Pol Das lac

Lehrerfortbildung Juli 2011
Schülerversuch Geninduktion
am Beispiel des lac-Operons von E.coli
Prof. Dr. Andreas Beyer
cand. stud. Yvonne Floer
cand. stud. Karina van den Broek
Ein Schul-tauglicher Versuch zur Untersuchung
genetischer Regulation bei Bakterien:
– Induktion und Repression –
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Das lac-Operon
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
lacY
lacA
Term
-Pol
lacZ,Y,A-mRNA
Gal
+
Glc
ßGal
Laclactose
Permease
trans
-Ac
2
Das lac-Operon: Der Repressor
RNA
Promotor
Term
lacI
-Pol
lacI-mRNA
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
lacY
-Pol
lacA
Term
lacZ,Y,A-mRNA
ßGal
lacPermease
trans
-Ac
4
Das lac-Operon: Der Repressor
RNA
Promotor
Term
lacI
-Pol
lacI-mRNA
Lac tose
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
-Pol
lacY
lacA
Term
lacZ,Y,A-mRNA
ßGal
lacPermease
trans
-Ac
6
Das lac-Operon: Glc-Repression
RNA
Promotor cAMP-RP Term
-Pol
cAMP
CRP-mRNA
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
-Pol
Lac tose
lacY
lacA
Term
lacZ,Y,A-mRNA
ßGal
lacPermease
trans
-Ac
8
Regulation des lac-Operons
• negatives Regulations-Element im Promotor:
lacR bindet an Operator
 blockiert Transkription in Abwesenheit vom Laktose
Induktor Laktose bindet an lacR
 LacR kann nicht mehr binden, Transkription ist entblockt
• positives Regulations Element im Promotor:
aAMP-CRP komplex bindet an CRP-Bindestelle
 Transcriptionslevel wird erheblich gesteigert
(Mechanismus der Katabolit-Repression)
10
Regulation des lac-Operons
lac-Operon
X
CAPbs PromotorOperator
lacZ
lacY
lacA
Term
X
++
Lac tose
++
cAMP
Transkription des lac-Operons
11
Das Versuchsprinzip
lacZ  ß-Gaslactosidase als Reporter:
Quantifizierung des Aktivitätsstatus‘ des lac-Operons
über Aktivitätsmessung der ß-Gal. via Chromogen:
proportionale Umsetzung von oNPG durch das Enzym
Quelle: chemgapedia
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Extinktion
Vorversuch: Wachstumskinetik
Zeit t in Minuten
13
Vorversuch: Wachstumskinetik
 Glycerin verworfen
14
Setup des Versuchs
•
•
•
•
E.coli H3000: intaktes lac-Operon
Sicherheitsstamm (keine S-Stufe!)
frische Übernacht-Kultur Standard-Medium LB
1:5 Verdünnung mit div. C-Quellen (Kinetik über 1h):
-
•
•
•
•
nur LB
Glucose
Laktose
Glucose + Laktose
Zentrifugation, Zellaufschluss
Zugabe von oNPG  definierte Zeit  Stopp
optische Auswertung (semiquantitativ)
Analyse: Korrelation mit den C-Quellen
15
Setup des Versuchs
1:5 Verdünnung
bei t=0
E.coli H3000: frische
Übernacht-Kultur
(Standard-Medium LB)
Farbtest
Zellaufschluss (Lysozym)
nur LB
…+Glc
…+Lact …+Glc +Lakt
Probennahme alle 20min
16
Ergebnis
17
semiquantitative Auswertung
(Semi-)Quantifizierung mit Photoshop
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