenz zur Fortsetzung
der Meiose zeigen (CROZET 1989; MOTLIK et al. 1984; ROSENKRANZ u. LIPP 1989). Die
Oozyten sollten ein homogenes, fein granuliertes Zytoplasma und mindestens drei kompakte
Kumulus-Zellschichten um die Oozyte herum aufweisen (LEIBFRIED und FIRST 1979). Die
Notwendigkeit der Anwesenheit einer ausreichenden Anzahl von Kumuluszellen für die
Oozytenreifung ist mehrfach beschrieben worden (MOTLIK et al. 1986; MOTLIK u. FULKA
1986; MATTIOLI et al. 1988; MOOR et al. 1990; THOMAS u. SEIDEL 1993).
Als Basismedien für die in vitro Reifung werden beispielsweise Tissue Culture Medium
(TCM) 199 (MOTLIK et al. 1986; MATTIOLI et al. 1989; FUNAHASHI u. DAY 1993b;
NAGASHIMA et al. 1993; GRUPEN et al. 1995), Waymouth Medium (KIKUCHI et al. 1995;
COY et al. 1999), North Carolina State University Medium (NCSU) 23 (ABEYDEERA et al.
1998b, 1999a; BOQUEST et al. 1999) oder NCSU 37 (FUNAHASHI et al. 1997; LONG et al.
1999; RATH et al. 1999; PETTERS u. WELLS 1993) und Krebs-Ringer-Bicarbonat-Lösung
(KRB) (NAITO et al. 1988; HIRAO et al. 1994) verwendet. Je nach unterschiedlichen
Zusätzen und Kulturbedingungen konnten Kernreifungsraten bis zu 100 % (NAGAI u. MOOR
1990) erreicht werden. Der Zusatz der Gonadotropine FSH und LH bzw. deren Analoga
PMSG und hCG zum Medium führt zu einer Verbesserung der Oozytenreifung, der
Kumulusexpansion und der Spermienpenetration (EPPIG 1979; MEINECKE u. MEINECKETILLMANN 1979; MOOR et al. 1980). Die Vorkernbildungsraten werden optimiert, wenn die
Hormone sich nur für die ersten 20 Stunden der Reifung im Medium befinden (FUNAHASHI
Schrifttum
13
und DAY 1993a; FUNAHASHI et al. 1994a). Das Gleiche gilt für den Zusatz von db-cAMP
(Dibutyryl-cyclic-Adenosin-3`, 5`-Monophosphate) zum Reifungsmedium (FUNAHASHI et al.
1997).
FUNAHASHI und DAY (1993b) fanden bei einem umfassenden Vergleich heraus, dass
porzine Follikelflüssigkeit (pFF) als proteinhaltiger Zusatz im Zusammenspiel mit
gonadotropen Hormonen sehr gute Reifungsergebnisse erzielt. Dies wurde verschiedentlich
bestätigt (CHENG et al. 1997; NAITO et al. 1988; RATH et al. 1995; YOSHIDA et al. 1992).
Einen günstigen Einfluss auf die Kumulusexpansion und damit auf die Oozyten-Maturation
haben Wachstumsfaktoren wie beispielsweise der „Epidermal Growth Factor“ (EGF), durch
dessen Zusatz auch die embryonale Entwicklung nach IVF verbessert wird (SINGH et al.
1993, 1997; ABEYDEERA et al. 1998a, 1999b).
Glutathion, das während der Reifung synthetisiert wird und als Indikator für die
zytoplasmatische Reifung angesehen werden kann (YOSHIDA et al. 1993a), stimuliert den
Aminosäuretransport sowie die Proteinsynthese und schützt die Oozyte gegenüber
oxidativen Schädigungen (MEISTER 1983; MEISTER u. ANDERSON 1993; TAKAHASHI et
al. 1997, YOSHIDA 1993). Durch Reduzierung der Disulfidbrücken in den Protaminen der
Spermienköpfe bewirkt es die Dekondensation derselben (MAHI u. YANAGIMACHI 1975)
und trägt somit entscheidend zur Ausbildung des männlichen Vorkerns bei. Weil Oozyten
Glutathion selbständig aus geeigneten Substraten, z. B. Cystein, synthetisieren können,
bewirkt ein Cystein-Zusatz zum Reifungsmedium eine Verbesserung der Entwicklungsrate
nach IVF (ABEYDEERA et al. 1999a; YOSHIDA et al. 1993a). Allerdings wird Cystein unter
In-vitro-Bedingungen schnell zu Cystin oxidiert (MOHINDRU et al. 1985). Dieses Defizit kann
durch Zugabe von β-Merkaptoethanol oder Cysteamin ausgeglichen werden (TAKAHASHI et
al.1993; GRUPEN et al. 1995; ABEYDEERA et al. 1998b; BOQUEST et al. 1999).
Der osmotische Druck des Reifungsmediums sollte zwischen 265 und 355 mOsm (optimaler
Wert: 285 mOsm) liegen (McGAUGHEY U. VAN BLERKOM 1977; STAIGMILLER 1988).
Der pH-Wert sollte auf 7,2 - 7,4 eingestellt sein (SATO und KOIDE 1987). Als optimales
Kulturmilieu für Oozyten gilt eine Temperatur von 38,5-39 °C (ENG et al. 1986; NAITO et al.
1989; YOSHIDA 1987) und eine Gasatmosphäre mit 5 % CO2 (TSAFIRI u. CHANNING
1975).
Als insgesamt benötigte Reifungsdauer wird ein Zeitraum von mindestens 44 Stunden
angesehen, wobei die Kernreifung schon nach 36 Stunden abgeschlossen ist. Dies gilt
jedoch nicht für die zytoplasmatische Reifung, soweit dies aus Ergebnissen von IVFVersuchen geschlossen werden kann (GRUPEN et al. 1996, 1997; PRATHER u. DAY 1998).
14
Schrifttum
2.2
Befruchtung und Aktivierung
2.2.1
Physiologie der Befruchtung
Die Befruchtung ist ein komplexer Vorgang, der mit der Imprägnation (aktives Eindringen des
Spermiums in die Eizelle) beginnt und mit der Sygamie oder Konjugation (Verschmelzung
des männlichen und des weiblichen haploiden Vorkerns zu einem Kern) endet.
Beim Schwein findet die Befruchtung am Übergang der Eileiterampulle zum Isthmus tubae
uterinae statt. Die Oozyten gelangen nach der Ovulation über den Fimbrientrichter in den
Eileiter und erreichen nach 30-45 Minuten die Eileiterampulle (HUNTER 1991). Ihre optimale
Befruchtungsfähigkeit bleibt jedoch nur maximal sechs Stunden bestehen (HUNTER 1991;
SCHNURRBUSCH u. HÜHN 1994). Die ersten Spermien können schon 15 Minuten nach der
Konzeption den Eileiter erreichen, was durch das relativ große Spermavolumen des Ebers,
die intrauterine Deposition und kranial gerichtete Myometriumskontraktionen gefördert wird
(HUNTER 1991). Im Bereich des kaudalen Isthmus tubae uterinae wird jedoch zuerst ein
Spermienreservoir gebildet, wobei die Spermien an epithelialen Zellen binden (HUNTER
1991). Die Freisetzung der Spermien erfolgt periovulatorisch aufgrund vom Follikel
ausgehender hormoneller Signale (HUNTER 1995).
Die Spermien sollten die Oozyte in einem befruchtungskompetentem Stadium erreichen.
Hierfür muss zunächst die Kapazitation eingeleitet werden (HUNTER u. DZIUK 1968). Die
Kapazitation ist durch komplexe biochemische und biophysikalische Umgestaltungsprozesse
gekennzeichnet (GADELLA 1996; NIEMANN u. MEINECKE 1993) und ist Voraussetzung für
die Akrosomenreaktion (AUSTIN 1951; CHANG 1951), die die Spermien zur Penetration
durch die Zona pellucida und zur Gametenfusion befähigt. Bei der Akrosomenreaktion
kommt es zur Verschmelzung der Plasmamembran des Spermienkopfes mit der äußeren
Akrosomenmembran und der anschließenden Exozytose akrosomaler Enzyme (BARROS et
al. 1967; YANAGIMACHI 1988). Nach Durchdringen der Zona erfolgt die Fusion der
nebeneinanderliegenden Plasmamembranen von Samenzelle und Oozyte. Aus dem
Halsstück der Samenzelle entwickelt sich das Zentriol für die später stattfindende erste
Teilung (SCHNORR 1989; YLLERA-FERNANDEZ et al. 1992). Die Gametenfusion führt zu
einer Zustandsänderung der Oozyte, die als Aktivierung bezeichnet wird (siehe Kapitel
2.2.2.1). Diese führt zur Fortsetzung der Meiose und somit zur Ausschleusung des zweiten
Polkörperchens und der Ausbildung des weiblichen Vorkerns. Demgegenüber steht die
Dekondensation des Spermienkopfes mit Ausbildung des männlichen Vorkerns (SCHNORR
1989), wobei ein zytoplasmatischer Faktor der Oozyte der „Male pronucleus growth factor“
(MPGF) eine entscheidende Rolle spielt (KIKUCHI et al. 1995). Die ersten Vorkerne sind
Schrifttum
15
frühestens sechs Stunden nach Besamung bzw. Konzeption zu sehen (HANCOCK 1961;
LAURINCIK et al. 1994). Zur Syngamie wandern beide Vorkerne aufeinander zu und
verschmelzen miteinander zur diploiden Zygote. Die erste Furchungsteilung vollzieht sich in
Form einer normalen Mitose, und tritt mindestens 21 Stunden nach Konzeption auf
(HANCOCK 1961).
2.2.2
Aktivierung und parthenogenetische Entwicklung der Oozyte
2.2.2.1
Grundlagen der Oozytenaktivierung
Die Aktivierung der Oozyte ist die Voraussetzung für die weitere Entwicklung zur Zygote und
zum Embryo. Bekannt ist, dass es durch die Fusion von Spermium und Oozyte zu einem
initialen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Ionen-Konzentration kommt, in dessen Folge der
intrazelluläre Ca2+-Gehalt bis zur Bildung der Vorkerne oszilliert (DAY et al. 2000; JONES et
al. 1995). Die Ca2+-Oszillationen sind wiederum das auslösende Signal für weitere Vorgänge
im Rahmen der Oozyten-Aktivierung (OZIL 1990; VITULLO u. OZIL 1992):
⇒ Sie bewirken die Exozytose der kortikalen Granula, die zu einer Modifikation von
Oolemm und Zona pellucida führt. Der Inhalt der kortikalen Granula entleert sich dabei in
den perivitellinen Raum und es kommt zu physikochemischen und biochemischen
Zustandsänderungen der Plasmamembran und zur Aushärtung der Zona pellucida
(CRAN u. CHENG 1986), so dass ein Polyspermieblock aufgebaut wird, der das
Eindringen weiterer Spermien in die Oozyte verhindert (HUNTER 1991).
2+
⇒ Die Ca -Oszillationen führen auch zur Fortsetzung der Meiose, so dass der zweite
Polkörper ausgeschleust wird und die Vorkerne gebildet werden. Ein hoher Gehalt an
aktivem „Maturation Promoting Factor“ (MPF), der für die Oozytenreifung beim Säuger
essentiell ist (WU et al. 1997; MOTLIK et al. 1998), erhält die Arretierung in der
Metaphase II aufrecht. Durch ein Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau einer der
Untereinheiten des MPF, des Cyclin B, bleibt die hohe MPF-Aktivität unter Kontrolle
zytostatischer Faktoren bestehen (KUBIAK et al. 1993). Als Folge der Ca2+-Oszillationen
im Rahmen der Befruchtung kommt es zu einer Störung dieses Gleichgewichtes und die
MPF-Aktivität nimmt deutlich ab (FULKA et al. 1992). Somit kann die Blockierung der
Meiose überwunden werden und der Zellzyklus läuft mit Ausbildung des weiblichen und
männlichen Vorkerns und der Ausschleusung des zweiten Polkörperchens weiter (TAIEB
et al. 1997). Eine wichtige, aber bisher noch nicht vollständig geklärte Rolle spielt dabei
die „Mitogen-activated Protein Kinase“ (MAPK) (LIU u. YANG 1999).
16
Schrifttum
2+
⇒ Außerdem kommt es im Rahmen der Ca -Oszillationen zu einer Änderung im
Proteinmuster, die als Kennzeichen einer vollständigen Aktivierung angesehen werden
kann. DING et al. (1992a) stellten fest, dass es beim Schwein aufgrund der Befruchtung
zu einem plötzlichen Absinken der Konzentration von 46 kDa-Proteinen kommt. Ebenso
tritt eine progressive Reduzierung eines 25 kDa-Proteins gekoppelt mit einem Anstieg
eines 22 kDa-Proteins auf. DING et al. (1992a) beschrieben weiterhin, dass diese
Veränderungen nicht auf eine Änderung der Proteinsynthese zurückzuführen sind,
sondern auf posttranslationale Modifikationen, die im Verlauf der Befruchtung stattfinden.
Die Proteinsynthese ist für die Befruchtung im Gegensatz zur Oozytenreifung nicht
essentiell (DING et al. 1992b). Eine Änderung des Proteinmusters aufgrund der
Befruchtung konnte auch bei anderen Säugetieren beschrieben werden (z. B. Maus:
ENDO et al. 1986; Schaf: MOOR u. GANDOLFI 1987).
⇒ Vom Seeigel und einigen anderen Invertebraten ist es bekannt, dass es während der
Befruchtung zu einem für die vollständige Aktivierung notwendigen, intrazellulären
Anstieg des pH-Wertes kommt (SHEN u. STEINHARDT 1979). Allerdings wiesen KLINE
und ZAGRAY (1995) sowie PHILIPS und BALTZ (1996) bei der Maus keinen
intrazellulären pH-Anstieg während der Befruchtung nach. Gleiches stellten BEN-YOSEF
et al. (1996) für die Ratte fest. Für das Schwein liegen Untersuchungsergebnisse
bezüglich der pH-Veränderungen bei in vitro gereiften Oozyten nach künstlicher
Aktivierung vor. So konnten RUDDOCK et al. (2000) einen Anstieg des pH durch die
artifizielle Aktivierung der Oozyten mit 7 % Ethanol, mit Ca2+-Ionophor und mit
Thimerosal nachweisen. Untersuchungen bezüglich pH-Veränderungen im Rahmen der
physiologischen Befruchtung beim Schwein fehlen.
Bezüglich des Mechanismus, wie durch das Spermium die Ca2+-Oszillationen ausgelöst
werden, bestehen zwei Theorien:
1. Bei der Fusion des Spermiums mit der Oozyte wird ein lösliches Protein aus dem
Zytoplasma (cytosolic sperm factor: CSF) der Samenzelle in die Oozyte freigesetzt, das
über einen noch ungeklärten Weg die Ca2+-Oszillationen auslöst und nicht speziesspezifisch ist.
Das Vorhandensein eines aktivierenden CSF ist verschiedentlich beschrieben worden
(Seeigel: DALE et al. 1985; Kaninchen, Maus: STICE u. ROBL 1990; Hamster: SWANN
1990; Mensch: HOMA u. SWANN 1994; PALERMO et al. 1997; Rind: WU et al. 1998).
So konnten PARRINGTON et al. (1996) ein lösliches Spermien-Protein nachweisen,
Oscillin, das die für eine normale Befruchtung charakteristischen Ca2+-Oszillationen in
17
Schrifttum
Mäuse-Oozyten auslösen konnte. Im Spermienkopf sitzt dieses Protein auf Höhe des
Äquatorialsegmentes, der Bereich, an dem die Spermien-Oozyten-Fusion ihren Anfang
nimmt. MACHATY et al. (2000) zeigten außerdem, dass durch Injektion eines porzinen
CSF in Oozyten vom Schwein alle Folgen der Aktivierung vollständig ausgelöst wurden.
Der Mechanismus wie der CSF die Ca2+-Freisetzung bewirkt, bleibt jedoch noch unklar.
Untersuchungen von WU et al. (2001) weisen allerdings darauf hin, dass CSF die
Phospholipase C stimuliert und somit über Produktion von Inositol-1,4,5 Triphosphat (IP3)
die Ca2+-Freisetzung bewirkt. PERRY et al. (1999b, 2000) führten als Ergebnisse ihrer
Untersuchungen beim Rind an, dass nur das Zusammenspiel mehrerer hitzestabiler und
hitzeempfindlicher Spermien-Proteine eine Aktivierung auszulösen vermag.
2. Die zweite Theorie nimmt an, dass das Spermium an einen Rezeptor in der
Plasmamembran der Oozyte bindet, der mit einem G-Protein oder einer Protein-TyrosinKinase (KIM et al. 1999a) gekoppelt ist, die über die Aktivierung der Phospholipase C die
Produktion von Inositol-1,4,5 Triphosphat (IP3) bewirken, was zur Freisetzung von Ca2+Ionen aus intrazellulären Speichern führt. So konnten MACHATY et al. (1995)
nachweisen,
dass
gereifte
porzine
Oozyten
einen
G-Protein
vermittelten
Signaltransduktionsweg besitzen. Durch Stimulation desselben mit Guanosin-5´-0-(3´Thiotriphosphat) (GTP-γ-S, ein GTP-Analog) konnten sie Ca2+-Oszillationen und die
folgenden Ereignisse der Oozyten-Aktivierung auslösen. Die Anwesenheit des G-Protein
vermittelten Signalwegs in porzinen Oozyten wurde in nachfolgenden Versuchen
bestätigt (KIM et al. 1998a; MACHATY et al. 1997a). Jedoch ist dadurch nicht bewiesen,
dass das Spermium bei der Befruchtung auf diesem Weg die Oozyte aktiviert.
Im Anschluß an eine erfolgreiche Aktivierung einer vollständig gereiften Oozyte durch das
Spermium kommt es schließlich zur synchronen Ausbildung des männlichen und des
weiblichen Vorkerns, zur Verschmelzung der beiden und zur nachfolgenden Zellteilung.
Die beschriebene, bei einer Befruchtung auftretende Aktivierung einer Oozyte kann auch
spontan erfolgen, ohne dass eine Samenzelle daran beteiligt ist. In diesem Fall kann es zu
einer parthenogenetischen Entwicklung der Oozyte mit Zellteilung und Blastozystenbildung
kommen.
18
Schrifttum
2.2.2.2
Parthenogenese
Unter Parthenogenese versteht man eine reduzierte Form der Fortpflanzung, bei der sich der
Embryo aus einer unbefruchteten Oozyte entwickelt, wodurch der Austausch genetischen
Materials unterbleibt (WEHNER u. GEHRING 1990).
Von der typischen Parthenogenese sind zwei verwandte Phänomene abzugrenzen
(KAUFMAN 1983):
⇒ die Gynogenese, bei der die Oozyte, stimuliert durch ein Spermium, die zweite Meiose
beendet und sich weiterentwickelt, ohne dass das Spermium genetisches Material
beisteuert;
⇒ die Androgenese, bei der sich die Oozyte, ebenfalls stimuliert durch ein eingedrungenes
Spermium, weiterentwickelt, aber nur das männliche Genom an der folgenden
embryonalen Entwicklung teilnimmt.
Es handelt sich bei der Parthenogenese um eine im Tierreich relativ weitverbreitete Art der
Reproduktion mit Ausnahme der Säugetiere. Physiologischerweise kommt sie bei
verschiedenen Insekten, Reptilien und Fischen vor (WEHNER u. GEHRING 1990). Es wird
auch über Parthenogenese bei Hühnern (OLSEN 1966) und Truthühnern (DARCEY et al.
1971) berichtet.
Ursächliche Mechanismen für den Beginn einer parthenogenetischen Entwicklung liegen
dabei vermutlich in der Meiose begründet. Durch Ausbleiben der meiotischen Teilung bleibt
die Oozyte diploid und kann sich zu einem normalen Nachkommen entwickeln. Allerdings
können auch Fehler im Ablauf der Meiose, z. B. durch Nichtausbilden des ersten oder
zweiten Polkörperchens, zur Ausbildung einer diploiden Oozyte und somit zum Beginn einer
parthenogenetischen Entwicklung führen (NIEMANN u. MEINECKE 1993).
Im
frühen
Embryonalstadium
können
auch
beim
Säuger
parthenogenetische
Entwicklungsstadien auftreten, wobei diese Stadien durch eine nicht spermien-induzierte
Aktivierung der Säugeroozyte entstehen. Diese Aktivierung kann entweder spontan oder
aufgrund künstlicher, externer Stimuli (siehe Kapitel 2.2.2.3) auftreten. Es gibt jedoch keine
Berichte über eine vollständige, parthenogenetische Entwicklung mit der Geburt normaler
Nachkommen bei Säugetieren (NIEMANN u. MEINECKE 1993).
In Abbildung 1 sind die von KAUFMAN und SACHS (1976) beschriebenen Möglichkeiten der
Entstehung parthenogenetischer Embryonen mit ihren genetische Konstitutionen aus
Oozyten in der Metaphase II dargestellt.
19
Schrifttum
Gereifte Oozyte
(Metaphase II)
Aktivierung
2. meiotische
Teilung
sofortige Teilung
2. Polkörper nicht
ausgeschleust
Ausschleusung des 2.
Polkörpers
VorkernStadien
1 diploider
Vorkern
2 haploide
Vorkerne
1 haploider Vorkern pro
Blastomere
1 haploider Vorkern
1. Teilung
heterozygot
diploid
heterozygot
diploid
mosaik
haploid
mosaik
haploid
uniform
haploid
genetische
Konstitution
Abbildung 1: Möglichkeiten der Entstehung parthenogenetischer Embryonen
(nach KAUFMAN u. SACHS 1976)
2.2.2.3
Methoden der artifiziellen Aktivierung gereifter Säugeroozyten
Zur Zeit gewinnt das Phänomen der parthenogenetischen Entwicklung von Säugeroozyten
im Rahmen der Untersuchungen zum Kerntransfer zunehmend an Bedeutung (z. B. LIU u.
MOOR 1997; TAO et al. 1999; KOO et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000). Deswegen
wurden im Laufe der letzten Jahre viele Methoden getestet, um Oozyten durch externe
Stimuli künstlich zu aktivieren und eine parthenogenetische Entwicklung auszulösen.
Auch im Zusammenhang mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) sind
verschiedene Aktivierungsmethoden bei unterschiedlichen Spezies geprüft worden, um die
Aktivierungsraten und somit die Befruchtungs- und frühembryonalen Entwicklungsraten
20
Schrifttum
spermieninjizierter Oozyten durch einen zusätzlichen, aktivierenden Stimulus zu verbessern
(z. B.: Mensch: TESARIK u. TESTART 1994; YANAGIDA et al. 1999; ZHANG et al. 1999;
Rind: KEEFER et al. 1990; LI et al. 1999; CHUNG et al. 2000; Pferd: KATO et al. 1997;
GUIGNOT et al. 1998; LI et al. 2000; Schaf: GOMEZ et al. 1998c; Schwein: KIM et al. 1999c;
KOLBE u. HOLTZ 1999). Die Ausschleusung des zweiten Polkörpers ist hierbei im
Gegensatz zum Kerntransfer essentiell, um eine normal befruchtete Zygote zu erhalten.
Verschiedene Autoren berichteten über ein abgewandeltes Muster des oben beschriebenen
Anstiegs
der
Aktivierung.
intrazellulären
Während
die
Ca2+-Konzentration
spermien-induzierte
([Ca2+]i)
Aktivierung
nach
zu
parthenogenetischer
andauernden
Ca2+-
Oszillationen führt (Abbildung 2A), tritt bei einer parthenogenetischen Aktivierung meist ein
konstanter Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration auf, die ein Plateau erreicht, bevor
sie nach einiger Zeit langsam wieder abfällt (Abbildung 2B) (RICKORDS u. WHITE 1992;
2+
[Ca ]i
2+
[Ca ]i
SUN et al. 1992; TESARIK et al. 1994; TESARIK u. TESTART 1994).
A
B
Zeit
Zeit
Abbildung 2: Muster der Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i):
A: spermienabhängige Aktivierung; B: parthenogenetische Aktivierung
(modifiziert nach TESARIK et al. 1994)
Die Entwicklung der Oozyten nach parthenogenetischer Aktivierung verläuft umso besser, je
mehr
mit
Hilfe künstlicher
Aktivatoren die spermienabhängigen Ca2+-Oszillationen
nachgeahmt werden können (OZIL 1990).
21
Schrifttum
Die vielfältigen Aktivierungsmethoden lassen sich grob in physikalische, chemische und
biochemische Reize einteilen, wie in Tabelle 1 dargestellt wird.
Tabelle 1:
Methoden zur artifiziellen Aktivierung von Säugerozyten
Aktivierungsmethode
Beispiele aus der Literatur
Elektrische Stimulation
COLLAS et al. (1989);
ONODERA u. TSUNODA (1989);
ESCRIBA u. GARCIA-XIMENEZ (2000);
COLLAS et al. (1993);
PROCHAZKA et al. (1992, 1993);
JOLIFF u. PRATHER (1997);
KURE-BAYASHI et al. (2000)
Mechanische Stimulation
(z. B. Injektion)
RHODES et al. (1994);
CATT u. RHODES (1995);
GOMEZ et al. (1998a)
Thermische Stimulation
KOMAR (1973);
LONGO (1975);
BALAKIER u. TARKOWSKI (1976)
Ca2+-Ionophor
STEINHARDT et al. (1974);
KLINE u. KLINE (1992);
CHIAN u. SIRARD (1995);
WANG et al. (1998a,b, 1999)
Ethanol
CUTHBERTSON (1983);
O´NEILL u. KAUFMAN (1989);
DIDION et al. (1990);
NAGAI (1992);
MINAMIHASHI et al. (1993)
CaCl2
FULTON u. WHITTINGHAM (1978);
MACHATY et al. (1996)
Thimerosal
CHEEK et al. (1993);
FISSORE u. ROBL (1995);
HERBERT et al. (1995);
MACHATY et al. (1997b)
physikalisch
chemisch
22
Tabelle 1:
biochemisch
Schrifttum
(Fortsetzung)
Aktivierungsmethode
Beispiele aus der Literatur
Stimulation eines G-Proteins
MIYAZAKI (1988);
MOORE et al. (1993);
MACHATY et al. (1995, 1997a);
KIM et al. (1998a)
Injektion von
Inositol-1,4,5 Triphosphat
WHITAKER u. IRVINE (1984);
MIYAZAKI (1988);
MIYAZAKI et al. (1992);
BERRIDGE (1993)
Protein-Synthese-Inhibitoren
SIRACUSA et al. (1978);
BALAKIER u. CASPER (1993);
FIRST et al. (1992);
YANG et al. (1992);
NUSSBAUM und PRATHER (1995)
Protein-Kinase-Inhibitoren
SZÖLLÖSI et al. (1993);
RICKORDS et al. (1992);
MAYES et al. (1995)
Injektion eines CSF
PARRINGTON et al. (1996);
MACHATY et al. (2000);
HOMA u. SWANN (1994);
PALERMO et al. (1997);
WU et al. (1998)
Als einer der wichtigsten Aktivatoren kann dabei die elektrische Stimulation angesehen
werden, die zur Fusion beim Kerntransfer regelmäßig eingesetzt wird und eine Steigerung
der Aktivierungs- und Entwicklungsraten bewirkt. Durch einen elektrischen Puls kommt es zu
einer kurzfristigen Porenbildung in der Zellmembran, so dass ein Influx von Ca2+-Ionen aus
dem extrazellulären Medium stattfinden kann (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982). Durch
Frequenz, Dauer und Stärke des elektrischen Pulses kann der Level des Ca2+-Anstiegs in
der Zelle reguliert werden (COLLAS et al. 1993).
Im Zusammenhang mit ICSI ist auch besonders die mechanische Stimulation einer Oozyte
durch den Injektionsprozess von Bedeutung. Verschiedentlich wurde nachgewiesen, dass
diese Manipulation an der Oozyte zur Aktivierung und Vorkernbildung führt (GOMEZ et al.
23
Schrifttum
1997, 1998c) und somit die Befruchtungsraten durch parthenogenetische Entwicklung
negativ beeinflusst. Auch Zentrifugation oder Vortexing können Oozyten mechanisch
aktivieren.
Ein weiterer, sehr häufig angewandter Aktivator ist ein Ca2+-Ionophor (A23187). Ionophore
sind carbozyklische Polyether-Antibiotika, die mit Kationen einen lipophilen Komplex bilden
können und somit frei in der Lipidregion von Zellmembranen beweglich sind. Auf diese
Weise werden Kationen, wie z. B. Ca2+-Ionen, passiv durch die Membran transportiert. Die
Oozyte wird aktiviert und die entsprechenden Ereignisse einer Oozyten-Aktivierung laufen
ähnlich den physiologischen Vorgängen einer Befruchtung ab. Allerdings darf die Zelle nur
kurz der Einwirkung des Ca2+-Ionophors ausgesetzt werden, da eine längere Einwirkung zu
einer starken Druckerhöhung in der Zelle und somit zum Zelltod führt (STEUBER u.
KROKER 1994).
Die direkte Injektion von Ca2+-Ionen, z. B. in Form von CaCl2, in das Zytoplasma der Oozyte
bewirkt zum einen den direkten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, zum anderen
wirkt es stimulierend auf die intrazellulären Mechanismen der Ca2+-Freisetzung und setzt auf
diese Weise Calcium aus intrazellulären Speichern frei (FINCH et al.1991; BERRIDGE
1993). Die Oozyte wird somit aktiviert.
Thimerosal, eine organische Quecksilber-Verbindung mit hoher aktivierender Wirkung,
bewirkt
die
Mobilisierung
intrazellulärer
Ca2+-Speicher
durch
Oxidierung
kritischer
Sulfhydrylgruppen an intrazellulären Ca2+-Releasing-Proteinen und führt auf diese Weise zu
sich wiederholenden Ca2+-Wellen. Die Wirkung der Thimerosal-Inkubation muss durch den
Antagonisten Dithiothreitol (DTT) (MACHATY et al. 1997b) nach ca. 10 Minuten wieder
aufgehoben werden, weil es sonst zur Oxidierung der Tubulin-Sulfhydryl-Gruppen mit
Zerstörung der meiotischen Spindel kommen kann.
Eine Aktivierung von Oozyten durch Inhibition der Proteinsynthese begründet sich darauf,
dass durch entsprechende Mittel, z. B. Cycloheximid oder Puromycin, die Synthese
zytostatischer Faktoren und von Cyclin B verhindert wird, wodurch die MPF-Aktivität nicht
mehr aufrechterhalten werden kann und die Oozyte die Meiose wieder aufnimmt. Beim Rind
hat sich diese Methode im Zusammenspiel mit elektrischer Stimulation als effektiv erwiesen
(FIRST et al. 1992; YANG et al. 1992), und NUSSBAUM und PRATHER (1995) zeigten den
gleichen Effekt bei porzinen Oozyten.
Protein-Kinase-Inhibitoren, z. B. 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP) (SZÖLLÖSI et al. 1993),
Staurosporin
(RICKORDS
et
al.
1992)
oder
H7
([1-(5-Isoquinolinesulfonyl)-2-
Methylpiperazin, HCL]) (MAYES et al. 1995), bewirken ebenfalls eine Störung des
Gleichgewichtes zur Aufrechterhaltung der MPF-Aktivität, so dass die Oozyte aus der
24
Schrifttum
Metaphase-II-Arretierung freigesetzt werden kann. In Folge der Protein-Kinase-Inhibition ist
beim Schwein keine Exozytose der kortikalen Granula und keine Entwicklung bis zur
Blastozyste zu beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass damit nur ein Teil der
Aktivierungskomponenten ausgelöst werden kann (MAYES et al. 1995; GREEN et al. 1999).
Beim Rind wurden Kombinationen von Ca2+-Ionophor zusammen mit 6-DMAP als sehr
erfolgreich beschrieben (RHO et al. 1998a,b; CHUNG et al. 2000).
In Tabelle 2 sind Erfolgsraten verschiedener Aktivierungsmethoden porziner Oozyten
anhand der Aktivierungsraten zusammengestellt.
Eine Oozyte gilt im Allgemeinen als aktiviert, wenn sie mindestens einen Vorkern aufweist.
Ergebnisse bezüglich Morulae- oder Blastozystenraten sind in Kapitel 2.3.2.3 beschrieben.
WANG et al. (1998a) verglichen die Ca2+-Ionophor-Aktivierung mit der elektrischen
Aktivierung in Bezug auf das vollständigen Auftreten der Aktivierungsereignisse in porzinen
Oozyten. Dabei stellte sich heraus, dass die elektrische Aktivierung im Gegensatz zur
Ionophor-Aktivierung kaum zur Ausbildung eines Polyspermieblocks führte, obwohl eine
Exozytose der kortikalen Granula stattgefunden hat. Außerdem bewirkte die elektrische
Aktivierung zwar eine höhere Vorkernbildung, jedoch fehlte deutlich öfter die Ausschleusung
des zweiten Polkörpers, so dass es vermehrt zur Ausbildung von zwei Vorkernen kam. Die
Aktivierung
mittels Ca2+-Ionophor
entsprach somit
eher
einer spermieninduzierten
Aktivierung (WANG et al. 1998b).
In verschiedenen Versuchen stellte sich heraus, dass die Anwendung einer Konzentration
von mindestens 50 µM für eine Dauer von zwei Minuten die besten Ergebnisse bei der
Aktivierung porziner Oozyten mit Ca2+-Ionophor ergibt (WANG et al. 1998a,b, 1999).
25
Schrifttum
Tabelle 2:
Beispiele der Wirksamkeit unterschiedlicher Aktivierungsmethoden für porzine
Oozyten anhand der Aktivierungsrate (6-24 Stunden nach Stimulation)
Autor
In-vitro-Kultur
(h)
Aktivierungsrate
(%)
HAGEN et al. 1991a
24
88
PROCHAZKA et al. 1992
6
40,6-100
KIM et al. 1996b
18
75
LIU u. MOOR 1997
7-8
72,2-86,7
WANG et al. 1998a
12
88
WANG et al. 1998a,b; 1999
12
19,8-65
JILEK et al. 2000
24
26-70
Thimerosal (+DTT)
MACHATY et al. 1997b
6
73,8
CaCl2-Injektion
MACHATY et al. 1996
6
79,4
MAYES et al. 1995
9
68,1
GREEN et al. 1999
24
74
Ethanol
DIDION et al. 1990
18
22
Cytosolic Sperm Factor
(CSF)
MACHATY et al. 2000
6
89,2
MACHATY et al. 1995
6
71,4
NUSSBAUM u. PRATHER
1995
24
92
Ethanol + 6-DMAP
LEAL u. LIU 1998
8
96
Ca2+-Ionophor +
Cycloheximid
JILEK et al. 2000
24
26-85
Aktivierung
Elektrische Aktivierung
2+
Ca -Ionophor
Protein-Kinase
Inhibitoren
G-Protein-Stimulation
(GTP-γ-S)
Protein-SyntheseInhibitoren
+ elektrische Aktivierung
26
2.2.3
Schrifttum
In-vitro-Fertilisation
Die Grundlage der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion ist die In-vitro-Befruchtung
(IVF), bei der entweder in vivo oder in vitro gereifte Oozyten mit befruchtungsfähigen
Spermien zusammen für kurze Zeit inkubiert und befruchtet werden. Obwohl schon seit
Anfang der siebziger Jahre an der In-vitro-Produktion (IVP) von porzinen Embryonen
geforscht wird (HARMS u. SMIDT 1970; MOTLIK u. FULKA 1974), ist bis heute noch immer
kein voll befriedigendes Verfahren entwickelt worden (NAGAI 1996, DAY 2000).
Das größte Problem bei der IVF in vitro gereifter Oozyten beim Schwein stellt dabei in vielen
Laboratorien die polysperme Befruchtung dar (NAGAI 1996). Aufgrund bisher suboptimaler
Kulturbedingungen kommt es zu einer unzureichenden Oozytenreifung, in deren Folge die
Ausbildung und Exozytose der kortikalen Granula nicht korrekt abläuft, der Block der Zona
pellucida nicht ausreichend ausgebildet wird und somit das Eindringen mehrerer Spermien
pro Oozyte nicht verhindert werden kann (CRAN u. CHENG 1986). Die Reduzierung der pro
Oozyte eingesetzten Spermienkonzentrationen bei der IVF, die Kokultivierung der Spermien
mit Eileiterzellen, das Hinzufügen von Eileiterflüssigkeit aus Eileitern rauschender Sauen
zum Befruchtungsmedium oder die Supplementierung des Mediums mit RGD enthaltenden
Oligopeptiden führte bei verschiedenen Arbeitsgruppen aber zu guten Ansätzen zur Senkung
der Polyspermieraten (NAGAI und MOOR 1990; RATH 1992; KIM et al. 1996a; YOSHIDA et
al. 1993b). Ein weiteres Problem der IVF mit in vitro gereiften Oozyten ist die oft mangelhafte
und asynchrone Ausbildung des männlichen Vorkerns, jedoch ist dieser Sachverhalt durch
die Klärung des erforderlichen Glutathiongehaltes der gereiften Oozyte (siehe auch Kapitel
2.1.2) verbessert worden (NAGAI 1996).
Zur Erlangung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien ist es notwendig, dass diese
kapazitieren und die Akrosomenreaktion ausgelöst wird. Eine essentielle Rolle spielen dabei
in vitro extrazelluläre Ca2+-Ionen (FRASER 1987). Der kapazitationsinduzierende Effekt von
Kalzium, das im Medium nur begrenzt löslich ist, kann unter in vitro Bedingungen durch
Anwendung von Ca2+-Ionophor gesteigert werden (BIRD u. HOUGHTEN 1989). Ein
regelmäßig zur Auslösung der Kapazitation angewandtes Mittel ist Koffein, das die Kopplung
der Ca2+-Ionen an die Spermien fördert (NIWA 1993; NAGAI et al. 1994; FUNAHASHI u.
NAGAI 2001). Somit wurden spezielle Fertilisationsmedien entwickelt, die den Bedürfnissen
der Spermien und Oozyten zum Zeitpunkt der IVF gerecht werden. Allerdings ist zu
berücksichtigen, dass Methoden zur Verbesserung der Kapazitation zwar zu einer
verbesserten Penetrationsrate, jedoch oft auch zu erhöhten Polyspermieraten führen
(ABEYDEERA u. DAY 1997).
27
Schrifttum
2.2.4
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)
2.2.4.1
Grundlagen
Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion ist eine spezielle Art der In-vitro-Befruchtung,
bei der ein einzelnes Spermium zur Befruchtung direkt in das Zytoplasma einer gereiften
Oozyte injiziert wird. Dabei werden wichtige Schritte einer physiologischen Befruchtung
umgangen, wie z. B. Kapazitation, Akrosomenreaktion und Penetration. Die verwendeten
Spermien müssen daher nicht voll funktionstüchtig sein. ICSI gewährleistet im Gegensatz zu
anderen In-vitro-Fertilisationstechniken eine ausschließlich monosperme Befruchtung.
Andere mikromanipulatorische Fertilisationstechniken, wie Zona Drilling, Partial Zona
Dissection (PZD) und subzonale Insemination (SUZI), gingen der ICSI-Technik in der
Humanmedizin voraus, waren jedoch nicht sehr erfolgreich (CATT 1996).
Als Anwendungsbereich steht in der Humanmedizin der therapeutische Ansatz bei
androgener Sub- und Infertilität im Vordergrund (CATT 1996). Bei Säugetieren kann ICSI zur
Erstellung transgener Tiere genutzt werden, indem die zu injizierenden Spermien mit einem
Genkonstrukt beladen werden und als Vektor dienen (LAVITRANO et al. 1999; PERRY et al.
1999a, SQUIRES 1999; KIM u. SHIM 2000). Außerdem ist die ICSI-Technik eine effiziente
Methode zur optimalen Ausnutzung genetischen Materials, z. B. für den Erhalt seltener
Rassen, aber auch für die Erstellung bestimmter Zuchtlinien (CATT 1996; POPE et al. 1998).
Interessant
ist
ICSI
im
Zusammenhang
mit
dem
Einsatz
von
flowzytometrisch
geschlechtsspezifisch sortierten Spermien. Besonders beim Schwein ist die Erstellung einer
für eine normale Besamung ausreichenden Menge an sortierten Spermien noch
unzureichend. Der Einsatz von gesexten Spermien zur IVF wird andererseits durch erhöhte
Polyspermieraten begrenzt (RATH et al. 1999; SEIDEL u. JOHNSON 1999).
Die Ursprünge der ICSI-Technik gehen bis in die sechziger Jahre zurück, als erste Versuche
mit Seeigel- und Frosch-Gameten durchgeführt wurden, bei denen die Bildung von
Vorkernen erreicht werden konnte (HIRAMOTO 1962; GRAHAM 1966). Vorkernbildung
konnte mit der Injektion sowohl homologer als auch hertrologer Spermien erreicht werden
(IRITANI et al. 1998). HOSOI et al. (1988) berichteten über die ersten Nachkommen bei
Säugetieren, als sie ICSI beim Kaninchen anwandten. In den neunziger Jahren stiegen die
experimentellen Versuche zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion sprunghaft an, und
es wurden ebenfalls Nachkommen bei Rind (GOTO et al. 1991), Mensch (PALERMO et al.
1992; VAN STEIRTEGHEM et al. 1993), Maus (AHMADI et al. 1995; KIMURA et al. 1995),
Schaf (CATT 1996; GOMEZ et al. 1998a) und Pferd (McKINNON et al. 1998) produziert. Die
28
Schrifttum
einzigen Berichte über „ICSI-Ferkel“ wurden erst kürzlich veröffentlicht (KOLBE u. HOLTZ
2000; MARTIN 2000).
In der Humanmedizin wurden intensive Studien zum Einsatz von unreifen und defekten
Spermien bei der ICSI durchgeführt. Nach ersten Versuchen an Labortieren, bei denen
unreife Spermien in Mäuseoozyten injiziert worden waren (KIMURA u. YANAGIMACHI 1995;
OGURA u. YANAGIMACHI 1995), wurden die positiven Ergebnisse auf die Humanmedizin
übertragen. SOFIKITIS et al. (1995) erreichten mit der Injektion von Spermatiden die erste
Schwangerschaft, und TESARIK et al. (1995) sowie TESARIK und MENDOZA (1996)
berichteten über die ersten Kinder, die aus mit Spermatiden befruchteten humanen Oozyten
geboren wurden. Beim Rind berichteten GOTO et al. (1996a,b) ebenfalls über den
erfolgreichen Einsatz unreifer Spermienformen. Der Reifungsgrad der männlichen Gameten
spielt bei der ICSI also keine entscheidende Rolle. Allerdings stellten YAZAWA et al. (2001)
fest, dass unreife Spermienformen das Muster im Anstieg der intrazellulären Ca2+-Ionen
auslösten, das einer parthenogenetischen Aktivierung gleicht (Abbildung 2).
HEUWIESER et al. (1992a) erreichten vergleichbar hohe Befruchtungsraten bei ICSI mit
defekten sowie mit morphologisch unauffälligen Bullenspermien. Ebenso stellten McKINNON
et al. (1998) keinen Unterschied bei der Verwendung von Spermien infertiler Hengste im
Vergleich zu denen fertiler Hengste fest. Auch bei der Verwendung von kapazitierten im
Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien bei Schaf und Rind wurde kein Unterschied in der
Befruchtungsrate festgestellt (GOMEZ et al. 1997; GALLI et al. 1999). Aufgrund dieser
Ergebnisse
scheint
die
Beschaffenheit
des
Spermiums
keinen
Einfluss
auf
die
Entwicklungsraten nach ICSI zu haben, allerdings zeigten GOMEZ et al. (1997) in ihren
Versuchen, dass frische Spermien im Gegensatz zu tiefgefrorenen beim Schaf bessere
Befruchtungsraten erzielten. LACHAM-KAPLAN und TROUNSON (1995) erreichten bei der
Maus mit kapazitierten Spermien höhere Befruchtungsraten als mit nicht kapazitierten.
HOSOI et al. (1999) verglichen den Einsatz von Spermienköpfen und intakten Spermien und
zeigten verringerte Teilungsraten für die Spermienköpfe. KIM et al. (1999c) konnten beim
Schwein nur mit Hilfe einer zusätzlichen Aktivierung der Oozyten Erfolge bei der Injektion
von Spermatiden erzielen.
2.2.4.2
ICSI-Technik
Für die erfolgreiche Durchführung der ICSI ist es notwendig, dass alle auf die Oozyte
wirkenden Stressfaktoren so gering wie möglich gehalten werden und das Spermium
ordnungsgemäß im Zytoplasma abgesetzt wird.
29
Schrifttum
Der Durchmesser der Injektionspipette sollte möglichst genau der Größe der Spermienköpfe
angepasst werden, um das mechanische Trauma durch den Injektionsprozesses in der Zona
pellucida und vor allem im Oolemm möglichst gering zu halten. GOTO et al. (1996a) setzten
z. B. beim Rind Pipetten mit einem inneren Durchmesser von 8 µm ein, während KIM et al.
(1998b) beim Schwein einen inneren Durchmesser von 6-7 µm angaben, entsprechend der
jeweiligen Spermienkopfgröße. TOCHARUS et al. (1996) bewiesen durch Einsatz von
Injektionspipetten verschiedenen Durchmessers, dass mit den dünneren Pipetten bessere
Entwicklungsergebnisse erreicht wurden. Das mit dem Spermium zusammen injizierte
Volumen des Spermienmediums kann bei Anwendung dünnerer Injektionspipetten sehr
gering gehalten werden.
Wichtig ist, dass das Spermium vor der Aufnahme in die Injektionspipette immobilisiert wird.
Bei der physiologischen Befruchtung verliert das Spermium bei der Fusion mit der Oozyte
seine Motilität, bei ICSI würde es ohne künstliche Immobilisation jedoch weiterhin im
Zytoplasma der Oozyte Geißelbewegungen machen. Dadurch könnten zytoplasmatische
Strukturen irreversibel geschädigt werden, was früher oder später zur Degeneration der
Oozyte führen würde (FISHEL et al. 1995; GERRIS et al. 1995).
Üblicherweise
wird
die
Injektionspipettenspitze
über
dem
Mittelstück
des
Spermienschwanzes abgesenkt und auf den Boden der Petrischale gedrückt, um die
Spermien durch Zerstörung der Schwanzstruktur unbeweglich zu machen (PAYNE 1995).
Ein Vorteil ist dabei das Anreißen der Spermienmembran, das durch seitliches Wegziehen
der Pipette noch verstärkt werden kann. Der beschriebene CSF (cytosolic sperm factor) kann
somit leicht aus dem „Restzytoplasma“ des Spermiums austreten und die Aktivierung der
Oozyte fördern. Ebenso wird das Chromatin der Samenzelle auf diese Weise für
dekondensierende Faktoren aus dem Zytoplasma der Oozyte leichter zugänglich
(DOZORTSEV et al. 1994, 1995a).
Um die Immobilisierung und das Einfangen der Spermien zu erleichtern, wird die Viskosität
der
verwendeten
Spermiensuspension
erhöht,
was
sich
durch
eine
10%ige
Polyvinylpyrrolidonlösung (PVP) mit einem Molekulargewicht von 360.000 erzielen lässt. Die
Verwendung von PVP wird allerdings kontrovers diskutiert. MOTOISHI et al. (1996) und
SAHA et al. (1996) stellten bei der Anwendung von PVP bei der Injektion boviner Oozyten
zwar keine negativen Einflüsse auf Entwicklungsfähigkeit und Embryonenqualität fest, jedoch
zeigten STREHLER et al. (1998) in einer elektronenmikroskopischen Studie, dass bei der
Verwendung von PVP der Spermiennukleus durch vermutlich nekrotische Prozesse
geschädigt
wird.
CLARKE
und
JOHNSON
(1988)
berichteten
über
mangelhafte
30
Schrifttum
Vorkernbildung nach Anwendung von PVP. Demnach sollte die Menge der injizierten, PVP
enthaltenden Spermiensuspension so gering wie möglich gehalten werden.
Bei dem Injektionsvorgang selber ist darauf zu achten, dass die Chromosomen der Oozyte
durch die eingeführte Injektionspipette nicht beschädigt werden, um die Weiterentwicklung
der Oozyte nicht zu beeinträchtigen. Die Metaphasenplatte befindet sich in der Regel in der
Nähe des ausgeschleusten Polkörpers, so dass der Einstich möglichst weit vom Polkörper
entfernt stattfindet. Dazu wird die Oozyte an der Haltepipette so positioniert, dass der
Polkörper auf 6- oder 12-Uhr-Position zu liegen kommt. Der Einstich erfolgt dann von der 3Uhr-Position aus (siehe Abbildung 3) (PAYNE 1995).
1. Polkörper
Zona pellucida
Spermium
Injektionspipette
Haltepipette
Oozyte in der Metaphase II
Abbildung 3:
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) – schematische Darstellung
Fehlerhaftes Absetzen des Spermiums führt zum Misserfolg der intrazytoplasmatischen
Spermieninjektion. Aufgrund der Elastizität des Oolemms kann es leicht zu einem Einstülpen
desselben und einem Absetzen der Samenzelle im perivitellinen Raum kommen, obwohl
man sich vermeintlich im Zytoplasma der Oozyte befindet. Durch Erzeugen eines
Unterdruckes in der Injektionspipette wird das Durchstoßen der Plasmamembran erleichtert.
Außerdem kann durch Ansaugen von Zytoplasma, bevor das Spermium in die Oozyte
entlassen wird, kontrolliert werden, ob die Pipettenspitze sich wirklich im Zytoplasma befindet
(PAYNE 1995). Allerdings berichteten MANSOUR et al. (1996), dass ohne Ansaugen des
Zytoplasmas die entstandenen Embryonen eine deutlich bessere Qualität hatten. Die
Befruchtungsrate wurde dabei nicht negativ durch fehlerhaftes Absetzen des Spermiums
beeinflusst.
31
Schrifttum
2.2.4.3
Einsatz der ICSI bei verschiedenen Haustierspezies
Der Erfolg der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion zur Befruchtung von Oozyten der
Säugetiere war bisher von Spezies zu Spezies sehr unterschiedlich. Während die Oozyten
von Mensch, Kaninchen, Hamster, Schwein und auch Schaf durch den Injektionsprozess
ausreichend stimuliert wurden, um sich weiterzuentwickeln (CATT 1996), war bei bovinen
Oozyten eine zusätzliche Aktivierung notwendig (KEEFER et al. 1990). In Tabelle 3 sind
Beispiele der Aktivierungs- (AR) und Befruchtungsraten (FR) verschiedener Haustierspezies
ohne zusätzliche Aktivierung der Oozyten dargestellt.
Tabelle 3:
Beispiele
für
Aktivierungs-
(AR)
und
Befruchtungsraten
(FR)
nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und Parthenogeneseraten (PR) nach
Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies ohne zusätzliche Aktivierung
Tierart
Schaf
Rind
Pferd
Kaninchen
Schwein
Autor
Reifung
AR (%)
FR (%)
PR (%)
RHODES et al. (1994)
In vitro
-
60
50
CATT u. RHODES (1995)
In vitro
-
63
55
GOMEZ et al. (1998a)
In vitro
-
30,6
26,6
In vitro
-
9
1
In vivo
-
74
66
DELL`AQUILLA et al. (1997)
In vitro
65,2
52,2
-
GRØNDAHL et al. (1997)
In vitro
66,7
50
0
DENG u. YANG (2001)
In vivo
78
-
-
CATT u. RHODES (1995)
In vitro
62
60
20
KIM et al. (1998b)
In vitro
80
54
18
LEE et al. (1998)
In vitro
85
33
25
In vivo
46,4
33,6
7,3
In vitro
46,9
40,2
6,4
HEUWIESER et al. (1992b)
KLOCKE (1999)
32
Um
Schrifttum
den
Erfolg
empfehlenswert,
der
die
Spermieninjektionen
entsprechenden
richtig
einschätzen
parthenogenetischen
zu können,
Entwicklungsraten
ist
es
nach
Kontrollinjektion zu berücksichtigen. Sofern die Parthenogeneserate (PR) angegeben war, ist
sie in Tabelle 3 mit aufgeführt. Die Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate umfasst die
Zellstadien, die genau zwei Vorkerne bildeten. Die Aktivierungsrate gibt den Anteil an
Oozyten an, die mindestens einen Vorkern enthielten. Effektiv sind Ergebnisse mit hohen
Aktivierungs- und Befruchtungsraten bei geringen Parthenogeneseraten kontrollinjizierter
Oozyten.
Demnach sind die dargestellten Ergebnisse beim Schaf ohne eine zusätzliche Aktivierung
der Oozyten zur ICSI bislang unbefriedigend (RHODES et al. 1994; CATT u. RHODES 1995;
GOMEZ et al. 1998a), ebenso beim Rind (HEUWIESER et al. 1992b).
Die bisherigen Ergebnisse für das Schwein weisen auf eine gute Aktivierbarkeit und
Befruchtung der Oozyten ohne hohe parthenogenetische Entwicklungsraten nach ICSI hin
(CATT u. RHODES 1995; KIM et al. 1998b; KLOCKE 1999).
Ebenso zeigen die Ergebnisse von GRØNDAHL et al. (1997), dass ICSI beim Pferd ohne
zusätzliche
Aktivierung
gute
Erfolgsaussichten
hat.
Ergebnisse
der
frühen
Embryonalentwicklung nach ICSI ohne zusätzliche Aktivierung sind in Kapitel 2.3.2
dargestellt.
2.2.4.4
Artifizielle Aktivierung
Haustierspezies
von
Oozyten
zur
ICSI
bei
verschiedenen
Es wurde verschiedentlich die zusätzliche Aktivierung von Oozyten zur ICSI diskutiert. Das
trifft besonders auf bovine Oozyten zu, die sich mittels ICSI nur schwer aktivieren lassen und
bei denen große Probleme bei der Bildung des männlichen Vorkernes auftreten.
In Tabelle 4 sind Beispiele einer Aktivierung der Oozyten zur ICSI bei verschiedenen
Haustieren dargestellt. Es wird deutlich, dass der am häufigsten zur ICSI eingesetzte
Aktivator Ca2+-Ionophor ist. Beim Rind können Aktivierungsraten von 70-80 % mit
zusätzlicher Aktivierung erreicht werden, aber die Befruchtungsraten blieben bislang unter
40 % und zeigten keinen ausgeprägten Unterschied zu den Parthenogeneseraten. Dies ist
ein Hinweis darauf, dass die Oozyten nach ICSI und künstlicher Aktivierung gut aktiviert
wurden, die Ausbildung des männlichen Vorkernes jedoch nicht in ausreichendem Umfang
erfolgte. RHO et al. (1998a) versuchten dieses Problem durch Behandlung der Spermien mit
Dithiothreitol (DTT) zu lösen und konnten eine signifikant höhere Bildungsrate des
männlichen Vorkerns erzielen (40 % vs. 11 %). DTT reduziert Disulfidbrücken in den
33
Schrifttum
Protaminen des Spermienkerns und fördert somit die Dekondensation der Spermienköpfe im
Zytoplasma der Oozyte.
LI et al. (2000) führten einen umfassenden Versuch bezüglich eines Vergleichs
verschiedener Aktivierungsmethoden zur ICSI beim Pferd durch. Weil jedoch entsprechende
parthenogenetische Vergleichsraten fehlen, kann die Effektivität der einzelnen Aktivatoren
nicht beurteilt werden. Gleiches gilt für die Untersuchungen von GOMEZ et al. (1998a) beim
Schaf.
Tabelle 4:
Beispiele
für
Aktivierungs-
(AR)
und
Befruchtungsraten
(FR)
nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und Parthenogeneseraten (PR) nach
Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies mit zusätzlicher Aktivierung
Tierart
Rind
Autor
Aktivierung
Reifung
AR (%)
FR (%)
PR (%)
HEUWIESER et al.
(1992a)
A 23187
In vitro
-
39
-
HEUWIESER et al.
(1992b)
A 23187
In vitro
-
44
23
MEDVEDEV et al.
(1997)
A 23187
In vitro
41
11
4
LI et al. (1999)
7 % Ethanol
In vitro
78,8
26,9
-
In vitro
70
38,3
23,7
In vitro
-
62,1
-
59
-
-
56
-
-
Thimerosal
79
-
-
IP3
56
-
-
In vitro
91,6
50
-
In vivo
92
44
-
A 23187 +
CHUNG et al. (2000)
GUIGNOT et al.
(1998)
DMAP
A 23187
A 23187
Pferd
7 % Ethanol
LI et al. (2000)
Schaf
GOMEZ et al. (1998a)
In vitro
A 23187
34
Schrifttum
In der Tabelle 5 sind separat die Ergebnisse der Versuche zur ICSI mit zusätzlicher
Aktivierung beim Schwein dargestellt. Zu den Aktivierungsverfahren gehören die Inkubation
in
Ca2+-Ionophor
(A
23187),
die
elektrische
Stimulation
vor
bzw.
nach
den
2+
Spermieninjektionen und die Injektion einer Ca -Ionen-haltigen Lösung.
O´BRIAN et al. (1996) sowie CATT et al. (1997) erreichten eine deutliche Verbesserung der
Befruchtungsrate
durch
Ca2+-Injektion,
ohne
dass
es
zu
einem
Anstieg
der
Parthenogeneserate kam. Während CATT et al. (1997) zwar eine Verbesserung der
Befruchtungsrate bei Anwendung der A 23187-Aktivierung erhielten, konnten KOLBE u.
HOLTZ (1999) keinen positiven Effekt mit A 23187 erzielen.
Auch die Ergebnisse elektrischer Aktivierungsversuche von LEE et al. (1998) und KIM et al.
(1999b) zeigten keine akzeptablen Verbesserungen der Entwicklungsraten. Allerdings
konnten KIM et al. (1999c) durch elektrische Aktivierung vor Spermatideninjektion eine
deutliche Verbesserung der Befruchtungsrate erreichen. In diesem Zusammenhang wurde
die Parthenogeneserate in einem direkten Vergleich aber nicht mituntersucht.
Ergebnisse der frühen Embryonalentwicklung nach ICSI mit zusätzlicher Aktivierung der
Oozyten sind für die verschiedenen Haustiere in Kapitel 2.3.1 zusammengefasst.
KOLBE u. HOLTZ
(1999)
KIM et al. (1999c)
KIM et al. (1999c)
KIM et al. (1999b)
LEE et al. (1998)
A 23187
Elektrischer
Puls
(nach ICSI)
Elektrischer
Puls
(vor ICSI)
Elektrischer
Puls
(vor ICSI)
Elektrischer
Puls
(nach ICSI)
A 23187
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
In vitro
Ca2+-Injektion
CATT et al. (1997)
In vitro
Reifung
O´BRIAN et al. (1996) CaCl2-Injektion
Aktivierung
Aktivierung
-
89
95
96,4
97
67
93
92
+
AR (%)
-
21
21
84
85
55
69
64
-
-
19
46
-
25
63
67
68
+
-
2
2
-
33
32
31
28
-
12
-
-
92,9
22
6
18
5
+
8
-
-
23,1
25
0
25
18
-
22
-
-
-
-
-
-
-
+
26
-
-
-
-
-
-
-
-
AR (%) FR (%) FR (%) PR (%) PR (%) TR(%) TR (%)
bzw. Parthenogeneseraten (PR) nach Kontrollinjektion beim Schwein mit (+) und ohne (-) zusätzliche
Aktivierungs- (AR), Befruchtungs- (FR) und Teilungsraten (TR) nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion
Autor
Tabelle 5 :
Schrifttum
35
36
Schrifttum
2.3
Embryonalentwicklung
2.3.1
Entwicklung nach IVF
Innerhalb weniger Tage nach der Befruchtung entwickelt sich aus der Zygote durch
Zellteilung eine Blastozyste mit Differenzierung der Zellen in Innere Zellmasse (inner cell
mass = ICM) und Trophektoderm (TE) (McLAREN 1982; SCHNORR 1989; DORST 1991).
Während dieser frühembryonalen Entwicklungsphase findet eine progressive Umstellung von
maternaler zu embryonaler RNA-Synthese statt (McLAREN 1982; BAVISTER 1988;
ARCHIBONG et al. 1989; TELFORD et al. 1990; JARRELL et al. 1991). Beginn dieser
Umstellung ist beim Schwein das Vier-Zellstadium, der Zeitpunkt, zu dem in vivo auch der
Übertritt der Embryonen vom Eileiter in den Uterus stattfindet (BAVISTER 1988; BRÜSSOW
1985). Die Embryonen sind in diesem Stadium daher erheblichen internen und externen
Veränderungen ausgesetzt, die in einer In-vitro-Kultur oftmals nicht ausreichend unterstützt
werden können.
Bei der In-vitro-Produktion (IVP) porziner Embryonen wurde im Vier-Zellstadium daher oft
eine Entwicklungsblockade beschrieben (BAVISTER 1988, 1995). Die Kulturbedingungen
wurden jedoch durch Supplementierung der Kulturmedien mit Serumbestandteilen,
Aminosäuren und Energiesubstraten (BAVISTER 1981; BECKMANN u. DAY 1991, 1993;
HAGEN et al. 1991b; REED et al. 1992; PETTERS u. WELLS 1993) soweit optimiert, dass
eine relativ zuverlässige IVP porziner Embryonen bis zum Blastozystenstadium mittlerweile
möglich geworden ist (DAY 2000). Die Geburt von Ferkeln nach IVF ist sowohl bei
Verwendung von in vivo (z. B. YOSHIDA 1987; NAGAI et al. 1988; RATH 1991; RATH et al.
1997) als auch mit in vitro gereiften Oozyten (z. B. MATTIOLI et al. 1989; YOSHIDA et al.
1993b; KIKUCHI et al. 1999; RATH et al. 1999; ABEYDEERA et al. 1998c, 2000) schon
mehrfach beschrieben worden.
2.3.2
Entwicklung nach ICSI
Die frühembryonale Entwicklung nach ICSI wurde bei den meisten Haustieren, abgesehen
vom Rind, erst vereinzelt untersucht. In Tabelle 6 sind dazu die Teilungs- (TR) und
Blastozystenraten (BR) nach Spermieninjektion ohne zusätzliche Aktivierung dargestellt.
Vielversprechend sind dabei die Entwicklungsraten in Versuchen von DENG und YANG
(2001), die in vivo gereifte Oozyten des Kaninchens untersuchten. Sie erhielten gute
Blastozystenraten ohne hohe Parthenogeneseraten und konnten Nachkommen nach ICSI
37
Schrifttum
erzeugen (Tabelle 8). Gleiches gilt für die Ergebnisse von GOMEZ et al. (1998a) beim Schaf,
wobei sogar in vitro gereifte Oozyten verwendet worden sind, die sich im Allgemeinen
schlechter entwickeln als in vivo gereifte Oozyten. Beim Schwein sind entweder die
Entwicklungsraten sehr gering, wobei erneut die Entwicklungsblockade im Vier-Zellstadium
ein Problem darstellte, oder die parthenogenetischen Entwicklungsraten lagen sehr hoch
(KLOCKE 1999; KOLBE u. HOLTZ 1999). Eine positive Ausnahme bezüglich der
Blastozystenentwicklung stellen die Ergebnisse von KIM et al. (1998b) dar.
Tabelle 6:
Beispiele
für
Teilungs-
intrazytoplasmatischer
(TR)
und
Blastozystenraten
Spermieninjektion
bzw.
(BR)
nach
parthenogenetische
Teilungsraten (pTR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies
ohne zusätzliche Aktivierung
Tierart
Autor
Reifung
TR (%)
pTR (%)
BR (%)
Rind
KEEFER et al. (1990)
In vitro
4
-
-
Schaf
GOMEZ et al. (1998a)
In vitro
42,5
31,6
8,5
Ziege
KESKINTEPE et al. (1997)
In vitro
57,7
-
15,5
SQUIRES et al. (1996)
In vitro
25
-
-
MEINTJES et al. (1996)
In vitro
39
-
-
GRØNDAHL et al. (1997)
In vitro
16
-
-
IRITANI et al. (1998)
In vivo
87
-
7
DENG u. YANG (2001)
In vivo
68
29
39
POPE et al. (1998)
In vivo
58,1
-
16
KIM et al. (1998b)
In vitro
73
67
38
In vivo
43,1
5,4
0
In vitro
38,9
10,9
0
In vitro
16
14
-
In vivo
14
2
-
In vivo
69
-
38
Pferd
Kaninchen
Katze
KLOCKE (1999)
Schwein
KOLBE u. HOLTZ (1999)
MARTIN (2000)
38
Schrifttum
In Tabelle 7 sind die entsprechenden frühembryonalen Entwicklungsraten nach ICSI bei
verschiedenen Haustieren mit zusätzlicher Aktivierung der Oozyten aufgeführt. Daraus wird
ersichtlich,
dass
bei
bovinen
Oozyten
mittels
zusätzlicher
Aktivierung
stabile
Blastozystenraten von ca. 5-15 % erreicht werden. RHO et al. (1998a) erreichten dagegen
nach Vorbehandlung der bovinen Spermien mit DTT eine relativ hohe Blastozystenrate von
24 %. Bei keiner der aufgeführten Arbeitsgruppen ergaben sich, sofern untersucht,
Blastozysten aus kontrollinjizierten Oozyten.
Beim Pferd ist bisher von keiner Arbeitsgruppe das Blastozystenstadium erreicht worden. Bei
der Ziege wurde auf Parthenogenesekontrollen verzichtet, so dass über die Effizienz dieser
Versuche keine Aussage gemacht werden kann.
KIM et al. (1999c) zeigten in ihren Versuchen die positive Entwicklungspotenz von porzinen
Oozyten, die mit Spermatiden injiziert wurden, nachdem sie zuvor mit elektrischem Puls
künstlich aktiviert worden waren. Dabei erzielten sie eine Blastozystenrate von 30 %, wobei
sich nur 9 % der kontrollinjizierten und aktivierten Oozyten parthenogenetisch zu
Blastozysten entwickelten.
In Tabelle 8 sind die bisher publizierten Ergebnisse bezüglich Nachkommen nach ICSI bei
Haussäugetieren zusammengefasst. Dabei fällt auf, dass bisher nur bei Rind und Schaf mit
in vitro gereiften Oozyten der Embryotransfer erfolgreich war, wobei zudem in der Regel
spätere embryonale Entwicklungsstadien übertragen wurden. Dies ist ein Hinweis, dass bei
diesen Tierarten adäquate In-vitro-Kultivierungs- und Reifungsmethoden zur Verfügung
stehen.
Bei anderen Tierarten dagegen konnten bisher nur aus in vivo gereiften Oozyten, die zudem
meist als Zygoten übertragen wurden (Ausnahme Katze: Transfer von Morulae),
Nachkommen nach ICSI erzeugt werden.
39
Schrifttum
Tabelle 7:
Beispiele
für
Teilungs-
intrazytoplasmatischer
(TR)
und
Blastozystenraten
Spermieninjektion
bzw.
(BR)
nach
parthenogenetische
Teilungsraten (pTR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies mit
zusätzlicher Aktivierung
Tierart
Rind
Autor
Aktivierung
Reifung TR (%) pTR (%) BR (%)
GOTO et al. 1990
A 23187
In vitro
12
7,8
7,8
KEEFER et al. (1990)
A 23187
In vitro
28
18
-
GOTO 1993
A 23187
In vitro
15,1
6,2
7,3
PAVASUTHIPAISIT et al.
(1994)
7 % Ethanol
In vitro
67
26,9
8,8
GOTO et al. 1996b
A 23187
In vitro
32
22
6,7
TOCHARUS et al. (1996)
7 % Ethanol
In vitro
68
20
15,7
A 23187
In vitro
47
55
16
7 % Ethanol
In vitro
50
52
0
7 % Ethanol
In vitro
55,5
54,7
-
27,3
7,4
0
62,1
44,3
3
CHEN u. SEIDEL (1997)
LI et al. (1999)
A 23187
CHUNG et al. (2000)
A 23187 +
DMAP
In vitro
KATO et al. (1997)
A 23187
In vitro
21
-
-
GUIGNOT et al. (1998)
A 23187
In vitro
46
0
-
10
25
-
10,5
10,5
-
Thimerosal
30,4
13
-
IP3
0
0
-
A 23187
Pferd
7 % Ethanol
In vitro
LI et al. (2000)
Ziege
KESKINTEPE et al. (1997)
A 23187
In vitro
62,2
-
24,4
Schwein
KIM et al. (1999c)
Elektr. Puls
In vitro
-
-
30
In vivo
In vivo
MARTIN (2000)
KOLBE u. HOLTZ
(2000)
In vivo
McKINNON et al.
(1998)
Pferd
Schwein
In vivo
In vitro
POPE et al. (1998)
GOMEZ et al.
(1998a)
In vitro
CATT et al. (1996)
In vivo
HOSOI et al.
(1988)
In vivo
In vitro
HAMANO et al.
(1999)
DENG u. YANG
(2001)
In vitro
In vitro
GOTO et al. (1990)
GOTO (1993)
Reifung
Autor
A 23187
-
-
-
-
-
-
-
Ethanol
A 23187
A 23187
Aktivierung
1 / 3 (33,3)
23 Zygoten
1 / 4 (25)
4 / 16 (25)
1 Zygote od. 1
geteiltes Stadium
13-32 2- bis 4Zellstadien
2 / 4 (50)
10-11 Morulae
15 / 17 (88,2)
1 / 28 (3,6)
6 Zygoten
1-4 Blastozysten
2 / 6 (33,3)
18-19 Zygoten
1 / 8 (12,5)
9 2- bis 4Zellstadien
4 / 8 (50)
2-4 Blastozysten
10 / 48 (20,8)
2 / 3 (66,7)
2-4 Blastozysten
1 Blastozyste
Trächtigkeiten/ET
(Trächtigkeitsrate in %)
Übertragene
Embryonen/Tier
Nachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bei verschiedenen Haustierarten
Katze
Schaf
Kaninchen
Rind
Tierart
Tabelle 8:
1
3
2
3
5 Tiere noch tragend
5 (+2 tot),
1
7
2
10
4
2
Nachkommen
(n)
40
Schrifttum
41
Schrifttum
2.3.3
Auch
Entwicklung porziner Oozyten nach parthenogenetischer Aktivierung
für
artifiziell
aktivierte
porzine
Oozyten
liegen
Untersuchungen
zur
Entwicklungsfähigkeit im frühen Embryonalstadium vor.
In Tabelle 9 sind parthenogenetische Teilungs- (pTR) und Blastozystenraten (pBR)
unterschiedlicher Aktivierungsmethoden vergleichend dargestellt. Es handelt sich dabei
ausschließlich um in vitro gereifte Oozyten. Für die Kulturphase wurde neben der in vitro
Kultivierung teilweise auch die In-vivo-Kultur im ligierten Eileiter nach Embryotransfer
verwendet. Die übliche Kultivierungszeit zur Bestimmung der Blastozystenrate betrug dabei
6-7 Tage. JOLIFF und PRATHER (1997) und KURE-BAYASHI et al. (2000) verlängerten die
in vivo Kultur nach elektrischer Aktivierung jedoch auf 12 bzw. sogar auf 17-29 Tage und
bewiesen die Effizienz ihrer Aktivierungsmethoden:
JOLIFF
und
PRATHER
(1997)
erhielten
nach
12
Tagen
neun
Embryonen
im
Elongationsstadium und einen Embryo in ovoider Form. Diese parthenogenetischen
Embryonen entsprachen morphologisch normal befruchteten Embryonen in diesem
Entwicklungsstadium.
KURE-BAYASHI et al. (2000) beschrieben nach Übertragung von 19-49 aktivierten
(elektrische
Stimulation + Cytochalasin B)
Implantationsfähigkeit
und
Organbildung
diploiden
der
Oozyten
Embryonen
bis
pro
zur
Empfängertier
Ausbildung
der
Gliedmaßenknospen. Bei mehreren Feten war Herzschlag erkennbar. Allerdings wiesen
viele der zurückgewonnenen Feten deutliche Missbildungen wie Kopfdeformationen und
Acephalus, fehlende Augenbildung, zu geringe Körpergröße und Herz- und Leberzysten auf.
Die elektrische Aktivierung ist, auch unter Berücksichtigung der in der Tabelle 9
beschriebenen pBR, somit als eine äußerst effektive künstlichen Aktivierungsmethoden für
porzine Oozyten anzusehen. Eine physiologische und vollständige parthenogenetische
Entwicklung zum lebensfähigen Individuum scheint jedoch nicht möglich zu sein.
Ebenfalls ein sehr effektiver Aktivator ist Thimerosal, das zu pBR um 40 % führt. Auch
Kombinationen der elektrischen Aktivierung mit Cycloheximid (NUSSBAUM u. PRATHER
1995), Cytochalasin B (JOLIFF u. PRATHER 1997) und Colcemid (NAGAI et al. 1999)
erbrachten gute parthenogenetische Blastozystenbildungsraten mit Raten um die 20 %.
42
Schrifttum
Tabelle 9:
Literaturübersicht der Ergebnisse unterschiedlicher Aktivierungsmethoden in
vitro gereifter porziner Oozyten bezüglich parthenogenetischer Teilungs(pTR) und Blastozystenraten (pBR)
Aktivierung
Autor
Kultur
Kulturdauer (h)
pTR
(%)
pBR
(%)
Elektrische Aktivierung
LIU u. MOOR 1997
In vitro
48
52,2-78,8
-
WANG et al. 1998a
In vitro
48 / 168
74
11
FUNAHASHI et al. 1994b
In vitro
48 / 120
20
0
WANG et al. 1998a
In vitro
48 / 168
39
5
WANG et al. 1999
In vitro
48 / 168
49
16
JILEK et al. 2000
In vitro
48 / 144
32-50
1
MACHATY et al. 1997b
In vitro
144
-
42
MACHATY et al. 1997b
In vivo
144
-
42,9
CaCl2-Injektion
MACHATY et al. 1996
In vivo
168
-
14,7
Cytosolic Sperm Factor
(CSF)
MACHATY et al. 2000
In vitro
168
51,7
2
JOLIFF u. PRATHER
1997
In vivo
168
-
4
2+
Ca -Ionophor
Thimerosal (+DTT)
Protein-Kinase-Inhibitor:
Staurosporin
Protein-SyntheseInhibitoren + elektrische
Akt.
G-Protein-Stimulation
(GTP-γ-S)
Stimulation eines GProtein gekoppelten
Rezeptors
Elektrische Aktivierung
+ Cytochalasin B
NUSSBAUM u.
PRATHER 1995
In vivo
144
-
23
MACHATY et al. 1995
In vivo
168
-
13,1
KIM et al. 1998a
In vivo
144
-
17,4
JOLIFF u. PRATHER
1997
In vivo
168
-
18
Ethanol + 6-DMAP
LEAL u. LIU 1998
In vitro
36
48
-
Elektrische Stimulation +
Colcemid
NAGAI et al. 1999
In vitro
168
-
22,4
JILEK et al. 2000
In vitro
48 / 144
49-62
1
2+
Ca -Ionophor +
Cycloheximid
43
Schrifttum
2.4
Erzeugung von Nachkommen mit vorbestimmtem Geschlecht
2.4.1
Geschlechtsspezifische
Flowzytometrie
Trennung
von
Spermien
mittels
Das genetische Geschlecht bei Säugetieren wird bei der Befruchtung durch das
befruchtende
Spermium
(Gynäkospermium:
festgelegt,
weiblich
je
nachdem
determinierend)
oder
ob
es
ein
X-Chromosom
trägt
ob
es
ein
Y-Chromosom
trägt
(Androspermium: männlich determinierend) (GLEDHILL 1988; SCHNORR 1989).
Die Möglichkeiten zur Geschlechtsdiagnose können dadurch grob in zwei Bereiche
gegliedert werden:
1. die präkonzeptionelle Geschlechtsbestimmung, bei der die Spermien vor der
Befruchtung in X- und Y-Chromosom tragende Samenzellen separiert werden, oder
2. die
postkonzeptionelle
Geschlechtsbestimmung,
bei
der
die
Diagnose
an
präimplantativen Embryonen oder an Feten durchgeführt wird.
Bei den postkonzeptionellen Methoden ist an Embryonen und Feten jedoch nur noch die
Identifizierung des Geschlechtes möglich und eine Änderung könnte theoretisch nur durch
Abortauslösung erreicht werden (SEIDEL u. JOHNSON 1999). Präimplantative Embryonen
können durch Entnahme einzelner Blastomeren und Einsatz molekularer Sonden mittels
PCR (Polymerase Chain Reaction) auf ihr Geschlecht untersucht werden. Allerdings ist
hierfür eine Eröffnung der Zona pellucida erforderlich, was zu einer Beeinträchtigung der
Embryonenqualität führt. Embryonen mit nicht erwünschtem Geschlecht werden nicht
übertragen, der wirtschaftliche Nutzen ist somit begrenzt (z. B. POMP et al. 1995;
GUTIERREZ-ADAN et al. 1997; SHEA 1999).
Eine einfache Methode wäre die präkonzeptionelle Geschlechtsbestimmung durch eine
vorherige Trennung der Samenzellen in X-chromosomale und Y-chromosomale Spermien,
um dann die Fraktion des gewünschten Geschlechts bei einer Besamung einzusetzen.
Als bisher einzige zuverlässige und praktikable Methode zur Geschlechtsbestimmung von
Spermien gilt die flowzytometrische Trennung der Samenzellen, basierend auf dem DNAUnterschied zwischen X- und Y-chromosomalen Spermien (SEIDEL u. JOHNSON 1999;
JOHNSON 2000).
JOHNSON und CLARKE (1988) zeigten erstmals die Befruchtungsfähigkeit sortierter
Spermienköpfe, indem sie diese in das Zytoplasma von Hamsteroozyten injizierten. Die
ersten Nachkommen aus gesextem Sperma nach chirurgischer Besamung beim Kaninchen
erhielten JOHNSON et al. (1989). Die Würfe zeigten eine Geschlechterverteilung von 94 %
44
Schrifttum
weiblichen und 81 % männlichen Nachkommen, je nach eingesetzter Spermienfraktion, die
keine morphologischen oder genetischen Schäden aufwiesen.
Die praktische Anwendung gesexten Spermas blieb zunächst jedoch aufgrund geringer
Sortierraten eingeschränkt. Heute ist die sogenannte „Beltsville Sperm Sexing Technology“
(BSST) durch den Einsatz des MoFlo-„High Speed Cell Sorters“ (Fa. Cytomation, Ft.
Collins, Co, USA) (JOHNSON u. WELCH 1999) und durch die Verwendung einer
modifizierten Auslassdüse („orienting nozzle“) ergänzt und so weit verbessert (RENS et al.
1998), dass die kommerzielle Anwendung beim Rind bereits erfolgt (RENS et al. 2001). Im
High-Speed-Flowzytometer lassen sich pro Stunde 6-10 Millionen Spermien mit einer
Reinheit von 95-98 % für das gewünschte Geschlecht sortieren (JOHNSON 2000).
In Abbildung 5 ist die Funktionsweise eines Flowzytometers zum Sortieren von
Säugerspermien schematisch dargestellt.
Hüllstrom
Spermien
Hüllstrom
90° Detektor
0° Detektor
Signal
X/Y Fluoreszenz
Signal
Lateralfluoreszenz
UV-Laser-Strahl
+
Ablenkungs
-platten
= Spermientropfen
Y
X
Verlust
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Flowzytometeres zum Sortieren von
Säugerspermien (modifiziert nach RATH et al. 1996)
45
Schrifttum
Für den Sortiervorgang wird ejakuliertes Sperma zunächst verdünnt und mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342, der an die DNA bindet, für eine Stunde bei 35 °C
inkubiert. Eine uniforme Färbung ist für eine maximale Trennung der Samenzellen
entscheidend. Im Flowzytometer werden die Spermien von einem Trägerstrom erfasst, der
mittels Vibrationen in einen Tröpfchenstrom zerteilt wird, wobei jeder Tropfen maximal eine
Samenzelle enthält. Als Trägermedium beschreibt JOHNSON (2000) PBS mit einem
0,1%igen BSA-Zusatz. Aufgrund des unterschiedlichen DNA-Gehaltes ergibt sich im
Laserstrahl ein unterschiedlich starkes Fluoreszenzsignal, aufgrund dessen eine elektrische
Aufladung der einzelnen Spermientropfen erfolgt. Im nachgeordneten elektrischen Feld
werden die Tropfen ihrer Ladung entsprechend abgelenkt und in getrennten Auffanggefäßen
gesammelt. Nur Spermien, die ein eindeutiges Fluoreszenzsignal aussenden, werden in den
Sortiervorgang mit einbezogen, alle anderen verbleiben in einem neutralem Tropfen und
werden nicht mit sortiert (RATH et al. 1996).
Durch den Sortiervorgang werden die Spermien aufgrund extremer Druckveränderungen,
hoher Verdünnung, Temperaturwechsel, Zentrifugation und Färbung vielen Stressfaktoren
ausgesetzt (JOHNSON 2000). Um die Lebensfähigkeit der Spermien optimal zu erhalten,
muss das Auffangmedium den Bedürfnissen der Spermien entsprechend angepasst werden.
Der Zusatz von Eidotter hat sich dabei bewährt (JOHNSON et al. 1989; JOHNSON 1991).
Ebenso ist die Zugabe von Seminalplasma empfehlenswert, da so der Anteil an frühzeitig
kapazitierten Spermien deutlich verringert und die Lebensspanne der Zellen verlängert
werden kann (MAXWELL et al. 1996, 1998). Ein Zusatz von 10 % Seminalplasma hat aber
möglicherweise aufgrund der enthaltenden dekapazitierenden Faktoren einen negativen
Effekt auf die Entwicklungsraten nach IVF (MAXWELL u. JOHNSON 1997; MAXWELL et al.
1998).
Das Erreichen einer 100%igen Reinheit des geschlechtsspezifisch sortierten Spermas ist bei
den meisten Haussäugetieren kaum möglich, jedoch ist eine Reinheit von durchschnittlich
95-98 % als realistisch anzusehen, wie durch Reanalyse der sortierten Spermien bewiesen
werden kann (JOHNSON 2000). Der Grund für die unterschiedliche Sortierbarkeit der
Spermien
verschiedener
Säugerspezies ist
unter
anderem
auf
speziesspezifische
Unterschiede der DNA-Differenz zwischen X- und Y-chromosomalen Spermien (z. B. Schaf:
4,2 %; Schwein: 3,6 %; Mensch: 2,8 %) zurückzuführen (JOHNSON 2000).
46
2.4.2
Schrifttum
Einsatz von gesexten Spermien bei IVF und ICSI
Aufgrund der bisher noch eingeschränkten Verfügbarkeit an gesexten Spermien für eine
normale
Besamungsdosis
beim
Schwein
müssen
bislang
noch vermehrt
andere
biotechnische Verfahren für die effektive Anwendung des gesexten Spermas eingesetzt
werden (SEIDEL u. JOHNSON 1999). Zu nennen sind beim Schwein dabei die tief
intrauterine oder die chirurgische Besamung mit reduzierter Spermiendosis (KRÜGER et al.
1999; KRÜGER u. RATH 2000) und In-vitro-Fertilisation (IVF) (RATH et al. 1997, 1999;
ABEYDEERA et al. 1998c) oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit
anschließendem Embryotransfer (O´BRIAN et al. 1996; KLOCKE 1999).
JOHNSON und SEIDEL berichteten 1999, dass bis zu diesem Zeitpunkt mehr als 1500
Nachkommen bei Mensch und Tier nach Befruchtung mit flowzytometrisch sortierten
Spermien geboren worden sind, die meisten davon nach intrauteriner oder chirurgischer
Besamung. Diese Zahl ist bis heute deutlich gestiegen.
Die Geburt von Nachkommen nach IVF und Embryotransfer mit gesextem Sperma
beschrieben erstmals CRAN et al. (1993) beim Rind, wobei sechs Kälber von sechs mit dem
korrekten Geschlecht geboren worden sind. RATH et al. (1997) erzeugten erstmals
Nachkommen beim Schwein nach IVF mit gesextem Sperma, wobei alle geborenen Ferkel
entsprechend den eingesetzten X-chromosomalen Spermien weiblichen Geschlechts waren
(100 % korrektes Geschlecht). ABEYDEERA et al. (1998c) verwendeten für IVF statt in vivo
gereifte Oozyten in vitro gereifte porzine Oozyten und erhielten nach Embryotransfer 23
weibliche Ferkel von 24 Ferkeln (96 %) und neun männliche Ferkel von neun (100 %). RATH
et al. (1999) setzten ebenfalls in vitro gereifte porzine Oozyten zur IVF ein und erhielten 33
weibliche von insgesamt 34 Ferkeln (97 %), während in einer Kontrollgruppe mit ungesexten
Spermien 52 % männliche und 48 % weibliche Ferkel geboren wurden.
Mit Hilfe der intrazytoplasmatischen Spermieninjektionen konnten ebenfalls erfolgreich
Nachkommen erstellt werden. Als erstes berichteten CATT et al. (1996) über die Geburt
eines männlichen Lamms nach ICSI mit gesexten, Y-chromosomalen Spermien (siehe auch
Kapitel 2.3.2.3, Tabelle 8). In der Humanmedizin konnten nach IVF, intrauteriner Besamung
und ICSI mit X-chromosomalen Spermien insgesamt 13 Mädchen von 14 Babys geboren
werden (93 %) (FUGGER et al. 1998). Ein Jahr später veröffentlichten HAMANO et al.
(1999) die Geburt von 10 Kälbern aus mit Y-chromosomalen Spermien injizierten, in vitro
gereiften Oozyten. Das Geschlechterverhältnis lag bei acht Bullen- und zwei Kuhkälbern
(80 %). SCHMID et al. (1998) konnten nach ICSI mit sortierten X-Spermien beim Pferd
Embryonen im Acht-Zellstadium erhalten, ein Embryotransfer schlug fehl. Jedoch wurden
Schrifttum
47
sieben Embryonen mittels PCR auf ihr Geschlecht hin untersucht und alle wurden als
weiblich identifiziert (100 %).
Zum Einsatz von geschlechtsspezifisch sortierten Spermien zur ICSI beim Schwein gibt es
bisher erst zwei Untersuchungen. O´BRIAN et al. (1996) untersuchten vergleichend die
Aktivierungs- und Befruchtungsraten ungesexter und gesexter Spermien nach ICSI. Es
ergaben sich keine signifikanten Unterschied zwischen ungesexten (68 % und 28 %) und
gesexten (82 % und 31 %) Spermien. KLOCKE (1999) berichtete nach Injektion von
X-chromosomalen Spermien in in vivo gereifte Oozyten von einer Teilungsrate von
20,1 ± 5,6 %. Für in vitro gereifte, mit gesexten Spermien injizierte Oozyten ergab sich eine
Teilungsrate von 17,4 %. Nach fünftägiger In-vitro-Kultur konnten weder mit in vivo noch mit
in vitro gereiften Oozyten Blastozysten erhalten werden. Es wurde ein Embryotransfer (14
Embryonen im Zwei- und Vier-Zellstadium) durchgeführt, aus dem sich jedoch keine
Trächtigkeit ergab.
Bisher wurde noch nicht über die Geburt von Ferkeln nach ICSI mit gesextem Sperma
berichtet.
48
3
Material und Methoden
Material und Methoden
Abbildung 5 zeigt eine zusammenfassende, schematische Übersicht der Versuchsabläufe
zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion.
In vitro gereifte
Oozyten
In vivo gereifte
Oozyten
44-48 h In-vitro-Reifung
in NCSU 37
Unsortierte
NHS-Spermien
Unsortierte
flüssigkonservierte Spermien
Flowzytometrische
Sortierung
ICSI
Aktivierung der
Oozyten
Beurteilung der
Vorkerne durch
Lacmoid-Färbung
-
spermieninjizierte Oozyten
kontrollinjizierte Oozyten
nicht injizierte Oozyten
20 h
In-vitro-Kultur
(Fert-Talp-Medium)
In-vitro-Kultur in NCSU 23
168 h
In-vitro-Kultur:
Bestimmung der
Zellkernzahl mit
Hoechst 33342
48 h
In-vitro-Kultur:
Beurteilung der
Teilungsrate
Embryotransfer
Trächtigkeitsuntersuchungen
ab dem 21. Tag mittels
Ultraschall
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Versuchsabläufe zur intrazytoplasmatischen
Spermieninjektion (ICSI)
Material und Methoden
3.1
In-vitro-Maturation (IVM) porziner Oozyten
3.1.1
Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe
49
Für alle Versuche wurden ausschließlich in vitro gereifte Oozyten verwendet. Die einzige
Ausnahme bildete der letzte Versuchsabschnitt, bei dem Embryotransfers mit Embryonen
aus in vivo gereiften Oozyten, die mit sortierten Spermien injiziert worden sind, durchgeführt
wurden.
Zur Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) wurden auf einem
nahegelegenen Schlachthof Ovarien präpuberaler Jungsauen (unbekannter Herkunft)
gesammelt und in einem auf ca. 38 °C vorgewärmten Thermogefäß zum Institut transportiert.
Im Labor wurden die Ovarien zunächst mit auf 38,5 °C erwärmter physiologischer
Kochsalzlösung (mit Zusatz von Penicillin G und Streptomycin) gespült.
Die Gewinnung der Oozyten erfolgte anschließend durch Punktion aller Follikel, die einen
Durchmesser von 2-5 mm aufwiesen. Dazu wurden Kanülen mit einer Nadelstärke von
18-gauge (Microlance 3, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) verwendet, die das Punktat
über einen Adapteraufsatz in ein steriles Auffanggefäß (50 ml Zentrifugenröhrchen, Fa.
Greiner, Frickenhausen) leiteten, in dem die Follikelflüssigkeit mit den darin befindlichen
KOK gesammelt wurde. Dieses Auffanggefäß war über ein Schlauchsystem mit einer
Unterdruckpumpe (VM AR – 5100, Fa. Cook, Queensland 4113, Australien) verbunden,
deren Vakuum so eingestellt wurde, dass in einer Minute 20 ml Flüssigkeit aspiriert werden
konnte. Es wurden im Normalfall vier Anschlüsse zur Follikelpunktion verwendet.
Nach Punktion aller geeigneten Follikel wurden die Auffanggefäße mit auf 38,5 °C
erwärmtem PBS + 1 % NBCS (PBS: Dulbecco´s phosphatgepufferte Salzlösung, # D-6650,
Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA; NBCS: newborn calf serum) aufgefüllt und für zehn Minuten
stehen gelassen, damit die KOK absedimentieren konnten. Anschließend wurde der
Überstand abgegossen und der Vorgang ein zweites Mal wiederholt.
Jeweils 1-2 ml des nach erneutem Abgießen des Überstands verbliebenen Pellets aus KOK
und Follikelwandzellen wurden in eine Petrischale (Ø 94 mm) gegeben und mit 10 ml PBS +
1 % NBCS verdünnt. Unter einem Stereomikroskop wurden die verwendbaren KOK bei
20-50facher Vergrößerung mit Hilfe einer selbstausgezogenen Glaspipette (Pasteurpipette,
# 7477 20, Fa. Brand, Wertheim) herausgesucht und in einem Petrischälchen (Ø 32 mm) mit
2 ml PBS + 1 % NBCS nach zweimaligem Waschen gesammelt.
Es wurden nur solche KOK ausgewählt, die von mindestens drei kompakten Lagen
Kumuluszellen umgeben waren und ein feingranuliertes, homogenes Zytoplasma aufwiesen.
50
3.1.2
Material und Methoden
In-vitro-Maturation porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU 37
Zur In-vitro-Maturation der gewonnenen KOK wurde als Medium NCSU 37 (North Carolina
State University, siehe Anhang) verwendet, welches mit Follikelflüssigkeit aus unreifen
Follikeln, Insulin, Cystein, Glutamin, EGF und Merkaptoethanol supplementiert und
anschließend sterilfiltriert (Einmal-Filterhalter FP 030/3, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel)
worden war.
Von dem Maturationsmedium wurden je 500 µl in die Vertiefungen von Five Well Dishes
(# 19021005, Fa. Minitüb, Tiefenbach) pipettiert und vor Versuchsbeginn für einige Stunden
bei 38,5 °C und einer 5%igen CO2-Atmosphäre in feuchtigkeitsgesättigter Luft in einem
Brutschrank (Nuaire NU 2700 E, Fa. Zapf Instrument, Sarstedt) zur Äquilibrierung
vorinkubiert.
Die selektierten KOK wurden fünfmal in dem äquilibrierten Maturationsmedium gewaschen,
bevor sie in Gruppen zu jeweils 50 KOK in die Vertiefungen der Embryokulturschale mit je
500 µl NCSU 37 gesetzt wurden.
Für die ersten 24 Stunden der Maturation wurden dem Medium db-cAMP sowie die
gonadotropen Hormone PMSG und hCG zugegeben. Für den zweiten Tag erfolgte die
Reifung der KOK in äquilibriertem NCSU 37 ohne Zusatz von PMSG, hCG und db-cAMP.
Nach insgesamt 44-48 Stunden Inkubation bei 38,5 °C und 5 % CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft wurde die Reifung beendet.
3.1.3
Denudierung und Vorbereitung der in vitro gereiften porzinen
Oozyten für ICSI
Nach Beendigung der Reifung wurden die Oozyten von den expandierten Kumuluszellen
befreit. Dies erfolgte durch wiederholtes Pipettieren der KOK in PBS + 1 % NBCS mit einer
100 µl-Eppendorf-Pipette in mehreren Schritten, wodurch eine mechanische Ablösung der
Kumuluszellen von den Oozyten erreicht wurde.
Bis zur weiteren Verarbeitung lagerten die entkumulierten Zellen in einer Petrischale
(∅ 35 mm) mit 2 ml PBS + 10 % NBCS im Brutschrank.
51
Material und Methoden
3.1.4 Bestimmung der Maturationsrate
An jedem Versuchstag wurden aus den Maturationsgruppen insgesamt 15-20 Oozyten
zufällig ausgewählt, um die Maturationsrate zu überprüfen.
Diese Oozyten wurden zuerst für eine Stunde in einer Paraformaldehyd-Triton-X-100-Lösung
(siehe Anhang) bei 38,5 °C inkubiert, um eine Andauung der Zona pellucida zu erreichen,
damit der verwendete Fluoreszensfarbstoff später besser in die Oozyten eindringen konnte.
Anschließend wurden die Oozyten dreimal in PBS gewaschen und für eine Stunde bei
Raumtemperatur in PBS aufbewahrt.
Fünf Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff-Lösung (Hoechst 33342, siehe Anhang) wurden nach
Ablauf
dieser
Zeit
mit
500 µl
Mounting
Medium
(siehe
Anhang)
in
einem
2 ml-Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf, Hamburg) gemischt, wovon ein 10 µl-Tropfen auf einen
Objektträger pipettiert wurde, in den die Oozyten mit möglichst wenig PBS zentral hinein
gesetzt und mit einem Deckgläschen abgedeckt wurden. Um ein Eintrocknen der Flüssigkeit
zu verhindern, wurde der Rand des Deckgläschens rundherum mit Nagellack versiegelt.
Die Beurteilung erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop (BX 60, mit Filtereinsatz:
U-URBC, F 06398, Fa. Olympus, Hamburg) bei 100- bis 400facher Vergrößerung. Eine
Oozyte galt als gereift, wenn sowohl die Chromosomenplatte als auch der Polkörper sichtbar
waren und die Oozyte sich somit in der Metaphase II (M II) der Meiose befand.
3.2
In-vivo-Maturation porziner Oozyten
3.2.1
Versuchstiere
Für Embryotransferversuche zur Entwicklungskapazität von Embryonen, die mittels
intrazytoplasmatischer Injektion von flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten
Spermien erstellt werden sollten, wurden in vivo gereifte Oozyten verwendet. Als
Spendertiere für in vivo gereifte Oozyten dienten präpuberale, mindestens fünf Monate alte,
geschlechts-
und
allgemeingesunde
Jungsauen
der
Deutschen
Landrasse
aus
institutseigener Zucht mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 87,9 ± 12,22 kg, die
nach Superovulation zur Oozytengewinnung geschlachtet wurden.
52
3.2.2
Material und Methoden
Gewinnung in vivo gereifter porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Superovulation der Spendertiere erfolgte durch die intramuskuläre Injektion von 1500 I.E.
PMSG (Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin, Intergonan, Fa. Intervet, Tönisvorst).
Zweiundsiebzig Stunden später erhielten die Tiere eine intramuskuläre Injektion von 500 I.E.
hCG (human Chorionic Gonadotropin, Ovogest, Fa. Intervet, Tönisvorst) und weitere
36 Stunden später erfolgte die Schlachtung im institutseigenem Schlachthaus.
Der Genitaltrakt der Tiere wurde direkt nach dem Entbluten entnommen und in einem
vorgewärmten (38 °C) Thermogefäß in das Labor transportiert. Dort wurden die Ovarien
isoliert und bis zur Follikelpunktion in 38 °C warmer physiologischer Kochsalzlösung
aufbewahrt. Auf einem 38 °C warmen Heiztisch (HAT 400, Fa. Minitüb, Tiefenbach) und mit
Hilfe einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter Kanüle (18-gauge, Microlance 3, Fa. Dickinson,
Drogheda, Irland) wurden alle mindestens 5 mm großen Follikel punktiert, vorsichtig gespült
und anschließend deren Inhalt aspiriert. Als Spülmedium wurde sterilfiltriertes PBS mit
Zusatz von 1 % NBCS verwendet. Die Aspirate wurden als Mikrodrops einzeln in einer
Petrischale (∅ 94 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) nebeneinander abgesetzt und unter einem
Stereomikroskop (SMZ-2T, Fa. Nikon, Düsseldorf) mit aufgelegter Heizplatte (39 °C) bei 35bis 50facher Vergrößerung nach Oozyten abgesucht.
Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Kumulus-Oozyten-Komplexe in Petrischälchen
(∅ 35 mm, Fa. Greiner, Nürtingen) mit 2 ml PBS + 1 % NBCS nach Schlachttier getrennt im
Brutschrank aufbewahrt.
3.2.3
Denudierung und Vorbereitung der in vivo gereiften Oozyten für ICSI
Das Entkumulieren der in vivo gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte enzymatisch
mit Hilfe einer EDTA-Trypsin-Lösung (0,2 % Ethylen-Diamin-Tetraacetat; 0,1 % Trypsin in
Ca2+- und Mg2+- freiem PBS mit 1 mg/ml PVA). Dazu wurden die Oozyten für 20 Minuten in
die auf 38,5 °C vorgewärmte EDTA-Trypsin-Lösung gesetzt und anschließend durch
wiederholtes Aufziehen in eine 100 µl-Eppendorf-Pipette in drei Waschschritten in PBS mit
Zusatz von 1 % NBCS von den Kumuluszellen befreit. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden
die Oozyten in PBS + 10 % NBCS im Brutschrank bei 38,5 °C aufbewahrt.
Material und Methoden
3.3
53
Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die morphologische Beurteilung der Qualität der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe
erfolgte in Anlehnung an die von LEIBFRIED und FIRST (1979) aufgestellten
Beurteilungskriterien für KOK des Rindes. Danach werden Zytoplasma und die Expansion
der Kumuluszellen bewertet und in vier Klassen eingeteilt, wie es in Tabelle 10 beschrieben
ist.
Für die Versuche wurden nur solche KOK eingesetzt, die den Klassen 1 und 2 zuzuordnen
waren und ein dunkles, homogenes Zytoplasma aufwiesen.
Tabelle 10:
Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK)
Klasse 1
hochgradig
expandiert
Die Kumuluszellen sind weit auseinandergerückt
und liegen sowohl in der Peripherie als auch in der
Nähe der Zona pellucida einzelnd.
Klasse 2
mittelgradig
expandiert
Die Kumuluszellen sind weit auseinandergerückt,
aber mehrere Zellen sind noch
zusammenhängend.
Klasse 3
geringgradig
expandiert
Die Kumuluszellen sind deutlich
auseinandergewichen, liegen der Zona pellucida
aber noch eng an.
Klasse 4
nicht expandiert
Die Kumuluszellen liegen dicht
aneinandergedrängt der Zona pellucida eng an.
3.4
Gewinnung und Aufbereitung der verwendeten Spermien
3.4.1
Nebenhodenschwanzspermien
Das in 0,25 ml Kunststoff-Röhrchen (System Minitüb, Tiefenbach) in flüssigem Stickstoff
tiefgefrorene Nebenhodenschwanzsperma wurde in einem auf 39 °C vorgewärmten
Wasserbad für ca. 30 Sekunden aufgetaut. Anschließend wurde der Inhalt des Röhrchens
mit 10 ml Spermaverdünner (AndrohepTM, # 13529/0010, Fa. Minitüb, Tiefenbach), der auf
38 °C vorgewärmt worden war, verdünnt und für drei Minuten bei 389 x g zentrifugiert.
54
Material und Methoden
Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesogen und das verbliebene Pellet mit
0,5 ml vorgewärmtem AndrohepTM resuspendiert.
In einer folgenden Verdünnungsreihe wurde die Spermienkonzentration auf eine relativ
geringe Spermiendichte von ca. 3-5 x 105 Samenzellen pro Milliliter eingestellt, um ein
problemloses Einfangen der Spermien für die Einzelspermieninjektion zu ermöglichen.
3.4.2
Flüssigkonservierte Spermien
Für alle Versuche mit flüssigkonservierten Spermien wurden Ejakulate desselben Ebers
verwendet.
Die
Samengewinnung
erfolgte
an
einem
Phantom
mit
Hilfe
der
sogenannten
„Handmethode“, wobei die einzelnen Spermafraktionen getrennt aufgefangen wurden.
Davon wurde die spermienreiche Phase unmittelbar nach Probennahme mit vorgewärmtem
AndrohepTM (# 13529/0010, Fa. Minitüb, Tiefenbach) in einem Verhältnis von 1 : 2
vorverdünnt.
Für die Versuche mit ungesexten Spermien wurde hiervon ein Aliquot abgenommen und in
weiteren Verdünnungsschritten mit AndrohepTM auf die für ICSI benötigte Konzentration von
3-5 x 105 Spermien pro Milliliter eingestellt.
3.4.3
Flowzytometrisch sortierte, flüssigkonservierte Spermien
Für die flowzytometrische Sortierung wurde flüssigkonserviertes Sperma wie unter 3.4.2.
beschrieben gewonnen und mit AndrohepTM vorverdünnt. Ein Milliliter verdünntes Sperma mit
einer eingestellten Dichte von 150 x 106 Samenzellen pro Milliliter wurde mit 10 µl
Fluoreszenzfarbstoff (Hoechst 33342, bisBenzimid, 5 mg/ml, Fa. Sigma, St.Louis, MO, USA)
versetzt und bei 35 °C für eine Stunde inkubiert. Anschließend erfolgte bei Raumtemperatur
eine Gegenfärbung der Spermien mit 1 µl des Lebensmittelfarbstoffs FD & C #40 (Fa.
Warner Jenkinson Company Inc., St. Louis, MO, USA) aus einer Stocklösung mit der
Konzentration 25 mg/ml, um akrosomendefekte Spermien zu separieren. Vor der
flowzytometrischen Sortierung wurde die Probe durch ein Nylonnetz mit einer Porenweite
von 51 µ (Fa. Reichelt Chemietechnik, Heidelberg) filtriert.
Die flowzytometrische Sortierung der gefärbten Samenzellen erfolgte nach der „Beltsville
Sperm Sexing Technology“ nach JOHNSON und WELCH (1999) mit einem „High Speed Cell
Sorter“ (MoFlo Cytomation, Fort Collins, CO, USA). Als Lichtquelle diente ein 5 W Argon-
55
Material und Methoden
Ionen-Laser mit einer Lichtleistung von 200 mW. Der Wellenlängenbereich des Lasers zur
Emissionsanregung lag zwischen 351 und 364 nm. PBS mit Zusatz von 0,002 % BSA
Fraktion V (Fa. Sigma, St.Louis, MO, USA), 50 µg/ml Penicillin G und 60 µg/ml Streptomycin
und einem pH-Wert von 7,5 diente als Hüllstrom. Es wurde mit einem Arbeitsdruck von
3,9 bar und einer Flußrate von 27000 Samenzellen pro Sekunde sortiert. Die Sortierrate
betrug 2700 bis 3000 Spermien pro Sekunde, die durchschnittliche Reinheit der sortierten
Spermienpopulationen umfasste 95 % für Y-chromosomale und 92 % X-chromosomale
Spermien.
Als Auffanggefäße dienten um 2 mm gekürzte 15 ml-Zentrifugenröhrchen (Fa. Greiner,
Frickenhausen), in die 0,5 ml „Auffangmedium“ vorgelegt wurden. Bei diesem Medium
handelte es sich um den Überstand einer bei 850 x g für zehn Minuten zentrifugierten 2 %TEST-Eidotter-Lösung (siehe Anhang), der bis zum Einsatz bei -20 °C gelagert wurde. Nach
dem Auftauen wurde das Auffangmedium ebenfalls mit Hilfe des 51 µ-Nylon-Filters filtriert
und anschließend mit 1 % Seminalplasma supplementiert.
Zur Konzentrierung des gesexten Spermas wurden die Samenzellen nach dem
Sortiervorgang für 20 Minuten bei 850 x g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand
abgenommen und das Spermienpellet mit 0,5 ml AndrohepTM resuspendiert. Dabei wurde
den sortierten Spermien erneut 1 % Seminalplasma zum Endvolumen zugesetzt. In einer
folgenden Verdünnungsreihe erfolgte die Einstellung der Spermienkonzentration auf die für
ICSI benötigte Dichte von 3-5 x 105 Spermien pro Milliliter. Für alle Versuche mit sortiertem
Sperma wurden nur die y-chromosomalen Spermien verwendet.
3.5
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)
3.5.1
Mikroinjektionsausstattung
Die Versuche wurden an einer Mikromanipulationseinheit mit inversem Mikroskop (Axiovert
135, Fa. Zeiss, Göttingen) bei 100- bis 400facher Vergrößerung durchgeführt. Das
Mikroskop war mit einer Hoffmann Modulation-Contrast-Optik (HMC, Fa. Modulation Optics
Inc., Greenvale, New York, USA) ausgestattet, wodurch eine besonders kontrastreiche
Darstellung gewährleistet wurde.
Der
Objekt-Kreuztisch
(Fa.
Minitüb,
Tiefenbach)
war
beheizbar
und
auf
eine
Arbeitstemperatur von 38,5 °C eingestellt. Auf dem Heiztisch war eine Metallplatte fixiert, die
mit einer entsprechenden Aussparung versehen war, um eine Petrischale von 55 mm
Durchmesser aufzunehmen.
56
Material und Methoden
Für die Spermieninjektionen wurden zwei verschiedene Mikromanipulatoren verwendet:
Auf der linken Seite des Mikroskops befand sich für die Führung und Halterung der OozytenHaltepipette ein manueller Mikromanipulator (# 11520138, Fa. Leitz, Wetzlar), während auf
der rechten Seite des Mikroskops für Halterung und Führung der Injektionspipette eine
elektrische Mikromanipulations-Einheit (LN-MINI 25 XYZ motorisch, Fa. Luigs & Neumann,
Ratingen) angebracht war. Die gesamte Mikromanipulationseinheit ist in Abbildung 6
dargestellt.
Abbildung 6: Mikromanipulationseinheit
Der mechanische Manipulator für die Haltepipette besaß eine Halterung, mit deren Hilfe der
Kapillarenhalter mit der Haltepipette am Gerät fixiert wurde. Der Kapillarenhalter war über
einen ca. 80 cm langen Schlauch (∅ ca. 5 mm) mit einer 1 ml-Einmalspritze verbunden.
Durch Bewegen des Spritzenstempels ließen sich Über- und Unterdruck in der Haltepipette
erzeugen, so dass durch Ansaugen und Abstoßen die Oozyte bewegt und fixiert werden
konnte. Die Haltepipette wurde mit Hilfe einer Gummidichtung in dem Kapillarenhalter fixiert.
Bei den Haltepipetten handelte es sich um Schmelzpunktbestimmungsröhrchen mit einer
Länge von 90 mm und einem Durchmesser von 1,5 mm (# 3005, Fa. Assistent), die selbst
bearbeitet wurden:
57
Material und Methoden
Zuerst wurden die Röhrchen mit Hilfe eines Mikropipetten-Pullers (# Mpp1, Fa. Research
Instruments, Cornwall, U.K.) ausgezogen und anschließend an einer Mikroschmiede
(# P430, 25800501, Fa. Bachhofer, Reutlingen) weiter bearbeitet. Nachdem sie bei einem
äußerem Durchmesser von ca. 120 µm senkrecht und gerade abgebrochen worden waren,
wurde dieses Ende der Pipette an die glühende Glaskugel der Mikroschmiede herangeführt,
um die Ränder der Spitze soweit zusammenzuschmelzen, dass die Öffnung der Pipette nur
noch 30-40 µm betrug. Als letztes wurde dieses Ende der Pipette ca. 1,5 mm vor der Spitze
in einem Winkel von 30° abgebogen.
Der elektrische Manipulator für die Injektionspipette bestand aus drei Teilen: zum einen aus
der Fixiereinheit, die direkt am Mikroskop befestigt war und zur Führung und Halterung der
Mikropipette diente und über Schrittmotoren in drei verschiedenen Achsen beweglich war,
zum anderen aus dem Tastenfeld mit Trackball, womit die Mikromanipulationseinheit
gesteuert wurde, und aus der Steuerungseinheit (SM2/2-96-023, Fa. Luigs & Neumann,
Ratingen).
Für die Spermieninjektion wurde auf einer Ebene im Proportional-Modus (P-Modus)
gearbeitet, bei dem sich der Manipulator proportional zu den Bewegungen des Trackballs
bewegte. Es wurden die Achsen X, Y, Z und D unterschieden.
Die Achsen X und Y dienten zu Bewegungen in alle Richtungen auf einer bestimmten Ebene
der Injektionspipette, während es mit Hilfe der Z-Achse möglich war, die Ebene bzw. Höhe
der Pipette zu verändern. Die D-Achse veränderte nicht die Position der Mikropipette,
sondern konnte über eine motorisch dosierte Spritze die Ölsäule in der Injektionsipette
bewegen (Abbildung 7).
Y
Öl
Z
D
X
Abbildung 7: Bewegungsachsen des Mikromanipulators
Es war möglich, die Bewegungsgeschwindigkeit der Pipette und der Ölsäule genau zu
definieren: Zum einen konnte eine grobe Einteilung in die Bereiche „HIGH“ (1-6 mm/sec) und
„LOW“ (0,04-0,68 mm/sec) festgelegt werden, zum anderen konnten in jedem Bereich
58
Material und Methoden
weitere Abstufungen in 32 Schritten durch Drücken der Tasten XYZ↑ oder XYZ↓, bzw. D↑
oder D↓ vorgenommen und gespeichert werden. Die gewählten Geschwindigkeiten wurden
auf dem Display des Tastenfeldes angezeigt. In Tabelle 11 sind die für die
intrazytoplasmatische Spermieninjektion verwendeten Geschwindigkeitsstufen aufgeführt.
Tabelle 11:
Gespeicherte Geschwindigkeitsstufen für ICSI
„LOW“
„HIGH“
Stufe
entspricht
mm/sec.
Stufe
entspricht
mm/sec.
D
11
0,24
19
3,81
XYZ
15
0,32
23
4,44
Die verwendete Injektionspipette (# 5175 112.008, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,
Köln) wurde mit Hilfe von Spannzange und Mutter fest in einem Kapillarenhalter (# KP000100, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) verankert. Es kamen Injektionsnadeln mit
folgenden Abmessungen zum Einsatz:
Tabelle 12:
Abmessungen der verwendeten Injektionspipette für ICSI
(# 5175 112.008, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, 51145 Köln)
Innerer Durchmesser der Spitze:
5,5 µm
Äußerer Durchmesser der Spitze:
7,0 µm
Länge des Schenkels:
Winkel:
Orientierung der Öffnung:
1000 µm
35°
seitlich
Material und Methoden
59
Der Kapillarenhalter mit der Injektionsnadel wurde in eine Kapillarenhalterung an der
Manipulationseinheit eingeklemmt. Mit Hilfe einer Stellschraube konnte diese Halterung in
einem Winkel zwischen 35-60° fixiert werden. Für die Spermieninjektionen wurde ein Winkel
von ca. 40° gewählt.
Über das andere Ende des Kapillarenhalters wurde ein Druckschlauch (# 05011515,
Angiodyn HD-Schlauch, Fa. Braun, Melsungen) geschoben und mit einer Mutter
festgeklemmt. Der Druckschlauch führte zu einem Dreiwegehahn (# 05012155, Angiodyn
HD-Hahn, Fa. Braun, Melsungen), der eine Verbindung mit einer gasdichten Spritze
(Hamilton MicroliterTM Syringe, Fa. Hamilton Bonaduz AG, 7402 Schweiz) und einem
weiteren Schlauch erlaubte. Die Hamilton-Spritze wurde in eine motorische Dosiereinheit
(LN-Mini-25-Manipulator mit Dosieradapter, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) eingespannt,
wodurch der Konus der Spritze über die oben erwähnte D-Achse bewegt und Öl in die
Injektionsnadel gedrückt werden konnte.
Am Ende des zweiten Schlauches wurde eine 10 ml-Spritze (Fa. Becton Dickinson,
Drogheda, Irland) befestigt, mit deren Hilfe das verwendete Öl (# M-3516, mineral oil, light
white oil, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) in das System eingefüllt werden konnte. Dazu
wurde der Zugang zur Hamilton-Spritze durch den Dreiwegehahn verschlossen. In dem mit
Öl gefüllten Schlauchsystem durften keine Luftblasen enthalten sein.
3.5.2
Durchführung der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI)
Die Spermieninjektionen wurden in einem Petrischalendeckel (∅ 55 mm, Fa. Greiner,
Nürtingen) durchgeführt, der exakt in die Aussparung des Objekttisches passte.
In die Mitte des Deckels wurde ein 10 µl Tropfen der Spermiensuspension gegeben und mit
einem 8 µl Tropfen Polyvinylpyrrolidon (PVP 10%ig, # 10890001, Fa. Gück, Berlin) überdeckt
und vermischt. Aufgrund der hohen Viskosität des PVP (Molekulargewicht: 360.000)
verlangsamten sich die Bewegungen der Spermien, so dass das Immobilisieren und
Einfangen der Spermien erleichtert wurde.
Um den Spermientropfen herum wurden in gleichmäßigen Abständen zehn 20 µl-Tropfen
PBS + 10 % NBCS pipettiert (Abbildung 8) und anschließend wurden alle Tropfen mit
Mineralöl (# M-3516, mineral oil, light white oil, Fa. Sigma, St. Louis, USA) vollständig
bedeckt. In jeden PBS-Tropfen wurden jeweils zwei entkumulierte Oozyten pipettiert.
60
Material und Methoden
= Spermientropfen
= Oozytentropfen
Abbildung 8: Schematische
Darstellung
des
„ICSI-Schälchens“
mit
Spermien-
und
Oozytentropfen
Zur Aufnahme eines Spermiums wurde die Injektionspipette von rechts in den
Spermientropfen „hinein gefahren“. Nachdem die Ölsäule in der Pipette ca. eine halbe
Spermienlänge vor der Pipettenspitze zum Stillstand gebracht worden war, wurde ein
Spermium rausgesucht, das morphologisch intakt erschien und noch Bewegungsaktivität
zeigte.
Zur Immobilisierung der Samenzelle wurde die Pipettenspitze vertikal über dem Mittelstück
abgesenkt und das Spermium auf den Boden der Petrischale gedrückt. Um die
Mittelstückmembran leicht anzureißen, wurde die Pipette ein- bis zweimal vorsichtig hin- und
herbewegt. Anschließend wurde die Samenzelle so gedreht, dass sie mit dem Schwanz
zuerst von der Injektionspipette aufgenommen werden konnte. Befand sich das Spermium in
der Pipette, wurde die Ölsäule wieder zum Stillstand gebracht, und die Injektionsnadel wurde
aus dem Tropfen „herausgefahren“.
Anschließend wurde eine Oozyte in einem PBS-Tropfen mit Hilfe der Haltepipette fixiert und
auf Vorhandensein und Lage eines Polkörpers untersucht. Die Oozyte wurde so von links
(neun Uhr) angesaugt, dass der Polkörper auf der Linie zwischen zwölf und sechs Uhr zu
liegen kam. Die Spermieninjektion erfolgte in der Drei-Uhr-Position (Abbildung 9). Dabei
wurde die Samenzelle zunächst direkt in der Spitze der Pipette positioniert, um die injizierte
Menge des PVP-Androhep-Gemisches im Zytoplasma möglichst gering zu halten. Nachdem
die Injektionsnadel durch Zona pellucida und Oolemm hindurch in die Oozyte eingeführt
worden war, wurde erst eine geringe Menge Zytoplasma angesaugt, um abzusichern, dass
sich die Pipettenspitze wirklich im Zytoplasma der Oozyte befand. Danach wurde das
Spermium mit dem Kopf zuerst in das Zytoplasma der Oozyte injiziert und, sobald die
Ölsäule wieder zum Stillstand gebracht worden war, die Pipette aus der Oozyte
herausgezogen.
61
Material und Methoden
Zur Kontrolle parthenogenetischer Entwicklungsvorgänge wurden an jedem Versuchstag
auch kontroll- und nicht injizierte Oozyten in die Versuche miteinbezogen. Kontrollinjizierte
Oozyten wurden dabei exakt wie die spermieninjizierten behandelt, außer dass sich kein
Spermium in der Injektionsnadel befand.
Die Oozyten der nicht injizierten Kontrollgruppen wurden genau wie die der injizierten
Gruppen behandelt, jedoch ohne sie der Mikromanipulation zu unterziehen.
Anschließend wurden die Oozyten bis zur Weiterkultivierung in PBS + 10 % NBCS im
Brutschrank bei 38,5 °C und 5%iger CO2-Atmosphäre in feuchtigkeitsgesättigter Luft
aufbewahrt.
Spermium
Polkörper
Abbildung 9: Intrazytoplasmatische Injektion eines Spermiums in eine gereifte Oozyte
(Polkörper auf sechs Uhr)
62
Material und Methoden
3.6
Für
Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI
die
zusätzliche
Aktivierung
porziner
Oozyten
zur
intrazytoplasmatischen
Spermieninjektion wurden folgende Methoden angewandt: die Injektion einer CaCl2-Lösung,
die Koinkubation mit Ca2+-Ionophor und die Aktivierung durch einen einzelnen elektrischen
Puls. Für diese Versuche wurden die Oozyten nur mit unsortierten, tiefgefrorenen,
aufgetauten Nebehodenschwanzspermien injiziert. Die Auswertung erfolgte nach 20stündiger In-vitro-Kultur anhand der Vorkernbildung.
3.6.1
Aktivierung durch CaCl2-Injektion
Bei der künstlichen Aktivierung der Oozyten mit CaCl2 wurde zusammen mit dem Spermium
eine bestimmte Menge einer CaCl2-Lösung in die Oozyte injiziert.
Das CaCl2 (CaCl2H2, # C 7902, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde in einer Konzentration
von 30 mM in einer 0,9%igen NaCl-Lösung gelöst und anschließend, nach Zugabe von 2 %
NBCS, sterilfiltriert (Einmal-Filterhalter FP 030/3, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel).
Zehn Mikroliter dieser vorbereiteten Lösung wurden im ICSI-Schälchen unterhalb des
Spermientropfens abgesetzt. Zusätzlich wurde für eine entsprechende Kontrollgruppe ein
10 µl Tropfen einer sterilfiltrierten 0,9%igen NaCl-Lösung unterhalb des CaCl2-Tropfens in
das ICSI-Schälchen pipettiert. Seitlich und oberhalb dieser Tropfen wurden neun Tropfen
PBS + 10 % NBCS für die Oozyten verteilt, und anschließend wurden alle Tropfen ebenfalls
mit Öl (# M-3516, mineral oil, light white oil, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) vollständig
bedeckt. Für eine Spermieninjektion mit zusätzlicher Aktivierung durch CaCl2 wurde die
Injektionspipette mit der aufgenommenen Samenzelle in den CaCl2-Tropfen gefahren. Dort
wurde soviel des PVP-Androhep-Gemisches aus der Pipette herausgespült bis sich das
Spermium in der Pipettenspitze befand, anschließend wurde ausreichend CaCl2-Lösung in
die Pipette aufgenommen und die Ölsäule wieder zum Stillstand gebracht.
Vor der Injektion von CaCl2 und Spermium in die Oozyte wurde die Samenzelle so
positioniert, dass der Kopf eine Spermienlänge von der Pipettenspitze entfernt war.
Anschließend erfolgte der Injektionsvorgang wie unter 3.5.2 beschrieben. Es wurden somit
ca. 1,2 pl CaCl2-Lösung zusammen mit dem Spermium in die Oozyte injiziert. Die
Berechnung des Injektionsvolumens erfolgte nach der in Tabelle 13 angegebenen Formel.
Material und Methoden
Tabelle 13:
63
Formel zur Berechnung des injizierten Volumens der CaCl2-Lösung
(5,5 µm : 2)2 • π • 50 µm = 1187,9 µm3 ↔ 1,188 pl
5,5 µm
= Innendurchmesser der Injektionspipette
50 µm
= Länge eines Eberspermiums
An jedem Versuchstag wurde zur Überprüfung der aktivierenden Eigenschaften des CaCl2 in
einige Oozyten nur CaCl2 und kein Spermium injiziert. Genauso erfolgte die Überprüfung der
aktivierenden Eigenschaften der 0,9%igen NaCl-Lösung ohne CaCl2.
Spermien-, kontroll- und nicht injizierte Oozyten ohne zusätzliche Injektion von CaCl2 oder
NaCl wurden jeweils als Kontrollgruppen mituntersucht.
3.6.2
Aktivierung durch Ca-Ionophor
Die Aktivierung der Oozyten durch Ca2+-Ionophor (A 23187, # C7522, Fa. Sigma, St. Louis,
MO, USA) wurde im Anschluss an die Spermien- und Kontrollinjektionen durchgeführt. Sie
erfolgte durch Inkubation der Oozyten in einem 50 µmol Ca2+-Ionophor (A 23187)
enthaltenden Fert Talp-Medium (siehe Anhang) für drei Minuten bei 38,5 °C, 5%iger CO2Atmosphäre in feuchtigkeitsgesättigter Luft.
Vorbereitend wurde Ca2+-Ionophor (Molekulargewicht: 523,6) in einer Konzentration von
1 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) gelöst, in Aliquots zu
52,4 µl in 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäss (Fa. Eppendorf, Hamburg) abgefüllt und bei
-21 °C eingefroren. Direkt vor Aktivierung der Oozyten wurde ein Reaktionsgefäß mit
Ca2+-Ionophor-DMSO-Lösung aufgetaut und mit 1947,6 µl äquilibriertem Fert Talp-Medium
auf 2 ml aufgefüllt und vermischt, um die gewünschte Konzentration von 50 µmol zu
erhalten.
Jeweils 500 µl dieser Lösung wurden dann in die, der Anzahl der zu aktivierenden Gruppen
entsprechend viele, Vertiefungen eines Five Well Dishes (# 19021005, Embryokulturschale
mit fünf Vertiefungen, Fa. Minitüb, Tiefenbach) gegeben und nochmals im Brutschrank
äquilibriert.
64
Material und Methoden
Die zu aktivierenden Oozyten wurden nach Gruppen getrennt jeweils einmal durch
äquilibriertes Fert-Talp-Medium gewaschen und anschließend in die Ca2+-Ionophor-haltige
Lösung gesetzt und für drei Minuten inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Oozyten
sechsmal durch äquilibriertes Fert Talp-Medium gewaschen, bevor sie weiterkultiviert
wurden.
Die Untersuchungen erfolgten parallel an spermien-, kontroll- und nicht injizierten Oozyten,
sowohl mit als auch ohne Aktivierung durch Ca2+-Ionophor für jeden Versuchsdurchgang.
3.6.3
Aktivierung durch elektrischen Puls
Die Aktivierung der Oozyten durch elektrischen Puls erfolgte vor der Spermieninjektion mit
Hilfe eines elektrische Fusionsgerätes (CFA 400, Elektro Zellfusion, Fa. Krüss, Hamburg).
Als Medium während der Aktivierung wurde eine auf 38,5 °C vorgewärmte und sterilfiltrierte,
für Zellfusionszwecke übliche, Ca2+- und Mg2+-haltige Mannose-Lösung (siehe Anhang)
verwendet.
Zur Äquilibrierung wurden jeweils 20 entkumulierte Oozyten zunächst für zwei Minuten in ein
auf 38,5 °C vorgewärmtes 1 : 1 Gemisch aus PBS + 10 % NBCS und Aktivierungsmedium
gesetzt. Anschließend wurden sie für ca. eine Minute in dem Aktivierungsmedium inkubiert,
bevor sie in Fusionsmedium zwischen die zwei Platin-Iridium-Drähte (Abstand der Drähte:
250 µm, ∅ der Drähte: 200 µm) einer Bügel-Fusionskammer (Fa. Krüss, Hamburg) verbracht
und mit einem einfachen DC-Puls von 0,4 kV/cm für 99 µs aktiviert wurden.
Im Anschluss an die elektrische Aktivierung wurden die Oozyten für ca. eine Minute in dem
Aktivierungsmedium belassen, bevor sie in ein Petrischälchen (∅ 35 mm) mit 2 ml PBS +
10 % NBCS pipettiert wurden. Die Spermien- und Scheininjektionen erfolgten, wie oben
beschrieben, ca. 10-30 Minuten nach der elektrischen Aktivierung.
Es wurden an jedem Versuchstag spermien-, kontroll- und nicht injizierte Oozyten, sowohl
mit als auch ohne elektrische Aktivierung, parallel untersucht und miteinander verglichen.
65
Material und Methoden
3.7
In-vitro-Kultur
Die Weiterkultivierung der Oozyten der Versuchs- und Kontrollgruppen im Anschluss an die
Spermieninjektionen erfolgte, je nach Versuchsansatz, für die ersten 20 Stunden in
Fert Talp-Medium (siehe Anhang) und weitergehend in NCSU 23 (siehe Anhang).
Die sich zunächst noch in PBS + 10 % NBCS befindlichen Oozyten wurden dreimal in
vorinkubiertem Fert Talp-Medium gewaschen und anschließend nach Gruppen getrennt in
kleine Petrischälchen (∅ 35 mm) mit 2 ml äquilibriertem Fert Talp-Medium gesetzt. Zur
Weiterkultivierung über 20 Stunden hinaus wurden die Oozyten nach Ablauf dieser Zeit
dreimal in äquilibriertem NCSU 23 (siehe Anhang) gewaschen und anschließend in die
Vertiefungen einer Embryokulturschale mit je 500 µl NCSU 23 (# 19021005, Fa. Minitüb,
Tiefenbach) gesetzt und weiterkultiviert.
Die Inkubation im Brutschrank (Nuaire NU 2700 E, Fa. Zapf Instrumente, Sarstedt) erfolgte
bei 38,5 °C und 5 % CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft.
Nach 48 Stunden In-vitro-Kultur wurde die Teilungsrate bestimmt und die geteilten
Zellstadien aller Versuchsgruppen wurden in frisches, äquilibriertes NCSU 23 pipettiert und
für weitere 120 Stunden entsprechend kultiviert.
3.8
Beurteilung der Entwicklungsraten
Embryonen nach ICSI
in
vitro
kultivierter
3.8.1
Beurteilung anhand der Vorkernstadien nach 20 und 48 Stunden
Die spermien-, kontroll- und nicht injizierten Oozyten wurden in den Aktivierungsversuchen
nach 20-stündiger In-vitro-Kultur, oder als ungeteilte Stadien in den Versuchen mit sortierten
Spermien nach 48 Stunden, fixiert und zwei Tage später zur zytogenetischen Untersuchung
gefärbt. Die Oozyten wurden mit möglichst wenig Medium zwischen zwei ParaplastVaseline-Streifen auf entfettete und staubfreie Objektträger pipettiert und vorsichtigt mit
einem Deckgläschen angedrückt. Die Objektträger wurden anschließend zur Fixierung
hochkant in eine Färbeküvette gestellt, die mit 40 ml einer Ethanol-Eisessig-Lösung (3 : 1)
gefüllt war, und für zwei Tage stehen gelassen.
Die Färbung der Oozyten erfolgte, indem am unteren Rand 2-3 Tropfen einer 1%igen
Lacmoid-Färbelösung (siehe Anhang) unter das Deckgläschen gegeben und vorsichtig mit
Hilfe eines Filterpapiers nach oben durchgezogen wurden. Die Beurteilung der Vorkerne
66
Material und Methoden
fand anschließend unter einem Phasenkontrastmikroskop (BX 60, PhasenkontrastMikroskop, Fa. Olympus, Hamburg) bei 100- bis 400facher Vergrößerung statt.
Eine Oozyte wurde dabei als aktiviert angesehen, wenn sie mindestens einen Vorkern (VK)
besaß oder geteilt war. Die Aktivierungsrate ergab sich somit aus dem prozentualen Anteil
aller aktivierten Oozyten der jeweiligen Versuchsgruppe.
Eine spermieninjizierte Oozyte galt als befruchtet, wenn sie genau zwei Vorkerne (Abbildung
10)
enthielt
oder
Befruchtungsrate
sich
in
abgeleitet
gleichmäßige
wurde.
Blastomeren
Entsprechend
geteilt
der
hatte,
woraus
Befruchtungsrate
die
der
spermieninjizierten Oozyten wurde die Parthenogeneserate bei den kontroll- und nicht
injizierten Oozyten angesehen (Oozyten mit zwei Vorkernen oder geteilt). Mit den hier
angewandten Untersuchungsmethoden konnte allerdings nicht exakt festgestellt werden, ob
die als befruchtet angesehenen spermieninjizierten Oozyten wirklich befruchtet waren oder
ob es sich um parthenogenetische Vorkernentwicklung oder Teilung ohne Beteiligung des
injizierten
Spermiums
handelte.
Die
jeweils
scheininjizierten
Oozyten
eines
Versuchsansatzes galten somit als Kontrolle für parthenogenetische Entwicklungen
spermieninjizierter Oozyten. Daraus ließ sich für Diskussionszwecke eine hypothetische
effektive Befruchtungsrate der spermieninjizierten Oozyten ableiten, die sich aus der
Befruchtungsrate spermieninjizierter Oozyten abzüglich der Parthenogeneserate der
entsprechend kontrollinjizierten Oozyten ergab.
Abbildung 10: Zwei-Vorkern-Stadium nach Spermieninjektion und CaCl2-Aktivierung einer in
vitro gereiften Oozyte, 20 Stunden nach ICSI
67
Material und Methoden
Oozyten, die sich zum Zeitpunkt des Fixierens in der Ana- oder Telophase II befanden,
wurden unter „Sonstige“ (Sonst.) eingeteilt. Die Oozyten, bei denen keine definierbaren
Kernstrukturen vorzufinden waren, wurden als nicht analysierbar (n.a.) eingestuft, woraus
eine Degenerationsrate abgeleitet wurde. Als Entwicklungsraten wurden die Raten der
verschiedenen Entwicklungsstadien zu den festgelegten Untersuchungszeitpunkten (20, 48
und 168 Stunden nach ICSI) angesehen.
3.8.2
Beurteilung der Teilungsrate nach 48 Stunden
Für die Versuche zum Einsatz geschlechtsspezifisch sortierter Spermien zur ICSI wurden die
Oozyten für insgesamt 168 Stunden in vitro kultiviert. Nach 48 Stunden erfolgte dazu die
Bestimmung der Teilungsrate. In diesem Versuchsansatz wurden vergleichend ungesexte
und gesexte Spermien jeweils in Kombination mit oder ohne CaCl2-Aktivierung zur ICSI
eingesetzt. Entsprechende Gruppen kontroll- und nicht injizierter Oozyten wurden parallel mit
untersucht.
Als Teilungsrate galt der prozentuale Anteil aller geteilten Zellstadien innerhalb einer
Versuchsgruppe. Entsprechend der oben erwähnten Befruchtungsrate war auch bei der
Teilungsrate
spermieninjizierter
Oozyten
eine
Differenzierung
„echter“
und
parthenogenetischer Teilung nicht möglich.
Die Beurteilung der Teilungsrate nach 48stündiger In-vitro-Kultur erfolgte morphologisch
mittels Stereomikroskop (SMZ-2T, Fa. Nikon, Düsseldorf) bei 35- bis 50-facher
Vergrößerung. Dazu wurden die Entwicklungsstadien in folgende Gruppen eingeteilt: ZweiZellstadien, Vier-Zellstadien, ≥ Vierzellstadien und ungeteilte Zellstadien. Die geteilten
Zellstadien wurden je nach Fragestellung weiterkultiviert oder im Embryotransfer eingesetzt.
Die ungeteilte Stadien wurden fixiert und zur zytogenetischen Untersuchung gefärbt (siehe
3.8.1).
3.8.3
Beurteilung anhand der Zellkernzahlen nach 168 Stunden
Alle Embryonen, die 48 Stunden nach ICSI mindestens das Zwei-Zell-Stadium erreicht
hatten, wurden für weitere 120 Stunden in vitro kultiviert. Im Anschluß an die Kulturphase
wurde morphologisch die Blastozystenrate bestimmt und mit Hilfe einer Fluoreszenzfärbung
eine Bestimmung der Zellkernzahl durchgeführt. Die entsprechenden prozentualen
Entwicklungsraten (Blastozysten, 5-Zell-Stadium bis Morula, 2- bis 4-Zell-Stadium, nicht
68
Material und Methoden
analysierbar) ergaben sich aus dem jeweiligen Anteil dieser Stadien an allen geteilten
Zellstadien der entsprechenden Versuchsgruppe.
Zur Zellkernzahlbestimmung wurden 10 µl Fluoreszenzfarbstoff-Lösung (Hoechst 33342,
siehe Anhang) in das die Embryonen enthaltende Kulturmedium in den Vertiefungen der
Embryokulturschale pipettiert. Jeweils 2-3 Embryonen wurden mit 10 µl KulturmediumFarbstoff-Gemisch auf einen Objektträger verbracht und mit einem Deckgläschen abgedeckt.
Die Bestimmung der Zellkernzahlen erfolgte an einem Fluoreszenzmikroskop (BX 60, Fa.
Olympus, Hamburg) bei 100- bis 400facher Vergrößerung (siehe auch Abbildung 18 u. 19).
3.9
Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit der ICSI-Embryonen
durch Embryotransfer
3.9.1
Empfängertiere
Als Empfängertiere für die chirurgische Embryonenübertragung dienten präpuberale,
mindestens fünf Monate alte, geschlechts- und allgemeingesunde Jungsauen der Deutschen
Landrasse aus institutseigener Zucht mit einem Körpergewicht von 85-93 kg.
3.9.2
Transfer von Embryonen im Zwei- bis Vier-Zell-Stadium
Zur Überprüfung ihrer Entwicklungsfähigkeit wurden Embryonen aus in vitro gereiften und
mit ungesexten, frischkonservierten Spermien und mit CaCl2 aktivierten Oozyten im Zweiund
Vier-Zellstadium
chirurgisch
auf
synchronisierte
Empfängertiere
übertragen.
Zur Ovulationsdeterminierung erhielten die Empfängertiere 140 Stunden vor dem
Embryotransfer jeweils eine intramuskuläre Injektion von 800 I.E. PMSG (Pregnant Mare´s
Serum Gonadotropin, Intergonan, Fa. Intervet, Tönisvorst) und 72 Stunden später eine
intramuskuläre Injektion von 500 I.E. hCG (human Chorionic Gonadotropin, Ovogest, Fa.
Intervet, Tönisvorst).
Die Embryonen wurden kurz vor dem Transfer aus dem Kulturmedium genommen, dreimal
in vorgewärmtem PBS + 10 % NBCS gewaschen und anschließend in einen sterilen PlastikStraw (Paillette Cristal 133, Ref ZA 176, L´Aigle, France) aufgezogen. Das untere Ende des
Straws war mit einem ca. 7 mm langen Schlauchstück aus weichem Kunststoff überzogen,
um beim Einführen in den Eileiter die Traumatisierung desselben möglichst gering zu halten.
69
Material und Methoden
Bis zum Embryotransfer und während des Transportes zum Stall wurde der Straw in einem
auf 38 °C erwärmten, mit Stahlkugeln gefüllten Thermogefäß aufbewahrt.
Zur Übertragung der Embryonen wurde ein chirurgischer Transfer vorgenommen. Die
Immobilisierung der Schweine erfolgte durch intramuskuläre, sedierende Prämedikation mit
Azaperon (Stresnil, Janssen-Cilag GmbH, Neuss) mit anschließender Narkose durch
intravenöse Injektion von Thiamylal (Surital, Fa. Pharmacia & Upjohn, Erlangen). Zur
Operation wurden die Empfängertiere in Rückenlage auf einem Operationstisch fixiert. Die
Eröffnung der Abdominalhöhle erfolgte zwischen den beiden letzten Zitzenpaaren in der
Linea alba. Der Uterus wurde aufgesucht, ein Ovar vorgelagert und die Gelbkörper gezählt.
Bei einer ausreichenden Anzahl frischer Gelbkörper wurde der Straw vorsichtig über den
Fimbrientrichter so weit wie möglich in den Eileiter eingeführt und die Embryonen dort
abgesetzt. Anschließend wurden Ovar und Eileiter reponiert und die Bauchhöhle mit
Bauchfell-Muskel-, Unterhaut- und Haut-Naht unter Verwendung von Catgut (Catgut chrom.,
7-metric, Fa. B. Braun Surgical GmbH, Melsungen) verschlossen.
Jedes Tier erhielt anschließend eine systemische Antibiose (Tardomyocel comp II, Fa.
Bayer, Leverkusen)
Eine Überprüfung der Trächtigkeit erfolgte bei allen Tieren zwischen dem 21. und 35. bzw.
56. Tag
durch
dreimalige
sonographische
Untersuchung
mit
einem
Real-time
Ultraschallgerät (Modell CS 9100, Fa. Picker International GmbH, Espelkamp).
3.9.3
Transfer von Embryonen im Zygotenstadium
In diesem Versuchsabschnitt wurden die aus in vivo gereiften und mit y-chromosomalen
Spermien befruchteten und mit CaCl2 aktivierten Oozyten erzeugten Zellstadien unmittelbar
nach den Spermieninjektionen auf Empfängertiere übertragen. Dazu wurden präpuberale
Jungsauen für den Embryotransfer entsprechend den Spendertieren wie unter 3.2.2.
synchronisiert, jedoch wurden diese Tiere nicht superovuliert und erhielten nur 800 I.E.
PMSG. Der Embryotransfer wurde durchgeführt wie unter 3.9.2 beschrieben, wobei die
Oozyten aufgrund der großen Anzahl auf beide Eileiter verteilt wurden.
70
3.10
Material und Methoden
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms „Sigma Stat for Windows“
(Jandel Scientific Cooperation, Erkrath).
Zunächst wurde für jeden einzelnen Versuch zu den angegebenen Zeitpunkten (20, 48 oder
168 Stunden nach ICSI) der prozentuale Anteil der unterschiedlichen Entwicklungsstadien an
der Gesamtzahl der Oozyten an diesem Versuchstag für die jeweilige Versuchsgruppe
ermittelt. Nach mehreren Wiederholungen des entsprechenden Versuches wurde der
arithmetische Mittelwert ( x ) und die Standardabweichung (± SD) dieser Entwicklungsraten
für die einzelnen Entwicklungsstadien und die jeweilige Versuchsgruppe errechnet.
Die Werte der verschiedenen Entwicklungsraten (%) wurden mittels ANOVA geprüft. Bei
nicht vorhandener Normalverteilung wurden die Werte mittels ANOVA on Ranks geprüft und
die Einzelwerte mit Tukey-Test bzw. Dunn´s Methode analysiert. Die Werte der ermittelten
Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten wurden mit dem t-Test einzeln
gegeneinander getestet, bei fehlender Normalverteilung wurde für diese Werte der MannWhitney Rank Sum Test angewendet.
Unterschiede zwischen den Gruppen galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05
als signifikant und ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,001 als hochsignifikant.
71
Ergebnisse
4
ERGEBNISSE
4.1
Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI
4.1.1
Aktivierung durch CaCl2-Injektion
In diesem Versuchsteil wurde überprüft, ob es durch Injektion von CaCl2 möglich ist, die
Aktivierungs- und Befruchtungsraten spermieninjizierter Oozyten zu steigern, ohne die in den
Kontrollgruppen untersuchte Parthenogeneserate zu erhöhen.
Für die Versuche standen in sechs Versuchdurchgängen insgesamt 676 in vitro gereifte
Oozyten zur Verfügung. Die durchschnittliche Maturationsdauer betrug 47,5 ± 0,6 Stunden.
Es wurde eine durchschnittlichen Maturationsrate von 77,4 ± 10,3 % erreicht.
In der Tabelle 14 ist die prozentuale Wertigkeit der Vorkernbildung 20 Stunden nach ICSI in
ihren Mittelwerten ( x ) sowie die Standardabweichungen (± SD) aus den sechs
Durchgängen
aufgeführt.
Dabei
wurden
pro
Versuchsdurchgang
alle
sechs
Versuchsgruppen (spermieninjizierte Oozyten mit CaCl2, spermieninjizierte Oozyten ohne
CaCl2, kontrollinjizierte Oozyten mit CaCl2, kontrollinjizierte Oozyten ohne CaCl2,
kontrollinjizierte Oozyten mit NaCl, nicht injizierte Oozyten) parallel untersucht. Signifikante
Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchs- und Kontrollgruppen bezüglich der
einzelnen Untersuchungsparameter sind dargestellt. Aus der Anzahl der Vorkerne (VK) und
der Zellteilungen wurden Rückschlüsse auf Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw.
Parthenogeneseraten gezogen (siehe 3.8.1), die in Abbildung 11 und 12 einschließlich der
signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchs- und Kontrollgruppen gezeigt werden.
Daraus wird ersichtlich, dass mittels CaCl2-Injektion sowohl die Aktivierungs- als auch die
Befruchtungsrate der spermieninjizierten Oozyten signifikant gesteigert werden konnte
(p < 0,001). Die aktivierten, spermieninjizierten Oozyten wiesen auch gegenüber allen
kontroll- und nicht injizierten Oozytengruppen eine deutlich höhere Aktivierungsrate auf
(p < 0,001). Zudem zeigten sie ebenfalls eine höhere Befruchtungsrate gegenüber den
Parthenogeneseraten der kontroll- und nicht injizierten Oozyten (p < 0,001). Entsprechend
verhielten sich die nicht aktivierten, spermieninjizierten Oozyten.
Auch bei den aktivierten, kontrollinjizierten Oozyten erfolgte ein Anstieg der Aktivierungsrate
gegenüber den nicht aktivierten, kontrollinjizierten Oozyten (p < 0,05), jedoch nicht der
Parthenogeneserate. Die Aktivierungs- und Parthenogeneseraten der nicht aktivierten,
kontrollinjizierten, der mit NaCl injizierten und der nicht injizierten Oozyten unterschieden
sich in keinem Parameter voneinander.
72
Ergebnisse
Anhand der Ergebnisse ließ sich für die spermieninjizierten, aktivierten Oozyten eine
hypothetische effektive Befruchtungsrate von 41,9 % errechnen, während die effektive
Befruchtungsrate der nicht aktivierten, spermieninjizierten Oozyten nur 30,4 % ergab.
Tabelle 14:
Entwicklungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht injizierter, in vitro
gereifter Oozyten mit bzw. ohne CaCl2-Aktivierung 20 Stunden nach ICSI;
x ± SD aus sechs Versuchsdurchgängen
Entwicklungsraten (%)
Versuchsgruppe
1 VK
x ± SD
2 VK
x ± SD
≥ 3 VK
x ± SD
Geteilt
x ± SD
M II
x ± SD
n.a.
x ± SD
Sonst.1
x ± SD
spermieninjiziert
mit CaCl2
n = 140
14,2ag
± 5,4
34,2a
± 6,1
5,0
± 4,3
15,5a
± 7,8
16,5ag
± 9,9
13,0
± 6,9
1,5
± 2,3
spermieninjiziert
ohne CaCl2
n = 135
10,4k
± 4,6
31,0c
± 4,3
2,3
± 2,5
2,2
± 3,8
33,3hic
± 7,4
19, 5
± 6,5
1,4
± 2,2
kontrollinjiziert
mit CaCl2
n = 113
18,4ci
± 3,5
2,6b
± 4,2
0,0
5,4
± 6,6
53,0bejk
± 6,7
19,8
± 5,5
0,9
± 2,2
kontrollinjiziert
ohne CaCl2
n = 107
8,1j
± 9,6
2,8b
± 5,1
0,0
0,0b
74,5bdl
± 16,9
14,6
± 11,4
0,0
kontrollinjiziert
mit NaCl
n = 91
5,12dh
± 4,4
2,3b
± 3,7
0,0
2,1
± 3,3
73,6bdf
± 12,2
17,4
± 8,7
0,0
nicht injiziert
n = 90
1,0bdl
± 2,4
0,0bd
0,0
0,0b
87,3bdf
± 8,4
11,7
± 6,0
0,0
(n = untersuchte
Oozyten)
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b; c : d; e : f p < 0,001 bzw. g : h; i : j; k : l p < 0,05
1
umfasst Ana- und Telophase II
73
Ergebnisse
80
a : b; c : d; e : f
a
Aktivierungsrate (%)
70
g:h
60
p < 0,001
p< 0,05
bc
50
40
bdeg
30
20
bdh
bdf
10
0
bdf
spermieninj.
mit CaCl2
spermieninj.
ohne CaCl2
kontrollinj. mit
CaCl2
kontrollinj.
ohne CaCl2
kontrollinj. mit
NaCl
nicht injiziert
Abbildung 11: Durchschnittliche Aktivierungsraten∗ (%) spermien-, kontroll- und nicht
injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne CaCl2-Aktivierung
Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate (%)
20 Stunden nach ICSI; x aus 6 Versuchen
80
a : b; c : d
70
60
e:f
p < 0,001
p < 0,05
a
50
40
bc
30
20
bde
bd
bd
10
0
bdf
spermieninj.
mit CaCl2
spermieninj. kontrollinj. mit kontrollinj. kontrollinj. mit nicht injiziert
ohne CaCl2
CaCl2
ohne CaCl2
NaCl
Abbildung 12: Durchschnittliche Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten∗ (%) spermien-,
kontroll- und nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne CaCl2Aktivierung 20 Stunden nach ICSI; x aus 6 Versuchen
∗
Die Werte sind mit Standardabweichung in Kapitel 4.1.4 aufgeführt.
74
4.1.2
Ergebnisse
Aktivierung durch Ca2+-Ionophor
In diesem Versuchsabschnitt wurde die Wirkung einer Aktivierung mit Ca2+-Ionophor auf die
Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten spermien- und kontroll- bzw.
nicht injizierter Oozyten 20 Stunden nach ICSI untersucht.
Für die Versuche zur Aktivierung mit Ca2+-Ionophor standen an sechs Versuchstagen
insgesamt
748
in
vitro
gereifte
Oozyten
zur
Verfügung.
Die
durchschnittliche
Maturationsdauer betrug 46,2 ± 1,0 Stunden bei einer durchschnittlichen Maturationsrate von
76,1 ± 11,2 %.
Folgende Versuchsgruppen wurden pro Durchgang parallel untersucht: spermieninjizierte
Oozyten mit Ca2+-Ionophor-Aktivierung, spermieninjizierte Oozyten ohne Ca2+-IonophorAktivierung,
kontrollinjizierte
Oozyten
mit
Ca2+-Ionophor-Aktivierung,
kontrollinjizierte
Oozyten ohne Ca2+-Ionophor-Aktivierung, nicht injizierte Oozyten mit Ca2+-IonophorAktivierung, nicht injizierte Oozyten ohne Ca2+-Ionophor-Aktivierung.
In Tabelle 15 sind die Ergebnisse der Vorkernbildung 20 Stunden nach ICSI aus sechs
Versuchsdurchgängen
Befruchtungs-
bzw.
aufgeführt.
Die
sich
daraus
ergebenden
Aktivierungs-
und
Parthenogeneseraten sind mit den vorhandenen signifikanten
Unterschieden in den Abbildungen 13 und 14 zu finden.
Die Aktivierung der spermieninjizierten Oozyten mit Ca2+-Ionophor führte weder zu einer
Verbesserung der Aktivierungs- noch der Befruchtungsrate, obwohl eine signifikante
Steigerung der Aktivierungsrate durch Ca2+-Ionophor sowohl bei den kontrollinjizierten als
auch bei den nicht injizierten Oozyten erreicht werden konnte (p < 0,05 bzw. p < 0,001). Die
Befruchtungsrate fiel bei den spermieninjizierten und mit Ca2+-Ionophor behandelten
Oozyten gegenüber den nicht aktivierten, spermieninjizierten sogar deutlich ab (p < 0,05).
Die Aktivierungs- und auch Befruchtungsraten beider spermieninjizierter Gruppen waren
jedoch immer deutlich höher als die Aktivierungs- und Parthenogeneseraten der vier
Kontrollgruppen (p < 0,05 bzw. p < 0,001).
In den Gruppen der aktivierten, spermieninjizierten und kontrollinjizierten Oozyten waren
signifikant mehr Oozyten 20 Stunden nach ICSI nicht analysierbar als bei den unbehandelten
und nicht injizierten bzw. bei den unbehandelten, kontroll- und nicht injizierten Oozyten
(p < 0,05). Die Degenerationsrate in diesen Gruppen war somit höher.
Die anhand der Ergebnisse errechnete effektive Befruchtungsrate für die mit Ca2+-Ionophor
behandelten, spermieninjizierten Oozyten betrug 21,5 % gegenüber den nicht behandelten,
spermieninjizierten Oozyten mit 35,9 %.
75
Ergebnisse
Tabelle 15:
Entwicklungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht injizierter, in vitro
gereifter Oozyten 20 Stunden nach ICSI mit bzw. ohne Aktivierung mit Ca2+Ionophor; x ± SD aus sechs Versuchsdurchgängen
Entwicklungsraten (%)
Versuchsgruppe
(n = untersuchte
Oozyten)
1 VK
x ± SD
2 VK
x ± SD
≥ 3 VK
x ± SD
Geteilt
x ± SD
M II
x ± SD
n.a.
x ± SD
Sonst.1
x ± SD
spermieninjiziert
+ Ca2+-Ionophor
n = 149
18,1e
± 12,2
23,8c
± 4,0
0,0
0,1
± 1,7
38,4a
± 16,8
18,6g
± 9,2
0,6
± 1,6
spermieninjiziert
− Ca2+-Ionophor
n = 149
6,6
± 3,7
33,6a
± 6,6
0,8
± 2,0
3,8
± 4,2
42,9a
± 6,9
11,7
± 5,3
0,6
± 1,4
kontrollinjiziert
+ Ca2+-Ionophor
n = 134
21,1e
± 11,1
2,2
± 2,5
0,0
0,8
± 1,8
52,3ce
± 16,3
23,0e
± 11,8
0,7
± 1,6
kontrollinjiziert
− Ca2+-Ionophor
n = 133
6,7
± 3,4
0,9b
± 2,2
0,8
± 2,0
0,0
83,2bd
± 6,4
7,1f
± 5,4
1,4
± 3,4
nicht injiziert
+ Ca2+-Ionophor
n = 89
10,1
± 4,8
0,0bd
0,0
0,0
72,2bfg
± 6,9
15,8
± 4,0
1,9
± 4,5
nicht injiziert
− Ca2+-Ionophor
n = 94
0,0f
0,0bd
0,0
0,0
94,6bdh
± 4,6
5,5fh
± 4,7
0,0
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b; c : d p < 0,001 bzw. e : f; g : h p < 0,05
1
umfasst Ana- und Telophase II
76
Ergebnisse
60
Aktivierungsrate (%)
50
a : b; c : d; e : f
ag
ag
40
g : h; i : j
p < 0,001
p < 0,05
chi
30
20
bej
bej
10
bdf
0
spermieninj.
mit Ionoph.
spermieninj.
ohne Ionoph.
kontrollinj. mit
Ionoph.
kontrollinj.
ohne Ionoph.
nicht inj. mit
Ionoph.
nicht inj. ohne
Ionph.
Abbildung 13: Durchschnittliche Aktivierungsraten∗ (%) spermien-, kontroll- und nicht
injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne Ca2+-Ionophor-Aktivierung
Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate (%)
(Ionoph.) 20 Stunden nach ICSI; x aus 6 Versuchen
60
50
ag
a : b; c : d
p < 0,001
e : f; g : h
p < 0,05
40
30
ch
20
10
bde
bd
bdf
bdf
0
spermieninj. spermieninj.
mit Ionoph. ohne Ionoph.
kontrollinj.
mit Ionoph.
kontrollinj.
nicht inj. mit nicht inj. ohne
ohne Ionoph.
Ionoph.
Ionph.
Abbildung 14: Durchschnittliche Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten∗ (%) spermien-,
kontroll- und nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne Ca2+Ionophor-Aktivierung (Ionoph.) 20 Stunden nach ICSI; x aus 6 Versuchen
∗
Die Werte sind mit Standardabweichung in Kapitel 4.1.4 aufgeführt.
77
Ergebnisse
4.1.3
Aktivierung durch elektrischen Puls
Für die Versuche zur Aktivierung durch einen einzelnen elektrischen Puls standen an sechs
Versuchstagen insgesamt 756 in vitro gereifte Oozyten zur Verfügung. Die durchschnittliche
Maturationsdauer
betrug
46,5 ± 0,9 Stunden.
Dabei
wurde
eine
durchschnittlichen
Maturationsrate von 72,8 ± 4,7 % erreicht.
In Tabelle 16 sind die Ergebnisse der Vorkernbildung 20 Stunden nach ICSI aus sechs
Versuchsdurchgängen aufgeführt. Folgende sechs Gruppen wurden pro Versuchstag parallel
untersucht: spermieninjizierte Oozyten mit elektrischer Aktivierung, spermieninjizierte
Oozyten ohne elektrische Aktivierung, kontrollinjizierte Oozyten mit elektrischer Aktivierung,
kontrollinjizierte Oozyten ohne elektrische Aktivierung, nicht injizierte Oozyten mit
elektrischer Aktivierung, nicht injizierte Oozyten ohne elektrische Aktivierung. In den
Abbildungen 15 und 16 sind die sich daraus ergebenden Aktivierungs-, Befruchtungs- und
Parthenogeneseraten dargestellt. Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen
Versuchs- und Kontrollgruppen bezüglich der einzelnen Untersuchungsparameter sind
gekennzeichnet.
Mit Hilfe des elektrischen Pulses konnte sowohl die Aktivierungsrate (p < 0,001) als auch die
Befruchtungsrate (p < 0,05) der spermieninjizierten Oozyten signifikant gesteigert werden.
Auch gegenüber den nicht aktivierten (p < 0,001) und den aktivierten (p < 0,05), kontroll- und
nicht injizierten Oozyten bestand für die aktivierten, spermieninjizierten Oozyten bezüglich
der Aktivierungsrate ein signifikanter Unterschied. Jedoch konnte kein Unterschied zwischen
der
Befruchtungsrate der
aktivierten,
spermieninjizierten Versuchsgruppe und der
Parthenogeneserate der aktivierten, kontrollinjizierten Gruppe festgestellt werden.
Sowohl die kontroll- als auch die nicht injizierten, aktivierten Oozyten zeigten gegenüber ihrer
jeweiligen nicht aktivierten Kontrollgruppe einen starken, signifikanten Anstieg der
Aktivierungs- und Parthenogeneseraten (p < 0,001).
Die Aktivierungs- und Befruchtungsraten der nicht aktivierten, spermieninjizierten Oozyten
unterschieden sich nicht von den Aktivierungs- und Parthenogeneseraten der aktivierten,
kontroll- und nicht injizierten Oozytengruppen.
Die kontrollinjizierten und elektrisch aktivierten Oozyten zeigten einen höheren Anteil an
nicht zu analysierenden Zellen und somit eine höhere Degenerationsrate als die nicht
aktivierten, spermien- und nicht injizierten Oozytengruppen (p < 0,05), und auch die
elektrisch aktivierten und nicht injizierten Oozyten erwiesen sich in diesem Parameter
gegenüber den nicht aktivierten, nicht injizierten Oozyten als signifikant (p < 0,05).
78
Ergebnisse
Für
die
elektrisch
aktivierten,
spermieninjizierten
Oozyten
konnte
eine
effektive
Befruchtungsrate von 9,3 % errechnet werden, während bei den nicht aktivierten,
spermieninjizierten Oozyten ein Wert von 31,6 % ermittelt werden konnte.
Tabelle 16:
Entwicklungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht injizierter, in vitro
gereifter Oozyten 20 Stunden nach ICSI mit bzw. ohne elektrische Aktivierung
(el. Akt.); x ± SD aus sechs Versuchsdurchgängen
Entwicklungsraten (%)
Versuchsgruppe
1 VK
x ± SD
2 VK
x ± SD
≥ 3 VK
x ± SD
Geteilt
x ± SD
M II
x ± SD
n.a.
x ± SD
Sonst.1
x ± SD
14,8c
± 6,1
21,9c
± 8,8
2,6
± 3,01
26,7a
± 12,7
14,4a
± 16,8
16,5
± 5,3
2,2
± 3,63
spermieninjiziert
ohne el. Akt.
n = 153
10,0
± 5,5
28,5a
± 6,76
0,7
± 1,8
3,8
± 3,3
45,2
± 13,5
11,2h
± 6,9
0,6
± 1,35
kontrollinjiziert
mit el. Akt.
n = 134
9,7
± 4,61
12,0
± 3,5
0,0
27,2a
± 7,2
30,9c
± 6,5
19,8eg
± 4,46
1,5
± 2,3
kontrollinjiziert
ohne el. Akt.
n = 135
4,9b
± 3,0
0,7bd
± 1,6
0,0
0,0b
80,3b
± 5,4
14,1
± 4,5
0,0
nicht injiziert
mit el. Akt.
n = 92
19,5a
± 6,5
6,6b
± 3,9
1,5
± 3,7
24,3a
± 8,8
30,4c
± 10,4
17,7e
± 8,6
0,0
nicht injiziert
ohne el. Akt.
n = 96
0,0bd
0,0bd
0,0
0,0b
90,7bd
± 2,5
9,3f
± 2,5
0,0
(n = untersuchte
Oozyten)
spermieninjiziert
mit el. Akt.
n = 146
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b; c : d p < 0,001 bzw. e : f; g : h p < 0,05
1
umfasst Ana- und Telophase II
79
Ergebnisse
80
a : b; c : d; e : f
ag
Aktivierungsrate (%)
70
g : h; i : j
60
p < 0,001
p < 0,05
eh
eh
bc
50
40
30
20
bdfi
10
bdfj
0
spermieninj.
mit el. Akt.
spermieninj. kontrollinj. mit kontrollinj.
ohne el. Akt.
el. Akt.
ohne el. Akt.
nicht inj. mit nicht inj. ohne
el. Akt.
el. Akt.
Abbildung 15: Durchschnittliche Aktivierungsraten∗ (%) spermien-, kontroll- und nicht
injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne elektrische Aktivierung (el.
Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate (%)
Akt.) 20 Stunden nach ICSI; x aus 6 Versuchen
60
a : b; c : d
ae
50
e:f
c
40
cf
p < 0,001
p < 0,05
cf
30
20
10
bd
bd
0
spermieninj. spermieninj. kontrollinj. kontrollinj. nicht inj. mit nicht inj.
mit el. Akt. ohne el. Akt. mit el. Akt. ohne el. Akt.
el. Akt.
ohne el. Akt.
Abbildung 16: Durchschnittliche Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten∗ (%) spermien-,
kontroll- und nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne elektrische
Aktivierung (el. Akt.) 20 Stunden nach ICSI; x aus 6 Versuchen
∗
Die Werte sind mit Standardabweichung in Kapitel 4.1.4 aufgeführt.
80
Ergebnisse
4.1.4
Vergleich der Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten nach Aktivierung durch CaCl2, Ca2+-Ionophor oder elektrischen
Puls
In Tabelle 17 sind die Aktivierungsraten der spermieninjizierten, aktivierten und nicht
aktivierten Gruppen aus den verschiedenen Aktivierungsversuchen vergleichend dargestellt.
Zwischen der mit CaCl2 aktivierten und der mit elektrischem Puls aktivierten Gruppe bestand
dabei kein signifikanter Unterschied, während beide Gruppen gegenüber den mit Ca2+Ionophor behandelten Oozyten eine signifikant höhere Aktivierungsrate zeigten (p < 0,001).
Tabelle 17:
Aktivierungsraten (%) der spermieninjizierten und aktivierten bzw. nicht
aktivierten Oozyten; x ± SD aus je sechs Versuchsdurchgängen
Aktivierungsraten (%)
CaCl2
Ca2+-Ionophor
Elektrischer Puls
spermieninjiziert
mit Aktivierung
70,4a ± 7,9
42,5b ± 11,2
65,6a ± 11,2
spermieninjiziert
ohne Aktivierung
45,9b ± 5,2
44,8 ± 8,9
43,1b ± 8,8
x ± SD
x ± SD
x ± SD
Werte mit unterschiedliche Indizes in einer Zeile oder in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001
In den Tabellen 18 und 19 sind die Aktivierungsraten der mit unterschiedlichen Methoden
behandelten, kontroll- und nicht injizierten Oozyten-Gruppen mit ihren signifikanten
Unterschieden zueinander aufgeführt. Die mit elektrischem Puls aktivierten, kontrollinjizierten
Oozyten zeigten eine deutlich höhere Aktivierungsrate gegenüber den mit CaCl2 und mit
Ca2+-Ionophor aktivierten Oozyten und gegenüber ihrer nicht aktivierten Kontrollgruppe
(p < 0,001). Entsprechend verhielt es sich bei den nicht injizierten Versuchsgruppen.
81
Ergebnisse
Tabelle 18:
Aktivierungsraten (%) der kontrollinjizierten, aktivierten und nicht aktivierten
Oozyten; x ± SD aus je sechs Versuchsdurchgängen
Aktivierungsraten (%)
CaCl2
Ca2+-Ionophor
Elektrischer Puls
kontrollinjiziert
mit Aktivierung
26,3bc ± 6,4
24,1bc ± 10,9
48,5a ± 6,4
kontrollinjiziert
ohne Aktivierung
11,2d ± 10,7
8,4d ± 3,4
5,6b ± 4,1
x ± SD
x ± SD
x ± SD
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte oder einer Zeile unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001 bzw. c : d p < 0,05
Tabelle 19:
Aktivierungsraten (%) der nicht injizierten, aktivierten und nicht aktivierten
Oozyten; x ± SD aus je sechs Versuchsdurchgängen
Aktivierungsraten (%)
CaCl2
Ca2+-Ionophor
Elektrischer Puls
nicht injiziert
mit Aktivierung
---
10,1bc ± 4,8
50,7a ± 9,2
nicht injiziert
ohne Aktivierung
1,0 ± 2,4
0,0d
0,0b
x ± SD
x ± SD
x ± SD
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte oder einer Zeile unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001 bzw. c : d p < 0,05
In den Tabelle 20, 21 und 22 sind die durchschnittlichen Befruchtungs- bzw.
Parthenogeneseraten der spermien-, kontroll und nicht injizierten Versuchsgruppen
dargestellt. Auch hier zeigten sich bei den spermieninjizierten Oozyten die mit CaCl2 und
elektrischem Puls aktivierten Gruppen der Ca2+-Ionophor-Gruppe deutlich überlegen
(p < 0,001), während bei den kontroll- und nicht injizierten Oozyten nur die elektrisch
aktivierten
Gruppen
eine
deutlich
Kontrollgruppen aufwiesen (p < 0,001).
höhere
Parthenogeneserate
als
die
anderen
82
Ergebnisse
Tabelle 20:
Befruchtungsraten (%) der spermieninjizierten, aktivierten und nicht aktivierten
Oozyten; x ± SD aus je sechs Versuchsdurchgängen
Befruchtungsraten (%)
CaCl2
x ± SD
Ca2+-Ionophor
x ± SD
Elektrischer Puls
x ± SD
spermieninjiziert
mit Aktivierung
49,9a ± 6,5
24,5bc ± 4,6
48,2ac ± 12,1
spermieninjiziert
ohne Aktivierung
33,2b ± 1,4
36,8d ± 7,0
32,3d ± 6,2
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte oder einer Zeile unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001 bzw. c : d p < 0,05
Tabelle 21:
Parthenogeneseraten (%)
der
kontrollinjizierten,
aktivierten und nicht
aktivierten Oozyten; x ± SD aus je sechs Versuchsdurchgängen
Parthenogeneseraten (%)
CaCl2
x ± SD
Ca2+-Ionophor
x ± SD
Elektrischer Puls
x ± SD
kontrollinjiziert
mit Aktivierung
8,0b ± 7,7
3,0b ± 2,3
38,9a ± 8,9
kontrollinjiziert
ohne Aktivierung
2,8 ± 5,1
0,9 ± 2,2
0,7b ± 1,6
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte oder einer Zeile unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001
Tabelle 22:
Parthenogeneseraten (%) der nicht injizierten, aktivierten und nicht aktivierten
Oozyten; x ± SD aus je sechs Versuchsdurchgängen
Parthenogeneseraten (%)
CaCl2
Ca2+-Ionophor
Elektrischer Puls
nicht injiziert
mit Aktivierung
---
0,0b
30,9a ± 11,9
nicht injiziert
ohne Aktivierung
0,0
0,0
0,0b
x ± SD
x ± SD
x ± SD
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte oder einer Zeile unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001
83
Ergebnisse
4.2
Einsatz von flüssigkonservierten, ungesexten und gesexten
Spermien zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit und
ohne CaCl2-Aktivierung
Die beschriebenen Ergebnisse aus Kapitel 4.1 führten bei allen folgenden Versuchen zu
einer Anwendung der Oozytenaktivierung mittels CaCl2-Injektion.
In diesem Versuchsabschnitt wurden die Unterschiede zwischen ungesexten und gesexten
Spermien bei der Einzelspermieninjektion in in vitro gereifte Oozyten und die Auswirkungen
einer zusätzlichen Aktivierung mit CaCl2-Injektion untersucht. Kontroll- und nicht injizierte
Oozyte wurden zur Kontrolle der Parthenogeneseraten in die Versuche mit einbezogen.
Daraus ergaben sich sieben parallel untersuchte Versuchsgruppen: mit gesexten Spermien
injizierte Oozyten mit CaCl2-Aktivierung, mit gesexten Spermien injizierte Oozyten ohne
CaCl2-Aktivierung, mit ungesexten Spermien injizierte Oozyten mit CaCl2-Aktivierung, mit
ungesexten Spermien injizierte Oozyten ohne CaCl2-Aktivierung, kontrollinjizierte Oozyten
mit CaCl2-Aktivierung, kontrollinjizierte Oozyten ohne CaCl2-Aktivierung und nicht injizierte
Oozyten.
Wesentliche
Beurteilungskriterien
waren
dabei
die
Teilungs-
und
Befruchtungsraten 48 Stunden nach ICSI und die Entwicklungskompetenz von in vitro
gereiften und mittels ICSI befruchteter Oozyten zu Blastozysten nach 7-tägiger In-vitroKultur.
Für diese Versuche wurden in acht Versuchsdurchgängen insgesamt 1016 Oozyten
ausgewertet. Die Maturationsdauer betrug im Schnitt 46,7 ± 0,6 Stunden bei einer
durchschnittlichen Maturationsrate von 72,1 ± 7,0 %.
4.2.1
Entwicklungsraten 48 Stunden nach ICSI
4.2.1.1
Teilungsrate
In Tabelle 23 werden die 48 Stunden nach ICSI erreichten, durchschnittlichen Teilungsraten
der sieben Versuchs- und Kontrollgruppen dargestellt.
Zwischen den vier spermieninjizierten Gruppen bestanden keine Unterschiede bezüglich der
Teilungsrate. Jedoch zeigten nur die mit unsortierten Spermien injizierten, nicht aktivierten
und die beiden mit CaCl2 aktivierten, spermieninjizierten Versuchsgruppen eine höhere
Teilungsrate gegenüber den parthenogenetischen Teilungsraten aller drei Kontrollgruppen
(p < 0,001 bzw. p < 0,05). Die mit sortierten Spermien injizierten und nicht aktivierten
Oozyten wiesen nur gegenüber den beiden nicht aktivierten Kontrollgruppen (kontrollinjiziert
ohne CaCl2 und nicht injiziert) eine höhere Teilungsrate auf (p < 0,05). Die aktivierte,
84
Ergebnisse
kontrollinjizierte Versuchsgruppe zeigte eine erhöhte parthenogenetische Teilungsrate
gegenüber den beiden nicht aktivierten Kontrollgruppen (p < 0,05).
Tabelle 23:
Teilungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und nicht
injizierter Oozyten mit und ohne CaCl2-Aktivierung 48 Stunden nach ICSI;
x ± SD aus acht Versuchsdurchgängen
untersuchte
Oozyten
(n)
x
± SD
sortierte Spermien mit CaCl2
157
48,9a
± 8,5
sortierte Spermien ohne CaCl2
162
43,8e
± 17
unsortierte Spermien mit CaCl2
157
50,9a
± 15,3
unsortierte Spermien ohne CaCl2
155
43,6cg
± 11,7
kontrollinjiziert mit CaCl2
129
29,8bhi
± 9,1
kontrollinjiziert ohne CaCl2
130
18,2bdfj
± 11,3
nicht injiziert
126
17,3bdfj
± 10,1
Versuchsgruppe
Teilungsrate (%)
Werte mit unterschiedlichen Indizes unterscheiden sich signifikant:
a : b; c : d p < 0,001 bzw. e : f; g: h; i : j p < 0,05
Tabelle 24 zeigt die Entwicklungstadien der injizierten Oozyten nach 48stündiger In-vitroKultur mit Differenzierung der geteilten Stadien. Signifikante Unterschiede zwischen den
verschiedenen Versuchs- und Kontrollgruppen sind markiert.
85
Ergebnisse
Tabelle 24:
Entwicklungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und nicht
injizierter Oozyten mit und ohne CaCl2-Aktivierung 48 Stunden nach ICSI;
x ± SD aus acht Versuchsgurchgängen
Entwicklungsraten (%)
2-ZellStadium
x ± SD
4-ZellStadium
x ± SD
> 4-ZellStadium
x ± SD
ungeteilt
x ± SD
sortierte Spermien
+ CaCl2
n = 157
29,23c
± 10,73
15,25
± 9,07
4,41
± 5,64
51,12a,c
± 8,46
sortierte Spermien
− CaCl2
n = 162
22,13
± 13,68
14,27
± 10,28
6,19
± 6,54
56,224e
± 16,97
unsortierte Spermien
+ CaCl2
n = 157
25,43e
± 12,55
18,78c
± 9,42
6,66
± 7,24
49,13a,c
± 15,32
unsortierte Spermien
− CaCl2
n = 155
23,85g
± 11,37
15,58
± 7,37
4,189
± 6,37
56,39e
± 11,75
kontrollinjiziert
+ CaCl2
n = 129
11,35d
± 3,84
10,38
± 7,34
8,11
± 9,02
70,17d
± 9,12
kontrollinjiziert
− CaCl2
n = 130
6,44d,f,h
± 9,05
2,08d
± 5,89
9,63
± 6,91
81,85b,f
± 11,3
nicht injiziert
n = 126
8,45d,f
± 6,79
2,22d
± 4,28
6,58
± 7,67
82,75b,f
± 10,09
Versuchsgruppen
(n = untersuchte Oozyten)
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,001 bzw. c : d; e : f; g : h p < 0,05
4.2.1.2
Befruchtungs- bzw. Parthenogeneserate
Alle Oozyten, die nach 48 Stunden In-vitro-Kultur ungeteilt geblieben sind, wurden zur
Untersuchung der Vorkernbildung zytogenetisch gefärbt, um somit weitere Rückschlüsse auf
Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten ziehen zu können (siehe Kapitel 3.8.1). In
Tabelle 25 ist die Entwicklung der Oozyten nach 48stündiger In-vitro-Kultur mit
Differenzierung der ungeteilten Stadien dargestellt.
86
Ergebnisse
Tabelle 25:
Entwicklungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und nicht
injizierter Oozyten mit und ohne CaCl2-Aktivierung 48 Stunden nach ICSI mit
Differenzierung
der
ungeteilten
Stadien;
x ± SD
aus
acht
Versuchsgurchgängen
Entwicklungsraten (%)
2 VK
M II
n. a.
(n = Oozyten)
Sonstiges1
x ± SD
x ± SD
x ± SD
x ± SD
geteilt
x ± SD
sortierte Spermien
+ CaCl2
n = 157
2,9
± 4,4
12,0
± 8,9
16,0a,e
± 8,5
20,3
± 6,9
48,9a
± 8,5
sortierte Spermien
− CaCl2
n = 162
0,5
± 1,5
27,0e
± 11,13
13,1a,e
± 9,3
15,6
± 7,61
43,8e
± 16,97
unsortierte Spermien
+ CaCl2
n = 157
3,6
± 5,0
21,6g
± 15,9
12,3a,e
± 9,7
11,6e
± 8,2
50,8a
± 15,3
unsortierte Spermien
− CaCl2
n = 155
4,5
± 5,6
19,6g
± 12,26
16,2a,e
±10,1
16,2
± 5,6
43,6cg
± 11,8
kontrollinjiziert
+ CaCl2
n = 129
9,8
± 8,1
2,6f
± 3,7
34,91f,g
± 9,8
22,8f
± 7,0
29,8bhi
± 9,1
kontrollinjiziert
− CaCl2
n = 130
10,7
±8,1
0,0f,h
49,6b
± 12,18
21,6
± 4,2
18,2bdfj
± 11,3
nicht injiziert
n = 126
12,2
± 12,5
0,7f,h
± 2,1
57,0b,h
± 9,5
12,8
± 8,6
17,3bdfj
± 10,1
Versuchsgruppen
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b; c : d p < 0,001 bzw. e : f; g : h; i : j p < 0,05
Nach 48 Stunden wurden alle Zellstadien als befruchtet bzw. parthenogenetisch entwickelt
angesehen, die entweder geteilt waren oder zwei Vorkerne enthielten. Daraus ergaben sich
für die jeweiligen Versuchsgruppen die in Tabelle 26 aufgeführten Befruchtungs- bzw.
Parthenogeneseraten.
1
umfasst Ana- und Telophase II und Zellstadien mit 1 und ≥ 3 Vorkernen
87
Ergebnisse
Tabelle 26:
Befruchtungs-
und
Parthenogeneseraten
(%)
spermien-
(sortiert
und
unsortiert), kontroll- und nicht injizierter Oozyten mit oder ohne CaCl2Aktivierung 48 Stunden nach ICSI; x ± SD aus acht Versuchsdurchgängen
untersuchte
Oozyten
(n)
Versuchsgruppe
Befruchtungs- bzw.
Parthenogeneserate (%)
x
± SD
sortierte Spermien mit CaCl2
157
60,9a
± 7,8
sortierte Spermien ohne CaCl2
162
70,8a
± 12,2
unsortierte Spermien mit CaCl2
157
72,5a
± 12,8
unsortierte Spermien ohne CaCl2
155
63,2a
±8
kontrollinjiziert mit CaCl2
129
32,4b
± 9,8
kontrollinjiziert ohne CaCl2
130
18,2b
± 11,3
nicht injiziert
126
18b
± 9,8
Werte mit unterschiedliche Indizes unterscheiden sich signifikant: a : b
Bezüglich
der
Befruchtungsrate
bestanden
zwischen
den
p < 0,001
vier
spermieninjizierten
Versuchsgruppen nach 48 Stunden keine signifikanten Unterschiede. Alle vier Gruppen
hatten eine signifikant höhere (p < 0,001) Befruchtungsrate als die entsprechende
Parthenogeneserate der drei Kontrollgruppen, zwischen denen keine Unterschiede
bestehen.
4.2.2
Nach
Entwicklungsraten 168 Stunden nach ICSI
der
ersten
48-stündigen
In-vitro-Kultur
wurden
die
geteilten
Stadien
aller
Versuchsgruppen einer weiteren Kulturphase von 120 Stunden unterzogen. Nach insgesamt
168 Stunden wurden die Embryonen dann morphologisch und mittels Kernfärbung auf ihr
Entwicklungsstadium untersucht und beurteilt. Die Endstadien wurden festgelegten Gruppen
(Zwei- bis Vier-Zellstadien, Fünf-Zellstadien bis Morula, Blastozysten) zugeteilt. Embryonen
mit mehrdeutigen Befunden (z. B. aufgrund von Fragmentation) oder degenerierte
Embryonen wurden der Gruppe „nicht analysierbar“ zugeordnet. Die Ergebnisse werden in
Tabelle 27 dargestellt.
88
Ergebnisse
Signifikante Unterschiede waren nur zwischen Embryonen, die „nicht analysierbar“ eingestuft
wurden, vorzufinden, wobei in den nicht aktivierten Gruppen der kontroll- und nicht injizierten
Oozyten eine signifikant höhere (p < 0,05) Degenerationsrate zu finden war als in den beiden
mit sortierten Spermien injizierten Gruppen und in der mit unsortierten Spermien injizierten
sowie aktivierten Versuchsgruppe.
Tabelle 27:
Entwicklungsraten der geteilten Stadien (%) spermien- (sortiert und
unsortiert), kontroll- und nicht injizierter Oozyten mit und ohne CaCl2Aktivierung 168 Stunden nach ICSI; x ± SD aus acht Versuchstagen
Entwicklungsraten (%)
2- bis 4-ZellStadium
x ± SD
5-Zell-Stadium
bis Morula
x ± SD
sortierte Spermien
+ CaCl2
nget = 77
39,6
± 15,5
12,1
± 14,7
0,0
48,4a
± 17,5
sortierte Spermien
− CaCl2
nget = 71
36,5
± 16,4
11,2
± 13,4
3,8
± 5,3
48,5a
± 24,7
unsortierte Spermien
+ CaCl2
nget = 80
35,7
± 9,4
7,3
± 8,7
10,1
± 11,5
48,5a
± 15,2
unsortierte Spermien
− CaCl2
nget = 68
34,2
± 20,76
7,5
± 8,5
0,0
58,3
± 21,6
kontrollinjiziert
+ CaCl2
nget = 38
29,4
± 17,4
7,7
± 10,9
0,0
62,9
± 16,6
kontrollinjiziert
− CaCl2
nget = 24
14,8
± 20,0
0,0
0,0
85,2b
± 20,0
nicht injiziert
nget = 20
13,1
± 16,6
0,0
0,0
86,9b
± 16,6
Versuchsgruppen
(nget = geteilte
Zellstadien)
Blastozysten
x ± SD
Werte mit unterschiedlichen Indizes in einer Spalte unterscheiden sich signifikant:
a : b p < 0,05
n. a.
x ± SD
Ergebnisse
89
Blastozysten entwickelten sich nur aus den Oozyten, die mit unsortierten Spermien injiziert
und mit CaCl2 aktiviert worden waren (9 von 80 geteilten Stadien; Abbildung 17), und aus
denen, in die sortierte Spermien injiziert und die nicht aktiviert worden waren (3 von 71
geteilten Stadien). Die Kernzahlen der Blastozysten lagen in der Gruppe der mit ungesexten
Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten Oozyten zwischen 7 und 19 Zellkernen (12 ±
3,8; siehe auch Abbildung 18). Für die Gruppe der mit gesexten Spermien injizierten und
nicht mit CaCl2 aktivierten Oozyten schwankten die Kernzahlen von 8 bis 15 Zellkernen
(11 ± 3,6; siehe auch Abbildung 19).
Abbildung 17: Blastozysten aus in vitro gereiften, mit ungesexten Spermien injizierten und
mit CaCl2 aktivierten Oozyten (168 Stunden nach ICSI)
90
Ergebnisse
Abbildung 18: Blastozyste mit 19 Zellkernen aus einer mit einem ungesexten Spermium und
mit CaCl2 injizierten Oozyte (168 Stunden nach ICSI); Quetschpräparat nach
Fluoreszenzfärbung mit Hoechst 33342
Abbildung 19: Blastozyste mit elf Zellkernen aus einer mit einem gesexten Spermium
injizierten, nicht aktivierten Oozyte (168 Stunden nach ICSI); Quetschpräparat
nach Fluoreszenzfärbung mit Hoechst 33342
91
Ergebnisse
4.3
Überprüfung der Entwicklungsfähigkeit
Oozyten durch Embryotransfer
spermieninjizierter
4.3.1
Transfer von Embryonen aus in vitro gereiften, mit ungesexten,
flüssigkonservierten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten
Oozyten
Zur Überprüfung der Entwicklungsfähigkeit in vitro gereifter Oozyten, die mit ungesexten,
flüssigkonservierten Spermien und gleichzeitiger CaCl2-Gabe injiziert worden waren, wurden
vier Embryotransfers (ET) auf synchronisierte, präpuberale Jungsauen durchgeführt.
Insgesamt wurden für die Transfers an vier Versuchstagen 511 Oozyten injiziert, die zuvor
mit einer durchschnittlichen Maturationsrate von 77,4 ± 3,7 % für 47,1 ± 1,1 Stunden gereift
worden waren. Es wurden nur geteilte Embryonen (Zwei- und Vier-Zellstadien) übertragen,
die sich morphologisch durch gut abgegrenzte und gleichmäßig runde Blastomeren mit
homogenem,
dunklem
Zytoplasma
auszeichneten.
Die
Einzeldaten
der
vier
Transferversuche sind in Tabelle 28 dargestellt. Keines der drei Empfängertiere der
Embryotransferversuche 1-3 wurde nach ICSI und ET tragend. Bei Tier 4 wurden am 22. Tag
nach ICSI drei Früchte im Uterus per Ultraschall eindeutig identifiziert (Abbildung 20).
Allerdings endete die Trächtigkeit eine Woche später.
Tabelle 28:
Daten zu den Embryotransferversuchen (ET) von Embryonen aus in vitro
gereiften und mit unsortierten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten
Oozyten
ET
Maturationsrate in
vitro gereifter
Oozyten (%)
Injizierte
Oozyten
(n)
Teilungsrate
(%)
Übertragene
Embryonen
(n)
1
80
120
39,17
47
2
80,92
139
30,22
42
3
73,2
142
33,80
48
4
75,34
110
50,91
56
x
77,4
127,8
38,5
48,3
92
Ergebnisse
Abbildung 20: Ultraschallbild der Trächtigkeit (Tag 22 nach ICSI) aus dem 4. Transfer von
Embryonen aus mit unsortierten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten,
in vitro gereiften Oozyten (Pfeil weist auf einen Embryo in einer Fruchtblase)
93
Ergebnisse
4.3.2
Transfer von Embryonen aus in vivo gereiften und mit gesexten,
y-chromosomalen Spermien und CaCl2 injizierten Oozyten
Für den Transfer von Embryonen aus ICSI mit gesexten, Y-chromosomalen Spermien und
CaCl2-Aktivierung wurden ausschließlich in vivo gereifte Oozyten verwendet. Dazu wurden
an vier Versuchstagen insgesamt 462 in vivo gereifte Oozyten aus 20 geschlachteten
Jungsauen gewonnen. Davon wurden 341 Oozyten für die Embryotransferversuche
erfolgreich
injiziert.
Die
Übertragung
der
Oozyten
erfolgte
direkt
nach
den
Spermieninjektionen auf jeweils ein entsprechend synchronisiertes Empfängertier. In Tabelle
29 sind die Einzeldaten der vier Embryotransferversuche dargestellt.
Tabelle 29:
Daten zu den Embryotransferversuchen (ET) von in vivo gereiften und mit
sortierten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten Oozyten
Alle
ET
Anzahl
geschlachteter
Spendertiere
(n)
Anzahl gewonnener
Oozyten pro
Spendertier
(x )
Gesamtzahl
gewonnener
Oozyten
(n)
Anzahl
befruchteter,
übertragener
Oozyten (n)
1
5
20,2
101
76
2
5
25,8
129
96
3
5
26,8
134
96
4
5
19,6
98
73
x
5
23,1
115,5
85,3
vier
Empfängertiere
wurden
tragend,
diagnostiziert
mittels
mehrmaligen
Ultraschalluntersuchungen zwischen dem 21. und 56. Tag nach ICSI (Trächtigkeitsrate:
100 %) Abbildung 21 zeigt ein Ultraschallbild der Trächtigkeit aus dem vierten
Embryotransfer.
Nach einer Trächtigkeitsdauer von 113-117 Tagen ferkelten alle vier Sauen ab. Tabelle 30
zeigt die entsprechenden Geburtsdaten.
94
Ergebnisse
Abbildung 21: Ultraschallbild der Trächtigkeit (Tag 24 nach ICSI) des 4. Transfer von
Embryonen aus mit Y-chromosomalen Spermien injizierten und mit CaCl2
aktivierten, in vivo gereiften Oozyten
Tabelle 30:
Geburtsdaten der Transferversuchen von Embryonen aus mit gesexten
Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten, in vivo gereiften Oozyten
Empfängertier
Trächtigkeitsdauer
(Tage)
Anzahl Ferkel
(n)
Geschlecht
der Ferkel
Geburtsgewichte
der Ferkel (kg)
1
115
3
alle ♂
1,4; 0,9; 0,7
2
113
6
alle ♂
2 x 0,9; 1,3;
2 x 1,5; 1,6
3
115
2
alle ♂
0,6; 0,9
4
117
2
alle ♂
1,2; 1,3
x
115
3,25
alle ♂
1,13
Ergebnisse
95
Das zweite Ferkel von Tier 3 wurde tot geboren. Alle anderen zwölf Ferkel waren nach der
Geburt morphologisch und gesundheitlich unauffällig und munter (Abbildung 22). Sowohl aus
dem ersten als auch aus dem zweiten Wurf verendete eines der Ferkel innerhalb von zwei
Tagen, nachdem sie von der Sau beim Niederlegen erdrückt worden sind.
Abbildung 22: Fünf „ICSI-Ferkel“ (ET 2), eine Woche nach der Geburt
96
5
Diskussion
DISKUSSION
In den letzten Jahrzehnten hat die Bedeutung biotechnischer Verfahren in der
Reproduktionsmedizin
stark
zugenommen.
Während
in
der
Humanmedizin
die
verschiedenen Techniken in erster Linie therapeutischen Zielen dienen (CATT 1996),
erweitern sie in der Tierzucht das Arsenal an Möglichkeiten, bestimmte Zuchtziele schneller
und effizienter zu erreichen und fördern den überregionalen und internationalen Austausch
wertvollen, genetischen Materials. Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ist als
Sonderform der In-vitro-Befruchtung eine ausgezeichnete Methode, seltenes oder
unzureichend verfügbares, genetisches Material optimal auszunutzen. Dies trifft besonders
auf Spermien zu, da pro Oozyte jeweils nur ein einzelnes Spermium für die Befruchtung
benötigt wird.
Die flowzytometrische Trennung X- und Y-chromosomaler Spermien ist mittlerweile soweit
entwickelt, dass die Spermienfraktionen mit einer Reinheit von ca. 95-98 % getrennt werden
können (JOHNSON 2000). Allerdings ist die geringe Anzahl der pro Stunde sortierten
Spermien noch immer ein limitierender Faktor für den Einsatz gesexten Spermas in der
normalen Besamungspraxis beim Schwein, so dass zur Zeit auf In-vitro-Befruchtung (IVF)
oder spezielle Besamungstechniken (chirurgisch, tief intrauterin, reduzierte Spermiendosis)
zurückgegriffen werden muss (RATH et al. 1997, 1999; ABEYDEERA et al. 1998c; KRÜGER
et al. 1999; SEIDEL u. JOHNSON 1999; KRÜGER u. RATH 2000). Beim Schwein ist die
Effizienz der IVF jedoch durch das Auftreten hoher Polyspermieraten begrenzt (NAGAI 1996;
DAY 2000). Die ICSI mit geschlechtsspezifisch sortierten Spermien ist somit eine gute
Alternative zur In-vitro-Produktion von Ferkeln. Allerdings zeigten die bisher veröffentlichten
Ergebnisse zur ICSI beim Schwein bezüglich der Entwicklungsraten, dass diese Technik
noch nicht sehr weit voran getrieben wurde, obwohl sie auch zur Erstellung transgener
Schweine im Zusammenhang mit der Xenotransplantation ein sehr interessantes
biotechnisches Instrument darstellt (LAVITRANO et al. 1999; PERRY et al. 1999a; SQUIRES
1999; KIM u. SHIM 2000).
Das Ziel dieser Arbeit war, ein Verfahren zur Produktion porziner Embryonen und Ferkel mit
vorherbestimmtem Geschlecht durch ICSI mit flowzytometrisch gesexten Spermien zu
erarbeiten. Dazu sollte zunächst eine Methode für eine artifizielle Aktivierung der Oozyten
entwickelt werden, um die frühembryonalen Entwicklungsraten nach ICSI zu verbessern. Im
zweiten Teil der Versuche wurde die Befruchtungsfähigkeit der gesexten Spermien nach
ICSI im Vergleich zu ungesexten Spermien getestet, wobei die Aktivierungsergebnisse des
ersten Versuchsabschnitts genutzt wurden. Abschließend erfolgte die Überprüfung der
97
Diskussion
Entwicklungskompetenz der mit gesexten oder ungesexten Spermien erzeugten Embryonen
durch Embryotransfer.
5.1
Artifizielle Aktivierung porziner Oozyten zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion
Verschiedene Autoren zeigten, dass durch eine Spermieninjektion porzine Oozyten
ausreichend aktiviert werden, um die ersten Zellzyklen zu durchlaufen (CATT u. RHODES
1995; KIM et al. 1998b; LEE et al. 1998; KLOCKE 1999; KOLBE u. HOLTZ 1999; MARTIN
2000). Eine Entwicklung bis zum Blastozystenstadium wurde bisher aber nur vereinzelt
beschrieben (KIM et al. 1998b; MARTIN 2000), und die Befruchtungsraten lagen in den
meisten Fällen deutlich unter 50 % (Tabelle 3). Es sollte daher in der vorliegenden Arbeit
eine Methode entwickelt werden, die embryonalen Entwicklungsraten nach ICSI durch eine
zusätzliche, artifizielle Aktivierung der Oozyten zu verbessern.
Dazu
wurden
im
ersten
Versuchsabschnitt
drei
verschiedene
künstliche
Aktivierungsmethoden, die CaCl2-Injektion, die Koinkubation mit Ca2+-Ionophor und die
Stimulation durch einen elektrischen Puls, auf ihre Wirksamkeit untersucht.
Alle drei Methoden waren schon im Vorfeld beim Schwein getestet worden (O´BRIAN et al.
1996; CATT et al. 1997; LEE et al. 1998; KIM et al. 1999b; KOLBE u. HOLTZ 1999). Die
Ergebnisse waren jedoch nicht vergleichbar, weil keine der Techniken unter identischen
Bedingungen im Vergleich zu anderen Aktivatoren untersucht worden war.
Eine zusätzliche Aktivierung der Oozyten zur ICSI führt allerdings zu der Situation, dass
erhöhte parthenogentische Entwicklungsstadien der spermieninjizierten Oozyten auftreten
können und somit nur zu scheinbar verbesserten Befruchtungsraten führen. Ein Prblem, das
sich zum Teil schon allein durch den Injektionsprozess ergibt (CATT u. RHODES 1995). Es
besteht aber die Möglichkeit, diese parthenogenetischen Entwicklungen durch gleichzeitige
Untersuchung identisch behandelter, kontrollinjizierter Oozyten tendenziell abzuschätzen.
Dies ist besonders wichtig, wenn mit den verwendeten Untersuchungsmethoden keine
genaue Differenzierung zwischen parthenogentischen und „echten“ Vorkern- oder
Teilungsstadien spermieninjizierter Oozyten vorgenommen werden kann, wie es auch in
dieser Arbeit der Fall ist. Die Ermittlung der Parthenogeneserate kontrollinjizierter Oozyten
erlaubt eine Beurteilung der Wirkungen, die Handhabung (Umsetzen, Injektion usw.) und
künstliche
Aktivierung
auf
die Oozyte haben.
Treten hohe Parthenogeneseraten
kontrollinjizierter Oozyten auf, so ist auch mit erhöhten parthenogenetischen Entwicklungen
98
Diskussion
spermieninjizierter Oozyten zu rechnen. Eine zusätzliche Aktivierung der Oozyten zur ICSI
ist somit nur dann effizient, wenn sie bei kontrollinjizierten Oozyten zu keiner oder nur zu
einer geringfügigen Steigerung der Parthenogeneserate führt. Ansonsten kann von einer
hohen parthenogenetischen Entwicklung spermieninjizierter Oozyten ausgegangen werden,
bei denen dann nicht das Spermium Auslöser für die Entwicklung ist, sondern die
Handhabung der Oozyte.
Als
hypothetisches
Konstrukt
zur
Kontrolle
einer
effizienten
Steigerung
der
Befruchtungsraten durch artifizielle Aktivierung der Oozyten zur ICSI kann dabei die effektive
Befruchtungsrate dienen, die aus der Differenz der Befruchtungsrate spermieninjizierter
Oozyten und der Parthenogeneserate der entsprechend kontrollinjizierten Oozyten gebildet
wird (siehe auch Kapitel 3.8.1). Durch einen Vergleich der effektiven Befruchtungsrate
spermieninjizierter, aktivierter und nicht aktivierter Oozyten kann somit eine wirkungsvolle
Steigerung der Befruchtungsrate spermieninjizierter Oozyten durch künstliche Aktivierung
ermittelt werden.
Unter diesen Gesichtspunkten stellte sich in den eigenen Versuchen, bei denen
Aktivierungs- und Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten 20 Stunden nach ICSI
untersucht wurden, die Aktivierung mittels CaCl2-Injektion gegenüber der elektrischen
Aktivierung und der Aktivierung mit Ca2+-Ionophor als die geeigneteste Methode einer
zusätzlichen Aktivierung zur ICSI dar.
Durch CaCl2-Aktivierung konnte sowohl die Aktivierungs- als auch die Befruchtungsrate
spermieninjizierter Oozyten signifikant gesteigert werden (p < 0,001). Zwar erfolgte bei den
kontrollinjizierten Oozyten ebenfalls ein signifikanter Anstieg der Aktivierungsrate (p < 0,05),
jedoch nicht der Parthenogeneserate, die mit durchschnittlich 8 % sehr niedrig lag.
Daraus ergab sich für die aktivierte, spermieninjizierte Gruppe eine verbesserte effektive
Befruchtungsrate von 41,9 % gegenüber der nicht aktivierten, spermieninjizierten Gruppe mit
einer Rate von 30,4 %.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass es mit Hilfe der CaCl2-Injektion
möglich ist, die Befruchtungsraten der spermieninjizierten Oozyten zu verbessern, ohne eine
Zunahme parthenogenetischer Stadien bei den spermieninjizierten Oozyten zu bewirken.
Diesen Wirkungsmechanismus beschrieben auch O`BRIAN et al. (1996) und CATT et al.
(1997), die die Befruchtungsraten nach Spermieninjektion mittels Ca2+-Injektion (O´BRIAN et
al. (1996): 25 mM CaCl2) deutlich erhöhen konnten, ohne dass dies einen Anstieg der
Parthenogeneserate bei den kontrollinjizierten Oozyten erzeugte (Tabelle 5). Unter
Berücksichtigung der Tatsache, dass in deren Untersuchungen degenerierte Oozyten in die
99
Diskussion
Endergebnisse nicht mit einbezogen wurden, liegen die Ergebnisse der eigenen Versuche in
vergleichbarer Größenordnung.
Im Jahr 1978 beschrieben FULTON und WHITTINGHAM die Möglichkeit, durch alleinige
Injektion von Ca2+-Ionen in Mäuseoozyten die Exozytose der kortikalen Granula, die
Fortsetzung der Meiose und die anschließende Zellteilung auszulösen und erhielten nach Invitro-Kultur parthenogenetische Blastozysten. MACHATY et al. (1996) beschrieben in ihren
Versuchen eine hohe Parthenogeneserate für porzine Oozyten nach alleiniger Injektion von
100 mM CaCl2 (siehe Tabellen 2 und 9), die zur Entwicklung bis zum Blastozystenstadium
führte.
Diese
Ergebnisse
ließen
für
die
eigenen
Versuche
theoretisch
ebenfalls
hohe
Parthenogeneseraten der aktivierten, kontrollinjizierten Oozyten erwarten. Es wurde jedoch
nur eine CaCl2-Konzentration von 30 mM verwendet. Außerdem betrug das von MACHATY
et al. (1996) beschriebene, injizierte Volumen der CaCl2-Lösung ca. 40 pl, während in den
eigenen Versuchen das Volumen der injizierten CaCl2-NaCl-Lösung lediglich ca. 1,2 pl
betrug. Diese beiden Faktoren führten dazu, dass die Parthenogenese nur zu einem
geringen Prozentsatz induziert wurde.
Wie die injizierten Ca2+-Ionen im Zusammenspiel mit dem Spermium in der Oozyte wirken,
ist nicht vollständig geklärt. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass die injizierten Ca2+Ionen selber, als Imitation eines ersten Anstiegs der intrazellulären Ca2+-Konzentration, die
Aktivierungsmechanismen in Gang setzen. Der hohe Ca2+-Gehalt kann im Zytoplasma die
weitere Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern bewirken und somit Ca2+Oszillationen auslösen, die für eine physiologische Aktivierung notwendig sind (FINCH et al.
1991; BERRIDGE 1993). Im vorliegenden Fall konnte durch das injizierte CaCl2
wahrscheinlich die aktivierende Wirkung des aus dem Spermium austretenden CSF, dessen
aktivierende Wirkung in porzinen Oozyten bekannt ist (MACHATY et al. 2000), ergänzt
werden.
Die erfolgreiche Aktivierung von Säugeroozyten mittels Ca2+-Injektion zur ICSI ist auch bei
der Maus beschrieben (AHMADI et al. 1995). Durch zusätzliche Injektion von 5 mM Ca2+ (34 pl) zwei oder drei Stunden vor der Spermieninjektion wurde eine signifikante Verbesserung
der Zellkernzahl der Blastozysten erreicht. Die Parthenogeneserate lag mit 8-10 % sehr
niedrig.
Aus der nicht aktivierenden Wirkung der NaCl-Kontrollinjektionen ergibt sich, dass die Ca2+Ionen der wirksame Bestandteil sind. MACHATY et al. (1996) setzten als Negativ-Kontrolle
eine MgCl2-Lösung ein und konnten ebenfalls keine Stimulation der Oozyten feststellen.
100
Diskussion
Die zweite untersuchte Aktivierungsmethode war die Koinkubation der Oozyten mit Ca2+Ionophor. Damit konnte keine aktivierende Wirkung auf spermieninjizierte Oozyten erzielt
werden, obwohl bei den Kontrollgruppen ein signifikanter Anstieg der Aktivierungsrate
erreicht wurde (p < 0,001). Es kam stattdessen sogar zu einem Absinken der
Befruchtungsrate bei den mit Ca2+-Ionophor behandelten, spermieninjizierten Oozyten
(p < 0,05), was besonders bei Berücksichtigung der effektiven Befruchtungsrate deutlich
wird, die bei den spermieninjizierten, mit Ca2+-Ionophor aktivierten Oozyten nur 21,5 %, aber
bei den spermieninjizierten, nicht aktivierten Oozyten 35,9 % betrug.
Auch KOLBE und HOLTZ (1999) kamen anhand ihrer Untersuchungen zu dem Schluss,
dass die Teilungsrate nach Ca2+-Ionophor-Exposition (100 µM für 5 Minuten) gegenüber der
Teilungsrate unbehandelter Oozyten nicht verbessert werden konnte. CATT et al. (1997)
erreichten
dagegen
mit
Ca2+-Ionophor
eine
Steigerung
der
Befruchtungsrate
spermieninjizierter Oozyten von 32 % auf 63 %. Es liegen allerdings keine Informationen
über Konzentration und Dauer der Ca2+-Ionophor-Behandlung vor, so dass ein direkter
Vergleich nicht möglich ist.
WANG et al. (1998a,b; 1999) stellten in mehreren Versuchen zur parthenogenetischen
Aktivierung porziner Oozyten fest, dass ab einer Ca2+-Ionophor-Konzentration von 50 µM
relativ hohe Aktivierungsraten aufgetreten sind (65 %). Auch JILEK et al. (2000) beschrieben
bei einer Konzentration von 50 µM Ca2+-Ionophor die höchste Aktivierungsrate (70 %).
Inkubationszeiten mit Ca2+-Ionophor von 0,5 bis 7 Minuten wurden untersucht (HAGEN et al.
1991a; WANG et al. 1998a,b, 1999; JILEK et al. 2000). WANG et al. (1999) bewerteten
jedoch eine Inkubationsdauer von mehr als zwei Minuten als nicht notwendig und ab fünf
Minuten als wahrscheinlich nachteilig. Auf diesen Resultaten basierte die hier verwendete
Methode.
Auffällig ist, dass in den vorliegenden Versuchen die mit Ca2+-Ionophor behandelten,
spermien- und kontrollinjizierten Oozyten höhere Degenerationsraten gegenüber nicht
behandelten Kontrollgruppen aufwiesen (p < 0,05; Tabelle 15). Dies ist ein Hinweis, dass die
Ca2+-Ionophor-Aktivierung zu einer fehlerhaften Aktivierung der Oozyten führte, die sich
negativ auf die Oozytenentwicklung ausgewirkt hat.
Der Grund für die mangelhafte Aktivierung der Oozyten nach Inkubation für drei Minuten in
50 µM Ca2+-Ionophor konnte bisher nicht geklärt werden. Ein Ansatzpunkt bietet die
Verwendung eines anderen Befruchtungsmediums während der Aktivierung als bei WANG et
al. (1998a,b; 1999) beschrieben.
101
Diskussion
Insgesamt ist die hier beschriebene Aktivierung porziner Oozyten zur ICSI mittels Ca2+Ionophor nicht geeignet, obwohl z. B. beim Rind Ca2+-Ionophor erfolgreich für die
intrazytoplasmatische Spermieninjektion eingesetzt wurde (z. B. HEUWIESER et al.
1992a,b; MEDVEDEV et al. 1997; LI et al. 1999; CHUNG et al. 2000).
Die elektrische Aktivierung gilt als einer der effektivsten parthenogenetischen Aktivatoren,
mit der beim Schwein Aktivierungsraten von bis zu 100 % erreicht wurden (Tabelle 2). Nach
Embryotransfer sind daraus sogar parthenogenetische Feten erzeugt worden (KUREBAYASHI et al. 2000).
In den vorliegenden Untersuchungen konnte mit einem elektrischen Puls sowohl die
Aktivierungs- als auch die Befruchtungsrate der spermieninjizierten Oozyten signifikant
erhöht werden (p < 0,001 bzw. p < 0,05). Es zeigte sich dabei aber auch eine starke
Zunahme der Aktivierungs- und Parthenogeneseraten der aktivierten Kontrollgruppen
gegenüber den nicht aktivierten (p < 0,001; Kapitel 4.1.3).
Damit reduzierte sich die effektive Befruchtungsrate der spermieninjizierten, aktivierten
Oozyten drastisch gegenüber den spermieninjizierten, nicht aktivierten Oozyten (9,3 % vs.
31,6 %) aufgrund der hohen Parthenogeneserate der kontrollinjizierten, aktivierten Oozyten,
und es wurde nur ein scheinbarer Anstieg der Befruchtungsrate spermieninjizierter Oozyten
durch vermutlich stark vermehrte parthenogentische Entwicklungsstadien erreicht. KIM et al.
(1999b) und LEE et al. (1998) kamen zu vergleichbaren Ergebnissen (Tabelle 5).
Interessanterweise gibt es bei anderen Haustieren fast keine Veröffentlichungen über eine
elektrische Aktivierung der Oozyten zur ICSI. HWANG et al. (2000) berichteten über
verbesserte Blastozystenraten nach elektrischer Aktivierung vor und nach ICSI beim Rind,
jedoch konnten auch hier zwischen aktivierten, spermien- und kontrollinjizierten Oozyten
bezüglich der Teilungsrate keine Unterschiede festgestellt werden.
Die elektrische Aktivierung ist somit aufgrund ihres hohen Potentials zur Auslösung
parthenogenetischer Entwicklung von Oozyten weniger für die ICSI als für den Kerntransfer
geeignet, wo Parthenogenese für die Embryonenentwicklung unumgänglich ist.
Die
Möglichkeiten
einer
genauen
Bestimmung
parthenogenetischer
Stadien
aus
spermieninjizierten Oozyten sind begrenzt oder können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
Die hier vorgestellte Ergebnisse sind somit als Tendenzen zu verstehen, denn durch
parthenogenetische Aktivierung spermieninjizierter Oozyten aufgrund exogener Einflüsse mit
folgender unvollständiger oder fehlerhafter meiotischer Teilung können sich diploide
Embryonen ohne Beteiligung des Spermiums bilden, die ebenso zwei Vorkerne oder geteilte
102
Diskussion
Stadien wie physiologisch befruchtete Oozyten bilden und eine physiologische Befruchtung
vortäuschen.
Eine
aussagekräftige
Methode
zur
Bestimmung
parthenogenetisch
entstandener Embryonen wäre z. B. der Einsatz geschlechtsspezifisch sortierten Spermas
zur ICSI. Werden Y-chromosomale Spermien für die Injektionen verwendet, so müssen die
entstehenden Embryonen aus normal befruchteten Oozyten männlich sein, nur die
parthenogenetischen Embryonen wären weiblich. Durch Geschlechtsbestimmung an den
Embryonen kann der Anteil an parthenogenetischen Stadien unter den spermieninjizierten
Oozyten dann exakt festgestellt werden.
5.2
In
Einsatz von sortierten und unsortierten Spermien beim Einsatz
zur ICSI mit und ohne CaCl2-Aktivierung
diesem
Versuchsabschnitt
wurde
die
Befruchtungsfähigkeit
flüssigkonservierter,
flowzytometrisch sortierter und unsortierter Eberspermien und die Entwicklungsfähigkeit der
damit erstellten ICSI-Embryonen getestet.
Die Ergebnisse der Aktivierungsversuche wurden dabei berücksichtigt, und es wurde mit der
CaCl2-Aktivierung weitergearbeitet. Entsprechende Kontrollgruppen blieben unbehandelt.
Signifikante Unterschied bezüglich der Befruchtungs- und Teilungsraten konnten zwischen
allen vier spermieninjizierten Gruppen sowohl mit als auch ohne CaCl2-Aktivierung nicht
festgestellt werden (Kapitel 4.2.1). Daraus ist abzuleiten, dass sortierte und unsortierte
Spermien sich in ihrem Befruchtungsverhalten bei der ICSI nicht voneinander unterscheiden.
Tendenzielle Unterschiede bezüglich der weiteren embryonalen Entwicklungsfähigkeit lagen
jedoch vor (siehe unten).
Zum Vergleich eines Einsatzes gesexter und ungesexter Spermien zur ICSI liegen beim
Schwein bisher erst zwei weitere Untersuchungen vor:
O´BRIAN et al. (1996) stellten gleichfalls keinen Unterschied der Befruchtungsrate zwischen
gesexten (31 %) und ungesexten Spermien (28 %) nach 17-stündiger In-vitro-Kultur fest. Es
ist davon auszugehen, dass die Befruchtungsraten der eigenen Versuche vermutlich deutlich
höher lagen (60-70 %; Tabelle 26). In den eigenen Versuchen erfolgte in diesem
Versuchsabschnitt die Bestimmung der Befruchtungsrate zwar erst nach 48 Stunden,
O´BRIAN et al. (1996) bezogen jedoch degenerierte Oozyten nicht in die Endergebnisse mit
ein, während dies in den eigenen Versuchen erfolgte.
KLOCKE (1999) erzielte eine Teilungsrate von 17,4 % nach Injektion von X-chromosomalen
Spermien in in vitro gereifte Oozyten. Mit unsortierten Spermien wurde jedoch eine
103
Diskussion
Teilungsrate von 38,9 % erreicht. Sortierte und unsortierte Spermien wurden hier aber nicht
in einem direkten Vergleich, sondern in verschiedenen Versuchsansätzen getestet, so dass
die Ergebnisse mit Vorsicht zu bewerten sind. Unterschiedliche Oozytenfraktionen der
verschiedenen Versuchstage können nach eigenen Erfahrungen zu starken Schwankungen
der Ergebnisse führen, wie anhand hoher Standardabweichungen der eigenen Ergebnisse
zu erkennen ist. KLOCKE (1999) verwendete tiefgefrorenes, aufgetautes sortiertes Sperma,
das somit einer doppelten Belastung ausgesetzt war. Dies könnte zu einer reduzierten
Teilungsrate geführt haben.
Die Teilungsraten spermieninjizierter Oozyten der eigenen Versuche zeigten insgesamt,
unabhängig von der Beschaffenheit der verwendeten Spermien, zufriedenstellende Werte
verglichen mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. KIM et al. (1998b) erreichten zwar
nach Spermieninjektion in vitro gereifter Oozyten Teilungsraten von 73 %, jedoch lag der
entsprechende Wert der kontrollinjizierten Oozyten bei 67 %, so dass die abzuleitende
effektive Teilungsrate sehr niedrig war. Ein entsprechendes Ergebnis erzielten KOLBE und
HOLTZ (1999) (TR: 16 % vs. pTR: 14 %).
MARTIN
(2000)
verwendete
nur
in
vivo
gereifte
Oozyten
zur
ICSI,
deren
Entwicklungspotential allgemein als besser angesehen wird. Der Autor erreichte aber nur
geringfügig höhere Teilungsraten als die in den eigenen Versuchen erzielten. Daraus ist zu
schließen, dass die Reifungsbedingungen für die eigenen in vitro gereiften Oozyten denen
der In-vivo-Situation vergleichbar waren.
Insgesamt weisen die Ergebnisse aber darauf hin, dass die verwendete ICSI-Technik noch
nicht ausgereift ist. Nach 7-tägiger In-vitro-Kultur konnte eine Blastozystenrate von nur 3,8 %
für sortierte Spermien bzw. 10,1 % für unsortierte Spermien erzielt werden. Diese Werte sind
im Vergleich zu KIM et al. (1998b) (38 % mit in vitro gereiften Oozyten) und MARTIN (2000)
(38 % mit in vivo gereiften Oozyten) sehr niedrig, was durch sehr geringe Zellkernzahlen der
Blastozysten (11 ± 3,6 bzw.12 ± 3,8) untermauert wird.
Dieses insuffiziente Entwicklungspotential der Embryonen kann unter anderem auf das
verwendete In-vitro-Kultursystem zurückgeführt werden. Die Embryonen verblieben gehäuft
im 4-Zellstadium (Tabelle 27), was nach BAVISTER (1988, 1995) ein Hinweis auf Defizite im
Kulturmedium ist. Auch KLOCKE (1999) berichtete über dieses Problem. ICSI-Embryonen
sind deutlich höheren Stressfaktoren ausgesetzt als IVF-Embryonen und zeigen sich
demnach anfälliger für suboptimale Kulturbedingungen.
104
Diskussion
Zu diskutieren bleibt, warum die CaCl2-Aktivierung in diesem Fall keine Wirkung hatte. Ein
Grund für den verminderten Wirkungsgrad des CaCl2 könnte in der Verwendung
frischkonservierter Spermien statt tiefgefrorener, aufgetauter Nebenhodenschwanzspermien
liegen. Das würde bedeuten, dass die Beschaffenheit des injizierten Spermiums im
Zusammenhang mit der CaCl2-Aktivierung einen Einfluss auf die Entwicklungsraten
spermieninjizierter Oozyten hat.
Eine entsprechende Tendenz war bei der Blastozystenbildung zu bemerken. Bei den mit
unsortierten Spermien injizierten Oozyten konnte nur mittels CaCl2-Aktivierung wiederholt
Blastozystenbildung
erzielt
werden,
was
für
eine
positive
Wirkung
dieser
Aktivierungsmethode spricht. Bei den mit sortierten Spermien injizierten Oozyten wurde nur
ohne CaCl2-Aktivierung dieser Entwicklungszustand erhalten. Ob dieses Ergebnis für einen
Unterschied zwischen sortierten und unsortierten und für ein unterschiedliches Verhalten auf
hohe CaCl2-Konzentrationen spricht, müsste in weiteren Versuchen genauer untersucht
werden. Veränderte Membraneigenschaften der Spermien könnten jedoch eine Erklärung für
dieses unterschiedliche Verhalten sein. LACHAM-KAPLAN und TROUNSON (1995)
erhielten
bei
der
Maus
durch
Injektion
von
kapazitierten
Spermien
bessere
Entwicklungsraten als mit nicht kapazitierten Spermien, und sortierte Spermien zeigen
deutliche Anzeichen einer Kapazitation (MAXWELL et al. 1996, 1998).
Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch zu Berichten, dass Spermien fertiler oder infertiler
Säuger, Spermien unterschiedlicher Reifungsstadien und kapazitierte oder nicht kapazitierte
Spermien usw. ohne Unterschiede in ihrer Fruchtbarkeit zur ICSI eingesetzt werden können
(HEUWIESER et al. 1992a; TESARIK und MENDOZA 1996; GOMEZ et al. 1997;
McKINNON et al. 1998; GALLI et al. 1999). Allerdings gibt es auch Untersuchungen, die auf
unterschiedliche
Befruchtungsfähigkeit
verschiedener
Spermienfraktionen
hinweisen
(DOZORTSEV et al. 1995b; HOSHI et al. 1995; GOMEZ et al. 1997; KIM et al. 1999c;
MILLER u. SMITH 2001).
Dieser Punkt bedarf noch der weiteren Klärung in weiterführenden Versuchen, da besonders
beim Schwein bisher keine weiteren Untersuchungen dazu vorliegen.
Diskussion
5.3
105
Überprüfung der Vitalität mit ICSI erstellter Embryonen durch
Embryotransfer
Im abschließenden Versuchsabschnitt wurde die Lebens- und Entwicklungsfähigkeit der mit
ICSI erstellten Embryonen durch Embryotransfer untersucht. Zunächst wurden Embryonen
aus in vitro gereiften Oozyten, die mit unsortierten Spermien injiziert und mit CaCl2 aktiviert
wurden, im Zwei- und Vier-Zellstadium auf präpuberale Jungsauen übertragen.
Die Entwicklungskompetenz in vitro gereifter Oozyten nach IVF und ET ist schon mehrfach
durch die Geburt von Ferkeln bestätigt worden (z. B. MATTIOLI et al. 1989; FUNAHASHI et
al. 1997; ABEYDEERA et al. 1998c; RATH et al. 1999). Dabei wurden pro Tier zwischen 30
und 50 Embryonen im 2- bis 8-Zellstadium sowie im Morula-Stadium übertragen.
Je nach Verfügbarkeit am jeweiligen Versuchstag erhielt in den eigenen Untersuchungen
jedes Empfängertier zwischen 42 und 56 Embryonen. Diese Embryonen stellten sich jedoch
als nicht entwicklungskompetent heraus. Es konnte nur eine Trächtigkeit aus vier Transfers
erzielt werden, die aber zwischen der 4. und der 5. Woche endete. Es gab bei dieser Sau
keine Anzeichen für eine Erkrankung, die zu einem Absterben der Früchte geführt haben
könnte. Offen bleibt, ob entweder zu wenig potentiell entwicklungsfähige Embryonen
übertragen wurden (es konnten mittels Ultraschall am 24. Tag nach ICSI nur drei Feten mit
Sicherheit dargestellt werden) oder ob sie fehlentwickelt waren, und dadurch die Erkennung
zur Aufrechterhaltung der Trächtigkeit unzureichend war (POLGE 1966; BOSTEDT 1995).
Die erheblich reduzierte Entwicklungspotenz kann unter anderem auf ein insuffizientes Invitro-Kultursystem im Anschluss an die Spermieninjektionen zurückgeführt werden.
Für den Transfer von Embryonen aus mit gesexten Spermien injizierten und mit CaCl2
zusätzlich aktivierten Oozyten wurden daher ausschließlich in vivo gereifte Oozyten
verwendet. Der Transfer erfolgte direkt im Anschluss an die Spermieninjektionen. Somit
konnten sowohl nachteilige Effekte einer eventuell ungenügenden zytoplasmatischen
Reifung der Oozyten (MOOR 1990) als auch schädigende Effekte suboptimaler In-vitroKulturbedingungen (GARDNER u. LEESE 1990; HYTTEL u. NIEMANN 1990; FLOOD u.
SHIRLEY 1991; FUNAHASHI et al. 1991) ausgeschlossen werden.
Es wurde aus vier Transfers eine Trächtigkeitsrate von 100 % mit der Geburt von gesunden
Ferkeln erzielt. Die Geburt von Ferkeln nach ICSI mit geschlechtsspezifisch sortierten
Spermien und Embryotransfer ist demnach weltweit bisher erstmalig erfolgreich gewesen.
Für die Spermieninjektionen wurden nur die Y-Chromosom-tragenden Spermien verwendet.
Alle dreizehn Ferkel der vier Würfe waren dieser Vorherbestimmung entsprechend männlich.
106
Diskussion
Dies ist eine Bestätigung für die Sortiergenauigkeit der „Beltsville Sperm Sexing Technology“
(BSST) in Verbindung mit einem High-Speed-Flowzytometer.
Noch nicht zufriedenstellend ist in den eigenen Versuchen die Wurfgröße, die im Schnitt 3,3
Ferkel betrug. Entweder wiesen die mit ICSI erstellten Embryonen eine herabgesetzte
Entwicklungsfähigkeit auf, oder es kam aufgrund der hohen Anzahl übertragener Zygoten
(73-96 pro Tier) zu einer erhöhten Embryonensterblichkeit aufgrund einer Platzkonkurrenz im
Uterus. Besonders Jungsauen weisen eine begrenzte Uteruskapazität für sich entwickelnde
Früchte auf, so dass eine erhöhte Embryonensterblichkeit zur Regulierung der Gravidität ein
normaler biologischer Vorgang ist (BOSTEDT 1995). Verminderte Ferkelzahlen sind bei
Jungsauen durchaus bekannt (RÜSSE u. GRUNERT 1993). Im Vergleich zu MARTIN
(2000), der nach drei Transfers mit ICSI-Embryonen nur einen Wurf mit drei Ferkeln erhielt,
und im Vergleich zu KOLBE und HOLTZ (1999), die aus vier Transfers nur ein einziges
Ferkel erhielten, sind diese Resultate zunächst aber befriedigend.
Bezüglich der Ergebnisse bei anderen Haustieren, wo ICSI mit gesextem Sperma
angewendet worden ist (CATT et al. 1996; HAMANO et al. 1999), wird deutlich, dass dort im
Vergleich zu den hier vorliegenden Ergebnissen noch vermehrt Verbesserungen erforderlich
sind.
Insgesamt
beweisen
die
Untersuchungsergebnisse
die
Funktionsfähigkeit
intrazytoplasmatischen Spermieninjektion mit flowzytometrisch gesexten Spermien.
der
107
Diskussion
5.4
Schlussfolgerungen
In dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion
(ICSI) beim Schwein gewonnen werden.
Wie anhand der Ergebnisse dargestellt, bietet die zusätzliche Aktivierung porziner Oozyten
mittels CaCl2-Injektion einen guten Ansatz zur Verbesserung der Entwicklungsraten nach
ICSI im Vergleich zur Aktivierung mit elektrischem Puls oder Ca2+-Ionophor. Diese Methode
bedarf aber noch einer Optimierung, weil die Wirkung der verwendeten Methode im
Zusammenhang
mit
dem
Einsatz frischkonservierter Spermien statt tiefgefrorener
Nebenhodenschwanzspermien deutlich reduziert war. Die Beschaffenheit der Spermien
könnte demnach einen Einfluss auf die Entwicklungsraten nach ICSI haben. Dieser Punkt
bedarf noch der Klärung durch weitere Versuche.
Zwischen
dem
Einsatz
von
unsortierten
und
geschlechtsspezifisch
sortierten,
frischkonservierten Spermien konnte in der Befruchtungsfähigkeit nach ICSI kein
Unterschied festgestellt werden. Es wurde die Entwicklungskompetenz injizierter Oozyten bis
zum Blastozystenstadium gezeigt. Die Blastozystenraten und die Zellkernzahlen waren
jedoch sehr gering. Daraus ist zu schließen, dass das verwendete In-vitro-Kultursystem für
die ICSI-Embryonen ungenügend war.
Durch
die
Geburt
ausschließlich
männlicher
Ferkel
nach
ICSI
mit
sortierten,
Y-chomosomalen Spermien und ET wurde die Funktionsfähigkeit der ICSI und der BSST
bestätigt. Die Geburt von Ferkeln mit vorherbestimmtem Geschlecht nach Einsatz
flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierter Spermien zur ICSI gelang erstmalig auf der
Welt.
Die ICSI mit gesexten Spermien zeigt sich somit als eine gebrauchsfähige aber noch
verbesserungswürdige Alternative zur IVF. Zur Zeit lässt sich jedoch keine gesicherte
Aussage
darüber
machen,
welche
Technik
bevorzugt
zur
In-vitro-Produktion
geschlechtsspezifischer Embryonen verwendet werden sollte. ICSI ist in jedem Fall
arbeitsaufwendiger, garantiert aber die kontrollierte, monosperme Befruchtung der einzelnen
Oozyte, während bei IVF mit der Verwendung sortierter Spermien erneut das Problem hoher
Polyspermieraten auftritt. Die Art der Methode zur In-vitro-Produktion von Embryonen und
Nachkommen beim Schwein mit vorherbestimmtem Geschlecht sollte demnach je nach
Vorraussetzungen und Ziel gewählt werden.
Im Zusammenhang mit der Erstellung transgener Tiere für die Xenotransplantation ergeben
sich weitere interessante Einsatzmöglichkeiten für die ICSI beim Schwein.
108
6
Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war, eine Methode zur Verbesserung der
frühembryonalen
Entwicklungsraten
porziner
Oozyten
nach
intrazytoplasmatischer
Spermieninjektion (ICSI) zu entwickeln und im folgenden porzine Embryonen mit
vorherbestimmtem Geschlecht zu produzieren.
Dazu wurde im ersten Versuchsabschnitt eine Methode zur artifiziellen Aktivierung porziner
Oozyten entwickelt, die eine Verbesserung der frühembryonalen Entwicklungsraten nach
ICSI ermöglicht. Im zweiten Teil wurden porzine Embryonen mit vorherbestimmtem
Geschlecht durch den Einsatz flowzytometrisch gesexter Eberspermien produziert. Die
Vitalität dieser Embryonen wurde durch Embryotransfer überprüft.
Für den ersten Versuchsabschnitt wurden ausschließlich in vitro gereifte (NCSU 37) Oozyten
verwendet, die mit unsortierten, kryokonservierten Nebenhodenschwanzspermien befruchtet
wurden. Zur Kontrolle des parthenogenetischen Entwicklungspotentials wurden in jedem
Versuch kontroll- und nicht injizierte Oozyten parallel mituntersucht, die exakt den gleichen
Behandlungen ausgesetzt wurden.
Als Aktivierungsmethoden wurden die Wirkungen einer CaCl2-Injektion, einer kurzfristigen
Inkubation in Ca2+-Ionophor und eines einzelnen elektrischen Pulses ermittelt. Die
Auswertung erfolgte nach 20-stündiger In-vitro-Kultur in Fert Talp Medium anhand der
Vorkernbildung. Dabei galten ungeteilte Zellstadien mit mindestens einem Vorkern und
geteilte Zellstadien als aktiviert, während Oozyten mit genau zwei Vorkernen oder geteilte
Stadien mit zwei Blastomeren als befruchtet angesehen wurden.
Im zweiten Versuchsabschnitt wurden ebenfalls in NCSU 37 gereifte Oozyten verwendet, die
mit flüssigkonservierten, entweder unsortierten oder flowzytometrisch sortierten Spermien
injiziert und mit CaCl2 aktiviert wurden. Anschließend erfolgte eine In-vitro-Kultur in Fert Talp
Medium für 20 Stunden, bevor die Embryonen in NCSU 23 umgesetzt wurden. Nach 48
Stunden wurde die Teilungsrate bestimmt. Geteilte Stadien wurden für weitere 120 Stunden
kultiviert, wobei nach insgesamt 168-stündiger In-vitro-Kultur die Blastozystenrate ermittelt
wurde. Oozyten, die nach 48 Stunden noch ungeteilt waren, wurden auf Vorkernbildung
untersucht, um die vollständige Befruchtungsrate zu bestimmen.
Zur Überprüfung der Vitalität mit ICSI erstellter Embryonen wurden in einem dritten
Versuchsabschnitt in vitro gereifte Oozyten mit unsortierten Spermien injiziert, mit CaCl2
aktiviert und nach 48-stündiger In-vitro-Kultur als geteilte Stadien auf synchronisierte
Jungsauen chirurgisch übertragen. Zusätzlich wurden in vivo gereifte Oozyten mit sortierten,
109
Zusammenfassung
Y-chromosomalen Spermien injiziert und mit CaCl2 aktiviert. Der Transfer auf Empfängertiere
erfolgte dabei direkt im Anschluss an die Spermieninjektionen.
Alle Empfängertiere wurden zwischen dem 21. und 56. Tag nach ICSI mehrmals
sonographisch auf Trächtigkeit untersucht.
Daraus ergaben sich folgende Ergebnisse:
1. Die Aktivierung spermieninjizierter Oozyten durch zusätzliche Injektion von CaCl2
ergab einen signifikanten Anstieg sowohl der Aktivierungs- (45,9 % vs. 70,4 %) als
auch der Befruchtungsrate (33,2 % vs. 49,9 %) (p < 0,001). Die Aktivierungsrate der
kontrollinjizierten Oozyten erhöhte sich ebenfalls von 11,2 % auf 26,3 % (p < 0,05),
jedoch blieb die Parthenogeneserate niedrig (2,8 % vs. 8 %).
2. Mit der Ca2+-Ionophor-Aktivierung konnte keine Verbesserung der Aktivierungsrate
spermieninjizierter
Oozyten
erreicht
werden
(44,8 %
vs.
42,5 %),
die
Befruchtungsrate reduzierte sich sogar gegenüber den nicht behandelten Oozyten
(36,8 % vs. 24,5 %; p < 0,05), so dass die Ca2+-Ionophor-Behandlung für eine weitere
Anwendung zur ICSI beim Schwein nicht in Betracht kommt.
3. Der elektrische Puls erbrachte ebenfalls einen Anstieg der Aktivierungs- (43,1 % vs.
65,6 %; p < 0,001) und der Befruchtungsrate (32,3 % vs. 48,2 %; p < 0,05)
spermieninjizierter Oozyten, jedoch erfolgte auch bei den kontroll- und nicht injizierten
Oozyten durch die elektrische Aktivierung eine starke Zunahme der Aktivierungs(5,6 % bzw. 0,0 % vs. 48,5 % bzw. 50,7 %; p < 0,001) und Parthenogeneseraten
(0,7 % bzw. 0,0 % vs. 38,9 % bzw. 30,9 %; p < 0,001). Daher erscheint die
elektrische Aktivierung zur ICSI ebenfalls nicht sinnvoll.
4. Beim Vergleich der Injektionen sortierter und unsortierter Spermien in in vitro gereifte
Oozyten ergab sich sowohl mit als auch ohne CaCl2-Aktivierung kein Unterschied
bezüglich der Teilungsrate der spermieninjizierten Gruppen (48,9 % vs. 43,8 % vs.
50,9 % vs. 43,6%). Es bestanden signifikante Unterschiede zu den Kontrollgruppen
(mindestens p < 0,05).
5. Blastozysten konnten nur aus den Oozyten erhalten werden, die mit ungesexten
Spermien injiziert und mit CaCl2 aktiviert (10,1 %) bzw. die mit gesexten Spermien
injiziert und nicht aktiviert worden waren (3,8 %). Bezüglich der Blastozystenrate
bestand
zwischen
allen
Versuchs-
und
Kontrollgruppen
kein
signifikanter
Unterschied. Insgesamt war die Entwicklungspotenz der Embryonen in vitro sehr
gering.
110
Zusammenfassung
6. Die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen aus mit unsortierten Spermien injizierten
und mit CaCl2 aktivierten, in vitro gereiften Oozyten konnte nach Embryotransfer nicht
bestätigt werden. Nur eines von vier Empfängertieren wurde tragend, jedoch endete
diese Trächtigkeit nach vier Wochen.
7. Durch Transfer von in vivo gereiften Oozyten, der direkt nach Injektion mit sortierten,
y-chromosomalen Spermien stattfand, konnte eine Trächtigkeitsrate von 100 %
erzielt werden. Alle vier Empfängertiere ferkelten ab und brachten insgesamt zwölf
lebende und ein totes Ferkel zur Welt. Alle Ferkel waren männlich.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine zusätzliche Aktivierung durch CaCl2-Injektion
ein erster Schritt zu einer effektiven Verbesserung der ICSI-Technik beim Schwein ist.
Des weiteren wurde die Befruchtungsfähigkeit flowzytometrisch sortierter und unsortierter
Spermien
mittels
ICSI
und
die
Entwicklungkompetenz
dieser
Embryonen
zum
Blastozystenstadium nachgewiesen. Die herabgesetzten Entwicklungsraten ließen auf
suboptimale In-vitro-Kulturbedingungen schließen.
Die Geburt von Ferkeln zeigte die Funktionsfähigkeit der ICSI-Technik beim Schwein. Die
hohe Reinheit der sortierten Spermaproben wurde durch die Geburt von ausschließlich
männlichen Ferkeln bestätigt.
Summary
7
111
SUMMARY
Sabine Probst
The intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of gender sorted boar semen in
activated porcine oocytes
The aim of this study was the improvement of the embryonic development after ICSI and the
production of porcine embryos and piglets with preselected gender.
Firstly, an protocol of artificial activation for porcine oocytes was developed to improve the
early embryonic development. Secondly, gender preselected spermatozoa, sorted by the
“Beltsville sperm sexing technology” (BSST), were used to produce porcine embryos by ICSI
and compared to embryos produced with unsorted spermatozoa. The viability of these
embryos was tested by embryo transfer.
The initial experiment was performed using in vitro matured (NCSU 37) oocytes. Only
thawed, cryopreserved, epididymal spermatozoa were used for these injections. Sham
injected and non injected oocytes, treated identically, were tested daily for control of the
parthenogenetic development. Three activation methods were examined: injection of CaCl2,
incubation in Ca2+-Ionophore and a single electrical pulse. After a culture period of 20 hours
in Fert Talp medium the sperm-injected and control oocytes were stained, and analysed by
development of pronuclei. If an oocyte contained one or more pronuclei, or these oocyte had
cleaved, it was considered activated. Ova with exactly two pronuclei or two blastomeres were
considered fertilized.
The second set of experiments were also performed with in vitro matured (NCSU 37)
oocytes. These oocytes were injected with fresh semen either unsorted or gender sorted,
and activated with CaCl2. After in vitro culture in Fert Talp for 20 hours the oocytes were
turned over in NCSU 23. The cleavage rate was assessed after a culture period of 48 hours.
The ability of the cleaved oocytes to develop to blastocysts was assessed after additional
120 hours of in vitro culture.
In order to assess the viability of the ICSI-embryos, cleaved ova obtained from in vitro
matured oocytes were injected with unsorted fresh semen and activated with CaCl2. These
were subsequently transferred to synchronized gilts after a 48 hour period of in vitro culture.
Additionally, in vivo matured oocytes injected with y-chromosomal sorted spermatozoa and
CaCl2 were transferred to the recipients immediately after ICSI. Pregnancy of recipients was
assessed several times using ultrasound between day 21 and day 56.
112
Summary
The following results were obtained:
1. The activation and fertilization rates of sperm injected oocytes stimulated by CaCl2injection were significantly higher than those without this activation (45.9 % vs.
70.4 %; 33.2 % vs. 49.9 %; p < 0,001). Although the activation rate of sham injected
and activated oocytes also increased (11.2 % vs. 26.3 %; p < 0.05), the
parthenogenetic development of this group remained low (2.8 % vs. 8 %).
2. The incubation in Ca2+-Ionophore did not improve the activation rate (44,8 % vs.
42,5 %). In fact, fertilization rate actually decreased compared with non-treated,
sperm injected oocytes (36,8 % vs. 24,5 %; p < 0,05). Therefore, the activation with
Ca2+-Ionophore is not suitable for use with ICSI.
3. The activation of sperm injected, sham injected, and non injected oocytes with a
single electrical pulse resulted in a significant increase of activation rates (43.1 % vs.
65.6 %; 5.6 % vs. 48.5 %; 0.0 % vs. 50.7 %; p < 0.001) and fertilization rates (32.3 %
vs. 48.2 %) and parthenogenetic rates respectively (0.7 % vs. 38.9 %; 0.0 % vs.
30.9 %; p < 0.001). Therefore electrical activation is not useful for activation of
porcine oocytes by ICSI because of the high parthenogenetic development.
4. There were no differences in the cleavage and fertilization rates when using sorted or
unsorted fresh semen with ICSI, regardless of CaCl2 activation (48.9 % vs. 43.8 % vs.
50.9 % vs. 43.6%). However significant differences existed to the control groups (at
least p < 0.05).
5. After 168 hours of in vitro culture, only oocytes injected with unsorted sperm and
activated with CaCl2, or oocytes injected with sorted sperm without CaCl2 activation,
gave blastocysts (10.1 % and 3.8 %). There was no significant difference in the rate
of blastocysts between the experimental groups. Overall, the development capacity of
the ICSI-embryos was very low.
6. One pregnancy resulted from the embryo transfer of cleaved ova obtained from in
vitro oocytes injected with unsorted spermatozoa and activated with CaCl2. But this
pregnancy failed after four weeks. Therefore it was not possible to prove the
development capacity of these embryos.
7. The transfers of in vivo matured oocytes injected with y-chromosomal sorted
spermatozoa, all resulted in pregnancies and gave birth to 13 male piglets. Only one
of these piglets was stillborn.
113
Summary
These results show, that additional activation of porcine oocytes by CaCl2-injection is a first
step
towards
improving
the
ICSI-technique
for
pigs.
The
fertilization
ability
of
flowcytometrically sorted spermatozoa by sperm injection and the development capacity of
these embryos has been demonstrated. However, the poor development rate of these
embryos indicated insufficient in vitro culture conditions.
The birth of piglets highlighted that the ICSI-technique for pigs does work. Furthermore, the
birth of only male piglets demonstrated the high purity of the sorted semen.
Literaturverzeichnis
8
114
LITERATURVERZEICHNIS
ABEYDEERA, L.R., u. B.N. DAY (1997):
Fertilization and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified
tris-buffered medium with frozen-thawed ejaculated spermatozoa.
Biol. Reprod. 57, 729-734
ABEYDEERA, L.R., L.A. JOHNSON, G.R. WELCH, W.H. WANG, A.C. BOQUEST, T.C.
CANTLEY, A. RIEKE u. B.N. DAY (1998c):
Birth of piglets preselected for gender following in vitro fertilization of in vitro matured pig
oocytes by X and Y chromosome bearing spermatozoa sorted by high speed flow cytometry.
Theriogenology 50, 981-988
ABEYDEERA, L.R., W.H. WANG, T.C. CANTLEY, A. RIEKE, R.S. PRATHER u. B.N. DAY
(1998a):
Presence of epidermal growth factor during in vitro maturation of pig oocytes and embryo
culture can modulate blastocysts development after in vitro fertilization.
Mol. Reprod. Dev. 51, 395-401
ABEYDEERA, L.R., W.H. WANG, T.C. CANTLEY, R.S. PRATHER u. B.N. DAY (1999a):
Glutathione content and embryo development after in vitro fertilisation of pig oocytes matured
in the presence of a thiol compound and various concentrations of cysteine.
Zygote 7, 203-210
ABEYDEERA, L.R., W.H. WANG, T.C. CANTLEY, R.S. PRATHER u. B.N. DAY (1998b):
Presence of beta-mercaptoethanol can increase the glutathion content of pig oocytes
matured in vitro and the rate of blastocyst development after in vitro fertilization.
Theriogenology 50, 747-756
ABEYDEERA, L.R., W.H. WANG, T.C. CANTLEY, A. RIEKE, C.N. MURPHY, R.S.
PRATHER u. B.N. DAY (2000):
Development and viability of pig oocytes matured in a protein-free medium containing
epidermal growth factor.
Theriogenology 54, 787-797
ABEYDEERA, L.R., W.H. WANG, T.C. CANTLEY, A. RIEKE, R.S. PRATHER u. B.N. DAY
(1999b):
Epidermal growth factor can enhance the developmental competence of pig oocytes matured
in vitro under protein-free culture-conditions.
Theriogenology 51, 365 (Abstr.)
AHMADI, A., S.G. NG, S.L. LIOW, J. ALI, A. BONGSO u. S.S. RATNAM (1995):
Intracytoplasmic sperm injection of mouse oocytes with 5 mM Ca2+ at different intervals.
Hum Reprod. 10, 431-435
ARCHIBONG, A.E., R.M. PETTERS u. B.H. JOHNSON (1989):
Development of porcine embryos from one- and two-cell stages to blastocysts in culture
medium supplemented with oviductal fluid.
Biol. Reprod. 41, 1076-1083
Literaturverzeichnis
115
AUSTIN, C.R. (1951):
Observation on the penetration of sperm into the mammalian egg.
Aust. J. Sci. Res. 4, 581-592
BALAKIER, H., u. R.F. CASPER (1993):
Experimentally induced parthenogenetic activation of human oocytes.
Hum. Reprod. 8, 740-743
BALAKIER, H., u. A.K. TARKOWSKI (1976):
Diploid parthenogenetic mouse embryos produced by heat-shock and Cytochalasin B.
J. Embryol. Exp. Morph. 35, 25-39
BARROS, C., J.M. BEDFORD, L.E. FRANKLIN u. C.R. AUSTIN (1967):
Membrane vesiculations as a feature of the mammalian acrosome reaction.
J. Cell Biol. 34, 1-5
BAVISTER, B.D (1981):
Substitution of a synthetic polymer for protein in a mammalian gamete culture system.
J. Exp. Zool. 217, 45-51
BAVISTER, B.D. (1988):
Role of oviductal secretions in embryonic growth in vivo and in vitro.
Theriogenology 29, 143-153
BAVISTER, B.D. (1995):
Culture of preimplantation embryos: Facts and artifacts.
Hum. Reprod. 1, 91-148 (Updates)
BECKMANN, L.S., u. DAY (1991):
Culture of the one- and two-cell porcine embryo: Effects of varied osmolarity in Whitten´s and
Kreb´s Ringer bicarbonate media.
Theriogenology 35, 184 (Abstr.)
BECKMANN, L.S., u. B.N. DAY (1993):
Effects of media NaCl concentration and osmolarity on the culture of early-stage porcine
embryos and the viability of embryos cultured in a selected superior medium.
Theriogenology 39, 611-622
BEN-YOSEF, D., Y. ORON u. R. SHALGI (1996):
Intracellular pH of rat eggs is not affected by fertilization and the resulting calcium
oscillations.
Biol. Reprod. 28, 235-247
BERRIDGE, M.J. (1993):
Inositol trisphosphate and calcium signalling.
Nature 361, 315-325
116
Literaturverzeichnis
BETTHAUSER, J., E. FORSBERG, M. AUGENSTEIN, L. CHILDS, K. EILERTSEN, J.
ENOS, T. FORSYTHE, P. GOLUEKE, G. JURGELLA, R. KOPPANG, T. LESMEISTER,
K. MALLON, G. MELL, P. MISICA, M. PACE, M. PFISTER-GENSKOW, N. STRELCHENKO,
G. VOELKER, S. WATT, S. THOMPSON u. M. BISHOP (2000):
Production of cloned pigs from in vitro systems.
Nat. Biotechnol. 18, 1055-1059
BIRD, J.M., u. J.A. HOUGHTEN (1989):
Fertilization of zona-free hamster ova by ionophore-treated boar sperm and the condensation
of sperm chromosomes.
Anim. Reprod. Sci. 21, 125-140
BOQUEST, A.C., L.R. ABEYDEERA, W.H. WANG u. B.N. DAY (1999):
Effect of adding reduced glutathione during insemination on the development of porcine
embryos in vitro.
Theriogenology 51, 1311-1319
BOSTEDT, H. (1995):
Weibliches Schwein.
In: BUSCH, W., u. K. ZEROBIN (Hrsg.): Fruchtbarkeitskontrolle bei Groß- und Kleintieren.
Gustav Fischer Verlag, Jena, Stuttgart, S. 244-268
BRÜSSOW, K.P. (1985):
Über die Verteilung der Eizellen im Eileiter von Jungsauen nach Ovulationssynchronisation.
Monatsh. Vet. Med. 40, 264-268
CATT, J.W. (1996):
Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and related technology.
Anim. Reprod. Sci. 42, 239-250
CATT, S.L., J.W. CATT, M.C. GOMEZ, W.M.C. MAXWELL u. G. EVANS (1996):
Birth of a male lamb derived from an in vitro matured oocyte fertilized by intracytoplasmic
sperm injection of a single presumptive male sperm.
Vet. Record 139, 494-495
CATT, J.W., J.K. O´BRIAN u. G. EVANS (1997):
Microinjection of sperm into porcine oocytes: does an influx of calcium promote fertilization
events?
J. Reprod. Fert. 19, 50 (Abstr.)
CATT, J.W., u. S.L. RHODES (1995):
Comparative intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in human and domestic species.
Reprod. Fertil. Dev. 7, 161-167
CHANG, M.C. (1951):
The fertilization capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.
Nature 168, 697-698
Literaturverzeichnis
117
CHEEK, T.R., O.M. McGUINNESS, C. VINCENT, R.B. MORETON, M.J. BERRIDGE u. M.H.
JOHNSON (1993):
Fertilisation and thimerosal stimulate similar calcium spiking patterns in mouse oocytes but
by separate mechanisms.
Development 119, 179-189
CHEN, S.H., u. G.E. SEIDEL, jr., (1997):
Bovine oocyte activation introcytoplasmic sperm injection.
Theriogeniology 47, 248 (Abstr.)
CHENG, S.P., W.T. HUANG, J.C. JU u. S.C. WU (1997):
Effects of supplement of porcine follicular fluid on porcine oocytes maturation in vitro.
J. Chin. Soc. Vet. Sci. 26, 37-53
CHIAN, R.C., u. M.A. SIRARD (1995):
Effects of cumulus cells and follicle-stimulating hormone during in vitro maturation on
parthenogenetic activation of bovine oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 42, 425-431
CHUNG, J.T., C.L. KEEFER u. B.R. DOWNEY (2000):
Activation of bovine oocytes following intracytoplasmatic sperm injection (ICSI).
Theriogenology 53, 1273-1284
CLARKE, R., u. L.A. JOHNSON (1988):
Factors related to successful sperm microinjection of hamster eggs: The effect of sperm
species, technical experience, needle dimensions and incubation medium on egg viability
and sperm decondensation following microinjection.
Theriogenology 30, 447-460
COLLAS, P., J.J. BALISE, G.A. HOFMANN u. J.M. ROBL (1989):
Electrical activation of mouse oocytes.
Theriogenology 32, 835-844
COLLAS, P., R. FISSORE, J.M. ROBL, E.J. SULLIVAN u. F.L. BARNES (1993):
Electrically induced calcium elevation, activation and parthenogenetic development of bovine
oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 34, 212-223
COY, P., S. RUIZ, R. ROMAR, I. CAMPOS u. J. GADEA (1999):
Maturation, fertilization and complete development of porcine oocytes matured under
different systems.
Theriogenology 51, 799-812
CRAN, D.G., u. W.T.K. CHENG (1985):
Changes in cortical granules during porcine oocyte maturation.
Gamete Res. 11, 311-319
CRAN, D.G., u. W.T.K. CHENG (1986):
The cortical reaction in pig oocytes during in vivo and in vitro fertilization.
Gamete Res. 13, 241-251
118
Literaturverzeichnis
CRAN, D.G., L.A. JOHNSON, N.G. MILLER, D. COCHRANGE u. C. POLGE (1993):
Production of bovine calves following separation of X- and Y-bearing sperm and in vitro
fertilization.
Vet. Rec. 132, 40-41
CROZET, N. (1989):
Nuclear structure and RNA synthesis in mammalian oocytes.
J. Reprod. Fert. 38 (Suppl.), 9-16
CUTHBERTSON, K.S.R. (1983):
Parthenogenetic activation of mouse oocytes in vitro with ethanol and benzyl alcohol.
J. Exp. Zool. 226, 311-314
DALE, B., L.J. DEFELICE u. G. EHRENSTEIN (1985):
Injection of a soluble sperm fraction into sea-urchin eggs triggers the cortical reaction.
Experimentia 41, 1068-1070
DARCEY, K.M., E.G. BUSS, S.E. BLOOM u. M.W. OLSEN (1971):
A cytological study of early cell populations in developing partheogenetic blastodiscs of the
turkey.
Genetics 69, 479-489
DAY, B.N. (2000):
Reproductive biotechnologies: current status in porcine reproduction.
Anim. Reprod. Sci. 60-61, 161-172
DAY, M.L., O.M. McGUINNESS, M.J. BERRIDGE u. M.H. JOHNSON (2000):
Regulation of fertilization-induced Ca2+ spiking in the mouse zygote.
Cell Calcium 28, 47-54
DELL´AQUILA, M.E., Y.S. CHO, P. MINOIA, V. TRAINA, S. FUSCO, G.M. LACALANDRA u.
F. MARITATO (1997):
Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoir-derived and in
vitro-matured equine oocytes.
Theriogenology 47, 1139-1156
DENG, M., u. X. YANG (2001):
Full term development of rabbit oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection.
Mol. Reprod. Dev. 59, 38-43
DIDION, B.A., M.J. MARTIN u. C.L. MARKERT (1990):
Parthenogenetic activation of mouse and pig oocytes matured in vitro.
Theriogenology 33, 1165-1175
DING, J., N. CLARKE, T. NAGAI u. R.M. MOOR (1992a):
Protein and nuclear changes in pig eggs at fertilization.
Mol. Reprod. Dev. 31, 287-296
DING, J., R.M. MOOR u. G.R. FOXCROFT (1992b):
Effects of protein synthesis on maturation, sperm penetration, and pronuclear development
in porcine oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 33, 59-66
Literaturverzeichnis
119
DORST, J. (1991):
Befruchtung, Bildung der Keimblase (Blastozyste) und deren Kontaktaufnahme zur
Gebärmutterschleimhaut.
In: W. BUSCH, K. LÖHLE u. W. PETER (Hrsg.): Künstliche Besamung bei Nutztieren
Fischer Verlag, Jena, Stuttgart, S. 249-256
DOZORTSEV, D., P. DESUTTER u. M. DHONT (1994):
Damage of the sperm plasma membrane by touching the sperm tail with a needle prior to
intracytoplasmic sperm injection.
Hum. Reprod. 9, 40
DOZORTSEV, D., A. RYBOUCHKIN, P. DESUTTER u. M. DHONT (1995):
Sperm plasma membrane damage prior to intracytoplasmic sperm injection: A necessary
condition for sperm nucleus decondensation.
Hum. Reprod. 10, 2960-2964
DOZORTSEV, D., A. RYBOUCHKIN, P. DE SUTTER, C. QUIAN u. M. DHONT (1995):
Human oocyte activation following intracytoplasmic injection: the role of the sperm cell.
Hum. Reprod. 10, 403-407
ENDO, Y., G.S. KOPF u. R.M. SCHULTZ (1986):
Stage-specific changes in protein phosphorylation accompanying meiotic maturation of
mouse oocytes and fertilization of mouse eggs.
J. Exp. Zool. 239, 401-409
ENG, L.A., E.T. KORNEGAY, J. HUNTINGDON u. T. WELLMANN (1986):
Effects of incubation temperature and bicarbonate on maturation of pig oocytes in vitro.
J. Reprod. Fert. 76, 657-662
EPPIG, J.J. (1979):
FSH stimulates hyaluronic acid synthesis by oocyte-cumulus cell complexes from mouse
preovulatory follicles.
Nature 281, 483-484
ESCRIBA, M.J., u. F. GARCIA-XIMENEZ (2000):
Influence of sequence duration and number of electrical pulses upon rabbit oocyte activation
and parthenogenetic in vitro development.
Anim. Reprod. Sci. 59, 99-107
FINCH, E.A., T.J. TURNER u. S.M. GOLDIN (1991):
Calcium as a coagonist of inositol 1,4,5-trisphosphate induced calcium release.
Science 252, 443-446
FIRST, N.L., M.L. LEIBFRIED-RUTLEDGE, D.L. NORTHEY u. P.R. NUTTLEMAN (1992):
Use of in vitro matured oocytes 24 hr of age in bovine nuclear transfer.
Theriogenology 37, 211 (Abstr.)
FISHEL, S., S. GREEN, A. HUNTER, F. LISI, L. RINALDI, R. LISI u. H. McDERMOTT
(1997):
Human fertilization with round and elongated spermatids.
Hum. Reprod. 12, 336-340
120
Literaturverzeichnis
FISHEL, S., F. LISI, L. RINALDI, S. GREEN, A. HUNTER, K. DOWELL u. S. THORNTEN
(1995):
Systematic examination of immobilizing spermatozoa before intracytoplasmic sperm
injection.
Hum Reprod. 10, 497-500
FISSORE, R.A., u. J.M. ROBL (1995):
Sperm, inositol trisphosphate, and thimerosal-induced intracellular Ca2+ elevations in rabbit
eggs.
Dev. Biol. 159, 122-130
FLOOD, L.P., u. B. SHIRLEY (1991):
Reproduction of embryonic toxicity by protein in embryo culture medium.
Mol. Reprod. Dev. 30, 226-231
FRASER, L.R. (1987):
Minimum and maximum extracellular Ca2+ requirements during mouse sperm capacitation
and fertilization in vitro.
J. Reprod. Fert. 81, 77-89
FUGGER, E.F., S.H. BLACK, K. KEYANFAR u. J.D. SCHULMAN (1998):
Birth of normal daughters after MicroSort sperm separation and intrauterine insemination, in
vitro fertilization, or intracytoplasmic sperm injection.
Hum. Reprod. 13, 2367-2370
FULKA jr., J., T. JUNG u. R.M. MOOR (1992):
The fall of biological maturation promoting factor (MPF) and histone H1 kinase activity during
anaphase and telophase in mouse oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 32, 378-382
FULTON, B.P., u. D.G. WHITTINGHAM (1978):
Activation of mammalian oocytes by intracellular injection of calcium.
Nature 273, 149-151
FUNAHASHI, H., Y. AOYAGI, T. TAKEDA u. T. OHIHARA (1991):
Developmental capacity of bovine oocytes collected from ovaries of individual heifers and
fertilized in vitro.
Theriogenology 36, 427-434
FUNAHASHI, H., T. CANTLEY u. B.N. DAY (1994a):
Different hormonal requirements of pig oocyte-cumulus complexes during maturation in vitro.
J. Reprod. Fert. 101, 159-165
FUNAHASHI, H., T. CANTLEY u. B.N. DAY (1997):
Synchronisation of meiosis in porcine oocytes by exposure to dibutyryl cyclic adenosin
monophosphate improves developmental competence following in vitro fertilization.
Biol. Reprod. 57, 49-53
FUNAHASHI, H., T.C. CANTLEY, T.T. STUMPF, S.L. TERLOUW u. B.N. DAY (1994b):
In vitro development of in vitro-matured porcine oocytes following chemical activation or in
vitro fertilization.
Biolog. Reprod. 50, 1072-1077
Literaturverzeichnis
121
FUNAHASHI, H., u. B.N. DAY (1993a):
Effects of the duration of exposure to hormone supplements on cytoplasmic maturation of pig
oocytes in vitro.
J. Reprod. Fert. 98, 179-185
FUNAHASHI, H., u. B.N. DAY (1993b):
Effects of different medium supplements in maturation medium on meiotic and cytoplasmic
maturation of pig oocytes.
Theriogenology 39, 965-973
FUNAHASHI, H., u. T. NAGAI (2001):
Regulation of in vitro penetration of frozen-thawed boar spermatozoa by caffeine and
adenosine.
Mol. Reprod. Dev. 58, 424-431
GADELLA, B.M. (1996):
Lipid changes in the plasma membrane of capacitated boar spermatozoa.
Reprod. Dom. Anim. 4 (Suppl.), 63 – 73
GALLI, C., G. CROTTI, C. NOTARI u. G. LAZZARI (1999):
High rate of activation and fertilisation following intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in
cattle.
Theriogenology 51, 355 (Abstr.)
GARDNER, D.K., u. H.J. LEESE (1990):
Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development
and metabolism in vitro.
J. Reprod. Fertil. 88, 361-368
GERRIS, J., K. MANGELSCHOTS, E. VAN ROYEN, M. JOOSTENS, W. EESTERMANS u.
G. RYCKAERT (1995):
ICSI and severe male-factor infertility: Breaking the sperm tail prior to injection.
Hum. Reprod. 10, 484-486
GLEDHILL, B.L. (1988):
Selection and separation of X- and Y-chromosome bearing mammalian spermatozoa.
Gam. Res. 20, 377-395
GOMEZ, M.C., J.W. CATT, G. EVANS u. W.M.C. MAXWELL (1998c):
Sheep oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
Reprod. Fertil. Dev. 10,197-205
GOMEZ, M.C., J.W. CATT, G. EVANS u. W.M.C. MAXWELL (1998a):
Cleavage development and competence of sheep embryos fertilized by intracytoplasmic
sperm injection and in vitro fertilization.
Theriogenology 49, 1143-1154
GOMEZ, M.C., J.W. CATT, L. GILLAN, G. EVANS u. W.M.C. MAXWELL (1997):
Effect of culture, incubation, and acrosome reaction of fresh and frozen-thawed ram
spermatozoa for in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection.
Reprod. Fertil. 9, 665-673
122
Literaturverzeichnis
GOTO, K. (1993):
Bovine microfertilization and embryo transfer.
Mol. Reprod. Dev. 36, 288-290
GOTO, K., A. KINOSHITA, Y. TAKUMA u. K. OGAWA (1991):
Birth of calves after the transfers of oocytes fertilized by sperm injection.
Theriogenology 35, 205 (Abstr.)
GOTO, K., A. KINOSHITA, Y. NAKANISHI u. K. OGAWA (1996a):
Blastocyst formation following intracytoplasmic injection of in vivo or in vitro derived
spermatids into bovine oocytes.
Theriogenology 45, 301 (Abstr.)
GOTO, K., A. KINOSHITA, Y. NAKANISHI u. K. OGAWA (1996b):
Blastocyst formation following intracytoplasmic injection of in-vitro derived spermatids into
bovine oocytes.
Hum. Reprod. 11, 824-829
GOTO, K., A. KINOSHITA, Y. TAKUMA u. K. OGAWA (1990):
Fertilization of bovine oocytes by the injection of immobilised, killed spermatozoa.
Veterinary Record 127, 517-520
GRAHAM, C.F. (1966):
The regulation of DNA synthesis and mitosis in multinucleate frog eggs.
J. Cell Sci. 1, 363-372
GREEN, K.M., J.H. KIM, W.-H. WANG, B.N. DAY u. R.S. PRATHER (1999):
Effect of myosin light chain kinase, protein kinase A, and protein kinase C inhibition on
porcine oocyte activation.
Biol. Reprod. 61, 111-119
GRØNDAHL, C., T.H. HANSEN, A. HOSSAINI, I. HEINZE, T. GREVE u. P. HYTTEL (1997):
Intracytoplasmic sperm injection of in vitro-matured equine oocytes.
Biol. Reprod. 57, 1495-1501
GRUPEN, C.G., H. NAGASHIMA u. M.B. NOTTLE (1995):
Cysteamine enhances in vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro.
Biol. Reprod. 53, 173-178
GRUPEN, C.G., H. NAGASHIMA u. M.B. NOTTLE (1996):
Progression of meiosis in porcine oocytes matured in vitro and the polyspermy problem.
Theriogenology 45, 190 (Abstr.)
GRUPEN, C.G., H. NAGASHIMA u. M.B. NOTTLE (1997):
Role of epidermal growth factor and insulin-like growth factor-I on porcine oocyte maturation
and embryonic development in vitro.
Reprod. Fertil. Dev. 9, 571-575
GUIGNOT, F., M. OTTOGALLI, J.-M. YVON u. M. MAGISTRINI (1998):
Preliminary observations in in vitro development of equine embryos after ICSI.
Reprod. Nutr. Dev. 38, 653-663
Literaturverzeichnis
123
GUTIERREZ-ADAN, A., W.T. CUSHWA, G.B. ANDERSON u. J.F. MEDRANO (1997):
Ovine-specific Y-chromosome RAPD-SCAR marker for embryo sexing.
Anim. Genet. 28,135-138
HAGEN, D.R., R.S. PRATHER u. N.L. FIRST (1991a):
Response of porcine oocytes to electrical and chemical activation during maturation in vitro.
Mol. Reprod. Dev. 28, 70-73
HAGEN, D.R., R.S. PRATHER, M.M. SIMS u. N.L. FIRST (1991b):
Development of one-cell porcine embryos to the blastocyst stage in simple media.
J. Anim. Sci. 69, 1147-1150
HAMANO, K., X. LI, X. QIAN, K. FUNAUCHI, M. FURUDATE u. Y. MINATO (1999):
Gender preselection in cattle with intracytoplasmically injected, flow cytometrically sorted
sperm heads.
Biol. Reprod. 60, 1194-1197
HANCOCK, J.L. (1961):
Fertilization in the pig.
J. Reprod. Fert. 2, 307-331
HARMS, E., u. D. SMIDT (1970):
Untersuchungen zur In-vitro-Befruchtung follikulärer und tubaler Eizellen vom Schwein.
BMT. Wochenschr. 83, 269-275
HERBERT, M., A.P. MURDOCH u. J.I. GILLESPIE (1995):
The thiol reagent, thimerosal, induces intracellular calcium oscillations in mature human
oocytes.
Hum Reprod. 10, 2183-2186
HEUWIESER, W., X. YANG, S. JIANG u. R.H. FOOTE (1992a):
A comparison between in vitro fertilization and microinjection of immobilized spermatozoa
from bulls producing spermatozoa with defects.
Mol. Reprod. Dev. 33, 489-491
HEUWIESER, W., X. YANG, S. JIANG u. R.H. FOOTE (1992b):
Fertilization of bovine oocytes after microsurgical injection of spermatozoa.
Theriogenology 38, 1-9
HIRAMOTO, Y. (1962):
Microinjection of the live spermatozoa into sea urchin eggs.
Exp. Cell Res. 27, 416-426
HIRAO, Y., T. NAGAI, M. KUBO, T. MIYANO, M. MIYAKE u. S. KATO (1994):
In vitro growth and maturation of pig oocytes.
J. Reprod. Fert. 100, 333-339
HOMA, S.T., u. K. SWANN (1994):
A cytosolic sperm factor triggers calcium oscillations and membrane hyperpolarizations in
human oocytes.
Hum. Reprod. 9, 2356-2361
124
Literaturverzeichnis
HOSHI, K., K. YANAGIDA, H. YAZAWA, H. KATAYOSE u. A. SATO (1995):
Intracytoplasmic sperm injection using immobilized or motile human spermatozoon.
Fert. Steril. 63, 1241-1245
HOSOI, Y., N. KUSAKA, K. SAEKI, K. MATSUMOTO, H. KATO u. A. IRITANI (1999):
Fertilization and development of rabbit oocytes injected with isolated sperm head after
activation.
Theriogenology 51, 358 (Abstr.)
HOSOI, Y., M. MIYAKE, K. UTSUMI u. H. IRITANI (1988):
Development of rabbit oocytes after microinjection of spermatozoa.
In: 11. Kongr. Int. Anim. Reprod. And AI, Dublin, Ireland 1988.
Kongr. Ber., Bd. 3, S. 331
HUNTER, R.H.F. (1990):
Fertilization of pig eggs in vivo and in vitro.
J. Reprod. Fert. 40 (Suppl.), 211-226
HUNTER, R.H.F. (1991):
Fertilization in the pig and horse.
In: B.S. DUNBAR u. M.G. O’RAND (Hrsg.): A comparative overview of mammalian
fertilization.
Plenum Press, New York, London, S. 329-349
HUNTER, R.H.F. (1995):
Ovarian endocrine control of sperm progression in the Fallopian tubes.
Oxford Reviews of Reproduction Biology 17, 85-124
HUNTER, R.H.F., u. P.J. DZIUK (1968):
Sperm penetration of pig eggs in relation to the timing of ovulation and insemination.
J. Reprod. Fert. 15, 199-208
HWANG, S., E. LEE, J. YOON, J.H. LEE u. D. CHOI (2000):
Effects of electric stimulation on bovine oocyte activation and embryo development in
intracytoplasmic sperm injection procedure.
J. Assist. Reprod. Genet. 17, 310-314
HYTTEL, P., u. H. NIEMANN (1990):
Ultrastructure of porcine embryos following development in vitro versus in vivo.
Mol. Reprod. Dev. 27, 136-144
IRITANI, A., Y. HOSOI u. R. TORII (1998):
Application of ICSI in domestic and/or zoo animals.
Gamet. Dev. Funct., Serono Symposia, Rom, S. 393-404
IWASAKI, T., E. KIMURA u. K. TOTSUKAWA (1999):
Studies on a chemically defined medium for in vitro culture of in vitro matured and fertilized
porcine oocytes.
Theriogenology 51, 709-720
Literaturverzeichnis
125
JARRELL, V.L., B.N. DAY u. S. PRATHER (1991):
The transition from maternal to zygotic control of development occurs during the 4-cell stage
in the domestic pig, Sus scrofa: Quantitative and qualitative aspects of protein synthesis.
Biol. Reprod. 44, 62-68
JILEK, F., R. HÜTTELOVA, J. PETR, M. HOLUBOVA u. J. ROZINEK (2000):
Activation of pig oocytes using calcium ionophore: effect of protein synthesis inhibitor
cycloheximide.
Anim. Reprod. Sci. 63, 101-111
JOHNSON, L.A. (1991):
Sex preselection in swine: Altered sex ratio in offspring following surgical insemination of flow
sorted X- and Y- bearing sperm.
Reprod. Dom. Anim. 26, 309-314
JOHNSON, L.A. (2000):
Sexing mammalian sperm for production of offspring: the state-of-art.
Anim. Reprod. Sci. 60-61, 93-107
JOHNSON, L.A., u. R.N. CLARKE (1988):
Flow sorting of X- and Y-chromosome-bearing mammalian sperm: Activation and pronuclear
development of sorted bull, boar and ram sperm mircroinjected into hamster oocytes.
Gamete Res. 21, 335-343
JOHNSON, L.A., J. FLOOK u. H.W. HAWK (1989):
Sex preselection in rabbits: Live births from X- and Y-sperm separated by DNA and cell
sorting.
Biol. Reprod. 41, 199-203
JOHNSON, L.A., u. G.R. WELCH (1999):
Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X and Y sperm for maximum
efficiency.
Theriogenology 52, 1323-1341
JOLIFF, W.J., u. R.S. PRATHER (1997):
Parthenogenetic development of in vitro-matured, in vivo-cultured porcine oocytes beyond
blastocysts.
Biol. Reprod. 56, 544-548
JONES, K.T., J. CARROLL, J.A. MERRIMAN, D.G. WHITTINGHAM u. T. KONO (1995):
Repititive sperm-induced Ca2+ transients in mouse oocytes are cell cycle dependent.
Development 121, 3259-3266
KATO, H., G.E. SEIDEL, E.L. SQUIRES u. J.M. WILSON (1997):
Treatment of equine oocytes with A23187 after intracytoplasmic sperm injection.
Equine vet. J. Suppl. 25, 51-53
126
Literaturverzeichnis
KAUFMAN, M.H. (1983):
Mammalian parthenogenesis: background to experimental studies, terminology and
pathways of development.
In: M.H. KAUFMAN (Hrsg.): Early mammalian development: parthenogenetic studies.
Cambridge University Press, Cambridge, New York, S. 1-228
KAUFMAN, M.L., u. S.T. SACHS (1976):
Complete preimplantation development in culture of parthenogenesis mouse embryos.
J. Embryol. Exp. Morphol. 35, 179-190
KEEFER, C.L., A.I. YOUNIS u. B.G. BRACKETT (1990):
Cleavage development of bovine oocytes fertilized by sperm injection.
Mol. Reprod. Dev. 25, 281-285
KESKINTEPE, L., P.C. MORTON, S.E. SMITH, M.J. TUCKER, A.A. SIMPLICIO u. B.G.
BRACKETT (1997):
Caprine blastocyst development after intracytoplasmatic sperm injection (ICSI).
Theriogenology 47, 249 (Abstr.)
KIKUCHI, K., Y. IZAIKE, J. NOGUCHI, T. FURUKAWA, F.P. DAEN, K. NAITO u. Y.
TOYODA (1995):
Decrease of histone H1 kinase activity in relation to parthenogenetic activation of pig
follicular oocytes matured and aged in vitro.
J. Reprod. Fertil. 105, 325-330
KIKUCHI, K., N. KASHIWAZAKI, J. NOGUCHI, A. SHIMADA, R. TAKAHASHI,
M. HIRABAYASHI, M. SHINO, M. UEDA u. H. KANEKO (1999):
Developmental competence, after transfer to recipients, of porcine oocytes matured,
fertilized, and cultured in vitro.
Biol Reprod 60, 336-340
KIM, J.-H., H.-J. DO, W.-H. WANG, Z. MACHATY, Y.-M. HAN, B.N. DAY u. R.S. PRATHER
(1999):
A protein tyrosine phosphatase inhibitor, sodium orthovanadate, causes parthenogenetic
activation of pig oocytes via an increase in protein tyrosine kinase activity.
Biol. Reprod. 61, 900-905
KIM, N.H., H. FUNAHASHI, L.R. ABEYDEERA, S.J. MOON, R.S. PRATHER u. B.N. DAY
(1996a):
Effects of ovidutal fluid on sperm penetration and cortical granule exocytosis during in vitro
fertilization of porcine oocytes.
J. Reprod. Fert. 107, 79-86
KIM N.-H., S.H. JUN, J.T. DO, S.J. UHM, H.T. LEE u. K.S. CHUNG (1999a):
Intracytoplasmic sperm injection of porcine, bovine, mouse or human spermatozoon into
porcine oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 53, 84-91
KIM, N.-H., J.W. LEE, S.H. JUN, H.T. LEE u. K.S. CHUNG (1998b):
Fertilization of porcine oocytes following intracytoplasmic sperm injection or isolated sperm
head injection.
Mol. Reprod. Dev. 51, 436-444
127
Literaturverzeichnis
KIM, N.-H., Z. MACHATY, R. A. CABOT, Y.-M. HAN, H.-J. DO u. R.S. PRATHER (1998A):
Development of pig oocytes activated by stimulation of an exogenous G protein-coupled
receptor.
Biol. Reprod. 59, 655-660
KIM, N.-H., S.J. MOON, R.S. PRATHER u. B.N. DAY (1996b):
Cytosceletal alteration in aged porcine oocytes and parthenogenesis.
Mol. Reprod. Dev. 43, 513-518
KIM, N.-H., u. H. SHIM (2000):
Intracytoplasmic sperm injection in pigs.
Embryo Transfer Newsletter 18, 10-13
KIM, N.H., J.S. SHIN, C. KIM, S.H. JUN, H.T. LEE u. K.S. CHUNG (1999c):
Fertilization and in vitro development of porcine oocytes following intracytoplasmic sperm
injection of round spermatid or round spermatid nuclei.
Theriogenology 51, 1441-1449
KIMURA, Y., u. R. YANAGIMACHI (1995):
Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into
normal offspring.
Development 121, 2397-2405
KLINE, D., u. J.T. KLINE (1992):
Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in
the mouse egg.
Dev. Biol. 149, 80-89
KLINE, D., u. J.A. ZAGRAY (1995):
Absence of an intracellular pH change following fertilization of the mouse egg.
Zygote 3, 305-311
KLOCKE, S. (1999):
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) in vivo und in vitro gereifter porziner Oozyten
mit Nebenhodenschwanzspermien und flowzytometrisch geschlechtsspezifisch sortierten
Eberspermien.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
KOLBE, T. (1998):
Befruchtung von Schweineeizellen in vitro (IVF), mittels
Spermieninjektion (ICSI) und im Eileiter (GIFT).
Göttingen, Georg-August-Univ., Agrarwissenschaftl. Fak., Diss.
intrazytoplasmatischer
KOLBE, T., u. W. HOLTZ (1999):
Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of in vitro or in vivo matured oocytes with fresh
ejaculated or frozen-thawed epididymal spermatozoa and additional calcium-ionophore
activation in the pig.
Theriogenology 52, 671-682
KOLBE, T., u. W. HOLTZ (2000):
Birth of a piglet derived from an oocyte fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
Anim. Reprod. Sci. 64, 97-101
128
Literaturverzeichnis
KOMAR, A. (1973):
Parthenogenetic development of mouse eggs activated by heat-shock.
J. Reprod. Fertil. 35, 433-443
KOO, D.B., Y.K. KANG, Y.H. CHOI, J.S. PARK, S.K. HAN, I.Y. PARK, S.U. KIM, K.K. LEE,
D.S. SON, W.K. CHANG u. Y.M. HAN (2000):
In vitro development of reconstructed porcine oocytes after somatic cell nuclear transfer.
Biol Reprod 63, 986-992
KRÜGER, C., u. D. RATH (2000):
Deep intrauterine insemination in weaned sows.
Reprod. Fert. Dev. 12, 113 - 117
KRÜGER, C., D. RATH u. J.A. JOHNSON (1999):
Low dose insemination in synchronized gilts.
Theriogenology 52, 1363-1373
KUBIAK, J.Z., M. WEBER, H. DE PENNART, N.J. WINSTON u. B. MARO (1993):
The metaphase arrest in mouse oocytes is controlled through microtuble-dependent
destruction of cyclin B in the presence of CSF.
EMBO J. 12, 3773-3778
KURE-BAYASHI, S., M. MIYAKE, K. OKADA u. S. KATO (2000):
Successful implantation of in vitro-matured, electro-activated oocytes in the pig.
Theriogenology 53, 1105-1119
LACHAM-KAPLAN, O., u. A. TROUNSON (1995):
Intracytoplasmic sperm injection in mice: increased fertilization and development to term
after induction of the acrosome reaction.
Hum. Reprod. 10, 1123-1129
LAURINCIK, J., D. RATH u. H. NIEMANN (1994):
Differences in pronucleus formation and first cleavage following in vitro fertilization between
pig oocytes matured in vivo and in vitro.
J. Reprod. Fertil. 102, 277-284
LAVITRANO, M., A. STOPPACIARO, M.L. BACCI, M. FORNI, D. FIORETTI, L. PUCCI, S.C.
DI, D. LAZZERESCHI, A. RUGHETTI, S. CERETTA, A. ZANNONI, H. RAHIMI, B. MOIOLI,
M. ROSSI, M. NUTI, G. ROSSI, E. SEREN, D. ALFANI, R. CORTESINI u. L. FRATI (1999):
Human decay accelerating factor transgenic pigs for xenotransplantation obtained by sperm
mediated gene transfer.
Transpl. Proc. 31, 972-974
LEAL, C.L.V., u. L. LIU (1998):
Differential effects of kinase inhibitor and electrical stimulus on activation and histone H1
kinase activity in pig oocytes.
Anim. Reprod. Sci. 52, 51-61
LEE, J.W., N.-H. KIM, H.T. LEE u. K.S. CHUNG (1998):
Microtuble and chromatin Organization during the first cell cycle following intracytoplasmic
sperm injection of round spermatid into porcine oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 50, 221-228
129
Literaturverzeichnis
LEIBFRIED, L., u. N.L. FIRST (1979):
Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro.
J. Anim. Sci. 48, 76-86
LI, X., K.-I. HAMANO, X.-Q. QUIAN, K. FUNAUCHI, M. FURUDATE u. Y. MINATO (1999):
Oocyte activation and parthenogenetic development of bovine oocytes following
intracytoplasmic sperm injection.
Zygote 7, 233-237
LI, X., L.H.-A. MORRIS u. W.R. ALLEN (2000):
Effects of different activation treatments
intracytoplasmatic sperm injection.
J. Reprod. Fert. 119, 253-260
on
fertilization
of
horse
oocytes
by
LIU, L., u. R.M. MOOR (1997):
Factors effecting electrical activation of porcine oocytes matured in vitro.
Anim. Reprod. Sci. 48, 67-80
LIU, L., u. X. YANG (1999):
Interplay of maturation-promoting factor and mitogen activated protein kinase inactivation
during metaphase-to-interphase transition of activated bovine oocytes.
Biol. Reprod. 61, 1-7
LONG, C.R., J.R. DOBRINSKY u. L.A. JOHNSON (1999):
In vitro production of pig embryos: comparisons of culture media and boars.
Theriogenology 51, 1375-1390
LONGO, F.J. (1975):
Ultrastructural analysis of artificially activated rabbit eggs.
J. Exp. Zool. 192, 87-112
MACHATY, Z., A.J. BONK, B. KÜHHOLZER u. R.S. PRATHER (2000):
Porcine oocyte activation induced by a cytosolic sperm factor.
Mol. Reprod. Dev. 57, 290-295
MACHATY, Z., H. FUNAHASHI, M.A. MAYES, B.N. DAY u. R.S. PRATHER (1996):
Effects of injecting calcium chloride into in vitro-matured porcine oocytes.
Biol. Reprod. 54, 316-322
MACHATY, Z., M.A. MAYES, L.G. KOVACS, P.A. BALATTI, J.-H. KIM u. R.S. PRATHER
(1997a):
Activation of porcine oocytes via an exogenously introduced muscarinic M1 receptor.
Biol. Reprod. 57, 85-91
MACHATY, Z., M.A. MAYES u. R.S. PRATHER (1995):
Parthenogenetic activation of porcine oocytes with guanosine-5´-0-(3´-thiotriphosphate).
Biol. Reprod. 52, 753-758
MACHATY, Z., W.-H. WANG, B.N. DAY u. R.S. PRATHER (1997b):
Complete activation of porcine oocytes induced by the sulfhydryl reagent, Thimerosal.
Biol. Reprod. 57,1123-1127
130
Literaturverzeichnis
MAHI, C.A., u. R. YANAGIMACHI (1975):
Induction of nuclear decondensation of mammalian spermatozoa in vitro.
J. Reprod. Fert. 44, 293-296
MANSOUR, R.T., M.A. ABOULGHAR, G.I. SEROUR, N.A. TAWAB, Y. AMIN u. M.A.
SATTAR (1996):
Successful intracytoplasmic sperm injection without performing cytoplasmic aspiration.
Fert. Steril. 66, 256-259
MARTIN, M. (2000):
Development of in vivo-matured porcine oocytes following intracytoplasmic sperm injection.
Biol. Reprod. 63, 109-112
MATTIOLI, M., M.L. BACCI, G. GALEATI u. E. SEREN (1989):
Developmental competence of pig oocytes matured and fertilized in vitro.
Theriogenology 31, 1201-1207
MATTIOLI, M., G. GALEATI, M.L. BACCI u. E. SEREN (1988):
Follicular factors influence oocyte fertilizability by modulating the intracellular cooperation
between cumulus cells and oocyte.
Gamet. Res. 21, 223-232
MAXWELL, W.M., u. L.A. JOHNSON (1997):
Chlortetracycline analysis of boar spermatozoa after incubation, flow cytometric sorting,
cooling, or cryopreservation.
Mol. Reprod. Dev. 46, 408-418
MAXWELL, W.M.C., C.R. LONG, L.A. JOHNSON, J.R. DOBRINSKY u. G.R. WELCH
(1998):
The relationship between membrane status and fertility of boar spermatozoa after flow
cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma.
Reprod. Fert. Dev. 10, 433-440
MAXWELL, W.M.C., G.R. WELCH u. L.A. JOHNSON (1996):
Viability and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in
the presence or absence of seminal plasma.
Reprod. Fertil. Dev. 8, 1165-1168
MAYES, M.A., P.L. STOGSDILL u. R.S. PRATHER (1995):
Parthenogenetic activation of pig oocytes by protein kinase inhibition.
Biol. Reprod. 53, 270-275
McGAUGHEY, R.W., u. J. VAN BLERKOM (1977):
Patterns of polypepetide synthesis of porcine oocytes during maturation in vitro.
Dev. Biol. 56, 241-254
McKINNON, A.O., O. LACHAM-KAPLAN u. A.O. TROUNSON (1998):
Pregnancies produced from fertile and infertile stallions by intracytoplasmic sperm injection
(ICSI) of single frozen/thawed spermatozoa into in vivo matured mare oocytes.
In: 7. International Symposium of Equine reproduction University of Pretoria, South Africa
1998.
Kongr. Ber., S. 137
Literaturverzeichnis
131
McLAREN, A. (1982):
The embryo.
In: C.R. AUSTIN u. R.V. SHORT (Hrsg.): Reproduction in mammals.
2. Aufl., Bd. 2: Embryonic and fetal development.
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Sydney, S. 1-25
MEDVEDEV, S., N. BOSSAK, J. ECKERT, A. LUCAS-HAHN, H. NIEMANN u. L.A.
JOHNSON (1997):
Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with flow cytometrically sorted y-chromosome bearing
bovine sperm.
Reprod. Domest. Anim. 32, 118 (Abstr.)
MEINECKE, B., u. S. MEINECKE-TILLMANN (1979):
Effects of gonadotropins on oocyte maturation and progesterone production by porcine
ovarian follicles cultured in vitro.
Theriogenology 11, 351-365
MEINTJES, M., K.J. GRAFF, D. PACCAMONTI, B.E. EILTS, R. COCHRAN, M. SULLIVAN,
H. FALL u. R.A. GODKE (1996):
In vitro development and embryo transfer of sperm-injected oocytes derived from pregnant
mares.
Theriogenology 45, 304 (Abstr.)
MEISTER, A. (1983):
Selective modification of glutathione metabolism.
Science 220, 472-477
MEISTER, A., u. M.E. ANDERSON (1993):
Glutathion.
Ann. Rev. Biochem. 52, 711-760
MILLER, J.E., u. T.T. SMITH (2001):
The effect of intracytoplasmic sperm injection and semen parameters on blastocyst
development in vitro.
Hum. Reprod. 16, 918-924
MINAMIHASHI, A., A.J. WATSON, P.H. WATSON, R.B. CHURCH u. G.A. SCHULTZ (1993):
Bovine parthenogenetic blastocysts following in vitro maturation and oocyte activation with
ethanol.
Theriogenology 40, 63-76
MIYAZAKI, S. (1988):
Inositol 1,4,5-trisphosphate-induced calcium release and guanine nucleotide-binding proteinmediated periodic calcium rises in golden hamster eggs.
J. Cell.Biol. 106, 346-361
MIYAZAKI, S., M. YUZAKI, K. NAKADA, H. SHIRAKAWA, S. NAKANISHI, S. NAKADE u. K.
MIKOSHIBA (1992):
Block of Ca2+ wave and Ca2+ oscillation by antibody to the inositol 1,4,5-trisphosphate
receptor in fertilized hamster oocytes.
Science 257, 251-255
132
Literaturverzeichnis
MOHINDRU, A., J.M. FISHER, u. M. RABINOVITZ (1985):
Endogenous copper is cytotoxic to a lymphoma in primary culture which requires thiols for
growth.
Experientia 41, 1064-1066
MOOR, R.M., I.M. CROSBY u. J.C. OSBORN (1983):
Growth and maturation of mammalian oocytes.
In: P.G. CROSIGNANI u. B.L. RUBIN (Hrsg.): In vitro fertilization and embryo transfer.
Proceedings of the Serono Clinical Colloquia on Reproduction 4, 39-63
MOOR, R.M., C. POLGE u. S.M. WILLADSEN (1980):
Effect of follicular steroids on the maturation and fertilization of mammalian oocytes.
J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 319-335
MOOR, R.M., u. F. GANDOLFI (1987):
Molecular and cellular changes associated with maturation and early development of sheep
eggs.
J. Reprod. Fert. 34 (Suppl.), 55-69
MOOR, R.M., M. MATTIOLI, J. DING u. T. NAGAI (1990):
Maturation of pig oocytes in vivo and in vitro.
J. Reprod. Fert. 40 (Suppl.), 197-210
MOORE, G.C., G.S. KOPF u. R.M. SCHULTZ (1993):
Complete mouse egg activation in the absence of sperm by stimulation of an exogenous GProtein-coupled receptor.
Dev. Biol. 159, 669-678
MOTLIK, J., N. CROZET u. J. FULKA (1984):
Meiotic competence in vitro of pig oocytes isolated from early antral follicles.
J. Reprod. Fert. 72, 323-328
MOTLIK, J., u. J. FULKA (1974):
Fertilization of pig follicular oocytes cultivated in vitro.
J. Reprod. Fertil. 36, 235-237
MOTLIK, J., u. J. FULKA (1986):
Factors affecting meiotic competence in pig oocytes.
Theriogenology 25, 87-96
MOTLIK, J., J. FULKA u. J.-E. FLECHON (1986):
Changes in intracellular coupling between pig oocytes and cumulus cells during maturation in
vivo and in vitro.
J. Reprod. Fert. 76, 31-37
MOTLIK, J., A. PAVLOK, M. KUBELKA, J. KALOUS u. P. KALAB (1998):
Interplay between CDC2 kinase and MAP kinase pathway during maturation of mammalian
oocytes.
Theriogenology 49, 461-469
Literaturverzeichnis
133
MOTOISHI, M., K. GOTO, K. TOMITA, S. OOKUTSU u. Y. NAKANISHI (1996):
Examination of the safety of intracytoplasmic injection procedures by using bovine zygotes.
Hum. Reprod. 11, 618-620
NAGAI, T. (1992):
Development of bovine in vitro-matured follicular oocytes activated with ethanol.
Theriogenology 37, 869-875
NAGAI, T. (1996):
In vitro maturation and fertilization of pig oocytes.
Anim. Reprod. Sci. 42, 153-163
NAGAI, T., M. GESHI, N. YAMAUCHI u. I. TODOROV (1999):
Activation of in-vitro matured porcine oocytes by electric stimuli.
Theriogenology 51, 363 (Abstr.)
NAGAI, T., K. NIWA u. A. IRITANI (1984):
Effect of sperm concentration during preincubation in a defined medium on fertilization in
vitro of pig follicular oocytes.
J. Reprod. Fertil. 70, 271-275
NAGAI, T., T. TAKAHASHI, H. MASUDA, Y. SHIOYA, M. KUWAYAMA, M. FUKUSHIMA, S.
IWASAKI u. A. HANADA (1988):
In vitro fertilization of pig oocytes by frozen boar spermatozoa.
J. Reprod. Fert. 70, 271-275
NAGAI, T., A. TAKANAKA, T. MORI u. M. HIRAYAMA (1994):
Effects of caffein and casein phosphopeptides on fertilization in vitro of pig oocytes matured
in culture.
Mol. Reprod. Dev. 37, 451-456
NAGAI, T., u. R.M. MOOR (1990):
Effect of oviduct cells on the incidence of polyspermy in pig eggs fertilized in vitro.
Mol. Reprod. Dev. 26, 377-382
NAGASHIMA, H., T. NAGAI u. H. YAMAKAWA(1993):
In vitro development of in vivo and in vitro fertilized porcine oocytes.
J. Reprod. Dev. 39, 163-168
NAITO, K., Y. FUKUDA u. Y. TOYODA (1988):
Effects of porcine follicular fluid on male pronucleus formation in porcine oocytes matured in
vitro.
Gamete Res. 21, 289-295
NAITO, K., Y. FUKUDA u. I. ISHIBASHI (1989):
Developmental ability of porcine ova matured in porcine follicular fluid and fertilized in vitro.
Theriogenology 31, 1049-1057
NIEMANN, H., u. B. MEINECKE (1993):
Embryotransfer und assoziierte Biotechniken bei landwirtschaftlichen Nutztieren.
Enke Verlag, Stuttgart
134
Literaturverzeichnis
NIWA, K. (1993):
Effectiveness of in vitro maturation and in vitro fertilization techniques in pigs.
J. Reprod. Fertil. 48 (Suppl.), 49-59
NUSSBAUM, D.J., u. R.S. PRATHER (1995):
Differential effects of protein synthesis inhibitors on porcine oocyte activation.
Mol. Reprod. Dev. 41, 70-75
O´BRIAN, J.K., J.W. CATT, W.M.C. MAXWELL u. G. EVANS (1996):
Intracytoplasmatic injection (ICSI) of in vitro matured pig oocytes with unsorted and sexsorted pig spermatozoa.
13. Int. Congress on animal reproduction ICAR, Sydney, Australien 1996,
Kongr. Ber. Bd. 2, S. 10-20
OGURA, A., u. R. YANAGIMACHI (1995):
Spermatids as male gametes.
Reprod. Fert. Dev. 7, 155-159
OLSEN, N.W. (1966):
Frequency of parthenogenesis in chicken eggs.
J. Heredity 57, 23-25
O´NEILL, G.T., u. M.H. KAUFMAN (1989):
Cytogenetic analysis of ethanol-induced parthenogenesis.
J. Exp. Zool. 249, 182-192
ONODERA, M., u. T. TSUNODA (1989):
Parthenogenetic activation of mouse and rabbit eggs by electric stimulation in vitro.
Gamet. Res. 16, 243-249
OZIL, J.P. (1990):
The parthenogenetic development of rabbit oocytes after repetitive pulsatile electrical
stimulation.
Development 109, 117-127
PALERMO, G.D., H. JORIS, P. DEVROEY u. A.C. VAN STEIRTEGHEM (1992):
Pregnancies after intracytoplasmic sperm injection of single spermatozoon into an oocyte.
Lancet 340, 17-18
PALERMO, G.D., O.M. AVRECH, L.T. COLOMBERO, H. WU, Y.M. WOLNY, R.A. FISSORE
u. Z. ROSENWAKS (1997):
Human sperm cytosolic factor triggers Ca2+ oscillations and overcomes activation failure of
mammalian oocytes.
Mol. Hum. Reprod. 3, 367-374
PARRINGTON, J., K. SWANN, V.I. SHEVCHENKO, A.K. SESAY u. F.A. LAI (1996):
Calcium oscillations in mammalian eggs triggered by a soluble sperm protein.
Nature 379, 364-368
Literaturverzeichnis
135
PAVASUTHIPAISIT, K., Y. KITIYANANT u. C. TOCHARUS (1994):
Embryonic development of bovine oocytes fertilized by sperm microinjection: comparison
between subzonal and ooplasmic injection.
Theriogenology 41, 270 (Abstr.)
PAYNE, D. (1995):
Intracytoplasmic sperm injection: Instrumentation and injection technique.
Reprod. Fert. Dev. 7, 185-196
PERRY, A.C., T. WAKAYAMA, I.M. COOKE u. R. YANAGIMACHI (2000):
Mammalian oocyte activation by the synergistic of discrete sperm head components:
induction of calcium transients and involvement of proteolysis.
Dev. Biol. 15, 386-393
PERRY, A.C.F., T. WAKAYAMA, H. KISHIKAWA, T. KASAI, M. OKABE, Y.TOYODA u.
R. YANAGIMACHI (1999a):
Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection.
Science 284, 1180-1183
PERRY, A.C., T. WAKAYAMA u. R. YANAGIMACHI (1999b):
A novel trans-complementation assay suggests full mammalian oocyte activation is
coordinately initiated by multiple, submembrane sperm components.
Biol. Reprod. 60, 747-755
PETTERS, R.M., u. K.D. WELLS (1993):
Culture of pig embryos.
J. Reprod. Fertil. 48 (Suppl.), 61-73
PHILLIPS, K.P., u. J.M. BALTZ (1996):
Intracellular pH change does not accompany egg activation in the mouse.
Mol. Reprod. Dev. 45, 52-60
POLGE, C. (1966):
Egg transplant in the pig.
World Rev. Anim. Prod. 4, 79-84
POMP, D., B.A. GOOD, R.D. GEISERT, C.J. CORBIN u. A.J. CONLEY (1995):
Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex
effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos.
J. Anim. Sci. 73, 1408-1415
POPE, C.E., C.A. JOHNSON, M.A. McRAE u. G.L. KELLER (1998):
Development of embryos produced by intracytoplasmic sperm injection of cat oocytes.
Anim. Reprod. Sci. 53, 221-236
PRATHER, R.S., u. B.N. DAY (1998):
Practical considerations for the in vitro production of pig embryos.
Theriogenology 32, 23-32
PRATHER, R.S., P.A. EICHEN, D.K. NICKS u. M.S. PETERS (1991):
Artificial activation of porcine oocytes matured in vitro.
Mol. Reprod. Dev. 28, 405-409
136
Literaturverzeichnis
PROCHAZKA, R., R. DUNFORD, P.S. FISER u. G.J. MARCUS (1993):
Parthenogenetic development of activated in vitro matured bovine oocytes.
Theriogenology 39, 1025-1032
PROCHAZKA, R. , J. KANKA, P. SUTOVSKY, J. FULKA u. J. MOTLIK (1992):
Development of pronuclei in pig oocytes activated by a single electric pulse.
J. Reprod. Fert. 96, 725-734
RATH, D. (1992):
Experiments to improve in vitro fertilization techniques for in vivo-matured porcine oocytes.
Theriogenology 37, 885-896
RATH, D., L.A. JOHNSON, J.R. DOBRINSKY u. G.R. WELCH (1997):
Production of piglets preselected for sex following in vitro fertilization with X- and Ychromosome-bearing spermatozoa sorted by flow cytometry.
Theriogenology 47, 795-800
RATH, D., L.A. JOHNSON u. A. GÖRLACH (1996):
Geschlecht von Kälbern jetzt vor der Besamung durch BSST vorausbestimmbar.
Informationsblatt d. Tierzucht- u. Besamungstechniker 120, 3-4
RATH, D., C.R. LONG, J.R. DOBRINSKY, G.R. WELCH, L.L. SCHREIER u. L.A. JOHNSON
(1999):
In vitro production of sexed embryos for gender preselection: High-speed sorting of Xchromosome-bearing sperm to produce pigs after embryo transfer.
J. Anim. Sci. 77, 3346-3352
RATH, D., u. H. NIEMANN (1996):
In vitro Erzeugung von Schweineembryonen.
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 103, 331-336
RATH, D., u. H. NIEMANN (1997):
In vitro fertilization of porcine oocytes with fresh and frozen thawed ejaculated or frozen
thawed epididymal semen obtained from identical boars.
Theriogenology 47, 785-793
RATH, D., H. NIEMANN u. T. TAO (1995):
In vitro maturation of porcine oocytes in follicular fluid with subsequent effects on fertilization
and embryo yield in vitro.
Theriogenology 44, 529-535
REED, M.L., M.J. ILLERA u. M. PETTERS (1992):
In vitro culture of pig embryos.
Theriogenology 37, 95-109
RENS, W., G.R. WELCH u. L.A. JOHNSON (1998):
A novel nozzle for more efficient sperm orientation to improve sorting efficiency of X and Y
chromosome bearing sperm.
Cytometry 33, 476-481
Literaturverzeichnis
137
RHO, G.-J., S. KAWARSKY, W.H. JOHNSON, K. KOCHHAR u. K.J. BETTERIDGE (1998a):
Sperm and oocyte treatments to improve the formation of male and female pronuclei and
subsequent development following intracytoplasmic sperm injection into bovine oocytes.
Biol. Reprod. 59, 918-924
RHO, G.-J., B. WU, S. KAWARSKY, S.P. LEIBO u. K.J. BETTERIDGE (1998b):
Activation regimes to prepare bovine oocytes for intracytoplasmic sperm injection.
Mol. Reprod. Dev. 50, 485-492
RHODES, S.L., J.W. CATT, W.M.C. MAXWELL u. G. EVANS (1994):
Fertilization of in vitro matured sheep oocytes by intracytoplasmic sperm injection.
J. Reprod. Fertil. 13, abstr. series 21
RICKORDS, L.F., M.F. PETERS u. T.T. STUMPF (1992):
Effect of the protein kinase C inhibitor staurosporine on oocyte activation of in vitro matured
oocytes.
Biol. Reprod. 46 (Suppl.), 82 (Abstr.)
RICKORDS, L.F., u. K.L. WHITE (1992):
Electrofusion-induced intracellular Ca2+ flux and its effect on murine oocyte activation.
Mol. Reprod. Dev. 31, 152-159
RORIE, R.W. (1999):
Effect of timing of artificial insemination on sex ratio.
Theriogenology 52, 1273-1280
ROSENKRANZ, C., u. W. LIPP (1989):
Morphologische Veränderungen der Kumulus-Eizell-Komplexe des Schweines während der
In-vitro-Maturation.
Fertilität 5, 209-212
RUDDOCK, N.T., Z. MACHATY u. R.S. PRATHER (2000):
Intracellular pH increase accompanies parthenogenetic activation of porcine, bovine and
murine oocytes.
Reprod. Fert. Dev. 12, 201-207
RÜSSE, I., u. E. GRUNERT (1993):
Die wachsende Frucht.
In: J. RICHTER u. R. GÖTZE: Tiergeburtshilfe.
Paul Parey, Berlin, Hamburg, S. 29-58
SAHA, E., T. OTOI u. M. TAKAGI (1996):
Normal calves obtained after direct transfer of vitrified bovine embryos using ethylene glycol,
trehalose and polyvinylpyrrolidone.
Cryobiology 33, 291-299
SATO, E., u. S.S. KOIDE (1987):
Biochemical transmitters regulating the arrest and resumption of meiosis in oocytes.
Int. Rev. Cytol. 106, 291-299
138
Literaturverzeichnis
SCHMID, R.L., H. KATO, L.A. HERICKHOFF, J.L. SCHENK, P.M. McCUE, Y.G. CHANG u.
E.L. SQUIRES (1998):
Fertilization with sexed equine spermatozoa using intracytoplasmic sperm injection and
oviductal insemination.
In: 7. International Symposium of Equine reproduction University of Pretoria, South Africa
1998.
Kongr. Ber., S. 139-140
SCHNORR, B. (1989):
Progenese, Vorentwicklung.
in: B. SCHNORR (Hrsg): Embryologie der Haustiere.
Verlag Enke, Stuttgart, S. 3-35
SCHNURRBUSCH, U., u. U. HÜHN (1994):
Fortpflanzungssteuerung beim weiblichen Schwein.
Fischer Verlag, Jena, Stuttgart
SEIDEL, G.E., u. L.A. JOHNSON (1999):
Sexing mammalian sperm – overview.
Theriogenology 52, 1267-1372
SHEA, B.F. (1999):
Determining the sex of bovine embryos using polymerase chain reaction results: A six-year
retrospective study.
Theriogenology 51, 841-854
SHEN, S.S., u. R.A. STEINHARDT (1979):
Intracellular pH and the sodium requirement at fertilization.
Nature 282, 87-89
SINGH, B., G.J. BARBE u. D.T. ARMSTRONG (1993):
Factors influencing resumption of meiotic maturation and cumulus expansion of porcine
oocyte-cumulus cell complexes in vitro.
Mol. Reprod. Dev. 36, 113-119
SINGH, B., L. MENG, J.M. RUTLEDGE u. D.T. ARMSTRONG (1997):
Effects of epidermal growth factor and follicle-stimulating hormone during in vitro maturation
on cytoplasmic maturation of porcine oocytes.
Mol. Reprod. Dev. 46, 401-407
SIRACUSA, G., D.G. WITTINGHAN, M. MOLINARO u. E. VIVARELLI (1978):
Parthenogenetic activation of mouse oocytes induced by inhibitors of protein synthesis.
J. Embryol. Exp. Morphol. 43, 157-166
SOFIKITIS, S.J., L. MIYAGAWA, I. SHARLIP, W. HELLSTROM, G. MERKAS u. E.
MASTLOU (1995):
Human pregnancies achieved by intra-ooplasmic injections of round spermatids (RS) nuclei
isolated from testicular tissue of azoospermic men.
AUA Meeting Abstracts, S. 616
Literaturverzeichnis
139
SOMMER, P., D. RATH u. H. NIEMANN (1991):
In vitro maturation of porcine oocytes in the presence of follicular granulosa cells, FSH and/or
EGF.
12th International Congress on Anim. Reprod., The Hague, Bd. 1, 378-380
SQUIRES, E.J. (1999):
Status of sperm-mediated delivery methods for gene transfer.
In: MURRAY, J.D, G.B. ANDERSON, A.M. OBERBAUER u. M.M. McGLOUGHLIN (Hrsg.):
Transgenic animals in agriculture.
CABI Publishing, Oxon, New York, S. 87-95
SQUIRES, E.L., J.M. WILSON, H. KATO u. A. BLASZCZYK (1996):
A pregnancy after intracytoplasmatic sperm injection into equine oocytes matured in vitro.
Theriogenology 45, 306 (Abstr.)
STAIGMILLER, R.B. (1988):
In vitro methods for production of viable embryos.
J. Anim. Sci. 66 (Suppl. 2), 54-64
STEINHARDT, R.A., D. EPEL, E. J. CARROLL jr., u. R. YANAGIMACHI (1974):
Is calcium ionophore a universal activator for unfertilized eggs?
Nature 252, 41-43
STEUBER, S., u. R. KROKER (1994):
Antiprotozoika.
In: W. LÖSCHER, F.R. UNGEMACH u. R. KROKER (Hrsg.): Grundlagen der
Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren.
Verlag Paul Parey, Berlin, Hamburg, S. 359-379
STICE, S.L., u. J.M. ROBL (1990):
Activation of mammalian oocytes by a factor obtained from rabbit sperm.
Mol. Reprod. Dev. 25, 272-280
STREHLER, E., B. BACCETTI, K. STERZIK, S. CAPITANI, G. COLLODEL, M. DE SANTO,
L. GAMBERA u. P. PIOMBONI (1998):
Detrimental effects of polyvinylpyrrolidone on the ultrastructure of spermatozoa.
Hum. Reprod. 13, 120-123
SUN, F.Z., J. HOYLAND u. X. HUANG (1992):
A comparison of intracellular changes in porcine eggs after fertilization and electroactivation.
Development 115, 947-956
SUN, Q.-Y., W.-H. WANG, M. HOSOE, T. TANGUCHI, D.-Y. CHEN u. Y. SHIOYA (1997):
Activation of protein kinase C induces cortical granule exocytosis in a Ca2+-independent
manner, but not the resumption of cell cycle in porcine eggs.
Develop. Groth Differ. 39, 523-529
SWANN, K. (1990):
A cytosolic sperm factor stimulates repetitive calcium increase and mimics fertilization in
hamster eggs.
Development 110, 1295-1302
140
Literaturverzeichnis
SZÖLLÖSI, M.S., J.Z. KUBIAK, P. DEBEY, H. DE PENNERT, D. SZOLLOSI u. B. MARO
(1993):
Inhibition of protein kinases after an induced calcium transient causes the transition to
interphase in activated mouse oocytes.
J. Cell Sci. 104, 861-872
TAIEB, R., C. THIBIER u. C. JESSUS (1997):
On cyclins, oocytes, and eggs.
Mol. Reprod. Dev. 48, 397-411
TAKAHASHI, M., T. NAGAI, S. HAMANO, M. KUWAYAMA, N. OKAMURA u. A. OKANO
(1993):
Effect of thiol compounds on in vitro development and intracellular glutathione content of
bovine embryos.
Biol. Reprod. 49, 228-232
TAKAHASHI, M., N. SAKA, Y. KANAI u. A. OKANO (1997):
Depletion of glutathione causes DNA damage and increase of hydrogen peroxide levels in
bovine embryos.
Theriogenology 47, 312 (Abstr.)
TAO, T., Z. MACHATY, A.C. BOQUEST, B.N. DAY u. R.S. PRATHER (1999):
Development of pig embryos reconstructed by microinjection of cultured fetal fibroblast cells
into in vitro matured oocytes.
Anim. Reprod. Sci. 56, 133-141
TELFORD, N.A., A.J. WATSON u. G.A. SCHULZ (1990):
Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: A
comparison of several spezies.
Mol. Reprod. Dev. 44, 90-100
TESARIK, J., C. MENDOZA u. J. TESTART (1995):
Viable embryos from injection of round spermatids into oocytes.
New Engl. J. Med. 333, 525
TESARIK, J., u. C. MENDOZA (1996):
Spermatid injection into human oocytes. I. Laboratory techniques and special features of
zygote development.
Hum. Reprod. 11, 772-779
TESARIK, J., M. SOUSA u. J. TESTART (1994):
Human oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection.
Hum. Reprod. 9, 511-518
TESARIK, J., u. J. TESTART (1994):
Treatment of sperm-injected human oocytes with Ca2+ Ionophore supports the development
of Ca2+ oscillations.
Biol. Reprod. 51, 385-391
THIBAULT, C., D. SZÖLLÖSI u. M. GERARD (1987):
Mammalian oocyte maturation.
Reprod. Nutr. Dev. 27, 865-896
Literaturverzeichnis
141
THOMAS, W.K., u. G.E. SEIDEL jr. (1993):
Effects of cumulus cells on culture of bovine embryos derived from oocytes matured and
fertilized in vitro.
J. Anim. Sci. 71, 2506-2510
TOCHARUS, C., Y. KITIYANANT u. K. PAVASUTHIPAISIT (1996) :
Fertilization and subsequent development of bovine embryos after intracytolasmic sperm
injection (ICSI) using different injection pipettes.
Theriogenology 45, 302 (Abstr.)
TSAFIRI, A., u. C.P. CHANNING (1975):
Influence of follicular maturation and culture conditions on the meiosis of pig oocytes in vitro.
J. Reprod. Fert. 43, 149-152
VAN STEIRTEGHEM, A.C., J. LIU, H. JORIS, Z. NAGY, C. JANSSENSWILLEN, H.
TOURNAYE, M.-P. DERDE, E. VAN ASSCHE u. P. DEVROEY (1993):
Higher success rate by intracytoplasmic sperm injection than by subzonal insemination.
Report of a second series of 300 consecutive treatment cycles.
Hum. Reprod. 8, 1055-1060
VITULLO, A.D., u. J.P. OZIL (1992):
Repetitive stimuli drive meiotic resumption and pronuclear development during mouse oocyte
activation.
Dev. Biol. 151, 128-136
WANG, W.H., L.R. ABEYDEERA, T.C. CANTLEY u. B.N. DAY (1997):
Effects of oocyte maturation media on development of pig embryos produced by in vitro
fertilization.
J. Reprod. Fertil. 111, 101-108
WANG, W.-H., L.R. ABEYDEERA, R.S. PRATHER u. B.N. DAY (1998a):
Functional analysis of activation of porcine oocytes by spermatozoa, Calcium Ionophore and
electrical pulse.
Mol. Reprod. Dev. 51, 346-353
WANG, W.-H., Z. MACHATY, L.R. ABEYDEERA, R.S. PRATHER u. B.N. DAY (1998b):
Parthenogenetic activation of pig oocytes with Calcium Ionophore and the block to sperm
penetration after activation.
Biol. Reprod. 58, 1357-1366
WANG, W.-H., Z. MACHATY, N. RUDDOCK, L.R. ABEYDEERA, A.C. BOQUEST,
R.S. PRATHER u. B.N. DAY (1999):
Activation of porcine oocytes with Calcium Ionophore: effects of extracellular Calcium.
Mol. Reprod. Dev. 53, 99-107
WASSARMAN, P.M. (1988):
The mammalian ovum.
in: E: KNOBIL u. J.D. NEILL (Hrsg.): The physiology of reproduction.
Raven Press, New York, S. 69-73
142
Literaturverzeichnis
WHITAKER, M., u. R.F. IRVINE (1984):
Inositol 1,4,5-trisphosphate microinjection activates sea urchine eggs.
Nature 312, 636-639
WEHNER, R., u. W. GEHRING (1990):
Zoologie.
22. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart
WU, H., C.L. HE u. R.A. FISSORE (1998):
Injection of a porcine sperm factor induces activation of mouse eggs.
Mol. Reprod. Dev. 49, 37-47
WU, B., G. IGNOTZ, B. CURRIE u. X. YANG (1997):
Dynamics of maturation-promoting factor and its constituent proteins during in vitro
maturation of bovine oocytes.
Biol. Reprod. 56, 253-259
WU, H., J. SMYTH, V. LUZZI, K. FUKAMI, T. TAKENAWA, S.L. BLACK, N.L. ALBRITTON u.
R.A. FISSORE (2001):
Sperm factor induces intracellular free calcium oscillations by stimulating the
phosphoinositide pathway.
Biol. Reprod. 64, 1338-1349
YANAGIDA, K., H. KATAYOSE, H. YAZAWA, Y. KIMURA, A. SATO, H. YANAGIMACHI u.
R. YANAGIMACHI (1999):
Successful fertilization and pregnancy following ICSI and electrical oocyte activation.
Hum. Reprod. 14, 1307-1311
YANAGIMACHI, R. (1988):
Mammalian fertilization.
In: E. KNOBIL, J.D. NEILL, L.L. EWING, G.S. GREENWALD, C.L. MARKET, D. u.
W. PFAFF (Hrsg.): The physiology of reproduction.
Raven Press, New York, S. 135-185
YANG, X., S. JIANG u. Z. SHI (1992):
Improved activation by combined cycloheximide and electric pulse treatment of bovine
follicular oocytes matured in vitro for 23-24 hours.
Biol. Reprod. 46 (Suppl.), 117 (Abstr.)
YAZAWA, H., K. YANAGIDA u. A. SATO (2001):
Oocyte activation and Ca(2+) oscillation-inducing abilities of mouse round/elongated
spermatids and the development capacities of embryos from spermatid injection.
Hum. Reprod. 16, 1221-1228
YLLERA-FERNANDEZ, M.M., N. CROZET u. M. AHMED-ALI (1992):
Microtubule distribution during fertilization in the rabbit.
Mol. Reprod. Dev. 32, 271-276
YOSHIDA, M. (1987):
In vitro fertilization of pig oocytes matured in vivo.
Jap. J. Vet. Sci. 49, 711-718
Literaturverzeichnis
143
YOSHIDA, M. (1989):
Improved viability of two-cell stage pig embryos resulting from in vitro fertilization of oocytes
matured in vivo.
Jap. J. Anim. Reprod. 35, 34-37
YOSHIDA, M. (1993):
Role of glutathione in the maturation and fertilization of pig oocytes in vitro.
Mol. Reprod. Dev. 35, 76-81
YOSHIDA, M., Y. ISHIZAKI u. H. KAWAGISHI (1990):
Blastocyst formation by pig embryos resulting from in-vitro fertilization of oocytes matured in
vitro.
J. Reprod. Fertil. 88, 1-8
YOSHIDA, M., Y. ISHIZAKI, H. KAWAGISHI, K. BAMBA u. Y. KOJIMA (1992):
Effects of pig follicular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent
fertilizing and developmental capacity in vitro.
J. Reprod. Fert. 95, 481-488
YOSHIDA, M., K. ISHIGAKI, T. NAGAI, M. CHIKYU u. V.G. PURSEL (1993a):
Glutathione concentration during maturation and after fertilization in pig oocytes: Relevance
to the ability of oocytes to form male pronucleus.
Biol. Reprod. 49, 89-94
YOSHIDA, M., Y. MIZOGUCHI, K. ISHIGAKI, T. KOJIMA u. T. NAGAI (1993b):
Birth of piglets derived from in vitro fertilization of pig oocytes matured in vitro.
Theriogenology 39, 1303-1311
ZHANG, J., C.-W. WANG, A. BLASZCYZK, J.A. GRIFO, J. OZIL, E. HABERMANN, A.
ADLER u. L.C. KREY (1999):
Electrical activation and in vitro development of human oocytes that fail to fertilize after
intracytoplasmic sperm injection.
Fert. Steril. 72, 509-512
ZIMMERMANN, U., u. J. VIENKEN (1982):
Electric field-induced cell-to-cell fusion.
J. Memb. Biol. 67, 165-182
144
9
Abkürzungsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AR
Aktivierungsrate
BR
Blastozystenrate
BSA
Bovines Serumalbumin
BSST
Beltsville Sperm Sexing Technology
bzw.
beziehungsweise
cAMP
cyclic adenosin monophosphate
°C
Grad Celsius
ca.
zirka
cm
Zentimeter
CSF
cytosolic sperm factor
db-cAMP
dibutyryl-cAMP
DC
direct current
DMAP
Dimethylaminopurin
DMSO
Dimethylsulfoxid
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylen-Diamin-Tetraacetat
EGF
epidermal growth factor
el. Akt.
Elektrische Aktivierung
ET
Embryotransfer
et al.
et alii
Fa.
Firma
FR
Fertilisationsrate (= Befruchtungsrate)
FSH
Follikelstimulierendes Hormon
g
Erdbeschleunigung
GTP
Guanosin-Triphosphat
GTP-γ-S
Guanosin-5´-0-(3´-Thiotriphosphat)
h
hora: Stunde
hCG
human Chorionic Gonadotropin
ICSI
intracytoplasmic sperminjection
I.E.
Internationale Einheiten
inj.
injiziert
Ionoph.
Ca2+-Ionophor
IP3
Inositol-1,4,5 Triphosphat
Literaturverzeichnis
IVF
In-vitro-Fertilisation
IVM
In-vitro-Maturation
IVP
In-vitro-Produktion
kDa
Kilo-Dalton
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplexe
kV
Kilovolt
LH
Luteinisierendes Hormon
M II
Metaphase II
MAPK
mitogen-activated protein kinase
µm
Mikrometer
µM
Mikromol
µs
Mikrosekunde
mg
Milligramm
min
Minute
mm
Millimeter
mM
Millimol
mOsm
Milliosmol
MPF
maturation promoting factor
MPGF
male pronucleus growth factor
mW
Milliwatt
n
Anzahl
n.a.
nicht analysierbar
NBCS
newborn calf serum
NCSU
North Carolina State University
NHS
Nebenhodenschwanz
p
Irrtumswahrscheinlichkeit
pBR
parthenogenetische Blastozystenrate
PBS
phosphate buffered salt solution
pFF
porzine Follikelflüssigkeit
pH
pondus Hydrogenii
pl
Pikoliter
PMSG
Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin
PR
Parthenogeneserate
pTR
parthenogenetische Teilungsrate
PVA
Polyvinylalkohol
145
146
Abkürzungsverzeichnis
PVP
Polyvinylpyrrolidon
SD
standard deviation
Sonst.
Sonstige
SUZI
subzonal insemination
TALP
Tyrode´s Albumin Laktat Pyruvat
TCM
tissue culture medium
TR
Teilungsrate
V
Volt
VK
Vorkern
∅
Durchmesser
x
Arithmetischer Mittelwert
♂
männlich
≥
größer als / gleich
↔
entspricht
147
Anhang
10
ANHANG
10.1
Zusammensetzung der verwendeten Medien
10.1.1
Kulturmedien
Tabelle 31:
Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien
Komponenten
BSA
CaCl2 x 2 H2O
Coffein
Ca-Lactat x 5 H2O
Cystein
db-cAMP
EGF
Glukose
Glutamin
hCG
Hypotaurin
immature pFF
Insulin
Kanamycin
KCl
KH2PO4
Merkaptoethanol
MgCl2 x H2O
MgSO4 x 7 H2O
Na2+-Pyruvat
NaCl
NaH2PO4
NaHCO3
Na2+-Laktat
Penicillin G
Phenolrot
PMSG
PVA
Sorbitol
Streptomycin
Taurin
∗
∗∗
NCSU 37
Fert Talp
NCSU 23
0,4 %∗
0,4 %∗
1,7 mM
1,7 mM
2,0 mM
2,5 g/l
0,6 mM∗
1,0 mM∗∗
10 ng/ml∗
5,6 mM
1,0 mM∗
10 I.E./ml∗∗
5,0 mM
5,6 mM
1,0 mM∗
5,0 mM∗
10 %∗
5,0 mg/l∗
0,1 g/L
3,2 mM
4,8 mM
1,2 mM
50 µM∗
4,8 mM
1,2 mM
0,5 mM
1,2 mM
1,2 mM
∗
108,7 mM
25,1 mM
1,0 mM
114 mM
0,34 mM
25,1 mM
10 mM
100 I.E./l
0,001%
108,7 mM
25,1 mM
100 I.E./l
0,001 %
∗∗
10 I.E./ml
1,0 g/l
12 mM
50 mg/l
Erst direkt vor Gebrauch einzuwiegen
Nur für die ersten 24 Stunden der Reifung dem Medium zufügen
50 mg/l
7,0mM∗
148
Anhang
10.1.2
Paraformaldehyd-Triton X-100-Lösung
⇒ 4%ige Paraformaldehydlösung:
o
50 ml H2O
o
4,0 g Paraformaldehyd
o
einige Tropfen einer 1 N NaOH
o
Mischen und unter Rühren fast zum Kochen bringen
o
Bei Klärung des Gemisches: 100 ml PBS zugeben
o
pH-Wert auf 7,0-7,2 einstellen
o
Gemisch filtern
o
Lagerung bei 4 °C (3 Monate verwendbar)
⇒ 2%ige Paraformaldehydlösung mit Triton X-100 (für jeden Versuch frisch anzusetzen)
o
4,5 ml 4%ige Paraformaldehydlösung mit
o
4,5 ml PBS und
o
1,0 ml Triton X-100 unter Erwärmung mischen
10.1.3
Mounting Medium
o
8 ml PBS und
o
2 ml Glycerol mischen
o
100 mg/ml DABCO (1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane, Fa. Sigma) dazugeben
o
gut mischen und bei 4 °C aliquotiert (2 ml) lagern
10.1.4
Lacmoid-Färbelösung
⇒ Stocklösung (2,2%ige Lacmoidlösung):
o
1 g Resorcinblau (Fa. Chroma-Gesellschaft, Stuttgart)
o
45 ml konzentrierter Essigsäure (99,8 %, Fa. Riedel de Haen, Seelze)
o
Mischen und zum Lösen bis fast zum Kochen erhitzen
⇒ Gebrauchslösung (1%ige Lacmoidlösung):
o
5 ml Stocklösung und 5,5 ml Aqua bidest mischen
o
vor Gebrauch filtrieren
Anhang
10.1.5
Medium zur elektrischen Aktivierung
⇒ Stocklösung:
o
0,1 mM MgSo4
o
0,05 mM CaCl2
o
in Ampuwa (Fa. Fresenius, Bad Homburg) lösen
⇒ Gebrauchslösung (für jeden Versuch frisch anzusetzen):
o
25 ml Stocklösung
o
1,284 g Mannose
o
1 % NBCS
o
sterilfiltrieren
10.1.6
Hoechst 33342, Farbstofflösung
o
1 mg Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) in
o
1 ml Ampuwa (Fa. Fresenius, Bad Homburg) lösen
o
kühl und dunkel lagern
10.1.7
2 %-TEST-Eidotter-Lösung
o
50 ml Ampuwa (Fa. Fresenius, Bad Homburg)
o
2,1629 g TES (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe)
o
0,5135 Tris (Fa. Roth GmbH, Karlsruhe)
o
0,1 g Glukose (Fa. Riedel-de-Haen, Seelze)
o
0,0125 g Streptomycin-Sulfat (Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA)
o
0,0075 g Penicillin-G (Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA)
o
1,25 ml frischer Eidotter
149
150
Anhang
10.2
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
10.2.1
Tabellen
Tabelle 1:
Methoden zur artifiziellen Aktivierung von Säugeroozyten
21
Tabelle 2:
Beispiele der Wirksamkeit unterschiedlicher Aktivierungsmethoden für
porzine Oozyten anhand der Aktivierungsrate (6-24 Stunden nach
Stimulation)
25
Beispiele für Aktivierungs- (AR) und Befruchtungsraten (FR) nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und Parthenogeneseraten (PR)
nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies ohne zusätzliche
Aktivierung
31
Beispiele für Aktivierungs- (AR) und Befruchtungsraten (FR) nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion und Parthenogeneseraten
(PR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies mit
zusätzlicher Aktivierung
33
Aktivierungs- (AR), Befruchtungs- (FR) und Teilungsraten (TR) nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bzw. Parthenogeneseraten
(PR) nach Kontrollinjektion beim Schwein mit und ohne zusätzliche
Aktivierung
35
Beispiele für Teilungs- (TR) und Blastozystenraten (BR) nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bzw. parthenogenetische
Teilungsraten (pTR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen
Spezies ohne zusätzliche Aktivierung
37
Beispiele für Teilungs- (TR) und Blastozystenraten (BR) nach
intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bzw. parthenogenetische
Teilungsraten (pTR) nach Kontrollinjektion bei unterschiedlichen Spezies
mit zusätzlicher Aktivierung
39
Nachkommen nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion bei
verschiedenen Haustierarten
40
Tabelle 3:
Tabelle 4:
Tabelle 5 :
Tabelle 6:
Tabelle 7:
Tabelle 8:
Tabelle 9:
Literaturübersicht der Ergebnisse unterschiedlicher Aktivierungsmethoden in vitro gereifter porziner Oozyten bezüglich parthenogenetischer
42
Teilungs- (pTR) und Blastozystenraten (pBR)
Tabelle 10:
Klassifizierung der gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK)
53
Tabelle 11:
Gespeicherte Geschwindigkeitsstufen für ICSI
58
Tabelle 12:
Abmessungen der verwendeten Injektionspipette für ICSI
(# 5175 112.008, Fa. Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, 51145 Köln)
58
Formel zur Berechnung des injizierten Volumens der CaCl2-Lösung
63
Tabelle 13:
Anhang
Tabelle 14:
Entwicklungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht injizierter,
in vitro gereifter Oozyten mit bzw. ohne CaCl2-Aktivierung 20 Stunden
nach ICSI; x ± SD aus sechs Versuchsdurchgängen
151
72
Tabelle 15:
Entwicklungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht injizierter,
in vitro gereifter Oozyten 20 Stunden nach ICSI mit bzw. ohne Aktivierung
75
mit Ca2+-Ionophor ; x ± SD aus sechs Versuchsdurchgängen
Tabelle 16:
Entwicklungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht injizierter,
in vitro gereifter Oozyten 20 Stunden nach ICSI mit bzw. ohne
elektrische Aktivierung; x ± SD aus sechs Versuchsdurchgängen
78
Aktivierungsraten (%) der spermieninjizierten und aktivierten bzw.
nicht aktivierten Oozyten
80
Aktivierungsraten (%) der kontrollinjizierten, aktivierten und nicht
aktivierten Oozyten
81
Aktivierungsraten (%) der nicht injizierten, aktivierten und nicht
aktivierten Oozyten
81
Befruchtungsraten (%) der spermieninjizierten, aktivierten und nicht
aktivierten Oozyten
82
Parthenogeneseraten (%) der kontrollinjizierten, aktivierten und nicht
aktivierten Oozyten
82
Parthenogeneseraten (%) der nicht injizierten, aktivierten und nicht
aktivierten Oozyten
82
Teilungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und
nicht injizierter Oozyten mit und ohne CaCl2-Aktivierung 48 Stunden
nach ICSI; x ± SD aus acht Versuchsdurchgängen
84
Entwicklungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und
nicht injizierter Oozyten 48 Stunden nach ICSI; x ± SD aus acht
Versuchsdurchgängen
85
Entwicklungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und
nicht injizierter Oozyten 48 Stunden nach ICSI mit Differenzierung
der ungeteilten Stadien; x ± SD aus acht Versuchsdurchgängen
86
Befruchtungsraten (%) spermien- (sortiert und unsortiert), kontroll- und
nicht injizierter Oozyten mit oder ohne CaCl2-Aktivierung 48 Stunden
nach ICSI; x ± SD aus acht Versuchsdurchgängen
87
Entwicklungsraten der geteilten Stadien (%) spermien- (sortiert und
unsortiert), kontroll- und nicht injizierter Oozyten mit und ohne CaCl2Aktivierung 168 Stunden nach ICSI; x ± SD aus acht
Versuchsdurchgängen
88
Tabelle 17:
Tabelle 18:
Tabelle 19:
Tabelle 20:
Tabelle 21:
Tabelle 22:
Tabelle 23:
Tabelle 24:
Tabelle 25:
Tabelle 26:
Tabelle 27:
152
Tabelle 28:
Tabelle 29:
Tabelle 30:
Tabelle 31:
10.2.2
Anhang
Daten zu den Embryotransferversuchen von Embryonen aus in vitro
gereiften und mit unsortierten Spermien injizierten und mit CaCl2
aktivierten Oozyten
91
Daten zu den Embryotransferversuchen von in vivo gereiften und
mit sortierten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten Oozyten
93
Geburtsdaten der Transferversuchen von Embryonen aus mit
gesexten Spermien injizierten und mit CaCl2 aktivierten, in vivo
gereiften Oozyten
94
Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien
147
Abbildungen
Abbildung 1: Möglichkeiten der Entstehung parthenogenetischer Embryonen
(nach KAUFMAN u. SACHS 1976)
19
Abbildung 2: Muster der Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i):
A: spermienabhängige Aktivierung; B: parthenogenetische Aktivierung
20
(modifiziert nach TESARIK et al. 1994)
Abbildung 3: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion - schematische Darstellung
30
Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Flowzytometeres zum Sortieren
von Säugerspermien
44
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Versuchsabläufe
48
Abbildung 6: Mikromanipulationseinheit
56
Abbildung 7: Bewegungsachsen des Mikromanipulators
57
Abbildung 8: Schematische Darstellung des „ICSI-Schälchens“ mit Spermienund Oozytentropfen
60
Abbildung 9: Intrazytoplasmatische Injektion eines Spermiums in eine gereifte
Oozyte (Polkörper auf sechs Uhr)
61
Abbildung 10: Zwei-Vorkern-Stadium nach Spermieninjektion und CaCl2-Aktivierung,
20 Stunden nach ICSI
66
Abbildung 11: Durchschnittliche Aktivierungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht
injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne CaCl2-Aktivierung
20 Stunden nach ICSI
73
Abbildung 12: Durchschnittliche Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten (%) spermien-,
kontroll- und nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne CaCl2Aktivierung 20 Stunden nach ICSI
73
Anhang
153
Abbildung 13: Durchschnittliche Aktivierungsraten (%) spermien-, kontroll- und nicht
injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne Ca2+-IonophorAktivierung (Ionoph.) 20 Stunden nach ICSI
76
Abbildung 14: Durchschnittliche Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten (%)
spermien-, kontroll- und nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit
und ohne Ca2+-Ionophor-Aktivierung (Ionoph.) 20 Stunden nach ICSI
76
Abbildung 15: Durchschnittliche Aktivierungsraten (%) spermien-, kontroll- und
nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne elektrische
Aktivierung (el. Akt.) 20 Stunden nach ICSI
79
Abbildung 16: Durchschnittliche Befruchtungs- bzw. Parthenogeneseraten (%) spermien-,
kontroll- und nicht injizierter, in vitro gereifter Oozyten mit und ohne
79
elektrische Aktivierung (el. Akt.) 20 Stunden nach ICS
Abbildung 17: Blastozysten aus in vitro gereiften, mit ungesexten Spermien injizierten
und mit CaCl2 aktivierten Oozyten, 168 Stunden nach ICSI
89
Abbildung 18: Blastozyste mit 19 Zellkernen aus einer mit einem ungesexten Spermium
injizierten und mit CaCl2 aktivierten Oozyte (168 Stunden nach ICSI);
Quetschpräparat nach Fluoreszenzfärbung mit Hoechst 33342
90
Abbildung 19: Blastozyste mit elf Zellkernen aus einer mit einem gesexten Spermium
injizierten, nicht aktivierten Oozyte (168 Stunden nach ICSI);
Quetschpräparat nach Fluoreszenzfärbung mit Hoechst 33342
90
Abbildung 20: Ultraschallbild der Trächtigkeit (Tag 22 nach ICSI) aus dem 4. Transfer
von Embryonen aus mit unsortierten Spermien injizierten und mit CaCl2
aktivierten, in vitro gereiften Oozyten (Pfeil weist auf einen Embryo in
einer Fruchtblase)
92
Abbildung 21: Ultraschallbild der Trächtigkeit (Tag 24 nach ICSI) des 4. Transfer von
mit gesexten, Y-chromosomalen Spermien injizierten und mit CaCl2
aktivierten, in vivo gereiften Oozyten
94
Abbildung 22: Fünf männliche „ICSI-Ferkel“ (ET 2), eine Woche nach der Geburt
95
Danksagung
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Ich danke besonders Herrn Prof. Dr. D. Rath für die Überlassung des Themas und die
große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit.
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Dem Leiter des Institutes für Tierzucht und Tierverhalten der FAL (Mariensee), Herrn Prof.
Dr. sc. agr. Dr. habil. Dr. h. c. F. Ellendorf, danke ich für die Bereitstellung des
Arbeitsplatzes.
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Mein ganz besonderer Dank gilt Frau A. Frenzel und Frau B. Sieg für die Einarbeitung und
die unermüdliche, tatkräftige Unterstützung im Bereich der Oozytengewinnung und
-kultivierung, der Bereitstellung des gesexten Spermas sowie für zahllose hilfreiche und
aufmunternde Ratschläge.
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Des weiteren bin ich Frau Dr. A. Lucas-Hahn und Frau E. Lemme sehr dankbar für viele
hilfreiche Anregungen und Lösungsvorschläge im Bereich der Mikromanipulation und der
Oozytenaktivierung.
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Frau Dr. S. Klocke und Frau. Dr. C. Krüger danke ich für die Einarbeitung in die ICSITechnik und den chirurgischen Embryotransfer beim Schwein.
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Frau Petra Hassel danke ich für ihre beständige, vielseitige Hilfe besonders bei der
Oozytengewinnung und den Operationen.
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Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung Biotechnologie des Institutes für
Tierzucht und Tierverhalten (Mariensee) der FAL für die freundliche Arbeitsatmosphäre
und die tatkräftige Unterstützung bedanken, besonders noch bei Herrn L. Schindler für die
Schlachthoffahrten, Herrn K.-G. Hadeler für die Narkosen und Superovulationen, Herrn R.
Poppenga für das Absamen von Bruno und Herrn D. Bunke für die Fotoarbeiten.
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Außerdem danke ich den Mitarbeitern der SVA Mariensee für die Unterstützung im Stall
und den Mitarbeitern des Schlachthauses für die Schlachtung der Schweine zur
Oozytengewinnung.
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Einen großen Dank an alle anderen Doktoranden für geteiltes Freud und Leid, besonders
an Andrea und Markus
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Ich danke ganz besonders herzlich Tappy für seine liebevolle Unterstützung während der
gesamten Zeit.
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Ein Dankeschön an alle anderen Freundinnen und Freunde für deren Hilfe und
Verständnis.
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Mein größter Dank gilt meinen Eltern, die mir jederzeit geduldige und uneingeschränkte
Hilfsbereitschaft entgegengebracht haben.