Dokument_30.

Aus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
(Direktor: Prof. Dr. Dr. F.W. Neukam)
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Prognoserelevante Bedeutung der Expression von Repp86
bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Philipp Häußinger
aus Aachen
2
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. J Schüttler
Referent:
Prof. Dr. Dr. E. Nkenke
Korreferent:
Prof. Dr. Dr. F. W. Neukam
Tag der mündlichen Prüfung:
10. Februar 2010
3
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung…………………………………………………...1
1.1.
1.2.
Zusammenfassung……………………………………………………. 1
Summary……………………………………………………………….. 3
2.
2.1.
2.2.
2.3.
Einleitung………………………………………………………………5
Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle……………………….. 5
Ki-67…………………...……………………………………………….. 6
Repp86…………………………………………………………………. 8
3.
3.1.
3.2.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.2.1.
3.3.2.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.3.5.
3.3.6.
3.3.6.1.
3.3.6.2.
3.4.
3.5.
Material und Methoden……………………...…………………….... 12
Patientenauswahl…………………...……………………………….... 12
TNM-Klassifikation und histopathologisches Grading……...…….. 13
Immunhistochemie……………………………………………...…….. 14
Prinzip der immunhistochemischen Färbung………………………. 14
Primärantikörper………………………………………...…………….. 16
Ki-S2 (Repp86)……………………………………………………..…. 16
Ki-S5 (Ki-67)…………………………………………………………… 16
Herstellung und Vorbehandlung der Schnittpräparate……………..17
Austestung der Primärantikörper-Konzentration…………………… 18
Immunhistochemische Färbung………………………………………19
Kontrollen………………………………………………………………. 21
Negativkontrolle……………………………………………………….. 21
Positivkontrolle………………………………………………………… 21
Auswertung…………………………………………………………….. 21
Statistikteil……………………………………………………………… 22
4.
4.1.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
4.3.
4.3.1.
4.3.1.1.
4.3.1.2.
4.3.2.
4.3.2.1.
4.3.2.2.
4.3.3.
4.4.
4.4.1.
4.4.2.
4.4.3.
Ergebnisse……………………………………………………………..23
Patientenbezogene Parameter…………………………………….....23
Qualitative immunhistochemische Analysen……………………….. 23
Antikörper Ki-S2 (Repp86)…………………………………………… 23
Antikörper Ki-S5 (Ki-67)………………………………………......….. 25
Quantitative Analyse der Antigenexpression………………………. 25
Repp86-Expression…………………………………………………... 25
Explorative Datenanalyse der Repp86-Expression………………...25
Univariate Analyse – Repp86…………………………………………27
Ki-67-Expression.……………………………………………………... 29
Explorative Datenanalyse der Ki-67-Expression…………………... 30
Univariate Analyse – Ki-67………………………………………….... 32
Korrelation der Proliferationsmarker nach Pearson……………….. 34
Prognose……………………………………………………………….. 35
Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier…………………………….. 35
Univariate Analyse…………………………………………………….. 35
Multivarianzanalyse…………………………………………………… 37
5.
Diskussion…………………………………………………………….. 41
6.
Literaturverzeichnis…………………………………………………. 45
7.
Anhang………………………………………………………………… 56
8.
Danksagung…………………………………………………………... 57
9.
Lebenslauf…………………………………………………………….. 58
1
1.
Zusammenfassung
1.1.
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Ziel der Untersuchung war die Erfassung der prognostischen Bedeutung der
Expression von Repp86 (Restrictedly Expressed Proliferation-associated
Protein), eines S-Phase-spezifischen Proteins, bei Plattenepithelkarzinomen
der Mundhöhle.
Methoden
In die retrospektive Untersuchung wurden 225 Patienten aus einem Kollektiv
von
731
Patienten
eingeschlossen,
bei
anhand
denen
definierter
die
Ein-
und
Erstdiagnose
Ausschlusskriterien
eines
primären
Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle in den Jahren 1997 bis 2003 gestellt
worden war und die anschließende R0-Tumorresektion, Lymphknotenchirurgie
und Defektrekonstruktion einzeitig erfolgten. Die Expressionsindizes von
Repp86 und Ki-67 wurden immunhistochemisch ermittelt und mit klinischen
Parametern korreliert. Die Überlebensdaten wurden aus einer prospektiven
Datenbank (Tumorzentrum, Universitätsklinikum Erlangen) generiert. Die
statistische Auswertung erfolgte zunächst mittels univariater Analyse und
Erstellung der Kaplan-Meier-Überlebenskurven. Zudem wurde der Einfluss der
Expressionsindizes und der klinischen Parameter (Alter, Geschlecht, pT, pN,
histopathologische Differenzierung) auf das tumorspezifische Überleben sowie
das Gesamtüberleben in einem multivariaten Modell überprüft.
Ergebnisse und Beobachtungen
Repp86 konnte in allen untersuchten Gewebeproben nachgewiesen werden.
Die mittleren Labelingindizes (LI) betrugen 19,2% und 27,6% für Repp86 bzw.
Ki-67. Ein Zusammenhang von Repp86- bzw. Ki-67-LI und pT- bzw. pNStadium
sowie
histopathologischem
Differenzierungsgrad
konnte
im
2
untersuchten Kollektiv nicht nachgewiesen werden. Dagegen zeigte sich eine
signifikante Korrelation der Proliferationsmarker (rRepp86_Ki-67=0,194; p<0,01).
Aus
dem
Patientenkollektiv
verstarben
117
Patienten
(52,5%)
im
Beobachtungszeitraum. Das Gesamtüberleben sowie das tumorbezogene
Überleben betrugen 67% nach zwei Jahren, 63% nach drei Jahren und 53%
nach fünf Jahren bzw. 78%, 78% und 71%.
Die univariate Analyse zeigte einen signifikanten Zusammenhang zwischen
Gesamtüberleben
bzw.
tumorspezifischem
Überleben
und
pT-Stadium
(p<0,001) sowie pN-Stadium (p<0,001). In der multivariaten Analyse hatten
Tumorgröße (p<0,05) und Nodalstatus (p<0,01) einen signifikanten Einfluss auf
das Gesamtüberleben. Bzgl. des tumorspezifischen Überlebens zeigte sich ein
signifikanter Effekt allein für den Nodalstatus (p<0,01).
Praktische Schlussfolgerungen
Die vorliegende Analyse zeigt, dass die Repp86-Expression als Maß der
Fraktion proliferierender Tumorzellen keinen signifikanten Einfluss auf die
Prognose von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle hat. Im
Gegensatz zu anderen Tumorentitäten führt der Vorteil der S-Phase-Spezifität
des Repp86-Antigens gegenüber anderen Proliferationsmarkern (Ki-67) somit
nicht zu einer verbesserten Abschätzung der Prognose.
3
1.2.
Summary
Purpose
The aim of the study was to assess the impact of Repp86 (Restrictedly
Expressed Proliferation-associated Protein) labeling index on prognosis in
patients undergoing curative resection of oral squamous cell carcinoma (OSCC)
and reconstruction by microvascular flaps.
Patients and Methods
A total of 731 patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity (OSCC)
were selected from a prospective database (Clinical Cancer Registry, University
of Erlangen-Nuremberg). Following an in- and exclusion protocol, 225 patients
were included in the study. All patients underwent complete resection (R0) of
squamous cell carcinoma of the oral cavity and reconstruction by microvascular
flaps at a single center between 1997 and 2003. The closing date of the study
was March 31st, 2008. Repp86 and Ki-67 labeling indices (LI) were determined
immunohistochemically by use of monoclonal antibodies Ki-S2 and Ki-S5.
Clinical (age, sex), pathologic (pT and pN stage, grading) and survival data
were retrieved from a prospective database and analysed retrospectively.
Overall and tumor related survival were assessed using the method of Kaplan
and Meier. For multivariate analysis the Cox hazard model was chosen.
Results
Repp86 and Ki-67 were detectable in all tissues analyzed. The mean LI were
19,2% und 27,6% for Repp86 and Ki-67 resp.. The expression of Repp86- and
of Ki-67 were not related to tumor size, lymph node invasion, or
histopathological grading but were positively correlated with each other
(rRepp86_Ki-67=0,194; p<0,01).
117 patients (52,5%) died within the period of observation. Overall survival was
67% at 2 years, 63% at 3 years, and 53% at 5 years while tumor related
survival was 78%, 78%, and 71% resp..
In univariate analysis pT stage (p<0,001), and nodal status (p<0,001) were
significantly associated with both tumor related and overall survival. Multivariate
4
analysis identified pT and pN stage as independent risk factors (p<0,05 and
p<0,01 resp.) for overall survival, whereas only pN stage showed a significant
effect on tumor related survival (p<0,01).
Conclusion
Repp86 and Ki-67 LI failed to show a significant influence on prognosis
following R0 resection of oral squamous cell carcinoma.
5
2.
Einleitung
2.1.
Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle
Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle ist ein maligner Tumor, der seinen
Ursprung
im
Epithel
der
Neuerkrankungen/100.000
Mundschleimhaut
Einwohner
haben
nimmt.
Mit
22,2
Mundhöhlen-
und
Rachenkarzinome die fünfthöchste Inzidenz und mit 8,7 Todesfällen/100.000
Einwohner die achthöchste Mortalität maligner Tumorerkrankungen bei der
männlichen Bevölkerung in Bayern. Bei Frauen sind Inzidenz und Mortalität mit
5,7 Neuerkrankungen/100.000 Einwohner bzw. 2,0 Todesfällen/100.000
Einwohner deutlich geringer, was primär als Folge einer verminderten
Kanzerogeneinwirkung angesehen wird. Hier sind Rauchen und Alkoholkonsum
als
die
bedeutendsten
Risikofaktoren
für
Plattenepithelkarzinome
der
Mundhöhle wie auch des oberen Aerodigestivtraktes im Allgemeinen zu nennen
[8,27,31,40,45]. Sie allein tragen einen Anteil von 75% zur Inzidenz dieser
Tumorarten bei [7]. Daneben gibt es eine Reihe erwiesener bzw. vermuteter
Risikofaktoren aus den Bereichen Beruf, Ernährung, Mikrobiologie und
medizinische
Vorgeschichte
[8,13,15,31,38,43,48,49,50,52].
Genetische
Faktoren spielen ebenfalls eine Rolle, wobei diese in der Literatur als
Nachrangig angesehen wird [22,47]. Schlechte Mundhygiene wird seit langem
als unabhängiger Risikofaktor diskutiert, konnte aber bis heute nicht konsistent
nachgewiesen werden [39]. Es summieren sich mit fortschreitendem Alter die
exogenen und endogenen Ursachengruppen, wodurch die ansteigende
Tumorrate in den höheren Lebensjahren eine Erklärung findet [1,28,53].
Die Prognose wird limitiert durch Lokalrezidive, Zweitmalignome im Bereich des
oberen Aerodigestivtraktes, Fernmetastasen und lokoregionäre Metastasen.
Die
5-Jahres-Überlebensrate
beträgt
für
die
Gesamtheit
der
am
Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle Erkrankten trotz diagnostischer und
therapeutischer Fortschritte derzeit lediglich 55% [27]. Trotz ähnlicher klinischer
und histopathologischer Charakteristika zeigen sich sehr unterschiedliche
6
Krankheitsverläufe, so dass die zur Risikostratifizierung herangezogenen
Faktoren, wie beispielsweise das pTNM Klassifikationssystem, eine genaue
Einschätzung des Krankheitsverlaufes bzw. der individuellen Prognose oftmals
nicht zulässt [34]. Dieser Umstand lässt nach Faktoren suchen, die es
ermöglichen, das Risiko eines Wiederauftretens in Form eines Regional- oder
Lokalrezidives sowie die Überlebenswahrscheinlichkeit im individuellen Fall
genauer bestimmbar zu machen. In diesem Zusammenhang haben Proteine
wie Ki-67 Antigen, Topoisomerase IIα oder Repp86, deren Expression auf die
DNS-Synthesephase bzw. die Teilungsphase des Zellzyklus beschränkt ist, bei
verschiedenen Tumorerkrankungen Bedeutung erlangt.
2.2.
Ki-67
Ki-67 wurde erstmals im Jahre 1983 durch J. Gerdes beschrieben [25]. Das
Protein besteht aus zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 345
bzw. 395 kDa [23]. Beide Isoformen enthalten sog. Ki-67-Repeats mit jeweils 16
repetitiven
Elementen,
die
von
einem
einzigen,
6845
Basenpaaren
umfassenden Exon kodiert werden [62]. Der Genlocus von Ki-67 umfasst
annähernd 30.000 Basenpaare [21]. Ki-67 gilt als Bestandteil der nukleären
Matrix
und
wird
ausschließlich
in
proliferierenden
Zellen,
der
sog.
Wachstumsfraktion, exprimiert [83]. Es liegt somit während der Phasen G1, S,
G2 und der Mitose (M) vor, nicht aber während G0 [24,65,78]. In
Zusammenhang
mit
diesem
Expressionsverhalten
ist
die
Dauer
der
Phasenintervalle von Bedeutung. Es ist in der S- und G2-Phase sowie während
der Mitose sowohl in entartetem als auch in physiologischem Gewebe nahezu
gleich, wohingegen in der G1-Phase eine zeitliche Inkonstanz herrscht [57].
Diese Variabilität wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst [31,51]. Als Maß
für die Aggressivität eines Tumors wird die Höhe der Proliferationsaktivität
angesehen. Die Zellen aggressiver Tumoren durchlaufen die G1-Phase
schneller als die Zellen langsam wachsender Tumoren. Weiterhin sind die in G1
befindlichen
Zellen
Zellzyklusphasen
allen
anderen
zahlenmäßig
Zellpopulationen
überlegen
[55].
Daraus
der
einzelnen
resultiert
eine
7
konsistente
Überschätzung
Proliferationsmarker
der
der
Anzahl
proliferierender
Wachstumsfraktion
zeichnen
Zellen
sich
[10,68].
durch
die
kontinuierliche Expression im Verlauf des Zellzyklus, sowie eine unverzügliche
Abnahme der Expression bei Wachstumsstillstand aus [80]. Diese Forderungen
werden von Ki-67 erfüllt. Unterschiedliche Auffassungen existieren hingegen für
die relative Expression in G1. Während manche Autoren einen Anstieg der Ki67 Expression bereits in der späten G1-Phase beschreiben, wiesen andere
Arbeitsgruppen eine Abnahme bis zum Eintritt in die S-Phase nach [9,11,37,72].
Diese Diskrepanz wird von du Manoir in einem Modell mit tridirektionalem
Signalweg gedeutet [17]. Der Signalweg der Anreicherung mündet dabei aus
dem Zellzyklus in die reversible G0-Phase. Werden diese Zellen anschließend
mittels geeigneter Wachstumsfaktoren aktiviert und in den Zyklus rückgeführt,
resultiert eine Anreicherung und der Eintritt in die S-Phase. Liegen optimale
Wachstumsbedingungen vor, verfolgen die Zellen einen konstanten Signalweg
und exprimieren kontinuierlich. Während der S-Phase ist ein Anstieg der
Expression feststellbar, der in der G2-Phase weiter zunimmt [17]. In der
Metaphase erreicht die Expression ihr Maximum [60,81]. In der nachfolgenden
Ana- und Telophase nimmt die Expression wieder ab. Die Halbwertszeit von Ki67 beträgt maximal eine Stunde [32]. Zu Beginn der G1-Phase ist die
Lokalisation von Ki-67 in direkter Nachbarschaft zur Satelliten-DNA zu finden
[10]. Diese räumliche Beziehung wird aber im Verlauf des Zellzyklus zugunsten
einer diffusen Verteilung im Kernplasma fast vollständig aufgegeben [62].
Weiterhin ist Ki-67 in den Umformungsprozess der Nukleoli involviert, die das
Protein ab Mitte der G1-Phase überwiegend assimilieren [47]. Während der G2Phase sind Lokalisationen im Nukleus oder im Nukleoplasma beschrieben
[9,17]. Die Funktion von Ki-67 ist bis zum heutigen Tag nicht vollständig geklärt.
Vermutungen über mögliche Interaktionen stützen sich häufig auf die CoLokalisation zu Strukturen bekannter Funktionalität oder ähnlicher genetischer
Muster. So beinhaltet das Protein eine Struktur, die man als “forkhead
assoziiert” bezeichnet [42]. Diese Sequenz weisen auch Proteine auf, die
regulierend in den Zellzyklus eingreifen. Falini et al. wiesen Ki-67 in
physiologischem und neoplastischem Gewebe von Hunden, Ratten und
Kaninchen
nach
und
brachten
diese
weitreichend
evolutionäre
Antigenkonservierung mit einer Kontrollfunktion des Zellzyklus in Verbindung
8
[18]. Die Erfahrungen mit Ki-67 mit Bezug zu klinischen Daten sind
weitreichend. Rudolph und Jansen et al. beschrieben dabei den Ki-67 LI als
einen signifikanten prognostischer Faktor [33,55]. Tabelle 1 gibt einen
Literaturüberblick
über
bereits
veröffentlichte
Ki-67-Studien
beim
Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle.
2.3.
Repp86
Im Jahr 1997 beschrieben Heidebrecht et al. ein bisher unbekanntes Protein,
das im Westernblot durch Immunisierung weiblicher BALB/C Mäuse mit
nukleären L428-Zelllysaten generierten monoklonalen Maus-Antikörper der
Subklasse IgG1 detektiert wurde [31]. Dieses Protein wurde vorübergehend als
p100, und schließlich aufgrund seines theoretischen Molekulargewichts von 86
kDa
als “restrictedly expressed proliferation-associated protein” 86kDa
(Repp86) bezeichnet. Manda et al. spezifizierte diese Bezeichnung für
untersuchtes Lungengewebe und führte als Synonym die Kurzbezeichnung DIL2 (differentially expressed in cancerous and noncancerous lung cells 2) ein
[41]. Das korrespondierende Gen ist auf dem Chromosom 20 lokalisiert.
Während der Mitose wird Repp86 mittels Phosphorylierung aktiviert, was für
zellzyklusassoziierte Proteine als typisch ausgewiesen wird. Repp86 ist in der
G1-Phase nicht detektierbar und liegt im Verlauf der Phasen S und G2 im
Nukleoplasma diffus verteilt vor [30]. Repp86 besitzt eine Halbwertszeit von 90
Minuten [31].
Färbungen mit dem monoklonalen Antikörper Ki-S2 zeigen, dass Repp86 in der
Prophase an den Spindelpolen kumuliert, während es in Meta- und Anaphase
den Verlauf des Spindelapparates nachzeichnet [31]. Weiterhin konnte Repp86
durch Klonierung der cDNA als menschliches Homolog des Xenopus Proteins
TPX2 charakterisiert werden [30,83]. Dieses Protein interagiert mit dem am
Minusende der Mikrotubuli und an den Spindelpolen lokalisierten Protein Xklp2,
dem eine wichtige Funktion bei der Chromosomentrennung zukommt [30].
Während der Mitose ist TPX2 für die chromatininduzierte Mikrotubulusformation
verantwortlich und kann die Geschwindigkeit der Mitose quantitativ beeinflussen
9
[29]. Eine analoge Affinität ist in Form des humanen Repp86-Hklp2 Komplexes
gegeben und lässt Vermutungen über eine gemeinsame Funktionsweise zu. In
der
Mitose
tritt
Wechselwirkung.
das
Antigen
Weiterhin
ist
mit
Spindelpolen
Repp86
neben
und
der
Mikrotubuli
Vermittlung
in
eines
Dynein/Dynactin-Komplexes am Transport des Motorproteins Hklp2 an die
Minusenden
der
Mikrotubuli
mitbeteiligt.
Ein
unterschiedlicher
Phosphorylierungsstatus könnte neben der Bindungsaffinität von Repp86 auch
seine Ubiquitierung bedingen, die in der Ana- und Telophase erfolgt. Das 747
Aminosäuren
umfassende
Protein
Repp86
nimmt
bezüglich
seines
Expressionsverhaltens eine Sonderstellung ein, die es als neuartigen
Proliferationsmarker etabliert. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen
Markern hebt es sich durch Beginn der Expression am Übergang von der G1/SPhase
ab
[30,35].
Durch
dieses
Expressionsmuster
wird
ein
Proliferationsmarker beschrieben, der eine Differenzierung von schnell
proliferierenden und langsam wachsenden Tumoren zulässt. Untersuchungen
an Normalgewebe und verschiedenen Tumorentitäten zeigten, dass der LI nur
ca. 40% der Ki-67 positiven Zellfraktion ausmacht [31]. In retro- und
prospektiven
Studien
prognoserelevanter
konnte
Parameter
die
beim
Expression
von
Neuroblastom,
Repp86
als
Mammakarzinom,
Endometriumkarzinom und Non-Hodgkin-Lymphom etabliert werden (Tab. 2).
Jahr
2002
1999
2002
2008
1996
2006
1994
1997
2004
1999
2002
Autor
De Vicente JC [14]
Sittel C [69]
Bettendorf O [5]
Faratzis G [19]
Gonzalez-Moles
MA [26]
Myoung H [46]
Roland NJ [54]
Tab. 1: Literaturübersicht zu Veröffentlichungen von Ki-67
Sommer T [71]
Tumuluri V [79]
Xie X [84]
Yao L [85]
66
85
47
64
79
113
74
87
329
56
35
Fallzahl
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
prospektiv
prospektiv
Studienart
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Nachweisverfahren
Hohe Ki-67-Werte stehen in Beziehung zu ungünstiger
Überlebensprognose
Hohe Ki-67-Werte stehen in Beziehung zu ungünstiger
Überlebensprognose
LI bei bereits metastasierenden Tumoren signifikant höher als bei
Tumoren ohne Metastasierung
Ohne prognostische Bedeutung
Ki-67 ohne signifikante Aussagekraft auf Überlebensrate
Ki-67 als unabhängiger Prognosefaktor; mit signifikantem Effekt auf
Überlebensdaten
Ki-67-Expression ohne Auswirkung auf Mitoseanzahl und
Überlebensrate
Exprimiert in 56,3% → korreliert signifikant mit schlechter
Überlebensprognose
Alleinige Färbung mit Ki-67 ohne relevante prognostische Bedeutung
Signifikant ungünstigere Überlebensprognose bei Ki-67-LI >53,7%;
deutet auf Behandlungsfehler hin
Li signifikant höher bei Tumoren mit niedriger histopathologischer
Differenzierung
Ergebnis
10
Tab. 2: Literaturübersicht zu Veröffentlichungen von Repp86
[76]
Tiemann M
[75]
Tiemann M
[74]
Taheri ZM
[63
Schrader C
[21]
Fenner M
[56]
Rudolph P
J [44]
2005
2005
2008
2005
2005
1999
2007
2003
Krams M
[35]
Mohsenifar
Jahr
Autor
Hodgkin Lymphom
T-Zell-reiches
grosszelliges B-ZellLymphom
malignes Mesotheliom
vs. benigne
mesotheliale
Hyperplasie
Mantelzell-Lymphom
Gesunde
Mundschleimhaut vs.
Plattenepithelkarzinom
der Mundhöhle
Mammakarzinom
Mammakarziom mit
neg. Nodalstatus vs.
Mammakarzinom mit
pos. Nodalstatus
Neuroblastom
Tumorart
224
16
36 vs. 22
94
10 vs.59
371
60 vs. 27
161
Fallzahl
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
retrospektiv
prospektiv
prospektiv
prospektiv
Studienart
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Immunhistochemie
Nachweisverfahren
Nur geringe Repp86-Expression (LI ca. 20%)
im Vergleich zu Ki-67-Expression (LI ca. 80%)
deutet auf ein Aussetzen des Zellzykluses
während der G1-Phase hin
Nur geringe Repp86-Expression (LI ca. 10%)
im Vergleich zu Ki-67-Expression (LI ca. 40%)
Mittlerer LI malignes Mesotheliom 26,3% und
mesothelialer Hyperplasie 3,26%. Nützlicher
Marker für Diagnosestellung und
Unterscheidung beider Krankheiten.
Signifikanter Unterschied der Überlebenszeit
nach Diagnosestellung zwischen LI 0-1% und
LI >10%
LI gesunde Schleimhaut 4,7%; LI Ple-Ca der
Mundhöhle 18,4%
LI > 10% sagt signifikant erhöhte Mortalität
vorher
Mamma-Ca mit neg. Nodalstatus: LI zeigt
keinen signifikanten Unterschied zwischen
Patientengruppe und Kontrollgruppe
Mamma-Ca mit pos. Nodalstatus: LI zeigt
signifikanten Unterschied zwischen beiden
Gruppen
LI > 10% sagt signifikant erhöhte Mortalität
vorher
Ergebnis
11
12
3.
Material und Methoden
3.1.
Patientenauswahl
Im Rahmen dieser retrospektiven Studie wurden in Kooperation mit dem
Tumorzentrum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg die
Krankengeschichten
aller
Patienten
der
Mund-,
Kiefer-
und
Gesichtschirurgischen Klinik, Universitätsklinikum Erlangen (Direktor Prof. Dr.
Dr. F.W. Neukam), die im Zeitraum vom 01.01.1995 bis zum 31.12.2003
aufgrund eines Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle behandelt worden
waren, rekrutiert.
Die Patientenselektion erfolgte anhand definierter Ein- und Ausschlusskriterien.
Einschlusskriterien:

primäre Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle

operative Therapie mit R0-Resektion

kurativ intendierte Behandlung
Ausschlusskriterien:

weitere maligne Grunderkrankungen

Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Bereich in der Anamnese

Vorbestrahlung im Kopf-Hals-Bereich

schwerwiegenden Grunderkrankungen (ASA-Wert>3)
Aus insgesamt 731 Krankengeschichten wurden 225 Patientenfälle anhand der
genannten Ein- und Ausschlusskriterien zur weiteren Analyse herangezogen.
Die dem histopathologischen Befund zugrundeliegenden Paraffinblöcke wurden
vom Pathologischen Institut, Universitätsklinikum Erlangen (Direktor Prof. Dr.
Arndt Hartmann) zur Verfügung gestellt. Im Falle einer präoperativen
neoadjuvanten Radiatio wurde auf die archivierte Probeexzision (PE), bei
postoperativer Bestrahlung auf das Resektionsmaterial zurückgegriffen. Neben
Geburtsdatum, Geschlecht, Operationsdatum und Bestrahlungsart, fanden das
13
pTNM Staging nach der Empfehlungen der Union internationale contre le
cancer (UICC), sowie das histopathologische Grading Berücksichtigung [70].
Weiterhin wurde das Alter bei Diagnosestellung ermittelt. Es wurden insgesamt
54 (24,00%) Frauen und 170 (74,60%) Männer in die Studie aufgenommen. Bei
einem Patienten ist das Geschlecht unbekannt (0,40%).
Für die weitere Analyse wurden die patientenbezogenen Daten nach
Rücksprache
mit
der
Ethikkommission,
Universitätsklinikum
Erlangen,
anonymisiert.
3.2.
TNM-Klassifikation und histopathologisches Grading
Die klinische Diagnose “Plattenepithelkarzinom” erfordert die routinemäßige
Klassifikation des Tumors in Ausdehnung und Metastasierungszustand anhand
des Schemas der UICC, wobei unterschieden wird zwischen TNM als klinische
Klassifikation und pTNM als pathologische Klassifikation. Nach diesem System
ist definiert [70]:
Tumorgröße T
Tis:
Carcinoma in situ
T0:
Kein Hinweis auf einen Primärtumor
T1:
Tumor bis zu zwei Zentimeter im Größendurchmesser
T2:
Tumor zwischen zwei und vier Zentimeter im Größendurchmesser
T3:
Tumor mehr als vier Zentimeter im Größendurchmesser
T4:
Jeder Tumor, der Nachbarstrukturen infiltriert. Die Klassifizierung erfolgt
bei T4 unabhängig von der Tumorgröße.
Lymphknotenbefall N
NX:
Der Lymphknotenstatus ist nicht zu beurteilen
N0:
Kein Hinweis auf regionäre Lymphknotenmetastasen
14
N1:
Lymphknotenmetastasen in einem regionärem Lymphknoten bis 3cm
Durchmesser auf der ipsilateralen Seite
N2a: Lymphknotenmetastase in einem regionären Lymphknoten zwischen 3
und 6cm im Durchmesser auf der ipsilateralen Seite
N2b: Lymphknotenmetastasen in mehreren regionären Lymphknoten bis 6cm
Durchmesser auf der ipsilateralen Seite
N2c: Lymphknoten in einem oder mehreren regionären Lymphknoten bis 6cm
Durchmesser auf der kontralateralen Seite oder bilateral
N3:
Lymphknotenmetastasen
in
einem
oder
mehreren
regionären
Lymphknoten über 6cm
Differenzierungsgrad G
GX:
Differenzierungsgrad kann nicht bestimmt werden
G1:
gut differenziert
G2:
mäßig differenziert
G3:
schlecht differenziert
G4:
undifferenziert
3.3.
Immunhistochemie
3.3.1.
Prinzip der immunhistochemischen Färbung
Das zugrunde liegende Prinzip der immunhistochemischen Färbung besteht in
der Bindung eines Antikörpers an das für ihn spezifische Antigen. Diese
Bindung weist eine hohe Spezifität auf, indem die Bindungsstelle des
Antikörpers, das Paratop, nur an ein bestimmtes komplementäres Areal des
zugehörigen Antigens, das Epitop, bindet. Diese Bindungsreaktion eines
Primärantikörpers wird über mehrere Folgeschritte mittels enzymatischer
Färbereaktion
sichtbar
gemacht.
Mit
Hilfe
eines
vollautomatischen,
immunhistochemischen Färbegeräts der Firma DAKO (Dako Autostainer Plus;
DAKO Diagnostics, Hamburg) wurden diese Färbereaktionen durchgeführt.
15
Prinzipiell können direkte und indirekte Färbeverfahren unterschieden werden.
Bei der direkten Methode ist der Primärantikörper bereits chemisch mit einer
Peroxidase gekoppelt. Diese wandelt ein chromogenes Substrat enzymatisch in
einen Farbstoff um und verursacht somit die spezifische Färbung des
Präparates. Bei der indirekten Methode kommt es zunächst zur Verbindung des
darzustellenden Antigens mit dem Primärantikörper, der allerdings nicht mit
einer Peroxidase gekoppelt ist. Um diesen Komplex sichtbar zu machen ist ein
weiterer Antikörper, der Sekundärantikörper nötig, der mit einer Peroxidase
konjugiert ist. Dieser konjugierte Sekundärantikörper bindet spezifisch an den
Primärantikörper, womit der Gesamtkomplex durch Chromogene wiederum
sichtbar gemacht werden kann.
Das hier verwendete Detektionssystem Advanced™ HRP (DakoCytomation
Advanced HRP Ready-to-Use; For In Vitro Diagnostic Use) verwendet ein
indirektes immunhistochemisches Färbeverfahren, welches zum Nachweis
niedriger Konzentrationen vorhandener Antigene eingesetzt wird. Dieses
System funktioniert nach der Peroxidase-Antiperoxidase-Färbemethode (PAPMethode; Abb. 1). Dazu werden drei Reagenzien gebraucht:
-
Der Primärantikörper (im Advanced™ HRP-Kit nicht enthalten),
-
Der Sekundärantikörper (Advanced™ HRP link mit sekundären
Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Antikörpern in Tris-HCl-Puffer)
und
-
Der Tertiärantikörper oder PAP-Komplex (Advanced™ HRP
Enzyme mit Meerrettichperoxidase polymerisierte Antikörper in
Tris-HCl-Puffer).
Der Primärantikörper ist spezifisch gegen das Antigen (Repp86, Ki-67)
gerichtet. Der Sekundär- oder Brückenantikörper (link antibody) kann sich
sowohl an den Primärantikörper als auch an den PAP-Komplex binden, da
beide in derselben Tierspezies hergestellt wurden [6]. Da es biotinfrei ist wird
die unspezifische Färbung wie z.B. in lymphatischen Geweben erheblich
abgeschwächt.
16
3.3.2.
Primärantikörper
3.3.2.1. Ki-S2 (Repp86)
Der monoklonale Mausantikörper Ki-S2 wurde im Institut für Pathologie der
Universität Kiel als Marker der Immunglobulin-Subklasse IgG1 entwickelt [32]
Im Westernblot wurde die Affinität von Ki-S2 zum Antigen Repp86
nachgewiesen, das vom Übergang G1/S-Phase bis zur Mitosephase exprimiert
wird. Zur Detektion dieses formalin- und paraffinresistenten Antigens können
sowohl frische als auch gefrorene Gewebeproben verwendet werden.
3.3.2.2. Ki-S5 (Ki-67)
Der monoklonale Antikörper Ki-S5 [32,36,58,59] ist ein Immunglobulin der
Subklasse IgG1, der gegen ein formalinresistentes Epitop des Ki-67-Antigens
gerichtet ist [23,24,25,61], das ausschließlich in proliferierenden Zellen
exprimiert wird. Westernblot-Analysen zeigten, dass der Antikörper Ki-S5 an ein
Kernantigen bindet, das wie bei Ki-67 aus einem 345 kDa und einem 395 kDa
Protein besteht und in den Zellzyklusphasen G1, S, G2 und M aber nicht in G0
exprimiert wird [77].
Abb. 1: Prinzip der Peroxidase-Antiperoxidase (modifiziert nach einer Produktbeschreibung der
Firma DAKO Diagnostika GmbH Hamburg, Deutschland)
17
3.3.3.
Herstellung und Vorbehandlung der Schnittpräparate
Von den Paraffinblöcken wurden mittels eines Schlittenmikrotoms (Leica RM
2165®, Leica Microsysteme, Nussloch GmbH, Deutschland) 2-3μm dicke
Schnitte angefertigt. Diese wurden zum Strecken in ein auf ca. 40°C beheiztes
Wasserbad (Aqua dest.) gegeben und anschließend auf beschichtete
Objektträger
(Super
Frost
Plus,
Menzel,
Braunschweig,
Deutschland)
aufgezogen. Über Nacht wurden die Schnitte bei 37°C im Brutschrank
getrocknet. Die nachfolgende Inkubation für 3×15 Minuten in Xylol (Merck,
Darmstadt, Deutschland) entzog dem Gewebe das Paraffin. Danach wurden die
Schnitte für eine Dauer von jeweils 2 Minuten in einer absteigenden
Alkoholreihe (100%, 100%, 96%, 96%, 90%, 70%, 70%; Isopropanol, Roth,
Karlsruhe, Deutschland) rehydriert. Abschließend wurden die Proben für 15
Minuten in einem Puffermedium (S3006, DAKO, Wash Buffer, 1:10 mit Aqua
dest. verdünnt) gespült.
Die
Formalinfixierung
vor
der
routinemäßigen
Paraffineinbettung
der
Tumorproben ruft eine Veränderung der Proteinstruktur im Gewebe hervor,
wodurch es auch zu einer Veränderung der antigenen Bindungsstellen, den
Epitopen kommen kann. Man spricht von einer so genannten „AntigenMaskierung“. Um die Immunreaktivität der Epitope wiederherzustellen, also eine
„Antigen-Demaskierung“ herbeizuführen, eignet sich besonders die auch hier
eingesetzte
Methode
der
Hitze-induzierten-Epitop-Wiederherstellung
(Retrieval). Durch Inkubation der Schnitte zusammen mit einer weiteren
Pufferlösung (S2367, DakoCytomation, Target Retrieval Solution, pH 9) in ein
kochendes Wasserbad (Aqua dest. ca. 99°C) für 25 Minuten werden die Proben
vorbehandelt. Es folgt ein Abkühlungsintervall von 30 Minuten in Pufferlösung
bei Raumtemperatur.
18
3.3.4.
Austestung der Primärantikörper-Konzentrationen
Als zu verändernde Variablen wurden die Andauzeit, das Puffermedium in
welchem
die
Proben
während
der
Andauzeit
liegen
sowie
die
Primärantikörperkonzentration [PAK] gewählt. Die Vorbehandlung der Schnitte,
die Konzentration der Sekundärantikörper, die Färbung und Gegenfärbung war
hingegen
bei
jeder
Probefärbung
identisch.
Verdünnt
wurden
die
Primärantikörper mit einem stabilen, gebrauchsfertigen Reagenz der Firma
DAKO (S2022, Dako REAL™, Antibody Diluent), das speziell für die
Verdünnung von Primärantikörpern entwickelt wurde.
1. Probefärbung: [Ki-S2] 1:5 und 1:10
[Ki-S5] 1:10 und 1:20
Andauzeit:
30
Minuten
in
Citratpuffer
(2,1g
Zitronensäuremonohydrat in 900ml Aqua dest.; mit
NaOH auf pH 6 einstellen und abschließend mit
Aqua dest. auf 1000ml auffüllen)
2. Probefärbung:
[Ki-S2] 1:25; 1:50 und 1:100
[Ki-S5] 1:10; 1:25 und 1:50
Andauzeit: 20 Minuten in Target Retrieval Solution
(Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9)
3. Probefärbung:
[Ki-S2] 1:5; 1:10 und 1:25
Andauzeit: 20 Minuten in Target Retrieval Solution
(Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9)
4. Probefärbung:
[Ki-S2] 1:5; 1:10 und 1:25
[Ki-S5] 1:10 und 1:25
Andauzeit: 25 Minuten in Target Retrieval Solution
(Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9)
19
Nach den Probefärbungen wurde die Andauzeit auf 25 Minuten in Target
Retrieval Solution (Dako; verdünnt mit Aqua dest. 1:10; pH 9) sowie folgende
Primärantikörperkonzentrationen festgelegt:
Verwendete Primärantikörper
Antigen
Antikörper
Verdünnung
Repp86
Ki-S2
1:10
Ki-67
Ki-S5
1:10
Prof. Dr. Parwaresch, Institut für HämatoPathologie, Christian-Albrechts-Universität,
Kiel
Prof. Dr. Parwaresch, Institut für HämatoPathologie, Christian-Albrechts-Universität,
Kiel
Tab. 3: Auflistung der verwendeten Primärantikörper
3.3.5.
Immunhistochemische Färbung
Vor Beginn einer Färbung wurden alle Reagenzien auf Raumtemperatur
gebracht. Da ausgetrocknete Schnitte unspezifische Färbungen aufweisen
können wurde die Luft im Automaten angefeuchtet um ein Austrocknen der
Gewebeproben zu verhindern. Außerdem wurde das richtige Tropfvolumen, das
pro Präparat und Reagenz auf den Objektträger getropft wurde, eingestellt.
Dieses Volumen ist bei kleinen Proben 100µl und 150µl bei den Restlichen.
Nach dem Andauen wurden die Präparate der Reihe nach in den Färbeautomat
(Dako
Autostainer
plus®,
Dako
Diagnostics,
Hamburg,
Deutschland)
eingeordnet. Alle Proben wurden mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit
Aqua dest. 1:10) gespült. Dieser Dako Wash Buffer ist ein Tris-Puffer mit einem
pH-Wert von 7,6 (+/-0,1), der Tween 20 enthält, ein Stoff der die
Oberflächenspannung herabsetzt und molekulare, oberflächliche Verbindungen
löst. Im nächsten Schritt wurde die im Gewebe vorhandene endogene
Peroxidase geblockt, um eine Hintergrundfärbung zu vermeiden. Das geschieht
mit DEEB (S2003, Dual Endogenous Enzyme Block, DakoCytomation,
Carpinteria, California, USA). Dieser Enzymblock wurde für 10 Minuten auf die
Objektträger gegeben und anschließend wieder mit Dako Wash Buffer (S3006,
verdünnt mit Aqua dest. 1:10) abgespült. Der Primärantikörper (Repp86/Ki-67)
wurde inkubiert und für 60 Minuten auf den Präparaten belassen. Nach einer
20
weiteren Spülung der Objektträger mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit
Aqua dest. 1:10) wurde nun der Sekundärantikörper für 30 Minuten, gefolgt von
einer Spülung mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit Aqua dest. 1:10),
aufgetragen. Auch der Tertiärantikörper blieb für 30 Minuten auf den Proben.
Nach einer neuerlichen Spülung mit Dako Wash Buffer (S3006, verdünnt mit
Aqua dest. 1:10) wurde das chromogene Substrat (K3469, AEC + High
Sensitivity Substrate Chromogen, DakoCytomation, Carpinteria, California,
USA) auf die Proben aufgebracht und für 18 Minuten auf den Gewebeschnitten
belassen. Wieder wurde gespült und für 15 Minuten Aqua dest. auf die
Objektträger appliziert. Der Färbedurchgang wurde mit einer Spülung Dako
Wash Buffer (S3006, verdünnt mit Aqua dest. 1:10) beendet. Anschließend
wurde die Gegenfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt [6]. Dazu wurden die
Objektträger in Küvetten überführt und für 4 Minuten in Hämatoxylin (S3301,
Automation Hematoxylin Histological Staining Reagent, DakoCytomation,
Carpinteria, California, USA) inkubiert. Um die Gegenfärbung zu stabilisieren
und die Haltbarkeit des Präparates zu verlängern wurden die angefärbten
Proben nachfolgend 5 Minuten „gebläut“, d. h. sie wurden unter fließendem
Leitungswasser abgespült um abschließend noch 5 Minuten in Aqua dest.
gelagert zu werden [12]. Nun wurden die Schnittpräparate auf das Eindecken
vorbereitet. Dazu mussten sie mit Zellstofftüchern getrocknet werden um
anschließend mit einem wasserbasiertem Klebstoff (Aquatex von Merck,
Darmstadt, Deutschland) und geeigneten Deckgläsern (Carl Roth, Karlsruhe,
Deutschland) eingedeckt zu werden. Das Eindeckmedium muss wasserhaltig
sein, da das Reaktionsprodukt von AEC in Alkohol und organischen
Lösungsmitteln löslich ist. Beim Eindecken muss außerdem darauf geachtet
werden, dass sich keine Luftblasen unter dem Deckglas befinden, da AEC sehr
oxidationsempfindlich ist und es so zu einem Ausbleichen des Präparats
kommen kann [6].
21
3.3.6.
Kontrollen
3.3.6.1. Negativkontrolle
Als Negativkontrolle wurde ein Präparat mit TBS-Pufferlösung, anstelle des
primären Antikörpers inkubiert. Es folgte das reguläre Färbeprotokoll.
3.3.6.2. Positivkontrolle
Als Positivkontrolle wurde in jeder Färbeserie ein Gewebeschnitt von humanem
Ovarialkarzinom mit bekannter Positivität mitgeführt.
3.4.
Auswertung
Zunächst wurden die Schnitte unter einem Hellfeldmikroskop (Axio Imager.A1,
Zeiss, Oberkochen, Deutschland) in 25- und 50-facher Vergrößerung (10-fach
Okular und 2,5- bzw. 5-fach Objektiv) qualitativ untersucht, um die
exprimierenden Areale im Tumor zu lokalisieren und unspezifische Färbungen
bzw. positive, außerhalb des Tumorgewebes gelegene Areale zu detektieren.
Anschließend wurden bei 400-facher Vergrößerung (10-fach Okular und 40fach Objektiv) vier Zählfelder im Tumorgewebe jedes Präparats bestimmt und
ausgezählt. Ein Zählfeld besitzt ca. 150 (±30) Zellen. Als Kriterium für eine
positive Kernfärbung galt das Vorhandensein einer artefaktfreien Zellstruktur mit
einer eindeutigen und spezifischen Färbung des Zellkerns. Die Intensität der
Färbungen fand keine Berücksichtigung. Die Bestimmung des LI konnte durch
Summation der positiv gefärbten Zellen und der Gesamtzellzahl pro Zählfeld
sowie anschließender Quotientenbildung erfolgen. Als Grundlage diente die von
Weibel
beschriebene
Methode
Subsamplings [64,66,67,82].
des
randomisierten
systematischen
22
3.5.
Statistikteil
Die deskriptive Darstellung stetiger Variablen (z.B. Alter, Repp86-LI und Ki-67LI) erfolgte durch Ermittlung von Mittelwert und Standardabweichung sowie der
Minimum- und Maximumwerte. Für kategoriale Variablen (z.B. Geschlecht,
Tumorgröße und Nodalstatus) wurden die absoluten und prozentualen
Ereignishäufigkeiten der jeweiligen Ränge ermittelt.
Für die weiterführende statistische Analyse wurden die Variablen anhand ihres
Mittelwertes/Medians
bzw.
anhand
klinischer
Überlegungen
wie
folgt
dichotomisiert:
Alter
<55 Jahre vs. ≥55 Jahre
Tumorgröße
pT1-2 vs. pT3-4
Nodalstatus
pN0 vs. pN1-3
histopathologischer Differenzierungsgrad
G1-2 vs. G3
Repp86-LI [%]
<25 vs. ≥25
Ki-67-LI [%]
<30 vs. ≥30
Der Vergleich kategorialer Variablen erfolgte über den Chi2-Test.
In der Univarianzanalyse erfolgte anhand der Kaplan-Meier-Methode die
Bestimmung
der
Überlebensfunktion,
welche
eine
Schätzung
der
Wahrscheinlichkeit darstellt, den Zeitpunkt t zu überleben, wobei die Analyse
aufgrund der Studienhypothese lediglich in Bezug auf das Gesamtüberleben
vorgenommen wurde. Zum Vergleich der Überlebensfunktionen wurde der
Mantel-Haenszel-Log-rank Test herangezogen.
Der gleichzeitige Einfluss verschiedener Variablen auf das Gesamtüberleben
erfolgte mittels einer Multivarianzanalyse (Cox proportional hazards model),
nachdem die Bedingungen der Anwendbarkeit einer logistischen Regression
überprüft worden waren.
Alle statistischen Berechnungen wurden mit dem Softwarepaket SPSS
(Software Package for Socioeconomic Science; Version 15.0) vorgenommen.
Das Signifikanzniveau wurde bei 5% festgelegt (P<0,05).
23
4.
Ergebnisse
4.1.
Patientenbezogene Parameter
Insgesamt wurden 225 Patienten mit der histopathologischen Diagnose
Plattenepithelkarzinom in
die
Studie
aufgenommen.
Die
170
(75,6%)
männlichen und 54 (24%) weiblichen Patienten zeigten eine Altersverteilung
von
30-79
Jahren.
Das
Durchschnittsalter
betrug
56,8
Jahre
(Standardabweichung 9,9%). Die Auswertung der pTNM-Daten ergab für T1 ein
Kollektiv von 60 Patienten (26,7%), für T2 60 (26,7%) Patienten, bezüglich T3
19 (8,4%) Patienten und für T4 77 (34,2%) Patienten. Bei 9 (4,0%) Patienten
konnte retrospektiv keine Tumorgröße ermittelt werden. Sie wurden deshalb
ausschliesslich in die Berechnungen zur Expression eingebunden. Der
Nodalstatus wurde bei 105 (46,7%) Patienten mit N0 evaluiert, 37 (16,4%)
Patienten gehörten der Kategorie N1 an, bei 68 (20,2%) Patienten ergab der
histopathologische Befund eine N2-Klassifizierung und bei einem (0,4%)
Patienten war der Nodalstatus N3. Bei 14 (6,2%) Patienten fehlten Angaben
zum Nodalbefund. 20 (8,9%) Tumoren zeigten eine G1-Differenzierung, 149
(66,2%) Tumoren wurden als mäßig differenziert (G2) aufgenommen, für G3
standen 37 (16,4%) Tumoren zur Verfügung. Bei 19 (8,4%) Patienten konnte
der Differenzierungsgrad retrospektiv nicht ermittelt werden (Tab. 4).
4.2.
Qualitative immunhistochemische Analysen
4.2.1.
Antikörper Ki-S2 (Repp86)
Nach Durchführung des Färbeprocederes ergab sich bei allen Gewebeproben
ein
bichromes
Erscheinungsbild.
Neben
der
bläulich
erscheinenden
Gegenfärbung in Mukosa und Submukosa imponierte die rosa bis tiefrote
Kernfärbung
Mitosefiguren
als
Ausdruck
fielen
durch
der
eine
Expression
kräftige
im
Zellkern.
Färbung
auf.
Auftretende
Eventuelle
24
präparatabhängig auftretende unspezifische Hintergrundfärbungen (blassrosa)
waren dezent und hatten keine Auswirkungen auf die Auszählung.
Patientenbezogene Parameter
Parameter
Kategorie
Fallzahl (n)
Anteil (%)
225
100
weiblich
54
24,0
männlich
170
75,6
keine Angabe
1
0,4
---
---
---
T1
60
26,7
T2
60
26,7
T3
19
8,4
T4
77
34,2
keine Angabe
9
4,0
N0
105
46,7
N1
37
16,4
N2
68
20,2
N3
1
0,4
keine Angabe
14
6,2
G1
20
8,9
G2
149
66,2
G3
37
16,4
keine Angabe
19
8,4
Gesamtfallzahl
Geschlecht
Alter: Durchschnitt 56,8 Jahre (30-79 J.)
Standardabweichung: 9,9%
Tumor im Größendurchmesser (T)
Nodalbefund (N)
Histopathologisches Grading (G)
Tab. 4: Auflistung der patientenbezogenen Parameter
Spezifische Bindungen innerhalb des Bindegewebes oder Zytoplasmas wurden
nicht beobachtet. Positive Zellen traten häufiger in kleinen Zellverbänden auf,
als in einer diffusen Verteilung.
Die Negativkontrollen wiesen keine spezifische Anfärbbarkeit auf. Die
mitgeführten Positivkontrollen (Ovarialkarzinome) zeigten eine spezifische und
charakteristische Kernfärbung.
25
4.2.2.
Antikörper Ki-S5 (Ki-67)
Vor dem blau gefärbten Hintergrund der Gegenfärbung manifestierten sich im
Tumorepithel tiefrote Zellkerne als Ausdruck der Kernexpression. Spezifische
Bindungen innerhalb des Bindegewebes oder des Zytoplasmas wurden nicht
beobachtet. Die mitgeführten Negativkontrollen zeigten keinen Hinweis
spezifischer Farbreaktionen. Das Gewebe der Ovarialkarzinome reagierte
positiv.
4.3.
Quantitative Analyse der Antigenexpression
4.3.1.
Repp86-Expression
Die Expression der 225 ausgewerteten Tumorgewebe variierte von 0,0-82,0%
bei einem Mittelwert von 21,5%. Die Standardabweichung betrug dabei 13,7%
(Tab. 5).
Ergebnisse der Repp86-Expression, Plattenepithelkarzinom %
Anzahl n
Mittelwert
Minimum LI
Maximum LI

225
21,5
0,0
82,0
13,7
Tab. 5: Ergebnisse der Repp86-Expression beim Plattenepithelkarzinom (%)
In Abbildung 2 ist die prozentuale Gesamtpositivität in 5%-Intervallen dargestellt
und die jeweilige Zahl der Fälle pro Intervall zugeordnet. Die markierten
Positivitäten bewegten sich zwischen 0% und 60%. Eine gleichmäßige
Verteilung ist zwischen 5% und 30% zu erkennen.
4.3.1.1. Explorative Datenanalyse der Repp86-Expression
Expressionsdaten für pT1 lagen für 45 Fälle vor. Dabei lag die minimale
Expression bei 1,0%, das Maximum bei 65,0%. Es wurde eine mittlere
Expression von 20,7% (±15,3%) berechnet. Für pT2 ergab sich eine mittlere
Expression von 21,7% (±11,3%) bei Extremwerten von 1,0-49,0% und
26
insgesamt 56 Fällen. Die Fallzahl für pT3 betrug 17 Fälle. Evaluiert wurde eine
mittlere Expression von 25,9% (±12,8%) bei einem Minimum bzw. Maximum
von 2,0% bzw. 45,0%. Für pT4 lag ein Patientenpool von 65 Fällen vor. Die
Expression betrug 1,0% im Minimum und 56,0% im Maximum. So errechnete
sich ein Mittelwert von 20,4% (±13,0%).
Abb. 2: Anzahl der durch den Antikörper Repp86 markierten Fälle in Abhängigkeit von
der Proliferationsrate
Bezüglich des Lymphknotenbefundes konnten für pN0 90 Fälle, für pN1 32
Fälle und für pN2 60 Fälle evaluiert werden. Für pN0 konnte eine mittlere
Expression von 20,8% (±13,7%) bei Extremwerten von 1,0-65,0% errechnet
werden. Für pN1 lag die minimale Expression bei 1,0%, das Maximum bei
41,0%. So errechnete sich ein Mittelwert von 20,8% (±11,1%). Bezüglich pN2
wurde ein Mittelwert von 22,0% (±12,9%) mit Extremwerten von 1,0-56,0%
berechnet. Der Nodalstatus pN3 konnte nur einem Patienten zugeordnet
werden. Bei G1 mit einer Fallzahl von 16 Fällen wurde bei einer minimalen
Expression von 1,0% und einem Maximum von 40,0% ein Mittelwert von 19,3%
(±10,6%) errechnet. Eine mäßiggradige Differenzierung war mit 137 Fällen
erfasst worden und lieferte eine mittlere Expression von 20,9% (±13,3%). Die
27
Expressionen lagen zwischen Werten von 1,0-65,0%. Für G3 wurden 30 Fälle
bei einer mittleren Expression von 24,5% evaluiert (±13,2%). Die Extremwerte
betrugen 5,0% bzw. 53,0%. Eine Auflistung der ermittelten Repp86-LI in
Zuordnung zu den klinischen Parametern sind Tabelle 6 zu entnehmen.
Repp86-LI %
n
Mittel
Min.
Max.

225
21,5
0
82
13,7
m
170
21,8
1
65
13,1
w
54
19,7
1
47
12,9
T1
45
20,7
1
65
15,3
T2
56
21,7
1
49
11,3
T3
17
25,9
2
45
12,8
T4
65
20,4
1
56
13,0
N0
90
20,8
1
65
13,7
N1
32
20,8
1
41
11,1
N2
60
22,0
1
56
12,9
N3
1
G1
16
19,3
1
40
10,6
G2
137
20,9
1
65
13,3
G3
30
24,5
5
53
13,2
Plattenepithelkarzinome, gesamt
Geschlecht
Tumorgröße (T)
Nodalstatus (N)
Grading (G)
Tab. 6: Auflistung der ermittelten Repp86-Labelingindizes (%)
4.3.1.2. Univariate Analyse – Repp86
Der statistische Zusammenhang zwischen den kategorischen Variablen
(Tumorgröße, Nodalstatus, Grading, Geschlecht) und den stetigen Variablen
der Expression erfolgte mittels des nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test.
Die statistische Signifikanz wurde ab einem Wert von p<0,05 festgesetzt.
Für Repp86 konnte in Bezug auf die klinischen Parameter Tumorgröße
(p=0,282), Nodalstatus (p=0,187) und Grading (p=0,074) keine Signifikanz
nachgewiesen werden. Beim Geschlecht hingegen war das Ergebnis mit einem
p-Wert von 0,049 signifikant.
28
Abb. 3: Boxplot für Repp86-LI in % und Tumorgröße (pT1-pT4)
Abb. 4: Boxplot für Repp86-LI in % und Nodalstatus (pN0-pN3)
29
Abb. 5: Boxplot für Repp86-LI in % und histopathologisches Grading (G1-G3)
4.3.2.
Ki-67-Expression
Errechnet wurde die mittlere Expression mit 30,3% (±17,7%) bei 0,0% bzw.
78,0% als Extremwerte (Tab. 7).
Ergebnisse der Ki-67-Expression, Plattenepithelkarzinom %
Anzahl n
Mittelwert
Minimum LI
Maximum LI

221
30,3
0,0
78,0
17,7
Tab. 7: Ergebnisse der Ki-67-Expression beim Plattenepithelkarzinom (%)
In den gefärbten Präparaten (siehe Abb. 6) wurden Proliferationsraten zwischen
0% und 80% ermittelt. Die Verteilung zeigte einen deutlichen Gipfel zwischen
15% und 35%. Zwischen 35% und 40% nimmt die Häufigkeit langsam ab.
Proliferationsraten über 80% wurden nicht beobachtet.
30
Abb. 6: Anzahl der durch den Antikörper Ki-67 markierten Fälle in Abhängigkeit von der
Proliferationsrate
4.3.2.1. Explorative Datenanalyse der Ki-67-Expression
Für pT1 ergab sich ein Kollektiv von 45 Patientenfällen. Die mittlere Expression
lag bei 31,7% (±21,4%) bei Extremwerten von 0,0% und 78%. Die 56 Fälle für
pT2 ergaben eine mittlere Expression von 28,4% (±15,5%). Das Minimum bzw.
Maximum lag bei 2,0% bzw. 66,0%. Die Extremwerte von 0,0-73,0% wurden bei
einer mittleren Expression von 40,2% (±21,8%) für pT3 errechnet (17 Fälle). Für
pT4 wurden 65 Fälle gezählt, die bei einer Standardabweichung von 16,7%
eine mittlere Expression von 27,7% ergaben (Werte von 0,0-67,0%). Für pN0
ergab sich ein Kollektiv von 90 Patienten. Bei einem Minimum von 0,0% und
einem Maximum von 78,0% errechnete sich eine mittlere Expression von 30,0%
(±21,0%). Für pN1 errechnete sich eine mittlere Expression von 27,2%
(Minimum: 3,0%, Maximum: 67,0%) bei einer Standardabweichung von 16,5%.
Für pN1 lagen 32 Fälle vor. Für pN2 ergaben sich 60 Fälle bei einem Mittelwert
von 31,7% (Minimum: 2,0%, Maximum: 59,0%). Die Standardabweichung
betrug 15,3%. pN3 betraf nur einen Patienten, sodass kein Mittelwert und
31
Standardabweichung berechnet werden konnte. Die 16 Fälle bei G1 ergaben
eine mittlere Expression von 30,0% (±20,1%) bei einem Minimalwert von 2,0%
und einem Maximum von 64,0%. Für G2 konnten 137 Fälle evaluiert werden,
deren mittlere Expression bei 29,0% (±18,4%) lag (Minimum: 0,0%, Maximum:
78,0%). Für G3 berechnete sich ein Pool von 30 Fällen. Dabei lag die mittlere
Expression bei 35,2% (±17,3%). Die Werte streuten in einem Intervall von 3,071,0%. Die Auflistung der Ki-67-LI ist der Tabelle 8 zu entnehmen.
Ki-67-LI %
n
Mittel
Min.
Max.

221
30,3
0
78
17,7
m
170
31,9
0
78
18,7
w
54
23,5
0
63
15,9
T1
45
31,7
0
78
21,4
T2
56
28,4
2
66
15,5
T3
17
40,2
0
73
21,8
T4
65
27,7
0
67
16,7
N0
90
30,0
0
78
21,0
N1
32
27,2
3
67
16,5
N2
60
31,7
2
59
15,3
N3
1
G1
16
30,0
2
64
20,1
G2
137
29,0
0
78
18,4
G3
30
35,2
3
71
17,3
Plattenepithelkarzinome, gesamt
Geschlecht
Tumorgröße (T)
Nodalstatus (N)
Grading (G)
Tab. 8: Auflistung der Ki-67-Labelingindizes (%)
32
4.3.2.2. Univariate Analyse – Ki-67
Der statistische Zusammenhang zwischen den kategorischen Variablen
(Tumorgröße, Nodalstatus, Grading, Geschlecht) und den stetigen Variablen
der Expression erfolgte mittels des nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test.
Die statistische Signifikanz wurde ab einem Wert von p<0,05 festgesetzt.
Zwischen Ki-67 und den kategorischen Variablen Tumorgröße (p=0,517),
Nodalstatus (p=0,933) und Grading (p=0,123) zeigte sich kein signifikanter
Zusammenhang. Allerdings war auch hier das Geschlecht mit einem p-Wert von
0,020 signifikant.
Abb. 7: Boxplot für Ki-67-LI in % und Tumorgröße (T1-T4)
33
Abb. 8: Boxplot für Ki-67-LI in % und Nodalstatus (N0-N3)
Abb. 9: Boxplot für Ki-67-LI in % und histopathologisches Grading (G1-G3)
34
4.3.3.
Korrelation der Proliferationsmarker nach Pearson
Korrelation
Repp86
Ki-67
Alter
1,000
0,194
-0,020
0,004
0,774
Signifikanz
Repp86
Ki-67
n
225
221
210
Korrelation
0,194
1.000
0,000
Signifikanz
0,004
n
221
0,990
221
206
Tab. 9: Korrelationsanalyse der Proliferationsmarker und dem Alter bei Diagnosestellung
Die Beziehung zwischen beiden Proliferationsmarkern und dem Patientenalter
wurde durch Bestimmung der jeweiligen Korrelationskoeffizienten nach Pearson
ermittelt (Tab. 9).
Für Repp86 und Ki-67 wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,194 ermittelt.
Damit
zeigte
sich
eine
statistisch
hoch
signifikante
Korrelation
der
Proliferationsmarker mit einem p-Wert von 0,004.
Das Patientenalter und Repp86 zeigten eine gering negative Korrelation
(-0,020), die statistisch nicht signifikant war (p=0,774).
Zwischen
Patientenalter und
Ki-67
war kein
linearer Zusammenhang
nachweisbar (Korrelationskoeffizient 0,000). Auch war statistisch keine
Signifikanz zu ermitteln (p=0,990).
35
4.4.
Prognose
4.4.1.
Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier
Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 3,1 Jahre (Min. 0 Jahre, Max. 10,2
Jahre). Zum Zeitpunkt des letzten Kontaktes waren 117 (52,5%) von 223
Patienten verstorben. Die Todesursache war tumorbedingt in 64 Fällen (28,7%)
und ohne Bezug zur Tumorerkrankung in 53 Fällen (23,8%) (Tab. 10). Die
Überlebensfunktionen des Patientenkollektivs sind für das Gesamtüberleben
sowie das tumorspezifische Überleben in Abb. 10 und 11 dargestellt.
Beobachtungszeitraum in Monaten
0
24
60
Lebend
223 (100,0%)
148 (66,4%)
122 (50,8%)
Tod (alle Ursachen)
0
75
101
Lebend oder Tod
aus and. Urs.achen
223 (100%)
179 (78,4%)
168 (70,6%)
Gesamtüberleben
Tumorbezogenes
Überleben
0
44
55
Tab. 10: Gesamtüberleben des Patientenkollektivs (Fallzahl, Überlebenswahrscheinlichkeit
nach Kaplan-Meier)
4.4.2.
Tod tumorbedingt
Univariate Analyse
In der univariaten Analyse für das tumorspezifische Überleben sowie das
Gesamtüberleben nach Kaplan-Meier wurden Alter (<55 Jahre vs. ≥55 Jahre),
Geschlecht, Tumorgröße (pT-Stadium, pT1-2 vs. pT3-4), Nodalstatus (pNStadium, pN0 vs. pN1-3), histopathologischer Differenzierungsgrad (G1-2 vs.
G3), Repp86-LI (<20% vs. ≥20%) sowie der Ki-67-LI (<30% vs. ≥30%)
betrachtet. Hier zeigte sich für die Parameter Tumorgröße und Nodalstatus ein
signifikanter Zusammenhang zu Gesamtüberleben und tumorspezifischem
Überleben (jew. p<0,001) (Tab. 11). Ein signifikanter Einfluss auf die Prognose
konnte dagegen für die Expressionsindizes von Repp86 noch Ki-67 nicht
nachgewiesen werden.
36
Abb. 10: Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier (krankheitsspezifisches Überleben)
Abb. 11: Überlebensfunktion nach Kaplan-Meier (Gesamtüberleben)
37
4.4.3.
Multivarianzanalyse
Für die Multivarianzanalyse wurde das Cox proportional hazards Modell
herangezogen. Eingeschlossen wurden die Faktoren, die in der univariaten
Schätzung der Überlebenswahrscheinlichkeit statistische Signifikanz erlangt
hatten oder in früheren Studien als prognostisch relevante Faktoren identifiziert
worden waren. Dies waren Alter (<55 Jahre vs. ≥55 Jahre), Geschlecht,
Tumorgröße (pT-Stadium, pT1-2 vs. pT3-4), Nodalstatus (pN-Stadium, pN0 vs.
pN1-3), histopathologischer Differenzierungsgrad (G1-2 vs. G3), Repp86-LI
(<20% vs. ≥ 20%) sowie der Ki-67-LI (<30% vs. ≥30%) (Tab. 12).
Für das tumorbezogene Überleben erlangte allein der Nodalstatus (pN 3 vs.
pN1-2) eine unabhängige prognostische Relevanz (p=0,010) (Tab. 13). Die
Betrachtung bzgl. des Gesamtüberlebens identifizierte Tumorgröße und
Nodalstatus als unabhängige Risikofaktoren (p=0,016 bzw. p=0,014) (Tab. 14).
Weder Repp86- noch Ki-67-LI vermochten einen unabhängigen Einfluss auf die
Prognose zu zeigen.
38
Kovariable
n
OSP, 2J. (SE) OSP, 3 J. (SE) OSP, 5 J. (SE)
Alter
< 55 Jahre
111
69 (4)
67 (5)
57 (5)
≥ 55 Jahre
112
65 (5)
60 (5)
49 (5)
Geschlecht
p-Wert
(Log-rank
Test)
0.21
0.86
männlich
168
67 (4)
63 (4)
52 (4)
weiblich
54
67 (6)
65 (7)
54 (7)
pT
0.001
<3
118
77 (4)
73 (4)
62 (5)
≥3
96
55 (5)
52 (5)
41 (5)
pN
0.001
0
104
81 (4)
78 (4)
64 (5)
≥1
105
53 (5)
49 (5)
40 (5)
Grading
0.07
<3
168
68 (4)
65 (4)
54 (4)
3
37
55 (8)
51 (8)
40 (9)
Repp86-LI
0.32
< 20%
107
64 (5)
61 (5)
50 (5)
≥ 20%
116
70 (4)
66 (4)
55 (5)
Ki-67-LI
0.59
< 30%
114
66 (5)
64 (5)
52 (5)
≥ 30%
105
68 (5)
63 (5)
53 (5)
Gesamt
223
67 (3)
63 (3)
53 (4)
Tab. 11: Univarianzanalyse für das Gesamtüberleben
(OSP, Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit*100 zu den Zeitpunkten 2/ 3/ 5 Jahre nach
Tumorresektion; SE, Standardfehler; LI, Labeling Index)
39
Kovariable
n
OSP, 2J. (SE) OSP, 3 J. (SE) OSP, 5 J. (SE)
Alter
< 55 Jahre
111
79 (4)
79 (4)
70 (5)
≥ 55 Jahre
112
78 (4)
76 (4)
71 (5)
Geschlecht
p-Wert
(Log-rank
Test)
0.96
0.86
männlich
168
79 (3)
78 (3)
70 (3)
weiblich
54
77 (6)
77 (7)
72 (7)
pT
0.003
<3
118
87 (3)
86 (3)
78 (4)
≥3
96
68 (5)
68 (5)
62 (5)
pN
0.001
0
104
91 (3)
91 (4)
82 (4)
≥1
105
66 (5)
65 (5)
60 (5)
Grading
0.29
<3
168
80 (3)
79 (4)
73 (4)
3
37
74 (8)
69 (8)
69 (9)
Repp86-LI
0.58
< 20%
107
78 (4)
77 (5)
68 (5)
≥ 20%
116
79 (4)
76 (4)
70 (5)
Ki-67-LI
0.58
< 30%
114
78 (4)
77 (4)
67 (5)
≥ 30%
105
78 (4)
76 (4)
73 (5)
Gesamt
223
78 (3)
78 (3)
71 (3)
Tab. 12: Univarianzanalyse für das tumorbezogene Überleben
(OSP, Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit*100 zu den Zeitpunkten 2/ 3/ 5 Jahre nach
Tumorresektion; SE, Standardfehler; LI, Labeling Index)
40
Kovariablen
Beta
SE(beta)
p-wert
RR
LCL(RR)
UCL(RR)
Alter
-0,35
0,215
0,10
0,70
0,46
1.07
Geschlecht
0,04
0,26
0,88
1,04
0,63
männl. vs. weibl.
pT
-0,52
0,21
0,02
0,60
0,39
pT<3 vs. pT≥3
pN
-0,55
0.22
0.01
0,58
0,38
pN=0 vs. pN≥1
Grading
-0,26
0,27
0,33
0,77
0,46
G≤2 vs. G>2
Repp86-LI
0,35
0.23
0,12
1,423
0,91
LI≤20% vs. LI>20%
Ki-67-LI
0,10
0,22
0,67
1,10
0,71
LI≤30% vs. LI >30%
Tab. 13: Multivarianzanalyse für das Gesamtüberleben
(Beta: Regressionskoeffizient; SE(beta): Standardfehler von Beta; RR: risk ratio; LCL(RR),
lower 95% confidence limit; UCL(RR), upper 95% confidence limit).
1,73
0,91
0,90
1,30
2,23
1,70
Kovariablen
Beta
SE(beta)
p-wert
RR
LCL(RR)
UCL(RR)
Alter
0,05
0,29
0,87
1,05
0,60
1.83
Geschlecht
-0,25
0,36
0,49
0,78
0,39
1,58
männl. vs. weibl.
pT
0,46
0,29
0,11
1,58
0,90
2,79
pT<3 vs. pT≥3
pN
0,80
0,31
0,01
2,21
1,21
4,06
pN=0 vs. pN≥1
Grading
0,47
0,34
0,17
1,60
0,82
3,12
G≤2 vs. G>2
Repp86-LI
-0,21
0.30
0,48
0,81
0,45
1,45
LI≤20% vs. LI>20%
Ki-67-LI
-0,27
0,31
0,40
0,77
0,42
1,42
LI≤30% vs. LI >30%
Tab. 14: Multivarianzanalyse für das tumorspezifische Überleben
(Beta: Regressionskoeffizient; SE(beta): Standardfehler von Beta; RR: risk ratio; LCL(RR),
lower 95% confidence limit; UCL(RR), upper 95% confidence limit).
41
5.
Diskussion
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Repp86-Expression
keinen
signifikanten
Einfluss
auf
die
Prognose
von
Patienten
mit
Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle hat. Im Gegensatz zu etablierten
Prognosefaktoren,
wie
Tumorausbreitung oder Nodalstatus konnte
die
Erfassung der Fraktion proliferierender Tumorzellen somit nicht zu einer
Abschätzung der Prognose bei am Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle
erkrankten Patienten beitragen.
Dabei ist das nukleäre Ki-67 Antigen mit Expression in den Zellzyklusphasen
G1, S, G2 und M ein etablierter immunhistochemischer Marker, der in der
histopathologischen Routine bei verschiedenen Tumorentitäten zur Erfassung
der Proliferation sowie als prognostischer Marker eingesetzt wird. Beim
Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle wird die prognostische Wertigkeit der Ki67-Expression dagegen unterschiedlich beurteilt (vgl. Tab. 1). In der
vorliegenden Arbeit ergab sich eine mittlere Gesamtexpression von 30,3%
(±17,7%) bei Extremwerten von minimal ca. 5% und maximal 78%. Der
Expressionsindex entspricht dabei den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen.
So betrug der immunhistochemisch ermittelte mittlere LI in einer Kohorte von 60
am Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle erkrankten Patienten 29,7% an der
invasiven Front und 25,6% im Tumorinneren. Die Unterscheidung von
Tumorzentrum und invasiver Front erfolgte dagegen in der vorliegenden Arbeit
nicht. Auch die fehlende prognostische Relevanz der Ki-67-Expression wird
durch die Literatur gestützt. So konnte beispielsweise in Kollektiven mit 329 [5]
und 60 [16] Patienten kein Einfluss der Ki-67-Expression auf Gesamt- bzw.
tumorbezogenes Überleben festgestellt werden. Im Gegensatz dazu finden sich
gleichfalls Arbeiten, die einen signifikanten Zusammenhang von Ki-67Expression und Überleben in den jeweiligen Kollektiven nachwiesen [19,69,84].
Hintergrund der vorliegenden Arbeit war die Überlegung, ob die uneinheitliche
Datenlage zum Zusammenhang von Ki-67 und der Prognose von am
Plattenepithelkarzinom
der
Mundhöhle
erkrankten
Patienten
auf
die
zyklusabhängige Verteilung der Ki-67-Expression zurückzuführen ist. Die
Expression des Ki-67-Antigens erfolgt in den Zellzyklusphasen G1, S, G2 und
42
M. Während die Zyklusphasen S, G2 und M einen konstanten Ablauf
aufweisen, unterliegt die G1-Phase einer hohen zeitlichen Variabilität im
Zeitraum von Stunden bis hin zu Monaten [2,3]. Auch kann die Zelle in G1
verharren, apoptotisch werden oder differenzieren, während die Zellteilung erst
ab dem Übergang der G1- zur S-Phase, dem sog. Restriktionspunkt,
unwiderruflich eingeleitet wird. Da die Zellfraktion in G1 den Zellpopulationen
der anderen Phasen zahlenmäßig überlegen ist, stellt sich die Frage, ob die
proliferative Aktivität durch Erfassung eines in den Phasen G1 bis M
exprimierten Proliferationsmarkers überschätzt wird bzw. ob der Ausschluss der
G1-Zellpopulation einen Vorteil bei der Abschätzung einer Prognose im
Vergleich zur Erfassung der gesamten Wachstumsfraktion darstellt.
Zur Beantwortung dieser Fragestellung bietet sich der Prolifertionsmarker
Repp86 (monoklonaler Antikörper Ki-S2) an, der vom Restriktionspunkt bis zum
Ende der Zytokinese exprimiert wird. Die Anwendbarkeit des im Western Blot
etablierten monoklonalen Antikörpers Ki-S2 in der Immunhistochemie ist in zwei
Studien belegt [32,57]. Dabei war die Darstellbarkeit des Epitops sowohl bei
gefrorenen wie auch bei formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben
nach adäquater Aufbereitung identisch. In dieser Studie wurde mit bis zu zehn
Jahren archiviertem, paraffineingebetteten Tumormaterial gearbeitet und bei
allen Gewebeproben eine auswertbare Färbung erzielt. Die Modifikation von
Andauzeit und Inkubationsdauer beeinflußte ausschließlich die Intensität der
Färbung, nicht jedoch die Anzahl gefärbter Zellkerne. Das ausschließliche
nukleare Auftreten in sowohl kleinen Zellverbänden, als auch diffuser Verteilung
wird in der Literatur bestätigt [35]. In normalem Gewebe zeigt Repp86 das
gleiche Verteilungsmuster wie Ki-67 und Topoisomerase II. Die von Repp86
vermittelte Immunreaktion war in einer Querschnittsuntersuchung an 331
Proben normaler Schleimhaut verschiedenster Lokalisationen strikt auf
prolifierierende Bereiche, z.B. die basalen Kompartimente des Epithels
beschränkt [57]. Diese dienen der Epithelregeneration und unterliegen damit
einem höheren Zellumsatz als die peripheren Anteile des Epithels. In einer
Kohorte
von
371
an
Brustkrebs
Lymphknotenbeteiligung betrug die
mittlere
erkrankten
Frauen
Gesamtexpression
ohne
9%
bei
Einzelexpressionen zwischen 0-29% [56]. Eine ähnliche Expression zeigte sich
in einer Kohorte von 161 Kindern mit Neuroblastom [35]. Der mittlere Repp86-LI
43
betrug
hier
10,2%
bei
Minimal-
bzw.
Maximalwerten
von
0-48%
(Standardabweichung 9,9%).
In der vorliegenden Untersuchung wurde ein mittlerer Repp86-LI von 21,5%
ermittelt (Extremwerte: 0,0-82,0%). Damit ist die mittlere Gesamtpositivität für
Repp86 in der vorliegenden Arbeit im Vergleich zu den angeführten, an
anderen Tumorentitäten erhobenen Daten annährend doppelt so hoch.
Andererseits
bestätigt
das
in
der
vorliegenden
Studie
dokumentierte
Expressionsprofil die Ergebnisse einer zurückliegenden Untersuchung, die die
Repp86-Expression am Plattenepithelkarzinom erstmalig erfasste [21]. Der
Vergleich mit Markierungsindizes etablierter Proliferationsmarker wie Ki-67 oder
Topoisomerase IIα zeigt, dass die Repp86-Expression jeweils konstant geringer
ist [31]. So ergab der Vergleich der Expressionen von Repp86 sowie von Ki-67Antigen und Topoisomerase IIα beim Ovarialkarzinom und Neuroblastom, dass
der mittlere LI für Ki-67 bzw. Topoisomerase IIα um 40-60% höher war, als für
Repp86 [20]. Diese Beobachtung erklärt sich aus den phasenspezifischen
Expressionsprofilen der untersuchten Antigene (S- bis M-Phase vs. G1- bis MPhase) und wird durch die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung
bestätigt. Gleichfalls abgeleitet werden kann die signifikante Korrelation der
Proliferationsmarker untereinander, die in anderen Arbeiten dokumentiert ist
und ebenfalls durch die vorliegende Analyse gestützt wird.
Im Gegensatz zu den vorgelegten Ergebnissen konnte an allen bislang
untersuchten Tumorentitäten eine prognostische Relevanz der Repp86Expression unter Beweis gestellt werden. So wurden die Expressionen von
Repp86, Ki-67 und p27 in einer Kohorte von 356 Frauen mit nodal-negativen
Brusttumoren mit Nachbeobachtungszeiten von durchschnittlich 95 Monaten
untersucht und mit Überlebensdaten korreliert [56, 71]. Bei einem Repp86-LI
kleiner 10% unterschied sich die Lebenserwartung nicht von Frauen gleichen
Alters ohne Brustkrebs. Bei einem LI größer als 10% stieg die Mortalität
dagegen auf das bis zu 20-fache an [56]. In der Multivarianzanalyse verblieb
Repp86-LI als statistisch signifikanter Indikator des Gesamtüberlebens, des
krankheitsspezifischen Überlebens bzw. des krankheitsfreien Überlebens
(p<0,0001) als einziger unabhängiger Prognosefaktor. In einer prospektiven
Untersuchung an 161 Kindern mit Neuroblastomen wurde Repp86 ebenfalls als
wichtiger Prognoseindikator identifiziert. So zeigte ein Repp86-LI von mehr als
44
10%
ein
verkürztes
krankheitsfreies
Intervall
und
eine
steigende
Tumormortalität auf. In der Multivarianzanalyse wurde der Repp86-LI als
wichtigster Faktor bzgl. des krankheitsspezifischen Überlebens ermittelt [35].
Auch
in
Untersuchungen
Endometriumkarzinomen
an
etablierte
Lymphomen,
sich
die
Ovarialkarzinomen
und
Repp86-Expression
als
überlebensrelevanter Prognosefaktor [20]. Diese Daten zeigen, dass der
Erfassung der Repp86-Expression bei den jeweiligen Tumorentitäten eine
zentrale Rolle bei der Identifikation von Risikopatienten zukommt. Beim
Vergleich zu den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchung ist jedoch
hervorzuheben, dass bei allen untersuchten Tumorentitäten auch die
Expression anderer Proliferationsmarker (Ki-67, Topoisomerase IIα) einen
signifikanten Prognoseindikator darstellten, wohingegen die Datenlage beim
Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle als uneinheitlich zu bewerten ist. Bzgl.
des Kollektivs entsprach die Altersverteilung der Patienten mit einem mittleren
Alter von 56,8 Jahren bei Diagnosestellung bisherigen Erhebungen, die in
neueren Untersuchungen einen Altersgipfel von 50-60 Jahren, in älteren
Untersuchungen einen Altersgipfel von 60-70 Jahren aufzeigen [4,42]. Ebenso
spiegelte das Patientenkollektiv die höhere Inzidenz für Männer sowie die
bevorzugte Lokalisationen der Plattenepithelkarzinome an Mundboden und
Zunge wieder [4,42]. Durch ein Selektionsprotokoll wurde der Einschluss auf
Patienten mit Karzinomen des Mundbodens bzw. der Zunge beschränkt und
eine größtmögliche Homogenität im zu untersuchenden Kollektiv erzielt. Die
resultierende Fallzahl war dabei vergleichbar mit der Anzahl der in den
Vergleichsuntersuchungen zur Repp86-Expression eingeschlossenen Patienten
[35,56,76] und den vorliegenden Untersuchungen zur Expression von Ki-67
beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle z.T. deutlich überlegen [21]. Die
retrospektive Datenerhebung muss dagegen als nachteilig gewertet werden und
schränkt die Aussagekraft der vorgelegten Ergebnisse ein. Es sollte folglich die
Fragestellung der prognostischen Wertigkeit der Repp86-Expression in einem
prospektiven Ansatz erneut untersucht und zusätzliche in der vorliegenden
Untersuchung nicht vollständig erhebbare klinische Parameter, wie Ansprechen
auf Strahlentherapie, Rezidivhäufigkeit etc. in die Auswertung einfließen.
45
6.
Literaturverzeichnis
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56
7.
Abb. 12
Anhang
Abb. 13
Abb. 12: Plattenepithelkarzinom, Negativkontrolle, 400x
Abb. 13: Plattenepithelkarzinom, Färbung mit Ki-S5 (Ki-67), 400x
Abb.14
Abb. 15
Abb. 14: Plattenepithelkarzinom, Negativkontrolle, 400x
Abb. 15: Plattenepithelkarzinom, Färbung mit Ki-S2 (Repp86), 400x
57
8.
Danksagung
Mein Dank richtet sich an Herrn Professor Dr. Dr. F. W. Neukam, Direktor der
Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg für die Nutzung modernster Geräte und
Arbeitsmittel im klinikinternen S1-Genlabor.
Herrn Professor Dr. Dr. E. Nkenke, leitender Oberarzt der Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg danke ich für die Vergabe des Themas.
In besonderem Maße möchte ich Herrn Dr. Dr. M. Fenner meinen Dank
aussprechen, der mit großem Engagement dieses Projekt betreut hat. Er war
mir jederzeit ein wertvoller Ansprechpartner.
Frau Dr. rer. nat. Jutta Ries danke ich für die gewissenhafte Einführung in das
Forschungslabor S1 der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
Bei Frau Heidi Haider möchte ich mich für die gewissenhafte Einarbeitung in die
Methoden der Immunhistochemie bedanken. Durch ihre langjährige Erfahrung
auf dem Gebiet der Immunhistochemie von Weichgeweben konnte sie mir
wertvolle praktische Hilfestellung leisten.
Herrn Professor Dr. Dr. R. Parwaresch danke ich für die Bereitstellung der
Antikörper Ki-S2 und Ki-S5.
Ganz besonders danke ich meinen Eltern. Ohne ihre Unterstützung wäre diese
Arbeit nicht möglich gewesen.
58
9.
Lebenslauf
Name:
Philipp Häußinger
Geburtsort:
Aachen
Geburtsdatum: 09.01.1981
Eltern:
Dr. ing. Dr. med. Georg Häußinger, Arbeitsmediziner, Bayreuth
Maria Häußinger, Lehrerin, Bayreuth
Geschwister: Christoph Häußinger
Florian Häußinger
Schulbildung
1987 – 1991
Grundschule, Bayreuth – St. Johannis
1991 – 1992
Hauptschule, Bayreuth – St. Johannis
1992 – 2001
Wirtschaftswissenschaftliches und Naturwissenschaftliches
Gymnasium Bayreuth
2001
Abitur
Zivildienst
2001-2002
Jugendcafé Babylon, Bayreuth
Studium
2002 – 2007
Studium der Zahnmedizin an der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
2004
Naturwissenschaftliche Vorprüfung
2005
Zahnärztliche Vorprüfung
2007
Staatsexamen
28.12.2007
Approbation und Berufsbezeichnung Zahnarzt
2005 – 2007
Durchführung des experimentellen Teils der Dissertation
2008
Vorbereitungsassistent im Kammerbereich ZBV – Oberfranken