2.1 Der Aufbau des lac

GENETIK
PRAKTIKUM
GENINDUKTION AM
BEISPIEL DES LAC-OPERONS
FH Gelsenkirchen / Recklinghausen Studiengang Molekulare Biologie 2011
Prof. Dr. Andreas Beyer
cand. stud. Yvonne Floer
cand. stud. Karina van den Broek
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ......................................................................... 2
2. Theoretische Grundlagen ............................................................. 2
2.1 Der Aufbau des lac-Operons ......................................................................... 2
2.2 Regulation durch den lac-Repressor ............................................................. 3
2.3 Katabolit-Repression ..................................................................................... 4
2.4 Prinzip des Versuchs ..................................................................................... 6
3. Versuchsdurchführung ................................................................. 6
3.1 Geräte ............................................................................................................ 6
3.2 Chemikalien................................................................................................... 7
3.3 Vorbereitung .................................................................................................. 7
3.4 Durchführung ................................................................................................ 8
4. Ergebnisse und Diskussion ........................................................... 9
4.1 Auswertung ................................................................................................. 10
5. Literatur ....................................................................................... 10
1 Zusammenfassung
Ziel dieses Versuches ist es, die Regulation des lac-Operons von Escherichia coli nachzuweisen. Hierzu wird E.coli mit verschiedenen C-Quellen (Glucose / Laktose) kultiviert; die
Aktivität des lac-Operons wird mit o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (oNPG) nachgewiesen, welches ein Substrat der ß-Galactosidase ist. Somit kann der Farbtest über oNPG
als Maß für die Promotoraktivität des lac-Operons dienen. Die Zellen werden nach Anzucht
mit Lysozym aufgeschlossen, danach wird der Farbtest ausgeführt, fotografisch dokumentiert
und mit Hilfe eines PC-Programms (semi-)quantitativ ausgewertet.
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Der Aufbau des lac-Operons
Das erste Operon-Modell zur Erklärung von Genregulation wurde 1961 durch die beiden
französischen Forscher Franςois Jacob und Jacques Monod aufgestellt (Jacob & Monod
1961; siehe auch Beckwith 1967 und Ullmann 1985). Sie stellten sich die Frage, woher
Bakterien wohl „wissen“ können, welcher Nährstoff gerade zur Verfügung steht – und ganz
besonders interessierten sie sich dafür, wie ein Bakterium es schafft, die Expression der
Enzyme einzuleiten und zu steuern, die genau für die erfolgreiche Umsetzung der angebotenen Nährstoffe benötigt werden.
Innerhalb ihrer Forschungen beschäftigten sie sich besonders mit der Umsetzung von
Laktose, einem β-Galactosid, durch E.coli. Das Ergebnis war ein detailliertes Modell der
DNA-Struktur, welche alle Strukturgene der benötigten Enzyme für den Laktose-Abbau
kodiert, sowie seine Regulationsmechanismen umfasst. Aus diesem Grund bekam das
Modell den Namen lac-Operon (Abb1).
Abbildung 1: Das lac-Operon von E.coli
E.coli - Chromosom
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
-Pol
lacY
Transkription
lacA
Term
lacZ,Y,AmRNA
Cytoplasma
Translation
Gal
+
Glc
ßGal
Lac tose
trans
-Ac
Lac tose
Zellmembran
Medium
LactosePermease
Lac tose
CAPbs: CAP-Bindestelle; RNA-Pol: RNA-Polymerase; Term: Terminator; lacZ, -Y, -A: Strukurgene, ßGal: ß-Galactosidase
2
Die Länge des lac-Operons beträgt ca. 6000 Bp des Chromosoms, die Transkription ergibt
eine einzige, polycistronische mRNA (d.h. alle 3 Enzyme werden auf einer mRNA kodiert).
„vorn“ (= links in Abb.1) liegt der Promotor, er enthält den core-Promotor (Kern-Promotor =
Bindungsstelle und Ansatzpunkt der RNA-Polymerase). Außerdem enthält der Promotor
noch regulative Elemente: Vor dem core-Promotor liegt CAPbs (= eine Bindestelle des CRP;
s.u.), dahinter der Operator (= die Bindestelle für den lac-Repressor; s.u.). Die nachfolgende,
kodierende Region enthält drei Strukturgene (die, wie gesagt, auf einer gemeinsamen mRNA
translatiert werden). Als erstes wird das Enzym β-Galactosidase kodiert. Die ß-Gal ist in der
Lage, β-Galactoside hydrolytisch in ihre einzelnen Zuckerbestandteile aufzutrennen. Ein
Beispiel ist hier ihr natürliches Substrat Laktose, welche durch das Enzym in Galaktose
sowie Glucose gespalten wird. Der LacZ-orf („open reading frame“ = „offenes Leseraster)
umfasst 3.500 Bp. Direkt anschließend folgt der LacY-orf, er kodiert die β-GalactosidPermease: ein membrangebundenes Kanalprotein, das dafür sorgt, dass β-Galactoside in
die Zelle hinein diffundieren können. Die Größe diese Gens beträgt knapp 800 Bp. Der letzte
orf trägt den Namen LacA und kodiert das Enzym β-Galactosid-Transacetylase: Sie überträgt
Acetylgruppen von Acetyl-CoA auf β-Galactoside. Die genaue Funktion dieser Reaktion ist
bisher noch unklar; vermutlich sind nicht gespaltene β-Galactoside in größeren Mengen
schädlich für die Zelle, und durch die Acetylierung sind sie besser ausscheidbar. Als letztes
folgt der Terminator des lac-Operons, die Abbruchsequenz für die RNA-Polymerase.
2.2 Regulation durch den lac-Repressor
Das LacI-Gen kodiert das lac-Repressor-Protein LacR. Es besitzt einen eigenen Promotor
(Pi, der schwach und konstitutiv aktiv ist) sowie einen Terminator; seine Länge beträgt etwa
1040 bp. Dieses Gen kodiert ein Regulatorprotein (= ein sog. trans-wirkendes Produkt, d.h.
wirkt an anderer Stelle als es selbst codiert ist). LacR kontrolliert die Aktivität des lacOperons (Abb.2).
Abbildung 2: Repression des lac-Operons von E.coli durch LacR
RNA
E
Ch .co
li
ro
–
m
os
om
Promotor
-Pol
Term
lacI
Transkription
lacI-mRNA
Tran
slati
on
R
c
La
cR
La
CAPbs PromotorOperator
RNA
lacZ
lacY
-Pol
Term
lacA
lacZ,Y,A-mRNA
ßGal
lacPermease
trans
-Ac
3
lacR bindet an seine Zielsequenz, den Operator, welcher Bestandteil der Promotorregion des
lac-Operons ist und verhindert auf diese Weise eine erfolgreiche Transkription (den Operator
nennt man auch „ein cis-wirkendes Element“, d.h. er kontrollieren nur die Expression der auf
demselben DNA-Strang direkt benachbarten Gene). Der Operator ist 26 Bp lang.
Die lacR-Repression kann durch den Induktor Laktose aufgehoben werden: Sobald Laktose
in die Zelle gelangt, bindet sie hochaffin an lacR, wobei letzerer inaktiviert wird: Es findet
eine Konformationsänderung statt, die es dem Repressor nicht mehr erlaubt, am Operator zu
binden. Für die RNA-Polymerase ist nun der Weg durchs lac-Operon frei; es kommt zur
Transkription (Abb. 3).
Abbildung 3: Induktion des lac-Operons von E.coli: Aufhebung der lacR-Repression
RNA
E
Ch .co
li
ro
–
m
os
om
Promotor
-Pol
Term
lacI
Transkription
lacI-mRNA
Tran
slati
Lac tose
on
R
c
La
X
Lac tose
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
lacY
-Pol
lacA
Term
lacZ,Y,A-mRNA
Trans
ßGal
lation
lacPermease
trans
-Ac
Frage: Einerseits wird die lac-Permease gebraucht, um Laktose in die Zelle zu befördern,
andererseits wird aber Laktose gebraucht, um das lac-Operon zu dereprimieren – wie kann
das funktionieren? – ohne Laktose keine Transkription der lac-Permease, und ohne lacPermease keine Laktose in der Zelle?
2.3 Katabolit-Repression
Bei Anwesenheit des Induktors kann dieser an den lacR binden, der Operator ist frei (Abb.3).
Doch selbst unter diesen Bedingungen ist der Transkriptionslevel des lac-Operons niedrig,
dessen Kern-Promotor ist nämlich relativ schwach.
Frage: Ein Promotor ist eine Stelle der DNA, an der die RNA-Polymerase binden und die
Transkription initiieren kann. Wie also kann ein Promotor „stark“ oder „schwach“ sein?
4
Damit die Transkription des lac-Operons auf hohem Level statt finden kann, muss ein
weiterer Aktivator hinzu kommen, das CRP (Abb.4).
Abbildung 4: Aktivierung des lac-Operons von E.coli durch CRP.
Anm: cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) =
catabolite gene activator protein (CAP)
RNA
Promotor cAMP-RP Term
CRP-mRNA
P
CR
RNA
CAPbs PromotorOperator
lacZ
-Pol
Trans
cR
Lac tose
lacY
Term
lacA
lacZ,Y,A-mRNA
X
++
La
n
P
CR
cAMP
Translatio
-Pol
cAMP
ßGal
lation
lacPermease
trans
-Ac
Viele Promotoren katabolischer Operons weisen, selbst wenn sie induziert werden (beim lacOperon: der Induktor Laktose hebt die lacR-Repression auf: Abb.3), nur eine niedrige Transkriptionsrate auf. Eine erhebliche Aktivitätssteigerung erfahren sie durch einen anderen
trans-wirksamen Faktor, nämlich das cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) = catabolite gene
activator protein (CAP). cAMP ist in der Bakterienzelle ein Signal für die Abwesenheit von
Glukose; wird er gebildet, so bindet er an das katabolische Aktivatorprotein CRP oder CAP:
Beide bilden zusammen einen Komplex, den cAMP-CAP-Komplex. Bei der Bindung an eine
spezifische Stelle auf der DNA, direkt vor dem Kern-Promotor (die CAP-Bindestelle CAPbs),
bewirkt der Komplex, dass die RNA-Polymerase wesentlich effektiver an die DNA binden
kann. Eine erfolgreiche Transkription auf hohem Level ist das Resultat.
Frage: Eine wie hohe Transkriptions-Aktivität des lac-Operons erwarten Sie bei Anwesenheit
folgender C-Quellen:
(a) eine komplexe C-Quelle, z.B. Aminosäuren
(b) eine komplexe C-Quelle plus Laktose
(c) Glucose
(d) Lactose
(e) Glucose + Lactose
5
2.4 Prinzip des Versuchs
Im Versuch wird die Transkriptions-Aktivität des lac-Operons in Abhängigkeit von veschiedenen C-Quellen getestet; dazu werden die Zellen mit den entsprechenden Medien
angezüchtet. Nach Ende der Wachstumsphase werden die Zellen aufgeschlossen, und dem
somit frei gesetzten Enzym β-Galactosidase wird ein anderes Substrat als Laktose zugeführt,
dieses Substrat ist chromogen („chromogen“ bedeutet, dass bei seiner Umsetzung durch das
Enzym einen Farbstoff entsteht, der optisch detektierbar ist). Dieses Substrat heißt orthoNitrophenyl-β-D-galactopyranosid (kurz ONPG): Es besteht aus Galaktose und einem Nitrophenyl-Ring, der bei der Spaltung der β-1,4-glycosidischen Bindung gelb wird (Abb.5).
(Quelle: chemgapedia.org)
3 Versuchsdurchführung
3.1 Geräte:
Größere Geräte:
Feinwaage, Autoklav bzw. Dampfdruckkochtopf, Bunsenbrenner, Magnetrührplatte, Schüttelinkubator, Kühlschrank, Trockenschrank, Zentrifuge, Vortexer (Wirbelmixer / Schüttler),
Fotokamera / Digicam / Handycam, PC mit Bildbearbeitungsprogramm (Photoshop o.ä.)
Glasgeräte und sonstige Materialien:
Wiegeschälchen, Bechergläser, Kolbenhubpipette 1 ml – 100 µl inklusive Spitzen (steril),
Autoklavierflasche 300 – 500 ml, Spatel/Löffel, Messkolben 50 ml, Rührfische, Feuerzeug,
Falcontubes 50 ml, 2 Flaschen 100 ml, pH-Papier / pH-Meter, Falcontubes 15 ml, 2 Messzylinder 100 ml, Erlenmeyerkolben (steril) 250 ml, Messpipette (steril) 10 ml, 4 Messpipetten
10 ml, 4 Erlenmeyerkolben (steril) 100 ml, Eisbox, Alufolie. Die meisten Gerätschaften
können durch andere, entsprechend geeignete ersetzt werden.
6
3.2 Chemikalien:
Name
Trypton
Hefeextrakt
Natriumchlorid
Benötigte Menge
1g
<1g
1g
Reinheit / Konzentration
pa oder reinst (99 -99,5%)
Natriumhydroxid
Lösung
< 1 ml
pa oder reinst: 2 M
Salzsäure
< 1 ml
pa oder reinst: 2 M
Laktose
Glucose
<1g
<1g
rein (Lebensmittelqualität)
rein (Lebensmittelqualität)
Tris
<1g
pa: 10 mM
EDTA
<1g
pa: 1 mM
ONPG
<1g
pa
Natriumcarbonat
<1 g
rein oder reinst
Lysozym
E.coli H3000
< 1g
< 1 ml
reinst
- Dauerkultur -
H &P Sätze
H: 314
P: 280-301+330+331309-310-305+351+338
H: 314-335
P: 260-301+330+331303+361+353305+351+338-405-501
H:315-319-335
P: 261-305+351+338
H: 319
P: 305+351+338
H: 319
P: 260-305+351+338
keine S-Stufe
3.3 Vorbereitung:


150 ml LB -Medium ansetzen:

1,5 g Trypton, 0,75 g Hefeextrakt, 1,5 g NaCl abwiegen

In 150 ml Wasser lösen, mit 2 M NaOH pH-Wert 8,5 einstellen

Medium in eine Flasche geben (darf nur zu 2/3 befüllt sein), Autoklavierband aufkleben und gegeben falls darauf beschriften, ACHTUNG: Deckel locker auflegen /
aufschrauben wegen der Druckentwicklung im Autoklaven!

Autoklavieren auf dem Programm Flüssigkeiten (bei 121 °C für 20 min) oder 30min im
Dampfdruckkochtopf kochen.
C-Quellen: Lösungen ansetzten (finale Konzentration im Medium = 5 mM):

Laktose Stammlösung (50mM) ansetzen: 171,2 mg einwiegen, A.dest ad 10 ml.

Glucose Stammlösung (50mM) ansetzen: 45 mg einwiegen, A.dest ad 5 ml.
Zuckerlösungen dürfen nicht autoklaviert werden! Da diese C-Quellen aber bei
hohem Bakterientiter nur 1h im Medium metabolisiert werden, müssen sie nicht steril
sein. Aber ACHTUNG: Aufbewahrung nur eingefroren!
Lysispuffer ansetzen:

48,4 mg Tris Base (Endkonz. 10 mM), 23,55 mg EDTA oder 29,8 mg Na2EDTA
(Endkonz. 2 mM) abwiegen, in einer Flasche auf 40 ml mit dest. Wasser auffüllen;
mischen, pH-Wert auf 8 einstellen (mit NaOH), dann im Kühlschrank aufbewahren.
7
Lysozym-Lösung (als 10x Stammlösung) ansetzen:

Frisch, also höchsten eine Stunde vor der Lyse, 4 mg Lysozym in 4 ml Lysispuffer
(ergibt 1 mg/ml Stammlösung ) in einem Reagenzglas lösen, durch Kippen mischen,
im Kühlschrank aufbewahren.
Frage: Wieso lysiert Lysozym E.coli nur in Gegenwart von EDTA?
Farbsubstrat: 10x oNPG-Lösung (=50 mM; Endkonz. im Ansatz = 5 mM) ansetzen:

60 mg oNPG einwiegen, in einem Reagenzröhrchen auf 4 ml mit dest. Wasser auffüllen, durch Kippen und Schütteln lösen, im Kühlschrank aufbewahren
Abstopplösung ansetzen:


0,4M Na2CO3: 848 mg Natriumcarbonat einwiegen und auf 20 ml mit dest. Wasser
auffüllen; ggf. unter Schütteln lösen.
benötigte Gerätschaften sterilisieren:

Andere Gerätschaften, die steril benötigt werden (insbesondere die Kolben und
Kölbchen bzw. Reagenzgläser für die Bakterienanzucht), autoklavieren und anschließend trocknen. Alternativ können solche Gefäße auch mit 70%igem Ethanol gespült,
mit locker aufsitzender Kappe verschlossen und dann über Wochenende getrocknet
werden.
3.4 Durchführung:
Vorkultur (Übernacht):

Am Vortag des Versuches E.coli H300 Cryokultur auf Eis auftauen lassen bzw.
Dauerkultur des DSMZ nach der entsprechenden Vorschrift revitalisieren.

40 ml steriles LB Medium in den 100 ml Kolben steril überführen, 100-500 µl der
getauten E. coli Cryokultur unter sterilen Bedingungen hinzugegeben, bei 30-37°C in
einem Schüttelinkubator über Nacht (= ca. 15 h) wachsen lassen. ACHTUNG: Nicht
sehr viel länger oder kürzer wachsen lassen, da die Zellen dann zum Großteil abgestorben sind bzw. noch keinen hinreichend hohen Titer erreicht haben.
Pipettieren der Ansätze am Anfang des Versuchstags:
 LB Medium und Substrat-Lösung in die jeweiligen sterilen Erlenmeyerkolben vorlegen, E.coli aus der Übernachtkultur erst zum Schluss hinzugeben, wenn möglich
alles unter sterilen Arbeitsbedingungen.
 Probenschema:
Kolben
LB frisch
ÜN-Kultur
Substrat Stammlösung (50 mM)
1 (50 ml)
16 ml
4 ml
2 (50 ml)
12 ml
4 ml
2 ml Glucose + 2 ml Laktose
3 (50 ml)
14 ml
4 ml
2 ml Glucose
4 (200 ml)
35 ml
10 ml
5 ml Laktose
8

Ansätze bei 37°C auf dem Schüttelinkubator (100 rpm) inkubieren. Aus allen Kolben
werden SOFORT 5 ml entnommen (in 15 ml Falcon-Tubes oder Reagenzröhrchen
geben), beschriftet und auf Eis oder in den Kühlschrank gestellt. Aus allen Kolben
werden weiterhin alle 20 Minuten weitere 5 ml-Proben entnommen, beschriftet und
auf Eis gestellt, die letzte bei 60 min. Somit liegen nach 1 h am Ende 4 x 4 Proben
vor; ferner sollten eine 5 ml Probe reinen LB-Mediums als Nullprobe mitlaufen.
Zelllyse:

Medium aus den 5 ml - Proben durch Zentrifugation bei 4.000 g und 4°C 10 min eliminieren, Achtung: Die Zentrifuge muss austariert sein! Überstand verwerfen. Sediment
kann eingefroren werden (was die Effizienz der Lyse erhöht!).

Zellsediment resuspendieren, in je 1,8 ml Lysispuffer resuspendieren (vortexen,
kräftig schütteln).

Wenn das Zellsediment komplett resuspendiert ist, 200 µl 10x Lysozym-Stammlösung
zugeben und 20 min unter leichtem Schütteln inkubieren (die Lyse-Effizienz ist höher
bei 37°C). Die Lösung sollte klar und viskös werden.
β-Galactosidase Nachweis:

222 µl der 50 mM oNPG-Lösung in die resuspendierten und lysierten Bakterien
geben, gründlich mischen, je nach Intensität der Farbreaktion 10 – 20 min bei Raumtemperatur oder 37°C stehen lassen (alle Proben gleich lang!). Dann Reaktion mit
1 ml der Abstopplösung abstoppen, kurz mischen. Optional am Ende Zelltrümmer
herunter zentrifugieren: 5 min bei 4.000 g, Achtung: Zentrifuge muss austariert sein!
Auswertung:

Zuerst visuell: Vergleichen der Färbung

Proben z.B. in Küvetten oder in andere rechteckige Gefäße überführen und vor eine
weiße Fläche stellen, Digital-Foto machen. Alternativ in kleine Petrischalen oder
andere flache Gefäße überführen und auf weißer Fläche stehend von oben
fotografieren. Günstig ist, alle Proben auf einem einzigen Bild zu erfassen, um sicher
zu stellen, dass die Werte nicht durch die Autokorrektur-Funktion der Kamera
verfälscht werden. Mit Fotoshop, Paintshop oder anderem Grafikprogramm die
Gelbwerte bestimmen.
9
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Auswertung
Vergleichen Sie die unterschiedlichen Färbungen der Ansätze. Entsprechen Sie den Erwartungen? Was sagt Ihnen die Kinetik über die Geschwindigkeit der Geninduktionsprozesse?
Speichern Sie die gemachten Bilder auf einem Computer ab, ermitteln Sie die Farbsättigung.
Definieren Sie die maximale Sättigung als 100%, ziehen Sie den Nullwert ab.
5 Literatur
Beckwith JR. (1967) Regulation of the lac operon. Recent studies on the regulation of Laktose
metabolism in Escherichia coli support the operon model. Science 156(3775):597-604.
Jacob F, Monod J. (1961) Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol.
3:318-56.
Ullmann A. (1985) Catabolite repression 1985. Biochimie. 67(1):29-34.
Weitere Empfehlungen
Janning W, Knust E: Genetik, Thieme, 2004 (lac-Operon S. 204)
10