Verwendete Mutationen bei P450 BM-3

Biotransformation of the sesquiterpene
(+)-valencene by cytochrome
P450cam and P450BM-3
Rebecca J. Sowden, Samina Yasmin, Nicholas H. Rees, Stephen G. Bell and
Luet-Lok Wong*
Department of Chemistry, Inorganic Chemistry Laboratory, University of Oxford, South
Parks
Road, Oxford, UK
Received 25th August 2004, Accepted 11th October 2004
First published as an Advance Article on the web 18th November 2004
Gewünschte Umsetzung:
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aus Orangenöl
Synthasegen in E.coli
exprimiert
billig
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aus Grapefruitsaft
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gefragter Duftstoff
teuer
Ansatz:
Biologische Oxidation von (+)-Valencene mit P450 Monooxygenase
zu (+)-Nootkatone
Probleme:
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(+)-Valencene kein Substrat für Wildtyp
P450
(+)-Nootkatone inhibiert P450
Neben (+)-Nootkatone entstehen auch
andere Produkte
Verwendung von Enzymen mit Punktmutationen
Verwendete Enzyme:
Cytochrom P450cam
Cytochrom P450BM-3
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aus Pseudomonas putida
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Substrat: Campher
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gut charakterisiert
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aus Bacillus megaterium
Substrat: mittel- bis
langkettige Fettsäuren
gut charakterisiert
Verwendete Mutationen bei P450cam:
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F87A: kleinere AS
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Y96F: hydrophobere AS
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Die Versuche wurden in vitro durchgeführt
V247L: schließt
Substrattasche
L244A: schafft Platz am
Häm
Ergebnisse für P450Cam
Bei natürlichem Substrat Campher: - Rate 1000min-1
- Ausbeute > 95%
Ergebnisse für P450cam:
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Mutanten haben niedrige Aktivität für (+)-Valencene verglichen mit
Campher
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Aber hohe Regioselektivität für C2-Oxidation
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F87A/Y96F/L244A Mutante erzeugt hohen Anteil an Nootkatone
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F87A/Y96F/L244A/V247L Mutante hat hohe Selektivität für (+)-transnootkatol: Eventuell Umsetzung zu Nootkatone mit Dehydrogenase bei
gleichzeitiger Regeneration von NADH möglich?
Verwendete Mutationen bei P450BM-3:
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R47L: kleiner und
unpolar
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Y51F: unpolare AS
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F87A: kleinere AS
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I263A: kleinere AS
Durchführung:
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In vivo Ansatz in E.coli zur Produktbildung und –isolation
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Problem: Produkte sind toxisch für Mikroorganismen
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Zugabe von 2% v/v n-Hexadecan
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Produkte gehen in organische Phase
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Trennung der Produkte per Säulenchromatographie
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Analyse per Gaschromatographie
Ergebnisse für P450BM-3:
Aktivität bei Fettsäuren:
ca 5000 min-1
Große Anzahl an weiteren
Produkten erhalten
Ergebnisse für P450BM-3:
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Geringe Aktivität für (+)-Valencene verglichen mit dem natürlichen
Substrat
Geringe Regioselektivität: Wahrscheinlich verschiedene
Orientationen des Substrats möglich
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Hohe Substratumsetzung
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Keine Inhibition durch Nootkatone
Zusammenfassung:
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P450cam oxidiert Valencene mit hoher Regioselektivität aber
geringer Aktivität: Wahrscheinlich nur eine Orientierung des
Substrats möglich
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P450cam produzierte bis zu 47% Nootkatone
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P450BM-3 zeigt höhere Aktivität als P450cam
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P450BM-3 zeigt geringe Regioselektivität, dadurch große
Produktvielfalt
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Keine Inhibition durch Nootkatone bei beiden Enzymen
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Beide Enzyme benötigen weitere Optimierung
Fragen?