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In der vorliegenden Arbeit wurden vier Zellinien aus humanen Karzinomen von Prostata
(DU-145, PC-3, LNCaP) und Mamma (MFM-223) untersucht. Die Zellinien unterscheiden
sich hinsichtlich der Mutationen des Proteins p53 und der Androgen-Sensitivität. In den
Experimenten sollte verglichen werden, welche Auswirkungen die Mutationen des
Zellzyklus und Apoptose regulierenden p53 auf die Regulation der abhängigen Proteine
MDM2 ("murine double-minute chromosome-2") bzw. p21/WAF1 (p21/"wt-p53-activated
fragment 1") und auf das Wachstumsverhalten haben. Zudem sollte die Apoptose nach
Wachstumsfaktoren-Entzug
und
nach
der
Behandlung
mit
Androgenen
oder
Antiandrogenen überprüft werden.
In den Untersuchungen wurden dem Kultivations-Serum der Zellinien Wachstumsfaktoren entzogen oder die Hormone DHT (5α-Dihydrotesteron), E2 (2; 17 β Östradiol)
bzw. das steroidale Antiandrogen CPA (Cyproteronazetat) oder das nicht-steroidale CAS
(Casodex; chem. Bezeichnung Bicalutamid) zugesetzt. Die Prostatakarzinom-Zellinien
DU-145 und PC-3 exprimierten keine Androgen-Rezeptoren und sind daher nicht
androgenssensitiv. Die androgensensitive Zellinie LNCaP hingegen reagierte nach
Behandlung
mit
DHT
oder
dem
steroidalen
Antiandrogen
CPA
mit
einer
Wachstumssteigerung. Das nicht-steroidale Antiandrogen CAS hat dagegen das Wachstum
dieser Zellinie gehemmt. Während der Behandlung mit CAS ergab sich, daß der Gehalt an
p53 bei Hemmung der Proliferation von LNCaP Zellen mit stiller Mutation des Gens und
wt-Status des Proteins regelhaft anstieg (vergl. Abb. Z1, S. 122). Entsprechend zeigten die
Western-Blot
Analysen
eine
erhöhte
Menge
an
MDM2
und
p21.
Im
immunzytochemischen Nachweis von DNA-Fragmenten im TUNEL-Assay wurden
vermehrt apoptotische LNCaP Zellen nach Wachstumsfaktoren-Entzug oder nach
Behandlung mit CAS nachgewiesen. Western-Blot Analysen zeigten einen Anstieg des
proapoptotischen Proteins BAX und der Caspase 8 bei unverändertem Gehalt des antiapoptotischen Proteins BCL-2 (Abb. Z1, S. 122). Nach Kultivation der LNCaP Zellen in
Wachstumsmedium oder mit den proliferationsfördernden Substanzen DHT bzw. dem
steroidalen Antiandrogen CPA war der p53 Gehalt gering, ebenso wie die Menge von
MDM2 und p21 (Abb. Z1, S. 122). Im TUNEL-Assay wurden unter diesen positiven
Wachstumsbedingungen nur 1-1.5 % apoptotische Zellen nachgewiesen, und die Menge
der Apoptose assoziierten Proteine BAX und Caspase 8 war entsprechend gering.
Zellen der androgensensitiven Mammakarzinom-Zellinie MFM-223 reagierten nach
Zusatz von DHT mit Wachstumshemmung. Die Behandlung mit dem steroidalen
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Antiandrogen CPA führte dagegen zur Wachstumssteigerung der Zellen. Im Gegensatz
dazu bewirkte der Zusatz des nicht-steroidalen Antiandrogens CAS eine Verminderung der
Proliferation. Nach Hemmung des Wachstums durch Wachstums-faktoren-Entzug und
nach Behandlung mit DHT oder CAS wurden p53 und die p53-induzierbaren Proteine
MDM2 und p21 regelhaft hochreguliert, obwohl aus eigenen Sequenzanalysen erstmals
hervor ging, daß das Protein im Core-Anteil durch eine p53-Punktmutation in Codon 132
(K132R) verändert ist (vergl. Abb. Z1, S. 122). Demnach hat die p53-Mutation von MFM223 Zellen anscheinend keinen Einfluß auf die Funktionsfähigkeit von p53. Die Mutation
könnte allerdings nur ein Allel betreffen, und das p53 des verbleibenden Allels entspräche
dem Wildtyp-Status. In diesem Fall würde die wt-p53 Komponente die regulativen
Funktionen von p53 weiterhin aufrecht erhalten. Entsprechend war unter negativen
Wachstumsbedingungen durch Wachstumsfaktoren-Entzug und Zusatz von DHT oder
CAS die Anzahl der apoptotischen MFM-223 Zellen im TUNEL-Assay erhöht, und der
Gehalt von BAX und Caspase 8 nahm zu (Abb. Z1, S. 122). Die Menge des
antiapoptotischen BCL-2 erfuhr dagegen unter diesen Kultivationsbedingungen keine
Änderung. Unter optimalen Wachstumsbedingungen in 10 % FCS oder nach Stimulation
des Wachstums durch das Antiandrogen CPA waren p53 sowie MDM2 und p21 in
Western-Blot Analysen gering exprimiert. Zudem wurden unter diesen positiven
Wachstumsbedingungen nur 1-2 % apoptotische Zellen nachgewiesen, vergleichbar mit
der Apoptose-Inzidenz von 1-1.5 % unter optimalen Proliferationsbedingungen bei LNCaP
Zellen. Entsprechend war in MFM-223 Zellen der Gehalt der Apoptose relevanten Proteine
BAX und Caspase 8 bei stimuliertem Wachstum geringer als bei den entsprechenden
Kontrollansätzen mit LNCaP Zellen. Dennoch wird in diesen beiden Zellinien der Zelltod
offenbar durch p53 und die davon regulierten Proteine gesteuert.
Im Gegensatz dazu, stehen die Ergebnisse der Untersuchungen an den Androgenresistenten Zellinien DU-145 und PC-3. Die Zellinie DU-145 trägt Mutationen in den
Codons 223 und 274 des p53 Gens. Es wurden zwei p53-ähnliche Proteine der Größen von
ca. 45 bzw. 50 kD in diesen Zellen detektiert, die offenbar auf Grund einer veränderten
Halbwertzeit in DU-145 Zellen akkumulierten. Die Zellinie PC-3 exprimiert kein p53. Die
Proliferation beider Zellinien wird durch den Entzug von Wachstumsfaktoren im Vergleich
zu LNCaP oder MFM-223 Zellen in geringerem Ausmaß gehemmt. Zudem haben
Western-Blot Analysen der durch p53-regulierten Proteine MDM2 oder p21 gezeigt, daß
diese in DU-145 oder PC-3 Zellen entweder nicht exprimiert oder durch die Variation der
Wachstumsbedingungen bei DU-145 und PC-3 Zellen nicht reguliert wurden (vergl. Abb.
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Z2, S. 123). Weiterhin ergaben die Untersuchungen im TUNEL-Assay, daß der Entzug von
Wachstumsfaktoren keine Apoptose in DU-145 oder PC-3 Zellen auslöste, und demnach
ein Zelluntergang offenbar nicht durch p53 und durch die nachregulierten Proteine
vermittelt wird.
Das nicht-steroidale Antiandrogen CAS bewirkte eine doppelt so hohe Akkumulation
von p53 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle in den Androgen sensitiven LNCaP
und MFM-223 Zellen, von denen letztere durch steroidale Androgene antiproliferativ
beeinflußt werden, während LNCaP Zellen durch steroidale Substanzen wie DHT oder
CPA eine Steigerung des Wachstums erfuhren. Die Inzidenz von apoptotischen LNCaP
Zellen nach Behandlung mit CAS war mit 12 % im Vergleich zur Apoptose-Inzidenz nach
Entzug von Wachstumsfaktoren mit 7 % nahezu doppelt so hoch. Dies impliziert eine
spezielle Wirkungsweise von CAS auf p53 und den programmierten Zelltod in LNCaP und
MFM-223 Zellen, zu deren Klärung weitere Untersuchungen erforderlich sind.
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Zusätzliche Abbildungen der Zusammenfassung
Z1:
Übersicht der Ergebnisse zur Regulation von p53 und Apoptose nach Inhibition der
Proliferation von LNCaP Prostatakarzinomzellen und MFM-223 Mammakarzinomzellen durch Serumentzug oder Casodex bzw. Dihydrotestosteron (DHT).
Z2:
Verzögerte Proliferation und Ausbleiben der Apoptose bei Prostatakarzinomzellen
DU-145 und PC-3 bei Serumentzug.
fördernd,
hemmend,
aufgehoben,
indirekter
Funktionen:
Effekt, (-) Protein nicht nachweisbar. Rot: kein Effekt für die entsprechende
Reaktion.