Gentechnologie

Gentechnologie
Vektorkunde II: pUC18
pUC-Vektoren
pUC-Vektoren haben lacZ-Gen als Markergen
lacZ
b-Galactosidase
XGal
5-Brom-4-Chlorindolyl-b-D-galactosid
5-Brom-4-Chlor-Indigo
(blau)
Kontrolle des lac-Operons
Inducer
•
Induktor und Substrat des lacOperons
der natürliche Induktor des lac-Operons
ist die Allolaktose:
b1-6-Bindung
•
das natürliche Substrat der ß-Galaktosidase
ist die Laktose:
Glucose + Galaktose
b1-4-Bindung
Bei lacZ-Vektorsystemen:
• Isopropyl-ß-D-Galaktosid (IPTG) als Induktor
IPTG ist selbst
kein Substrat!!!
• X-GAL als Substrat:
5-Brom-4-Chlor-indolyl-ß-D-Galaktosid
> > > > 5-Brom-4-Chlor-Indigo
chromosomal
Pro
lacZ als
Markergen
Op
Pro
x
Op
x
(= lacZ‘)
x
• Chromosom:
in lacZDM15
fehlen AS-Pos.
11 bis 41
• lacZ‘ auf
Vektor kodiert
AS 1 bis 59
der ß-Galaktosidase
a-Komplementation
Was passiert bei der Integration
von Fremd-DNA in das lacZ´-Gen?
PO
MCS
lacZ´
• das erste Drittel des lacZ‘-Gens ist für a-Komplementation nicht
essentiell
> ermöglichte Integration der synthetischen MCS!
• Inaktivierung des lacZ‘ bei Integration von Fremd-DNA durch:
... Einführen von Translations-Stop-Kodons
... Veränderung des Leserahmens (frameshifts)
... (Einführen von Transkriptionsstop-Sequenzen)
Religation des Vektors
„rekombinante“ DNA
Religation des Integrats
Fragen:
Warum darf bei einem Klonierungsexperiment der
Induktor nicht gleichzeitig selbst auch das Substrat
sein?
Wann können Integrat-enthaltende Kolonien blau
werden?
Warum haben manchmal weiße Kolonien kein Integrat?
Transformationsmethoden
Bakterien
chemisch (CaCl2 > Quelleffekt)
physikalisch (Elektroporation)
eukar. Zellen
Co-Präzipitation der DNA als Salz
Elektroporation
Mikroinjektion
Gene Gun !
CaCl2-Methode zur Transformation
von Bakterien