Untersuchungen der Mechanismen der RSV

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
1.1 Die Bedeutung von RSV-Infektionen im Säuglingsund Kleinkindesalter
1
1.2 Das Th1/Th2-Paradigma
2
1.3 Dendritische Zellen als Mediatoren der Immunantwort
5
1.4 Transkriptionsfaktoren der Th2-vermittelten Immunantwort
6
1.5 Die Regulation des IL-4-Gens
9
1.6 Fragestellung
11
2. Material und Methoden
12
2.1 Material
12
2.1.1 Geräte
12
2.1.2 Chemikalien
2.1.3 Kits
13
2.1.4 Antikörper
13
2.1.4.1 Antikörper für Western-Blot-Analysen
13
2.1.4.2 Antikörper für durchflußzytomterische Messungen
14
2.1.4.3 Mikrobeads
14
2.1.5 Oligonukleotide
14
2.1.6. Primerpaare für die RT-PCR
16
2.1.7 Puffer, Lösungen und Medien
17
2.1.8 Virusstamm
17
2.1.9 RSV-spezifische Antikörper
17
2.1.10 Sekundäre Antikörper
18
2.2 Methoden
19
2.2.1 Methoden der Wirtszell- und Viruskultivierung
19
2.2.1.1 Zellzucht
19
2.2.1.2 Viruskultivierung
19
2.2.1.3 Bestimmung des Virustiters
19
2.2.2 Anzucht von dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut
2.2.2.1 Isolierung von CBMCs über Ficoll-Gradienten
20
20
2.2.2.2 Sortierung von Stammzellen
21
2.2.2.3 Anzucht der dendritischen Zellen
21
2.2.3 Sortierung von dendritischen Zellen nach CD1a- und CD14negativen Zellen
2.2.4 Isolierung von naiven T-Zellen
21
22
2.2.5 Kokultivierung von stimulierten dendritischen Zellen und
allogenen naiven T-Zellen
22
2.2.6 Molekularbiologische Methoden
23
2.2.6.1 RT-PCR
23
2.2.6.1.1 Isolierung von RNA
23
2.2.6.1.2 Polymerase-Kettenreaktion
23
2.2.6.1.3 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen
25
2.2.7 Darstellung von Proteinen durch Western-Blot
25
2.2.7.1 Isolierung von Kern- und zytoplasmatischen Proteinen
25
2.2.7.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
26
2.2.7.3 Western Blot
27
2.2.7.4 Ponceau-Rot-Färbung
27
2.2.7.5 Immundetektion der transferierten Proteine
28
2.2.8 Gel-Shift-Assay
28
2.2.8.1 Radioaktive Phosphorylierung von Oligonukleotiden
28
2.2.8.2 DNA-Bindungsreaktion
29
2.2.8.3 Elektrophorese der DNA-Protein-Komplexe
29
2.2.9 Zellphysiologische Methoden
30
2.2.9.1 Messung der Proliferation von T-Zellen in vitro
30
2.2.9.2 Messung der Apoptose von T-Zellen in vitro
30
2.2.9.3 Messung der Phagozytoseaktivität
31
2.2.10 Fluoreszenzmikroskopie
31
2.2.10.1 Herstellung der Präparate
31
2.2.10.2 Färben der Präparate
31
2.2.11 Intrazelluläre Zytokinmessung im Durchflußzytometer
32
3. Ergebnisse
33
3.1 Charakterisierung der dendritischen Zellen
33
3.1.1 Einteilung in Subpopulationen anhand von spezifischen
Oberflächenmarkern
33
3.1.2 Phagozytose
34
3.1.3 Nachweis der Infektion von dendritischen Zellen mit RSV
36
3.1.3.1 Nachweis der Infektion in der Gesamtkultur
36
3.1.3.2 Nachweis der Infektion in den einzelnen
Subpopulationen
37
3.1.4 Expression von kostimulatorischen Oberflächenantigenen und
Ausreifungsmarkern nach RSV-Infektion
40
3.1.5 Apoptosemessung von infizierten dendritischen Zellen
44
3.1.6 Zytokine in dendritischen Zellen
45
3.1.6.1 PCR-Analysen
45
3.1.6.2 Ergebnisse aus der Durchflußzytometrie
47
3.2 Kokulturen von dendritischen Zellen und naiven T-Zellen
48
3.2.1 Etablierung eines humanen in-vitro-Modells
48
3.2.2 Zytokinproduktion in T-Zellen nach RSV-Infektion
50
3.2.3 Induktion von IFN-γ
52
3.2.4 Induktion von IFN-γ mit PMA und Ionomycin
53
3.2.5 Proliferation und Apoptose von T-Zellen
54
3.2.6 Nachweis von Zytokinen und Zytokinrezeptoren in Kokulturen
mittels PCR
57
3.2.7 Untersuchung von Transkriptionsfaktoren
61
3.2.8 Aktivität von STAT-Proteinen
64
4. Diskussion
66
4.1. Zelluläre Immunologie der RSV-Infektion
66
4.2 Modulation der Signaltransduktionswege durch RSV
72
5. Zusammenfassung
76
6. Literatur
77
7. Anhang