Der Transkriptionsfaktor NF
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NF-κB = Nuclear Factor kappaB 1. Transkriptionsfaktor 2. weitgehend ubiquitär exprimiert 3. durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Stimuli induzierbar 4. zentrale Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Entzündungsreaktionen Allgemeine zelluläre Prozesse, die durch NF-κB gesteuert werden 1. Dorsal-Ventral Entwicklung in Drosophila 2. Aktivierung von Immunzellen 3. Entwicklung und Proliferation von B- und T-Zellen 4. Steuerung der Immunantwort gegen Viren und Bakterien 5. Multiple Antworten einer Zelle auf Stress 6. Kontrolle von Apoptose (v.a. Anti-Apoptose) 7. Embryonalentwicklung im Säuger ? Funktion eines Transkriptionsfaktors Aktivierungsdomän DNABindedomän e e Erkennungssequenz RNAPolymerase Promoto r Genexpression Aktivierung des NF-κB Systems nach: Baeuerle PA and Baltimore D, Cell 87, 13-20,1996 Einzelne molekulare Komponenten des NF-κB Systems nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000 Verschiedene NF-κB Dimere nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000 Beispiele von Homo- und Heterodimerbildung von NF-κB Untereinheiten Transaktivierend: p50/p65: sehr abundant, DER induzierbare NF-κκB Komplex p50/c-Rel: konstitutiv exprimiert in B-Zellen p52/p65 p65/c-Rel Repressoren der Transkription: (p50)2: konstitutiv z.B. in T-Zellen (p52)2: konstitutiv z.B. in Makrophagen Phänotypen von NF-κB/Rel/IκB transgenen und knockout Mäusen nach: Baeuerle PA and Baltimore D, Cell 87, 13-20,1996 NF-κB-aktivierende Faktoren Bakterielle Produkte Viren Virale Produkte Eukaryonte Parasiten Zytokine T-Zellmitogene B-Zellmitogene Stress Pharmazeutika LPS, TSST1, Muramylpeptide HIV, HTLV-1, HBV, HSV-1, EBV, HHV6, Adenovirus dsRNA, Tax (HTLV-1), HBx, HBs, EBNA-2, LMP Theileria parva TNF, LTβ, IL-1, IL-2, LIF, LT-B4 Antigen, PHA, Kalzium-Ionophore, α-CD3, α-CD2, α-CD28 α -Oberflächen IgM UV, γ-Strahlung, H2O2 Phorbolester, ocadaic acid IκB-Poteine und Verwandte Serin-Phosphorylierungsstellen nach: Karin M, J. Biol. Chem. 274, 27339-27342,1999 Aktivierung des NF-κB System (etwas detaillierter) nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000 Der IκB-Kinase-Komplex } aktivierende Phosphorylierung (Serin) } inhibierende Autophosphorylierung regulatorische Untereinheit nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000 Ubiquitinierung von IκB nach: Karin M and Ben-Neriah Y,Annu. Rev. Immunol., 18, 621-663,2000 Aktivierung des IKK-Komplexes Verschiedene aktivierende Kinasen werden durch unterschiedliche Stimuli aktiviert nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000 Aktivierung des IKK-Komplexes durch TNF TNF TNF-R55 TRADD TRAF-2 RIP RIP N IK, M EKK1 , Akt / PKB, ASK1 , T2 K ??? IKK-Kom plex Toll-like Rezeptoren (Rezeptoren zur Erkennung von Mikroorganismen) nach: Akira S, Takeda K, and Kaisho T, Nature Immunol., 2, 675-680,2001 Aktivierung des IKK-Komplexes durch TLRs nach: Akira S, Takeda K, and Kaisho T, Nature Immunol., 2, 675-680,2001 Aktivierung des IKK-Komplexes durch TLR4 nach: Akira S, Takeda K, and Kaisho T, Nature Immunol., 2, 675-680,2001 Aktivierung des IKK-Komplexes durch den TCR nach: Wallach D, Nature Immunol., 3,803-803, 2002 IKK aktiviert NF-κB über zwei unterschiedliche Wege nach: Karin M and Anning L ,Nature Immunol., 3, 221-227,2002 Aktivierung von NF-κB Transaktivierende Funktion von NF-κ κB wird unterschiedliche Modifikationen verändert nach: Baeuerle PA and Baltimore D, Cell 87, 13-20,1996 Regulation der transaktivierenden Funktion von NF-κ κB durch Phosphorylierung nach: Ghosh, S and Karin M , Cell 109, S81-S96, 2002 NF-κB Zielgene Viren Immunrezeptoren Zelladhäsionsmoleküle Zytokine Wachstumsfaktoren Akut-Phase Proteine Transkriptionsfaktoren anti-Apoptose Proteine Sonstige HIV, HCMV, Adenoviren, SV40 Ig κ light chain, TCR α und β-Ketten, versch. MHC-Gene, β2-Mikroglobulin, Invariante Kette ELAM-1 (endothelial leukocyte adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule), ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule) TNF, LT-β, IL-2, IL-6, IL-8 , IFN-β GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Angiotensinogen, Komplementfaktoren c-rel, p105, IκB-α, c-myc, IRF-1 (interferon regulatory factor) IAPs, TRAFs, A20, c-FLIP iNOS, Vimentin NF-κ κB induziert Faktoren, welche die TNFinduzierte Apoptose blockieren nach: Karin M and Anning L ,Nature Immunol., 3, 221-227,2002 EMSA (electrophoretic mobility shift assay) = bandshift assay 1. Radioaktive Markierung eines NF-κ κB-spezifischen Oligonukleotids: 5` NF- κB Bindestell e + 32 P- γ-ATP und Polynukleotid-Kinas 3` e 5` NF- κB Bindestell *P e 3` 2. Annealing mit einem unmarkierten Gegenstrang-Oligonukleotid: Kochen und 5` 3` κ B Bin dest elle NF-κ + 5` 3` langsam kalt werden lasse n *P 3` e NF- κB Bindestell e κ B Bin dest elle NF-κ *P NF- κB Bindestell 3` 5` 5` 3. Präparation eines Kernextraktes aus unstimulierten oder stimulierten Zellen 4. Bindung von nukleärem NF-κ κB an das radioaktiv markierte Oligonukleotid: 1. Absättigung von unspezifisch an DNA bindenden Proteinen mit poly-dI/dC 2. Spezifische Bindung 5. Natives Polyacrylamid-Gel: 1: ohne Kernextrakt 2: unstimulierte Zellen 3: TNF 4: Serum 5: TNF mir Kompetitor 6: TNF mit unspez. Kompetitor 1 2 3 4 5 6 Oligonukleotid mit gebundenem p50/p65-Heterodime freies Oligonukleoti d r Messung der NF-κ κB Aktivität indirekt über Abbau/Phosphorylierung von Iκ κB 1. Zellen mit gewünschtem Stimulus behandeln 2. Gesamt-Lysate herstellen (Detergens-Lyse, Debris abzentrifugieren) 3. Lysate mittels SDS-PAGE auftrennen, blotten und mit spezifischen anti-Iκ κB bzw. anti-phospho-Iκ κB Antikörpern färben 4. Ergebnis: 1 2 3 4 5 Iκ κB 6 Iκ κB Phospho-Iκ κB 1: unbehandelte Zellen 2: 1 Min. TNF 3: 5 Min. TNF 4: 10 Min. TNF 5: 30 Min. TNF 6: 120 Min. TNF Messung der NF-κB Aktivität über Reportergen-Konstrukte 1. Zellen mit Reportergen-Konstrukten transfizieren 2. Gesamt-Lysate herstellen (Detergens-Lyse, Debris abzentrifugieren) 3. Menge des Reportergen-Produktes ermitteln (CAT-assay, Luciferase assay, β-Galaktosidase assay, etc.) 4. Beispielhaftes Ergebnis: untransfizierte Zellen unstimulierte Zellen 20 Min. TNF 2 Std. TNF 4 Std. TNF 8 Std. TNF 24 Std. TNF 2 Std. Serum RLU 445 25670 55788 127590 155400 87339 30893 22386 Regulationsmechanismen nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000 Mögliche Effekte einer NF-κB Fehlregulation nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000 nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000 Entzündliche Erkrankungen, die mit erhöhter NF-κB Aktivierung einhergehen Mögliche therapeutische Strategien zur NF-κB Inhibition Strategien zur NF-κB Inhibition nach: Perkins ND, Trends Biochem. Sci., 25, 434-440,2000
