Aktivierung des NF-κB Signaltransduktionsweges in mononukleären
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Universitätsklinikum Ulm Klinik für Anästhesiologie Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Michael Georgieff Aktivierung des NF-κB Signaltransduktionsweges in mononukleären peripheren Blutzellen elektiv chirurgischer Patienten in Bezug auf den Zytokinspiegel Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Alexandra Grünenwald geboren in Waiblingen 2011 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Uwe Senftleben 2. Berichterstatter: PD Dr. Bernd Mühling Tag der Promotion: 20.04.2012 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III 1 Einleitung 1 1.1 „Systemic Inflammatory Response Syndrom“ und Sepsis 1 1.2 Der Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor kappa B (NF-κB) 3 1.3 Die Rolle von NF-κB im septischen Kontinuum 8 1.4 Zytokine 14 1.5 Zielsetzung und Fragestellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Materialien 19 2.2 Methodik zur NF-κB Bestimmung 20 2.3 Probandenkollektiv und Studiendesign 26 2.4 Blutentnahme 27 2.5 Dokumentation 28 2.6 Zytokinbestimmung 29 2.7 Statistische Auswertung 29 3 Ergebnisse 31 3.1 Kollektivbeschreibung 31 3.2 Verlauf der von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen 33 3.3 Verlauf der Zytokine 46 3.4 Korrelationsanalysen 57 4 Diskussion 61 4.1 Einleitung 61 4.2 Probandenkollektiv 63 4.3 Verlauf der von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen 64 4.4 Verlauf der Zytokine 70 I Inhaltsverzeichnis 4.5 Korrelationsanalysen 75 4.6 Schlussfolgerung und Ausblick 77 5 Zusammenfassung 81 6 Literaturverzeichnis 83 7 Danksagung 97 8 Lebenslauf 98 II Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis AC Arteria Carotis ACCP American College of Chest Physicians ACI Arteria Carotis interna aHT arterielle Hypertonie AK Aktivierungskapazität APACHE Acute Physiology and Chronic Health Evaluation ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome ASA American Society of Anesthesiology (d)ATP (desoxy)Adenosintriphosphat BA Bindungsaktivität BAA Bauchaortenaneurysma BAFF B-cell Activating Factor of the Tumor Necrosis Factor Family BA rel 0 Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 Bcl B-cell Leukemia/Lymphoma Related Protein BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung BSA Bovine Serum Albumin, Rinderserumalbumin ca. circa CD Cluster of Differentiation c-Flip Cellular FLICE-inhibitory Proteins Ci Curie CINC cytokine-induced neutrophil chemoattractant Cl Chlor CO2 Kohlenstoffdioxid Cpm Counts per Minute CRP C-reaktives Protein C-terminal Carboxyl-terminal (d)CTP (desoxy)Cytosintriphosphat DIC Disseminated Intravasal Coagulation DM II Diabetes Mellitus Typ II DNA Desoxyribonucleinacid dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat III Abkürzungsverzeichnis DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraacetat EGTA Ethylenglycoltetraacetat ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay FACS Fluorescens Activated Cell Sorting FADD Fas-associated death domaine protein FCS Fetal Calf Serum FFP Fresh Frozen Plasma g Gramm G-CSF Granulocyte colony stimulating factor gE Erdbeschleunigung (d)GTP (desoxy)Guanosintriphophat h hour, Stunde HCl Hydrochloridsäure, Salzsäure HIV Human Immundeficiency Virus HIV-LTR Human Immundeficiency Virus- Long Terminal Repeat HLP Hyperlipoproteinämie H2O Wasser Ig Immunglobulin I-κB Inhibitor kappa B IKK Inhibitor kappa B Kinase IL Interleukin KCl Kaliumchlorid kDa kilo Dalton KHK Koronare Herzkrankheit l Liter LPS Lipopolysaccharid LT β Lymphotoxin β m Meter m Milli (10-3) M Molar µ Mikro (10-6) MDNCF Monozyten-produzierter neutrophiler chemotaktischer Faktor IV Abkürzungsverzeichnis MI Myokardinfarkt min Minuten mmHg Millimeter Quecksilbersäule MODS Multi Organ Dysfunction Syndrome MOF Multi Organ Failure, Multiorganversagen n Nano (10-9) Na Natrium NaCl Natriumchlorid NAF Neutrophile aktivierender Faktor NAP-1 Neutrophile aktivierendes Protein-1 NEMO NF-κB-essential-Modulator NF-1 Nukleärer Faktor 1 NF-κB Nukleärer Faktor kappa B NF-y Nukleärer Faktor y NIK NF-κB-inducing- kinase NLS Nuclear Localization Signal -OH Hydroxygruppe OP Operation 32 Phosphor, Isotop mit der Massenzahl/Nukleonenzahl 32 P p Piko (10-12) PBS Phosphat Buffered Saline, Pufferlösung PDTC Pyrrolidine Dithiocarbamate PMNCs Peripheral Blood Mononuclear Cells pNPP p-Nitrophenyl Phosphate PNK Polynukleotid Kinase Poly-dIdC Poly-Deoxy Inosinic Deoxycytidylic Acid PSL Photo-Stimulated Luminescence r Signifikanzniveau rSP Spearmans Korrelationskoeffizient Rel Relish (Drosophilahomolog) RHD Rel-Homology Domain (m)RNA (messenger) Ribonucleinacid RPMI Zellkulturmedium SCCM Society of Critical Care Medicine V Abkürzungsverzeichnis SepNet Kompetenznetzwerk Sepsis sICAM1 Intercellular Adhesion Molecule 1 SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome TACE TNF-α converting enzyme TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TEA Thrombendarteriektomie TEMED N;N;N’,N’-Tetramethylethylendiamin TFIID Transkripitonsfaktor II D TLR Toll-like-Receptor TNF Tumor Necrosis Faktor TNF-R Tumor Necrosis Factor-Receptor Tris Tris Puffer, 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (d)TTP (desoxy)Thymidintriphosphat V Volt v.Chr. vor Christus vs. versus z.B. zum Beispiel Z.n. Zustand nach VI Einleitung 1 Einleitung 1.1 „Systemic Inflammatory Response Syndrome“ und Sepsis Schon Hippokrates führte 400 v. Chr. den Begriff der Sepsis ein. Die moderne heute noch gültige Definition der Sepsis prägte 1989 der US-amerikanische Intensivmediziner Roger C. Bone (1941-1997), indem er schrieb: „Sepsis ist definiert als eine Invasion von Mikroorganismen und/oder ihrer Toxine in den Blutstrom zusammen mit der Reaktion des Organismus auf diese Invasion.“ Trotz aller Fortschritte und erheblicher Forschungsanstrengungen in den letzten Jahren stellt die Sepsis noch heute eine Herausforderung an die Medizin dar. Nicht zuletzt, da sie auf Grund ihrer hohen Morbiditäts- und Letalitätsrate eine große klinische und auch sozioökonomische Bedeutung innehat. Dies macht die Notwendigkeit eines inflammatorischen Monitorings deutlich, welches ein Erkennen und eine Verlaufskontrolle von durch Sepsis gefährdeten Patienten erlaubt. Spezifische Marker existieren in dieser Hinsicht noch nicht, sind aber Gegenstand aktuellster Forschung. Vielversprechend erscheint auch der Transkripitonsfaktor Nukleärer Faktor kappa B (NF-κB) als Modulator inflammatorischer Gene bzw. Genprodukte [7]. 1.1.1 Definition von SIRS und Sepsis Das obligate Kriterium zur Definition der Sepsis ist im Gegensatz zum SIRS der Nachweis einer infektiösen Ursache zusätzlich zur systemischen inflammatorischen Antwort des Wirts auf diesen Erreger. Da die Sepsis nicht als isoliertes Krankheitsbild aufgefasst werden kann, sondern ein komplexes klinisches Syndrom ist, bei dem der Übergang von Sepsis über schwere Sepsis zu septischem Schock fließend sein kann, spielen zusätzlich Vitalparameter wie Temperatur, Herzfrequenz, Atemfrequenz, Blutdruck und Laborwerte so wie die Leukozytenanzahl eine wichtige Rolle in der Abstufung des Schweregrades. Allerdings erlauben auch diese Parameter keine präzise Einteilung oder Prognostik, da das klinische Bild der Sepsis eine zu weite Variabilität aufweist [95]. Die aktuelle Definition und die darauf basierenden Leitlinien wurden 1991 von der Konsensus- Konferenz des „American College of Chest Physicians“ und der 1 Einleitung „Society of Critical Care Medicine“ (ACCP / SCCM 1992) [2] herausgegeben. Im Rahmen der „International Sepsis Definition Conference“ 2001 wurde lediglich eine Erweiterung von Symptomen bei Beibehaltung der Grunddefinition vorgenommen. 2008 wurden aktuelle internationale Behandlungsleitlinien der „Surviving Sepsis Campaign“ von Dellinger et al. veröffentlicht [49]. 1.1.2 Pathophysiologie von SIRS und Sepsis Ursächlich für das Entstehen der Sepsis ist das Zusammenspiel der Infektion und der Reaktion des Immunsystems darauf. Dabei ist nicht die initiale Infektion selbst maßgeblich für die Schwere und limitierende Prognose der Sepsis, sondern die unbalancierte Reaktion des menschlichen Körpers [140]. Ursprünglich ging man von einer Hyperreaktion proinflammatorischer Mediatoren aus, die ursächlich für die klinische Symptomatik der Sepsis sind [119]. Auf Grund fehlender Erfolge antiinflammatorischer Therapieansätze in klinischen Studien ist man mittlerweile von dieser Theorie abgekommen [13, 117]. Vielmehr geht man heute davon aus, dass die Immunantwort auf die Sepsis biphasisch verläuft. Auf eine initiale proinflammatorische Phase folgt stetig eine ausgedehnte Phase der Immunsuppression. Auch ein Pendeln zwischen pro- und antiinflammatorischem Zustand ist durchaus möglich. Zytokine sind hierbei die verantwortlichen Mediatoren [40, 82, 94]. Doch nicht nur die inflammatorische Überreaktion des Immunsystems, in deren Rahmen es natürlich auch zur Aktivierung aller immunkompetenten Zellen kommt, spielt bei der schweren Sepsis eine Rolle. Im Rahmen des „Systemic Inflammatory Response Syndrome“ (SIRS) wird durch die freigesetzten Mediatoren und Toxine der infektiösen Mikroorganismen eine komplexe Homöostasestörung ausgelöst, die klinisch in Organversagen resultiert [14, 140, 141]. 1.1.3 Epidemiologie und Kosten der Sepsis im deutschen Krankenhauswesen In den Jahren 2003 und 2004 wurden insgesamt 3877 Intensivpatienten in eine prospektive, querschnittliche, multizentrische, 2 epidemiologische Einleitung Beobachtungsstudie des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Kompetenznetzwerkes Sepsis (SepNet) eingeschlossen. Unter Berufung auf die Kriterien der ACCP/SCCM Konsensus-Konferenz als diagnostisches Hilfsmittel stellt sich die Sepsis als siebthäufigste Krankenhausentlassdiagnose unter den lebensbedrohlichen Erkrankungen dar. Die Prävalenz für Sepsis auf Intensivstationen belief sich dabei auf 12%, für schwere Sepsis und septischen Schock auf 11% [53]. Mit ca. 60.000 Todesfällen pro Jahr stellen septische Erkrankungen somit die dritthäufigste Todesursache gleich nach Koronaren Herzkrankheiten und akutem Myokardinfarkt dar. Nach dem Vergleich mit den bisherigen Zahlen des Statistischen Bundesamts zeigt sich, dass sowohl Häufigkeit als auch Sterblichkeit der Sepsis um den Faktor 4 bzw. 10 unterschätzt wurden, da von Krankenhäusern oftmals ungenaue Angaben im Hinblick auf die Todesursache gemacht werden. Die direkten anteiligen Kosten (Medikation, Routinelabor, Mikrobiologie, Einmalartikel, Unterkunft, Personal), die alleine für die intensivmedizinische Behandlung von Patienten mit schwerer Sepsis anfallen, liegen bei ca. 1,77 Milliarden Euro. Damit werden ca. 30% des Budgets für Intensivmedizin in die Behandlung der schweren Sepsis investiert. Die indirekten Kosten, welche durch Produktivitätsverlust, Arbeitsausfall oder vorzeitige Verrentung entstehen, werden auf weitere ca. 4,5 Milliarden Euro geschätzt, so dass von Gesamtkosten in Höhe von ca. 6,3 Milliarden Euro auszugehen ist, welche durch die schwere Sepsis in Deutschland verursacht werden [30]. 1.2 Der Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor kappa B (NF-κB) Im Rahmen der Sepsisforschung spielt die Aufklärung von zellulären Signalkaskaden, die eine systemische Entzündungsreaktion induzieren, eine große Rolle. Auslösende Faktoren dieser spezifisch aktivierbaren, molekularen Mechanismen sind meist extrazelluläre Stresssignale, wie sie im Rahmen von Ischämie/Reperfusion und oxidativem Stress auftreten. Ob sich die Aktivierung dieser Signalsysteme allerdings protektiv auswirkt oder permissiv das Fortschreiten der pathologischen Vorgänge unterstützt, ist unklar. Eine besonders herausragende Signaltransduktionskaskade im inflammatorischen 3 Einleitung Geschehen stellt der NF-κB Signalweg dar. 1.2.1 Physiologische Bedeutung von NF-κB Der eukaryotische Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor κB wurde 1986 von Sen und Baltimore als Protein entdeckt, das an eine spezifische DNA- Sequenz im Enhancer des Gen für die κ-Leichtkette der Immunglobuline in reifen B- und Plasmazellen, nicht aber in deren Vorstufen bindet [123]. Ursprünglich angesehen als B-Zell spezifischer Transkriptionsfaktor [18] wurde schnell erkannt, dass NF-κB in fast jedem Zelltyp in inaktiviertem Zustand vorliegt und als Regulator der Genexpression dient [124]. Die NF-κB Familie der Transkriptionsfaktoren ist als pluripotenter Aktivierungsfaktor hauptsächlich in die zelluläre Antwort auf stressinduzierte, immunologische und entzündliche Stimuli involviert [51]. NF-κB wird rasch durch ein weites Spektrum an diversen chemikalischen Agenzien und zellulärem Stress wie z. B. LPS, Zytokinen wie TNF-α und IL-1, bakteriellen und viralen Pathogenen und Wachstumsfaktoren, ionisierender Strahlung [74] und in einigen Zellen auch durch oxidativen Stress aktiviert [96]. Die bedeutendste Rolle spielt NF-κB wohl im Immunsystem [75]. Die Mitglieder der NF-κB Familie kontrollieren sowohl die Transkription von Zytokinen und antimikrobiellen Effektoren als auch die Regulation von Differenzierung, Überleben und Proliferation von Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems. NF-κB trägt zur Entwicklung und dem Überleben von Zellen und Geweben bei, die bei der Immunantwort im Säugetier mitwirken [76, 77]. Die relevanten Funktionen von NF-κB sind allerdings nicht auf das Immunsystem beschränkt. NF-κB dient auch dem Schutz vor Apoptose und unterstützt die Erneuerung bzw. das Fortschreiten des Zellzyklus [74, 87]. Auch scheint die NF-κB Familie in die Formierung neuronaler Synapsen und beim Voranschreiten von Neoplasmen einbezogen [51]. 1.2.2 Die Struktur von NF-κB Der nukleäre Faktor kappa B besteht aus einer Gruppe strukturverwandter und evolutionär konservierter Proteine, die dimerisiert als Trankskriptionsfaktor wirken 4 Einleitung [18] und an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt sind [23]. Fünf davon kommen in Säugetieren vor und können in zwei verschiedene Klassen eingeteilt werden. Zur einen gehören Rel (c-Rel), RelA (p65) und RelB, als ausgereifte und von vornherein transkriptionsaktive Proteine, die keinen proteolytischen Prozess mehr benötigen. Sie enthalten am C-terminalen Ende der „Rel-Homology Domain“ (RHD) eine potente Transaktivierungsdomäne [120]. Zur anderen Klasse werden NF-κB1 (p50 und sein Vorläufer p105) und NF-κB2 (p52 und dessen Vorläuferprotein p100) gezählt, die als Vorläuferproteine synthetisiert werden und zum fertigen Protein noch eine proteolytische Prozessierung benötigen [23, 62, 87]. Diese Proteine regulieren die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Adhäsionsmolekülen und antimikrobiellen Peptiden und manipulieren sowohl die angeborene als auch die erworbene Immunantwort [51, 63]. NF-κB und Rel-Proteine können sowohl als Homo- als auch als Heterodimer vorkommen [62, 63]. NF-κB und Rel-Proteinen gemeinsam ist eine 300 aminosäurelange, hoch konservierte N-terminale „Rel-Homology Domain“. Diese ist verantwortlich für die Bindung an die DNA, die Dimerisation und die Bindung an eine Gruppe von Inhibitorproteinen, genannt I-κB, mit denen alle NF-κB Proteine interagieren können [18, 148]. Eine weitere Komponente der RHD ist eine kurze Abfolge von Aminosäuren, die das „Nuclear Localization Signal“ (NHL) formen. Dieses NHL ist nahe des C-terminalen Endes der RHD lokalisiert und ist bei der Translokation von NF-κB Dimeren vom Cytoplasma in den Zellkern von enormer Bedeutung [21]. Die Dimere der NF-κB Transkriptionsfaktoren binden an 9 oder 10 Basenpaare lange DNA-Regionen, die sogenannten „κB-sites“ [91, 112], die eine sehr hohe Variabilität besitzen [64]. Zu den bestbeschriebensten DNA-Zielen von NF-κB gehören die „κB-sites“ der Gene für κ-Leichtkette und „HIV-LTR“ (Human Immunodeficiency Virus – Long Terminal Repeat) der Immunglobuline sowie das Gen für Interferon β [116]. 1.2.3 Regulation Da NF-κB, unabhängig von der de-novo-Proteinsynthese, schon in der Zelle vorbesteht, kann es unwahrscheinlich schnell induziert werden. [124] Die Aktivität von NF-κB ist durch die Interaktion mit den verschiedenen 5 Einleitung Inhibitorproteinen I-κB (α, β, γ, ε, Bcl-3 oder ζ, p100, p105) strikt reguliert. Es zeigte sich, dass vor allem I-κB α vielfach mit NF-κB interagiert [35]. Alle bekannten I-κB Proteine enthalten eine Vielzahl von Kopien von 30-33 Aminosäurensequenzen, die „ankyrin repeats“ genannt werden. Die spezifische Interaktion zwischen diesen „ankyrin repeats“ und der „RHD“ ist ausschlaggebend für die Bindung von I-κB und NF-κB. Durch diese Bindung maskieren die I-κB Moleküle das „NLS“ an NF-κB und verhindert so die Translokation in den Zellkern [102]. Aktiviertes NF-κB kann aber auch durch multiple Mechanismen wieder herunterreguliert werden. Zu diesen Mechanismen zählt unter anderem der gut erforschte „feedback pathway“, bei dem neu synthetisiertes I-κB α an das nukleäre NF-κB bindet und dieses wieder ins Zytosol exportiert [75]. 1.2.4 Signalwege In vitro wurde der Ablauf der NF-κB Signaltransduktionskaskaden bereits weitestgehend untersucht und verstanden. Mittlerweile sind drei verschiedene Signalkaskaden bekannt. Am gemeinsamen Beginn aller drei Kaskaden steht die Aktivierung einer InhibitorκB Kinase Komplex (IKK) genannten Serinkinase. Dieser Komplex besteht aus einer katalytischen Kinase-Untereinheit (IKK α und/oder β) und einem Gerüstprotein, dem sogenannten „NF-κB essential modulator“ (NEMO), der regulatorischen Untereinheit [63]. Die Aktivierung der NF-κB Dimere geschieht durch eine IKK-vermittelte und durch Phosphorylierung induzierte Degradation des I-κB Inhibitors. In Abhängigkeit der Potenz des Aktivators kann dies innerhalb von Minuten passieren [85, 86]. Nun ist es den NF-κB Dimeren möglich, in den Kern zu wandern und dort die spezifische Genexpression zu aktivieren [80, 81]. Zur Aktivierung des am längsten bekannten Klassischen oder auch Kanonischen Signalwegs bindet einer der oben beschriebenen Liganden an TNF-α – oder „Tolllike“-Rezeptoren (TLR), vor allem TLR 2 und TLR 4 [7]. Diese Kaskade ist vor allem für das angeborene Immunsystem essentiell [63]. Der Alternative Signalweg hingegen, der erst seit kürzerer Zeit bekannt ist, spielt vor allem eine Rolle bei der Entwicklung von lymphatischen Organen, spezifischer Keimzentren und der Reifung von B-Zellen [125]. Hier aktiviert die Bindung an 6 Einleitung Lymphotoxin B (LT β), „B-cell activating factor“ (BAFF) und CD40 Rezeptoren die „NF-κB-inducing- Kinase“ (NIK). Ein dritter Signalweg, bei dem NF-κB Homodimere im Zellkern durch Interaktion mit dem I-κB ähnlichen Coaktivator Bcl-3 zur Aktivierung der Transkription führen, ist bekannt. Die Regulation dieser dritten Kaskade ist allerdings noch nicht geklärt und Gegenstand aktueller Forschung [64]. 1.2.5 NF-κB Aktivitätsbestimmung Von verschiedenen Wissenschaftlern wurden unterschiedliche Nachweisverfahren zur NF-κB Aktivitätsmessung angewandt. Zum Beispiel wurde von Cuzzocrea et al. ein indirekter Nachweis durch Bestimmung der I-κB Proteine, die parallel zur NF-κB Aktivierung abgebaut werden, genutzt [42]. Blackwell hingegen benutzte 2000 einen sogenannten „Reporter Assay“ als ebenfalls indirekte Nachweismethode zur NF-κB Aktivitätsbestimmung [27]. Hierdurch wird deutlich, dass die Vergleichbarkeit der einzelnen Studien untereinander durch die sehr unterschiedlichen Bestimmungsmethoden extrem erschwert ist. Als Goldstandard zur Bestimmung der NF-κB Aktivität kann der „Electrophoretic Mobility Shift Assay“ (EMSA) angesehen werden. Zwar ist das EMSA-Verfahren komplex, radioaktiv und zeitraubend, allerdings bietet es die Möglichkeit, die einzelnen NF-κB Proteine direkt nachzuweisen und zu bestimmen. Ein Nachteil des Verfahrens liegt aber darin, dass mit dem EMSA-Verfahren nur semiquantitative Aussagen gemacht werden können. Der EMSA wurde auch in der vorliegenden Studie angewandt, nachdem in einer vorangehenden Dissertation die Kombination des EMSA mit einer qualitativen Bestimmungsmethode gelang [41]. In der vorliegenden Studie wurde als Referenz- und Standardgröße zusätzlich zu NF-κB die Aktivität des Nukleären Faktors Y (NF-Y) bestimmt. Der Nukleäre Faktor Y ist ein heterotrimerer Transkriptionsfaktor, der am reichlichsten und häufigsten in eukaryoten Zellen vorkommt. NF-Y ist essentiell für das Überleben und die Proliferation der Säugetierzellen [24]. In den Zellen von Säugetieren ist NF-Y ubiquitär und konstitutiv vorhanden und somit besonders geeignet, um im Verhältnis zu NF-κB als „transkriptive 7 Einleitung Grundaktivität“ zu fungieren. Zudem dient NF-Y der Regulation von zahlreichen Genen. Die Untereinheiten NF-YA, NF-YB und NF-YC bilden einen trimeren Komplex, der zur spezifischen Erkennung der CCAAT-Box dient, die im Promoter von vielen Genen lokalisiert ist [104, 131, 133]. Abhängig von seinen Cofaktoren wirkt NF-Y sowohl als Aktivator als auch als Repressor. Allerdings lässt sich die Grundaktivität von NF-Y nicht durch äußere Faktoren induzieren, was sie als perfekte Ladungskontrolle erscheinen lässt und NF-Y so vielfach als Vergleichsmolekül für verschiedenste Untersuchungen herangezogen wird. 1.3 Die Rolle von NF-κB im septischen Kontinuum 1.3.1 NF-κB und SIRS/Sepsis Der transkriptionssteuernde Faktor NF-κB spielt eine zentrale Rolle in der Modulation immunregulierender Mediatoren, die an der akuten Entzündungsreaktion beteiligt sind [7]. In den letzen Jahren zeigte sich, dass NF-κB eine zentrale Rolle in der Regulation der Gene spielt, die für die Produktion von Mediatoren zur Induktion lokaler oder systemischer Inflammation ebenso wie für den zirkulatorischen Schock verantwortlich sind und das einige Zytokine unter der Regulation von NF-κB im septischen Patienten eine hyperinflammatorische Wirkung haben [127]. Hierbei stehen zwei Mechanismen im Vordergrund. Vor allem in der Frühphase von Entzündungsreaktionen unterhält NF-κB über positive Rückkopplungsmechanismen die Transkription proinflammatorischer Gene, die die Inflammation unterhalten bzw. weiter aufschaukeln können. Zusätzlich bewirkt es durch Transkription von antiapoptotischen Genen eine Verlängerung der Lebensspanne von bestimmten Zellpopulationen wie neutrophilen Granulozyten, die selbst proinflammatorische Mediatoren produzieren und somit ebenfalls die Entzündung unterhalten [5, 143]. Sepsis führt ebenfalls zu extensiver Lymphozytenapoptose und somit zu Immunsuppression und Tod. Der klassische NF-κB Signalweg verhindert jedoch die TNF-α induzierte Lymphozytenapoptose [67]. Allerdings konnte im Gegensatz dazu auch gezeigt werden, dass eine reguläre Aktivität von NF-κB notwendig ist, um einen Entzündungsprozess aufzulösen. 8 Einleitung Hierbei wirkt NF-κB repressiv auf proinflammatorische Zielgene und eine Hemmung des Nukleären Faktors wäre gleichbedeutend mit einer verzögerten Auflösung der Entzündung und langsameren Gewebeheilung [93]. 1.3.2 Referenzstudien Durch vielfache Studien an Tieren wurde deutlich, dass durch oxidativen Stress auf zellulärer Ebene, wie er bei Ischämie/Reperfusion, Endotoxinämie oder Bakteriämie entsteht, das IKK/ NF-κB –System aktiviert wird [27, 88, 130, 139]. Zudem kristallisierte sich ebenfalls im Tiermodell ein deutlicher Zusammenhang zwischen der NF-κB Aktivierung und Sepsis, ARDS und MOF heraus [4, 15, 65, 129, 145]. Eine gewisse Zweischneidigkeit von NF-κB zeigte sich 2001, als Lawrence et al. demonstrierten, dass die reguläre Aktivität von NF-κB nötig ist, um den Entzündungsprozess bei Pleuritis im Rattenmodell aufzulösen. Die Inhibition von NF-κB würde hier zu verlängerter Inflammation führen. Vor allem p50 Homodimere waren zu finden, die eine repressive Wirkung auf die proinflammatorischen Gene haben [93]. Chen et al. unterstrichen 2003 ebenfalls eine der Doppelfunktionen von NF-κB, indem sie auf der einen Seite die antiapoptotische Wirkung und den damit verbundenen erhöhten Schutz vor Gewebezerstörung hervorhoben, auf der anderen Seite aber auch an die proinflammatorische Wirkung von NF-κB bei der Erhaltung systemischer Entzündungen erinnerten [36]. Die Schlussfolgerung daraus gebietet höchste Vorsicht bei Einsatz von IKK und NF-κB Inhibitoren, da damit zwangsläufig eine Gewebezerstörung einhergeht. Ist die Supprimierung der Aktivität von NF-κB einerseits mit erhöhter bakterieller Belastung im Mäusesepsismodell verbunden [65], kann sie andererseits, abhängig vom verwendeten Tiermodell, auch die Mortalität senken. Problematisch wird, wie oft, allerdings die Extrapolation der Ergebnisse aus dem Tiermodell auf den Menschen [3, 37]. Patientenstudien sind hier die naheliegendste Folge. Schon 1997 zeigte Böhrer et al. mit einer Studie an 15 Sepsispatienten, dass die NF-κB Bindungsaktivität in mononukleären Zellen positiv mit der Mortalität korreliert. Die aus peripheren mononukleären 9 Blutzellen gewonnenen Einleitung Patientenproben wurden mit EMSA ausgewertet. Zudem korrelierte die NF-κB Bindungsaktivität mit dem APACHE II Score, einem intensivmedizinischem Punktesystem zur Vorhersage des Outcome [28]. Im gleichen Jahr wurde die intraoperative Aktivierung von neutrophilen Granulozyten bei Patienten mit thorakoabdominalem Aortenaneurysma untersucht und festgestellt, dass diese einen prädiktiven Marker für die Entwicklung postoperativer Komplikationen darstellt [57]. Arnalich et al. versuchten 2000 aus der kombinierten Messung von Zytokinen und der NF-κB Aktivität einen prognostischen Vorhersagewert im Hinblick auf das Outcome von Patienten mit schwerer Sepsis zu finden. Es stellte sich ähnlich wie bei Böhrer heraus, dass die Nichtüberlebenden eine signifikant höhere NF-κB Aktivierung aufwiesen. Zusätzlich war der IL-6 Serumspiegel bei den nichtüberlebenden Patienten deutlicher erhöht als bei den Patienten, die sich wieder erholten [17]. Paterson et al. bestätigten dies anhand von SIRS-Patienten. Ein deutlicher NF-κB Aktivitätsanstieg konnte in peripheren mononukleären Zellen vor dem Tod verzeichnet werden. Patienten, bei denen zwar eine erhöhte, aber konstant bleibende Aktivität des Nukleären Faktors gemessen wurde, überlebten über einen Zeitraum von 96 Stunden hinaus. Ganz ähnlich wie bei Arnalich et al. zeigten auch die Zytokinkonzentrationen von IL-6, IL-8 und sICAM1 keine Korrelation zur Aktivität von NF-κB [114]. Mit dem Hintergrundwissen um die Inhibierung der Apoptose von neutrophilen Zellen durch systemische Inflammation und der Unterhaltung von Multiorganversagen stellten Nolan et al. 2000 die Hypothese auf, dass schwere Traumen ebenfalls zu einer Dysregulation des Zelltods neutrophiler Zellen führen. Neutrophile Granulozyten von Traumapatienten wurden mit denen gesunder Probanden verglichen und die Apoptose mittels ELISA sowie die NF-κB Aktivität mittels Westernblot registriert. Tatsächlich konnte eine NF-κB abhängige Inhibition von neutrophilen Granulozyten bei Traumapatienten nachgewiesen werden. Zudem gelang es bei einer Vorbehandlung mit dem Antioxidans Pyrrolidindithiocarbamat, die Inhibition der Granulozytenapoptose zu blockieren [109]. Ähnlich hierzu, ebenfalls im Sinne einer Immunparalyse, ist eine Studie von AdibConquy. Sie zeigten, dass mononukleäre Zellen des peripheren Blutes von 10 Einleitung Patienten mit schwerer Sepsis in vitro häufig eine verminderte Reaktion auf Stimuli (z.B. LPS) aufweisen [9], was einer Endotoxintoleranz durchaus ähnelt [103]. Man fand heraus, dass NF-κB-verwandte Signalwege bei der Entstehung der Endotoxintoleranz involviert sind. [29]. Bei allen Patienten mit schwerer Sepsis und großem Trauma war p65/p50 die aktive Form von NF-κB, reduziert im Vergleich zur Kontrollgruppe. Für die verminderte NF-κB Expression konnte nicht die Inhibition durch I-κB α verantwortlich gemacht werden, da die I-κB α Expression ebenso niedrig war wie p50 und p65. Interessanterweise war p50/p50, die inhibitorische Form von NF-κB, bei Überlebenden und bei Patienten mit Trauma reduziert. Die hier folgende in vitro Stimulation mit LPS induzierte keine weitere NF-κB Translokation. Bei Nichtüberlebenden zeigten sich im Vergleich große Mengen an inaktiven p50/p50 Homodimeren. Beides ähnelt Studien, die Toleranzen hinsichtlich LPS untersucht haben [9]. Diese Hyporeaktivität des Immunsystems untersuchten Adib-Conquy et al. ein Jahr später nochmals und konnten feststellen, dass es sich hierbei nicht um einen generellen Effekt handelt, sondern vom aktivierenden Agens abhängt [10]. Foulds et al. untersuchten 2001 die NF-κB Expression in Zusammenhang mit postoperativer Organdysfunktion nach großen chirurgischen Eingriffen. Diese Studie kommt der hier vorliegenden in der Intention, ein molekulares Ziel für die NF-κB Modulation zur postoperativen Prävention von MODS zu finden, wohl am nächsten. Ebenfalls wurden die Patienten einem großen chirurgischen Trauma, nämlich einer thorakoabdominalen Aortenaneurysmaoperation ausgesetzt. Im Gegensatz zu klinischen Parametern ließ sich bei Patienten, die anschließend ein Multiorganversagen entwickelten, präoperativ eine signifikant höhere NF-κB Konzentration nachweisen als bei den postoperativ unauffälligen Patienten. Anders als bei den meisten anderen Studien ermittelte Foulds das NF-κB Profil dieser Studie durch FACS Analyse [59]. Im Großen und Ganzen fassen diese Studien zusammen, dass es durchaus berechtigten Grund zu der Annahme gibt, dass das Ausmaß der NF-κB Aktivierung bei Patienten mit SIRS und Sepsis einen prädiktiven Aussagewert für deren weiteren Genesungs- oder Krankheitsweg besitzt. Andere aktuellere Studien wandten sich dem Aktivierungsmuster von neutrophilen Granulozyten zu. Yang et al. zeigte 2003, dass eine frühe Veränderung im 11 Einleitung Aktivierungsmuster und zum Teil auch die Fähigkeit der Zellen, NF-κB nach relevantem Stimulus im Kern zu akkumulieren, zum weiteren klinischen Verlauf beiträgt [6, 147]. Worin genau der Unterschied der neutrophilen Granulozyten besteht, bleibt allerdings noch zu klären. Eine der aktuelleren Studien von 2006 konzentriert ihr Augenmerk auf die Reaktion neutrophiler Granulozyten und einer möglichen Assoziation mit dem Verlauf einer durch LPS induzierten Inflammation der Lunge. Tatsächlich konnte ein stabiles Antwortmuster der Granulozyten auf LPS nachgewiesen werden, das ebenfalls mit der Entzündungsreaktion korrelierte, die eine direkte LPS-Stimulation der Lunge auslöste. Laut Studie ließen sich diese Antwortmuster mit ganz bestimmten Phänotypen der neutrophilen Granulozyten in Verbindung bringen. Somit liegt der Schluss nahe, dass auch andere proinflammatorische Phänotypen Mediatoren zeigen könnten ähnliche und Verbindungen das zu klinische neutrophilen Outcome einer Entzündungsreaktion vom zugrunde liegenden Zellprofil abhängt [8]. Zusammenfassend fällt die Variabilität der Studien sowohl in der Methodik als auch in Fallzahlen und statistischen Verfahren auf. Aussagekräftige Vergleiche können somit schwer gezogen werden. Ein erster Schritt wäre eine Standardisierung der Bestimmung der NF-κB Aktivität. Nachdem sich eine vorangegangene Dissertation mit der Evaluation der Methodik beschäftigt hat, soll sich diese Arbeit nun mit ähnlichen, oben beschriebenen Untersuchungen beschäftigen. 1.3.3 Therapieansätze Vor dem Hintergrund der Bedeutung von NF-κB und seiner deutlich proinflammatorischen Rolle bei Entzündungsgeschehen und Sepsis liegt die Intention nahe, eine therapeutische Option zu entwickeln, die in dieses Geschehen eingreift. Wünschenswert wäre eine spezifische pharmakologische Blockade, welche die NF-κB Signalkaskade in ihrer Wirkung auf die Transkription proinflammatorischer Gene hemmt und somit Organdysfunktion und Mortalität senkt. Erste Ansätze in dieser Hinsicht wurden bereits mehrfach an Tieren studiert [98]. So zeigt zum Beispiel Christman 1998 im präklinischen Modell, dass die Blockade 12 Einleitung von NF-κB ausgehend davon, dass NF-κB Aktivierung zur Organdysfunktion und Zelluntergang beiträgt, die Überlebenswahrscheinlichkeit verbessert [37]. Vielversprechend klang auch eine Studie von Sawa et al. bei der per Gentransfer die NF-κB Bindungsstelle im Kern geblockt wurde und somit eine erhöhte Ischämie/Reperfusions- Toleranz des Myokards bei Ratten erreicht werden konnte [121]. 2003 konnte durch spezifischen Einsatz eines I-κB-α –Inhibitors der Gewebeschaden nach Ischämie/Reperfusions- Trauma ebenfalls geringer gehalten werden [149]. Fidan et al. zeigten, dass der beste Zeitpunkt für eine NF-κB Inhibiton zur Senkung von Mortalität und Verbesserung der histopathologischen Variablen direkt nach dem Einsetzen der Sepsis ist [54]. Eine ganz spezifische und viel erforschte Form zur NF-κB Inhibiton stellen Antioxidantien dar. NF-κB muss im Nucleus in reduzierter Form vorliegen, um seine Wirkung auszuüben, und ist in dieser Hinsicht von Thioredoxinen abhängig [55]. Dies wiederum erklärt die inhibitorische Wirkung von Antioxidantien auf die NF-κB Aktivität. In diesem Sinne wiesen Blackwell et al. nach, dass nach einer Behandlung von Ratten mit dem Antioxidans N-Acetylcystein die durch Endotoxin stimulierte NF-κB Aktivität signifikant gesenkt wird [26]. Ebenfalls am Rattenmodell wurden vergleichbare Dithiocarbamat (PDTC) Ergebnisse sowie mit Vitamin den E Antioxidanten Analogon IRFI-042 Pyrrolidine und dem Calcineurininhibitor Tacrolimus erzielt [11, 12, 97]. Im Mausmodell wurde die Rolle von NF-κB bei Reperfusion nach Darmischämie untersucht. Hierbei läuft die NF-κB Aktivierung IKK-β vermittelt ab und führt zu einer inflammatorischen Reaktion und ödematösen Veränderungen in der Darmmukosa und auch zur Produktion von TNF-α, was wiederum zu SIRS führen kann. Durch selektive Inhibition von IKK-β konnte zwar SIRS verhindert werden, allerdings nur auf Kosten massiver Nekrotisierung [36]. Dies macht deutlich, dass die Blockade von NF-κB zwar als viel versprechend gehandelt wird, allerdings im Hinblick auf die zweischneidige Funktion von NF-κB Nebeneffekte nicht in den Hintergrund gestellt werden dürften. Immerhin spielt NFκB eine bedeutende Rolle in der normalen Immunabwehr und eine Blockade könnte unabsehbar schwere immunsuppressive Folgen haben. Daher ist eine Modulation als therapeutischer Ansatzpunkt eher denkbar als eine komplette Blockade. Um dies zu ermöglichen, muss allerdings an vorderster Stelle 13 Einleitung eine standardisierte Messmethode zur Bestimmung der NF-κB Aktivität gewährleistet sein. 1.4 Zytokine 1.4.1 Tumornekrosefaktor alpha und die Signaltransduktion via TNFRezeptoren Das Zytokin TNF-α ist ein äußerst potenter Aktivator des NF-κB Signalwegs und nimmt eine enorm wichtige Rolle bei lokaler und systemischer Inflammation ein. 1975 wurde TNF-α von Carswell et al. als ein aus Makrophagen freigesetzter Faktor beschrieben, der im Mausmodell Tumornekrose von transplantierten Tumoren auslöste [31]. Im Zusammenhang mit dem NF-κB Signalweg wird über die Freisetzung des Nukleären Faktors ein negativer Rückkopplungsmechanismus, c-Flip, aktiviert, der den Zelltod unterdrückt [47]. Der Klassische Weg der NF-κB Aktivierung wird essentiell benötigt, um TLymphozyten vor einer TNF-α induzierten Apoptose zu schützen [67, 126]. Die antiapoptotische Wirkung von NF-κB ist also direkt mit TNF-α verknüpft [87, 106]. Im Gegensatz dazu wird der Zelltod ausgelöst, indem Procaspasen und „Fasassociated death domaine protein“ (FADD) aktiviert werden und somit eine apoptotische Signalkaskade angestoßen wird [142]. Zusammenfassend ist TNF-α im Hinblick auf Entzündungsvorgänge, Sepsis und Multiorganversagen ein bedeutender Mitspieler im Immunsystem [78]. 1.4.2 Interleukin-6 Interleukin 6 (IL-6) galt lange vor allem als Aktivator der Akut-Phase-Reaktion und als Stimulator von Lymphozyten. IL-6 wird in Monocyten/Makrophagen und in Nicht-Immunzellen (z.B. Endothelzellen) gebildet. Es stimuliert die Leberzellen zur Produktion der Akut-Phase-Proteine und ist damit Initiator des CRP-Anstiegs. Allerdings kommt IL-6 durch die Art seiner komplexen Regelung und Funktionen in dem Orchester der anderen Zytokine noch eine andere Stellung zu. IL-6 scheint einen entscheidenden Anteil am Übergang von Mechanismen der angeborenen 14 Einleitung Immunität hin zu Mechanismen der erworbenen Immunität innerhalb des Entzündungsprozesses zu haben [84]. 1.4.3 Interleukin-8 Ein weiteres Mitglied der Zytokinfamilie ist Interleukin-8 (IL-8). Es wurde 1987 als neues Zytokin entdeckt und stellt ein nicht glykosiliertes Protein mit einem Molekulargewicht von 8,38 kDA dar. Wie bei den meisten Zytokinen ist auch seine Plasma-Halbwertszeit kurz und umfasst weniger als vier Stunden [20]. Neben der Rekrutierung von Lymphozyten, der Regulation der IgE-Synthese, dem Wachstum von epidermalen Zellen oder der Angiogenese ist die wichtigste biologische Aufgabe von IL-8 die Mobilisierung, Aktivierung und Degranulierung von neutrophilen Granulozyten [38, 39, 134]. Deshalb wurde IL-8 anfangs auch als „Neutrophile aktivierender Faktor“ (NAF), „Neutrophile aktivierendes Protein-1“ (NAP-1) oder „Monozyten-produzierter neutrophiler chemotaktischer Faktor“ (MDNCF) bezeichnet [19, 66]. Experimente zeigten, dass bei gesunden Erwachsenen bereits ein bis zwei Stunden nach LPS Injektionen der Serumspiegel von IL-8 anstiegen [100]. 1.4.4 TNF-α, IL-6 und IL-8 in der Sepsis Wegen seiner Fähigkeit neutrophile Granulozyten zu aktivieren, wurde 1992 von Hack in einer Studie an 47 Sepsispatienten angenommen, dass IL-8 eine durchaus wichtige Rolle im Immungeschehen bei Sepsis spielt. Es wurde klar, dass die IL-8 Konzentration tatsächlich bei den meisten Sepsispatienten erhöht ist und auch mit klinischen Parametern, wie arteriellem Mitteldruck sowie biochemischen Parametern wie Leukozyten- und Thrombozytenzahl gegenläufig korreliert. Auch konnte nachgewiesen werden, dass das IL-8 Level bei Patienten, die nicht überlebten, bei Aufnahme deutlich höher war [70]. Casey et al. führten 1993 an 97 Sepsispatienten eine Zytokinmessung durch, die daraufhin mit kritisch kranken Patienten ohne Sepsis und gesunden Probanden verglichen wurde. Wiederum zeigte sich, dass IL-6 und TNF-α bei Sepsispatienten deutlich höhere Level erreichten [32]. Verdeutlicht wurde dies schon ein Jahr früher durch Damas et al. Bei einer Untersuchung von 40 Patienten erhöhte ein IL15 Einleitung 6 Anstieg von über 1.000 pg/ml deutlich die Mortalität. Eine übermäßig starke Erhöhung des TNF-α Spiegels über 100 pg/ml trat nur während der Akutphase des Septischen Schocks und auch dann nur über einige Stunden auf [45]. Eine Studie von 1994 konnte sogar zeigen, dass IL-6 eine bessere Vorhersage bei Patienten mit intraabdomineller Sepsis lieferte als der APACHE II Score, ein gern angewandtes intensivmedizinische Punktesystem. IL-6 wies eine Sensitivität von 86,4% und eine Spezifität von 78,9% im Hinblick auf die prädiktive Aussage zur Mortalität auf [113]. Ebenso war die Mortalität bei Patienten mit länger bestehendem IL-6 Anstieg erhöht [16, 118]. Bei jungen Patienten im primären septischen Schock korrelierten die Level von TNF-α und IL-6 mit dem APACHE II Score und der Schwere der Erkrankung. Man sah allerdings, dass die Plasmakonzentration von TNF-α innerhalb der ersten Tage wieder absank, hingegen IL-6 bis zur vollständigen Genesung erhöht blieb [61]. Der Versuch allerdings, ein einheitliches Zytokinprofil bei Patienten mit schwerer Sepsis oder septischem Schock zu finden, brachte keine Klarheit. Zwar zeigte sich, dass unter den gemessenen Zytokinen IL-8 am besten mit Laktatämie, DIC, Hypoxämie, dem APACHE II Score und der Mortalitätsrate korreliert, im Hinblick auf die Spitzenspiegel ließ sich aber kein einheitliches Profil ausmachen [46]. Um den diagnostischen Wert von IL-6 und IL-8 im septischen Kontinuum zu ermitteln, führten Harbarth et al. 2001 an 78 mit SIRS aufgenommenen Patienten entsprechende Messungen durch. Im Gegensatz zu Procalcitonin, das ebenfalls bestimmt wurde und eine diagnostische Aussage auf die Entwicklung einer Sepsis zuließ, konnte gleiches bei IL-6 bzw. IL-8 nicht bestätigt werden [73]. Von Martin et al. wurde festgestellt, dass bei Patienten im septischen Schock die TNF-α Serumspiegel im Vergleich zu Traumapatienten deutlich höher lagen. Hier korrelierten die TNF-α Werte auch mit dem Outcome der Patienten, da sich bei Überlebenden keine Erhöhung des Tumornekrosefaktors zeigte [101]. Im Übrigen konnte erst kürzlich in einer Studie an 159 Traumapatienten gezeigt werden, dass Variationen im TNF-α Gen zu unterschiedlicher Ausprägung des Schweregrads einer Sepsis führen [105]. Auch wenn man aus vorliegenden Studien schon viel über die Rolle der Zytokine weiß und ihr Mitwirken im Sepsisgeschehen gesichert ist, bleibt doch die Frage, 16 Einleitung wie genau sie als diagnostischer Parameter einsetzbar sind. Die vorliegende Arbeit versucht nun, da man von einer standardisierten NF-κB Messung ausgeht, die Aktivität von NF-κB in Bezug zu den Zytokinen zu setzen und daraus eine Aussage hinsichtlich des klinischen Outcomes zu entwickeln. Da vor allem IL-6 laut einigen Studien prädiktive Aussagen zur Mortalität liefern konnte, untersucht diese Arbeit den Zusammenhang mit NF-κB und eine mögliche Korrelation. 1.5 Zielsetzung und Fragestellung Septische Erkrankungen haben mittlerweile einen besonderen Stellenwert in der Intensivmedizin eingenommen. Nicht nur, weil sie die dritthäufigste Todesursache und eine enorme Kostenbelastung für das Gesundheitssystem darstellen, sondern auch weil sich die Suche nach einem zuverlässigen Monitoring dieses Erkrankungskontinuums so schwierig gestaltet. Nicht nur Überreaktion, sondern auch Paralyse des Immunsystems spielen pathophysiologisch eine tragende Rolle. Da die NF-κB Signalkaskade sowohl pro- als auch antiinflammatorische Funktionen aufweist, nimmt sie einen hohen Stellenwert bei der pathophysiologischen Modulation der Sepsis ein. In der vorliegenden Studie soll die Aktivierung dieses Signalweges in Leukozyten untersucht werden. Zusätzlich soll eine Korrelation von NF-κB mit dem Verlauf von inflammatorischen Zytokinen, wie TNF-α, Interleukin-6 und Interleukin-8 ermittelt werden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass diese Mediatoren sowohl essentiell am inflammatorischen Geschehen beteiligt sind als teils auch Aussagekraft im Hinblick auf die Schwere der Erkrankung und Mortalität besitzen. Es soll allerdings nicht nur, wie in den meisten Studien zum NF-κB Signalweg die Bindungsaktivität von NF-κB, sondern auch die Aktivierungskapazität untersucht werden. Hiervon verspricht man sich nicht nur eine Momentaufnahme des zellulären Geschehens zu erhalten, sondern einen Bezug auf die Grundaktivität, die in der Zelle herrscht, herstellen zu können. Die Relation zu NF-Y als konstitutiv exprimierter Faktor soll die Basis der Zellaktivität darstellen. Patienten, die elektiven ausgedehnten gefässchirurgischen Eingriffen unterzogen 17 Einleitung wurden, dienen als Modell der systemisch ablaufenden pathophysiologischen Vorgänge, wie sie zum Beispiel bei SIRS nicht infektiöser Genese zu finden sind. Bei dieser Gruppe wurde perioperativ, sprich präoperativ und an bis zu vier Tagen postoperativ im Sinne einer prospektiven Longitudinalstudie Vollblut entnommen. Als Kontrollgruppe fanden sich Patienten, die eher gering traumatisierenden operativen Eingriffen an der Arteria Carotis ausgesetzt waren. Dies erlaubt den direkten Vergleich von bagatell-assoziierten Effekten im Gegensatz zu Mechanismen, die bei schwer traumatisierenden Eingriffen im Sinne von SIRS die Folge sind. Mit diesem Hintergrund ist es nun das Ziel, ein inflammatorisches Monitoring entwickeln zu können, bei dem sich die präoperative NF-κB Aktivierungskapazität in vitro als prädiktiver Parameter für die postoperative Krankheitsentwicklung erweist. Hier könnte eine erhöhte Aktivierungskapazität das Zeichen für einen erschwerten inflammatorischen Verlauf bedeuten bzw. im umgekehrten Sinne eine verminderte Aktivierungkapazität mit einer erhöhten Infektrate einhergehen. Zum anderen wird nach einer Korrelation der NF-κB Bindungs- oder Aktivierungskapazität zu einem aussagekräftigen Zytokinprofil von TNF-α, IL-6 oder IL-8 gesucht, auf Grund dessen sich ein brauchbares prädiktives Monitoring entwickeln lässt. Auch im Hinblick auf den immer lauter werdenden Wunsch nach einer möglichen pharmakologischen Beeinflussung des für das septische Geschehen so wichtigen NF-κB Signalwegs sind Patientenstudien wie diese unumgänglich. In der vorliegenden Studie sollen nun folgende Fragestellungen bearbeitet werden: Bestehen Unterschiede hinsichtlich des Zeitpunkts, des Ausmaßes und der Dauer der Bindungsaktivität und der Aktivierungskapazität von NF-κB in mononukleären Zellen nach Stimulation ex vivo mit TNF-α bei Patienten mit schwerem und leichtem chirurgischen Trauma? Besteht ein Zusammenhang zwischen prä-und/oder postoperativer Aktivierung von NF-κB mit dem postoperativen Zytokinprofil, im genaueren den einzelnen Verläufen von TNF-α, Interleukin-6 und Interleukin-8? 18 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden, falls nicht gesondert aufgeführt, von den Firmen Biochrom, Bio-Rad, BD Bioscience, Milteny, Santa Cruz und Sigma bezogen. Produkt Firma Bestellnummer Acrylamid-Bis 29:1 40% Serva 10680 Aqua B. Braun Braun 75/12604052/0503 Biocoll Seperating Solution Biochrom AG L6115 Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 BSA für Biorad Assay Pierce 23209 dNTP 10mM Mix C114 B Promega 6250706 DTT Sigma D-9779 EDTA Dinatrium Dihydrat AppliChem A3553.0500 PBS GIBCO Invitrogen 14190 RPMI 1640 Medium GIBCO Invitrogen 42401-018 S-Monovette (Heparin) Sarstedt 01.1604 S-Monovette (EDTA) Sarstedt 05.1167 S-Monovette (Citrat) Sarstedt 05.1071 TEMED Sigma T-8133 Tumor Necrosis Factor-α Sigma T6674 Qiagen 28304 (human, rekombinant) QIAquick Nucleotide Removal Kit 2.1.2 Lösungen • TBE 0,5 fach: 45 mM Tris-Cl; 45 mM Na-Borat; 1mM EDTA pH 8,0 • Zellkulturmedium: RPMI 1640 Medium, 10% FCS 19 Material und Methoden • Lysepuffer (1fach): 50 mM Tris-HCl pH 7,6; 250 mM NaCl; 3 mM EDTA; 3 mM EGTA; 1% Triton-X-100; 0,5% NP 40; 10% Glycerol; ProteaseInhibitoren (β-Glycerolphosphat 2 mM); DTT 2 mM; Leupeptin 10 µM; Natriumorthovanadat 0,1 mM; pNPP = p-Nitrophenyl Phosphate 2 mM) • EMSA-Puffer: 10 mM Hepes; 50 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 1mM DTT; 10 % Glycerol • Fixierlösung: 15% Methanol; 5% Eisessig; 5% Glycerol in Aqua bidest 2.1.3 Oligonukleotide Oligonukleotide Hersteller NF-κB HIV-κB site (Labeln) Biomers NF-κB consensus HIV site Biomers (spezifisches Oligonukleotid, ohne 32P gelabelt) NF-Y consensus Biomers (spezifisches Oligonukleotide, ohne 32P gelabelt) 2.2 Methodik zur NF-κB Bestimmung 2.2.1 Isolation von mononukleären Zellen mittels Ficoll Die Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation bietet die Möglichkeit, die zellulären Blutbestandteile nach ihrer Dichte zu trennen und zu isolieren. Im Besonderen gilt dies für die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PMNCs), da sich die Lymphozyten und Monozyten entsprechend ihrer spezifischen Dichte in der Interphase zwischen Überstand aus Plasma, Thrombozyten und Ficoll ansammeln, während die Erythrozyten und Granulozyten aufgrund ihrer höheren Dichte am Boden des Gefäßes absedimentieren. Das den Patienten entnommene und mit Heparin antikoagulierte Vollblut wurde sofort auf Eis gelegt und im Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt. Anschließend wurde jeweils die gleiche Menge von verdünntem Blut äußerst sorgfältig auf 5 ml Ficoll 20 Material und Methoden geschichtet und daraufhin für 22 Minuten bei 420 gE in der auf 4°C vorgekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Das Plasma der Oberphase wurde abgenommen und für die spätere Zytokinbestimmung in Tubes abgefüllt, während die verbliebene Interphase vorsichtig bis zur Ficollgrenze abpipettiert wurde. Zwei anschließende Waschschritte mit PBS bei 270 gE für sieben Minuten sorgten dafür, dass verbliebene Thrombozyten und Ficoll weitestgehend beseitigt wurden. Die isolierten Zellen konnten nun mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt werden. Gesamtzellzahl = Mittelwert aus den 4 großen Quadraten x verwendetes Volumen x Verdünnungsfaktor x 10.000 2.2.2 Stimulation Nach Bestimmung der Zellzahl wurden die aufgereinigten mononukleären Zellen jeweils zur Hälfte mit humanem TNF-α in einem RPMI-Medium stimuliert. Die andere Hälfte liefert unstimuliert die Kontrolle. Um eine optimale NF- κB Aktivierung zu erreichen, wurden jeweils 4x 106 Zellen in 1 ml Medium mit 10 ng TNF-α für 30 Minuten bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Voruntersuchungen ergaben diese optimalen Stimulationsbedingungen [41]. Dabei wurden in der Länge variierende Stimulationszeiten als auch unterschiedliche TNF-α Konzentrationen auf ihr NF- κB Aktivierungspotential hin untersucht. 2.2.3 Gesamtzelllysat Nach der Inkubation wurden die Zellen sofort mit PBS durch Zentrifugation gewaschen. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das verbliebene Zellsediment sorgsam trocken pipettiert. Nach der Zugabe von einfach konzentriertem Lysepuffer verblieben die Zellen zur Lyse mindestens 40 Minuten lang auf Eis. Anschließend wurde das Lysat bei 20.000 gE und 4°C für 35 Minuten zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Pellet, bestehend aus Zellresten, verworfen. Die nun komplett im Überstand enthaltenen Proteine der Zelle wurden bei -80°C gelagert. 21 Material und Methoden 2.2.4 Proteinbestimmung Um in den gewonnenen Proben die jeweils gleiche Proteinkonzentration zu erhalten, wurden durch photometrischer Konzentrationsmessung des Gesamtzelllysats mittels Biorad Protein-Assay die Proteine auf eine Konzentration von 10 µg pro 5 µl EMSA-Puffer entsprechend 2 µg/µl mit einer Toleranz von 5% eingestellt. Durch den Biorad Protein-Assay erhält man die absolute Proteinkonzentration einer unbekannten Lösung, indem man zuvor eine Messreihe mit einem Protein bekannter Konzentration durchführt, in diesem Fall BSA von der Firma Pierce. Dieses Verfahren basiert auf der Beobachtung, dass das Absorptionsmaximum für eine saure Lösung von Coomassie Brilliant Blue G-250 nach Bindung an ein Protein von 465 nm (braun) nach 595 nm (blau) verschoben wird. Die Amplitude der Absorption bei 595 nm ist der Menge an Protein in einem großen Bereich direkt proportional. Die Proteinverdünnungen wurden ebenfalls bei -80°C aufbewahrt. 2.2.5 Radioaktive Markierung der Oligonukleotid-Sequenzen Um den Electrophoretic Mobility Shift Assay durchzuführen, ist ein radioaktiv gelabeltes Oligonukleotid nötig, welches die spezifische Erkennungssequenz der NF-κB Familie aufweist. Somit wird bei bei Neusynthese der DNA das Isotop Phosphor 32 P als α32P-Cytosintriphosphat zusammen mit den übrigen unmarkierten Nukleotiden verwendet. Folgende NF-κB Sequenz wurde verwendet: Oligosequenz (HIV κB-Site) (Biomers): sense: 5´ GGATCCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGGCCA 3´ reverse: 5´ GGATCCTGGCCTCGGAAAGTCCCCTCTGTTGA 3´ Im ersten Schritt erfolgt das sogenannte Annealing, wobei die beiden Einzelstränge miteinander verbunden werden. Hierzu werden die Ursprungsnukleotide in einer Konzentration von 1 µg/µl in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst. Jeweils 10 µl Oligonukleotide wurden auf 100 µl H2O aufgefüllt (10 µl sense Einzelstrang + 10 µl reverse Einzelstrang + 80 µl H2O), anschließend im Wasserbad auf 94°C erhitzt und dann langsam im ausgeschalteten Wasserbad auf Raumtemperatur heruntergekühlt. 22 Material und Methoden Zur Markierung wurde Klenow als verkürzte DNA-Polymerase I verwendet, welche in der Lage ist, 3’ Enden von DNA-Fragmenten aufzufüllen, indem es die 5’ Überhänge als doppelsträngigen Reaktionsgemisch Matrize nutzt. NF-kB Oligonukleotide wurde 1 Dieser µl Schritt war Überhänge doppelsträngiges notwendig, aufwiesen. da die Für das Ursprungsoligonukleotid zusammen mit je 0,5 mM unmarkiertem dATP, dGTP und dTTP sowie 5 µl radioaktiv markiertes α32P-dCTP (entspricht 50 µCi) mit 0,5 µl Klenow in 2 µl Eco Pol Puffer auf 20 µl H2O aufgefüllt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur (25°C) inkubiert. Um abschließend die Radioaktivität überprüfen zu können, wurden im Anschluss daran die neu synthetisierten Oligonukleotide mittels QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Oligonukleotid für NF-Y: Das radioaktiv markierte Oligonukleotid der spezifischen NF-Y Erkennungssequenz wurde in etwas abgewandelter Weise hergestellt. Hierbei wurde das Isotop Phosphor 32 P im Gegenzug als γ32P-Adenosintriphosphat zur Markierung eingebaut. Von der Firma Biomers wurde als Urspungsoligonukleotid die folgende NF-Y Sequenz verwendet: Oligosequenz NF-Y (Biomers): sense: 5’ CCAAACTCGCCAGAACCAATCAGAAAA 3’ reverse: 5’ TTTTCTGATTGGTTCTGGCGAGTTTGG 3’ Auch hier erfolgte zunächst das Annealing der Einzelstränge. Wie zuvor bei NF-κB wurden hierfür die Ursprungsoligonukleotide in einer Konzentration von 1 µg/µl in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst. Jeweils 10 µl Oligonukleotide wurden auf 100 µl H2O aufgefüllt (10 µl sense Einzelstrang + 10 µl reverse Einzelstrang + 80 µl H2O), anschließend im Wasserbad auf 94°C erhitzt und dann langsam im ausgeschalteten Wasserbad auf Raumtemperatur heruntergekühlt. Da diese Oligonukleotide im Gegensatz zu den NF-κB-Strängen keine Überhänge aufwiesen, wurde als Enzym die T4 Polynucleotide Kinase verwendet, die die endständige Phosphatgruppe von ATP an freie 5'-OH Enden von Nukleotiden überträgt. Für diese Reaktion wurden 5 pmol des doppelsträngigen NF-Y Oligonukleotids mit 5 µl γ32P - Adenosintriphosphat (entspricht 50 µCi) zusammen 23 Material und Methoden mit 0,5 µl T4 Kinase in 2 µl PNK-Puffer auf 20 µl H2O aufgefüllt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die neu synthetisierten Oligonukleotide ebenfalls mittels QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt, um abschließend die Radioaktivität zu überprüfen. 2.2.6 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Die oben beschriebenen Oligonukleotide verwendete man, um die sequenzspezifische Bindung von Proteinen an doppelsträngige DNA zu ermitteln. Hierbei wurden die eingestellten Proteinisolate der Patienten mit den radioaktiv markierten DNA Sequenzmotiven inkubiert und die dabei entstehenden Komplexe in einem nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt. DNA-Fragmente, an denen ein Protein gebunden ist, wandern im Gel langsamer und können dadurch von ungebundener DNA getrennt werden. Synthetische Kompetitoren wie Poly-dIdC verhindern dabei eine unspezifische DNA-Bindung durch andere Proteine. Hierbei wurden10 µg Proteinlysat in 5 µl EMSA-Puffer mit 30.000 cpm 32 Sequenz) respektive 30.000 cpm P-markiertem NF-κB Oligonukleotid (HIV-κB- 32 P-markiertem NF-Y Oligonukleotid für 30 min bei Raumtemperatur unter Zugabe von 1 mM DTT und 1 µg Poly-dIdC in einem Gesamtvolumen von 10 µl inkubiert. Nachdem ein 7 %iges natives Polyacrylamidgel zunächst bei 100 V 30 Minuten äquilibriert worden war, wurden die Proben in die Taschen des Gels geladen und in 0,5fachem TBE Laufpuffer bei 200 V über eine Laufzeit von 3 Stunden aufgetrennt. Im Anschluss an den Lauf wurde das Gel zunächst für 30 min im Fixierbad fixiert und anschließend für 10 min gewässert. Danach wurde das Gel auf Whatmanpapier aufgezogen und für die Dauer einer Stunde bei 80°C in einem Vakuumgeltrockner getrocknet. Zur Visualisierung der Banden wurden die getrockneten Gele jeweils einmal 24 h und 72 h mit Agfa Cronex-5-Film bei –80°C exponiert. Wenn NF-κBUntereinheiten in dem Zelllysat vorhanden waren, dann wurden diese aufgrund der Interaktion mit dem gelabelten Oligonukleotid auf dem Gel als deutlich sichtbare Bande nach oben verlagert, da der Komplex aus NF-κB Protein und Oligonukleotid eine geringere elektrophoretische Mobilität aufweist als das 24 Material und Methoden Oligonukleotid alleine. Die Intensität der geshifteten Bande kann somit als ein Maß für die Menge an NF-κB in dem Proteingemisch angesehen werden. 2.2.7 Kompetitortest Durch einen Kompetitortest erfolgte der Nachweis einer spezifischen DNA-ProteinWechselwirkung, um die jeweils richtige Bande für NF-κB respektive NF-Y zu verifizieren. Hierbei wurde zunächst ein nicht gelabeltes Oligonukleotid für 30 Minuten mit den Proben inkubiert, um dann anschließend für weitere 30 Minuten das radioaktiv markierte Oligonukleotid hinzuzugeben. Das jeweils unmarkierte Oligonukleotid enthielt ebenso wie das jeweils markierte die NF-κB-HIV-κB-site beziehungsweise die NF-Y- Erkennungssequenz. War nun die jeweils beobachtete NF-κB- beziehungsweise NF-Y-Bande spezifisch, sollte diese beim Hinzugeben der zugehörigen, ungelabelten Wildtyp-Sequenz vollständig verschwinden, jedoch in Gegenwart der ungelabelten „mutierten“ Sequenz persitieren. 2.2.8 Densitometrie mittels Phosphor Imaging Technik Zur Quantifizierung der elektrophoretisch aufgetrennten, radioaktiv markierten NFκB bzw. NF-Y Proteine wurde ein Phosphorimager (FLA-3000) der Firma Fuji verwendet. Zur Analyse wurde das Programm „AIDA Image Analyzer for Windows“ der Firma Raytest benutzt. Hierzu wurden die getrockneten Polyacrylamidgele jeweils 5 Stunden auf den Imaging Plates bei Raumtemperatur exponiert. Dadurch wird die Energie der radioaktiv markierten Probe auf die Phosphorkristallstruktur auf der Bildplatte übertragen. Als reiner β-Strahler emittiert Phosphor 32 P seine Energie in Form von Elektronen, welche auf der Bildplatte eingefangen werden. Das spezifische Absorbtionsverhalten, welches die somit in einer bestimmten Form in der Kristallstruktur asservierten Elektronen aufweisen, macht man sich in der Folge zu Nutze. Wird das eingefangene Elektron mit Laserlicht dieser bestimmten Wellenlänge angeregt (ca. 600 nm), emittiert es Licht einer anderen Wellenlänge (ca. 400 nm), welches detektiert und ausgewertet werden kann. Die Software quantifiziert und integriert die gemessenen Signalintensitäten über vordefinierte Flächen und gibt sie als numerischen Wert in der Einheit photostimulierte 25 Material und Methoden Lumineszenz (PSL) Radioaktivitätsverteilung aus. wurde Die somit erhaltene abschließend noch Intensität von der für die gemessenen Hintergrundaktivität des Gels abgezogen, um nur die spezifische Intensität der jeweiligen Bande zu errechnen. 2.3 Probandenkollektiv und Studiendesign Die Untersuchung erfolgte mit Zustimmung der Ethikkommission der Universität Ulm nach der Deklaration von Helsinki (Ethikantrag Nr.145/2005). An dieser Arbeit, einer prospektiv-deskriptiven laborchemischen Untersuchung, nahmen Patienten aus der gefäßchirurgischen Abteilung der Universität Ulm teil. Die Versuchsgruppe bestand aus Patienten mit elektiver gefäßchirurgischer Versorgung eines abdominellen Aortenaneurysmas (BAA). Die Patienten waren zwischen 40 und 85 Jahren alt mit einer ASA-Klassifizierung von 1-4. Die Kontrollgruppe beinhaltet Patienten mit elektivem Eingriff an der Arteria carotis (AC), die in Alter und ASA-Klassifizierung der Versuchsgruppe gleichen. Beide Gruppen waren ebenso im Vor- und Nebenerkrankungsprofil vergleichbar. Alle Patienten wurden spätestens am letzten präoperativen Tag über die Art der Studie aufgeklärt und gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, mit der sie sowohl die Teilnahme an der Studie als auch die Erlaubnis zur wissenschaftlichen Auswertung der von ihnen erhobenen Daten und Messwerte bestätigten. Im Studienzeitraum von 01. Januar 2007 bis 30. Juni 2008 nahmen insgesamt 50 Patienten an dieser Studie teil. Hierbei beinhaltet die Versuchsgruppe der BAA-Patienten 30 Probanden, die Kontrollgruppe der an der Arteria carotis operierten Patienten besteht aus 20 Personen. Ein- und Ausschlusskriterien waren wie folgt festgelegt: Einschlusskriterien Versuchsgruppe • Präoperative Patienten vor elektiver gefäßchirurgischer Versorgung eines abdominellen oder thorakalen Aortenaneurysma 26 Material und Methoden • Alter > 40 Jahre oder < 85 Jahre • ASA (American Society of Anesthesiology) Klassifizierung 1-4 • Einverständniserklärung des Patienten Kontrollgruppe • Präoperative Patienten vor elektiven peripheren gefässchirurgischen Eingriffen oder Eingriffen an der Arteria carotis • Alter > 40 Jahre und < 85 Jahre • ASA (American Society of Anesthesiology) Klassifizierung 1-4 • Einverständniserklärung des Patienten Ausschlusskriterien (gültig für beide Gruppen) • Alter < 40 Jahre und > 85 Jahre • Präoperativ nachgewiesene bakterielle Infektion • Neoplastische Erkrankungen • Z.n. Organtransplantation • Immunmodulatorische Therapien: Corticosteroide, G-CSF, Immunsuppression • Dauerhafte Einnahme von Antioxidantien (Vitaminpräparaten) • Ablehnung des Patienten 2.4 Blutentnahme Die Blutentnahme erfolgt nach dem Standard der Universität Ulm an peripheren Venen oder soweit postoperativ vorhanden an Zentralvenenkathetern zu festgelegten Zeitpunkten. Auf eine präoperative Blutentnahme folgten vier weitere am 1., 2., 3. und 5. postoperativen Tag. Bei Entlassung der Patienten vor dem 5. postoperativen Tag entfiel diese Blutentnahme allerdings. Jeweils wurden den Patienten zwischen 25 und 30 ml Blut mit HeparinMonovetten für die Analyse entnommen. Hinzu kam die Entnahme von 2 bis 3 ml EDTA-Blut zur Erstellung eines maschinellen Blut- und Differenzialblutbildes, 5 bis 7 ml Heparin-Blut zur Bestimmung von CRP, Gesamtbilirubin, Elektrolyten, Retentionswerten wie Kreatinin und Harnstoff und 5 ml Citrat-Blut zur Gerinnungsanalytik. Diese Bestimmungen erfolgten in der Abteilung für Klinische 27 Material und Methoden Chemie der Universität Ulm. 2.5 Dokumentation Die Patientendaten wurden in einem Dokumentationsbogen in einer Microsoft Access 97® Datenbank angelegt. 2.5.1 Patientendaten Als Grundinformation, die für jeden Patienten in den Dokumentationsbogen aufgenommen wurden, dienten: • Name, Vorname, Geburtsdatum, Geschlecht • Diagnose, Vorerkrankungen, Voroperationen, Medikation • Operationsdatum • ASA-Klassifikation • Intra- oder postoperative Besonderheiten • Intraoperativer Blutverlust und Substitution mit Erythrozyten-, Thrombozytenkonzentraten oder Fresh Frozen Plasma • Clampingzeit (bei BAA-Patienten) • Anlage eines patientenkontrollierten Periduralkatheters zur postoperativen Schmerztherapie 2.5.2 Klinische Daten und Laborwerte Zusätzlich wurden an jedem Tag klinische Daten des Patienten erfasst, von denen der jeweils schlechteste Wert innerhalb 24 Stunden des Messtages Eingang in die Datenbank fand. Hierzu zählten: • Körpertemperatur in ° Celsius • Herzfrequenz in 1/min • Mittlerer arterieller Druck in mmHg • Systolischer Blutdruck in mmHg Durch die Klinische Chemie der Universität Ulm wurden ebenfalls an jedem Messzeitpunkt folgende Laborwerte erfasst: Aus Lithium-Heparin-Plasma: • Elektrolyte: Natrium, Kalium 28 Material und Methoden • Nierenfunktionsparameter: Harnstoff, Kreatinin • Leberstoffwechsel: Bilirubin gesamt • Glukose • C-reaktives Protein (CRP) Aus EDTA-Plasma • Kleines Blutbild: Leukozyten, Erythrozyten, Hämatokrit, Thrombozyten • Differentialblutbild: Neutrophile Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten Aus Citrat-Plasma • Prothrombinzeit (Quick-Wert) • Partielle Thrombinzeit 2.6 Zytokinbestimmung Zur Zytokinbestimmung wurde das Plasma, welches nach der Ficolldichtezentrifugation die Oberphase bildete, verwendet. Die Klinische Chemie der Universität Ulm bestimmte TNF-α, IL-6 und IL-8 mittels Immulite® der Firma DPC Biermann (heute Siemens) und den passenden Kits für die einzelnen Zytokine. Bei Immulite® handelt es sich um ein vollautomatische ChemilumineszenzImmunoassay System, dessen enzymkatalysierte Chemilumineszenzreaktion hochsensitive Immunoassays mit weitem Messbereich ermöglicht. Die Bestimmung erfolgt mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und erfolgt nach dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Das entsprechende Zytokin bindet an einen enzymmarkierten monoklonalen Antikörper, die hierbei entstehende Lichtemission wird mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Als Gefäß für die Reaktion, die Inkubation, die Waschvorgänge und die Signalentwicklung dient ein patentiertes Teströhrchen. In diesem befindet sich die antikörperbeschichtete Polystyrolkugel, die für Reaktionen während des Messvorgangs eine wichtige Rolle spielt. Für die Bestimmung wurden pro Messung ca. 100 µl Plasma benötigt. 2.7 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der in der Microsoft Access® Datenbank beinhalteten 29 Material und Methoden Rohdaten erfolgte mittels des Programms Microsoft Excel® 2003. Es wurden Graphen beider Studiengruppen erstellt, die patientenweise den Messverlauf der Zielgröße anzeigen. Mit demselben Programm wurden Berechnungen von Median, Minimum und Maximum angestellt. Die entsprechenden Boxplotdiagramme wurden mit dem Programm SigmaPlot 7.0 Notebook® erstellt. Die Boxplots dienen der vergleichenden Gegenüberstellung der Zielgrößen beider Gruppen an den verschiedenen Messzeitpunkten. Die BAA Patienten sind hier als blauer Plot, die Carotis Patienten als grüner Plot erstellt. Der Boxplot selbst gibt Auskunft über den Median, die 5-, 25-, 75- und 95 %Perzentile. Für die Korrelationsanalyse wurde das Programm SPSS 8.0® für Windows genutzt. Es wurde der Spearmans Korrelationskoeffizient (rSP) bestimmt, der eine Korrelation für ordinale Daten erlaubt. Bei ordinalen Daten ist eine feste Ordnungsrelation definiert und ihren Werten eine eindeutige Ordnungsnummer zugeordnet, wie dies bei Laborwerten wie sie hier vorliegen der Fall ist. Somit ist der Spearmans Korrelationskoeffizient das hier erforderliche Mittel zur Korrelationsanalyse. Dieser Koeffizient kann Werte zwischen -1 und +1 annehmen. Hierbei zeigt rSP<0 einen gegensinnigen monotonen Zusammenhang an, ein rSP>0 einen gleichsinnigen monotonen Zusammenhang. rSP=0 hingegen spricht für keinen monotonen Zusammenhang. Das Signifikanzlevel für alle Korrelationsanalysen beträgt p<0,05. 30 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Kollektivbeschreibung Initial bestand das Patientenkollektiv aus 50 Probanden, die in die Studie aufgenommen werden konnten. 30 Patienten wurden an Bauchaortenaneurysmen (BAA) operiert und galten als Versuchsgruppe. Primär galt keiner der Patienten als Drop out, allerdings entfielen zwei Patienten, nachdem die mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay geshifteten Banden nicht auswertbar waren. Somit bezieht sich die Auswertung in der Versuchsgruppe auf 28 Patienten. 20 Patienten mit Operation an der Arteria Carotis (AC) entfielen auf die Kontrollgruppe. Hier konnten die Ergebnisse aller Patienten verwertet werden. Die Blutabnahmen waren präoperativ sowie am 1., 2., 3., und 5. Tag postoperativ angesetzt. Alle Patienten, die nach dem dritten postoperativen Tag ausschieden, wurden in die Auswertung komplett miteinbezogen. Keiner der Probanden schied vor dem dritten postoperativen Tag aus. Hinsichtlich demographischer Parameter erlauben die beiden Gruppen in Bezug auf das Alter bestmöglichen Vergleich. Das Durchschnittsalter beider Gruppen unterscheidet sich nur um 3 Jahre. Anders liegen die Verhältnisse bei der Geschlechterverteilung. In der BAA Gruppe sind 96% der Patienten männlichen Geschlechts, während in der Kontrollgruppe der Carotispatienten das Geschlechterverhältnis beinahe ausgeglichen ist. Beim Vorerkrankungsprofil der Patienten wurde besonderes Augenmerk auf gefäßassoziierte Erkrankungen wie arterielle Hypertonie, Hyperlipoproteinämie, Diabetes Mellitus Typ II, Koronare Herzerkrankungen, Myokardinfarkt und apoplektische Geschehen gelegt. Mit Ausnahme des Apoplex, der bei der Kontrollgruppe deutlich häufiger auftrat, waren die Vorerkrankungen der Patienten beider Gruppe durchaus vergleichbar. Die anschließende Tabelle 1 gibt darüber einen kurzen Überblick. 31 Ergebnisse Tabelle 1: Demographie und Vorerkrankungsprofil der Versuchs- und Kontrollgruppe; relevante Unterschiede sind kursiv gedruckt Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Patienten BAA Carotis Anzahl 28 20 Alter in Jahren 67,7 70 männlich 96% 45% weiblich 4% 55% aHT 75% 80% HLP 57% 50% DM II 21% 20% KHK/MI 39% 40% Apoplex 4% 50% Geschlecht: Vorerkrankungsprofil: Ebenfalls als vergleichende Ausgangswerte der Versuchs- und Kontrollgruppe dienen die präoperativ bestimmten Werte der NF-κB Bindungsaktivität und der NFκB Aktivierungskapazität sowie die präoperativen Bestimmungen von Interleukin6, Interleukin-8 und TNF-α. Der einzig deutliche Unterschied zwischen Versuchsund Kontrollgruppe bestand in der Höhe der NF-κB Bindungsaktivität. Einen vergleichenden Überblick gibt hier Tabelle 2: 32 Ergebnisse Tabelle 2: Zielgrößen an Messtag null (präoperative Messung) angegeben als Median (MinimumMaximum) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Zielgrößen BAA Carotis NF-κB Bindungsaktivität in PSL 7248,8 (1725,7-29810,4) 4802 (1334,1-26375,8) NF-κB Aktivierungskapazität 1,21 (0,72-2,44) 1,14 (0,77-1,58) Interleukin-6 in pg/ml 4 (4-30,2) 4,4 (4-19,2) Interleukin-8 in pg/ml 10 (10-10) 10 (10-10) Tumornekrosefaktor α in pg/ml 12,8(8-30,8) 16,5 (9,8-45) 3.2 Verlauf der von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen Im Folgenden werden nun die von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen näher betrachtet. Im Einzelnen sind das die NF-κB Bindungsaktivität, die NF-κB Bindungsaktivität im relativen Verhältnis zu Tag 0 gesetzt und die NF-κB Aktivierungskapazität. Besonderes Augenmerk liegt auf dem zeitlichen Verlauf, der Dauer und dem Ausmaß der Veränderung der Zielgrößen. Ebenso wird der Zeitpunkt möglicher Veränderungen betrachtet. 3.2.1 NF-κB Bindungsaktivität Die NF-κB Bindungsaktivität stellt den unstimulierten Wert von NF-κB dar. An den verschiedenen Messzeitpunkten kann damit eine Aussage über die Quantität der unstimulierten, im Zellkern vorliegenden Menge von NF-κB gemacht werden. Gemessen wird dieser Wert in der Einheit PSL. In den folgenden Abbildungen wird der zeitliche Verlauf der Bindungsaktivität beider Gruppen über die einzelnen Messzeitpunkte dargestellt. S-xy als Patientencode steht für die Kontrollgruppe der Carotispatienten, O-xy für Probanden der BAA-Gruppe. 33 Ergebnisse Schon bei flüchtiger Betrachtung kann man erkennen, dass diese Größe bei beiden Gruppen ein sehr heterogenes Verteilungsmuster aufweist. Generell lässt sich sagen, dass die Kontrollgruppe weniger große Schwankungen innerhalb der Einzelpatientenverläufe aufweist als die Versuchsgruppe. So liegen innerhalb der Kontrollgruppe 45% in ihrem kompletten zeitlichen Verlauf unterhalb von 5000 PSL. In der Versuchsgruppe hingegen sieht man dies nur bei 32%. Gleichzeitig mit der Tatsache, dass die Maximalwerte der Bindungsaktivität bei der BAA-Gruppe deutlich höher ausfielen, kann man also durchaus sagen, dass die Versuchsgruppe im Allgemeinen höhere Werte der NF-κB Bindungsaktivität aufweist, als dies bei der Kontrollgruppe der Fall ist. Auch wird deutlich, dass die Patienten in der Versuchsgruppe deutlich häufiger, nämlich zu 50%, mit dem Ausgangswert der NF-κB Bindungsaktivität an Tag 0 über 8000 PSL liegen. In der Vergleichsgruppe finden sich nur bei 35% der Probanden so hohe Werte an Tag 0. 34 Ergebnisse Abbildung 1: Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität der BauchaortenaneurysmaPatienten (O-02 – O-58) über alle fünf Messzeitpunkte (Universitätsklinikum Ulm 20072008) Abbildung 2: Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität der CarotisPatienten (S-22 – S-63) über alle fünf Messzeitpunkte (Universitätsklinikum Ulm 2007-2008) Ein Vergleich der medianen Verteilung bestätigt dieses Bild. Sowohl der Median als auch die Maxima der erreichten NF-κB Bindungsaktivität liegen bei der Versuchsgruppe deutlich höher. Davon ausgehend kann man im Medianverlauf der Versuchsgruppe über die Zeit sehen, dass dieser während der ersten beiden postoperativen Tage kontinuierlich ansteigt. Präoperativ noch bei 7248,75 PSL (1724,7 PSL - 29810,4 PSL) gelegen, klettert die Bindungsaktivität am ersten postoperativen Tag auf 7950,6 PSL (1084,2 PSL - 37787,5 PSL) und steigt am zweiten postoperativen Tag sogar weiter auf 8990,35 PSL (972,5 PSL - 25406,2 PSL). Auf einen Abfall der Bindungsaktivität am dritten Tag von 6977,1 PSL (515,6 PSL - 23349,2 PSL) folgt am fünften post-OP Tag ein minimaler Anstieg auf 7183,9 PSL (599,3 PSL - 19835,6 PSL). 35 Ergebnisse Betrachtet man isoliert den Verlauf der Maxima in der Versuchsgruppe, kann man nach einem enormen Anstieg des NF-κB Wertes am ersten postoperativen Tag von 29810,4 PSL präoperativ auf 37787,5 PSL einen kontinuierlichen Abfall der Bindungsaktivität bis unter den Ausgangswert beobachten. Tabelle 3: NF-κB Bindungsaktivität der Versuchsgruppe (Bauchaortenaneurysma-Patienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in PSL Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 7248,75 7950,60 8990,35 6977,10 7183,90 Minimum 1724,70 1084,20 972,50 515,60 599,30 Maximum 29810,40 37787,50 25406,20 23349,20 19835,60 Etwas anders verhält sich der Verlauf der Mediane in der Kontrollgruppe. Wie schon erwähnt, verlaufen auch die Mediane der Carotispatienten homogener mit weniger großen Schwankungen. Im zeitlichen Verlauf kann man erkennen, dass im Gegensatz zur Studiengruppe die Bindungsaktivität vom präoperativen Ausgangswert von 4801,95 PSL (1334,10 PSL - 26374,80 PSL) am ersten postoperativen Tag auf 4520,20 PSL (1646,50 PSL - 20075,60 PSL) abfällt. Ein erneuter kleiner Anstieg am zweiten Tag auf 4623,85 PSL (1174,20 PSL 21898,30 PSL) wird von einem noch kleineren Abfall am dritten Tag auf 4583,70 PSL (1471,30 PSL - 22080,50 PSL) gefolgt. Am fünften postoperativen Tag resultiert jedoch wiederholt ein Anstieg über den präoperativen Ausgangswert auf 6484,40 PSL (2330,90 PSL - 22024,60 PSL). Diesen Anstieg findet man ebenfalls in der Versuchsgruppe wieder, allerdings fällt er im Vergleich zur Kontrollgruppe quantitativ deutlich geringer aus. Betrachtet man auch in der Kontrollgruppe isoliert die Maximalwerte fällt hier auf, dass nach einem initialen Abfall von 26374,80 PSL prä- zu 20075,60 PSL postoperativ die Bindungsaktivität an den folgenden Messzeitpunkten relativ konstant bleibt. 36 Ergebnisse Tabelle 4: NF-κB Bindungsaktivität der Kontrollgruppe (Carotispatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in PSL Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 4801,95 4520,20 4623,85 4583,70 6484,40 Minimum 1334,10 1646,50 1174,20 1471,30 2330,90 Maximum 26374,80 20075,60 21898,30 22080,50 22024,60 Generell darf aber bei all diesen Vergleichen die enorm große Streubreite in der NF-κB Bindungsaktivität beider Gruppen nicht außer Acht gelassen werden. Sie bewegt sich im Minimum zwischen über 18000 PSL bis zu einem Maximum von über 36000 PSL. Dies ist auch deutlich in den Boxplot-Diagrammen zu erkennen, die eine tagesabhängige Gegenüberstellung der Versuchs- und Kontrollgruppe erlauben. 37 Ergebnisse NF-κB Bindungsaktivität 30000 Carotis BAA 25000 PSL 20000 15000 10000 5000 0 0 1 2 3 5 Tage postoperativ Abbildung 3: Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität der Bauchaortenaneurysma-Patienten (blau) und der CarotisPatienten (grün) über alle fünf Messzeitpunkte, dargestellt als Boxplots (Mediane, 5-, 25-, 75- und 95%Perzentile) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 3.2.2 NF-κB Bindungsaktivität im relativen Verhältnis zu Tag 0 Da die Ergebnisse der Untersuchungen zur Bindungsaktivität von NF-κB als reine unstimulierte Größe eine enorme Streubreite aufweisen, erscheint es zweckmäßig, die postoperativen Messwerte in Relation zum präoperativen Wert zu setzen. Es wird somit ein Quotient gebildet mit dem Ergebnis der präoperativen Messung im Nenner. Eine Einheit entfällt folglich. Dies wird im Folgenden als NFκB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 bezeichnet. Nimmt man die Ergebnisse mal 100, erhält man die prozentuale Bindungsaktivität präoperativen NF-κB Aktivierung, die 100% entspricht. 38 ausgehend von der Ergebnisse Abbildung 4: Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag null der BauchaortenaneurysmaPatienten (O-02 – O-58) über alle fünf Messzeitpunkte (Universitätsklinikum Ulm 20072008) Abbildung 5: Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag null der Carotis-Patienten (S-22 – S-63) über alle fünf Messzeitpunkte (Universitätsklinikum Ulm 2007-2008) Anhand der Graphiken in Abbildung 4 und 5 erkennt man, dass die Ergebnisverteilung weiterhin inhomogen bleibt. Eine extrem hohe Aktivität über 200% im Vergleich zu Tag 0 bleibt in beiden Gruppen jedoch selten. Lediglich in der Versuchsgruppe der BAA-Patienten kommt es bei drei Probanden an insgesamt sechs Messzeitpunkten zu einer NF-κB Bindungsaktivität von über 200%, was 2,0 auf der Graphik entspricht. In der Kontrollgruppe erreicht nur ein Proband und auch nur an einem Messzeitpunkt eine ähnlich hohe NF-κB Bindungsaktivität von 2,0. Abgesehen davon konzentrieren sich die Verläufe der Probanden sowohl in der Versuchs- als auch in der Kontrollgruppe in einem Bereich von 0,5 bis 1,5, was einer prozentualen NF-κB Bindungsaktivität von 50% - 150%, abgeleitet von Tag 0, entspricht. 39 Ergebnisse Legt man den Fokus auf die Bindungsaktivität, die die Probanden am ersten postoperativen Tag aufweisen und unterteilt diese in solche, die einen Wert von > 1, also eine NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 von >100% aufweisen und andere, die </= 1 bleiben, also die NF-κB Bindungsaktivität von Tag 0 nicht erreichen, ergeben sich in beiden Gruppen ähnliche Verteilungen. In der Versuchsgruppe bleiben 64% der Patienten am ersten postoperativen Tag </= 1 mit ihrer Bindungsaktivität. In der Kontrollgruppe sind dies 14 Patienten, was 70% des Patientenguts entspricht. Eine geringe Anzahl von Patienten in beiden Gruppen behält am ersten postoperativen Tag exakt die gleiche NF-κB Bindungsaktivität wie am präoperativen Messzeitpunkt bei. Prozentual gesehen sind dies 15% der Patienten in der Kontrollgruppe und 7% des Patientenguts in der Versuchsgruppe. Ein weitergehend homogener Verlauf über die folgenden Messzeitpunkte lässt sich von der Bestimmung der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 am ersten postoperativen Tag </= oder > 1 allerdings nicht ableiten. Tabelle 5: NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 der Versuchsgruppe (BauchaortenaneurysmaPatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 1,00 0,77 0,97 0,79 0,78 Minimum 1,00 0,54 0,45 0,26 0,34 Maximum 1,00 3,75 4,36 1,41 2,89 Bei der Betrachtung der Median-Werte in der Studiengruppe fällt auf, dass nach einem initialen Abfall der relativen Bindungsaktivität am ersten postoperativen Tag auf 0,77 (0,54-3,75) ein Anstieg am zweiten postoperativen Tag auf 0,97 (0,454,36) folgt. Dies widerspricht den Beobachtungen der absoluten Bindungsaktivität, bei der die medianen Werten einen konstanten Anstieg bis zum zweiten postoperativen Tag zeigten. Der Median der relativen Bindungsaktivität erreicht an Tag 2 jedoch nicht mal den Ausgangswert von Tag 0. An Tag 3 und 5 resultiert ein erneuter Abfall der relativen Größe auf ähnliche Werte wie an Tag 1. 40 Ergebnisse Tabelle 6: NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 der Kontrollgruppe (Carotispatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 1,00 0,93 0,93 0,93 1,02 Minimum 1,00 0,55 0,52 0,50 0,55 Maximum 1,00 1,89 1,71 1,99 1,39 Der Verlauf der Mediane der relativen BA zu Tag 0 in der Kontrollgruppe hingegen entspricht ziemlich genau dem der absoluten Bindungsaktivität. Nach einem geringen Abfall am ersten postoperativen Tag auf 0,93 (0,55-1,89) bleiben die Werte des Median an Tag 2 und 3 konstant, um am fünften postoperativen Tag auf 1,02 (0,55-1,39) über den Ausgangswert an Tag 0 anzusteigen. Die Schwankungen der Mediane über den Verlauf sind hier ähnlich wie bei der absoluten Bindungsaktivität von NF-κB deutlich geringer als bei der Versuchsgruppe. Ein Vergleich mit dem Verlauf der Mediane der Versuchsgruppe zeigt, dass mit Ausnahme von Tag 2 die relative NF-κB Bindungsaktivität in der Kontrollgruppe stets höher ist und im Gegensatz zu den BAA-Patienten einmal, nämlich am fünften postoperativen Tag über 1,0, sprich über 100% hinausgeht. Die folgenden Boxplot-Diagramme (Abbildung 6) stellen hier erneut die Versuchsund Kontrollgruppe visuell gegenüber. Die Konstanz der Kontrollgruppe im Verlauf ist hier deutlich auszumachen. 41 Ergebnisse NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 2,5 Carotis BAA NF-κB / NF-κB Tag O 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1 2 3 5 Tage postoperativ Abbildung 6: Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag null der Bauchaortenaneurysma-Patienten (blau) und der Carotis-Patienten (grün) über alle fünf Messzeitpunkte, dargestellt als Boxplots (Mediane, 5-, 25-, 75- und 95%Perzentile) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 3.2.3 NF-κB Aktivierungskapazität Die Größe, die im Folgenden als NF-κB Aktivierungskapazität beschrieben wird, stellt sich als NF-κB Bindungsaktivität stimuliert mit 10 ng TNF-α (NF-κB stimuliert) geteilt durch die unstimuliert NF-κB Bindungsaktivität (NF-κB Kontrolle) dar. Durch die Quotientenbildung entfällt die Einheit ebenfalls. Die NF-κB Aktivierungskapazität (AK) soll angeben, in welchem Ausmaß die NF-κB Bindungsaktivität durch in-vitro Stimulation mit TNF-α im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle noch gesteigert werden kann. Nimmt man die Ergebnisse mal 100 lässt sich ausgehend von der unstimulierten Bindungsaktivität als 100% gesetzt, die prozentuale Steigerung durch die Stimulation angeben. Betrachtet man die unten stehenden Graphen in Abbildung 5 fällt in der BAAGruppe erneut die stark inhomogene Verteilung auf. Zwar befinden sich die 42 Ergebnisse meisten Messzeitpunkte in einem Bereich von 0,5 bis 1,5, allerdings zeigt sich bei 57% der Probanden (16 Patienten), dass mindestens einer und maximal vier Messzeitpunkte über 1,5 liegen. Generell lässt sich kaum eine einheitliche Tendenz der Verläufe ausmachen. Immerhin liegen 53,6% der Patienten in ihrem gesamten Verlauf >/= 1,0, also der als Grundaktivität gesetzten 100% der unstimulierten Kontrolle. Im Gegensatz dazu gibt es keinen einzigen Probanden in der Versuchsgruppe, der in seinem Verlauf konstant unter 1,0 bleibt. Zwar beinhaltet der Verlauf von 46,7% an einigen Messzeitpunkten eine „negative“ Aktivierungskapazität, dass heißt durch die Stimulation wird nicht einmal der unstimulierte Ausgangswert erreicht, allerdings passiert dies zu maximal zwei Messzeitpunkten pro Verlauf. Der niedrigste Wert hier entspricht 0,6, also nur 60% des Werts der unstimulierten Kontrolle. Ein anderes graphisches Bild zeichnet die Vergleichsgruppe. Die Verläufe der Carotis Patienten liegen relativ homogen innerhalb von 0,5 bis 1,5. Lediglich drei Probanden übertreten an jeweils einem Messzeitpunkt die 150%-Grenze. Eine richtungsweisende Tendenz ist auch bei der Kontrollgruppe schwierig auszumachen, allerdings halten sich die Schwankungen hier deutlich geringer als in der Versuchsgruppe. Die maximale Aktivierungskapazität liegt hier bei 1,6 (160%), das Minimum bei 0,7 (70%). Somit beträgt die Spanne der Aktivierungskapazität der Kontrollgruppe nur 90%, während bei der Versuchsgruppe hier 200% erreicht werden (Maximum 2,6 und Minimum 0,6). Über den Gesamtverlauf betrachtet, liegen bei den an der Carotis operierten Patienten 50% konstant >/= 1,0. Gleichförmig < 1 über alle Messzeitpunkte liegt allerdings auch bei der Vergleichsgruppe kein einziger Patient. Die übrigen 50% oszillieren vielmehr um die 100% Marke und weisen an bis zu maximal drei Messzeitpunkten Werte unter 1,0 auf. An Tag 5 muss bei der Kontrollgruppe allerdings beachtet werden, dass hier sieben Patienten (35%) bereits entlassen waren und nicht mehr in die Auswertung einflossen. 43 Ergebnisse Abbildung 7: Verlauf der NF-κB Aktivierungskapazität der BauchaortenaneurysmaPatienten (O-02 – O-58) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 20072008 Abbildung 8: Verlauf der NF-κB Aktivierungskapazität der Carotis-Patienten (S-22 – S63) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 20072008 Tabelle 7: NF-κB Aktivierungskapazität der Versuchsgruppe (Bauchaortenaneurysma-Patienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 1,21 1,15 1,14 1,05 1,35 Minimum 0,72 0,87 0,55 0,61 0,84 Maximum 2,44 2,36 1,78 2,57 2,53 Bei der Betrachtung der Mediane in der Versuchsgruppe fällt auf, dass die NF-κB Aktivierungskapazität präoperativ höher liegt (1,21 (0,72-2,44)) als zu den Messzeitpunkten an Tag 1 (1,15 (0,87-2,36), 2 (1,14 (0,55-1,78)) und 3 (1,05 44 Ergebnisse (0,61-2,57)), die einen kontinuierlichen Abfall zeigen. Am fünften postoperativen Tag jedoch steigt der mediane Wert sogar noch über das präoperative Ergebnis auf 1,35 (0,84-2,53) an. Präoperativ sind es sogar nur vier Probanden (14,3%), die nach Stimulation den unstimulierten Ausgangswert nicht erreichen, sprich mit der Aktivierungskapazität unter 1,0 bleiben. Tabelle 8: NF-κB Aktivierungskapazität der Kontrollgruppe (Carotispatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 1,14 1,14 1,07 1,09 1,01 Minimum 0,77 0,89 0,81 0,84 0,72 Maximum 1,58 1,63 1,51 1,47 1,53 Wie auch oben schon beschrieben, fällt bei der Kontrollgruppe eine deutlich geringere Schwankungstendenz auf. Am ersten postoperativen Tag verändert sich der Median mit 1,14 (0,89-1,63) im Vergleich zum präoperativen Wert von 1,14 (0,77-1,58) überhaupt nicht. An Tag 2 erfolgt ein Abfall auf 1,07 (0,81-1,51), an Tag 3 wiederum ein minimaler Anstieg auf 1,09 (0,84-1,47). Ein erneuter Abfall resultiert am fünften postoperativen Tag auf 1,01 (0,72-1,53). Von Tag 0 bis Tag 3 liegen jeweils 80 % der Probanden der Kontrollgruppe in einem Bereich von >/= 1,0 bis </= 1,5. Am fünften postoperativen Tag sind es 77%, allerdings konnten an diesem Tag sieben Patienten nicht mehr in die Auswertung miteinbezogen werden. Die folgenden Boxplots in Abbildung 9 erlauben den direkten Vergleich beider Gruppen. Hier wird deutlich, dass die Mediane der Versuchsgruppe vor allem an Tag 0 und 5 deutlich höher liegen als die der Kontrollprobanden. Auch der konstantere Verlauf der Kontrollgruppe und die geringeren Schwankungen werden hier anschaulich dargestellt. 45 Ergebnisse NF-κB Aktivierungskapazität Carotis BAA NF-kB stim / NF-κB unstim 2 2 1 1 0 0 1 2 3 5 Tage postoperativ Abbildung 9: Verlauf der NF-κB Aktivierungskapazität der Bauchaortenaneurysma-Patienten (blau) und der CarotisPatienten (grün) über alle fünf Messzeitpunkte, dargestellt als Boxplots (Mediane, 5-, 25-, 75- und 95%Perzentile) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 3.3 Verlauf der Zytokine Zusätzlich zu den von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen wurden an jedem Messzeitpunkt bestimmte Zytokine im Plasma der Patienten bestimmt. Im Einzelnen handelt es sich hier um Tumornekrosefaktor alpha, Interleukin-6 und Interleukin-8, alles Zytokine, denen eine Rolle im inflammatorischen Geschehen bzw. bei SIRS oder Sepsis nachgesagt werden. 3.3.1 Tumornekrosefaktor alpha TNF-α ist ein multifunktionales Zytokin des Immunsystems, welches bei lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen in Aktion tritt. Allerdings erlaubt eine erhöhte TNF-α Konzentration keine differentialdiagnostischen Schlussfolgerungen, sondern ist lediglich ein Marker für 46 ablaufende Entzündungsprozesse Ergebnisse unterschiedlichster Genese. Der Referenzbereich im Immunometrischen Assay liegt bei < 8,0 pg/ml. Abbildung 10: Verlauf von Tumornekrosefaktor α der BauchaortenaneurysmaPatienten (O-02 – O-58) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 20072008 Abbildung 11: Verlauf von Tumornekrosefaktor α der Carotis-Patienten (S-22 – S63) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Besieht man sich die graphische Darstellung der TNF-α Werte über den Verlauf aller fünf Messzeitpunkte beider Gruppen, konzentrieren sich die Messergebnisse im Bereich unter 20 pg/ml. Tatsächlich verlaufen in der Versuchsgruppe der BAA-Patienten die Werte von 60,7% der Probanden konstant unter 20 pg/ml. Immerhin noch 32,1% der Patientenverläufe bleiben sogar konstant unter 15 pg/ml. Nur 7% der Versuchsgruppe hingegen konnten über alle fünf Messzeitpunkte einen Verlauf über 20 pg/ml aufzeigen. Über 30 pg/ml bis hin zu 45 pg/ml bewegten sich die TNF-α Werte nur an drei einzelnen 47 Messzeitpunkten während der Ergebnisse Untersuchungen an der Versuchsgruppe. Ein einzelner hochschießender Wert von 148 pg/ml an Tag 5 des Probanden O-19 machte eine Erweiterung der Graphik nötig. Der postoperative Verlauf des TNF-α Wertes lässt keine einheitliche Tendenz erkennen. Auch präoperativ waren die Werte erhöht. Betrachtet man die Mediane, ändert sich der Wert von 12,6 pg/ml (8 pg/ml-30,8 pg/ml) präoperativ auf 12,6 pg/ml (8 pg/ml-25,2 pg/ml) am ersten postoperativen Tag nicht. Am zweiten und dritten postoperativen Tag kann man einen Anstieg auf 15,5 pg/ml (8 pg/ml-25,2 pg/ml) und weiter auf 15,8 pg/ml (7,6 pg/ml-29,6 pg/ml) als mediane Werte ausmachen. Obwohl an Tag fünf bei drei Probanden TNF-α Werte über 30 pg/ml gemessen wurden, fällt der mediane Wert auf 14,3 pg/ml (8 pg/ml-148 pg/ml) ab. Tabelle 9: TNF-α Konzentrationen in der Versuchsgruppe (Bauchaortenaneurysma-Patienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in pg/ml Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 12,6 12,6 15,5 15,8 14,3 Minimum 8 8 8 7,6 8 Maximum 30,8 25,2 25,2 29,6 148 Die Graphik in der Kontrollgruppe ähnelt der der Versuchsgruppe. 60% der Patienten bleiben über den Gesamtverlauf konstant unter 20 pg/ml. Nur ein Patient (S-44) weist im Verlauf über alle Messzeitpunkte einen TNF-α Wert von </= 10 pg/ml auf. Bei immerhin 35% der Probanden bewegen sich die Verläufe kontinuierlich in einem Rahmen von >/= 15 pg/ml bis <30 pg/ml. Allerdings gibt es auch zwei Patienten, S-41 und S-55, entsprechend 10% der Kontrollgruppe, die sowohl prä- als auch postoperativ in all ihren Messzeitpunkten einen TNF-α Wert konstant über 30 pg/ml halten. Eine Tendenz der Werte - ausgehend von der präoperativen TNF-α Konzentration - lässt sich allerdings auch hier, in der Vergleichsgruppe nicht ausmachen. Interessanterweise liegen die Mediane des Parameters in der Kontrollgruppe durchweg höher als in der Versuchsgruppe. Allerdings kommt es anders als in der Studiengruppe nach ähnlichen Werten an Tag 0 (16,5 pg/ml (9,8 pg/ml-45 pg/ml)) und Tag 1 (16,7 pg/ml (8,8 pg/ml-46,2 pg/ml) zu einem minimalen Abfall der TNFα Konzentration auf 15,6 pg/ml (9,6 pg/ml-39,4 pg/ml) am zweiten postoperativen 48 Ergebnisse Tag. Zu den beiden folgenden Messzeitpunkten steigt der TNF-α Spiegel weiter an (Tag 3 15,9 pg/ml (8,2 pg/ml-39,8 pg/ml)) und erreicht an Tag 5 einen Wert von 17,8 pg/ml (11,6 pg/ml-39,8 pg/ml). Tabelle 10: TNF-α Konzentration der Kontrollgruppe (Carotispatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in pg/ml Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 16,5 16,7 15,6 15,9 17,8 Minimum 9,8 8,8 9,6 8,2 11,6 Maximum 45 46,2 39,4 39,82 39,8 Abbildung 12 stellt den Verlauf beider Gruppen zur Verdeutlichung als Boxplots gegenüber. Tumor Nekrose Faktor-α 50 Carotis BAA 40 pg/ml 30 20 10 0 0 1 2 3 5 Tage postoperativ Abbildung 12: Verlauf von Tumornekrosefaktor α der Bauchaortenaneurysma-Patienten (blau) und der Carotis-Patienten (grün) über alle fünf Messzeitpunkte, dargestellt als Boxplots (Mediane, 5-, 25-, 75- und 95%Perzentile) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 49 Ergebnisse 3.3.2 Interleukin-6 Von den Zytokinen zeigt IL-6 am schnellsten, innerhalb von zwei bis vier Stunden nach einem akuten oder schweren Entzündungsereignis, einen Anstieg. Der Normwert von Interleukin-6 liegt bei < 11,3 pg/ml. Zwar fällt der Anstieg von Interleukin-6 proportional zum Schweregrad der Entzündung aus, es lässt jedoch ähnlich wie bei TNF-α keinen Schluss auf die Genese der Inflammation zu. Für schwere Traumen und Sepsis wurden allerdings die höchsten Werte (>1000 pg/ml) beschrieben. Betrachtet man die graphische Darstellung der Interleukin-6 Werte über alle fünf Messzeitpunkte kann man hier einen relativ homogenen Verlauf erkennen. Abbildung 13: Verlauf von Interleukin-6 der BauchaortenaneurysmaPatienten (O-02 – O-58) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 20072008 Abbildung 14: Verlauf von Interleukin-6 der Carotis-Patienten (S-22 – S63) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Bei der Versuchsgruppe der BAA-Patienten ist gut zu erkennen, dass 89,3% (25 Patienten) präoperativ unter dem Referenzwert von 11,3 pg/ml liegen. Nur zwei Patienten (7,1%) zeigen präoperativ IL-6 Werte von über 25 pg/ml. Der Großteil 50 Ergebnisse der Probanden zeigt einen extrem homogenen Verlauf. Bei 100% der Patienten ist ein Anstieg des IL-6 Wertes vom präoperativen Ausgangswert zur ersten postoperativen Messung zu erkennen. An Tag 1 bewegen sich die Maxima hier von einem zweifachen Anstieg des Referenzwerts auf 24,8 pg/ml bis zu einem über 60fachen Anstieg auf 670 pg/ml. Dabei liegt allerdings die Mehrheit der Versuchsgruppe, nämlich 67,9% am ersten postoperativen Tag in einem Bereich unter 100 pg/ml. Bei 32,1% der Probanden ergeben sich Werte von > 100 pg/ml und nur drei Patienten (10,7%) weisen Interleukin-6 Spiegel von > 400 pg/ml auf. Am zweiten postoperativen Tag resultiert insgesamt ein Abfall der Interleukin-6 Level, was auch sehr schön in der Median-Tabelle erkennbar ist. Trotzdem weisen immer noch 28,6% der Probanden IL-6 Werte > 100 pg/ml auf. Allerdings liegt nur ein Patient (3,6%) über einem Wert von 400 pg/ml. Die nachfolgend kräftig fallenden IL-6 Konzentrationen werden besonders daran deutlich, dass am dritten postoperativen Tag bereits 96,3% der Probanden der Versuchsgruppe einen IL-6 Spiegel < 100 pg/ml aufweisen können. Am fünften postoperativen Tag und letzten Messzeitpunkt sind 100% der Patienten unter 100 pg/ml gefallen und 60,7% befinden sich wieder innerhalb des Referenzbereiches. Tabelle 11 mit den Medianen, minimalen und maximalen Werten gibt hier nochmals einen Überblick. Tabelle 11: Interleukin-6 Konzentration der Versuchsgruppe (Bauchaortenaneurysma-Patienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in pg/ml Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 4 82,2 74,2 26,6 10,2 Minimum 4 24,8 34,2 11,8 5 Maximum 30,2 670 412 196,6 94,6 Die Studiengruppe lässt sich in Hinsicht auf den Verlauf der Interleukin-6 Werte sehr schön in zwei Untergruppen aufteilen. Die erste Untergruppe zeigt einen Maximalanstieg von Interleukin-6 am ersten postoperativen Tag. Zwar variiert hier die Höhe der Werte, der Verlauf über die fünf Messzeitpunkte allerdings ist tendenziell gleich. Nach einem mehr oder minder hohen Anstieg am ersten postoperativen Tag, sinken die Interleukin-6 Werte an Tag 2, 3 und 5 konsekutiv ab. Dieser Verlauf wird bei der Mehrheit der 51 Ergebnisse Patienten in der Versuchsgruppe, nämlich 67,9% so gemessen. Die Medianwerte der BAA-Gruppe zeigen über alle fünf Messzeitpunkte dasselbe Bild. Die zweite Untergruppe innerhalb der BAA-Patienten zeigt einen im Vergleich zur ersten Untergruppe etwas verzögerten Anstieg von Interleukin-6. Hier liegt das Anstiegsmaximum der Patienten am zweiten postoperativen Tag. Die Interleukin-6 Werte steigen hier also über den ersten postoperativen Tag kontinuierlich an, um dann nach dem Maximalpeak an Tag 2 über Tag 3 zu Tag 5 konsekutiv abzufallen. In der Studiengruppe sind von diesem Verlauf immerhin 25% der Probanden betroffen. Der Großteil der Studienteilnehmer in der Kontrollgruppe lässt graphisch ebenfalls einen homogenen Verlauf erkennen. Die Maxima sind auf den ersten oder zweiten postoperativen Tag verteilt. Insgesamt verhalten sich die Verläufe der Kontrollgruppe deutlich flacher als die der Studiengruppe. Präoperativ liegen auch hier 85% der Probanden innerhalb des Interleukin-6 Referenzwertes von 11,3 pg/ml. 3 Patienten (15%) zeigen erhöhte Werte, allerdings bis maximal 19,2 pg/ml, was lediglich das 1,7fache des Referenzwerts darstellt. Wieder resultiert bei allen Probanden (100%) ein deutlicher Anstieg des Interleukin-6 Levels von der präoperativen Messung zum Wert am ersten postoperativen Tag. Der maximale Wert liegt an Tag 1 bei 118, 8 pg/ml. Dies kommt einem Anstieg auf das 10,5fache des Normwertes gleich. Allerdings liegt nur ein Patient an Tag 1 über 100 pg/ml, was 5% der Vergleichsgruppe entspricht. 40% zeigen zwar einen Anstieg im Vergleich zur präoperativen IL- 6 Konzentration, bleiben mit ihrem Ergebnis allerdings auch am ersten postoperativen Tag im Normbereich. Ein insgesamtes Absinken der IL-6 Spiegel an den folgenden Messzeitpunkten erkennt man auch daran, dass sich schon am zweiten postoperativen Tag 50% der Carotisgruppe wieder im Normbereich befinden und im Vergleich zum ersten postoperativen Tag (10 Patienten entsprechend 50% >/= 15 pg/ml) nur noch 35% der Probanden Werte >/= 15 pg/ml aufweisen. An Tag 3 zeigen bereits 75% der Vergleichsgruppe normwertige Interleukin-6 Spiegel. Am fünften postoperativen Tag allerdings sind es prozentual schon wieder nur 69,2%, es gilt aber zu beachten, dass hier sieben Patienten aufgrund von Entlassung nicht mehr in die Messung einbezogen werden konnten. 52 Ergebnisse Tabelle 12: Interleukin-6 Konzentration der Kontrollgruppe (Carotispatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in pg/ml Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 4,4 15,1 11,1 8 6,2 Minimum 4 5,2 5,4 4 4 Maximum 19,2 118,8 71,6 60,8 19,4 Betrachtet man zusätzlich die oben stehenden Median-Werte, wird der Verlauf nochmals veranschaulicht. Direkt am postoperativen ersten Tag erfolgt ein Anstieg auf 15,1 pg/ml (5,2 pg/ml-118,8 pg/ml), darauf folgend ein konsekutiver Abfall der Interleukin-Werte zurück in den Referenzbereich. Auch die Kontrollgruppe lässt sich in zwei weitere Untergruppen einteilen. Wie bei der Versuchsgruppe der BAA-Patienten lassen sich die Verläufe der Patienten aufsplitten. Untergruppe 1 zeigt bei 60% der Patienten einen Verlauf, der das Interleukin-6 Maximum am ersten postoperativen Tag aufweist. Dies korreliert mit dem Median-Wert (vgl. Tabelle 12). Untergruppe 2 hingegen, die 40% der Carotis-Patienten einschließt, besitzt den IL6 Peak am zweiten postoperativen Tag. Der Interleukinanstieg erscheint hier verzögert, fällt dann aber nach Tag 2 bei den meisten Patienten ebenfalls wieder kontinuierlich in den Normbereich ab. Die unten stehenden Boxplot-Diagramme in Abbildung 15 zeigen den direkten tagesabhängigen Vergleich der beiden Gruppen. Die Kontrollgruppe zeigt nicht nur deutlich geringere Interleukinspiegel über den Gesamtverlauf, sie bleibt auch in der Streubreite der einzelnen Tage geringer. 53 Ergebnisse Interleukin-6 500 Carotis BAA 400 pg/ml 300 200 100 0 0 1 2 3 5 Tage postoperativ Abbildung 15: Verlauf von Interleukin-6 der BauchaortenaneurysmaPatienten (blau) und der Carotis-Patienten (grün) über alle fünf Messzeitpunkte, dargestellt als Boxplots (Mediane, 5-, 25-, 75- und 95%-Perzentile) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 3.3.3 Interleukin-8 Ebenso wie die beiden vorangehend beschriebenen Zytokine erlaubt auch eine Erhöhung des Interleukin-8 Spiegels keine differentialdiagnostischen Rückschlüsse, sondern zeigt lediglich das Ablaufen eines Entzündungsprozesses unterschiedlichster Ursachen an. Prognostische Bedeutung erlangt IL-8 bei Sepsis und Trauma. Zusätzlich wird es auch zur Frühdiagnostik bei neonataler Sepsis eingesetzt. Der Referenzwert von Interleukin-8 liegt im Labor der Universität Ulm bei < 70 pg/ml. Auf den ersten Blick erscheint die Gesamtgraphik der Interleukin-8 Verläufe bei der Versuchsgruppe (BAA-Patienten) über alle Messzeitpunkte uneinheitlich. Es fällt aber auf, dass präoperativ - also an Tag 0 - 100% der Patienten einen Wert von 10 pg/ml aufweisen. 54 Ergebnisse Abbildung 16: Verlauf von Interleukin-8 der BauchaortenaneurysmaPatienten (O-02 – O-58) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 20072008 Abbildung 17: Verlauf von Interleukin-8 der Carotis-Patienten (S-22 – S63) über alle fünf Messzeitpunkte Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Weitergehend zeigen knapp die Hälfte der Patienten, nämlich 46,4% über den Zeitraum aller fünf Messzeitpunkte kontinuierlich einen Interleukin-8 Wert von 10 pg/ml. Lediglich zu zwei Messzeitpunkten an Tag 2 und 3 bei zwei verschiedenen Patienten der Studiengruppe steigt der Interleukin-8 Wert über den Referenzbereich und es werden Werte von > 70 pg/ml gemessen. Weitere Untergruppen führen zu einheitlicheren Verläufen der Interleukinspiegel. Wieder kristallisiert sich eine Gruppe heraus, bei der 28,6% der Patienten am ersten postoperativen Tag die höchste Interleukin-8 Konzentration aufweisen. Hier sticht besonders Patient O-19 heraus, der mit einem Wert von 148,4 pg/ml weit aus dem Feld der restlichen Patienten ausreißt. Eine weitere Untergruppe bilden vier Probanden (14,3%), die ihren IL-8 Maximalpeak erst am zweiten postoperativen Messzeitpunkt erreichen. Diesmal schießt Patient O-51 bis zu 75 pg/ml hinauf. Die anderen Verläufe dieser Gruppe 55 Ergebnisse bewegen sich alle in einem Bereich von </= 21 pg/ml. Bei einem Blick auf die Median-Tabelle lässt sich zusammenfassend sagen, dass die meisten der Patienten keine oder nur extrem geringfügige Veränderungen in ihrem Interleukin-8 Spiegel aufweisen. Der Median in der Versuchsgruppe hält sich über alle Messzeitpunkte bei 10 pg/ml, was völlig dem Referenzbereich entspricht. Tabelle 13: Interleukin-8 Konzentration der Versuchsgruppe (Bauchaortenaneurysma-Patienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in pg/ml Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 10 10 10 10 10 Minimum 10 10 10 10 10 Maximum 10 148,4 75 16,6 23,6 Bei Betrachtung der Verlaufsgraphik der Kontrollgruppe fällt im Gegensatz zur Gruppe der BAA-Patienten die enorme Homogenität auf. Außer einem steilen Anstieg der IL-8 Konzentration bei Patient S-62 auf 30,6 pg/ml an Tag 2 sind nur minimalste Schwankungen zu erkennen. Wie bei der Versuchsgruppe wird bei der Vergleichsgruppe der 20 Carotispatienten an Tag 0 konstant ein Wert von 10 pg/ml gemessen. Bei 80% der Patienten in der Kontrollgruppe zieht sich dieser Spiegel sogar kontinuierlich über alle fünf Messzeitpunkte. Die Tabelle der medianen, minimalen und maximalen Werte an den verschiedenen Messzeitpunkten bestätigt nur dieses Bild. Zu jedem Zeitpunkt liegen alle Messwerte im Referenzbereich für Interleukin-8. Tabelle 14: Interleukin-8 Konzentrationen der Kontrollgruppe (Carotispatienten): Median, Minimum und Maximum an allen Messzeitpunkten in pg/ml Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 5 Median 10 10 10 10 10 Minimum 10 10 10 10 10 Maximum 10 10,8 30,6 11,4 10 Die Gegenüberstellung der Boxplotdiagramme pro Messzeitpunkt zeigt hier ganz deutlich, wie wenig sich der Interleukin-8 Spiegel bei beiden Versuchsgruppen 56 Ergebnisse verändert. Es ist eine durchgängige Konstanz von 10 pg/ml zu erkennen, die nur selten von Ausreißern unterbrochen wird. Diese Ausreißer sind in der Studiengruppe der BAA-Patienten allerdings häufiger. Interleukin-8 25 Carotis BAA pg/ml 20 15 10 5 0 1 2 3 5 Tage postoperativ Abbildung 18: Verlauf von Interleukin-8 der BauchaortenaneurysmaPatienten (blau) und der Carotis-Patienten (grün) über alle fünf Messzeitpunkte, dargestellt als Boxplots (Mediane, 5-, 25-, 75- und 95%-Perzentile) Universitätsklinikum Ulm 2007-2008 3.4 Korrelationsanalysen Nachdem die Zielgrößen im vorangehenden Teil ausführlich deskriptiv erläutert wurden, sollen die sie nun anhand von Kreuzkorrelationen miteinander verglichen werden. Bei einer Studie dieser Art wurde der Spearman Korrelationskoeffizient verwendet, der bei ordinalen Daten, wie sie hier vorliegen, verwendet werden kann. Im Besonderen stellt sich natürlich die Frage, ob Korrelationen zwischen den von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen und den drei verschiedenen Zytokinen ableitbar sind. Um dies herauszufinden, werden alle drei mit NF-κB verwandten Größen, nämlich die NF-κB Bindungsaktivität, die NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 und die NF-κB Aktivierungskapazität jeweils an jedem einzelnen Messzeitpunkt 57 Ergebnisse mit den Zytokinen Interleukin-6, Interleukin-8 und TNF-α korreliert. Ebenso werden die präoperativen Werte von NF-κB Bindungsaktivität und NF-κB Aktivierungskapazität auf Korrelationen mit den postoperativen Zytokinspiegeln hin untersucht. Außerdem wird der Frage nachgegangen, ob der präoperative Zytokinspiegel Korrelationen mit der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 aufweist. 3.4.1 NF-κB Bindungsaktivität In der Versuchsgruppe der BAA-Patienten konnten keinerlei signifikante Korrelationen der NF-κB Bindungsaktivität mit den Zytokinen Interleukin-6, Interleukin-8 und TNF-α ausgemacht werden. Dies gilt ebenso für die Korrelationen an den jeweiligen Messzeitpunkten als auch für den Vergleich des präoperativen Ausgangswerts der Bindungsaktivität mit den postoperativen Zytokinspiegeln. Im Gegensatz dazu konnten in der Kontrollgruppe durchaus signifikante Werte der Bindungsaktivität mit den Zytokinen festgestellt werden. Hier weist die NF-κB Bindungsaktivität vor allem Korrelationen mit Interleukin-6 auf. So zeigen die präoperativen BA- Werte signifikante (p<0,05) gegensinnige Kreuzkorrelationen zu Tag 2 (rSP=-0,518) und zu Tag 5 (rSP=-0,611) der Interleukin 6-Messung. Ebenfalls gegensinnig signifikant korreliert die Bindungsaktivität am ersten postoperativen Tag mit dem TNF-α- Wert zum gleichen Messzeitpunkt (p<0,05; rSP=-0,449) und am zweiten postoperativen Tag mit dem gleichzeitig gemessenen Interleukin-6 Wert (p<0,05; rSP=-0,489). 3.4.2 NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 Anders als bei der NF-κB Bindungsaktivität treten in der Studiengruppe signifikante Korrelationen der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 mit TNF-α auf. Es ist vor allem eine hochsignifikante gegensinnige Korrelation (p<0,01) der Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 mit TNF-α am zweiten postoperativen Tag mit rSP=-0,495 auszumachen. Auch an Tag 5 korrelieren TNF-α und die BA relativ zu Tag 0 gegensinnig signifikant (p<0,05) miteinander (rSP=-0,435). Abgesehen von TNF-α zeigt die NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 allerdings überhaupt keine signifikanten Korrelationen mit den anderen beiden 58 Ergebnisse Zytokinen. In der Vergleichsgruppe der an der Carotis operierten Patienten zeigen hingegen TNF-α und Interleukin-8 keinerlei signifikante Korrelationen mit der BA relativ zu Tag 0. Lediglich bei Interleukin-6 wurden solche Korrelationen gefunden. So korreliert am postoperativen dritten (rSP=0,469) und fünften Tag (rSP=0,622) die NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 gleichsinnig mit Interleukin-6 mit einer Signifikanz von p<0,05. Wie auch bei der Versuchsgruppe für die TNF-α Werte korrelieren an Tag 5 die BA relativ zu Tag 0 Werte signifikant (p<0,05), diesmal allerdings gleichsinnig mit den präoperativen Interleukin-6 Werten (rSP=0,621). 3.4.3 NF-κB Aktivierungskapazität Als letzte NF-κB Zielgröße wurde die NF-κB Aktivierungskapazität mit den Zytokinen korreliert. Hier ergibt sich in der Versuchsgruppe lediglich eine signifikante Korrelation. Wieder sind es die TNF-α Werte, die hier an Tag 0 eine gegensinnige Korrelation (rSP=-0,377) mit einer Signifikanz von p<0,05 mit den Werten der NF-κB Aktivierungskapazität ebenfalls an Tag 0 aufzeigen. Im Hinblick auf die beiden anderen Zytokine Interleukin-6 und -8 sind keine signifikanten Korrelationen auszumachen. Anders ist das in der Kontrollgruppe. Zwar zeigt hier auch vor allem TNF-α wieder signifikante Korrelationen, aber ebenso korrelierte Interleukin-6 an Tag 5 mit der Aktivierungskapazität. Die präoperativen Werte der NF-κB Aktivierungskapazität korrelieren mit einer Signifikanz von p<0,05 am zweiten und dritten postoperativen Tag mit den TNF-α Konzentrationen der Carotis-Patienten. Wie auch bei der Versuchsgruppe ist die Korrelation hier gegensinnig und der Korrelationskoeffizient beträgt am zweiten Tag rSP=-0,553 und am dritten Tag rSP=-0,530. Bei der Kreuzkorrelation der NF-κB Aktivierungskapazität mit Interleukin-6 erreichen die Werte am fünften postoperativen Tag Signifikanz (p<0,05). Der Korrelationskoeffizient beträgt hier rSP=-0,559 und zeigt somit eine gegensinnige Korrelation an. Im Allgemeinen fällt auf, dass die Kontrollgruppe deutlich mehr Korrelationen der von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen mit den Zytokinen aufweist als die Versuchsgruppe mit den an der Bauchaorta operierten Probanden. Zudem finden 59 Ergebnisse sich signifikante Korrelationen in der Versuchsgruppe alleine zu TNF-α und korrelieren auch stets gegensinnig. In der Kontrollgruppe hingegen gibt es signifikante Korrelationen neben TNF-α auch mit Interleukin-6. Die Korrelationen der Zielgrößen sind hier, mit Ausnahme der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0, die durchgehend gleichsinnig korreliert, ebenfalls gegensinnig. Auffällig ist auch, dass allein die Korrelationsanalysen mit Interleukin-8 durchweg keine signifikanten Ergebnisse in beiden Gruppen brachten. Bis auf eine Ausnahme in der Versuchsgruppe, bei der sich eine hochsignifikante Korrelation p<0,01 der BA relativ zu Tag 0 mit TNF-α ergab, blieb auch das Signifikanzlevel mit p<0,05 kontinuierlich dasselbe. 60 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Einleitung Nicht nur in Deutschland stellt die Sepsis ein häufig komplexes, ernstes und kostenintensives Problem auf Intensivstationen dar. Die Kosten, die damit verbunden sind, gehen mit einer großen Belastung für das Gesundheitssystem einher [68, 107, 108]. Leider sind die pathophysiologischen Vorgänge, die zu septischen Erkrankungen führen, noch nicht gänzlich verstanden. Hier sind vor allem zwei sich gegenüberstehende Mechanismen von essentieller Bedeutung. Zum einen scheint eine Überregulation des Immunsystems mit nachfolgender Hyperinflammation eine entscheidende Rolle zu spielen, zum anderen wurde bei Sepsispatienten eine Art Paralyse in der Immunantwort entdeckt. An verschiedenen vorherrschenden Theorien Theorie scheiden wird sich hier angenommen, die Geister. dass nach Bei der einer hyperinflammatorischen Phase, die von den meisten Patienten überlebt wird, ein Zustand der Immunparalyse eintritt, der dem Körper deutlich schwerer zu schaffen macht [22, 111]. Andere Studien konnten allerdings auch zeigen, dass eine vorbestehende Immunparalyse erst zur Entstehung und Fulminanz der Sepsis führt [144]. Somit zeigt sich, wie wichtig es ist, ein zuverlässiges Monitoring zu finden, dass nicht nur erlaubt, das Ausmaß der Sepsis, sondern auch die Phase, in der sich die Immunantwort befindet, zuverlässig einzuschätzen. Die Bedeutung, die der Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor kappa B (NF-κB) in der Immunantwort einnimmt, lässt ihn in dieser Hinsicht vielversprechend erscheinen. Sowohl pro- als auch antiinflammatorisch wirksam ist NF-κB ein wichtiger Regulator des Immunsystems im entzündlichen Geschehen [93]. Auch für die Pathogenese der Sepsis spielen gerade diese gegensätzlichen Wirkungen des Nukleären Faktors eine Rolle. In mehreren Patientenstudien wurde die NF-κB Aktivierung als Marker im septischen Geschehen getestet. Hier stellte sich heraus, dass eine erhöhte Aktivität von NF-κB durchaus mit ungünstigen Verläufen bei Sepsispatienten korreliert [17, 28, 114]. Allerdings wurde in diesen Studien ein Anstieg erst während des Krankheitsverlaufes festgestellt. Als Parameter mit präoperativer 61 Diskussion Aussagekraft wurde NF-κB ebenfalls untersucht und korrelierte positiv mit der Letalität der Patienten [59]. Andererseits konnte im Tiermodell gezeigt werden, dass es ohne funktionstüchtigen NF-κB Signalweg zur verstärkten Anfälligkeit im Bezug auf septische Erkrankungen kommt [60], und dass eine ausreichende Grundaktivität von NF-κB unabdingbar nötig ist, um antiinflammatorische Signale zu vermitteln, die für die Auflösung einer Entzündung nötig sind [76]. Es lässt sich also schlussfolgern, dass NF-κB durchaus das Potential eines inflammatorischen Monitorings für Sepsis bietet, sich allerdings noch nicht klar sagen lässt, ob die Aktivität des Nukleären Faktors in den einzelnen Phasen der Erkrankung eher destruktiver oder protektiver Art für das weitere Fortschreiten des septischen Geschehens ist [128]. Ein weiteres Problem, das zum jetzigen Zeitpunkt ein Monitoring mittles NF-κB nicht erlaubt, ist die unterschiedliche Methodik der Aktivitätsmessung. Fast alle Referenzstudien unterscheiden sich in der Bestimmungsart der NF-κB Aktivität und erschweren somit den Vergleich der Studien untereinander [28, 59, 109]. Als Goldstandard der NF-κB Aktivitätsmessung gilt der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), der die Möglichkeit bietet, die einzelnen NF-κB Proteine direkt nachzuweisen. Der Nachteil des EMSA liegt darin, dass nur halbquantitative Aussagen gemacht werden können. Somit war es bisher nötig, eine Basis zu bestimmen, auf die die NF-κB Aktivität Bezug nehmen kann. Dies wurde in den einzelnen Studien ebenfalls unterschiedlich umgesetzt. Zum Beispiel betrachtete man die NF-κB Aktivität in einem gesunden Patientenkollektiv [17] oder die NF-κB Aktivität derselben Studienperson am ersten gemessenen Zeitpunkt [28] als „Baseline“. Dies zeigt allerdings weiterhin, wie schwierig ein Vergleich der einzelnen Studien ist. Eine vorangehende Dissertation beschäftigte sich intensiv mit dem Thema, wie sich eine quantitative Aussage per EMSA als standardisierte Methode etablieren ließe [41]. Die Ergebnisse bei Versuchen an gesunden Probanden zeigten, dass die Aktivierungskapazität eine geeignete Größe zur Deskription des Funktionszustands im NF-κB Signalweg darstellt, da die Immunzellen der Probanden unabhängig vom Ausgangswert in der Lage waren, adäquat auf einen inflammatorischen Reiz zu reagieren. Im Gegensatz dazu erwiesen sich Einzelmessungen der NF-κB Aktivität aufgrund zu großer Streuungen als weniger geeignet. 62 Diskussion Vor dem Hintergrund dieser vorangegangenen Studie soll nun die verbesserte Methodik zur NF-κB Bestimmung auf ein Kollektiv kranker Patienten angewendet werden, die aufgrund ihrer Elektivoperation ein Trauma ähnlich eines SIRS nicht infektiöser Genese erleiden. Der Gedanke dabei ist, den NF-κB Signalweg in einem Zustand zu untersuchen, der einem inflammatorischen und somit septischen Geschehen möglichst nahe kommt. 4.2 Probandenkollektiv 50 Patienten der gefäßchirurgischen Abteilung der Universitätsklinik Ulm fanden primär Eingang in die vorliegende Studie. Bei ihnen wurde in der perioperativen Phase an einem Messzeitpunkt vor und an vier Messzeitpunkten nach der Operation die Aktivierung des NF-κB Signalwegs in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PMNCs) untersucht. Der Versuchsgruppe von 30 Patienten mit schwerem abdominellem gefäßchirurgischen Eingriff stand eine Kontrollgruppe von 20 Patienten mit gering traumatisierendem gefäßchirurgischen Eingriff gegenüber. Die Patienten in der Versuchsgruppe wurden ausschließlich der Elektivoperation eines Bauchaortenaneurysmas unterzogen. Während dieser Operation ist zum Einsetzen der Prothese ein Crossclamping der Aorta notwendig. Dieses schwere chirurgische Trauma induziert systemisch ablaufende pathophysiologische Vorgänge, wie sie auch bei SIRS zu finden sind [57, 58, 99, 136]. In der vorliegenden Studie dient der große operative Eingriff in der Versuchsgruppe also als Modell für den Ablauf eines inflammatorischen Prozesses. Die Kontrollgruppe von 20 Probanden unterzog sich einer Thrombendarteriektomie (TEA) an der Arteria Carotis. Diese Operationen waren ebenfalls elektiv, verglichen mit dem Eingriff an der Bauchaorta, jedoch im Operationsverlauf deutlich kürzer und nicht mit einem Ischämie/ReperfusionTrauma verbunden. Zudem ist das postoperative Outcome der Patienten bei einer Operation an der Carotis auch aufgrund der geringeren Invasivität besser [137, 146]. Die Gegenüberstellung gerade dieser beiden Gruppen ließ somit einen Vergleich zwischen Effekten, die bagatell-traumatisch assoziiert sind, wie bei einer Operation an der Arteria Carotis und Abläufen, wie sie bei schwer traumatisierenden Eingriffen z.B. an der Bauchaorta stattfinden, die in der 63 Diskussion Pathophysiologie SIRS ähneln, zu. Im Hinblick auf die demographischen Daten der Patienten war ein Vergleich beider Gruppen sehr gut möglich. Der Altersdurchschnitt unterschied sich zwischen beiden Gruppen lediglich um drei Jahre. Allerdings war hinsichtlich der Geschlechterverteilung eine große Diskrepanz zu sehen. In der Versuchsgruppe der BAA-Patienten befand sich unter den 28 ausgewerteten Patienten nur eine weibliche Person. Zu einem Teil ist dies durch die Epidemiologie des Krankheitsbildes bedingt. Das männliche Geschlecht gilt zwar als Risikofaktor für abdominelle Aortenaneurysmen, allerdings nur in einem Verhältnis von 1:5 (weiblich zu männlich) [56, 132] oder 1:4 (weiblich zu männlich) [72]. In der Kontrollgruppe lag das Geschlechterverhältnis hingegen bei 45% männlichen und 55% weiblichen Patienten. Eine epidemiologische Erklärung lässt sich hierfür nicht finden. In den meisten Studien wird das Geschlechterverhältnis für Carotisstenosen von männlichen zu weiblichen Patienten als 2:1 angegeben [48, 52]. Da das Geschlecht als Einschlusskriterium in diese Studie keine Rolle spielte, kann davon ausgegangen werden, dass die Verteilung hier dem Zufall entspricht. Ausgeglichen war hingegen das Verhältnis von Vorerkrankungen in beiden Gruppen. Hier litten prozentual ähnlich viele Patienten an arteriellem Hypertonus, Hyperlipidämie, Diabetes Typ II oder Koronarer Herzkrankheit/Myokardinfarkt. Dies ist nicht weiter verwunderlich, da diese Leiden definitiv eine Prädisposition für Erkrankungen am Gefäßsystem allgemein darstellen. Eine Ausnahme stellte hier die Häufigkeit von Apoplex-Ereignissen in der Kontrollgruppe der Carotispatienten dar. Mit einer Ratio von 50% zu nur 4% in der Versuchsgruppe liegt diese Erkrankung in der Kontrollgruppe also deutlich höher. Verwunderlich ist dies allerdings nicht, wenn man bedenkt, dass eine Stenose der Arteria Carotis einen eindeutigen Risikofaktor für einen Schlaganfall darstellt [1] und bei gut 30% der Schlaganfallpatienten eine Carotisstenose die zugrunde liegende Ursache ist [43]. 4.3 Verlauf der von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen Im Rahmen großer operativer Eingriffe, wie in der vorliegenden Studie bei Operationen an der Bauchaorta kommt es fast zwangsläufig zur Traumatisierung 64 Diskussion von Gewebe, ausgeprägten Blutverlusten mit folgenden Mikrozirkulationsstörungen und mangelhafter Gewebsoxygenierung [71, 83]. Die hier induzierten Ischämie- und Reperfusionsschäden führen zu oxidativem Stress mit Ausschüttung von Sauerstoffradikalen und Entzündungsmediatoren. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass genau diese Faktoren, die im Verlauf chirurgischer Interventionen auftreten können, zur Aktivierung des IKK/NF-κBSystems führen [34, 69, 139]. Allerdings gibt es Hinweise auf eine zweischneidige Funktion von NF-κB. Zum einen ist NF-κB in der Lage, die Entzündung über positive Rückkopplungsmechanismen zu erhalten oder sogar weiter aufzuschaukeln. Andererseits wird auch eine Mitbeteiligung von NF-κB bei der Terminierung einer Entzündung durch Induktion antiinflammatorischer Gene diskutiert [93]. Vor diesem Hintergrund geht diese Studie der Frage nach, inwiefern sich das operativ gesetzte Trauma im NF-κB System widerspiegelt und ob sich hinsichtlich des Verlaufs, der Dauer und des Ausmaßes der NF-κB Bindungsaktivität oder der NF-κB Aktivierungskapazität Unterschiede ergeben. 4.3.1 NF-κB Bindungsaktivität Die im Folgenden als NF-κB Bindungsaktivität (NF-κB BA) bezeichnete Größe entspricht der reinen, unstimulierten NF-κB Konzentration, die an den einzelnen Messzeitpunkten in PSL gemessen wird. In der Versuchsgruppe wird ausgehend von der präoperativen NF-κB Konzentration ein Werteanstieg bis Tag 2 beobachtet. Es ist durchaus möglich, dass dieser Anstieg eine Reaktion auf das durch die Operation ausgelöste Trauma darstellt. Wie schon mehrfach beschrieben [4, 34, 89], könnte die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren und Sauerstoffradikalen, wie sie bei Ischämie/Reperfusionsgeschehen üblich ist, zu einer Aktivierung des IKK/NF-κB Systems geführt haben und somit einen Anstieg der NF-κB Bindungsaktivität über den postoperativen Wert ausgelöst haben. Der Rückgang der Bindungsaktivität am dritten postoperativen Tag kann zum einen als Erschöpfungsreaktion gedeutet werden, bei der durch die vorangegangene starke Stimulation des NF-κB Signalwegs die Translokation von NF-κB in den Zellkern nachlässt. Zum anderen kann durch nachlassende Stimulation, sprich durch die verminderte Inflammationsreaktion oder durch Erholung des Körpers, die Aktivierung des NFκB Signalwegs sinken. Betrachtet man den erneuten Anstieg der NF-κB BA an 65 Diskussion Tag 5 erscheint es wahrscheinlicher, dass nach einer Erschöpfungsphase an Tag 3 aufgrund der hohen Aktivität am ersten und zweiten postoperativen Tag, eine Regenerationsphase auftritt, die sich im erneuten NF-κB Anstieg bemerkbar macht. Allerdings könnte man diesen Anstieg an Tag 5 auch mit der antiinflammatorischen Funktion von NF-κB begründen [93]. Die erneute Erhöhung der Bindungsaktivität am fünften postoperativen Tag könnte auf das Bestreben des Organismus hindeuten, durch eine Hochregulation antiinflammatorischer Genprodukte durch NF-κB auf die Auflösung der bestehenden Entzündung hinzuarbeiten. Die Konzentrationen der NF-κB Bindungsaktivität der Kontrollgruppe unterscheiden sich deutlich im Vergleich mit der Versuchsgruppe. Schon die präoperativen Werte erreichen nicht die Höhe der Werte der BAA-Patienten. Im weiteren Verlauf liegen die Werte durchschnittlich immer im selben Bereich. Ein einziger etwas deutlicherer Anstieg kann an Tag 5 verzeichnet werden. Hier steigt die Bindungsaktivität sogar über den präoperativen Ausgangswert an. Insgesamt scheint die Operation an der Arteria Carotis hiermit ihren Stellenwert als bagatelltraumatisierenden Eingriff zu unterstreichen. Eine offensichtliche Aktivierung des NF-κB Signalwegs mit vermehrter Translokation von NF-κB in den Zellkern scheint hier nicht gegeben. Die Erhöhung der Bindungsaktivität am fünften postoperativen Tag lässt sich möglicherweise mit dem frühen Ausscheiden von sieben Patienten der Vergleichsgruppe erklären. Aufgrund ihres guten Allgemeinzustandes wurden immerhin 35% bereits vor dem fünften Messzeitpunkt entlassen. Die höheren NF-κB Konzentrationen an Tag 5 lassen sich nun eventuell mit dem schlechteren Allgemeinzustand der verbliebenen Patienten erklären und mit der Tatsache, dass über 50% (53,6%) gerade dieser länger stationär liegenden Patienten von Anfang an eine höhere NF-κB Bindungsaktivität (>5000 PSL) aufwiesen. Im direkten Vergleich der Mediane beider Gruppen kann man deutlich sehen, dass die NF-κB Bindungsaktivität in der Kontrollgruppe kontinuierlich unter der BA der BAA-Patienten liegt. Wie schon vorher erwähnt, kann man dies auf das minder schwere Trauma der Carotisoperation im Vergleich zur Operation an der Abdominalaorta zurückführen. Das allerdings auch präoperativ höhere Werte in beiden Gruppen messbar sind, liegt sicher daran, dass die Patienten auch vor der Operation nicht gesund sind, 66 Diskussion sondern an Voerkrankungen leiden [132]. Obwohl durch eine vorangehende Studie gezeigt wurde [41], dass durch Einzelmessungen von NF-κB keine genaue Aussage hinsichtlich des Aktivierungsvermögens gemacht werden kann, wurde diese Größe bewusst gewählt, um einen eventuellen Zusammenhang mit dem Verlauf der Zytokine zu untersuchen. Trotzdem müssen diese Einzelmessungen mit einer gewissen Skepsis betrachtet werden, da sich die reine NF-κB Bindungsaktivität durch eine enorme Streuung der Werte durchgehend an allen Messzeitpunkten auszeichnet. 4.3.2 NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 Die extreme Streubreite der ordinalen Werte der NF-κB Bindungsaktivität ist der Grund dafür, die Bindungsaktivität an den einzelnen Messpunkten in Bezug zur präoperativen Messung zu setzen. Diese Größe wird hier im Folgenden NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 (BA rel 0) genannt. Das Prinzip entspricht hier einem ähnlichen, das Böhrer et al. in ihrer Studie 1997 anwandten [28]. Im Unterschied zu Böhrer wird in dieser Studie der präoperative Wert als 100% angesehen, alle weiteren Werte an Tag eins bis fünf können als Multiplikationsfaktor zum Ausgangswert betrachtet werden und besitzen daher keine Einheit. In der Versuchsgruppe zeigt sich, dass nur wenige Probanden eine starke Aktivierung im Vergleich zu ihrem präoperativen Wert aufweisen. Im Hinblick auf die Böhrer-Studie, die die NF-κB Aktivierung bei septischen Patienten untersuchte, erscheinen die Werte sogar ziemlich gering. Es drängt sich die Frage auf, ob die Operation eines Bauchaortenaneurysmas wirklich vergleichbare pathophysiologische Vorgänge auslösen kann, wie diese bei einer Sepsis ablaufen. Die Weiterentwicklung und das Fortschreiten der operativen Techniken vermögen möglicherweise selbst bei solch invasiven Operationen das Trauma auf einem generell sehr geringen Level zu halten. Der größere Anteil in der Gruppe der Studienpatienten weist am ersten postoperativen Tag sogar eine geringere Bindungsaktivität auf als an Tag 0. Betrachtet man die medianen Werte an allen vier postoperativen Messzeitpunkten, ist kein einziges Mal eine Erhöhung der NFκB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 zu erkennen. Diese Quotienten stehen also im Gegensatz zu den Rohdaten der reinen NF-κB Bindungsaktivität, bei der die Mediane über den Verlauf hinweg doch ein Bild des Anstiegs der NF-κB Aktivität 67 Diskussion bis zum zweiten postoperativen Wert und einen nachfolgenden Abfall vermittelten. Dieser Verlauf muss aber möglicherweise auf die außerordentlich große Streuung der Einzelwerte zurückgeführt werden und kann nicht als Tatsache gelten. In der Kontrollgruppe entspricht der mediane Verlauf der NF-κB Bindungsaktivität zu Tag 0 hingegen ziemlich genau den Rohwerten der reinen NF-κB Bindungsaktivität. An Tag 1 bis 3 zeigt sich im Vergleich zum präoperativen Wert nur ein minimaler Abfall und auch der Anstieg der NF-κB Aktivität an Tag 5 spiegelt sich in der Quotientenbildung wieder. Dies lässt wie auch schon bei der reinen BA den Schluss zu, dass bei den Patienten, die sich einer TEA der Carotis unterzogen, das operative Trauma nicht ausreichend für eine deutliche Aktivierung der NF-κB Signalkaskade war. Somit bestätigt sich auch bei der Bewertung dieser Zielgröße der Status der Carotispatienten als Kontrollgruppe mit sehr geringem operativen Trauma. 4.3.3 NF-κB Aktivierungskapazität In vorangehenden Untersuchungen zur standardisierten Messung von NF-κB zeigte sich, dass Einzelmessungen der reinen unstimulierten NF-κB Bindungsaktivität unzureichende Aussagekraft haben [41]. Eine sinnvollere Größe, um den Funktionszustand des NF-κB Signalwegs zu beschreiben, scheint hier die NF-κB Aktivierungskapazität zu sein. Bei diesem Parameter werden die mononukleären Zellen in vitro mit 10 ng TNF-α stimuliert und nachfolgend wird die stimulierte NF-κB Bindungsaktivität in Bezug zur reinen unstimulierten Bindungsaktivität gesetzt. Somit erhält man eine Aussage über die in vitro Stimulierbarkeit des NF-κB Signalwegs. Da dieser Wert durch Quotientenbildung entsteht, besitzt er keine Einheit. Im medianen Verlauf der Werte in der Versuchsgruppe nimmt die Aktivierungskapazität ausgehend vom präoperativen Wert bis zum dritten postoperativen Tag konstant ab. War präoperativ noch eine Stimulation von 121% möglich, ist sie an Tag 3 nur noch bei 105%. Ein Erklärungsansatz hierfür wäre, dass das NF-κB System präoperativ noch kaum aktiviert ist und somit viele Ressourcen hat, die auf die Stimulation reagieren können. Führt nun das operativ gesetzte Trauma an der Aorta und ein nachfolgendes inflammatorisches Geschehen zur in vivo Aktivierung des NF-κB Signalwegs, sinken die Kapazitäten zur Stimulation mit TNF-α in vitro. Dies resultiert in einer verminderten 68 Diskussion Aktivierungskapazität an Tag 1 und Tag 2 von nur 115% bzw. 114%. Die noch geringere Aktivierungskapazität an Tag 3 könnte zum einen darauf hindeuten, dass das inflammatorische Geschehen an den ersten beiden postoperativen Tagen so schwerwiegend war, dass nun eine Art Erschöpfungsreaktion eintritt. Zum anderen könnte eine extrem starke in vivo Ausschöpfung der NF-κB Ressourcen am dritten postoperativen Tag damit zusammenhängen, dass NF-κB nun verstärkt an der Auflösung der Entzündung mitarbeitet. Am fünften postoperativen Tag hingegen wird ein Anstieg der NF-κB Aktivierungkapazität auf 135% über den präoperativen Wert sichtbar. Diese erneute starke in vitro Aktivierbarkeit lässt auf ein erholtes NF-κB System schließen, das nun wieder Kapazitäten hat, mit der es auf diese Stimulation reagieren kann. Dass die Aktivierungskapazität sogar den präoperativen Wert übersteigt, lässt sich mit einer Art Triggerung durch das vorgegangene inflammatorische Ereignis in Verbindung bringen. Möglicherweise befinden sich nach Ablaufen oder bei Rückgang des entzündlichen Geschehens mehr NF-κB Dimere im Zytosol, die aufgrund ihrer schnellen Induzierbarkeit sofort auf die Stimulation mit TNF-α anspringen. Auch die Kontrollgruppe zeigt präoperativ noch eine ordentliche Aktivierungskapazität von 114%. Diese hält sich allerdings über den ersten postoperativen Tag hinweg stabil und erst an Tag 2 kommt es zu einem Abfall auf 107%. Am dritten postoperativen Tag hält sich die AK ähnlich bei 109%, am fünften Tag sinkt der Wert jedoch weiter auf 101%. Die gleichbleibende Aktivierungskapazität an Tag 1 unterstreicht weiter die Stellung der Carotis TEA als bagatelltraumatisierenden Eingriff. Aufgrund zu geringer Stimuli in vivo scheint kein Anstoßen der NF-κB Kaskade stattgefunden zu haben, was sich in der gleichbleibenden Aktivierungskapazität im Vergleich zur präoperativen Messung niederschlägt. Die geringen Abfälle der AK an Tag 2 und 3 lassen sich entweder als verspätete Reaktion hinsichtlich der proinflammatorischen Aktivität von NF-κB deuten oder eben ähnlich wie Lawrence et al. dies beschrieben, als Faktor der zur Auflösung des inflammatorischen Geschehens, wenn es auch nur in geringem Maße vorhanden war, entscheidend beiträgt [93]. Der weitere Abfall an Tag fünf lässt sich also in dieser Hinsicht damit erklären, dass NF-κB in seiner antiinflammatorischen Rolle stark aktiviert ist und sich kaum noch ex vivo stimulieren lässt. Von der anderen Seite allerdings betrachtet, muss man eben auch anführen, dass in der Kontrollgruppe sieben Patienten an Tag 5 aufgrund 69 Diskussion ihres guten Allgemeinzustands bereits entlassen waren und nicht mehr in die Auswertung einfließen konnten. Somit lässt sich schlussfolgern, dass nur noch Patienten mit weniger gutem Allgemeinzustand an Tag 5 ausgewertet wurden und diese möglicherweise doch eher einer proinflammatorischen Aktivierung des NFκB Signalwegs unterlagen und deshalb nur gering in der Lage waren auf eine in vitro Stimulation zu reagieren. Generell kann man sagen, dass die Patienten der Versuchsgruppe stärker, aber eben auch mit größeren Schwankungen auf die ex vivo Stimulation mit TNF-α reagierten. Postoperativ weist dies eben erneut auf den schwereren chirurgischen Eingriff hin, dem die BAA-Patienten unterliegen. Allerdings wird auch deutlich, dass die Patienten extrem individuell auf das gesetzte Operationstrauma reagieren. Auch in der Carotisgruppe gab es Patienten, die mit einer Aktivierungskapazität von über 150% an einzelnen Messzeitpunkten auf die Operation reagierten. Die Aktivierungskapazität von NF-κB kann also als Größe betrachtet werden, die je nach in vivo Aktivierung der NF-κB Signalkaskade noch weiter stimulierbar ist. Hier kristallisiert sich eher die Theorie heraus, dass bei starker intravitaler Aktivierung des NF-κB Systems eine weitere Stimulierung von NF-κB in vitro nur noch gering bis gar nicht möglich ist. Dieses Modell, den Funktionszustand im NF-κB Signalweg zu messen, ist allerdings ein neuer Ansatz, der so bisher keinen Eingang in Publikationen fand und damit auch nicht belegt werden kann. Allerdings bietet die NF-κB Aktivierungskapazität interessante Ansätze für weitere Forschung. 4.4 Verlauf der Zytokine Mehrere Studien beschreiben einen exzessiven Anstieg der NF-κB Aktivität im Zusammenhang mit SIRS und/oder Sepsis [50, 98]. Die Pathophysiologie von SIRS und Sepsis beinhaltet ein komplexes Zusammenspiel von Zytokinen und inflammatorischen Mediatoren. In diesem Zusammenhang nehmen proinflammatorische Zytokine wie der Tumornekrosefaktor alpha, Interleukin-6 und Interleukin-8 eine enorm wichtige Rolle ein [79]. Trauma und Infektion führen beide zu einem Anstieg von Körpertemperatur, Leukozytenzahlen, Akutphaseproteinen, Flüssigkeits- und Natriumretention. Es ist 70 Diskussion unbestritten, dass die Immunantwort in der Akutphase durch Zytokine wie TNF-α und Interleukin-6 vermittelt wird [138]. Da die Operation als schwer traumatisierender Eingriff an den Patienten mit Bauchaortenaneurysma als Modell für die Entwicklung eines SIRS stehen soll, wurden neben den NF-κB Größen auch die Zytokinwerte an allen Messzeitpunkten mitbestimmt. Da diese Zytokine bereits teilweise schon als diagnostisches Mittel zur Quantifizierung von inflammatorischem Geschehen bzw. SIRS/Sepsis eingesetzt werden, also im Gegensatz zu NF-κB durchaus schon praktische Anwendung finden [25, 115], interessiert hier in dieser Studie vor allem der Vergleich zwischen den Verläufen von NF-κB und den Zytokinen. 4.4.1 Tumornekrosefaktor alpha Neben seiner Funktion in der Akutphasereaktion wurde allerdings bewiesen, dass TNF-α auch in der Pathophysiologie der Sepsis eine große Rolle einnimmt. TNF-α ist im septischen Geschehen für die zunehmende Gewebeverletzung, instabile Hämodynamik, Flüssigkeitsverschiebung und Zerstörung von Endothelzellen verantwortlich. Zudem führen hohe systemische Konzentrationen von TNF-α mit der Zeit zu Multiorganversagen bis hin zum Tod [138]. Dass hier ein Zusammenhang zwischen der Mortalität und der Höhe der TNF-α Konzentration besteht, wurde schon 1989 beschrieben [44]. Die Ergebnisse der Versuchsgruppe zeigen im Verlauf der Mediane einen Anstieg der TNF-α Konzentration bis zum dritten postoperativen Tag, am fünften Tag beginnt der Spiegel bereits wieder zu sinken. Allerdings befinden sich die TNF-α Werte weitgehend in einem Bereich, der maximal das Vierfache des Normwerts von < 8 pg/ml beträgt, so dass kaum von einer hohen systemischen Konzentration gesprochen werden kann. 60% der Probanden in der BAA-Gruppe bleiben sogar konstant unter 20 pg/ml (2,5faches des Normwerts) und immerhin noch ein Drittel bleibt unter 15 pg/ml im gesamten Verlauf. Dies zeigt, dass das operative Trauma nicht in dem Maße eine TNF-α Ausschüttung auslöst, wie dies zum Beispiel bei Sepsis der Fall wäre. Bei großem operativem Stress steigen die TNF-α Werte nämlich mit Leichtigkeit auf das 10-100fache an [33]. Dies lässt sich auch sehr schön am Verlauf des Patienten O-19 erkennen, der nach seiner Operation an der Abdominalaorta einen sehr schlechten Allgemeinzustand aufwies und länger auf der Intensivstation 71 Diskussion verbleiben musste. An Tag 5 schießt der TNF-α Wert dieses Patienten in die Höhe, was ungefähr den Zeitpunkt markiert, an dem der Patient auch ein Organversagen der Niere entwickelte. Interessant erscheint bei der Kontrollgruppe, dass der Verlauf der medianen Werte stets höher liegt als in der Versuchsgruppe. Allerdings ist dieser Unterschied marginal, es dreht sich nur um 3 pg/ml. Zwei Patienten stechen allerdings dadurch hervor, dass sie durchgehend einen TNF-α Spiegel von über 30 pg/ml aufweisen. Hier kann schon präoperativ von einer Aktivierung inflammatorischer Mediatoren ausgegangen werden. Klinisch zeigen beide Patienten das Bild einer symptomatischen ACI-Stenose kombiniert mit zahlreichen Vorerkrankungen. Allerdings wurde festgestellt, dass bei älteren Patienten mit Sepsis eine signifikant niedrigere Konzentration von TNF-α an Tag 1 der Untersuchung positiv mit der Mortalität korreliert [90]. Würde man diese Aussage auf die gemessenen Werte anwenden, würde dies erneut den Stellenwert der Kontrollgruppe als Bagatelltrauma hervorheben und wäre ein Indiz für die deutlich schwerer traumatisierende Operation bei den BAA-Patienten. Gegen diese These spricht jedoch, dass sich die Konzentrationen von TNF-α in beiden Gruppen nur minimal unterscheiden. Zusammenfassend lässt sich aus den gemessenen TNF-α Werten bei beiden Gruppen nur schwierig eine sinnvolle Aussage treffen, da die TNF-α Konzentrationen durch das gesetzte operative Trauma nur unwesentlich ansteigen und sich kein signifikanter Unterschied zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe zeigt. Um hier eine bessere Aussage machen zu können, empfiehlt es sich wohl, eine ähnliche Untersuchung an schwerer erkrankten Patienten durchzuführen. 4.4.2 Interleukin-6 Interleukin-6 ist ein Zytokin, das konsistent bei Patienten nach Operationen, Trauma oder bei Sepsis gefunden wird und korreliert sehr gut mit dem Schweregrad der Verletzung oder Sepsis. Interleukin-6 ist zusätzlich für die Entwicklung von Fieber und metabolischer Veränderungen verantwortlich [138]. Die Höhe der IL-6 Konzentration ist somit ein wunderbarer Indikator für die inflammatorische Reaktion der beiden Patientengruppen auf das gesetzte chirurgische Trauma [135]. Die Versuchsgruppe lässt einen homogenen Verlauf der Interleukin-6 Werte 72 Diskussion erkennen. Knapp 90% der Probanden liegen präoperativ im Normbereich. Dann zeigt sich ein deutlicher Anstieg des schnell reagierenden Zytokins mit Maximum entweder am ersten oder zweiten postoperativen Tag. Danach sinkt die Konzentration mehr oder weniger schnell wieder ab. Dass Interleukin-6 enorm schnell auf ein inflammatorisches Ereignis reagiert und ein guter Prädikator für die Schwere desselben ist, wurde bereits mehrfach gezeigt [110]. Auch in diesen Ergebnissen spiegelt sich dies wider, wie man z.B. erneut an Patient O-19 sehen kann. Auch hier hat der Patient, der wohl den schlechtesten Allgemeinzustand in der Studiengruppe aufwies, den höchsten Anstieg von Interleukin-6 am ersten postoperativen Tag und damit die heftigste Reaktion auf das inflammatorische Geschehen. In einer Studie von Kumar 2009 wurde auch gezeigt, dass ein Rückgang des Interleukin-6 Spiegels innerhalb sieben Tagen positiv mit der Überlebenswahrscheinlichkeit korreliert [90]. In unserem Studienkollektiv ist dies ausschließlich der Fall. Auch in der Kontrollgruppe lassen sich die Patienten in zwei Gruppen mit Maximum des Interleukin-6 Anstiegs am ersten oder am zweiten postoperativen Tag aufteilen. Insgesamt fällt hier jedoch auf, dass die Elevation der IL-6 Konzentration deutlich geringer ausfällt und auch in keinster Weise die Höhe der Interleukinkonzentrationen bei der Studiengruppe erreicht. So deutlich wie Interleukin-6 zeigt kein anderer der Zielparameter, dass der operative Eingriff an der Carotis quantitativ deutlich geringer eine Entzündung induziert. Normalerweise ist Interleukin-6 eines der Zytokine, die am schnellsten einen Anstieg in Folge eines Entzündungsgeschehens zeigen. Nun ließen sich die Probanden sowohl in der Versuchs- als auch in der Kontrollgruppe weiter aufteilen. Die Mehrheit der Probanden, in der Versuchsgruppe knapp 68% und in der Kontrollgruppe 60%, zeigt wie erwartet einen sofortigen maximalen Anstieg am ersten postoperativen Tag als Reaktion auf das operative Geschehen. Die anderen Probanden zeigten jedoch ihr Maximum erst am zweiten postoperativen Tag. Hier lässt sich möglicherweise eine Verzögerung in der Immunantwort ableiten, die darin resultiert, dass die Akutphaseantwort erst ca. 24 Stunden später ihr Maximum entfalten kann. Im Großen und Konzentrationen, Ganzen dass bestätigen dieses Zytokin die Messungen einen exzellenten der Interleukin-6 Parameter zur Beurteilung des inflammatorischen Geschehens und dessen Schweregrad 73 Diskussion darstellt. 4.4.3 Interleukin-8 Auch Interleukin-8 gehört zu den proinflammatorischen Zytokinen und wird ebenfalls als Marker für eine Immunaktivierung bzw. Sepsis eingesetzt. In diesem Zusammenhang stellt IL-8 besonders bei der neonatalen Sepsis einen wertvollen diagnostischen Parameter dar. Ebenso wird IL-8 gerne bestimmt, um den Therapieverlauf zu evaluieren [92, 122]. In der Gruppe der BAA-Patienten erkennt man, dass fast kein Patient überhaupt den Normbereich für Interleukin-8 verlässt. Die präoperativen Interleukin-8 Werte, die bei allen Patienten bei 10 pg/ml liegen, lassen erkennen, dass hier keine Aktivierung von Interleukin-8 vorliegt. Somit sind in Bezug auf IL-8 alle Patienten in ähnlichem „Immunzustand“. Knapp 50% der BAA-Patienten halten diesen Zustand konstant bei, ein Anstieg der Interleukin-8 Konzentration ist über alle fünf Messzeitpunkte nicht zu beobachten. Bei diesen Patienten war der Organismus wohl in der Lage, die Inflammation, die durch das operative Trauma entstand, ohne großartigen Anstieg und Aktivierung von Interleukin-8 zu bekämpfen. Bei den restlichen Probanden ist ein Anstieg des IL-8 Levels, wenn dieser auch nicht bedeutsam ist, zu erkennen. Lediglich zwei Patienten überschreiten die Normwertgrenze. Darunter ist wieder Patient O-19, der die höchste IL-8 Konzentration aufweist, was wiederum sehr gut mit dem klinischen Verlauf korreliert. Einen weiteren „Peak“ verzeichnet Patient O-51 am zweiten postoperativen Tag. Dieser Patient war am ersten postoperativen Tag aufgrund hoher Blutverluste ebenfalls nicht in guter Verfassung und erhielt zu diesem Zeitpunkt zwei Erythrozyten- Konzentrate, was den Anstieg von IL- 8 am nächsten Tag erklären könnte. Generell führte die Operation bei den BAA-Patienten, die ja die Gruppe der schwerer traumatisierten Probanden darstellen, zu keinem nennenswerten Konzentrationsanstieg von Interleukin-8. Der Ausreißer von Patient O-19 zeigt allerdings, dass noch schwerere Erkrankungen wie SIRS oder beginnendes MOF durchaus Unterschiede im Interleukin-8 Profil aufzeigen können. Wenn man die Werte der Kontrollgruppe betrachtet, fällt eine große Homogenität auf. 80% der Patienten zeigen sogar über den gesamten Messverlauf keinerlei Abweichung von der präoperativen IL-8 Messung von 10 pg/ml. Resultiert doch 74 Diskussion ein Anstieg aufgrund des Operationsstimulus war dieser bis maximal 30,6 pg/ml zu beobachten, was immer noch im Referenzbereich liegt. Im Vergleich der beiden Gruppen zeigt sich auch hier wieder, dass die Operation bei den Carotispatienten einen geringeren Stimulus für das Immunsystem darstellt und dass Interleukin-8 erst bei schwerwiegenderen inflammatorischen Ereignissen ansteigt als es z.B. Interleukin-6 tut. 4.5 Korrelationsanalysen Durch mehrere Studien konnte belegt werden, dass sowohl hohe Konzentrationen von NF-κB als auch von Zytokinen wie TNF-α, Interleukin-6 und Interleukin-8 einen positiv prädiktiven Zusammenhang in Hinblick auf die Mortalität von Sepsispatienten aufweisen [44, 59, 110, 138]. Aufgrund dessen liegt es nahe in dieser Studie Korrelationsanalysen durchzuführen, die der Frage nachgehen, ob ein Zusammenhang des Ausmaßes der Zytokinkonzentration mit der Höhe der NF-κB Aktivität besteht. Bei den Korrelationsanalysen wurde hier der Spearmans Korrelationkoeffizient verwendet, der eine Korrelation von ordinalen Zahlen erlaubt. In der Versuchsgruppe zeigt sich, dass die von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen mit Interleukin-6 und Interleukin-8 überhaupt keine signifikanten Korrelationen aufweisen. Lediglich mit TNF-α zeigen sich Zusammenhänge. Die reine unstimulierte NF-κB Bindungsaktivität zeigt in der Studiengruppe der BAAPatienten als einzige Zielgröße überhaupt keine Korrelation zu den Zytokinen. Wie schon von einer Vorgänger-Dissertation beschrieben, eignet sich dieser Parameter eben nur beschränkt für eine Aussage [41]. Im Gegensatz dazu korreliert die NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0 an zwei Messzeitpunkten nämlich an Tag zwei und Tag fünf gegensinnig mit TNF-α. Dies bedeutet, je höher die TNF-α Spiegel sind, desto niedriger ist der Quotient der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0. Der Zusammenhang, den die beiden Parameter zeigen, deutet also darauf hin, dass durch die hohen TNF-α Konzentrationen eine Lymphozytenapoptose ausgelöst wird, die in Immunsuppression resultiert und eine starke NF-κB Aktivierung verhindert [9, 10]. Deutlich mehr signifikante Korrelationen finden sich in der Kontrollgruppe. Schon die reine NF-κB Bindungsaktivität, die in der Versuchsgruppe überhaupt keine 75 Diskussion signifikante Statistik aufweisen konnte, korreliert mit Interleukin-6 und TNF-α. Vor allem die präoperativen Werte der NF-κB Bindungsaktivität korrelieren gegensinnig mit Interleukin-6. Je geringer also die Bindungsaktivität vor dem operativen Ereignis ist, desto höher ist die Konzentration von Interleukin-6 an Tag 2 und 5 und umgekehrt. Dieser Zusammenhang würde dafür sprechen, dass eine niedrige präoperative Konzentration von NF-κB ein stärkeres inflammatorisches Ereignis auslöst, welches man direkt am stärkeren Anstieg von Interleukin-6 erkennt. An Tag 2 zeigt sich ebenfalls eine gegensinnige Korrelation der Bindungsaktivität mit Interleukin-6. Dies würde die These weiter untermauern. Allerdings ist die reine NF-κB Bindungsaktivität wie im Vorfeld schon mehrfach erwähnt und durch Cordes bestätigt [41], als aussagekräftiger Parameter mit Vorsicht zu genießen. Ähnlich wie auch in der Versuchsgruppe zeigt sich zu TNF-α erneut ein gegensinnig signifikanter Zusammenhang mit der NF-κB Bindungsaktivität. Auch dies unterstützt weiter die These der Immunparalyse, sogar in der Vergleichsgruppe. Ein anderes Bild vermittelt der Zusammenhang von TNF-α und der NF-κB Bindungsaktivität relativ zu Tag 0. Hier zeigt sich eine gleichsinnige Korrelation der beiden Parameter an Tag 5. Ebenso zeigt die Korrelation von Interleukin-6 mit der BA relativ zu Tag 0 einen gleichsinnig signifikanten Zusammenhang. Je höher also die Interleukin-6 Werte steigen, desto höher ist auch die prozentuale Steigerung der NF-κB Bindungsaktivität an Tag 3 und 5. Da in der Kontrollgruppe durch das geringere operative Trauma allerdings weder bei den Interleukin-6 Werten noch bei der NF-κB Aktivität große Schwankungen im Verlauf über alle Messzeitpunkte zu beobachten waren, sollte diesen Aussagen nur vorsichtig Bedeutung beigemessen werden. Auch bei Korrelationen der Kontrollgruppe mit der NF-κB Aktivierungskapazität sind mehr Korrelationen vorhanden als in der Versuchsgruppe. Die präoperative Aktivierungskapazität korreliert erneut signifikant gegensinnig mit den TNF-α Werten an Tag 2 und 3. Folgende Annahme lässt sich daraus ableiten: wenn nun das Potential der NF-κB Aktivierung präoperativ groß genug ist, vermindert dies einen Anstieg von TNF-α und somit eine Immunparalyse durch Apoptose der Lymphozyten [67]. Jedoch muss auch hier wieder bedacht werden, dass es sich um die Gruppe der weniger traumatisierten Patienten handelt. Einen weiteren 76 Diskussion gegensinnig signifikanten Zusammenhang zeigt die NF-κB Aktivierungskapazität mit Interleukin-6 an Tag 5. Wie schon im Vorfeld erwähnt, könnte man davon ausgehen, dass an Tag 5 eine Erholung im NF-κB System eintritt und somit eine größere Kapazität der NF-κB Dimere zur Aktivierung bereitsteht. Aus diesem Blickwinkel macht die gegensinnige Korrelation durchaus Sinn, da mit Auflösung der Inflammation ein Abfall des IL-6 Spiegels resultiert und die NF-κB Aktivierungskapazität wieder ansteigt. Generell gab es in beiden Gruppen keine einzige signifikante Korrelation mit Interleukin-8. Möglicherweise lässt dies darauf schließen, dass das Trauma, dem die Patienten ausgesetzt waren, in beiden Gruppen nicht schwer genug war, um dieses Zytokin in ausreichendem Maße zu aktivieren. Auffallend in der BAAGruppe war, dass nur signifikante Korrelationen mit TNF-α auftraten und diese durchgehend gegensinnig signifikant waren, so dass in dieser Gruppe die These von einer Immunparalyse während eines Traumas weiter untermauert wurde. Insgesamt ist es allerdings schwierig, aus diesen Daten statistisch solide Aussagen zu machen, da jeweils nur einzelne Parameter an einzelnen Messzeitpunkten ohne Zusammenhang zum weiteren Verlauf miteinander korrelierten. 4.6 Schlussfolgerung und Ausblick Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Versuchsgruppe von der Vergleichsgruppe zwar im postoperativen inflammatorischen Geschehen unterscheidet, dieser Unterschied aber lediglich an den Medianen erkennbar ist. Aufgrund der starken Streuung ergeben sich statistisch hier keine signifikanten Unterschiede. Zwar zeigt die reine NF-κB Bindungsaktivität im Vergleich der Mediane der beiden Gruppen unterschiedliche Verläufe, eine so hohe Aktivität wie sie bei den BAAPatienten vorhanden ist, erreicht die Kontrollgruppe nicht. Verfolgt man den Verlauf der Mediane dieser Zielgröße, liegt der Eindruck nahe, dass mit steigender Aktivität der Inflammation die NF-κB Werte ebenfalls steigen. Allerdings kann dies nicht als gegeben, und somit statistisch relevant betrachtet werden, da die unstimulierte NF-κB Bindungsaktivität lediglich eine Momentaufnahme des 77 Diskussion Zellgeschehens widerspiegelt. Betrachtet man die NF-κB Aktivierungskapazität lässt sich ebenfalls nur ein auf den Medianverlauf bezogenen Unterschied zwischen den beiden Gruppen herausarbeiten. Postoperativ kommt es zu einem Abfall der Aktivierungskapazität, was zu der These führt, dass das postoperative Trauma einen Großteil der NF-κB Ressourcen aufbraucht und eine in vitro Stimulierung dadurch nur noch in geringem Maße möglich ist. Da der Abfall in der BAA-Gruppe deutlicher zu erkennen ist, kann angenommen werden, dass ein schwereres Trauma die inflammatorischen Kapazitäten stärker ausschöpft. Allerdings muss betont werden, dass dies ein neuer Ansatz ist, den Funktionszustand im NF-κB Signalweg zu messen und somit keine vergleichbaren Studien vorliegen. Im Hinblick auf ein präzises inflammatorisches Monitoring wurden neben NF-κB auch verschiedene proinflammatorische Zytokine bestimmt. Hierzu gehört unter anderem TNF-α, das bei der Evaluation von septischen Erkrankungen durchaus praktische Anwendung findet [25, 115]. In dieser Studie konnte in beiden Gruppen kein bedeutender Anstieg über den Verlauf festgestellt werden. Abgesehen von einzelnen Ausreißern bewegen sich die Werte der Probanden in einem Bereich von maximal dem vierfachen des Normwerts. Allerdings traten bei der Korrelationsanalyse vor allem signifikante Zusammenhänge zwischen den von NF-κB abgeleiteten Größen und TNF-α auf. In der BAA-Gruppe traten sogar ausschließlich Korrelationen mit TNF-α auf, die stets eine gegensinnige Signifikanz aufwiesen. Hier liegt der Schluß nahe, an die Art einer posttraumatischen Immunparalyse mit Downregulation von NF-κB zu denken, wie sie ja bereits von Adib-Conquy vorbeschrieben ist, und dies gleichzeitig mit der immunsuppressiven Wirkung von TNF-α in hohen Konzentrationen in Verbindung zu bringen [9, 10]. Die Messung von Interleukin-6 fiel im Prinzip wie erwartet aus und zeigte auch statistische Signifikanz. Ein deutlicherer Anstieg war in der Versuchsgruppe zu finden, geringer fiel er in der Kontrollgruppe aus. Wie schon häufig vorbeschrieben, kam hier Interleukin-6 seinem Ruf als Indikator für die Schwere der inflammatorischen Reaktion nach [110]. In der Vergleichsgruppe korrelierte auch Interleukin-6 mit den von NF-κB abgeleiteten Zielgrößen. Einige der signifikanten Korrelationen lassen zwar darauf schließen, dass gleichzeitig mit dem Anstieg der NF-κB Bindungsaktivität in Relation zum präoperativen Wert 78 Diskussion auch die Interleukin-6 Konzentrationen ansteigen und dass ausgehend vom präoperativen Wert die Entzündungsressourcen und somit auch der IL-6 Anstieg gegensinnig groß sind, allerdings ist an der Bedeutung dieser Ergebnisse zu zweifeln, da diese lediglich die Kontrollgruppe betreffen. Die Versuchsgruppe zeigt in dieser Hinsicht keine Signifikanzen, was eine Extrapolation auf schwerer kranke Patienten, die ja eigentlich im Fokus dieser Untersuchung stehen, extrem unsicher macht. Die zusätzliche Messung von Interleukin-8 zeigte, dass kaum ein Patient, egal welcher Gruppe, mit einem Anstieg über den Referenzwert reagierte. Lediglich zwei einzelne Ausreißer waren zu beobachten. Auch konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen den NF-κB Zielgrößen und Interleukin-8 hergestellt werden. Parallelen zu anderen Projekten zu ziehen, fällt hier schwer, da weder mit der gleichen Art von NF-κB Bestimmung gearbeitet wurde, noch Zusammenhänge zwischen NF-κB und dem Zytokinprofil gesucht wurden. Zudem wurden auch in den meisten Studien, die ansatzweise vergleichbar sind, Patienten gewählt, die in weit schlechterem Allgemeinzustand waren, als die Patienten dieser Studie. Dies kann man alleine schon daran erkennen, dass Zytokine wie TNF-α und Interleukin8 gar nicht oder nur sehr schwach auf den inflammatorischen Stimulus der Operation reagierten. Weitere Fragen wirft die Bestimmung der NF-κB Größen auf. Wie auch schon bei Cordes beobachtet, zeigt die Messung der reinen NF-κB Bindungsaktivität eine extrem große Streuung und ist somit nur wenig aussagekräftig [41]. Der Bezug zu einem Referenzwert schien notwendig, so dass in dieser Studie die Werte an Tag 0, ähnlich wie bei Böhrer et al., als solche betrachtet wurden [28]. Weiter wurde versucht, durch die Aktivierungskapazität einen Eindruck der in der Zelle vorliegenden inflammatorischen Ressourcen zu erhalten. Jedoch war auch hier eine deutliche Streuung der Ergebnisse auszumachen. Möglicherweise könnten verschiedene Änderungen an der Methodik die Streuung verringern und somit zu homogeneren Ergebnissen führen. Da ja die Intensität der Banden maßgeblich für den Ergebniswert in PSL ist, wäre beispielsweise bei der Analyse der Banden eine feinere Subtraktion des Backgrounds pro einzelner Ladereihe sinnvoll. Zudem gibt es Hinweise, dass sich eigentlich nur Proben, die auf demselben Gel gelaufen sind, miteinander vergleichen lassen. Das war 79 Diskussion möglicherweise ein Grund für das Scheitern eines konstitutiv aktivierten Faktors wie NF-Y als Bezugswert. Hier war es nicht immer möglich, NF-κB und NF-Y auf demselben Gel laufen zu lassen. Im Endeffekt vergrößerte sich durch Bezugnahme auf NF-Y die Streuung so weit, dass er lediglich als Ladungskontrolle diente und nicht in die Ergebnisse einbezogen wurde. Abgesehen von der Empfehlung NF-κB und NF-Y auf einem Gel laufen zu lassen, könnte man auch einen anderen NF-Y ähnlichen Faktor wie zum Beispiel NF-1 testen, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Eine weitere Möglichkeit wäre, nicht Tag null als Referenzwert zu benutzen, sondern gesunde Patienten, ähnlich wie es auch Arnalich et al. in ihrer Studie taten [17]. Wie schon mehrfach angesprochen, stellt sich auch die Frage, ob eine rein operative Stimulation für diese Art der Fragestellung geeignet war. Wie man deutlich am Zytokinprofil erkennen kann, scheint der dargebotene Stimulus kein adäquater Reiz für eine Aktivierung zu sein, was vielleicht auch auf das NF-κB System zutrifft. Möglicherweise wären Patienten mit schwerer Erkrankung, wie Sepsis oder ähnlichem, besser für die Art dieser Untersuchung geeignet. Eine eindeutige Verifizierung der von Cordes etablierten Methodik konnte in dieser Studie nicht stattfinden. Allerdings bietet die NF-κB Aktivierungskapazität durchaus Potential für nachfolgende Studien, möglicherweise auch im Zusammenhang mit TNF-α, wenn die Probanden schwerer erkrankt sind. Hier lässt sich nämlich nicht nur eine Momentaufnahme des Funktionszustandes im NF-κB System beschreiben, sondern auch das inflammatorische Potential, das bei Entzündungsgeschehen und verschiedenen Organismus vorhanden ist. 80 Zuständen des menschlichen 5 Zusammenfassung Systemische Entzündungsreaktionen wie SIRS und Sepsis stellen eine enorme Problematik für die moderne Intensivmedizin dar. Die Inzidenz- und Mortalitätsraten können noch nicht in befriedigendem Maße gesenkt werden. Damit verbunden sind extrem hohe Kosten. Die Pathophysiologie ist nicht in ausreichender Form geklärt. Das immunologische Gleichgewicht zwischen Überregulation der inflammatorischen Immunantwort und einer Art Immunparalyse, sowie das Wechselspiel zwischen diesen beiden Zuständen spielt dabei eine entscheidende Rolle. Dies macht ein immunologisch-inflammatorisches Monitoring dringend erforderlich um eine bessere Abschätzung des Immunzustands und die damit verbundene adäquate Therapie zu gewährleisten. Der Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor kappa B (NF-κB) hat eine besondere Bedeutung in der Modulation des Immunsystems. NF-κB vermittelt sowohl pro- als auch antiinflammatorische Wirkung im septischen Geschehen. Unklar ist allerdings, ob sich die Aktivierung dieser Signaltransduktionskaskade protektiv auswirkt oder ob permissiv ein weiteres Fortschreiten der pathologischen Vorgänge gestützt wird. Im Zusammenhang von NF-κB und Sepsis wurden viele Patientenstudien durchgeführt, welche eine direkte Korrelation erhöhter NF-κB Konzentrationen und der Mortalität der Patienten zeigen. Der Vergleich dieser Studien untereinander ist auf Grund der sehr unterschiedlichen Methodik erschwert. Eine standardisierte Methode zur NF-κB Bestimmung mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) in humanen Blutzellen wurde bereits etabliert und an gesunden Probanden evaluiert. Das vorliegende Projekt wendet diese etablierte Methodik auf zwei unterschiedliche Patientenkollektive im Hinblick auf ein operatives Trauma an. Es wurde die Aktivierung des NF-κB Signalwegs in mononukleären peripheren Blutzellen (PMNC) in der perioperativen Phase bei Patienten mit unterschiedlichen gefässchirurgischen Eingriffen untersucht. Die Messungen wurden hier einmal präoperativ und an vier definierten Zeitpunkten postoperativ durchgeführt. Die Kontrollgruppe bestand aus 20 Patienten, welche an der Arteria carotis interna operiert wurden. Die Versuchsgruppe bestand aus 28 Patienten, die ein Bauchaortenaneurysma operativ versorgen ließen. Das im Vergleich zur Kontrollgruppe schwerere chirurgische Trauma soll als Modell der systemisch ablaufenden pathophysiologischen Vorgänge, wie sie im Rahmen eines Systemic 81 Inflammatory Response Syndrome (SIRS) ablaufen, dienen. An allen Messzeitpunkten wurde die Bindungsaktivität von NF-κB gemessen, die einen reinen, unstimulierten Wert im Sinne einer Momentaufnahme des aktuellen Funktionszustandes des NF-κB Signalwegs liefert. Da diese Größe aber eine extreme Streubreite aufwies, wurde die gemessene Aktivität an den postoperativen Tagen auf den präoperativen Wert bezogen, der 100% darstellte. Vielversprechend war die Messung der NF-κB Aktivierungskapazität. Hier wurden die PMNC ex vivo mit Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) stimuliert und dieser Wert in Bezug zur reinen unstimulierten Bindungsaktivität gesetzt. Der erhaltene Quotient stellt somit ein Maß für das noch vorhandene Aktivierungspotential des NF-κB Signalwegs dar. Ergänzend wurden an allen fünf Messzeitpunkten drei proinflammatorische Zytokine bestimmt, welche im Rahmen von Inflammation, SIRS und Sepsis eine diagnostische und prognostische Aussagekraft besitzen. Vor allem anhand des sensitiven und schnell reaktiven IL-6 ließ sich in der Versuchsgruppe eine klare Reaktion auf das operative Trauma erkennen. IL-8 und TNF-α zeigten keinen Anstieg. Trotzdem zeigte keine der NF-κB Größen einen statistisch signifikanten Unterschied um im Verlauf zwischen den Gruppen zu unterscheiden. Im Bezug der Zytokine mit den NF-κB Zielgrößen gab es ebenfalls keine durchgehende, statistisch signifikante Korrelation. Somit ließ sich in dieser Studie weder ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Schwere des Traumas und der NF-κB Aktivierung zum einen noch zwischen den NF-κB Größen und dem Zytokinprofil zum anderen finden. Dies ist vor allem auf die starke interindividuelle Streuung zurückzuführen. Möglich wäre aber auch, dass beide Operationen im Hinblick auf das Trauma keinen adäquaten Reiz zur Diskriminierung darstellten. Anzuschließen wäre hier eine Untersuchung an septischen Patienten in der Frühphase der Sepsis, da hier ein deutlich abgestufteres Profil der Zielparameter zu erwarten wäre. Hierbei sollten sich signifikante Unterschiede für ein immunologisch-inflammatorisches Monitoring aufzeigen. Darüber hinaus sollte auch der Ansatz der NF-κB Aktivierungskapazität weiter untersucht werden. Es scheint hier möglich zu sein den Funktionszustand im NF-κB System quantitativ zu erfassen und so den Immunzustand der Patienten diagnostisch und prognostisch besser einschätzen zu können. 82 Literatur 6 Literatur 1. Erlanger Schlaganfallregister seit 1994, http://www.kompetenznetzschlafanfall.de/176.0.html#c425, http://www.public-health.med.unierlangen.de/ 2. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med, 1992. 20: 864-74. 3. Abraham, E., R. 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Ganz besonders danke ich Frau Rosemarie Meyer und Frau Andrea Gratza für die hervorragende Zusammenarbeit, den tatkräftigen Einsatz und die Hilfsbereitschaft in jeder Situation. Ohne sie wäre diese Studie nicht realisierbar gewesen. Außerdem danke ich herzlichst Herrn Tim Irfan, der einen nicht unerheblichen Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit geleistet hat. Mein ganz besonderer Dank gilt natürlich meinen Eltern und meinem Bruder, die mich beständig unterstützt und begleitet haben. 97 Lebenslauf 8 Lebenslauf Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt 98 Lebenslauf 99 Lebenslauf 100
