DNA-Reparatur und Mutagenese
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Helle Ulrich Vorlesung Molekulargenetik – DNA-Reparatur und Mutagenese A) Einführung - - Definitionen und Überblick ß Bedeutung der Genomstabilität für Organismus/Evolution ß Arten von Mutationen ß Ursachen von Mutationen ß Reparatur- und Schutzmechanismen allgemein Modellorganismen zur Untersuchung von Reparatur und Mutagenese Experimentelle Systeme zur Analyse von Mutagenese und Reparatur ß Bestimmung von Mutationsraten: Reportersysteme ß spontane Mutagenese: Fluktuationstest nach Luria und Delbrück ß induzierte Mutagenese: Ames-Test B) Replikationsfehler und ihre Korrektur - Basentautomerien Genauigkeit der Polymerasen Korrekturfunktion der Polymerasen Fehlpaarungsreparatur: ß das MutH/L/S-System in E. coli ß Strang-Unterscheidung durch Methylierung Sonderfälle von Fehlpaarungsreparatur ß das VSP-System ß MutY C) DNA-Schäden und ihre Konsequenzen - - - Schäden durch Strahlung ß UV-Strahlung: Photoprodukte ß ionisierende Strahlung: Basenschäden und Strangbrüche Schäden durch Chemikalien ß Desaminierung ß Depurinierung ß Oxidationen ß Alkylierungen/Addukte ß Strangvernetzungen ß Strangbrüche Konsequenzen ß induzierte Fehlpaarungen ß Störung der Genexpression ß Störung der Replikation Sonderfall: interkalierende Agenzien D) Passive Schutzmechanismen - Pigmente Radikalfänger Redox-Puffer Helikale Struktur der DNA Helle Ulrich E) Reparaturmechanismen - Direkte Eliminierung des Schadens ß Photoreaktivierung ß Alkyltransferasen Excisionsreparatur ß Basen-Excisionsreparatur (BER) ß Das MutY/M/T-System ß Nucleotid-Excisionsreparatur (NER) ß Transkriptions-gekoppelte Reparatur (TCR) F) Bypass-Mechanismen und Schadenstoleranz - Das SOS-System in E. coli Transläsionssynthese G) Doppelstrangbruchreparatur - Reparatur durch Ligation [Ausblick: Homologe Rekombination ] Vorlesung Molekulargenetik: DNA-Reparatur und Mutagenese Helle D. Ulrich Genetische Information ist stabil ... ... aber nicht unveränderlich! 60 Jahre George, 1943 George W., 2003 90 min Konstanz der Erbinformation: - Zellteilung (insbes. mehrzellige Organismen) - Weitergabe von Merkmalen Variabilität / Mutationen: - Voraussetzung für Evolution (+ Kombination durch sexuelle Fortpflanzung) Mutationsraten Definitionen: Klassen von Mutationen Punktmutationen G C Transitionen A T T A Transversionen C G oder Leserastermutationen („frame shifts“) Insertionen T T T T C C A A A A G G +1 T T T C C A A A G G Deletionen T T C C A A G G -1 Chromosomenmutationen oder Translokationen, Rearrangements Verluste Genommutationen Aneuploidie Polyploidie Wie entstehen Mutationen? Replikation A) während der Replikation (Falscheinbau von Basen) G Falscheinbau G G C G T A T T Fehlpaarung (mismatch) Mutation! B) durch DNA-Schäden (Veränderung der kodierenden Eigenschaften der Basen) OH G + H2O G C - NH3 C Deaminierung G C G U Schaden U A U U A T Mutation! C) durch fehlerhafte Reparatur von DNA-Schäden C C G C G C Depurinierung Schaden A Bypass Reparatur A T Mutation! !! wichtig: Unterscheidung zwischen Fehlpaarungen, Schäden und Mutationen !! Modellorganismen Genetik Zellbiologie „Relevanz“ Escherichia coli ++ - Saccharomyces cerevisiae +++ +/- ++ - +++ +++ Säuger-Zellkultur Komplexität +/- Konserviert: Mechanismen und Prinzipien Variabel: Gewichtung der verschiedenen Mechanismen Anzahl/Redundanz der beteiligten Faktoren Komplexität der Regulation Experimentelle Systeme zur Analyse von Reparatur und Mutagenese Überlebensraten 100% log(Überlebende) Sensitivitätsanalyse Reportergene Mutationsraten „forward“-Mutationen: Wildtyp Mutante Dosis Verlust einer Funktion (lacZ+ -> lacZ-) Resistenzentwicklung (strS -> strR) verschiedenste Arten von Mutationen lacZ+ lacZ+ lacZ- Reversionen: Rückgewinn einer Prototrophie (his- -> his+) oder Funktion (lacZ- -> lacZ+) meistens nur Punktmutationen (selten!) Shuttle-Vektoren lacZ Reparaturgenauigkeit, Mutationsspektrum lacZ Sequenzanalyse Reparatur Spontane Mutagenese: Der Fluktuationstest (nach Luria und Delbrück) Fragestellung: Entstehen Mutationen spontan oder durch Kontakt mit der selektiven Bedingung? B) Ausgelöst durch die Selektionsbedingung Häufigkeit Häufigkeit A) Spontane Mutagenese Zahl der Mutanten Zahl der Mutanten Induzierte Mutagenese: Der Ames-Test (his-) suspected mutagen anpaßbar an - säugerspezifischen Metabolismus - spezifische Basenaustausche - Leserastermutanten (his+) Vorhersage der karzinogenen Wirkung von Chemikalien Mutagenese durch Replikationsfehler Mechanismus der Fehlpaarungsreparatur in E. coli „Scanning“ „Linker“ Nuclease Strangunterscheidung bei der Fehlpaarungsreparatur in E. coli Dam-Methylierung (GAmTC) markiert den parentalen Strang 5‘ 3‘ Zeitfenster für Fehlpaarungsreparatur 5‘ 3‘ MutH: Bindung an Hemimethylierte Stellen 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ Strangunterscheidung bei der Fehlpaarungsreparatur in E. coli (UvrD) Fehlpaarungsreparatur in Eukaryonten MutS-Homologe: „MSH“: - „Scanning“-Funktion - mehrere Homologe mit unterschiedlichen Spezifitäten (Fehlpaarungen, Insertionen etc.) MutL-Homologe: - MLH, PMS MutH-Homologe: nicht vorhanden! Problem: Strangunterscheidung! siehe Übungsstunde! Sonderfall: VSP („Very short patch“) -Reparatur (E. coli) C mC A G G Dcm-Methylierung: G G T vsr: m Desaminierung C C C T A G G G G T m Hotspot für C -> T Mutagenese! C C - G-T-spezifische, strang-spezifische Endonuklease - schneidet 5‘ vom T - Reparaturtrakte ≤ 10 nt Schutz vor Mutagenese durch mC-Desaminierung Verringerung der Sequenz „CTAG“ im Genom von E. coli Funktion: Konsequenz: Sonderfall: MutY (E. coli) MutY: - erkennt G-A-Fehlpaarungen - A-spezifische Glykosylase - Korrektur zu G-C MutY oxoG oxoG A G A Reparatur G G C
