PRAKTIKUM
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PRAKTIKUM INFEKTIOLOGIE, IMMUNOLOGIE UND TRANSFUSIONSMEDIZIN SS 2010 Analyse der frühen Hämatopoese PD Dr. rer. nat. B. Giebel Granulozytenfunktionstest und ELISpot PD Dr. med. Lindemann Immungenetik: Spenderauswahl für die allogene Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen 20.04. – 22.04.10 27.04. – 29.04.10 04.05. – 06.05.10 Prof. Dr. med. Hardt / Dr. rer. nat. Remus Titel folgt Dr. pharm. Ferencik Immunhämatologische Diagnostik (s. Praktikumsskript Teil 2 - Transfusionsmedizin) 18.05. – 20.05.10 08.06. – 10.06.10 Prof. Dr. med. Horn / Dr. med. H. Klump 1 Analyse der frühen Hämatopoese PD Dr. rer. nat. Giebel 2 Institut für Transfusionsmedizin Universitätsklinikum Essen Institut für Transfusionsmedizin Transplantationsdiagnostik und FuE Robert-Koch-Haus, Virchowstr. 179, 45147 Essen Transplantationsdiagnostik und FuE Direktor: Prof. Dr. med. Peter Horn PD. Dr. rer. nat. Bernd Giebel Telefon: 0201/723-4204 Telefax: 0201/723-5906 E-Mail: [email protected] http: www.uk-essen.de/ transfusionsmedizin/AGGiebel/ Praktikumsskript SS2010: Analyse der frühen Hämatopoese Lernziele: Nachweisverfahren unterschiedlicher myeloischer Vorläuferzellen (Colony-Forming-Cell Assay) Das hämatopoetische System Das menschliche Blut besteht zu ca. 55% aus Blutplasma und zu ca. 45% aus verschiedenen Blutzellen. Der zelluläre Bestandteil des Blutes repräsentiert das hämatopoetische System, das sich in mehrere Linien ausdifferenzierter Zelltypen unterteilen lässt. Im Lichtmikroskop können die zellulären Komponenten des Blutes phänotypisch in zwei Übergruppen, Leukozyten und Erythrozyten, unterteilt werden. Des Weiteren sind kleinere Partikel erkennbar, die Thrombozyten bzw. Blutplättchen. Alle reifen Blutzellen leiten sich von multipotenten Stammzellen ab, die sich zum einen selbst erhalten können und zum anderen weiterentwickelte, multipotente Vorläuferzellen hervorbringen, die zur Reifung festgelegt sind. Aus solchen Zellen leiten sich dem klassischen Model der Hämatopoese zur Folge Vorläuferzellen der myeloischen bzw. der lymphatischen Zellreihe ab. Aus den myeloischen Vorläuferzellen entwickeln sich Erythrozyten, Granulozyten (neutrophile, basophile und eosinophile), die Thrombozyten bildenden Megakaryozyten, Monozyten, Makrophagen und die Zellen der roten Blutzellreihe (Erythroblasten, aus denen Erythrozyten hervorgehen) sowie ein Subtyp der Dendritischen Zellen. Der lymphatische Entwicklungszweig bringt B- und TLymphozyten sowie Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und einen weiteren Subtyp der Dendritischen Zellen hervor. Die Hierarchie der humanen Hämatopoese nach dem klassischen Modell ist schematisch in Abb. 1 dargestellt. 3 Abb. 1: Modell der adulten humanen Hämatopoese und Darstellung verschiedener hämatopoetischer Zelltypen. LTC-IC: long-term-culture-inititating-cell; CFU: colony-forming-unit; GEMM: granulocyte-erythrocyte-macrophage-megakaryocyte; BFU: burst-forming-unit. Die meisten Leukozyten, genauer Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten, Makrophagen und Dendritische Zellen sind die Hauptbestandteile des Immunsystems der körpereigenen Abwehr. Dabei wird zwischen angeborener (unspezifische Abwehr) und erworbener (spezifische Abwehr) Immunität unterschieden, die beide jeweils über humorale und zelluläre Effektormechanismen erfolgen. Erstere umfasst als zelluläre Effektoren die Phagozyten (Monozyten, Neutrophile und Makrophagen), die Bakterien und Trümmer abgestorbener Zellen umfließen und verdauen, Zellen die Entzündungsmediatoren freisetzen (Basophile, Mastzellen, Eosinophile) und NK-Zellen. Die erworbene Immunität ist durch Proliferation antigenspezifischer B- und T4 Lymphozyten gekennzeichnet, die durch Bindung der Antigene an spezifische Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgelöst wird. Dabei sind die zellulären Effektoren zytotoxische T-Lymphozyten und die humoralen Effektoren die Antikörper der B-Zellen. Bei der Abwehr von Pathogenen (Bakterien, Pilze oder Viren) und bei der Zerstörung veränderter Körperzellen (maligne Zellen) arbeiten angeborenes und erworbenes Immunsystem meist zusammen. Die Lebensdauer der Leukozyten kann zwischen wenigen Stunden und mehreren Jahren betragen. Das Blut eines gesunden Menschen enthält unter normalen Umständen etwa 7000 Leukozyten und ca. 5 Millionen Erythrozyten pro Mikroliter. Erythrozyten besitzen z.B. eine mittlere Lebensdauer von rund 120 Tagen. Die relativ niedrige Lebensdauer der verschiedenen Blutzellen und der daraus folgende hohe Umsatz im Organismus im Vergleich zur Lebensdauer eines Menschen zeigt, dass die Hämatopoese beim Menschen in der Lage sein muss, den Verlust an Blutzellen über den gesamten Lebenszeitraum permanent auszugleichen. Nachweis und Quellen hämatopoetischer Stammzellen Bereits in den frühen 1960er Jahren gab es erste Hinweise, die zu dem heute gängigen Modell der hämatopoetischen, multipotenten Stammzelle führten. In Experimenten an Mäusen wurde entdeckt, dass einzelne Zellen aus dem adulten, murinen Knochenmark in der Lage sind, Kolonien auf der Milz von bestrahlten Empfängermäusen zu bilden, die sowohl Erythrozyten als auch weiße myeloische Zellen enthalten. In folgenden Experimenten wurde gezeigt, dass aus den Kolonien gewonnene Zellklone in sekundären Empfängermäusen erneut in der Lage sind, Kolonien hervorzubringen. In weiterführenden Experimenten wurden die Koloniebildenden Zellen als myeloische Vorläuferzellen charakterisiert. Letztendlich wurde mit Hilfe weiterentwickelter Transplantationsmodelle nachgewiesen, dass einzelne isolierte Zellpopulationen in der Lage sind, das komplette hämatopoetische System von letal bestrahlten, immundefizienten Mäusen zu rekonstituieren. Diese und weiterführende Arbeiten halfen dadurch, Funktion und Phänotyp muriner hämatopoetischer Stammzellen näher aufzuklären. Mangels Durchführbarkeit entsprechender Experimente am Menschen wurden zur Untersuchung des Potentials humaner hämatopoetischer Stammzellen xenogene in vivo als auch diverse in vitro Analyseverfahren entwickelt. Durch Transplantationsexperimente, in denen frühe humanen hämatopoetischen Zellen in 5 immunodefiziente NOD/SCID- (engl. non-obese diabetic/ severe combined immunodeficiency) Mäuse transplantiert wurden, konnten bestimmte Subpopulationen von Zellen detektiert werden, die in der Lage sind, sich in das Knochenmark solcher Mäuse einzunisten und dort über einen längeren Zeitraum hinweg reifere menschliche Blutzellen zu bilden. Solche Zellen, die bestimmte Aspekte eines humanen Immunsystems in diesen Mäusen bilden können, werden als SCID repopulating cells (SRC) bezeichnet. Sie gelten bis dato als die primitivsten hämatopoetischen Zellen, die sich experimentell nachweisen lassen. Es soll jedoch nicht unerwähnt bleiben, dass Zellen mit einem SCID repopulating Potential nicht zwangsläufig auch ein langzeitrepopulierendes Potential in Großtiermodellen aufweisen. Dennoch gibt es bislang kein allgemein anerkanntes, funktionelles Verfahren, das eine bessere Annäherung an den eigentlichen Pool der humanen hämatopoetischen Stammzellen liefert. Primitive hämatopoetische Zellen mit SRC-Potential tragen auf Ihrer Oberfläche das Glykoprotein CD34. Dieses Protein ist Mitte der 1980er Jahre als Marker für frühe hämatopoetische Zellen beschrieben worden und spielt vermutlich eine Rolle bei Adhäsion und zielgerichteter Wanderung (engl. homing) dieser Zellen. Die Subpopulation der CD34-positiven (CD34+-) Zellen enthält sowohl myeloische als auch lymphatische Vorläuferzellen und stellt ein heterogenes Gemisch aus primitiveren hämatopoetischen Zellen und determinierten, linienspezifischen Vorläuferzellen wie z.B. Pro-B-Zellen dar, die bereits das B-Zell spezifische Oberflächenantigen CD19 exprimieren. Da für jede hämatopoetische Entwicklungslinie charakteristische Oberflächenmarker, so genannte lineage-Marker (lin) bekannt sind, lassen sich durch Negativ-Selektion unter Verwendung entsprechender Antikörper CD34+-Zellen aufreinigen, die keine linienspezifischen Marker exprimieren. Es zeigte sich, dass in dem Pool dieser lin-CD34+-Zellen die Zellen mit SRC-Potential stark angereichert sind. Eine weitere Anreicherung konnte durch die Verwendung des Oberflächenantigens CD38 erzielt werden, das äußerst heterogen in der Population der CD34+-Zellen exprimiert ist. Während in der Population der CD34+-Zellen mit geringer CD38 Expression die Zellen mit SRC-Potential weiter konzentriert sind, ist die Frequenz in der CD34+CD38+-Fraktion deutlich reduziert. Neben der Population der lin-CD34+CD38low Zellen wurden auch CD34--Zellen beschrieben, die SRC Aktivitäten besitzen. Diese exprimieren wie die meisten CD34+-Zellen den Stammzell-Surrogatmarker CD133, der somit die Population der primitiven hämatopoetischen Zellen besser beschreibt als der Marker CD34. Obwohl 6 CD133 der bessere Marker ist, wird aus klassischen bzw. Referenzgründen nach wie vor der CD34 Gehalt als Surrogat für den in entsprechenden Präparaten enthaltenen Anteil an hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen angegeben. Andere Möglichkeiten zur Charakterisierung humaner hämatopoetischer Stammund Vorläuferzellen bieten verschiedene in vitro Zellkulturanalyseverfahren, in denen das Koloniebildungsverhalten, genauer die Proliferation von Vorläuferzellen nach Stimulation mit bestimmten Wachstumsfaktoren, analysiert wird. Da reifere Vorläuferzellen bereits zur Differenzierung determiniert sind, besitzen sie im Vergleich zu primitiveren Vorläuferzellen ein zeitlich begrenztes Proliferationspotential. Sich diese Unterschiede zu Nutze machend, wurden bestimmte Analyseverfahren etabliert: Nur sehr primitive Zellen können z.B. auf unterstützenden Stromazellen und in Anwesenheit von definierten Wachstumsfaktoren über einen Zeitraum von 5 Wochen kultiviert werden, ohne ihr Proliferationspotential zu verlieren. Nur diese Zellen können in einem sich anschließenden Differenzierungsansatz noch weiter proliferieren und Kolonien bilden. Diesem Potential entsprechend werden sie als LTC-IC (long term culture initiating cell) bezeichnet. Um das Potential reiferer, bereits determinierter Vorläuferzellen zu analysieren, werden diese direkt in entsprechende Differenzierungsmedien überführt und zwei Wochen lang kultiviert. In Abhängigkeit der zugesetzten Zytokine bilden sich bestimmte Kolonieformen aus, die dann retrospektiv Rückschlüsse auf das Entwicklungspotential der ursprünglich in den Versuchsansatz eingebrachten Zellen zulassen. In dem im Praktikum zu erlernenden CFC (Colony-forming-cell) oder auch CFU-GEMM (Colony-forming-unitGranulocyte-Erythrocyte-Macrophage-Megakaryocyte) genannten Ansatz können verschiedene myeloische Vorläuferzellen ausgelesen werden, solche die Granulozyten (CFU-G) und/oder Makrophagen (CFU-M bzw. CFU-GM) hervorbringen, solche die rote Blutzellen bilden (BFU-E bzw. CFU-E) und solche, die sich in alle drei Zelltypen entwickeln (CFU-GEMM). Nochmals zur Verdeutlichung: Auch wenn uns die geschilderten Verfahren ermöglichen, den Gehalt verschiedener hämtopoetischer Vorläuferzellen in einer entsprechenden Quelle zu analysieren, ist die humane hämatopoetische Stammzelle trotz aller Annäherungen nicht nachweisbar. Zur Qualitätssicherung von Präparaten die 7 humane hämatopoetische Stammzellen enthalten sollen, können daher nur solche Stammzellsurrogat Verfahren herangezogen werden. In der Tat wird die Qualität hämatopoetischer Stammzellpräparate routinemäßig mittels CFU-GEMM Ansatz dokumentiert. Als hämatopoetische Stammzellpräparate dienen vor allem das Knochenmark, das Restblut aus der Nabelschnurvene Neugeborener (engl. umbilical cord blood – UCB) und das periphere Blut G-CSF- (Granulocyte-colony stimulating factor-) mobilisierter Menschen. Die Behandlung mit dem Zytokin G-CSF bewirkt beim Menschen eine Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Knochenmark ins periphere Blut und ermöglicht die Gewinnung der Zellen durch Apherese ohne Knochenmarkspunktion. Dieses Verfahren wird therapeutisch bei Spendern vor peripherer Blutstammzelltransplantation eingesetzt, ferner bei Patienten mit schweren Neutropenien. Der Anteil der CD34+-Zellen liegt im peripheren Blut G-CSF behandelter Personen üblicherweise bei 0,5-1%, im Knochenmark bei 2-3% und bei Nabelschnurrestblut bei ca. 0,5-2%. Nach jüngeren Erkenntnissen besitzen aus UCB gewonnene CD34+-Zellen im Vergleich zu solchen aus adulten Individuen ein deutlich höheres Repopulationspotential und eine größere Immunverträglichkeit, sie sind aber zahlenmäßig limitiert und brauchen aufgrund ihrer höheren Primitivität länger, um eine vollständige Rekonstitution des Immunsystems in entsprechend behandelten Patienten zu erzielen. 8 Protokoll zum Ansetzen eines Colony Forming Cell (CFC) – Assays Material: • 50µl-Pipette, Pipettenspitzen • 2ml Stabpipetten, Peleusball • 1ml Methylzellulose-Gemisch (enthält Zellkulturmedium und Zytokine) in 2ml Reaktionsgefäß • Zellsuspension in Zellkulturmedium (human umbilical cord blood CD34+ cells = hUCB CD34+) eingestellt auf 10000 Zellen / ml • 6-well Platten • dest. H2O • Vortex-Gerät Hinweis: Normalerweise wird der gesamte Versuch unter einer Sterilbank durchgeführt! Durchführung: • Zum Ansetzen des Colony-Assays sollen zunächst ca. 500 Zellen zu dem MethylzelluloseGemisch pipettiert werden. 1ml der Ausgangszellsuspension enthalten ca. 10.000 Zellen. Wieviel µl der Zellsuspension sollen Sie der Methylzellulose zugeben? ________µl (Bitte auch auf letztem Blatt ausfüllen!) • Nach Zugabe der Zellen das Methylzellulose-Röhrchen verschließen und gut am Vortexer mischen (ca. 10 Sekunden). • Anschließend das Methylzellulose-Röhrchen für ca. 5-10 Minuten im CO2-Inkubator bei 37°C, 5% CO2 aufrecht lagern, bis alle Blasen aufgestiegen sind. • In der Zwischenzeit 6-well Platte mit Namen, Datum und Zellzahl / Zelltyp beschriften und mit Peleusball / 2ml-Stabpipette und Wasser Pipettieren üben. • Wenn das Zell-Methylzellulose-Gemisch blasenfrei ist, mittels Peleusball und 2ml Stabpipette das viskose Gemisch langsam (!) ansaugen und anschließend vorsichtig und möglichst blasenfrei (!) in eine Vertiefung einer 6well-Platte pipettieren. Der Boden sollte vollständig bedeckt sein. Ggfs. durch langsames Kippen der Platte das Gemisch langsam verteilen. Befüllen Sie 1-2 Vertiefungen • Die restlichen Vertiefungen der 6well-Platte jeweils ca. zur Hälfte mit dest. H2O befüllen. • Sehen Sie sich die Zellen an. Notieren Sie Ihre Beobachtungen auf dem letzten Blatt • Inkubation für 10-14 Tage bei 37°C, 5% CO2 Aus ersichtlichen Gründen haben wir der Versuchsanleitung entsprechend 2 Wochen vor Praktikumsbeginn solche Assays angesetzt. Diese werden Ihnen zur Verfügung gestellt und sollen von Ihnen ausgewertet werden (mindestens 8 Platten; siehe letztes Blatt). Hintergrund: • Das Methylzellulose-Gemisch besteht aus o Methylzellulose, um dem Medium eine hohe Viskosität zu geben, damit die Zellen nicht zu viel umherwandern können. Nur so können Sie Kolonien bilden. o Basalmedium (enthält Puffer, Nährstoffe, Aminosäuren, Salze und Vitamine) mit FBS (fetal bovine serum). Als Indikator für den pH-Wert ist Phenolrot zugesetzt. o Wachstumsfaktor-Cocktail bestehend aus SCF, GM-CSF, IL-3 und EPO. Dieser Cocktail induziert die myeloische Differenzierung der Zellen. • Die restlichen Wells werden mit Wasser befüllt, damit der Assay während der bis zu 2 wöchigen Kultivierung bei 37°C nicht austrocknet. 9 Auswertung / Fragen – Dieses Blatt bitte nach dem Praktikum bei einem Betreuer abgeben! Bitte beachten: Die Lehrmikroskope sind nicht besonders gut für Zellkulturplatten geeignet. Bitte warten Sie, bis Ihnen von einem Betreuer gezeigt wird, wie Sie die Platten mikroskopieren können. Name: _______________ Matrikelnr.: _________________________ Fragen: • Zum Ansetzen des Colony-Assays sollen zunächst ca. 500 Zellen zu dem MethylzelluloseGemisch pipettiert werden. 1ml der Ausgangszellsuspension enthalten ca. 10.000 Zellen. Wieviel µl der Zellsuspension sollen Sie der Methylzellulose zugeben? ________µl • Sehen Sie sich die selbst ausplattierten Zellen unter dem Mikroskop an. Was sehen Sie? ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ • Nur ein Teil der CD34+ Zellen, die wir in den Assay einbringen, kann Kolonien hervorbringen. Der Prozentsatz solcher Zellen mit myeloischem klonogenen Potential liegt in der CD34+ Zellfraktion aus Nabelschnurblut bei ca. 30%. Wie viele Kolonien erwarten Sie pro Well? __________ Auswertung Kolonieanzahl: Platte Rote Kolonien Weiße Kolonien Nr. • Gemischte Kolonien Gesamt Frequenz (Kolonien/ausgesähte Zellen) Weicht die Zahl der von Ihnen ausgezählten Kolonien von der Erwartung ab? Welche Gründe könnte eine solche Abweichung haben? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ • • Wie kann sich die Zugabe eines Zytokins / Wachstumsfaktors auf Zellen auswirken? Welche Mechanismen kennen Sie? (Bitte Rückseite dieses Blattes für Antwort verwenden) Wie ist das Verhältnis von roten zu weißen zu gemischten Kolonien bei Ihren Platten? Diskutieren Sie ihr Ergebnis. (Bitte Rückseite dieses Blattes für Antwort verwenden) 10 Granulozytenfunktionstest und ELISpot PD Dr. med. Monika Lindemann 11 Granulozytenfunktionstest (NBT-Test) Bedeutung und Prinzip Zur Abwehr mikrobieller Infektionen sind sowohl ein intaktes „Erkennungssystem“, also Lymphozyten und Antigen-präsentierende Zellen notwendig, als auch Effektorzellen, deren Funktion darin besteht Keime zu eliminieren. Die klassischen Phagozytosefähigen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen sind in erster Linie die Effektorzellen, die Mikroorganismen aufnehmen und durch intra- und extrazelluläre Mechanismen abtöten können. Die Aufnahme/Phagozytose aktiviert diese Effektorzellen, so dass intrazellulär eine Reihe von Substanzen freigesetzt bzw. neu synthetisiert werden, so z. B. Wasserstoffsuperoxid (H2O2), Chlorid-Radikalen und Superoxidanionen (O2-). Diese toxischen Substanzen, die intrazellulär in den Phagosomen wirken, werden zusätzlich auch nach außen abgegeben. Dort sind sie unserer Messung zugänglich. Die Bildung von O2- erfolgt durch Aktivierung einer membranständigen NADPH-Oxidase, die NADPH oxidiert und Sauerstoff reduziert: NADPH-Oxidase NADPH NADP+ + H+ + 2e- 2 O2 + 2e- 2 O2- Mittels Nitroblau-Tetrazolium (NBT), einem zunächst hellgelben löslichen Farbstoff, können O2--Ionen sichtbar gemacht werden. Bei Anwesenheit von O2--Ionen entsteht aus dem löslichen NBT durch Reduktion ein rot-violetter unlöslicher Komplex. Beim dem im Praktikum durchgeführten NBT-Test wird die Fähigkeit der Granulozyten geprüft, Candida albicans zu phagozytieren und in der Folge O2--Ionen zu bilden. Die Radikalbildung läßt sich durch die rot-violette Färbung der Hefepilze mikroskopisch nachweisen. Das häufigste klinische Symptom bei eingeschränkter Granulozytenfunktion ist die Hautinfektion mit opportunistischen Mikroben. Eine seltene aber ausgeprägte Form dieser Immundefizienz ist die sog. septische Granulomatose. Diese angeborene Granulozytenfunktionsstörung manifestiert sich ca. 2 Jahre nach Geburt. Typisch sind hier neben Hautinfektionen (z. B. mit Staphylokokkus epidermidis und Aspergillus) der Befall von Lunge, Knochenmark und Lymphknoten. Bei der septischen Granulomatose, einem angeborenen Defekt des oxidativen Metabolismus der Granulozyten, ist eine Bildung von toxischen Sauerstoffmetaboliten nicht möglich. Daraus resultiert eine Störung der intrazellulären Keimabtötung. Klinisch zeigen sich schwere rezidivierende Infektionen v. a. mit Staphylokokken, Enterobacteriaceae und Pilzen, z. B. als Lymphadentitis, Pneumonie, Leberabszess und Osteomyelitis. 12 Versuchsdurchführung 1. Adhärenzobjektträger unter fließendem Wasser (Wasserhahn) spülen, bis die grüne Schutzschicht abgewaschen ist. Mit Hanks-Puffer nachspülen. Flüssigkeit auf dem Objektträger durch mehrmaliges Klopfen auf Papierunterlage entfernen. 1 2 3 4 5 6 Gruppe 1 1 2 3 4 5 6 Gruppe 2 2. In die Felder 1-6 je 25 µl der Granulozyten-Suspension (G) auftragen. Die Zellen 3 min sedimentieren lassen und danach den Überstand vorsichtig mit der Pipette absaugen. Eine zweite Gruppe von StudentenInnen belegt entsprechend die untere Felderreihe. 3. Auftragen von je 25 µl NBT-Lösung (N) auf Felder 1+2, je 25 µl Candida-NBTLösung (CN) auf Felder 3+4 und je 25 µl Serum-Candida-NBT-Lösung (SCN) auf Felder 5+6. 4. 15 min in einem Brutschrank bei 37°C inkubieren. 5. Anschließend den Objektträger vorsichtig mit Methanol abspülen. 6. 30 min in 2% Methylengrün-Lösung inkubieren. 7. Objektträger mit Wasser kurz spülen, vorsichtig Flüssigkeit auf dem Objektträger durch mehrmaliges Klopfen auf Papierunterlage entfernen und 5 min trocknen lassen. 8. Granulozyten unter Verwendung des 100er Objektivs und Öl mikroskopisch beurteilen. Es sind die Granulozyten (grüne Kernfärbung) zunächst in den Feldern 1+2 zu identifizieren (Hier soll nicht gezählt werden). In den Feldern 3 oder 4 sowie 5 oder 6 (jeweils Doppelansätze) sollen pro Feld 50 Granulozyten mikroskopiert werden. Dabei soll der Anteil von Granulozyten, die Candida phagozytiert bzw. O2--Ionen gebildet haben (rot-violette Färbung) protokolliert werden (z. B. 30/50). 13 ELISpot Bedeutung und Prinzip Der ELISpot (Enzyme-linked-immuno-Spot) Test ist ein extrem sensitives Verfahren, um Zellaktivierung auf Einzelzellniveau zu messen. Bei dieser Aktivierung werden u.a. Zytokine, lösliche Polypeptide oder Glykoproteine, die der Zellkommunikation dienen, freigesetzt. Die von Zellen freigesetzten Proteine werden beim ELISpot durch zwei monoklonale Zytokinantikörper (mAb 1 und mAb 2) detektiert, die unterschiedliche Epitope dieses Zytokins erkennen. Der eine der beiden Antikörper ist beim ELISpot an eine feste Phase gebunden, so dass es sich vom Prinzip her um einen FestphasenELISA handelt. Der ELISpot wird insbesondere im Rahmen von Studien eingesetzt, bei denen eine genaue Quantifizierung von zellulären Reaktionen erfasst werden soll, etwa um einen Impferfolg zu messen. Im Falle der Influenza-Impfung könnten z. B. vor und nach Impfung Lymphozyten und Monozyten aus Blutproben von Probanden isoliert und in Zellkulturexperimenten mit Influenza-Proteinen stimuliert werden. Sollten die InfluenzaProteine von den Zellen erkannt werden, so werden Zytokine wie Interferon-γ gebildet und können mit Hilfe des ELISpot als kleine Punkte (Spots) detektiert werden. Die einzelnen Schritte des ELISpot Testes sind im Folgenden schematisch dargestellt: Der Test wird in 96-Loch Mikrotiterplatten durchgeführt. Als erster Schritt wird ein hochaffiner monoklonalen Antikörper ( ) in die Löcher gegeben, der sich an die Platten bindet. Es werden für 6 – 72 Stunden Zellen in Gegenwart des Antigens (z. B. InfluenzaProteine) zugegeben. Während dieser Zeit setzen antigenspezifische Zellen ( ) Zytokine ( ) frei, die in unmittelbarer Nachbarschaft durch die monoklonalen Antikörper an die Platten gebunden werden. Die Zellen werden durch Waschen entfernt und biotinylierter Antikörper ( ) zugegeben, der ein zweites Epitop des Zytokins erkennt. Streptavidin, das mit einem Enzym ( peroxidase) wird zugegeben. ) konjugiert ist (z. B. Meerettich- Ein präzipitierendes Substrat für Meerettichperoxidase wird zugegeben, bis dort Spots ( ) entstehen, wo eine antigenspezifische Zelle reagiert hat. Die Spots können entweder mit einem Mikroskop oder einem automatischen BildanalyseSystem detektiert und ausgezählt werden. Der Vergleich der Anzahl von Spots und der eingesetzten Zellzahl erlaubt es, die Frequenz reagierender Zellen zu errechnen. 14 15 ELISpot-Beispiel A B A. Interferon-γ Spots nach Stimulation von Lymphozyten und Monozyten mit Influenza-Proteinen bei einem Probanden, der gegen Influenza geimpft wurde. B. Kontrollansatz (Kultur von Lymphozyten und Monozyten ohne Zusatz von Influenza-Proteinen). Zusammenfassung des Prinzips Farbsubstrat Zytokin mAb 1 Zytokin mAb 2 biotinyliert Streptavidin [ ]Biotin [ ]-MeerettichPeroxidase-Komplex 16 17 Immungenetik Immungenetik Spenderauswahl für die allogene Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen Prof. Dr. med. C. Hardt Dr. rer. nat. Remus 18 Immungenetik Immungenetik Eine Transplantation ist aus immunologischer Sicht unproblematisch bei genomischer Identität von Spender und Empfänger. Genomische Identität besteht bei autologer Transplantation hierbei werden körpereigene Zellen oder Gewebe übertragen. Genomische Identität besteht auch bei syngener Transplantation, hierbei werden Zellen oder Gewebe eines eineiigen (monozygoten) Zwillings übertragen. Genomisch different sind allogene Transplantate, hierbei werden Zellen oder Gewebe eines zweieiigen (dizygoten) Zwillings, eines anderen Familienmitglieds oder einer unverwandten Person übertragen. Histokompatibilität: Die allogene Transplantation ist die häufigste Art der Transplantation. Sie ist mit einer Gewebeunverträglichkeit (Histoinkompatibilität) verbunden. Sie führt zu einer Abstoßung des übertragenen Organs, wenn nicht therapeutisch interveniert wird. Zellstrukturen, die eine Histoinkompatibilität verursachen, werden Transplantationsantigene genannt. Als fremde Antigene werden sie vom Immunsystem nicht toleriert. Einige der Antigene induzieren stärkere Immunantworten (Haupthistokompatibilitätsantigene) andere geringere (minor Histokompatibilitätsantigene; mHAg). Die Haupthistokompatibilitätsantigene wurden beim Menschen zuerst auf Leukozyten gefunden und Humane Leukozyten Antigene (HLA) genannt. Aufgrund ihrer molekularen Struktur, ihrer Funktion und ihrer Lokalisation im Genom werden sie in zwei Klassen eingeteilt. Transplantationsrelevant sind die HLA Moleküle der Klasse I, HLA-A, -B und -C sowie die der Klasse II, HLA-DR, -DQ und -DP. HLA Moleküle der Klasse I sind Heterodimere aus einer alpha-Kette und einer assoziierten beta-Kette, dem beta-2-Microglobulin. HLA Moleküle der Klasse II sind ebenfalls Heterodimere und bestehen aus einer alpha- und einer beta-Kette. Die genetischen Informationen (Kodierung) für die Bildung von alpha-Ketten der Klasse I und der alpha- und beta-Ketten der Klasse II liegen auf dem Chromosom 6p21 in einem Abschnitt, der als Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex; MHC) bezeichnet wird (Abb. 1.). 19 Immungenetik Abb. 1 HLA-DPA1 HLA-DPB1 HLA-DRA1 HLA-DRB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 TAP2 LMP7 TAP1 LMP2 MHC-Klasse II MHC-Klasse III C2 BF C4A C4B HLA-F HLA-G HLA-H HLA-A HLA-E HLA-C HLA-B MHC-Klasse I Centromer LTA TNFa LTB LST-1 Telomer 6p21 Haupthistokompatibilitätskomplex (Chromosom 6) 4 Mb Der MHC umfasst etwa 4 Mb und ist mit einer Anzahl von 200 Genen eine der gendichtesten Regionen im menschlichen Genom. Gene der HLA-Klasse I liegen in der MHC-Klasse I Region (2 Mb) zum Chromosomen Ende (Telomer) hin, die der HLAKlasse II liegen in der MHC-Klasse II Region (1 Mb) zur Chromosomen Mitte (Zentromer). Zwischen beiden ist die MHC-Klasse III Region (1 Mb) lokalisiert (Abb. 1). Sie enthält genetische Informationen für Proteine, die unmittelbar an Immunreaktionen beteiligt sind, z. B. die Komplementkomponenten oder Zytokine, wie Tumornekrosefaktor alpha sowie Lymphotoxin alpha und beta. Bei vielen anderen Genen ist eine Beziehung zum Immunsystem nicht offensichtlich. 20 Immungenetik Tabelle 1: HLA-Klasse I und II Antigene und Allele HLA-DRB1* Genort MHC / HLA Klasse I Klasse II Gruppe 13:01:02:01 Spez. Allel der Gruppe HLA Gene* (WHO-Nomenklatur) Syngene Mutation Allele (n) Mutation außerhalb der kodierenden Sequenz Proteine (n) Null Allele HLA-A 1001 739 57 HLA-C 690 513 12 HLA-B 1605 1268 47 HLA-DRB1 785 605 5 HLA-DQB1 108 79 1 HLA-DPB1 138 120 3 * Die HLA-Gene sind in der Reihenfolge ihrer chromosomalen Lokalisation vom Telomer zum Zentromer aufgeführt Die genetische Information (Sequenz) für die jeweilige alpha-Kette von den HLA-A, -B und -C Genen sowie für die jeweilige beta-1-Kette von den HLA-DR, -DQ und -DP Genen kann erheblich variieren (Tab. 1). Unterschiedliche Sequenzen des gleichen Gens werden als Allele bezeichnet, der unmittelbare Sequenzunterschied (z.B. Nukleotidaustausch) als Polymorphismus. Sequenzen von zwei oder mehr Genen, die benachbart auf einem Chromosom liegen, werden solange als Sequenzblock (Haplotyp) an Nachkommen weitergegeben, bis sie in der elterlichen Meiose durch ein Rekombinationsereignis voneinander getrennt werden. 21 Immungenetik Im MHC sind solche Ereignisse relativ selten, so dass HLA-A, -C, -B, -DR, -DQ und -DP Haplotypen über viele Generationen bestehen bleiben (Abb. 2). Die Testung von HLAAllelen kann mit serologischen oder molekular-genetischen Methoden erfolgen; letztere haben sich in der Diagnostik durchgesetzt. Nach einer Nomenklatur der Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation, WHO) wird ein serologischer Befund einbzw. zweistellig (z.B. HLA-A1, HLA-A11) beziffert. Das molekulargenetische Ergebnis wird als niedrig auflösende HLA-Testung (low-resolution) mit dem Symbol (*) und einem zweistelligen Zifferncode (HLA-DRB1*01) versehen oder als hoch auflösende HLATestung (high-resolution) mit einem vierstelligen Zifferncode (HLA-DRB1*01:01). Die ersten beiden Ziffern geben die Gruppenzugehörigkeit bzw. eine „Antigendifferenz“ an, die folgenden beiden Ziffern geben den Subtyp bzw. eine „Alleldifferenz“ an (Tab. 1). Diese Terminologie berücksichtigt, dass eine HLA Antigendifferenz zwischen Spender und Empfänger eine stärkere „Antigenität“ bzw. Immunantwort erwarten lässt als eine Alleldifferenz. Die hoch auflösende HLA-Testung erfasst nur die kodierenden Sequenzen der Exone 2 und 3 (bei Klasse I Genen), bzw. des Exons 2 bei Klasse II Genen. Nach dem heutigen Wissensstand tragen nur diese zur Bildung relevanter antigener Determinanten bei. Sequenzunterschiede außerhalb dieser Exone werden mit einem 6- bzw. 8-stelligen Zifferncode belegt. Jedes HLA Molekül hat verschiedene antigene Determinanten (Epitope), die, in einem fremden Empfänger, eine Bildung von unterschiedlichen Antikörpern oder eine zelluläre Immunreaktion induzieren können. Epitope, die für ein bestimmtes HLA-Molekül spezifisch sind, werden eigene (private) Determinanten genannt. Epitope, die bei verschiedenen HLA-Molekülen vorkommen, werden als gemeinsame (public) Determinanten oder kreuz-reagierende Gruppen (cross reactive groups; CREG) zusammengefasst. So haben z.B. die HLA-Antigene HLA-A1, A3 und A11 sowie HLAA2, A9, A28 oder die Antigene HLA-B5, B15, B35 und B7 neben den eigenen Determinanten auch gemeinsame. Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen: Die Spende von hämatopoetischen Stammzellen ist eine Lebendspende. Sie beeinträchtigt die Gesundheit des Spenders nicht oder nicht langfristig. Freiwillige Spender können für ihre HLA-Merkmale getestet und ihre Testergebnisse elektronisch erfasst werden. Wird ein Spender benötigt, können die HLA-Typisierungsergebnisse des Patienten mit der Datenbank abgeglichen und ein geeigneter Stammzell-Spender ausgewählt werden. Die Auswahl 22 Immungenetik erfolgt gemäß dem „3. Deutschen Konsensus zur immungenetischen Spenderauswahl für die allogene Stammzelltransplantation“. Vor einer Transplantation muss ein Bestätigungstest des HLA-Ergebnisses und gegebenenfalls eine lymphozytäre Kreuzprobe durchgeführt werden. Die Wahrscheinlichkeit einen HLA-identischen Spender zu finden ist unter Geschwistern wesentlich höher als in der allgemeinen Bevölkerung bzw. der nationalen (3,79 Mill. Spender) und internationalen (13,83 Mill. Spender) Spenderdateien. Ein Spender ist HLA-identisch, wenn er nach der hoch auflösenden HLA-Testung (4-stellig) mit dem Empfänger an den Genorten (HLA-A, -C, -B, -DR, -DQ) eine völlige Übereinstimmung zeigt (sog. 10/10-Match). Kinder leiblicher Eltern haben sowohl mit dem Vater als auch mit der Mutter jeweils einen identischen Haplotyp (Abb. 2). Hieraus ergeben sich bei Geschwistern die folgenden Wahrscheinlichkeiten gemeinsame Haplotypen zu haben (Abb. 2): einen Haplotyp 50% (II:1, II:4), keinen Haplotyp 25% (II:2) und zwei Haplotypen 25% (II:3). Um Haplotypen zweifelsfrei zuordnen zu können ist gegebenenfalls die Testung der Eltern erforderlich. Die Wahrscheinlichkeit gemeinsamer Haplotypen erhöht sich auf 50%, wenn ein Elter für einen Haplotyp homozygot ist. Aufgrund der sehr hohen Heterozygotierate (>95%) von HLA-Haplotypen kommt dies jedoch sehr selten vor. Bei Geschwistern genügt eine niedrig (2-stellig) auflösende molekulargenetische Testung der Genorte HLA-A, -B, -DRB1, -DQB1. Die HLA-Identität muss aufgrund der Merkmalssegregation sichergestellt sein, andernfalls muss eine zusätzliche HLA-C Testung oder eine hoch auflösende (4-stellig) HLA-Testung des fraglichen HLA-Merkmals durchgeführt werden. Die Befundmitteilung der HLAErgebnisse erfolgt gemäß der WHO-Nomenklatur. 23 Immungenetik Abb. 2 Segregation von HLA-Haplotypen in einer Familie I:1 HLA-A HLA-C HLA-B HLA-DRB1 HLA-DQB1 Haplotyp II:1 HLA-A HLA-C HLA-B HLA-DRB1 HLA-DQB1 Haplotyp 0201 0401 3503 0901 0301 a 0301 0401 0702 0801 0402 c 0201 0401 3503 0901 0301 a 0301 0401 0702 0801 0402 c 3201 1602 5108 1101 0303 b II:2 0201 0401 3503 0901 0301 a 2402 0702 3501 1501 0602 d I:2 2402 0702 3501 1501 0602 d II:3 3201 1602 5108 1101 0303 b 0301 0401 0702 0801 0402 c II:4 3201 1602 5108 1101 0303 b 2402 0702 3501 1501 0602 d II:5 3201 1602 5108 1101 0303 b 0301 0401 0702 0801 0402 c Bei Einleitung einer Fremdspenderspendersuche in den zentralen Registern muss zunächst das HLA-Ergebnis des Patienten als hoch auflösende (4-stellig) Testung bestätigt werden. Steht kein HLA-identischer Spender zur Verfügung, dann ist auch ein Spender mit einer HLA-Alleldifferenz gegebenenfalls auch mit einer HLAAntigendifferenz in GvH-Richtung und/oder HvG Richtung geeignet. Soweit möglich, sollte eine Differenz der Genorte HLA-A, -B, -DRB1 vermieden und eher eine HLA-C oder -DQB1 Differenz akzeptiert werden. Bei Vorliegen von HLA-A, -B, -C, -DRB1 oder DQB1 Differenzen zwischen Empfänger und prospektiven Spendern ist eine Kreuzprobe zum Ausschluss spenderspezifischer Antikörper durchzuführen. Das Serum des Empfängers wird mit mononukleären peripheren Lymphozyten sowie getrennten T- und B-Lymphozyten des Spenders im LCT untersucht. 24 Immungenetik Eine positive Kreuzprobe ist eine Kontraindikation für eine Transplantation. Stehen zwei oder mehr Spender zur Verfügung kann die Spenderauswahl nach zusätzlichen klinischen Kriterien erfolgen. So sollte bei männlichen Empfängern eine weibliche Spenderin vermieden werden, junge Spender sollten gegenüber älteren bevorzugt werden und CMV-negative bzw. CMV-positive Patienten sollten mit einem Spender gleichen Infektionsstatus transplantiert werden. Molekulargenetische Testung von HLA-Allelen Eine molekulargenetische Testung von HLA-Allelen ist mit verschiedenen Methoden möglich: 1.) der Sequenzspezifischen Oligonukleotidhybridisierung (SSO), 2.) der Amplifikation mittels Sequenzspezifischer Primer (SSP) oder 3.) einer auf der Sequenzierung basierenden Technik (SBT). Grundlage der drei Techniken ist die Polymerasekettenreaktion (PCR; siehe Lehrbücher der Biochemie). 25 Immungenetik Sequenzspezifische Oligonukleotidhybridisierung (SSO) Bei der Sequenzspezifischen Oligonukleotidhybridisierung wird zunächst der zu untersuchende DNA-Abschnitt amplifiziert. Die Amplifikate werden jeweils auf zwei spezielle Trägermaterialen (Hybridisierungsfolien) aufgebracht und mit UV-Licht fixiert. Die Amplifikate werden denaturiert (DNA-Doppelstrang → Einzelstrang) und anschließend mit Allel spezifischen Oligonukleotiden hybridisiert. Einzelstrang: Allel 1 ÅGCATGCTATTCAGATCAGATAATGCATGGGCCCTTAGGCATGCCATCA-> TAGTCTATTACGTACCCG Oligonukleotid 1 hybridisiert mit Allel 1 TAGTCTAGTACGTACCCG Oligonukleotid 2 hybridisiert nicht mit Allel 1 Einzelstrang: Allel 2 ÅGCATGCTATTCAGATCAGATCATGCATGGGCCCTTAGGCATGCCATCA-> TAGTCTAGTACGTACCCG Oligonukleotid 2 Hybridisiert mit Allel 2 TAGTCTATTACGTACCCG Oligonukleotid 1 Hybridisiert nicht mit Allel 2 Ein positives Hybridisierungssignal mit Oligonukleotid 1 und kein Signal mit Oligonukleotid 2, entspricht dem Genotyp 1/1. Ein positves Hybridisierungssignal mit Oligonukleotid 2 und kein Signal mit Oligonukleotid 1, entspricht dem Genotyp 2/2. Ein positives Hybridisierungssignal mit Oligonukleotid 1 sowie ein positives Signal mit Oligonukleotid 2, entspricht dem Genotyp 1/2 26 Immungenetik Amplifikation mittels Sequenzspezifischer Primer (SSP) Bei dem Nachweis unterschiedlicher Allele mittels sequenzspezifischer Primer wird einer der beiden Primer so gewählt, dass er sich nur an den Einzelstrang von einem der beiden Allele anlagern kann. Folglich entsteht ein PCR-Produkt nur dann, wenn das entsprechende Allel in der zu testenden DNA vorhanden ist. ______________________________________________________________________ Allel 1 GCATGCTATTCAGATCAGATAATGCATGGGCCCTTAGGCATGCCAT.. CGTACGATAAGTCTAGTCTAT Allelspezifischer Primer 1 Nicht allelspezifischer Primer (vorwärts) (rückwärts) CGTACGATAAGTCTAGTCTAG Allelspezifischer Primer 2 bindet nicht an Allel 1 (vorwärts) ______________________________________________________________________ Allel 2 GCATGCTATTCAGATCAGATCATGCATGGGCCCTTAGGCATGCCAT…… CGTACGATAAGTCTAGTCTAG Allelspezifischer Primer 2 Nicht allelspezifischer Primer (vorwärts) (rückwärts) CGTACGATAAGTCTAGTCTAT Allelspezifischer Primer 1 bindet nicht an Allel 2 (vorwärts) ______________________________________________________________________ 27 Immungenetik Ein Amplifikat entsteht nur dann, wenn das Allel, für das der Primer spezifisch ist, in der genomischen DNA vorhanden ist. Der Nachweis von spezifisch amplifizierter DNA erfolgt nach Agarosegelelektrophorese durch Anfärbung mit Ethidium-Bromid. Ein Amplifikat mit dem Allelspezifischen Primer 1, jedoch nicht mit dem Allelspezifischen Primer 2 entspricht dem Genotyp 1/1. Ein Amplifikat mit dem Allelspezifischen Primer 2, jedoch nicht mit dem Allelspezifischen Primer 1 entspricht dem Genotyp 2/2. Ein Amplifikat mit dem Allelspezifischen Primer 1 sowie eines mit dem Allelspezifischen Primer 2 entspricht dem Genotyp 1/2. Sequenzierverfahren (SBT) Die Sequenz basierende Testung (SBT) ist ein hoch auflösendes Verfahren zur Bestimmung von HLA-Allelen. Zunächst wird eine orientierende Amplifikation durchgeführt um die Zugehörigkeit der beiden Allele eines Probanden zu einer bestimmten Allelgruppe zu ermitteln. Beide Allele werden dann separat amplifiziert und anschließend sequenziert. Der Sequenzabgleich mit bekannten Allelen in den Datenbanken erlaubt die Bestimmung des Genotyps. 28 Immungenetik HLA-Testung mittels SSP Die Bestimmung von di-allelischen Polymorphismen in einem Gen erfolgt nach Amplifikation genomischer DNA mit zwei spezifischen Primerpaaren. Für die Bestimmung der hoch polymorphen HLA-Gene sind jedoch weitaus mehr PCRReaktionen notwendig um ein Allel zweifelsfrei zu bestimmen. Zunächst wird für jeden Probanden eine niedrig auflösende HLA-Testung mit 40 bis 60 gruppenspezifischen Primerpaaren durchgeführt. Ausgehend von diesem Testergebnis wird eine zweite Analyse mit wiederum 40 bis 60 Allelspezifischen Primerpaaren durchgeführt. Aus den Amplifikationsmustern ergibt sich der jeweilige Genotyp des Probanden. Praktikumsaufgaben: 1.) Erstellung eines Stammbaums mit den HLA-A, -B, -DR und -DQ Typisierungsergebnissen einer Familie. 2.) Beurteilung ob in dem vorliegenden Stammbaum für den Patienten ein geeigneter Familienspender für die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen in Frage kommt. 3.) Auswertung einer hoch auflösenden HLA-Typisierung (Fremdspender) nach Amplifikation mittels SSP 4.) Auswahl eines geeigneten Fremdspenders für die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen bei einem Leukämie Patienten 5.) Immungenetische Checkliste bei hämatopoetischer Stammzelltransplantation. 29 30 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP Dr. Stanislav Ferencik 31 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP_____________________ ALLGEMEINE HINWEISE 1. Die praktischen Arbeiten werden von den Kursteilnehmern in zweier Gruppen durchgeführt. 2. Wegen des Umgangs mit PCR-Produkten sowie mit Gefahrstoffen müssen alle Praktikumsteilnehmer Einmal-Handschuhe und Laborkittel tragen. 3. Alle Pipettierschritte werden mit Hilfe von Pipetten durchgeführt. 4. Alle Abfälle kommen in die dafür vorgesehenen Behälter. 5. Im Praktikumsraum sind Essen, Trinken und Rauchen nicht erlaubt.________ EINLEITUNG Die Entdeckung von J. Watson und F. Crick im Jahr 1953, dass die Desoxyribonukleinsäure (DNS) den Träger der Erbinformation darstellt und somit die primäre Informationseinheit innerhalb der Zellen bildet, ist die Grundlage der Molekularbiologie und der Gentechnik. In den letzten Jahren haben DNS basierende Techniken inzwischen eine weit verbreitete Anwendungsmöglichkeit in der Grundlagenforschung sowie in der medizinischen Diagnostik gefunden. Die HLA Loci des menschlichen Histokompatibilitätskomplexes (MHC), die am kurzen Arm des menschlichen Chromosoms Nummer 6p liegen, kodieren drei bestimmte Klassen der hochpolymorphen Zelloberflächenmoleküle. LOCALISATION OF HLA GENES ON CHROMOSE 6p 32 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP_____________________ Die Region der klassischen HLA Klasse I Gene liegt auf der telomer gelegenen Seite des HMC-Komplexes, zentromerwärts gelegen schließen sich die der HLA-Klasse III Region zugehörigen Gene an. Die HLA Klasse II Genorte liegen auf der zentromerwärts gelegenen Seite des MHC. Diese MHC Moleküle binden Antigene in Form von Peptiden an sich und präsentieren diese Peptide so den T-Lymphozyten. Dieser Schritt ist entscheidend bei der Einleitung der zellulären wie auch humoralen Immunantwort. Weiter spielen diese Moleküle eine zentrale Rolle in der Regulierung des Immunsystems, in der Transplantationsbiologie bei der Spender/Empfänger Auswahl vor allogener Organtransplantation sowie bei der Anfälligkeit zu einigen Krankheiten, einschließlich Autoimmunerkrankungen und gewissen Krebserkrankungen. Die HLA Klasse I Moleküle (HLA-A, HLA-B, HLA-C) befinden sich auf den meisten kernhaltigen Zellen. Sie sind Oberflächenglykoproteine, die Degradationsprodukte (Peptide) von endogen hergestellten Proteinen (z.B. Virus und Tumorpeptide) binden und CD8 positiven T- Lymphozyten präsentieren. Die HLA Klasse I Moleküle lassen sich auch durch ihren molekularen Aufbau, ihre Expression im Gewebe und damit verbunden durch ihre Funktion von den HLA Klasse II Merkmalen unterscheiden. Die HLA Klasse I Moleküle werden als Heterodimere bezeichnet. Diese Heterodimere bestehen aus einer HLA kodierenden schweren membranverankerten α-Kette mit ihren drei Domänen (α1 bis α3), die mit einem nicht MHC kodierten Polypeptid verbunden ist, dem β2 Mikroglobulin (Chromosom 15q22). 33 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP___________________ Die optimale Definition eines HLA Genproduktes ist die Bestimmung der Aminosäuresequenz des Proteins, bzw. der Nukleotidsequenz des entsprechenden Gens. Während β2 Mikroglobulin monomorph ist, sind die Gene der α-Kette extrem polymorph. Die Sequenzaktualisierung im Jahr 2010 ergab 965 HLA-A Allele, 1.543 HLA-B Allele und 626 HLA-C Allele. Das HLA System umfasst ungefähr 3.500 Kilobasen. Die lineare Abfolge der Basen im Gen kodiert die aufeinanderfolgenden Aminosäuren der Polypeptidkette, wobei dem genetischen Kode jeweils 3 Basen (Kodon) die Information für eine Aminosäure bilden. Jedes Gen ist organisiert in aufeinanderfolgende Exone und Introne, wobei nur die Sequenz des Exons in Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jedes HLA Klasse I Gen besteht aus 8 Exonen, die von 7 Intronen getrennt werden. STRUCTURE OF HLA CLASS I AND HLA CLASS II GENES SP α1 α2 270 Bp INTRON 1 5´ EXON1 276 Bp SP INTRON 3 EXON 3 INTRON 4 EXON 4 ß1 CP INTRON 5 EXON 5 ß2 270 bp EXON1 CP 3´ EXON 6 EXON 7 EXON8 3,5 kb INTRON 1: 8.500 bp 5´ CP 276 bp INTRON 2 EXON 2 TM α3 TM CP CP 279 bp INTRON 2: 2.750 bp EXON 2 INTRON 3 EXON 3 3´ EXON 4 EXON 5 EXON 6 14,5 kb Das erste Exon kodiert das Leaderpeptid, das dafür verantwortlich ist, dass die synthetisierte Polypeptidkette an der richtigen Stelle exprimiert wird. Die HLA Klasse I Polymorphismen sind hauptsächlich in den Exonen 2 und 3 lokalisiert, welche die extrazelluläre Domäne, die als Peptidbindungsstelle fungiert, kodieren. Innerhalb dieser zwei Exone sind die Polymorphismen in sogenannten hypervariablen Regionen konzentriert, welche selbst innerhalb eines relativ konservierten Rahmen liegen. Die Analysen von HLA Klasse I Kristallstrukturen haben gezeigt, dass diese Polymorphismen in den peptidbindenden Taschen liegen und mit dem Peptid und/oder dem T-Zellrezeptor direkt interagieren. Das fünfte Exon ist in der 34 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP___________________ Transmembranregion lokalisiert und die Exone 6-8 kodieren für den Zytoplasmatischen Anteil und die 3´-unübersetzte Region. HLA Genes Class II Region DP B1 A1 L B1 B2 1 2 3 DQ B1 A1 Class I Region DR B1 TM Cyt 4 5 6 B3 or B4 or B5 B C A A1 L A1 A2 A3 1 2 3 4 TM 5 6 Cyt 7 8 METHODEN ZUM NACHWEIS DER HLA ALLELE Grundsätzlich können wir zum Nachweis molekulargenetische Methoden einsetzen: 1. 2. 3. der HLA-Polymorhismen folgende PCR-SSP (Sequence-Specific-Primers), PCR-SSOP (Sequence-Specific-Oligonucleotid-Probes) PCR-SBT (Sequence-Based-Typing=Sequenzierung) ZIELSETZUNG Zielsetzung dieses Praktikums ist es, Ihnen das methodische Vorgehen bei einer HLA Klasse I (HLA-A*) molekulargenetischen Typisierung mit Hilfe der reversen Hybridisierungstechnologie (PCR-SSOP) näher zu bringen. TESTPRINZIP Die PCR-SSOP Methode ist ein DNA-Hybridisierungstest zur Bestimmung von HLA Merkmalen/Allelen. Zur Differenzierung der polymorphen HLA Sequenzmotive werden Sequenz-Spezifische-Oligonukleotid-Sonden eingesetzt, deren Bindung nach einem vom Protein-ELISA abgeleiteten Prinzip nachgewiesen wird. Der PCR-SSOP Test beruht auf folgenden Hauptprozessen: 1. DNS-Isolierung Genomische DNS, die als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, wird auf einfache Weise aus Vollblut isoliert. 35 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP___________________ 2. PCR Amplifizierungsreaktion Amplifikation der Zielsequenz mittels PCR. Durch PCR mit Biotin markierten Primern werden die polymorphen Regionen im zweiten und dritten Exon der HLAA Gene amplifiziert. 3. Hybridisierungsreaktion Hybridisierung (Bindung von komplementären DNA-Sequenzen/Strängen) der amplifizierten Produkte mit auf einem Träger immobilisierten HLA sequenzspezifischen Oligonukleotidsonden. Nach der PCR Amplifizierungsreaktion werden die PCR Produkte (Amplikons) chemisch denaturiert um DNS Einzelstränge zu erhalten. Diese werden anschließend in die Vertiefungen der Hybridisierungsplatte mit den vorgelegten Nylonmembranen (Streifen) pipettiert. Auf den Nylonmembranen sind bereits die HLA-A spezifischen Oligonukleotide immobilisiert. Beim Auftragen der denaturierten und verdünnten PCR Produkte auf die Streifen findet im Hybridisierungsverfahren eine Bindung zwischen den Sonden und dem PCR Produkt statt. Für die Spezifität des Verfahrens ist der nachfolgende StringenzWaschschritt entscheidend, in dem Sonden mit ungenügender Sequenzhomologie zu den PCR Produkten entfernt werden. 4. Detektionsreaktion Nach dem stringenten Waschen der Membranstreifen gibt man StreptavidinMeerrettich-Konjugat in die Vertiefung des Typisiertabletts. Das Streptavidin bindet an die mit Biotin markierten Amplikonen, die an den Membrangebundenen Sonden hybridisiert wurden. Nach Entfernen des ungebundenen Konjugates wird durch das gebundene Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat (POD) mittels Wasserstoffperoxid (H2O2) und Tetramethylbenzidin (TMB) ein blauer Farbkomplex geformt. Diese Reaktion wird durch mehrfache Waschschritte mit Wasser gestoppt. PCRPCR-SSOP COLOR COLOR REACTION REACTION POD H22O22 TMB α - FITC FITC SSOSSO-Probe TCGATCCAGGC TCGATCCAGGC 5´ 3´ AGCTAGGTCCG AGCTAGGTCCG PCRPCR-Product Biotin Streptavidin 36 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP___________________ 5. Auswertung von positiven Reaktionen. Das Muster der positiven Positionen wird an Hand der beiliegenden Schablonen ausgewertet und die Typisierung wird ermittelt. AUFLÖSUNG DES TESTS Mit Hilfe dieses HLA-A spezifischen Typisierungsverfahrens wird eine niedrige (Merkmal) Auflösung erreicht. REAGENZIEN Alle benötigten Reagenzien sind in ausreichendem Maße abgefüllt in 1.5 ml Röhrchen an jedem Arbeitsplatz vorhanden. Diese Röhrchen sind wie folgt gekennzeichnet: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. HLA-A spezifisches PCR Produkt (60 µl) Denaturierungslösung (60 µl) Hybridisierungspuffer (5 ml) Ambient Waschpuffer (5 ml) Stringent Waschpuffer (5 ml) Konjugat Arbeitslösung (5 ml) Ambient Waschpuffer (5 ml) Ambient Waschpuffer (5 ml) Ambient Waschpuffer (5 ml) Citratpuffer (5 ml) Substrat-Arbeitslösung Deionisiertes H2O (5 ml) Deionisiertes H2O (5 ml) Deionisiertes H2O (5 ml) Citratpuffer (5 ml) BENÖTIGTE GERÄTE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 1. 2. 3. 4. 5. Schüttellwasserbad Pipetten Teststreifen Typisierplatte (Tablett) mit 24 Vertiefungen Auswertungsschablone PRAKTIKUMSDURCHFÜHRUNG Im Rahmen des Praktikums wird von den Studierenden in Gruppen jeweils zwei Personen eine HLA Typisierung mittels PCR-SSOP durchgeführt. Folgende Schritte werden dazu benötigt: 37 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP_____________________ 1. 2. 3. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Denaturierung des HLA-A spezifischen PCR Produktes Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur Hybridisierung 30 Minuten bei 50°C Erster Waschgang 10 Sekunden bei Raumtemperatur Zweiter Waschgang 15 Minuten bei 50 °C Erste Detektionsreaktion 15 Minuten bei Raumtemperatur Dritter Waschgang 5 Minuten bei Raumtemperatur Vierter Waschgang 5 Minuten bei Raumtemperatur Fünfter Waschgang 5 Minuten bei Raumtemperatur Inkubation 5 Minuten bei Raumtemperatur Zweite Detektionsreaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur Stoppen der Farbreaktion-Inkubation 5 Minuten bei Raumtemperatur Auswertung der Resultate FOLGENDE SCHRITTE WERDEN DURCHGEFÜHRT 1. Die Teststreifen gegenüber der schwarzen Referenzlinie individuell mit Kugelschreiber beschriften. 2. 60 µl der Denaturierungslösung (Röhrchen Nr.2) mit 60 µl des HLA-A spezifischen PCR Produktes (Röhrchen Nr.1) mit einer Pipette sorgfältig mischen. Inhalt ins Röhrchen 1A pipettieren. 3. Röhrchen verschließen. Es folgt eine Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. 4. Die HLA Teststreifen werden in die Vertiefungen des Typisierungstabletts gelegt, mit den Oligonukleotidsonden nach oben zeigend. 5. 5 ml des vorgewärmten (50°C) Hybridisierungspuffers (Röhrchen Nr.3, befindet sich im Wasserbad) werden in jede Vertiefung des Typisierungstabletts pipettiert. 6. Aus dem Röhrchen 1A werden insgesamt 70 µl des denaturierten PCR Produktes mit Hilfe einer Pipette in die entsprechende Vertiefung im Typisiertablett pipettiert. 7. Das Typisiertablett wird mit dem Deckel verschlossen und die Streifen werden 30 Minuten bei 50°C im Wasserbad unter Schaukelbewegungen inkubiert. Es muss sichergestellt werden, dass der Hybridisierungspuffer, ohne in benachbarte Vertiefungen zu spritzen, jeden Streifen komplett bedeckt. 8. Die Platte wird aus dem Wasserbad herausgenommen und der Hybridisierungspuffer aus den Vertiefungen abgesaugt*. 9. 5 ml des Ambient Waschpuffers (Röhrchen Nr. 4) werden in jede Vertiefung pipettiert und das Typisiertablett wird für ein paar Sekunden 38 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP_____________________ bei Raumtemperatur hin und hergeschaukelt. Der Ambient Waschpuffer wird anschließend abgesaugt*. 10. 5 ml des vorgewärmten Stringent Waschpuffers (Röhrchen Nr. 5, befindet sich im Wasserbad) werden in jede Vertiefung pipettiert und das Typisiertablett wird zurück ins Wasserbad gestellt. Es folgt eine Inkubation für 15 Minuten bei 50°C. Bitte beachten Sie : Die Zeit und Temperatur sind bei diesem Schritt für den gesamten Ausgang der Testung entscheidend. 11. Die Platte wird aus dem Wasserbad herausgenommen und der Stringent Waschpuffer aus den Vertiefungen abgesaugt*. 12. 5 ml der Konjugat Arbeitslösung (Röhrchen Nr. 6) werden zu jeder Vertiefung des Typisiertabletts gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einer beweglichen Platte hin und hergeschaukelt. Die Konjugat Arbeitslösung wird anschließend abgesaugt*. 13. 5 ml des Ambient Waschpuffers (Röhrchen Nr. 7) werden in jede Vertiefung pipettiert und das Typisiertablett wird auf einer beweglichen Platte bei Raumtemperatur 5 Minuten hin und hergeschaukelt. Der Ambient Waschpuffer wird anschließend abgesaugt*. 14. Schritt 13 bitte zweimal wiederholen (Röhrchen Nr. 8+9) 15. 5 ml des Citratpuffers (Röhrchen Nr. 10) werden in jede Vertiefung pipettiert und das Typisiertablett wird auf einer beweglichen Platte bei Raumtemperatur 5 Minuten hin und hergeschaukelt. Der Citratpuffer wird anschließend abgesaugt*. 16. 5 ml der Substrat Arbeitslösung (Röhrchen Nr. 11) werden zu jeder Vertiefung des Typisiertabletts gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einer beweglichen Platte hin und hergeschaukelt. Die Substrat Arbeitslösung wird anschließend abgesaugt*. 17. 5 ml des deionisierten H2O (Röhrchen Nr. 12) werden zu jeder Vertiefung des Typisiertabletts gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einer beweglichen Platte hin und hergeschaukelt. Das restliche H2O wird anschließend abgesaugt*. 18. Schritt 17 bitte zweimal wiederholen (Röhrchen Nr. 13+14). 19. 5 ml des Citratpuffers (Röhrchen Nr. 15) werden in jede Vertiefung pipettiert. Die Streifen sind fertig zum Auswerten. Die Streifen müssen während des ganzen Vorgangs nass bleiben. Bemerkung *Das Absaugen wird von der Kursleitung durchgeführt. 39 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP_ AUSWERTUNG VON RESULTATEN Die HLA-A Typisierung wird durch das Bestimmen der positiven Signale (blaue Linien) auf dem Typisierungsstreifen bestimmt. Das Bandenmuster entscheidet, welche HLA-A Merkmale in der DNA Probe vorhanden sind. Die Positionen der einzelnen HLA-A spezifischen Banden werden manuell mit Hilfe der beiliegenden Schablone abgelesen und notiert. Die HLA Typisierung erfolgt wie folgt an Hand der HLA-A spezifischen Auswertungstabelle: 40 Molekulargenetische Darstellung der HLA Klasse I genomischer Polymorphismen mittels PCR-SSOP_ 41
