neue Reaktion

Biosynthese
und
Enzymfamilien
The vast array of plant natural
products can be viewed as the
current status of nature’s activities in
combinatorial chemistry.
R.A. Dixon
Kombinatorische Chemie
Technologie der multiplen Reaktionen
Ansicht von zwei Polymerkügelchen, die eine Matrix für die Katalyse
darstellen. Durchmesser ca. 0.1 mm. Polystyren links; Pepsyn K rechts.
Beispiel 1
Beispiel 2
Detection of benzene by the artificial nose. The figure shows 35 sequential images of the bundle of
optical fibers that make up the artificial nose. Each fiber has different chemicals attached. These
chemicals differ in color, how well and for how long benzene attaches to them, and what effect that
attachment has on their color. The sum of all the changes in the different images is a molecular
signature for benzene, which allows it to be differentiated from many other chemicals. In this experiment,
benzene is applied between frames 4 and 19, with the entire set of images covering less than nine
seconds.
Wie funktioniert die Biosynthese von Sekundärstoffen?
Enzyme
•
Katalytische Makromoleküle (Proteine)
•
An manche Enzyme bindet ein Kofaktor, der direkt an der Reaktion
mitwirkt (organisches Molekül, Coenzym, Metallion).
•
Nur eine bestimmte Region (Molekültasche), das sogen. katalytische
Zentrum bindet das Substrat.
•
Katalysatoren können die Aktivierungsenergie heruntersetzen.
•
Kompetitive Hemmung tritt auf, wenn Moleküle, die dem Substrat sehr
ähnlich sind, an das aktive Zentrum binden
•
Nichtkompetitive Hemmung tritt auf, wenn der Hemmstoff an eine
andere Stelle des Proteins bindet, die nicht mit dem aktiven Zentrum
ident ist.
Das aktive Zentrum ist ausschlaggebend
für das Binden eines Substrats an ein aktives Zentrums
nach dem Schlüssel-Schloss Prinziph.
Enzyme werden nach ihren katalytischen
Eigenschaften klassifiziert
1. Oxidoreduktasen (Elektronentransfer)
a. Dehydrogenasen (katalysieren die Übertragung eines Protons vom Substrat auf NAD+)
b. Oxidasen (katalysieren die Übertragung von Proten vom Substrat auf Sauerstoff,
Wasserstoffperoxid entsteht als Nebenprodukt.
c. Peroxidasen (katalysieren die Oxidation eines Substrats durch Wasserstoffperoxid)
d. Oxygenasen (katalysieren die Oxidation eines Substrats durch molekularen Sauerstoff)
2. Transferasen (Übertragung einer chemischen Gruppe)
3. Hydrolasen (Substratspaltung unter Wasseraufnahme)
4. Lyasen (Ausbildung von ungesättigten Bindungen durch Addition oder
Subtration einer chemischen Gruppe)
5. Isomerasen (Gruppentransfer innnerhalb des Moleküls)
6. Ligasen (katalysieren verschiedenste Reaktionen unter Aufspaltung von ATP
oder einem ähnlichen Nukleotid)
Traditioneller Ansatz der Charakterisierung
von Enzymen des Sekundärstoffwechsels
• Chromatographische Trennung (Gelfiltration)
• SDS-Polyacryl Amid Gel Elektrophorese
• UV Absorbtion
• Aminosäuresequenz
• Bestimmung der Substratspezifität
Nachteil:
unvollständige Charakterisierung aufgrund von Instabilität und Zerfall der
isolierten Enzyme
Aktueller Ansatz der Charakterisierung von
Enzymen des Sekundärstoffwechsels
• cDNA Klonbibliotheken
• Genfamilienspezifische Primer
• Heterologe Expression von Kandidatengenen (z.B. in
Hefe)
• Bestimmung der Substratspezifität
• Aminosäuresequenz
• Phylogentische Studien (DNA oder Aminosäuresequenz)
zum Studium der Evolution der Enzymfamilie
Nachteil:
Flaschenhalssitutation bei der heterologen Expression
Genomics: Expressed Sequence Tags (EST)
Microarrays
Microarrays
Proteom Analyse
Metabolomics
amino and organic acids
monosaccharides
disaccharides
GC−MS
Kernresonanz
spektroskopie
future prospects
Arabidopis Genom
• Die Schätzungen bezüglich des Anteils der am
Sekundärstoffwechsel beteiligten Gene liegen
zwischen 15 and 25 % des Genoms.
• Man schätzt, dass in der Natur hunderttausende Gene existieren, von denen eine Pflanze
nur einen Bruchteil enthält.
Terpen-Synthasen
(TS)
Squalen-Hopen Cyclase
Polyketidsynthasen (PKS)
PKS Typ I: alle katalytischen Zentren finden sich entlang der Domaine
eines multifunktionellen Polypetids
(Bakterien, Pilze)
AT, acyl transferase; KS, ketosynthase; ACP, acyl carrier protein; KR, ketoreductase; DH, dehydratase
PKS Typ II: jedes katalytische Zentrum befindet sich auf einer Proteinuntereinheit,
die sich daraus ergebende Poly-β-Ketokette wird einmal reduziert und darauffolgend
durch Zyklisierung, Aromatisierung oder anders modifiziert
(Bakterien und Pflanzen)
PKS Typ III: einheitliche Annahme von Acyl-CoA Thioestern als Substrat anstatt einer
Anlagerung der wachsenden Kette an ein Acyl Carrier Protein (ACP)
(Pflanzen und Bakterien)
CHS … Chalkon Synthasen
Enzymtaschenvolumen beeinflusst die Auswahl des Startermoleküls
und kontrolliert die Größe des Polyketids
Cytochrom P450
Monooxygenasen
(CYP)
“Diversozyme”
Monooxygenase
S + O2 +NADPH2
SO + H2O + NADP+
S .. Oxidierbares Substrat
2-Oxosäure-abhängige
Dioxygenasen
(ODD)
Gemeinsame Merkmale der Enzymfamilie
• 2-Oxoglutarat as Kosubstrat.
• Eisen und Ascorbinsäure als Kofaktoren sind für eine
optimale Aktivität erforderlich.
• oder Sequenzähnlichkeit zu einer der beiden Gruppen.
dioxygenases
FSI … flavone synthase type I
F3H
FLS … flavonol synthase
ANS … pelargonidin synthase
monooxygenase
DFR … dehydroflavonol-4-reductase
Gibberellin biosynthesis
Methyltransferasen
(MET)
O-methyltransferases
C-methyltransferases
Acyltransferasen
(BAHD)
Klassifikation nach Donormolekülen
•
•
•
•
1-O-Acylglykoside
Acyl Coenzym A
Acylierte Acyl Carrierproteine
Chinasäureeester (z. B. Chlororgensäure)
Glucosyltransferasen
(GT)
• Anschliessende Modifikationschritte der
Biosynthese (Transportform, Speicherung
in Vakuolen)
• Entgiftung durch eine Hydrophilisierung
• Eher regiospezifisch als stereoselektiv als
substratspezifisch
Kompartimentspezifität
Kompartimentspezifität
Von wo kommen die Gene des
Sekundärstoffwechsels her?
• Verdopplung von Primärstoffgenen und
anschließende Mutation
• Allelische Divergenz von orthologen Genen
Die Existenz von großen Enzymfamilien erhöht die Chance
dass - infolge einer Mutation – ein neues Enzym entsteht,
welches entweder
die gleiche Reaktion für ein neues Substrat
oder
eine neue Reaktion für das alte Substrat
katalysiert.
Dieser Schneeballeffekt erklärt zumindest in Ansätzen die
Größe existierende Genfamilien.