Dokument_1.

Mechanismen der lytischen Reaktivierung des
Epstein-Barr Virus
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Anke Lang
aus Würzburg
2010
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
27. April 2010
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Winkler
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Gerald Niedobitek
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ............................................................................................................ 1
2. Summary ............................................................................................................................ 2
3. Einleitung ........................................................................................................................... 3
3.1 Das Epstein-Barr Virus, ein humanes Herpesvirus................................................... 3
3.2 Das EBV-Genom ........................................................................................................... 4
3.3 Die EBV-Infektion ......................................................................................................... 5
3.3.1 Die in vitro Infektion ................................................................................................. 6
3.3.2 Die in vivo Infektion ................................................................................................. 8
3.4 EBV-assoziierte Erkrankungen ................................................................................. 10
3.4.1 Die primäre EBV-Infektion ..................................................................................... 10
3.4.2 EBV-assoziierte Erkrankungen bei immunkomprimierten Individuen .................... 11
3.4.3 EBV-assoziierte Erkrankungen bei immunkompetenten Individuen ...................... 12
3.5 Die Reaktivierung von EBV ....................................................................................... 13
3.5.1 Die in vitro Reaktivierung....................................................................................... 13
3.5.2 Die in vivo Reaktivierung ....................................................................................... 14
3.6 Das „unmittelbar frühe“ Genprodukt BZLF1 ........................................................... 15
3.6.1 Das BZLF1 Protein ................................................................................................ 15
3.6.2 Der BZLF1 Promotor ............................................................................................. 16
3.7 Der Zelldifferenzierungsfaktor Blimp1 ..................................................................... 18
3.7.1 Aufbau und Funktion von Blimp1........................................................................... 18
3.7.2 Blimp1, ein Differenzierungsfaktor......................................................................... 20
3.7.3 Blimp1, ein Tumorsuppressor................................................................................ 21
3.8 microRNAs .................................................................................................................. 22
3.8.1 Aufbau und Prozessierung von microRNAs .......................................................... 22
3.8.2 Funktion von microRNAs ....................................................................................... 24
3.8.3 Virale microRNAs .................................................................................................. 25
3.8.4 EBV-kodierte microRNAs ...................................................................................... 26
4. Fragestellung ................................................................................................................... 28
I
Inhaltsverzeichnis
5. Ergebnisse ....................................................................................................................... 29
5.1 Differenzierungsabhängige Induktion von BZLF1 in Epithelzellen ....................... 29
5.1.1 Nachweis von Blimp1-Expression in differenzierten Epithelzellen ........................ 30
5.1.2 Nachweis der EBV-Infektion in oralen Haarleukoplakien ...................................... 32
5.1.3 Untersuchung zur Kolokalisation von Blimp1 und BZLF1 ..................................... 34
5.1.4 Untersuchung zur Blimp1-abhängigen Induktion von BZLF1 ................................ 36
5.1.5 Untersuchungen zur Blimp1-vermittelten Inhibierung des BZLF1-Repressors
ZEB1 ..................................................................................................................... 38
5.2 Untersuchung zur Inhibition der lytischen Reaktivierung von EBV durch die
virale miR-BHRF1-3.................................................................................................... 43
5.2.1 Untersuchung der miR-BHRF1-3 Expression in Zelllinien..................................... 44
5.2.2 Biochemische Verifizierung der miR-BHRF1-3-Bindung an den BZLF1-3´-UTR .. 46
5.2.3 Verifizierung von endogenem BZLF1 als Ziel der miR-BHRF1-3 in EBV-positiven
B-Zellen................................................................................................................. 52
5.2.4 Induktion des lytischen Zyklus durch Stimulation mit anti-IgM .............................. 58
6. Diskussion........................................................................................................................ 65
6.1 Replikative EBV-Infektion im differenzierten Plattenepithel von oralen
Haarleukoplakien........................................................................................................ 66
6.2 Blimp1-abhängige Induktion des BZLF1-Promotors Zp ......................................... 70
6.3 Einfluss der miR-BHRF1-3 auf die spontane lytische Reaktivierung von EBV .... 73
6.4 Einfluss der miR-BHRF1-3 auf die IgM-vermittelte Induktion der replikativen
EBV-Infektion.............................................................................................................. 76
7. Material und Methoden.................................................................................................... 79
7.1 Materialien................................................................................................................... 79
7.1.1 Chemikalien, Enzyme und Materialien .................................................................. 79
7.1.2 Antikörper .............................................................................................................. 79
7.1.3 Oligonukleotide...................................................................................................... 80
7.1.4 Radioaktive Isotope ............................................................................................... 81
7.1.5 Plasmide................................................................................................................ 82
7.1.6 Zelllinien ................................................................................................................ 83
7.1.7 Bakterien ............................................................................................................... 84
7.1.8 Geräte, Datenbanken und Software ...................................................................... 84
II
Inhaltsverzeichnis
7.2 Methoden..................................................................................................................... 85
7.2.1 Allgemeine Methoden............................................................................................ 85
7.2.2 Zellkultur ................................................................................................................ 85
7.2.2.1 Kultivierung von Zellen................................................................................... 85
7.2.2.2 Bestimmung der Zellzahl ............................................................................... 86
7.2.2.3 Einzelzellklonierung zur Gewinnung stabil transfizierter Zellklone ................ 86
7.2.2.4 Stimulation von B-Zellen mit anti-Immunglobulin-Antikörpern ....................... 86
7.2.3 Transfektion von Zellen ......................................................................................... 87
7.2.4 Luziferase-Versuche.............................................................................................. 88
7.2.5 Charakterisierung von Nukleinsäuren ................................................................... 88
7.2.5.1 Herstellung von cDNA aus RNA .................................................................... 88
7.2.5.2 Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) ......................................................... 89
7.2.5.3 DNA-Agarose Gelelektrophorese .................................................................. 89
7.2.5.4 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden............................................... 90
7.2.5.5 Northern-Blot-Analyse.................................................................................... 90
7.2.5.6 EBER-in-situ Hybridisierung .......................................................................... 93
7.2.6 Charakterisierung von Proteinen ........................................................................... 96
7.2.6.1 Präparation von Proteinextrakten .................................................................. 96
7.2.6.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ......................................................... 96
7.2.6.3 Western-Blot-Analyse .................................................................................... 97
7.2.6.4 Durchflusszytometrische Proteinanalyse ....................................................... 99
7.2.6.5 Proteinnachweis an Paraffinschnitten.......................................................... 100
7.2.7 Statistische Auswertung ...................................................................................... 101
8. Abkürzungen.................................................................................................................. 102
9. Literaturverzeichnis....................................................................................................... 105
10. Eigene Publikationen .................................................................................................. 127
11. Lebenslauf.................................................................................................................... 128
12. Danksagung ................................................................................................................. 129
III
1. Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Das Epstein-Barr Virus gehört zu den humanpathogenen Herpesviren und persistiert überwiegend in
latenter Form in Gedächtnis-B-Zellen. Eine Reaktivierung des lytischen Zyklus resultiert in einer
replikativen Infektion mit der Produktion von infektiösen Viruspartikeln und der Lyse der Wirtszelle. Der
Übergang von latenter zu lytischer Infektion erfolgt durch die Induktion des Transaktivators BZLF1.
Die Expression von BZLF1 führt zu einer kaskadenartigen Expression lytischer Virusgene und einem
Abschalten des latenten Expressionsprogramms. Die Aktivierung des BZLF1-Promotors Zp unterliegt
einer strikten Kontrolle durch zelluläre und virale Faktoren. Ein Eingriff in diese Kontrollmechanismen
stellt einen wichtigen Ansatz bei der Entwicklung von Therapieansätzen für EBV-assoziierte
Tumorerkrankungen dar.
In mehreren Studien mit latent infizierten Gedächtnis-B-Zellen wurde gezeigt, dass die Differenzierung
von B-Lymphozyten zu Plasmazellen mit einer lytischen Reaktivierung einhergeht. Das „B lymphocyte
induced maturation protein“ Blimp1 stellt einen wichtigen Transkriptionsfaktor bei der terminalen
Differenzierung von Lymphozyten und Epithelzellen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte
bei oralen Haarleukoplakien eine auf die differenzierten Zellen im Plattenepithel begrenzte Expression
von Blimp1 nachgewiesen werden. Ebenso wurde das lytische Protein BZLF1 nur in den
differenzierten Epithelzellen detektiert. Eine Doppelmarkierung der beiden Proteine zeigte, dass
BZLF1 nur in Blimp1-positiven Epithelzellen exprimiert wird. In Luziferase-Versuchen konnte in 293Tund HeLa-Zellen eine Blimp1-abhängige Induktion des BZLF1-Promotors Zp gezeigt werden. Dabei
erfolgte die Induktion durch den Repressor Blimp1 vermutlich indirekt. Eine Untersuchung des
Einflusses von Blimp1 auf den bekannten BZLF1-Repressor ZEB1 ergab, dass die ZEB1-Expression
nicht durch Blimp1 herunterreguliert wird.
Neben der Induktion des BZLF1-Promotors wurde im zweiten Teil der Arbeit die Hemmung der
BZLF1-Translation durch die virale miRNA miR-BHRF1-3 untersucht. Die miRNA wurde nur in
Zelllinien der Latenz III detektiert. Eine Ausnahme stellte hierbei die miRNA-negative lymphoblastoide
Zelllinie IM-9 (Latenz III) dar. In EBV-positiven B-Zelllinien konnte gezeigt werden, dass die
Expression der miRNA negativ mit der Expression von BZLF1 und dem späten Glykoprotein gp220
korreliert. Luziferase-Versuche zeigten eine Bindung der miR-BHRF1-3 an den 3´-UTR von BZLF1.
Anhand von stabil miR-BHRF1-3-transfizierten Zellen konnte eine miRNA-vermittelte Inhibierung der
BZLF1-Translation nachgewiesen werden. Die Induktion des lytischen Zyklus über anti-IgM-vermittelte
Aktivierung des B-Zell-Rezeptors resultierte in miR-BHRF1-3-exprimierenden Zellen in einer zeitlich
verzögerten aber deutlichen Induktion von BZLF1. Dies lässt vermuten, dass die miRNA eine
spontane lytische Reaktivierung unterbindet und nur eine ausreichende Stimulierung des B-ZellRezeptors die Induktion von BZLF1 zulässt. Die miRNA könnte somit einen viralen Faktor bei der
Etablierung und Erhaltung der persistenten EBV-Infektion darstellen.
1
2. Summary
2. Summary
Epstein-Barr virus, an oncogenic human herpesvirus, manifests two distinct lifestyles: latency
and lytic replication. In latent form of infection, EBV persists predominantly as a latent
infection in memory B cells. Induction of lytic infection results in virus replication and
production of infectious particles. The switch form latent to lytic infection is triggered by
induction of the transactivator BZLF1. Expression of BZLF1 is sufficient to activate the EBV
lytic cascade and to down-regulate the latency program. Activation of BZLF1 promotor Zp is
strictly controlled by cellular and viral factors. Interference with control mechanisms of lytic
reactivation is a possible therapeutic approach for EBV-associated malignancies.
In several studies of latently infected memory B cells, lytic reactivation was shown to coincide
with differentiation of B lymphocytes towards plasma cells. „B lymphocyte induced maturation
protein“ Blimp1 is an essential transcription factor for terminal differentiation of lymphocytes
and epithelial cells. In oral hairy leukoplakia, Blimp1 expression was limited to differentiated
squamous epithelial cells. Expression of the lytic protein BZLF1 was detected in the same
cell population. Double staining of both proteins revealed a restriction of BZLF1-expression
to Blimp1 positive epithelial cells. Luciferase assays in 293T and HeLa cells showed a
Blimp1-dependent induction of the BZLF1 promotor Zp. Since Blimp1 is described as a
transcriptional repressor, Blimp1-dependent BZLF1 induction likely occurs indirectly. Analysis
of the impact of Blimp1 on expression of the known BZLF1 repressor ZEB1 showed no ZEB1
down-regulation by Blimp1.
In the second part of this thesis, inhibition of BZLF1 translation by the viral miRNA miRBHRF1-3 was analysed. Except for the lymphoblastoid cell line IM-9 (latency III), miRBHRF1-3 expression was restricted to B cells with latency III pattern. A negative correlation
of miR-BHRF1-3 expression with expression of BZLF1 and the late glycoprotein gp220 was
observed in EBV positive B cell lines. The binding of miR-BHRF1-3 to the 3´-UTR of BZLF1
was verified by luciferase assays. Anti-IgM mediated B cell receptor activation resulted in
delayed but clear induction of lytic reactivation in miR-BHRF1-3 expressing cells. This
implies miRNA mediated inhibition of lytic reactivation without clear and sufficient B cell
receptor signalling. The viral miRNA may contribute to establishment and maintenance of
EBV persistence.
2
3. Einleitung
3. Einleitung
3.1 Das Epstein-Barr Virus, ein humanes Herpesvirus
Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist ein humanpathogenes Virus aus der Familie der
Herpesviridae. Herpesviren zählen bezüglich ihres Genoms und ihrer Morphologie zu den
größten und komplexesten Viren. Die Einteilung der Herpesviren erfolgt aufgrund der
Morphologie des Virions. Das lineare, doppelsträngige Genom befindet sich im Virus-Core
und ist von einem ikosaedrischem Kapsid (Proteinhülle) aus 162 Kapsomeren umgeben. Auf
das Kapsid folgen nach außen ein proteinreiches Kompartiment (Tegument) und eine
Hüllmembran (envelope) welche mit viralen Glykoproteinen (spikes) besetzt ist. Alle
Herpesviren etablieren eine lebenslange latente Persistenz im Wirt und können in den
lytischen Zyklus zur Virusreplikation übergehen. Bisher sind neun humanpathogene
Herpesviren (HHV) beschrieben: Herpes-simplex Virus 1 und 2 (HHV1, -2), Varicella-Zoster
Virus (HHV3), Epstein-Barr Virus (HHV4), Zytomegalievirus (HHV 5), humane Herpesviren
6A, -6B und -7, sowie das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (HHV8) [1].
Das Epstein-Barr Virus gehört zu der Unterklasse der γ-Herpesviren und zum Genus der
Lymphokryptoviren. Die Entdeckung des EBV ist eng mit der Erforschung des Burkitt
Lymphoms verbunden. In den 1950er Jahren beschrieb der britische Arzt Denis Burkitt eine
in Äquatorialafrika weitverbreitete B-Zell-Tumorerkrankung bei Kindern. Zuerst wurde eine
Infektionserkrankung als Ursache vermutet, da die Lymphome mit dem Auftreten von Malaria
korrelierten. Im Jahr 1964 gelang es sowohl Epstein und Barr als auch Pulvertaft erstmals
Burkitt-Lymphom-Zellen aus Tumorbiopsien zu kultivieren [2, 3]. Noch im selben Jahr
konnten Epstein, Barr und Achong in den kultivierten Zellen elektronenmikroskopisch
Viruspartikel nachweisen, die morphologisch zu den Herpesviren gehörten [4]. Das Ehepaar
Henle zeigte durch serologische Tests, dass es sich bei dem entdeckten Virus um ein neues
humanes Herpesvirus handelt [5]. Das Virus wurde nach seinen Entdeckern Epstein-Barr
Virus genannt. In den folgenden Jahren konnte erstmals gezeigt werden, dass humane BLymphozyten durch Infektion mit EBV zu unbegrenztem Wachstum angeregt werden können
[6, 7]. Somit war das erste humane Tumorvirus entdeckt.
3
3. Einleitung
3.2 Das EBV-Genom
Das Genom des EBV-Stammes B95-8 war das erste Herpesvirusgenom, das vollständig
kloniert [8-10] und sequenziert [11] wurde. Das Genom hat eine Länge von etwa 172000
Basenpaaren und enthält ungefähr 100 offene Leseraster (open reading frame, ORF). Die
Sequenzierung des EBV-Genoms basiert auf einer Bibliothek aus BamHI-Fragmenten. Aus
diesem Grund sind die EBV-Gene oft nach dem korrespondierenden BamHI-Fragment
benannt [11]. Zum Beispiel steht BZLF1 für den ersten offenen Leseraster in linker
Orientierung im BamHI-Z-Fragment (BamHI Z Leftward open reading Frame 1).
TR
US
oriP
UL
IR
oriLyt
TR
oriLyt
Abbildung 1: Schematische Darstellung des linearen EBV-Genoms. Abkürzungen: TR, TandemRepetitionen; US / UL, kurzer (s) uns langer (L) „unique“ Abschnitt; oriP, Replikationsursprung Latenz; oriLyt,
lytischer Replikationsursprung; IR, interne Repetitionen.
Das EBV-Genom liegt im Viruspartikel als lineare doppelsträngige DNA vor und besitzt
folgende charakteristische Strukturen (Abbildung 1): An den beiden Genomenden befinden
sich je 0,5 kb große terminale Tandem-Repetitionen (TR). Das Genom wird von internen
Repetitionen (IR) aus 6 bis 12 Einheiten von je 3,1 kb in einen kurzen und einen langen
„unique“ Abschnitt (US und UL) unterteilt. Nach der Infektion zirkularisiert die lineare DNA
über die TR-Bereiche und gelangt als episomale DNA in den Zellkern [1, 12]. Die Anzahl der
TRs in jedem linearen Genom variiert. Das zirkularisierte Episom hält die Anzahl der TRs in
latent infizierten Zellen während der episomalen Replikation konstant. Die Anzahl der TRs
dient somit als Marker der viralen Klonalität in EBV-infiziertem Gewebe [12]. Während der
latenten Infektion mit EBV erfolgt die Replikation der viralen DNA parallel zur DNAReplikation der Wirtszelle durch die zelluläre DNA-Polymerase [13]. Aus diesem Grund ist
EBV während der latenten Phase nicht durch anti-virale Medikamente, wie z.B. Acyclovir, zu
therapieren. Die virale Replikation setzt hierbei am Replikationsursprung oriP ein. In der
lytischen Phase wird die DNA ausgehend von den zwei lytischen Replikationsursprüngen
oriLyt repliziert. Die Replikation des Episoms verläuft hierbei nach dem Mechanismus der σReplikation („rolling circle“) und benötigt die virale DNA-Polymerase [14].
4
3. Einleitung
Einige Virusstämme haben in vitro Deletionen im Genom erworben. Das P3HR1-Virus weist
zum Beispiel eine 6,6 kb große Deletion im Bereich der Gene des EBV nukleären Antigens
EBNA2 und Teilen von EBNA-LP („leader protein“) auf. P3HR1 hat die Fähigkeit B-Zellen zu
transformieren verloren [15, 16].
3.3 Die EBV-Infektion
Das Epstein-Barr Virus zeigt den für Herpesviren typischen Infektionsverlauf von latenter
Infektion und lytischem Zyklus (Abbildung 2). Während der latenten Infektion repliziert das
Virusgenom mit der zellulären DNA und wird an die Tochterzelle weitergegeben. Es kommt
nur zur Expression sogenannter Latenzgene und zu keiner Produktion infektiöser
Viruspartikel.
DNA-Replikation mit Wirtszelle
Latenz
Virus Persistenz
externe Stimuli, z.B. anti-Ig
endogene Stimuli, z.B. Differenzierung
Lytischer Zyklus
direkte Aktivierung durch
Signaltransduktion
Keine infektiösen Viruspartikel
Unmittelbar frühe Gene
(BZLF1)
Acyclovir
Expression wird durch die
unmittelbar frühen Gene
induziert
Frühe Gene
Lytische DNA-Replikation
Acyclovir
Expression sensitiv auf
Inhibitoren der lytischen
DNA-Replikation, wie
z.B: Acyclovir
Späte Gene
Infektiöse Viruspartikel
Abbildung 2: Schematische Darstellung einer EBV-Infektion mit latenter Phase und lytischem Zyklus.
Nach Induktion des lytischen Zyklus wird die Expression der lytischen Gene über eine
Kaskade von unmittelbar frühen, frühen und späten Proteinen eingeleitet. Es kommt zur
Produktion und Freisetzung infektiöser Viruspartikel und somit zur Verbreitung des Virus [1,
17].
5
3. Einleitung
3.3.1 Die in vitro Infektion
Epstein-Barr Virus kann in vitro primäre humane B-Zellen infizieren und zu kontinuierlichem
Wachstum anregen. Es entstehen sogenannte lymphoblastoide Zelllinien (LCLs), die
unbegrenzt proliferieren. Das Wirtsspektrum der in vitro Infektion umfasst B-Lymphozyten
aus allen Kompartimenten und in allen Entwicklungsstadien, von pro-B-Zellen bis
Gedächtnis-B-Zellen, mit Ausnahme ausdifferenzierter Plasmazellen [6, 7, 18]. LCLs können
auch aus B-Lymphozyten des peripheren Bluts von EBV-seropositiven Personen ohne
Zugabe von exogenen Viruspartikeln entstehen [19]. EBV-immortalisierte LCLs weisen einen
lymphoblastoiden Phänotyp auf und sind durch die Expression aller latenten Gene
charakterisiert. Lymphoblastoide Zelllinien dienen als in vitro Modell zur Untersuchung der
EBV-Infektion und der EBV-induzierten Transformation in B-Lymphozyten. Die Form der
EBV-Infektion wird hierbei als Latenz III oder auch Wachstumsprogramm bezeichnet. Die
exprimierten Gene kodieren für sechs EBV-nukleäre Antigene (EBNA1, -2, -3A, -3B, -3C,
LP), drei latente Membranproteine (LMP1, -2A, -2B), zwei kleine, nicht polyadenylierte, und
somit nicht kodierende RNA-Moleküle („EBV-encoded RNAs“, EBER1, -2) und Transkripte
der BamHI A Region („BamHI A Rightward Transcripts“ BARTs) [20-22]. BARTs können in
allen LCLs der Latenz III , BL-Zelllinien der Latenz I und III und in NPCs nachgewiesen
werden, aber es ist umstritten ob diese mRNAs für Proteine kodieren [20, 23, 24].
Für die Transformation der B-Zellen sind vier Gene der Latenz III, EBNA2, -3A, -3C und
LMP1, essentiell [25-29]. EBNA-LP und LMP2A, -2B und EBERs verbessern die
Transformationseffizienz [26, 30-34], EBNA3B und BARTs haben keinen Einfluss auf die
Transformation [35]. Die Funktion von EBNA1 bei der Immortalisierung von B-Zellen wird
noch kontrovers diskutiert [36, 37]. Wobei keines der latenten Genprodukte allein die
Fähigkeit besitzt B-Lymphozyten zu transformieren. In konditionellen in vitro Systemen
konnte durch gezieltes an- oder abschalten der latenten Gene gezeigt werden, dass die BZell-Immortalisierung ein reversibler Prozess in LCLs ist. Dies steht im Kontrast zu
Untersuchungen in EBV-assoziierten Tumorzelllinien, welche durch eine Häufung von
irreversiblen genetischen Veränderungen charakterisiert sind. Daher ist die Bezeichnung
Immortalisierung von B-Zellen durch EBV in vitro treffender als der Begriff Transformation.
In LCLs mit dem Genexpressionsmuster der Latenz III startet die Transkription aller EBNAGene von den Promotoren Cp und Wp, welche in kurzen Abständen in den BamHIFragmenten C und P lokalisiert sind. Aus dem bis zu 100 kb großen EBNA-Primärtranskript
entstehen durch komplexe differentielle Spleißvorgänge die sechs EBNA-Transkripte [38].
6
3. Einleitung
EBNA1 ist ein DNA-bindendes Kernprotein, das durch die Bindung an den latenten
Replikationsursprung oriP („origin of replication“) im Episom die Rekrutierung des zellulären
„origin of recognition complex“ (ORC) die Replikation der episomalen DNA vermittelt [13, 39].
Zudem ist EBNA1 für die Erhaltung des viralen Episoms während der Zellteilung
verantwortlich [13, 40]. EBNA1 ist durch eine interne Glycin-Alanin-Wiederholungsdomäne
gekennzeichnet, die den proteosomalen Abbau des Proteins und somit eine MHC-Klasse-Iabhängige Antigen-Präsentation verhindert [41]. Als Folge wird die immunogene Wirkung
von EBNA1 blockiert und zusätzlich die Halbwertszeit des Proteins erhöht [42, 43].
Zusätzlich interagiert EBNA1 mit zwei Bindestellen downstream des Qp Promotors (Latenz I
und III), was zu einer negativen Regulation der eigenen Expression in verschiedenen
Tumorerkrankungen führt [44]. Im Gegensatz dazu ist EBNA1 ein transkriptioneller
Transaktivator der Cp und LMP1 Promotoren.
EBNA2 ist ein phosphoryliertes Protein und wirkt als Transaktivator viraler und zellulärer
Gene. Es induziert die Transkription der viralen Gene LMP1, LMP2A und LMP2B [45-47] und
aktiviert den viralen Promotor Cp. Dies führt zu einem Wechsel der Transkription vom Wp
zum Cp Promotor [48]. EBNA2 induziert beispielsweise auch die Transkription der B-ZellAktivierungsmarker CD21 und CD23 [49-51] und der Proto-Onkogene c-fgr [52] und c-myc
[53]. EBNA2 ist ein ungewöhnlicher Transaktivator, der nicht direkt, sondern durch
Interaktion
mit
dem
ubiquitären
zellulären
Transkriptionsfaktor
RBP-Jκ
(Rekombinationssignal-Bindeprotein-Jκ) an die Promotorsequenzen bindet [54, 55]. Da RBPJκ eine Komponente des Notch1 Signaltransduktionswegs ist, wird EBNA2 als funktionelles
Äquivalent des aktivierten Notch-Rezeptors betrachtet [56, 57]. Das Protein EBNA-LP ist ein
Ko-Aktivator von EBNA2 und verstärkt dessen Wirkung [58].
Die drei Mitglieder der EBNA3–Familie sind an der Transkriptionsregulation beteiligt und
ebenfalls in der Lage an den Transkriptionsfaktor RBP-Jκ zu binden. Somit konkurrieren die
EBNA3 Proteine mit EBNA2 um die Komplexbildung mit dem Transkriptionsfaktor und wirken
als Gegenpart zur EBNA2-vermittelten Transkription [59]. Die EBNA3 Protein-Familie hat
zusätzlich noch vielfältige Funktionen. So ist beispielsweise EBNA3A für die initialen Schritte
der B-Zell-Immortalisierung nötig [28]. EBNA3B induziert das Cytosklett-Protein Vimentin und
den B-Zell-Aktivierungsmarker CD40 [60]. EBNA3C interagiert mit der zellulären HistonDeacetylase I [61].
Die LMP-Proteine besitzen Transmembrandomänen und sind in der Plasmamembran latent
infizierter B-Zellen lokalisiert [62, 63]. LMP1 Expression in vitro resultiert in einer
permanenten Aktivierung verschiedener Signaltransduktions-Kaskaden. Dabei verhält sich
7
3. Einleitung
LMP1 wie ein konstitutiv aktivierter Rezeptor und agiert unabhängig von extrazellulären
Signalen [64]. LMP1 wird als virales Äquivalent des CD40-Rezeptors betrachtet. Seine
Expression führt somit zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB und dessen
Zielgenen [65-67]. Zusätzlich aktiviert LMP1 die Signaltransduktionswege p38 MAPK (p38
Mitogen-aktivierte Proteinkinase), JNK/AP1 (c-jun N-terminale Kinase) und über JAK3
(Janus Kinase 3) den Transkriptionsfaktor STAT3 („signal transducer and activator of
transcription 3“) [68-70]. Die onkogene Wirkung von LMP1 bei der Immortalisierung von BZellen beruht teilweise auf der Aktivierung anti-apoptotischer Gene wie bcl-2 und A20 über
NF-κB [71, 72]. Weder LMP2A noch LMP2B sind für die Transformation latent infizierter BZellen in vitro essentiell [32]. Der cytoplasmatische Teil von LMP2A besitzt ITAM-Motive
(„immunoreceptor tyrosine based activation motif“) die mit Phosphotyrosinkinasen (PTK) der
Src-, und Syk-Familien interagieren [73-75]. Die Phosphorylierung der ITAM-Motive und die
darauf folgende Rekrutierung der PTKs haben auch bei der Singnaltransduktion durch den
B-Zell-, und T-Zell-Rezeptor eine wichtige Funktion [76]. Die Bindung der PTKs an
phosphorylierte ITAM-Motive von LMP2A kann die normale Signalaktivierung durch den BZell-Rezeptor abschwächen bzw. sogar blockieren. LMP2A kann den B-Zell-Rezeptor in der
B-Zellentwicklung ersetzen und einen konstitutiv aktiven B-Zell-Rezeptor imitieren [77, 78].
LMP2B wird eine Rolle als negativer Regulator der LMP2A Funktion zugesprochen [79].
3.3.2 Die in vivo Infektion
Die Infektion mit Epstein-Barr Virus erfolgt in vivo über den Speichel [80] . Daher ist die
primäre Infektion mit EBV und eine daraus entstehende infektiöse Mononukleose (IM) auch
unter dem Begriff „kissing disease“ bekannt. Die Viruspartikel gelangen über den Speichel in
die Mundhöhle. Im frühen Verlauf einer primären Infektion werden B-Lymphozyten mit EBV
infiziert. Es ist bislang nicht geklärt, ob das Virus direkt B-Lymphozyten infiziert oder ob die
primäre Infektion in den Epithelzellen der Mundhöhle beginnt. Der Mechanismus der in vivo
Infektion von B-Zellen wurde bereits eingehend untersucht. Die Infektion startet hierbei über
Interaktionen des viralen Glykoproteins BLLF1 (gp 350/220) in der Virushülle mit dem
zellulären Oberflächenprotein CD21, auch Komplementrezeptor 2 (CR2) genannt [81, 82].
Das Viruspartikel wird durch anschließende rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle
aufgenommen. Dort löst sich die Kapsidhülle des Virus auf, das freigesetzte lineare
Virusgenom zirkularisiert im Zellkern und wird mit zellulärem Chromatin verpackt [83-85].
Während der frühen Phase der Infektion nutzt EBV das Infektionsprogramm des lytischen
Zyklus, in dem es zur Produktion infektiöser Viruspartikel kommt, um eine Vielzahl
zirkulierender B-Zellen in den Tonsillen und Lymphknoten zu infizieren [86, 87]. Es folgt eine
8
3. Einleitung
latente Infektion der B-Zellen mit dem Wachstumsprogramm (Latenz III). Hierbei kommt es
zur Expression aller viralen Latenzgene, was zur Aktivierung und Proliferation der infizierten
Zellen führt (vgl. LCLs 3.3.1) [88, 89]. In der akuten Phase der Primärinfektion können in IMPatienten 0,1-1 % der peripheren B-Zellen mit dem Virus infiziert sein [90]. Die latenten
viralen Antigene in den proliferierenden Zellen und die Antigene der lytischen Phase rufen
eine starke zytotoxische T-Zellantwort des Immunsystems hervor [91]. Eine daraus
resultierende massive Expansion EBV-spezifischer CD8+ T-Zellen und die Freisetzung von
Zytokinen verursachen sowohl das veränderte Blutbild als auch die typischen Symptome der
infektiösen Mononukleose [92, 93]. Die zytotoxische T-Zellantwort führt aber auch zur
Kontrolle des Immunsystems über die EBV-Infektion durch Eliminierung der EBV-infizierten
B-Zellen [93]. Das Immunsystem ist aber nicht in der Lage alle EBV-infizierten B-Zellen im
Körper zu eliminieren. In einigen entwickelt sich eine lebenslange Persistenz des Virus. Es
wird
diskutiert,
dass
EBV
in
diesen
Zellen
durch
ein
stark
eingeschränktes
Genexpressionsmuster, der sogenannten Latenz 0, der Immunkontrolle entgehen kann [94,
95]. In dieser Latenzform kann in einigen Zellen das latente Membranprotein LMP2A
nachgewiesen werden (Tabelle 1). Zu diesem Zeitpunkt sind im Gegensatz zur akuten
Primärinfektion nur noch 1 x 10-6 der B-Zellen mit dem Virus infiziert [91]. Durch bislang noch
unbekannte Stimuli erfolgt von Zeit zu Zeit in einigen Zellen eine spontane Reaktivierung des
Virus.
Dies
führt
zur
Freisetzung
von
Viruspartikeln
im
Oropharynx-Epithel,
zur
Virusausscheidung über den Speichel und somit zur Weiterverbreitung in der Bevölkerung
[96].
Latenz
Erkrankung
EBERs
EBNA1
EBNA2
EBNA3s
EBNA-LP
LMP1
LMP2s
0
IM
+
-
-
-
-
-
(+)
I
BL
+
+
-
-
-
-
-
II
HL
+
+
-
-
-
+
+
III
PTLDs
+
+
+
+
+
+
+
Tabelle 1: Genexpressionsmuster der Latenzformen. IM: infektiöse Mononukleose, BL: Burkitt Lymphom,
HL: Hodgkin Lymphom, PTLD: post-transplantional lymphoproliferative disorder, + Expression des Proteins;
- keine Expression des Proteins.
Latent infizierte Zellen zeigen in vivo vier Varianten im Expressionsmuster der neun
bekannten Latenzproteine, EBV-nukleäre Antigene (EBNA1, -2, -3A, -3B, -3C, LP) und
latente Membranproteine (LMP1, -2A, -2B) [20]. Zwei kleine nicht kodierende RNA-Moleküle
9
3. Einleitung
(„EBV-encoded RNAs“, EBER1, -2) können in allen Formen der EBV-Infektion nachgewiesen
werden [97]. Die verschiedenen Latenzformen sind in Tabelle 1 dargestellt. In der Latenz III
werden die EBNAs von den Promotoren CP und Wp transkribiert, wohingegen in der Latenz I
und II nur die Transkription der monocistronischen EBNA1 mRNA vom Promotor Qp erfolgt
[98].
Im Gegensatz zu B-Lymphozyten ist die Interaktion von EBV mit Epithelzellen noch kaum
verstanden. Ursprünglich ging man davon aus, dass der Viruseintritt bei Epithelzellen
ebenfalls über die Interaktion des viralen Glykoproteins gp350/220 mit dem zellulären
Oberflächenrezeptor CD21 erfolgt. In einigen in vitro Experimenten konnten Epithelzellen
nach ektopischer CD21 Expression erfolgreich infiziert werden. Man vermutet in vivo eine
sehr geringe endogene CD21 Expression auf Epithelzellen [99, 100]. Aber es konnte gezeigt
werden, dass EBV-Mutanten ohne das Glykoprotein gp350/220 immer noch sowohl
Epithelzellen als auch B-Zellen, wenn auch mit reduzierter Effizienz, infizieren [101]. Diese
Beobachtungen deuten darauf hin, dass noch andere zelluläre und virale Moleküle eine Rolle
bei der Adsorption des Virus an die Zellmembran spielen [101]. Bei Epithelzellen konnte eine
erfolgreiche Infektion über die Interaktion des lytischen Membranproteins BMRF2 auf der
Oberfläche von EBV-infizierten Zellen mit dem zellulären Integrin α5β1 gezeigt werden [102,
103]. In einigen Experimenten wurde auch eine effiziente Infektion durch Ko-Kultivierung
infizierter B-Zellen mit Epithelzellen beobachtet. Dies deutet auf eine mögliche Bedeutung
von Zell-Zell-Kontakten für eine erfolgreiche Infektion von Epithelzellen hin [103, 104].
3.4 EBV-assoziierte Erkrankungen
3.4.1 Die primäre EBV-Infektion
Das Epstein-Barr Virus ist ein weitverbreitetes humanes Herpesvirus, das weltweit in über 90
% der Bevölkerung persistiert. Eine primäre Infektion während der frühen Kindheit verläuft
meist asymptomatisch. Eine primäre EBV-Infektion bei Jugendlichen und Erwachsenen
hingegen verursacht oft eine infektiöse Mononukleose. Die Erkrankung ist auch als
Pfeiffersches Drüsenfieber, benannt nach ihrem Entdecker Emil Pfeiffer, bekannt [105].
Hierbei handelt es sich um eine selbst-limitierende lymphoproliferative Erkrankung mit
Symptomen
wie
z.B.
Fieber,
Lymphknotenschwellung,
Vergrößerung
der
Milz
(Splenomegalie) und Entzündung des Rachenraums [106]. Die Symptome werden durch
eine massive Proliferation der infizierten B-Lymphozyten und einer daraus resultierenden
starken T-Zellaktivierung verursacht [92, 93]. Im peripheren Blut finden sich die
10
3. Einleitung
namengebenden atypischen mononukleären Zellen. Nach der primären Infektion etabliert
das Virus eine lebenslange latente Infektion in zirkulierenden Gedächtnis-B-Zellen.
Die persistierende Infektion ist in den meisten Fällen asymptomatisch, kann aber mit der
Entwicklung von Virus-assoziierten Tumoren einhergehen. Die einzelnen Erkrankungen
unterscheiden sich unter anderem in ihrer Korrelation mit EBV und ihrem viralen
Genexpressionsmuster (Latenz Typ). Die Tumore können dabei sowohl in gesunden als
auch in immunkomprimierten Individuen auftreten.
3.4.2 EBV-assoziierte Erkrankungen bei immunkomprimierten Individuen
Die Rolle des Immunsystems bei der Kontrolle der persistierenden EBV-Infektion wird
besonders durch die EBV-induzierte B-Zellproliferation bei Personen mit genetischer oder
erworbener Immunschwäche deutlich. Hier kommt es aufgrund der geschwächten
Immunabwehr zu einem Verlust der Wachstumskontrolle EBV-infizierter Zellen.
So besitzen Transplantationspatienten ein erhöhtes Risiko eine lymphoproliferative
Erkrankung („posttransplant lymphoroliferative disorder“, PTLD) zu entwickeln. Das Risiko
korreliert mit der Stärke der Immunsuppression [107-109]. PTLDs beinhalten ein breites
Spektrum an Erkrankungen, die meist B-lymphoproliferativ und EBV-assoziiert sind. Die
Erkrankung kann polyklonal oder monoklonal sein. Wobei sich die monoklonalen Lymphome
nicht von Lymphomen in nicht-immunsuppremierten Patienten unterscheiden lassen [107].
Polyklonale, polymorphe PTLDs weisen überwiegend eine EBV Latenz Typ III, mit leichten
Variationen auf Einzelzellebene, auf [110]. Bei monoklonalen Lymphomen liegt das Virus in
Latenzen des Typs I oder III vor [111] (Tabelle 1).
AIDS-Patienten weisen ebenfalls ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung EBV-assoziierter
Tumore auf. Die auftretenden Tumore bilden eine heterogene Gruppe aus primären
Lymphomen des zentralen Nervensystems (ZNS) [112], diffusen großzelligen B-Zell
Lymphomen („diffuse large B cell lymphoma“, DLBCL) und dem Burkitt-Lymphom [113].
Wobei DLBCLs und ZNS-Lymphome meist EBV-assoziiert sind und eine Viruslatenz des
Typs II oder III aufweisen. Burkitt Lymphome bei AIDS-Patienten zeigen dagegen eine
geringere Frequenz von EBV-Infektionen (30 - 50 %), welche eine Latenz vom Typ I besitzen
[113, 114].
11
3. Einleitung
Die orale Haarleukoplakie (OHL) ist eine Läsion des Plattenepithels am Zungenrand bei
AIDS-Patienten, bei der das Virus nur im lytischen Zyklus nachweisbar ist [115, 116]. Die
virale Replikation findet in den differenzierten Zellschichten des Plattenepithels statt [117].
3.4.3 EBV-assoziierte Erkrankungen bei immunkompetenten Individuen
Burkitt Lymphom, Hodgkin Lymphom und Nasopharynxkarzinom sind die drei häufigsten
EBV-assoziierten Erkrankungen in immunkompetenten Individuen. Da sie oft erst Jahre nach
einer primären Infektion mit EBV auftreten, ist die EBV-Infektion nur ein Faktor in einem
komplexen Prozess bei der Entwicklung dieser Erkrankungen.
Burkitt Lymphome (BL) leiten sich von B-Zellen des Keimzentrums ab [118-120] und treten in
drei Formen mit unterschiedlich starker EBV Assoziation auf. Das endemische BL ist eine
weitverbreitete Krebserkrankung bei Kindern in Äquatorialafrika und zu 100 % mit EBVassoziiert [121]. In westlichen Industrieländern tritt das BL in sporadischer Form auf und ist
nur zu 15 – 30 % mit EBV-assoziiert [122]. Eine dritte Form des BLs kommt bei Personen mit
Immundefizienzen, vor allem bei AIDS-Patienten, vor und zeigt ein Assoziation mit EBV von
30 – 50 % [113, 114]. Allen drei Formen gemeinsam ist eine Chromosomentranslokation, die
das Proto-Onkogen c-myc von Chromosom 8 in einen Immunglobulin-Lokus auf Chromosom
2, 14 oder 22 versetzt und dereguliert [123, 124]. Das virale Genom liegt bei EBVassoziierten BL als monoklonales Episom vor und die Expression der viralen Latenzgene
beschränkt sich auf die EBERs und EBNA1. EBV liegt in BL-Biopsien somit in der Latenz I
vor [12, 125]. Allerdings zeigen die meisten aus Tumorbiopsien etablierten BL-Zelllinien nach
mehrmaliger Passage in vitro einen Wechsel vom latenten Genexpressionsmuster Typ I zu
Typ III [126, 127]. Der Zusammenhang von c-myc Translokation und EBV-Infektion bei der
Entstehung von BL ist bislang noch nicht aufgeklärt.
Hodgkin Lymphome (HL) werden durch das Vorkommen von einkernigen Hodgkin-Zellen
und mehrkernigen Reed-Sternberg-Zellen (HRS) charakterisiert. Histologisch werden zwei
Haupttypen von HL unterschieden, das klassische HL (cHL) und das noduläre
lymphozytenprädominate HL (nlpHL). Die Einteilung erfolgt aufgrund der Morphologie der
Tumorzellen und den übrigen infiltrierten Zellen. Das cHL besitzt einkernige Hodgkin- oder
Reed-Sternberg-Zellen (HRS-Zellen), während die Tumorzellen des nlpHL als L&H(„lymphocytic and histocytic“) oder Popcorn-Zellen bezeichnet werden. Das cHL wird
wiederum in vier Untergruppen eingeteilt, das nodulär-sklerosierende HL (cHLns), das
gemischtzellige HL (cHLmc), das lymphozytenreiche HL (cHLlr) und die lymphozytenarme
12
3. Einleitung
Form (cHLld). Das cHL leitet sich überwiegend von B-Zellen und zum kleinen Teil von TZellen ab. Das nlpHL stammt ausschließlich von B-Zellen des Keimzentrums ab [128-130]. In
westlichen Ländern kann EBV in 20 -50 % der HRS-Zellen beim cHL nachgewiesen werden.
Wohingegen eine fast 100 % -ige Assoziation mit dem Virus in Entwicklungsländern
beobachtet wird [131]. Die EBV-Assoziation der HL Erkrankung ist abhängig vom Alter der
Person. HL bei Kindern zeigt eine starke Assoziation mit EBV und ältere Menschen weisen
nur eine EBV-Assoziation von ca. 60 % auf. Bei jungen Erwachsenen dagegen tritt das HL
unabhängig von einer EBV-Infektion auf [132]. Das EBV-Genom liegt in HL als monoklonales
Episom vor und die Expression der viralen Latenzgene LMP1, LMP2A ist als Kennzeichen
für den Latenztyp II zusätzlich zu den latenten Genen EBNA1 und EBERs nachweisbar [133136] (Tabelle 1).
Das Nasopharynxkarzinom (nasopharyngeal carcinoma, NPC), ein epithelialer Tumor des
Nasen-Rachen-Raumes, der endemisch überwiegend bei Männern in Südostasien und
Nordafrika und sporadisch in Westeuropa und Nordamerika auftritt [137]. NPCs werden in
zwei Hauptgruppen eingeteilt, keratinisierendes und nicht-keratinisierendes Karzinom. Wobei
letzteres noch in differenzierte und undifferenzierte Subtypen unterschieden wird. Die
Assoziation mit EBV von undifferenzierten NPCs beträgt 100 % und das Virusgenom liegt als
monoklonales Episom vor [12, 138]. Das virale Genexpressionsmuster entspricht einer
Latenz des Typs II. Die EBV-Assoziation bei den restlichen Formen des NPC ist geringer
und mit der bei Burkitt Lymphomen vergleichbar [137, 139]. Neben der EBV-Infektion spielen
wahrscheinlich Umweltfaktoren, Ernährung und die genetische Prädisposition eine Rolle bei
der Karzinogenese [140].
3.5 Die Reaktivierung von EBV
3.5.1 Die in vitro Reaktivierung
Für in vitro Untersuchungen der EBV-Infektion stellen lymphoblastoide Zelllinien (LCLs) das
meist genutzte System dar. Das Epstein-Barr Virus zeigt aber in LCL-Kulturen oft eine stabile
latente Infektion. Die Expression des kompletten latenten Genprogramms (Latenz III)
verhindert eine Induktion des lytischen Zyklus [79]. Eine spontane Aktivierung des lytischen
Zyklus erfolgt nur in einem sehr kleinen Teil der Zellen. Hingegen kann in einigen BLZelllinien mit der Latenz I in vitro eine effiziente Stimulation der lytischen Reaktivierung
erreicht werden. Besonders gut eignen sich hierbei Akata-Zellen, da sie in vitro eine stabile
Latenz I Expression aufweisen [141]. Andere Latenz I BL, wie z.B. Mutu I, unterlaufen in
13
3. Einleitung
Kulturbedingungen oft einen Wechsel zur Latenz III (Mutu III). Ein häufig verwendeter
Stimulus
des
lytischen
Zyklus
sind
anti-Immunglobulin
(Ig)-Antikörper
[142].
Die
Reaktivierung von EBV erfolgt hierbei durch die anti-Ig-Antikörper-induzierte Quervernetzung
und somit der Aktivierung des B-Zell-Rezeptors (BCR) [142, 143]. Diese Form der
Reaktivierung imitiert die Aktivierung des BCR durch Antigen-Bindung. Die latent infizierten
Gedächtnis-B-Zellen differenzieren aufgrund der BCR-Stimulation zu Plasmazellen, was mit
der Aktivierung des lytischen Zyklus einhergeht. Alternativ kann der lytische Zyklus in vitro
durch Phorbolester (TPA) [144], Butyrate [145], Calcium-Ionophore [146] oder eine
Superinfektion mit dem P3HR1-Virusstamm [147] durch unbekannte Mechanismen
eingeleitet werden. Die Induktion des lytischen Zyklus über den BCR stellt dagegen einen
spezifischen und physiologischen Weg der EBV-Reaktivierung dar. Die lytische Replikation
wird aber in allen Fällen durch die Aktivierung des unmittelbar frühen Genprodukts BZLF1
und der folgenden Expressionskaskade viraler Gene ausgelöst [148].
3.5.2 Die in vivo Reaktivierung
Das Epstein-Barr Virus persistiert in vivo in zirkulierenden Gedächtnis-B-Zellen. Für die
Replikation von infektiösen Viruspartikeln muss das Virus eine Aktivierung des lytischen
Zyklus durchlaufen. Die Freisetzung der Virionen ist immer mit dem Tod der infizierten Zelle
verbunden [1]. Aus diesem Grund ist für die Etablierung einer latenten Infektion eine strikte
Kontrolle der Virusreaktivierung wichtig. Bei der Unterdrückung der Reaktivierung spielen
sowohl virale als auch zelluläre Faktoren eine Rolle. Genaue Mechanismen oder ein
eventuelles Zusammenspiel von Virus und Wirtszelle müssen noch genauer untersucht
werden. In vitro wurde gezeigt, dass das virale Latenz-Protein LMP2A die Induktion des
lytischen
Zyklus
durch
anti-Immunglobulin-Antikörper
blockieren
kann
[79].
Die
Differenzierung von der ruhenden Gedächtnis-B-Zelle zur Plasmazelle kann auch die lytische
Reaktivierung des Virus auslösen [149]. Es wurde erst kürzlich gezeigt, dass der plasmazellspezifische Transkriptionsfaktor XBP1 („x-box binding protein 1“) allein [150] oder in
Kombination mit der Proteinkinase D (PKD) [151] den lytischen Zyklus in B-Zellen induzieren
kann. Bei gesunden EBV-positiven Personen ist im peripheren Blut keine lytische Replikation
des Virus nachweisbar [152]. Zur Weiterverbreitung des Virus in der Bevölkerung ist aber
eine periodische Reaktivierung nötig. Diese erfolgt vermutlich in den Tonsillen, aber es wird
auch eine Rolle der Epithelzellen diskutiert.
14
3. Einleitung
3.6 Das „unmittelbar frühe“ Genprodukt BZLF1
3.6.1 Das BZLF1 Protein
Das Protein des BZLF1-Gens (BamHI Z fragment Leftward open reading Frame 1) ist in der
Literatur unter den Bezeichnungen BZLF1, ZEBRA (BamHI Z Epstein-Barr Virus Replication
Activator), Z, Zta und EB1 beschrieben. In dieser Arbeit wird es BZLF1 genannt.
Die Replikation des Epstein-Barr Virus erfolgt durch Induktion des lytischen Zyklus und einer
Expressionskaskade lytischer Gene. Die lytischen Gene werden wie bei allen Herpesviren in
drei Kategorien, gemäß ihrer Expression, unterteilt. Die unmittelbar frühen Gene werden
durch lytische Stimuli induziert und induzieren wiederum die Expression der frühen Gene
(Abbildung 2). Diese leiten dann die Replikation der viralen DNA und die Induktion der
späten Gene ein. Frühe Gene kodieren überwiegend für virale Enzyme, wie z.B. die virale
DNA-Polymerase. Wohingegen Strukturproteine des Virions von den späten Genen kodiert
werden [1]. Die Transkription der unmittelbar frühen Gene BRLF1 (BamHI R fragment
Leftward open reading Frame 1) und BZLF1 nach Induktion des lytischen Zyklus ist
unabhängig von Inhibitoren der Proteinbiosynthese (z.B. Cycloheximid) [141]. Die
Expression der beiden unmittelbar frühen Gene wird somit ohne zwischengeschaltete
Faktoren direkt induziert. Es zeigte sich, dass allein die Expression von BZLF1 ausreichend
und nötig ist für die Induktion des lytischen Zyklus [148]. BZLF1 aktiviert außerdem das
zweite unmittelbar frühe Gen BRLF1, welches auch als Transkriptionsfaktor auf die frühen
Gene wirkt, [153, 154] und verstärkt durch Bindung an den eigenen Promotor Zp seine
Expression autoregulativ [155].
Das BZLF1-Protein ist aus einer aminoterminalen Transaktivierungsdomäne (AS 1-167)
[156], einer DNA-Bindedomäne (AS 168-203) [157] und einer carboxyterminalen
Dimerisierungsdomäne (AS 204-245) [158] aufgebaut. BZLF1 gehört wie die zellulären
Transkriptionsfaktoren c-Jun und c-Fos zur bZip-Familie („basic leucine zipper“) und bindet
als Homodimer an sogenannte ZEBRA-responsive Elemente (ZRE) im viralen Genom und
an konsensus AP-1-Elemente [159-161]. Diese Elemente befinden sich in den Promotoren
der BZLF1 Zielgene und in der Region des lytischen Replikationsursprungs oriLyt im EBVGenom [157]. Über die AP-1-Elemente induziert BZLF1 die Expression von c-fos [162] und
TGF-β1 („tumor growth factor β1) [163]. Durch seine Assoziation mit dem zellulären
Transkriptionsfaktor TFIID und dem Transkriptionsregulator CREB-Bindeprotein (CBP) kann
BZLF1 mehrere zelluläre und virale Gene regulieren. CBP lockert über seine Histon-
15
3. Einleitung
Acetylase Aktivität die Histone am oriLyt auf und ermöglicht so eine besseren Zugang des
viralen Replikationskomplexes [153, 164]. Dieser wird ebenfalls durch Interaktionen von
BZLF1 mit dem viralen Helikase-Primase-Komplex an den lytischen Replikationsursprung im
EBV Genom rekrutiert [165]. Zudem reguliert BZLF1 die Aktivität der Latenz-Promotoren Cp
und Wp [166, 167].
In der latenten Phase unterliegt die BZLF1 Expression einer strengen Kontrolle durch
zelluläre Faktoren. Histon-Deacetylasen halten den BZLF1 Promotor geschlossen [168] und
eine konstitutiv, niedrige Expression der NO-Synthase (iNOS) blockiert die BZLF1
Expression [169]. Zusätzlich fördern negative Elemente („silincing“-Elemente“) des BZLF1
Promotors die Aufrechterhaltung der Latenz [170].
3.6.2 Der BZLF1 Promotor
Die Transkription des BZLF1-Gens kann von zwei benachbarten Promotoren gestartet
werden (Abbildung 3). Der proximale BZLF1-Promotor Zp liefert ein 1,0 kb großes
monocistronisches Transkript aus drei Exons [171]. Wobei das zweite Exon für die DNAbindende Domäne des BZLF1 Proteins kodiert [172].Der distale BRLF1/BZLF1-Promotor Rp
liefert ein 2,8 kb großes bicistronisches, aus fünf Exons bestehendes, Transkript [171].
BZLF1
BRLF1
Zp
Rp
BZLF1
1,0 kb RNA
BRLF1/ BZLF1
2,8 kb RNA
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Transkription des BZLF1-Gens. Die Transkription der
monocistronischen BZLF1-mRNA erfolgt vom Promotor Zp. Die bicistronische BRLF1/ BZLF1-mRNA wird am
Promotor Rp induziert.
Die Induktion eines der beiden Promotoren führt unmittelbar zur Aktivierung des anderen
Promotors [173]. Wobei das Protein BZLF1 den Promotor Rp direkt über ZEBRA-responsive
Elemente (ZRE) aktivieren kann [174]. Das Protein BRLF1 hingegen kann den Promotor Zp
16
3. Einleitung
nur indirekt über zwischengeschaltete Signaltransduktionswege anschalten [175]. Sowohl
BRLF1 als auch BZLF1 wirken als Transkriptionsfaktoren auf die Expression der frühen
Gene des lytischen Zyklus [153, 154, 161]. Mehrere Untersuchungen belegen, dass der
BZLF1 Promotor Zp nach Induktion des lytischen Zyklus direkt aktiviert wird [168, 176]. Die
Aktivierung des BRLF1 Promotors Rp hingegen erfolgt indirekt [177].
Der BZLF1 Promotor Zp besitzt eine sehr niedrige basale Aktivität, die durch Induktion des
lytischen Zyklus stark erhöht wird [161, 162]. Die Promotorregion von -221 bis +12 besitzt die
nötigen cis-Elemente für die Erhaltung der niedrigen basalen Aktivität während der latenten
Infektion und die Induktion einer starken BZLF1 Expression nach Aktivierung des lytischen
Zyklus (Abbildung 4). Das zelluläre Protein ZEB1 („zinc finger E-box binding factor 1“) bindet
im Zp-Promotor an die Regionen ZV (-17 bis -12) und ZV` (+5 bis +10) und wirkt als
Repressor der BZLF1 Transkription während der latenten Infektion (Abbildung 4 A) [178]. Yu
et al., zeigten, dass eine Mutation im ZV-Element eine Bindung von ZEB1 verhindert. ZVMutanten weisen in Abwesenheit von lytischer Stimulation eine erhöhte spontane
Reaktivierung des lytischen Zyklus auf [179]. In der Zp Region wurden zwei weitere Formen
von cis-Elementen beschrieben, die eine Bindung mit zellulären Faktoren aufweisen. Die
Bindung an diese Elemente erfolgt aber erst über Signalkaskaden nach Induktion des
lytischen Zyklus (Abbildung 4 B).
BZLF1 Transkription
A
ZEB1
ZIA
ZIB
ZIC
ZIIIA
ZID
ZIIIB
ZII
ZV
-221
ZV´
-
+1
B
ZIIIA
ZIIIB
ZID
CREB
ATF1/2
ZIC
MEF2D
ZIB
SP1/3
SP1/3
ZIA
MEF2D
SP1/3
MEF2D
Anti-Ig
ZII
ZV
-221
ZV´
BZLF1
ZV´
BZLF1
+
+1
BZLF1
ZID
-221
CREB
ATF1/2
ZIIIB
MEF2D
ZIIIA
SP1/3
ZIC
BZLF1
BZLF1
ZIB
BZLF1
BZLF1
SP1/3
ZIA
MEF2D
SP1/3
MEF2D
C
ZII
ZV
+++
+1
Abbildung 4: Schematische Darstellung des BZLF1-Promotors von -221 bis +12 und des Modells der
Promotoraktivierung. Negativ regulierte Elemente sind in blau und positiv regulierte Elemente in orange und rot
dargestellt. -/ + kennzeichnet die Transkription von BZLF1.
17
3. Einleitung
Die vier AT-reichen Elemente ZI (ZIA-D) binden mit unterschiedlicher Affinität die
Transkriptionsfaktoren Sp1, Sp3 und MEFD2 („monocyte enhancer factor 2D“) [180, 181].
Das ZII-Element (-47 bis -65), das Homologie zur CRE/AP-1-Bindestelle („consensus cAMP
response element“) besitzt, bindet die Transkriptionsfaktoren ATF1, ATF2 und CREB und ist
für die Induktion von Zp unbedingt erforderlich [162, 182, 183]. Neben den Bindestellen für
zelluläre Transkriptionsfaktoren befinden sich in der Zp-Promotorregion die positiven cisElemente ZIIIA und ZIIIB, welche wie in Abbildung 4 C dargestellt als ZREs das BZLF1Protein binden [184].
Flemington und Speck stellten 1990 ein sogenanntes Zwei-Schritt-Modell zur Aktivierung des
lytischen Zyklus auf (Abbildung 4 A-C). Im latenten Zustand unterdrücken zelluläre Faktoren
durch die Bindung an negative cis-Elemente die Transkription des BZLF1-Gens vom Zp
Promotor. Dies erfolgt z.B. an den ZV- und ZV´-Elementen über ZEB1 [178]. Exogene
Faktoren wie Phorbolester (TPA) und anti-Immunglobulin-Antikörper induzieren über die
responsiven Elemente ZI und ZII des Promotors eine schwache Expression des BZLF1
Proteins.
Übersteigt
die
BZLF1-Menge
eine
kritische
Konzentration,
führt
die
Autoreaktivierung des Promotors über BZLF1-Bindung an die ZIII-Elemente zu einer starken
Expression des BZLF1-Proteins [184]. Durch den Schwellenwert der BZLF1-Konzentration
und die positive, autoregulative Rückkopplung verhindert das Virus einerseits eine
Reaktivierung ohne Stimulation des lytischen Zyklus und sichert andererseits eine schnelle
und starke BZLF1-Expression nach effizienter Induktion des lytischen Zyklus.
3.7 Der Zelldifferenzierungsfaktor Blimp1
3.7.1 Aufbau und Funktion von Blimp1
Das „B lymphocyte induced maturation protein“ Blimp1 ist ein Transkriptionsfaktor mit
vielfältigen Funktionen der Zelldifferenzierung in einer Reihe von Geweben und wird in die
Familie der PR-Domänen (PRDI-BF1R und RIZ, den beiden ersten Proteinen) Zinkfinger
(ZNF) Proteine eingegliedert. Das Blimp1-kodierende Gen wird mit prdm1 („PR domain
containing 1, with ZNF domain“) bezeichnet [185]. Teilweise findet sich auch für das Protein
die Bezeichnung Prdm1. Blimp1 wurde erstmals 1991 in der Arbeitsgruppe von Maniatis als
neuer Repressor der humanen Interferon β (IFN-β) Genexpression beschrieben. Da das
Protein die PRDI-Domäne („positive-regulatory domain“) im IFN-β-Promotor bindet wurde es
als PRDI-BF1 („beta-interferon gene positive-regulatory domain 1 binding factor“) bezeichnet
[186]. Drei Jahre später identifizierten Davis und Kollegen ein murines Protein, das während
18
3. Einleitung
der Differenzierung von B-Lymphozyten zu Plasmazellen induziert wurde und für die Reifung
nötig war. Sie nannten es daher „B lymphocyte induced maturation protein 1“, oder Blimp1
[187]. Noch im gleichen Jahr zeigte Huang, dass es sich bei PRDI-BF1 um das humane
Homolog von Blimp1 handelt [188]. Das murine und humane Protein weisen eine sehr große
Homologie auf und sind in funktionellen in vitro Versuchen austauschbar. Murines Blimp1
unterscheidet sich lediglich im N-Terminus leicht vom humanen, da es 67 zusätzlich
Aminosäuren besitzt [188]. Das humane Blimp1 Protein besteht aus 789 Aminosäuren und
hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 88 kDa [186]. Die Domänen-Struktur des
Blimp1 Proteins ist in Abbildung 5 dargestellt. Das Protein besitzt fünf DNA-bindende
Zinkfinger-Domänen (ZNF-Domäne) im C-terminalen Bereich, wobei nur die ersten beiden
für die Bindung an DNA-Zielsequenzen essentiell sind [189].
H3N
COOH
Saure
Region
PR
Prolin-reiche
Region
PEST
ZNF
Domäne
Saure
Region
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Blimp1 Domänen. Abkürzungen: PR, PRDI-BF1 und RIZ
homologe Region; PEST, P (Prolin) E (Glutaminsäure) S (Serin) T (Threonin) reiche Peptidsequenz; ZNF,
Zinkfinger.
Jeweils am aminoterminalen und carboxyterminalen Ende beinhaltet Blimp1 eine saure
Region. Vom aminoterminalen Bereich folgen eine PR-Domäne, eine Prolin-reiche Region
und PEST-Sequenzen (P: Prolin, E: Glutaminsäure, S: Serin, T: Threonin reiche
Peptidesequenz). PR-Domänen haben Ähnlichkeiten mit den SET-Domänen in HistonMethyltransferasen. Blimp1 besitzt keine Transferaseaktivität [190], weist allerdings in
Isoformen ohne PR-Domäne eine verminderte Repressor-Aktivität auf [191]. In aktiver Form
liegt Blimp1 normalerweise als Monomer vor. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurden
aber auch Dimere des Proteins nachgewiesen [192]. Die in vivo Funktion der Blimp1-Dimere
bedarf aber noch genauer Untersuchungen, da in der Studie exogenes Blipm1
überexprimiert wurde. Das humanen prdm1 Gen exprimiert von zwei benachbarten
Promotoren die beiden Isoformen PRDM1α und PRDM1β [191]. Die Transkription von
PRDM1α erfolgt vom ursprünglichen Blimp1 Promotor und ergibt das Protein mit voller
Länge. Dagegen liegt der Promotor von PRDM1β upstream von Exon 4 und ergibt eine um
101 Aminosäuren kürzere Isoform. Ein großer Teil der PR-Domäne fehlt PRDM1β, was in
einer verminderten Repressoraktivität von PRDM1β resultiert [191].
19
3. Einleitung
Zur Ausführung seiner Funktionen als transkriptioneller Repressor bedient sich Blimp1 einer
Reihe von Mechanismen. Die verschiedenen Domänen des Proteins rekrutieren eine große
Anzahl von Chromatin-modifizierenden Enzymen oder Ko-Repressoren der Groucho-Familie
zur transkriptionellen Unterdrückung von Zielgenen. Dies erfolgt durch Induktion einer
geschlossenen Chromatin-Struktur am Ziel-Lokus. So assoziiert Blimp1 mit der G9a
Methyltransferase über die ersten beiden Zinkfinger-Domänen. Die darauf folgende Blimp1vermittelte Methylierung von Lysin 9 im Histon 3 führt zur transkriptionellen Stilllegung der
Zielgene, wie z.B. am Interferon β-Promotor [190]. Die Interaktion von Blimp1 mit der
Methyltransferase Prmt5 („protein arginine methyltransferase 5“) und die anschließende
Methylierung von Arginin 3 in Histon 3 und Histon 4 unterdrückt die somatische
Differenzierung in primordialen Keimzellen [193]. Die Assoziation der Prolin-reichen und der
Zinkfinger-Domänen mit Histon-Deacetylasen (HLACs) unterdrückt über die Deacetylierung
des Histons 3 ebenfalls die Transkription von Zielgenen, wie z.B. c-myc [194]. Blimp1
reprimierte Gene in Plasmazellen kodieren folgende Proteine: c-myc, ein wichtiger Regulator
des Zellzyklus [195]; CIITA („class II activator“), nötig für die positive Regulation der MHC-IIExpression [196]; Spi-B und Ida3 („inhibitor of DNA-binding 3“), wichtig für die
Keimzentrumsreaktion [197]; und Pax5 („paired box protein 5“), sorgt für den Erhalt des BZell-Phänotyps [198]. Zusätzlich wurden folgende humane und murine Blimp1-Zielgene
identifiziert: Interferon β [186]; NFAT5 („nuclear factor of activated T cells 5), dsup16 und fos
in Epithelzellen [199]; p53 [200]; und Interleukin 2 (IL-2) [201].
3.7.2 Blimp1, ein Differenzierungsfaktor
Die ersten bekannten biologischen Funktionen von Blimp1 waren die Regulation der
Interferon-β-Produktion und die Differenzierung von B-Lymphozyten zu Plasmazellen [186,
187]. Die immunologische Funktion Blimp1 wurde darauf intensiv untersucht und zeigte,
dass Blimp1 eine große Rolle in der Regulation der funktionellen Differenzierung von
Epithelzellen [199], B- und T-Lymphozyten spielt [202, 203]. In B-Zellen ist Blimp1 für die
komplette Differenzierung zu Antikörper-sekretierenden Plasmazellen [187, 203] und die
Unterdrückung von Transkriptionsfaktoren unreifer B-Zellen und der Zellproliferation
erforderlich [197]. In T-Zellen wird Blimp1 nach der T-Zell-Aktivierung induziert und reguliert
die Homeostasis peripherer Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen [202, 204]. Die terminale
Differenzierung bei Epithelzellen zu Keratinozyten ist ebenfalls von der Blimp1 Expression
abhängig [199]. Obwohl ursprüngliche Funktionen von Blimp1 in der Regulation der
Immunantwort beschrieben wurden, zeigt sich immer mehr dass Blimp1 für die Entwicklung
und Differenzierung in einer ganzen Reihe von Geweben verantwortlich ist. So wird Blimp1
20
3. Einleitung
auch schon während der Embryonalentwicklung exprimiert [205]. Das Ausschalten des Gens
prdm1 im Mausmodel ist schon am Tag 10,5 embryonal letal [206]. In Gewebe-spezifischen
Mausmodellen konnte eine ganze Reihe von Blimp1 Funktionen aufgedeckt werden. So
beeinflusst Blimp1 beispielsweise die Differenzierung der Keimzellen [207] und der
Talgdrüsen [208]. Zusätzlich ist Blimp1 für die korrekte Entwicklung der vorderen
Gliedmaßen,
des
Rachenbogens,
des
Herzens
und
der
sensorischen
Vibrissen
verantwortlich [209]. Das Vorkommen von Blimp1 homologen Proteinen in Insekten,
Würmern, Echinodermen, Fischen, Amphibien, Vögeln und Säugetieren lässt den Schluss
zu, dass Blimp1 ein konserviertes und altes Protein in der Evolution ist [185].
3.7.3 Blimp1, ein Tumorsuppressor
Die Fähigkeit von Blimp1, die Expression einzelner Gene gezielt zu unterdrücken, ist eine
wichtige Funktion für die normale Zellentwicklung. Eine Fehlfunktion der Blimp1 Expression
kann leicht zu unkontrolliertem Wachstum und fehlgeleiteter Entwicklung der Zellen führen.
Daher wird Blimp1 auch eine Rolle als Tumorsuppressor zugesprochen. So kann z.B. in
Myelom-Zellen, eine maligne Form von Plasmazellen, eine relativ hohe Expression der
PRDM1β-Isoform nachgewiesen werden [191, 210]. Ungewöhnlich hohe Konzentrationen
der β-Isoform von Blimp1 treten auch in verschiedenen T-Zell-Lymphomen auf [211].
Patienten mit Waldenströms Makroglobulinämie, einer malignen Lymphomerkrankung,
weisen eine stark reduzierte Blimp1-Expression auf [212]. Ein weiterer Hinweis für Blimp1 als
Tumorsuppressor ist, dass in verschiedenen B-Zell-Lymphomen eine Deletion des Blimp1
Gens prdm1 vorliegt [213, 214]. Aber auch ohne eine Blimp1-Deletion kann in einigen
Leukämien und Lymphomen eine verminderte Blimp1-Aktivität nachgewiesen werden. In
dem B-Zell-Tumor DLBCL („diffuse large B cell lymphoma“) führen Mutationen in Blimp1 zu
einer reduzierten Blimp1-Aktivität [215, 216] und in Hodgkin Lymphomen inhibieren die
miRNAs miR-9 und let-7a die Transkription des Blimp1-Proteins [217]. Die Gruppe von
Garrett-Sinha konnte kürzlich zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Ets1, ein Onkogen, die
DNA-Bindung von Blimp1 und somit die biologische Aktivität des Repressors blockieren kann
[218]. Zusammengefasst deuten die Daten darauf hin, dass eine verminderte oder blockierte
Blimp1-Expression die Differenzierung der Tumorzellen verhindert und sie so im
proliferativen Status hält.
21
3. Einleitung
3.8 microRNAs
3.8.1 Aufbau und Prozessierung von microRNAs
microRNAs (miRNAs) sind kleine, ca. 22 Nukleotide (nt) lange, nicht kodierende RNAs, die
eine wichtige Rolle in der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression in Tieren und
Pflanzen ausüben. Ursprünglich wurden miRNAs (lin4 und let-7) bei der Regulation des
Larvenstadiums von Caenorhabditis elegans (C. elegans) entdeckt [219, 220]. Aber schon
kurze Zeit später wurden miRNAs in Pflanzen [221, 222], Eukaryoten (vom Einzeller bis
Vielzeller) [223, 224] und in Viren nachgewiesen [225]. Derzeit liegen in der Sanger
Datenbank (Version 14.0) 721 humane miRNAs vor (www.mirbase.org). Im Genom kommen
miRNAs innerhalb oder außerhalb von Genen vor [226]. Liegt die miRNA innerhalb eines
kodierenden Gens, so erfolgt die Transkription und Prozessierung meist zusammen mit dem
Gen. Diese miRNAs besitzen vermutlich keinen eigenen Promotor und ihre Expression wird
über die gleichen Faktoren wie die Genexpression gesteuert [226-228]. Sind miRNAs
außerhalb von Genen kodiert, so erfolgt ihre Transkription durch eigene Promotoren. Meist
liegen sie in Clustern vor und werden als lange polycistronische Transkripte exprimiert [228].
Die miRNA-Expression kann in Abhängigkeit von der Zellentwicklung oder dem Zelltypen
erfolgen. So wird miR-1 nur in Säugerherzen [229] und miR-122 nur in Leberzellen [230]
exprimiert. Wohingegen lin-4 und let-7 in bestimmten Stadien der Entwicklung vorkommen
[231]. Jeder Zelltyp weist zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Entwicklung ein spezifisches
miRNA-Expressionsprofil auf.
Primäre miRNA-Transkripte sind, wie die klassischen protein-kodierenden mRNAs, durch
eine 1-Methyl-Guanylat (m7G) Cap am 5´-Ende und einen poly (A)-Schwanz am 3´-Ende
charakterisiert [232] (Abbildung 6). Fast alle bis heute bekannten humanen miRNAs werden
durch die RNA-Polymerase II (Pol II) transkribiert [232, 233]. Nur die Transkription des miR19 Clusters erfolgt durch die RNA-Polymerase III (Pol III) [234]. Es entsteht ein langer RNAVorläufer, primäre miRNA (pri-miRNA) genannt [232, 233]. In der pri-miRNA befindet sich die
reife miRNA-Sequenz (ca. 22 nt) in einem Arm der sich ausbildenden ca. 80 nt langen
imperfekten Haarnadel-Sequenz (stem-loop) [235]. Die Prozessierung der pri-miRNA erfolgt
durch ein Enzym namens Drosha, das die Haarnadel-Struktur erkennt und spaltet. Drosha,
eine RNA-Endonuklease Typ III mit zwei RNase III Regionen und einer dsRNABindungsdomäne, schneidet an der Basis der Haarnadelstruktur [236]. Dabei entsteht ein
weiterer miRNA-Vorläufer, das ca. 60 nt lange RNA-Haarnadel-Intermediat mit einem 5´Ende Phosphat-Überhang und einem 2nt-Überhang am 3´-Ende [237]. Diese Zwischenstufe
22
3. Einleitung
wird als pre-miRNA (precursor-miRNA) bezeichnet. Für eine effiziente Prozessierung
benötigt Drosha nicht-strukturierte Regionen die die Haarnadel flankieren. Die Interaktion mit
dem dsRNA-Bindungsprotein DGCR8 („DiGeorge syndrom critical region 8“) spielt eine
wichtige Rolle bei der Erkennung des primären Transkripts [238].
DNA
Pol II
Pol III
AAAA
pri-miRNA
DGCR8
Drosha
Nukleus
pre-miRNA
Zytoplasma
Exp5
pre-miRNA
Dicer
miRNA-Duplex
Ago
RISC-Komplex
hohe Komplementarität
partielle Komplementariät
AAAA
AAAA
mRNA
mRNA Abbau
Hemmung der Translation
Abbildung 6: Prozessierung von miRNAs. Die Transkription der pri-miRNA erfolgt durch die zellulären DNAPolymerasen Pol I und Pol III. Die pri-miRNA wird über den DGCR8/Drosha-Komplex in die pre-miRNA
prozessiert. Der Transport in das Zytoplasma erfolgt über Exportin5. Hier wird die pre-miRNA über Dicer zum
miRNA-Duplex weiter prozessiert. Ein Strang der reifen miRNA wird in den RISC-Komplex eingebaut, der andere
Strang wird degradiert. Im RISC-Komplex bindet die reife miRNA an die Zielsequenz in der mRNA. Dies führt bei
hoher Komplementarität zum Abbau der mRNA. Eine partielle Komplementarität resultiert in der Hemmung der
mRNA-Translation. Abkürzungen: Pol, Polymerase; Exp5, Exportin5; Ago, Argonaut.
23
3. Einleitung
Der nächste Schritt in der miRNA-Prozessierung ist der Export der pre-miRNA aus dem
Zellkern in das Zytoplasma. Der Export erfolgt über einen energieabhängigen Schritt durch
das Protein Exportin 5. Das Protein bildet ein Heterodimer mit dem Ko-Faktor Ran, welches
die 2nt-Überhänge am 3´-Ende der pre-miRNA erkennt [239, 240]. Im Zytoplasma wird die
pre-miRNA durch GTP-Hydrolyse freigesetzt und von Dicer gebunden. Bei Dicer handelt es
sich um eine RNA-Endonuklease Typ III, mit zwei RNase III Regionen und einer dsRNABindungsdomäne [235, 241]. Dicer bindet die pre-miRNA über die 2nt-Überhänge und
schneidet zwei helikale Windungen nach der ersten Base des Doppelstrangs. Es entsteht ein
miRNA Duplex-Intermediat, welches die reife miRNA und einen komplementären Strang
(„passenger-strand“) enthält [242]. Das Zwischenprodukt wird ATP-abhängig entwunden und
die einzelsträngige reife miRNA wird in einen Komplex namens RISC („RNA-induced
silencing complex“) eingebaut. Der komplementäre Strang wird vermutlich abgebaut [243].
Die Zusammensetzung des RISC-Komplex ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Eine
wichtige Funktion in diesem Komplex wird von Argonaut-Proteinen übernommen [244]. Vier
humane Formen sind bislang bekannt, wobei nur das Argonaut 2 Protein (Ago2) zur
Spaltung von Nukleinsäuren in der Lage ist [244]. Die miRNA im RISC-Komplex bindet
komplementäre mRNAs. Besitzt die im RISC-Komplex gebundene mRNA eine starke
Homologie zur miRNA, so wird die mRNA über Ago2 degradiert. Besteht jedoch nur eine
partielle Homologie zwischen der miRNA und der mRNA, dann führt die Verbindung im
RISC-Komplex zur Hemmung der mRNA Translation [245].
3.8.2 Funktion von microRNAs
Die gebundene miRNA dirigiert den RISC-Komplex zu ihrer Ziel-mRNA und induziert somit in
der Regel den Abbau der mRNA oder die Inhibierung der Translation [245]. In einigen Fällen
wurde aber auch eine miRNA-vermittelte Steigerung der mRNA-Translation beobachtet. So
bindet die murine miR-10a im 5´-UTR („untranslated region“) von mRNAs für ribosomale
Proteine und verstärkt dadurch die Translation [246]. Auch für die humane miR369-3 wurde
gezeigt, dass sie die Translation von mRNAs durch Bindung an den 3´-UTR steigert [247].
Die miRNA-Bindungsstellen sind meist perfekt homolog zu den „seed“-Sequenzen am 5´Ende der miRNA (nt 2-7) und im 3´-UTR der mRNA lokalisiert [248].
Mittlerweile sind viele Funktionen von miRNAs in unterschiedlichen Zelltypen beschrieben.
Die Differenzierung von Hautzellen wird z.B. durch eine miR-203 vermittelte Regulation von
p63 beeinflusst [249]. Ein Verlust der Expression des miR-20a/b1-Clusters in Neuronen trägt
zur Entstehung von Alzheimer bei [250]. Die miR-155 z.B. verringert die mRNA-Translation
24
3. Einleitung
von AID („activation-induced cytidine deaminase“), einem wichtigen Protein für den
Klassenwechsel in B-Zellen [251]. Eine Überexpression von miR-155 im Mausmodell führt zu
einer pro-leukämischen Proliferation der B-Zellen und somit zu malignen B-ZellErkrankungen [252]. Außerdem kann eine verstärkte Expression der miR-155 in humanen BZell-Tumoren beobachtet werden [253]. Da einige miRNAs die Translation von Proteinen des
Immunsystems inhibieren und miRNAs auch die Translation von viralen Genen beeinflussen,
wird den miRNAs eine Rolle als intrazelluläres Immunsystem zugesprochen [254].
3.8.3 Virale microRNAs
Die Gruppe von Thomas Tuschl berichtete als erste von der Existenz viraler miRNAs. Sie
konnten EBV-kodierte miRNAs in Burkitt Lymphom-Zelllinien identifizieren [225]. Mittlerweile
sind über 141 virale miRNAs in 15 Viren aus drei Virusfamilien nachgewiesen worden. Die
bekannten viralen miRNAs beschränken sich auf die Virusfamilien der Herpesviren,
Polyomaviren und Retroviren [255]. Die Prozessierung der viralen miRNAs erfolgt über den
gleichen Mechanismus wie die Biogenese der humanen miRNAs (Abbildung 6) [256]. Dieser
Weg der miRNA-Prozessierung stellt für RNA-Viren und den DNA-Virus Poxvirus ein
Problem dar. Denn der erste Schritt der miRNA Prozessierung erfolgt durch Spaltung der primiRNA im Zellkern, jedoch replizieren und exprimieren diese Viren ihr Genom im Zytoplasma
[235, 236]. Es ist bislang nicht bekannt ob RNA-Viren und das Poxvirus miRNAs kodieren.
Nur für den RNA-Virus HIV-1 („human immunodeficiency virus 1“) gibt es kontroverse
Ergebnisse. So konnten Omoto et al., und Ouellet et al., miRNAs im TAR-Element („transactivation responsive“) von HIV-1 miRNAs identifizieren [257, 258]. Wohingegen Pfeffer et
al., und Lin und Cullen keine HIV-1-kodierten miRNA nachweisen konnten [259, 260]. Der
Mechanismus der miRNA-Prozessierung ist dabei noch vollkommen unbekannt.
Virale miRNAs können sowohl auf die Translation viraler als auch zellulärer mRNAs Einfluss
nehmen. Die EBV-kodierte miR-BHRF1-3 unterdrückt die Expression des Interferoninduzierbaren Chemokines CXCL-11/I-TAC, welches für die Rekrutierung von T-Zellen
während der Immunantwort verantwortlich ist [261]. Eine weitere EBV-kodierte miRNA, miRBART5, inhibiert die Expression des pro-apoptotischen zellulären Proteins PUMA („p53 upregulated modulator of apoptosis“) und fördert so das Überleben der Wirtszelle [262]. Die
ebenfalls EBV-kodierte miR-BART2 dagegen inhibiert die Translation der viralen DNAPolymerase BALF5 [263]. Auch die Translation des EBV latenten Membranproteins 1
(LMP1) wird durch gleiche mehrere virale miRNAs unterdrückt [264]. Auf der anderen Seite
können auch zelluläre miRNAs auf die Translation viraler Proteine Einfluss nehmen. So
25
3. Einleitung
können z.B. gleich mehrere zelluläre miRNAs, deren Expression durch die antivirale
Interferon-Antwort ausgelöst wird, die Replikation des Hepatitis C Virus (HCV) verhindern
[265]. HVC kann aber auch die Expression zellulärer miRNAs, wie z.B. die Leber-spezifische
miR-122, zu seinem Vorteil nutzen, da sie die Replikation von HCV fördert [266]. Die
Funktionen von viralen und zellulären miRNAs können sich aber auch ergänzen. So stellt die
miR-K12-11 des KSHV („Kaposi´s-sarcoma-associated herpes virus“) ein virales Ortholog
der zellulären miR-155 dar [267].
3.8.4 EBV-kodierte microRNAs
Die ersten viralen miRNAs wurden in dem Herpesvirus EBV entdeckt [225]. Bislang sind laut
der Sanger Datenbank (Version 14.0) (www.mirbase.org) 25 EBV-kodierte miRNAs bekannt.
Im EBV liegen die miRNAs in zwei Clustern im Genom vor. Wie in Abbildung 7 dargestellt
befindet sich ein Cluster im BHRF1-Gen (BamHI fragment H rightward open reading frame)
und das zweite in Introns der BART-Transkripte („BamHI A rightward transcripts“).
BHRF 1-1
EBNA 2
BHRF 1-2
BHRF 1-3
EBNA-LP
EBERs
BHRF 1
EBNA 1
BARTs
EBNA 3
LMP 2A,B
172 kbp
Cp Wp
Qp
BFLF 2
15 kbp
25 kbp
BZLF1
BART 2
Cluster 1
Cluster 2
BART 1
BART 3-6
BART 15-17
BART 7-14
BART 18-22
LMP 1
Abbildung 7: Schematische Darstellung der EBV-kodierten miRNAs. Latente Gene sind in grauen und
lytische Gene sind in schwarzen Balken dargestellt. Nicht-kodierende RNAs (EBER) sind blau und miRNAs rot
gekennzeichnet. Die Transkription der latenten Gene erfolgt von den Promotoren Cp, Wp oder Qp.
BHRF1 kodiert für ein Homolog des zellulären, anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 und
beinhaltet die miRNAs miR-BHRF1-1, miR-BHRF1-2 und miR-BHRF1-3. Die miR-BHRF1-1
befindet sich in der 5´-UTR von BHRF1, überlappt mit dem Transkriptions-InititationsStartpunkt und wird somit nicht in der mRNA kodiert. Die beiden miRNAs BHRF1-2 und
BHRF1-3 liegen im 3´-UTR des BHRF1-Gens und damit auch in der transkribierten BHRF1mRNA [225, 268]. Die BHRF1-miRNAs werden durch endonukleolytische Spaltung aus dem
26
3. Einleitung
BHRF1-Transkript prozessiert, weshalb ihre Expression vermutlich nicht gleichzeitig mit der
BHRF1-Expression stattfinden kann [269].
Die miR-BART1-22 werden in Introns der BART-Transkripte kodiert [270]. Bis auf miRBART2 werden die miRNAs wiederum in zwei Cluster im BART-Lokus eingeteilt. Im ersten
Cluster werden die miR-BART1, 3-6 und 15-17 und im zweiten Cluster die miR-BART7-14
und 18-22 kodiert [271]. Es gibt Untersuchungen, dass Cluster 1 miR-BARTs die Expression
des EBV latenten Membranproteins (LMP1) herunter reguliert [264]. miR-BART5 inhibiert
das zelluläre, pro-apoptotische Protein PUMA [262]. Die Funktionen der Cluster 2 miRNAs
sind zum jetzigen Zeitpunkt noch unbekannt. Die eigenständige miR-BART2 ist zur Zeit die
am besten erforschte BART-miRNA. Auf dem komplementären Strang zu miR-BART2 ist die
virale DNA-Polymerase BALF5 kodiert und wird von der miRNA translationell gehemmt
[263].
Die BHRF1-miRNAs zeigen eine starke Expression in Latenz III B-Zellen, eine niedrige
Expression dagegen in Epithelzellen und B-Zellen der Latenzen I und II. Die BART-miRNAs
weisen ein umgekehrtes Expressionsmuster auf. In latent infizierten Epithelzellen oder PELs
(„primary effusion lymphomas“) der Latenz II kommt es zu einer hohen Expression der
miRNAs, wohingegen in B-Zellen der Latenzen I und III nur geringe BART-miRNA-Level
nachgewiesen werden [268]. Die Expression der viralen miRNAs während des lytischen
Zyklus ist bis heute noch kaum untersucht.
27
4. Fragestellung
4. Fragestellung
Das Epstein-Barr Virus persistiert in latenter Form überwiegend in Gedächtnis-B-Zellen. Während der
lytischen Infektion kommt es zur Produktion von infektiösen Viruspartikeln. Bei gesunden Personen
unterliegt die Virusreaktivierung einer strikten Kontrolle durch das Immunsystem. Immundefiziente
Personen hingegen tragen ein erhöhtes Risiko EBV-assoziierte Tumorerkrankungen zu entwickeln.
Die Kontrolle der Latenz von EBV ist von großer klinischer Bedeutung, da die Aktivierung der
replikativen EBV-Infektion zur Lyse der EBV-infizierten Zellen und zur Aktivierung des Immunsystems
führt. Somit könnte die Induktion der lytischen Reaktivierung als möglicher Therapieansatz zur
Eliminierung von transformiertem Tumorgewebe angewendet werden. Der Übergang von latenter zu
lytischer Infektion ist abhängig von der Induktion des unmittelbar frühen lytischen Gens BZLF1. Die
Expression von BZLF1 aktiviert in einer Kaskade die Expression aller lytischen Virusgene und das
latente Genexpressionsprogramm wird heruntergefahren. Die lytische Infektion kann in vitro durch die
Induktion des BZLF1-Promotors mittels Reagenzien wie Phorbolester, anti-Immunglobulin (Ig)
Antikörper oder eine Super-Infektion mit dem EBV-Virusstamm P3HR1 ausgelöst werden. Die
Induktion des lytischen Zyklus mittels anti-Ig Antikörpern imitiert in vitro die lytische Reaktivierung von
EBV über Signale des aktivierten B-Zell-Rezeptors. In vivo führt die Aktivierung des B-Zell-Rezeptors
zur Proliferation und Differenzierung von B-Lymphozyten zu Plasmazellen. In latent EBV-infizierten
Gedächtnis-B-Zellen wurde beobachtet, dass die Aktivierung des lytischen Zyklus mit der
Differenzierung zu Plasmazellen einhergeht.
Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Bedeutung des „B lymphocyte induced maturation protein“
Blimp1, eines wichtigen Transkriptionsfaktors bei der terminalen Differenzierung von Lymphozyten
und Epithelzellen, für die Induktion der replikativen EBV-Infektion in Epithelzellen untersucht werden.
Hierfür sollte zunächst die Expression von Blimp1 und BZLF1 in vivo analysiert werden. Als Modell der
EBV-Replikation in Epithelzellen wird die orale Haarleukoplakie, eine AIDS-assoziierte Läsion der
Zungenschleimhaut, verwendet. Anschließend sollte in Luziferase-Versuchen die Induktion des
BZLF1-Promotors Zp in Abhängigkeit von der Blimp1-Expression untersucht werden. Des Weiteren
soll eine mögliche Inhibierung des BZLF1-Repressors ZEB1 durch Blimp1 überprüft werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte der Einfluss der viralen miRNA miR-BHRF1-3 auf die lytische
Reaktivierung von EBV untersucht werden. Hierfür sollte zunächst die Expression der miR-BHRF1-3
in
EBV-positiven
Zelllinien
geklärt
werden.
Insbesondere
werden
hier
B-Zelllinien
mit
unterschiedlichen Formen der Viruslatenz untersucht. Anschließend sollte eine mögliche Bindung der
miRNA an den 3´-UTR von BZLF1 in Luziferase-Versuchen überprüft werden. Die Etablierung von
stabil miR-BHRF1-3-transfizierten Zellen sollte die Frage beantworten, ob die miRNA die endogene
Expression von BZLF1 reguliert. Zusätzlich sollte der Einfluss der miRNA auf die BZLF1-Expression
nach Induktion des lytischen Zyklus untersucht werden.
28
5. Ergebnisse
5. Ergebnisse
Das Epstein-Barr Virus durchläuft als Herpesvirus zwei Formen von Infektionen: die latente
Infektion, in der das Virus überwiegend in Gedächtnis-B-Zellen persistiert und die lytische
Infektion, die zur Produktion von infektiösen Viruspartikeln führt. Der Übergang von latenter
zu lytischer Infektion ist abhängig von der Induktion des unmittelbar frühen lytischen Gens
BZLF1. Die Expression von BZLF1 aktiviert in einer Kaskade die Expression aller lytischen
Virusgene und führt zum Abschalten des latenten Expressionsprogramm. Die lytische
Infektion kann in B-Zellen in vitro durch die Induktion des BZLF1-Promotors mittels
Reagenzien wie Phorbolester, anti-Immunglobulin Antikörper oder eine Super-Infektion mit
dem EBV-Virusstamm P3HR1 ausgelöst werden [142, 144, 147].
Die Stimuli für die Induktion des lytischen Zyklus in vivo sind dagegen noch nicht vollständig
bekannt. Ein Zusammenhang zwischen lytischer Infektion durch die Induktion des BZLF1Promotors Zp und dem Differenzierungsstatuts der Wirtszelle wird in Abschnitt 5.1 an
Epithelzellen untersucht. Im zweiten Abschnitt (5.2) der vorliegenden Arbeit wird der Einfluss
der viralen miRNA miR-BHRF1-3 auf die Hemmung der BZLF1-Transkription und somit auf
eine Unterdrückung der lytischen Infektion in latent infizierten Burkitt-Lymphom-Zelllinien
überprüft.
5.1 Differenzierungsabhängige Induktion von BZLF1 in Epithelzellen
In zahlreichen Studien wurde eine Induktion des lytischen Zyklus in Abhängigkeit des
Differenzierungsstatus der Wirtszelle beobachtet. Bereits 1991 wurde im Plattenepithel von
oralen Haarleukoplakien (OHL) die Expression lytischer EBV-Proteine in den oberen,
differenzierten Zellschichten nachgewiesen [117, 272]. In der Plattenepithelzelllinie SCC12F
wurde in vitro nach terminaler Differenzierung der Epithelzellen eine gesteigerte BZLF1Expression gezeigt [273]. Zusätzlich konnten Niedobitek et al., nachweisen, dass EBV in den
differenzierten Epithelschichten von OHL nur in replikativer und nicht in latenter Form
vorkommt [116]. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass der für die Plasmazelldifferenzierung
nötige zelluläre Transkriptionsfaktor XBP1 („x-box binding protein 1“) allein [150] oder in
Kombination mit der Proteinkinase D (PKD) [151] den lytischen Zyklus in B-Zellen induzieren
kann. Beide Arbeitsgruppen konnten aber in Epithelzellen keine allein durch XBP1 induzierte
Aktivierung von BZLF1 nachweisen.
29
5. Ergebnisse
In latent EBV-infizierten Gedächtnis-B-Zellen wurde beobachtet, dass die Aktivierung des
lytischen Zyklus mit der Differenzierung zu Plasmazellen einhergeht [274]. Eine wichtige
Rolle bei der Plasmazelldifferenzierung spielt das „B lymphocyte induced maturation protein“
Blimp1. Die Gruppe von Kathryn Calame konnte zeigen, dass die terminale Differenzierung
von Epithelzellen zu Keratinozyten ebenfalls von der Blimp1-Expression abhängig ist [199].
Aufgrund der vorliegenden Erkenntnisse sollte im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von
Blimp1 auf die Induktion des lytischen Transaktivators BZLF1 untersucht werden. Hierfür
wurde zuerst eine mögliche Korrelation der Blimp1-Expression und lytischer Infektion von
Epithelzellen in vivo analysiert. Als Modell diente hierbei die orale Haarleukoplakie, eine
AIDS-assoziierte proliferative Läsion des Plattenepithels am lateralen Zungenrand. Zum
anderen wurde die Aktivierung des unmittelbar frühen lytischen BZLF1-Promotors Zp in
Abhängigkeit von der Blimp1-Expression in Epithelzellen mittels Luziferase-ReporterVersuche untersucht.
Die immunhistochemischen Analysen erfolgten an oralen Haarleukoplakien. Dr. Alan
Cruchley von der London School of Medicine and Dentistry hat uns freundlicherweise
Material aus Biopsien von fünf Patienten zur Verfügung gestellt. Die dargestellten
Abbildungen
der
immunhistochemischen
Färbungen
sind
jeweils
repräsentativ
für
durchgeführte Analysen an dem Material von allen fünf Patienten.
5.1.1 Nachweis von Blimp1-Expression in differenzierten Epithelzellen
Zu Beginn wurde die Expression von Blimp1 in differenzierten Epithelzellen untersucht. In
der Epithelschicht erfolgt die Differenzierung der Zellen ausgehend von den basalen
Epithelzellen (Stratum basale) über das Stratum spinosum zu den äußeren Bereichen des
Epithels. Bei oralen Haarleukoplakien findet sich im Gegensatz zu unverändertem
Zungenepithel oberflächlich eine unterschiedlich stark ausgeprägte Parakeratoseschicht.
Hier kommt es zur teilweisen Verhornung der Zellen, welche aber noch Zellkerne besitzen.
Im Rahmen von immunhistochemischen Untersuchungen an Tonsillen wurde in der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Niedobitek eine nukleäre Expression von Blimp1 in
Plasmazellen beobachtet [275]. Zusätzlich wurde in der vorliegenden Arbeit eine deutliche
nukleäre Blimp1-Färbung der Epithelzellen in den oberen, differenzierten Zellschichten des
Tonsillen begrenzenden Plattenepithels gefunden (Abbildung 8 A). Der Nachweis von Blimp1
30
5. Ergebnisse
erfolgte immunhistochemisch durch die Bindung eines anti-Blimp1 Antikörpers und einem
entsprechenden alkalische Phosphatase (AP)-konjugierten Polymer.
Aufgrund der gefundenen Blimp1-Expression in den differenzierten Epithelzellen in Tonsillen
wurde als nächstes die Expression von Blimp1 in den differenzierten Plattenepithelzellen von
oralen Haarleukoplakien untersucht.
A
B
C
D
Abbildung 8: Nachweis von Blimp1-Expression in differenziertem Gewebe. Die Expression von Blimp1 (rot)
wurde immunhistochemisch durch die Bindung eines anti-Blimp1 Antikörpers und eines entsprechenden APkonjugierten Polymer untersucht. In differenzierten Schichten von Tonsillen mit einem Objektiv 10-facher
Vergrößerung (A) und oralen Haarleukoplakien mit einem Objektiv 4-facher (B), 10-facher (C) und 20-facher (D)
Vergrößerung. Die Zellkerne sind durch eine Gegenfärbung mit Hämalaun in blau zu erkennen. AP: alkalische
Phosphatase.
31
5. Ergebnisse
In den untersuchten fünf Präparaten von OHL-Biopsien wurde Blimp1, wie in den Tonsillen,
ebenfalls nur in Zellkernen im differenzierten Epithel detektiert (Abbildung 8 C). Abbildung 8
B zeigt eine deutliche Restriktion der Blimp1-Expression auf den äußeren Bereich des
Epithels. In den basalen Epithelzellen konnte hingegen keine Expression von Blimp1
detektiert werden. In der obersten, parakeratotischen, Epithelschicht konnte nur eine
verminderte Expression von Blimp1 nachgewiesen werden (Abbildung 8 B und Abbildung 10
D). Die Stärke der Blimp1-Expression nimmt in den Epithelzellen mit fortschreitender
Zelldifferenzierung zum Plattenepithel hin graduell zu (Abbildung 8 D). In den
undifferenzierten basalen Epithelzellen konnte hingegen weder in Tonsillen noch in
Haarleukoplakien eine Expression von Blimp1 nachgewiesen werden.
5.1.2 Nachweis der EBV-Infektion in oralen Haarleukoplakien
Als nächstes wurde die Infektion der Epithelzellen mit EBV anhand der Expression viraler
Proteine in den Präparaten von Haarleukoplakien immunhistochemisch analysiert. Hierbei
erfolgte der immunhistochemische Nachweis von BZLF1 durch die Bindung von anti-BZLF1
Antikörper und einem entsprechenden AP-konjugierten Sekundärantikörper. EBNA1 wurde
durch die Bindung eines anti-EBNA1 Antikörpers und einem entsprechenden HRP
(horseradish peroxidase)-gekoppelten Polymer detektiert.
Die Expression des lytischen Gens BZLF1 wurde wie erwartet nur in den Zellkernen der
oberen, differenzierten Epithelzellen nachgewiesen. (Abbildung 9 A, B).
Zusätzlich wurde die Expression des latenten Proteins EBNA1 untersucht. Die Expression
von EBNA1 ist für die Erhaltung des viralen Episoms während der Zellteilung in latent
infizierten Zellen erforderlich. Es konnte allerdings eine Funktion von EBNA1 während der
lytischen Replikation von EBV in Epithelzellen gezeigt werden [276]. In den Präparaten der
Haarleukoplakien konnte die Expression von EBNA1 ebenfalls nur im oberen, differenzierten
Plattenepithel nachgewiesen werden (Abbildung 9 C).
Mittels EBER-in-situ-Hybridisierung wurde die Verteilung von EBV-positiven Zellen in OHLs
untersucht. EBERs, kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle, werden in allen latent EBVinfizierten Zellen exprimiert. Während der lytischen EBV-Infektion kann die Methode der
EBER-in-situ-Hybridisierung ebenfalls zum Nachweis von EBV angewandt werden. In
diesem Fall erfolgt eine Hybridisierung der Digoxigenin (DIG)-markierten EBER-RNA-Sonde
mit der replizierenden einzelsträngigen EBV-DNA. Die hybridisierte Sonde wurde
32
5. Ergebnisse
anschließend mit anti-DIG Antikörper und einem entsprechenden AP-konjugierten Polymer
detektiert. In der EBER-in-situ-Hybridisierung Analyse in Abbildung 9 D wurden EBERMoleküle eindeutig nur in den oberen, differenzierten Schichten des Plattenepithels
nachgewiesen.
A
BZLF1
B
BZLF1
C
EBNA1
D
EBER
Abbildung 9: Nachweis von EBV in oralen Haarleukoplakien. Die EBV-Infektion von Epithelzellen in oralen
Haarleukoplakien wurde immunhistochemisch untersucht. (A) Mit einem Objektiv 20-facher Vergrößerung:
Färbung des lytischen Proteins BZLF1 erfolgte durch anti-BZLF1 Antikörper und einen AP-konjugierten
Sekundärantikörper. (B) Mit einem Objektiv 40-facher Vergrößerung: BZLF1. (C) Mit einem Objektiv 20-facher
Vergrößerung: Färbung des latenten Proteins EBNA1 mittels anti-EBNA1 Antikörper und einem entsprechenden
HRP-gekoppelten Polymer. (D) Mit einem Objektiv 20-facher Vergrößerung: EBER-in-situ-Hybridisierung der DIGmarkierten EBER-Sonde wurde mittels anti-DIG Antikörper und einem AP-Polymer detektiert. Die Zellkerne sind
durch eine Gegenfärbung mit Hämalaun in blau zu erkennen. AP: alkalische Phosphatase; DIG: Digoxigenin;
HRP: horseradish peroxidase.
33
5. Ergebnisse
5.1.3 Untersuchung zur Kolokalisation von Blimp1 und BZLF1
Falls Blimp1 für die Induktion des unmittelbar frühen lytischen Gens BZLF1 notwendig ist, ist
eine Kolokalisation von Blimp1 und BZLF1 zu erwarten. Um eine mögliche Korrelation der
Blimp1- und der BZLF1-Expression zu untersuchen, wurden an Präparaten von
Haarleukoplakien Doppelmarkierungen durchgeführt. Hierbei wurde die Bindung von antiBlimp1 Antikörper mit einem entsprechenden Cy3-konjugierten Sekundärantikörper (rot) und
die Bindung von anti-BZLF1 Antikörper mit einem entsprechenden Cy5-konjugierten
Sekundärantikörper (blau) nachgewiesen.
In Abbildung 10 A und D ist die Expression von Blimp1 in zwei repräsentativen Präparaten
deutlich
im
oberen
parakeratotischen
Bereich
des
Zellschichten
Plattenepithels
beider
zu
Präparate
erkennen.
wurde
keine
In
den
obersten
Blimp1-Expression
nachgewiesen.
In den analysierten Präparaten der Haarleukoplakie wurde eine unterschiedlich starke
Infektionsrate mit EBV beobachtet (Abbildung 10 B und E). Die Expression von BZLF1
erfolgte ausschließlich im differenzierten Bereich des Plattenepithels.
Die in der immunhistochemischen Analyse gefundene Restriktion der Blimp1- und BZLF1Expression auf die differenzierten Zellen des Plattenepithels konnte somit auch in der
Immunfluoreszenz bestätigt werden.
Nach Überlagerung der Immunfluoreszenzen für Blimp1 und BZLF1 war deutlich zu
erkennen, dass BZLF1 ausschließlich in Blimp1-positiven Zellen exprimiert wurde (Abbildung
10 C und F). Die Kolokalistaion von BZLF1 (blau) mit Blimp1 (rot) war durch die
Überlagerung der beiden Färbungen in lila zu erkennen. Auch an dem Präparat mit starker
EBV-Infektionsrate (Abbildung 10 F) wurde in keine Expression von BZLF1 in Blimp1negativen Zellen nachgewiesen. Die replikative Infektion mit EBV erfolgte nur in der obersten
Schicht
der
differenzierten
Plattenepithelzellen.
Darunter
Epithelzellen wiesen keine Iytische Infektion mit EBV auf.
34
liegende
Blimp1-positive
5. Ergebnisse
A
Blimp1
D
Blimp1
B
BZLF1
E
BZLF1
C
Blimp1 + BZLF1
F
Blimp1 + BZLF1
Abbildung 10: Blimp1 und BZLF1 Doppelmarkierung an oralen Haarleukoplakien. An Schnitten von oralen
Haarleukoplakien wurden die Bindung von anti-Blimp1 Antikörper bzw. anti-BZLF1 Antikörper über Cy3-markierte
(rot) und Cy5-markierte (blau) Sekundärantikörper nachgewiesen. (A, D) Aufnahme der Blimp1-Färbung (rot) und
(B, E) der BZLF1-Färbung (blau). (C, F) Überlagerung der beiden Färbungen. Eine Kolokalisation von Blimp1 und
BZLF1 ist durch die Überlagerung von rot und blau in violett zu erkennen. Einige gefundene Kolokalisationen sind
repräsentativ mit Pfeilen gekennzeichnet. Die Aufnahmen wurden mit einem Objektiv 40-facher Vergrößerung
angefertigt.
35
5. Ergebnisse
Die Kolokalisation von BZLF1 mit differenzierten, Blimp1-positiven, Zellen wurde durch
Arbeiten von Dr. Maike Büttner, aus der Arbeitsgruppe von Prof. Niedobitek bestätigt. Frau
Dr. Büttner konnte in Tonsillen von EBV-seropositiven Patienten mit infektiöser
Mononukleose zeigen, dass auch in B-Zellen eine Kolokalisation von BZLF1 und Blimp1
vorhanden war (nicht veröffentlichte Daten).
5.1.4 Untersuchung zur Blimp1-abhängigen Induktion von BZLF1
Nachdem immunhistochemisch eine Kolokalisation von Blimp1 und BZLF1 an Präparaten
von oralen Haarleukoplakien nachgewiesen wurde, sollte der Einfluss der Blimp1-Expression
auf den BZLF1-Promotor Zp untersucht werden. Die Analyse der Blimp1 induzierten
Aktivierung des lytischen Promotors Zp erfolgte durch Luziferase-Versuche. Hierfür wurden
freundlicherweise die Vektoren pHEBo-Zp-Luc und pHEBo-Luc von P. Farrell vom Imperial
College in London, UK zu Verfügung gestellt [176]. In dem Vektor pHEBo-Zp-Luc steht das
Firefly-Luziferase Reportergen unter Kontrolle der Region von -552 bis +12 nt des BZLF1Promotors Zp (Abbildung 4). Als Negativkontrolle wurde der Vektor ohne den Zp Promotor,
pHEBo-Luc, verwendet. Für die Luziferase-Versuche wurden die Blimp1-negativen humanen
Epithelzelllinen 293T und HeLa transient für 48 h mit pHEBo-Zp-Luc und dem Blimp1Expressionsvektor pEXP4-Blimp1 ko-transfiziert. Der korrespondierende Vektor pEXP4-MCS
wurde als Negativkontrolle der Blimp1-Expression verwendet. Zusätzlich zu den FireflyLuziferase-Vektoren wurde jeweils ein Vektor mit dem Renilla-Luziferase Reportergen
(pRenilla-luc) ko-transfiziert. Die Messung der Renilla-Luziferase-Aktivität diente zum einen
der Quantifizierung der Transfektion und zum anderen wurde die relative Firefly-Aktivität
durch den Quotienten von Renilla- und Firefly-Luziferase-Aktivität berechnet. Eine Blimp1abhängige Induktion des BZLF1-Promotors Zp sollte in dem Luziferase-Reportersystem in
einer deutlichen Aktivierung der Firefly-Luziferase resultieren.
293T- und HeLa-Zellen wurden transient mit pHEBo-Zp-Luc oder pHEBo-Luc und pEXP4Blimp1 oder pEXP4-MCS in unterschiedlichen Kombinationen und jeweils pRenilla-luc kotransfiziert (Abbildung 11). Alle Luziferase-Versuche wurden in mindestens 3 unabhängigen
Experimenten jeweils in Triplikaten durchgeführt. Die Versuche in 293T Zellen mit pHEBoZp-Luc/pEXP4-Blimp1
und
pHEBo-Luc/pEXP4-Blimp1
wurden
in
4
unabhängigen
Experimenten durchgeführt. Wobei die Luziferase-Aktivität in einem Versuch mit pHEBo-Luc
/pEXP4-MCS nur im Duplikat gemessen wurde. In Abbildung 11 ist die relative FireflyLuziferase-Expression als Mittelwert der unabhängigen Experimente mit Standardfehler
dargestellt.
36
5. Ergebnisse
Durch die ektopische Expression von Blimp1 konnte in 293T-Zellen eine deutliche
Expression der Firefly-Luziferase induziert werden (Abbildung 11 A). In Anwesenheit von
Blimp1 (pEXP4-Blimp1) und dem Vektor pHEBo-Zp-Luc zeigte sich eine hoch signifikante
Aktivierung der Firefly-Luziferase durch den BZLF1-Promotor im Vergleich zu ektopisch
Blimp1-exprimierenden 293T Zellen mit dem Luziferase-Vektor ohne den Promotor Zp (p =
0,0001). Auch verglichen mit 293T-Zellen ohne Blimp1-Expression (pEXP4-MCS) war die
Blimp1 induzierte Induktion des Promotors Zp, sowohl in Anwesenheit des Promotors bei
Transfektion von pHEBo-Zp-Luc (p = 0,0021), als auch in Abwesenheit des Promotors nach
Transfektion mit pHEBo-Luc (p = 0,0008) stark signifikant.
A
B
239T
HeLa
Abbildung 11: Induktion des BZLF1-Promotors durch exogene Blimp1-Expression. 293T-und HeLa-Zellen
wurden mit verschiedenen Kombinationen aus Blimp1-Expressionsvektor (pEXP4-Blimp1), einem Kontrollvektor
(pEXP4-MCS), und Luziferasevektoren ko-transfiziert. Bei dem Luziferasevektor pHEBo-Zp-Luc steht die
Expression der Firefly-Luziferase unter Kontrolle des BZLF1-Promotors Zp. Wohingegen die Expression der
Luziferase im Vektor pHEBo-Luc keinem direkten Promotor untergeordnet ist. Zusätzlich wurden alle Ansätze mit
einem Renilla-Luziferase-Vektor ko-transfiziert. Aus dem Quotienten der Renilla- und Firefly-Luziferase-Aktivität
wurden die relativen Luziferase-Einheiten berechnet. Die Versuche wurden mindestens dreimal in Duplikaten
(293T) oder dreimal in Triplikaten (HeLa) durchgeführt. Die Luziferase-Aktivität wurde nach 48 h
Transfektionsdauer gemessen. *=p = 0,0129, **= p < 0,01 ***= p < 0,0009
In HeLa-Zellen konnte ebenfalls eine deutliche Aktivierung der Firefly-Luziferase-Aktivität
durch den Promotor Zp in Zellen mit Blimp1-Expression beobachtet werden (Abbildung 11
B). In Anwesenheit von Blimp1 (pEXP4-Blimp1) wurde in HeLa-Zellen eine signifikante
Induktion (p = 0,0129) des Firefly-Reportergens durch den Promotor Zp (pHEBo-Zp-Luc) im
Vergleich zu pHEBo-Luc-transfizierten HeLa-Zellen gemessen. Die Expression der FireflyLuziferase war auch im Vergleich zu Blimp1-negativen pHEBo-Zp-Luc-transfizierten Zellen
37
5. Ergebnisse
signifikant erhöht (p = 0,0099). In Abwesenheit von Blimp1 (pEXP4-MCS) und des Promotors
Zp (pHEBo-Luc) wurde nur eine sehr geringe Luziferase-Aktivität gemessen, die im
Vergleich zu den Bilmp1-positiven (pEXP4-Blimp1) und pHEBo-Zp-Luc-transfizierten Zellen
signifikant erniedrigt war (p = 0,0087).
Anhand der in 293T- und HeLa-Zellen durchgeführten Experimente im LuziferaseReportersystem konnte gezeigt werden, dass nur in Anwesenheit von Blimp1 eine Induktion
des BZLF1-Promotors Zp erfolgte. In den Versuchsansätzen mit dem Kontrollvektor pHEBoLuc war keine Induktion der Firefly-Luziferase nachweisbar. Die Daten implizieren einen
kausalen Zusammenhang zwischen der Expression von Blimp1 und der Induktion des
lytischen Promotors Zp.
5.1.5 Untersuchungen zur Blimp1-vermittelten Inhibierung des BZLF1Repressors ZEB1
Blimp1 wird in der Literatur als klassischer Repressor beschrieben und wirkt aus diesem
Grund vermutlich indirekt auf die Aktivierung des BZLF1-Promotors Zp. In dieser Arbeit sollte
der Einfluss von Blimp1 auf die Expression von ZEB1, einem negativen Regulator des
BZLF1-Promotors (siehe 3.6.2), untersucht werden.
A
Blimp1 konsensus Bindemotiv
ggaagggaag
B
ZEB1
-1000
-706
+1
-670
BBS2
5´- c gtc cct gga agg gaa ggg aag gga gtc cgg gct gcg - 3´
BBS1
Blimp1 Bindstellen
Abbildung 12: Schematische Darstellung des ZEB1-5´-UTR mit putativen Blimp1-Bindestellen. (A)
Konsensus Bindemotiv des Transkriptionsfaktors Blimp1. (B) Der 5´-UTR von -706 bis -670 Nukleotiden der
ZEB1-Sequenz besitzt zwei putative Blimp1-Bindestellen, BBS1 und BBS2.
38
5. Ergebnisse
Mit Hilfe des Computerprogramms rVista 2.0 wurde die 5´-UTR-Region des ZEB1-Gens
nach möglichen konsensus Bindemotiven für den Transkriptionsfaktor Blimp1 untersucht
(Abbildung 12 A). Die Analyse der ZEB1-Nukleotidsequenz ergab in der 5´-UTR-Region von
ZEB1 im Bereich von Nukleotid -706 bis -670 zwei mögliche Bindestellen für Blimp1
(Abbildung 12 B).
Zunächst wurden verschiedene Zelllinien mittels Western-Blot-Analyse auf die Expression
der Proteine ZEB1 und Blimp1 überprüft. Da es sich bei ZEB1 und Blimp1 um nukleäre
Transkriptionsfaktoren handelt, wurde für die Western-Blot-Analyse Gesamt-Zell-Lysat
gewonnen. Die EBV-negativen BL-Zellen Ramos wiesen keine Expression von ZEB1 auf. In
den übrigen Zelllinien konnte das Protein ZEB1 in unterschiedlich starker Menge detektiert
werden (Abbildung 13 A). Die EBV-negative Epithelzelllinie HEK293 und die beiden EBVpositiven lymphoblastoiden Zelllinien HS-Sultan und Arh-77 zeigten im Vergleich zu den
EBV-negativen Epithelzellen HeLa eine starke ZEB1 Expression. Dagegen konnte in den
EBV-negativen Myelom-Zellen RPMI-8226 und den EBV-positiven BL-Zelllinien Raji, Mutu I
und Mutu III und der lymphoblastoiden Zelllinie IM-9 nur eine schwache Expression des
Proteins ZEB1 detektiert werden. Für die Überprüfung der Blimp1-Expression wurden die
Myelom-Zellen RPMI-8226 als positive Kontrolle verwendet. Lediglich in den HS-SultanZellen konnte eine mit den RPMI-8226-Zellen vergleichbar starke Expression von Blimp1
nachgewiesen werden. Mit Ausnahme der Blimp1-negativen Zellen HEK293 und IM-9
wiesen die übrigen Zelllinien AGS, HeLa, Raji, Mutu I, Mutu III und Arh-77 eine
vergleichsweise schwache Expression des Proteins Blimp1 auf. Die Detektion von Aktin
diente zur Kontrolle der aufgetragenen Proteinmenge.
Auf Protein-Ebene konnte beim Vergleich aller untersuchten Zelllinien keine negative
Korrelation zwischen der Expression von ZEB1 und Blimp1 beobachtet werden. Nur die
RPMI-8226-Zellen zeigten in Anwesenheit von Blimp1 eine im Vergleich mit den Blimp1negativen HEK293-Zellen schwächere Expression von ZEB1 auf.
39
HS
-S
ul
ta
Ar
n
h77
III
IM
-9
I
M
ut
u
M
ut
u
i
Ra
j
RP
M
I-8
22
6
Ra
m
os
kDa
AG
S
A
HE
K2
93
He
La
5. Ergebnisse
170
ZEB1
100
Blimp1
Aktin
45
RP
M
I-8
2
He
La
HE
K2
9
bp
AG
S
3
26
B
700
ZEB1
200
Blimp1
300
Aktin
Abbildung 13: Untersuchung der ZEB1- und Blimp1-Expression in verschiedenen Zelllinien. Die EBVnegativen Epithelzelllinien AGS, HEK293 und HeLa, die EBV-negative Myelom-Zelllinie RPMI-8226, die EBVnegative BL-Zelllinie Ramos sowie die EBV-positiven BL-Zelllinien Raji, Mutu I und Mutu III und die
lymphoblastoiden Zelllinien IM-9, HS-Sultan und Arh-77 wurden (A) auf Proteinebene mittels Western-BlotAnalyse auf die Expression von ZEB1 und Blimp1 überprüft. Hierfür wurde Gesamt-Zell-Lysat im SDS-PAGE
aufgetrennt. Die Analyse der Protein-Lysate erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegen ZEB1 und Blimp1 und
HRP-konjugierten Sekundärantikörpern. Die Detektion von Aktin diente als Ladekontrolle der eingesetzten
Proteinmenge. (B) Semiquantitative RT-PCR-Analyse der Expression von ZEB1 und Blimp1 auf mRNA-Ebene
mittels spezifischen Oligonukleotiden nach Gesamt-RNA-Isolation und cDNA-Synthese. Die PCR-Produkte
wurden in einem 1,8 %-igem Agarosegel aufgetrennt. Die Amplifikation von Aktin diente als Kontrolle der
eingesetzten cDNA-Menge. Die Größenstandards wurden in kilo Dalton (kDa) und Basenpaaren (bp) angegeben.
HRP: horseradish peroxidase.
Zusätzlich wurde in den EBV-negativen Zelllinien AGS, HEK293, HeLa und RPMI-8226 die
Expression von ZEB1 und Blimp1 auf mRNA-Ebene mittels semiquantitativer RT-PCRAnalyse überprüft (Abbildung 13 B). Für die Amplifikation der PCR-Produkte wurde GesamtRNA isoliert und in einer reversen Transkriptase-Reaktion in cDNA umgeschrieben. Ein
eindeutiger Einfluss von Blimp1 auf die Expression der ZEB1-mRNA konnte nicht festgestellt
werden, da die stark Blimp1-positiven RPMI-8226 Zellen die stärkste Expression von ZEB1mRNA aufwiesen. Bei den schwach Blimp1-positiven AGS- und HeLa-Zellen konnte
hingegen im Vergleich mit den Blimp-1-negativen HEK293-Zellen eine verringerte
Expression von ZEB1 beobachtet werden. Die Amplifikation von Aktin diente zur Kontrolle
der eingesetzten cDNA-Menge.
40
5. Ergebnisse
HEK293
-
P4
-B
lim
p1
pE
X
-M
CS
P4
P4
pE
X
pE
X
-
P4
-M
CS
-B
lim
p1
HeLa
pE
X
A
kDa
ZEB1
170
Blimp1
100
Aktin
45
B
bp
ZEB1
700
Blimp1
200
300
Aktin
Abbildung 14: Untersuchung der Blimp1-vermittelten Inhibierung der ZEB1-Expression. HEK293- und
HeLa-Zellen wurden für 48 h mit dem Blimp1-Expressionsvektor (pEXP4-Blimp1) und dem korrespondierenden
Kontrollvektor (pEXP4-MCS) transient transfiziert oder unbehandelt gelassen (-). (A) Zum Nachweis der Proteine
ZEB1 und Blimp1 wurde Gesamt-Zell-Lysat im SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot-Analyse
untersucht. Die Analyse der Protein-Lysate erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegen ZEB1 und Blimp1 und
HRP-konjugierten Sekundärantikörpern. Die Detektion von Aktin diente zur Überprüfung der geladenen
Proteinmenge. (B) Die mRNA-Expression von ZEB1 und Blimp1 wurde mittels semiquantitativer RT-PCR-Analyse
überprüft. Hierfür wurde Gesamt-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die Amplifikation von Aktin diente zur
Kontrolle der eingesetzten cDNA-Menge. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,8 %-igem Agarosegel
aufgetrennt. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für jeweils drei unabhängig durchgeführte
Experimente. Die Größenstandards wurden in kilo Dalton (kDa) und Basenpaaren (bp) angegeben. HRP:
horseradish peroxidase.
Um die mögliche Inhibierung der ZEB1-Expression durch den Transkriptionsfaktor Blimp1
weiter zu untersuchen, wurden im folgenden HEK293- und HeLa-Zellen für 48 h transient mit
dem Blimp1-Expressionsvektor pEXP4-Blimp1 transfiziert. Der korrespondierende Vektor
pEXP4-MCS wurde als Negativkontrolle der Blimp1-Expression verwendet. In der WesternBlot-Analyse in Abbildung 14 A war nach Transfektion mit dem Vektor pEXP4-Blimp1 sowohl
in HEK293 als auch in HeLa-Zellen eine deutliche ektopische Blimp1-Expression zu
erkennen. Kontrollvektor-transfizierte und unbehandelte HEK293-Zellen wiesen keine
Expression von Blimp1 auf. In unbehandelten HeLa-Zellen sowie in Kontrollvektor-infizierten
Zellen wurde eine schwache endogene Blimp1-Expression nachgewiesen. Die schwache
41
5. Ergebnisse
endogene Blimp1-Expression in HeLa-Zellen hatte allerdings keinen Effekt auf die Induktion
des BZLF1-Promotors Zp in den Luziferase-Versuchen (Abbildung 11 B). Der Nachweis von
ZEB1 in der Western-Blot-Analyse zeigte keine inhibierende Funktion von Blimp1 auf die
Expression von ZEB1. Auch in Anwesenheit von ektopisch exprimiertem Blimp1 konnte
weder in HEK293- noch in HeLa-Zellen eine Reduktion der ZEB1-Expression im Vergleich
mit den unbehandelten und den Kontroll-transfizierten Zellen beobachtet werden. Die
Detektion von Aktin zeigte, dass ungefähr gleiche Mengen an Protein für die Western-BlotAnalysen aufgetragen wurden.
Die mögliche Inhibierung der ZEB1-Expression durch ektopische Blimp1-Expression wurde
zusätzlich auf mRNA-Ebene untersucht (Abbildung 14 B). Hierfür wurden Gesamt-RNA aus
pEXP4-Blimp1-, pEXP4-MCS und unbehandelten HEK293- und HeLa-Zellen isoliert, in
cDNA umgeschrieben und in einer semiquantitativen RT-PCR-Reaktion mit spezifischen
Oligonukleotiden für ZEB1 und Blimp1 amplifiziert. Auch auf mRNA-Ebene konnte keine
Inhibierung der ZEB1-Expression in Anwesenheit von Blimp1 nachgewiesen werden. In
HEK293- und HeLa-Zellen war nach ektopischer Blimp1-Expression keine Hemmung der
ZEB1-mRNA-Menge zu beobachten. HeLa-Zellen zeigten auf mRNA-Ebene nur eine sehr
schwache endogene mRNA-Expression für Blimp1. Die Amplifikation von Aktin diente zur
Kontrolle der eingesetzten cDNA-Menge in der PCR-Reaktion.
Die Daten mit ektopisch exprimiertem Blimp1 lassen weder auf Protein- noch auf mRNAEbene in HEK293- oder HeLa-Zellen einen Einfluss von Blimp1 auf die Expression von ZEB1
erkennen.
42
5. Ergebnisse
5.2 Untersuchung zur Inhibition der lytischen Reaktivierung von
EBV durch die virale miR-BHRF1-3
Die Gruppe um Eain Murphey hat einen quantitativen Algorithmus entwickelt um Zielgene
von herpesviralen miRNAs vorherzusagen [277]. Sie konnten zwei mögliche Bindestellen für
die zwei EBV-kodierte miRNAs miR-BHRF1-3 und miR-BART5 in der mRNA des
BZLF1/BRLF1 3´-UTR von EBV bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bindung
der EBV-kodierten mir-BHRF1-3 an den 3´-UTR der mRNA des unmittelbar frühen lytischen
Gens BZLF1 untersucht, da die zweite miRNA, miR-BART5, nur in Epithelzellen exprimiert
wird [268].
In Abbildung 3 ist die Transkription von BZLF1 und BRLF1 schematisch dargestellt. Die
Induktion von BZLF1 ist für die Aktivierung des lytischen Zyklus von EBV unbedingt
erforderlich. Die Expression von BRLF1 erfolgt unmittelbar danach. Die Expression von
BZLF1 unter dem Promotor Zp ergibt ein monocistronisches mRNA-Transkript, das
ausschließlich für das Protein BZLF1 kodiert. Wohingegen die BZLF1-Expression durch den
Rp-Promotor in einer bicistronischen mRNA für die beiden unmittelbar frühen Proteine
BZLF1 und BRLF1 resultiert. Bei der Induktion des lytischen Zyklus erfolgt als erstes die
Expression von BZLF1 durch den Zp-Promotor. Die Induktion des dahinter geschalteten RpPromotors wird durch den Transkriptionsfaktor BZLF1 aktiviert. Sowohl BRLF1 als auch
BZLF1 wirken als Transkriptionsfaktoren auf die Expression der frühen Gene des lytischen
Zyklus.
Die Haarnadelstruktur der unreifen miR-BHRF1-3 ist in Abbildung 15 A dargestellt. Die
Position der reifen miR-BHRF1-3, von Nukleotid 3 bis 24, ist hierbei in der Struktur der primiRNA in grau hervorgehoben. Darunter ist die Sequenz der prozessierten reifen, 22 nt
langen, miR-BHRF1-3 abgebildet. Die reife miR-BHRF1-3 besitzt eine sogenannte „seed“Sequenz (rot) zur Bindung von komplementären mRNA-Sequenzen. Die „seed“-Sequenz
besteht aus 7 nt und befindet sich an Position 2 bis 8 in der reifen miRNA. Die Prozessierung
von der pri-miRNA zur reifen miRNA ist in Abbildung 6 dargestellt.
43
5. Ergebnisse
A
--uc
uaacgg
ga
u
aca
aau
agugug aagcac
cgu
u
gcg
auugcu ucgcac uucgug
g
--aac
uaaa
uc
-
u pri-miR-BHRF1-3 Haarnadelstruktur
3 - uaacgggaaguguguaagcaca - 24
reife miR-BHRF1-3 mit „seed”-Sequenz
B
miR-BHRF1-3
mRNA
weniger BZLF1 Protein
BZLF1
inhibierte lytische Reaktivierung
BZLF1 3‘-UTR
Abbildung 15: Struktur und Funktion der miR-BHRF1-3. (A) Darstellung der pri-miR-BHRF1-3-Sequenz in der
Haarnadelstruktur, mit der reifen miRNA-Sequenz in grau hervorgehoben. Darunter ist die reife miR-BHRF1-3Sequenz mit rot hinterlegter „seed“-Sequenz zu sehen. (B) Die miR-BHRF1-3 besitzt eine dem BZLF1 3´-UTR
komplementäre „seed“-Sequenz (rot). Die vorhergesagte Bindung der miRNA an den 3´-UTR sollte die
Translation der BZLF1-mRNA inhibieren und die Aktivierung des lytischen Zyklus blockieren.
Eine zur „seed“-Sequenz komplementäre Bindstelle für die miR-BHRF1-3 befindet sich im 3´UTR der monocistronischen mRNA für das lytische Gen BZLF1 und auch im 3´-UTR der
bicistronischen mRNA für die beiden unmittelbar frühen Gene BZLF1/BRLF1 (Abbildung 15
B). Bei einer Bindung der miR-BHRF1-3 an den 3´-UTR von BZLF1 wird eine Hemmung der
BZLF1-Protein-Synthese erwartet. Es wird angenommen, dass eine Bindung der miRBHRF1-3 an den BZLF1-3´-UTR die Aktivierung des lytischen Zyklus inhibiert.
5.2.1 Untersuchung der miR-BHRF1-3 Expression in Zelllinien
Zuerst wurde die Expression der miR-BHRF1-3 in verschiedenen EBV-positiven Zelllinien
untersucht. Hierfür wurde Gesamt-RNA inklusive der kleinen miRNAs aus den Zellen isoliert,
in einem Harnstoffgel aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert. Darauf
erfolgte die Detektion der viralen miR-BHRF1-3 durch eine spezifische Sonde, welche mit
dem radioaktiven Isotop 32P markiert war.
Einige Studien zeigten bereits, dass die miR-BHRF1-3 nur in EBV-positiven B-Zellen mit
einer Latenz III exprimiert wird. Die miRNA konnte nicht in Zellen mit der Latenz I oder II
44
5. Ergebnisse
nachgewiesen werden [268, 278]. Aus diesem Grund wurden für die Northern-Blot-Analyse
und die RT-PCR-Analyse in Abbildung 16 sowohl B-Zelllinien mit der Latenz I als auch mit
der der Latenz III verwendet.
Die BL-Zelllinien Akata und Mutu I besitzen die Latenz I und wiesen keine Expression der
miR-BHRF1-3 auf (Abbildung 16 A). Wohingegen in der BL-Zelllinie Mutu III, die durch
längere Kultivierung einen Wechsel von der Latenz I zur Latenz III durchlaufen hat, die
Expression der reifen miR-BHRF1-3 detektiert werden konnte. Ebenso konnte in der
lymphoblastoiden Zelllinie HS-Sultan, welche ebenfalls eine Latenz III aufzeigt, die
Expression der reifen miR-BHRF1-3 nachgewiesen werden. Die lymphoblastoide Zelllinie IM9 mit einer Latenz III exprimierte wie die BL-Linie Raji keine miR-BHRF1-3. Die EBVnegative BL-Zelllinie Ramos wurde als Negativkontrolle mitgeführt und zeigte in der
Northern-Blot-Analyse wie erwartet kein Signal für die EBV-kodierte miR-BHRF1-3. Als
Ladekontrolle für den Northern-Blot wurde eine
32
P-markierte Sonde gegen die ubiquitär
m
os
Ra
Ra
j
i
ul
ta
n
HS
-S
IM
-9
III
M
ut
u
I
M
ut
u
bp
Ak
a
A
ta
vorkommende humane miRNA miR-16 verwendet.
25
miR-BHRF1-3
20
hsa-miR- 16
20
B
BZLF1
200
200
gp220
300
Aktin
200
Abbildung 16: Untersuchung der Expression von miR-BHRF1-3 und mRNAs für lytische Proteine in
Zelllinien. Die EBV-positiven BL-Zelllinien Akata, Mutu I, Mutu III und Raji, und die LCLs IM-9 und HS-Sultan
sowie die EBV-negative BL-Zellline Ramos wurden auf die (A) Expression der miR-BHRF1-3 mittels NorthernBlot-Analyse überprüft. Die humane miR-16 diente als Ladekontolle. (B) Die Untersuchung zur Expression des
unmittelbar frühen lytischen Gens BZLF1 und des späten lytischen Gens gp220 auf mRNA erfolgte durch RNAIsolation, cDNA-Synthese und anschließender RT-PCR. Die Amplifikation von Aktin diente als Kontrolle der
eingesetzten cDNA-Konzentrationen. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,8 %-igem Agarosegel aufgetrennt.
Die Größenstandards wurden in Basenpaaren (bp) angegeben. LCL: lymphobalstoide Zelllinie.
45
5. Ergebnisse
Zusätzlich wurde in diesen Zelllinien noch die Expression des unmittelbar frühen lytischen
Gens BZLF1 und späten lytischen Gens gp220, ein Glykoprotein des Viruskapsids, mittels
RT-PCR untersucht. Da die Expression von gp220 erst spät im Verlauf des lytischen Zyklus
erfolgt, diente der Nachweis von gp220 als Kontrolle der durchlaufenen lytischen Replikation.
Für die semiquantitative RT-PCR wurde Gesamt-RNA isoliert und nach einem DNaseVerdau in einer reversen Transkriptase-Reaktion in cDNA umgeschrieben. Die gewonnene
cDNA wurde anschließend mittels spezifischen Oligonukleotiden für BZLF1 und gp220 in
einer PCR-Reaktion amplifiziert (Abbildung 16 B). Die miR-BHRF1-3 negativen Zelllinien
Akata, Mutu I und IM-9 zeigten im Agarosegel spezifische Produkte für die Expression der
lytischen Gene BZLF1 und gp220. Wohingegen in den miR-BHRF1-3 exprimierenden
Zelllinien Mutu III und HS-Sultan keine Signale für BZLF1 und gp220 nachgewiesen werden
konnten. Die EBV-negative BL-Zellline Ramos und die EBV-positive BL-Zelllinie Raji zeigten
weder für die miR-BHRF1-3 noch für die lytischen Gene eine Expression. Spezifische
Oligonukleotide für Aktin wurden in der PCR-Reaktion als Kontrolle der eingesetzten cDNAKonzentrationen verwendet.
Anhand der durchgeführten Experimente konnte in den EBV-positiven B-Zelllinien eine
negative Korrelation der miR-BHRF1-3-Expression mit dem Vorkommen von mRNAs
lytischer Proteine aufgezeigt werden. Nur in miR-BHRF1-3-negativen Zelllinen wurde die
Expression der mRNAs für BZLF1 und gp220 beobachtet.
5.2.2 Biochemische Verifizierung der miR-BHRF1-3-Bindung an den
BZLF1-3´-UTR
Die Bindung der viralen miR-BHRF1-3 an den BZLF1 3´-UTR wurde anhand eines
Luziferase-Reporter-Systems untersucht. Die EBV-kodierte miR-BHRF1-3 wurde hierfür in
einem heterologen System in der EBV-negativen humanen Epithelzellline HEK293
exprimiert. Zur Generierung des miR-BHRF1-3-Expressionsvektors wurde die miRNASequenz aus dem miR-BHRF1-3-Vektor von der Firma Geneservice (Cambridge, UK)
herausgeschnitten und in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pEF1/Mcy-HisA kloniert.
Anschließend wurde die Expression und Prozessierung der miR-BHRF1-3 in HEK293-Zellen
überprüft, indem die Zellen zum einem mit dem miR-BHRF1-3-Expressionsvektor (pmiRBHRF1-3) und zum anderen mit dem korrespondierenden Kontrollvektor (pKontroll) transient
transfiziert wurden. 48 h nach der Transfektion wurde Gesamt-RNA isoliert und mittels
Northern-Blot-Analyse die ektopische miR-BHRF1-3-Expression überprüft (Abbildung 17).
46
5. Ergebnisse
miR-BHRF1-3
iR
-B
HR
F1
pm
ro
ll
75
pK
on
t
-
bp
HS
-S
ul
ta
n
3
HEK293
pre-miRNA
50
25
reife miRNA
20
hsa-miR-16
20
Abbildung 17: Northern-Blot-Analyse zur Expression und Prozessierung ektopisch exprimierter miRBHRF1-3 in HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wurden mit Lipofectamin 2000 transient mit dem miR-BHRF1-3Expressionsvektor (pmiR-BHRF1-3) transfiziert. Nach 48 h wurde die RNA isoliert und eine Northern-Blot-Analyse
zur Überprüfung der Prozessierung reifer miRNA durchgeführt. Die EBV-positive Zellline HS-Sultan,
untransfizierte HEK293-Zellen und mit dem Kontrollvektor (pKontroll) transfizierte HEK293-Zellen wurden als
Kontrollen der miR-BHRF1-3-Expression verwendet. Die humane miR-16 diente als Ladekontrolle. Die
Größenstandards wurden in Basenpaaren (bp) angegeben.
Untransfizierte und Kontrollvektor-transfizierte HEK293-Zellen zeigten kein Signal für die
miR-BHRF1-3. Wohingegen bei pmiR-BHRF1-3-transfizierten HEK293-Zellen in der
Northern-Blot-Analyse sowohl ein Signal für die pre-miRNA als auch für die prozessierte reife
miR-BHRF1-3 nachgewiesen werden konnte. Die Detektion der endogenen miR-BHRF1-3 in
der Zelllinie HS-Sultan diente als positive Kontrolle für die Expression und die Prozessierung
der ektopisch eingebrachten miRNA. Zur Überprüfung der eingesetzten RNA-Mengen wurde
die Northern-Blot-Membran zusätzlich mit einer Sonde für die humane miR-16 hybridisiert.
47
5. Ergebnisse
A
Dualer Luziferase-Vektor
miR-BHRF1-3
Expressionsvektor
RenillaLuziferase
BZLF1 3‘-UTR
FireflyLuziferase
HEK 293
B
miR-BHRF1-3
mRNA Renilla-Luziferase
Expression inhibiert
BZLF1 3‘-UTR
mRNA
Firefly-Luziferase
relative Renilla-Expression =
normale Expression
Aktivität Firefly-Luziferase
Aktivität Renilla-Luziferase
Abbildung 18: Prinzip der dualen Luziferase-Versuche. (A) Der duale Luziferasevektor kodiert für die RenillaLuziferase, welche den BZLF1 3´-UTR besitzt, und für die Firefly-Luziferase. Die beiden Luziferasen werden von
zwei unabhängigen Promotoren exprimiert. Für die dualen Luziferase-Versuche wurden HEK293-Zellen mit dem
Luziferasevektor und dem miR-BHRF1-3-Expressionsvektor transient ko-transfiziert. (B) Eine Bindung der reifen
miR-BHRF1-3 an den BZLF1 3´-UTR in der mRNA der Renilla-Luziferase führt zur Inhibierung der RenillaLuziferase-Expression. Die Expression der Firefly-Luziferase wird durch die miRNA nicht beeinflusst. Die FireflyLuziferase-Expression dient zur Berechnung der relativen Renilla-Luziferase-Aktivität in Bezug auf die FireflyAktivität.
48
5. Ergebnisse
Für die Untersuchung der miR-BHRF1-3-Bindung an den BZLF1-3´-UTR wurden in HEK293Zellen Luziferase-Versuche mit einem dualen Luziferase-Vektor durchgeführt. In diesem
dualen Vektor wurde die 53 nt lange 3´-UTR-Sequenz von BZLF1 hinter das RenillaLuziferase-Reportergen kloniert (Abbildung 18 A). Der Vektor kodiert außerdem für die
Firefly-Luziferase, wobei die Expression beider Luziferasen von unabhängigen Promotoren
erfolgt. Um die Bindung von miR-BHRF1-3 an den 3´-UTR von BZLF1 zu untersuchen
wurden HEK293-Zellen transient mit dem dualen Luziferase-Vektor und dem miR-BHRF1-3Expressionsvektor ko-transfiziert. Wie in Abbildung 18 B dargestellt, führt eine Bindung der
miR-BHRF1-3 an den 3´-UTR zu einer Hemmung der Renilla-Luziferase-Aktivität.
Wohingegen die Aktivität der Firefly-Luziferase von der miRNA-Expression nicht beeinflusst
wird. Die Messung der Firefly-Luziferase-Aktivität diente zum einen der Quantifizierung der
Transfektion und zum anderen wurde die relative Renilla-Luziferase Expression durch den
Quotienten aus Firefly- und Renilla-Luziferase-Aktivität berechnet.
Zu
Beginn
wurde
der
Effekt
verschiedener
Konzentration
des
miR-BHRF1-3-
Expressionsvektors auf die relative Renilla-Luziferase-Expression in dualen LuziferaseVersuchen getestet. Dazu wurde die humane Epithelzellline HEK293 für 48 h transient mit je
7,5 ng dualem Luziferase-Vektor pLuc-3´-UTRwt und dem miR-BHRF1-3-Expressionsvektor
in Konzentrationen von 125 bis 1200 ng DNA ko-transfiziert (Abbildung 19 A). Zusätzlich
wurden HEK293-Zellen mit ebenfalls 7,5 ng pLuc-3´-UTRwt und 600 ng pKontroll kotransfiziert. Die Versuche wurden einmal in Triplikaten durchgeführt und der Mittelwert
inklusive Standardfehler berechnet. Die Quotienten aus Firefly- und Renilla-LuziferaseAktivität der Kontrollvektor-transfizierten Ansätze wurden auf 100 % gesetzt und die
Hemmung
der
miR-BHRF1-3-induzierten
relativen
Renilla-Luziferase-Aktivität
darauf
bezogen. Bei allen Versuchsansätzen konnte in Anwesenheit der miR-BHRF1-3 ein
Rückgang der Renilla-Luziferase-Aktivität um mindestens 21 % in Bezug auf den
Kontrollansatz beobachtet werden. Die Transfektion von 600 ng pmiR-BHRF1-3 führt zur
stärksten Reduktion der Renilla-Luziferase-Aktivität. Verglichen mit dem Kotrollansatz (100
%) wurde nur noch eine Renilla-Luziferase-Aktivität von 58 % nachgewiesen. Bei den
übrigen Konzentrationen an eingesetzter miRNA-Menge wurden in Bezug auf den
Kontrollansatz folgende relative Renilla-Luziferase-Aktivitäten gemessen: 125 ng (62 %), 250
ng (64 %), 375 ng (68 %), 500 ng (70 %), 800 ng (79 %) und 1200 ng (66 %). Es ist zu
beachten, dass in diesem Luziferase-Experiment die verschiedenen Konzentrationen der
miR-BHRF1-3 immer auf den Kontrollansatz mit 600 ng pKontroll bezogen wurden.
49
5. Ergebnisse
Aus diesem Grund wurde in einem weiteren Luziferase-Experiment der Einfluss der miRBHRF1-3-Expression bei eingesetzten Konzentrationen von 600 bzw. 1200 ng pKontroll und
600 bzw. 1200 ng pmiR-BHRF1-3 verglichen. Der Versuch wurde ebenfalls einmal in
Triplikaten für 48 h in transient ko-transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt (Abbildung 19
B). Die Quotienten aus Firefly- und Renilla-Luziferase-Aktivität der pKontroll-transfizierten
Ansätze wurden wiederum auf 100 % gesetzt und die Hemmung der miR-BHRF1-3induzierten relativen Renilla-Luziferase-Aktivität darauf bezogen. Die Reduktion der relativen
Renilla-Luziferase-Aktivität war bei den eingesetzten Plasmid-Konzentrationen vergleichbar.
Die Transfektion von 600 ng pmiR-BHRF1-3 führte zu einem Rückgang der relativen RenillaLuziferase-Aktivität auf 58 % im Vergleich zu 600 ng pKontroll. Die Transfektion von 1200 ng
pmiR-BHRF1-3 führte verglichen mit 1200 ng pKontroll zu einer Reduktion der relativen
Renilla-Luziferase-Aktivität auf 60 %. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden in allen
weiteren Luziferase-Experimenten 7,5 ng pLuc-3´-UTR und 600 ng pmiR-BHRF1-3- oder
pKontroll eingesetzt.
pKontroll / pLuc-3´-UTRwt
pmiRNA-BHRF1-3 / pLuc-3´-UTRwt
A
B
600 125
250 375
500 600
800 1200 ng
600
1200
ng
Abbildung 19: Titration der DNA-Menge für duale Luziferase-Versuche. HEK293-Zellen wurden mit
Lipofectamin 2000 und verschiedenen Konzentrationen an miRNA-Expressionsvektor (pmiR-BHRF1-3) bzw.
dualem Luziferasevektor (pLuc-3´-UTRwt) transient transfiziert. (A) Es wurden Konzentrationen von 125 ng bis
1200 ng miRNA-Expressionsvektor mit je 7,5 ng Luziferasevektor in HEK293-Zellen ko-transfiziert. Die Hemmung
der Renilla-Luziferase-Aktivität wurde in Bezug auf HEK293-Zellen mit Luziferasevektor (7,5 ng) und
Kontrollvektor pKontroll (600 ng) untersucht. (B) Der Effekt von 7,5 ng Luziferasevektor mit wt BZLF1 3´-UTR und
600 ng oder 1200 ng miRNA-Expressionsvektor bzw. Kontrollvektor wurde verglichen. Die Experimente in (A) und
(B) wurden einmal in Triplikaten durchgeführt. Die Luziferase-Aktivität wurde 48 h nach der Transfektion
gemessen. Die relative Luziferase-Aktivität wurde aus dem Quotient der Firefly- und Renilla-Luziferase-Aktivität
berechnet. wt, Wildtyp.
50
5. Ergebnisse
In zusätzlichen Luziferase-Versuchen wurde überprüft, ob der Zeitpunkt der miRNATransfektion einen Einfluss auf die Hemmung der Renilla-Luziferase-Aktivität zeigte. Hierfür
wurden HEK293-Zellen zuerst nur mit pmiR-BHRF1-3 transfiziert. Erst nach 24 h erfolgte die
Transfektion des dualen Luziferase-Vektors. Die Messung der Luziferase-Aktivität wurde 48
h nach der ersten Transfektion durchgeführt. Es konnten keine Unterschiede zwischen der
zeitversetzten Transfektion und der Ko-Transfektion festgestellt werden (ohne Abbildung).
Nach mehrmaliger Wiederholung der Luziferase-Experimente mit 48 h Transfektionsdauer,
zeigte sich eine starke Schwankung in der relativen Renilla-Luziferase-Aktivität in
Anwesenheit der miR-BHRF1-3. Um auszuschließen, dass die miRNA innerhalb der 48 h
abgebaut wird, wurden die folgenden Luziferase-Versuche mit einer Transfektionsdauer von
24 h durchgeführt.
A
BZLF1 3´ - UTR ( 53nt )
ctcccgttattgaaaccacgcctgcttcacgcctcgtttactaatggaatatt
miR-BHRF1-3 Bindestelle (wt)
ctTAAACtattgaaaccacgcctgcttcacgcctcgtttactaatggaatatt
mutierte miR-BHRF1-3 Bindestelle (mut)
B
pKontroll / pLuc-3´-UTRwt
pmiRNA-BHRF1-3 / pLuc-3´-UTRwt
pKontroll / pLuc-3´-UTRmut
pmiRNA-BHRF1-3 / pLuc-3´-UTRmut
*** = p < 0,0005
Abbildung 20: Untersuchung der miR-BHRF1-3-Bindung and den Wildtyp BZLF1 3´-UTR und einen
mutierten BZLF1 3´-UTR. (A) Darstellung der Sequenz des BZLF1 3´-UTR mit natürlicher Bindestelle (grau) und
einer mutierten Bindestelle (grün) für die miR-BHRF1-3. (B) HEK293-Zellen wurden in 3 unabhängigen
Versuchen mit Luziferasevektoren für den Wildtyp BZLF1 3´-UTR (pLuc-3´-UTRwt) bzw. den mutierten 3´-UTR
(pLuc-3´-UTRmut) und miRNA-Expressionsvektor (pmiR-BHRF1-3) bzw. Kontrollvektor (pKontroll) transient kotransfiziert. Die Ermittlung der Luziferase-Aktivität erfolgte 24 h nach der Transfektion. Die einzelnen Versuche
wurden in drei unabhängigen Versuchen jeweils in Triplikaten durchgeführt. wt, Wildtyp; mut, mutiert. *** = p <
0,0005.
51
5. Ergebnisse
In den folgenden Experimenten wurde die Bindung der miR-BHRF1-3 an die vorhergesagte
BZLF1-Bindestelle im natürlich vorkommenden 3´-UTR (wt) und an den 3´-UTR mit einer
mutierten Bindestelle im 3´-UTR (mut) verglichen (Abbildung 20 A). Hierfür wurden HEK293Zellen durch Lipofektion mit je 7,5 ng der Luziferasevektoren für den Wildtyp BZLF1-3´-UTR
(pLuc-3´-UTRwt) oder den mutierten BZLF1-3´-UTR (pLuc-3´-UTRmut) mit jeweils 600 ng
pKontroll oder pmiR-BHRF1-3 ko-transfiziert. Die Versuche wurden in drei unabhängigen
Experimenten in Triplikaten durchgeführt. Nach einer Transfektionsdauer von 24 h wurden
die Zellen lysiert und die Aktivitäten der Renilla- und Firefly-Luziferase im Luminometer
gemessen. Für die Quantifizierung der Transfektionseffizienz wurde für jeden Einzelversuch
der Quotient aus Firefly- und Renilla-Luziferase-Aktivität berechnet. Hierfür wurde aus jedem
Versuch mit Triplikaten der Mittelwert bestimmt. In Abbildung 20 B ist der Mittelwert aus drei
unabhängig durchgeführten Experimenten mit Standardfehler dargestellt. Die relative
Renilla-Luziferase-Aktivität der Kontrollvektor-transfizierten Versuchsansätze wurde auf 100
% gesetzt. Die Renilla-Luziferase-Aktivität der pmiR-BHRF1-3-transfizierten Zellen wurde auf
die 100 % bezogen.
Die ektopische miR-BHRF1-3-Expression führte in Versuchen mit dem BZLF1-3´-UTRwt zu
einer statistisch signifikanten Reduktion der relativen Renilla-Luziferase-Aktivität um 35 %
verglichen mit den Kontrollvektor-infizierten Zellen (p = 0,0001). Wohingegen die Expression
der miRNA die relative Aktivität der Renilla-Luziferase in pLuc-3´-UTRmut-transfizierten
Zellen bezogen auf die Zellen ohne miR-BHRF1-3-Expression (100 %) nur um 16 %
hemmte. Der Einfluss der miRNA auf den mutierten 3´-UTR ist ebenfalls statistisch
signifikant (p = 0,0001). Die Bindung der miR-BHRF1-3 an die natürliche Bindestelle (BZLF1
3´-UTR wt) ist im Vergleich zu der Bindung an die mutierte Bindestelle im 3´-UTR von BZLF1
stark signifikant (p = 0,0004) (Abbildung 20 B). In Anwesenheit der miR-BHRF1-3 kam es zu
keiner kompletten Inhibierung der Renilla-Luziferase-Expression, aber zu einer deutlichen
Reduktion der Renilla-Luziferase-Translation.
5.2.3 Verifizierung von endogenem BZLF1 als Ziel der miR-BHRF1-3 in
EBV-positiven B-Zellen
Nachdem in dualen Luziferase-Versuchen eine Bindung der miR-BHRF1-3 an den 3´-UTR
von BZLF1 gezeigt wurde, sollte der Einfluss der viralen miRNA auf die endogene
Expression des lytischen Proteins BZLF1 in EBV-positiven Zellen untersucht werden. Bei der
Überprüfung der miR-BHRF1-3-Expression in verschiedenen Zelllinien in Abschnitt 5.2.1,
konnte bereits eine negative Korrelation zwischen der Translation der BZLF1-mRNA und
52
5. Ergebnisse
dem Vorkommen der miRNA beobachtet werden (Abbildung 16). Die BL-Zelllinie Mutu I
weist in vitro eine relativ hohe Rate an spontaner Aktivierung des lytischen Zyklus auf. Mutu
I-Zellen zeigten in der Northern-Blot-Analyse keine miR-BHRF1-3-Expression (Abbildung 16
A) aber in der reversen Transkriptase-PCR (RT-PCR) deutliche mRNA-Level für die lytischen
Proteine BZLF1 und gp220 (Abbildung 16 B). Dagegen ist bei der miR-BHRF1-3-positiven
BL-Zelllinie Mutu III keine spontane lytische Reaktivierung zu beobachten. Daher eignet sich
die Zelllinie Mutu I als Modell zur Untersuchung von ektopischer miR-BHRF1-3-Expression
auf die Induktion und die Transkription der BZLF1 mRNA. Die BL-Zellen lassen sich transient
nur schwer und mit sehr geringer Effizienz transfizieren. Aus diesem Grund wurden Mutu IZellen durch Elektroporation (Amaxa) und anschließender Selektion mit 1 mg/ml G418 stabil
mit dem miR-BHRF1-3-Expressionsvektor pmiR-BHRF1-3 oder dem Kontrollvektor pKontroll
transfiziert.
Durch Subklonierung konnten 14 stabil transfizierte Zelllinien generiert werden, wobei in elf
Zelllinien der miR-BHRF1-3-Expressionsvektor und in drei der Kontrollvektor integriert wurde
(Abbildung 21).
Die Expression der reifen miR-BHRF1-3 in den stabil-transfizierten Zelllinien wurde mit einer
spezifischen
32
P-markierten Sonde durch Northern-Blot-Analyse überprüft (Abbildung 21 A).
Die Zelllinien Mutu I und Mutu III wurden als Kontrollen mitgeführt und waren wie auch schon
in Abbildung 16 A negativ (Mutu I) bzw. positiv (Mutu III) für die miR-BHRF1-3-Expression.
Die Mutu I-Klone 7, 12, 5 und 23 zeigten keine Signale für die miR-BHRF1-3, obwohl sie
stabil mit dem miR-BHRF1-3-Expressionsvektor transfiziert wurden. Eine unterschiedlich
starke Expression der miRNA konnte in den miR-BHRF1-3 transfizierten Mutu I-Klonen 4,
18, 10, 15, 17, 8 und 22 nachgewiesen werden. Die Kontrollvektor-transfizierten Mutu IKlone 2, 63 und 36 waren in der Northern-Blot-Analyse wie erwartet negativ für die miRNAExpression. Die Hybridisierung der Northern-Blot-Membran mit einer spezifischen
32
P-
markierten Sonde gegen die ubiquitäre humane miRNA miR-16 diente als Ladekontrolle.
Sowohl in der RT-PCR-Analyse (Abbildung 21 B), als auch in der Western-Blot-Analyse
(Abbildung 21 C) ist die BZLF1-Expression zwischen den miR-BHRF1-3-positiven und negativen stabilen Zelllinen zu vergleichen. Denn die Transfektanten wurden unter den
gleichen Bedingungen, dem Selektionsmedium mit G418, kultiviert und einer AmaxaElektroporation unterzogen. Wohingegen die Ursprungs-Zellline keinem Elektroporationspuls
ausgesetzt war und in Standardmedium kultiviert wurde.
53
5. Ergebnisse
Um den Einfluss der miRNA-Expression auf die mRNA-Level des unmittelbar frühen
lytischen Proteins BZLF1 und des späten Viruskapsid-Proteins gp220 zu untersuchen, wurde
Gesamt-RNA aus den Zelllinien isoliert, mittels reverser Transkriptase-Reaktion in cDNA
umgeschrieben und mit spezifischen Oligonukleotiden für BZLF1 und gp220 in einer
semiquantitativen RT-PCR-Reaktion amplifiziert (Abbildung 21 B). Die Mutu I-Klone 4, 18, 15
und 17 mit ektopischer miR-BHRF1-3-Expression wiesen im Vergleich zu miRBHRF1-3negativen Klone (Klon 7, 12, 2, 63, 36, 5 und 23) ein geringeres Level an BZLF1-mRNA auf.
Wobei die miR-BHRF1-3-Expression in den Klone 10, 8 und 22 auf mRNA-Level keinen
deutlichen Einfluss auf die Transkription von BZLF1 erkennen ließ. Die RT-PCR zum
Nachweis von gp220 mRNA diente zur Überprüfung, ob in Anwesenheit der miR-BHRF1-3
nur die Expression von BZLF1, oder auch von späteren lytischen Genen beeinflusst wurde.
Die mRNA-Transkription des späten lytischen Proteins gp220 verhielt sich kongruent mit
dem mRNA-Level von BZLF1. Mutu III-Zellen, die endogen miR-BHRF1-3 exprimieren,
zeigten in der PCR keine Amplifikation für die mRNA der beiden lytischen Proteine.
Wohingegen die miR-BHRF1-3-negativen Mutu I-Zellen sowohl BZLF1 als auch gp220
exprimierten. Die durchgeführte RT-PCR-Analyse für Aktin wies auf eine gleichmäßig
eingesetzte cDNA-Konzentration hin.
Zusätzlich wurde der Einfluss der miR-BHRF1-3-Expression auf die Translation des lytischen
Proteins BZLF1 untersucht (Abbildung 21 C). Hierfür wurde Gesamt-Zell-Lysat aus den Mutu
I- und Mutu III-Zellen sowie den stabilen Klonen gewonnen und in der Western-Blot-Analyse
auf die Signalstärke des BZLF1-Proteins überprüft. Wie schon in der RT-PCR-Analyse auf
mRNA-Ebene, wiesen die Mutu I-Klone 4, 18, 15 und 17 mit ektopischer miR-BHRF1-3Expression im Vergleich zu miR-BHRF1-3-negativen Mutu I-Klonen (Klon 7, 12, 2, 63, 36, 5
und 23) auch auf Protein-Ebene ein geringeres Level an BZLF1 auf. Außerdem wurde auf
Protein-Ebene auch bei den Mutu I-Klonen 10, 8 und 22 ein Einfluss der miR-BHRF1-3 auf
die Transkription des Zielproteins BZLF1 beobachtet. Die miR-BHRF1-3-positive Zelllinie
Mutu III zeigte in der Western-Blot-Analyse kein Signal für das Protein BZLF1. Wohingegen
bei Mutu I-Zellen, die keine miR-BHRF1-3 exprimierten, das Protein BZLF1 detektiert werden
konnte, was für eine spontane lytische Reaktivierung in diesen Zellen spricht. Die stabiltransfizierten Zelllinien ohne exogene miR-BHRF1-3-Expression zeigten im Vergleich mit
den miR-BHRF1-3-negativen Mutu I-Zellen stärkere Signale für BZLF1. Dies deutete auf
eine erhöhte spontane Aktivierung des lytischen Zyklus in den transfizierten Zellen hin. Die
Analyse der Aktin-Signalstärke diente zur Überprüfung einer vergleichbaren Beladung mit
Proteinlysat.
54
III
23
#
22
#
8
#
17
#
15
#
10
#
5
#
36
pmiR-BHRF1-3
#
2
63
#
#
12
pKontroll
#
7
#
wt
18
wt
pmiR-BHRF1-3
#
4
bp
-
Mutu I
#
A
M
ut
u
M
ut
u
I
5. Ergebnisse
Klon-Nummer
25
miR-BHRF1-3
20
hsa-miR-16
20
B
200
BZLF1
200
gp220
300
Aktin
200
C
kDa
BZLF1
35
45
Aktin
Abbildung 21: Analyse der Expression von miR-BHRF1-3 und lytischer Proteine in stabilen Mutu I-miRBHRF1-3 Klonen. Mutu I-Zellen wurden durch Amaxa-Elektroporation mit dem Expressionsvektor für miRBHRF1-3 (pmiR-BHRF1.3) bzw. dem Kontrollvektor (pKontroll) transfiziert und durch G418-Zugabe stabil
32
selektioniert. (A) Die stabilen Mutu I-Klone wurden durch Northern-Blot-Analyse mittels einer spezifischen Pmarkierten Sonde auf die Expression der reifen miR-BHRF1-3 untersucht. Die Zelllinien Mutu I und Mutu III
wurden als Kontrollen verwendet und die humane miR-16 diente als Ladekontrolle. (B) Die mRNA-Expression
des unmittelbar frühen lytischen Gens BZLF1 und des späten lytischen Gens gp220 wurden durch die
Amplifikation mit spezifischen Oligonukleotiden mittels RT-PCR überprüft Hierfür wurde Gesamt-RNA in cDNA
umgeschrieben. Die amplifizierte Aktin-mRNA diente als Ladekontrolle. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,8
%-igem Agarosegel aufgetrennt. (C) Zum Nachweis des BZLF1-Proteins wurde Gesamt-Zell-Lysat im SDS-PAGE
aufgetrennt und durch anti-BZLF1 Antikörper und einen entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper
mittels Western-Blot-Analyse untersucht. Als Ladekontrolle wurde Aktin nachgewiesen. Die dargestellten
Ergebnisse sind repräsentativ für jeweils zwei unabhängig durchgeführte Experimente. Die Größenstandards
wurden in kilo Dalton (kDa) und Basenpaaren (bp) angegeben. HRP: horseradish peroxidase; wt = Wildtyp.
Es konnte keine Korrelation zwischen der Stärke der miRNA-Expression und der Expression
des Zielproteins BZLF1 hergestellt werden. Es ist zu beachten, dass die miRNA-Sequenz
bzw. der Kontrollvektor in den einzelnen Klonen durch ungerichtete Integration in das Mutu IGenom unterschiedlich reguliert werden. Außerdem bewirkten möglicherweise der
Elektroporationspuls und die Kultivierung im Selektionsmedium für die einzelnen Klone eine
ungleiche Stimulation der spontanen Aktivierung des lytischen Zyklus. Somit lässt sich die
unterschiedlich starke BZLF1-Expression der einzelnen Klone untereinander und im
Vergleich mit der Wildtyp-Zelllinie Mutu I erklären.
55
5. Ergebnisse
Die Mutu I-Klone 15, 17 und 22 zeigten in der Northern-Blot-Analyse nur eine schwache
miR-BHRF1-3-Expression und in der Western-Blot-Analyse ebenfalls nur ein schwaches
Signal für das Zielprotein BZLF1 (Abbildung 21 A und C). Wohingegen in den Mutu I-Klonen
10 und 8 trotz starker miR-BHRF1-3 Expression eine im Vergleich zu den anderen miRNApositiven Klonen relativ hohe BZLF1-Expression nachgewiesen wurde. Eine mögliche
Erklärung für die unterschiedliche Auswirkung der miRNA-Expression auf das Zielgen ist,
dass in den Mutu I-Klonen 10 und 8 nur wenige Zellen sehr viel miR-BHRF1-3 exprimieren,
was zu einem geringen Effekt auf die BZLF1-Expression in der gesamten Zellkultur führte.
Im Gegensatz hierzu exprimierten in den Mutu I-Klone 15, 17 und 22 vermutlich viele Zellen
wenig miR-BHRF1-3, aber dennoch genügend in den einzelnen Zellen, um einen Effekt auf
die BZLF1-Expression auszuüben.
Für eine bessere Analyse der BZLF1-Signalstärke der einzelnen Zelllinien in Abhängigkeit
von der miR-BHRF1-3-Expression wurden die Signale für BZLF1 und Aktin aus der
repräsentativen Western-Blot-Analyse in Abbildung 21 C mit dem Bildbearbeitungsprogramm
ImageJ gemessen. Die Signale von BZLF1 wurden für die Zelllinien auf den jeweiligen
Aktinwert normalisiert (Abbildung 22 A). Die relative Expression von BZLF1 war in den
Klonen 4, 18, 15 und 17 mit miR-BHRF1-3-Expression (dunkelgraue Balken) im Vergleich zu
den sieben Klonen ohne miR-BHRF1-3-Expression (hellgraue Balken) stark erniedrigt.
Dagegen zeigten die miR-BHRF1-3-positiven Klone 10, 8 und 22 nur im Bezug auf die miRBHRF1-3-negativen Klone 7 und 5 eine deutlich verminderte BZLF1-Expression.
Für die weitere Analyse der relativen BZLF1-Expression in Abhängigkeit von der miRBHRF1-3-Expression wurden die sieben miR-BHRF1-3-positiven und die sieben miRBHRF1-3-negativen stabil transfizierten Zelllinien als einzelne Experimente betrachtet. Die
Mittelwerte mit Standardfehler nach Normalisierung der BZLF1-Signalstärken aus zwei
unabhängig durchgeführten Western-Blot-Analysen auf die jeweiligen Aktinwerte ist in
Abbildung 22 B dargestellt. In Anwesenheit der miR-BHRF1-3 (dunkelgrauer Balken) wurde
eine statistisch signifikant erniedrigte Expression des BZLF1-Proteins im Bezug auf miRBHRF1-3-negative Zelllinien (hellgrauer Balken) nachgewiesen (p = 0,0033).
56
5. Ergebnisse
23
#
8
22
#
#
17
#
#
15
10
5
#
#
36
2
63
#
#
#
7
12
#
#
18
#
#
4
Relative BZLF1-Expression
A
Mutu I-Klone
Relative BZLF1-Expression
B
** = p = 0,0033
Abbildung 22: Relative BZLF1-Expression in An- und Abwesenheit von miR-BHRF1-3. Die Intensität der
Expression von BZLF1 und Aktin in den Mutu I- und Mutu III-Zellen sowie den stabilen Mutu I-Klonen im WesternBlot wurde mit dem Bildbearbeitungsprogramm ImageJ gemessen. Die Expression von BZLF1 wurde auf die
Ladekontrolle Aktin normalisiert. Dunkelgraue Balken stehen für Zellen mit miR-BHRF1-3-Expression, hellgraue
für miR-BHRF1-3-negative Zellen. (A) Relative BZLF1-Expression der einzelnen Klone und der Zelllinien Mutu I
und Mutu III aus einer Western-Blot-Analyse. In (B) sind die Mittelwerte mit Standardfehlern der BZLF1
Expression für die sieben miR-BHRF1-3 exprimierenden und die sieben miR-BHRF1-3 negativen Klone bzw.
Zelllinien dargestellt. Die Western-Blot-Analyse erfolgte zweimal, mit unabhängig voneinander isoliertem GesamtZell-Lysat.
57
5. Ergebnisse
5.2.4 Induktion des lytischen Zyklus durch Stimulation mit anti-IgM
Ein Einfluss der miR-BHRF1-3-Expression auf die Stärke der BZLF1-Expression und auf die
Rate der spontanen lytischen Reaktivierung konnte in den Mutu I-Klonen beobachtet werden.
Basierend auf diesen Daten sollte überprüft werden, ob die eingebrachte miR-BHRF1-3 in
den stabilen Mutu I-Klonen eine Induktion des lytischen Zyklus durch anti-IgM-Stimulation
inhibieren kann. Die Behandlung von EBV-positiven BL-Zelllinien der Latenz I mit anti-IgMAntikörpern ist ein häufig verwendetes Modell zur in vitro Aktivierung des lytischen Zyklus
(siehe 3.5.2 und Abbildung 4). Die Reaktivierung von EBV erfolgt hierbei durch eine anti-IgAntikörper-induzierte Quervernetzung, und somit zur Aktivierung des B-Zell-Rezeptors (BCR)
[142, 143].
Für die Stimualtionsversuche mit anti-IgM-Antikörpern wurden die folgenden Zelllinen
verwendet: Mutu I (bekannt für gute Stimulierbarkeit), Mutu III (nicht stimulierbar), die beiden
miR-BHRF1-3-positiven Klone 4 und 18, die miR-BHRF1-3-negativen Klone 7 und 12 (miRBHRF1-3-transfiziert, aber miR-BHRF1-3 negativ) sowie die Klone 2 und 63 (Kontrollvektorinfiziert, miR-BHRF1-3 negativ). Die Mutu I-Klone 4 und 18 wurden ausgewählt, da sie trotz
unterschiedlich starker miR-BHRF1-3-Expression eine vergleichbare Inhibierung des
Zielgens BZLF1 zeigten.
Bevor die Zellen mit anti-IgM-Antikörpern stimuliert wurden, wurde die IgM-Expression auf
der Zelloberfläche der verwendeten Zelllinien durchflusszytometrisch überprüft. Die Zellen
wurden mit einem biotinylierten anti-IgM-Antikörper und einem Strep-Cy3-konjugierten
Zweitantikörper extrazellulär angefärbt. In der anschließenden Durchflusszytometrie wurde
die Zelllinie JKL6 als Negativkontrolle verwendet. Auf den Zelllinien Mutu I und Mutu III sowie
allen verwendeten stabil transfizierten Zelllinien konnte eine starke Expression von IgM auf
der Zelloberfläche nachgewiesen werden (Abbildung 23). Somit konnten die acht Zelllinien in
den folgenden Stimulierungsversuchen mit anti-IgM-Antikörpern eingesetzt werden.
58
5. Ergebnisse
Mutu I
Mutu III
Klon 4
Klon 18
Klon 7
Klon 12
Klon 2
Klon 63
Zellzahl
JKL6
Fluoreszenzintensität (IgM-Strep-Cy3)
Abbildung 23: Bestimmung der Oberflächenexpression von IgM. Die Expression von IgM auf der Oberfläche
von Mutu I-Klonen und den Zelllinien Mutu I, Mutu III und JKL6 wurde durch Färbung mit biot.-anti-IgM-Antikörper
und einem Strep-Cy3-markierten zweiten Antikörper durchflusszytometrisch bestimmt. Die Zelllinie JKL6 wurde
als Negativkontrolle verwendet. biot.: biotyniliert.
Die Stimulation der Zellen mit anti-IgM-Antikörpern erfolgte in 24-Loch-Platten, die mit 5 µg
anti-IgM Antikörper in 500 µl PBS oder nur 500 µl PBS über Nacht bei 4 °C beschichtet
wurden. Die Induktion des lytischen Zyklus erfolgte durch Inkubation von 2,5 x 105 Zellen in
den mit PBS oder anti-IgM-Antikörper beschichteten Platten. Nach anti-IgM Stimulation
wurde die Induktion der BZLF1-Expression auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht.
Hierfür wurde zum einen für die Western-Blot-Analyse Gesamt-Zell-Lysat gewonnen und
59
5. Ergebnisse
zum anderen für die Analyse der mRNA-Level Gesamt-RNA isoliert. Die RNA wurde in einer
reversen Transkriptase-Reaktion in cDNA umgeschrieben und es erfolgte die PCRAmplifikation der lytischen Produkte BZLF1 und gp220 mittels spezifischen Oligonukleotiden.
Die Amplifikation des Glykoproteins gp220, ein spätes lytisches Protein, diente zur
Überprüfung, ob die anti-IgM-Stimulation nur die Expression von BZLF1 induziert oder zur
Aktivierung des kompletten lytischen Zyklus führt.
Nach 48 h IgM-Stimulation zeigten Mutu I-Zellen eine starke Induktion des lytischen Zyklus
auf mRNA-Ebene (Abbildung 24 A). Die mRNA-Menge von BZLF1 und gp220 stieg im
Vergleich zu den PBS-behandelten Zellen deutlich an. Dagegen konnte die miR-BHRF1-3positive Mutu III-Zelllinie nicht lytisch reaktiviert werden. Es wurden weder für BZLF1 noch
für gp220 mRNA-Transkripte nachgewiesen. Die miR-BHRF1-3-positiven Klone 4 und 18
zeigten nach 48 h PBS-Behandlung nur schwache mRNA-Signale für BZLF1 und gp220.
Diese Signale sind durch spontane lytische Reaktivierung des lytischen Zyklus zu erklären.
Aber nach Stimulation mit anti-IgM wurde eine deutliche Steigerung der mRNA-Transkription,
bei Klon 4 stärker als bei Klon 18, für BZLF1 und gp 220 beobachtet (Abbildung 24 A). Diese
Daten sprechen für eine Induktion des lytischen Zyklus durch BCR-Aktivierung. Bei den miRBHRF1-3-negativen Klonen 7, 12, 2 und 63 war auch mit PBS-Behandlung eine spontane
lytische Reaktivierung auf mRNA-Ebene (BZLF1 und gp220) nachweisbar. Durch IgMStimulation wurde die Transkriptionsrate der lytischen Gene BZLF1 und gp220 deutlich
erhöht (Abbildung 24 A). Die durchgeführte RT-PCR-Analyse für Aktin wies auf eine
gleichmäßig eingesetzte cDNA-Konzentration hin.
Zusätzlich wurde die anti-IgM-vermittelte Induktion des lytischen Zyklus auf Protein-Ebene
untersucht (Abbildung 24 B). Bei der Zelllinie Mutu III konnte wie schon auf mRNA-Ebene
weder eine spontane noch eine induzierte lytische Aktivität nachgewiesen werden. Die mit
PBS-behandelten miR-BHRF1-3-negativen Klone 7, 12, 2 und 63 wiesen eine spontane
Aktivierung des BZLF1-Poteins auf. Wobei Klon 63 in den drei unabhängig durchgeführten
Experimenten im Vergleich mit den anderen miR-BHRF1-3-negativen Klonen eine
schwächere spontane BZLF1-Aktivierung zeigte. Durch anti-IgM-Stimulation konnte eine
deutlich gesteigerte Expression des Proteins beobachtet werden. Mutu I-Zellen und die miRBHRF1-3-positiven Klone 4 und 18 zeigten ebenfalls eine anti-IgM-vermittelte Induktion von
BZLF1. Wohingegen die Inkubation mit PBS zu keiner BZLF1-Expression auf Protein-Ebene
führte. In der repräsentativen Western-Blot-Analyse in Abbildung 24 B konnte somit in den
miR-BHRF1-3-exprimierenden Zellen keine spontane Aktivierung des lytischen Zyklus
beobachtet werden. Es ist dabei zu beachten, dass es nicht immer zu einer spontanen
Reaktivierung von EBV in vitro kommt. Außerdem wurden für die Stimulierungsversuche
60
5. Ergebnisse
weniger Zellen eingesetzt als zur Isolierung des Gesamt-Zell-Lysats in Abbildung 21 C. Die
Western-Blot-Analyse für Aktin diente zur Überprüfung der Beladung mit Proteinlysat in den
jeweiligen Spuren.
miR-BHRF1-3-Expression
A
Mutu I
bp
-
+
#4
Mutu III
-
+
-
keine miR-BHRF1-3-Expression
# 18
+
-
+
#7
-
+
# 12
-
#2
+
-
+ anti-IgM Stimulation
# 63
+
-
- PBS Kontrolle
+
BZLF1
200
200
gp220
300
200
Aktin
B
48 h
kDa
BZLF1
35
45
Aktin
Abbildung 24: Induktion des lytischen Zyklus durch Stimulation mit anti-IgM-Antikörper. Die Mutu I-Klone
und die Zelllinien Mutu I und Mutu III wurden für 48 h in einer mit anti-IgM-Antikörper beschichteten oder PBSbehandelten 24-Loch-Platte inkubiert. Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei 4° C. (A) Nach 48 h anti-IgMStimulation wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und eine RT-PCR mit spezifischen Oligonukleotiden für
die mRNA des unmittelbar frühen lytischen Gens BZLF1 und des späten lytischen Gens gp220 durchgeführt. Die
amplifizierte Aktin-mRNA diente als Ladekontrolle. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,8 %-igem Agarosegel
aufgetrennt. (B) Ebenfalls nach 48 h wurde Gesamt-Zell-Lysat der anti-IgM- oder PBS-behandelten Proben
gewonnen. Zum Nachweis der BZLF1-Induktion wurden die Proben in einem 10 %-SDS-Gel aufgetrennt und das
BZLF1-Protein durch anti-BZLF1 Antikörper und einen entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper
mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die Detektion von Aktin diente als Ladekontrolle. Die dargestellten
Ergebnisse sind repräsentativ für je drei unabhängig durchgeführte Experimente. Die Größenstandards wurden in
kilo Dalton (kDa) und Basenpaaren (bp) angegeben. HRP: horseradish peroxidase.
Die BCR-vermittelte Induktion des lytischen Zyklus in Anwesenheit der miR-BHRF1-3 war
ein unerwartetes Ergebnis. Denn es konnte gezeigt werden, dass die miRNA eine spontane
lytische Reaktivierung von EBV über eine post-transkriptionelle Interaktion mit dem BZLF13´-UTR die BZLF1-Proteinexpression unterdrückt (Abbildung 22 B). Aus diesem Grund
wurde die BZLF1-Induktion in An- und Abwesenheit der miR-BHRF1-3 genauer untersucht.
Da in den PBS-behandelten Klonen 4 und 18 und Mutu I-Zellen nicht immer eine spontane
BZLF1-Expression nachgewiesen werden konnte, wurden verschiedene Inkubationszeitpunkte mit anti-IgM analysiert.
61
5. Ergebnisse
Bereits nach 6 h anti-IgM-Stimulation konnte bei Mutu I-Zellen und den Klonen 4 und 18 eine
Induktion des lytischen Zyklus beobachtet werden. In der RT-PCR-Analyse zeigten die drei
Zelllinien nach Inkubation mit anti-IgM im Vergleich zur Behandlung mit PBS einen Anstieg
der mRNA für BZLF1 und gp220 (Abbildung 25 A). Mit Ausnahme von Klon 63 konnte auch
in den miR-BHRF1-3-negativen Klonen eine deutliche Induktion der Gene BZLF1 und gp220
nach nur 6 h anti-IgM-Stimulation beobachtet werden. Wiederum konnte in Abwesenheit der
miR-BHRF1-3 eine spontane Aktivierung der beiden lytischen Gene beobachtet werden.
Wobei Klon 63 von allen miR-BHRF1-3-negativen Klonen in drei unabhängig durchgeführten
Experimenten eine schwächere spontane Aktivierung des lytischen Zyklus zeigte.
A
miR-BHRF1-3-Expression
bp
Mutu I
Mutu III
-
-
+
+
#4
-
keine miR-BHRF1-3-Expression
# 18
+
-
+
#7
-
+
# 12
-
+
#2
-
+ anti-IgM Stimulation
# 63
+
-
- PBS Kontrolle
+
200
BZLF1
200
gp220
300
200
Aktin
200
BZLF1
200
gp220
300
200
Aktin
6h
B
24 h
Abbildung 25: Nachweis der mRNA für lytische Proteine 6 h und 24 h nach anti-IgM-Stimulation. Die Mutu
I-Klone und die Zelllinien Mutu I und Mutu III wurden für 6 h (A) oder 24 h (B) in einer mit anti-IgM-Antikörper
beschichteten oder PBS-behandelten 24-Loch-Platte inkubiert. Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei 4° C.
Nach 6 h oder 24 h anti-IgM-Stimulation wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und eine RT-PCR für die
mRNA des unmittelbar frühen lytischen Gens BZLF1 und des späten lytischen Gens gp220 durchgeführt. Die
amplifizierte Aktin-mRNA diente als Ladekontrolle. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,8 %-igem Agarosegel
aufgetrennt. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für je drei unabhängig durchgeführte Experimente.
Die Größenstandards wurden in Basenpaaren (bp) angegeben.
Die RT-PCR-Analyse nach 24 h anti-IgM-Stimulation zeigte im Vergleich zu 6 h Stimulation
eine deutliche Hochregulation der BZLF1- und gp220-mRNA (Abbildung 25 B). Besonders in
den miR-BHRF1-3-exprimierenden Klonen 4 und 18 ist eine deutliche Aktivierung der zwei
lytischen Gene zu beobachten. Die durchgeführte RT-PCR-Analyse für Aktin wurde als
Kontrolle für gleichmäßig eingesetzte cDNA-Konzentrationen verwendet.
62
5. Ergebnisse
Basierend auf den Ergebnissen, dass bereits nach 6 h eine anti-IgM-induzierte Aktivierung
der lytischen Infektionsphase auf mRNA-Ebene zu beobachten war und diese nach 24 h
anti-IgM-Stimulation noch gesteigert werden konnte, erfolgte eine Western-Blot-Analyse zur
Protein-Expression von BZLF1 (Abbildung 26 A). Auch auf Protein-Ebene konnte im
Vergleich von 6 h und 24 h anti-IgM-Stimulation eine deutliche Induktion von BZLF1
beobachtet werden. Wie erwartet ergab die Stimulation in den Mutu III-Zellen keine
erkennbare Aktivierung des lytischen Proteins BZLF1. Die Western-Blot-Analyse für HSP90
diente zur Überprüfung der Beladung mit Proteinlysat in den jeweiligen Spuren.
A
kDa
miR-BHRF1-3-Expression
Mutu I
6
#4
Mutu III
24
6
24
6
keine miR-BHRF1-3-Expression
# 18
24
6
#7
24
6
24
90
# 12
6
24
#2
6
24
# 63
6
24
Klon-Nummer
h anti-IgM Stimulation
HSP90
BZLF1
35
63
#
2
#
12
#
7
#
18
4
#
#
M
ut
u
I
B
Abbildung 26: Vergleich der BZLF1-Expression nach 6 h und 24 h anti-IgM Stimulation. (A) Die Mutu IKlone und die Zelllinien Mutu I und Mutu III wurden für 6 h oder 24 h in einer mit anti-IgM-Antikörper
beschichteten 24-Loch-Platte inkubiert. Die Beschichtung erfolgte über Nacht bei 4° C. Nach 6 h bzw. 24 h
Inkubationszeit wurde Gesamt-Zell-Lysat isoliert. Zum Nachweis der BZLF1-Induktion wurden die Proben in
einem 10 %-SDS-Gel aufgetrennt und das BZLF1-Protein durch anti-BZLF1 Antikörper und einen
entsprechenden HRP-markierten Sekundärantikörper mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die Detektion
von HSP90 mittels anti-HSP90 diente als Ladekontrolle. (B) Die Intensität der BZLF1- und HSP90-Expression
wurde mit dem Bildbearbeitungsprogramm ImageJ gemessen und die BZLF1-Expression wurde auf die
Ladekontrolle HSP90 normalisiert. Die Induktion der anti-IgM-vermittelten BZLF1-Expression wurde im Verhältnis
von 24 h / 6 h Inkubationszeit berechnet. Dunkelgraue Balken stehen für Zellen mit miR-BHRF1-3-Expression,
hellgraue für miR-BHRF1-3 negative Zellen. Die Größenstandards wurden in kilo Dalton (kDa) angegeben. HRP:
horseradish peroxidase.
63
5. Ergebnisse
Um die anti-IgM-vermittelte BZLF1-Induktion in An- und Abwesenheit der miR-BHRF1-3
genauer zu untersuchen, wurden die Signalstärken von HSP90 und BZLF1 mit dem
Bildbearbeitungsprogramm ImageJ gemessen. Anschließend erfolgte eine Normalisierung
der BZLF1-Expression in den einzelnen Zelllinien auf die jeweilige HSP90-Beladung. Aus
dem Quotienten der BZLF1-Proteinmenge für 24 h und 6 h Stimulation wurde die miRBHRF1-3-abhängige Induktion von BZLF1 berechnet (Abbildung 26 B).
In Anwesenheit der miR-BHRF1-3 wurde die Expression von BZLF1 deutlich stärker durch
anti-IgM induziert (Abbildung 26 B). Die Ursprungszelllinie Mutu I, die ein bekanntes Modell
zur anti-IgM-vermittelten Aktivierung des lytischen Zyklus darstellt, wies nach 24 h
Stimulation eine 1,44-fach stärkere BZLF1-Expression als nach 6 h Stimulation auf. Die miRBHRF1-3-negativen Klone zeigten im Vergleich mit Mutu I eine etwas schwächere BZLF1Induktion im Verhältnis der BZLF1-Expression nach 24 h und 6 h Stimulation. Bei Klon 7
wurde die BZLF1-Expression um 1,16-fach aktiviert, die Klone 12 und 2 wiesen eine 1,14fach erhöhte Expression auf und bei Klon 63 wurde eine um 1,07-fach gesteigerte BZLF1Expression beobachtet. Hierbei ist zu beachten, dass die Klone ohne miR-BHRF1-3Expression im Vergleich mit Mutu I sowohl eine höhere spontane BZLF1-Expressionsrate
(Abbildung 24 B) als auch eine stärkere BZLF1-Expression nach 6 h anti-IgM-Stimulation
(Abbildung 26 A) zeigten. Wohingegen bei miR-BHRF1-3-positiven Klonen mit nur sehr
geringer spontaner BZLF1-Aktivierung und schwacher Expression nach 6 h Stimulation,
nach 24 h Stimulation eine deutlich stärkere Induktion von BZLF1 nachweisbar war. Klon 4
zeigte nach 24h Stimulation eine 2,38-fach stärkere BZLF1-Expression als nach 6 h
Stimulation auf. Bei Klon 18 wurde eine 2,17-fache Induktion von BZLF1 beobachtet.
Zusammenfassend deuten die Daten darauf hin, dass die Induktion von BZLF1 nach antiIgM-Stimulation durch die miR-BHRF1-3 zeitlich verzögert wird.
64
6. Diskussion
6. Diskussion
Die Induktion des unmittelbar frühen Gens BZLF1 stellt einen entscheidenden Kontrollpunkt
bei der Aktivierung des EBV von der latenten Infektion zur lytischen Replikation dar. EBV
persistiert überwiegend in latenter Form in ruhenden Gedächtnis-B-Zellen. Während der
latenten Phase repliziert sich das Virus mit der zellulären DNA und wird an die Tochterzellen
weitergegeben. Erst die Aktivierung des lytischen Zyklus führt zur unabhängigen Replikation
des viralen Genoms und zur Produktion infektiöser Viruspartikel [13, 14]. Eine latente EBVInfektion ist mit einigen humanen Erkrankungen, wie dem Burkitt Lymphom, dem Hodgkin
Lymphom und dem Nasopharynxkarzinom assoziiert. Das Vorkommen von EBV bei diesen
Erkrankungen kann als Therapieansatz für die Bekämpfung der Tumore genutzt werden
[279]. Die Untersuchung der lytischen Reaktivierung ist hierbei ein wichtiger Beitrag zur
Therapieentwicklung, da EBV mit den gängigen antiviralen Therapeutika wie z.B. den
Nukleotid-Anagola Acyclovir und Ganciclovir nur in der replikativen Form bekämpft werden
kann [280]. Das in Äquatorialafrika weitverbreitete endemische Burkitt Lymphom besitzt eine
EBV-Assoziation von 100 %. Das Burkitt Lymphom stellt in dieser Region die häufigste
Tumorerkrankung bei Kindern dar [118]. In Burkitt Lymphomen liegt das Virus in der Latenz I
vor und beschränkt die Expression der viralen Latenzgene auf die EBERs und EBNA1. Das
Protein EBNA1 ist durch eine interne Glycin-Alanin Wiederholungsdomäne vor dem
proteosomalen Abbau und somit einer MHC-Klasse-I-abhängigen Antigen-Präsentation
geschützt. Dies blockiert die immunogene Wirkung von EBNA1 und verhindert eine
Eliminierung von Latenz I infizierten Zellen durch das Immunsystem [41-43]. Erst eine
Aktivierung des Virus in den lytischen Zyklus ermöglicht es dem Immunsystem die EBVpositiven Zellen in den Lymphomen zu erkennen und somit den Tumor anzugreifen.
In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Mechanismen zur Aktivierung des unmittelbar
frühen lytischen Transkriptionsfaktors BZLF1 untersucht.
Mehrere Arbeiten zeigten bereits eine Aktivierung des lytischen Zyklus in Abhängigkeit vom
Differenzierungsstatus der infizierten Zellen [273]. In B-Zellen wurde gezeigt, dass die
lytische Aktivierung von EBV mit der Differenzierung von latent infizierten Gedächtnis-BZellen zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen einhergeht [149, 274]. Das „B lymphocyte
induced maturation protein“ Blimp1 spielt eine wichtige Rolle bei der terminalen
Differenzierung von Lymphozyten und Epithelzellen [199]. In oralen Haarleukoplakien, einer
benignen Läsion des Plattenepithels am Zungenrand, wurde eine lytische EBV-Infektion
nachgewiesen [116]. Die replikative Infektion mit EBV findet hier ausschließlich im
65
6. Diskussion
differenzierten Plattenepithel statt [115-117, 199]. Aus diesem Grund sollte im ersten Teil
dieser
Arbeit
ein
Zusammenhang
zwischen
der
Expression
des
zellulären
Differenzierungsfaktors Blimp1 und der lytischen Infektion von Epithelzellen untersucht
werden.
In den letzten Jahren stellte sich eine wichtige biologische Funktion von miRNAs bei der
post-transkriptionellen Regulation der Genexpression heraus. Die ca. 22 nt langen, nicht
kodierenden miRNAs wurden ursprünglich bei der Regulation des Larvenstadiums von C.
elegans entdeckt [219, 220]. Später wurden miRNAs auch in Pflanzen, allen Eukaryoten und
Viren nachgewiesen [221-223, 225]. Bislang sind laut der Sanger Datenbank (Version 14.0)
(www.mirbase.org) 25 EBV-kodierte miRNAs bekannt. Für die EBV-kodierte miR-BHRF1-3
wurde eine Bindestelle im 3´-UTR der mRNA des lytischen Proteins BZLF1 vorhergesagt
[277]. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte daher zum einen die Bindung der EBV-kodierten
miRNA an den 3´-UTR im Luziferase-Reporter-System, und zum anderen der Einfluss der
miRNA auf die endogene Expression von BZLF1 untersucht werden.
6.1 Replikative EBV-Infektion im differenzierten Plattenepithel von
oralen Haarleukoplakien
Die latente EBV-Infektion, die durch das Immunsystem weder erkannt noch eliminiert werden
kann, ermöglicht dem EBV eine lebenslange Persistenz in den Wirtszellen. Die Etablierung
der latenten EBV-Infektion in lang-lebenden Gedächtnis-B-Zellen verhindert, dass das
Reservoir an infizierten Zellen im Wirt verloren geht. Zur Verbreitung des Virus in der
Bevölkerung und möglicherweise auch zur Aufrechterhaltung der Infektion im Individuum
muss EBV periodisch in die replikative Form der Infektion reaktiviert werden.
Das EBV besitzt einen Tropismus für B-Lymphozyten [21], kann aber auch Epithelzellen
infizieren und in ihnen replizieren [116, 117]. Das genaue Zusammenspiel von B-Zellen und
Epithelzellen bei der Viruspersistenz, der viralen Replikation und der Produktion von
infektiösen Virionen ist noch nicht geklärt. Sowohl in B-Zellen [149], als auch in Epithelzellen
[117,
273]
ist
eine
Aktivierung
der
Virusreplikation
in
Abhängigkeit
vom
Differenzierungsstatus der infizierten Wirtszelle bekannt. Der zelluläre Transkriptionsfaktor
XBP1 („X-box-binding protein 1“), nötig für die Plasmazelldifferenzierung, wurde in der
Gruppe von Thorley-Lawson als ausreichender Transaktivator für das unmittelbar frühe
lytische Gen BZLF1 in EBV-positiven B-Zellen, aber nicht in Epithelzellen, identifiziert [150].
66
6. Diskussion
Die Aktivierung von BZLF1 erfolgt über eine XBP1-spezifische Bindestelle im proximalen ZpPromotor [150]. Zeitgleich wurde von einer anderen Gruppe gezeigt, dass BZLF1 von XBP1
nur in Kombination mit der aktiven Protein-Kinase D (PKD), einer Histon-Deacetylase, und
nicht allein durch XBP1 induziert werden kann [151]. Die Aktivierung des lytischen Zyklus
durch das Zusammenspiel von aktivierter PKD und XBP1 wurde in vitro sowohl in
lymphoblastoiden B-Zelllinen als auch in latent infizierten Epithelzelllinien nachgewiesen
[151].
Für die Infektion mit EBV [281] und die Aktivierung des lytischen Zyklus [173, 282-284] wird
eine unterschiedliche Regulation durch zelluläre und virale Faktoren in B-Zellen und
Epithelzellen postuliert. In Versuchen mit BZLF1-defizienten Viren wurde gezeigt, dass in
vitro die Infektion und die initiale Amplifikation des viralen Episoms während der
Primärinfektion in B-Zellen und primären und undifferenzierten Epithelzellen mit EBV
unabhängig von der Expression lytischer Gene erfolgen. Die Expression von BZLF1 ist
hingegen für die Infektion und für die initiale Amplifikation des Episoms in der weiter
differenzierten Epithelzelllinie AGS erforderlich [281]. Diese Ergebnisse heben die Rolle
zellulärer Faktoren der infizierten Zelle bei der Expression viraler Gene und der Amplifikation
und Erhaltung des Episoms während der Infektion mit EBV hervor [281].
Erst kürzlich wurde gezeigt, dass der Differenzierungsfaktor Blimp1 nicht nur für die
Differenzierung von ruhenden B-Zellen zu Plasmazellen, sondern auch bei der terminalen
Differenzierung von Epithelzellen nötig ist [199, 205, 208]. In humanen und murinen
Keratinozyten besteht eine Korrelation der Expression von Blimp1 mit der terminalen
Differenzierung. Im Mausmodell führt eine Epidermis-spezifische Deletion von Blimp1 zu
einer Störung der Differenzierung epidermaler Keratinozyten [199].
Young et al., zeigten 1991 in oralen Haarleukoplakien erstmals im biologischen, zellulären
Umfeld eine Assoziation von Zelldifferenzierung und Induktion des lytischen Transaktivators
BZLF1 in Epithelzellen [117]. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurde im BZLF1Promotor Zp ein regulatorisches Element entdeckt, das positiv auf die in vitro Differenzierung
der humanen Plattenepithelzelllinie SCC12F reagiert [273].
Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde in der vorliegenden Arbeit am Modell der oralen
Haarleukoplakie eine Korrelation der Blimp1-abhängigen Differenzierung von Keratinozyten
im Plattenepithel mit der replikativen Infektion von EBV untersucht. Hierfür wurden uns
freundlicherweise von Dr. Alan Cruchley von der London School of Medicine and Dentistry
Paraffin-Schnitte aus Biopsien von 5 Patienten mit oraler Haarleukoplakie zur Verfügung
67
6. Diskussion
gestellt. Die nukleäre Expression von Blimp1 war an Schnitten von allen 5 Patienten auf das
obere Drittel des differenzierten Plattenepithels begrenzt (Abbildung 8). Weder im basalen,
undifferenzierten, Bereich des Epithels noch im darunterliegenden Gewebe konnte eine
Expression von Blimp1 nachgewiesen werden (Abbildung 8 B). Zusätzlich konnte eine
Restriktion der Blimp1-Expression auf die oberflächlichen Epithelzellen in Tonsillen gezeigt
werden (Abbildung 8 A). Im differenzierten Plattenepithel der OHL wurde eine mit
zunehmender Differenzierung graduell ansteigende Expression von Blimp1 gezeigt
(Abbildung 8 D).
Für die Infektion von Epithelzellen werden für EBV drei mögliche Modelle diskutiert [116]:
(I) EBV persistiert in den undifferenzierten basalen Epithelzellen in latenter Form und wird
durch die Differenzierung der oberen Zelleschichten in den replikativen Zyklus aktiviert.
(II) Differenzierte Epithelzellen werden durch EBV-positive B-Zellen, die das Plattenepithel
infiltrieren, infiziert. (III) Kontinuierliche Infektion der differenzierten Epithelzellen durch
infektiöse Viruspartikel im Speichel.
Aufgrund der Arbeit von Becker et al., wurde postuliert, dass EBV in der basalen Zellschicht
von OHL persistiert und es differenzierungsabhängig zu einer Replikation kommt. Die
Färbung von BZLF1 im Zytoplasma der basalen Zellschicht in der Arbeit von Becker et al.,
gilt heute aber als Artefakt [272]. In der vorliegenden Arbeit konnte in Übereinstimmung mit
publizierten Daten der Transkriptionsfaktor BZLF1 nicht in den basalen Epithelzellen der
OHL nachgewiesen werden [116, 117, 285]. Der immunhistochemische Nachweis von
BZLF1 an Paraffin-Schnitten von OHL Patienten zeigte eine Restriktion der nukleären
Expression des lytischen Proteins in differenzierten Epithelzellen des Plattenepithels
(Abbildung 9 A und B). Daher wird die OHL heute als ein Resultat einer isolierten fokalen
EBV-Replikation im oberflächlichen Epithel angesehen. Eine in dieser Arbeit beobachtete
fehlende oder stark verminderte Expression von BZLF1 in der obersten Zellschicht des
Plattenepithels (Abbildung 9 A und B) wurde bereits von Young et al., beschrieben. Sie
konnten auch durch EBV-DNA-in-situ Hybridisierung in der obersten Zellschicht keine
Infektion mit EBV nachweisen. Mögliche Erklärungen hierfür sind, dass zum einen die
hyperparakeratotische Zellschicht für die Detektionsmethoden schlechter zugänglich ist. Zum
anderen könnte die EBV-Replikation in den obersten, terminal differenzierten Zellen
herunterreguliert sein [117].
68
6. Diskussion
Die Abwesenheit einer latenten Infektion in den differenzierten Epithelzellen wurde durch
EBER-in-situ Hybridisierung und den immunhistochemischen Nachweis von EBNA1
demonstriert (Abbildung 9 C und D). In allen untersuchten Biopsien wurde keine EBNA1Expression in den basalen Epithelzellen nachgewiesen. Lediglich in dem oberen,
differenzierten, Blimp1- und BZLF1-positiven Plattenepithel wurde das latente Protein
detektiert (Abbildung 9 C). Eine Expression des ursprünglich latenten Markerproteins EBNA1
in rein lytisch infizierten Epithelzellen von OHL wurde bereits mehrfach beschrieben [116,
276]. Die Funktion von EBNA1 bei der Infektion von Epithelzellen, aber nicht von B-Zellen, ist
erst kürzlich genauer untersucht worden. In Epithelzellen erfolgt die Expression von EBNA1
von dem latenten Promotor Qp und ist für den Erhalt des viralen Episoms und die lytische
Infektion nötig. In B-Zellen dagegen wird EBNA1 nach der Infektion von den Promotoren Wp
und Cp exprimiert und ist nicht mit einer BZLF1-induzierten replikativen Infektion verbunden
[281].
EBERs sind kleine nicht-polyadenylierte RNA-Transkripte, die während allen Formen der
latenten EBV-Infektion exprimiert werden. Die Methode der EBER-in-situ Hybridisierung
ermöglicht auch in lytisch infizierten Zellen einen indirekten Nachweis einer EBV-Infektion.
Hierbei erfolgt die Detektion über die Bindung der EBER-Sonden an die einzelsträngige, sich
replizierende virale DNA. Mittels der EBER-in-situ Hybridisierung konnte eine stark
reduzierte EBV-Infektion der oberen Epithelzellschicht und eine deutlich auf das
differenzierte Plattenepithel limitierte Infektion mit EBV zeigen (Abbildung 9 D).
Die auf das obere Drittel des Plattenepithels begrenzte Expression von Blimp1 und BZLF1 in
OHL deutet auf einen möglichen Einfluss von Blimp1 auf die lytische Infektion hin (Abbildung
8 und Abbildung 9). Eine Doppelmarkierung für die Proteine Blimp1 und BZLF1 zeigte eine
Kolokalisation von BZLF1 und Blimp1 in Epithelzellen von OHL-Biopsien. Die Expression von
BZLF1 konnte ausschließlich in Blimp1-positiven Epithelzellen nachgewiesen werden und
beschränkt sich deutlich auf die differenzierten Zellen im oberen Bereich des Plattenepithels
(Abbildung 10).
Anhand der immunhistologischen Daten konnte zusammenfassend gezeigt werden, dass nur
im differenzierten Plattenepithel eine Infektion mit EBV erfolgt (Abbildung 8 und Abbildung 9).
Das Virus liegt in den infizierten Zellen in der replikativen Form vor. In der Immunfluoreszenz
wurde deutlich eine Kolokalisation von Blimp1 und BZLF1 gezeigt (Abbildung 10). Die
oberste Zellschicht des Epithels weist weder eine Expression von BZLF1 noch von Blimp1
auf. Dies könnte auf eine Herunterregulation der Blimp1-Expression in diesen Zellen
hindeuten. Es kann spekuliert werden, dass EBV entweder nur differenzierte, Blimp1-positive
69
6. Diskussion
Epithelzellen infiziert oder das Virus in differenzierten Epithelzellen nur in der replikativen
Form existieren kann.
Die beobachtete fehlende EBV-Infektion im basalen Epithel in OHL unterstützt die oben
beschriebenen Modelle II und III zur Infektion von Epithelzellen [116]. Untersuchungen an
EBV-seropositiven Patienten zeigten, dass in OHL das Epithelgewebe mit verschiedenen
EBV-Stämmen infiziert ist [286]. Nicht alle im Plattenepithel der Zunge nachgewiesenen
Virusstämme konnten bei den Patienten auch in peripheren B-Zellen im Blut gefunden
werden [287]. Diese Beobachtungen deuten auf eine exogene Infektion des Zungenepithels
über den Speichel hin. Ähnliche Untersuchungen bei HIV-Patienten zeigten eine strikte
Korrelation von HIV-Stämmen in Blut und in Speichel und identifizierten die infizierten
Lymphozyten als Quelle der Viruspartikel im Speichel [288]. Anhand der Doppelmarkierung
von Blimp1 und BZLF1 zeigten die Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit eine lytische
Infektion mit EBV in den oberen Blimp1-positiven Epithelzellen. In weiter basal gelegenen
Blimp1-positiven Zellen konnte keine replikative Infektion beobachtet werden, was eine
exogene EBV-Infektion der Epithelzellen mit Viren aus dem Speichel vermuten lässt
(Abbildung 10).
6.2 Blimp1-abhängige Induktion des BZLF1-Promotors Zp
Bei BZLF1 handelt es sich um ein unmittelbar frühes Gen des lytischen Zyklus, dessen
Expression notwendig und ausreichend ist, den replikativen Zyklus von EBV in infizierten
Zellen einzuleiten [148]. Sobald das induzierte BZLF1-Protein eine Schwellenkonzentration
erreicht, wird die BZLF1-Expression in einer positiven Rückkopplungsschleife verstärkt und
leitet im Anschluss daran die kaskadenartige Aktivierung der etwa 100 Gene des lytischen
Zyklus ein [184]. Die Expression von BZLF1 steht unter Kontrolle des Promotors Zp, dessen
regulative Elemente gut charakterisiert sind. Durch negative Elemente in der Promotorregion
wird eine niedrige basale Aktivität von Zp gesichert, die nach der Induktion des lytischen
Zyklus durch positive Elemente stark erhöht wird [184]. Die Regulation des BZLF1Promotors Zp ist in Abschnitt 3.6.2 genauer beschrieben (Abbildung 4).
Um die in der Immunhistologie gefundene Kolokalisation von BZLF1 und Blimp1
biochemisch weiter zu untersuchen, wurden Luziferase-Versuche durchgeführt. Hierfür
wurden die EBV-negativen humanen Epithelzelllinen 293T und HeLa transient mit einem
BZLF1-Promotor/Luziferase-Konstrukt und einem Blimp1-Expressionsvektor transfiziert. Die
70
6. Diskussion
ektopische Blimp1-Expression induzierte in beiden Epithelzelllinen signifikant die Expression
der Zp-Promotor-abhängigen Luziferase (Abbildung 11). Die Induktion des Zp-Promotors ist
Blimp1-spezifisch, da Kontroll-Versuche mit der Luziferase ohne den Zp-Promotor und ohne
Blimp1-Expression oder mit beiden Negativkontrollen keine signifikante Induktion der
Luziferase-Aktivität aufzeigten (Abbildung 11). Die in 293T-Zellen leicht erhöhte LuziferaseAktivität in Abwesenheit von Blimp1 ist durch die geringe basale Aktivität des unstimulierten
Zp-Promotors zu erklären. In unseren Versuchen zeigte der ektopisch eingebrachte ZpPromotor in 293T-Zellen eine stärkere basale Aktivität als in HeLa-Zellen. Die schwachen
Werte für die Luziferase-Aktivität in Abwesenheit des Zp-Promotors sind auf eine
unspezifische Induktion der Luziferase zurückzuführen. Die basale Promotor-Aktivität und die
unspezifische Luziferase-Expression sind in den durchgeführten Versuchen aber im
Vergleich zu der signifikanten, Blimp1-induzierten Zp/Luziferase-Aktivität verschwindend
gering und daher zu vernachlässigen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der
lytische Promotor Zp nur in Blimp1-exprimierenden 293T- und HeLa-Zellen signifikant
induziert wird. Diese Ergebnisse zeigen erstmals eine Blimp1-abhängige Induktion von
BZLF1 in Epithelzellen.
Die Daten aus den Luziferase-Versuchen lassen keine Aussage zu, ob der Einfluss von
Blimp1 auf die Induktion des Zp-Promotors direkt durch die Bindung an die Promotorregion
oder indirekt über zwischengeschaltete Moleküle erfolgt. Ein indirekter Einfluss von Blimp1
auf die Induktion des Zp-Promotors ist aber wahrscheinlicher, da es sich bei Blimp1 um
einen Transkriptionsfaktor mit repressiven Eigenschaften handelt. Daher wird vermutlich
durch die Expression von Blimp1 ein negativer Regulator des lytischen Promotors Zp
reprimiert wird und kann folglich nicht mehr an die Zp-Promotorregion binden.
Für die negative Regulation des Zp-Promotors wurden distale und proximale Elemente
beschrieben. YY1, ein Zinkfingerprotein der GL1-Krüppel-Familie, inhibiert die Aktivierung
des BZLF1-Promotors durch Bindung an die distalen Promotor-Elemente ZIVA, ZIVB und
ZIVD [289]. Das E-Box-Bindeprotein E2-2 unterdrückt in B-Zellen, aber nicht in Epithelzellen,
die Induktion von BZLF1 über die negative Regulation von HI-Sequenzen im distalen
Promotorbereich von Zp [290]. Erst kürzlich wurde eine Inhibierung des lytischen Zyklus in BZellen und Epithelzellen durch die Bindung von ZEB1, einem zellulären Transkriptionsfaktor
der Zinkfinger-E-Box-Bindeproteine, an die proximalen Strukturen ZV und ZV´ des ZpPromotors gezeigt (Abbildung 4) [179]. Die Infektion der undifferenzierten humanen
Epithelzelllinie HeLa und der weiter differenzierten humanen Epithelzelllinie AGS mit dem
EBV-Virusstamm B95-8 zeigte eine deutlich höhere Zp-Promotor-Aktivität in den AGSZellen. Dieser Effekt wird auf die stark reduzierte ZEB1-Expression in AGS-Zellen im
71
6. Diskussion
Vergleich zu den HeLa-Zellen zurückgeführt [291]. In 293T-Zellen, die in LuziferaseVersuchen in der vorliegenden Arbeit ebenso wie die HeLa-Zellen keine Aktivierung des ZpPromotors in Abwesenheit von Blimp1 zeigten (Abbildung 11), wurde auch eine stark
verminderte Expression von ZEB1 nachgewiesen [291]. Die latent infizierte B-Zelllinie Akata,
die ohne Stimulierung keine spontane Aktivierung des lytischen Zyklus aufweist, zeigte eine
hohe Expression des negativen lytischen Regulators ZEB1 [291]. Die Infektion von ZEB1positiven Epithelzellen mit einem EBV mit mutierter ZEB1-Bindestelle resultiert im Vergleich
mit den Wildtyp-EBV infizierten Zellen in einer deutlich gesteigerten BZLF1-Induktion [179,
291]. Die Daten der vorliegenden Arbeit weisen auf einen möglichen Einfluss von Blimp1 auf
die ZEB1-vermittelte Inhibierung des BZLF1-Promotors hin. Eine Interaktion von Blimp1 mit
der ZEB1-Expression ist bis heute noch nicht bekannt.
Eine bioinformatische Analyse der 5´-UTR-Region der Nukleotidsequenz von ZEB1 durch die
Datenbank rVista2.0 zeigte zwei mögliche, direkt benachbarte Blimp1-Bindestellen im
Bereich von -706 bis -670 nt (Abbildung 12). Ausgehend von einer möglichen negativen
Regulation der ZEB1-Expression durch Blimp1 über die vorhergesagten Bindestellen wurde
die Expression der Proteine ZEB1 und Blimp1 in verschiedenen Zelllinen überprüft
(Abbildung 13 A). Eine verminderte ZEB1-Proteinmenge in Anwesenheit von Blimp1 konnte
nur bei der Epithelzelllinie HeLa und den Myelom-Zellen RPMI-8226 beobachtet werden. Die
lymphoblastoide Zelllinie HS-Sultan zeigte keinen inhibierenden Effekt von Blimp1 auf die
Expression des ZEB1-Proteins. In Zelllinien mit geringer Blimp1-Expression, Raji, Mutu I und
Mutu III, wurde im Vergleich mit den Blimp1-negativen HEK293-Zellen eine verminderte
ZEB1-Proteinexpression detektiert. Zusätzlich konnte in EBV-negativen Zellen AGS,
HEK293, HeLa und RPMI-8226 auch auf mRNA-Ebene keine Korrelation der ZEB1-und
Blimp1-Expression gezeigt werden (Abbildung 13 B). Zusammenfassend konnte weder auf
Protein- noch auf mRNA-Ebene eine eindeutige negative Regulation der ZEB1-Expression
durch endogenes Blimp1 nachgewiesen werden. Eine ektopische Überexpression von
Blimp1 durch transiente Transfektion mit dem Blimp1-Expressionsvektor pEXP4-Blimp1 in
HEK293- und HeLa-Zellen führte weder auf Protein- noch auf mRNA-Ebene zu einer
verminderten ZEB1-Expression (Abbildung 14).
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine eindeutige, vermutlich indirekte, Aktivierung des
unmittelbar frühen lytischen Promotors Zp durch Blimp1. Eine Blimp1-abhängige Inhibierung
des negativen Zp-Promotor-Regulators ZEB1 konnte nicht nachgewiesen werden.
72
6. Diskussion
6.3 Einfluss der miR-BHRF1-3
Reaktivierung von EBV
auf
die
spontane
lytische
Die lytische Replikation des Virus ist unmittelbar mit dem Tod der infizierten Zelle verbunden.
Um die lebenslange Viruspersistenz in nicht proliferierenden Zellen zu sichern, muss zum
Erhalt der Population latent infizierter Zellen entweder die Reaktivierung des Virus
unterdrückt
oder
ein
Gleichgewicht
zwischen
Virusproduktion
und
kontinuierlicher
Neuinfektion hergestellt werden. Bei gesunden, EBV-positiven Personen konnte bislang in
den Zellen des peripheren Blutes keine Virusreaktivierung festgestellt werden, weshalb in
den zirkulierenden, latent infizierten B-Zellen eine Unterdrückung der lytischen Infektion
wahrscheinlich ist [152]. Die zur Verbreitung des Virus in der menschlichen Population
notwendige Virusproduktion findet wahrscheinlich in den B-Zellen und den Epithelzellen im
Lymphgewebe des Oropharynx statt [292]. Im Gegensatz zur Aktivierung, sind Mechanismen
zur Unterdrückung der replikativen Infektion bis heute noch nicht gut untersucht.
Die Regulation der replikativen Infektion durch die Expression des lytischen Proteins BZLF1
erfolgt auf mehreren Ebenen. Zelluläre Proteine, wie die Transkriptionsfaktoren ZEB1, YY1
und EF-2, unterdrücken die Virus-Reaktivierung über negative Elemente im BZLF1-Promotor
(siehe Abschnitt 6.2). Zusätzlich wird die Aktivität des viralen Transaktivators BZLF1 durch
post-transkriptionelle Modifikationen wie Phosphorylierung reguliert [293]. Eine weitere
Möglichkeit der post-transkriptionellen Regulation stellen die miRNAs dar. Die kleinen, nichtkodierenden RNAs erkennen komplementäre Sequenzen überwiegend im 3´-UTR von
mRNAs und können zur Inhibition der Translation führen oder den Abbau der mRNAs
einleiten (siehe Abschnitt 3.8). Für die EBV-kodierte miR-BHRF1-3 wurde in silico eine
Bindestelle im 3´-UTR der BZLF1-mRNA vorhergesagt [277]. In der vorliegenden Arbeit
sollte untersucht werden, ob die miR-BHRF1-3 durch Bindung an den 3´-UTR der mRNA von
BZLF1 die Translation von BZLF1 inhibiert und somit die Reaktivierung des lytischen Zyklus
unterdrückt (Abbildung 15).
Zu Beginn wurden verschiedene EBV-positive Zelllinien auf die Expression der miR-BHRF13 untersucht. In der Northern-Blot-Analyse konnte in den Latenz I BL-Zelllinien Akata, Mutu I
und Raji und der Latenz III lymphoblastoiden Zelllinie IM-9 keine reife miR-BHRF1-3
detektiert werden. Die Latenz III Zelllinien Mutu III (BL) und HS-Sultan (LCL) zeigten eine
Expression der reifen miR-BHRF1-3 (Abbildung 16 A). Die gefundene Expression der miRBHRF1-3 in Zelllinien der Latenz III, mit Ausnahme von IM-9, stimmen mit der von Cai et al.,
gefundenen differentiellen Expression der viralen miRNAs überein. Die viralen BHRF1miRNAs werden nur in Zellen, welche die Latenz III-Promotoren Wp und Cp für die
73
6. Diskussion
Expression des EBNA-Transkripts verwenden, exprimiert [261, 268]. Bei Zellen der Latenzen
I und II erfolgt die Transkription des latenten EBNA1-Proteins vom Promotor Qp. Die Lage
des BHRF1-Lokus upstream vom Promotor Qp verhindert hierbei die Expression der
BHRF1-miRNAs [278] (Abbildung 7). Durch semiquantitative RT-PCR-Analysen wurde eine
inverse Korrelation der miR-BHRF1-3-Expression mit der Transkription des unmittelbar
frühen Gens BZLF1 und des späten lytischen Gens für das Glykoprotein gp220 auf mRNAEbene gezeigt (Abbildung 16). Unstimulierte BL-Zelllinien mit Latenz I (Mutu I und Akata)
weisen in vitro eine regelmäßige spontane lytische Aktivierung in einigen Zellen auf.
Aufgrund der geringen Frequenz der spontan lytischen Zellen von unter 5 % [268, 294] war
die replikative Infektion nicht im Western-Blot-Verfahren nachweisbar. LCLs der Latenz III
(Mutu III, HS-Sultan) sind weniger permissiv für die Induktion des lytischen Zyklus [295, 296]
und sind in vitro meist durch eine stabile latente Infektion gekennzeichnet [116]. miR-BHRF13-negative IM-9-Zellen zeigten in der vorliegenden Arbeit allerdings eine deutliche
Expression der lytischen Gene BZLF1 und gp220 (Abbildung 16). Die inverse Korrelation der
miR-BHRF1-3-Expression mit dem Auftreten spontaner lytischer Virus-Reaktivierung,
besonders bei der lymphoblastoiden Zelllinie IM-9, lässt auf einen Einfluss der viralen miRNA
auf die Induktion des lytischen Zyklus schließen.
Die biochemische Verifizierung der in silico vorhergesagten miR-BHRF1-3-Bindung an den
3´-UTR von BZLF1 wurde in dualen Luziferase-Versuchen durchgeführt (Abbildung 18).
HEK293-Zellen wurden transient mit verschiedenen Konzentrationen von dem miR-BHRF13-Expressionvektor (Abbildung 17) und dem dualen BZLF1-3´-UTR-Luziferase-Vektor kotransfiziert. Die eingesetzten miR-BHRF1-3-Mengen von 125 ng bis 1200 ng DNA zeigten im
Vergleich zu 600 ng Kontrollvektor in allen Ansätzen einen Rückgang der Luziferase-Aktivität
um mindestens 21 % (Abbildung 19 A). Die stärkste Reduktion der Luziferase-Aktivität von
42 % wurde bei einer eingesetzten Menge von 600 ng miR-BHRF1-3 gemessen. Zusätzlich
wurde in einem weiteren Experiment die miR-BHRF1-3-vermittelte Hemmung der LuziferaseAktivität bei eingesetzten Mengen von 600 ng und 1200 ng miR-BHRF1-3 auf die Ansätze
mit den entsprechenden Mengen an Kontrollvektoren untersucht. Hier zeigte sich ebenfalls
eine deutliche Reduktion der Luziferase-Aktivität um 42% (600 ng) und 40 % (1200 ng) in
Anwesenheit der miR-BHRF1-3 (Abbildung 19 B). Luziferase-Versuche mit einer mutierten
BZLF1-3´-UTR-Bindestelle für die miR-BHRF1-3 zeigten, dass die Bindung der miRNA an
den 3´-UTR von BZLF1 spezifisch erfolgt (Abbildung 20). Obwohl die miR-BHRF1-3 auch die
Luziferase-Aktivität bei mutierter 3´-UTR-Bindestelle um 16 % reduzierte, war im Vergleich
dazu der Rückgang der Luziferase-Aktivität mit der Wildtyp 3´-UTR-Bindestelle um 35 %
stark signifikant (p = 0,0004). Der leichte Einfluss der miRNA auf die mutierte Bindestelle
74
6. Diskussion
beruht vermutlich auf teilweiser Interaktion der kurzen, reifen miRNA-Sequenz mit kurzen
komplementären Bereichen des mutierten BZLF1-3´-UTR außerhalb der Bindestelle.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit eine deutliche miR-BHRF1-3-vermittelte Reduktion
der Luziferase-Aktivität durch Bindung der reifen miRNA an den BZLF1-3´-UTR gezeigt
werden. Aber es kam zu keiner kompletten Inhibierung der Luziferase-Translation. Neben
dem EBV wurde auch bei einem weiteren humanen Herpesvirus, dem Zytomegalievirus
(HCMV), ein Einfluss der viralen hcmv-miR-UL112-1 auf die Translation des unmittelbar
frühen lytischen Proteins IE1/IE72 beobachtet [277, 297]. In beiden Arbeitsgruppen konnte in
Luziferase-Versuchen ebenfalls nur eine miRNA-induzierte Reduktion, aber keine komplette
Inhibierung der Luziferase-Aktivität gezeigt werden. Murphy et. al., konnten mit einem in der
Arbeitsgruppe entwickelten Algorithmus auch für weitere humane Herpesviren, wie HSV-1
und KSHV, bioinformatisch mögliche Bindestellen für Virus-kodierte miRNAs im 3´-UTR von
unmittelbar frühen lytischen Genen vorhersagen [277].
Basierend auf den Ergebnissen der Luziferase-Versuche sollte die miR-BHRF1-3-induzierte
Inhibierung von endogenem BZLF1 in EBV-positiven B-Zellen untersucht werden. Als
Modell-System dienten hierbei die miR-BHRF1-3 negativen Wildtyp Mutu I-Zellen und stabil
mit pmiR-BHRF1-3- und pKontroll-transfizierte Mutu I-Klone (Abbildung 21 A). Auf mRNAEbene konnte kein eindeutiger Einfluss der miR-BHRF1-3-Expression auf die mRNA-Menge
von BZLF1 und gp220 gezeigt werden (Abbildung 21 B). Die geringere Menge an BZLF1mRNA in den miR-BHRF1-3-positiven Klonen 4, 18, 15 und 17 ist vermutlich auf einen
miRNA-vermittelten Abbau der mRNA zurückzuführen. Die mRNA-Expression des späten
lytischen Gens gp220 verhält sich wie erwartet kongruent mit der mRNA-Expression des
lytischen Aktivators BZLF1. Auf Protein-Ebene führt die Expression der miR-BHRF1-3 zu
einer signifikanten Reduktion der BZLF1-Proteinmenge. Die Normalisierung der BZLF1Proteinintensität aus Abbildung 21 C auf die Aktin-Expression zeigte eine überwiegend
verminderte BZLF1-Expression in miR-BHRF1-3-positiven Zellen (Abbildung 22 A). Der
Vergleich von allen miR-BHRF1-3-positiven Klonen mit Klonen ohne miRNA zeigt eine
deutliche und stark signifikante (p= 0,0033) Reduktion der relativen BZLF1-Proteinmenge in
Anwesenheit der miR-BHRF1-3 (Abbildung 22 B).
Die unterschiedliche Expressionsstärke des BZLF1-Proteins lässt sich möglicherweise durch
den Einfluss des Elektroporationspulses erklären. Die verstärkte spontane lytische
Aktivierung in allen Klonen im Vergleich zu den Wildtyp Mutu I-Zellen kann zusätzlich durch
die Kultivierung im Selektionsmedium bedingt sein. Außerdem ist nicht bekannt, ob alle
G418-resistente Zellen der stabil-transfizierten Klone die miRNA in gleicher Stärke
75
6. Diskussion
exprimieren. Dies müsste auf Einzelzellebene mittels in-situ-Hybridisierung für die miRBHRF1-3 überprüft werden. Die Tatsache, dass keine Korrelation zwischen der BZLF1Proteinmenge und der Stärke der miR-BHRF1-3-Expression besteht, kann möglicherweise
auf unterschiedliche Expressionslevel der miR-BHRF1-3 auf Einzelzellebene zurückgeführt
werden.
Die Bindung der miR-BHRF1-3 in den Luziferase-Versuchen und die signifikante Reduktion
endogenen BZLF1-Proteins in miR-BHRF1-3-positiven Klonen implizieren eine Rolle der
miRNA bei der Unterdrückung der spontanen replikativen EBV-Infektion. Die Ergebnisse aus
dieser Arbeit werden unterstützt durch die hcmv-miR-UL112-1-induzierte Hemmung des
unmittelbar frühen lytischen Proteins IE1/IE72 bei HCMV und weitere identifizierte putative
Bindestellen viraler miRNAs in unmittelbar frühen lytischen Transaktivatoren bei mehreren
humanen Herpesviren [277, 297]. Bis auf die HCMV-kodierte miRNA werden die
beschriebenen herpesviralen miRNAs während der latenten Infektion des Virus exprimiert.
Die Expression der miRNA in latent infizierten B-Zellen resultiert nur in einer Reduktion der
spontanen lytischen Reaktivierung und verhindert die Translation von BZLF1 nicht
vollständig. Die miR-BHRF1-3 stellt somit vermutlich einen viralen Faktor dar, der die
Translation des lytischen Transaktivators BZLF1 hemmt und somit die spontane Aktivierung
des replikativen Zyklus unterdrückt und die persistente EBV-Infektion aufrecht erhält.
6.4 Einfluss der miR-BHRF1-3 auf die IgM-vermittelte Induktion der
replikativen EBV-Infektion
Anhand der stabilen miR-BHRF1-3-Klone konnte eine verminderte spontane Aktivierung der
replikativen Infektion von EBV in latent infizierten B-Zellen in Anwesenheit der miRNA
gezeigt werden. Aber unterdrückt die virale miRNA auch die BZLF1-Translation nach
Stimulierung des lytischen Zyklus? Flemington und Speck stellten 1990 ein sogenanntes
Zwei-Schritt-Modell zur Aktivierung des lytischen Zyklus auf (Abbildung 4). Im latenten
Zustand unterdrücken zelluläre Faktoren durch die Bindung an negative cis-Elemente die
Transkription des BZLF1-Gens vom Zp Promotor. Exogene Faktoren wie Phorbolester (TPA)
und anti-Immunglobulin-Antikörper induzieren über die responsiven Elemente des Promotors
eine schwache Expression des BZLF1 Proteins. Übersteigt die BZLF1-Menge eine kritische
Konzentration, führt die Autoreaktivierung des Promotors über BZLF1-Bindung zu einer
starken Expression des BZLF1-Proteins [184]. Durch den Schwellenwert der BZLF1Konzentration und die positive, autoregulative Rückkopplung verhindert das Virus einerseits
76
6. Diskussion
eine häufige spontane Reaktivierung ohne Stimulation des lytischen Zyklus und sichert
andererseits eine schnelle und starke BZLF1-Expression nach effizienter Induktion des
lytischen Zyklus. Die anti-Immunglobulin-vermittelte Induktion des lytischen Zyklus über den
BCR stellt dagegen einen spezifischen und physiologischen Weg der EBV-Reaktivierung
dar. Die lytische Replikation wird durch die Aktivierung des unmittelbar frühen Genprodukts
BZLF1 und der folgenden Expressionskaskade viraler Gene ausgelöst [148].
Die Stimulierung der Wildtyp Mutu I-Zellen und der stabilen Klone erfolgte über anti-IgMvermittelte Induktion des BCR, da alle Zellen den IgM-Rezeptor auf der Oberfläche
exprimieren (Abbildung 23). Nach 48 h anti-IgM Stimulierung konnte in allen Zellen mit
Latenz I die Induktion des lytischen Zyklus beobachtet werden (Abbildung 24). Unabhängig
von der miR-BHRF1-3-Expression wurde BZLF1 sowohl auf mRNA- als auch auf ProteinEbene induziert. Wobei die induzierte BZLF1-Expression bei miR-BHRF1-3-positiven Zellen
deutlich geringer war als die spontane BZLF1-Expression in miR-BHRF1-3-negativen
Klonen. Der Anstieg der mRNA für gp220 zeigt, dass nicht nur der lytische Transaktivator
BZLF1 induziert wurde, sondern die lytische Kaskade bis hin zu den späten lytischen
Glykoproteinen erfolgte (Abbildung 24 A). Nach 48 h IgM-Stimulation konnte keine Aussage
über die relative Induktion von BZLF1 getroffen werden, da die miRNA-positiven Klone 4 und
18
unstimuliert
keine
Expression
von
BZLF1
zeigten.
Bei
kürzeren
anti-IgM-
Stimulierungsversuchen zeigte sich bereits nach 6 h Inkubation mit anti-IgM auf mRNAEbene eine Induktion der BZLF1-Expression, die nach 24 h Stimulation noch deutlich
gesteigert wurde (Abbildung 25). Die relative BZLF1-Expression nach IgM-Stimulation zeigte
beim Vergleich der BZLF1-Proteinmenge nach 6 h und 24 h Inkubation eine deutlich erhöhte
Induktion von BZLF1 um den Faktor 2,38 (Klon 4) und 2,17 (Klon18) in miR-BHRF1-3exprimierenden Klonen (Abbildung 26). In den miRNA-negativen Klonen wurde nur eine
maximal 1,16-fache Induktion von BZLF1 erreicht. Die im Vergleich zu den miRNA-negativen
Klonen leicht erhöhte BZLF1-Induktion bei den Wildtyp Mutu I-Zellen ist durch die erhöhte
basale BZLF1-Expression der unstimulierten Klone zu erklären (Abbildung 24 C).
Die Daten der Stimulierungsversuche sprechen dafür, dass die miR-BHRF1-3 nach Induktion
des lytischen Zyklus die Expression von BZLF1 zuerst unterdrückt, aber nach längerer
Stimulierung die Induktion von BZLF1 nicht mehr inhibiert.
Die in vivo Expression der viralen miR-BHRF1-3 ist bislang noch nicht untersucht. Aber in
vitro wurde die Expression von miR-BHRF1-3 nur in B-Zellen der Latenz III nachgewiesen
[268]. Das virale Proteinexpressionsmuster der Latenz III verhindert eine spontane
Aktivierung der replikativen EBV-Infektion [79]. In B-Zellen mit der Latenz I, welche keine
77
6. Diskussion
miR-BHRF1-3 exprimieren, kann in vitro dagegen regelmäßig eine spontane lytische
Reaktivierung von EBV beobachtet werden. Die spontane Induktion von BZLF1 in B-Zellen
kann mit den Ergebnissen dieser Arbeit teilweise durch die Abwesenheit der miR-BHRF1-3
erklärt werden. Aber die virale miRNA ist wahrscheinlich nur ein Faktor zur Unterdrückung
der spontanen Aktivierung des lytischen Zyklus, da die exogene Expression von miRBHRF1-3 die Expression von BZLF1 in unstimulierten Zellen nur vermindert, aber nicht
komplett inhibiert. Nach Stimulierung des lytischen Zyklus durch anti-IgM zeigt die miRNA
eine Verzögerung der BZLF1-Induktion, welche aber nach länger andauernder Stimulierung
aufgehoben wird. Somit verhindert die miR-BHRF1-3 vermutlich, dass EBV in B-Zellen ohne
ausreichend starkes BCR-Signal in die replikative Form der Infektion übergeht und sichert
somit die persistente Infektion.
78
7. Material und Methoden
7. Material und Methoden
7.1 Materialien
7.1.1 Chemikalien, Enzyme und Materialien
Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche allgemeine Reagenzien, Chemikalien,
Enzyme und Materialien von folgenden Firmen erworben: BioRad (München), Dako
Deutschland GmbH (Hamburg), Eppendorf (Hamburg), Fermentas (St. Leon-Rot), GEHealthcare (München), Greiner (Frickenhausen), Invitrogen/GIBCO (Karlsruhe), Merck
(Darmstadt), NEB (Frankfurt/M.), Nunc (Wiesbaden), Peqlab (Erlangen), Qiagen (Hilden),
Promega (Mannheim), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Roth (Karlsruhe) und SigmaAldrich (Taufkirchen). Für die Herstellung von Puffern, Lösungen und Verdünnungen wurde
ausschließlich Reinstwasser aus einer PureLab Deionisierungsanlage der Firma USF
(Ramsbach-Baumbach) oder HPLC-Wasser der Firma Merck verwendet.
7.1.2 Antikörper
Alle verwendeten Antikörper wurden gemäß den Herstellerangaben gelagert. Serum wurde
bei -70°C und Hybridom-Überstand bei -20°C gelagert.
Antigen
Antikörper
Verdünnung/
Konzentration
Herkunft
Aktin
Kaninchen IgG-anti-Maus/Human
WB 1:10000
Sigma-Aldrich
Blimp1
Kaninchen Serum-anti-Maus/Human
IF 1:5000
IH 1:2000
Labor Jäck
BZLF1
Maus-Hybridom-Überstand-anti-EBV, Klon BZ1
WB 1:10
IF 1:20
IH 1:20
Young et al., [117]
EBNA1
Ratten-Hybridom-Überstand-anti-EBV, Klon 1H4
IH 1:20
Grässer et al. ,
[134]
HSP90
Maus IgG-anti-Maus/Human
WB 1:1000
Santa Cruz
IgM
Biotin-Ziege IgM-anti-Human
FACS 1:50
Southern Biotech
IgM
Ziege IgM-anti-Human (µ-chain-specific)
Stim.: 5 µg/500 µl
Sigma-Aldrich
ZEB1
Kaninchen IgG-anti-Maus/Human, Klon H102
WB 1:500
Santa Cruz
Tabelle 2: Alphabetische Auflistung verwendeter Primär-Antikörper. Abkürzungen: WB: Western-BlotAnalyse; IF: Immunfluoreszenz; IH: Immunhistochemie; FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting; Stim.: AntiIgM-Stimulation.
79
7. Material und Methoden
Antigen
Antikörper
Verdünnung
Herkunft
Kaninchen IgG
Cy3-Esel anti-Kaninchen IgG
IF 1:300
Jackson Lab
Maus IgG
Cy5-Ziege anti-Maus IgG
IF 1:600
Chemicon
Maus IgG
AP-Kaninchen anti-Maus IgG
IH 1:100
DakoCytomation
Biotin
Cy3-Streptavidin
FACS 1:800
GeHealthcare
Maus IgG
HRP-Ziege anti-Maus IgG
WB 1:10000
BioRad
Kaninchen IgG
HRP-Ziege anti-Kaninchen IgG
WB 1:10000
BioRad
Ratten IgG
Kaninchen anti-Ratte IgG
IH 1:20000
Jackson Lab
Tabelle 3: Auflistung verwendeter Sekundär-Antikörper. Abkürzungen: WB: Western-Blot-Analyse; IF:
Immunfluoreszenz; IH: Immunhistochemie; FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting; ISH.: in-situHybridisierung, AP: alkalische Phosphatase.
7.1.3 Oligonukleotide
Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen bezogen.
ƒ
Oligonukleotide für die Klonierung des BZLF1-3´-UTR in die Luziferase-Vektoren
Name
Sequenz 5´→ 3
BZLF1 3´-UTR XbaI.for
ctagactcccgttattgaaaccacgcctgcttcacgcctcgtttactaatggaatattgc
BZLF1 3´-UTR NotI.rev
ggccgcaatattccattagtaaacgaggcgtgaagcaggcgtggtttcaataacgggagt
mutBZLF1 3´-UTR XbaI.for
ctagacttaaacttattgaaaccacgcctgcttcacgcctcgtttactaatggaatattgc
mutBZLF1 3´-UTR NotI.rev
ggccgcaatattccattagtaaacgaggcgtgaagcaggcgtggtttcaatagtttaagt
Tabelle 4: Auflistung verwendeter Oligonukleotide für die Klonierung des BZLF1-3´-UTR in die LuziferaseVektoren. Eingebrachte Schnittstellen für Restriktionsenzyme sind unterstrichen. Die mutierte Sequenz ist fett
hervorgehoben.
80
7. Material und Methoden
ƒ
Sonden für Northern-Blot-Analysen
Name
Sequenz 5´→ 3´
miR-BHRF1-3
tgtgcttacacacttccctta
hsa-miR-16
cgccaatatttacgtgctgcta
Tabelle 5: Auflistung verwendeter Oligonukleotide für Northern-Blot-Sonden.
ƒ
Primer für RT-PCR-Analysen
Name
Sequenz 5´→ 3´
Aktin.for
caagagatggccacggctgct
Aktin.rev
tccttctgcatcctgtcggca
Blimp.for
gttcctaacgccaacagg
Blimp.rev
gcaaagtcccgacaataccac
BZLF1.for
ttccacagcctgcaccagtg
BZLF1.rev
ggcagcagccacctcacggt
gp220.for
gtcacctgtgttatattttcaccactttc
gp220.rev
cctaccaacctcaccgcacc
ZEB1.for
ttcagcatcaccaggcagtc
ZEB1.rev
gagtggaggaggctgagtag
Tabelle 6: Alphabetische Auflistung verwendeter Oligonukleotide für semiquantitative RT-PCR-Analysen.
7.1.4 Radioaktive Isotope
γ-32P-ATP
für
Northern-Blot-Analysen
wurde
(Braunschweig) bezogen.
81
von
der
Firma
Hartmann
Analytic
7. Material und Methoden
7.1.5 Plasmide
pEXP4-Blimp1
Der Vektor enthält die komplette cDNA für Blimp1 und wurde von Dr. Maike Büttner,
Pathologisches
Institut
Erlangen
zur
Verfügung
gestellt.
Als
korrespondierender
Kontrollvektor ohne das Blimp1-cDNA-Insert diente pEXP4-MCS.
pHEBo-Zp-Luc
Der Vektor enthält das Firefly-Luziferase-Gen unter Kontrolle des BZLF1-Promotors Zp. Als
korrespondierender Kontrollvektor ohne den BZLF1-Promotor diente pHEBo-Luc. Beide
Vektoren wurden uns freundlicherweise von Prof. Paul Farrell vom Imperial College in
London, UK zur Verfügung gestellt und sind in Binne et al., beschrieben [176].
pmiR-BHRF1-3
Die Sequenz der miR-BHRF1-3 wurde über BamHI/EcoRI (NEB) aus dem miR-BHRF1-3Vektor der Firma Geneservice Ltd. (Cambridge, UK) herausgeschnitten und über
BamHI/EcoRI in die multiple Klonierungsstelle in den Vektor pEF1/Mcy-HisA der Firma
Invitrogen kloniert. Der Vektor ohne Insert diente als korrespondierende Kontrolle (pKontroll).
pRenilla-luc (pRL-TK)
Der Vektor wurde von der Firma Promega bezogen und enthält die cDNA der RenillaLuziferase.
pLuc-3´-UTR und pLuc-3´-UTRmut
Die dimerisierten Oligonukleotide für den Wildtyp BZLF1-3´-UTR und den BZLF1-3´-UTRmut
aus Tabelle 4 wurden über NotI/XbaI (NEB) in den dualen Luziferasevektor psi-CHECK-4
(Labor Jäck) ligiert.
pBSJJJ1 und pBSJJJ2
Die Vektoren enthalten die Inserts für EBER1 bzw. EBER2 und standen in der Arbeitsgruppe
von Prof. Niedobitek zur Verfügung.
82
7. Material und Methoden
7.1.6 Zelllinien
Zelllinie
293T
AGS
Akata
Arh-77
HeLa
HEK293
HS-Sultan
IM-9
Mutu I
Mutu III
Ramos
Raji
RPMI-8226
Eigenschaften
Wachstum
ƒ
EBV-negativ
ƒ
embryonale Epithelzellen der Niere
ƒ
mit Adenovirus Typ 5 transformiert
ƒ
EBV-negativ
ƒ
Epithelzellen aus Magenadenokarzinom
ƒ
EBV-positiv
ƒ
Burkitt Lymphom
ƒ
stabil Latenz I
ƒ
EBV-positiv
ƒ
lymphoblastoide Zelllinie
ƒ
Latenz III
ƒ
EBV-negativ
ƒ
Epithelzellen aus Zervixadenokarzinom
ƒ
EBV-negativ
ƒ
embryonale Epithelzellen der Niere
ƒ
EBV-positiv
ƒ
lymphoblastoide Zelllinie
ƒ
Latenz III
ƒ
EBV-positiv
ƒ
lymphoblastoide Zelllinie
ƒ
Latenz III
ƒ
EBV-positiv
ƒ
Burkitt Lymphom
ƒ
Latenz I
ƒ
EBV-positiv
ƒ
Burkitt Lymphom
ƒ
Latenz III
ƒ
EBV-negativ
ƒ
Burkitt Lymphom
ƒ
EBV-positiv
ƒ
Burkitt Lymphom
ƒ
Latenz I
ƒ
EBV-negativ
ƒ
Myelom-Zelllinie
adhärent
adhärent
Suspension
Suspension
adhärent
adhärent
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
Suspension
Tabelle 7: Alphabetische Auflistung verwendeter humaner Zelllinien.
83
7. Material und Methoden
7.1.7 Bakterien
Alle Klonierungen wurden mit folgenden Bakterienstämmen durchgeführt:
E.coli GeneHogs: mcrA, ∆(mrr-hsd RMS-mcr BC), Φ80 LacZ ∆M15, ∆LacX74, recA1,
ara∆139, (ara-leu) 7697, galU galK rpsL (strR), endA1, nupG (Invitrogen)
E.coli DH5α: ∆(lacZYA-argF)U169, deoR, endA1, gyrA96, hsdR17, phoA, Φ80 ∆LacZ M15,
recA1, relA1, supE44, λ-, thi-1
7.1.8 Geräte, Datenbanken und Software
Die in dieser Arbeit verwendeten Geräte sind bei den jeweiligen Methoden aufgelistet.
Für diese Arbeit wurden folgende öffentlich zugängliche Datenbanken verwendet:
ƒ
ensemble.org (Genom Browser)
ƒ
miRBase.org (miRNA-Datenbank)
ƒ
ncbi.nlm.nih.gov (Datenbank für molekularbiologische Informationen)
ƒ
pubmed.com (Literaturrecherche)
ƒ
rVista 2.0.dcode.org (Identifizierung von Transkriptionsfaktorbindestellen)
Für die Durchführung der Versuche und die Auswertung der gewonnen Daten wurde
folgende Computerprogramme verwendet:
ƒ
Aida Image Analyzer (Raytest, Phospho-Imager)
ƒ
BASReader (Raytest, Phospho-Imager)
ƒ
CellQuestPro (Becton Dickinson, Durchflusszytometrie)
ƒ
FB12 Sirius (Berthold Detection Systems, Luziferase-Messungen)
ƒ
GraphPad Prism 4 (GraphPad, Graphen, Statistik)
ƒ
ImageJ (Shareware, Bildbearbeitungsprogramm)
ƒ
Microsoft 0ffice 2003
84
7. Material und Methoden
7.2 Methoden
7.2.1 Allgemeine Methoden
Die im Folgenden aufgeführten Standardmethoden der Molekularbiologie wurden nach
Protokollen durchgeführt, die im Maniatis (Sambrook et al., 1989) beschrieben sind:
ƒ
Ligation und Klonierung
ƒ
Transformation von Bakterien
ƒ
Präparation und Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
ƒ
Verdau von DNA mit spezifischen Restriktionsendonukleasen
7.2.2 Zellkultur
7.2.2.1 Kultivierung von Zellen
Kultivierung von in Suspension wachsenden Zellen
Alle verwendeten B-Zelllinen wurden in Suspension bei 37°C mit einem CO2-Partialdruck von
5 % in RPMI-1640-Medium mit 10 % Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM
L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin kultiviert.
Zur Selektion wurde dem Kulturmedium der Mutu I-Klone zusätzlich 1 mg/ml G418
zugesetzt.
Sobald die Zellen eine Dichte von 106 Zellen/ml erreichten, wurden die Zellen durch
Entnahme von Kulturmedium und Zugabe von frischem Medium verdünnt bzw. expandiert.
Kultivierung von adhärent wachsenden Zellen
Die adhärent wachsenden HEK293- und HEK293T-Zellen wurden bei 37 °C mit einem CO2Partialdruck von 7 % in DMEM-Medium mit 10 % Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum
(FCS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml
Streptomycin kultiviert.
Die ebenfalls adhärent wachsenden HeLa-Zellen wurden wie die Suspensionskulturen bei
37°C mit einem CO2-Partialdruck von 5 % in RPMI-1640-Medium mit 10 % Hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml
Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin kultiviert.
85
7. Material und Methoden
Alle adhärenten Zelllinien wurden dreimal pro Woche zuerst einmal mit PBS gewaschen,
anschließend mit Trypsin-EDTA vom Flaschenboden abgelöst und mit 1/8 des Zellvolumens
neu in Flaschen ausgebracht.
7.2.2.2 Bestimmung der Zellzahl
Die Zellzahl wurde mittels Trypanblaufärbung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.
Hierfür wurden je 50 µl Zellsuspension mit 50 µl einer Trypanblaulösung gemischt und 10 µl
in die Zählkammer gegeben. Tote Zellen nehmen aufgrund ihrer durchlässigen Zellmembran
das Trypanblau auf und erscheinen im Mikroskop dunkler als lebende Zellen. Zur
Bestimmung der Zellzahl wurden die lebenden Zellen in den vier Eckquadraten der
Zählkammer
ausgezählt.
Der
Mittelwert
ergibt
nach
Multiplikation
mit
dem
Verdünnungsfaktor (x 2) und dem Kammerfaktor (x 104) die Zellzahl pro ml.
7.2.2.3 Einzelzellklonierung zur Gewinnung stabil transfizierter Zellklone
Für die Gewinnung von stabilen Klonen wurden die pmiRNA-BHRF1-3- und pKontrolltransfizierten Mutu I-Zellen 24 h nach der Transfektion mit 0,5 mg/ml Selektionsmarker G418
versetztem Kultivierungsmedium für fünf Tage kultiviert. Anschließend wurde zur
Subklonierung einzelner Klone die „limiting-dilution“-Methode angewendet. Die Zellen
wurden hierbei so in einer 96-Loch-Platte in Selektionsmedium mit 1 mg/ml G418 ausgesät,
dass 0,3 Zellen/Loch in 200 µl Medium vorlagen. Ausgewachsene Klone wurden expandiert
und auf die Expression des transfizierten Konstrukts überprüft.
7.2.2.4 Stimulation von B-Zellen mit anti-Immunglobulin-Antikörpern
Für die Stimulation des B-Zell-Rezeptors durch anti-IgM wurden 2,5 x 105 Zellen für
verschiedene Zeitpunkte in anti-IgM beschichteten Platten inkubiert. Die Beschichtung mit
anti-IgM (5 µg/Loch 24-Loch-Platte) erfolgte über Nacht in 500 µl 1 x PBS und wurde vor
Zugabe der Zellen einmal mit 1 ml 1 x PBS gewaschen.
86
7. Material und Methoden
7.2.3 Transfektion von Zellen
Bei allen eingesetzten Transfektionsmethoden wurden die Zellen einen Tag vor der
Transfektion
in
frischem
Medium
verdünnt
(Suspensionszellen)
oder
in
frischem
Transfektionsmedium ausgebracht (adhärente Zellen).
Transfektion mittels Elektroporation (Amaxa)
Für die Transfektion der Mutu I-Zellen mit den Vektoren pmiRNA-BHRF1-3 und pKontroll
wurde eine Nukleofektion mit dem Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit V durchgeführt. Die
Transfektion von 2 x 106 Mutu I-Zellen mit je 2 µg des entsprechenden Vektors erfolgte
mittels Amaxa-Impuls C-009 in Amaxa-Solution V nach Herstellerangaben.
Transfektion mittels Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
Einen Tag vor der Transfektion wurden 1,5 x 105 HEK293-und 293T-Zellen in 500 µl DMEMMedium ohne Zugabe von Antibiotika in 24-Loch-Platten ausgesät. Die Transfektion erfolgte
nach Herstellerangaben. Zur Überprüfung von Expressionsvektoren wurden 2 µg PlasmidDNA eingesetzt. Für Luziferase-Versuche wurden folgende Mengen an Plasmid kotransfiziert:
Duale Luziferase-Versuche: 7,5 ng dualer Luziferase-Vektor,
600 ng miRNA-Expressionsvektor
Luziferase-Versuche:
200 ng Firefly-Luziferase-Vektor
100 ng Renilla-Luziferase-Vektor
200 ng Blimp1-Expressionsvektor
Transfektion mittels FuGene HD (Roche Diagnostics)
Einen Tag vor der Transfektion wurden 1,5 x 105 HeLa-Zellen in 500 µl RPMI-Medium ohne
Zugabe von Antibiotika in 24-Loch-Platten ausgesät. Die Transfektion wurde nach
Herstellerangaben durchgeführt. Für Luziferase-Versuche wurden folgende Mengen an
Plasmid ko-transfiziert:
200 ng Firefly-Luziferase-Vektor
100 ng Renilla-Luziferase-Vektor
200 ng Blimp1-Expressionsvektor
Transfektion mittels SuperFect (Qiagen)
Für die Überexpression von Blimp1 in HeLa-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion
2,5 x 105 Zellen in 2 ml RPMI-Kultivierungsmedium in 6-Loch-Platten ausgesät. Die
Transfektion mit 2 µg Plasmid-DNA wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.
87
7. Material und Methoden
7.2.4 Luziferase-Versuche
Für die Durchführung der Luziferase-Versuche wurde das Dual-Luciferase® Reporter Assay
System der Firma Promega verwendet. Die Herstellung der Gesamtzellextrakte und die
Biolumineszenz-Messung erfolgten nach Herstellerangaben. Für die Messungen wurde das
Luminometer Sirius V3.1 (Berthold Detection Systems) verwendet.
7.2.5 Charakterisierung von Nukleinsäuren
7.2.5.1 Herstellung von cDNA aus RNA
Für die Herstellung von cDNA aus RNA wurde das RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis
Kit von Fermentas verwendet. Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte am
NanoDrop-Photometer (Peqlab). Für die cDNA-Synthese wurden 0,5 – 1 µg RNA eingesetzt
cDNA-Synthese-Reaktion
0,5 – 1 µg
RNA
1 µl
Oligo(dT) Primer (100µM)
Der Ansatz wurde mit DEPC-Wasser auf 12 µl aufgefüllt, für 5 min bei 70°C inkubiert und
anschließend kurz auf Eis gestellt.
Anschließend wurden pro Ansatz
4 µl
5 x Reaktionspuffer
1 µl
RiboLockTM RNase Inhibitor (20 U/µl)
2 µl
dNTP-Mix (10 mM)
zugegeben und für 5 min bei 42°C inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wurde pro Ansatz 1 µl M-MuLV reverse Transkriptase (200 U/µl)
dazugegeben und für 1 h bei 42°C inkubiert. Abschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung
der Reaktion bei 70°C für 10 min.
Zur weiteren Verwendung der cDNA wurde der 20 µl Syntheseansatz auf 100 µl mit dH2O
aufgefüllt.
88
7. Material und Methoden
7.2.5.2 Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Alle RT-PCR-Reaktionen erfolgten in 20 µl Ansätzen und wurde in GeneAmp® PCR
Systems 9700 Maschine der Firma Applied Biosystems (Darmstadt) durchgeführt. Enzyme,
dNTPs und Puffer wurden von der Firma Genaxxon BioScience GmbH (Ulm) bezogen.
PCR-Ansatz
2 µl
cDNA
2 µl
10x Reaktionspuffer-15 mM MgCl2
0,3 µl dNTP-Mix (10 mM)
1,5 µl 5´-Primer (5 µM)
1,5 µl 3´-Primer (5 µM)
0,3 µl Taq-Polymerase (5 Units/µl)
ad 20 µl dH2O
Aktin
BZLF1, gp 220
Blimp1, ZEB1
5 min 94°C
5 min 94°C
5 min 94°C
28
35
30
Denaturierung
30 sek 94°C
30 sek 94°C
30 sek 94°C
Hybridisierung
30 sek 58°C
30 sek 58°C
30 sek 60°C
Synthese
30 sek 72°C
30 sek 72°C
40 sek 72°C
5 min 72°C
5 min 72°C
5 min 72°C
Denaturierung
Zyklen
Synthese
Tabelle 8: Reaktionsbedingungen bei der semiquantitativen PCR-Analyse. Abkürzungen: min: Minute; sek:
Sekunde.
7.2.5.3 DNA-Agarose Gelelektrophorese
Zur Auftrennung und Größenbestimmung von DNA-Fragmenten wurden Agarose-Gele (1,8
%) mit 5 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) pro 100 ml 1 x TAE-Puffer (50 x: 2 M Tris-HCl pH 8,5;
1 M Natriumacetat; 50 mM EDTA) verwendet. Parallel zu den DNA-Fragmenten wurde ein
100 bp DNA-Größenstandard (NEB) aufgetragen. Die Gele wurden nach der Elektrophorese
unter UV-Licht (312 nm) dokumentiert.
89
7. Material und Methoden
7.2.5.4 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden
Die radioaktive Markierung von Sonden für die Hybridisierung von miRNAs in Northern-BlotAnalysen wurde wie folgt mit Enzymen der Firma Fermentas durchgeführt:
Der Reaktionsansatz mit:
2 µl
10 µM Oligonukleotid [100 µM]
2 µl
10 x T4 PNKinase-Puffer
5 µl
γ-32P-ATP [10 mCi/ml]
10 µl
ddH2O
1 µl
T4 Poly-Nukleotid Kinase
wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend die Kinase für 10 min bei 68°C inaktiviert.
Der Ansatz wurde direkt in die vorgewärmte Hybridisierungslösung gegeben.
7.2.5.5 Northern-Blot-Analyse
Die Northern-Blot-Analyse diente dem Nachweis von miRNAs. Hierfür wurde Gesamt-RNA
mit dem miRNeasy-Mini-Kit (Qiagen) isoliert und die Konzentration am NanoDrop bestimmt.
Mit dem verwendeten Kit werden speziell die miRNAs bei der RNA-Isolierung angereichert.
Auftrennung der RNA-Moleküle
Die Auftrennung der RNA-Moleküle erfolgte durch Gelelektrophorese in einem 10 %-igen
Harnstoff-Polyacrylamidgel. Die Elektrophorese wurde in einer Trennkammer mit einer
Größe von 16 x 18 cm der Firma Hoefer (San Francisco, USA) bei 60 V über Nacht
durchgeführt. Zuvor wurde das Harnstoff-Polyacrylamidgel für 1 h bei 60 V auf die optimale
Temperatur zur RNA-Auftrennung vorgewärmt. Als Laufpuffer diente 1 x TBE-Puffer. Als
Größenstandard wurden 5 µl Ultra Low Range Marker von Fermentas mitgeführt.
Vor der Elektrophorese wurden je 30 µg der RNA-Proben mit DEPC-H2O auf gleiches
Volumen eingestellt und mit einer dem Endvolumen entsprechenden äquivolumetrischen
Menge 2 x RNA-Ladepuffer vermischt, für 5 min bei 72°C erhitzt und anschließend auf Eis
abgekühlt.
90
7. Material und Methoden
Zusammensetzung von Harnstoff-Polyacrylamidgelen
Für einen 70 ml Gel-Ansatz wurden 29,4 g Harnstoff in einem sterilen Kolben mit 15,15 ml
DEPC-H2O durch Erhitzen in der Mikrowelle aufgelöst und anschließend mit 7 ml 10 x TBE
und 23,35 ml 40 % Acryl-/ 0,8 % Bisacrylamid (19:1) versetzt. Nach Abkühlung auf RT wurde
die Gellösung durch einen 0,22 µm Sterilfilter gefiltert und anschließend 425 µl 10 % APS
und 45 µl TEMED zur Katalyse der Polymerisation zugegeben.
Verwendete Puffer und Lösungen
DEPC-H2O
Zu 3 l H2O wurden 3 ml DEPC gegeben, bei RT über Nacht
gerührt, dreimal für je 30 min autoklaviert und durch einen 0,22
µm Filter filtriert.
10 x TBE-Puffer
890 mM Tris
890 mM Borsäure
20mM EDTA; pH 8,0
in DEPC-H2O, auf pH 8,5 eingestellt, gefiltert und autoklaviert
2 x RNA-Ladepuffer
95 % (v/v) Formamid
0,09 % (w/v) Bromphenolblau in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3
0,09 % (w/v) Xylen-Cyanol in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH 8,3
in DEPC-H2O
Zur Überprüfung der Auftrennung und Integrität der RNA wurde nach der Elektrophorese das
Gel für 10 min in 1 x TBE-Puffer mit 0,1 µg/ml Ethidiumbromid gefärbt, unter UV-Licht (320
nm) dokumentiert und anschließend für 2 x 5 min in ddH20 entfärbt.
RNA-Transfer auf eine Nylonmembran
Der Transfer der aufgetrennten RNA auf eine GeneScreen Plus Nylonmembran
(PerkinElmer, Whaltham, Massachusetts, USA) erfolgte mittels der semi-dry-Methode mit
dem PerfectBlueTM-Blotting-System Sedec M der Firma Peqlab bei einer konstanten
Stromstärke von 1 mA pro cm2 Nylonmembran für 1 h. Der Aufbau des Transfers wurde
folgendermaßen durchgeführt: 3 Lagen 0,34 mm Whatman-Paper, die Nylonmembran, das
Harnstoff-Polyacrylamidgel und weitere 3 Lagen 0,34 mm Whatman-Paper luftblasenfrei und
in 1 x TBE-Puffer getränkt auf die Anodenplatte gestapelt. Zur Vernetzung der RNA-Moleküle
auf der Nylonmembran wurde die noch feuchte Membran im Stratalinker UV-crosslinker
(Stratagene, La Jolla, USA) mit einer Dosis von 1,24 J UV-Energie für 30 sek bestrahlt und
91
7. Material und Methoden
anschließend im Trockenschrank (Memmert, Schwabach) für 1 h bei 80°C gebacken. Die
Membran wurde entweder direkt hybridisiert oder bis zur weiteren Verwendung getrocknet
bei 4°C aufbewahrt.
Hybridisierung der Membran
Die Nylonmembran wurde für mind. 2 h mit 25 ml vorgewärmter Prähybridisierungslösung
bei 45°C in einer Glasröhre in einem Hybridisierungsofen (Hybaid) vorhybridisiert.
Anschließend wurde die Membran über Nacht bei 45°C mit 25 ml vorgewärmter
Hybridisierungslösung mit der radioaktiv-markierten DNA-Sonde hybridisiert. Beiden
Hybridisierungslösungen
wurde
kurz
vor
Gebrauch
10
mg/ml
frisch
denaturierte
Lachssperma-DNA (5 min, 95°C; 2 min Eis) zugegeben.
Waschen der Membran
Die hybridisierte Membran wurde für 2 x 10 min und 2 x 30 min mit 40 ml vorgewärmter
nicht-stringenter
Waschlösung
bei
45°C
im
Hybridisierungsofen
gewaschen.
War
anschließend mit dem Geiger-Zähler (Berthold Detection Systems) noch Radioaktivität von
über 100 cps messbar, wurde die Membran zusätzlich für 5 min mit 80 ml vorgewärmter
stringenter Waschlösung bei 45°C gewaschen.
Verwendete Puffer und Lösungen
Prä-/Hybridisierungslösung
5 x SSC
20 mM Na2HPO4, pH 7,2
7 % SDS
2 x Denhardt´s Lösung
in dH2O
20 x SSC
3 M NaCl
0,3 M Trinatriumcitrat-Dihydrat
pH 7,0 mit 1 M HCl
in dH2O
50 x Denhardt´s Lösung
1 % Ficoll
1 % Polyvinylpyrrolidone-40
1 % BSA, Fraktion V
in dH2O
92
7. Material und Methoden
nicht-stringente Waschlösung
3 x SSC
25 mM NaH2PO4, pH 7,5
5 % SDS
10 x Denhardt´s Lösung
in dH2O
stringente Waschlösung
1 x SSC
1 % SDS
in dH2O
Detektion der hybridisierten Sonde
Die gewaschene Membran wurde in Plastikfolie eingeschweißt und zur Detektion der
radioaktiv-markierten Sonde mind. für 12 h auf einer Phospho-Imager-Platte (BAS MP2040;
Fuji) in einer Autoradiographie Filmkassette (FBXC 1417; Fisher Scientific, Schwerte)
inkubiert. Die anschließende quantitative Messung der Isotopenintensität erfolgte mit einem
Phospho-Imager FLA-3000 (Raytest, Straubenhardt) und der Software BASReader
(Raytest). Die Auswertung wurde mit der Software Aida Image Analyzer (Raytest)
durchgeführt.
Strippen der Membran
Wurden mit einer Membran mehrere Analysen durchgeführt, wurden die gebundenen
radioaktiv-markierten Sonden durch 1 x 30 min Inkubation in 80 ml vorgewärmter Striplösung
(1 % SDS in dH2O) bei 85°C entfernt. Das Strippen der Membran wurde durch erneute
Detektion für 12 h überprüft.
7.2.5.6 EBER-in-situ Hybridisierung
Die EBER-in-situ Hybridisierung diente dem Nachweis der kleinen nicht kodierenden RNAMoleküle EBER1 und EBER2 an Paraffinschnitten.
Herstellung Digoxigenin-markierter EBER-Sonden
Die DNA-Plasmide mit EBER1-Insert und EBER2-Insert wurden über Nacht bei 37°C
linearisiert. Die Linearisierung für die antisense-EBER1-Sonde erfolgte mit HindIII, für die
93
7. Material und Methoden
sense-EBER1-Sonde mit EcoRI. Eine Linearisierung des EBER2-Plasmids mit BamHI ergibt
die antisense-Sonde, mit EcoRI die sense-Sonde.
Linearisierungsansatz:
10 µg Plasmid
10 µl
10 x Reaktionspuffer
4 µl
Restriktionsenzym
ad 50 µl DEPC-H2O
Aufreinigung und Konzentration des linearisierten Plasmids durch Alkohol-Fällung für mind.
60 min bei -20°C:
50 µl
linearisiertes Plasmid
5 µl
3 M Natriumacetat
100 µl 100 % Ethanol
Anschließend erfolgte ein Zentrifugationsschritt für 30 min bei 13000 rpm und 4°C. Das
Pellet wurde getrocknet und in 12,5 µl DEPC-H2O aufgenommen.
Die Transkription des linearisierten Plasmids in die RNA-Sonden und die gleichzeitige
Digoxigenin-Markierung der Sonde wurde mit der T3- oder T7-RNA-Polymerase von
Promega und dem DIG-RNA-Labeling Kit von Roche Diagnostics wie folgt durchgeführt:
1 µl
linearisiertes Plasmid
2 µl
10 x DIG-RNA-Labeling Mix
4 µl
5 x Transkriptionspuffer
2 µl
RNA-Polymerase
11 µl
DEPC-H2O
wurden für 2 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde restliche DNA durch die Zugabe von
2 µl DNase I und 15 min Inkubation bei 37 °C abgebaut. Nach Zugabe von 5 µl yeast-t-RNA
und 0,5 µl RNase-Inhibitor und einer Inkubation bei 37°C für 8 min wurde der
Reaktionsansatz mit 12,5 µl DEPC-H2O auf ein Endvolumen von 30 µl aufgefüllt. Es folgte
eine erneute Alkohol-Fällung mit 3 µl 3 M Natriumazid und 60 µl 100 % Ethanol über Nacht
bei -20°C. Die markierte Sonde wurde für 30 min bei 4°C und 13000 rpm abzentrifugiert, das
Pellet getrocknet und in 12,5 µl DEPC- H2O und 12,5 µl Formamid aufgenommen und bei
4°C gelagert. Die Transkription mit der entsprechenden RNA-Polymerase ergab folgende
Sonden:
antisense-EBER1
T7-RNA-Polymerase,
sense-EBER1
T3-RNA-Polymerase,
antisense-EBER2 T3-RNA-Polymerase, sense-EBER2 T7-RNA-Polymerase.
94
7. Material und Methoden
Hybridisierung der Paraffinschnitte
Die Schnitte wurden durch 3 x 20 min Inkubation in Xylol entparaffiniert und durch Inkubation
für je 3 min in einer absteigenden Alkoholreihe rehydratisiert (2 x 100 %, 2 x 96 %, 1 x 70 %)
und anschließend in DEPC-H2O gestellt. Die Demaskierung der Antigene erfolgte durch eine
20-minütige Behandlung mit 0,2 N HCl und Inkubation in 1 x PBS mit 0,5 mg/ml Pronase für
10 min. Anschließend wurden die Schnitte für 20 min in 4 % PfA fixiert, mit PBS gewaschen
und für 3 min in je 70 % und 96 % Ethanol dehydriert und an der Luft getrocknet.
Die Hybridisierung mit der antisense-EBER1/2-Sonde und der sense-EBER1/2-Sonde wurde
wie folgt durchgeführt:
Der Hybridisierungsmix aus
50 µl
Formamid
5 µl
20 x SSC
10 µl
Dextransulfat
0,5 µl EBER1-Sonde
0,5 µl EBER2-Sonde
0,5 µl yeast-t-RNA
ad 50 µl DEPC-H2O
wurde auf die Schnitte gegeben, mit Parafilm abgedeckt und über Nacht bei 50°C inkubiert.
Die DIG-markierten Sonden wurden kurz vor Zugabe für 30 sek bei 80°C erhitzt und auf Eis
abgekühlt. Nach der Hybridisierung wurden die Schnitte für 2 x 1 h in Waschlösung 1 (1 x
SSC, 50 % Formamid; 52°C) und 1 x 20 min in Waschlösung 2 (2 x SSC; 37°C) inkubiert.
Anschließend wurde noch ungebundene RNA durch Inkubation in 2 x SSC mit 20 mg/ml
RNase für 30 min bei 37°C abgebaut. Die Schnitte wurden noch 1 x 10 min in 2 x SSC bei
RT gewaschen und in Tris-Puffer gestellt.
Detektion der DIG-markierten EBER-Sonden
Die immunhistologische Detektion wurde mit dem ZytoChem-Plus AP-Polymer-Kit der Firma
Zytomed Systems nach Herstellerangaben wie folgt bei RT durchgeführt:
Blocking Solution
5 min
Primärantikörper anti-Digoxigenin 1:50
30 min
Post-Block Reagent
30 min
AP-Polymer (anti-Maus/Kaninchen)
30 min
Fast Red (Chromogen)
20 min
Gegenfärbung mit Hämalaun, eindecken mit Aquatex
95
7. Material und Methoden
7.2.6 Charakterisierung von Proteinen
7.2.6.1 Präparation von Proteinextrakten
Für die Herstellung von Gesamt-Zell-Lysaten wurden die Zellen einmal mit eiskaltem 1 x
PBS gewaschen und das Zellpellet direkt mit 50 µl 2 x SLB-Puffer pro 2 x 106 Zellen
aufgenommen. Die Zellen wurden durch resuspendieren lysiert und gegebenenfalls kurz
gevortext. Anschließend wurden die Proteine für 10 min bei 99°C aufgekocht, für ca. 5 min
auf Eis abgekühlt und bei -20°C gelagert.
2 x SLB-Puffer
4 % SDS
20 % Glycerol
100 mM Tris, pH 6,8
2 % Bromphenolblau
0,2 mM ß-Mercaptoethanol
in dH2O
7.2.6.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von Proteinen nach dem Molekulargewicht erfolgte durch diskontinuierliche
Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli [298]. Die Elektrophorese wurde in einer
Trennkammer mit einer Größe von 16 x 18 cm der Firma Hoefer (San Francisco, USA)
durchgeführt. Die Auftrennung der Proteine erfolgte unter Wasserkühlung bei einer
konstanten Stromstärke von 35 mA pro Gel für ca. 4 Stunden. Als Laufpuffer diente 1 x
Laemmli-Puffer, verdünnt aus einer 10 x konzentrierten Stammlösung. Zur Bestimmung des
Molekulargewichts der Proteine wurde der peqGold Prestained Protein-Marker IV von Peqlab
mitgeführt.
10 x Laemmli-Puffer
0,25 M Tris-HCl
1,92 M Glycin
10 % SDS
in dH2O
96
7. Material und Methoden
Komponente
Trenngel (10 %) [ml]
Sammelgel (5 %) [ml]
30 % Acryl-/ 0,8 % Bisacrylamid (37,5:1)
7,5
0,88
3 M Tris-HCl, pH 8,8
3,75
-
-
2,5
18,14
6,53
10 % SDS
0,3
0,1
10 % APS
0,3
0,1
0,015
0,006
0,5 M Tris-HCl, pH 608
dH2O
TEMED
Tabelle 9: Einzelkomponenten der SDS-Polyacrylamidgele
7.2.6.3 Western-Blot-Analyse
Nach elektrophoretischer Auftrennung der Proteine im SDS-Polyacrylamidgel wurden die
Proteine auf eine Nitrozellulosemembran (Schleicher & Schuell, Dassel) übertragen. Der
Transfer erfolgte mittels der semi-dry-Methode mit dem PerfectBlueTM-Blotting-System Sedec
M
der
Firma
Peqlab
bei
einer
konstanten
Stromstärke
von
1
mA
pro
cm2
Nitrocellulosemembran für mind. 1 h. Für den Aufbau des Gel-Sandwich-Blots wurden der
Reihe nach folgende Komponenten auf die Anodenplatte luftblasenfrei geschichtet:
ƒ
1 x 1,0 mm Whatman-Paper mit Anodenpuffer II befeuchtet
ƒ
2 x 0,34 mm Whatman-Paper mit Anodenpuffer I befeuchtet
ƒ
Nitrozellulosemembran mit Anodenpuffer I befeuchtet
ƒ
SDS-Polyacrylamidgel mit Kathodenpuffer befeuchtet
ƒ
2 x 0,34 mm und 1 x 1,0 mm Whatman-Paper mit Kathodenpuffer befeuchtet
Zur Überprüfung des Transfers wurden die Proteine auf der Nitrozellulosemembran mit
Ponceau-S unspezifisch angefärbt und dokumentiert. Die Membran wurde durch
mehrmaliges
Waschen
mit
TBS-T
entfärbt.
Anschließend
wurden
unspezifische
Antikörperbindestellen durch Inkubation in Blocklösung für 1 h blockiert. Der spezifische
Nachweis von Proteinen erfolgte durch Inkubation mit dem entsprechenden Primärantikörper
97
7. Material und Methoden
für 1 h bei RT oder bei 4°C über Nacht. Nach 3 x 10 min Waschen der Membran mit TBS-T
erfolgte
die
Inkubation
mit
dem
entsprechenden
Peroxidase
(HRP)-gekoppelten
Sekundärantikörper für 1 h bei RT. Nach erneutem 3 x 10 min Waschen mit TBS-T wurden
die Proteine mittels ECL-System und Röntgenfilm detektiert. Die Primärantikörper wurden
meist in Antikörper-Verdünnungslösung angesetzt, während die Sekundärantikörper jeweils
frisch in Blocklösung verdünnt wurden. Erfolgten mit einer Membran mehrere Analysen,
wurden die gebundenen Antikörper durch 2 x 10 min Inkubation in Striplösung entfernt. Vor
erneuter Antikörperinkubation wurde die Membran 3 x 10 min mit TBS-T gewaschen und für
1 h in Blocklösung inkubiert.
Verwendete Puffer und Lösungen
Anodenpuffer I
25 mM Tris
10 % Methanol
in dH2O
Anodenpuffer II
0,3 M Tris
20 % Methanol
in dH2O
Antikörper-Verdünnungslösung
1 x PBS
3 % BSA
0,1 % Natriumazid
0,05 % Tween20
Blocklösung
5 % Magermilchpulver oder 3% BSA
TBS-T
ECL
2 ml 1M Tris, pH 8,5
200 µl 250 mM Luminol (in DMSO)
89 µl 90 mM pCumarsäure (in DMSO)
ad 20 ml dH2O (4 °C)
6 µl 35 % H2O2
Kathodenpuffer
20 % Methanol
40 mM Aminohexansäure
in dH2O
98
7. Material und Methoden
Ponceau-S
0,2 % Ponceau-S
3 % Trichloressigsäure
3 % Sulfosalicylsäure
in dH2O
Striplösung
0,1 M Glycin, pH 2,5
0,5 M NaCl
0,1 % Tween20
0,01 % Natriumazid
10 mM ß-Mercaptoethanol
TBS-T
1 x TBS
0,1 % Tween20
7.2.6.4 Durchflusszytometrische Proteinanalyse
Für den Nachweis von IgM-Molekülen auf der Oberfläche von Zellen wurden ca. 5 x 105
Zellen mit 400 µl 1 x PBS gewaschen und mit in 50 µl FACS-Puffer verdünntem
Primärantikörper für 15 min auf Eis inkubiert und erneut gewaschen. Anschließend wurden
die Zellen mit Cy3-Streptavidin-markiertem Sekundärantikörper in 50 µl FACS-Puffer für 15
min auf Eis inkubiert, einmal mit FACS-Puffer gewaschen und für 15 min auf Eis mit 400 µl 2
% PfA fixiert. Ungefärbte Kontrollansätze wurden ebenfalls in FACS-Puffer gewaschen und
mit 2 % PfA fixiert. Die Analyse von 1 x 104 lebenden Zellen erfolgte an einem BD FACSCalibur™Durchflusszytometer (Becton Dickinson). Die Daten wurden mit der Software
CellQuestPro als Histogramme ausgewertet.
FACS-Puffer
2 % FCS
0,05 % Natriumazid
1 x PBS
2 % PfA
2 % (w/v) Paraformaldehyd
in 1 x PBS
99
7. Material und Methoden
7.2.6.5 Proteinnachweis an Paraffinschnitten
Schnittpräparate von in Paraffin eingebetteten Geweben müssen zunächst entparaffiniert
und rehydratisiert werden. Das Entparaffinieren erfolgt durch 3 x 20 min Inkubation in Xylol
und einer anschließenden Rehydratisierung durch je 3 min Inkubation in einer absteigenden
Ethanolreihe (2 x 100 %, 2 x 96 % und 1 x 70 %) und 1 x 10 min in dH2O. Die AntigenDemaskierung wurde durch 5 min feuchtes Autoklavieren in einem Dampfdruckkochtopf mit
Citratpuffer erreicht. Bei der EBNA1-Färbung erfolgte die Demaskierung der Antigene durch
Hitzebehandlung mit EDTA-Puffer. Alle Färbeschritte wurden in einer feuchten Kammer
durchgeführt.
Blimp1-Färbung
Für den immunhistochemischen Nachweis von Blimp1 wurde das ZytochemPlus AP Polymer
Kit der Firma Zytomed Systems (Berlin) nach Herstellerangaben wie folgt verwendet:
Blocking Solution
5 min
Primärantikörper anti-Blimp1
über Nacht
Post-Block Reagent
30 min
AP-Polymer (anti-Maus/Kaninchen)
30 min
Fast Red (Chromogen)
15 min
Gegenfärbung mit Hämalaun, eindecken mit Aquatex
BZLF1-Färbung
Blocking Solution
5 min
Primärantikörper anti-BZLF1
über Nacht
Sekundärantikörper AP-anti-Maus
30 min
Fast Red (Chromogen)
15 min
Gegenfärbung mit Hämalaun, eindecken mit Aquatex
100
7. Material und Methoden
Doppelmarkierung mittels Immunfluoreszenz
Blocking Solution
5 min
Primärantikörper anti-Blimp1/anti BZLF1
über Nacht
Sekundärantikörper Cy3-anti-Kaninchen
30 min
TSA-Verstärkung
10 min
Sekundärantikörper Cy5-anti-Maus
30 min
eindecken mit Aquatex
EBNA1-Färbung
Für den immunhistochemischen Nachweis von EBNA1 wurde das ZytochemPlus HRP
Polymer Kit der Firma Zytomed Systems (Berlin) wie folgt verwendet:
H2O2-Blockierung der endogenen Peroxidase
10 min
Primärantikörper anti-EBNA1
30 min
Sekundärantikörper anti-Ratte IgG
30 min
Post-Block Reagent
30 min
HRP-Polymer
30 min
DAB (Diaminobenzidin, Chromogen)
Gegenfärbung mit Hämalaun, eindecken mit Aquatex
7.2.7 Statistische Auswertung
Von unabhängigen Versuchen wurden nach mindestens dreimaliger Durchführung unter
identischen Bedingungen der Mittelwert und der Standardfehler berechnet. Zusätzlich wurde
die Signifikanz der Ergebnisse durch den Student t-Test ermittelt. Der t-Test wurde
ungepaart und zweiseitig durchgeführt, wobei P-Werte < 0,05 als signifikant angenommen
wurden.
Zur Kalkulation der statistischen Werte wurden die Computerprogramme Excel (Microsoft)
und GraphPad Prism 4 verwendet. Die Erstellung der in dieser Arbeit gezeigten Graphen
erfolgte mit der Software GraphPad Prism 4.
101
8. Abkürzungen
8. Abkürzungen
AA
Acrylamid
Abb.
Abbildung
A
Adenin
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure
ATP
Adenosintriphosphat
BL
Burkitt Lymphom
bp
Basenpaare
BRLF1
“BamHI R fragment leftward open reading frame number 1”
BSA
Rinder („bovine“) Serum Albumin
BZLF1
“BamHI Z fragment leftward open reading frame number 1”
bzw.
beziehungsweise
C
Cytosin
°C
Grad Celsius
cDNA
komplementäre DNA
Cp
EBNA-Promotor im BamHI-C-Fragment
cps
„counts per second“
Cy
Cyanin
Da
Dalton (relative Masse, Proteine)
DIG
Digoxigenin
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP´s
2`-Desoxynukleosid-5´-Triphosphat
ds
doppelsträngig
EA
„early antigens“ (frühe Antigene)
EBV
Epstein-Barr Virus
EBERs
„EBV-encoded RNAs“
EBNA
Epstein-Barr nukleäres Antigen
EBV
Epstein-Barr-Virus
ECL
“enhanced chemoluminescence”
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiaminotetraacetat
et al.
et alii (und andere)
EtBr
Ethidiumbromid
102
8. Abkürzungen
FACS
“fluorescence activated cell sorting”
FCS
fötales Kälberserum
FSC
“forward scatter“
G
Guanin
g
Gramm
gp
Glykoprotein
h
Stunde
HL
Hodgkin Lymphom
HRP
Meerrettich-Peroxidase (horse-radish peroxidase)
Ig
Immunglobulin
k
Kilo
kDa
Kilodalton
l
Liter
LB-Medium
Luria-Bertani-Medium
LCL
lymphoblastoide Zelllinie
LMP
latentes Membranprotein
Luc
Luziferase
m
milli (10-3)
M
molar
µ
mikro (10-6)
mA
Milliampere
min
Minute
miRNA
microRNA
ml
Milliliter
µl
Mikroliter
mM
millimolar; Bezeichnung für Konzentration
mmol
millimol; Bezeichnung für Stoffmenge
mRNA
„messenger RNA“
mut
mutiert
n
nano (10-9)
NPC
“nasopharyngeal carcinoma”
ori
„origin of replication“
p
piko (10-12)
PAA
Polyacrylamid
PAGE
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
PBS
“phosphate buffered saline”
PCR
“polymerase chain reaction”
103
8. Abkürzungen
PFA
Paraformaldehyd
PMSF
Phenylmethansulfonylfluorid
RLU
relative Lichteinheit
RPMI
„Rosewell-Park-Memorial-Institute”
RNA
Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
Rp
BRLF1/BZLF1-Promotor
rpm
Umdrehungen pro Minute
SDS
Sodiumdodecylsulfat
sec
Sekunden
SSC
“sideward scatter”
T
Thymidin
TAE
Tris/Natriumacetat/EDTA
TBE
Tris/Borat/EDTA-Puffer
TBS
“Tris buffered saline”
TEMED
N, N, N´, N´- Tetramethylethylendiamin
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
Tween20
Poly(oxyethylen)n-Sorbitan-Monolaurat
U
Einheit (Unit)
V
Volt
VCA
virales Kapsidantigen
Wp
EBNA-Promotor im BamHI-W-Fragment
wt
Wildtyp
z.B.
zum Beispiel
ZEBRA
“BamHI Z Epstein-Barr virus replication activator”
Zp
BZLF1-Promotor
104
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10. Eigene Publikationen
10. Eigene Publikationen
Bergmann, S., Lang, A., Rhode, M., Agarwl, V., Rennemeier, C., Grasshoff, C., Preissner, K.
T., Hammerschmidt, S. (2009). Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated
internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. J Cell Sci. 122(Pt 2):256-67.
Teile dieser Arbeit werden wie folgt veröffentlicht:
Lang, A.*, Büttner, M. *, Meyer, B., Schuh, W., Cruchley, A., Jäck, H.-M., Niedobitek, G.
(2010). Blimp1-dependent lytic reactivation of Epstein-Barr Virus in epithelial cells.
Manuskript in Vorbereitung
Lang, A., Schuh, W., Wittmann, J., Niedobitek, G., Jäck H.-M. (2010). EBV-encoded miRBHRF1-3 delays lytic reactivation. Manuskript in Vorbereitung
* Geteilte Erstautorenschaft
127
11. Lebenslauf
11. Lebenslauf
Person
Name
Anke Lang
Geburtsdatum
01. August 1978
Geburtsort
Würzburg
Schulbildung
1985 -1989
Grundschule in Neubrunn
1989 -1998
Friedrich-Koenig-Gymnasium in Würzburg
Hochschulbildung
1998 -2006
Studium Diplom Biologie an der Julius-Maximilians-Universität
Würzburg
2001-2002
ERASMUS-Aufenthalt an der Universitet Umeǻ, Schweden
02/2005 -12/2005
Diplomarbeit am Zentrum für Infektionsforschung der
Universität Würzburg
Thema: Untersuchung der Vitronektin-vermittelten Adhäsion
von Streptococcus pneumoniae an humane Wirtszellen
Abschluss: Diplom Biologie
06/2006 -05/2009
Stipendiat des Erlanger Graduiertenkollegs 592: Lymphozyten:
Differenzierung, Aktivierung und Deviation
05/2007 -07/2007
Trainee-Aufenthalt am Cancer Research UK Institute for Cancer
Studies, University of Birmingham, England
2006 -2010
Dissertation am Institut für Pathologie und in der Abteilung für
Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III in
Erlangen unter Anleitung von Prof. Dr. Gerald Niedobitek und
Prof. Dr. Hans-Martin Jäck
Thema: Mechanismen der lytischen Reaktivierung des EpsteinBarr Virus
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12. Danksagung
12. Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Betreuer Prof. Dr. Gerald Niedobitek ganz
herzlich für die Überlassung des interessanten Themas, seine wissenschaftlichen
Anregungen und die Durchsicht dieser Arbeit bedanken.
Ein ganz besonderer Dank gilt Prof. Dr. Hans-Martin Jäck für die Übernahme meiner
Betreuung, die großartige Unterstützung und die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe nachdem
Prof. Dr. Gerald Niedobitek die Universität Erlangen verlassen hat.
Bei Prof. Dr. Thomas Winkler möchte ich mich für die Bereitschaft bedanken, diese
Promotionsarbeit von Seiten der naturwissenschaftlichen Fakultät zu betreuen.
Bei Dr. Maike Büttner, Dr. Sabine Schreck und Birgit Meyer aus der Pathologie möchte ich
mich ganz herzlich für das schöne Arbeitsklima, die großartige Unterstützung und den
Erfahrungsaustausch bedanken.
Allen Molims gilt ein besonderer Dank für die schöne Zeit, die tolle Arbeitsatmosphäre, die
Hilfsbereitschaft, die Aufnahme in die Arbeitsgruppe und die gute Zusammenarbeit.
Den Mitgliedern meiner Betreuungskommission, PD Dr. Robert Slany, Dr. Dirk Mielenz und
Prof. Dr. Michael Stürzl danke ich für ihre große Diskussionsbereitschaft und ihre wertvollen
Anregungen bei meinen Kommissionssitzungen.
Allen Kollegiaten des Graduiertenkollegs 592 danke ich für die unvergessliche Zeit.
Bei allen Freunden, besonders Carmen und Mirjam, möchte ich mich für die seelische
Unterstützung und das Verständnis in den letzten Jahren bedanken.
Meinen Eltern und meinem Bruder Steffen danke ich vielmals für die großartige
Unterstützung in den letzten Jahren.
Meinem Freund Matthias gilt ein ganz besonders großer und herzlicher Dank für die
seelische Unterstützung, das Verständnis und dafür dass er immer für mich da ist.
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